JP2024520905A - α－シヌクレイン病治療用抗体 - Google Patents

Abstract

本開示は、α－シヌクレインおよびインスリン様成長因子１受容体の両方を標的とする多重特異性の単離された結合タンパク質を含む、α－シヌクレインを標的とするヒト化抗体およびその抗原結合断片などの単離された結合タンパク質を提供する。また、α－シヌクレイン病を治療するために結合タンパク質を使用する方法も提供される。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年５月１２日に出願された韓国特許出願第１０－２０２１－００６１４０７号の優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。２０２２年５月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２２５４８＿ＷＯ０１５＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは８７，６８４バイトである。

α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）は、小胞輸送、脳内のシナプス伝達、およびＤＮＡ修復に関連する神経タンパク質である。シヌクレイン病とも呼ばれるα－シヌクレイン病は、脳内の不溶性α－ｓｙｎの異常蓄積を特徴とする神経変性疾患である。パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、および扁桃体レビー小体を伴うアルツハイマー病が含まれる。α－シヌクレイン病は広く蔓延しており、ヒトの罹患および死亡の重大な原因となっている。例えば、世界中で約１，０００万人がパーキンソン病に罹患している。α－ｓｙｎの病理学的蓄積の増大は、疾患の重症度の進行と相関している（非特許文献１）。α－シヌクレイン病を治療する際の１つの治療目標は、脳内のα－ｓｙｎの異常蓄積を減少させることである。

α－ｓｙｎの病理学的蓄積を予防または低減するための１つのアプローチは、典型的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に基づいてα－ｓｙｎ標的化抗体を開発することである。このような抗体は開発されているが、臨床的には大きな限界がある（非特許文献２）。１つの重要な問題は、血液中の分子の脳への通過を制限する内皮細胞障壁である血液脳関門（ＢＢＢ）を治療用抗体が効率的に通過できないことである。さらに、これまでに開発されたα－ｓｙｎ標的化抗体は、α－ｓｙｎの生理的な単量体形態と、疾患に関連するα－ｓｙｎのオリゴマー形態または前原線維形態を区別しない（非特許文献３；非特許文献２、上掲）。実際、α－ｓｙｎの単量体形態の減少は、いくつかの種の神経病理に関与している（非特許文献４）。したがって、α－シヌクレイン病の治療を改善は必要とされたままである。

Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．（２０１９）７０９：１３４３１６ Ｖａｉｋａｔｈら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２０１９）１５０：６１２－２５ Ｌａｓｈｕｅｌら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１３）１４（１）：３８－４８ Ｇｏｒｂａｔｙｕｋら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１０）１８（８）：１４５０－７

本明細書には、α－シヌクレイン病の治療に有用な、抗α－ｓｙｎ抗体およびその抗原結合断片などの組換えα－ｓｙｎ結合タンパク質が記載される。一局面において、本開示は、ヒトα－シヌクレインに結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体または抗原結合断片は：（ｉ）それぞれ配列番号３３～３５に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３、および（ｉｉ）ヒトＶＨ１－０２遺伝子由来の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、および／または３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびにそれぞれ配列番号３６～３８に示す軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ヒトＶＨ１－０２遺伝子に由来するＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３は、ヒトＶＨ１－０２遺伝子によってコードされる対応するＦＲと比較して６個以下（例えば、６個、５個、４個、３個、２個、１個、または０個）の変異（例えば、置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒトＪＨ１、ＪＨ４、またはＪＨ５遺伝子由来の重鎖ＦＲ４を含む。

一局面において、本開示は、ヒトα－シヌクレインに結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号６４～６６に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および／またはそれぞれ配列番号６７～６９に示す軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書における抗体または抗原結合断片は、配列番号１～９のいずれか１つを含むＶＨ、および配列番号１１～１５のいずれか１つを含むＶＬを有する。さらなる実施形態において、ＶＨおよびＶＬはそれぞれ：配列番号１および１１、配列番号２および１２、配列番号３および１２、配列番号４および１２、配列番号７および１２、配列番号５および１３、配列番号５および１５、配列番号６および１３、配列番号６および１４、配列番号５および１４、配列番号８および１４、または配列番号９および１４を含む。特定の実施形態において、ＶＨは配列番号１を含むか、またはＶＬは配列番号１１を含む。特定の実施形態において、ＶＨは配列番号１を含み、そしてＶＬは配列番号１１を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書の抗体または抗原結合断片は、ヒトκ軽鎖定常領域（例えば、配列番号４３）を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は二重特異性である。二重特異性抗体または抗原結合断片は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）と結合する部分を含み得る。いくつかの実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、ＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは、それぞれ配列番号５１～５３に示す重鎖ＣＤＲ１～３を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号４６～４８に示す軽鎖ＣＤＲ１～３を含む。さらなる実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号５０および４５を含む。特定の実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、ｓｃＦｖ（例えば、配列番号５４）である。

いくつかの実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、抗体の両方の重鎖のＣ末端に融合している。

いくつかの実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、抗体の一方のみの重鎖のＣ末端に融合している。

いくつかの実施形態において、本開示の抗α－ｓｙｎ抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。この定常領域は、場合により、野生型ヒトＩｇＧ１配列と比較して変異を含んでいてもよい。例えば、抗体の一方の重鎖は、１つまたはそれ以上のノブ変異（例えば、Ｔ３６６Ｗ）を含んでいてもよく、抗体の他方の重鎖は、１つまたはそれ以上のホール変異（例えば、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）を含んでいてもよい（全てＥｕ番号付け）。さらなる実施形態では、ノブ重鎖は配列番号３９を含み、および／またはホール重鎖は配列番号４０を含む。いくつかの実施形態において、抗体の重鎖は、Ｍ４２８Ｌ変異（Ｅｕ番号付け）をさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、ノブ重鎖は配列番号４１を含んでいてもよく、ホール重鎖は配列番号４２を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書の二重特異性抗体は、ノブ重鎖のＣ末端に融合したＩＧＦ１Ｒ結合部分を含む。例えば、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、ホール重鎖のＣ末端に位置し、場合により、ホール重鎖は配列番号５５または５６を含む。

特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号５７を含む重鎖および配列番号５８を含む重鎖；ならびに各々が配列番号５９を含む２つの軽鎖を含む。

本開示の単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）抗体または抗原結合断片は、凝集またはオリゴマーのα－シヌクレインに、場合により２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭまたは１０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合し得、場合により単量体のα－シヌクレインには特異的に結合しない。

他の局面において、本開示は、本明細書中の単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）抗α－ｓｙｎ抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

他の局面において、本開示は、本抗体または抗原結合断片をコードする、発現構築物などの１つまたはそれ以上の核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、配列番号１７～２５から選択されるヌクレオチド配列および配列番号２７～３１から選択されるヌクレオチド配列を含む。また、これらの核酸分子を含む宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）；および抗体または抗原結合断片の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物から抗体または抗原結合断片を単離することによって、抗体または抗原結合断片を産生する方法も提供される。

他の局面において、本開示は、必要とするヒト対象においてα－シヌクレイン病（例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、または扁桃体レビー小体を伴うアルツハイマー病）を治療する方法であって、治療有効量の本明細書中の抗体または抗原結合断片を対象に投与することを含む方法を提供する。また、これらの方法において使用するための抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物；ならびにこのような治療方法において使用するための医薬の製造における抗体もしくは抗原結合断片の使用も提供される。

ＥＬＩＳＡにおける、指示された抗体濃度（ｎＭ）の示された単一特異性キメラ１Ｅ４抗体（ｃｈ１Ｅ４）または単一特異性ヒト化１Ｅ４抗体（ｈｕ１Ｅ４；具体的には、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ２＿ＶＬ２）、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ３＿ＶＬ２）、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ７＿ＶＬ２）、およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ４＿ＶＬ２））によるα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）前形成原線維（ＰＦＦ）の結合を示すグラフである。平均値：結合の指標である波長４５０ｎｍにおける平均光学密度。 ＥＬＩＳＡにおける、単一特異性キメラ抗体ｃｈ１Ｅ４および単一特異性ｈｕ１Ｅ４抗体（ｈｕ１Ｅ４（Ｖ８＿ＶＬ４）およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ９＿ＶＬ４））によるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すグラフである。「ｈＩｇＧ１」：陰性対照としての無関連なヒトＩｇＧ１。 ＥＬＩＳＡにおける、示された抗体濃度でのＧｒａｂｏｄｙ Ｂ（抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ）に基づく単一特異性ｃｈ１Ｅ４抗体および二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体によるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すグラフである。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ２＿ＶＬ２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ３＿ＶＬ２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ４＿ＶＬ２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ７＿ＶＬ２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂであった。 ＥＬＩＳＡにおける、示された抗体濃度でのＧｒａｂｏｄｙ Ｂに基づくｃｈ１Ｅ４および二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体によるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すグラフである。ＢｓＡｂは、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ５＿ＶＬ３）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ５＿ＶＬ５）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ６＿ＶＬ３）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ抗体；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ６＿ＶＬ４）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ５＿ＶＬ４）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂであった。 ＥＬＩＳＡにおける、示された濃度での組換えマウス１Ｅ４、ｃｈ１Ｅ４、およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）によるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにおける、示された抗体濃度でのＢｓＡｂ ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×ＧｒａｂｏｄｙおよびＢｓＡｂ ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂによるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにおける、本抗体および従来公知の抗体によるオリゴマーα－ｓｙｎの結合を示すグラフである。抗体は、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）；キメラ９Ｅ４抗体（ｃｈ９Ｅ４、別名プラシネズマブ；Ｒｏｃｈｅ／Ｐｒｏｔｈｅｎａ）；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）；ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ；ＮＩ－２０２（Ｂｉｏｇｅｎ）；およびマウスハイブリドーマ１Ｅ４（ｈｙ１Ｅ４）であった。 ＥＬＩＳＡにおける、ＢｓＡｂ ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂおよびｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂによるオリゴマーα－ｓｙｎの結合を示すグラフである。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された、ＢｓＡｂ ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂおよびｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂによるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すプロットのセットである。各プロットは、時間（秒）に対する共鳴単位（ＲＵ）を示す。データは、会合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄ）、および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）のような、α－ｓｙｎ ＰＦＦ／抗体結合の定量的特性を計算するために使用した。 ＳＰＲによって測定された、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂおよび市販の（単一特異性）抗α－ｓｙｎ抗体（ＢＡ１４９（ＢｉｏＡｒｃｔｉｃ）、ｃｈ９Ｅ４、およびＮＩ－２０２）によるα－ｓｙｎ ＰＦＦの結合を示すプロットのセットである。 ＳＰＲによって測定された、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、ｃｈ９Ｅ４、およびｈＩｇＧ１（陰性対照）による単量体α－ｓｙｎの結合を示すプロットのセットである。 ｃｈ１Ｅ４、ｃｈ９Ｅ４、またはｈＩｇＧ１（陰性対照）の存在下での、ＢＶ－２細胞（ミクログリア細胞）による細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を示すグラフである。「ｇＭＦＩ」：蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を用いて測定した幾何平均蛍光強度。 ｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ ＢまたはｈＩｇＧ１（陰性対照）の存在下での、ＴＨＰ－１細胞（単球）による細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を示すグラフである。 異なる濃度のｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ７＿ＶＬ２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ抗体、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ５＿ＶＬ５）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、またはｈＩｇＧ１の存在下での、ＢＶ２細胞による細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を示すヒストグラムである。 異なる濃度のｃｈ１Ｅ４（単一特異性）、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、またはｈＩｇＧ１の存在下における、ＢＶ２細胞による細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を示すグラフである。 異なる濃度のｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、ｃｈ９Ｅ４、またはｈＩｇＧ１の存在下における、ＢＶ２細胞による細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を示すグラフである。 異なる濃度のｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、またはｈＩｇＧ１の存在下における、ＢＶ２細胞による細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を示すグラフである。 大脳皮質、線条体、ならびに黒質緻密部（ＳＮｐｃ）および黒質網様部（ＳＮｐｒ）を含む黒質（ＳＮ）を含むマウスの脳切片におけるα－ｓｙｎの免疫組織化学を示す画像のセットである。脳切片は、ヒトα－ｓｙｎを過剰発現するｍＴｈｙ－１マウスに由来し、ｃｈ１Ｅ４、ｈｕ１１Ｆ１１、ＮＩ－２０２、ｃｈ９Ｅ４、またはＢＡ１４９抗体で染色した。 扁桃体、海馬のアンモン角（ＣＡ３）、ならびに歯状回の顆粒細胞層（ＧｒＤＧ）および歯状回の多形層（ＰｏＤＧ）を含む海馬の歯状回（ＤＧ）を含むマウスの脳切片におけるα－ｓｙｎの免疫組織化学を示す画像のセットである。脳切片はｃｈ１Ｅ４、ｈｕ１１Ｆ１１、ＮＩ－２０２、ｃｈ９Ｅ４、およびＢＡ１４９で染色した。脳組織は、ヒトα－ｓｙｎを過剰発現するｍＴｈｙ－１マウスに由来する。 パーキンソン病と診断されたヒト患者の死後脳組織におけるリン酸化α－ｓｙｎの免疫組織化学を示す画像のセットである。ｃｈ１Ｅ４および市販のＳｙｎ３０３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のリン酸化α－ｓｙｎ結合能力を隣接切片で比較した。 ｍＴｈｙ－１マウスの大脳皮質、海馬のＣＡ３、および黒質におけるｃｈ１Ｅ４およびｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂの分布を示す画像のセットである。抗α－ｓｙｎ抗体の量（単一特異性および二重特異性ｃｈ１Ｅ４の両方がヒトＩｇＧ１定常領域を含むため、ヒトＩｇＧ１のレベルによって定量化される）を、右の棒グラフに示す。 ｃｈ１Ｅ４またはｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂのｉｎ ｖｉｖｏ投与後のｍＴｈｙ－１マウスにおけるリン酸化α－ｓｙｎの免疫組織化学を示す画像のセットである。画像は、大脳皮質、扁桃体、および海馬の歯状回を示す。リン酸化α－ｓｙｎの定量化を右の棒グラフに示す。 ｈｕ１１Ｆ１１×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、および陰性対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）のｉｎ ｖｉｖｏ投与後のｍＴｈｙ－１マウスにおけるリン酸化α－ｓｙｎの免疫組織化学を示す画像および棒グラフのセットである。野生型（ＷＴ）マウスはヒトα－ｓｙｎを過剰発現しなかった。 パーキンソン病患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のドーパミン作動性ニューロンにおけるα－ｓｙｎ伝播の改善を示すグラフおよび画像のセットである。細胞を単一特異性ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）抗体とｈｕ１１Ｆ１１抗体を用いて１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌの用量で処理した。細胞はＤＡＰＩ（青）で標識し、チロシン水酸化酵素（ＴＨ；緑）の染色によりドーパミン作動性ニューロンを局在させ；α－ｓｙｎは赤で示す。

本開示は、α－シヌクレインに結合する抗体およびその抗原結合断片などの単離された結合タンパク質を提供する。これらの結合タンパク質は、特異的抗原結合配列を含むヒト化抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

抗体および抗原結合断片などのこれらの結合タンパク質は、α－シヌクレイン病の治療剤として好都合であるが、これは、単量体α－ｓｙｎとは対照的に、疾患に関連する凝集、オリゴマー、およびリン酸化形態のα－ｓｙｎに優先的に結合するためである。α－ｓｙｎ単量体は健康なヒトの脳および血液中に大量に存在し、神経伝達物質の放出を調節するのに重要な役割を果たす。しかし、α－シヌクレイン病患者の脳内には、典型的には、疾患に関連したα－ｓｙｎの凝集体は微量しか存在しない。抗α－ｓｙｎ抗体がα－ｓｙｎ単量体と凝集体の両方によく結合する場合、単量体がはるかに大量に存在するため、抗体のかなりの量が体内の単量体に結合することになる。その結果、抗体は病原性凝集体の除去に対する効果がほとんどない。さらに、治療用抗α－ｓｙｎ抗体が単量体形態にかなりの程度結合すると、α－ｓｙｎの正常な生理機能に悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、疾患関連形態に対する本発明のα－ｓｙｎ結合タンパク質の優先的結合は、α－ｓｙｎ関連疾患の治療において重要である。

さらに、本発明者らは、ヒト化抗体のような本発明の結合タンパク質が、それらが由来する親マウス抗体よりも高い親和性でα－ｓｙｎの疾患関連形態に結合することを驚くべきことに見出した。これらのヒト化抗体はまた、操作抗体の抗原結合親和性を維持するためにヒト化プロセス中に復帰変異を必要としないか、またはほとんど必要としないため、ヒト患者において低い免疫原性を有すると予測される。

本開示はまた、α－ｓｙｎおよびＩＧＦ１Ｒの両方に結合する抗体などの多重特異性（例えば、二重特異性）結合タンパク質を提供し、ここで、結合タンパク質のＩＧＦ１Ｒ結合部分は、脳血液関門を通過するタンパク質の能力を有意に改善し、疾患部位における結合タンパク質への患者の暴露を改善する。

本発明の結合タンパク質は、凝集したα－ｓｙｎおよびオリゴマーα－ｓｙｎに対する高親和性結合を示す点で、これまでの公知の抗α－ｓｙｎ抗体よりも優れている。この優位性は、抗α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ二重特異性フォーマットにおいても保持される。

特に断らない限り、本明細書においてα－シヌクレインはヒトα－シヌクレインを指す。ヒトα－シヌクレインポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＱＢＳ３（配列番号６０）で入手可能である。特に断らない限り、本明細書においてＩＧＦ１ＲはヒトＩＧＦ１Ｒを指す。ヒトＩＧＦ１Ｒポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８０６９（配列番号７７）で入手可能である。

Ｉ．α－Ｓｙｎ結合タンパク質
本明細書におけるα－ｓｙｎ結合タンパク質には、マウス由来の抗原結合ドメインを有するキメラまたはヒト化抗α－ｓｙｎ抗体が含まれる。本明細書において「抗体」という用語は、単一特異性および多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を含む。「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で使用する場合、ジスルフィド結合によって相互連結された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む四量体を指す場合がある。各重鎖は、重鎖可変領域またはドメイン（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域またはドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域が点在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分される。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲ（本明細書中、ＨＣＤＲは重鎖由来のＣＤＲを示し、本明細書中、ＬＣＤＲは軽鎖由来のＣＤＲを示す）および４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置されている。

所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら、５ｔｈ Ｅｄ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）（「Ｋａｂａｔ」系）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７３：９２７－４８）（「Ｃｈｏｔｈｉａ」系）；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６２：７３２－４５（「接触」系）；Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」系）；ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００１）３０９（３）：６５７－７０（「Ａｈｏ」系）；ならびにＷｈｉｔｅｌｅｇｇおよびＲｅｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（２０００）１３（１２）：８１９－２４（「ＡｂＭ」系）に記載されるものを含む、いくつかの周知の系によって画定することができる。所定のＣＤＲまたはＦＲの境界は、使用する系によって異なる場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ系は配列アライメントに基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ系は構造情報に基づいている。Ｋａｂａｔ系およびＣｈｏｔｈｉａ系の両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域の配列長に基づいており、挿入部分は例えば「３０ａ」のような挿入文字で対応する。この２つの系では、特定の挿入および欠失（「ｉｎｄｅｌ」）を異なる位置に配置するため、番号付けに差異が生じる。接触系は、複雑な結晶構造の解析に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ系と多くの点で類似している。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、Ａｈｏ、ＡｂＭ、またはその組合せから選択される系によって定義することができる。

本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）などの任意の免疫グロブリンアイソタイプであり得る。本明細書における抗体は、好ましくは、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、抗体の治療可能性を改善する変異、例えば、抗体のエフェクター機能を低減または排除する変異を含み得る（例えば、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０１８）９（１）：６３－７３を参照）。例えば、本明細書における単一特異性抗体または多重特異性抗体は、変異Ｌ２３５Ｅ、「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、または「ＬＡＬＡＧＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ）（Ｅｕ番号付け）を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含み得る。ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ変異（Ｅｕ番号付け）のような、抗体の血清中半減期を改善する変異を含んでいてもよい。ＩｇＧ定常領域は、抗体の製造および収率を改善する変異を含んでいてもよく；例えば、二重特異性抗体のノブインホール変異に関する以下の説明を参照のこと。このような変異ヒト定常領域は、本明細書では依然として「ヒト」定常領域とみなされる。

好ましい実施形態において、本開示の結合タンパク質は、ヒト化抗体、例えば、ヒト化ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲ（例えば、マウス）に由来し、全てまたは実質的に全てのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲ（すなわち、アクセプター）に由来する抗体である。ヒト化抗体はまた、ヒト抗体由来の抗体重鎖および／または軽鎖定常領域の少なくとも一部を含むことができる。ヒト化抗体が由来する非ヒト親抗体と比較して、ヒト化抗体はヒトに対する免疫原性が低下している。親抗体の特異性および親和性を維持するために、ヒトアクセプターのＦＲ残基の一部を非ヒト親抗体由来の対応する残基で置換してもよい（復帰変異）。

いくつかの実施形態において、本明細書における結合タンパク質は、完全（四量体）抗体の抗原結合断片である。本明細書における「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、従来の全長四量体構造を有しない、遺伝子操作および／または他の方法で改変された形態の免疫グロブリンを包含する。この用語は、イントラボディ、ペプチボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはｓＦｖ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、およびタンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖを包含する。

本開示のα－ｓｙｎ結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体１Ｅ４に由来する。マウス１Ｅ４親抗体のヒト化バージョンを、本明細書ではｈｕ１Ｅ４抗体と呼ぶ。いくつかの実施形態において、ｈｕ１Ｅ４抗体などの結合タンパク質またはその抗原結合断片は、以下のヒト化ＶＨ配列のうちの１つのＨＣＤＲの１つまたはそれ以上（例えば、２つまたは３つ）を含む。これらの配列は、ヒト化のためのアクセプターとして使用されるヒト生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１－０２と以下にアライメントされている。Ｋａｂａｔで定義されたＨＣＤＲは斜体で、ヒト生殖細胞系列配列からの変異は太字で下線が引かれている。

上記の配列において、ヒトＶＨ１－０２ ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３の配列は、それぞれ配列番号６１～６３と命名される。ＶＨｈｕ１Ｅ４＿ｖｅｒ．１～ｖｅｒ．９（ｈｕ１Ｅ４Ｖ１～Ｖ９とも呼ばれる）の配列は、各配列の末尾の括弧内の番号で示されるように、それぞれ配列番号１～９と命名される。Ｋａｂａｔ定義のＨＣＤＲ１～３配列は、それぞれ配列番号３３～３５と命名される。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるｈｕ１Ｅ４抗体または抗原結合断片などのα－ｓｙｎ結合タンパク質は、配列番号３３～３５に示すＨＣＤＲ１～３配列を含む。さらなる実施形態において、ヒト化抗体または抗原結合断片は、配列番号３３～３５に示すＨＣＤＲ１～３配列、ならびにヒトＶＨ１－０２由来の１つまたはそれ以上（例えば、２つまたは３つ）のＦＲ１～３を含む。特定の実施形態において、抗体または断片は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ１－０２遺伝子によってコードされる対応するＦＲに対して６個以下の変異（例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の変異）を有する重鎖ＦＲを含む。特定の実施形態において、本明細書における抗体または抗原結合断片は、生殖細胞系列のヒトＶＨ１－０２遺伝子によってコードされる対応するＦＲに対して、２個以下の変異を有する重鎖ＦＲ１、２個以下の変異を有する重鎖ＦＲ２、および／または６個以下の変異を有する重鎖ＦＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体または抗原結合断片は、ヒトＪＨ１、ＪＨ４、またはＪＨ５遺伝子由来のＦＲ４を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化１Ｅ４抗体または抗原結合断片は、ｈｕ１Ｅ４Ｖ１のＩＭＧＴ－定義ＨＣＤＲ１～３を含む。ＩＭＧＴ定義ＣＤＲは、以下のＶＨ配列において斜体であり、下線を引かれている：

ＩＭＧＴ定義ＨＣＤＲ１～３配列は、それぞれ配列番号６４～６６と命名される。

いくつかの実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合断片などのα－ｓｙｎ結合タンパク質は、以下のヒト化ＶＬ配列のうちの１つのＬＣＤＲの１つまたはそれ以上（例えば、２つまたは３つ）を含む。Ｋａｂａｔ定義ＬＣＤＲは斜体であり；ＬＣＨｕ１Ｅ４＿ＶＬ１との違いは太字および下線で示す。

ＬＣｈｕ１Ｅ４＿Ｖ１～Ｖ５（ｈｕ１Ｅ４＿ＶＬ１～ＶＬ５とも呼ばれる）の配列は、各配列の末尾の括弧内の番号で示されるため、それぞれ配列番号１１～１５と命名される。Ｋａｂａｔ定義ＬＣＤＲ１～３配列は、それぞれ配列番号３６～３８と命名される。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、ｈｕ１Ｅ４＿ＶＬ１のＩＭＧＴ定義ＬＣＤＲ１～３を含む。ＩＭＧＴ定義ＣＤＲは、以下のＶＬ１配列において斜体であり、下線が引かれている：

ＩＭＧＴ定義ＬＣＤＲ１～３配列は配列番号６７～６９と命名される。親マウス１Ｅ７ ＣＤＲ（例えば、ＩＭＧＴ－またはＫａｂａｔ－定義）は、アクセプターヒトκまたはλ軽鎖に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、アクセプター軽鎖は、ヒトκＶ２－２９（＊０２または＊０３）遺伝子に由来する。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片などのα－ｓｙｎ結合タンパク質は、ＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは、配列番号３３～３５に示すＨＣＤＲ１～３およびヒトＶＨ１－０２遺伝子由来のＦＲ１～３（各ＦＲは対応する生殖細胞系列のＦＲ配列から６個以下の変異を有する）を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号３６～３８に示すＬＣＤＲ１～３を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片などのα－ｓｙｎ結合タンパク質は、それぞれ配列番号６４～６９に示すＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片などのα－ｓｙｎ結合タンパク質は、配列番号１～９から選択されるＶＨおよび配列番号１１～１５から選択されるＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号１および１１に規定されるＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号２および１２に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号３および１２に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号４および１２に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号７および１２に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号５および１３に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号５および１５に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号６および１３に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号６および１４に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号５および１４に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号８および１４に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、それぞれ配列番号９および１４に示すＶＨおよびＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片は、ＶＨおよびＶＬを含み、ここでＶＨは、配列番号３３～３５に示すＨＣＤＲ１～３およびヒトＶＨ１－０２遺伝子由来のＦＲ１～３（対応する生殖細胞系列のＦＲ配列から６個以下の変異を有する各ＦＲ）を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号３６～３８に示すＬＣＤＲ１～３を含み；ここでＶＨは、配列番号１～９の１つと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一であり、および／またはＶＬは配列番号１１～１５の１つと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一である。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるヒト化抗体または抗原結合断片などのα－ｓｙｎ結合タンパク質は、それぞれ配列番号６４～６９に示すＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３を含み；ここで、ＶＨは、配列番号１～９の１つと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一であり、および／またはＶＬは、配列番号１１～１５の１つと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一である。

参照ポリペプチド配列に関するパーセント（％）配列同一性または相同性は、配列をアライメントさせ、必要に応じてギャップを導入してパーセント配列同一性を最大にした後の、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列のパーセント同一性を決定するためのアライメントは、利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて様々な方法で達成することができる。配列をアライメントさせるための適切なパラメータは、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含めて決定することができる。いくつかの実施形態において、クエリー配列は、参照配列の長さの少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、または９５％）を有する。本明細書において、配列相同性または同一性は、デフォルトのパラメータを使用して、米国国立生物工学情報センターのサーバーで利用可能なバイオインフォマティクスプログラムであるＢＬＡＳＴによって同定し得る。

単一特異性および二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体を含む本開示のα－ｓｙｎ結合タンパク質は、疾患関連形態のα－ｓｙｎ、例えば、凝集した前原線維、前形成原線維（ＰＦＦ）、またはオリゴマー形態に高親和性で特異的に結合する。結合タンパク質はまた、疾患関連リン酸化α－ｓｙｎ（例えば、アミノ酸残基１２９でリン酸化されたα－ｓｙｎ（ｐ－１２９α－ｓｙｎ））に特異的に結合し得る。本開示において「特異的に」結合するとは、結合の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、または０．０１ｎＭ以下であることを意味する。Ｋ_Ｄは、任意の適切なアッセイによって測定し得る。特定の実施形態では、Ｋ_Ｄは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）またはＯｃｔｅｔ（登録商標）機器を用いる）を用いて測定することができる。抗体の特異的結合はまた、アイソタイプ対照抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっても実証し得る。

いくつかの実施形態において、ｈｕ１Ｅ４抗体または関連断片などの結合タンパク質は、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭまたは１０ｐＭ以下のＫ_Ｄで疾患関連形態のα－ｓｙｎに結合し、場合によって、単量体α－シヌクレインに結合しない。特定の実施形態において、本明細書における単一特異性または二重特異性抗体は、５０ｐＭ以下のＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎに結合する。特定の実施形態において、単一特異性または二重特異性抗体は、２０ｐＭ以下のＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎと結合する。特定の実施形態において、単一特異性または二重特異性抗体は、１０ｐＭ以下のＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎと結合する。特定の実施形態において、単一特異性または二重特異性抗体は、５ｐＭ以下のＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎと結合する。特定の実施形態において、単一特異性または二重特異性抗体は、４ｐＭ以下のＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎと結合する。特定の実施形態において、単一特異性または二重特異性抗体は、３ｐＭ以下のＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎと結合する。特定の実施形態において、単一特異性または二重特異性抗体は、２ｐＭのＫ_Ｄで凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎと結合する。結合Ｋ_Ｄを決定するためのアッセイは、以下の実施例６に詳細に記載されるように実施されるＳＰＲアッセイであり得る。

さらに、結合タンパク質は、ミクログリア細胞および／または単球／マクロファージによる凝集またはオリゴマーα－ｓｙｎの貪食を促進し、α－ｓｙｎの疾患関連形態（例えば、凝集、オリゴマー、およびリン酸化形態）の除去を促進し、および／またはニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン）間でのα－ｓｙｎの疾患形態の伝播を阻害するのに非常に有効となり得る。

ＩＩ．二重特異性結合タンパク質
本開示はまた、多重特異性、例えば二重特異性であるｈｕ１Ｅ４抗体などのα－ｓｙｎ結合タンパク質を提供する。これらの多重特異性または二重特異性結合タンパク質は、α－ｓｙｎおよびＩＧＦ１Ｒの両方に特異的である。ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、結合タンパク質のＩＧＦ１Ｒへの効率的な結合および血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る結合タンパク質のシャトリングを可能にし、α－ｓｙｎ結合部分は、凝集またはオリゴマーのα－ｓｙｎ結合および脳からのクリアランスを可能にする。したがって、このような多重特異性、例えば、二重特異性結合タンパク質（例えば、抗体）は、α－シヌクレイン病の治療に特に有用である。

特定の実施形態において、本明細書における二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体は、単一特異性ｈｕ１Ｅ４抗体もしくはキメラ１Ｅ４抗体、または先行抗α－ｓｙｎ抗体よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または６倍高い速度でＢＢＢを通過する。いくつかの実施形態において、二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体は、単一特異性ｈｕ１Ｅ４抗体もしくはキメラ１Ｅ４抗体、または先行抗α－ｓｙｎ抗体よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または６倍高い速度で、大脳皮質、海馬、および／または黒質に到達する。

ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、ペプチドリンカーを介してｈｕ１Ｅ４抗体に融合させることができる。ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、例えば、ペプチドリンカーを介して、ｈｕ１Ｅ４抗体の重鎖の一方もしくは両方、および／またはｈｕ１Ｅ４抗体の軽鎖の一方もしくは両方のＮ末端および／またはＣ末端に融合していてもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを主に含み得る。ペプチドリンカーは、２つの分子がそれぞれの所望の活性を維持するように、互いに対して正しいコンフォメーションを想定するように連結するのに適切な長さを有し得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、１～５０（例えば、１～３０または１～２０）アミノ酸長である。有用なリンカーとしては、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号７０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７１）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７２）を含み、ここでｎが少なくとも１の整数であるグリシン－セリンポリマー；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；ＸＴＥＮリンカー；および他の可撓性リンカーが挙げられる。抗体断片または単鎖可変断片を連結するための追加の例示的なリンカーとしては、ＡＡＥＰＫＳＳ（配列番号７３）、ＡＡＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧ（配列番号７５）、またはＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７６）が挙げられる。

いくつかの実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、それぞれ配列番号５１～５３に示すＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号４６～４８に示すＬＣＤＲ１～３を含む抗体またはその抗原結合断片を含む。

さらなる実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、それぞれ配列番号５１～５３に示すＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号４６～４８に示すＬＣＤＲ１～３を含む抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖを含む。

いくつかの実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、上記のようなペプチドリンカーによって連結された、それぞれ配列番号５０および４５に示すＶＨおよびＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは配列番号４９を含む。特定の実施形態において、この部分は、配列番号５４を含む。特定の実施形態において、その部分は、配列番号５０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一のＶＨ、および／または配列番号４５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一のＶＬを含む。

さらなる実施形態において、ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、上記のようなペプチドリンカーによって連結された、それぞれ配列番号５０および４５に示すＶＨおよびＶＬを含む抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは配列番号４９を含む。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号５４を含む。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号５０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一のＶＨ、および／または配列番号４５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一のＶＬを含む。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号５４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一である配列を含む。

さらなる実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体であり、上記の抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖはその両方の重鎖のＣ末端に、場合によりペプチドリンカーを介して、融合している。

さらなる実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体であり、上記の抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖは、その重鎖の一方のみのＣ末端に場合によりペプチドリンカーを介して、融合している。これらの実施形態において、二重特異性抗体は２つの異なる重鎖を有する（一方は抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖを有し、他方は有さない）。したがって、製造時に２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を促進するために、物理的（例えば、立体障害、「ノブ」を「ホール」に入れる）または生化学的（例えば、静電相互作用）に同じタイプの重鎖の結合を抑止するために変異を重鎖に導入することができる。例えば、ノブインホール（ＫＩＨ）変異を導入して、優先的に互いに対合する「ノブ」重鎖および「ホール」重鎖を作製することができる。例示的なＫＩＨ変異は、一方の重鎖にＴ３６６Ｗ、他方の重鎖にＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む（全てＥｕ番号付け）。国際公開第２００９／０８９００４号および米国特許第８，６４２，７４５号；ならびにＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＭＡｂｓ．（２０１７）９（２）：１８２－２１２も参照されたい。

いくつかの実施形態において、ｈｕ１Ｅ４抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、ＫＩＨ変異を含み、例えば、配列番号５５（抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ配列を含む）からなるホール重鎖定常領域および配列番号３９を含むノブ重鎖定常領域を有する。

いくつかの実施形態において、ｈｕ１Ｅ４抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、ＫＩＨ変異およびＭ４２８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号５６（抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ配列を含む）を含むホール重鎖定常領域および配列番号４１を含むノブ重鎖定常領域を有する。

特定の実施形態において、ｈｕ１Ｅ４抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号５７を含むホール重鎖および配列番号５８を含むノブ重鎖、ならびにそれぞれ配列番号５９を含む２つの軽鎖を含む。

特定の実施形態において、ｈｕ１Ｅ４抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一である配列を含むホール重鎖、および配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一である配列を含むノブ重鎖、ならびにそれぞれ配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）相同または同一である配列を含む２つの軽鎖を含む。

ＩＩＩ．α－Ｓｙｎ結合タンパク質の作製
結合タンパク質は、タンパク質の各鎖をコードする発現構築物のような単離された核酸分子を用いて組換え的に産生し得る。本明細書中で「単離された」または「精製された」と称する生体分子（例えば、核酸またはポリペプチド）分子は、（１）その起源の生体分子（例えば、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡの核酸、またはポリペプチド）から分離されたもの；および／または（２）自然界に存在しないものである。各ポリペプチド鎖のコード配列は、単一のベクターにクローニングしても、または別々のベクターにクローニングしてもよい。

抗体のようなタンパク質を生産する方法は周知である。抗体のような本発明の結合タンパク質は、適切な発現構築物を用いて、例えば哺乳動物宿主細胞において産生し得る。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多数の他の細胞株が含まれる。他の使用し得る細胞株は、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞株および酵母細胞株である。細胞株はその発現レベルに基づいて選択し得る。結合タンパク質は、遠心分離、超遠心分離、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬ精製、および／またはイオン交換クロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて、宿主細胞培養物から単離精製することができる。

ＩＶ．医薬組成物および使用
本開示はまた、本明細書の単一特異性結合タンパク質および多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」、または「希釈剤」に関して「薬学的に許容される」とは、適切な溶媒、分散媒体、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤などを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は滅菌水溶液であり、緩衝剤；界面活性剤；ポリオール；酸化防止剤；および／またはキレート剤を含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥形態で提供され、投与前に再構成される。特定の実施形態において、凍結乾燥抗体製剤は、増量剤を含み得る。

医薬組成物は、非経口投与（例えば、注射または注入）によって患者に投与し得る。例えば、医薬組成物は、静脈内、脳内、頭蓋内、または脊髄経路によって投与し得る。

本明細書における結合タンパク質を含む医薬組成物は、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、およびアルツハイマー病の特定の形態（例えば、扁桃体レビー小体を伴うアルツハイマー病）などのα－シヌクレイン病を有する、または発症する危険性のあるヒト患者の治療に有用である。本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、疾患または状態の重症度の軽減；疾患または状態の持続期間の短縮；疾患または状態に関連する１つまたはそれ以上の症状の改善または除去；または疾患または状態を有する対象への有益な効果の提供をもたらす、生理学的疾患状態への意図的な介入を指す。治療は、基礎となる疾患または状態を治癒することを必要としない。

医薬組成物は、医療提供者によって適切であると決定された投与強度および投与頻度で患者に提供される。治療上有効量は、治療されるべき疾患または苦痛に関連する１つまたはそれ以上の症状を改善するのに十分な量である。本明細書における結合タンパク質の「治療上有効量」、「有効用量」、「有効量」、または「治療上有効な投与量」は、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患苦痛に起因する機能障害もしくは障害（例えば、認知能力もしくは運動能力）の予防もしくは遅延によって証明されるように、対象を疾患の発症から保護するか、または疾患の退縮もしくは安定化を促進する。

本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。

キメラ抗α－Ｓｙｎ抗体の作製
国際公開第２０１８／１２８４５４号に開示されたマウス抗α－ｓｙｎ抗体１Ｅ４クローンに基づいてキメラ１Ｅ４（ｃｈ１Ｅ４）抗体を作製した。１Ｅ４抗体を得るために抗原として使用した全長ヒトα－ｓｙｎのアミノ酸配列を、配列番号６０に記載する。マウス１Ｅ４の重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号３３～３５（Ｋａｂａｔ定義）に記載されており、マウス１Ｅ４の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号３６～３８に記載されている。

ｃｈ１Ｅ４を作製するために、マウス１Ｅ４のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒトＩｇＧ１およびκ定常領域を哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）にクローニングした。各可変領域のコード配列は、ＣＨＯコドンに最適化された短ヌクレオチド断片であるｇＢｌｏｃｋ（Ｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ）の形で合成した。ｇＢｌｏｃｋは、ベクター断片と約２０ｂｐ重なるように合成し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ法を用いてクローニングを行った。

次に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞を発現構築物でトランスフェクションした。トランスフェクションは、ＤＮＡ２００μｇ／ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞２００ｍＬ／１Ｌの三角フラスコで行った。その後、抗体産生をスケールアップするため、細胞を１２日間インキュベートした。得られた細胞培養物を遠心分離し、上清を孔径０．２μｍのフィルタで濾過して浮遊物を除去した。

濾過した上清を、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１１－００３４－９４）を用いて精製した。必要に応じて、精製画分をＨｉＬｏａｄ（登録商標）２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）に通すことにより二次精製を行った。質量分析を用いて精製キメラ抗体のアミノ酸配列を確認した。

Ｃｈ１Ｅ４は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＶＨ（ｃｈ１Ｅ４－ＶＨ）および配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＶＬ（ｃｈ１Ｅ４－ＶＬ）を含むＩｇＧ型一価抗体である。

ヒト化抗α－Ｓｙｎ抗体の作製
マウス１Ｅ４のヒト化バージョンも作製した。最初に、マウス１Ｅ４のＶＨおよびＶＬの遺伝子配列に基づいて、相同性に基づく分子モデリングを行った。このモデリングから、マウスフレームワークと高い相同性を有するヒトフレームワークをアクセプターとして選択した。マウスＣＤＲを、選択したヒトフレームワークに移植して、ヒト化抗体のライブラリーを作製した。

ヒト化のプロセスで抗原結合親和性が失われるのを防ぐために、抗原結合親和性に重要であると考えられる特定の位置にマウス配列を導入するために、ヒトフレームワークに復帰変異を加えることがある。このような復帰変異は、ヒト化抗体の「ヒトらしさ」を低下させ得る。作製されたヒト化ＶＨおよびＶＬのヒトらしさを評価するために、ヒト生殖細胞系列の配列に基づいてＩＭＧＴ（％）スコアを算出し、ＩＭＧＴスコアが高いほどヒトらしさが高いことを意味する。ヒト化１Ｅ４ ＶＨ（配列番号１～９）の９つのバージョン（ｖｅｒ．１～ｖｅｒ．９）およびヒト化１Ｅ４ ＶＬ（配列番号１１～１５）の５つのバージョン（ＶＬ１～ＶＬ５）の結果をそれぞれ表１および表２に示す（ＢＭ：復帰変異）。

Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析に基づくと、Ｖｅｒ．１（ＨＣ）およびＶＬ１（ＬＣ）のフレームワーク領域が、必要な復帰変異が少なく、ＩＭＧＴスコアが高いことから、最もヒトに近いと考えられた。

次に、ヒト化ＶＨおよびＶＬの様々な組合せを、それぞれヒトＩｇＧ１およびκ定常領域に融合し、「ｈｕ１Ｅ４（Ｖ＃＿ＶＬ＃）」（または「ｈｕ１Ｅ４（Ｖｅｒ．＃＿ＶＬ＃）」）と称する１２のヒト化１Ｅ４（ｈｕ１Ｅ４）抗体クローンを作製した。表３は、これら１２のヒト化１Ｅ４抗体をリスト化しており、ＶＨおよびＶＬの配列番号は括弧内に示されている。ヒト化抗体はヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされた。

抗α－Ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ二重特異性抗体の作製
次に、α－ｓｙｎおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異性抗体を作製した。ＩＧＦ１Ｒ結合部分は、血液脳関門を介した受容体媒介トランスサイトーシスを促進し、抗α－ｓｙｎ抗体の一方または両方の重鎖のＣ末端に融合される。本実施例では、各二重特異性抗体は、ＩＧＦ１Ｒ結合ｓｃＦｖのＮ末端ＶＬが、Ｆｃドメインにノブインホール変異を有する抗α－ｓｙｎ抗体に融合した構造を有していた。抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーを介して、「ホール」変異を含む重鎖（「ホール重鎖」）のみに融合した。

抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖは、国際公開第２０２０／２５１３１６号に記載されているＦ０６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）クローンに基づくものであった。ｓｃＦｖ形態の一価のコンジュゲートされたＦ０６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）は、本明細書では「Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ」と称する（配列番号５４）。Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ（配列番号４５）、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（配列番号４９）、およびＶＨ（配列番号５０）から構成される。Ｇｒａｂｏｄｙ ＢのＬＣＤＲ１～３は、それぞれ配列番号４６～４８に記載されており、そのＨＣＤＲ１～３は、それぞれ配列番号５１～５３に記載されている。

抗α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ二重特異性抗体は、構造的に非対称であった。これらはそれぞれ、ペプチドリンカー（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号４４）を介してＧｒａｂｏｄｙ ＢのＮ末端にそのＣ末端で連結された１つの抗α－ｓｙｎ ＩｇＧ１重鎖、およびＧｒａｂｏｄｙ Ｂに連結されていない１つの抗α－ｓｙｎ ＩｇＧ１重鎖を含んでいた。抗体産生中にこのヘテロ二量体重鎖の組合せを促進するために、ノブインホール（ＫＩＨ）変異をＩｇＧ１重鎖Ｆｃドメインに導入した。「ホール」変異はＣＨ３ドメインのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０６Ｖであり、「ノブ」変異はＣＨ３ドメインのＴ３６６Ｗに置換された（全てＥｕ番号付けによる）。ノブ変異が導入されたＩｇＧ１重鎖定常領域の配列は配列番号３９に記載されており；ホール変異が導入されたＩｇＧ１重鎖定常領域の配列は配列番号４０に記載されている。Ｍ４２８Ｌ変異がさらに導入された「ノブ」ＩｇＧ１重鎖定常領域の配列は配列番号４１に記載されており；Ｍ４２８Ｌ変異がさらに導入された「ホール」ＩｇＧ１重鎖定常領域の配列は配列番号４２に記載されている。Ｍ４２８Ｌ変異は、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、その結果ｉｎ ｖｉｖｏでリサイクルすることにより、抗体の血清中半減期を増加させるために導入した。

特に断らない限り、ｈＩｇＧ１重鎖定常領域（ノブ）（Ｍ４２８Ｌ）（配列番号４１）およびｈＩｇＧ１重鎖定常領域（ホール）（Ｍ４２８Ｌ）（配列番号４２）を用いて二重特異性抗体を構築した。ヒトκ軽鎖（配列番号４３）を軽鎖の供給源として使用した。

抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ（ｈＩｇＧ１（定常）－Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ（ホール））に連結されたｈＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号５５に示す配列を有する。抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖに連結されていないｈＩｇＧ１重鎖定常領域（ｈＩｇＧ１（定常）（ノブ））は、配列番号３９に示す配列を有する。ｈＩｇＧ１重鎖定常領域－ｈＩｇＧ１（定常、Ｍ４２８Ｌ）－Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ（ホール）およびｈＩｇＧ１（定常、Ｍ４２８Ｌ）（ノブ）は、それぞれ配列番号５６および４１に示す配列を有し、ここで重鎖は両方がＭ４２８Ｌ変異を含む。

二重特異性抗体は、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞（Ｇｉｂｃｏ）に、ホール重鎖、ノブ重鎖、および軽鎖をコードする発現ベクターを０．５：０．５：１の割合でトランスフェクションすることにより作製した。トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｇｉｂｃｏ）に３×１０^６～４×１０^６の生存細胞／ｍＬの濃度で播種した後、８％ＣＯ_２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。

トランスフェクションの当日、細胞を、９５％以上の生存率を有する７×１０^６～１０×１０^６の生存細胞／ｍＬの濃度から、６×１０^６の生存細胞／ｍＬの濃度まで新鮮な培地で希釈した。

親細胞のトランスフェクションには、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ）を用いた。プラスミドＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を作製した。この複合体を冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で播種した。得られた混合物を室温で５分間保ち、親細胞に添加した。トランスフェクションの１日後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ ＥｎｈａｎｃｅｒおよびＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄをトランスフェクト細胞に添加した。トランスフェクションの５日後、２回目のＦｅｅｄを細胞培養に添加した。８％ＣＯ_２、３７℃、および１２０ｒｐｍの条件下で１０日間培養した後、細胞培養物を遠心ボトルに移し、４℃、および６，５００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清を０．２μｍフィルタで濾過して浮遊物を除去し、さらに精製して二重特異性抗体を得た。

α－Ｓｙｎ前形成原線維に対する抗体親和性の評価のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ試験
サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑのヒトα－ｓｙｎ ＰＦＦ（ヒトα－シヌクレイン前形成原線維ＩＩ型、ＳＰＲ－３１７）を用いて、１Ｅ４キメラ抗体およびヒト化抗体のα－ｓｙｎ前形成原線維（ＰＦＦ）に対する結合親和性を解析するものであった。具体的には、抗体をＰＢＳで４００ｎＭから０．００９ｎＭまで６倍連続希釈した。希釈した抗体を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、コーティングした。プレートを密閉し、４℃で１６時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で５回洗浄した後、プレートを、５％ＢＳＡのＰＢＳ中２００μＬ／ウェルで３７℃、２時間ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、α－ｓｙｎ ＰＦＦ（２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、２％ＢＳＡのＰＢＳ中）をプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、７Ｂ７－ビオチン抗体（抗α－ｓｙｎ抗体；１μｇ／ｍＬ／１００μＬ／ウェル、２％ＢＳＡのＰＢＳ中）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、プレートを２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（１：５０００、１ｍｇ／ｍＬストック、２０ｎｇ／ウェル、１００μＬ／ウェル）と共に、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（１００μＬ／ウェル）を添加し、室温で５分間インキュベートした。０．５ＮのＨ_２ＳＯ_４（５０μＬ／ウェル）を添加することによって反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーを用いて測定し、読み取り値から６５０ｎｍの吸光度を差し引いた。

図１および図２は、キメラおよび単一特異性ヒト化１Ｅ４抗体のＰＦＦへの結合の結果を示す。以下の表４および表５は、ＥＬＩＳＡからの、キメラ１Ｅ４抗体および選ばれた単一特異性ヒト化１Ｅ４（ｈｕ１Ｅ４）抗体のＥＣ_５０値を示す。

これらのデータは、試験したキメラ抗体およびヒト化１Ｅ４抗体の全てがα－ｓｙｎ ＰＦＦに対して高い結合親和性を示し、ヒト化抗体はキメラ抗体よりも高い結合親和性を示したことを示している。キメラ抗体は親マウス１Ｅ４抗体のＶＨおよびＶＬを含むため、これらの結果はヒト化プロセスにより１Ｅ４抗体の抗原結合親和性が改善されたことを示している。

図３および図４は、キメラおよび二重特異性１Ｅ４抗体のＥＬＩＳＡ結果を示す。以下の表６および表７は、サンドイッチＥＬＩＳＡによるこれらの抗体のＥＣ_５０値を示す。

上記のデータは、試験した二重特異性抗体の全てがα－ｓｙｎ ＰＦＦに対して高い結合親和性を示し、いくつかはキメラ抗体よりも高い結合親和性を示したことを示している。

次に、α－ｓｙｎ ＰＦＦに対する結合親和性を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて評価し、上記のようにマウス１Ｅ４（ｒｍ１Ｅ４）、キメラ１Ｅ４（ｃｈ１Ｅ４）、および単一特異性ヒト化１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）の間で直接比較した。以下の図５および表８に示すように、ｈｕ１Ｅ４抗体は、マウスまたはキメラ１Ｅ４と比較して、α－ｓｙｎ ＰＦＦに対してより高い親和性を示した。

α－ｓｙｎ ＰＦＦに対する結合親和性もサンドイッチＥＬＩＳＡで評価し、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）および別のマウス抗α－ｓｙｎ抗体のヒト化バージョンであるｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（国際公開第２０１９／０９８７６３号参照）の間で比較した。両抗体は、実施例３に記載したように融合Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂを含むように構成した。図６および表９に示すように、二重特異性「ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ」抗体は、二重特異性「ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ」抗体よりもα－ｓｙｎ ＰＦＦに対してはるかに高い親和性を示した。

オリゴマーα－Ｓｙｎに対する抗体親和性の評価のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
α－ｓｙｎのＰＦＦとは異なり、ドーパミンＨＣｌ安定化α－ｓｙｎオリゴマーはβシートをほとんど持たず、オリゴマーが小さい球状の形態を有するために、ＰＦＦとは異なる種類の凝集体であると考えられる。α－ｓｙｎ ＰＦＦおよびドーパミンＨＣｌ安定化α－ｓｙｎオリゴマーに結合する抗体は、パーキンソン病などのシヌクレイン病の様々な段階にある患者の脳に存在する様々な種類の凝集体に広く作用し得る。

オリゴマーα－ｓｙｎに対するｈｕ１Ｅ４抗体の結合親和性を評価し、既存の抗α－ｓｙｎ抗体と比較するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを、単一特異性ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）、二重特異性ｈｕ１Ｅ４（ｖｅｒ．１＿ＶＬ１）× Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ、単一特異性ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、キメラ９Ｅ４抗体（Ｒｏｃｈｅ）、ＮＩ－２０２抗体（Ｂｉｏｇｅｎ）、およびマウス１Ｅ４抗体であるｈｙ１Ｅ４を用いて、上記のように実施した。ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑのヒトα－ｓｙｎオリゴマー（ドーパミンＨＣＬ安定化ヒト組換えα－シヌクレインオリゴマー、ＳＰＲ－４６６）を、アッセイにおけるオリゴマーα－ｓｙｎとして使用した。

このサンドイッチＥＬＩＳＡでは、試験抗体をＰＢＳで８０ｎＭから０．００５ｎＭまで５倍連続希釈した。連続希釈した抗体を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、コーティングした。プレートを密閉し、４℃で１６時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、プレートを５％ＢＳＡのＰＢＳ中 ２００μＬ／ウェルで３７℃、２時間ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、オリゴマーα－ｓｙｎ（２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、２％ＢＳＡのＰＢＳ中中）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、７Ｂ７－ビオチン抗体（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、２％ＢＳＡのＰＢＳ中）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、プレートを２％ＢＳＡのＰＢＳ中ストレプトアビジン－ＨＲＰ （１：５０００、１ｍｇ／ｍＬストック、２０ｎｇ／ウェル、１００μＬ／ウェル）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した後、ＴＭＢ（１００μＬ／ウェル）を添加し、室温で５分間インキュベートした。０．５ＮのＨ_２ＳＯ_４（５０μＬ／ウェル）を添加することによって反応を停止させた。４５０ｎＭにおける光学吸光度を、プレートリーダーを用いて測定し、６５０ｎｍにおける吸光度を読み取り値から差し引いた。

以下の図７および表１０に示すように、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）およびその二重特異性バージョンは、試験した他の全ての比較物質よりもα－ｓｙｎオリゴマーによく結合した。

これらの結果は、本発明のヒト化１Ｅ４抗体の単一特異性および二重特異性形態の両方が、既存の市販の抗α－ｓｙｎ抗体と比較して、優れた結合親和性を示したことを示唆している。

次に、オリゴマーα－ｓｙｎに対する結合親和性を評価し、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂとの二重特異性抗体フォーマットのｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）およびｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）の間で比較した。図８および表１１に示すように、「ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ」二重特異性抗体は、「ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ」二重特異性抗体よりもオリゴマーα－ｓｙｎに対して高い結合性を示した。

α－Ｓｙｎ ＰＦＦに対する抗体結合親和性のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行い、キメラ抗体およびヒト化抗α－ｓｙｎ １Ｅ４抗体の結合親和性を定量的に分析した。使用した機器はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、モデルＴ２００）である。プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ：２９－１２７５－５６）をチップとして使用し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ：ＢＲ－１００３－５４）を再生緩衝剤として使用し、ＨＢＳ－ＥＰをランニング緩衝剤および分析物希釈およびサンプル希釈緩衝剤として使用した。抗体を１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰで希釈し、α－ｓｙｎ原線維タンパク質溶液（ＰＦＦ、２．６ｍｇ／ｍＬ）（分析物）を２倍に連続希釈し、０、０．１５６２５、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５ｎＭの濃度で６サンプルを分析した。捕捉相は接触時間６０秒で行い、流速３０μＬ／分を安定化期間６０秒に使用し、原線維の目標共鳴単位（ＲＵ）は１０（理論値）に設定した。会合相では、会合時間を６０秒に設定し、流速を６０μＬ／分に設定した。解離相では、解離時間を１８０秒に設定し、流速を６０μＬ／分に設定した。再生相では、流速を３０μＬ／分に設定し、再生時間を６０秒に設定した。フィッティングには１：１結合モデルを使用し、評価にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。

表１２に示すように、いくつかのヒト化１Ｅ４クローンは、キメラ１Ｅ４と同程度の結合親和性レベルを示し、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）のようなクローンは、キメラ１Ｅ４と比較して優れた結合親和性を示すものさえあった。ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）はｃｈ１Ｅ４よりも優れたｋ_ｄ値を有し、これはｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）が一旦α－ｓｙｎに結合すると、結合を維持し、容易に解離しないことを意味している。これは高い親和性（低いＫ_Ｄ値）からも証明できる。ヒト化の間マウス抗体およびキメラ抗体の初期結合親和性を維持することは通常困難であるため、これらの結果は驚くべきものである。

ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）クローンをＧｒａｂｏｄｙ Ｂとの抗α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ二重特異性抗体にフォーマットした。次いで、α－ｓｙｎ ＰＦＦに対する抗体の結合親和性を上記のように試験した。表１３に示すように、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）単一特異性抗体および二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、１：１結合モデルにおいて同様のＫ_Ｄ値を有することが確認された。これらのデータは、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ部分は、ｈｕ１Ｅ４を二重特異性抗体のパートナーとして用いた場合、α－ｓｙｎ ＰＦＦに対する結合親和性に悪影響を及ぼさなかったことを示唆している。

様々なヒト化１Ｅ４クローンを、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂと共に抗α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ ＢｓＡｂとして作製し、ＰＦＦに対する親和性を上記のように試験し、ｃｈ１Ｅ４のＳＰＲ結果と比較した。表１４に示すように、二重特異性ヒト化１Ｅ４抗体も１：１結合モデルでキメラ１Ｅ４に匹敵する結合親和性を示した。ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）のようないくつかのクローンは、単一特異性キメラ１Ｅ４抗体と比較して、ＢｓＡｂフォーマットで優れた結合親和性を示した。

ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）の既存の抗α－ｓｙｎヒト化抗体ｈｕ１１Ｆ１１に対する優位性を確認するために、ＳＰＲ解析を用いてｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂおよびｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂのα－ｓｙｎ ＰＦＦに対する結合親和性を定量的に解析した。使用した機器はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）であった。酢酸緩衝剤（ｐＨ５．０）で希釈した抗ｈＦａｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５２６０－１ＭＬ）をアミンカップリングによりＣＭ３チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面に固定化した。次に、試験品をＨＢＳ－ＥＰ緩衝剤で希釈し、希釈したサンプルを約１０ＲＵ（ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂの場合）または５０ＲＵ（ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂの場合）で３０μＬ／分で抗ｈＦａｂチップ表面で捕捉した。α－ｓｙｎ ＰＦＦを、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂでは０、０．０１２、０．０３７、０．１１１、０．３３３、１ｎＭ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂでは０、０．１１１、０．３３３、１、３、９ｎＭの濃度で３倍連続希釈でＨＢＳ－ＥＰ緩衝剤によって希釈した。各希釈α－ｓｙｎ ＰＦＦ溶液を６０μＬ／分で抗体捕捉チップ表面に６０秒間注入し、その後ＨＢＳ－ＥＰ（１Ｘ）緩衝剤で１８０秒間表面を洗浄した。会合相および解離相の全ての手順はシングルサイクルキネティクスで行った。フィッティングには１：１結合モデルを用い、評価にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した。

表１５および図９に示す結果は、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）ＢｓＡｂがｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）二重特異性抗体よりもはるかに優れたα－ｓｙｎ ＰＦＦ結合親和性を有していたことを示す。

ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂと他の市販の抗α－ｓｙｎ抗体との間で、α－ｓｙｎ ＰＦＦに対する結合親和性を上記のＳＰＲ分析により評価し、比較した。表１６および図１０のデータは、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂはα－ｓｙｎ ＰＦＦに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が２．５×１０^－１１Ｍであり、既存の抗α－ｓｙｎ抗体と比較して優れたα－ｓｙｎ ＰＦＦ結合親和性を示したことを示す。

これらのデータは、ＢｓＡｂの形態であっても、本開示のヒト化抗体は、既存の抗α－ｓｙｎ単一特異性抗体と比較して、優れたα－ｓｙｎ ＰＦＦ結合親和性を有することを示している。

α－Ｓｙｎ単量体に対する抗体結合親和性のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価
単量体α－ｓｙｎに対するｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ８＿ＶＬ４）の結合親和性を評価し、既存の抗α－ｓｙｎ抗体ｃｈ９Ｅ４（Ｒｏｃｈｅ／Ｐｒｏｔｈｅｎａ；プラシネズマブ）と比較した。陰性対照として無関連のヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を用いた。単量体α－ｓｙｎ（活性ヒト組換えα－シヌクレインタンパク質モノマーＩＩ型、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ、ＳＰＲ－３１６）との結合親和性を定量的に解析するためにＳＰＲ解析を用いた。使用した機器はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００であった。抗α－ｓｙｎ単一特異性抗体または抗α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ二重特異性抗体を１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰＴで希釈した。希釈した抗体サンプルは、プロテインＡチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ：２９－１２７５－５６）の表面に３０μＬ／分で約８００ ＲＵで捕捉した。α－シヌクレイン単量体を１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ緩衝剤で５０ｎＭから３．１２５ｎＭまで２倍連続希釈した。各希釈単量体サンプルを６０μＬ／分でプロテインＡチップ表面に６０秒間注入し、続いて１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ緩衝剤で洗浄した。解離速度は１８０秒間評価した。会合／解離相の全ての手順は、シングルサイクルキネティクスで行った。チップ表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をチップ表面に３０μＬ／分で６０秒間注入し、残存するα－ｓｙｎ単量体／抗体複合体を除去することにより再生した。フィッティングには１：１結合モデルを使用し、評価にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した。

表１７～１９および図１１のデータは、本開示の単一特異性および二重特異性ｈｕ１Ｅ４抗体が、単量体α－ｓｙｎに対して非常に低い結合親和性を示したことを示している。対照的に、ｃｈ９Ｅ４抗体は単量体に対して強い親和性で結合した。

これらの結果は、本開示の抗α－ｓｙｎ抗体がα－ｓｙｎ凝集体に優先的に結合し、α－ｓｙｎ単量体に対しては検出可能な結合親和性を有さないことを示す。

抗体収率の評価
マウス、キメラ、およびヒト化１Ｅ４抗体をコードする発現構築物を用いて、上記のように宿主細胞をトランスフェクションした。細胞内で産生された抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）（ＭＳＳ）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単離精製した。抗体収率はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計を用いて測定した。最初に、ゼロ点を確認するために１×ＰＢＳをロードした。次に、所定量の精製抗体サンプルをロードし、各試験サンプルのタンパク質量をＵＶ波長２８０ｎｍで測定し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）で測定されたタンパク質濃度と試験サンプルの総量を乗算して算出した。精製抗体サンプルの純度は、ＨＬＣ－００１（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ）系を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析し、主要ピークの比率を定量化した。

以下の表２０は、選ばれた抗体の生産性値（溶出物の質量／採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）の体積）を示す。

上記のデータは、キメラ１Ｅ４抗体、ヒト化１Ｅ４抗体、およびその二重特異性抗体の収率が、マウス１Ｅ４抗体の収率よりも顕著に高かったことを示している。

キメラおよびヒト化１Ｅ４単一特異性抗体クローンの生産性を比較するために、培養ブロス３０ｍＬをＭＳＳカラムで精製し、精製産物中の抗体量をＮａｎｏｄｒｏｐ（商標）を用いて分析した。表２１に示すように、ヒト化１Ｅ４単一特異性抗体クローンは全て、キメラ１Ｅ４クローンと比較して優れた生産性を示した。

ヒト化抗体の免疫原性の評価
ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）の免疫原性を、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）のＴ細胞エピトープ予測ソフトウェアを用いたｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析により評価し、ｃｈ１Ｅ４の免疫原性と比較した。

Ｆｖ領域の抗体配列全体にまたがる１５残基を有する個々のペプチドを、ＭＨＣ ＩＩ複合体に結合する能力に基づいてスコアリングした。選択したＭＨＣ ＩＩ対立遺伝子は、１１のヒトＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子および４のヒトＨＬＡ ＤＲＢ３／４／５対立遺伝子であった。１２～１５（スコア８～１０）または６～１１（スコア４～７）のＭＨＣ ＩＩ分子に結合する非冗長ペプチドは、それぞれ、プロミスキャス高およびプロミスキャス中とマークされ、潜在的なＴ細胞エピトープである可能性を示した。

以下の表２２のデータは、軽鎖の６～１１個のＭＨＣ ＩＩ分子（プロミスキャス中とマークされた）に結合する非冗長ペプチドの数が、ｃｈ１Ｅ４では３個であるのに対し、ｈｕ１Ｅ４ ＶＬ１では０個であることを示している。ＭＨＣ ＩＩ分子に結合する非冗長ペプチドの数がより多いことは、ｃｈ１Ｅ４はｈｕ１Ｅ４よりも免疫原性が高い可能性があると解釈できる。

Ｈｕ１Ｅ４抗体はα－Ｓｙｎ ＰＦＦの貪食促進において優れた有効性を示す
ｃｈ１Ｅ４抗体およびｈｕ１Ｅ４抗体（単一特異性フォーマットまたはＧｒａｂｏｄｙ Ｂとの二重特異性フォーマットのいずれか）を、ミクログリアの貪食促進活性または単球の貪食促進活性について評価した。ｃｈ１Ｅ４、ｈｕ１Ｅ４、既存の抗α－ｓｙｎ抗体ｃｈ９Ｅ４、以前のヒト化抗α－ｓｙｎ抗体１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、およびｈＩｇＧ１対照の間で比較を行った。

ＢＶ－２細胞（ミクログリア細胞株）を、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０中で増殖させ、９６ウェルプレートに２．５×１０^５細胞／ウェルで添加した。他のチューブにα－ｓｙｎ ＰＦＦおよび様々な濃度の試験抗体を混合し、２０分間インキュベートした。抗体の濃度を表２３に示す。

この混合物をＢＶ－２細胞に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ２．５に調整）で洗浄し、再懸濁および遠心分離した後、上清を捨てて細胞表面の非内在化ＰＦＦ－Ａｂ複合体を除去した。この洗浄および遠心分離を２回繰り返した。

細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、１００μＬの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶液を細胞に添加し、さらに２０分間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、ブロッキングのためにＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン１００μＬを添加した。細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、一次抗体（抗α－ｓｙｎ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ：ＳＣ－１０７１７、１：１０００）１００μＬと室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０含有）１００μＬを添加し、溶液を再懸濁し、遠心分離し（２０００ｒｐｍ、３分、４℃）；上清を廃棄した。二次Ａｂ（抗ウサギ－ａｌｅｘａ４８８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ、カタログ：４４１２Ｓ、１：１０００）を細胞に添加し、暗所で１時間インキュベートする前に、上記の洗浄ステップを繰り返した。再度、ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０含有）１００μＬを添加し、溶液を再懸濁し、遠心分離した（２０００ｒｐｍ、３分、４℃）。上清を捨て、洗浄ステップを繰り返した。その後、細胞をＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳ分析を行い、その結果を、試験した抗体濃度にわたる幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）として定量化し、図１２に示す。

図１２のデータは、ＢＶ－２細胞において、ｃｈ１Ｅ４が、ｈＩｇＧ１対照よりもはるかに大きく、ｃｈ９Ｅ４（Ｒｏｃｈｅ／Ｐｒｏｔｈｅｎａ）よりも２倍高い割合で、α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を促進したことを示している。これらの結果は、ｃｈ１Ｅ４がミクログリアによるα－ｓｙｎ凝集体の除去を促進することを示しており、これはニューロンにおける神経毒性、炎症、および神経変性、ならびにパーキンソン病の病因と関連している。したがって、これらの結果は、ｃｈ１Ｅ４がｃｈ９Ｅ４よりも強い治療的可能性を有することを示している。

次に、ｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ抗体の単球貪食促進活性を、ｈＩｇＧ１と比較した。アッセイは、ＢＶ－２細胞の代わりにＴＨＰ－１細胞を用いたこと以外は、上記のように行った。ＴＨＰ－１は、貪食機能を有するヒト単球白血病細胞である。図１３のデータは、ＴＨＰ－１細胞において、ｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂが、ｈＩｇＧ１対照よりも大きな程度でα－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を促進したことを示している。ＴＨＰ－１細胞がミクログリア上のマーカーと類似の細胞表面マーカーを発現し、類似の方法で貪食することを考慮すると、これらの結果は、ｃｈ１Ｅ４およびｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂ ＢｓＡｂが共にヒトミクログリアによる細胞外α－ｓｙｎ ＰＦＦの貪食を促進することを示唆する。

追加のｈｕ１Ｅ４ ＢｓＡｂを、ミクログリアの貪食を促進する活性について比較した。図１４のデータは、試験したＢｓＡｂの中で、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂが、貪食促進において最も高い活性を示したことを示している。

図１５は、ｃｈ１Ｅ４およびｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂの貪食促進活性を比較したものである。ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）は、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂとの組合せにもかかわらず、ｃｈ１Ｅ４と同程度、さらにはわずかに高い貪食促進活性を示した。図１６は、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂおよびｃｈ９Ｅ４の貪食促進活性を比較したものである。図１７は、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂおよびｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂの貪食促進活性を比較したものである。これらの図のデータは、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂが、ｈＩｇＧ１、ｃｈ９Ｅ４、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、およびｃｈ１Ｅ４と比較して、優れた貪食促進活性を示したことを示している。したがって、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）の高いＰＦＦ結合親和性は、より大きな治療可能性と相関する。

Ｃｈ１Ｅ４は、ｍＴｈｙ－１マウスにおいてヒトα－Ｓｙｎに結合する優れた能力を示す
Ｃｈ１Ｅ４および他のα－ｓｙｎ抗体を、ヒトα－ｓｙｎを過剰発現するトランスジェニックマウスモデルであるｍＴｈｙ－１マウス（ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）において、α－ｓｙｎ凝集体を認識する能力について試験した。

１１カ月齢のｍＴｈｙ－１雌マウスを１×ＰＢＳで心臓内灌流した。その後、脳を４％ＰＦＡ／１×ＰＢＳ溶液に浸漬して固定した。１２時間の固定後、脳を３０％スクロース／１×ＰＢＳ溶液に移し、３日間保存した。固定した脳をクライオスタット型ミクロトームで４０μｍ厚片に切り出した。切片を１×ＰＢＳで２回洗浄し、３％過酸化水素でブロッキングした。一次抗体として用いた全ての抗α－ｓｙｎ抗体を１×ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ブロッキングした切片に１：１０００の割合で添加した後、４℃で１２時間インキュベートした。ブロッキングした切片を１×ＰＢＳで十分に洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ抗体を１：２００の割合で添加し、ブロッキングした切片を３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で染色した。染色した切片を明視野顕微鏡を用いて画像化し、分析した。

図１８および図１９に示すように、ｃｈ１Ｅ４は、分析した脳の全ての部分においてニューロピルおよびα－ｓｙｎ凝集体を認識した。市販の抗体（例えば、ＮＩ２０２およびＢＡ１４９）は、非常に弱いα－ｓｙｎ凝集体の認識を示した。Ｃｈ９Ｅ４は認識能を示したが、扁桃体および海馬では程度が低く、不規則で汚れた染色パターンを示した。ＢＡ１４９はニューロピルα－ｓｙｎ凝集体をよく認識せず、脳の一部の領域でのみ認識能を示した。

Ｃｈ１Ｅ４を用いたパーキンソン病を有する死後ヒト脳の染色
シヌクレイン病患者の脳組織において、１Ｅ４が凝集α－ｓｙｎを認識することを確認するために、ｃｈ１Ｅ４を用いて、死亡の４．５年前に認知症を伴うパーキンソン病と診断された７４歳の男性患者の死後脳組織を染色した。死亡した患者のパラフィン包埋脳切片をさらに４μｍ厚片に切り出した。これらの脳切片をスライドに載せ、キシレンで脱パラフィンした後、段階的エタノール溶液で再水和した。抗原回収後、ＰＢＳ中０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む３％過酸化水素を用いて脳切片をクエンチした。脳切片を一次抗体－リン酸化α－ｓｙｎに対する市販抗体Ｓｙｎ３０３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：８２４３０１）またはｃｈ１Ｅ４と４℃で１２時間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳで洗浄した後、製造元のマニュアルにしたがってＤＡＢ反応を行った。染色した切片をスライドに載せ、明視野顕微鏡を用いて画像を撮影し、解析した。

リン酸化α－ｓｙｎは、パーキンソン病における神経変性および脳機能障害に寄与するレビー小体およびレビー神経突起の主要な構成要素であることが知られている。図２０に示すように、ｃｈ１Ｅ４は、隣接切片で使用したＳｙｎ３０３と同様の感度でリン酸化α－ｓｙｎを認識した。リン酸化α－ｓｙｎの認識パターンは、文献で報告されているレビー小体およびレビー神経突起のパターンと類似していた。これらの結果は、ｃｈ１Ｅ４がパーキンソン病患者の脳組織中のレビー小体およびレビー神経突起を認識したことを示している。

Ｃｈ１Ｅ４抗体への脳暴露
ｍＴｈｙ－１トランスジェニックマウスにおけるｃｈ１Ｅ４およびｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂへの暴露を分析した。単一特異性または二重特異性ｃｈ１Ｅ４抗体のそれぞれを、１１日間（０、７２、１４４、および２１６時間）、３日毎に１回、５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。７カ月齢の雄のｍＴｈｙ－１マウスを単一特異性抗体試験群（ｎ＝３）と二重特異性抗体試験群（ｎ＝２）に分けた。血漿は０、７２、および２６４時間に採取した。脳の病理学的解析のため、人道的規定にしたがって２６４時間後に動物を抱水クロラールで麻酔した。次に、動物を０．９％生理的食塩水で心内灌流した。

次に、灌流した脳の半分（矢状断面）を、分析までリン酸緩衝剤中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４、４℃）中に保存した。脳の他の半分は直ちに凍結状態（－７０℃）で保存した。

病理学的分析は以下のように行った。パラホルムアルデヒドで固定した脳の半分を、ビブラトームを用いて４０μｍ厚で自由に連続切片に切り出した。各動物群の脳におけるリン酸化α－ｓｙｎの発現レベルを決定するため、大脳皮質、海馬、および線条体を含む切片をリン酸化α－ｓｙｎ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。凝集α－ｓｙｎについて使用されたマーカーとしては、リン酸化－１２９α－ｓｙｎ抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５９２６４）または全長α－ｓｙｎ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２６４２）が含まれた。マーカーは、次いで製造元のマニュアルにしたがってＤＡＢを用いて染色した。免疫染色した組織切片を明視野顕微鏡で画像化した。

隣接切片では、免疫蛍光染色によりヒトＩｇＧのレベルを分析した。様々な脳領域の切片を、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８がコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体と４℃で１２時間反応させた。その後、脳切片を１×ＰＢＳで洗浄した。ニューロンを局在させるために、切片をニューロンマーカーＮｅｕＮに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、＃ＭＡＢ３７７）で処理した。切片を共焦点顕微鏡で分析し、細胞の光学密度を測定した。

図２１のデータは、ｃｈ１Ｅ４ ＢｓＡｂが、単一特異性ｃｈ１Ｅ４と比較して、脳内でより高いレベルの暴露を有したことを示している。具体的には、二重特異性抗体は単一特異性抗体と比較して、大脳皮質で７．３９倍、海馬で４．２８倍、および黒質で６．０４倍高い暴露レベルをそれぞれ示した。この結果は、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂが、様々な脳領域において、１Ｅ４の血液脳関門（ＢＢＢ）通過能力を有意に改善することを示している。

ｉｎ ｖｉｖｏでのリン酸化α－Ｓｙｎの減少
本実施例では、試験１Ｅ４抗体をマウスに投与した後、マウスの脳組織の大脳皮質、扁桃体、および海馬をｐ－１２９ α－Ｓｙｎに対する抗体で染色した以外は、実施例１３と同様の方法で実験を行った。Ｐ－１２９ α－ｓｙｎは、１２９位のセリン残基がリン酸化されたα－ｓｙｎの一形態であり、パーキンソン病の病態に関与している。本実験において、この形態のα－ｓｙｎは、抗ｐ－１２９α－Ｓｙｎ抗体で染色した組織において、暗褐色の点または凝集体の形態で観察された。

図２２のデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでα－ｓｙｎ凝集体を除去する単一特異性および二重特異性ｃｈ１Ｅ４の両方の能力を示している。データはまた、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂを有する二重特異性ｃｈ１Ｅ４が、単一特異性ｃｈ１Ｅ４と比較して、大脳皮質、海馬、および扁桃体を含む脳においてｐ－１２９α－ｓｙｎを減少させる能力が増大したことを示す。特に、二重特異性抗体は、大脳皮質、扁桃体、および海馬において、ｐ－１２９ α－ｓｙｎをそれぞれ２６％、３４％、および４０％減少させるという優れた効果を示した。したがって、単一特異性フォーマットと比較して、ｃｈ１Ｅ４×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂは、パーキンソン病の動物モデルにおいて、ｐ－１２９ α－ｓｙｎおよびその凝集体のレベルをはるかに効果的に減少させた。これらの結果は、実施例１３の結果と一致しており、単一特異性抗α－ｓｙｎ抗体と比較して、改善されたＢＢＢ浸透能力により、より多量の１Ｅ４ ＢｓＡｂが脳に到達することができ、二重特異性抗体がシヌクレイン病を治療するための改善された治療手段となることが確認された。

同様の実験を、Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂベースの二重特異性ヒト化抗α－ｓｙｎ抗体を用いて行った。図２３のデータは、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂが、ｈｕ１１Ｆ１１×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂより大きな程度でｍＴｈｙ－１マウスのｐ－１２９α－ｓｙｎレベルを減少させたことを示しており、ｈｕ１Ｅ４がニューロン間のα－ｓｙｎ伝達を阻害する上でより効果的であることを示唆している。

要約すると、この結果は、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）×Ｇｒａｂｏｄｙ Ｂのような二重特異性ｈｕ１Ｅ４が、ｉｎ ｖｉｖｏで脳からｐ－１２９α－ｓｙｎを除去するのに高度に有効であることを実証している。

Ｈｕ１Ｅ４はドーパミン作動性ニューロンにおけるα－Ｓｙｎの伝播を減少させる
Ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）およびｈｕ１１Ｆ１１を、パーキンソン病患者起源の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するドーパミン作動性ニューロンにおけるα－ｓｙｎ伝播を抑制する能力について試験した。図２４に示すように、５μｇ／ｍｌで、ｈｕ１Ｅ４（Ｖ１＿ＶＬ１）はｈｕ１１Ｆ１１よりも大きい程度でこれらのニューロンにおけるα－ｓｙｎの伝播を改善した。ドーパミン作動性ニューロン細胞マーカーであるチロシン水酸化酵素と共局在化したα－ｓｙｎの染色強度は、ｈｕ１Ｅ４ ｍＡｂを３０日間処理した後、ドーパミン作動性ニューロンで有意かつ用量依存的に減少した。ｈｕ１１Ｆ１１ ｍＡｂの場合、共局在強度の減少はｈｕ１Ｅ４ ｍＡｂほど顕著ではなかった。これらの結果は、ｈｕ１Ｅ４がニューロン間のα－ｓｙｎ伝達をより効果的に阻害し、したがってパーキンソン病および他のα－シヌクレイン病の治療により有効であり得ることを示唆する。

本明細書において特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当技術分野の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、発行済み特許、およびその他の文書は、個々の刊行物、特許出願、発行済み特許、またはその他の文書が、その全体が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書では多数の文書を引用するが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではない。矛盾が生じた場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、文脈上別段の定めがない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態全体を通して、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を排除することを意味しないことは理解される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載された量に１０％以下近い量を指す。さらに、本明細書で提供される見出しは、便宜上のみであり、特許請求される実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

配列表
本開示において提供されるアミノ酸配列およびヌクレオチド（ｎｔ）配列を以下に列挙する（ＳＥＱ：配列番号）。配列は全て、「ｎｔ」で他に示されない限り、アミノ酸配列である。

Claims (35)

1. ヒトα－シヌクレインに結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって：
   （ｉ）配列番号３３～３５にそれぞれ示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３、および（ｉｉ）ヒトＶＨ１－０２遺伝子由来の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、および／または３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
   それぞれ配列番号３６～３８に示す軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
   を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
2. 重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３が、ヒトＶＨ１－０２遺伝子によってコードされる対応するＦＲに対して６個以下の変異を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
3. ヒトＪＨ１、ＪＨ４またはＪＨ５遺伝子由来の重鎖ＦＲ４を含む、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
4. ヒトα－シヌクレインに結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって：
   それぞれ配列番号６４～６６に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および
   それぞれ配列番号６７～６９に示す軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
   を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
5. ＶＨが配列番号１～９のいずれか１つを含み；
   ＶＬが、配列番号１１～１５のいずれか１つを含む、
   請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
6. ＶＨおよびＶＬが：
   配列番号１および１１、
   配列番号２および１２、
   配列番号３および１２、
   配列番号４および１２、
   配列番号７および１２、
   配列番号５および１３、
   配列番号５および１５、
   配列番号６および１３、
   配列番号６および１４、
   配列番号５および１４、
   配列番号８および１４、または
   配列番号９および１４
   をそれぞれ含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
7. ＶＨが配列番号１を含み、および／またはＶＬが配列番号１１を含む、請求項５に記載の抗体または抗原結合断片。
8. 抗体がヒトκ軽鎖定常領域を含み、場合によりヒトκ軽鎖定常領域が配列番号４３を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
9. ヒトＩｇＧ１定常領域を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
10. 抗体の一方の重鎖が、１つまたはそれ以上のノブ変異を含み、場合により、１つまたはそれ以上のノブ変異がＴ３６６Ｗを含み、
    抗体の他方の重鎖が１つまたはそれ以上のホール変異を有し、場合により、１つまたはそれ以上のホール変異がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｅｕ番号付け）を含む、
    請求項９に記載の抗体。
11. 単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原結合断片。
12. 二重特異性である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
13. 二重特異性抗体または抗原結合断片が、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）と結合する部分を含む、請求項１２に記載の抗体または抗原結合断片。
14. ＩＧＦ１Ｒ結合部分がＶＨおよびＶＬを含み、ここで、
    ＶＨが、それぞれ配列番号５１～５３に示す重鎖ＣＤＲ１～３を含み、
    ＶＬが、それぞれ配列番号４６～４８に示す軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、
    請求項１３に記載の抗体または抗原結合断片。
15. ＩＧＦ１Ｒ結合部分のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号５０および４５を含む、請求項１４に記載の抗体または抗原結合断片。
16. ＩＧＦ１Ｒ結合部分がｓｃＦｖであり、場合により配列番号５４を含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
17. ＩＧＦ１Ｒ結合部分が抗体の両方の重鎖のＣ末端に融合している、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の抗体。
18. ＩＧＦ１Ｒ結合部分が抗体の一方の重鎖のみのＣ末端に融合している、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の抗体。
19. 抗体の一方の重鎖が、１つまたはそれ以上のノブ変異を含み、場合により、１つまたはそれ以上のノブ変異がＴ３６６Ｗを含み、
    抗体の他方の重鎖が、１つまたはそれ以上のホール変異を含み、場合により、１つまたはそれ以上のホール変異がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｅｕ番号付け）を含む、
    請求項１３～１８のいずれか１項に記載の抗体。
20. ノブ重鎖が配列番号３９を含み、および／またはホール重鎖が配列番号４０を含む、請求項１０または１９に記載の抗体。
21. 抗体の重鎖がさらにＭ４２８Ｌ変異（Ｅｕ番号付け）を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗体。
22. ノブ重鎖が配列番号４１を含み、ホール重鎖が配列番号４２を含む、請求項２１に記載の抗体。
23. 前記ＩＧＦ１Ｒ結合部分がノブ重鎖のＣ末端に位置する、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の抗体。
24. ＩＧＦ１Ｒ結合部分がホール重鎖のＣ末端に位置し、場合によりホール重鎖が配列番号５５または５６を含む、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の抗体。
25. 配列番号５７を含む重鎖および配列番号５８を含む重鎖；ならびに各々が配列番号５９を含む２つの軽鎖を含む、請求項２４に記載の抗体。
26. 凝集している、またはオリゴマーのα－シヌクレインに結合し、場合によりＫ_Ｄが２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭまたは１０ｐＭ以下であり、
    場合により、単量体α－シヌクレインには結合しない、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
27. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
28. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子。
29. 核酸分子（複数可）が発現構築物であり、場合により配列番号１７～２５から選択されるヌクレオチド配列および配列番号２７～３１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸分子（複数可）。
30. 請求項２８または２９に記載の核酸分子を含む宿主細胞であって、場合により哺乳動物細胞である、宿主細胞。
31. 抗体または抗原結合断片を産生する方法であって
    抗体または抗原結合断片の発現を可能にする条件下で、請求項３０に記載の宿主細胞を培養すること、および
    細胞培養物から抗体または抗原結合断片を単離すること
    を含む、方法。
32. 必要とするヒト対象においてα－シヌクレイン病を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を対象に投与することを含む、方法。
33. 必要とするヒト対象においてα－シヌクレイン病を治療するための医薬の製造のための、請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
34. 必要とするヒト対象におけるα－シヌクレイン病の治療における使用のための、請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項２７に記載の医薬組成物。
35. α－シヌクレイン病が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、または扁桃体レビー小体を伴うアルツハイマー病である、請求項３２に記載の方法、請求項３３に記載の使用、または請求項３４に記載の使用のための抗体、抗原結合断片、もしくは医薬組成物。

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