JP2024520555A - 新規遺伝子サイレンシング技術としての非対称短鎖二重鎖ｄｎａおよびその使用 - Google Patents

新規遺伝子サイレンシング技術としての非対称短鎖二重鎖ｄｎａおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞、組織、生物および動物における標的核酸および／またはタンパク質のモジュレーションのための新規タイプの遺伝子サイレンシング技術を開示する。この新しい技術は、ヒトの疾患の予防および処置を含む、遺伝子標的化または遺伝子サイレンシングの適用における使用のための組成物を提供する。組成物は、センス鎖がアンチセンス鎖より短い、非対称、短鎖、二重鎖ＤＮＡ分子を含む。二重鎖ＤＮＡ分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメントをさらに含む。本発明は、標的遺伝子の発現もしくは機能をモジュレートするために、または疾患の処置もしくは予防のために、ならびに他の医学的または生物学的適用のために、組成物を使用する方法をさらに提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２９日に出願された同時係属米国仮特許出願第６３／１９５，００８号の優先権および利益を請求するものであり、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、遺伝子サイレンシング技術として使用される非対称短鎖二重鎖ＤＮＡに関し、生物学的または医学的研究において、疾患の処置および予防において、ならびに他の生物学分野における遺伝子サイレンシングの適用に、使用することができる関連する組成物および方法にも関する。
発明の背景
現代の医学的治療薬は、２つの基本的な技術、すなわち、小分子化学およびタンパク質／抗体技術に依存している。しかし、ゲノムおよび生物医学研究により同定される標的の約１０％しか前述の２つの基礎技術によって対処することができない。オリゴヌクレオチドは、小分子化学および抗体／タンパク質技術により創薬可能でないものを含む非常に多くの標的に対処する可能性を秘めている。４０年を超える研究によってアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術が生み出された（Cy A. Stein et al., 2017）。しかし、４０年を超える研究にもかかわらず、少数の臨床的オーファン適応症以外、有意な創薬可能性の問題が、ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡ技術の開発が主力治療プラットフォームになることを妨げている。そのような創薬可能性の問題には、数ある中でも特に、低いサイレンシング効率、オフターゲット効果、意図しない免疫応答の刺激、組織透過の課題、およびｉｎ ｖｉｖｏ送達などが含まれる。したがって、様々な生物学的および医学的適用において目的の遺伝子を標的化する新規技術を生み出すことに対する有意な満たされていない要求がある。
ＡＳＯは、１９７８年に最初に提唱された概念（Zamecnik P.C. et al., 1978）に基づく遺伝子サイレンシング技術である。一般に、ＡＳＯ技術の背後にある原理は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、遺伝子発現活性または機能、例えば、転写／転写後もしくは翻訳、をモジュレートすることである。機序は、次のように広くカテゴリー分けされ得る：（１）ＡＳＯの結合が、翻訳停止、スプライシングの阻害、もしくは選択的にスプライシングされたバリアントの導入につながる、ＲＮＡ分解を促進しない単なる占有、または（２）ＡＳＯの結合が、リボヌクレアーゼＨ１（ＲＮａｓｅ Ｈ１）などの内在性酵素によるＲＮＡの分解を促進する、占有誘導不安定化；および（３）翻訳モジュレーション：ＡＳＯが、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）または５’ＵＴＲにおける他の阻害もしくは調節エレメントを遮断し得、それによって翻訳効率が上昇またはモジュレートされ得る（Stanley T. Crooke et al., 2008；C. Frank Bennett, 2010；Richard G. Lee, 2013；Stanley T. Crooke, 2017）。ＡＳＯ構造は、標的ＲＮＡに塩基対合によって結合することができる一本鎖デオキシリボヌクレオチド配列である。４０年の研究の後、ＡＳＯ技術は、一本鎖オリゴヌクレオチドの様々な化学的改変、例えば、ホスホロチオエート置換または他の改変ヌクレオチドによって改善されてきた（Iwamoto N et al 2017, Crooke ST, 2017；Crooke ST et al., 2018；米国特許第７９１９４７２号および同第９０４５７５４号を参照されたい）。
ＲＮＡｉは、短鎖二本鎖ＲＮＡが相同配列のＲＮＡの喪失を誘発する機序であり、植物において最初に観察され、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）において実証された（A. Fire et al, 1998）。この機序は、長鎖ｄｓＲＮＡの短鎖干渉二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への分解、およびｓｉＲＮＡと多タンパク質ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の相互作用を含んだものであり、ＲＩＳＣの中で、ｓｉＲＮＡは巻き戻され、センス鎖は廃棄され、アンチセンスまたはガイド鎖は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡＧＯ２に結合し、次いで、それが標的ＲＮＡを切断する（de Fougerolles et al., 2007；Ryszard Kole, 2016）。哺乳動物細胞では、合成ｓｉＲＮＡまたは非対称短鎖干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡもしくは非対称ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＲＩＳＣ依存性機序によって遺伝子サイレンシングを誘導することができる（Elbashir SM et al., 2001；Sun X et al., 2008；米国特許第７０５６７０４号および同第９３２８３４５号を参照されたい）。
オリゴヌクレオチドは、何十年にもわたって研究されており、全く新しい種類の治療薬になる大きな可能性を秘めていると考えられる。しかし、オリゴヌクレオチドの、限られたサイレンシング効率、送達の課題、ならびにハイブリダイゼーション依存性毒性およびハイブリダイゼーション非依存性毒性をはじめとする用量依存性有害効果が、これらの新規種類の治療薬を制限し続けている（C. Frank Bennett, 2010；C. Frank Bennett, 2019；Roberts TC et al., 2020；Crooke ST et al., 2018；およびSetten RL et al., 2020）。一般に、ＡＳＯ化合物は、ｓｉＲＮＡに基づく化合物よりも遺伝子サイレンシングを誘導する点で作用が弱いが、ＡＳＯ化合物にはｓｉＲＮＡ化合物と比べていくつかの薬学的利点がある。目下、ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡは、依然として、遺伝子サイレンシング治療薬を設計するための２つの同様に重要なプラットフォーム技術である（Crooke ST et al 2018；Roberts TC et al 2020）。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション依存性毒性は、主として、非標的遺伝子とのハイブリダイゼーション（「オフターゲット効果」）に起因すると考えられる（Jackson et al., 2003；Lin X et al., 2005）。ハイブリダイゼーション非依存性毒性は、オリゴヌクレオチドとタンパク質の相互作用によって起こり、これらの効果は、凝固時間の増加、炎症誘発効果、および補体経路の活性化を含む。これらの効果は、オリゴヌクレオチドのより高い用量で生じる傾向があり、用量依存性である。例えば、より高い濃度で、ＡＳＯは、腎尿細管変化および血小板減少症をもたらす（Geary, RS. et al., 2007；Kwoh J T, 2008）。臨床的には、第一世代ＰＳアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよび第二世代２’－ＭＯＥ改変アンチセンスオリゴヌクレオチドについての主な忍容性および安全性の問題は、活性化部分トロンボプラスチン時間の延長、注射部位反応、ならびに全身症状、例えば、発熱、悪寒および頭痛などの、ハイブリダイゼーション非依存性効果であることが証明されている（C. Frank Bennett, 2010；Henry S P, 2008；Kwoh J T, 2008）。最も最適化されたＡＳＯであっても、一般にｓｉＲＮＡよりも作用がはるかに弱く、投薬量依存性の画一的な毒性を有することが証明されている（Kendall S. Frazier, 2015）。オリゴヌクレオチドの用量依存性毒性を緩和するために、過去４０年間、様々な化学的改変によって、限られた有効性の問題および付随する安全性の問題点を克服するための努力がなされてきた（Iwamoto N et al 2017, Crooke ST et al., 2018；およびRoberts TC et al., 2020）。
ＡＳＯと比較して、ｓｉＲＮＡ二重鎖のオフターゲット効果は、センス鎖媒介サイレンシング、内在性ｍｉＲＮＡ経路との競合、およびＴＬＲまたは他のタンパク質との相互作用により媒介されると考えられている（Setten RL et al 2019）。加えて、２１ｎｔ／１９ｂｐの典型的なｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞および組織透過の点で効率的でなく、安定性および他の薬学的特性を増強するために大掛かりな化学的改変も必要とする。非対称ｓｉＲＮＡ（またはａｉＲＮＡ）は、対称ｓｉＲＮＡのセンス鎖により媒介されるオフターゲット効果、および他のオフターゲット機序を克服するために設計された（Sun X et al., 2008；Grimm D, 2009；Selbly CR et al., 2010；およびＰＣＴ特許公開ＷＯ２００９０２９６８８を参照されたい）。
まとめると、ＡＳＯ技術の４０年を超える革新、およびＲＮＡｉに基づく技術の２０年を超える研究を経て、ヒトの疾患に関与する標的のほぼ９０％に対する遺伝子標的化療法の成功裏の開発は、いまだ困難である。さらに、現在承認されているオリゴヌクレオチド薬は、患者１人あたり／１年に５０万ＵＳＤを超える費用がかかり、したがって、一般的な集団が罹患する疾患に対処することは不可能である。それ故、これらの課題を克服するための新規技術が、至急、必要とされている。
本明細書に引用される参考文献は、本請求項に関わる発明に対する先行技術であること認めるものではない。
米国特許第７９１９４７２号明細書 米国特許第９０４５７５４号明細書 米国特許第７０５６７０４号明細書 米国特許第９３２８３４５号明細書
発明の概要
本発明は、非対称短鎖二重鎖デオキシリボヌクレオチド（ａｓｄＤＮＡ、非対称ｓｄＤＮＡ）により誘発される強力な遺伝子サイレンシングの驚くべき発見に基づく。１つまたは複数のリボヌクレオチドが散在しているａｓｄＤＮＡにより可能になるこの新規タイプの遺伝子サイレンシング技術は、天然に存在するヌクレオチド、そのアナログ、および改変ヌクレオチド（本明細書では以降、まとめて「ヌクレオチドモノマー」と呼ばれる）の群から各々選択される連結されたヌクレオチドモノマーによって構成される、短鎖、二重鎖分子を利用する。言い換えると、本発明の実施形態で使用されるヌクレオチドモノマーは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、そのアナログ、および改変デオキシリボヌクレオチドの群から選択される、「デオキシリボヌクレオチドモノマー」を含む。さらに、ａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング機能は、１つまたは少数の散在リボヌクレオチドモノマーを組み込むことにより、劇的に可能にまたは増強され得る。「リボヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチド、そのアナログ、および改変リボヌクレオチドの群から選択され得る。
本発明では、短鎖二重鎖ＤＮＡ（ｓｄＤＮＡ）分子、またはよりいっそう具体的には、非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）分子には、さらに、リボヌクレオチドモノマーが散在しており、これらが少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（「ＩＳＲ」）を形成する。
本開示に含有されるａｓｄＤＮＡに基づく新規プラットフォーム技術の高い遺伝子サイレンシング効果は、一実施形態では、オリゴヌクレオチドモノマーのセンス鎖と、標的となるリボヌクレオチド配列に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドモノマーのアンチセンス鎖とによって達成される。本発明者らのデータは、本発明のａｓｄＤＮＡ分子がそれらの固有かつ新規の組成物によってピコモル濃度で遺伝子サイレンシングを誘発することができることを示しており、これは、既存のアンチセンス技術およびｓｉＲＮＡ技術より強力であり、したがって、用量依存性毒性の低下を可能にする。本発明のａｓｄＤＮＡ分子はまた、より良好な組織透過；細胞質内でしか起こらないｓｉＲＮＡに基づく遺伝子サイレンシングとは対照的に、核内、ミトコンドリア内などにおける遺伝子サイレンシングを可能にすること；オフターゲット効果の低減；より良好な安定性；ｓｉＲＮＡに関連する内在性マイクロＲＮＡ経路との望ましくない競合の排除または低減；より低い合成費用および他の改善された薬学的特性をはじめとする、既存の遺伝子サイレンシング技術に対する利点のうちの少なくとも１つを有すると予想される。したがって、本発明のａｓｄＤＮＡ分子には、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡおよび他の既存の遺伝子サイレンシング技術が直面する様々な課題に対処する大きな可能性がある。本発明のａｓｄＤＮＡ分子は、研究、診断、疾患予防および治療、ならびに農業および獣医学を含む生物学分野における他の適用をはじめとする、現行のオリゴヌクレオチドが適用されているまたはその使用が企図されるあらゆる領域において、使用することができる。
第１の態様では、本発明は、第一の、第二鎖より長い鎖を有する、短鎖二重鎖ＤＮＡ（ｓｄＤＮＡ）分子を含む組成物を提供する。言い換えると、ｓｄＤＮＡ分子は、第二鎖が第一鎖より短い、非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）分子である。第一鎖は、少なくとも１つの標的化領域による標的となるＲＮＡの標的となるセグメントに実質的に相補的であり、したがって、アンチセンス鎖またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであると考えられ得る。さらに、センス鎖またはセンスオリゴヌクレオチドと考えられる得る第二鎖は、第一鎖に実質的に相補的であり、第一鎖と少なくとも１つの二本鎖領域を形成する。ａｓｄＤＮＡ分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ）を含む。ある特徴において、ａｓｄＤＮＡ分子におけるＩＳＲは、どちらかまたは両方の鎖内に存在し得る少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマーを含む。
本発明により提供される組成物は、真核細胞における遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用され、ａｓｄＤＮＡは、細胞に接触させられるか、または対象に投与される。
一部の実施形態では、ａｓｄＤＮＡ分子は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ）を含む。本発明のａｓｄＤＮＡ分子のある特徴において、分子の第一鎖は、少なくとも１つのＩＳＲを含む。ある実施形態では、第一鎖は、少なくとも１つのＩＳＲを含み、第二鎖も少なくとも１つのＩＳＲを含む。ある特徴において、各ＩＳＲは、互いに独立して、１つのリボヌクレオチドモノマーからなるか、または連続する少なくとも２つ、３つ、４つもしくは５つのリボヌクレオチドモノマーを含む。別の特徴において、ＩＳＲは、少なくとも２つのリボヌクレオチドモノマーを、それらが連続しているか、異なる種類の少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれより多く）の介在モノマーで離間しているかを問わず、含む。さらに別の特徴において、第一鎖内の全てのＩＳＲのリボヌクレオチドモノマーの総数は、少なくとも２である。
１つの特徴において、少なくとも１つのＩＳＲは、第一（アンチセンス）鎖の少なくとも１つの標的化領域内に配置されている。別の特徴において、少なくとも１つのＩＳＲは、第二（センス）鎖の少なくとも１つの二本鎖領域内に配置されている。さらに別の特徴において、少なくとも１つのＩＳＲは、第一鎖の少なくとも１つの標的化領域内に配置されており、少なくとも１つのＩＳＲは、第二（センス）鎖の少なくとも１つの二本鎖領域内に配置されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＳＲは、第一鎖のいずれの位置に配置されていてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＳＲは、第一鎖の５’末端もしくはその付近（７核酸塩基以内、もしくは末端から前記末端を数えて前記鎖内の核酸塩基の総数の３３％以内、例えば、末端から出発して、約２１核酸塩基長である鎖については位置番号１、２、３、４、５、６もしくは７）に；および／または第一鎖の３’末端もしくはその付近（７核酸塩基以内、もしくは末端から前記末端を数えて前記鎖内の核酸塩基の総数の３３％以内）に；および／または第一鎖のより中心部に位置する。一部の実施形態では、第一鎖に配置されている少なくとも１つのＩＳＲは、第一鎖のオーバーハング領域のみに位置する。一部の実施形態では、第一鎖に配置されている少なくとも１つのＩＳＲは、第一鎖のオーバーハング領域と二本鎖領域の両方に位置する。一部の実施形態では、第一鎖内のＩＳＲは、第一鎖の５’末端または第一鎖の３’末端に位置する少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＳＲは、第二鎖の５’末端もしくはその付近（７核酸塩基以内、もしくは末端から前記末端を数えて前記鎖内の核酸塩基の総数の３３％以内）に；および／または第二鎖の３’末端もしくはその付近（７核酸塩基以内、もしくは末端から前記末端を数えて前記鎖内の核酸塩基の総数の３３％以内）に；および／または第二鎖のより中心部に位置する。
１つの特徴において、第一鎖またはアンチセンス鎖は、核酸塩基配列を形成する複数の連結されたヌクレオチドモノマーを含み、標的となる遺伝子のＲＮＡの標的となるセグメントに少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％相補的または完全に相補的である。ある特定の実施形態では、標的となるＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡから選択され、このＲＮＡは、疾患、例えば哺乳動物の疾患、に関与するタンパク質をコードするか、または前記疾患に関与する生物学的経路の一部を制御する。用語「標的」および「標的となる」は、本開示では同義で使用され、同じ意味を共有する。
様々な実施形態では、第一／アンチセンス鎖は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０の連結されたヌクレオチドモノマー、もしくはその等価物の、または前記値のいずれか２つで挟まれている範囲（範囲の終点両方を含む）の、骨格長を有する。例えば、第一アンチセンス鎖の長さの範囲の一部は、（ａ）８～３３ヌクレオチドモノマー；（ｂ）１０～３０ヌクレオチドモノマー；（ｃ）１０～２９ヌクレオチドモノマー；（ｄ）１２～２９ヌクレオチドモノマー；（ｅ）１２～２８ヌクレオチドモノマー；（ｆ）１２～２６ヌクレオチドモノマー；（ｇ）１２～２５ヌクレオチドモノマー；（ｈ）１３～２５ヌクレオチドモノマー；（ｉ）１３～２４ヌクレオチドモノマー；（ｊ）１３～２３ヌクレオチドモノマー；（ｋ）１５～２３ヌクレオチドモノマー；（ｌ）８～５０ヌクレオチドモノマー；（ｍ）１０～３６ヌクレオチドモノマー；（ｎ）１２～３６ヌクレオチドモノマー；（ｏ）１２～３２ヌクレオチドモノマー；（ｐ）１４～３６ヌクレオチドモノマー；および（ｑ）少なくとも８ヌクレオチドモノマーを含む。
１つの特徴において、第二鎖またはセンス鎖は、核酸塩基配列を形成する複数の連結されたヌクレオチドモノマーを含み、第一鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも１つの連結された領域に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相補的または完全に相補的である。一部の実施形態では、センス鎖は、第一／アンチセンス鎖の少なくとも１つの連結された領域に完全に相補的であり、いかなるミスマッチもない少なくとも１つの二本鎖領域を形成する。一部の実施形態では、センス鎖は、第一／アンチセンス鎖の少なくとも１つの連結された領域に相補的であり、１つ、２つ、３つまたはそれより多くのミスマッチを有する少なくとも１つの二本鎖領域を形成する。１つの特徴において、センス鎖内のミスマッチモノマーは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴからなる群より選択される核酸塩基、または改変核酸塩基を有する。一部の実施形態では、第二鎖の第１の塩基および最後の塩基の少なくとも一方は、第一鎖内の塩基に相補的である。一部の実施形態では、第二鎖の少なくとも第１の塩基および最後の塩基は、第一鎖内の核酸塩基に相補的である。
１つの特徴において、第二鎖またはセンス鎖は、少なくとも次のようなヌクレオチドモノマー数だけ、第一鎖またはアンチセンス鎖より短い骨格長を有する：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８。様々な実施形態では、第二またはセンス鎖は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５もしくは３６の連結されたヌクレオチドモノマー、またはその等価物の、または前記値のいずれか２つで挟まれている範囲（範囲の終点両方を含む）の、骨格長を有する。ある特定の実施形態では、例えば、第二センス鎖の長さの範囲の一部は、（ａ）８～３２ヌクレオチドモノマー；（ｂ）８～３０ヌクレオチドモノマー；（ｃ）８～２９ヌクレオチドモノマー；（ｄ）９～２９ヌクレオチドモノマー；（ｅ）９～２６ヌクレオチドモノマー；（ｆ）９～２５ヌクレオチドモノマー；（ｇ）１０～２９ヌクレオチドモノマー；（ｈ）１０～２８ヌクレオチドモノマー；（ｉ）１０～２６ヌクレオチドモノマー；（ｊ）１０～２５ヌクレオチドモノマー；（ｋ）１１～２４ヌクレオチドモノマー；（ｌ）１２～２３ヌクレオチドモノマー；（ｍ）１２～２３ヌクレオチドモノマー；（ｎ）１２～２２ヌクレオチドモノマーのタイド（ｔｉｄｅ）；（ｏ）１３～２３ヌクレオチドモノマー；（ｐ）１５～２３ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｑ）８～３５ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｒ）８～３３ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｓ）９～３５ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｔ）９～３４ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｕ）９～３２ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｖ）９～３０ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｗ）１０～３０ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｘ）１０～３２ヌクレオチドモノマーのタイド；（ｙ）少なくとも８ヌクレオチドモノマーおよび（ｚ）少なくとも６ヌクレオチドモノマーを含む。ある特定の実施形態では、第二鎖は、熱力学的に第一鎖と二重鎖を形成することができることを条件に、第一鎖のものより少ない任意のヌクレオチドモノマー数の骨格長を有し得る。
ある特徴において、第一鎖の２つの末端は、次の構成のうちの１つである：３’－オーバーハングおよび５’－オーバーハング；３’－オーバーハングおよび５’末端における平滑末端；５’－オーバーハングおよび３’末端における平滑末端；３’－オーバーハングおよび５’陥凹末端；または５’－オーバーハングおよび３’陥凹末端。ある特定の実施形態では、第一鎖の３’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドモノマーの、または前記値のいずれか２つで挟まれている範囲（範囲の終点両方を含む）の、長さを有する。様々な実施形態では、第一鎖の３’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。
ある特定の実施形態では、第一鎖の５’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドモノマーの、または前記値のいずれか２つで挟まれている範囲（範囲の終点両方を含む）の、長さを有する。様々な実施形態では、第一鎖の５’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。
本発明のある実施形態では、第一鎖は、１～１５ヌクレオチドモノマーの３’－オーバーハング、および１～１５ヌクレオチドモノマーの５’－オーバーハングを有する。別の実施形態では、第一鎖は、１～２６ヌクレオチドモノマーの３’－オーバーハング、および５’平滑末端または５’陥凹末端を有する。さらに別の実施形態では、第一鎖は、１～２６ヌクレオチドモノマーの５’－オーバーハング、および３’平滑末端または３’陥凹末端を有する。
ある特徴において、第二鎖の２つの末端は、次の構成のうちの１つである：３’－オーバーハングおよび５’陥凹末端；５’－オーバーハングおよび３’陥凹末端；３’平滑末端および５’陥凹末端；５’平滑末端および３’陥凹末端；３’陥凹末端および５’陥凹末端。ある特定の実施形態では、第二鎖の３’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドモノマーの長さを有する。様々な実施形態では、第二鎖の３’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。ある特定の実施形態では、第二鎖の５’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドモノマーの長さを有する。様々な実施形態では、第二鎖の５’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。
本発明のａｓｄＤＮＡ分子のある特徴において、第一鎖および／または第二鎖内の少なくとも１つのヌクレオチドモノマーは、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、糖改変ヌクレオチド、骨格改変ヌクレオチド、および／または塩基改変ヌクレオチドである。ある実施形態では、そのような骨格改変ヌクレオチドは、例えば、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも一方を含むための、ヌクレオシド間連結の改変を少なくとも有する。一部の実施形態では、改変されたヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）基、ホスホトリエステル、メチルホスホネートもしくはホスホルアミデートである、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、第一鎖および／または第二鎖は、少なくとも１つの改変ヌクレオシド間連結を含み、改変ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、第一鎖および／または第二鎖の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。様々な実施形態では、第一鎖および／または第二鎖のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結の混合物である。
ある特徴において、本発明の分子の第一鎖および／または第二鎖は、改変糖部分を含む少なくとも１つの改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む。ある特定の実施形態では、改変糖部分の２’位は、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮから選択される基により置き換えられており、ここで、各Ｒは、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。一部の実施形態では、改変糖部分の２’位は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ１）－（ＣＨ２）２－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される基により置き換えられており、ここで、各Ｒｌ、ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、改変糖部分は、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ、２’－Ｏ－アミノプロピル化（２’－ＡＰ）および２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３の群から選択される置換基を有する。一部の実施形態では、改変糖部分は、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（ｃＥｔ）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’、ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ－（＝ＣＨ２）－２’の群から選択される二環式糖により置換されている。一部の実施形態では、改変糖部分は、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖（ＭＯＥ）、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（２’－Ｆ－アラビノ、ＦＡＮＡ）、およびメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）の群から選択される。
本発明のａｓｄＤＮＡ分子のある特徴において、デオキシリボヌクレオチドモノマーの糖部分は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド（２－Ｈ）または２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（ＦＡ）のどちらかの糖部分である。
本発明のａｓｄＤＮＡ分子のある特徴において、リボヌクレオチドモノマーの糖部分は、天然に存在するリボヌクレオチド（２－ＯＨ）、２’－Ｆ改変糖、２’－ＯＭｅ改変糖、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖（ＭＯＥ）、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖（ＬＮＡ）およびメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）から選択される。
別の特徴において、本発明の分子の第一鎖および／または第二鎖は、改変核酸塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドモノマーを含む。一部の実施形態では、改変核酸塩基は、５－メチルシトシン（５－Ｍｅ－Ｃ）、イノシン塩基、トリチル化塩基、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体；６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、１－メチル－シュード－ウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルならびに他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、５－メチルウリジンならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、ならびに７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンの群から選択される。ある特定の実施形態では、改変核酸塩基は、５－メチルシトシンである。ある実施形態では、本発明の分子における各シトシン塩基は、５－メチルシトシンである。ある実施形態では、本発明のａｓｄＤＮＡ分子のＩＳＲにおける各ウリジン塩基は、５－メチルウリジンである。
ある特徴において、本発明のａｓｄＤＮＡ分子は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、例えばＴｏｌｌ様受容体、により認識され得る少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含み得る。
１つの特徴において、本発明の分子の第一鎖および／または第二鎖は、リガンドまたは部分にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態では、リガンドまたは部分は、ペプチド、抗体、ポリマー、多糖、脂質、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、親油性化合物または部分 オリゴヌクレオチド、コレステロール、ＧａｌＮＡｃおよびアプタマーの群から選択される。
本発明のある特徴において、ａｓｄＤＮＡ分子は、細胞、例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞、における遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用される。
ある特定の実施形態では、本発明の原理によるａｓｄＤＮＡ分子のヌクレオチドモノマー配列の少なくとも一部を指示する、標的となるＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡから選択され、そのようなＲＮＡは、疾患に関与するタンパク質をコードするか、または疾患に関与する生物学的経路の一部を制御する。そのような標的ＲＮＡは、様々な実施形態では、ヒトまたは動物の疾患または状態に関与する遺伝子のｍＲＮＡ；病原性微生物の遺伝子のｍＲＮＡ；ウイルスＲＮＡ、ならびに自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫介在性障害、アレルギー性疾患、皮膚科疾患、悪性疾患、胃腸障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ様障害、神経障害、内分泌障害、および老化関連障害または疾患からなる群より選択される疾患または障害に関与するＲＮＡから選択され得る。
ある実施形態では、本発明は、ヌクレオチド、そのアナログ、および改変ヌクレオチドの群から選択される連結されたヌクレオチドモノマーを各々が含む第一鎖および第二鎖を含む、非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）分子であって、（ａ）第一鎖が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０モノマーの群から選択されるモノマー数だけ、第二鎖より長く；（ｂ）第一鎖が、少なくとも１つの標的化領域による標的となるＲＮＡの標的となるセグメントに実質的に相補的であり、第一鎖が、ホスホロチオエート連結、ホスホジエステル連結、およびホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結の混合物からなる群より選択される連結によって隣接モノマー間が連結されている１０～３６（範囲の終点両方を含む）のヌクレオシドモノマーからなり；（ｃ）第二鎖が、第一鎖に実質的に相補的であり、第一鎖と少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、第二鎖が、ホスホロチオエート連結、ホスホジエステル連結、およびホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結の混合物からなる群より選択される連結によって隣接モノマー間が連結されている８～３２（範囲の終点両方を含む）のヌクレオシドモノマーからなり；（ｄ）ａｓｄＤＮＡ分子が、デオキシリボヌクレオチド、そのアナログ、および改変デオキシリボヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドモノマーに連結された少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ）を含み；（ｅ）ａｓｄＤＮＡ分子におけるＩＳＲが、リボヌクレオチド、そのアナログ、および改変リボヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマーを含む、ａｓｄＤＮＡ分子を提供する。ある特徴において、ａｓｄＤＮＡ分子は、細胞、例えば、哺乳動物細胞などの真核細胞、における標的遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用される。さらなる特徴において、ａｓｄＤＮＡ分子は、細胞において対応するＡＳＯより標的遺伝子の発現をサイレンシングさせる点で強力または効果的である。
第２の態様では、本発明は、活性薬剤としての第１の態様における組成物と、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。そのような担体の例は、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、脂質ナノ粒子、タンパク質担体、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、ＧａｌＮＡｃ、多糖、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、コレステロール、脂質、親油性化合物または部分、およびリポイドを含み、これらに限定されない。
第３の態様では、本発明は、本発明のａｓｄＤＮＡ分子のまたはそのような分子を含有する医薬組成物の治療有効量を投与することにより疾患または状態を処置または予防するために、第１の態様における組成物または第２の態様における医薬組成物を使用する方法を提供する。投与方法は、静脈内注射（ｉｖ）、皮下注射（ｓｃ）、経口的に（ｐｏ）、筋肉内（ｉｍ）注射、経口投与、吸入、局所的、髄腔内、および他の局部的な投与の群から選択される経路である。
ある特徴において、予防的または治療的に処置されることになる疾患または状態は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫介在性障害、アレルギー性疾患、皮膚科疾患、悪性疾患、胃腸障害、肝障害、呼吸器障害、心血管障害、皮膚科障害、腎障害、リウマチ様障害、神経障害、精神障害、内分泌障害、および老化関連障害または疾患の群から選択される。
第４の態様では、本発明は、真核細胞における遺伝子発現または遺伝子機能を制御またはモジュレートするために、第１の態様における組成物または第２の態様における医薬組成物を使用する方法を提供する。方法は、細胞を、本発明の任意のａｓｄＤＮＡ分子のまたはそのような分子を含有する医薬組成物の有効量と、接触させるステップを含む。
一実施形態では、前記接触させるステップは、前記ａｓｄＤＮＡ分子を含む組成物を、培養下の標的細胞に、または選択的遺伝子サイレンシングを行うことができる生物における標的細胞に、導入するステップを含む。さらなる実施形態では、導入するステップは、単純な混合、トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、感染、注射、および経口投与、静脈内注射（ｉｖ）、皮下注射（ｓｃ）、経口的に（ｐｏ）、筋肉内（ｉｍ）注射、吸入、局所的、髄腔内、および他の局部的な投与からなる群より選択される。別の実施形態では、導入するステップは、医薬担体、正電荷担体、脂質ナノ粒子、リポソーム、タンパク質担体、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、ＧａｌＮＡｃ、多糖、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、コレステロール、脂質、親油性化合物または部分、およびリポイドを含む群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を使用することを含む。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡである。
ある実施形態では、標的遺伝子は、哺乳動物における疾患、病的状態または望ましくない状態に関連している。さらなる実施形態では、標的遺伝子は、病原性微生物の遺伝子である。さらにさらなる実施形態では、標的遺伝子は、ウイルス遺伝子である。別の実施形態では、標的遺伝子は、腫瘍関連遺伝子である。さらに別の実施形態では、標的遺伝子は、第３の態様に関して列挙された群から選択される疾患に関連する遺伝子である。
別の態様では、本発明は、（ａ）１つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド、そのアナログ、または改変デオキシリボヌクレオシドと、（ｂ）長さ少なくとも８核酸塩基のアンチセンス配列内に連結されたリボヌクレオシド、そのアナログ、または改変リボヌクレオシドを含む、１つまたは複数のＩＳＲとを含む、非対称オリゴマー二重鎖を提供する。アンチセンス配列は、標的配列に少なくとも７０％相補的である。
本発明の他の特徴および利点は、異なる例を含む本明細書で提供される追加の説明から明らかである。提供される例によって、本発明を実施する際に有用である異なる構成要素および方法論が例証される。例は、本請求項に関わる発明を限定しない。本開示に基づいて、当業者は、本発明の実施に有用な他の構成要素および方法論を特定することおよび利用することができる。いくつかの実施形態を示し、説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく任意の改変を加えることができる。
図１は、代表的な標的遺伝子、および実施例で使用される代表的な標的配列、ならびに標的遺伝子をサイレンシングさせるために使用することができる分子の対応するアンチセンス鎖の例示的な配列を示す。
図２Ａは、アンチセンス鎖（第一鎖）および／またはセンス鎖（第二鎖）に少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ）を有する非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）の一部の実施形態の例示的な構造を示す。ここに描示されている各二重鎖では、センス鎖がアンチセンス鎖の上に列挙されている。図２Ｂは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする図２Ａにおける構造を有するａｓｄＤＮＡの例示的な配列を示す。図２Ｃは、ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするａｓｄＤＮＡ（図２Ｂ）の遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。 同上。
図３Ａは、アンチセンス鎖に少なくとも１つのＩＳＲを有するａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造を示す。図３Ｂは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする図３Ａにおける構造を有するａｓｄＤＮＡの例示的な配列を示す。図３Ｃは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするａｓｄＤＮＡ（図３Ｂ）の遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。 同上。
図４Ａは、非改変ＤＮＡセンス鎖を有し、アンチセンス鎖に少なくとも１つのＩＳＲを有する、ａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造を示す。図４Ｂは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする図４ＡにおけるａｓｄＤＮＡの例示的な配列を示す。図４Ｃは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするａｓｄＤＮＡ（図４Ｂ）の遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。 同上。
図５Ａは、アンチセンス鎖にＩＳＲの様々なモチーフを有するａｓｄＤＮＡの例示的な構造、およびＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするａｓｄＤＮＡの例示的な配列を示す。図５Ａ中のアンチセンス鎖内のＩＳＲの様々なモチーフは、アンチセンス鎖ではＩＳＲの様々な数のリボヌクレオチドモノマーおよび位置を有する。図５Ｂは、図５Ａに示されているＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力、および対応するＡＳＯ（各々の対応するＡＳＯは、図５Ａにおける各々のａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同じ配列を有する）の遺伝子サイレンシング効力との比較を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。 同上。
図６Ａは、アンチセンス鎖内のＩＳＲの位置が様々であるａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造、およびＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的化するためのａｓｄＤＮＡの例示的な配列を示す。図６Ｂは、図６Ａに示されているＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力、および対応するＡＳＯ（各々の対応するＡＳＯは、図６Ａにおける各々のａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同一の配列を有する）の遺伝子サイレンシング効力との比較を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。
図７Ａは、アンチセンス鎖の長さが異なるａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造、およびＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的化するためのａｓｄＤＮＡの例示的な配列を示す。図７Ｂは、図７Ａに示されているＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力、および対応するＡＳＯ（各々の対応するＡＳＯは、図７Ａにおける各々のａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同一の配列を有する）の遺伝子サイレンシング効力との比較を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。
図８Ａは、アンチセンス鎖およびセンス鎖のモチーフの長さが様々であるａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図８Ｂは、図８Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。図８Ｃは、図８Ａに示されている各ａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同一の配列を有する対応するＡＳＯのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルの遺伝子サイレンシング効力をＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。 同上。
図９Ａは、アンチセンス鎖およびセンス鎖のモチーフの長さが様々であるａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図９Ｂは、図９Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１０Ａは、様々な長さのセンス鎖と固定長のアンチセンス鎖とを有するａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図１０Ｂは、図１０Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１１Ａはまた、様々な長さのセンス鎖と固定長のアンチセンス鎖とを有するａｓｄＤＮＡの一部の他の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図１１Ｂは、図１１Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１２Ａはまた、様々な長さのアンチセンス鎖と固定長のセンス鎖とを有するａｓｄＤＮＡの一部の他の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図１２Ｂは、図１２Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１３Ａは、アンチセンス鎖にＩＳＲの様々なモチーフを有するａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図１３Ｂは、図１３Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１４Ａは、標的遺伝子にハイブリダイズしたときにアンチセンス鎖に少なくとも１つのミスマッチを有するａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図１４Ｂは、図１４Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１５Ａは、アンチセンス鎖と二本鎖領域を形成したときにセンス鎖に少なくとも１つのミスマッチを有するａｓｄＤＮＡの一部の実施形態の例示的な構造および配列を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示されているａｓｄＤＮＡのＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする遺伝子サイレンシング効力を示す。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルをＨｅｐａＲＧ細胞においてａｓｄＤＮＡを１００ｐＭでトランスフェクトした後に検出した。
図１６Ａは、ＳＴＡＴ３遺伝子を標的化するための本発明の例示的なａｓｄＤＮＡおよびその対応するｓｉＲＮＡの構造および配列、ならびにＩＣ５０およびＩＣ９０により決定したａｓｄＤＮＡとｓｉＲＮＡとの遺伝子サイレンシング効力比較を示す。図１６Ｂは、図１６Ａに示されているａｓｄＤＮＡによるおよびｓｉＲＮＡによるＨｅｐａＲＧ細胞におけるそれぞれ１００ｐＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭでの遺伝子サイレンシング効力の比較を示す。
図１７は、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡの構造、配列および遺伝子サイレンシング効力を対応するＡＳＯと比較して示す。
図１８は、ＡＰＯＢ遺伝子を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡの構造、配列および遺伝子サイレンシング効力を対応するＡＳＯと比較して示す。
図１９は、ＴＴＲ遺伝子を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡの構造、配列および遺伝子サイレンシング効力を対応するＡＳＯと比較して示す。
図２０は、ＳＴＡＴ３遺伝子を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡの構造、配列および遺伝子サイレンシング効力を示す。
図２１は、β－カテニン遺伝子を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡの構造、配列、ならびにＤＬＤ１細胞におけるそれぞれ１００ｐＭ、２００ｐＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭおよび３０ｎＭでの遺伝子サイレンシング効力を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、短鎖二重鎖ＤＮＡを使用する遺伝子またはＲＮＡモジュレーション／サイレンシング技術に言及する。この新しい技術は、非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）組成物を使用することによるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子発現または機能のモジュレーションに使用される。本発明は、標的遺伝子の発現もしくは機能をモジュレートするために、または疾患の処置もしくは予防のために、ならびに他の医学的および生物学的適用のために、組成物を使用する方法も提供する。これらの組成物および方法は、遺伝子発現または遺伝子機能を制御する点で高い効力を提供するが、用量依存性毒性を低下させもする。
１．定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の言及対象を含む。例えば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、その混合物をはじめとする複数の細胞を含む。
用語「約」が、数値範囲とともに使用される場合、それは、境界をそれらの数値より上および下に拡大することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、述べられている値より上および下に２０％、１０％、５％または１％の分散分、数値を変更するために、本明細書では使用される。一部の実施形態では、用語「約」は、述べられている値より上および下に１０％の分散分、数値を変更するために使用される。一部の実施形態では、用語「約」は、述べられている値より上および下に５％の分散分、数値を変更するために使用される。一部の実施形態では、用語「約」は、述べられている値より上および下に１％の分散分、数値を変更するために使用される。
本明細書で使用される場合、用語「アナログ」または「類似体」は、同義で、機能的または構造的等価物を意味する。例えば、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、何十年にもわたってがんおよびウイルス感染症の臨床処置に使用されており、新しい化合物は、研究者および製薬業界により継続的に合成され、評価されている。例えば、Jordheim L.P. et al., Nat Rev Drug Discov 12, 447-464 (2013)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオシドモノマー」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオシド、そのアナログ、および改変デオキシリボヌクレオシドを含む、ヌクレオシドモノマーを意味する。用語「デオキシリボヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、そのアナログ、および改変デオキシリボヌクレオチドを含む、ヌクレオチドモノマーを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオシドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオシド、そのアナログ、および改変リボヌクレオシドを含む、ヌクレオシドモノマーを意味する。用語「リボヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチド、そのアナログ、および改変リボヌクレオチドを含む、ヌクレオチドモノマーを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基部分および糖部分を含む化合物を意味する。ヌクレオシドモノマーは、天然に存在するヌクレオシド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにそれぞれ見られるようなデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド）、そのアナログ、および改変ヌクレオシドを含むが、これらに限定されない。ヌクレオシドモノマーは、デオキシリボヌクレオシドモノマーであることもあり、またはリボヌクレオシドモノマーであることもある。ヌクレオシドモノマーは、例えばヌクレオチドモノマーになるように、リン酸部分に連結され得る。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸連結基をさらに含むヌクレオシドを意味する。ヌクレオチドモノマーは、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにそれぞれ見られるようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、そのアナログ、および改変ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドモノマーは、デオキシリボヌクレオチドモノマーであることもあり、またはリボヌクレオチドモノマーであることもある。改変ヌクレオチドは、次のものより多くのもののうちの１つにおいて改変されていることがある：その窒素含有核酸塩基部分、その５炭素糖部分、およびヌクレオシド間連結の変化をもたらすそのリン酸連結基。
本明細書で使用される場合、用語「オリゴ」または「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結されたヌクレオシドモノマーを含む化合物を指す。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドモノマーの１つもしくは複数またはヌクレオシド間連結の１つもしくは複数が改変されている。
用語「デオキシヌクレオシド」および「デオキシリボヌクレオシド」は、本明細書では同義で使用される。用語「デオキシヌクレオチド」および「デオキシリボヌクレオチド」も、本明細書では同義で使用される。本明細書で使用される場合、「デオキシヌクレオシド」または「デオキシヌクレオチド」は、デオキシ糖部分を含有する、それぞれ、ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「短鎖二重鎖ＤＮＡ（ｓｄＤＮＡ）」または「非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）」におけるような、用語「二重鎖ＤＮＡ」は、互いにハイブリダイズして二重鎖オリゴヌクレオチドとしての形をなし、細胞と接触させられる、または対象に投与される、２本の鎖またはヌクレオチドモノマーの鎖で構成される分子であって、肝要なＲＮＡ標的化モチーフの連結されたヌクレオチドモノマーの大部分、すなわち、５０％またはそれより多くが、改変デオキシリボヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチドモノマーである、分子を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「モチーフ」は、例えばアンチセンス鎖またはセンス鎖内の、化学的に別個の領域のパターンを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「直接隣接する」は、２つのエレメントの間、例えば、領域、セグメント、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの間に介在エレメントがないことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「改変ヌクレオチド」は、少なくとも１つの改変糖部分、改変ヌクレオシド間連結および／または改変核酸塩基を有する、ヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「改変ヌクレオシド」は、少なくとも１つの改変糖部分および／または改変核酸塩基を有する、ヌクレオシドを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「改変オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在するヌクレオシド間連結」は、３’から５’へのホスホジエステル連結を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「改変ヌクレオシド間連結」は、天然に存在するヌクレオシド間結合からの置換または任意の変化を指す。例えば、ホスホロチオエート連結は、改変ヌクレオシド間連結である。
本明細書で使用される場合、用語「天然糖部分」は、ＤＮＡ（２－Ｈ）またはＲＮＡ（２－ＯＨ）に天然に見られる糖を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「改変糖」は、天然糖からの置換または変化を指す。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖は、改変糖である。
本明細書で使用される場合、用語「二環式糖」は、２つの非ジェミナル環原子の架橋により改変されたフロシル環を意味する。二環式糖は、改変糖である。
本明細書で使用される場合、用語「二環式核酸」、「ＢＮＡ」、「二環式ヌクレオシド」、または「二環式ヌクレオチド」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分が、フラノース環上の２個の炭素原子を接続する架橋を含むことによって二環式環系を形成している、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「２’－Ｏ－メトキシエチル」（同じく２’－ＭＯＥ、２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル））は、フロシル環の２’位のＯ－メトキシ－エチル改変を指す。２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖は、改変糖である。本明細書で使用される場合、用語「２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオチド」（同じく２’－ＭＯＥ ＲＮＡ）は、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖部分を含む改変ヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「改変核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外の、任意の核酸塩基を指す。例えば、５－メチルシトシンは、改変核酸塩基である。その一方で、「非改変核酸塩基」は、本明細書で使用される場合、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「５－メチルシトシン」は、５位に結合されたメチル基によって改変されたシトシンを意味する。例えば、５－メチルシトシンは、改変核酸塩基である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ様ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、ノーザン構成をとり、ＲＮＡのように機能する、改変ヌクレオチドを意味する。ＲＮＡ様ヌクレオチドは、２’－エンドフラノシルヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、ＬＮＡ、ｃＥｔ、２’－Ｏ－メチル化核酸、２’－Ｏ－メトキシエチル化（２’－ＭＯＥ）核酸、２’－フッ素化核酸、２’－Ｏ－アミノプロピル化（２’－ＡＰ）核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキサン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）およびＲＮＡ代替物を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ様ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドに組み込まれたときＤＮＡのように機能する、改変ヌクレオチドを意味する。ＤＮＡ様ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（ＦＡＮＡ）ヌクレオチドおよびＤＮＡ代替物を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ノンコーディングＲＮＡ」は、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ分子を意味する。ノンコーディングＲＮＡの例としては、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ならびに低分子ノンコーディングＲＮＡおよび長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「低分子ノンコーディングＲＮＡ」の例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ａｓＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、および前述のもののいずれかについての模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ｌｎｃＲＮＡ」、「長鎖ノンコーディングＲＮＡ」は、タンパク質をコードしない、２００より多くのヌクレオチドを含有する転写されたＲＮＡ分子である。ｌｎｃＲＮＡは、５’－キャッピング、３’－ポリアデニル化、およびスプライシングをはじめとする、一般的な転写後改変にも付され得る。一般に、ＩｎｃＲＮＡは、遺伝子およびゲノム機能の改変において様々な役割を果たす多様なクラスの分子である。例えば、ｌｎｃＲＮＡが遺伝子転写、翻訳およびエピジェネティック制御を制御することは公知である。ＩｎｃＲＮＡの例としては、Ｋｃｎｑｌｏｔｌ、Ｘｌｓｉｒｔ、Ｘｉｓｔ、ＡＮＲＩＬ、ＮＥＡＴ１、ＮＲＯＮ、ＤＡＮＣＲ、ＯＩＰ５－ＡＳ１、ＴＵＧ１、ＣａｓＣ７、ＨＯＴＡＩＲおよびＭＡＬＡＴ１が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「スプライス」または「スプライシング」は、ＲＮＡの不必要な領域を除去し、ＲＮＡを再形成する、自然過程を指す。その二重鎖を含むオリゴヌクレオチドによるＲＮＡ標的機能のモジュレーションの例は、ノンコーディングＲＮＡ機能のモジュレーションである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二重鎖は、上述の低分子ノンコーディングＲＮＡのうちの１つを標的とするように設計される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二重鎖は、ｍｉＲＮＡを標的とするように設計される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二重鎖は、プレｍｉＲＮＡを標的とするように設計される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二重鎖は、プリｍｉＲＮＡを標的とするように設計される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二重鎖は、ｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド二重鎖は、スプライスを標的とするように設計される。
用語「単離された」または「精製された」は、本明細書で使用される場合、それがそのネイティブ状態で通常は伴う構成要素が実質的にまたは本質的にない、物質を指す。純度および均一性は、代表的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。
用語「散在（している）」は、本明細書で使用される場合、隣接空間に異なる種類の部分を有すること、例えば、異なる種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のそばに、同じ種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に対する異なる改変を有することを指す。本発明の様々な実施形態では、「リボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ：ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ）」は、１つまたは複数のリボヌクレオチドが、前記リボヌクレオチドとは異なる種類である少なくとも１つの部分に接続されている、オリゴヌクレオチド鎖のセグメントを指す。例えば、前記リボヌクレオチドが未改変である場合には、異なる種類の部分は、デオキシヌクレオチドもしくはそのアナログ、改変デオキシヌクレオチド、改変リボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドアナログであり得る。前記リボヌクレオチドが改変されている場合には、異なる種類の部分は、デオキシヌクレオチドもしくはそのアナログ、改変デオキシヌクレオチド、未改変リボヌクレオチド、異なって改変されたリボヌクレオチド、または異なる種類のリボヌクレオチドアナログである。
本明細書で使用される場合、「モジュレートすること」、「制御すること」、およびその文法上の等価物は、増加させることまたは減少させること（例えば、サイレンシングさせること）のどちらか、言い換えると、上方制御することまたは下方制御することのどちらか、を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子発現の低減を指し、標的となる遺伝子の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の遺伝子発現の低減を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「阻害すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」、「阻害すること（ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ）」およびそれらの文法上の等価物は、生物活性の文脈で使用されるとき、タンパク質の産生または分子のリン酸化などの、標的となる機能を低下または消失させ得る、生物活性の下方制御を指す。特定の実施形態では、阻害は、標的となる活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の低下を指し得る。障害または疾患の文脈で使用されるとき、これらの用語は、症状の発現を防止することの、症状を緩和することの、または疾患、状態もしくは障害を消失させることの、成功を指す。
本明細書で使用される場合、用語「実質的に相補的」または「相補的」は、連結されたヌクレオシドの２本の鎖間の、末端オーバーハングなどのいずれの一本鎖領域も、２つの二本鎖領域間のギャップ領域もない、塩基対合した二本鎖領域における相補性を指す。相補性は、完全である必要はなく、例えば、連結されたヌクレオシドの２本の鎖間に、任意の数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、ミスマッチの数が、たとえ最小限にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下であってもハイブリダイゼーションが起こらないくらい多い場合、配列は、実質的に相補的な配列ではない。具体的には、２つの配列が、本明細書において「実質的に相補的」と呼ばれるとき、それは、それらの配列が、選択された反応条件下でハイブリダイズするのに十分、互いに相補的であることを意味する。特異性を達成するのに十分な、核酸相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関係は、当技術分野において周知である。２つの実質的に相補的な鎖は、例えば、完全に相補的であることもあり、またはハイブリダイゼーション条件が、例えば、対合する配列と対合しない配列との区別を可能にするのに十分であることを条件に、１つから多数のミスマッチを含有することもある。したがって、実質的に相補的な配列は、二本鎖領域における少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、または間の任意の数の、塩基対相補性を有する、配列を指し得る。
本明細書で使用される場合、「完全に相補的」または「１００％相補的」は、連結されたヌクレオシドの第一鎖の核酸塩基配列の各核酸塩基が、連結されたヌクレオシドの第二鎖の第２の核酸塩基配列内に相補核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態では、連結されたヌクレオシドの第一鎖は、アンチセンス化合物であり、連結されたヌクレオシドの第二鎖は、標的核酸である。ある特定の実施形態では、連結されたヌクレオシドの第一鎖は、センス化合物であり、連結されたヌクレオシドの第二鎖は、アンチセンス化合物であり、または逆に、連結されたヌクレオシドの第一鎖は、アンチセンス化合物であり、連結されたヌクレオシドの第二鎖は、センス化合物である。
本明細書で使用される場合、用語「標的化領域」は、オリゴヌクレオチド鎖内の領域であって、別のオリゴヌクレオチド鎖に実質的にまたは完全に相補的であり、したがって、これら２本の鎖が、適した条件下で、そのような標的化領域において互いにハイブリダイズまたはアニールする、領域を指す。例えば、アンチセンス鎖は、標的化領域を含むことができ、それによって、標的となるｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる。
用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、本明細書では、それらの最も広い意味で使用される。これらの用語は、本明細書に記載の化合物または医薬組成物を対象に導入する任意の方法を指し、例えば、対象に化合物を全身に、局所に、またはｉｎ ｓｉｔｕで導入することを含み得る。したがって、組成物からの対象において産生される本開示の化合物は（その組成物がその化合物を含むか否かを問わず）、これらの用語に包含される。これらの用語が、用語「全身（性）の」または「全身に」と結びつけて使用されるとき、それらは、血流中の化合物または組成物のｉｎ ｖｉｖｏでの全身性の吸収または蓄積、続いての全身への分布を、一般に指す。
用語「有効量」または「治療有効量」は、下で説明されるような、疾患処置を含むがこれに限定されない意図された結果に影響を与えるのに十分である、本明細書に記載の化合物または医薬化合物の量を指す。一部の実施形態では、「治療有効量」は、がん細胞の成長もしくは広がり、腫瘍のサイズもしくは数、ならびに／またはがんのレベル、ステージ、進行および／もしくは重症度の他の尺度の、検出可能な死滅もしくは阻害に有効である量である。一部の実施形態では、「治療有効量」は、全身に、局所に、またはｉｎ ｓｉｔｕで投与される量（例えば、対象においてｉｎ ｓｉｔｕで産生される化合物の量）を指す。治療有効量は、意図される適用（ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ）、または処置されることになる対象および病状、例えば、対象の体重および年齢、病状の重症度、または投与様式などによって変わり得るものであり、当業者はそれを容易に決定することができる。この用語は、標的細胞における特定の応答、例えば細胞遊走の低減、を誘導することになる用量にも適用される。具体的な用量は、例えば、特定の医薬組成物、対象ならびに彼らの年齢および既存の健康状態または健康状態のリスク、従うことになる投薬レジメン、疾患の重症度、それが他の薬剤と組み合わせて投与されるのかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、ならびにそれが担持される物理的送達系に依存して変わり得る。
対象における「がん」という用語は、がんを引き起こす細胞に典型的な特性、例えば、制御されない増殖、不死性、転移能、速い成長および増殖速度、ならびにある特定の形態学的特徴を有する、細胞の存在を指す。多くの場合、がん細胞は、腫瘍または腫瘤の形態で存在することになるが、そのような細胞は、対象内に単独で存在することもあり、または白血病もしくはリンパ腫細胞などの独立細胞のように血流中を循環することもある。本明細書で使用される場合のがんの例としては、これらに限定されないが、肺がん、膵臓がん、骨がん、皮膚がん、頭部または頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、乳がん、子宮がん、卵巣がん、腹膜がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸腺癌、肛門部がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胃腸がん、胃腺癌、アドレノコルチコイド癌（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道がん、胃食道接合部がん、胃食道腺癌、軟骨肉腫、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、ユーイング肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、精巣がん、尿管がん、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、腎臓がん、腎細胞癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽種、星状細胞種、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、前述のがんのいずれかの、または前述のがんの１つもしくは複数についての組合せの、難治性バージョンを含めて、挙げられる。例示されたがんの一部は、一般用語に含まれ、この用語に含まれる。例えば、一般用語である泌尿器がんは、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、精巣がんなどを含み、別の一般用語である肝胆道がんは、肝臓がん（それ自体が、肝細胞癌もしくは胆道癌を含む一般用語）、胆嚢がん、胆道がん、または膵臓がんを含む。泌尿器がんと肝胆道がんの両方が、本開示により企図され、用語「がん」に含まれる。
用語「医薬組成物」は、対象への投与に好適な形態で、多くの場合、他の物質、例えば、滅菌水溶液などの医薬担体、との混合物で、活性成分、例えば本明細書で開示される分子または組成物、を含有する製剤である。一実施形態では、医薬組成物は、バルクでのまたは単位剤形でのものである。単位剤形は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルをはじめとする、様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の活性成分の量は、有効な量であり、関与する特定の処置に従って変化する。患者の年齢および状態に依存して投薬量を常套的に変動させることがときには必要であることは、当業者には理解されるであろう。投薬量は、投与経路にも依存することになる。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内経路などを含む、様々な経路が企図される。本発明のａｓｄＤＮＡの局所的または経皮投与用の剤形は、粉末、スプレー剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を含む。
用語「医薬品」は、個体に投与されたときに治療利益をもたらす物質を意味する。
用語「薬学的に許容される担体」は、化合物の構造に干渉しない媒体または希釈剤を意味する。そのような担体の幾つかは、医薬組成物を、例えば、対象による経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物およびトローチ剤として、製剤化することを可能にする。そのような担体の幾つかは、医薬組成物を、注射、注入または局所的投与用に製剤化することを可能にする。例えば、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液である。
用語「薬学的に許容される誘導体」は、本明細書に記載の化合物の誘導体、例えば、溶媒和物、水和物、エステル、プロドラッグ、多形体、異性体、同位体標識バリアント、薬学的に許容される塩、および当技術分野において公知の他の誘導体を包含する。
用語「薬学的に許容される塩」は、化合物の生理的におよび薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに望ましくない毒性効果を付与しない、塩を意味する。用語「薬学的に許容される塩」または「塩」は、親化合物と、無機または有機酸および塩基を含む薬学的に許容される非毒性酸または塩基との反応から調製される、塩を含む。本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、当技術分野において周知の方法により調製することができる。薬学的に許容される塩の総説については、Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照されたい。薬学的に許容される塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩（maleale）、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩および酒石酸塩をはじめとする、酸付加塩；アルカリ金属カチオン、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、アルカリ土類金属塩、例えば、ＭｇもしくはＣａ、または有機アミン塩を含み得るが、これらに限定されない。特に、オリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、有用であることが証明されており、ヒトへの治療的投与に十分に許容される。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ナトリウム塩の形態のものである。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、特定の処置のレシピエントになる、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。代表的に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して本明細書では同義で使用される。
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」もしくは「処置」もしくは「処置すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」または「緩和すること（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」もしくは「緩和すること（ｔｏ ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」などの用語は、本明細書で使用される場合、（１）診断された病的状態もしくは障害を治癒させる、緩徐化する、その症状を減少させる、および／またはその進行を停止させる、治療的手段と、（２）標的となる病的状態または障害の発症を予防または緩徐化する予防的手段または予防手段の、両方を指す。したがって、処置を必要とする者は、障害を既に有している者；障害に罹患しやすい者；および疾患を予防すべき者を含む。患者が次のうちの１つまたは複数を示す場合、対象は、本発明の方法に従ってうまく「処置される」：がん細胞の数の低減またはがん細胞の完全非存在；腫瘍サイズの低減；軟部組織および骨へのがんの広がりを含む、末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害または非存在；腫瘍転移の阻害または非存在；腫瘍成長の阻害または非存在；特定のがんに関連する１つまたは複数の症状の軽減；罹病率および死亡率の低下；ならびに生活の質の改善。
用語「担体」は、本明細書で使用される場合、例えば、身体の１つの器官または部分から身体の別の器官または部分に対象医薬化合物を運ぶこともしくは輸送することに関与するまたはそれができる、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体、担体、および／または希釈剤の非限定的な例としては、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオ脂および坐薬用ワックス；油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに医薬製剤に利用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシドコポリマー、ならびに着色剤、放出剤（release agent）、コーティング剤、甘味剤、矯味矯味剤および芳香剤、保存剤ならびに抗酸化物質も、組成物中に存在し得る。
２．ある特定の実施形態
本発明のある特定の実施形態は、アンチセンス鎖およびセンス鎖が両方とも、連結されたヌクレオシドモノマーで構成されている、二重鎖組成物を提供する。肝要なＲＮＡ標的化モチーフにおけるヌクレオシドモノマーの５０パーセントもしくはそれより多くは、デオキシリボヌクレオシドモノマーであり、またはａｓｄＤＮＡ分子の二本鎖領域の１本の鎖内の５０パーセントまたはそれより多くの核酸塩基対は、デオキシリボヌクレオシドモノマーを含み、それに含有されるデオキシリボヌクレオシドモノマーおよび／もしくはヌクレオシド間連結の一部は、天然ＤＮＡに見られるものから改変されていることがある。本発明の二重鎖ＤＮＡ分子は、さらに、１つまたは複数のリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（「ＩＳＲ」）にリボヌクレオシドモノマーを含む。１つまたは複数のＩＳＲが、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖のどちらかに見られることもあり、または両方に見られることもある。一部の実施形態では、各ＩＳＲは、互いに独立して、１つのリボヌクレオチドモノマー、または連続する２つ、３つ、４つもしくは５つのリボヌクレオチドモノマーからなる。一部の実施形態では、ＩＳＲは、連続する少なくとも２つの連結されたリボヌクレオチドモノマーを有する。
本発明の二重鎖分子のアンチセンス鎖とセンス鎖両方は、比較的短く、２つのうちアンチセンス鎖のほうが長く、それ故、「非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ」（ａｓｄＤＮＡ）である。
本発明の二重鎖分子の例示的な構造が、図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、１７、１８、１９、２０に示されており、これらの図において、ＩＳＲは、両方の鎖に見られ、または、１００ｐｍで比較的低い遺伝子サイレンシング活性を示す唯一のものでもある、ＩＳＲが短いほうのセンス鎖のみに見られる図５Ａ中の最後のものを除いて、ほぼ全ての二重鎖において長いほうのアンチセンス鎖にのみ見られる。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖とセンス鎖との長さ非対称は、アンチセンス鎖内のその５’末端（例えば、図２Ａにおける右側の最初の３個）またはその３’末端（例えば、図２Ａにおける左側の最初の１０個）における少なくとも１つのオーバーハングと、平滑または陥凹末端である他方の末端につながる。他の実施形態では、アンチセンス鎖の両方の末端にオーバーハングがある（例えば、図２Ａにおける右側の最後の１３個）。
本発明の組成物を、（ｉ）１種類のａｓｄＤＮＡ分子を細胞と接触させるまたは対象に投与する；（ｉｉ）異なる種類のａｓｄＤＮＡ分子を細胞と接触させるまたは対象に異なる時点で別々に投与する；（ｉｉ）異なる種類のａｓｄＤＮＡ分子を細胞と接触させるまたは対象に同時に投与するという少なくとも３つの方法で、真核細胞における遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用することができる。
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、ｍＲＮＡおよびノンコーディングＲＮＡをはじめとするそれが標的化される標的遺伝子の標的セグメントに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である「標的化領域」と呼ばれる核酸塩基配列領域を含む。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが標的化される標的遺伝子の標的セグメントの完全相補配列を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが標的化される標的遺伝子の標的セグメントにハイブリダイズしたときに最大でも１つ、２つまたは３つのミスマッチしか含まない核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、哺乳動物の疾患に関与する、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡから選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＳＲは、アンチセンス鎖の標的化領域内に配置されている。ある特定の実施形態では、ＩＳＲは、アンチセンス鎖の５’末端またはその付近（すなわち、例えば、約２１核酸塩基長である鎖についてはその末端を数えて７核酸塩基以内を意味する、鎖の長さの３分の１以内）に位置する。あるいは、ＩＳＲは、アンチセンス鎖の３’末端またはその付近（すなわち、例えば、約２１核酸塩基長である鎖についてはその末端を数えて７核酸塩基以内を意味する、鎖の長さの３分の１以内）にある。一部の実施形態では、ＩＳＲ、またはＩＳＲの少なくとも一部はまた、アンチセンス鎖のより中央の部分に、すなわち、長さの中間部３分の１に位置し、長さの中間部３分の１にとは、例えば、約２１核酸塩基長である鎖についてはアンチセンス鎖の両末端から７核酸塩基を超えて離れて、という意味である。
様々な実施形態では、第一またはアンチセンス鎖は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０の連結されたヌクレオチドモノマー、もしくはその等価物の、または前記値のいずれか２つで挟まれている範囲（範囲の終点両方を含む）の、骨格長を有する。例えば、第一アンチセンス鎖の範囲の一部は、８～５０ヌクレオチドモノマー；８～３６ヌクレオチドモノマー；８～３３ヌクレオチドモノマー；１０～３０ヌクレオチドモノマー；１０～２９ヌクレオチドモノマー；１２～２９ヌクレオチドモノマー；１２～２８ヌクレオチドモノマー；１２～２６ヌクレオチドモノマー；１２～２５ヌクレオチドモノマー；１３～２５ヌクレオチドモノマー；１３～２４ヌクレオチドモノマー；１３～２３ヌクレオチドモノマー；１５～２３ヌクレオチドモノマー；１０～３６ヌクレオチドモノマー；１２～３６ヌクレオチドモノマー；１２～３２ヌクレオチドモノマー；１４～３６ヌクレオチドモノマー；および少なくとも８ヌクレオチドモノマーを含む。
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、長さ１０～３６（範囲の終点両方を含む）ヌクレオチドモノマーである。言い換えると、アンチセンス鎖は、１０～３６（範囲の終点両方を含む）の連結された核酸塩基モノマーである。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、８～１００、１０～８０、１２～５０、１４～３０、１５～２３、１６～２２、１６～２１、または２０（範囲の終点両方を含む）の連結された核酸塩基からなる、改変オリゴヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３～２３（範囲の終点両方を含む）の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２３の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。
ある特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖に実質的に相補的であり、かつ、センス鎖の全核酸塩基配列にわたって測定して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連結された領域の配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である、核酸塩基配列を含む。両方の鎖からのこれらの実質的に相補的な配列は、１つまたは複数の二本鎖領域を形成する。ある特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の連結された領域の完全相補配列を含む、核酸塩基配列を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＩＳＲは、センス鎖の二本鎖領域内に配置されている。
ある特定の実施形態では、ＩＳＲは、センス鎖の５’末端もしくはその付近（末端から前記末端を数えて核酸塩基の総数の３３％以内）に、またはセンス鎖の３’端もしくはその付近（末端から前記末端を数えて核酸塩基の総数の３３％以内）に、位置する。一部の実施形態では、ＩＳＲ、またはＩＳＲの少なくとも一部はまた、センス鎖のより中央の部分に位置し、すなわち、センス鎖の両末端から核酸塩基の総数の３３％を超えて離れて位置する。一部の実施形態では、ＩＳＲは、センス鎖内に配置されている必要はない。
ある特徴において、センスオリゴヌクレオチド鎖は、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖より短い長さを有する。ある特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の約半分から約全長の長さを有する。ある特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の約４分の１から約全長の長さを有する。ある特定の実施形態では、センス鎖は、長さ６～２９（範囲の終点両方を含む）ヌクレオチドモノマーである。言い換えると、これらのセンス鎖は、６～２９（範囲の終点両方を含む）の連結された核酸塩基である。他の実施形態では、センス鎖は、１３、４～３０、６～１６、１０～２０、または１２～１６（範囲の終点両方を含む）の連結された核酸塩基からなる、オリゴヌクレオチドを含む。ある特定のそのような実施形態では、センス鎖は、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９の連結された核酸塩基、または前記値のいずれか２つにより定義される範囲（範囲の終点両方を含む）からなる、オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、センスオリゴヌクレオチドである。
１つの特徴において、第二またはセンス鎖は、次のようなヌクレオチドモノマー数だけ、第一鎖またはアンチセンス鎖より短い骨格長を有する：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７または３８。様々な実施形態では、第二またはセンス鎖は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８もしくは４９の連結されたヌクレオチドモノマー、またはその等価物の、あるいは前記値のいずれか２つで挟まれている範囲（範囲の終点両方を含む）の、骨格長を有する。ある特定の実施形態では、例えば、第二、センス鎖の長さの範囲の一部は、６～４９ヌクレオチドモノマー；８～４６ヌクレオチドモノマー；８～３５ヌクレオチドモノマー；９～３５ヌクレオチドモノマー；１０～４６ヌクレオチドモノマー；１０～４０ヌクレオチドモノマー；１０～３４ヌクレオチドモノマー；８～３２ヌクレオチドモノマー；８～３０ヌクレオチドモノマー；８～２９ヌクレオチドモノマー；９～２９ヌクレオチドモノマー；９～２６ヌクレオチドモノマー；９～２５ヌクレオチドモノマー；１０～２９ヌクレオチドモノマー；１０～２８ヌクレオチドモノマー；１０～２６ヌクレオチドモノマー；１０～２５ヌクレオチドモノマー；１１～２４ヌクレオチドモノマー；１１～２３ヌクレオチドモノマー；１２～２３ヌクレオチドモノマー；１３～２３ヌクレオチドモノマー；１２～２２ヌクレオチドモノマーのタイド；１３～２３ヌクレオチドモノマー；１５～２３ヌクレオチドモノマーのタイド；および少なくとも６ヌクレオチドモノマーを含む。ある特定の実施形態では、第二鎖は、熱力学的に第一鎖と二重鎖を形成することができる場合、任意のヌクレオチドモノマーの骨格長を有し得る。
ある特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖より１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドモノマー短い。ある特定の実施形態では、センス鎖は、８～２３（範囲の終点両方を含む）の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の実施形態では、センス鎖は、１３の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の実施形態では、センス鎖は、１５の連結されたヌクレオシドモノマーからなる。
本発明の様々な実施形態では、アンチセンス鎖の２つの末端は、次の構成のうちの１つである：３’－オーバーハングおよび５’－オーバーハング；３’－オーバーハングおよび５’末端における平滑末端；５’－オーバーハングおよび３’末端における平滑末端；３’－オーバーハングおよび５’陥凹末端；または５’－オーバーハングおよび３’陥凹末端。
ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドモノマーの長さを有する。様々な実施形態では、アンチセンス鎖の３’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。
ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドモノマーの長さを有する。様々な実施形態では、アンチセンス鎖の５’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。
本発明のある実施形態では、アンチセンス鎖は、１～１５（範囲の終点両方を含む）ヌクレオチドモノマーの３’－オーバーハング、および１～１５（範囲の終点両方を含む）ヌクレオチドモノマーの５’－オーバーハングを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、１～２６（範囲の終点両方を含む）ヌクレオチドモノマーの３’－オーバーハング、および５’平滑末端または５’陥凹末端を有する。さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖は、１～２６（範囲の終点両方を含む）ヌクレオチドモノマーの５’－オーバーハング、および３’平滑末端または３’陥凹末端を有する。
本発明の様々な実施形態では、第二（センス）鎖の２つの末端は、次の構成のうちの１つである：３’－オーバーハングおよび５’陥凹末端；５’－オーバーハングおよび３’陥凹末端；３’平滑末端および５’陥凹末端；５’平滑末端および３’陥凹末端；または３’陥凹末端および５’陥凹末端。ある特定の実施形態では、第二鎖の３’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドモノマーの長さを有する。様々な実施形態では、第二鎖の３’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマー（範囲の終点両方を含む）の長さを有する。ある特定の実施形態では、第二鎖の５’－オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドモノマーの長さを有する。様々な実施形態では、第二鎖の５’－オーバーハングは、１～１５、１～１０、１～８、または１～５ヌクレオチドモノマーの長さを有する。
本発明のａｓｄＤＮＡ分子において、第一鎖および／または第二鎖内の少なくとも１つのヌクレオチドモノマーは、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、糖改変ヌクレオチド、骨格改変ヌクレオチド、および／または塩基改変ヌクレオチドであり得る。ある実施形態では、そのような骨格改変ヌクレオチドは、例えば、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも一方を含むための、ヌクレオシド間連結の改変を少なくとも有する。一部の実施形態では、改変ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）基、ホスホトリエステル、メチルホスホネートもしくはホスホルアミデートである、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、少なくとも１つの改変ヌクレオシド間連結を含む。そのような改変ヌクレオシド間連結は、２つのデオキシリボヌクレオシドモノマー間、２つのリボヌクレオシドモノマー間、または１つのデオキシリボヌクレオシドモノマーと１つのリボヌクレオシドモノマーの間にあり得る。あるいは、末端ヌクレオシドモノマーの少なくとも１つの上のリン酸基は、改変されていることがある。ある特定の実施形態では、ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ある特定の実施形態では、ヌクレオシド間連結は、チオホスホルアミデートヌクレオシド間連結である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ある特定の実施形態では、鎖（アンチセンスまたはセンスまたは両方）内のヌクレオシド間連結の全ては、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結であり、またはホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結の混合物である。
ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、改変糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオシドモノマーを含む。そのようなヌクレオシドモノマーは、デオキシリボヌクレオシドモノマーであることもあり、またはリボヌクレオシドモノマーであることもある。
ある特定の実施形態では、改変糖部分の２’位は、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮから選択される基により置き換えられており、ここで、各Ｒは、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。一部の実施形態では、改変糖部分の２’位は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ１）－（ＣＨ２）２－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される基により置き換えられており、ここで、各Ｒｌ、ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、改変糖部分は、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆおよび２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基の群から選択される。一部の実施形態では、改変糖部分は、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（ｃＥｔ）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’、ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ－（＝ＣＨ２）－２’の群から選択される二環式糖により置換されている。
一部の実施形態では、改変糖部分は、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖（ＭＯＥ）、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（ＦＡＮＡ）、およびメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）の群から選択される。
一部の実施形態では、本発明の分子のアンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、改変核酸塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドモノマーを含む。そのようなヌクレオシドモノマーは、デオキシリボヌクレオシドモノマーであることもあり、またはリボヌクレオシドモノマーであることもある。
一部の実施形態では、改変核酸塩基は、５－メチルシトシン（５－Ｍｅ－Ｃ）、イノシン塩基、トリチル化塩基、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体；６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルならびに他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、ならびに７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンの群から選択される。
特定の実施形態では、本発明の分子における改変核酸塩基は、５－メチルシトシンである。ある実施形態では、本発明の分子における各シトシン塩基は、５－メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、改変核酸塩基は、５－メチルウラシルである。ある特定の実施形態では、各ウラシルは、５－メチルウラシルである。
ある特定の実施形態では、本発明の分子のアンチセンス鎖もしくはセンス鎖のどちらかまたは両方は、連結されたデオキシヌクレオシドモノマーを含む。ある特定の実施形態では、鎖（アンチセンスまたはセンス）全体が、連結されたデオキシヌクレオシドモノマーから排他的になる。ある特定の実施形態では、センス鎖全体が、連結されたデオキシヌクレオシドモノマーから排他的になる。ある特徴において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖のどちらかまたは両方は、連結されたデオキシヌクレオシドモノマーに加えて、さらに、１つまたは複数の連結されたリボヌクレオシドモノマーからなるＩＳＲを含む。別の特徴において、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖とセンス鎖の両方のどちらかは、連結されたデオキシヌクレオシドモノマーに加えて、さらに、１つまたは複数の連結されたリボヌクレオシドモノマーからなるＩＳＲを含む。さらに、よりいっそう多くのＩＳＲセグメントがあることもある。ＩＳＲは、どちらかの鎖のどこにあってもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＳＲは、末端ヌクレオシドモノマー、または末端の最後から２番目のヌクレオシドモノマーを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＳＲは、デオキシヌクレオシドモノマーのセグメントに挿入され、それによって、それらは複数のセグメントに分離される。ある特定の実施形態では、ＩＳＲの各々は、独立して、１つのリボヌクレオシドモノマー、２つ、３つ、４つまたは５つの連結されたリボヌクレオシドモノマーからなる。
ある特定の実施形態では、二本鎖領域の少なくとも１本の鎖内の核酸塩基の少なくとも半分は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。
ある特定の実施形態では、二本鎖領域のＲＮＡ標的化部分における１本の鎖内のヌクレオチドの少なくとも５０％は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。
ある特定の実施形態では、ａｓｄＤＮＡ分子内のリボヌクレオチドモノマーの総数は、最大でも、同じａｓｄＤＮＡ分子内のデオキシリボヌクレオチドモノマーの総数である。
ある特定の実施形態では、ＩＳＲの連結されたリボヌクレオシドモノマーの少なくとも１つまたは各々は、改変リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドアナログである。リボヌクレオチドは、以下と同じまたは同様の方法で改変され得る：改変ヌクレオシド間連結、改変糖部分および／または改変核酸塩基を有する。
一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチドモノマーの糖部分は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド（２－Ｈ）または２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（ＦＡＮＡ）のどちらかの糖部分である。
一部の実施形態では、リボヌクレオチドモノマーの糖部分は、天然に存在するリボヌクレオチド（２－ＯＨ）、２’－Ｆ改変糖、２’－ＯＭｅ改変糖、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖（ＭＯＥ）、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖（ＬＮＡ）およびメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖、センス鎖または両方の鎖において、その中の各ＩＳＲの少なくとも１つのまたは各々のリボヌクレオシドモノマーは、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖（ＭＯＥ）、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖（ＬＮＡ）、およびメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）の群から選択される改変糖部分を有する。ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖、センス鎖または両方の鎖において、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドモノマーは、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（ＦＡＮＡ）の改変糖部分を有する。ある特定の実施形態では、各ＩＳＲの各リボヌクレオシドモノマーは、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖、またはメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）を有し、各シトシンは、５－メチルシトシンであり、各ウラシルは、５－メチルウラシル、またはメチル－シュードウラシルであり、各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
ある特定の実施形態では、本発明の分子は、各ヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結である、デオキシヌクレオシドモノマーからなるアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかを有する。ある特定の実施形態では、本発明の分子は、各ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエート改変を有さない天然のリン酸連結である、デオキシヌクレオシドモノマーからなるアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかを有する。
ある特定の実施形態では、本発明の分子は、センス鎖を含み、このセンス鎖の各ヌクレオチドモノマーは、アンチセンス鎖の相補ヌクレオチドモノマーと同じ改変を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖およびセンスオリゴヌクレオチド鎖を有する本発明の例示的な分子の例示的な構造および例示的な配列は、図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１５Ａ、１６Ａ、１７、１８、１９、２０および２１で示される。
ある特定の実施形態では、非対称短鎖ＤＮＡ二重鎖、および二重鎖分子のアンチセンス鎖内の少なくとも１つのＩＳＲは、強力な遺伝子サイレンシングを可能にする。下の全ての実施例で示されるデータは、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを有する非対称二重鎖であって、そのアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドに少なくとも１つのＩＳＲを有する非対称二重鎖に基づく新しいプラットフォーム技術が、極めて強力な遺伝子サイレンシングを可能にしたことを示唆する。長さモチーフ、相補的およびミスマッチ、様々な改変モチーフなどを含む、ａｓｄＤＮＡのＳＡＲ（構造と活性の関係）特徴についてさらなる研究を行った。この研究は、遺伝子サイレンシング活性に影響し得る様々な構造因子を規定するのに役立つ。そのようなＳＡＲ因子は、典型的な哺乳動物細胞における１００，０００より多くの異なるｍＲＮＡの、およびさらにいっそう多くのノンコーディングＲＮＡの、様々な配列および構造を標的とする最適化遺伝子サイレンサーの設計に、重要である。遺伝子サイレンシング活性およびａｓｄＤＮＡのＳＡＲに関する本発明者らのデータは、ａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング特徴がｓｉＲＮＡおよびＡＳＯとは大いに異なることを示唆し、これは、まだ同定されていない遺伝子サイレンシング機序である新規の独特な機序を示す。
ある特定の実施形態では、本発明の分子を、少なくとも１つの化学的改変または二次構造のどちらかによって、分解に対して安定化することができる。センスオリゴヌクレオチド鎖およびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、アンマッチヌクレオチドモノマーまたは不完全にマッチしたヌクレオチドモノマーを有し得る。センスオリゴヌクレオチド鎖および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、１つまたは複数のニック（核酸骨格の切断部）、ギャップ（１つもしくは複数の欠損ヌクレオチドを有する断片化された鎖）、および改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有し得る。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖内のヌクレオチドモノマーのいずれかまたは全てを化学的に改変することができるばかりでなく、各鎖を、その機能性を強化するために、１つまたは複数の部分またはリガンドに、例えば、ペプチド、抗体、抗体断片、ポリマー、多糖、脂質、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、親油性化合物または部分 オリゴヌクレオチド、コレステロール、ＧａｌＮＡｃおよびアプタマーから選択される部分またはリガンドと、コンジュゲートさせることができる。
ある特定の実施形態では、本発明の二重鎖分子の二本鎖領域は、いかなるミスマッチもバルジも含有せず、２本の鎖は、二本鎖領域において互いに完全に相補的である。別の実施形態では、二重鎖の二本鎖領域は、ミスマッチおよび／またはバルジを含有する。
ある特定の実施形態では、標的は、哺乳動物の疾患に関与する、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡである。ある特定の実施形態では、標的は、ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、標的は、ノンコーディングＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡである。アンチセンス鎖は、標的配列に、それらが互いに実質的に相補的であれば、ハイブリダイズすることによって標的を占有し、標的遺伝子を不活性化することができる。
３．アンマッチ領域またはミスマッチ領域
本発明のアンチセンス鎖とセンス鎖の間の相補領域は、例えば１つまたは複数のミスマッチを含有する、少なくとも１つのアンマッチ領域または不完全にマッチした領域を有し得る。一部の実施形態では、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡのセンス鎖は、ａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング活性に対していかなる影響もなく、３つまたはそれより多く（標的化領域の少なくとも１５％）のミスマッチを許容することができる。センス鎖内のミスマッチは、オフターゲット効果を低下させるために望ましいこともあり、またはａｓｄＤＮＡに対する他の特徴を可能にすることもある。
当業者には周知であるように、活性を消失させることなくミスマッチ塩基を導入することが可能である。同様に、本発明のａｓｄＤＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの鎖は、アンマッチ領域またはミスマッチ領域を含み得る。一部の実施形態では、本発明のａｓｄＤＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの鎖は、ａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング活性を維持しながら、少なくとも３つ（標的化領域の少なくとも１５％）のミスマッチを許容することができる。アンチセンス鎖内のミスマッチは、オフターゲット効果を低下させるために望ましいこともあり、またはａｓｄＤＮＡに対する他の特徴を可能にすることもある。
４．改変
ヌクレオシドモノマーは、塩基－糖組成物である。ヌクレオシドモノマーの核酸塩基（塩基としても公知）部分は、通常は、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドモノマーは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドモノマーである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドモノマーについては、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に連結されていることがある。オリゴヌクレオチドは、隣接ヌクレオシドモノマーが互いに共有結合して線状ポリマーオリゴヌクレオチドを形成することによって形成される。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成すると一般にいわれている。
本発明のａｓｄＤＮＡ分子、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の改変は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基に対する置換または変化を包含する。改変されたａｓｄＤＮＡ、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、一部の場合には、例えば、阻害活性の増大、細胞取込みの増強、鎖親和性の増強、溶解度、非特異的相互作用を低減させること、およびＲＮａｓｅ分解に対する耐性、またはその他の点での安定性の増強などの、望ましい特性のため、ネイティブ形態より好ましい。それ故、そのような化学的に改変されたヌクレオシドモノマーを有する、より短いアンチセンス鎖と同等の結果を、多くの場合、得ることができる。本発明のアンチセンスおよびセンス鎖内の天然ヌクレオチドの１つまたは複数を、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体で置換することができる。置換は、アンチセンス鎖およびセンス鎖のどこで行われてもよい。
オリゴヌクレオチド分子の改変は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびＲＮＡｉをはじめとする、様々なオリゴヌクレオチド分子の安定性を改善するために研究されている（Chiu and Rana, 2003；Czauderna et al., 2003；de Fougerolles et al., 2007；Kim and Rossi, 2007；Mack, 2007；Zhang et al., 2006；Schrnidt, 2007；Setten RL et al., 2020；Crooke ST et al., 2018；およびRoberts TC et al., 2020）。
当業者に公知の任意の安定化改変を使用して、オリゴヌクレオチド分子の安定性を改善することができる。オリゴヌクレオチド分子内で、化学的改変を、リン酸骨格（例えば、ホスホロチオエート連結）、糖（例えば、ロックド核酸、グリセロール核酸、ｃＥｔ、２’－ＭＯＥ、２’－フルオロウリジン、２’－Ｏ－メチル）、および／または塩基（例えば、２’－フルオロピリミジン）に導入することができる。
そのような化学的改変のいくつかの例は、後続のセクションで要約される。
様々な実施形態では、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、糖改変ヌクレオチド、骨格改変ヌクレオチド、および／または塩基改変ヌクレオチドである。
４．１ 改変ヌクレオシド間連結または骨格改変ヌクレオチド
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結は、３’から５’へのホスホジエステル連結である。１つまたは複数の改変された、すなわち天然に存在しない、ヌクレオシド間連結をその一方または両方の鎖に有する本発明のａｓｄＤＮＡ分子は、例えば、細胞取込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの、望ましい特性のため、天然に存在するヌクレオシド間連結のみを有する対応する分子よりも選ばれることもある。
改変ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチド鎖は、リン原子を保持するヌクレオシド間連結はもちろん、リン原子を有さないヌクレオシド間連結も含む。ある実施形態では、ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、窒素および／または硫黄ヘテロ原子を少なくとも含むように改変されている。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結としては、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、チオホスホルアミデートおよびホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。リン含有および非リン含有連結の調製方法は、周知である。
一実施形態では、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、骨格改変ヌクレオチドである。骨格改変ヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の改変を有し得る。さらなる実施形態では、骨格改変ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
４．２ 改変糖部分
本発明のアンチセンスおよび／またはセンス鎖は、糖基が改変されている１つまたは複数のヌクレオシドモノマーを必要に応じて含有し得る。そのような糖改変ヌクレオシドモノマーは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増大、または一部の他の有益な生物学的特性を鎖に付与し得る。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドモノマーは、化学的に改変されたリボフラノース環部分を含む。化学的に改変されたリボフラノース環の例は、限定ではないが、置換基（５’および２’置換基を含む）の付加、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）またはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは保護基である）での置き換え、およびこれらの組合せを含む。化学的に改変された糖の例としては、２’－Ｆ－５’－メチル置換ヌクレオシド（他の開示されている５’，２’－二置換ヌクレオシドについては、２００８年８月２１日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ２００８／１０１１５７を参照されたい）、または２’位におけるさらなる置換を伴うリボシル環酸素原子のＳでの置き換え（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願公開第２００５－０１３０９２３を参照されたい）、または代替的に、ＢＮＡの５’置換（ＬＮＡが、例えば５’－メチルもしくは５’－ビニル基で、置換されている、２００７年１１月２２日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１を参照されたい）が挙げられる。
改変糖部分を有するヌクレオシドモノマーの例としては、限定ではないが、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆおよび２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。２’位における置換基を、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ１）－（ＣＨ２）２－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択することもでき、ここで、各Ｒｌ、ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルである。
二環式ヌクレオシドは、二環式糖部分を有する改変ヌクレオシドである。二環式核酸（ＢＮＡ）の例としては、限定ではないが、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるａｓｄＤＮＡ、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、架橋が次の式のうちの１つを含む、１つまたは複数のＢＮＡヌクレオシドを含む：４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびそのアナログ、２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびそのアナログ、２００９年１月８日に公開された、ＷＯ／２００９／００６４７８として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびそのアナログ、２００８年１２月１１日に公開された、ＷＯ／２００８／１５０７２９として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（２００４年９月２日に公開された米国特許出願公開第２００４－０１７１５７０号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である）（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい）；および４’－ＣＨ２－Ｃ－（＝ＣＨ２）－２’（およびそのアナログ、２００８年１２月８日に公開された、ＷＯ２００８／１５４４０１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、（Ａ）α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２）ＢＮＡ （Ｂ）β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２）ＢＮＡ （Ｃ）エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）ＢＮＡ（拘束エチルまたはｃＥｔと呼ばれる）、（Ｇ）メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２）ＢＮＡ、（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ、および（Ｋ）ビニルＢＮＡを含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、２’－ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、およびＣＮから選択される基によって置き換えられている、糖改変リボヌクレオチドであり、ここで、各Ｒは、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、アルケニルおよびアルキニルからなる群より選択され、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩの群から選択される。ある特定の実施形態では、糖改変リボヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ改変ヌクレオチド、２’－Ｆ改変ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）改変ヌクレオチド、ＬＮＡ（ロックド核酸）改変ヌクレオチド、ＧＮＡ（グリセロール核酸）改変ヌクレオチド、およびｃＥｔ（拘束エチル）改変ヌクレオチドの群から選択される。
血清中でのエンドヌクレアーゼ活性に対する耐性を増大させる、２’－Ｏ－メチルプリンおよび２’－フルオロピリミジンなどの、リボースの２’位における化学的改変を採用して、本発明の分子を安定化することができる。改変の導入のための位置は、分子のサイレンシング／制御効力の有意な低下を回避するように注意深く選択するべきである。ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドモノマーに隣接する第１のヌクレオチドモノマーは、２’－フルオロ－リボヌクレオチドである。
４．３ 改変核酸塩基
ａｓｄＤＮＡ分子内のアンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、核酸塩基（または塩基）改変または置換も有し得る。核酸塩基（または塩基）改変または置換は、天然に存在する核酸塩基または合成未改変核酸塩基と構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能である。天然核酸塩基と改変核酸塩基の両方が、水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基改変は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、または一部の他の有益な生物学的特性をａｓｄＤＮＡ分子に付与し得る。改変核酸塩基は、例えば、５－メチルシトシン（５－Ｍｅ－Ｃ）などの、合成および天然核酸塩基を含む。５－メチルシトシン置換を含む、ある特定の核酸塩基置換は、アンチセンスおよびセンス鎖の結合親和性を増大させるのに特に有用である。例えば、５－メチルシトシン置換は、０．６～１．２℃だけ、核酸二重鎖安定性を増大させることが示されている（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。
追加の改変核酸塩基は、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、１－メチルシュードウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体；６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルならびに他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含み、これらに限定されない。
複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジンおよび２－ピリドン、で置き換えられているものを含み得る。アンチセンスおよびセンス鎖の結合親和性を増大させるのに特に有用である核酸塩基としては、５置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンが挙げられ、前記置換プリンには、２アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンが含まれる。
ある特定の実施形態では、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、塩基改変ヌクレオチドである。ある実施形態では、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、通常ではない塩基または改変塩基を有する。ある特定の実施形態では、改変塩基は、５－メチルシトシン（５’－Ｍｅ－Ｃ）である。ある特定の実施形態では、各シトシンは、５－メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、改変塩基は、５－メチルウラシル（５’－Ｍｅ－Ｕ）である。ある特定の実施形態では、各ウラシルは、５－メチルウラシルである。
安定性または親和性に役立ち得る任意の改変ヌクレオチドまたは類似体を、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく作製することができる。そのような化学的改変のいくつかの例は、上に要約されたものと同じである。
５．医薬組成物
一部の実施形態では、本発明は、本発明のａｓｄＤＮＡまたはその薬学的に許容される誘導体と少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬製剤も提供する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むように意図されている。好適な担体は、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Twentieth Edition," Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.に記載されており、この参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も、使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤がａｓｄＤＮＡ分子と非適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。
本発明の分子とともに使用することができる薬学的に許容される担体の例としては、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、脂質ナノ粒子、タンパク質担体、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、ＧａｌＮＡｃ、多糖、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、コレステロール、脂質、親油性化合物または部分、およびリポイドが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本発明は、医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置の方法を提供する。ある実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射（ｉｖ）、皮下注射（ｓｃ）、経口的に（ｐｏ）、筋肉内（ｉｍ）注射、経口投与、吸入、局所的、髄腔内、および他の局部的な投与の群から選択される経路によって投与される。別の実施形態では、治療有効量は、１日に１ｎｇ～１ｇ、１日に１００ｎｇ～１ｇ、または１日に１μｇ～１０００ｍｇである。
製剤のための方法は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４２６２（ＷＯ０３／０１ １２２４）、米国特許出願公開第２００３／００９１６３９号および米国特許出願公開第２００４／００７１７７５号において開示されており、これらの参考特許文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のａｓｄＤＮＡ分子は、本発明のａｓｄＤＮＡ分子（活性成分として）の治療有効量（例えば、腫瘍成長の阻害、腫瘍細胞の死滅、細胞増殖性障害の処置または予防などによって所望の治療効果を達成するのに十分な効果的なレベル）と標準的な医薬担体または希釈剤とを従来の手順に従って併せることにより（すなわち、本発明の医薬組成物を生成することにより）調製された好適な剤形で、投与される。
これらの手順は、所望の調製物を達成するために、適宜、成分を混合すること、造粒すること、および圧縮することまたは溶解することを含み得る。別の実施形態では、ａｓｄＤＮＡ分子の治療有効量は、標準的な医薬担体または希釈剤を伴わない好適な剤形で投与される。一部の実施形態では、本発明の二重鎖分子の治療有効量は、好適な剤形で投与される。薬学的に許容される担体は、固体担体、例えば、ラクトース、白土（ｔｅｒｒａ ａｌｂａ）、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含む。例示的な液体担体としては、シロップ、落花生油、オリーブ油、水などが挙げられる。同様に、担体または希釈剤は、当技術分野において公知の時間遅延材料、例えば、単独での、またはワックス、エチルセルロース（eihylcellulose）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどを伴う、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンを含む。他の充填剤、賦形剤、矯味矯味剤（ｆｌａｖｏｒａｎｔ）、および他の添加剤、例えば、当技術分野において公知であるものも、本発明による医薬組成物に含めることができる。
本発明の医薬組成物を、一般に知られている様式で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、水簸、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスによって、製造することができる。医薬組成物を、薬学的に使用することができる調製物へのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの加工を助長する賦形剤および／または助剤を含む１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化することができる。もちろん、適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
本発明の組成物、化合物、組合せまたは医薬組成物を、化学療法処置に現在使用されている周知の方法のうちの多くの方法で対象に投与することができる。例えば、がんの処置のために、本発明のａｓｄＤＮＡ分子を、腫瘍に直接注射することができ、血流もしくは体腔に注射することができ、または経口摂取することができ、またはパッチを用いて皮膚を通して適用することができる。乾癬状態の処置には、全身投与（例えば、経口投与）、または皮膚の患部への局所的投与が、好ましい投与経路である。選択される用量は、有効な処置を構成するのに十分なものであるべきであるが、許容しがたい副作用を引き起こすほど高用量であってはならない。患者の病状（例えば、がん、乾癬など）および健康の状態を、処置中、および処置後の妥当な期間、入念にモニターするべきである。
６．有用性
６．１ 使用方法
本発明は、細胞または生物における遺伝子発現または機能をモジュレートする方法を提供する。細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であり得る。方法は、前記細胞または生物を本明細書で開示されるａｓｄＤＮＡ分子と選択的遺伝子サイレンシングが起こり得る条件下で接触させるステップ、およびアンチセンス鎖に実質的に相補的な配列部分を有する標的核酸に対してａｓｄＤＮＡ分子によって発揮される選択的遺伝子サイレンシングを媒介するステップを含む。標的核酸は、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡなどのＲＮＡであり得、そのようなＲＮＡは、疾患に関与するタンパク質をコードするか、または疾患に関与する生物学的経路の一部を制御する。
ある実施形態では、接触させるステップは、ａｓｄＤＮＡ分子を、培養下の標的細胞に、または選択的遺伝子サイレンシングを行うことができる生物における標的細胞に、導入するステップを含む。さらなる実施形態では、導入するステップは、混合、トランスフェクション、リポフェクション、感染、電気穿孔、または他の送達技術を含む。別の実施形態では、導入するステップは、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、脂質ナノ粒子、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、親油性化合物または部分、およびリポイドの群から選択される薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を使用して、ｉｖ、ｓｃ、髄腔内、ｐｏ、吸入、局所的または他の臨床的に許容される投与方法によって投与することを含む。
ある実施形態では、サイレンシング方法は、細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定するために使用される。
ある実施形態では、本発明の組成物による標的となる遺伝子またはＲＮＡは、疾患、例えば、ヒトの疾患もしくは動物の疾患、病的状態、または望ましくない状態に関連または関与する。さらなる実施形態では、標的遺伝子またはＲＮＡは、病原性微生物のものである。さらにさらなる実施形態では、標的遺伝子またはＲＮＡは、ウイルス起源のものである。別の実施形態では、標的遺伝子またはＲＮＡは、腫瘍関連のものである。
代替実施形態では、本発明の組成物による標的となる遺伝子またはＲＮＡは、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫介在性障害、アレルギー性疾患、皮膚科疾患、悪性疾患、胃腸障害、肝障害、呼吸器障害、心血管障害、皮膚科障害、腎障害、リウマチ様障害、神経障害、精神障害、内分泌障害、または老化関連障害または疾患に関連する、またはより具体的にはそれに関与する、遺伝子またはＲＮＡである。
６．２ 処置方法
本発明は、ＡＳＯおよびｓｉＲＮＡについて要約されたものを含む、様々な疾患または状態を処置または予防する方法も提供する(Czech, 2006; de Fougerolles et al., 2007; Dykxhoorn et al., 2003; Kim and Rossi, 2007; Mack, 2007; Crooke ST et al., 2018; Setten RL et al., 2019; Roberts TC et al., 2020)。方法は、ａｓｄＤＮＡ分子の有効量を、それを必要とする対象に、直ぐ上のセクションで説明された所望の遺伝子阻害が起こり得る条件下で、投与するステップを含む。
例示的な実施形態では、ａｓｄＤＮＡ分子と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを有する医薬組成物が、治療有効量で、疾患または望ましくない状態を処置または予防するために、それを必要とする患者に投与される。
一部の実施形態では、本発明を、がん治療として、またはがんを予防するために、使用することができる。ａｓｄＤＮＡの組成物は、細胞増殖障害または悪性疾患に関与する遺伝子をサイレンシングまたはノックダウンするために使用することができる。これらの遺伝子の例は、ｋ－Ｒａｓ、β－カテニン、Ｓｔａｔ３である。これらの癌遺伝子は、多数のヒトがんにおいて活性であり、関連がある。
本発明の新規組成物を、眼疾患（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ））；感染性疾患（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＲＣＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デング熱、ウエストナイルウイルス）；呼吸器疾患（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＣ）、喘息、嚢胞性線維症）；神経疾患（例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、疼痛）；心血管疾患；代謝性障害（例えば、高脂血症、高コレステロール血症、および糖尿病）；遺伝性障害；および炎症状態（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、リウマチ様疾患、自己免疫障害）、皮膚科疾患を処置または予防するために、使用することもできる。
代替実施形態では、投与方法は、静脈内注射（ｉｖ）、皮下注射（ｓｃ）、経口的に（ｐｏ）、髄腔内、吸入、局所的、および他の局部的な投与の群から選択される経路である。
本発明の異なる特徴をさらに例証するために、実施例を下に提供する。実施例は、本発明の実施のための有用な方法論も例証する。これらの実施例は、本請求項に関わる発明を限定しない。
方法および材料
細胞培養
ＤＬＤ１細胞をＡＴＣＣから購入した。細胞を、１０％不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。
ＨｅｐａＲＧ細胞を、１０％ＦＢＳと、１０ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（Hydrcortisone）と、４ｍｇ／ｍｌのヒト組換えインスリンとを補充したウィリアム培地で成長させた。
ＤＬＤ１細胞またはＨｅｐａＲＧ細胞へのａｓｄＤＮＡのトランスフェクション
トランスフェクションの２４時間前に、ＤＬＤ１またはＨｅｐａＲＧ細胞を６ウェルプレートに播種した（１×１０５細胞／２ｍＬ／ウェル）。非対称ｓｄＤＮＡを、１００ｐＭ、２００ｐＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭまたは１００ｎＭの最終濃度で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）により製造方法に記載の通りにトランスフェクトした。手短に述べると、非対称ｓｄＤＮＡおよびＲＮＡｉＭＡＸを無血清ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で２０分間インキュベートし、次いで、培養培地とともに細胞に添加した。
定量的ＰＣＲ
示した非対称ｓｄＤＮＡをトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの４８時間後に回収した。ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬで単離し、ＴａｑＭａｎ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ試薬、およびβ－カテニンｍＲＮＡ検出のためのＣＴＮＮＢ１アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＡＰＯＣＩＩＩ ｍＲＮＡ検出のためのＡＰＯＣＩＩＩアッセイ、ＡＰＯＢ ｍＲＮＡ検出のためのＡＰＯＢアッセイ、ＴＴＲ ｍＲＮＡ検出のためのＴＴＲアッセイ、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ検出のためのＳＴＡＴ３アッセイを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行い、遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルを内部対照として使用した。
標的配列
本発明で開示するａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効果を調査するために、ａｓｄＤＮＡを、異なる遺伝子を標的とするように設計し、作製した。設計し、下の実施例で使用した、標的遺伝子、標的配列を図１に示し、ａｓｄＤＮＡ、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡの対応するアンチセンス鎖の例示的な配列も図１に示す。
（実施例１）
ＡＳおよびＳＳ両方にＩＳＲを有するａｓｄＤＮＡに関する構造と活性の関係（ＳＡＲ）
ＡＳ（アンチセンス鎖）とＳＳ（センス鎖）両方にまたはＡＳのみにＩＳＲを有する非対称ｓｄＤＮＡの構造および配列を設計し、使用した。それらを図２Ａおよび図２Ｂに列挙する。
ＡＰＯＣＩＩＩを標的とする設計したａｓｄＤＮＡ（ｓｄＤＮＡ ａ１～ａ３３）全てをＨｅｐａＲＧ細胞にトランスフェクトした。ＨｅｐａＲＧ細胞にｓｄＤＮＡ ａ１～ａ３３分子を１００ｐＭでトランスフェクトした後、ＡＰＯＣＩＩＩの相対ｍＲＮＡレベルを検出した。遺伝子サイレンシング結果を図２Ｃに示す。この図は、設計したａｓｄＤＮＡ全てが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有することを示唆する。
図２Ａでは、示されている構造中の全ての文字「Ｄ」は、ＤＮＡ残基またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを表し、示されている構造中の全ての文字「Ｒ」は、ＲＮＡ残基またはリボヌクレオチドモノマーを表し、示されている構造中の全ての「＊」は、ＰＳ（ホスホロチオエートヌクレオシド間連結）を表す。
図２Ｂでは、配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」は、ＤＮＡ残基を表し、配列中の全ての大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」は、２’－ＭＯＥ改変ＲＮＡ残基を表し、この場合、全ての「Ｕ」は、５－メチルウリジン２’－ＭＯＥ ＲＮＡ残基であり、全ての「Ｃ」および「ｃ」は、５－Ｍｅ－Ｃであり、配列中の全ての「＊」は、ＰＳ（ホスホロチオエートヌクレオシド間連結）を表す。
（実施例２）
ＡＳに排他的に配置されたＩＳＲと様々な位置および長さのＰＳ改変ＤＮＡ ＳＳとを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図３Ａは、ＩＳＲが排他的にＡＳに見られる、ａｓｄＤＮＡの一連の実施形態の様々な構造を示す。ＩＳＲ含有アンチセンス鎖（ＡＳ）を一定に保ち、ＰＳ改変ＤＮＡ（ｓｄＤＮＡ ｂ１～ｂ３１）で排他的に構成されているセンス鎖（ＳＳ）の位置および長さを変化させることにより、そのような構造バリエーションの遺伝子サイレンシング効果を試験した。具体的には、ａｓｄＤＮＡ ｂ１～ｂ３１を、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするように設計した（図３Ｂに示されているａｓｄＤＮＡ ｂ１～ｂ３１の構造および配列）。これらのａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（図３Ｃ）。
図３Ａでは、示されている構造中の全ての文字「Ｄ」、「Ｒ」および「＊」は、図２Ａにおけるものと同じものを表す。図３Ｂでは、配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、全ての大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有すること、実施例１の場合と同じ結論、を示唆する。
（実施例３）
ＡＳに排他的に配置されたＩＳＲと様々な位置の非改変ＤＮＡ ＳＳとを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図４Ａは、ＡＳに排他的に配置されたＩＳＲを有するａｓｄＤＮＡの別の一連の実施形態の異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、ＡＳを一定に保った。純粋な天然ＤＮＡモノマーで構成されているＳＳを使用する。ＳＳの様々な位置および長さを設計した（ｓｄＤＮＡ ｃ１～ｃ３１）（図４Ｂに示されている構造および配列）。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするこれらのａｓｄＤＮＡ ｃ１～ｃ３１の遺伝子サイレンシング効果をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（図４Ｃ）。
図４Ａでは、示されている構造中の全ての文字「Ｄ」、「Ｒ」および「＊」は、図２Ａにおけるものと同じものを表す。図４Ｂでは、配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、全ての大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有すること、実施例１および２の場合と同じ結論、を示唆する。
（実施例４）
ＡＳの様々な位置に配置された様々な数のリボヌクレオチドモノマーを含むＩＳＲを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図５Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、ＳＳを一定に保ったが、アンチセンス鎖内のＩＳＲのリボヌクレオチドモノマーを変化させた（ｓｄＤＮＡ ｄ１～ｄ２４）（図５Ａに示されている構造および配列）。ａｓｄＤＮＡ ｄ１～ｄ２０のアンチセンス鎖と同一の構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、各々のａｓｄＤＮＡの対応するＡＳＯとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したａｓｄＤＮＡ ｄ１～ｄ２４および各々の対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（比較結果を図５Ｂに示す）。
図５Ａでは、示されている構造および配列中の全ての文字「Ｄ」、「Ｒ」、小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ａおよび図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
結果は、ＡＳ内に少なくとも１つＩＳＲを有する全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、対応するＡＳＯよりも有意に強力および効果的であることを示唆する。
（実施例５）
ＡＳ内のリボヌクレオチドモノマーの総数を一定に保ちながらＡＳ内の様々な位置に配置されたＩＳＲを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図６Ａは、さらに別の一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、センス鎖を一定に保ったが、固定総数のリボヌクレオチドモノマーを含むＩＳＲのアンチセンス鎖内の位置を変化させた（ｓｄＤＮＡ ｅ１～ｅ１１；図６Ａにおける構造および配列）。ｓｄＤＮＡ ｅ１～ｅ１１のアンチセンス鎖と同じ構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、各々のａｓｄＤＮＡの対応するＡＳＯとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的とするように設計したａｓｄＤＮＡ ｅ１～ｅ１１および各々の対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（比較結果を図６Ｂに示す）。
図６Ａでは、示されている構造および配列中の全ての文字「Ｄ」、「Ｒ」、小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ａおよび図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、対応するＡＳＯよりも有意に強力および効果的であること、実施例４の場合と同じ結論、を示唆する。
（実施例６）
様々な長さのＡＳを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図７Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、センス鎖を一定に保ったが、アンチセンス鎖の長さを変化させた（ｓｄＤＮＡ ｆ１～ｆ９、図７Ａに示されている構造および配列）。ａｓｄＤＮＡ ｆ１～ｆ９のアンチセンス鎖と同じ構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、各々のａｓｄＤＮＡの対応するＡＳＯとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したｓｄＤＮＡ ｆ１～ｆ９および各々の対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（比較結果を図７Ｂに示す）。
図７Ａでは、示されている構造および配列中の全ての文字「Ｄ」、「Ｒ」、小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ａおよび図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、対応するＡＳＯよりも有意に強力および効果的であること、実施例４および５の場合と同じ結論、を示唆する。
（実施例７）
様々な長さのＡＳおよびＳＳを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図８Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的化するための様々な長さのアンチセンス鎖およびセンス鎖を設計した（図８Ａに示されているｓｄＤＮＡ＿１～１０構造および配列）。ａｓｄＤＮＡ＿１～１０のアンチセンス鎖と同じ構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、各々のａｓｄＤＮＡの対応する一本鎖ＡＳとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したａｓｄＤＮＡ＿１～１０および各々の対応する一本鎖ＡＳの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（ａｓｄＤＮＡの結果を図８Ｂに示し、対応するＡＳＯを図８Ｃに示す）。
図８Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、対応する一本鎖ＡＳよりも有意に強力および効果的であること、実施例４～６の場合と同様の結論、を示唆する。対応する一本鎖ＡＳは、ここではピコモル濃度レベルで概して非常に低い活性を示すが、周知のＡＳＯ技術の公知の開発と同じナノモル濃度レベル（約１０ｎＭ～３０ｎＭ）で遺伝子サイレンシング活性を示すことができる。ここで、典型的なＡＳＯ（一般に１６ｎｔ～２０ｎｔの長さを有する）よりはるかに長い長さを有する一本鎖ＡＳオリゴヌクレオチドが、遺伝子サイレンシング活性についてその典型的なＡＳＯより高い効力を示すことも、驚くべき発見である。しかし本発明のａｓｄＤＮＡは、公知のはるかに最適化されたＡＳＯを含む、対応する一本鎖ＡＳオリゴヌクレオチドより、はるかに高い効力および有効性を常に有する。
（実施例８）
様々な長さのＡＳおよびＳＳを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図９Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、ＡＰＯＣＩＩＩ遺伝子を標的化するための様々な長さのアンチセンス鎖およびセンス鎖を設計した（ｓｄＤＮＡ１～４、図９Ａに示されている構造および配列）。図９Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表し、示されている配列中の全ての大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」は、ＬＮＡ改変ＲＮＡ残基を表し、この場合、全ての「Ｕ」は、５－メチルウリジンＬＮＡ ＲＮＡ残基であり、全ての「Ｃ」は、５－Ｍｅ－Ｃ ＬＮＡ ＲＮＡ残基である。
ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したａｓｄＤＮＡ＿１～１０および各々の対応する一本鎖ＡＳＯの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（ａｓｄＤＮＡの結果を図９Ｂに示す）。結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有すること、実施例１～３の場合と同様の結論、を示唆する。
（実施例９）
様々な長さのＳＳを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図１０Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、アンチセンス鎖を３２ｎｔの長さで一定に保ったが、センス鎖の長さを８ｎｔから２８ｎｔまで変化させた（ａｓｄＤＮＡ＿１～８、図１０Ａに示されている構造および配列）。図１０Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。３２ｎｔの長さを有する、全てのａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同一の構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、比較のために対応する一本鎖ＡＳＯとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したａｓｄＤＮＡ＿１～８および対応する一本鎖ＡＳＯの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（結果を図１０Ｂに示す）。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、対応する一本鎖ＡＳＯより、そのＡＳＯが公知の典型的なＡＳＯ技術（一般に、１６ｎｔ～２０ｎｔの長さを有する）より長い、かなりの長さを有するときであっても、はるかに強力および効果的であること、実施例７の場合と同じ結論、を示唆する。
（実施例１０）
様々な長さのＳＳを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図１１Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、アンチセンス鎖を３６ｎｔの長さで一定に保ったが、センス鎖の長さを８ｎｔから３２ｎｔまで変化させた（ｓｄＤＮＡ＿１～９、図１１Ａに示されている構造および配列）。図１１Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。３６ｎｔの長さを有する、全てのａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同じ構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、比較のために対応する一本鎖ＡＳＯとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したａｓｄＤＮＡ＿１～９および対応する一本鎖ＡＳＯの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（結果を図１１Ｂに示す）。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、対応する一本鎖ＡＳＯより、そのＡＳＯが公知の典型的なＡＳＯ技術（一般に、１６ｎｔ～２０ｎｔの長さを有する）よりかなり長いときを含めて、はるかに強力および効果的であること、実施例７および９の場合と同じ結論、を示唆する。
（実施例１１）
様々な長さのＡＳを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図１２Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、センス鎖を１２ｎｔの長さで一定に保ったが、アンチセンス鎖の長さを２０ｎｔから３６ｎｔまで変化させた（ｓｄＤＮＡ＿１～５、図１２Ａに示されている構造および配列）。図１２Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。各々のｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同じ構造および配列を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドも、比較のために対応する一本鎖ＡＳとして設計した。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したｓｄＤＮＡ＿１～５および各々の対応する一本鎖ＡＳの遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（結果を図１２Ｂに示す）。
結果は、全ての設計したａｓｄＤＮＡが、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有し、ＩＳＩＳ３０４８０１である一本鎖ＡＳＯ配列番号１１などの、最も先進的な最先端のノウハウで最適化された対応する一本鎖ＡＳＯを含む、対応する一本鎖ＡＳＯより、はるかに強力および効果的であることを示唆する。結果は、実施例７、９および１０の場合と同じ結論を示唆する。
（実施例１２）
ＡＳの様々な位置に配置されたＩＳＲの様々なモチーフを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図１３Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、センス鎖を一定に保ったが、ＡＳ内のＩＳＲのリボヌクレオチドモノマーの位置および総数を変化させた（ＩＳＲ＿０～５、図１３Ａに示されている構造および配列）。図１３Ａにおけるアンチセンス鎖内のＩＳＲの様々なモチーフは、各ＩＳＲが、１または２程度の少ない数のリボヌクレオチドモノマーを有すること、および各ＩＳＲが、少なくとも１つの介在デオキシリボヌクレオチドモノマーで離間していることを示す。図１３Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したＩＳＲ＿０～５の遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（結果を図１３Ｂに示す）。
全ての設計したａｓｄＤＮＡは、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有する。結果は、ＡＳ内の少なくとも１つのＩＳＲであって、様々な数のリボヌクレオチドモノマーを有し、ＡＳの任意の位置に配置された、ＩＳＲが、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡの極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を可能にすることを、さらに示唆する。
（実施例１３）
ＡＳにミスマッチを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図１４Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、アンチセンス鎖を、標的遺伝子にハイブリダイズしたときに少なくとも１つのミスマッチを含むように設計し（Ｍｉｓ１～３、図１４Ａに示されている構造および配列）、ミスマッチを有さないアンチセンス鎖（Ｍｉｓ０）を比較として設計した。図１４Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したＭｉｓ＿０～３の遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（結果を図１４Ｂに示す）。
全ての設計したａｓｄＤＮＡは、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有する。結果は、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖が、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング活性を維持しながら少なくとも３つ（標的化領域の少なくとも１５％）のミスマッチを許容することができることを、さらに示唆する。ＡＳ内のある特定の位置における一部のミスマッチまたは複数のミスマッチは、ａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング活性を低下させる可能性がある。
（実施例１４）
ＳＳにミスマッチを有するａｓｄＤＮＡに関するＳＡＲ
図１５Ａは、さらなる一連のａｓｄＤＮＡの異なる構造設計を示す。これらのａｓｄＤＮＡでは、センス鎖を、アンチセンス鎖と二本鎖領域を形成したときに少なくとも１つのミスマッチを含むように設計し（Ｍｉｓ１～４、図１５Ａに示されている構造および配列）、ミスマッチを有さないセンス鎖（Ｍｉｓ０）を比較として設計した。図１５Ａでは、示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするように設計したＭｉｓ＿０～４の遺伝子サイレンシング活性をＨｅｐａＲＧ細胞において試験した（結果を図１５Ｂに示す）。
全ての設計したａｓｄＤＮＡは、非常に低い濃度（ピコモル濃度レベル）で極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を有する。結果は、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡのセンス鎖が、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡの極めて強力な遺伝子サイレンシング活性を維持しながら３つまたはそれより多く（標的化領域の少なくとも１５％）のミスマッチを許容することができることを、さらに示唆する。センス鎖内のミスマッチは、多くの場合、潜在的なオフターゲット効果を低下させるのに役立ち得る。
（実施例１５）
ａｓｄＤＮＡとｓｉＲＮＡとの比較
図１６Ａは、ＳＴＡＴ３遺伝子を標的化するための本発明の例示的なａｓｄＤＮＡおよびその対応するｓｉＲＮＡの配列を示す。図１６Ａでは、ａｓｄＤＮＡの示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表し、ｓｉＲＮＡの示されている配列中の大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」は、ＲＮＡ残基を表す。対応するｓｉＲＮＡは、ａｓｄＤＮＡのアンチセンス鎖と同じ核酸塩基配列を有する。ＳＴＡＴ３を標的とするように設計したａｓｄＤＮＡおよび対応するｓｉＲＮＡのＩＣ５０およびＩＣ９０によって表される遺伝子サイレンシング効力の比較を図１６Ａに示す。図１６Ｂは、ＨｅｐａＲＧ細胞において１００ｐＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭで試験したａｓｄＤＮＡおよび対応するｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性の比較を示す。
結果は、本発明で提供されるａｓｄＤＮＡが、ｓｉＲＮＡと比べて他の上述の様々な薬学的利点の他に、対応するｓｉＲＮＡと比べて遺伝子サイレンシング活性の改善された効力および有効性も有し得ることを示唆する。
（実施例１６）
ＡＰＯＣＩＩＩを標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力
ＡＰＯＣＩＩＩを標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング効力を試験した。図１７は、ＡＰＯＣＩＩＩを標的とする試験したａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの構造、配列、ならびにＩＣ５０およびＩＣ９０の値を示す。図１７では、ａｓｄＤＮＡの示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
（実施例１７）
ＡＰＯＢを標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力
設計し、使用した、ＡＰＯＢを標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよびその対応するＡＳＯの構造および配列を、図１８に示す。図１８では、ａｓｄＤＮＡの示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
ＡＰＯＢを標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング効力を試験した。図１８は、ＡＰＯＢを標的とするａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの構造、ならびにＩＣ５０およびＩＣ９０の値を示す。
（実施例１８）
ＴＴＲを標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力
設計し、使用した、ＴＴＲを標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよびその対応するＡＳＯの構造および配列を図１９に示す。図１９では、ａｓｄＤＮＡの示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
ＴＴＲを標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング効力を試験した。図１９は、ＴＴＲを標的とするａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの構造、ならびにＩＣ５０およびＩＣ９０の値を示す。
（実施例１９）
ＳＴＡＴ３を標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力
設計し、使用した、ＳＴＡＴ３を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよびその対応するＡＳＯの構造および配列を、図２０に示す。図２０では、ａｓｄＤＮＡの示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、下線付きの大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図９Ｂにおけるものと同じものを表す。
ＳＴＡＴ３を標的とする例示的なａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの遺伝子サイレンシング効力を試験した。図２０は、ＳＴＡＴ３を標的とするａｓｄＤＮＡおよび対応するＡＳＯの構造、ならびにＩＣ５０およびＩＣ９０の値を示す。
（実施例２０）
β－カテニンを標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力
設計し、使用した、β－カテニンを標的とするａｓｄＤＮＡの構造および配列を図２１に列挙する。β－カテニンを標的とするａｓｄＤＮＡの遺伝子サイレンシング効力を、ＤＬＤ１細胞において１００ｐＭ、２００ｐＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭおよび３０ｎＭで試験した。結果を図２１に示す。図２１では、ａｓｄＤＮＡの示されている配列中の全ての小文字「ａ、ｃ、ｇ、ｔ」、大文字「Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ」および「＊」は、図２Ｂにおけるものと同じものを表す。
実施例１～２０におけるこれらの結果は、本発明に基づいて設計したａｓｄＤＮＡが、異なる遺伝子を標的とする高い遺伝子サイレンシング効力を達成することができることを、強く示唆する。
均等物
代表例は、本発明の例証に役立つことを目的としたものであり、本発明の範囲を限定することを目的としたものではなく、それらを、本発明の範囲を限定すると解釈するべきでない。実際、本明細書で示したおよび本明細書に記載したものに加えて、本発明の様々な変更形態およびそれらの多くのさらなる実施形態が、本明細書に含まれる例ならびに科学および特許文献への言及を含む本書の完全な内容から、当業者には明らかになる。例は、その様々な実施形態およびそれらの均等物での本発明の実施に適し得る重要な追加情報、例示およびガイダンスを含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての専門および科学用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料も本開示の実施または試験の際に使用することができるが、好ましい方法および材料を今は記載する。本明細書で述べる方法は、開示する特定の順序に加えて、理論的に可能である任意の順序で行うことができる。
参照による組込み
他の文献、例えば、特許、特許出願、特許公報、定期刊行物、本、学術論文、ウェブコンテンツへの言及およびそれらの引用を、本開示で行った。全てのそのような文献は、あらゆる目的でこれによりそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に参照により組み込まれると述べる、しかし本明細書で明確に示す既存の定義、記載または他の開示材料と矛盾する、いずれの材料またはその部分も、組み込まれる材料と本開示材料との間に矛盾が生じない範囲でのみ、組み込まれる。矛盾がある場合は、好ましい開示としての本開示のほうを優先して矛盾を解消されたい。
参考文献

Claims (60)

  1. 第一鎖および第二鎖を含む非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）分子であって、
    前記第二鎖が、前記第一鎖より短く、
    前記第一鎖が、少なくとも１つの標的化領域による標的となるＲＮＡの標的となるセグメントに実質的に相補的であり、
    前記第二鎖が、前記第一鎖に実質的に相補的であり、前記第一鎖と少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、
    前記ａｓｄＤＮＡ分子が、少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマーを含む少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ）を含む、
    ａｓｄＤＮＡ分子。
  2. 前記第一鎖が、少なくとも１つのＩＳＲを含む、請求項１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  3. 前記第二鎖が、少なくとも１つのＩＳＲを含む、請求項１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  4. 前記第一鎖が少なくとも１つのＩＳＲを含み、前記第二鎖も少なくとも１つのＩＳＲを含む、請求項１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  5. 前記少なくとも１つのＩＳＲが、前記第一鎖の少なくとも１つの標的化領域内に配置されている、請求項２または４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  6. 前記第一鎖内の全てのＩＳＲのリボヌクレオチドモノマーの総数が、少なくとも２である、請求項５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  7. 前記少なくとも１つのＩＳＲが、前記第二鎖の少なくとも１つの二本鎖領域内に配置されている、請求項３または４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  8. 少なくとも２つまたはそれより多くのＩＳＲを含み、各ＩＳＲが、互いに独立して、１つのリボヌクレオチドモノマーからなるか、または連続する少なくとも２つ、３つ、４つもしくは５つのリボヌクレオチドモノマーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  9. 前記少なくとも１つのＩＳＲが、連続する少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのリボヌクレオチドモノマーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  10. 前記第一鎖が、前記標的となるＲＮＡの前記標的となるセグメントに少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％相補的または完全に相補的である、請求項１から９のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  11. 前記第一鎖が、前記標的となるＲＮＡにハイブリダイズしたときに最大でも１つ、２つまたは３つのミスマッチしか含まない、請求項１から１０のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  12. 前記第一鎖が、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０ヌクレオチドモノマーからなる群より選択される長さを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  13. 前記第一鎖が、
    ａ）８～５０ヌクレオチドモノマー、
    ｂ）１０～３６ヌクレオチドモノマー、
    ｃ）１２～３６ヌクレオチドモノマー、および
    ｄ）１２～２５ヌクレオチドモノマー
    からなる群より選択される長さを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  14. 前記第二鎖が、前記第一鎖の少なくとも１つの領域に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相補的または完全に相補的な実質的に相補的な領域を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  15. 前記第二鎖が、前記第一鎖の前記少なくとも１つの領域に対して相補的な二重鎖の形成時に１つ、２つ、３つまたはそれより多くのミスマッチを含む、請求項１４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  16. センス鎖内のミスマッチモノマーが、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴからなる群より選択される核酸塩基を有する、請求項１５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  17. 前記第二鎖が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群より選択されるモノマー数だけ、前記第一鎖より短い、請求項１４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  18. 前記第二鎖が、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６ヌクレオチドモノマーからなる群より選択される長さを有する、請求項１４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  19. 前記第二鎖が、前記第一鎖と二重鎖を形成することができることを条件に、前記第一鎖のものより少ない任意のヌクレオチドモノマー数の長さを有する、請求項１４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  20. 前記第二鎖の第１の塩基および最後の塩基の少なくとも一方が、前記第一鎖内の核酸塩基に相補的である、請求項１４に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  21. 前記第二鎖が、
    ａ）６～３６ヌクレオチドモノマー、
    ｂ）６～３２ヌクレオチドモノマー、
    ｃ）８～２５ヌクレオチドモノマーおよび
    ｄ）８～２３ヌクレオチドモノマー
    からなる群より選択される長さを有する、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  22. 前記第一鎖の２つの末端が、
    ａ）３’－オーバーハングおよび５’－オーバーハング、
    ｂ）３’－オーバーハングおよび５’末端における平滑末端、
    ｃ）５’－オーバーハングおよび３’末端における平滑末端、
    ｄ）３’－オーバーハングおよび５’陥凹末端、ならびに
    ｅ）５’－オーバーハングおよび３’陥凹末端
    からなる群より選択される、請求項１から２１のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  23. 前記第一鎖の前記３’－オーバーハングが、
    ａ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドモノマー、
    ｂ）１～１５ヌクレオチドモノマー、
    ｃ）１～１０ヌクレオチドモノマー、
    ｄ）１～８ヌクレオチドモノマー、および
    ｅ）１～５ヌクレオチドモノマー
    からなる群より選択される長さを有する、請求項２２に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  24. 前記第一鎖の前記５’－オーバーハングが、
    ａ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドモノマー、
    ｂ）１～１５ヌクレオチドモノマー、
    ｃ）１～１０ヌクレオチドモノマー、
    ｄ）１～８ヌクレオチドモノマー、および
    ｅ）１～５ヌクレオチドモノマー
    からなる群より選択される長さを有する、請求項２２に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  25. 前記第一鎖が、１～１５ヌクレオチドモノマーの３’－オーバーハング、および１～１５ヌクレオチドモノマーの５’－オーバーハングを有する、請求項２２に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  26. 前記第一鎖が、１～２８ヌクレオチドモノマーの３’－オーバーハング、および５’平滑末端または５’陥凹末端を有する、請求項２２に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  27. 前記第一鎖が、１～２８ヌクレオチドモノマーの５’－オーバーハング、および３’平滑末端または３’陥凹末端を有する、請求項２２に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  28. 少なくとも１つのヌクレオチドモノマーが、改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項１から２７のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  29. 前記改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、糖改変ヌクレオチド、骨格改変ヌクレオチド、および／または塩基改変ヌクレオチドである、請求項２８に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  30. 前記骨格改変ヌクレオチドが、ヌクレオシド間連結の改変を有する、請求項２９に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  31. 前記ヌクレオシド間連結が、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも一方を含むように改変されている、請求項３０に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  32. 改変された前記ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）基、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、およびホスホルアミデートからなる群より選択される、請求項３１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  33. 前記第一鎖および／または前記第二鎖が、少なくとも１つの改変ヌクレオシド間連結を含み、前記改変ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項２８に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  34. 前記第一鎖および／または前記第二鎖の各ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項３３に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  35. 前記改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、改変糖部分を含む、請求項２８に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  36. 前記改変糖部分の２’位が、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、およびＣＮからなる群より選択される基により置き換えられており、ここで、各Ｒは、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、請求項３５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  37. 前記改変糖部分の２’位が、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ１）－（ＣＨ２）２－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）からなる群より選択される基により置き換えられており、ここで、Ｒｌ、ＲｍおよびＲｎの各々は、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルである、請求項３５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  38. 前記改変糖部分が、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ３、２’－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆおよび２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基からなる群より選択される、請求項３５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  39. 前記改変糖部分が、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（ｃＥｔ）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’、ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ－（＝ＣＨ２）－２’からなる群より選択される二環式糖により置換されている、請求項３５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  40. 前記改変糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル改変糖（ＭＯＥ）、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’二環式糖（ＬＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノース（ＦＡＮＡ）、およびメチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２）二環式糖（ｃＥｔ）からなる群より選択される、請求項３５に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  41. 前記改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、改変核酸塩基を含む、請求項２８に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  42. 前記改変核酸塩基が、５－メチルシトシン（５－Ｍｅ－Ｃ）、イノシン塩基、トリチル化塩基、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、１－メチル－シュード－ウラシル、５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体；６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルならびに他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、ならびに７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンからなる群より選択される、請求項４１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  43. 前記改変核酸塩基が、５－メチルシトシンである、請求項４１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  44. 各シトシン塩基が、５－メチルシトシンである、請求項４１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  45. 細胞における遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用される、請求項１から４４のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  46. 標的ＲＮＡをサイレンシングさせる点で対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドより強力または効果的である、請求項１から４５のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  47. 細胞における遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用される、請求項１から４６のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  48. 前記細胞が、真核細胞である、請求項４７に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  49. 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４８に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  50. 前記標的となるＲＮＡが、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡのどちらかであり、そのようなＲＮＡが、疾患に関与するタンパク質をコードするか、または疾患に関与する生物学的経路の一部を制御する、請求項１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  51. 前記標的となるＲＮＡが、
    ａ）ヒトまたは動物の疾患または状態に関与する遺伝子のｍＲＮＡ、
    ｂ）病原性微生物の遺伝子のｍＲＮＡ、
    ｃ）ウイルスＲＮＡ、ならびに
    ｄ）自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫介在性障害、アレルギー性疾患、皮膚科疾患、悪性疾患、胃腸障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ様障害、神経障害、内分泌障害、および老化関連障害からなる群より選択される疾患または障害に関与するＲＮＡ
    からなる群より選択される、請求項１に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  52. 前記第一鎖および／または前記第二鎖が、リガンドまたは部分にコンジュゲートされている、請求項１から５１のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  53. 前記リガンドまたは部分が、ペプチド／タンパク質、抗体、ポリマー、多糖、脂質、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、親油性化合物または部分 オリゴヌクレオチド、コレステロール、ＧａｌＮＡｃおよびアプタマーからなる群より選択される、請求項５２に記載のａｓｄＤＮＡ分子。
  54. 活性薬剤としての請求項１から５３のいずれかに記載のａｓｄＤＮＡ分子と、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  55. 前記担体が、医薬担体、正電荷担体、脂質ナノ粒子、リポソーム、タンパク質担体、疎水性部分または分子、カチオン性部分または分子、ＧａｌＮＡｃ、多糖、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、コレステロール、脂質、親油性化合物または部分、およびリポイドからなる群より選択される、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. 疾患または状態を処置または予防するための方法であって、治療有効量の請求項１から５３のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子または請求項５４もしくは請求項５５のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
  57. 前記疾患または状態が、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫介在性障害、アレルギー性疾患、皮膚科疾患、悪性疾患、胃腸障害、肝障害、呼吸器障害、心血管障害、皮膚科障害、腎障害、リウマチ様障害、神経障害、精神障害、内分泌障害、および老化関連障害または疾患からなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ａｓｄＤＮＡ分子または医薬組成物が、静脈内注射（ｉｖ）、皮下注射（ｓｃ）、経口的に（ｐｏ）、筋肉内（ｉｍ）注射、経口投与、吸入、局所的、髄腔内、および他の局部的な投与からなる群より選択される経路によって投与される、請求項５７に記載の方法。
  59. 真核細胞における遺伝子発現または遺伝子機能をモジュレートするための方法であって、前記細胞を、有効量の請求項１から５３のいずれか一項に記載のａｓｄＤＮＡ分子または請求項５４もしくは５５のいずれかに記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
  60. ヌクレオチド、そのアナログ、および改変ヌクレオチドからなる群より選択される連結されたヌクレオチドモノマーを各々が含む第一鎖および第二鎖を含む、非対称短鎖二重鎖ＤＮＡ（ａｓｄＤＮＡ）分子であって、
    前記第一鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０モノマーからなる群より選択されるモノマー数だけ、前記第二鎖より長く、
    前記第一鎖が、少なくとも１つの標的化領域による標的となるＲＮＡの標的となるセグメントに実質的に相補的であり、前記第一鎖が、ホスホロチオエート連結、ホスホジエステル連結、またはホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結の混合物からなる群より選択される連結によって隣接モノマー間が連結されている１０～３６（範囲の終点両方を含む）のヌクレオシドモノマーからなり、
    前記第二鎖が、前記第一鎖に実質的に相補的であり、前記第一鎖と少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、前記第二鎖が、ホスホロチオエート連結、ホスホジエステル連結、またはホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結の混合物からなる群より選択される連結によって隣接モノマー間が連結されている８～３２（範囲の終点両方を含む）のヌクレオシドモノマーからなり、
    前記ａｓｄＤＮＡ分子が、デオキシリボヌクレオチド、そのアナログ、および改変デオキシリボヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドモノマーに連結された少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマー散在セグメント（ＩＳＲ）を含み、
    前記ａｓｄＤＮＡ分子における前記ＩＳＲが、リボヌクレオチド、そのアナログ、および改変リボヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つのリボヌクレオチドモノマーを含み、
    前記ａｓｄＤＮＡ分子が、細胞における標的遺伝子発現または機能をモジュレートするために使用され、
    前記ａｓｄＤＮＡ分子が、細胞において対応するＡＳＯより前記標的遺伝子の発現をサイレンシングさせる点で強力または効果的である、
    ａｓｄＤＮＡ分子。
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