JP2024520880A - Ｗ／ｏ／ｗ型の多層かつ官能化可能なナノカプセルを得るためのポリウレタン／ポリ尿素化学に基づくナノテクノロジープラットフォームおよびそれらの調製プロセス - Google Patents

Abstract

Ｗ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセル化物であって、その内側水滴は活性化合物と、第１のポリウレタン／ポリ尿素プレポリマー１を含む第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁とを含み、その油滴はその中に分散された内側水滴と、第２のポリウレタン／ポリ尿素プレポリマー２を含む第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁とを含み、両方のプレポリマーは異なる極性の主鎖および側鎖を有し、かつ両方のプレポリマーの主鎖はその骨格にウレタン、尿素、ＰＥＯ、ジスルフィおよびアミン官能基を含むＷ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセル化物。ハイブリッドＷ／Ｏ／Ｗ／ポリウレタン／ポリ尿素リポソームであって、その油滴はその中に分散された内側水滴と、リポソームの構造に似ている外壁とを含み、その外壁はジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの表面配置により水中油型乳化において得ることができるハイブリッドＷ／Ｏ／Ｗ／ポリウレタン／ポリ尿素リポソーム。【選択図】なし

Description

本出願は、２０２１年６月３日に出願された欧州特許出願第２１３８２４９９号の利益を主張する。

本発明は、Ｗ／Ｏ／Ｗ型多層ナノカプセル化物、それらの調製プロセスならびにそれらを含む化粧品もしくは医薬組成物に関する。

単一カプセル化エマルションは、化粧品、医薬品（例えば、薬物送達のためのベシクル）、食料品および界面活性剤の生産において広く使用されきた。一般にそれらは、水性連続相および分散されたカプセル化油相（Ｏ／Ｗ型エマルション）を用いて製剤化され、この理由のために水溶性活性材料よりも油溶性活性材料に適している。

水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルションも知られている。それらは、それ自体が外側水性連続相に分散されたより大きい油滴内に分散された内側水滴からなる。

相の反転またはエマルションの２つの相の間での乳化剤の移動のいずれかにより、高濃度の分散相または乳化剤での乳化手順により多層エマルションを得ることができることが知られている。それらは、界面活性剤の存在下で二段階乳化方法によって調製することができる。乳化の第１段階により油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルションが得られ、次いでこれを水溶液と混合してＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成する。

従って国際公開第０１７８８８８Ａ１号は、最初に油中水型エマルションを形成し、かつ次いで外部乳化剤を用いて油中水型エマルションを連続相の中に乳化させることに基づくＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションに関する。それは、イソシアネートおよびアミンポリマー前駆体であってもよい２種以上のポリマー前駆体の反応および相間で生じる他の種類の反応のうちポリウレタンおよびポリ尿素化学を使用することよるポリマー壁の形成を開示している。

米国特許第４５３４７８３Ａ号は、カプセル化のためのプロセスおよび特にポリマー材料、例えばポリ尿素、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリエステル、ポリカーボネートまたはポリウレタンの殻すなわち薄い壁によって構成された小型もしくは微細カプセルのためのプロセスであって、ａ）油溶性アルキル化ポリビニルピロリドン乳化剤を含有する有機液体（連続相液体）、ｂ）カプセル化される材料である水溶性材料を含有する不連続（水性）相液体＋第１のシェル壁成分を提供する工程を含み、不連続相を連続相液体に分散させて油中水型エマルションを形成するプロセスを開示している。第２のシェル壁成分を油中水型エマルションに添加し、そうすると第１のシェル壁成分は第２のシェル壁成分と反応してカプセル化される材料の周りに固体のポリマーシェル壁を形成する。形成されたカプセルは、有機液体中にマイクロカプセルを含む懸濁液の形態と同様に直接使用することができる。

また米国特許第２００４／０１１５２５４Ａ１号は、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型微小粒子を調製するための組成物および方法を開示している。この微小粒子は、水性内部にカプセル化された核酸またはＤＮＡなどの活性剤、カチオン性脂質などの両親媒性結合分子、およびポリウレタンなどのカプセル化材料を含む。両親媒性分子は活性剤との親和性を有する第１の官能性およびカプセル化材料と同じ溶媒に可溶な第２の官能性を有すると言われている。このプロセスは、ａ）活性剤を有する第１の水溶液をカプセル化材料を有する有機溶媒と混合してエマルションを形成する工程と、両親媒性結合分子をエマルションと混合してａｍｐｈｉｐｌｅｘを形成する工程であって、両親媒性分子は活性剤との親和性を有する第１の官能性およびカプセル化材料と同じ溶媒に可溶な第２の官能性を含む工程と、ｃ）このａｍｐｈｉｐｌｅｘを安定化剤を有する第２の水溶液と混合して粒子を形成する工程とを含む。

しかし、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおける乳化プロセスは調製方法によって強く影響を受け、生成物安定性に厳密に関連している非常に異なる液滴サイズ分布が達成される。非常に多くの場合に、これらの系は安定化させることが難しい。その上、エマルションを形成するための分散剤および／または乳化剤の使用は、壁形成プロセスを妨害する可能性がある。

他方、Ｗ／Ｏ型カプセル化を行うためにポリウレタン－ポリ尿素プレポリマーを用いるカプセル化が開示されている。これらのプレポリマーは、Ｗ／Ｏにおいてマイクロカプセル化物の一部を形成し、かつ同時に乳化剤として機能するポリマーのプレポリマーであり、外部乳化剤の使用を回避し、かつ当該壁のバリア効果を向上させる。

例えば欧州特許第２９９２９５３Ａ２号は、同時に反応して相反転によりＯ／Ｗ系中にポリマー壁を形成するＮＣＯ官能基を有する両親媒性自己乳化性ポリマーを用いて、小型マイクロカプセルを調製するための方法を開示している。ＮＣＯ基はアルコールおよびアミン官能基とそれぞれ反応させた場合に、ウレタンおよび／または尿素型結合を形成するのに適している。

Ｃｕｓｃｏらは、「ｐＨ同調シェルカチオン化および酸化還元誘発放出を伴う多感受性薬物が充填されたポリウレタン／ポリ尿素ナノカプセル（Ｍｕｌｔｉｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｒｕｇ－ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ／ｐｏｌｙｕｒｅａ ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｗｉｔｈ ｐＨ－ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅ ｓｈｅｌｌ ｃａｔｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｏｘ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）」，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，第７巻，ｐｐ．６４５７－６４６６において、水性条件下で異なる疎水性薬物をナノカプセル化するためのポリウレタン／ポリ尿素ポリマーを調製するためのワンポット手順も開示している。この文献は、アミン末端基を有するポリウレタン／ポリ尿素ポリマーを開示している。これらのプレポリマーは、異なる官能性ジオールおよびジアミンと反応して自己乳化型反応性プレポリマーを生じさせるジイソシアネートから形成されている。次いで、これらのプレポリマーを使用して水性条件下で所望の疎水性薬物をナノ乳化させる。しかし外部乳化剤を使用しないこれらのカプセル化は、Ｏ／Ｗ型カプセル化などの１つのカプセル化のみを含む系においてのみ使用されてきた。

当該技術分野で知られている内容から、構造的安定性、薬物充填の増加、生体適合性の向上または特異的生物学的性能などの向上した特性を有するＷ／Ｏ／Ｗ型ナノ構造体を提供することがなお必要とされているということが導き出される。

本発明者らは、高い架橋および安定性を有する非常に小型（２０～５０ｎｍ）の多層Ｗ／Ｏ／Ｗ型カプセル化物を得るのを可能にし、かつ架橋および層状化の程度を調整することができる特定の条件下で非常に小型であり、かつ第２のカプセル化を行うことができるように構成されている第１のＷ／Ｏ型カプセル化物を得るのを可能にするアミン末端基でキャップされた特定の新しいポリウレタン／ポリ尿素プレポリマーの使用により、Ｗ／Ｏ／Ｗ型カプセル化によって調製される多層ナノカプセル化物を開発した。

有利には、そのようなカプセル化は外部乳化剤を必要とせず、かつ第１の壁がＷ／Ｏ界面において形成され、第２の壁がＯ／Ｗ界面において形成される２つの堅牢な壁を有する二段階ナノカプセル化において、Ｗ／Ｏ界面またはＯ／Ｗ界面での疎水性／親水性勾配により促進されるナノ界面で制御される層状化を可能にする。その官能性はそれらの多層構造体において調整可能である。有利には本発明は、非常に汎用であるカプセル化のためのナノテクノロジープラットフォームを提供する。

本ナノカプセル化物は、第１の工程でＷ／Ｏエマルションを生成し、かつ第２の工程でＯ／Ｗエマルションを生成するための特有の疎水性／親水性バランスを有する、自己乳化型ポリウレタン／ポリ尿素反応性プレポリマー（予め設計された反応性界面活性剤）を用いる相反転エマルションに基づくプロセスによって得られる。これらのプレポリマーは、アミンまたはイソシアネート基で終端させる（キャップする）ことができ、かつ異なる官能性を有していてもよい（主として、第１もしくは第２の工程において形成される特定の界面において自己層状化することができるようにするために二官能性または約二官能性である）。形成された壁は、それらに別々に堅牢性を与えるためにそれらを所望のアミノもしくはイソシアネート基と反応させることにより架橋されている。全てのプレポリマーの事前設計および全ての工程のためのそのキャッピング機能は、層状化および全ての壁の堅牢性を定める。この方法論は、化学量論的反応により自己乳化系と共に界面（Ｗ／ＯまたはＯ／Ｗ）において機能する可能性を与え、不純物および二次反応を最小限に抑える。壁調製の間に精製工程は必要でない。

ポリウレタン／ポリ尿素ナノカプセルを調製するためのＯ／Ｗ系における自己乳化型プレポリマーの使用について既に記載されたことはあるが、分散相が油滴ではなく、油滴よりもかなり大きいサイズを有するＷ／Ｏ型ナノカプセル化物である場合に、これらのＯ／Ｗ型ナノカプセル化物が適切に機能することは期待されていない。

これは、小型のＷ／Ｏ型ナノカプセル化物の形成において強い影響を有する第１のＷ／Ｏ型カプセル化物に使用される特定のプレポリマーの選択のおかげで可能になり、外部界面活性剤を使用することなくＷ／Ｏ／Ｗ型カプセル化物を調製するためのそれの後での使用を可能にした。その上、この第１のカプセル化は、極性溶媒（例えばＴＨＦ）の代わりに水と混和しない溶媒、特に非極性溶媒（例えばシクロヘキサン）を用い、かつ好ましくはエマルションを形成するために特定の回転速度で行われる。

得られるＷ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセルは、高い架橋および安定性と共に非常に小型にすることができ、約２０～５０ｎｍのサイズを有することさえでき、ここでは架橋および層状化の程度を調整することができる。

従って、有効に内側を外側から分離し、異なる時間に動態学的に放出することができ、かつより親水性の最外側層を失った後に疎水性カプセルを提供することができる２つの別々に官能化可能な堅牢な壁を有する本発明のナノカプセルが開示されている。この疎水性カプセルが網内系（ＲＥＳ）によって検出可能でないその親水性外側層により安定な方法で最初に血中に入ることができるという事実のおかげで、それは例えばリンパ系に入って特定の臓器に到達するかリンパそれ自体を通って循環することができるため、これは有利である。

当該用途のいくつかでは、Ｗ／Ｏ／Ｗ系の最内壁はポリウレタン／ポリ尿素系ポリマーによって形成することができるが、その外壁はリポソームの構造に似ており、従って以前のナノカプセル化物と第１のカプセル化を共有している。

従って本発明の第１の態様は、それ自体が外側水性連続相に分散されている油滴内に分散されている内側水滴を含む多層水中油中水型ナノカプセル化物であって、内側水滴は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物および第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第１のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー１）および（ｂ）水溶性ポリアミン１の両方のアミン基とのポリイソシアネート１の界面における反応による相反転により油中水型乳化プロセスにおいて得ることができ、油滴は、その中に分散された内側水滴および第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第２のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー２）および（ｂ）ポリイソシアネート２の両方のイソシアネート基とのポリアミン２の界面におけるその反応による相反転により水中油型乳化プロセスにおいて得ることができ、プレポリマーすなわちプレポリマー１およびプレポリマー２は両方とも異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、両方のプレポリマーの主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン残基および任意に疎水性繰り返し単位を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基はアミン末端基であり、かつプレポリマー２の２つのエンド末端官能基はイソシアネート末端基である、多層水中油中水型ナノカプセル化物に関する。

本発明の第２の態様は、水中油中水型多層ポリマーナノカプセル化物の調製のためのプロセスであって、
ａ）以下の工程：ａ１）水溶性の化学的／生物学的活性化合物、プレポリマー１）および水溶性ポリアミン１を所与の体積の水の中で混合する工程、ａ２）水と混和しない５～７倍多い量の有機溶媒を添加して相反転により第１のエマルションを生成する工程、ａ３）プレポリマー１および水溶性ポリアミン１のアミンとの界面におけるその化学量論的反応により、水溶性の化学的／生物学的薬剤のために第１のカプセル化の壁を作り出すためのエマルションのために選択された有機溶媒に可溶なポリイソシアネート１を添加する工程を含むプロセスによって最初に第１のＷ／Ｏ型カプセル化を行う工程と、
ｂ）以下の工程：ｂ１）先のカプセル化にイソシアネート基の代わりに第二級アミン末端基を有するプレポリマー２の対応する前駆体であるプレポリマー３を添加する工程、ｂ２）工程ｂ１）の混合物を当量のプレポリマー３に関して当量の過剰なポリイソシアネートの上に添加してその場でプレポリマー２を形成する工程、ｂ３）必要な量の水を添加して第２の相反転により第２のエマルションを生成する工程、ｂ４）水溶性ポリアミン２を添加して、プレポリマー２からのイソシアネートおよび過剰に添加された遊離ポリイソシアネート２との界面におけるその反応により第２のカプセル化の壁を作り出す工程を含むプロセスによって、第２のＯ／Ｗ型カプセル化を行う工程と、
ｃ）任意に有機溶媒を蒸発させる工程と、
ｄ）任意に工程ｃ）の水中油中水型エマルションを透析する工程と
を含み、
プレポリマー１、プレポリマー２およびプレポリマー３は独立して、異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、当該プレポリマーのそれぞれの主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性繰り返し単位を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基であり、かつプレポリマー２の２つのエンド末端官能基はイソシアネート末端基であり、プレポリマー３の２つのエンド末端官能基は第一級もしくは第二級アミン末端基である、
プロセスに関する。

この技術を使用してリポソームに似ている構造体も調製することができる。この場合、第１のナノカプセル化物は上に記載されているものと同じであり、次いでそれを外面のリポソーム構造体の中にカプセル化する。従って本発明の第３の態様は、より大きい油滴内に分散されている内側水滴を含むハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームであって、ａ）内側水滴は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物および第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第１のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー１）および（ｂ）水溶性ポリアミン１の両方のアミン基とのポリイソシアネート１の界面における反応による相反転により油中水型乳化プロセスにおいて得ることができ、プレポリマー１は異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性繰り返し単位を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基であり、かつｂ）油滴は、その中に分散された内側水滴およびリポソームの構造に似ている外壁を含み、外壁はジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの表面配置により水中油型乳化において得ることができる、ハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームに関する。

本発明の第４の態様は、上に定義されているより大きい油滴内に分散されている内側水滴を含むハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームの調製のためのプロセスであって、ａ）上に記載されている水中油中水型多層ポリマーナノカプセル化物の調製のためのプロセスと同じ工程を含むプロセスによって最初に第１のＷ／Ｏ型カプセル化を行う工程と、次いでｂ）以下の工程：ｂ１）先のカプセル化に第１の好適な溶媒に含まれているジパルミトイルホスファチジルコリンおよび第２の好適な溶媒に含まれているコレステロールを添加する工程、ｂ２）必要な量の水を添加して第２の相反転により第２のエマルションを生成し、かつジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの物理的再配置により外壁を作り出す工程を含むプロセスによって、第２のＯ／Ｗ型カプセル化を行う工程と、ｃ）任意に有機溶媒を蒸発させる工程と、ｄ）任意に工程ｃ）の水中油中水型エマルションを透析する工程とを含むプロセスに関する。

本発明の第５の態様は、担体と共に上に定義されているナノカプセル化物を含む組成物に関する。

最後に本発明の第６の態様は、美容的もしくは薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に、上に定義されているナノカプセル化物を含む化粧品もしくは医薬組成物に関する。

ポリマーＰ１の形成のＩＲスペクトルを示す。線１は反応の開始時に記録された第１の試料（２２５２ｃｍ^－１での鋭いＮＣＯ非対称伸縮振動バンド）に対応している。線２はジオールとジイソシアネートとの反応を含む合成の第１の工程の終了を示す（ＮＣＯ伸縮振動バンドの強度は著しく減少し、１７１９ｃｍ^－１でのＣＯ伸縮振動バンド、１５３７ｃｍ^－１でのＣＮ伸縮振動バンド、１２４０ｃｍ^－１でのＮＣＯＯ／ＣＯＣ非対称伸縮振動バンドの強度は増加した）。線３は、当該合成の第２の工程中にジアミンを添加した効果を示す（２２５２ｃｍ^－１でのＮＣＯ伸縮振動バンドは瞬時に消失し、同時に１６３４ｃｍ^－１での新しい伸縮振動バンドなどの他の特徴的バンドが出現または変化し、これは尿素結合のカルボニルおよび遊離第二級アミンに対応している９０８ｃｍ^－１での新しい縦揺れバンドに関連していた）。 ポリマーＰ３の形成のＩＲスペクトルを示す。図１と同様に、線１は反応の開始時に記録された第１の試料（２２５２ｃｍ^－１での鋭いＮＣＯ非対称伸縮振動バンド）に対応している。線２はジオールとジイソシアネートとの反応を含む合成の第１の工程の終了を示す（ＮＣＯ伸縮振動バンドの強度は著しく減少し、１７１９ｃｍ^－１でのＣＯ伸縮振動バンド、１５３７ｃｍ^－１でのＣＮ伸縮振動バンド、１２４０ｃｍ^－１でのＮＣＯＯ／ＣＯＣ非対称伸縮振動バンドの強度は増加した）。線３は当該合成の第２の工程中にジアミンを添加した効果を示す（２２５２ｃｍ^－１でのＮＣＯ伸縮振動バンドは瞬時に消失し、同時に１６３４ｃｍ^－１での新しい伸縮振動バンドおよび９０８ｃｍ^－１での新しい縦揺れバンドなどの他の特徴的バンドが出現または変化した）。 Ｗ／Ｏ型カプセル化反応のＩＲスペクトルを示す。 Ｗ／Ｏ／Ｗ型カプセル化反応を示す。線１はＰ１＋ＮＣ１混合後の試料を表す。線２は、ポリマーを再活性化させ、かつＮＣＯ反応性実体に変換するために決定したジイソシアネート量の上に添加したＰ１＋ＮＣ１混合物に対応している。線３は、活性化されたポリマーおよび添加されていたＬ－リジンナトリウム塩とのその後の反応による尿素形成を示す（カルボニルおよびＣＮ伸縮振動バンドの増加と同時に、２２５５ｃｍ^－１でのＮＣＯ伸縮振動バンドの強度の減少）。線４はＮＣＯ伸縮振動バンドが維持されることを示し、ここではＭｉｌｌｉ－Ｑ水による相反転が表されている。線５はトリアミンを添加した後の尿素形成を示す（ＮＣＯ伸縮振動バンドは瞬時に消失し、尿素に関連するバンドは、残っているＮＣＯ基とこのポリアミンとの迅速な反応の結果としてそれらの強度を増加させた）。 実施例７のカルボプラチンナノカプセル化物の各試料におけるｐＨに対するζ－ｐｏｔを示す。 ＤＣをＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－２５に曝露した陰性対照と共に、経時的な（６時間および２４時間にわたる）ＤＣに対するクマリン誘導体色素発現のグラフ表示を示す。このグラフは、ｎ＝４の独立した実験からのクマリン陽性ＤＣの割合を示す。 補正された結果が異なるＮＣ濃度の内部移行比をどのように維持するかを示す。クマリンが充填されたナノ粒子により内部移行を補正した。４℃の陽性割合は３７℃のものから差し引かれている。グラフはｎ＝１の実験を示す。 ４８時間のインキュベーション後の異なる濃度におけるＤＣに対するＲ８４８が充填されたナノ粒子の免疫刺激作用を示す。ｎ＝３の独立した実験からのＣＤ８０－ＦＩＴＣ陽性ＤＣの割合。 ４８時間のインキュベーション後の異なる濃度におけるＤＣに対するＲ８４８が充填されたナノ粒子の免疫刺激作用を示す。ｎ＝２の独立した実験からのＣＤ８３－ＰＥ陽性ＤＣの割合。 ４８時間のインキュベーション後の異なる濃度におけるＤＣに対するＲ８４８が充填されたナノ粒子の細胞毒性効果を示す。このグラフは、ｎ＝１の独立した実験からの７－ＡＡＤ－ＰｅｒＣｐ５．５陽性細胞の割合を示す。 図１０ａ）および図１０ｂ）はフローサイトメトリー蛍光分析のための適切な細胞の選択を示す。 図１１ａ）は充填されていないナノカプセルと共にインキュベートした蛍光陽性細胞の数を示し、図１１ｂ）はＩＣＧが充填されたナノカプセルと共にインキュベートした蛍光陽性細胞の数を示す。 Ｔｈｕｎｄｅｒ顕微鏡において記録された蛍光顕微鏡画像を示す。蛍光体が充填されたナノカプセルの細胞内局在化の定性的分析。 ＢＡＬＢ／Ｃマウス群（ｎ＝４のマウス）に対する１６０μｌ（４０μＭの遊離ＩＣＧ）の静脈内投与を示す。 ＢＡＬＢ／Ｃマウス群（ｎ＝４のマウス）に対する１６０μｌ（３０ｍｇ／ｍＬのカチオン性ＩＣＧ－ＮＣ中に４０μＭのＩＣＧ）の静脈内投与を示す。 ＢＡＬＢ／Ｃマウス群（ｎ＝４のマウス）に対する１６０μｌ（３０ｍｇ／ｍＬの両性ＩＣＧ－ＮＣ中に４０μＭのＩＣＧ）の静脈内投与を示す。 ＮＳＧマウスにおけるＩＣＧ標識したナノカプセルの全身体内分布のインビボイメージングを示す。媒体（ＰＢＳ）で治療した３７５匹の接種済みＮＳＧマウス（ｎ＝３／群）。腫瘍細胞の注射のための位置は赤色の円で示されている。 ＮＳＧマウスにおけるＩＣＧ標識したナノカプセルの全身体内分布のインビボイメージングを示す。遊離ＩＣＧで治療した３７５匹の接種済みＮＳＧマウス（ｎ＝３／群）。腫瘍細胞の注射のための位置は赤色の円で示されている。 ＮＳＧマウスにおけるＩＣＧ標識したナノカプセルの全身体内分布のインビボイメージングを示す。両性ＩＣＧ－ＮＣで治療した３７５匹の接種済みＮＳＧマウス（ｎ＝３／群）。腫瘍細胞の注射のための位置は赤色の円で示されている。 異なる治療後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下に埋め込まれた癌細胞の増殖曲線および腫瘍増殖を示す。Ｂ１６．Ｆ０（７×１０^４）細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射した。腫瘍増殖（面積、ｍｍ^２）および重量（ｇ）をそれぞれ隔日および屠殺時に測定した。データは平均±ＳＥＭとして表されている。 Ｂ１６．Ｆ０（７×１０^４）細胞を接種し、かつＰＢＳ、Ｒ４８４、カチオン性Ｒ８４８－ＮＣもしくは両性Ｒ８４８－ＮＣナノカプセルで静脈内もしくは皮下治療したＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓の免疫表現型分析を示す。Ａ）総リンパ球様細胞数。Ｂ）ＮＫ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞。

定義
本出願において本明細書中で使用される全ての用語は、特に明記しない限り、当該技術分野で知られているそれらの通常の意味で理解されるものとする。本出願において使用されている特定の用語のための他のより具体的な定義は以下に記載されているとおりであり、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して適用されることを意図している。

本明細書で使用される「約～」または「～前後」または「およそ～」という用語は、値の範囲±指定されている値の１０％を指す。例えば「約１０」または「１０前後」という表現は１０±１０％、すなわち９～１１を含む。

本明細書で使用される「１つ（種）以上の」という表現は、言及されている実体の１つ以上、特に１、２、３または４つ（種）が存在し得るという事実を指す。

本明細書で使用される「任意の」という用語は、この用語が指す要素または工程が存在しても存在しなくてもよいことを意味する。

本明細書で使用される「薬物」および「治療薬」という用語は同義で使用される。

本発明において数値間隔が使用されている場合、これはその間隔の両端の値を含む。特に本明細書で使用される「～に含まれる」という用語は、その範囲の終点を含む値の範囲を指す。

本発明の目的のための「～を含む」という単語は、「～からなる」の場合を包含する。

特に明記しない限り、本明細書において言及される全ての割合は、成分の量の合計が１００％に等しいという条件で、生成物の総重量に対する重量で表されている。

「相反転」という用語は、自己乳化型ポリマーの存在下で水中油系を撹拌した場合に生じ、油中水系に戻る現象およびその逆の現象を指す。相反転による乳化は、化粧品、医薬品（例えば、薬物送達のためのベシクル）、食料品および界面活性剤の生産において広く使用されている。相反転プロセスにより、連続相において細かく分散された液滴の形成が生じる。

「室温で」という用語は、１８～３０℃、一般に２０～２５℃の範囲に含まれ得る温度を意味する。

本明細書で使用される「異なる極性の側鎖」という用語は、ポリマー鎖の物理化学的特性を変える、異なる官能基または異なる比で導入される同じ基を有する側鎖を指す。

本明細書で使用される「疎水性」という用語は、水との親和性を欠いているポリマーを指す。すなわち、それは水に溶解しない、水と混合しない、または水によって濡れないように、あるいは非常に限られた程度でのみそうであり、かつ水を吸収しない、あるいはこの場合も非常に限られた程度でのみそうであるように水をはじく傾向がある。

本明細書で使用される「親油性」という用語または「脂溶性」という用語は、脂肪、油、脂質およびヘキサンまたはトルエンなどの非極性溶媒に溶解する化合物の能力を指す。

本明細書で使用される「親水性」は、水分子に引き寄せられ、かつ水によって溶解される傾向がある化合物を指す。

本明細書で使用される「両親媒性脂質」という用語（両親媒性物質と呼ぶ場合もある）は、脂質材料の疎水性部分が疎水性相の中に向かうと共に親水性部分が水相の方に向かうあらゆる好適な材料を指す。

本明細書で使用される、化合物の「親水性／親油性バランス」という用語は、Ｄａｖｉｅｓ（「エマルション型の定量的動態学的理論、Ｉ．乳化剤の物理化学（Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｔｙｐｅ，Ｉ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」，気体／液体および液体／液体界面（Ｇａｓ／Ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ Ｌｉｑｕｉｄ／Ｌｉｑｕｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ），界面活性の国際会議の議事録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ），ｐｐ．４２６－３８）によって記載されているように、分子の異なる領域について値を計算することにより決定される、それが親水性または親油性である程度の尺度である。特に本方法は、分子の化学基に基づく値に基づいている。

「カプセル化」という用語は、完全に架橋されたカプセル化、部分的に架橋されたカプセル化またはそれらの組み合わせを有する化合物を提供する製剤を指すことができる。

本明細書で使用される脂肪族化合物という用語は、非芳香族炭化水素である炭化水素化合物を指す。脂肪族化合物はヘキサンのような飽和であってもヘキセンおよびヘキシンのような不飽和であってもよい。

本明細書で使用される非極性溶媒は、低い誘電率を有し、かつ水と混和しない化合物に関する。

本発明の第１の態様は、それ自体が外側水性連続相に分散されている油（すなわち水不混和性相）液滴の中に分散されている内側水滴を含む多層水中油中水型ナノカプセル化物であって、
（１）内側水滴は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物および第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第１のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー１）および（ｂ）水溶性ポリアミン１の両方のアミン基とのポリイソシアネート１の界面における反応による相反転により油中水型乳化プロセスにおいて得ることができる、
（２）油滴は、第２のエマルションのための有機相または分散相とみなされ、かつその中に分散された内側水滴および第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第２のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー２）および（ｂ）ポリイソシアネート２の両方のイソシアネート基とのポリアミン２の界面におけるその反応による相反転により水中油型乳化プロセスにおいて得ることができる、
当該プレポリマーすなわちプレポリマー１およびプレポリマー２は両方とも、異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、両方のプレポリマーの主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性繰り返し単位を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基はアミン末端基であり、かつプレポリマー２の２つのエンド末端官能基はイソシアネート末端基である
という特徴を有する、多層水中油中水型ナノカプセル化物に関する。

内側水滴は、内側水滴よりも大きい油滴である油滴内に分散されている。

特定の実施形態では、プレポリマー１のアミン末端基は第一級アミン末端基である。別の特定の実施形態では、プレポリマー１のアミン末端基は第二級アミン基である。

疎水性繰り返し単位の例は、Ｃ３６脂肪族二量体ジオール（プリポール２０３３）、Ｎ－オクタデシルプロパン－１，３－ジアミン（Ｇｅｎａｍｉｎ ＴＡＰ １００ＤまたはＤｕｏｍｅｅｎ Ｔ）、および（１Ｅ，１９Ｅ）－１０，１１－ジオクチルイコサ－１，１９－ジエン－１，２０－ジアミン（Ｐｒｉａｍｉｎｅ １０７４）である。

特定の実施形態では、プレポリマー１または２のいずれかの主鎖は疎水性繰り返し単位を含む。

異なる極性の側鎖は特に、例えばアルキル鎖、アルキルアミン鎖またはアルキルエーテル鎖であってもよい。アルキル鎖は例えば（Ｃ_２～Ｃ_１２）アルキル鎖であってもよく、特定の実施形態では、アルキル鎖は（Ｃ_３～Ｃ_１０）アルキル鎖であり、別の特定の実施形態では、アルキル鎖は（Ｃ_４～Ｃ_８）アルキル鎖である。アルキルアミンは例えば（Ｃ_２～Ｃ_１２）アルキルアミンであってもよく、特定の実施形態では、アルキルは（Ｃ_３～Ｃ_１０）アルキルアミンであり、別の特定の実施形態では、アルキルは（Ｃ_４～Ｃ_８）アルキルアミンである。それらは第一級、第二級もしくは第三級アミンであってもよい。アルキルエーテルは例えば（Ｃ_２～Ｃ_１２）アルキルエーテルであってもよく、特定の実施形態では、アルキルは（Ｃ_３～Ｃ_１０）アルキルエーテルであり、別の特定の実施形態では、アルキルは（Ｃ_４～Ｃ_８）アルキルエーテルである。特定の実施形態では、アルキルエーテルは、特に（Ｃ_２～Ｃ_１２）炭素原子を有するポリエチレングリコールエーテルである。

別の特定の実施形態では、ポリアルコールまたはポリアミン炭水化物は、特にバイオターゲットまたは生分解性基を有するポリマー骨格に導入されている。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、二重壁の水中油中水型ナノカプセル化物である。

第１のカプセル化では、第１のエマルションは、水と混和しない有機溶媒を高速撹拌しながら室温でゆっくりと添加すること、およびこの溶媒が反応器において水よりも高い濃度にある瞬間に予め設計された両親媒性ポリマーの乳化能力によって媒介される相反転により生成することができる。

第２の反転は、第２のカプセル化工程中に反応器において水の濃度が有機相の濃度よりも高い場合に生じる。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、２０～５０ｎｍの範囲、好ましくは２５～４０ｎｍの範囲に含まれる流体力学的直径を有するものである。流体力学的直径は、０．０５～０．１％の濃度の固形分においてＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（動的光散乱法）により測定する。

流体力学的直径（Ｄ_Ｈ）は、測定されている粒子または分子と同じ速度で拡散する硬い球体の直径である。流体力学的直径は粒子「コア」のサイズだけでなく、任意の表面構造ならびに媒体中の任意のイオンの種類および濃度によっても決まる。

プレポリマー組成物は、ナノ液滴が乳化中に安定なままであり、かつ大きいサイズに成長しないことを保証する。プレポリマー１およびプレポリマー２は自己乳化型反応性ポリマーであり、分散剤として挙動し、かつエマルションを自己乳化させると共に、同時に反応性であり、これは、それらがカプセル化に介入してナノカプセル化物の壁を形成することを意味する。当該プレポリマーの自己乳化特性は、外部界面活性剤の添加および乳化中の高剪断（４００～５００ｒｐｍの間）撹拌の必要性を回避する。界面活性剤などのいくつかの添加剤は一般に最終生成物から除去することが難しいため、これは有利である。当該製品が食品、化粧品または医薬品のいずれかである場合、残っている乳化剤が消費者において接触アレルギーまたは過敏症を誘発する恐れがあるため、この問題はより深刻になる。その上、技術的限界により大規模生産においてこれらの要求を果たすことは難しいため、高速撹拌の必要性を回避することが有利である。

プレポリマー１および２を調製するためのプロセスは、多官能性ポリウレタン／ポリ尿素プレポリマーを調製するために容易に規模を拡大させることができるプロセスである。特定の程度の官能性が存在してもよい。より高い程度の官能性は、多層の官能化可能なポリウレタン－ポリ尿素ナノカプセル化物の調製においてより高い程度の官能性を有するプレポリマーを使用すること、またはそのような官能性を追加することにより達成することができる。この点に関しては、このプロセスの後の化学的汎用性は、生分解性結合などの幅広い潜在的官能性、例えば反応条件下で生分解性であるジスルフィド結合の組み込みを可能にする。

それはリガンド、荷電モノマーおよび異なる極性のダングリング鎖を標的化する炭水化物をベースとする部分も含んでもよい。また最後に、これらの官能性はペプチド、エステル、エーテルなどであってもよい。

その上、当該プレポリマーの設計を修正し、かつ様々な生物学的官能性を与えて、より大きい生分解性、細胞外もしくは細胞内媒体の特定の条件下での選択的放出、媒体に従ったその表面電荷の修飾、生物の特徴的領域または標的組織における選択的蓄積などを与えることができる。

特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁が独立してジオールエステル基、ジオール蛍光含有基、ジアミン蛍光含有基、ポリアルコール炭水化物基、ポリアミン炭水化物基、ペプチド基、ジオールエーテル基、標的リガンド、バイオリガンドおよび荷電モノマーから選択される基で官能化されているものである。官能化は、イソシアネート基に対するポリアルコールおよびポリアミンの反応によるポリウレタン／ポリ尿素形成により行う。

プレポリマー１および２は、その調製プロセスによって定めることができる。

プレポリマー１は、ａ１）ジスルフィド結合を含むポリアルコール、ｂ１）ポリアルコール、ｃ１）ポリアミンおよびｄ１）ポリイソシアネートを反応させることを含むプロセスによって得ることが可能であってもよい。

ジスルフィド結合を含むポリアルコールａ１）は、例えばジヒドロキシ（Ｃ_２～Ｃ_６）アルキルジスルフィドであってもよい。特定の実施形態では、ジスルフィド結合を含むポリアルコールａ）は、２．２’－ジヒドロキシエチルジスルフィド（ＤＥＤＳ）であってもよい。

ポリアルコールｂ１）は、１０００～３０００の分子量ＭＷを有するポリエチレングリコール（ＹＭＥＲ Ｎ１２０のような、直鎖状二官能性ポリエチレングリコールモノメチル）であってもよい。分子量はサイズ排除クロマトグラフィにより測定することができる。特定の実施形態では、１０００～３０００の分子量ＭＷを有するポリエチレングリコールは市販もしくは公知の化合物である。別の特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは１０００の分子量ＭＷを有する。別の特定の実施形態では、ポリエチレングリコールはジオールポリエチレングリコールである。またポリアルコールは二量体ジオールなどの脂肪性ジオール、例えば二量体リノール酸ジオールであるプリポール２０３３（登録商標）であってもよい。

ポリアミンｃ１）は（Ｃ_１０～Ｃ_４０）脂肪族ポリアミンであり、すなわち、それは疎水性化合物であり、ポリアミンは直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。別の特定の実施形態では、ポリアミンｃ１）は直鎖状（Ｃ_１０～Ｃ_４０）アルキルポリアミンである。この（Ｃ_１０～Ｃ_４０）アルキルポリアミンは第一級もしくは第二級基を有していてもよい。別の特定の実施形態では、直鎖状もしくは分岐鎖状（Ｃ_１０～Ｃ_４０）アルキルポリアミンは（Ｃ_１０～Ｃ_２０）アルキル鎖を有する。この脂肪族鎖はカプセル化分子のミセル形態および安定化に寄与する。特定の実施形態では、（Ｃ_１０～Ｃ_４０）脂肪族ポリアミンは（Ｃ_１０～Ｃ_２５）脂肪族ポリアミンである。

別の特定の実施形態では、（Ｃ_１０～Ｃ_４０）アルキルポリアミンは、１，３－ジアミノ－Ｎ－オクタデシルプロパン、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロパノールアミン、（Ｚ）－Ｎ－９－オクタデセニルプロパン－１，３－ジアミン、（Ｚ）－オクタデカ－９－エニルアミン、Ｎ－テトラデシルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ－ドデシルプロパン－１，３－ジアミン、Ｎ－［（１０Ｚ）－ヘプタデカ－１０－エン－１－イル］プロパン－１，３－ジアミンまたはＮ－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イル］プロパン－１，３－ジアミンからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、（Ｃ_１０～Ｃ_４０）アルキルアミンは１，３－ジアミノ－Ｎ－オクタデシルプロパンである。

ポリイソシアネートｄ１）は、例えば脂肪族ジイソシアネートまたはアルキル芳香族ジイソシアネートであってもよい。特定の実施形態では、ポリイソシアネートはイソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、メチルキシリレンジイソシアネート（ＭＸＤＩ）、テトラメチルキシレンジイソシアネート（ＴＭＸＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート（ＴＭＤＩ）、ジシクロヘキシルメタン－４，４’－ジイソシアネート（Ｃｏｖｅｓｔｒｏ社製のＤｅｓｍｏｄｕｒ Ｗ（登録商標））または上記からの二官能性プレポリマーからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、ポリイソシアネートは、脂肪族構造および比較的高い蒸気圧力によりその毒性が減少し、かつ２つのＮＣＯ基が異なる反応性で作用し、それが重付加制御の向上に寄与するという理由から、特別に好ましいイソホロンジイソシアネートである。

特定の実施形態では、プレポリマー１の当量の比の開始成分は、以下：
１：０．３～１：０．６の範囲のポリイソシアネートｄ１）／ポリアルコールａ１（ジスルフィド結合）、
１：０．０５～１：０．１５の範囲のポリイソシアネートｄ１）／ポリアルコールｂ１（ポリエチレングリコール）、および
１：０．２～１：０．８の範囲のポリイソシアネートｄ１）／ポリアミンｃ１（疎水性の調整）
である。

別の特定の実施形態では、プレポリマー１の当量の比の開始成分は、以下：
１：０．４５のポリイソシアネートｄ１）／ポリアルコールａ１（ジスルフィド結合）、
１：０．０９のポリイソシアネートｄ１）／ポリアルコールｂ１（ポリエチレングリコール）、および
１：０．５５のポリイソシアネートｄ１）／ポリアミンｃ１（疎水性の調整）
である。

プレポリマー２は、対応するアミノ前駆体プレポリマー（プレポリマー３）から第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を形成する場合にその場で得てもよい。

プレポリマー３は、ａ２）ジスルフィド結合を含むポリアルコール、ｂ２）ポリアルコール、ｃ２）ポリアミンｄ２）ジオール－ポリアミンおよびｅ２）ポリイソシアネートを反応させることを含むプロセスによって得ることが可能であってもよい。

ジスルフィド結合を含むポリアルコールａ２）は独立して、ポリアルコールａ１）と同じ群から選択される。

ポリアルコールｂ２）は独立してポリアルコールｂ１）と同じ群から選択される。

ポリアミンｃ２）は独立してポリアミンｃ１）と同じ群から選択される。

ジオール－ポリアミンｄ２）は、２つのアルコール位置を含む第三級（Ｃ_８～Ｃ_２０）アルキルジアミンからなる群から選択される。例としては、Ｎ（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロパノールアミンが挙げられる。

ポリイソシアネートｅ２）は独立して、ポリイソシアネートｄ１）と同じ群から選択される。

プレポリマー１および３は溶媒の存在下で調製することができる。プレポリマー１の調製に適した溶媒は例えばアセトンである。プレポリマー３の調製に適した溶媒は、例えばテトラヒドロフランである。

特定の実施形態では、プレポリマー３の当量の比の開始成分は、以下のとおりである。

特定の実施形態では、プレポリマー３の当量の比の開始成分は、以下：
１：０．０５～１：０．２の範囲のポリイソシアネートｅ２）／ポリアルコールａ２（ジスルフィド結合）、
１：０．２～１：０．６の範囲のポリイソシアネートｅ２）／ポリアルコールｂ２（ポリエチレングリコール）、
１：０．２～１：０．８の範囲のポリイソシアネートｅ２）／ポリアミンｃ２（疎水性の調整）、および
１：０．０５～１：０．３の範囲のポリイソシアネートｅ２）／ジオール－ポリアミンｄ２
である。

別の特定の実施形態では、プレポリマー３の当量の比の開始成分は、以下：
１：０．１６のポリイソシアネートｅ２）／ポリアルコールａ２（ジスルフィド結合）
１：０．３１のポリイソシアネートｅ２）／ポリアルコールｂ２（ポリエチレングリコール）
１：０．４８のポリイソシアネートｅ２）／ポリアミンｃ２（疎水性の調整）
１：０．１２のポリイソシアネートｅ２）／ポリアミンｄ２（ジオール－ジアミン）
である。

そのような官能性を含むプレポリマーは、多層構造体を生じさせる油－水界面または水－油界面におけるそれらのＨＬＢおよび自己層状化により、規則正しいシェルを作り出す。これらのプレポリマーのＨＬＢは、最終ナノ－カプセル化の粒径を制御するために増減させることもできる。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた特定の実施形態では、プレポリマー１は１０以下のＨＬＢ値を有する。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、プレポリマー３は１０よりも高いＨＬＢ値を有する。別の特定の実施形態では、ＨＬＢは１５以上である。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、水溶性ポリアミン１は、ジアミン、トリアミン、テトラアミンおよびペンタアミンからなる群から選択される。水溶性ポリアミン１は脂肪族もしくはアルキル芳香族ポリアミンであってもよい。特定の実施形態では、ポリアミンはアルキル芳香族アミンである。別の特定の実施形態では、芳香族アミンはメチルキシリレンジアミンである。別の特定の実施形態では、ポリアミンは脂肪族アミンである。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、ポリアミン１は、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、Ｌ－リジン、グアニジン、メチルキシリレンジアミン（ＭＸＤＡ）、スルホン化ポリアミンおよびカルボキシル化ポリアミンからなる群から選択される。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、ポリアミンは、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）およびＬ－リジンならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、ポリイソシアネート１は生分解された製品の良好な生体適合性および減少した毒性を保証する多脂肪族イソシアネートである。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、多脂肪族イソシアネートは、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、メチルキシリレンジイソシアネート（ＭＸＤＩ）、テトラメチルキシレンジイソシアネート（ＴＭＸＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）、トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート（ＴＭＤＩ）、ジシクロヘキシルメタン－４，４’－ジイソシアネート（Ｃｏｖｅｓｔｒｏ社製のＤｅｓｍｏｄｕｒ Ｗ（登録商標））からなるジイソシアネート群、および上記から得られる二官能性ＮＣＯ末端ポリウレタンベースのプレポリマーから選択される。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、多脂肪族イソシアネートは、キシリレンジイソシアネートのトリメチロールプロパン付加物（Ｍｉｔｓｕｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のＴａｋｅｎａｔｅ Ｄ１１０－Ｎ）、１，３，５－トリス（５－イソシアナトペンチル）－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンおよび２－メチルプロピル＝Ｎ－（５－イソシアナトペンチル）－Ｎ－（５－イソシアナトペンタイルカルバモイル）カルバメート（Ｍｉｔｓｕｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のＳｔａｂｉｏ Ｎ３７６）、脂肪族ポリイソシアネートＨＤＩウレトジオン（Ｃｏｖｅｓｔｒｏ社製のＤｅｓｍｏｄｕｒ Ｎ－３４００およびＮ－３６００など）、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする親水性脂肪族ポリイソシアネート（Ｃｏｖｅｓｔｒｏ社製のＢａｙｈｙｄｕｒ ＸＰ２６５５およびＢａｙｈｙｄｕｒ ３１００など）、および多官能性ＮＣＯ末端プレポリマーからなるポリイソシアネート群から選択される。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、ポリアミン２は独立して、それらの混合物を含む上に定義されているポリアミン１と同じ群から選択される。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた特定の実施形態では、ポリアミン２はＤＥＴＡおよびＬ－リジンの混合物である。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた特定の実施形態では、ポリアミン２はポリアミン炭水化物である。上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた特定の実施形態では、ポリアミン２はキトビオースまたはキトサンである。増量剤または前架橋剤としてのＬ－リジンの使用により、ミセルのサイズおよび表面特性を調整し、最後にＤＥＴＡまたは別の種類のポリアミン誘導体による架橋によって安定化された非常に小型の実体に達する。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、ポリイソシアネート２は独立して、上に定義されているポリイソシアネート１と同じ群から選択される。

本発明のプレポリマーは化学的に官能化させることも、汎用的かつ容易な方法でバイオリガンドにより官能化させることもできる。官能化は外壁について、欧州特許第２９９２９５３Ａ２号に開示されているように行うことができる。内壁の官能化は類似の方法で行うことができる。これにより、ナノカプセルを生物の特定の場所に導き、かつ同様に官能化された内壁を有することにより外壁がそのような場所において消失した場合に、ナノカプセルを細胞小器官またはリンパ系などの細胞の他のより内側の部位に導くことを可能にしてもよい。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、決定された酵素（主としてエステラーゼ）の存在下で特異的放出を制御するためのプレポリマー１またはプレポリマー３の合成におけるアルコールおよびイソシアネートの直接的な反応により、あるいは局所化された加熱を用いて（低融点エステルの場合）、ジオールエステル基をポリウレタン骨格に導入する。別の特定の実施形態では、先に記載されている壁の一方または両方は、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、エステル分解条件下での特異的放出のためにポリウレタン骨格に導入されるブタンジオールアジペートまたはポリブチレンサクシネート部分を含む。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、疎油性もしくは超疎水性特性に達するためのプレポリマー１またはプレポリマー３の合成中にジオールまたはジアミン蛍光含有基をポリウレタン骨格に導入する。別の特定の実施形態では、先に記載されている壁の一方または両方が、高性能コーティングを得るためにパーフルオロポリエーテル（Ｆｌｕｏｒｏｌｉｎｋ Ｅ１０Ｈ）を含む。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、ポリマー１の合成中に遊離イソシアネート基とのアミンもしくはアルコール反応により、あるいはＮＣ２合成プロセスにおいてその場で（水溶性アミノ化炭水化物の場合）、炭水化物基をポリウレタン骨格に導入して生体適合性／生分解性を高め、ＲＥＳ回避挙動または特異的臓器／組織標的化を高める。別の特定の実施形態では、先に記載されている壁の一方または両方がキシリトール、エリスリトールまたはキトビオースを含み、ナノカプセル全体の生分解性および生体適合性を高める。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、ナノカプセルの合成中に腫瘍細胞誘導物質をポリウレタン骨格に導入する。官能化基は２つの主要な官能基を有し、このようにしてそれは当該プレポリマーの主鎖に組み込まれたままになる。当該官能基はモノクローナル抗体であってもよく、あるいはモノクローナル抗体を含んでいてもよい。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、ペプチドをポリウレタン骨格に導入する。このペプチドは、例えばナノカプセルの外壁中にあってもよく、かつ腫瘍細胞の外側で過剰発現されたタンパク質と相互作用することができるようにしてもよい。当該ペプチドは、例えばｃ－（ＲＧＤｆＫ）であってもよい。葉酸はｃ－（ＲＧＤｆＫ）と同一の方法で組み込まれていてもよい。それは数多くの癌細胞において過剰発現されている葉酸受容体タンパク質と相互作用してもよい。

官能化要素が２つの主要な官能基を有していない場合、それを最初に例えばジイソシアネートまたはポリイソシアネートなどのリンカーと反応させることができる。このように、官能性要素とリンカーとの結合により、上に示されている官能基を得ることが可能になる。例として、当該ペプチドをジイソシアネートまたはポリイソシアネート（例えばＢａｙｈｙｄｕｒ ３１００（登録商標）など）と反応させることができ、反応生成物を第２のカプセル化の有機相に添加することができる。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁の調製において、プレポリマー１またはプレポリマー３の合成中にジオールエーテル基をポリウレタン骨格に導入する。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、プレポリマー２が第二級アミノエンド末端基を有すること以外はプレポリマー２と同じ構造を有するプレポリマー３の前駆体からその場で得ることができるものである。

プレポリマー３のポリウレタン／ポリ尿素組成物は、プレポリマー１と同じであるかそれよりも小さいＨＬＢ値（上述のＤａｖｉｅｓ方法を用いて計算される理論上の値）を有する。

特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物が医薬有効成分、ペプチド、抗体、ビタミンＣ、ｐＨ調節剤、オリゴヌクレオチド、炭水化物、水溶性蛍光体、水溶性金属医薬および水溶性酸素バリア化合物（ガスバリアコーティングにおける用途のため）からなる群から選択されるものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、中心の水コアにカプセル化された水溶性ペプチドを有するものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、中心の水コアにカプセル化されたＢａｃ７、ＴＡＴ、バンコマイシンまたはポリミキシンＢを有するものである。Ｂａｃ７およびＴＡＴは抗生物質として有用な公知のペプチドである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物（親水性薬物）が黒色腫に対して免疫系を活性化させるためのＴＬＲ７／８アゴニストであるものである。別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物がレシキモド（Ｒ８４８）またはイミキモドであるものである。薬物がレシキモドまたはイミキモドである場合、本発明のナノカプセル化物は免疫療法に使用するためのものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物（親水性薬物）がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビンおよびエトポシドから選択される化学療法剤であるものである。当該薬物が化学療法剤である場合、本発明のナノカプセル化物は化学療法に使用するためのものである。

カプセル化させることができる薬物の他の例は、レムデシビル（この場合、それを含有するナノカプセル化物は抗ウイルス剤として使用するためのものである）、ゲムシタビン＋パクリタキセルのカクテル（この場合、それらを含有するナノカプセル化物は化学療法に使用するためのものである）、レシキモド＋イリノテカン、シスプラチン＋レシキモドまたはパクリタキセル＋レシキモド（この場合、それらを含有するナノカプセル化物は化学療法および免疫療法において使用するためのものである）、メロペネム、エルタペネム、トブラマイシンまたはシプロフロキサシン（この場合、本ナノカプセル化物は抗生物質として使用するためのものである）である。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、中心の水コアにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを有するものである。オリゴヌクレオチドのナノカプセル化物は遺伝子治療に使用するためのものである。遺伝子治療に一般に使用されるこれらの化合物は通常、環境（温度、空気など）に非常に敏感であり、容易に変性または分解し、さらにそれらの不活性化を引き起こすため、多層水中油中水型ナノカプセル化物を用いたこれらの化合物のカプセル化は有利である。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物はペプチドを有するものであり、この場合、本ナノカプセル化物は異なる医療分野（腫瘍学、抗菌剤、再生医療など）に使用するためのものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は抗体、特にモノクローナル抗体、例えば抗Ｈｅｒ２を有するものであり、この場合、本ナノカプセル化物は乳癌の治療に使用するためのものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、中心の水コアにカプセル化された水溶性の紫外可視、ＮＩＲすなわち近赤外蛍光体を有するものである。別の特定の実施形態では、水溶性蛍光体は４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）である。別の特定の実施形態では、水溶性蛍光体はヨウ化プロピジウムである。別の特定の実施形態では、水溶性蛍光体はインドシアニングリーンである。別の特定の実施形態では、水溶性蛍光体はＤｉＩである。水溶性蛍光体を含むナノカプセルは生体イメージングのため、特にナノカプセルの生物学的経路を監視するため、および遊離およびカプセル化蓄積の区別のために使用するためのものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は中心の水コアにカプセル化された水溶性金属医薬を有するものである。これらの水溶性金属医薬の例はシスプラチン、カルボプラチン、水溶性ルテニウムおよびイリジウムベースの化合物および誘導体である。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、生理食塩水緩衝液を中心の水コアにカプセル化するものである。生理食塩水緩衝液の例は、活性が制御されない細胞外もしくは細胞内領域においてｐＨを制御することを可能にするアスコルビン酸、炭酸塩または他の緩衝液である。生理食塩水緩衝液を含む本ナノカプセル化物は化粧品および医薬品に使用される。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、水溶性酸素バリア化合物をカプセル化するものである（ガスバリアコーティングにおける用途のため）。これらのナノカプセル化物は、高い酸素バリアにより水溶性化合物を安定化させるナノエマルションを作り出すのに有用である。特定の実施形態では、水溶性酸素バリア化合物は、ポリビニルアルコール、カチオン性もしくはアニオン性ポリビニルアルコール誘導体（Ｋｕｒａｒａｙ（登録商標）社の取り扱い製品Ｍｏｗｉｏｌ（商標））、Ｇａｎｔｒｅｚ（商標）ポリマーライン（Ａｓｈｌａｎｄ（登録商標）社製）、ポリメチルビニルエーテル－ｃｏ－マレイン酸、アセチル化ポリビニルアルコールまたは炭水化物である。

特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、油滴が油相に可溶化された化学的／生物学的活性化合物をさらに含むものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、親水性薬物を中心のコアにカプセル化し、かつ異なる作用（例えば細胞毒性）の脂溶性薬物を油相にカプセル化するものである。両活性化合物は対応する壁組成に従って、異なる蓄積および放出系を有していてもよい。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、ポリウレタン－ポリ尿素壁が各壁の選択的放出を可能にする方法で官能化されており、それにより例えば酸化または還元により、あるいは加水分解酵素（エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、炭水化物加水分解酵素など）により、当該壁のそれぞれに異なる放出系を与えるものである。

別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は、油相中に有機溶媒を含まないものである。

本発明の水中油中水型多層ポリマーナノカプセル化物を調製するためのプロセスは本発明の一部でもある。本プロセスは、ａ）以下の工程：ａ１）水溶性の化学的／生物学的活性化合物、プレポリマー１）および水溶性ポリアミン１を所与の体積の水の中で混合する工程、ａ２）水と混和しない５～７倍多くの量の有機溶媒を添加して、相反転により第１のエマルションを生成する工程、ａ３）プレポリマー１および水溶性ポリアミンのアミンとの界面においてその化学量論的反応により水溶性の化学的／生物学的薬剤のために第１のカプセル化の壁を作り出すためのエマルションのために選択された有機溶媒に可溶なポリイソシアネート１を添加する工程を含むプロセスによって最初に第１のＷ／Ｏ型カプセル化を行う工程と、ｂ）以下の工程：ｂ１）先のカプセル化にイソシアネート基の代わりに第二級アミン末端基を有するプレポリマー２の対応する前駆体であるプレポリマー３を添加する工程、ｂ２）工程ｂ１）の混合物を当量のプレポリマー３からの当量の過剰なポリイソシアネートの上に添加してその場でプレポリマー２を形成する工程、ｂ３）必要な量の水を添加して第２の相反転により第２のエマルションを生成する工程、ｂ４）水溶性ポリアミン２を添加して、プレポリマー２からのイソシアネートと過剰に添加された遊離イソシアネートとの界面におけるその反応により第２のカプセル化の壁を作り出す工程を含むプロセスによって、第２のＯ／Ｗ型カプセル化を行う工程と、ｃ）任意に有機溶媒を蒸発させる工程と、ｄ）任意に工程ｃ）の水中油中水型エマルションを透析する工程とを含み、ここではプレポリマー１、プレポリマー２およびプレポリマー３は独立して、異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、当該プレポリマーのそれぞれの主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性繰り返し単位を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基であり、かつプレポリマー２の２つのエンド末端官能基はイソシアネート末端基であり、プレポリマー３の２つのエンド末端官能基は第一級もしくは第二級アミン末端基である。

特定の実施形態では、プレポリマー３の２つのエンド末端官能基は第一級もしくは第二級アミン末端基である。

特定の実施形態では、プレポリマー１、２または３のいずれかの主鎖は疎水性繰り返し単位を含む。

対応するＮＣＯ反応性ポリマーを得るためのナノカプセル化工程中にその場で再活性化されやすいアミン末端ポリマーであるプレポリマー３の使用は、加水分解しやすく、かつ経時的にＮＣＯ含有量を失う傾向があるＰＥＧなどの親水性基を含むこれらの種類のプレポリマーを使用することを可能にする。

プレポリマー３は有機溶媒に可溶である。

上述のように、両方のプレポリマーすなわちプレポリマー１およびプレポリマー２は自己乳化剤であり、プレポリマー１は、反応器において水不混和性溶媒が水よりも高い濃度にある瞬間に乳化する能力を有する。プレポリマー２は、反応器において水が有機溶媒よりも高い濃度にある瞬間に乳化する能力を有する。従って別の特定の実施形態では、上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は乳化剤を含んでいないものである。当該ナノカプセル化物は、乳化剤の添加およびカプセル化物が合成された際のその後の除去を回避するので、これは有利である。

当該反応は、ＮＣＯが２２８０～２２３０ｃｍ^－１において非常に明確かつ特徴的な伸縮振動バンドを有していれば、ＩＲ分光法により容易に制御することができる。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、プレポリマー３のポリウレタン／ポリ尿素組成物は、プレポリマー１のポリウレタン／ポリ尿素組成物のＨＬＢよりも高いＨＬＢ値を有する。

別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、プレポリマー１のアミン基は１０以下のＨＬＢ値を有する。別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、プレポリマー３のアミン基は１０以上のＨＬＢ値を有する。

上記または下記実施形態のいずれかと組み合わせた特定の実施形態では、工程ａ２）における溶媒を高速撹拌しながらゆっくりと添加する。

別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、工程ａ）およびｂ）は室温で行う。別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、工程ｃ）は低い圧力および３５～４０℃の範囲に含まれる温度で行う。

別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、第１のカプセル化（工程ａ２）は、（Ｃ_６～Ｃ_７）アルカン、（Ｃ_６～Ｃ_９）芳香族炭化水素または塩素化溶媒（例えば、シクロヘキサン、ヘキサン、トルエン、クロロホルムまたはジクロロメタン）であってもよい水不混和性溶媒を用いて行う。別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、第１のカプセル化では、エマルションを形成するために特定の回転速度（２００ｒｐｍ～５００ｒｐｍ）を使用する。

別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、カプセルは中間有機相として高沸点有機油を用いて合成したものでもある（脂溶性化合物をこの油に溶解された２つの壁の間の有機相において帯電させることができるＷ／Ｏ／Ｗ系）。

別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、透析は、最後の水相に残った分子（非カプセル化薬物、僅かに過剰な未反応アミンなど）を除去する１０ｋＤａの膜を用いて水中で２４～７２時間行う。

得られた生成物は、２つの合成のナノ構造化壁を有するＷ／Ｏ／Ｗ型カプセルである。

溶媒の除去により、大きく安定化された２０～５００ｎｍの流体力学的直径（ＤＬＳによる流体力学的直径）を有するＷ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセル化物を得ることが可能になる。特定の実施形態では、流体力学的直径は２０～１００ｎｍである。別の特定の実施形態では、流体力学的直径は２０～５０ｎｍである。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、有機溶媒を低い圧力および適度な温度（３５～４０℃）で蒸発させる。中間溶媒を抽出して親水性コア（溶解された化学的／生物学的化合物を含む）を得る場合、プレポリマー１によって形成された壁は、プレポリマー２によって形成された壁および分散剤相としての水と直接接触している（カプセルＷ／／Ｗ’’）。

第１のカプセル化の直後にイソシアネート基の一部と反応して、表面電荷に関して両性挙動を定めるカルボキシル基を当該壁の中に導入するアミノ酸を添加するカプセルも調製した（これは癌細胞に選択的に蓄積させるために使用される方法である）。

本発明の水中油中水型多層ポリマーナノカプセル化物はその調製プロセスによって定めることができる。従って、上に開示されている特定の実施形態および／または好ましい実施形態のいずれかを含む上に定義されているプロセスによって得ることができる水中油中水型多層ポリマーナノカプセル化物は本発明の一部である。

癌の治療に使用するために、親水性薬物を中心のコアにカプセル化し、かつ異なる作用（例えば細胞毒性）の脂溶性薬物を油相にカプセル化する上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物は本発明の一部である。

蛍光ガイド外科手術などの技術における、水溶性蛍光体（ＮＩＲすなわち近赤外）をカプセル化する上に定義されている多層水中油中水型ナノカプセル化物の使用は本発明の一部である。そのような蛍光体の例はＤＡＰＩ、ＩＣＧおよびヨウ化プロピジウムである。

リポソームは、水性コアおよび脂質相にそれぞれ封入される親水性および疎水性薬物の両方を充填することができる。それらは生体適合性および広い用途に関して明確な利点を与える。多層水中油中水型リポソームは本発明の一部である。本発明の別の態様は、より大きい油滴内に分散されている内側水滴を含むハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームであって、ａ）内側水滴は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物および第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第１のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー１）および（ｂ）水溶性ポリアミン１の両方のアミン基とのポリイソシアネート１の界面における反応による相反転により油中水型乳化プロセスにおいて得ることができ、プレポリマー１は異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および疎水性繰り返し単位を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基であり、かつｂ）油滴は、その中に分散された内側水滴およびリポソームの構造に似ている外壁を含み、外壁はジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの表面配置により水中油型乳化において得ることができる、ハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームに関する。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、プレポリマー１の主鎖は疎水性繰り返し単位を含む。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、多層水中油中水型リポソームは油相中に有機溶媒を含んでいない。

内側水滴に関する多層水中油中水型ナノカプセル化物の全ての特定の実施形態は、ハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームの特定の実施形態でもある。

ハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームを調製するためのプロセスも本発明の一部であり、本プロセスは、
ａ）以下の工程：
ａ１）水溶性の化学的／生物学的活性化合物、プレポリマー１）および水溶性ポリアミン１を所与の体積（０．０５～０．５ｍＬ）の水の中で混合する工程、
ａ２）水と混和しない必要な量の有機溶媒を添加して、相反転により第１のエマルションを生成する工程、ａ３）プレポリマー１および水溶性ポリアミンのアミンとの界面におけるその反応により水溶性の化学的／生物学的薬剤のために第１のカプセル化の壁を作り出すためのエマルションのために選択された有機溶媒に可溶なポリイソシアネート１を添加する工程
を含むプロセスによって最初に第１のＷ／Ｏ型カプセル化を行う工程であって、
プレポリマー１は、異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、プレポリマー１のそれぞれの主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、疎水性繰り返し単位、ジスルフィド結合およびアミン結合を含み、プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基である工程と、
ｂ）以下の工程：
ｂ１）先のカプセル化に第１の好適な溶媒に含まれているジパルミトイルホスファチジルコリンおよび第２の好適な溶媒に含まれているコレステロールを添加する工程、
ｂ２）必要な量の水を添加して第２の相反転により第２のエマルションを生成し、かつジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの表面の配置により外壁を作り出す工程を含むプロセスによって、第２のＯ／Ｗ型カプセル化を行う工程と、
ｃ）任意に有機溶媒を蒸発させる工程と、
ｄ）任意に工程ｃ）の水中油中水型油エマルションを透析する工程と
を含む。

特定の実施形態では、プレポリマー１の主鎖は疎水性繰り返し単位を含む。

ジパルミトイルホスファチジルコリンに適した溶媒の例はエタノールである。コレステロールに適した溶媒の例はテトラヒドロフランである。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、コレステロール／ＤＰＰＣのモル比は１：４～１：６の範囲である。別の特定の実施形態ではコレステロール／ＤＰＰＣのモル比は１：５～１：６の範囲である。別の特定の実施形態では、コレステロール／ＤＰＰＣのモル比は１：５．８５である。コレステロール／ＤＰＰＣ比を低下させた場合、より小さい構造体を得ることができる。約１：６の比を有するコレステロール／ＤＰＰＣを用いた場合、約２０～８０ｎｍの脂質で包まれたナノカプセル化物が得られる。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、脂質で包まれたナノカプセル化物から有機溶媒を除去する。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、有機溶媒を低い圧力および適度な温度（３０～４０℃）で蒸発させる。中間溶媒を抽出して親水性コア（溶解された化学的／生物学的化合物を含む）を得る場合、プレポリマー１によって形成された壁は、リポソームによって形成された壁および分散剤相としての水と直接接触している。

別の特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、試料を透析する工程は、最後の水相に残った分子（非カプセル化薬物、僅かに過剰な未反応アミンなど）を除去する１０ｋＤａの膜を用いて、水、特にＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で２４～７２時間行う。

本発明のハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームは、その調製プロセスによって定めることもできる。従って、本プロセスの任意の特定の実施形態または好ましい実施形態を含む上に定義されているプロセスによって得ることができるハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームは本発明の一部である。

本発明の別の態様は、担体と共に上に定義されているナノカプセル化物またはハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームを含む組成物に関する。

特定の実施形態では、上記または下記実施形態のいずれかを用いた場合、ガングリオシドのような生物学的基は、疎水性相互作用により外側リポソーム様壁の中に導入することができ、すなわちそれは担体として使用される。特定の実施形態では、ガングリオシドはＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（Ｎｅｕ５Ａｃα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１セラミド（ＧＭ１）であり、ここではハイブリッド標的化ナノカプセルは、ＨＩＶ感染に対して使用することを目的としている。

本発明の別の態様は、美容的もしくは薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に上に定義されているナノカプセル化物または上に定義されているリポソームを含む化粧品もしくは医薬組成物に関する。

本明細書および特許請求の範囲の全体を通して「を含む」という単語およびその単語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分または工程を排除することは意図されていない。さらに、「～を含む」という単語は「～からなる」の場合を包含する。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、本明細書を考察すれば当業者に明らかになり、あるいは本発明の実施によって学ぶことができる。以下の実施例および図面は例示として提供されており、本発明を限定することは意図していない。図面に関連し、かつ請求項においてカッコに入れられている参照符号は、単に請求項の理解度を高めることを試みるためのものであって、請求項の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。さらに本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態および好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。

実施例１：両親媒性ポリマーの調製（第１のカプセル化のため）
２，２’－ジヒドロキシエチルジスルフィド（ＤＥＤＳ）（２．８７ｇ、３７．２５ｍｅｑ）およびジオール－ポリエチレングリコール１０００（ＹＭＥＲ Ｎ－１２０）（３．６４ｇ、７．０２ｍｅｑ）を、機械撹拌を備えた３つ口丸底フラスコの中に室温（ｒｔ）で添加し、Ｎ２でパージした。混合物が均質になった時に、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）（８．８９ｇ、７９．９８ｍｅｑ）を穏やかに機械撹拌しながら反応器の中に添加し、反応系を６０℃に加熱した。重付加反応をこれらの条件下に維持し、ＮＣＯ伸縮振動バンド強度が変化しなくなるまでＩＲ分光法によって監視した。この時点で、このポリマーを流体化するために、乾燥アセトン（１７．５６ｍＬ）を反応混合物の中に添加した。並行して、１，３－ジアミノ－Ｎ－オクタデシルプロパン（Ｇｅｎａｍｉｎ ＴＡＰ １００Ｄ）（６．８５ｇ、４１．９８ｍｅｑ）を乾燥ＴＨＦ（５．５３ｍＬ）で溶解して、予めＮ２でパージした別の１００ｍＬの３つ口丸底フラスコの中に入れた。前者の反応混合物を半月羽根により１００ｒｐｍで機械撹拌しながらで後者の上に滴下した。ＮＣＯ伸縮振動バンド強度が完全に消失するまで反応系をＩＲにより監視した。

ＮＣＯが２２８０～２２３０ｃｍ^－１で非常に明確かつ特徴的な伸縮振動バンドを有していれば（図２を参照）、重合反応をＦＴＩＲ分光法により制御する。図２は、ポリマー合成の両方の工程におけるジオール、ジアミンおよびジイソシアネート間での重合反応の成功も示す。合成の第１の工程中に行ったＩＲスペクトル解析により、ＮＣＯ消費と共にポリウレタン結合形成が確認された。当該合成の第２の工程中に行ったＩＲスペクトル解析により、ポリ尿素形成も確認された。

実施例２：両親媒性カチオン性ポリマーの調製（第２のカプセル化のため）（Ｐ２）
２，２’－ジヒドロキシエチルジスルフィド（ＤＥＤＳ）（９０１．０ｍｇ、１１．６８ｍｅｑ）、ジオール－ポリエチレングリコール１０００（ＹＭＥＲ Ｎ－１２０）（１２．０４ｇ、２３．１８ｍｅｑ）およびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロパノールアミン（Ｊｅｆｆｃａｔ ＤＰＡ）（９８１．３ｍｇ、８．９９ｍｅｑ）を、機械撹拌を備えた３つ口丸底フラスコの中に室温（ｒｔ）で添加し、Ｎ２でパージした。混合物が均質になった時に、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）（８．１４ｇ、７３．２４ｍｅｑ）を穏やかに機械撹拌しながら反応器の中に添加した。ＮＣＯ伸縮振動バンド強度が変化しなくなるまで、重付加反応をこれらの条件下に維持し、ＩＲ分光法によって監視した。この時点で、このポリマーを流体化するために、乾燥ＴＨＦ（２１ｍＬ）を反応混合物の中に添加した。並行して、１，３－ジアミノ－Ｎ－オクタデシルプロパン（Ｇｅｎａｍｉｎ ＴＡＰ １００Ｄ）（５．９９ｇ、３５．４５ｍｅｑ）を乾燥ＴＨＦ（５．２３ｍＬ）で溶解して、予めＮ２でパージした別の１００ｍＬの３つ口丸底フラスコの中に入れた。前者の反応混合物を半月羽根により１００ｒｐｍで機械撹拌しながらで後者の上に滴下した。ＮＣＯ伸縮振動バンド強度が完全に消失するまで反応系をＩＲにより監視した。

２２８０～２２３０ｃｍ^－１でＮＣＯが非常に明確かつ特徴的な伸縮振動バンドを有すれば、重合反応をＦＴＩＲ分光法により制御する（図１を参照）。図１は、ポリマー合成の両方の工程におけるジオール、ジアミンおよびジイソシアネート間での重合反応の成功を示す。合成の第１の工程中に行ったＩＲスペクトル解析により、ＮＣＯ消費と共にポリウレタン結合形成が確認された。当該合成の第２の工程中に行ったＩＲスペクトル解析により、ポリ尿素形成も確認された。

実施例３：油中水（Ｗ／Ｏ）型カプセル化物の調製
親水性活性化合物（Ｘｍｇ、Ｙμｍｏｌ）、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（１００ｍｇ）、ポリマーＰ１（６３５．２ｍｇ、０．０８９ｍｅｑ）、ＤＥＴＡ１０％ｗ／ｗ（４５．０ｍｇ、０．１３１ｍｅｑ）および乾燥アセトン（１ｍＬ）を磁気撹拌によりバイアル中で混合し、必要であれば超音波処理により１５分間均質化し、光から保護した。シクロヘキサン（１ｍＬ）をバイアルに滴下して第１の逆相エマルションを行った。次いで、ＩＰＤＩ（４０．０ｍｇ、０．３６ｍｅｑ）を添加して第１のナノカプセル壁を架橋し、ＮＣＯの存在をＦＴＩＲにより制御する。この合成プロセスによりＮＣ１が得られる。カプセル化の最後に、第２のカプセル化の第１の工程に対して反応する遊離ＮＣＯの僅かな存在を証明するために、Ｏ／Ｗ型カプセル化反応をＦＴＩＲ分光法により制御した（図３を参照）。

実施例４：水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型カプセル化物の調製（ＮＣ１のカプセル化）
ＩＰＤＩ（２２５．０ｍｇ、２．０２ｍｅｑ）を、機械撹拌を備えた３つ口丸底フラスコの中に添加し、Ｎ２でパージし、かつ光から保護した。並行して、ＮＣ１（１．５０ｇ）、ポリマーＰ２（５．８７ｇ、０．６２ｍｅｑ）および乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）をバイアル中で混合し、フラスコの中に添加し、１５０ｒｐｍで１０分間均質化し、光から保護した。この時点で、０．９３ｇのＬ－リジンを１１．３８ｇのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解し、かつ３Ｍおよび１Ｍのアルカリ性ＮａＯＨ溶液でｐＨを１１．０に調整することにより、Ｌ－リジンのアルカリ性水溶液を調製した（７．５６重量％の総Ｌ－リジン濃度）。このＬ－リジン溶液（８５１．１ｍｇ、０．７８ｍｅｑ）を４５０ｒｐｍで添加し、１分後にＦＴＩＲにより重付加反応を確認した。次いで、有機相を冷たいＭｉｌｌｉ－Ｑ水（１２．０ｇ）により４５０ｒｐｍで乳化させ、最後にナノミセルから架橋されたＮＣを生成するために、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）の１０％ｗ／ｗ水溶液（２５３．３ｍｇのＤＥＴＡ、０．７４ｍｅｑ）を添加した。撹拌を１５０ｒｐｍまで減少させた。この重付加反応をＩＲおよびｐＨ測定により監視した。ＮＣが形成されたら、ＴＨＦを３５℃および真空下で反応器から除去し、１２～１４ｋＤａのＭＷＣＯを有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ分子多孔膜管を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ水に対する２４時間の透析精製を行った。この合成手順によりＮＣ２が得られる。

図４に示すようにＷ／Ｏ／Ｗ型カプセル化反応もＦＴＩＲ分光法により制御した。ＮＣ（それらの充填に関わらない）のＩＲスペクトルは、ナノカプセル形成の成功を示した。ＩＲスペクトルにおける紫色の線はＰ１＋ＮＣ１混合後の試料を表す。黄色の線は、決定したジイソシアネート量の上に添加したＰ１＋ＮＣ１混合物に対応している。この最初の工程は、ポリマーの再活性化およびＮＣＯ反応性実体へのその変換であった。その後に、Ｌ－リジンナトリウム塩を添加し（緑色の線）、活性化されたポリマーと反応させた。カルボニルおよびＣＮ伸縮振動バンドの増加と同時に２２５５ｃｍ^－１でのＮＣＯ伸縮振動バンドの強度の減少により、尿素形成（それぞれ１６４２ｃｍ^－１および１５３２ｃｍ^－１）が確認された。青色の線ではＮＣＯ伸縮振動バンドは維持されており、ここではＭｉｌｌｉ－Ｑ水による相反転が表されている。最後にトリアミンを添加し（赤色の線）、ＮＣＯ伸縮振動バンドは瞬時に消失し、尿素に関連するバンドは、残っているＮＣＯ基とこのポリアミンとの迅速な反応の結果としてそれらの強度を増加させた。

実施例５：水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型脂質分散系の調製（両親媒性脂質を用いたＮＣ１のカプセル化。外側リポソーム構造体）
最初に、実施例３に開示されているように油中水（Ｗ／Ｏ）型カプセル化物を調製した（ＮＣ１）。

次いで、ＮＣ１（１．００ｇ）を機械撹拌を備えた３つ口丸底フラスコの中に添加し、Ｎ２でパージし、かつ光から保護した。並行して、エタノール（２．７８ｍＬ）中にジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、４２．３ｍｇ）を含む１つの溶液およびＴＨＦ（０．６２ｍＬ）中にコレステロール（１６．００ｍｇ）を含む別の溶液を調製し、フラスコの中に添加し、１５０ｒｐｍで５分間均質化し、光から保護した。次いで、有機相を冷たいＭｉｌｌｉ－Ｑ水（１０．０ｇ）により４００ｒｐｍで滴下しながら乳化した。脂質で包まれたＮＣが形成されたら、シクロヘキサン、ＴＨＦおよびＥｔＯＨを３５℃および真空下で反応器から除去し、１２～１４ｋＤａのＭＷＣＯを有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ分子多孔膜管を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ水に対する２４時間の透析精製を行った。この合成手順によりＮＣ２が得られる。

この合成手順により、約３００～７００ｎｍの脂質で包まれたＮＣ２の形成に達した（ＤＬＳによる流体力学的直径）。コレステロール／ＤＰＰＣ比が低下した場合、表２に詳述されている量を用いて約２０～３００ｎｍのより小さい構造体が得られる。

実施例６：カルボプラチンを含むＮＣ１の物理化学的特性評価およびカルボプラチン含有量の決定
試験したナノカプセル：
・ＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－Ｌｙｓ－０２。水が充填された両性ＮＣ（対照試料）。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中で透析済み。水が充填されたＮＣ（参照）は実施例３に従って調製した。
・ＪＢ－ｃａｒｂｏＰｔ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－Ｌｙｓ－０１。水媒体中のカルボプラチンが充填された両性ＮＣ。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中で透析済み。カルボプラチンが充填されたＮＣは実施例３に従って調製した。

物理化学的特性評価：異なる分析技術によりＮＰを特性評価した。最初に、合成プロセスを赤外線分光法（ＩＲ）およびｐＨ測定により監視して、最終ポリアミンがＮＰシェルに沿って残っている反応部位を架橋することを確認した。その後に、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水に対する２４時間の透析によりＮＰを精製し、得られた生成物を動的光散乱法（ＤＬＳ）により特性評価して、ゼータ電位（ζ－ｐｏｔ）により０．０５～０．１％の固形分濃度で平均粒径を決定して異なるｐＨ条件下で表面電荷を分析し、かつＩＣＰ－ＭＳによりカルボプラチンペイロードを決定した。各技術において全ての試料を３回アッセイした。

サイズ：各試料の平均サイズが表３に示されている：

ゼータ電位：ＮＰのゼータ電位値（表面電荷）が表４に示されている。

図５は、薬物が充填された両性ＮＣを本記載の方法を用いて調製することができることを示す。

ＮＣおよびカルボプラチン含有量：ポリマー化学においてよく使用される固体濃縮機を用いてエマルション中のＮＣの濃度を定量化した。表５には、最終エマルション中のＮＣの濃度がｍｇ／ｍＬで表されている。さらに、ＮＣ内部のカルボプラチンの濃度を、以下に記載されている方法に従ってＩＣＰ－ＭＳ分析により決定した。

２０μＬのエマルション試料を５００μＬの濃縮７２％ｖ／ｖ硝酸で希釈し、次いで試料をｗｈｅａｔｏｎ ｖ－バイアル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）の中に移し、３７３Ｋの乾燥器中で１８時間加熱した。次いでこれらのバイアルを放冷し、各試料溶液を容積測定管の中に移し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（１．５ｍＬ）で洗浄しながら１つにまとめた。

消化された試料をＭｉｌｌｉ－Ｑで５回希釈して、およそ３．６％ｖ／ｖの最終ＨＮＯ_３濃度を得た。Ｃｅｎｔｒｅｓ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ ｉ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｄｅ ＢａｒｃｅｌｏｎａでＩＣＰ－ＭＳ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｌａｎ ６０００シリーズ機器により白金含有量を分析した。全てのＩＣＰ－ＭＳ実験のために使用した溶媒は、１％ＨＮＯ_３を含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水であった。白金標準（高純度標準、５％ＨＮＯ_３中に１０００μｇ／ｍＬ＋５μｇ／ｍＬ）を１％ＨＮＯ_３で２０ｐｐｂに希釈した。各実験の前に、１％ＨＮＯ_３を含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で白金標準を新たに調製した。較正曲線のために使用した濃度は全ての場合に０、０．２、０．４、１および２ｐｐｂであった。検出された同位体は１９６Ｐｔであり、読み取りを３回行った。ロジウムを全ての試料中に１０ｐｐｂの濃度で内部標準として添加した。

実施例７：ＮＣＳ ＤＡＰＩおよびＩＣＧ－１の物理化学的特性評価ならびに蛍光体含有量の決定
試験したナノカプセル（ＮＣ）：
・ＮＩ－Ｈ_２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－ＬＹＳ－０３。どんな蛍光体も含まないＮＣ（対照試料）
・ＮＩ－ＤＡＰＩ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－ＬＹＳ－０１。蛍光体ＤＡＰＩ（λ_ｅｘｃ：３５８ｎｍ／λ_ｅｍ：４６１ｎｍ）が充填されたＮＣ
・ＮＩ－ＩＣＧ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－ＬＹＳ－０１。蛍光体インドシアニングリーン（ＩＣＧ）（λ_ｅｘｃ：７８９ｎｍ／λ_ｅｍ：８１４ｎｍ）が充填されたＮＣ

物理化学的特性評価：異なる分析技術によりＮＣを特性評価した。最初に、合成プロセスを赤外線分光法（ＩＲ）およびｐＨ測定により監視して、最終ポリアミンがナノ粒子（ＮＰ）シェルに沿って残っている反応部位を架橋することを確認した。その後に、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水に対する２４時間の透析によりＮＰを精製し、得られた生成物を動的光散乱法（ＤＬＳ）（０．０５～０．１％の固形分濃度）により特性評価して、ゼータ電位（ζ－ｐｏｔ）（０．０５～０．１％の固形分濃度）により平均粒径を決定して、異なるｐＨ条件下およびＵＶ／Ｖｉｓ分光法により表面電荷を分析して（０～１Ａ．Ｕ．の吸光度範囲で水中で行った較正曲線、ここではそれは濃度に直接比例している）、ＤＡＰＩおよびＩＣＧペイロードを決定した。各技術において全ての試料を３回アッセイした。

サイズ：試料の平均サイズが表６に示されている。

ゼータ電位：ＮＣのゼータ電位値（表面電荷）を調べて、これらが両性であるか否か、および媒体のｐＨに応じて表面電荷が何か変化を受けるか否かも明らかにする。結果が表７に示されている：

表７では、媒体のｐＨに応じて異なる表面電荷を観察することができる。媒体のｐＨが６．０から８．０に増加するにつれて、ゼータ電位値は３種類の試料全てにおいて減少し、ＤＡＰＩが充填されたＮＣの場合、この値は負に変化する。

蛍光体およびＮＣ含有量：遊離蛍光体により較正曲線の作成を行った後に、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によりＮＣ内部のＩＣＧの濃度を決定した。０．２５ｍＬのＩＣＧ－ＮＣエマルション試料を２５ｍＬの容積測定フラスコ中でＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈した。希釈した試料（３回）を６５０ｎｍ～９５０ｎｍの範囲のＵＶ－Ｖｉｓで分析した。ＩＣＧピークを７９８ｎｍで評価した。ＤＡＰＩが充填されたＮＣの場合、ＩＣＧ蛍光体の場合のように較正曲線を作成することができなかったため、定性的結果しか得ることができない。ＵＶ－Ｖｉｓでこれらの試料を分析し、かつ４５０ｎｍ～２００ｎｍの範囲で試料を励起させて、蛍光体がカプセル化されたこと、および蛍光体の最大吸収が３６８ｎｍであったことを観察することができる。このＵＶ－Ｖｉｓ講義におけるＤＡＰＩ－ＮＣの濃度は１．５８ｍｇ／ｍＬであった。また、ポリマー化学においてよく使用される固体濃縮機を用いてエマルション中のＮＣの濃度を定量化した。表８では、最終エマルション中のＮＣの濃度がｍｇ／ｍＬで表されている。

内部移行アッセイ：ＩＣＧが充填されたＷ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセルについてフローサイトメトリー分析（図１０および図１１）ならびに蛍光顕微鏡分析（図１２）を行った。ＩＣＧが充填されたＷ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセルの内部移行を非分化細胞において３７℃および５％ＣＯ_２で１時間にわたって行った。健康で形の良い細胞の群を選択した。自家蛍光現象を回避するために、充填されていないナノカプセル（参照試料）とＩＣＧが充填されたナノカプセルとの蛍光比較を行った。図１１の左側のプロット（図１１ａ）において、この細胞群（充填されていない参照試料）には蛍光シグナル検出が存在しないことを明らかに観察することができる。代わりとして、検出ゾーンにおいてＩＣＧが充填されたナノカプセル（図１１ｂ）と共にインキュベートされたほぼ全ての細胞が蛍光を発することが観察される。これらの結果を支持して、図１２に示されている蛍光顕微鏡分析により、非分化肝細胞においてＩＣＧが充填されたナノカプセルについて細胞内シグナル伝達が検出される。

実施例８：樹状細胞に対するＴＬＲ７／８アゴニストレシキモド（Ｒ８４８）が充填されたナノカプセル（ＮＣ）の効果
Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で乳化されたＭｉｌｌｉ－Ｑ水コア中にＴＬＲ７／８アゴニストレシキモド（Ｒ８４８）（ＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５を参照）またはＣＯＵＰＹＳＯ３フルオロクロムのいずれかが充填されたナノカプセル（ＮＣ）を、健康な対象からの培養されたヒトの単球由来樹状細胞（ＤＣ）にインビトロで添加して、細胞免疫応答ならびにＮＣに関連する細胞毒性を評価した。

これは、ＤＣに対する同時刺激マーカーの発現およびフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ）によるそれらの生存度を測定することにより監視した。

方法：ＩＴ－Ｓ－ＩＭＭ－４６５に対する手順に従って健康なドナーの血液からＤＣを得た。

用量反応アッセイ。Ｒ８４８用量依存反応および関連する細胞毒性を評価するために、７日目の未成熟ＤＣ（１０６ＤＣ／ｍＬ）を、異なる濃度のＲ８４８－ＮＣに４８時間にわたって曝露する。ナノカプセル化Ｒ８４８の濃度は、実験上のＲ８４８値から計算する（０．９２５２±０．０６９９ｍｇ／ｍＬ）。
・空のＮＰ（陰性対照）（２．１６μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－２５）
・４μｇ／ｍＬの可溶なＲ８４８＋ＭＣ（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、１０ｍｇ／ｍＬのＰＧＥ２）（陽性対照）
・０．４μｇ／ｍＬのＲ８４８（０．４３μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・１μｇ／ｍＬのＲ８４８（１．０８μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・２μｇ／ｍＬのＲ８４８（２．１６μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・２．５μｇ／ｍＬのＲ８４８（２．７０μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・３μｇ／ｍＬのＲ８４８（３．２４μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・３．５μｇ／ｍＬのＲ８４８（３．７８μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・４μｇ／ｍＬのＲ８４８（４．３２μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）

各条件の物質を、ＦＩＴＣで標識したαＣＤ８０、ＰＥで標識したαＣＤ８３およびバックグラウンド蛍光対照としてＰＥで標識したαＩｇＧで染色し、かつフローサイトメトリーにより分析した。

さらに、ナノ粒子関連の細胞毒性を評価するために、３つの条件を実験に追加する：
・５μｇ／ｍＬのＲ８４８（５．４０μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・６μｇ／ｍＬのＲ８４８（６．４８μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）
・７μｇ／ｍＬのＲ８４８（７．５６μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５）

このアッセイでは、全ての条件の物質をＰｅｒＣｐ５．５で標識したα７－ＡＡＤ抗体で染色する。

内部移行アッセイ。ＮＣ内部移行を評価するために、７日目の未成熟ＤＣ（１０６ＤＣ／ｍＬ）を異なる濃度のＣＯＵＰＹ－ＮＣに３７℃または４℃で６時間および２４時間曝露した。低い温度はＤＣ内部移行を妨害する。ナノカプセル化ＣＯＵＰＹの濃度は、用量反応アッセイで使用したポリマーの濃度と当量の実験上のポリマー値から計算した（１７４．３５±０．２６ｍｇ／ｍＬ）（初期ポリマー濃度のＪＢ－Ｒ８４８－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０５＝２４９．９６±０．５０）。
・空のＮＰ（陰性対照）：３．２９μＬ／ｍＬのＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－２５
・Ａ：０．６１９μＬ／ｍＬのＪＢ－ＣＯＵＰＹＳＯ３－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０３
・Ｂ：１．５５μＬ／ｍＬのＪＢ－ＣＯＵＰＹＳＯ３－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０３
・Ｃ：３．１μＬ／ｍＬのＪＢ－ＣＯＵＰＹＳＯ３－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０３
・Ｄ：６．１９μＬ／ｍＬのＪＢ－ＣＯＵＰＹＳＯ３－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－０３

６時間および２４時間のインキュベーション後に、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。ＣＯＵＰＹフルオロクロムはＲ－ＰＥチャネルにおいて読み取る（グリーンレーザー、ＧＬ－１チャネル、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴサイトメーター）。それらの結果が図６および図７に示されている。図６は、ＤＣをＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－２５に曝露した陰性対照と共に、ＤＣに対するＣＯＵＰＹ発現のグラフ表示を示す。それらの結果は、ナノ粒子が内部移行され、かつそれらの膜に結合されているだけではないことを示す。６時間のインキュベーションによるものと比較して、ＣおよびＤ濃度で２４時間インキュベートしたＤＣに対してナノ粒子の内部移行における有意な増加が認められる。図７は、補正された結果がどのように異なるＮＣ濃度の内部移行比を維持するかを示す。

用量反応アッセイ。図８は、一方は未成熟ＤＣからなり（ｉＤＣ）、他方はＤＣをＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－２５に曝露されたものからなる２つの陰性対照と共に、ＤＣ（免疫原性の成熟マーカー）に対するＣＤ８０およびＣＤ８３発現のグラフ表示を示す。その際に、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃと炎症誘発性サイトカインの成熟カクテルとの組み合わせを可溶なＲ８４８の欠如による陽性対照として使用した。それらの結果は、１ｍＬの培養物当たり５μｇのＲ８４８でピークに達する、異なるＲ８４８－ＮＰ濃度におけるＤＣに対するＣＤ８０およびＣＤ８３発現の指数関数的増加を示す。

細胞毒性アッセイ。露出されたＤＮＡを染色する生存度マーカー７－ＡＡＤを用いて細胞毒性を評価した（この場合、細胞死による）。一方は未成熟ＤＣからなり（ｉＤＣ）、他方はＤＣをＪＢ－Ｈ２Ｏ－ＰＰＡＨ－ＰＰ２２－２５に曝露したものからなる２つの陰性対照を実験で使用した。グラフ形式での結果（図９）は、０．４～４μｇのＲ８４８濃度のうちＲ８４８－ＮＰの関連する細胞毒性について有意差が認められず、それはより高い濃度で僅かに増加することを示しめている。但し、関連する細胞死は全ての場合において３０％よりも低い。

実施例９：ペプチド標的化水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型カプセル化物の調製（ＮＣ１のカプセル化）
ＩＰＤＩ（２２５．０ｍｇ、２．０２ｍｅｑ）を機械撹拌を備えた３つ口丸底フラスコの中に添加し、Ｎ２でパージし、かつ光から保護した。並行して、ＮＣ１（１．５０ｇ）、ポリマーＰ２（５．８７ｇ、０．６２ｍｅｑ）および乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）をバイアル中で混合し、フラスコの中に添加し、１５０ｒｐｍで１０分間均質化し、光から保護した。並行して、二末端ＮＣＯポリマー（ＳＰ１）を、１．３０３０ｇ（１．２８ｍｅｑ）のＯ，Ｏ－ビス（２－アミノプロピル）ポリプロピレングリコール－ブロック－ポリエチレングリコール－ブロック－ポリプロピレングリコールを０．５７１１ｇ（５．１４ｍｅｑ）のＩＰＤＩと反応させて調製する。ＩＲスペクトルのＮＣＯ結合の消失がプラトーに達した場合に、０．２５ｇのこのポリマーＳＰ１を、１ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水中に４２．４ｍｇのｃＲＧＤｆＫを含む溶液の上に添加し、磁気撹拌を用いて激しい剪断を行った。この時点で、この溶液を３つ口丸底フラスコに４５０ｒｐｍで滴下する。即座に、有機相を冷たいＭｉｌｌｉ－Ｑ水（１５．０ｇ）により４５０ｒｐｍで乳化させ、最後にナノミセルから架橋されたＮＣを生成するために、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）の１０％ｗ／ｗ水溶液（１．５８ｇのＤＥＴＡ、４．６ｍｅｑ）を添加する。撹拌を１５０ｒｐｍまで減少させる。この重付加反応をＩＲおよびｐＨ測定により監視する。ＮＣが形成されたら、ＴＨＦを３５℃および真空下で反応器から除去し、１２～１４ｋＤａのＭＷＣＯを有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ分子多孔膜管を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ水に対する２４時間の透析精製を行う。この合成手順によりペプチド－ＮＣ２が得られる。

実施例１０：抗体を標的化する水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型カプセル化物の調製（ＮＣ１のカプセル化）
ＩＰＤＩ（２２５．０ｍｇ、２．０２ｍｅｑ）を、機械撹拌を備えた３つ口丸底フラスコの中に添加し、Ｎ２でパージし、かつ光から保護した。並行して、ＮＣ１（１．５０ｇ）、ポリマーＰ２（５．８７ｇ、０．６２ｍｅｑ）および乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）をバイアル中で混合し、フラスコの中に添加し、１５０ｒｐｍで１０分間均質化し、光から保護した。この時点で、１ｍＬのＰＢＳ中に１００μｇの抗ＧＤ２モノクローナル抗体を含む市販の溶液を４５０ｒｐｍで３つ口丸底フラスコに滴下する。即座に、４５０ｒｐｍで１５．０ｇの冷たいＭｉｌｌｉ－Ｑ水を添加して乳化プロセスを行い、最後にナノミセルから架橋されたＮＣを生成するためにジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）の１０％ｗ／ｗ水溶液（１．５８ｇのＤＥＴＡ、４．６ｍｅｑ）を添加する。撹拌を１５０ｒｐｍまで減少させる。この重付加反応をＩＲおよびｐＨ測定により監視した。ＮＣが形成されたら、ＴＨＦを３５℃および真空下で反応器から除去し、１２～１４ｋＤａのＭＷＣＯを有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ分子多孔膜管を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ水に対する２４時間の透析精製を行う。この合成手順によりｍＡＢ－ＮＣ２が得られる。

実施例１１：健康なＢＡＬＢ／ＣマウスモデルにおけるＷ／Ｏ／Ｗ型ナノカプセルの静脈内投与体内分布
健康なＢＡＬＢ／Ｃマウスモデルにおける１時間、２４時間および４８時間でのＩＣＧ、両性ＩＣＧ－ＮＣ（物質ＩＣＧについての実施例４の表１）およびカチオン性ＩＣＧ－ＮＣ間の静脈内投与体内分布の比較。

カチオン性ＩＣＧ－ＮＣＳは、Ｌ－リジンの溶液を添加しないこと以外は両性ＩＣＧ－ＮＣについて実施例４に開示されている同じ手順によって調製した。

それらの結果は図１３Ａ～図１３Ｃで確認することができる。

静脈内投与およびカチオン性および両性ナノカプセルの両方の監視について得られた結果から、それらが血流中でのＩＣＧの循環時間を増加させると結論づけることができる。

カチオン性ＩＣＧ－ＮＣは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージング技術を用いて、ＢＡＬＢ／Ｃマウスモデルにおいて静脈内注射後４８時間を超えて追跡可能であり得る。

実施例１２：皮下腫瘍マウスモデルにおけるＷ／Ｏ／Ｗ両性ナノカプセルの体内分布のインビボ蛍光イメージング
この実験を行うために免疫抑制されたマウスのモデルを使用した。雌のＮＳＧマウス（９週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に、皮下（ｓ．ｃ）注射によりＡ３７５ヒト黒色腫細胞株（１×１０^６）細胞を右脇腹に２３ゲージ針で接種した。腫瘍接種後１４日目に、両性ＩＣＧ－ＮＣおよびカチオン性ＩＣＧ－ＮＣを静脈内投与した。ＰＢＳおよび遊離ＩＣＧを対照群に注射した。７８０ｎｍ／８４５ｎｍの励起／放出波長を用いて、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）により蛍光を監視した。

それらの結果が図１４に示されている。対照マウス（ＰＢＳ注射）において蛍光シグナルは観察されない（図１４Ａを参照）。遊離ＩＣＧ蛍光色素を注射した場合のそのシグナルは低い（図１４Ｂを参照）。逆に、ＮＳＧ腫瘍（皮下Ａ３７５）マウスモデルの静脈内ＮＣ投与では、ＮＣ注射から３～９日後に腫瘍位置において両性ＩＣＧ－ＮＣ（物質としてＩＣＧを含む実施例４の表１に開示されているとおりのもの）について特異的蓄積が明らかに観察され、静脈内注射から９日後に取り出した臓器において両性ＮＣを検出することはできない（図１４Ｃを参照）。

実施例１３：イメージングの安全性
（１）カチオン性および両性ナノカプセル
カプセル化された未充填ＮＣＳナノカプセル（カチオン性および両性ナノカプセル）を３種類の異なる用量で雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に静脈内投与した。急性毒性分析のために、投与から２４時間後に血液および血清試料を得た（ＳＢＣＶおよびＳＨＣＶ、バルセロナ自治大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｄｅ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ））。

血中で分析される血液学的パラメータは、白血球（ＷＢＣ）数、赤血球（ＲＢＣ）数、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板（ＰＬＴ）、リンパ球（ＬＹＭＰＨ）、単球（ＭＯＮＯ）、好中球（ＮＥＵ）、好酸球（ＥＯ）および好塩基球（ＢＡＳＯ）を含んでいた。未治療群に関して有意差は観察されなかった。

血清中で検出される生化学的パラメータは、アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、カリウム、総タンパク質、ナトリウムおよび尿素を含んでいた。未治療群に関して有意差は観察されなかった。

カチオン性および両性ＮＣは両方とも、静脈内注射から２４時間後の健康な対照群との生化学的および血液学的比較において関連する毒性を示さなかった。

（２）治療の安全性（遊離薬物に対する薬物充填されたＮＣ）
カプセル化物または遊離Ｒ８４８を３種類の異なる用量で雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に静脈内注射した。急性毒性分析のために、投与から２４時間後に血液および血清試料を得た（ＳＢＣＶおよびＳＨＣＶ、バルセロナ自治大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｄｅ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ））。

血中おいて分析される血液学的パラメータは、白血球（ＷＢＣ）数、赤血球（ＲＢＣ）数、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板（ＰＬＴ）、リンパ球（ＬＹＭＰＨ）、単球（ＭＯＮＯ）、好中球（ＮＥＵ）、好酸球（ＥＯ）および好塩基球（ＢＡＳＯ）を含んでいた。未治療群に関して有意差は観察されなかった。

血清中で検出される生化学的パラメータは、アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、カリウム、総タンパク質、ナトリウムおよび尿素を含んでいた。未治療群に関して有意差は観察されなかった。

実施例１４：黒色腫接種マウスにおけるカプセル化Ｒ８４８投与の効果
Ｒ８４８は免疫系を活性化させる薬物である。従って、この実施例では免疫可能なマウスを使用する。

雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に、皮下注射によりＢ１６－Ｆ０細胞（７×１０^４）を右脇腹に２３ゲージ針で接種した。Ｖｅｒｎｉｅｒキャリパーを用いて腫瘍を隔日で測定し、その面積（腫瘍の長さ×幅、ｍｍ^２）を平均した。腫瘍接種から１０日後に、両性もしくはカチオン性Ｒ８４８含有ナノカプセルを皮下または静脈内投与した。実験の最後にマウスを安楽死させ、腫瘍重量を測定した。有効性における良好な結果が図１５に示されている。

これらの結果を考慮に入れると、両性Ｒ８４８－ＮＣの皮下投与は、黒色腫細胞に対するより高い細胞毒性応答と共により低い腫瘍増殖を促進するように思われると結論づけられる。

フローサイトメトリー分析のために、実験の最後に図１５の場合と同じマウスから脾臓を得た（図１６）。全ての場合に、ナノカプセルは遊離薬物と同じであるかそれによりも良好な応答を生じさせる。

引用文献
特許文献
・国際公開第０１７８８８８Ａ１号
・米国特許第４５３４７８３Ａ号
・米国特許出願公開第２００４／０１１５２５４Ａ１号
・欧州特許第２９９２９５３Ａ２号
非特許文献
・Ｃ．Ｃｕｓｃｏら，「ｐＨ同調シェルカチオン化および酸化還元誘発放出を伴う多感受性薬物が充填されたポリウレタン／ポリ尿素ナノカプセル（Ｍｕｌｔｉｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｒｕｇ－ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ／ｐｏｌｙｕｒｅａ ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｗｉｔｈ ｐＨ－ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅ ｓｈｅｌｌ ｃａｔｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｏｘ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）」，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，ｖｏｌ．７，ｐｐ．６４５７－６４６６）
・Ｄａｖｉｅｓら，「Ｉ型エマルションの定量的動態学的理論。乳化剤の物理化学（Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｔｙｐｅ，Ｉ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」，気体／液体および液体／液体界面（Ｇａｓ／Ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ Ｌｉｑｕｉｄ／Ｌｉｑｕｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ），界面活性の国際会議の議事録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ），ｐｐ．４２６－３８

Claims (14)

1. それ自体が外側水性連続相に分散されている油滴内に分散されている内側水滴を含む多層水中油中水型ナノカプセル化物であって、
   前記内側水滴は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物および第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、
   前記第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第１のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー１）および（ｂ）水溶性ポリアミン１の両方のアミン基とのポリイソシアネート１の界面における反応による相反転により油中水型乳化プロセスにおいて得ることができ、
   前記油滴は、その中に分散された前記内側水滴および第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、
   前記第２のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第２のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー２）および（ｂ）ポリイソシアネート２の両方のイソシアネート基とのポリアミン２の界面におけるその反応による相反転により水中油型乳化プロセスにおいて得ることができ、
   プレポリマーすなわちプレポリマー１およびプレポリマー２は両方とも異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、
   前記両方のプレポリマーの主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性繰り返し単位を含み、
   前記プレポリマー１の２つのエンド末端官能基はアミン末端基であり、かつ
   前記プレポリマー２の２つのエンド末端官能基はイソシアネート末端基であり、
   前記プレポリマー２は、イソシアネート基の代わりに第二級アミンエンド末端基を有する対応する前駆体であるプレポリマー３からその場で得ることができる、
   多層水中油中水型ナノカプセル化物。
2. 動的光散乱法により測定された２０～５００ｎｍの範囲に含まれる流体力学的直径を有する、請求項１に記載の多層水中油中水型ナノカプセル化物。
3. 前記ポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は独立して、ジオールエステル基、ジオール蛍光含有基、ジアミン蛍光含有基、ポリアルコール炭水化物基、ポリアミン炭水化物基、ペプチド基、ジオールエーテル基、標的リガンド、バイオリガンドおよび荷電モノマーから選択される基で官能化されている、請求項１～２のいずれかに記載の多層水中油中水型ナノカプセル化物。
4. 前記プレポリマー１は、以下の当量の比：
   １：０．３～１：０．６の範囲の当量の比のポリイソシアネートｄ１）／ポリアルコールａ１（ジスルフィド結合）、
   １：０．０５～１：０．１５の範囲の当量の比のポリイソシアネートｄ１）／ポリアルコールｂ１（ポリエチレングリコール）、および
   １：０．２～１：０．８の範囲の当量の比のポリイソシアネートｄ１）／ポリアミンｃ１（疎水性の調整）
   で、ａ１）ジスルフィド結合を含むポリアルコール、ｂ１）ポリアルコール、ｃ１）ポリアミン、およびｄ１）ポリイソシアネートを反応させることを含むプロセスによって得ることができる、請求項１～３のいずれかに記載の多層水中油中水型ナノカプセル化物。
5. 前記プレポリマー３は、以下の当量の比：
   １：０．０５～１：０．２の範囲の当量の比のポリイソシアネートｅ２）／ポリアルコールａ２（ジスルフィド結合）、
   １：０．２～１：０．６の範囲の当量の比のポリイソシアネートｅ２）／ポリアルコールｂ２（ポリエチレングリコール）、
   １：０．２～１：０．８の範囲の当量の比のポリイソシアネートｅ２）／ポリアミンｃ２（疎水性の調整）、および
   １：０．０５～１：０．３の範囲の当量の比のポリイソシアネートｅ２）／ジオール－ポリアミンｄ２
   で、ａ２）ジスルフィド結合を含むポリアルコール、ｂ２）ポリアルコール、ｃ２）ポリアミン、ｄ２）ポリオール－ポリアミンおよびｅ２）ポリイソシアネートを反応させることを含むプロセスによって得ることができる、請求項１～４のいずれかに記載の多層水中油中水型ナノカプセル化物。
6. 前記油滴は油相に可溶化された化学的／生物学的活性化合物をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の多層水中油中水型ナノカプセル化物。
7. 油相中に有機溶媒を含んでいない、請求項１～６のいずれかに記載の多層水中油中水型ナノカプセル化物。
8. ａ）以下の工程：
   ａ１）水溶性の化学的／生物学的活性化合物、プレポリマー１）および水溶性ポリアミン１を所与の体積の水の中で混合する工程、
   ａ２）水と混和しない５～７倍多い量の有機溶媒を添加して相反転により第１のエマルションを生成する工程、
   ａ３）前記プレポリマー１および前記水溶性ポリアミン１のアミンとの界面におけるその化学量論的反応により、水溶性の化学的／生物学的薬剤のために第１のカプセル化の壁を作り出すための前記エマルションのために選択された前記有機溶媒に可溶なポリイソシアネート１を添加する工程
   を含むプロセスによって最初に第１の油中水型カプセル化を行う工程と、
   ｂ）以下の工程：
   ｂ１）先のカプセル化にイソシアネート基の代わりに第二級アミン末端基を有するプレポリマー２の対応する前駆体であるプレポリマー３を添加する工程、
   ｂ２）工程ｂ１）の混合物を当量の前記プレポリマー３に関して当量の過剰なポリイソシアネート２の上に添加してその場でプレポリマー２を形成する工程、
   ｂ３）必要な量の水を添加して第２の相反転により第２のエマルションを生成する工程、
   ｂ４）水溶性ポリアミン２を添加して、前記プレポリマー２からの前記イソシアネートおよび過剰に添加された遊離ポリイソシアネート２との界面におけるその反応により第２のカプセル化の壁を作り出す工程
   を含むプロセスによって第２の水中油型カプセル化を行う工程と、
   ｃ）任意に前記有機溶媒を蒸発させる工程と、
   ｄ）任意に工程ｃ）の水中油中水型エマルションを透析する工程と
   を含み、
   プレポリマー１、プレポリマー２およびプレポリマー３は独立して、異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、
   前記プレポリマーのそれぞれの前記主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性繰り返し単位を含み、
   前記プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基であり、かつ
   前記プレポリマー２の２つのエンド末端官能基はイソシアネート末端基であり、かつ
   前記プレポリマー３の２つのエンド末端官能基は第一級もしくは第二級アミン末端基である、請求項１～７のいずれかに記載の水中油中水型多層ポリマーナノカプセル化物の調製のためのプロセス。
9. 前記第１のカプセル化の油相中に使用される前記溶媒は水不混和性溶媒を含む、請求項８に記載のプロセス。
10. より大きい油滴内に分散されている内側水滴を含むハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームであって、
    ａ）前記内側水滴は、水に可溶化された化学的／生物学的活性化合物および第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁を含み、
    前記第１のポリウレタン－ポリ尿素ポリマー壁は、（ａ）第１のポリウレタン／ポリ尿素ポリマー（プレポリマー１）および（ｂ）水溶性ポリアミン１の両方のアミン基とのポリイソシアネート１の界面における反応による相反転により油中水型乳化プロセスにおいて得ることができ、
    前記プレポリマー１は異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、
    前記主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合、アミン結合および任意に疎水性の調整された繰り返し単位を含み、
    前記プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基であり、
    ｂ）前記油滴は、その中に分散された前記内側水滴およびリポソームの構造に似ている外壁を含み、
    前記外壁はジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの表面配置により水中油型乳化において得ることができる、
    ハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソーム。
11. 油相中に有機溶媒を含んでいない、請求項１０に記載のハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソーム。
12. 請求項１０～１１のいずれかに記載のより大きい油滴内に分散されている内側水滴を含むハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームの調製のためのプロセスであって、
    ａ）以下の工程：
    ａ１）所与の体積の水の中で水溶性の化学的／生物学的活性化合物、プレポリマー１）および水溶性ポリアミン１を溶解する工程、ａ２）水と混和しない５～７倍多い量の有機溶媒を添加して相反転により第１のエマルションを生成する工程、ａ３）前記プレポリマー１および前記水溶性ポリアミン１のアミンとの界面におけるその反応により、水溶性の化学的／生物学的薬剤のために第１のカプセル化の壁を作り出すための前記エマルションのために選択された前記有機溶媒に可溶なポリイソシアネート１を添加する工程を含むプロセスによって最初に第１の油中水型カプセル化を行う工程であって、
    前記プレポリマー１は異なる極性の主鎖および側鎖と２つのエンド末端官能基とを有し、前記プレポリマー１のそれぞれの前記主鎖はその骨格に、ウレタン官能基、尿素官能基、ポリエチレンオキシド繰り返し単位、ジスルフィド結合およびアミン結合および任意に疎水性の調整された繰り返し単位を含み、前記プレポリマー１の２つのエンド末端官能基は第二級アミン末端基である工程と、
    ｂ）以下の工程：
    ｂ１）先のカプセル化に第１の好適な溶媒に含まれているジパルミトイルホスファチジルコリンおよび第２の好適な溶媒に含まれているコレステロールを添加する工程、
    ｂ２）必要な量の水を添加して第２の相反転により第２のエマルションを生成し、かつジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールの物理的再配置により外壁を作り出す工程
    を含むプロセスによって第２の水中油型カプセル化を行う工程と、
    ｃ）任意に前記有機溶媒を蒸発させる工程と、
    ｄ）任意に工程ｃ）の水中油中水型エマルションを透析する工程と
    を含むプロセス。
13. 担体と共に、請求項１～７のいずれかに記載のナノカプセル化物または請求項１１～１２のいずれかに記載のハイブリッド水中油中水型ポリウレタン／ポリ尿素リポソームを含む組成物。
14. 美容的もしくは薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に、請求項１～７のいずれかに記載のナノカプセル化または請求項１０～１１のいずれかに記載のリポソームを含む化粧品もしくは医薬組成物である、請求項１３に記載の組成物。
    
    

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