JP2024519861A - てんかんを治療するための方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化することによって、てんかんを治療するためのアンチセンス療法を必要とする対象における側頭葉てんかん等のてんかんを治療するためのアンチセンス療法に関する方法及び組成物が開示される。特に、本開示は、ＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害し、過興奮性神経回路におけるてんかん型放電を阻害することができる阻害性ＲＮＡコンストラクトを提供する。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年４月２８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は「５１４６０－００７ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿４＿２８＿２２＿ＳＴ２５」であり、サイズは２９７，１２７バイトである。
開示の分野
本開示は、てんかんの分野におけるものである。特に、本開示は、例えば側頭葉てんかん等のてんかんを治療するための方法及び組成物に関する。
背景
世界的には、毎年推定５００万人がてんかん、発作を特徴とする神経障害、又は脳の異常な電気的活動に関連する感覚障害、意識喪失、若しくは痙攣の突然の再発エピソードと診断されている。てんかんの典型的な診断は、患者が２回以上の非誘発性発作を経験する場合に生じる。てんかんの原因には、遺伝子異常、以前の脳感染、出生前傷害、発達障害、及び脳卒中又は脳腫瘍等の他の神経学的問題が含まれるが、てんかんと診断された人の約５０％は、障害の発症の原因が知られていない。
側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は、成人における部分てんかんの最も一般的な形態である（てんかんの全ての形態の３０～４０％）。海馬がＴＬＥの病態生理学において重要な役割を果たすことは十分に確立されている。ヒト患者及びＴＬＥの動物モデルでは、ニューロン回路の異常な再編が起こる。ネットワーク再編（「反応可塑性」）の最良の例の１つは、海馬（Ｔａｕｃｋ ａｎｄ Ｎａｄｌｅｒ，１９８５；Ｒｅｐｒｅｓａ ｅｔ ａｌ．，１９８９ａ，１９８９ｂ；Ｓｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）の歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）上への新規な病態生理学的グルタミン酸作動性シナプスを確立する再発性苔状線維（ｒＭＦ）の発芽であり、再発性興奮性ループをもたらす。ｒＭＦシナプスは、異所性カイニン酸受容体（ＫＡＲ）を介して作動する（Ｅｐｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｒｔｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，２０１５）。ＫＡＲは、ＧｌｕＫ１－ＧｌｕＫ５サブユニットから組み立てられた四量体グルタミン酸受容体である。異種発現系では、ＧｌｕＫ１、ＧｌｕＫ２及びＧｌｕＫ３はホモマー受容体を形成し得るが、ＧｌｕＫ４及びＧｌｕＫ５はＧｌｕＫ１－３サブユニットと共にヘテロマー受容体を形成する。天然のＫＡＲは脳に広く分布しており、ＴＬＥに関与する重要な構造である海馬に高密度の受容体が見られる（Ｃａｒｔａ ｅｔ ａｌ，２０１６，ＥＪＮ）。本発明者らによる以前の研究は、発作間欠期スパイク及び発作性放電を含むてんかん活性が、ＧｌｕＫ２ ＫＡＲサブユニットを欠くマウスにおいて著しく低下することを確立した。更に、てんかん様活動は、異所性シナプスＫＡＲを遮断するＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５含有ＫＡＲの薬理学的小分子アンタゴニストの使用後に強く低下した（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。これらのデータは、ＤＧＣ中のｒＭＦで異所性に発現されるＫＡＲがＴＬＥの慢性発作において主要な役割を果たすという仮説を裏付けている。したがって、ＤＧＣで発現され、ＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５で構成される異常なＫＡＲは、ＴＬＥ等の薬物耐性てんかんの治療のための有望な標的であると考えられる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略が、多くの疾患標的に対して提案されている。ＲＮＡｉに基づく治療の適用の成功は限られている。ＲＮＡｉ治療薬は、反復投与の必要性及び製剤の課題等の複数の課題に直面している。しかしながら、難治性ＴＬＥの治療のために利用可能なＲＮＡｉベースの遺伝子療法は限られている。したがって、例えばＴＬＥ（例えば、治療に難治性のＴＬＥ）等の発作障害の治療のための新しい治療様式が緊急に必要とされている。
Ｔａｕｃｋ ＤＬ，Ｎａｄｌｅｒ Ｊ Ｖ（１９８５）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｉｎｉｃ ａｃｉｄ－ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５：１０１６－１０２２ Ｒｅｐｒｅｓａ Ａ，Ｌｅ Ｇａｌｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ Ｇ，Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ（１９８９ａ）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎｄｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ９９：３４５－３５０． Ｒｅｐｒｅｓａ Ａ，Ｒｏｂａｉｎ Ｏ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ Ｅ，Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ（１９８９ｂ）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ９９：３５１－３５５． Ｓｕｔｕｌａ Ｔ，Ｃａｓｃｉｎｏ Ｇ，Ｃａｖａｚｏｓ Ｊ，Ｐａｒａｄａ Ｉ，Ｒａｍｉｒｅｚ Ｌ（１９８９）Ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２６：３２１－３３０． Ｇａｂｒｉｅｌ Ｓ，Ｎｊｕｎｔｉｎｇ Ｍ，Ｐｏｍｐｅｒ ＪＫ，Ｍｅｒｓｃｈｈｅｍｋｅ Ｍ，Ｓａｎａｂｒｉａ ＥＲＧ，Ｅｉｌｅｒｓ Ａ，Ｋｉｖｉ Ａ，Ｚｅｌｌｅｒ Ｍ，Ｍｅｅｎｃｋｅ Ｈ－Ｊ，Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ Ｅ ａ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｕ，Ｌｅｈｍａｎｎ Ｔ－Ｎ（２００４）Ｓｔｉｍｕｌｕｓ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４：１０４１６－１０４３０． Ｐｅｒｅｔ Ａ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｌ ａ．，Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ ＤＷ，Ｇｏｒｌｅｗｉｃｚ Ａ，Ｅｐｓｚｔｅｉｎ Ｊ，Ｍｕｌｌｅ Ｃ，Ｃｒｅｐｅｌ Ｖ（２０１４）Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｂｅｒｒａｎｔ ＧｌｕＫ２－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｋａｉｎａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｌｏｂｅ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ８：３４７－３５４．
開示の概要
本開示は、てんかんの治療又は予防を必要とする対象（例えば、ヒト）における、例えば側頭葉てんかん（ＴＬＥ）等のてんかんを治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。開示される方法は、てんかんを有すると診断された、又はてんかんを発症するリスクがあると診断された対象に対する、治療有効量のポリヌクレオチド（例えば、阻害性ポリヌクレオチド）、例えば、グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２）遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はこれをコードする核酸ベクター（例えばレンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えばＡＡＶ９ベクター）の投与を含む。開示されるポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２転写物のＲＮＡ干渉媒介分解を増強するために、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質への改善されたローディングを示す。本開示はまた、開示される阻害性核酸（例えば、ＲＮＡ）剤及びそれをコードする核酸ベクターの１つ以上を含有する医薬組成物を特徴とする。
本開示は、部分的には、本明細書に記載される阻害性ポリヌクレオチドが有意により高いガイド対パッセンジャー鎖比（Ｇ／Ｐ比）を示すという驚くべき発見に基づいており、この発見は、阻害性ポリヌクレオチドのプロセシングの直接的で実質的な増加、並びにその後のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ及び得られたＧｌｕＫ２タンパク質の両方の発現レベルの低下の改善を支持する。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）治療薬の課題は、トランスフェクトされたポリヌクレオチドのプロセシング効率が低いことである。したがって、Ｇ／Ｐ比の改善は、成熟ｍｉＲＮＡ分子の産生の増加、及び付随して、投与されたｍｉＲＮＡ療法の所望の治療効果（複数可）の増加と相関し得る。
第１の態様では、本開示は、５’アーム（５ｐ）と、ループ領域と、３’アーム（３ｐ）とを含むステム－ループ領域を含むＧｒｉｋ２ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする単離された阻害性ポリヌクレオチド（複数可）を特徴とし、ステム－ループ領域はガイド鎖配列及びパッセンジャー鎖配列を含み、ガイド鎖配列及びパッセンジャー鎖配列は、（ａ）ガイド鎖の５’末端におけるウラシル（Ｕ）－アデニン（Ａ）塩基対又はＵ－グアニン（Ｇ）塩基対、（ｂ）パッセンジャー鎖の５’末端におけるシトシン（Ｃ）－Ｇ対、（ｃ）ガイド鎖配列の５’末端におけるＵ、（ｄ）ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列との間のシード領域におけるミスマッチ；及び／又は（ｅ）ポリヌクレオチドのステム領域とループ領域との接合部におけるＵ－Ｇゆらぎを置き換えるためのＣ－Ｇ塩基対又はＵ－Ａ塩基対を含む。
いくつかの実施形態では、ａ）及びｃ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質へのガイド鎖配列ローディングを改善する。いくつかの実施形態では、ｂ）は、ＲＩＳＣタンパク質へのパッセンジャー鎖配列のローディングを損なう。いくつかの実施形態では、ｄ）は、ＲＩＳＣローディング中のガイド鎖配列からのパッセンジャー鎖配列のデカップリングを促進する。いくつかの実施形態では、ｅ）は、ダイサーによるステム領域からのループ領域の切断を改善する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列のシード領域は、ガイド鎖配列のヌクレオチド２～７を含む。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１７のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号１７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３２のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１８のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号１８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３３のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１９のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号１９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３４のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３５のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２１のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２２のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３７のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３８のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号３９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３９のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２５のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号４０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４０のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号４０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号４１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４１のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号４１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２７のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号４２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４２のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号４２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２８のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号４３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４３のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号４３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２９のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号４４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４４のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号４４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号３０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号３０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号４５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号４５のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号４５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２２６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２３０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２３４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３４のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２２７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２３１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３１のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２３５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３５のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２２８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２３２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３２のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２３６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２２９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２３３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２３７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２３７のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２３７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２３８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２４２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４２のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２４６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２３９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２４３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２４７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４７のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２４０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２４４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４４のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２４８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４８のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号２４１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号２４５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４５のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号２４９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２４９のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表３に示す配列番号２４９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号４７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号６４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６４のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号６４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８１のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号４８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号６５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６５のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号６５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８２のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号４９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号６６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６６のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号６６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８３のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号６７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６７のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号６７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８４のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号６８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６８のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号６８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８５のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号６９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６９のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号６９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８７のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７１のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８８のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７２のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号８９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号８９のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号８９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９０のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７４のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９１のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７５のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９２のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号５９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７６のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９３のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号６０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７７のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９４のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号６１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７８のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９５のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号６２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号７９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号７９のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号７９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号９６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号９６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表５に示す配列番号９６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号９８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２２のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号９９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１１のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２３のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１００の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１２のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２４のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２５のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１４のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１５のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１５の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２７のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１６のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２８のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１７のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１２９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２９のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１８のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１３０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１３０のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１３０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１１９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１１９のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１１９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１３１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１３１のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１３１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１０８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１２０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１２０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１３２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１３２のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表７に示す配列番号１３２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１３４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１４０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４０のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１４６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４６のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４６の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１３５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１４１の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４１のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４１の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１４７の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４７のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４７の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１３６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１４２の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４２のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４２の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１４８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４８のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４８の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１３７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１４３の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４３のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４３の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１４９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４９のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４９の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号１３８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド鎖配列は、配列番号１４４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１４４のガイド鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１４４の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖配列は、配列番号１５０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１５０のパッセンジャー鎖は、１～７個（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド変化（例えば、置換、欠失、挿入又はミスマッチ）を含み、該変化（複数可）は、表９に示す配列番号１５０の太字のヌクレオチドのいずれも含まない。
いくつかの実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピン適合ｍｉＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチド～２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは２１ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３又は配列番号１７４のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３又は配列番号１７４の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、（本開示で更に論じるように）細胞内のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞中のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを少なくとも１０％、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％低下させる。いくつかの実施形態では、細胞は、海馬ニューロン（例えば、歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）又はグルタミン酸作動性錐体ニューロン）等のニューロンである。細胞がニューロンであるものを含む他の実施形態では、細胞はヒト細胞である。
別の態様では、本開示は、前述の態様及び実施形態のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。いくつかの実施形態では、ベクターは複製欠損である。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物、昆虫、細菌又はウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス、及びカナリア痘ウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ１０ベクターである。
別の態様において、本開示は、本開示の第１の態様のステム－ループ配列に対応するポリヌクレオチド、例えば、配列番号１～１５、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ領域をコードするか又はそれを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを特徴とする。いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ステム－ループ領域は、配列番号４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１３５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２６０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２６１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本開示は、配列番号４６～６２のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号９７～１０８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１３３～１３８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態では、ステム－ループ配列は、配列番号１３５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ステム－ループ配列は、配列番号１３５の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’隣接領域、ループ領域、及び３’隣接領域を含む。いくつかの実施形態では、５’隣接領域は、配列番号２１７、２２０、又は２２３のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’隣接領域は、配列番号２１８、２２１、又は２２４のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’隣接領域は、５’スペーサー配列及び５’隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、３’隣接領域は、３’スペーサー配列及び３’隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、ループ領域は、Ｅ－ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３配列であるマイクロＲＮＡループ配列を含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号２１９、２２２、又は２２５のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号２２２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号２２２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、シナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター又はカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、サイトメガロウイルスのエンハンサー（例えば、ＣＡＧ又はＣＢＡ）、Ｕ６、Ｈ１又は７ＳＫプロモーターを含有する構成的プロモーターを含む。
別の態様では、本開示は、５’から３’に、以下を含む発現カセットを提供する：（ａ）第１のプロモーター配列；（ｂ）配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド；（ｃ）任意に、第２のプロモーター配列；（ｄ）配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’から３’に、（ａ）第１プロモーター配列；（ｂ）配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド；（ｃ）任意に、第２のプロモーター配列；（ｄ）配列番号１３５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’から３’に、（ａ）第１プロモーター配列；（ｂ）配列番号４の核酸配列を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド；（ｃ）任意に、第２のプロモーター配列；（ｄ）配列番号１３５の核酸配列を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、若しくは２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチドは、ガイド配列と相補的又は実質的に相補的なパッセンジャー配列を含み、パッセンジャー配列はガイド配列に対して５’又は３’に位置する。いくつかの実施形態では、配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、若しくは２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチドは、ガイド配列に対して５’に位置する５’隣接領域を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、若しくは２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチドは、ガイド配列に対して３’に位置する３’隣接領域を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、若しくは２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチドは、ガイド配列とパッセンジャー配列との間に位置するループ領域を含み、ループ領域はマイクロＲＮＡループ配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び／又は任意に第２のプロモーターは、ｈＳｙｎプロモーター又はＣａＭＫＩＩプロモーターからなる群から選択される。第１及び／又は第２のプロモーターは、サイトメガロウイルスのエンハンサー（例えば、ＣＡＧ又はＣＢＡ）、Ｕ６、Ｈ１及び７ＳＫプロモーターを含有する構成的プロモーターから選択することもできる。
いくつかの実施形態では、５’隣接領域は、配列番号２１７、２２０、又は２２３のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’隣接領域は、配列番号２１８、２２１、又は２２４のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、Ｅ－ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３配列である。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号２１９、２２２、又は２２５のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号２２２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号２２２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、当該発現カセットの５’末端に５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び当該発現カセットの３’末端に３’－ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２の５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、配列番号２０８又は配列番号２０９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、配列番号２０８又は配列番号２０９の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、配列番号２０８の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、配列番号２１０、配列番号２１１、又は配列番号２１２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、配列番号２１０、配列番号２１１、又は配列番号２１２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、配列番号２１２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、エンハンサー配列を更に含む。一実施形態では、エンハンサー配列は、発現カセット又はベクター中のプロモーターの活性を増強するために、本明細書に開示される発現カセット又はベクター中に位置し得る（例えば、エンハンサー配列は、本明細書に記載の発現カセット又はベクター中のプロモーター配列の５’側に位置し得る）。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号２０７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号２０７の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、イントロン配列を更に含む。一実施形態では、イントロン配列は、阻害性ポリヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ（例えば、ｍｉＲＮＡ配列；例えば、イントロンを、プロモーターと阻害性ポリヌクレオチドの核酸配列との間に配置することができる）の発現を改善するために発現カセット又はベクター内に配置することができる。いくつかの実施形態では、イントロン配列は、本明細書に記載の２つ以上の阻害性ポリヌクレオチド配列（例えば、２つ以上のｍｉＲＮＡ配列）の間に位置する。いくつかの実施形態では、イントロン配列は、配列番号２０５又は配列番号２０６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、イントロン配列は、配列番号２０５又は配列番号２０６の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）のポリアデニル化シグナル配列（例えば、本明細書に開示される発現カセット又は発現ベクターの阻害性ポリヌクレオチドの核外輸送、翻訳及び安定性を改善するために）を更に含む。ポリアデニル化シグナル配列は、末端阻害剤ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に開示されるＡＳＯ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ配列等））の３’及び／又は３’ＩＴＲ配列の５’に位置し得る。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態では、ＲＢＧポリアデニル化シグナルは、配列番号２１３、配列番号２１４又は配列番号２１５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢＧポリアデニル化シグナルは、配列番号２１３、配列番号２１４又は配列番号２１５の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である。いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２１６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２１６の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、発現カセットの３’末端（例えば、ポリアデニル化配列と３’ＩＴＲ配列との間）に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、又は５）スタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、前述の態様及び実施形態のいずれかの発現カセットは、５’から３’に、以下を含む：（ａ）５’ＩＴＲ配列；（ｂ）任意に、エンハンサー配列；（ｃ）第１のプロモーター配列；（ｄ）任意に、イントロン配列；（ｅ）ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド；（ｆ）任意に、第２のプロモーター配列；（ｇ）任意に、ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド；（ｈ）ポリアデニル化シグナル配列、例えばＲＢＧポリアデニル化シグナル配列；（ｉ）１つ以上のスタッファー配列；及び（ｊ）３’ＩＴＲ。
いくつかの実施形態では、前述の態様及び実施形態の発現カセットは、配列番号２５２～２６１のいずれか１つの配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、前述の態様及び実施形態の発現カセットは、配列番号２５６及び２５８～２６１のいずれか１つの配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、前述の態様及び実施形態の発現カセットは、配列番号２６１の配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５６の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、前述の態様及び実施形態の発現カセットは、前述の態様及び実施形態のベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは複製欠損ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物、昆虫、細菌又はウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス、及びカナリア痘ウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ１０ベクターである。
別の態様では、本開示は、細胞におけるＧｒｉｋ２発現を阻害する方法であって、細胞を、前述の態様及び実施形態の少なくとも１つのポリヌクレオチド、前述の態様及び実施形態のベクター、又は前述の態様及び実施形態の発現カセットと接触させることを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、（本開示において更に論じられるように）細胞におけるＧｒｉｋ２の発現を阻害又は低下させる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中のＧｒｉｋ２のレベルを少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％低下させる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％低下させる。
いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はニューロン（例えば、ヒトニューロン）である。いくつかの実施形態では、ニューロンは海馬ニューロン（例えば、ヒト海馬ニューロン）である。いくつかの実施形態では、海馬ニューロンはＤＧＣ（例えば、ヒトＤＧＣ又は錐体ニューロン）である。いくつかの実施形態では、ＤＧＣは、再発性苔状線維軸索を含む。細胞はまた、Ｇｒｉｋ２を発現するｉＰＳＣ由来グルタミン酸作動性ニューロン等の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するニューロン細胞であり得る。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象の障害を治療又は改善する方法を提供し、この方法は、前述の態様及び実施形態の少なくとも１つのポリヌクレオチド、前述の態様及び実施形態のベクター、又は前述の態様及び実施形態の発現カセットを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、障害はてんかんである。いくつかの実施形態では、てんかんは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）、慢性てんかん、及び／又は難治性てんかんである。いくつかの実施形態では、てんかんはＴＬＥである。いくつかの実施形態では、ＴＬＥは、片側ＴＬＥ及び／又は両側ＴＬＥ等の外側ＴＬＥ（ｌＴＬＥ）である。いくつかの実施形態では、ＴＬＥは内側ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）である。
いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
別の態様では、本開示は、前述の態様及び実施形態のポリヌクレオチド、前述の態様及び実施形態のベクター、又は前述の態様及び実施形態の発現カセットと、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、前述の態様の医薬組成物と添付文書とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、添付文書は、前述の態様及び実施形態の方法における医薬組成物の使用説明書を含む。
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語及び語句の意味を以下に提供する。別段の記載がない限り、又は文脈から暗示的でない限り、以下の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の実施形態の説明を助けるために提供されており、特許請求される技術を限定することを意図するものではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな不一致がある場合、本明細書内で提供される定義が優先するものとする。
本出願では、文脈から明らかでない限り、（ｉ）「１つの（ａ）」という用語は「少なくとも１つ」を意味すると理解され得る。（ｉｉ）「又は」という用語は、「及び／又は」を意味すると理解され得る。（ｉｉｉ）「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、それ自体で提示されるか、１つ以上の追加の構成要素又はステップと共に提示されるかにかかわらず、項目化された構成要素又はステップを包含すると理解され得る。
「約」という用語は、列挙された値の±１０％である量を指し、列挙された値の±５％又は列挙された値の±２％であり得る。
「３’非翻訳領域」及び「３’ＵＴＲ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の終止コドンに対する領域３’を指す（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）。３’ＵＴＲはタンパク質に翻訳されないが、ｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化、局在化、安定化、及び／又は翻訳効率に重要な調節配列を含む。３’ＵＴＲ中の調節配列は、エンハンサー、サイレンサー、ＡＵリッチエレメント、ポリＡテール、ターミネーター及びマイクロＲＮＡ認識配列を含み得る。「３’非翻訳領域」及び「３’ＵＴＲ」という用語はまた、ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子の対応する領域を指し得る。
「５’非翻訳領域」及び「５’ＵＴＲ」という用語は、開始コドンに対して５’であるｍＲＮＡ分子（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）の領域を指す。この領域は翻訳開始の調節に重要である。５’ＵＴＲは、完全に非翻訳であり得るか、又はいくつかの生物においてその領域の一部が翻訳され得る。転写開始部位は、５’ＵＴＲの開始を示し、開始コドンの１つ前のヌクレオチドを終了させる。真核生物では、５’ＵＴＲは、開始コドンを含むコザックコンセンサス配列を含む。５’ＵＴＲは、翻訳の調節に重要な上流オープンリーディングフレームとしても知られるシス作用性調節エレメントを含み得る。この領域はまた、上流ＡＵＧコドン及び終止コドンを有し得る。その高いＧＣ含有量を考慮すると、５’ＵＴＲは、翻訳の調節において役割を果たすヘアピンループ等の二次構造を形成し得る。「投与」という用語は、任意の有効な経路によって治療剤（例えば、本明細書に開示されるような、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害する阻害性ポリヌクレオチド又はそれをコードするベクター）を対象に提供又は与えることを指す。例示的な投与経路は、本明細書及び以下に記載される（例えば、脳室内注射、髄腔内注射、実質内注射、静脈内注射、及び定位注射）。
「ＡＡＶベクター」又は「アデノ随伴ウイルスベクター」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含むがこれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを指すＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の全部又は一部が欠失しているが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持している１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子を有することができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングを促進する。したがって、ＡＡＶベクターは、本明細書では、ウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる配列を少なくとも含むと定義される。ＩＴＲは、野生型ポリヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的救済、複製及びパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変化し得る。ＡＡＶ発現ベクターは、転写の方向に作動可能に連結された構成要素として、転写開始領域、目的のＤＮＡ（例えば、本開示の阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチド）及び転写終結領域を含む制御エレメントを少なくとも提供する既知の技術を使用して構築される。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」及び「ＡＡＶ ＩＴＲ」という用語は、ＤＮＡ複製起点として及びウイルスのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に隣接する当技術分野で認識されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と共に、隣接する２つのＩＴＲの間に介在するポリヌクレオチド配列の哺乳動物ゲノムへの効率的な切除及び組込みを提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のポリヌクレオチド配列は公知である。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変化し得る野生型ポリヌクレオチド配列を必ずしも含まない。更に、ＡＡＶ ＩＴＲは、とりわけ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクター中の選択されたポリヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されたように機能する限り、例えば、宿主細胞ゲノム又はベクターからの目的の配列の切除及びレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にする限り、同一である必要はなく、又は同じＡＡＶ血清型又は単離体に由来する必要はない。更に、ＡＡＶ ＩＴＲは、とりわけ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」及び「ＡＳＯ」という用語は、標的ｍＲＮＡ分子（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）と相補的塩基対合によってハイブリダイズし、ｍＲＮＡの不安定化及び分解、又は翻訳の阻害によってその発現を阻害することができる阻害性ポリヌクレオチドを指す。
「ｃＤＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ配列（すなわち、チミジンで置換されたウリジンを有する）のＤＮＡ等価物である核酸配列を指す。一般に、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡという用語は、ウリジンがチミジンとして読み取られることを除いて、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と同じであることを当業者は理解するであろうので、特定の遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）に関して交換可能に使用され得る。更に、本明細書に開示されるアンチセンスコンストラクトをコードするＤＮＡ配列又はそれによってコードされるＲＮＡ転写物が参照される場合、文脈によって特に示されない限り、「ＤＮＡ」及び「ＲＮＡ」という用語は、アンチセンス配列を指すために交換可能に使用され得る。更に、本明細書に開示される特定のＤＮＡ配列（例えば、Ｇｒｉｋ２アンチセンス配列をコードするもの）はＲＮＡヌクレオチドを含み得、その場合、配列は全体として「ＤＮＡ配列」又は「ＲＮＡ配列」と呼ばれる場合がある。
「コード配列」という用語は、タンパク質又はその一部をコードするｍＲＮＡ分子の核酸配列に対応する。関連して、「非コード配列」は、タンパク質又はその一部をコードしないｍＲＮＡ分子の核酸配列に対応する。非コード配列の非限定的な例としては、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、ポリＡテール、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及び他のシス調節配列が挙げられる。
「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド又はヌクレオシド配列に関して第１のヌクレオチド又はヌクレオシド配列を記載するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、特定の条件下で第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、以下を含み得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０°Ｃ又は７０°Ｃで１２～１６時間、その後洗浄が続く（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。生物の内部で遭遇し得る生理学的に関連する状態等の他の状態が適用され得る。ハイブリダイズしたヌクレオチド又はヌクレオシドの最終用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適した条件のセットを決定する方法は、当技術分野で周知である。
本明細書で使用される場合、「相補的」配列はまた、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対及び／又は非天然及び代替ヌクレオチドから形成される塩基対を含むか、又はそれらから完全に形成され得る。そのような非ワトソン・クリック塩基対には、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン塩基対合が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載のポリヌクレオチドと標的配列との間の相補的配列は、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって、第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書では互いに「完全に相補的」と呼ぶことができる。第１の配列が本明細書の第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得るか、又はそれらは、それらの最終的な用途、例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ等のｍＲＮＡへの結合及びその発現の阻害に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大３０塩基対の二重鎖に対するハイブリダイゼーションの際に、１つ以上であるが一般には１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が目的のｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、目的のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
「相補性領域」という用語は、内因性遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２）の発現を妨げるように、遺伝子、一次転写産物、配列（例えば、標的配列）、又はプロセシングされたｍＲＮＡの全部又は一部に実質的に相補的な阻害性ポリヌクレオチドの領域を指す。相補性の領域が標的配列と完全に相補的でない場合、ミスマッチは分子の内部領域又は末端領域にあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、阻害性ポリヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端の５、４、３又は２ヌクレオチド以内にある。
「保存的アミノ酸置換」、「保存的置換、」及び「保存的変異」という用語は、極性、静電荷及び立体容積等の類似の物理化学的特性を示す１つ以上の異なるアミノ酸に対する１つ以上のアミノ酸の置換を指す。これらの特性は、下の表１中に、２０の天然アミノ酸のそれぞれについて要約されている。
この表から、保存的アミノ酸ファミリーには、（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ；（ｉｉ）Ｄ及びＥ；（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ及びＴ；（ｉｖ）Ｈ、Ｋ及びＲ；（ｖ）Ｎ及びＱ；並びに（ｖｉ）Ｆ、Ｙ及びＷが含まれることが理解される。したがって、保存的突然変異又は置換は、同じアミノ酸ファミリーのメンバーに対して１つのアミノ酸を置換するものである（例えば、Ｔｈｒに対するＳｅｒ又はＡｒｇに対するＬｙｓの置換）。
本明細書に開示される阻害性ポリヌクレオチド等の「細胞を阻害性ポリヌクレオチドと接触させる工程、」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。細胞を阻害性ポリヌクレオチドと接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を阻害性ポリヌクレオチドと接触させること、又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞を阻害性ポリヌクレオチドと接触させることを含む。細胞を阻害性ポリヌクレオチドと接触させることはまた、細胞を、阻害性ポリヌクレオチドをコードする核酸ベクター又はそれを含有する医薬組成物と接触させることを意味し得る。接触は、直接的又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、阻害性ポリヌクレオチドは、本方法を実施する個体によって細胞と物理的に接触させられてもよく、あるいは、阻害性ポリヌクレオチド剤は、その後に細胞と接触することを可能にするか又は引き起こす状況に置かれてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の接触は、例えば、細胞を阻害性ポリヌクレオチドとインキュベートすることによって行われ得る。細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させることは、例えば、阻害性ポリヌクレオチドを細胞が位置する組織内又はその近くに注射することによって、又は阻害性ポリヌクレオチド剤を別の領域、例えば血流若しくは皮下空間に注射することによって行うことができ、その結果、薬剤はその後、接触させる細胞が位置する組織に到達する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの接触方法の組み合わせも可能である。例えば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害性ポリヌクレオチドと接触させ、続いて対象に移植することもできる。
細胞と阻害性ポリヌクレオチドとの接触には、細胞への取り込み又は吸収を促進又は達成することによる「導入すること」又は「阻害性ポリヌクレオチドを細胞に送達すること」が含まれる。阻害性ポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸ベクターの吸収又は取り込みは、補助されない拡散又は活性な細胞プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって起こり得る。阻害性ポリヌクレオチドを細胞に導入することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏであり得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ導入のために、阻害性ポリヌクレオチドを組織部位に注射することができ、又は全身投与することができる。細胞へのＩｎ ｖｉｔｒｏ導入には、エレクトロポレーション及びリポフェクション等の当技術分野で公知の方法が含まれる。別の例では、阻害性ポリヌクレオチドは、阻害性ポリヌクレオチドをコードするウイルスベクター等による形質導入によって細胞に導入することができる。ウイルスベクターは、コードされた阻害性ポリヌクレオチドを発現するために細胞プロセシング（例えば、細胞インターナリゼーション、キャプシド排出、阻害性ポリヌクレオチドの転写、及びドローシャ及びダイサーによるプロセシング）を受け得る。更なるアプローチは、本明細書において以下に記載され、及び／又は当技術分野で公知である。
遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２）に関して「発現を破壊する、」、「の発現を阻害する」又は「の発現を減少させる」という用語は、機能的遺伝子産物（例えば、ＧｌｕＫ２タンパク質）の形成を予防又は減少させることを指す。遺伝子産物は、その通常の（野生型）機能を果たす場合、機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によってコードされる機能性タンパク質の発現を防止又は低減する。破壊された遺伝子は、例えば、本明細書に記載されるもの等の干渉ＲＮＡ分子（例えば、ＡＳＯ）によって破壊され得る。
本明細書に記載の組成物、ベクターコンストラクト又はウイルスベクターの「有効量、」「治療有効量、」及び「十分な量」という用語は、哺乳動物、例えばヒトを含む対象に投与した場合、臨床結果を含む有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。したがって、「有効量」又はその同義語は、それが適用されている状況に依存する。例えば、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）を治療する状況では、組成物、ベクターコンストラクト、又はウイルスベクターの投与なしで得られる応答と比較して、治療応答を達成するのに十分な組成物、ベクターコンストラクト、又はウイルスベクターの量である。そのような量に対応する本明細書に記載される所与の組成物の量は、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害の種類及びその重症度、対象（例えば、年齢、性別、体重）のアイデンティティ、治療される宿主、及び／又はてんかんの場合、てんかん焦点の大きさ（例えば、脳体積）等の様々な要因に応じて変化するが、それでも当技術分野で周知の方法に従って決定することができる。また、本明細書で使用される場合、本開示の組成物、ベクターコンストラクト、又はウイルスベクターの「治療有効量」は、対照と比較して対象において有益な又は所望の結果をもたらす量である。本明細書で定義されるように、本開示の組成物、ベクターコンストラクト、ウイルスベクター、又は細胞の治療有効量は、当技術分野で公知の方法によって容易に決定することができる。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。
「てんかん」という用語は、再発性てんかん発作を臨床的に呈する１つ以上の神経障害を指す。てんかんは、国際抗てんかん連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｇｕｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）の分類及び用語（ＩＬＡＥ；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に従って、電気臨床症候群に従って分類することができる。これらの症候群は、発症時の年齢、特有のコンスタレーション（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）（外科的症候群）、及び構造的代謝的原因、例えば以下により分類される：（Ａ）発症年齢：（ｉ）新生児期には、良性家族性新生児てんかん（ＢＦＮＥ）、早期ミオクローヌス脳症（ＥＭＥ）、大田原症候群が含まれる；（ｉｉ）乳児期には、遊走性焦点発作を伴う乳児てんかん、ウエスト症候群、乳児ミオクローヌスてんかん（ＭＥＩ）、良性乳児てんかん、良性家族性乳児てんかん、ドラベ症候群、非進行性障害におけるミオクローヌス脳症が含まれる；（ｉｉｉ）小児期には、熱性痙攣プラス（ＦＳ＋）、パナイオトプロス症候群、ミオクロニー脱力発作（以前は静的）を伴うてんかん、中心側頭スパイクを伴う良性てんかん（ＢＥＣＴＳ）、常染色体優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）、遅発性小児後頭てんかん（ガストー型）、ミオクロニー欠神発作を伴うてんかん、レノックス・ガストー症候群、睡眠時連続スパイク・アンド・ウェーブを伴うてんかん性脳症（ＣＳＷＳ）、ランダウ・クレフナー症候群（ＬＫＳ）、小児欠神てんかん（ＣＡＥ）が含まれる；（ｉｖ）青年期～成人期には、若年性欠神てんかん（ＪＡＥ）、若年性ミオクロニーてんかん（ＪＭＥ）、全身性強直間代発作のみを伴うてんかん、進行性ミオクローヌスてんかん（ＰＭＥ）、聴覚的特徴を伴う常染色体優性てんかん（ＡＤＥＡＦ）、その他の家族性側頭葉てんかんが含まれる；（ｖ）様々な年齢での発症には、様々な焦点（小児から成人まで）を伴う家族性焦点性てんかん、反射性てんかんが含まれる；（Ｂ）特有のコンスタレーション（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）（外科的症候群）には、内側側頭葉てんかん（ＭＴＬＥ）、ラスムッセン症候群、視床下部過誤腫を伴う弾性発作、片麻痺－片麻痺－てんかんが含まれる；（Ｃ）構造的代謝原因に起因し組織化されるてんかんには、皮質発達の奇形（片側巨脳症、異所形成等。）、神経皮膚症候群（結節性硬化症複合体及びスタージ－ウェーバー）、腫瘍、感染、外傷、血管腫、周産期傷害及び脳卒中が含まれる。「難治性てんかん」という用語は、薬学的治療に抵抗性のてんかんを指し、すなわち、現在の薬学的治療は、患者の疾患の効果的な治療を可能にしない（例えば、Ｄａｒｉｏ Ｊ．Ｅｎｇｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照）。
「エクソン」という用語は、遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）のコード領域内の領域を指し、そのヌクレオチド配列が対応するタンパク質のアミノ酸配列を決定する。「エクソン」という用語はまた、遺伝子から転写されたＲＮＡの対応する領域を指す。エクソンはプレｍＲＮＡに転写され、遺伝子の選択的スプライシングに応じて成熟ｍＲＮＡに含まれ得る。プロセシング後の成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンはタンパク質に翻訳される。エクソンの配列は、タンパク質のアミノ酸組成を決定する。あるいは、成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンは非コードであり得る（例えば、タンパク質に翻訳されないエクソン）。
「発現」という用語は、遺伝子又は核酸の発現に関連して使用される場合、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ又は任意の他の種類のＲＮＡ）又はｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化及び編集等のプロセスによって修飾されるｍＲＮＡ、並びに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリストイル化及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質（例えば、ＧｌｕＫ２）も含まれる。
「発現」という用語は、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の作製（例えば、転写によって）；（２）ＲＮＡ転写物（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端処理によって、）のプロセシング；（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳；（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。対象における目的の遺伝子の発現は、例えば、対象から得られた試料中の対応するタンパク質（例えば、本明細書に記載されるか又は当技術分野で知られているＲＮＡ検出手順、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及びＲＮＡ配列技術を使用して評価される場合）をコードするｍＲＮＡの量若しくは濃度の減少若しくは増加、対応するタンパク質（例えば、とりわけ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の本明細書に記載される又は当技術分野で公知のタンパク質検出方法を使用して評価される場合）の量若しくは濃度の減少若しくは増加、及び／又は対応するタンパク質（例えば、イオンチャネルの場合、本明細書に記載の電気生理学的方法又は当技術分野で公知の電気生理学的方法を使用して評価される場合）の活性の減少若しくは増加を検出することによって明らかにすることができる。
「ＧｌｕＲ６」、「ＧＲＩＫ２」、「ＭＲＴ６」、「ＥＡＡ４」又は「ＧｌｕＫ６」としても公知の「ＧｌｕＫ２」という用語は、現在使用されているＩＵＰＨＡＲ命名法（Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．，Ｓｐｅｄｄｉｎｇ，Ｍ．，２００９．Ａ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄ－ｇａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６，２－５）で命名されているグルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸型サブユニット２タンパク質を指す。「ＧｌｕＫ２含有ＫＡＲ」、「ＧｌｕＫ２受容体」、「ＧｌｕＫ２タンパク質」及び「ＧｌｕＫ２サブユニット」という用語は、全体を通して互換的に使用され得、一般に、Ｇｒｉｋ２遺伝子によってコードされるか又は発現されるタンパク質を指す。
「ガイド鎖」及び「ガイド配列」という用語は、ステム－ループ構造の５’又は３’ステム－ループアームのいずれかに位置するステム－ループＲＮＡ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）の成分を指し、ガイド鎖／配列は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害することができるＧｒｉｋ２ｍＲＮＡアンチセンス配列（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つ、又は配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）を含む。ガイド鎖／配列はまた、例えばスペーサー又はリンカー配列等の追加の配列を含み得る。ガイド配列は、ステム－ループＲＮＡ構造のパッセンジャー鎖／配列に対して相補的又は実質的に相補的（例えば、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個以下のミスマッチを有する）であり得る。
「イオノトロピック型グルタミン酸受容体」という用語は、ＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸）、ＡＭＰＡ（α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸）及びカイニン酸受容体（ＫＡＲ）クラスのメンバーを含む。機能性ＫＡＲは、ＧｌｕＫ１、ＧｌｕＫ２、ＧｌｕＫ３、ＧｌｕＫ４及びＧｌｕＫ５サブユニットと命名された５つのサブユニットのホモマー又はヘテロマーの組み合わせから四量体アセンブリに組み立てることができる（Ｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。本開示の標的は、いくつかの例では、ＧｌｕＫ２及びＧｌｕＫ５で構成されるＫＡＲ複合体である。ＧｌｕＫ５サブユニットが単独では機能的ホモマーチャネルを形成しないという観察を考慮すると、Ｇｒｉｋ２遺伝子の発現を阻害することは、ＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５カイニン酸受容体機能を無効にするのに十分である。
「発現阻害剤」は、遺伝子、例えばＧｒｉｋ２遺伝子の発現を阻害又は減少させる生物学的効果を有する薬剤（例えば、本開示の阻害性ＲＮＡ剤）を指す。遺伝子、例えばＧｒｉｋ２遺伝子の発現を阻害すると、典型的には、標的細胞又は組織における遺伝子産物（タンパク質、例えばＧｌｕＫ２タンパク質）の減少又は消滅さえももたらすが、様々なレベルの阻害が達成され得る。発現の阻害又は低下は、典型的にはノックダウンと呼ばれる。
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む単離された分子を指す。そのような共有結合したヌクレオチドは、核酸分子とも呼ばれ得る。一般に、「単離された」ポリヌクレオチドは、それが得られる核酸配列に関して人工の、化学的に合成された、精製された、及び／又は異種のポリヌクレオチドを指す。
「マイクロＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ翻訳を調節し、したがって標的タンパク質の存在量に影響を及ぼす非コードＲＮＡの短い（例えば、典型的には約２２ヌクレオチド）配列を指す。いくつかのマイクロＲＮＡは単一のモノシストロニック遺伝子から転写されるが、他のマイクロＲＮＡはポリシストロニック遺伝子クラスターの一部として転写される。マイクロＲＮＡの構造は、５’及び３’隣接配列、ステム配列及びループ配列を含むヘアピン配列を含み得る。細胞内でのプロセシング中、未成熟マイクロＲＮＡはドローシャによって切断され、これは５’及び３’隣接配列を切断する。続いて、マイクロＲＮＡ分子は核から細胞質に転位し、そこでダイサーによるループ領域の切断を受ける。マイクロＲＮＡの生物学的作用は、ｍＲＮＡ分子の領域、典型的には３’非翻訳領域への結合を介して翻訳調節のレベルで発揮され、ｍＲＮＡの切断、分解、不安定化、及び／又はあまり効率的でない翻訳をもたらす。マイクロＲＮＡのその標的への結合は、一般に、マイクロＲＮＡのヘアピン配列内の短い（例えば、６～８ヌクレオチド）「シード領域／配列」によって媒介される。本開示を通して、ｓｉＲＮＡという用語は、ｍｉＲＮＡがその等価なｓｉＲＮＡとして標的（例えば、シード領域内）と相同性を有する同じ塩基を包含するように、その等価なｍｉＲＮＡを含み得る。本明細書に記載されるように、マイクロＲＮＡは、１つ以上の異種核酸配列を有するマイクロＲＮＡ等の天然に存在しないマイクロＲＮＡであり得る。
「ヌクレオチド」という用語は、修飾又は天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとして定義される。ヌクレオチドには、典型的には、チミジン、シチジン、グアノシン、アデノシン及びウリジンを含むプリン及びピリミジンが含まれる。本明細書で使用される場合、「阻害性ポリヌクレオチド」という用語は、上で定義されたヌクレオチド又は本明細書に開示される修飾ヌクレオチドのオリゴマーとして定義される。「阻害性ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖であり得る、３’－５’又は５’－３’に配向した核酸配列を指す。本開示の文脈で使用される阻害性ポリヌクレオチドは、特にＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。この用語はまた、例えば、（ｉ）修飾された骨格構造、例えば、天然のオリゴ－及びポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、並びに（ｉｉ）任意に、修飾された糖部分、例えば、リボース又はデオキシリボース部分ではなくモルホリノ部分を有する阻害性ポリヌクレオチドを指す「阻害性ポリヌクレオチド類縁体」を含み得る。阻害性ポリヌクレオチド類縁体は、ワトソン・クリック型塩基対合によって標準的なポリヌクレオチド塩基に水素結合することができる塩基を支持し、類縁体骨格は、阻害性ポリヌクレオチド類縁体分子と標準的なポリヌクレオチド中の塩基（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）との間の配列特異的様式でのそのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。特に、類縁体は、実質的に非荷電のリン含有骨格を有するものである。阻害性ポリヌクレオチド類縁体中の実質的に非荷電のリン含有骨格は、サブユニット結合の大部分、例えば５０～１００％、典型的にはその結合の少なくとも６０％～１００％又は７５％又は８０％が非荷電であり、単一のリン原子を含有する骨格である。更に、「阻害性ポリヌクレオチド」という用語は、転写のためのその通常の向きに対して反転しており、したがって宿主細胞内で発現される標的遺伝子ｍＲＮＡ分子に相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ配列に対応する阻害性ポリヌクレオチド配列を含むことができる。アンチセンスガイド鎖は、標的遺伝子の発現を妨害することができる限り、いくつかの異なる方法で構築され得る。例えば、アンチセンスガイド鎖は、標的遺伝子のコード領域（又はその一部）を、その相補体（例えば、アンチセンス遺伝子及びセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡは相補的であり得る）の転写を可能にする転写のためのその通常の配向に対して逆相補することによって構築することができる。阻害性ポリヌクレオチドは、標的遺伝子と同じイントロン又はエクソンパターンを有する必要はなく、標的遺伝子の非コードセグメントは、ＡＳＯ等のコードセグメントと同様に、標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を達成するのに等しく有効であり得る。いくつかの場合、阻害性ＲＮＡは標的遺伝子と同じエクソンパターンを有する。
阻害性ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、阻害性ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの少なくとも１つの領域に完全に又は実質的に相補的である）への標的化及びハイブリダイゼーションを可能にする任意の長さであり得、約１０～５０塩基対長、例えば、約１５～５０塩基対長又は約１８～５０塩基対長の範囲であり得、例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０塩基対長であり得、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２塩基対の長さであり得る。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さも本開示の一部であると考えられる。
「パッセンジャー鎖」及び「パッセンジャー配列」という用語は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンス配列（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つ、又は配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）と相補的又は実質的に相補的な配列（例えば、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のミスマッチを有する）を含む、ステム－ループ構造の５’又は３ステム－ループアームのいずれかに配置されたステム－ループＲＮＡ構造の成分（例えば、ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）を指す。パッセンジャー鎖／配列は、例えばスペーサー又はリンカー配列等の追加の配列も含み得る。パッセンジャー配列は、ステム－ループＲＮＡ構造のガイド鎖／配列に相補的又は実質的に相補的であり得る。
「プラスミド」という用語は、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、ベクターの一種であり、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子である。特定のプラスミドは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌プラスミド、及びエピソーム哺乳動物プラスミド）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。特定のプラスミドは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、タンパク質、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡをコードし、更に１つ以上の調節配列（例えば、とりわけ、プロモーター、エンハンサー、イントロン、終結配列）を含むポリヌクレオチドを指す。
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによって結合されるＤＮＡ上の認識部位を指す。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの転写を駆動する。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した例示的なプロモーターは、例えばＳａｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：４２４（２００７）に記載されており、その開示は、核酸調節エレメントに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。更に、「プロモーター」という用語は、生物系では天然に存在しない調節ＤＮＡ配列である合成プロモーターを指し得る。合成プロモーターは、天然には存在しないポリヌクレオチド配列と組み合わされた天然に存在するプロモーターの一部を含み、様々なポリヌクレオチド、ベクター、及び標的細胞型を使用して組換えＤＮＡを発現するように最適化することができる。
参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列中の核酸又はアミノ酸と同一である候補配列中の核酸又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。核酸又はアミノ酸配列同一性のパーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野で周知の様々な方法で達成することができる。十分に認識された従来の方法を使用して、比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。例えば、パーセント配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成され得る。例示として、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂ（あるいは、所与の核酸又はアミノ酸配列、Ａは、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂと、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂと、又は所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂに対して一定のパーセント配列同一性を有すると言い換えることができる）に対する、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂとの、又は所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与の核酸又はアミノ酸配列Ａのパーセント配列同一性は、以下のように計算される：
１００に（分数Ｘ／Ｙ）を乗算
（式中、Ｘは、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一のマッチとしてスコア化されたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂ中の核酸の総数である）。核酸又はアミノ酸配列Ａの長さが核酸又はアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ａ対Ｂのパーセント配列同一性は、Ｂ対Ａのパーセント配列同一性に等しくないことが理解されよう。候補配列と参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との間のパーセント配列同一性にかかわらず、候補配列は、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の機能（例えば、本明細書で定義されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベル又は本明細書で定義されるＧｌｕＫ２タンパク質の発現レベルを低下させる能力）の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％を保持する。
「薬学的に許容され得る」という用語は、合理的な利益／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応及び他の問題となる合併症を伴わない、哺乳動物（例えば、ヒト）等の対象の組織との接触に適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容され得る賦形剤と共に製剤化された本明細書に記載の化合物（例えば、阻害性核酸分子（例えば、ＲＮＡ）又はそれを含むベクター）を含有する組成物を表し、場合によっては、哺乳動物の疾患を治療するための治療レジメンの一部として政府規制機関の承認を得て製造又は販売され得る。医薬組成物は、例えば、単位剤形（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ゲルキャップ、又はシロップ）での経口投与、局所投与（例えば、クリーム、ゲル、ローション、又は軟膏として）、静脈内投与（例えば、粒子状塞栓を含まず、静脈内使用に適した溶媒系中の滅菌溶液として）、髄腔内注射、脳室内注射、実質内注射、又は任意の他の薬学的に許容され得る製剤に製剤化することができる。
「薬学的に許容され得る賦形剤」は、本明細書に記載される化合物（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解することができるビヒクル）以外であり、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性であるという特性を有する任意の成分を指す。賦形剤は、例えば、付着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤又はコーティング、フレーバー、香料、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤又は分散剤、甘味料、及び水和水を含み得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ及びキシリトールが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の化合物（例えば、阻害性核酸分子（例えば、ＲＮＡ）及びそれを含有するベクター）は、薬学的に許容され得る塩として調製することができるようにイオン化可能な基を有し得る。これらの塩は、無機酸若しくは有機酸を含む酸付加塩であり得、又は酸性形態の本明細書に記載される化合物の場合、塩は無機塩基若しくは有機塩基から調製され得る。多くの場合、化合物は、薬学的に許容され得る酸又は塩基の付加生成物として調製される、薬学的に許容され得る塩として調製又は使用される。薬学的に許容され得る好適な酸及び塩基、並びに適切な塩を調製するための方法は、当技術分野で周知である。塩は、無機酸及び有機酸並びに塩基を含む、薬学的に許容され得る非毒性の酸及び塩基から調製され得る。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシルエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸、及び吉草酸塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられ、これらには、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びエチルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
「調節配列」という用語は、遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル配列）を含む。そのような調節配列は、例えば、；参照により本明細書に組み込まれるＰｅｒｄｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（２０１４））に記載される。
「標的」又は「標的化（する）」という用語は、阻害性核酸分子（例えば、ＲＮＡ）、例えば本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ剤が、相補的塩基対合を介してＧｒｉｋ２遺伝子又はＧｌｕＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的に結合する能力を指す。
「低分子干渉ＲＮＡ」及び「ｓｉＲＮＡ」という用語は、各鎖がＲＮＡ、ＲＮＡ類縁体（複数可）又はＲＮＡ及びＤＮＡを含む二本鎖核酸を含む阻害性ポリヌクレオチドを指す。ｓｉＲＮＡ分子は、１９～２３ヌクレオチド（例えば、２１ヌクレオチド）を含み得る。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ｓｉＲＮＡ中の二重鎖領域が１７～２１ヌクレオチド（例えば、１９ヌクレオチド）を含むように、各鎖の３’末端に２ｂｐのオーバーハングを有する。典型的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉経路内で作用し、標的ｍＲＮＡ（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）に結合し、ダイサー媒介ｍＲＮＡ切断を介してｍＲＮＡを分解することによってｍＲＮＡ発現の阻害をもたらす。本開示を通して、ｓｉＲＮＡという用語は、ｍｉＲＮＡがその等価なｓｉＲＮＡとして標的と相同性を有する同じ塩基を包含するように、その等価なｍｉＲＮＡを含むことを意味する。
「短ヘアピンＲＮＡ」及び「ｓｈＲＮＡ」という用語は、５～３０ヌクレオチドのループ領域を含む細胞においてステム－ループ構造を形成する５０～１００ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡと、相補的ＲＮＡ配列間の塩基対合によって二本鎖ステムを形成する、ループ領域の両側に１５～５０ヌクレオチドの長い相補的ＲＮＡとを含む阻害性ポリヌクレオチドを指し、いくつかの場合、ステムを形成する各相補鎖の前後に追加の１～５００ヌクレオチドが含まれる。例えば、ｓｈＲＮＡは、一般に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を終結させるためにヘアピンの特異的配列３’を必要とする。そのようなｓｈＲＮＡは、一般に、短い５’及び３’隣接配列を含むために、ドローシャによるプロセシングを迂回する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩから転写される「ｓｈＲＮＡ様マイクロＲＮＡ」等の他のｓｈＲＮＡは、より長い５’及び３’隣接配列を含み、ドローシャによる核内でのプロセシングを必要とし、その後、切断されたｓｈＲＮＡは核から細胞質ゾルに輸送され、ダイサーによって細胞質ゾルで更に切断される。ｓｉＲＮＡと同様に、ｓｈＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに配列特異的に結合し、標的ｍＲＮＡを切断及び破壊し、標的ｍＲＮＡの発現を抑制する。
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」及び「特異的に結合する」という用語は、ポリヌクレオチドと標的核酸（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）との間に十分な程度の相補性を有して所望の効果（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡからのＧｌｕＫ２の発現の減少又は阻害）を誘導するが、非標的核酸に対する効果は最小限であるか又は全く示さないポリヌクレオチドを指す。特異的なハイブリダイゼーション又は結合は、生理学的条件下で起こり得る。例えば、特異的なハイブリダイゼーション又は結合は、対応する標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ配列）の核酸塩基に相補的なポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）中の核酸塩基の数が、標的核酸へのポリヌクレオチドのアニーリングを促進するが非標的核酸（例えば、相補性は、例えば、標的核酸に対するポリヌクレオチドの結合部分の８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）のパーセント配列同一性に対応する）へのポリヌクレオチドのアニーリングを促進しない場合に起こる。当業者は、そのような状況では、ポリヌクレオチド中核酸配列（例えば、アンチセンスオリゴマー）及び標的核酸中の核酸配列が、高度の相補性（例えば、規定の数のポリヌクレオチド（例えば、約７～２２個の核酸塩基）等に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％相補的）を有することを理解するであろう。
「対象」及び「患者」という用語は、動物（例えば、ヒト等の哺乳動物）を指す。本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、てんかん（例えば、ＴＬＥ）と診断された対象、又はこの状態を発症するリスクがある対象であり得る。診断は、当技術分野で公知の任意の方法又は技術によって行うことができる。本開示に従って治療される対象は、標準的な試験に供されていてもよく、又は検査なしで、疾患又は状態に関連する１つ以上の危険因子の存在に起因して危険性があると同定されていてもよい。
「側頭葉てんかん」又は「ＴＬＥ」という用語は、脳の側頭葉に起源を有する慢性及び再発性の発作（てんかん）を特徴とする慢性の神経学的状態を指す。この疾患は、ＴＬＥがニューロンネットワークの形態機能的再編成及び海馬の歯状回の顆粒細胞からの再発性苔状線維の発芽を特徴とするのに対して、ナイーブ組織における急性発作はそのような回路特異的再編成を沈殿させないので、ナイーブ脳組織における急性発作とは異なる。ＴＬＥは、脳の片方又は両方の半球におけるてんかん原性焦点の出現に起因し得る。
「形質導入」及び「形質導入」という用語は、核酸材料（例えば、ウイルスベクターコンストラクト等のベクター、又はその一部）を細胞に導入し、続いて核酸材料（例えば、ベクターコンストラクト又はその一部）によってコードされるポリヌクレオチドを細胞において発現させる方法を指す。
「治療／処置」又は「治療する／処置する」という用語は、予防的処置及び予防的処置、並びに治癒的処置又は疾患修飾処置の両方を指し、疾患に罹患するリスクがある患者又は疾患に罹患した疑いがある患者、並びに疾患又は病状に罹患していると診断された患者の処置を含む。治療には、臨床的再発の抑制も含まれる。治療は、疾患若しくは再発性疾患の１つ以上の症状を予防するため、治癒するため、その発症を遅延させるため、その重症度を低下させるため、若しくはその１つ以上の症状を改善するために、又はそのような処置の非存在下で予想される生存期間を超えて対象の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか、又は最終的にその障害を獲得し得る対象に投与され得る。「治療レジメン」とは、病気の治療パターン、例えば治療中に使用される投与パターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの初期期間中に患者に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、「ローディングレジメン」を（部分的又は全体的に）使用することができ、これは、維持レジメン中に医師が使用するよりも多い用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含むことができる。「維持レジメン」又は「メンテナンス期間」という語句は、疾患の治療中に患者を維持するために、例えば長期間（月又は年）にわたって患者を寛解状態に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続療法（例えば、定期的な間隔、例えば、毎週、毎月、毎年等で薬物を投与すること）又は間欠療法（例えば、中断された治療、断続的な治療、再発時の治療、又は特定の所定の基準（例えば、疾患発現）を達成したときの治療）を用いることができる。
「ベクター」という用語は、核酸ベクター、例えばＤＮＡベクター、例えばプラスミド、ＲＮＡベクター、又は別の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）を含む。外因性ポリヌクレオチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞又は真核細胞に送達するための様々なベクターが開発されている。そのような発現ベクターの例は、例えば、国際公開第１９９４／０１１０２６号に開示されており、目的の核酸材料の発現に適したベクターに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターは、哺乳動物細胞における異種核酸材料（例えば、ＡＳＯ）の発現に使用されるポリヌクレオチド配列並びに例えば追加の配列エレメントを含有する。本明細書に記載の阻害性核酸（例えば、ＲＮＡ）剤の発現に使用することができる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター領域及びエンハンサー領域等の調節配列を含むプラスミドが含まれる。本明細書に開示される阻害性核酸（例えば、ＲＮＡ）剤の発現のための他の有用なベクターは、これらのポリヌクレオチドの翻訳速度を増強するか、又は遺伝子転写から生じる核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性若しくは核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、発現ベクター上に担持される遺伝子の効率的な転写を指示するために、例えば、５’及び３’非翻訳領域、ＩＲＥＳ、並びにポリアデニル化シグナル配列部位が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。適切なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ノウルセオトリシン又はゼオシン等の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、出発配列（例えば、参照配列）に対する１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７）のヌクレオチド修飾（置換、挿入、欠失又はミスマッチ）を合理的に含むことによって得られるポリヌクレオチド、例えば本開示の阻害性ポリヌクレオチド配列又はその相補体（例えば、その実質的又は完全な相補体）を指す。そのような修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ガイド鎖のＲＩＳＣローディング若しくは保持の改善、パッセンジャー鎖のＲＩＳＣローディング若しくは保持の減少、又はガイド対鎖産生の比の増加、及び標的核酸配列の阻害の改善）の少なくとも１つの特徴（例えば、生物学的機能）を改善し得る。
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、申請に応じて、必要な手数料を支払うことにより、米国特許庁から提供されることになる。
図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図１Ａ～図１Ｗは、内在性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＧＩ（配列番号１６）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＧＩアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１７～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号３１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号３２～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＡ）を図１Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図１Ｂ～図１Ｗに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来グルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に送達された出発コンストラクトＡから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図２Ａ～図２Ｑは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６３）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、Ｇ９アンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号６４～７９）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号８０）又はその合理的に設計された変異体（配列番号８１～９６］）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＢ）を図２Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図２Ｂ～図２Ｑに示す。図２Ａ～図２Ｉに示されるコンストラクトは、５’から３’に、パッセンジャー鎖、ループ配列及びガイド鎖を含むステム－ループ構造を特徴とし、一方、図２Ｊ～図２Ｑは、５’から３’に、ガイド鎖、ループ配列及びパッセンジャー鎖を含むステム－ループ構造を特徴とする。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＢから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図３Ａ～図３Ｌは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１０９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３’に、パッセンジャー配列（配列番号１２１）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１２２～１３２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列、及びＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１１０～１２０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＣ）を図３Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図３Ｂ～図３Ｌに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＣから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図４Ａ～図４Ｆは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１３９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４０～１４４）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号１４５）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４６～１５０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＤ）を図４Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図４Ｂ～図４Ｆに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＤから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図４Ａ～図４Ｆは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１３９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４０～１４４）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号１４５）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４６～１５０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＤ）を図４Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図４Ｂ～図４Ｆに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＤから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図４Ａ～図４Ｆは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１３９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４０～１４４）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号１４５）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４６～１５０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＤ）を図４Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図４Ｂ～図４Ｆに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＤから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図４Ａ～図４Ｆは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１３９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４０～１４４）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号１４５）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４６～１５０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＤ）を図４Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図４Ｂ～図４Ｆに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＤから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図４Ａ～図４Ｆは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１３９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４０～１４４）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号１４５）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４６～１５０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＤ）を図４Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図４Ｂ～図４Ｆに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＤから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図４Ａ～図４Ｆは、内在性Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれたＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ標的化アンチセンス配列ＭＷ（配列番号１３９）又はその変異体を含むステム－ループ構造の画像である。ステム－ループ構造は、５’から３に、ＭＷアンチセンス配列又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４０～１４４）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列、及びパッセンジャー配列（配列番号１４５）又はその合理的に設計された変異体（配列番号１４６～１５０）を含むガイド鎖を含む。出発コンストラクト（コンストラクトＤ）を図４Ａに示す。出発コンストラクトに対する変化をそれぞれ図４Ｂ～図４Ｆに示す。小さな黒い点は、Ｕ－Ｇゆらぎ対に対応する。数字が付された大きな黒い点は、実施例１に記載の設計基準に対応する。＊ドローシャ及びダイサー切断部位は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓに送達された出発コンストラクトＤから得られた低分子ＲＮＡ配列決定データにおいて観察された最も豊富な種に基づく。 図５Ａ～図５Ｅは、本開示の単一マイクロＲＮＡコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。５’から３’への一般的なコンストラクト構造の特徴：ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＳｙｎ１プロモーター配列、５’から３’に含有されるステム－ループ配列：５’マイクロＲＮＡ隣接配列、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖配列のいずれかを含有する５’ステム－ループアーム、マイクロＲＮＡ（Ｅ－ｍｉＲ）ループ配列、パッセンジャー鎖又はガイド鎖配列のいずれかを含有する３’ステム－ループアーム、及び３’隣接配列；ポリアデニル化配列（ＲＧＢポリＡ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲ（図５Ａ）。図５Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクター、コンストラクト番号１０２を示す。図５Ｃは、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターである、コンストラクト番号１０３を示す。図５Ｄは、コンストラクト番号３９（配列番号９８）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。図５Ｅは、コンストラクト番号４０（配列番号９９）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。 図５Ａ～図５Ｅは、本開示の単一マイクロＲＮＡコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。５’から３’への一般的なコンストラクト構造の特徴：ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＳｙｎ１プロモーター配列、５’から３’に含有されるステム－ループ配列：５’マイクロＲＮＡ隣接配列、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖配列のいずれかを含有する５’ステム－ループアーム、マイクロＲＮＡ（Ｅ－ｍｉＲ）ループ配列、パッセンジャー鎖又はガイド鎖配列のいずれかを含有する３’ステム－ループアーム、及び３’隣接配列；ポリアデニル化配列（ＲＧＢポリＡ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲ（図５Ａ）。図５Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクター、コンストラクト番号１０２を示す。図５Ｃは、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターである、コンストラクト番号１０３を示す。図５Ｄは、コンストラクト番号３９（配列番号９８）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。図５Ｅは、コンストラクト番号４０（配列番号９９）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。 図５Ａ～図５Ｅは、本開示の単一マイクロＲＮＡコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。５’から３’への一般的なコンストラクト構造の特徴：ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＳｙｎ１プロモーター配列、５’から３’に含有されるステム－ループ配列：５’マイクロＲＮＡ隣接配列、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖配列のいずれかを含有する５’ステム－ループアーム、マイクロＲＮＡ（Ｅ－ｍｉＲ）ループ配列、パッセンジャー鎖又はガイド鎖配列のいずれかを含有する３’ステム－ループアーム、及び３’隣接配列；ポリアデニル化配列（ＲＧＢポリＡ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲ（図５Ａ）。図５Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクター、コンストラクト番号１０２を示す。図５Ｃは、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターである、コンストラクト番号１０３を示す。図５Ｄは、コンストラクト番号３９（配列番号９８）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。図５Ｅは、コンストラクト番号４０（配列番号９９）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。 図５Ａ～図５Ｅは、本開示の単一マイクロＲＮＡコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。５’から３’への一般的なコンストラクト構造の特徴：ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＳｙｎ１プロモーター配列、５’から３’に含有されるステム－ループ配列：５’マイクロＲＮＡ隣接配列、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖配列のいずれかを含有する５’ステム－ループアーム、マイクロＲＮＡ（Ｅ－ｍｉＲ）ループ配列、パッセンジャー鎖又はガイド鎖配列のいずれかを含有する３’ステム－ループアーム、及び３’隣接配列；ポリアデニル化配列（ＲＧＢポリＡ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲ（図５Ａ）。図５Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクター、コンストラクト番号１０２を示す。図５Ｃは、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターである、コンストラクト番号１０３を示す。図５Ｄは、コンストラクト番号３９（配列番号９８）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。図５Ｅは、コンストラクト番号４０（配列番号９９）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。 図５Ａ～図５Ｅは、本開示の単一マイクロＲＮＡコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。５’から３’への一般的なコンストラクト構造の特徴：ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＳｙｎ１プロモーター配列、５’から３’に含有されるステム－ループ配列：５’マイクロＲＮＡ隣接配列、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖配列のいずれかを含有する５’ステム－ループアーム、マイクロＲＮＡ（Ｅ－ｍｉＲ）ループ配列、パッセンジャー鎖又はガイド鎖配列のいずれかを含有する３’ステム－ループアーム、及び３’隣接配列；ポリアデニル化配列（ＲＧＢポリＡ）及びＡＡＶ３’ＩＴＲ（図５Ａ）。図５Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクター、コンストラクト番号１０２を示す。図５Ｃは、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターである、コンストラクト番号１０３を示す。図５Ｄは、コンストラクト番号３９（配列番号９８）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。図５Ｅは、コンストラクト番号４０（配列番号９９）のステム－ループ配列を含むＡＡＶベクターを示す。 図６Ａ及び図６Ｂは、本開示のコンカテマーコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。図６Ａは、コンストラクト番号３（配列番号４）及びコンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含む二重マイクロＲＮＡ ＡＡＶベクター、コンストラクト番号１００を示し、コンストラクト番号３はコンストラクト番号５１に対して５’に位置する。図６Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）及びコンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むコンカテマーＡＡＶベクターを示し、コンストラクト番号３はコンストラクト番号５１に対して３’に位置する。 図６Ａ及び図６Ｂは、本開示のコンカテマーコンストラクトを含有するＡＡＶ発現コンストラクトの画像である。図６Ａは、コンストラクト番号３（配列番号４）及びコンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含む二重マイクロＲＮＡ ＡＡＶベクター、コンストラクト番号１００を示し、コンストラクト番号３はコンストラクト番号５１に対して５’に位置する。図６Ｂは、コンストラクト番号３（配列番号４）及びコンストラクト番号５１（配列番号１３５）のステム－ループ配列を含むコンカテマーＡＡＶベクターを示し、コンストラクト番号３はコンストラクト番号５１に対して３’に位置する。 図７は、実施例３に示されるようにトランスフェクトされたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における、ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量されるようなヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示すグラフである。全ての群についてｎ＝４。一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットの多重比較検定（対ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ）。＊＊ｐ＜０．００１；エラーバー：標準偏差。キー：ＲＮＡｉＭＡＸ＝トランスフェクション試薬のみ；ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ＝ｓｉＲＮＡ陰性対照；ｓｉＰｏｓｉｔｉｖｅ＝ｓｉＲＮＡ陽性対照；Ａ、Ｃ、Ｄ＝それぞれコンストラクトＡ、Ｃ、及びＤ；番号１、番号２、番号３、番号４、番号３９、番号４０、番号５０、及び番号５１＝それぞれコンストラクト番号１、番号２、番号３、番号４、番号３９、番号４０、番号５０、及び番号５１。 図８Ａ及び図８Ｂは、ＡＡＶベクターによる形質導入後のマウス皮質ニューロン（ＭＣＮ）におけるｍｉＲＮＡ ＧＩ及びＭＷ及びＧＬＵＫ２タンパク質レベルのそれぞれの発現を示すグラフである。図８Ａは、ステム－ループＲＴ－ｑＰＣＲによるＧＩ及びＭＷの定量化を示す。ｙ軸は、ＡＡＶベクター：左から右へ、ＲＮＡヌルベクター（Ｃｔｒｌ）、二重ｍｉＲＮＡコンカテマー、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）に対して５’に位置するコンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むコンストラクト番号１００（配列番号２５６）、二重ｍｉＲＮＡコンカテマー、コンストラクト番号３に対して５’に位置するコンストラクト番号５１のステム－ループ配列を含むコンストラクト番号１０１（配列番号２５７）、ＧＩ配列のみを含む単一コンストラクト（配列番号２５２）、及びＭＷ配列のみを含む単一コンストラクト（配列番号２５３）で形質導入された細胞で発現される、全ＲＮＡ１０ｐｇあたりのＧＩ又はＭＷ ｍｉＲＮＡの分子数を示す。図８Ｂは、免疫ブロットによって定量されたＧＬＵＫ２タンパク質レベルを示す。対照ウェルをＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ、ＲＮＡヌル対照ベクターで処置するか、又は非処置とした。図は、各条件について、ベータ－アクチンに対して正規化されたＧＬＵＫ２／ＧＬＵＫ３発現の倍数変化対ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ対照を示す。＊＊Ｐ＜０．０１． 図８Ａ及び図８Ｂは、ＡＡＶベクターによる形質導入後のマウス皮質ニューロン（ＭＣＮ）におけるｍｉＲＮＡ ＧＩ及びＭＷ及びＧＬＵＫ２タンパク質レベルのそれぞれの発現を示すグラフである。図８Ａは、ステム－ループＲＴ－ｑＰＣＲによるＧＩ及びＭＷの定量化を示す。ｙ軸は、ＡＡＶベクター：左から右へ、ＲＮＡヌルベクター（Ｃｔｒｌ）、二重ｍｉＲＮＡコンカテマー、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）に対して５’に位置するコンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含むコンストラクト番号１００（配列番号２５６）、二重ｍｉＲＮＡコンカテマー、コンストラクト番号３に対して５’に位置するコンストラクト番号５１のステム－ループ配列を含むコンストラクト番号１０１（配列番号２５７）、ＧＩ配列のみを含む単一コンストラクト（配列番号２５２）、及びＭＷ配列のみを含む単一コンストラクト（配列番号２５３）で形質導入された細胞で発現される、全ＲＮＡ１０ｐｇあたりのＧＩ又はＭＷ ｍｉＲＮＡの分子数を示す。図８Ｂは、免疫ブロットによって定量されたＧＬＵＫ２タンパク質レベルを示す。対照ウェルをＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ、ＲＮＡヌル対照ベクターで処置するか、又は非処置とした。図は、各条件について、ベータ－アクチンに対して正規化されたＧＬＵＫ２／ＧＬＵＫ３発現の倍数変化対ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ対照を示す。＊＊Ｐ＜０．０１． 図９は、ＲＮＡヌルベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００（配列番号２５６）に対して５’に位置するコンストラクト番号３（配列番号４）のステム－ループ配列を含む二重ｍｉＲＮＡコンカテマー、コンストラクト番号５１（配列番号１３５）をコードするＡＡＶのいずれかによる形質導入後のｉＰＳＣ由来ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎ細胞におけるＲＮＡ配列決定によって定量化されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ＴＰＭ、１００万当たりの転写物。＊＊ＦＤＲ（Ｐ ａｄｊ）＜０．０１。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）を有する２人の患者由来の隣接するヒト脳切片のてんかん性活動を表示するグラフである。一方の患者の脳切片を過興奮性条件下で記録し、他方の患者の脳切片を生理学的条件下で記録した。図１０Ａは、４－ＡＰ／ガバジンの存在下で記録されたＴＬＥ患者由来の隣接する器官型海馬スライスを示す。パネルの左側は、対照ベクターによる形質導入後に記録された発作事象の生トレースを示す（ＡＡＶ ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ）。パネルの右側は、コンストラクト番号１００（ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．コンストラクト番号３／コンストラクト番号５１；配列番号２５６）で形質導入した後のてんかん型放電を示す生のトレースを示す。対照と比較して、コンストラクト番号１００は、過興奮性条件下でｅｘ－ｖｉｖｏでＴＬＥ海馬からの自発発作を著しく抑制した。図１０Ｂは、別のＴＬＥ患者由来の器官型海馬スライスのニューロン興奮性を示し、これらのスライス片を生理学的条件下で記録して、ＲＮＡヌル対照及びコンストラクト番号１００による形質導入後の自発的発作活性を記録した。対照と比較して、コンストラクト番号１００は、生理学的緩衝液条件でｅｘ－ｖｉｖｏでＴＬＥ海馬からの自発発作を著しく抑制した。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）を有する２人の患者由来の隣接するヒト脳切片のてんかん性活動を表示するグラフである。一方の患者の脳切片を過興奮性条件下で記録し、他方の患者の脳切片を生理学的条件下で記録した。図１０Ａは、４－ＡＰ／ガバジンの存在下で記録されたＴＬＥ患者由来の隣接する器官型海馬スライスを示す。パネルの左側は、対照ベクターによる形質導入後に記録された発作事象の生トレースを示す（ＡＡＶ ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ）。パネルの右側は、コンストラクト番号１００（ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．コンストラクト番号３／コンストラクト番号５１；配列番号２５６）で形質導入した後のてんかん型放電を示す生のトレースを示す。対照と比較して、コンストラクト番号１００は、過興奮性条件下でｅｘ－ｖｉｖｏでＴＬＥ海馬からの自発発作を著しく抑制した。図１０Ｂは、別のＴＬＥ患者由来の器官型海馬スライスのニューロン興奮性を示し、これらのスライス片を生理学的条件下で記録して、ＲＮＡヌル対照及びコンストラクト番号１００による形質導入後の自発的発作活性を記録した。対照と比較して、コンストラクト番号１００は、生理学的緩衝液条件でｅｘ－ｖｉｖｏでＴＬＥ海馬からの自発発作を著しく抑制した。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ピロカルピンマウスモデルにおけるてんかん関連表現型の行動評価を示すグラフである。慢性てんかんマウスを、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００（配列番号２５６）、コンストラクト番号１０１（配列番号２５７）、ＧＩ配列のみを含有する単一コンストラクト（配列番号２５２）、及びＭＷ配列のみを含有する単一コンストラクト（配列番号２５３）のいずれかで処置し（ｎ＝５）、全て１Ｅ＋９ＧＣ／脳で適用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。コンカテマーベクターであるコンストラクト番号１００及びコンストラクト番号１０１は、ｉｎ ｖｉｖｏでピロカルピンモデルのてんかん関連表現型を改善するのに有効であった。図１１Ａは、オープンフィールドボックスでの１０分間の探索中に慢性てんかんマウスがカバーする総距離を示す。てんかんマウスは多動性であり、非てんかんマウスと比較して約２倍の距離を移動する。したがって、コンカテマーベクターで処置されたマウスは、より非てんかん性マウスのように挙動し、処置後にあまり移動しなかった。図１１Ｂは、ＲＮＡヌル対照、第１のコンカテマー、コンストラクト番号１００、又は第２のコンカテマー、コンストラクト番号１０１のいずれかで処置した慢性てんかんマウスの発作の平均１日数を示す。図１１Ｃは、５つの動物行動（ネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）、身震い、毛髪、ハンドリング、及び自発歩行）に基づく行動スコアリングを示す。Ｙ軸は、５つの挙動に対するスコーリングの合計を表す。対照は、対照ベクターで処置したてんかんマウスを表す。コンストラクト番号１００で処置したマウスは、正常な非てんかんマウスと同様の行動を示した。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ピロカルピンマウスモデルにおけるてんかん関連表現型の行動評価を示すグラフである。慢性てんかんマウスを、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００（配列番号２５６）、コンストラクト番号１０１（配列番号２５７）、ＧＩ配列のみを含有する単一コンストラクト（配列番号２５２）、及びＭＷ配列のみを含有する単一コンストラクト（配列番号２５３）のいずれかで処置し（ｎ＝５）、全て１Ｅ＋９ＧＣ／脳で適用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。コンカテマーベクターであるコンストラクト番号１００及びコンストラクト番号１０１は、ｉｎ ｖｉｖｏでピロカルピンモデルのてんかん関連表現型を改善するのに有効であった。図１１Ａは、オープンフィールドボックスでの１０分間の探索中に慢性てんかんマウスがカバーする総距離を示す。てんかんマウスは多動性であり、非てんかんマウスと比較して約２倍の距離を移動する。したがって、コンカテマーベクターで処置されたマウスは、より非てんかん性マウスのように挙動し、処置後にあまり移動しなかった。図１１Ｂは、ＲＮＡヌル対照、第１のコンカテマー、コンストラクト番号１００、又は第２のコンカテマー、コンストラクト番号１０１のいずれかで処置した慢性てんかんマウスの発作の平均１日数を示す。図１１Ｃは、５つの動物行動（ネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）、身震い、毛髪、ハンドリング、及び自発歩行）に基づく行動スコアリングを示す。Ｙ軸は、５つの挙動に対するスコーリングの合計を表す。対照は、対照ベクターで処置したてんかんマウスを表す。コンストラクト番号１００で処置したマウスは、正常な非てんかんマウスと同様の行動を示した。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ピロカルピンマウスモデルにおけるてんかん関連表現型の行動評価を示すグラフである。慢性てんかんマウスを、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００（配列番号２５６）、コンストラクト番号１０１（配列番号２５７）、ＧＩ配列のみを含有する単一コンストラクト（配列番号２５２）、及びＭＷ配列のみを含有する単一コンストラクト（配列番号２５３）のいずれかで処置し（ｎ＝５）、全て１Ｅ＋９ＧＣ／脳で適用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。コンカテマーベクターであるコンストラクト番号１００及びコンストラクト番号１０１は、ｉｎ ｖｉｖｏでピロカルピンモデルのてんかん関連表現型を改善するのに有効であった。図１１Ａは、オープンフィールドボックスでの１０分間の探索中に慢性てんかんマウスがカバーする総距離を示す。てんかんマウスは多動性であり、非てんかんマウスと比較して約２倍の距離を移動する。したがって、コンカテマーベクターで処置されたマウスは、より非てんかん性マウスのように挙動し、処置後にあまり移動しなかった。図１１Ｂは、ＲＮＡヌル対照、第１のコンカテマー、コンストラクト番号１００、又は第２のコンカテマー、コンストラクト番号１０１のいずれかで処置した慢性てんかんマウスの発作の平均１日数を示す。図１１Ｃは、５つの動物行動（ネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）、身震い、毛髪、ハンドリング、及び自発歩行）に基づく行動スコアリングを示す。Ｙ軸は、５つの挙動に対するスコーリングの合計を表す。対照は、対照ベクターで処置したてんかんマウスを表す。コンストラクト番号１００で処置したマウスは、正常な非てんかんマウスと同様の行動を示した。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００（配列番号２５６）のいずれかで処置したピロカルピンマウスにおける移動距離又は発作活動のグラフである。１Ｅ＋１０ ＧＣ／脳の試験用量では、コンストラクト番号１００は、ｉｎ ｖｉｖｏでピロカルピンマウスモデルの運動亢進表現型及び発作活動の減少に有効であった。図１２Ａは、オープンフィールドボックスでの１０分間の探索中に慢性てんかんマウスがカバーする総距離を示す。慢性てんかんマウスを、対照ベクター又は１Ｅ＋１０ＧＣ／脳に適用されたコンストラクト番号１００のいずれかで処置した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニー検定。図１２Ｂは、対照ベクター又はコンストラクト番号１００のいずれかによる処置の１ヶ月後の慢性てんかんマウスにおける発作の平均１日数を示す。＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００（配列番号２５６）のいずれかで処置したピロカルピンマウスにおける移動距離又は発作活動のグラフである。１Ｅ＋１０ ＧＣ／脳の試験用量では、コンストラクト番号１００は、ｉｎ ｖｉｖｏでピロカルピンマウスモデルの運動亢進表現型及び発作活動の減少に有効であった。図１２Ａは、オープンフィールドボックスでの１０分間の探索中に慢性てんかんマウスがカバーする総距離を示す。慢性てんかんマウスを、対照ベクター又は１Ｅ＋１０ＧＣ／脳に適用されたコンストラクト番号１００のいずれかで処置した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニー検定。図１２Ｂは、対照ベクター又はコンストラクト番号１００のいずれかによる処置の１ヶ月後の慢性てんかんマウスにおける発作の平均１日数を示す。＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、コンストラクト番号１００で処置したピロカルピンマウスにおける運動亢進表現型及び発作の用量依存的減少を示すグラフである。図１３Ａは、オープンフィールドボックスにおける１０分間の探索の間にカバーされた総距離を示す。慢性てんかんマウスを、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００、１Ｅ＋８／１Ｅ＋９／１Ｅ＋１０ＧＣ／脳）のいずれかで処置した。＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。野生型マウス（ＷＴ）の過去の自発運動活性を別個の実験で評価したが、ここでは比較のために示す。図１３Ｂは、対照ベクター又はコンストラクト番号１００のいずれかで処置した後の慢性てんかんマウスにおける発作の平均１日数を示す。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、コンストラクト番号１００で処置したピロカルピンマウスにおける運動亢進表現型及び発作の用量依存的減少を示すグラフである。図１３Ａは、オープンフィールドボックスにおける１０分間の探索の間にカバーされた総距離を示す。慢性てんかんマウスを、ＲＮＡヌル対照ベクター（Ｃｔｒｌ）又はコンストラクト番号１００、１Ｅ＋８／１Ｅ＋９／１Ｅ＋１０ＧＣ／脳）のいずれかで処置した。＊＊ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。野生型マウス（ＷＴ）の過去の自発運動活性を別個の実験で評価したが、ここでは比較のために示す。図１３Ｂは、対照ベクター又はコンストラクト番号１００のいずれかで処置した後の慢性てんかんマウスにおける発作の平均１日数を示す。 図１４は、コンストラクト番号１００の阻害性ポリヌクレオチド配列を含むベクターマップの画像である。コンストラクト番号１００は、ｌａｃプロモーター配列、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）プロモーター配列、及びカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）配列を含むが、他のプロモーター及び抗生物質耐性配列（例えば、クロラムフェニコール耐性配列）を代替として含めることができる。
詳細な説明
ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）ローディングに影響を及ぼし（例えば、改善する）、例えばアンチセンスガイド鎖の産生を増強し、パッセンジャー鎖の産生を最小限に抑え、それによりＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ及びＧｌｕＫ２発現のより大きなノックダウンを促進し、パッセンジャー鎖によって誘導されるオフターゲット効果及び毒性の潜在的リスクを低下させるように設計された改変を有する阻害性ポリヌクレオチド（例えば、阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチド）を使用して、対象（例えば哺乳動物対象、例えばヒト）において、例えば側頭葉てんかん（ＴＬＥ；例えば、処置に難治性のＴＬＥ）等のてんかんを治療するための組成物及び方法が本明細書に記載される。例えば、グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２）遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、又はそれらをコードする核酸ベクター、例えば本明細書に記載されるもの）の治療有効量を、例えば本明細書に記載の方法に従って投与して、それを必要とする対象（例えば、ヒト）のてんかんを治療することができる。ＴＬＥの治療のためのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ剤をコードする核酸ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）を含有する組成物も本明細書に記載される。
Ｇｒｉｋ２
Ｇｒｉｋ２は、内因性アゴニストであるグルタメートによって活性化され、アゴニストであるカイニン酸によっても選択的に活性化され得るイオノトロピック型グルタメート受容体サブユニットＧｌｕＫ２をコードする遺伝子である。ＧｌｕＫ２含有カイニン酸受容体（ＫＡＲ）は、他のイオノトロピック型グルタミン酸受容体と同様に、ナトリウム及びカリウムを透過性の陽イオンチャネル孔を開くことによって作用するグルタミン酸による迅速なリガンド開口を示す。ＫＡＲ複合体は、ＫＡＲサブユニットのヘテロマー又はホモマー集合体としていくつかのサブユニットからアセンブリすることができる。そのような受容体は、リガンド結合ドメイン及び細胞内Ｃ末端を共に形成する細胞外Ｎ末端及び大きなペプチドループを特徴とする。イオノトロピック型グルタミン酸受容体複合体自体は、リガンド開口型イオンチャネルとして作用し、グルタミン酸と結合すると、荷電イオンのニューロン膜を通過することを媒介する。一般に、ＫＡＲは、ＧｌｕＫ１、２及び／又は３（それぞれ以前にＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６及びＧｌｕＲ７と命名されている）、ＧｌｕＫ４（ＫＡ１）及びＧｌｕＫ５（ＫＡ２）サブユニット（Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２００９ Ｊａｎ；５６（１）：２－５）の多量体アセンブリである。ＫＡＲ複合体に関与するサブユニットの様々な組み合わせは、特定のＫＡＲサブユニットをコードするｍＲＮＡのＲＮＡスプライシング及び／又はＲＮＡ編集（例えば、アデノシンデアミナーゼによるアデノシンのイノシンへの変換）によって決定されることが多い。更に、そのようなＲＮＡ修飾は、受容体の特性、例えばチャネルのカルシウム透過性の変化に影響を及ぼし得る。カイニン酸受容体の活性の増加はてんかん原性であることが知られている。ＧｌｕＫ２含有ＫＡＲは、イオノトロピック型グルタミン酸受容体活性の調節及びその後のてんかん発生に関連する症状の改善に適した標的である（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
側頭葉てんかん
てんかん発生は、てんかんの確立をもたらし、病理学的な神経ネットワーク再編成をもたらす細胞、分子、及び形態学的変化が起こる間に潜在的に見えることがあるプロセスである。ＴＬＥは、てんかん原性焦点の解剖学的起源に基づく２つの主要なタイプによって特徴付けられる。内側側頭葉（例えば、とりわけ、海馬、海馬傍回、鉤状回及び扁桃体）に由来するＴＬＥは内側ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）と呼ばれ、外側側頭葉（例えば、側頭新皮質）に由来するＴＬＥは外側ＴＬＥ（ｌＴＬＥ）と呼ばれる。ＴＬＥに特徴的な追加の特徴としては、海馬のＣＡ１、ＣＡ３、歯状回及び歯状回（ＤＧ）領域におけるニューロン細胞死、ＧＡＢＡ逆転電位の逆転、ＤＧにおける顆粒細胞（ＧＣ）の分散、並びに歯状ＧＣ上への病態生理学的な反復興奮性シナプスの形成をもたらす再発性ＧＣ苔状線維の発芽（ｒＭＦ－ＤＧＣシナプス）が挙げられ得る。
様々な原因因子が、内側側頭葉硬化症、外傷性脳損傷、脳感染症（例えば、脳炎及び髄膜炎）、低酸素性脳損傷、脳卒中、脳腫瘍、遺伝的症候群及び熱性発作を含むＴＬＥの病因に起因している。ＣＮＳの可塑性は発達状態及び脳領域特異的感受性の両方に依存するので、脳損傷を有する全ての対象がてんかんを発症するわけではない。ＤＧを含む海馬は、ＴＬＥを引き起こす損傷を特に受けやすい脳領域として同定されており、場合によっては、治療抵抗性（すなわち、難治性）てんかんに関連している（Ｊａｒｅｒｏ－Ｂａｓｕｌｔｏ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０１８，１１，１７；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈ１１０１００１７）。興奮性グルタミン酸作動性シグナル伝達の増幅は、自発発作を促進し得る（Ｋｕｒｕｂａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖ．２００９，１４（Ｓｕｐｐｌ．１），６５－７３）。
理論に拘束されることを望むものではないが、異所性ＧｌｕＫ２含有ＫＡＲを介して作動する異常なｒＭＦ－ＤＧＣシナプス（Ｅｐｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｒｔｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，２０１５）は、ＴＬＥ慢性発作において重要な役割を果たし得る（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。例えば、発作間欠期スパイク及び発作事象（すなわち、てんかん様脳活動の電気生理学的シグネチャ）は、ＧｌｕＫ２受容体サブユニットを欠くトランスジェニックマウスにおいて、又はＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５受容体を阻害する薬理学的薬剤の存在下において減少した（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｒｅｐｅｌ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅ，２０１５）。これらの理論を試験するように設計されたトランスジェニック動物モデルにおけるＧｌｕＫ２のノックダウン又はサイレンシングは実現可能であるが、ＧｌｕＫ２サブユニットに対して選択的であり、ヒトにおける使用に安全な阻害剤を設計することは困難である。ＧｌｕＫサブユニットは構造的に保存されており、それらのＤＮＡコード配列は有意な相同性を共有する。ホモマー型及びヘテロマー型のイオノトロピック型及び代謝型グルタミン酸受容体に関する脳内の複雑な遺伝子発現パターンは、任意の治療戦略を更に複雑にする。本明細書に開示される方法及び組成物は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化し、ニューロン又は星状膠細胞におけるＧｌｕＫ２含有ＫＡＲの発現を減少させる（例えば、ノックダウン）ことによって、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）の治療に適しており、これは、例えば、ニューロン回路（例えば、海馬回路）における自発性てんかん型放電の減少を促進する。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の生理学的原因を標的とし、治療に使用することができる。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ポリヌクレオチド
ＴＬＥの臨床管理は困難であることは周知であり、ＴＬＥ患者の少なくとも１／３は、利用可能な薬物を使用して消耗性発作を十分に制御することができない。これらの患者は、治療に反応しない再発性てんかん発作を経験することが多い。そのようなシナリオでは、ＴＬＥ患者は、側頭葉のてんかん原性焦点の侵襲的かつ不可逆的な外科的切除に頼ることがあり、これは望ましくない認知欠損をもたらし得る。したがって、ＴＬＥ患者のかなりの割合が、薬物耐性ＴＬＥを治療するための新規な治療手段を必要としている。本明細書に記載される組成物及び方法は、ＴＬＥの発症及び進行をもたらす基礎となる分子病態生理を治療する利点を提供する。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１６４～１７４のいずれか１つ）を標的とする阻害性核酸コンストラクト（例えば、阻害性ＲＮＡ剤又はそれをコードする核酸ベクター）をコードするポリヌクレオチドである本明細書に記載の組成物は、ＴＬＥ等のてんかんを治療するために本明細書に記載の方法に従って投与することができる。本明細書に記載の方法及び組成物は、例えば、焦点性発作を伴うＴＬＥ、全般発作を伴うＴＬＥ、ｍＴＬＥ、又はｌＴＬＥ等の任意のタイプのＴＬＥを有するＴＬＥ患者を治療するために使用することができる。更に、本開示の方法及び組成物は、例えば、内側側頭葉硬化症、外傷性脳損傷、脳感染症（例えば、脳炎及び髄膜炎）、低酸素性脳損傷、脳卒中、脳腫瘍、遺伝的症候群、又は熱性痙攣等の任意の病因に起因するＴＬＥを治療するために使用され得る。本明細書に記載される組成物及び方法はまた、ＴＬＥを発症するリスクがある対象、例えば、ＴＬＥ進行の潜伏期にある対象に予防的処置として投与され得る。
本明細書に開示される方法及び組成物によれば、阻害性核酸（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は、細胞（例えば、ニューロン、例えば、海馬ニューロン、例えば、歯状回の海馬ニューロン、例えば、歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）、又はグルタミン酸作動性錐体ニューロン）においてＧｒｉｋ２ｍＲＮＡの分解を引き起こすことによってＧｌｕＫ２の発現を阻害し、それによってｍＲＮＡの機能的ＧｌｕＫ２タンパク質への翻訳を妨げることができる。
本明細書に開示されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は、１つ以上の脳領域におけるてんかん性脳活動（例えば、てんかん型放電）の発生頻度を低下させるように、又はその発生を完全に阻害するように作用し得る。そのような脳領域は、内側側頭葉、外側側頭葉、前頭葉、又はより具体的には、海馬（例えば、ＤＧ、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、鉤状回）又は新皮質を含み得るが、これらに限定されない。ＤＧのｒＭＦ－ＤＧＣにおけるＧｌｕＫ２含有ＫＡＲの異常な発現のために、てんかん性脳活動の発生はＤＧで阻害され得る。
したがって、本開示は、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する有効量の阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）、又はそれをコードする核酸ベクター、例えば配列番号２５６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸ベクターと細胞を接触させることによって、ＣＮＳ細胞（例えば、ＤＧＣ）におけるてんかん型放電を減少させるための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号１９の核酸配列同一性を有するｍｉＲ－３０ガイド配列、配列番号４の核酸配列を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４の核酸配列を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号１４１の核酸配列を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５の核酸配列を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７の核酸配列を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、配列番号１３５の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、並びに（ｂ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４の配列を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４の配列を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、並びに（ｂ）配列番号１４１の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７の配列を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２５８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２５８の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９４～１９８のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｂ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、並びに（ｃ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｂ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、並びに（ｃ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９８の配列を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｂ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４の配列を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４の配列を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、並びに（ｃ）配列番号１４１の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７の配列を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２５９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２５９の核酸配列を含む。
本明細書に記載される下記の核酸分子のいずれかのいくつかの実施形態では、その核酸分子は、１つ以上の（例えば、２つの）ｍｉＲＮＡ配列の発現を制御することができる単一のプロモーター、あるいは、それぞれが単一のｍｉＲＮＡコンストラクトの発現を制御することができる２つのプロモーターを含む場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）ｍｉＲ－３０ガイド配列、ｍｉＲ－３０ステム－ループ配列及びｍｉＲ－３０パッセンジャー配列を含むｍｉＲ－３０配列等のｍｉＲＮＡ配列；（ｃ）任意に、第２のプロモーター配列；（ｄ）ｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、ｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列及びｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含むｍｉＲ－２１８配列等の第２のｍｉＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）ｍｉＲ－３０ガイド配列、ｍｉＲ－３０ステム－ループ配列及びｍｉＲ－３０パッセンジャー配列を含むｍｉＲ－３０配列等のｍｉＲＮＡ配列；並びに（ｃ）ｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、ｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列及びｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含むｍｉＲ－２１８配列等の第２のｍｉＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）ｍｉＲ－３０ガイド配列、ｍｉＲ－３０ステム－ループ配列及びｍｉＲ－３０パッセンジャー配列を含むｍｉＲ－３０配列等のｍｉＲＮＡ配列；（ｃ）第２のプロモーター配列；並びに（ｄ）ｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、ｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列及びｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列を含むｍｉＲ－２１８配列等の第２のｍｉＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９４～１９８のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｂ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｃ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、並びに（ｄ）配列番号２１３、２１４及び２１５のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するウサギベータグロビン（ＲＢＧ）アデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｂ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｃ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、並びに（ｄ）配列番号２１３、２１４及び２１５のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するＲＢＧポリＡシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号１９８の配列を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｂ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４の配列を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４の配列を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｃ）配列番号１４１の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７の配列を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、並びに（ｄ）配列番号２１３、２１４及び２１５のいずれかの配列を有するＲＢＧポリＡシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２６０と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２６０の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号２０８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する５’ＩＴＲ配列、（ｂ）配列番号１９８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｃ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｄ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、（ｅ）配列番号２１３、２１４及び２１５のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するＲＢＧポリＡシグナル配列、並びに（ｆ）配列番号２１２と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する３’ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号２０８の配列を有する５’ＩＴＲ配列、（ｂ）配列番号１９８の配列を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｃ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４の配列を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｄ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７の配列を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、（ｅ）配列番号２１３、２１４及び２１５のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するＲＢＧポリＡシグナル配列、並びに（ｆ）配列番号２１２の配列を有する３’ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２６１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２６１の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号２０８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する５’ＩＴＲ配列、（ｂ）配列番号１９８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｃ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｄ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、（ｅ）配列番号２１３、２１４及び２１５のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するＲＢＧポリＡシグナル配列；（ｆ）配列番号２５０及び２５１のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するスタッファー配列、並びに（ｇ）配列番号２１２と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する３’ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’に、（ａ）配列番号２０８の配列を有する５’ＩＴＲ配列、（ｂ）配列番号１９８の配列を有するｈＳｙｎプロモーター配列、（ｃ）配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－３０配列ガイド配列、配列番号４の配列を有するｍｉＲ－３０ステム－ループ配列、及び配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有するｍｉＲ－３０パッセンジャー配列、（ｄ）配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するｍｉＲ－２１８－１ガイド配列、配列番号１３５の配列を有するｍｉＲ－２１８－１ステム－ループ配列、及び配列番号１４７の配列を有するｍｉＲ－２１８－１パッセンジャー配列、（ｅ）配列番号２１３、２１４及び２１５のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、又は５）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するＲＢＧポリＡシグナル配列、（ｆ）配列番号２５０及び２５１のうちの一又は複数（例えば、２、３、４、又は５）の配列を有するスタッファー配列、並びに（ｇ）配列番号２１２の配列を有する３’ＩＴＲ配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２５６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する発現カセットにコードされる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５６の核酸配列を有する。
本開示の阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は、ＧｌｕＫ２阻害剤であり得る。特に、ＧｌｕＫ２阻害剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現阻害剤であり得る。ＧｌｕＫ２の発現を阻害することはまた、ＧｌｕＫ５のレベルを阻害し得る（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００５）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本開示は、ＧｌｕＫ５サブユニット単独ではホモマー集合体を形成することができないため、ＧｌｕＫ２単独の十分な除去が全てのＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５ヘテロマーを除去すべきであるという原理に基づいている。
開示される方法及び組成物によれば、本明細書に開示される阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は、１５～５０ヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、３０、３５、４０、４５、又は最大５０ヌクレオチド）の長さを有し得る。例えば、本明細書に開示される阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は、１５ヌクレオチドの長さを有し得る。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は１６ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は１７ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は１８ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は１９ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２０ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２１ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２２ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２３ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２４ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２５ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は２５～３０ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は３０～３５ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は３５～４０ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は４０～４５ヌクレオチドの長さを有する。別の例では、阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）は４５～５０ヌクレオチドの長さを有する。
本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１６４～１７４のいずれか１つ）又はその変異体の配列の領域に少なくとも実質的に相補的又は完全に相補的な配列を含み、当該相補性は細胞内条件下で特異的結合を生じるのに十分である。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ剤は、配列番号１６４等のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの配列の領域、又は配列番号１６４と少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体に少なくとも実質的に相補的又は完全に相補的な配列を含む。例えば、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の少なくとも７個（例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又はそれ以上）の連続するヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する阻害性ＲＮＡ剤を企図する。特定の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の７個の連続するヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の８個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の９個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１０個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１１個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１２個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１３個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１４個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１５個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１６個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１７個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１８個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１９個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の２０個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の２１個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の２２個の連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンス配列を有する。更に別の例では、阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上領域のヌクレオチドに１００％相補的なアンチセンス配列を有する。
本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１６４～１７４に記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域のいずれか１つ）の１つ以上の領域に結合した場合、７～２２（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２）ヌクレオチド長のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡと二重鎖構造を形成する阻害性ＲＮＡ剤を企図する。いくつかの実施形態では、本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、配列番号１６４の配列内のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域に結合し、７～２２（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２）ヌクレオチド長のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡと二重鎖構造を形成し得る。例えば、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は、７ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は８ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は９ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１０ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１１ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１２ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１３ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１４ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１５ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１６ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１７ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１８ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１９ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は２０ヌクレオチド長であり得る。別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は２１ヌクレオチド長であり得る。更に別の例では、阻害性ＲＮＡ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二重鎖構造は１０ヌクレオチド長であり得る。
開示される方法及び組成物によれば、二重鎖構造は、阻害性ＲＮＡ剤（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する薬剤）によって形成される二重鎖構造、例えば配列番号２５８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する阻害性ＲＮＡ剤によって形成され、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域は、少なくとも１つの（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）ミスマッチを含み得る。例えば、二重鎖構造は１個のミスマッチを含み得る。別の例では、二重鎖構造は２個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は３個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は４個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は５個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は６個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は７個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は８個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は９個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は１０個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は１１個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は１２個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は１３個のミスマッチを含む。別の例では、二重鎖構造は１４個のミスマッチを含む。更に別の例では、二重鎖構造は１５個のミスマッチを含む。
したがって、本開示の目的は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する単離された、合成された、又は組換え阻害性核酸分子（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）に関する。本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、ＲＮＡ又はＤＮＡ阻害性ポリヌクレオチドを含む任意の適切なタイプのものであり得る。したがって、開示される方法及び組成物は、阻害性ＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）であるＧｒｉｋ２発現阻害剤を特徴とする。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む阻害性ＲＮＡ剤は、それに結合してタンパク質翻訳を防止するか又はｍＲＮＡ分解を増加させ、それによってＧｌｕＫ２タンパク質のレベル及び活性を低下させることによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用し得る。例えば、少なくとも約１９塩基を有し、ＧｌｕＫ２をコードするｍＲＮＡ転写物配列の固有の領域に対する相補性を有する阻害性ＲＮＡ剤は、例えば従来の技術（例えば、本明細書に開示される技術）によって合成され、本明細書に記載の他の経路の中でも、例えば静脈内注射又は注入によって、例えば脳の領域への直接注射等によって投与され得る。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に緩和するためのアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第、６，５６６，１３５号、同第６，５６６，１３１号、同第６，３６５，３５４号、同第６，４１０，３２３号、同第６，１０７，０９１号、同第６，０４６，３２１号及び同第５，９８１，７３２号を参照（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
特定の例では、本開示のＧｒｉｋ２ 阻害性ＲＮＡ剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。Ｇｒｉｋ２ 遺伝子発現は、対象又は細胞を低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はそれをコードするベクターと接触させ、それによって配列特異的にｍＲＮＡの分解によってＧｒｉｋ２発現を特異的に阻害することができる低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすことによって（例えば、ＲＮＡ干渉経路によって）減少させることができる。適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、その配列が既知である遺伝子について当技術分野で公知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）；Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．ｅｔ ａｌ．（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．ｅｔ ａｌ．（２００２）；米国特許第６，５７３，０９９号、同第６，５０６，５５９号；及び国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号及び国際公開第０１／６８８３６号を参照（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
本開示のＧｒｉｋ２阻害性ＲＮＡ剤はまた、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる密なヘアピンターンを形成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、一般に、標的細胞に導入されたベクターを使用して発現され、ベクターは、ｓｈＲＮＡが構成的に発現されることを確実にするために遍在性Ｕ６プロモーターをしばしば利用する。このベクターは通常、娘細胞に渡され、細胞分裂後に遺伝子サイレンシングを維持することを可能にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、その後、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、それが結合しているｓｉＲＮＡ配列と一致するｍＲＮＡに結合して切断する。
更に、本開示のＧｒｉｋ２発現阻害剤はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。ｍｉＲＮＡは、当技術分野において一般的な意味を有し、例えば、１９ヌクレオチド～最大２３ヌクレオチドの長さが報告されており、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために使用することができるが、一般に２１～２２ヌクレオチド長であるマイクロＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡはそれぞれ、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体ｍｉＲＮＡは、それらがダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼ酵素によって動物において切断されるステム－ループ又はフォールドバック様構造を形成することを可能にする２つの相補性領域を有する。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的には、標的ｍＲＮＡの領域に対して完全に又は実質的に相補的である「シード配列」（典型的には６～８ヌクレオチド）を含有するステムの一部である。プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は、特定の標的遺伝子のダウンレギュレーション（例えば、翻訳を減少させるか又はｍＲＮＡを分解する）のための大きな複合体の一部となる。
更に、本開示のＧｌｕＫ２阻害剤は、ｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）であり得る。ｓｈｍｉＲＮＡ作用因は、マイクロＲＮＡの隣接配列及びループ配列を含有するマイクロＲＮＡスキャフォルド（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０スキャフォルド）の－５ｐアーム又は－３ｐアーム内にアンチセンス配列を組み込むキメラ分子を示す。ｓｈｍｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと比較して、一般に、マイクロＲＮＡ由来の配列に基づくより長いステム－ループ構造を有し、－５ｐ及び－３ｐアームは完全又は実質的な相補性を示す（例えば、ミスマッチ、Ｇ：Ｕゆらぎ）。それらのより長い配列及びプロセシング要件のために、ｓｈｍｉＲＮＡは一般にＰｏｌ ＩＩプロモーターから発現される。これらのコンストラクトはまた、ｓｈＲＮＡベースの薬剤と比較して毒性の低下を示すことが示されている。
複数のｍｉＲＮＡを使用して、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現をノックダウンすることができる（続いて、その遺伝子産物ＧｌｕＫ２）。ｍｉＲＮＡは、異なる標的転写物又は単一の標的転写物の異なる結合部位に相補的であり得る。ポリシストロニック又は多重遺伝子転写物もまた、標的遺伝子ノックダウンの効率を高めるために利用され得る。同じｍｉＲＮＡ又は異なるｍｉＲＮＡをコードする複数の遺伝子は、単一の転写物において一緒に調節され得るか、又は単一のベクターカセットにおいて別個の転写物として調節され得る。本開示のｍｉＲＮＡは、ベクター、例えば、ウイルスベクター（組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレトロトランスポゾンに基づくベクター系が含まれるが、これらに限定されない）にパッケージングされ得る。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのセンス標的配列に相補的な（例えば、実質的に又は完全に相補的である）阻害性ＲＮＡは、一般に、前述の阻害剤のいずれかの産生のためのＤＮＡ配列によってコードされる（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）。目的の二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは、遺伝子カセット（例えば、ＤＮＡの転写がプロモーターによって制御される発現カセット）に組み込むことができる。
ガイド配列のＲＩＳＣローディングの改善
ＲＮＡ干渉におけるステップは、標的ｍＲＮＡ切断を媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質複合体へのマイクロＲＮＡガイド鎖のアセンブリである。マイクロＲＮＡは、相補的塩基対合によってパッセンジャー鎖にハイブリダイズしたガイド鎖を含む二本鎖二重鎖として産生される。ガイド鎖のＲＩＳＣ複合体へのアセンブリは、一般に、パッセンジャー鎖の分解を伴う。ＲＩＳＣアセンブリは、二本鎖からほつれたり遊離したりする傾向がより大きい５’末端を有するマイクロＲＮＡ鎖に有利である。本明細書に記載のコンストラクトは、ガイド鎖の５’末端での塩基対合を不安定化し（例えば、Ｕ－Ａ対又はＵ－Ｇゆらぎ対をガイド鎖の５’末端又はその近くに導入することによって）、パッセンジャー鎖の５’末端での塩基対合を強固にする（例えば、パッセンジャー鎖の５’末端又はその近くにＧ－Ｃ対を導入することによって）ことによって、ガイドの選択及びローディングに有利に働き、ＲＩＳＣによるパッセンジャーの選択に不利に働くように設計されている。この戦略は、ガイド鎖と標的ｍＲＮＡとの間のミスマッチが、ガイド鎖の最初のヌクレオチド又は３’末端付近（例えば、最後の４ヌクレオチド以内）で起こる場合、十分に許容されるので達成可能である。そのような戦略は、ガイド鎖によるオンターゲットノックダウンを改善するだけでなく、ＲＩＳＣタンパク質複合体によるパッセンジャー鎖の産生又は保持からのオフターゲット効果も低減する。
したがって、本明細書に記載される抗Ｇｒｉｋ２アンチセンス分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）は、ガイド鎖のＲＩＳＣ負荷又は保持を改善し、パッセンジャー鎖のＲＩＳＣローディング又は保持を減少させ、細胞内のガイド対パッセンジャー鎖比を増加させ、標的Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウンのレベルを増加させる１つ以上の改変を含む。
ガイド鎖の５’末端又はその近くの塩基対合不安定性は、本明細書に記載のコンストラクトのいくつかにおいて、ガイド鎖のＲＩＳＣローディング又は保持を改善するために増加した。例えば、塩基対合不安定性は、いくつかのコンストラクトのガイド鎖の５’末端又はその近くにＵ－Ａ対又はＵ－Ｇゆらぎ対を導入することによって達成される。
本明細書に記載のコンストラクトのいくつかでは、パッセンジャー鎖の５’末端に塩基対合不安定性を導入することによって、パッセンジャー鎖のＲＩＳＣローディング又は保持が減少する。塩基対合不安定性は、パッセンジャー鎖の５’末端又はその近くにＣ－Ｇ対を付加することによって導入される。
本開示のいくつかのコンストラクトはまた、ガイド鎖に５’末端ウラシルを導入することによってガイド鎖のＲＩＳＣローディング又は保持を増強するように設計された。この５’末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）へのハイブリダイゼーションに関与せず、一般にアルゴノートＲＩＳＣ触媒成分２（Ａｇｏ２）タンパク質のリン酸結合ポケットに固定される。
いくつかの開示されたコンストラクトについて、ガイド鎖のシード領域（ガイド鎖のヌクレオチド２～７に対応；ｇ２－ｇ７）に１つ以上のミスマッチ（例えば、１、２、３、４、５、６、７個、又はそれ以上のミスマッチ）を導入することによって、パッセンジャー鎖のＲＩＳＣローディング又は保持が低減される。この戦略は、ＲＩＳＣローディング中のパッセンジャー鎖の巻き戻し及び取り出しを促進するために用いられる。ガイド鎖のシード領域（ガイドヌクレオチド２－８、ｇ２－ｇ８）及び中間領域における広範な相補性は、Ａｇｏ２媒介ｍＲＮＡ切断にとって極めて重要であるが、３’末端における塩基対合は必要とされない。実際、ガイド鎖の位置ｇ１８、ｇ１９、ｇ２０、ｇ２１における標的ｍＲＮＡとのミスマッチは、Ａｇｏ２からのガイド鎖の放出、すなわち、標的ｍＲＮＡによって媒介される非負荷活性を弱めるために決定された。
抗Ｇｒｉｋ２コンストラクトのステム－ループ構造からのループ領域のダイサー切断は、本明細書に開示されるコンストラクトのいくつかについて、Ｕ－Ｇゆらぎ対をＣ－Ｇ対に置き換えることによってステム領域とループ領域との接合部における塩基対合を強固にすることによって改善される。本開示のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化コンストラクトは、前述の改変を活用して、パッセンジャー鎖産生に対するガイドの比の増加を促進し、発作性障害（例えば、ＴＬＥ）の治療のためのＧｒｉｋ２のサイレンシングを改善する。
したがって、本明細書に記載される阻害性ＲＮＡ分子は、Ｅ－ｍｉＲ－３０マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれる抗Ｇｒｉｋ２配列ＧＩ（配列番号１６）及びそれに相補的な配列（例えば、表２（例えば、配列番号１～１５、２２６～２２９及び２３８～２４１）を参照）から合理的に設計されたガイド鎖及びパッセンジャー鎖配列、又はそれに対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含有するステム－ループ配列を含み得る。
したがって、本開示のＧｒｉｋ２標的化アンチセンスコンストラクトは、以下の表３に記載されるガイド鎖（配列番号１６～３０、２３０～２３３及び２４２～２４５）及びパッセンジャー鎖（配列番号３１～４５、２３４～２３７及び２４６～２４９）対を含み得る。
Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれた抗Ｇｒｉｋ２配列Ｇ９（配列番号６３）及びそれに相補的な配列（例えば、表４（例えば、配列番号４６～６２）を参照）から合理的に設計されたガイド鎖及びパッセンジャー鎖配列、又はそれに対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含有するステム－ループ配列を含み得る阻害性ＲＮＡ分子も本明細書に開示される。
したがって、本開示のＧｒｉｋ２標的化アンチセンスコンストラクトは、以下の表５に記載されるガイド鎖（配列番号６３～７９）及びパッセンジャー鎖（配列番号８０～９６）対を含み得る。
本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ分子は、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれた抗Ｇｒｉｋ２配列ＭＷ（配列番号１０９）及びそれに相補的な配列（例えば、表６（例えば、配列番号９７～１０８）を参照）から合理的に設計されたガイド鎖及びパッセンジャー鎖配列、又はそれに対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むステム－ループ配列を含み得る。
したがって、本開示のＧｒｉｋ２標的化アンチセンスコンストラクトは、以下の表７に記載されるガイド鎖（配列番号１０９～１２０）及びパッセンジャー鎖（配列番号１２１～１３２）対を含み得る。
本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ分子は、Ｅ－ｍｉＲ－２１８マイクロＲＮＡスキャフォルドに組み込まれた抗Ｇｒｉｋ２配列ＭＷ（配列番号１０９）及びそれに相補的な配列（例えば、表８（例えば、配列番号１３３～１３８）を参照）から合理的に設計されたガイド鎖及びパッセンジャー鎖配列、又はそれに対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むステム－ループ配列を含み得る。
したがって、本開示のＧｒｉｋ２標的化アンチセンスコンストラクトは、以下の表９に記載されるガイド鎖（配列番号１３９～１４４）及びパッセンジャー鎖（配列番号１４５～１４６）対を含み得る。
前述の配列は、本開示のベクターに組み込むことができるＤＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）配列として表される。これらの配列はまた、細胞内でベクターから合成される対応するＲＮＡ配列として表され得る。当業者は、ウリジンがチミジンで置換されていることを除いて、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書と同じ目的、すなわち、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を阻害するためのポリヌクレオチドの生成に使用することができることを理解するであろう。ＤＮＡベクター（例えば、ＡＡＶ）の場合、アンチセンス核酸を含むポリヌクレオチドはＤＮＡ配列である。ＲＮＡベクターの場合、導入遺伝子カセットは、本明細書に記載のアンチセンスＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物を組み込む。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号３の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１２の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１４の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１４の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１４の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１５の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２２６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２６の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２２７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２２８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２２９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２２９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２３８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２３８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２３８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２３８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２３９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２３９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２３９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２３９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２４０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２４０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２４０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２４０の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２４１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２４１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２４１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２４１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号４６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号４６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４６の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号４７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号４７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号４８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号４８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号４９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号４９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号４９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５０の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５２の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５２の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５２の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５３の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５３の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５３の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５４の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５４の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５４の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５５の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５５の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５５の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５６の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号５９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号５９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号５９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号６０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号６０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６０の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号６１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号６１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号６２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号６２の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６２の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号６２の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号９７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号９７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号９８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号９８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号９９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号９９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号９９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１００の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１００の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１００の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１００の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０２の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０２の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０２の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０２の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０３の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０３の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０３の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０４の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０４の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０４の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０５の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０５の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０５の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０６の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１０８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１０８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１３３の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３３の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３３の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３３の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１３４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３４の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３３の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３４の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１３５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３５の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３５の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３５の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１３６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３６の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１３７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３７の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３７の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３７の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号１３８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１３８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２５８の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５８の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５８の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５８の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２５９の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５９の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５９の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５９の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２６０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２６０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２６０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２６０の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２６１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２６１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２６１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２６１の核酸配列を有し得る。
本開示の阻害性ＲＮＡ配列は、配列番号２５６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。例えば、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５６の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。別の例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５６の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る。更なる例では、阻害性ＲＮＡは、配列番号２５６の核酸配列を有し得る。
ゆらぎ塩基対を有する阻害性ポリヌクレオチド
本開示は、１つ以上のゆらぎ塩基対を有する阻害性ＲＮＡ剤を更に特徴とする。４つの主要なゆらぎ塩基対は、グアニン－ウラシル（Ｇ－Ｕ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－Ｕ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－Ａ）、及びヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－Ｃ）であり、ヒポキサンチンはヌクレオシドイノシンを表す。Ｇ－Ｕゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｃ、Ａ－Ｔ及びＡ－Ｕの熱力学的安定性と同様の熱力学的安定性を示すことが示されている（Ｓａｘｅｎａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８（４５）：４４３１２－９）。
したがって、本開示は、配列番号１６４～１７４のいずれか１つの標的領域の相補体と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する阻害性ＲＮＡ剤を提供する（例えば、阻害性ＲＮＡは、Ｇｒｉｋ２ 遺伝子配列のアンチセンス鎖と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得る）。特に、本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、対応するアラインメントされたヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ転写物（例えば、配列番号１６４～１７４のいずれか１つ）に相補的ではない１、２又は３ヌクレオチドを有し得る。したがって、本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、配列番号１６４～１７４のいずれか１つの標的領域の相補体と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））、少なくとも８６％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））、少なくとも８７％（例えば、少なくとも８７％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））、少なくとも８８％（例えば、少なくとも８８％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））、少なくとも８９％（例えば、少なくとも８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））又は少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を有し得る。アラインメントされたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列の相補配列と１００％同一でないヌクレオチドは、ゆらぎヌクレオチドであり得る。
Ｇｒｉｋ２転写物上の特定の領域に対して設計されたアンチセンスＲＮＡによって媒介されるオフターゲット効果の確率は、任意の数の公的に利用可能なアルゴリズムを使用して測定され得る。例えば、オンラインツールｓｉＳＰＯＴＲ（ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｓｉｓｐｏｔｒ．ｉｃｔｓ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／ｓｉｓｐｏｔｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＿で入手可能な”ｓｉＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ－ｏｆ－Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ”を使用することができる）。
本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤は、ＧｌｕＫ２タンパク質（例えば、配列番号１５１～１６３のいずれか１つを含むＧｌｕＫ２タンパク質、又は配列番号１５１の少なくともアミノ酸１～５０９を含むＧｌｕＫ２タンパク質）をコードするｍＲＮＡを標的とする。ＧｌｕＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１５１～１６３のいずれか１つの配列を有するポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、例えば１つ以上の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の保存的アミノ酸置換）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
Ｇｒｉｋ２タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド
本明細書に開示されるＧｒｉｋ２阻害性ＲＮＡ剤は、例えば、バイオインフォマティクツールを使用することによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの配列を出発点として使用することによって設計され得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ遺伝子番号２８９８に見出され得る。別の例では、配列番号１５１をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１５１の連続するアミノ酸１～５０９をコードするポリヌクレオチド配列、又は配列番号１５１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－１）、配列番号１５２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－２）、配列番号１５３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－３）、配列番号１５４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－４）、配列番号１５５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－５）、配列番号１５６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－６）、配列番号１５７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－７）、配列番号１５８（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１０４７３８．２、配列番号１５９（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０３４４７９．３）、配列番号１６０（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０３４４７９．３）、配列番号１６１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿０１４９９２４８１．１）、配列番号１６２（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＸＰ＿０１４９９２４８３．１）及び配列番号１６３（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０６２１８２．１）のいずれか１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＧｌｕＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする核酸を設計するための基礎として使用することができる。ＧｌｕＫ２受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１６４～１７４のいずれか１つから選択され得る。
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５１のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－１；ＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮグルタミン酸受容体イオノトロピック、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１５１）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５２のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－２；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム２、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＥＳＳＩＷＬＶＰＰＹＨＰＤＴＶ
（配列番号１５２）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－３；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム３、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦ
（配列番号１５３）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５４のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－４；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム４、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１５４）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５５のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－５；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム５、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＡＫＴＫＬＰＱＤＹＶＦＬＰＩＬＥＳＶＳＩＳＴＶＬＳＳＳＰＳＳＳＳＬＳＳＣＳ
（配列番号１５５）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５６のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－６；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム６、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＥＳＳＩＷＬＶＰＰＹＨＰＤＴＶ
（配列番号１５６）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５７のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－７；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム７、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＡＫＴＫＬＰＱＤＹＶＦＬＰＩＬＥＳＶＳＩＳＴＶＬＳＳＳＰＳＳＳＳＬＳＳＣＳ
（配列番号１５７）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５８のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＮＰ＿００１１０４７３８．２；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＭＯＵＳＥアイソフォーム１前駆体、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＳＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＶＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１５８）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１５９のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＮＰ＿０３４４７９．３；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＭＯＵＳＥアイソフォーム２前駆体、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
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（配列番号１５９）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１６０のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＮＰ＿００１３４５７９５．２；グルタミン酸受容体イオノトロピックのＧＲＩＫ２＿ＭＯＵＳＥアイソフォーム１前駆体、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＳＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＶＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１６０）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１６１のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＸＰ＿０１４９９２４８１．１；ＧＲＩＫ２＿ＲＨＥＳＵＳ ＭＡＣＡＱＵＥアイソフォームＸ１、グルタミン酸受容体イオノトロピック、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
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（配列番号１６１）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１６２のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよく、これを以下に示す（ＸＰ＿０１４９９２４８３．１；ＧＲＩＫ２＿ＲＨＥＳＵＳ ＭＡＣＡＱＵＥアイソフォームＸ１、グルタミン酸受容体イオノトロピック、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１６２）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１６３のアミノ酸配列、又は配列番号１６３のアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であり得て、これは、以下に示される（ＮＰ＿０６２１８２．１；ＧＲＩＫ２＿ＲＡＴグルタミン酸受容体イオノトロピック前駆体、カイニン酸２）：
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＶＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＶＬＬＡＣＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＲＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１６３）
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、配列番号１６４の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１６４の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２１９５６．１：４５９２ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１６５の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１６５の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２１９５６．４：２９４－３０２０ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１６６の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１６６の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７５７６８．３：２９４－２９０３ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体２、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１６７の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１６７の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１６６２４７．１：２９４－２９７２ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体３、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、以下に示すように、配列番号１６８の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１６８の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１１１２６８．２マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体４、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１６９の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１６９の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１０３４９．４マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体５、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１７０の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１７０の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１３５８８６６マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体６、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１７１の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１７１の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿０１５１３６９９５．２アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体７、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１７２の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１７２の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿０１５１３６９９７．２アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写変異体Ｘ１、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、配列番号１７３の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１７３の核酸配列（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１９３０９．２ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）グルタミン酸イオノトロピック型受容体カイニン酸タイプサブユニット２（ＧＲＩＫ２）、ｍＲＮＡ）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
追加的又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、成熟ＧｌｕＫ２ペプチドコード配列に対応し、配列番号１７４の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１７４の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含む。
開示された方法及び組成物によれば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、５’ＵＴＲ、例えば配列番号１７５の核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる５’ＵＴＲ、又は配列番号１７５の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含み得る。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡはまた、表１０に示されるように、配列番号１７６の核酸配列を有するポリヌクレオチド又は配列番号１７６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体によってコードされる３’ＵＴＲ等の３’ＵＴＲを含み得る。
更に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表１０に示されるように、Ｇｒｉｋ２シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１７７の核酸配列によってコードされるシグナルペプチド配列、又は配列番号１７７の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含み得る。
更に、本開示の阻害性ポリヌクレオチドは、以下の表１０に記載されるＧｒｉｋ２転写物（配列番号１７７～１９３に対応する）のエクソン１～１６のいずれか１つの中で結合することができる。
核酸ベクター
本明細書に開示される核酸作用物質の有効な細胞内濃度は、作用物質をコードするポリヌクレオチド（例えば、哺乳動物細胞の核又はミトコンドリアゲノムへの組み込みによって）の安定な発現によって達成することができる。核酸は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤）である。そのような外因性核酸を哺乳動物細胞に導入するために、薬剤のポリヌクレオチド配列をベクターに組み込むことができる。ベクターは、形質転換、トランスフェクション、直接的な取り込み、粒子衝撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、及びリポソームへのベクターの封入を含む様々な方法によって細胞に導入することができる。細胞をトランスフェクト又は形質転換する適切な方法の例は、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション及び直接取り込みである。このような方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１４））；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１５））に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される薬剤は、かかる薬剤をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞膜リン脂質に標的化することによって哺乳動物細胞に導入することもできる。例えば、ベクター分子を、全ての細胞膜リン脂質に対する親和性を有するウイルスタンパク質であるＶＳＶ－Ｇタンパク質に連結することによって、ベクターを細胞膜の細胞外表面のリン脂質に標的化することができる。そのようなコンストラクトは、当技術分野の従来の日常的な方法を使用して製造することができる。
高い転写率及び翻訳率を達成することに加えて、哺乳動物細胞における外因性ポリヌクレオチドの安定な発現は、遺伝子を含有するポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核ゲノムに組み込むことによって達成することができる。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの哺乳動物細胞の核ＤＮＡへの送達及び組込みのための様々なベクターが開発されている。発現ベクターの例は、例えば国際公開第１９９４／０１１０２６号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される組成物及び方法において使用するための発現ベクターは、Ｇｒｉｋ２標的化阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチド配列、同様にまた、例えば、これらの作用因の発現及び／又はこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳動物細胞のゲノムへのインテグレーションのために使用される追加の配列エレメントを含有する。使用することができる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター領域及びエンハンサー領域等の調節配列を含むプラスミドが含まれる。他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、又は遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性又は核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、発現ベクター上に担持される遺伝子の効率的な転写を指示するために、例えば、５’及び３’ＵＴＲ領域、ＩＲＥＳ、並びにポリアデニル化シグナル配列部位が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。適切なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ノウルセオトリシン等の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。
調節配列
本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤は、治療上の利益を誘発するのに十分に高いレベルで発現され得る。したがって、ポリヌクレオチド発現は、開示される阻害性ＲＮＡ剤の堅牢な発現を駆動することができるプロモーター配列によって媒介され得る。本明細書に開示される方法及び組成物によれば、プロモーターは異種プロモーターであり得る。本明細書で使用される場合、「異種プロモーター」という用語は、自然状態で所与のコード配列に作動可能に連結されていることが見出されないプロモーターを指す。有用な異種対照配列には、一般に、哺乳動物又はウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。
異種プロモーター及び他の制御エレメント（ＣＮＳ特異的及び誘導性プロモーター、エンハンサー等）の両方を使用することができる。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）に由来していてもよく、又は異なる天然に存在するプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されていてもよい。あるいは、プロモーターは、合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織若しくは細胞型において、又は異なる発生段階において、又は異なる環境条件若しくは薬物若しくは転写補助因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指示する。様々なプロモーター、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生段階特異的プロモーター及び条件的プロモーター、例えば、薬物応答性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）がこの技術分野では広く知られている。
哺乳動物系では、３種類のプロモーターが存在し、発現ベクターの構築の候補である。（ｉ）大きなリボソームＲＮＡの転写を制御するＰｏｌ Ｉプロモーター；（ｉｉ）ｍＲＮＡ（タンパク質に翻訳される）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）及び内因性マイクロＲＮＡ（例えば、プレ－ｍＲＮＡのイントロンから）の転写を制御するＰｏｌ ＩＩプロモーター；（ｉｉｉ）及び小さな非コードＲＮＡをユニークに転写するＰｏｌ ＩＩＩプロモーター。それぞれが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡの発現のためのコンストラクトを設計するときに考慮すべき利点及び制約を有する。例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡ鋳型から阻害性ＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）を合成するのに有用である。組織特異的発現に対するより大きな制御のために、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターを使用することができる（例えば、ｍｉＲＮＡの転写のため）。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターを使用する場合、ＲＮＡがｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとして機能し、ｉｎ ｖｉｖｏでペプチドに翻訳されないように、翻訳開始シグナルを省略することができる。
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適したポリヌクレオチドには、哺乳動物調節配列、例えばプロモーター配列及び任意にエンハンサー配列の制御下でＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ剤をコードするものも含まれる。哺乳動物細胞における開示される阻害性ＲＮＡ剤の発現に有用な例示的なプロモーターには、細胞型特異的プロモーターが含まれる。例えば、Ｇｒｉｋ２阻害性ＲＮＡ剤のニューロン特異的発現は、ニューロン特異的プロモーター、例えばヒトシナプシン１（ｈＳｙｎ）プロモーター又はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターを使用して付与することができる。ｈＳｙｎ及びＣａＭＫＩＩプロモーターの変異体は、Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：８７２－８２（２００７）及びＳａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２５）：１４９３２－７（１９９０）に記載されており、これらの開示は、特定のｈＳｙｎ及びＣａＭＫＩＩプロモーター配列に関するので、参照により本明細書に組み込まれる。サイトメガロウイルスのエンハンサー（例えば、ＣＡＧ又はＣＢＡ）、Ｕ６、Ｈ１又は７ＳＫプロモーターを含有する構成的プロモーターもまた、代わりに使用され得る。これらのプロモーターの配列は当技術分野で公知である（これらのプロモーターの配列は、例えば、国際公開第２０２２／０１１２６２号にも開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
特定の例では、本開示の発現ベクターは、ＳＹＮプロモーター（例えば、ヒトＳＹＮプロモーター（ｈＳｙｎ）等、例えば、配列番号１９４～１９８のいずれか１つ、又は配列番号１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含む。別の例では、本開示の発現ベクターは、ＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号１９９～２０４のいずれか１つ、又は配列番号９９～２０４のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）を含む。
発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）と共に使用するのに適した例示的なプロモーター配列を以下の表１１に提供する。
特定の例では、本開示のウイルスベクターは、ニューロン特異的プロモーター配列を組み込む。特定の例では、ニューロン特異的プロモーターは、ヒトＳｙｎ（ｈＳｙｎ）プロモーター、例えば配列番号：１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列を有するヒトＳｙｎプロモーター、又は配列番号１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
別の例では、ニューロン特異的プロモーターは、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列、例えば配列番号：１９９～２０４のいずれか１つのＣａＭＫＩＩプロモーター、又は配列番号１９９～２０４のいずれか１つの核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
追加のＣａＭＫＩＩプロモーターには、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３５（１）：３７－４４，２００７）に記載されているヒトアルファＣａＭＫＩＩプロモーター配列が含まれ得て、この開示は、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列に関するものとしてその全体が本明細書に組み込まれる。
開示される阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチドが哺乳動物細胞の核ＤＮＡに組み込まれると、このポリヌクレオチドの転写は、当技術分野で公知の方法によって誘導することができる。例えば、発現は、転写因子及び／又はＲＮＡポリメラーゼの哺乳動物プロモーターへの結合を調節し、したがって遺伝子発現を調節する薬剤等の外部化学試薬に哺乳動物細胞を曝露することによって誘導することができる。化学試薬は、例えばプロモーターに結合したリプレッサータンパク質を除去することによって、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写因子の哺乳動物プロモーターへの結合を促進するのに役立ち得る。あるいは、化学試薬は、化学試薬の存在下でプロモーターの下流に位置する遺伝子の転写速度が増加するように、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写因子に対する哺乳動物プロモーターの親和性を高めるのに役立ち得る。上記の機構によってポリヌクレオチド転写を増強する化学試薬の例は、テトラサイクリン及びドキシサイクリンである。これらの試薬は市販されており（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）、確立されたプロトコルに従って遺伝子発現を促進するために哺乳動物細胞に投与することができる。
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドに含まれ得る他のＤＮＡ配列エレメントは、エンハンサー配列である。エンハンサーは、ＤＮＡが転写開始部位での転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合に有利な三次元配向をとるように、目的の遺伝子を含有するポリヌクレオチドの立体構造変化を誘導する別のクラスの調節エレメントを表す。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法において使用するためのポリヌクレオチドには、Ｇｒｉｋ２標的化阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチドが含まれ、加えて、哺乳動物エンハンサー配列が含まれる。現在、多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から知られており、例は、哺乳動物グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン及びインスリンをコードする遺伝子からのエンハンサーである。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのエンハンサーには、真核細胞に感染することができるウイルスの遺伝物質に由来するものも含まれる。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。真核生物遺伝子転写の活性化を誘導する追加のエンハンサー配列は、Ｙａｎｉｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７（１９８２）に開示されている。エンハンサーは、本開示のアンチセンスコンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに、例えばこの遺伝子の５’又は３’の位置でスプライシングされ得る。特定の配向では、エンハンサーはプロモーターの５’側に配置され、プロモーターは本開示の阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチドに対して５’側に位置する。エンハンサー配列の非限定的な例を以下の表１２に示す。
本明細書に記載される組成物及び方法において使用するためのポリヌクレオチドに含まれ得る追加の調節エレメントは、イントロン配列である。イントロン配列は、ＲＮＡスプライシング中に除去されて成熟ｍＲＮＡ産物を産生するプレｍＲＮＡに見られる非タンパク質コードＲＮＡ配列である。イントロン配列は、他の非コードＲＮＡ分子を産生するために更にプロセシングされ得るという点で、遺伝子発現の調節に重要である。選択的スプライシング、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構及びｍＲＮＡ搬出は、イントロン配列によって調節されることが示されている生物学的プロセスである。イントロン配列はまた、イントロン媒介性増強を介して導入遺伝子の発現を促進し得る。イントロン配列の非限定的な例を以下の表１２に示す。
本開示のベクターと併せて使用され得る更なる調節エレメントとしては、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が挙げられる。ＩＴＲ配列は、例えば、それぞれが典型的には約１４５塩基対を含む５’及び３’末端のＡＡＶゲノムに見られる。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶベクターが細胞に組み込まれると相補鎖合成を促進することによってＡＡＶゲノム多重化に特に重要である。更に、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込み及びＡＡＶゲノムのカプセル化に重要であることが示されている。ＩＴＲ配列の非限定的な例を以下の表１２に示す。
本開示のベクターへの組み込みに適した追加の調節エレメントとしては、ポリアデニル化配列（すなわち、ポリＡ配列）が挙げられる。ポリＡ配列は、一続きのアデニン塩基を含むＲＮＡ尾部である。これらの配列をＲＮＡ分子の３’末端に付加して、成熟ｍＲＮＡ転写物を生成する。ｍＲＮＡのプロセシング及び輸送に関連するいくつかの生物学的プロセスは、核外輸送、翻訳及び安定性を含むポリＡ配列によって調節される。哺乳動物細胞では、ポリＡテールの短縮は、ｍＲＮＡ分解の可能性の増加をもたらす。ポリＡ配列の非限定的な例を以下の表１２に提供する。
他の例では、本開示のウイルスベクターは、本開示のアンチセンスコンストラクトの発現を促進することができる１つ以上の調節配列エレメントを組み込む。一例では、調節配列エレメントはイントロン配列である。例えば、本開示のベクターに含めるのに適したイントロン配列は、キメライントロン、配列番号２０５の核酸配列を有するキメライントロン、又は配列番号２０５の核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
別の例では、イントロン配列は、免疫グロブリン重鎖可変４（ＶＨ４）イントロン、例えば、配列番号２０６の核酸配列を有するＶＨ４配列、又は配列番号２０６の核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
いくつかの実施形態では、５’から３’に、ベクターは以下を含む：（ａ）第１のプロモーター配列、（ｂ）イントロン配列、（ｃ）ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド、（ｄ）任意に第２のプロモーター配列、及び（ｅ）任意に、ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド。
別の例では、調節配列エレメントはエンハンサー配列である。例えば、エンハンサー配列は、ＣＭＶエンハンサー、例えば配列番号２０７の核酸配列を有するＣＭＶエンハンサー、又は配列番号２０７の核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
いくつかの実施形態では、５’から３’に、ベクターは以下を含む：（ａ）エンハンサー配列、（ｂ）第１のプロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド、（ｅ）任意に、第２のプロモーター配列、及び（ｆ）任意に、ステム－ループ配列を含む第２のポリヌクレオチド。
別の例では、調節配列エレメントは、例えばＡＡＶ ＩＴＲ配列等のＩＴＲ配列である。例えば、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ配列、例えば配列番号２０８の核酸配列を有するＡＡＶ ５’ ＩＴＲ配列、又は配列番号２０８若しくは配列番号２０９の核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
別の例では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ３’ＩＴＲ配列、例えば配列番号２１０～２１２のいずれか１つの核酸配列を有するＡＡＶ ３’ ＩＴＲ、又は配列番号２１０～２１２のいずれか１つの核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。
いくつかの実施形態では、５’から３’に、ベクターは以下を含む：（ａ）５’ＩＴＲ配列、（ｂ）任意に、エンハンサー配列、（ｃ）第１のプロモーター配列、（ｄ）任意に、イントロン配列、（ｅ）ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド、（ｆ）任意に、第２のプロモーター配列、（ｇ）任意に、ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド、及び（ｈ）３’ＩＴＲ配列。
別の例では、調節配列エレメントは、ポリアデニル化シグナル配列（すなわち、ポリＡテール）である。例えば、本明細書に開示されるベクターと共に使用するのに適したポリアデニル化シグナル配列には、ウサギβ－グロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列、例えば配列番号２１３～２１５のいずれか１つの核酸配列を有するＲＢＧポリアデニル化シグナル配列、又は配列番号２１３～２１５のいずれか１つの核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。開示される組成物及び方法と併せて使用することができる別のポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、例えば配列番号２１６のＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、又は配列番号２１６の核酸配列に少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体である。いくつかの実施形態では、５’から３’に、ベクターは以下を含む：（ａ）５’ＩＴＲ配列、（ｂ）任意に、エンハンサー配列、（ｃ）第１のプロモーター配列、（ｄ）任意に、イントロン配列、（ｅ）ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド、（ｆ）任意に、第２のプロモーター配列、（ｇ）任意に、ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチド、（ｈ）ポリアデニル化シグナル配列、例えばＲＢＧポリアデニル化シグナル配列、及び（ｉ）３’ＩＴＲ配列。
ウイルスベクター
ウイルスゲノムは、哺乳動物細胞への外因性ポリヌクレオチドの効率的な送達のために使用することができるベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドが一般化又は特殊化された形質導入によって哺乳動物細胞の核ゲノムに典型的に組み込まれるので、遺伝子送達のための特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質や試薬を必要としない。ウイルスベクターの例は、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、レトロウイルス（例えば、レトロウイルス科ウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしか及びセンダイ）等のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルス等のプラス鎖ＲＮＡウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）及びカナリア痘（ｃａｎａｒｙｐｏｘ））を含む二本鎖ＤＮＡウイルスである。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト泡沫状ウイルス及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプーマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９６）））である。その他の例としては、ネズミ白血病ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、鳥白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ギボン類人猿白血病ウイルス、メイソン・ファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、ＭｃＶｅｙ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第５，８０１，０３０号）に記載されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶベクター
本明細書に記載される組成物の核酸は、例えば本明細書に開示される方法に関連して、細胞へのそれらの導入を容易にするためにＡＡＶベクター及び／又はビリオンに組み込まれ得る。ＡＡＶベクターは中枢神経系で使用することができ、適切なプロモーター及び血清型は、例えば、Ｐｉｇｎａｔａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １２５（３）：５７５－８９（２０１７）に記載されており、その開示は、ＣＮＳ遺伝子治療に有用なプロモーター及びＡＡＶ血清型に関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法において有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現される異種配列（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチド）及び（２）異種遺伝子の組み込み及び発現を促進するウイルス配列を含む組換え核酸コンストラクトである。ウイルス配列は、ＤＮＡの複製及びビリオンへのパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにシスにおいて必要とされるＡＡＶの配列を含み得る。そのようなｒＡＡＶベクターはまた、マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含有し得る。有用なｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶ ＷＴ遺伝子が全体的又は部分的に欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持している。ＡＡＶ ＩＴＲは、特定の用途に適した任意の血清型であり得る。ｒＡＡＶベクターを使用するための方法は、例えば、Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）、及びＭｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４（２０００）に記載され、これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の核酸剤を組み込むためのベクターとして使用することができるＡＡＶ（例えば、阻害性ＲＮＡ配列（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つ））の例としては、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６が挙げられる。
本明細書に記載の核酸及びベクターは、細胞への核酸又はベクターの導入を容易にするために、ｒＡＡＶビリオンに組み込むことができる。ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ビリオンの外部の非核酸部分を構成し、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンアセンブリに必要とされる３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号に記載されている。米国特許第５，１３９，９４１号；米国特許第５，８６３，５４１号；米国特許第５，８６９，３０５号；米国特許第６，０５７，１５２号；及び米国特許第６，３７６，２３７号；同様にまた、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）に記載され手織り、これらのそれぞれの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なｒＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及びｒｈ７４を含む様々なＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる。中枢神経系に位置する又は中枢神経系に送達される細胞を標的化するために、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０が特に有用であり得る。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９（２０００）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３４２８（２０００）；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５（２００１）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載され、その各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するものとして、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて、偽型ｒＡＡＶベクターも有用である。偽型ベクターには、所与の血清型以外の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６）に由来するキャプシド遺伝子で偽型化された所与の血清型のＡＡＶベクターが含まれる。例えば、ＡＡＶは、偽型組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、例えばｒＡＡＶ２／８又はｒＡＡＶ２／９ベクターを含み得る。偽型ｒＡＡＶを作製及び使用するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
ビリオンキャプシド内に変異を有するＡＡＶビリオンは、非変異キャプシドビリオンよりも効果的に特定の細胞型に感染するために使用され得る。例えば、適切なＡＡＶ変異体は、特定の細胞型へのＡＡＶの標的化を促進するためのリガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶキャプシド変異体の構築及び特徴付けは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５（２０００）に記載される。本明細書に記載される方法において使用され得る他のｒＡＡＶビリオンには、ウイルスの分子育種及びエキソンシャッフリングによって作製されるキャプシドハイブリッドが含まれる。例えば、Ｓｏｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６（２０００）ａｎｄ Ｋｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３（２００１）を参照されたい。
本開示の組成物及び方法で使用されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶＤＪ８から選択されるＡＡＶキャプシド血清型由来のキャプシドタンパク質、又はその誘導体、改変、若しくは偽型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８若しくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のｖｐ１、ｖｐ２及び／又はｖｐ３と例えば少なくとも８０％以上同一である、例えば８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上、すなわち例えば最大１００％同一であるキャプシドタンパク質等を含み得る。
本明細書に記載の方法で使用することができるＡＡＶベクターは、参照によりその全体が組み込まれるＺｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５：１０５６－１０６８に記載されているように、Ａｎｃ８０又はＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、以下のアミノ酸挿入の１つを含み得る：米国特許第９，１９３，９５６号；米国特許第９４５８５１７号；及び米国特許第９，５８７，２８２号；並びに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載される、ＬＧＥＴＴＲＰ（’９５６、’５１７、’２８２、又は’３２３の配列番号１４）又はＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（’９５６、’５１７、’２８２、又は’３２３の配列番号１５）。あるいは、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号；同第９，５８７，２８２、及び米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載されているように、ＡＡＶ．７ｍ８であり得る。更にまた、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂベクター等の米国特許第９，５８５，９７１号に開示されている任意のＡＡＶであり得る。本明細書に記載の方法で使用される別のＡＡＶベクターは、アミノ酸位置５８８と５８９との間に挿入されたペプチド及び修飾Ａ５８７Ｄ／５８８Ｇを有するＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ等のＣｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（８）：１１７２－１１７９，２０１７）に開示されている任意のベクターであり得る。更に、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、米国特許第９，８４０，７１９号及び国際公開第２０１５／０１３３１３号に開示されている任意のＡＡＶ、例えばＡＡＶ．Ｒｈ７４又はＲＨＭ ４－１ベクターであってもよく（その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。更に、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．７４等の、国際公開第２０１４／１７２６６９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶであってもよい。本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターはまた、それぞれその全体が参照により組み込まれる、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０に記載されるＡＡＶ２／５ベクターであってもよい。更なる例では、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡＡＶ２ｔＹＦベクター等の、国際公開第２０１７／０７０４９１号に開示されている任意のＡＡＶであってもよい。更に、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、その全体が参照により組み込まれるＰｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８に記載されるＡＡＶＬＫ０３又はＡＡＶ３Ｂであってもよい。追加の例では、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、米国特許第８，６２８，９６６号、米国特許第８，９２７，５１４号；米国特許第９，９２３，１２０号及び国際公開第２０１６／０４９２３０号（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶ、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５又はＨＳＣ１６であってもよい。
更に、本明細書に記載の方法で使用されるＡＡＶベクターは、以下の特許及び特許出願のいずれかに開示されているＡＡＶベクターであり得、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許第７，２８２，１９９号；同第７，９０６，１１１号；同第８，５２４，４４６号；同第８，９９９，６７８号；同第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第８，７３４，８０９号；米国特許第９，２８４，３５７号；同第９，４０９，９５３号；同第９，１６９，２９９号；同第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；同第２０１５／０１２６５８８号；同第２０１７／００６７９０８号；同第２０１３／０２２４８３６号；同第２０１６／０２１５０２４号；同第２０１７／００５１２５７号；並びに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。ｒＡＡＶベクターは、以下の特許及び特許出願のいずれかに開示されているＡＡＶキャプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／又はｖｐ３アミノ酸配列と少なくとも８０％又はそれを超える同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれを超える同一性（例えば、１００％）を有するキャプシドタンパク質を有し得て、その各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる；米国特許第７，２８２，１９９号；同第７，９０６，１１１号；同第８，５２４，４４６号；同第８，９９９，６７８号；同第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第８，７３４，８０９号；米国特許第９，２８４，３５７号；同第９，４０９，９５３号；同第９，１６９，２９９号；同第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；同第２０１５／０１２６５８８号；同第２０１７／００６７９０８号；同第２０１３／０２２４８３６号；同第２０１６／０２１５０２４号；同第２０１７／００５１２５７；及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
更に、ｒＡＡＶベクターは、国際出願公開の国際公開第２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１の配列番号２を参照）、国際公開第２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１の配列番号１２３及び８８を参照）、国際公開第０３／０４２３９７号（例えば、’３９７の配列番号２、８１、８５及び９７を参照）、国際公開第２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８の配列番号１及び３～６を参照）、国際公開第２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９の配列番号５～３８を参照）、国際公開第２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照）、国際公開第２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７の配列番号５～３８を参照）、国際公開第２０１５／１９１５０８号（例えば、’０５８の配列番号８０～２９４を参照）及び米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４の配列番号１、５～１０を参照）（それらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるキャプシドタンパク質を有し得て、例えば、国際出願公開の国際公開第２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１の配列番号２を参照）、国際公開第２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１の配列番号１２３及び８８を参照）、国際公開第０３／０４２３９７号（例えば、’３９７の配列番号２、８１、８５及び９７を参照）、国際公開第２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８の配列番号１及び３～６を参照）、国際公開第２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９の配列番号５～３８を参照）、国際公開第２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照）、国際公開第２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７の配列番号５～３８を参照）、国際公開第２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８の配列番号８０～２９４を参照）、及び米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４の配列番号１、５～１０を参照）に開示されるＡＡＶキャプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／又はｖｐ３アミノ酸配列と少なくとも８０％以上、例えば８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上（例えば、１００％）同一であるキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶベクターであり得る。
ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列並びに組換えＡＡＶ及びＡＡＶキャプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９号；同第７，９０６，１１１号；同第８，５２４，４４６号；同第８，９９９，６７８号；同第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第８，７３４，８０９号；同第９，２８４，３５７号；同第 ９，４０９，９５３号；同第９，１６９，２９９号；同第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；同第２０１５／０１２６５８８号；同第２０１７／００６７９０８号；同第２０１３／０２２４８３６号；同第２０１６／０２１５０２４号；同第２０１７／００５１２５７号；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号；国際公開第２００３／０５２０５１号、同第２００５／０３３３２１号、同第０３／０４２３９７号、同第２００６／０６８８８８号、同第２００６／１１０６８９号、同第２００９／１０４９６４号、同第２０１０／１２７０９７号及び同第２０１５／１９１５０８、並びに米国特許出願公開第公開第２０１５００２３９２４号において教示されている。
したがって、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のＡＡＶキャプシド血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からのキャプシドタンパク質を含有するキャプシドを含み得る。
一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターは、開示された方法及び組成物と共に使用することができる。あるいは、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２，ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４；並びに米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
限定されないが、ニューロン及び／又はグリア細胞を含む中枢神経系の細胞に対する親和性を有する組換えＡＡＶベクターは、本開示のポリヌクレオチド剤（例えば、阻害性ＲＮＡ剤）を送達するために使用することができる。そのようなベクターには、非複製「ｒＡＡＶ」ベクター、特にＡＡＶ５、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ１０キャプシドを有するものが含まれ得る。ＡＡＶ変異体キャプシドを使用することができ、限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９０６，１１１号のＷｉｌｓｏｎによって特に好ましいと記載されるＡＡＶ／ｈｕ．３１及びＡＡＶ／ｈｕ．３２、また同様に、米国特許第８，６２８，９６６号、米国特許第８，９２７，５１４号及びＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２：１６２５－１６３４（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されているＡＡＶ変異体キャプシドが挙げられる。更に、天然のＡＡＶ２分離株の間で保存されているアミノ酸配列を組み込んだ、Ｔｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒａｉｎ １４１：２０１４－３１，２０１８；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって開示されたＡＡＶ－ＴＴベクターもまた、本開示の組成物及び方法と共に使用することができる。ＡＡＶ－ＴＴ変異体キャプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０と比較して、ＣＮＳ全体にわたって増強された向神経性及び強い分布を示す。同様に、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（２）：ｅ０１８８８３０，２０１７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているＡＡＶ－ＤＪ８ベクターは、優れた神経向性を示し、本開示の組成物及び方法での使用に適し得る。
特定の例では、本開示は、（ｉ）制御エレメントの制御下にあり、ＩＴＲに隣接する阻害性ＲＮＡ配列（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット；及び（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、又はＡＡＶ９キャプシドの生物学的機能を保持しながらＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．９％同一であるウイルスキャプシドを含む人工ゲノムを含むＡＡＶ９ベクターを特徴とするコードされたＡＡＶ９キャプシドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９０６，１１１号に記載の配列番号１１６の配列を有し得て、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸置換を有し、ＡＡＶ９キャプシドの生物学的機能を保持する。
（ｉ）調節エレメントの制御下にあるポリヌクレオチドを含有し、ＩＴＲに隣接する発現カセット；（ｉｉ）ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、又はＡＡＶｒｈ１０キャプシドの生物学的機能を保持しながらＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．９％同一であるウイルスキャプシドを含む人工ゲノムを含むＡＡＶｒｈ１０ベクターも本明細書で提供されるコードされたＡＡＶｒｈ１０キャプシドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，４２７号に記載される配列番号８１の配列を有し得て、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸置換を有し、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドの生物学的機能を保持する。
遺伝子調節エレメントは、哺乳動物細胞（例えば、ニューロン）において機能的であるように選択され得る。作動可能に連結された成分を含む得られたコンストラクトは、（５’及び３’）機能的ＡＡＶＩＴＲ配列に隣接する。特定の例としては、哺乳動物ＣＮＳの細胞、特にニューロンに対する指向性及び高い形質導入効率を有するＡＡＶ血清型に由来するベクターが挙げられる。異なる血清型の形質導入効率の総説及び比較を本特許出願で提供する。特定の例では、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０ベースのベクターは、例えばニューロン及び／又はグリア細胞を形質導入することによって、ＣＮＳにおけるポリヌクレオチドの長期発現を指示する。
ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチド）を保有するＡＡＶ発現ベクターは、主要ＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」を切り取ったＡＡＶゲノムに選択された配列を直接挿入することによって構築することができる。ＩＴＲの十分な部分が複製及びパッケージング機能を可能にするために残っている限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失させることができる。そのようなコンストラクトは、当技術分野で周知の技術を使用して設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び同第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）及び国際公開第９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）を参照されたい。あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノム又はそれを含有するＡＡＶベクターから切り取られ、標準的な核酸ライゲーション技術を使用して別のベクター中に存在する選択された核酸コンストラクトの５’及び３’末端に融合され得る。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターがそこに記載されており、これらは受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５及び５３２２６でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 「ＡＴＣＣ」から入手可能である。更に、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列に対して５’及び３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように合成的に作製することができる。哺乳動物ＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のための好ましいコドンを使用することができ、ある場合には、ポリヌクレオチドのコドン最適化を周知の方法によって行うことができる。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複ポリヌクレオチドから組み立てられる。ＡＡＶビリオンを産生するために、公知の技術を使用して、例えばトランスフェクションによって、ＡＡＶ発現ベクターを適切な宿主細胞に導入する。多数のトランスフェクション技術が当技術分野で一般的に知られている。特に適切なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、及び高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達が含まれる。
例えば、本開示の特定のウイルスベクターは、本開示の核酸配列（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つ）に加えて、ＡＡＶ２ウイルスに由来するＩＴＲを有するＡＡＶベクタープラスミドの骨格、プロモーター、例えば野生型又は変異型形態のＷＰＲＥを有する又は有さないｈＳｙｎプロモーター及び／又はＣａＭＫＩＩプロモーター等のニューロンプロモーター、並びにウサギベータグロビンポリＡ配列を含み得る（表１１及び表１２参照）。所望であれば、ｈＳｙｎプロモーター及びＣａＭＫＩＩプロモーターは、本明細書に記載されるコンストラクトにおいて、サイトメガロウイルスのエンハンサー（例えば、ＣＡＧ又はＣＢＡ）、Ｕ６、Ｈ１又は７ＳＫプロモーターを含有する構成的プロモーターで置き換えられ得る。
本開示は更に、（ｉ）制御エレメントの制御下にあり、ＩＴＲに隣接するポリヌクレオチドを含有する発現カセット、及び（ｉｉ）ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶであって、ポリヌクレオチドが、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１６４～１９３に記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの部分又は領域のいずれか１つ）の少なくとも一部又は領域に特異的に結合し、細胞（例えば、ニューロン）中のＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害する（例えば、ノックダウン）阻害性ＲＮＡ（例えば、ＡＳＯ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ、特に、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有する阻害性ＲＮＡ、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）をコードするｒＡＡＶに関する。
ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）及びｈＳｙｎプロモーターを含み得る。例えば、ＡＡＶベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、並びにｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列を有するｈＳｙｎプロモーター、又は配列番号１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）を含み得る。
あるいは、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）配列及びＣａＭＫＩＩプロモーターを含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、並びにＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号１９９～２０４のいずれか１つの核酸配列を有するＣａＭＫＩＩプロモーター、又は配列番号１９９～２０４のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号４、１９、３４、１３５、１４１、１４７、及び２５８のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号４、１９、３４、１３５、１４１、１４７、及び２５８のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含み得る。
レトロウイルスベクター
本明細書に記載の方法及び組成物で使用される送達ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。本明細書に記載される方法及び組成物において使用され得るレトロウイルスベクターの１つのタイプは、レンチウイルスベクターである。レトロウイルスのサブセットであるレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、広範囲の分裂細胞型及び非分裂細胞型を高効率で形質導入し、ポリヌクレオチドの安定な長期発現をもたらす。ＬＶをパッケージング及び形質導入するための最適化戦略の概要は、Ｄｅｌｅｎｄａ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：Ｓ１２５（２００４）に提供され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
レンチウイルスに基づく遺伝子導入技術の使用は、目的のポリヌクレオチドが収容されている高度に欠失したウイルスゲノムを有する組換えレンチウイルス粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に依存する。特に、組換えレンチウイルスは、（１）パッケージングコンストラクト、すなわちＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体をＲｅｖと一緒に発現するベクター（あるいはトランスで発現）；（２）一般に異種の性質のエンベロープ受容体を発現するベクター；並びに（３）全てのオープンリーディングフレームを欠いているが、複製、キャプシド挿入及び発現に必要な配列を維持しており、発現される配列が挿入されているウイルスｃＤＮＡからなるトランスファーベクターの許容細胞株におけるトランス共発現によって回収される。
本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるＬＶは、１つ以上の５’－長末端反復配列（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶＰｓｉシグナル５’－スプライス部位（ＳＤ）、δ－ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）、３’－スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１－αプロモーター及び３’－自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ－ＬＴＲ）を含み得る。レンチウイルスベクターは、任意に、米国特許第６，１３６，５９７号に記載されているように、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ：ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、その開示は、ＷＰＲＥに関するものとして参照により本明細書に組み込まれる。レンチウイルスベクターは、ｐＨＲ’骨格を更に含み得、これは、例えば以下に提供されるようなものを含み得る。
Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：９６３（２００４）に記載されているＬｅｎｔｉｇｅｎ ＬＶを使用して、ＤＮＡ分子を発現させ、及び／又は細胞を形質導入することができる。本明細書に記載される方法及び組成物において使用されるＬＶは、５’－長末端反復配列（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶＰｓｉシグナル５’－スプライス部位（ＳＤ）、デルタ－ＧＡＧエレメント、Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）、３’－スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１－アルファプロモーター及び３’－自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ－ＬＴＲ）であり得る。任意に、１つ以上のこれらの領域は、同様の機能を実行する別の領域で置換される。
エンハンサーエレメントを使用して、修飾ＤＮＡ分子の発現を増加させるか、又はレンチウイルス組込み効率を増加させることができる。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるＬＶは、ｎｅｆ配列を含み得る。本明細書に記載される方法及び組成物において使用されるＬＶは、ベクター組み込みを増強するｃＰＰＴ配列を含み得る。ｃＰＰＴは、（＋）鎖ＤＮＡ合成の第２の起点として作用し、その天然のＨＩＶゲノムの中央に部分的な鎖重複を導入する。トランスファーベクター骨格へのｃＰＰＴ配列の導入は、核輸送及び標的細胞のＤＮＡに組み込まれたゲノムの総量を強く増加させた。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるＬＶは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み得る。ＷＰＲＥは、転写産物の核外輸送を促進することによって、及び／又は新生転写産物のポリアデニル化の効率を高めることによって転写レベルで作用し、したがって細胞中のｍＲＮＡの総量を増加させる。ＬＶへのＷＰＲＥの添加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、いくつかの異なるプロモーターからのポリヌクレオチド発現レベルの実質的な改善をもたらす。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるＬＶは、ｃＰＰＴ配列及びＷＰＲＥ配列の両方を含み得る。ベクターはまた、単一のプロモーターからの複数のポリペプチドの発現を可能にするＩＲＥＳ配列を含み得る。
ＩＲＥＳ配列に加えて、複数のポリヌクレオチドの発現を可能にする他のエレメントが有用である。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるベクターは、２つ以上のポリヌクレオチドの発現を可能にする複数のプロモーターを含み得る。将来的に同定される複数のポリヌクレオチドの発現を可能にする他のエレメントは有用であり、本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適したベクターにおいて利用され得る。本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるベクターは、臨床グレードのベクターであり得る。
したがって、レトロウイルスベクターは、開示された方法及び組成物と併せて使用され得る。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングされる能力のために、遺伝子送達ベクターとして選択され得る。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を特異的ウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及び／又はパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをレトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共にこの細胞株に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることを可能にし、次いでこれを培養培地に分泌する。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を回収し、任意に濃縮し、遺伝子導入のために使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することができる。
更に、レンチウイルスベクターは、本明細書に開示される方法及び組成物と組み合わせて使用され得る。したがって、本開示の目的は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）配列（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１及び２５８に記載される阻害性ＲＮＡ配列のいずれか１つ）を含むレンチウイルスベクターに関する。
したがって、レンチウイルスベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含み得る。レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）及びｈＳｙｎプロモーターを含み得る。
レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）及びｈＳｙｎプロモーターを含み得る。例えば、レンチウイルスベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８～２６０のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８～２６０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、及びｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列を有するｈＳｙｎプロモーター、又は配列番号１９４～１９８のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）を含み得る。
あるいは、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）配列及びＣａＭＫＩＩプロモーターを含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８～２６０のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１、及び２５８～２６０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、並びにＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号１９９～２０４のいずれか１つの核酸配列を有するＣａＭＫＩＩプロモーター、又は配列番号１９９～２０４のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）を含み得る。
レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。より高い複雑性は、潜伏感染の過程のように、ウイルスがそのライフサイクルを調節することを可能にする。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ １、ＨＩＶ ２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重減衰させることによって生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆは欠失され、ベクターは生物学的に安全になる。レンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号（これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般に、ベクターはプラスミド系又はウイルス系であり、外来核酸を組み込むため、及び核酸を選択するため、及び宿主細胞に移入するための必須配列を有するように構成される。目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子も当技術分野で公知である。したがって、関連する遺伝子を選択されたベクターにクローニングし、次いで、目的の標的細胞を形質転換するために使用する。非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスであって、適切な宿主細胞が、パッケージングタンパク質、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びに米国特許第５，９９４，１３６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上ベクターでトランスフェクトされる、組換えレンチウイルス。この刊行物は、ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードする核酸を提供することができる第１のベクター、並びにパッケージング細胞を作製するためのウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することができる第２のベクターを提供する。異種遺伝子を提供するベクターを当該パッケージング細胞に導入すると、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出する産生細胞が得られる。ｅｎｖは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能にする両性エンベロープタンパク質であり得る。典型的には、本開示の核酸分子又はベクターは、集合的にプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル配列、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等を指す「制御配列」を含み、集合的にレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写及び翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
例えば海馬ニューロン、例えばＤＧＣ等の特定の標的細胞に対する親和性を示す核酸ベクターを使用して、本明細書に記載の阻害性ポリヌクレオチドを送達することができる。
ウイルス調節エレメント
ウイルス調節エレメントは、核酸分子を宿主細胞に導入するために使用される送達ビヒクルの成分である。ウイルス調節エレメントは、任意に、レトロウイルス調節エレメントである。例えば、ウイルス調節エレメントは、ＨＳＣ１又はＭＳＣＶ由来のＬＴＲ及びｇａｇ配列であり得る。レトロウイルス調節エレメントは、レンチウイルスに由来し得るか、又は他のゲノム領域から同定された異種配列であり得る。他のウイルス調節エレメントが知られるようになるにつれて、これらは、本明細書に記載される方法及び組成物とともに使用される場合がある。
Ｇｒｉｋ２阻害性ポリヌクレオチドをコードするウイルスベクター
本開示は、異種ポリヌクレオチドの送達のための核酸ベクターであって、ポリヌクレオチドが、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的に結合し、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害する阻害性ＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）コンストラクトをコードする、核酸ベクターに関する。したがって、本開示の目的は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの少なくとも１つの領域又は部分（例えば、配列番号１６４～１９３のいずれか１つから選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域又は部分のいずれか１つ、又は配列番号１６４～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体に完全に又は実質的に相補的な阻害性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本開示のベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域に完全に又は実質的に相補的な阻害性ポリヌクレオチド配列の任意の変異体を含み得る。更に、本開示のベクターは、ＧｌｕＫ２タンパク質の任意の変異体をコードするＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに完全に又は実質的に相補的な阻害性ポリヌクレオチド配列の任意の変異体を含み得る。
したがって、目的の二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは、遺伝子カセット、例えばＤＮＡの転写がプロモーター及び／又は他の調節エレメントによって制御される発現カセットに組み込まれる。ＤＮＡは、目的のＧｒｉｋ２阻害性ＲＮＡ（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１及び２５６～２６１のいずれか１つ）を発現するベクターのそのような発現カセットに組み込まれ、標的細胞への送達のために目的のウイルスベクターによってキャプシド化される。したがって、本開示のウイルスベクターは、任意のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ転写物アイソフォーム（例えば、配列番号１６４～１７４のいずれか１つ）にハイブリダイズする任意のアンチセンスＲＮＡをコードする。ウイルスベクターは、例えば、表２、４、６及び８に列挙される阻害性ポリヌクレオチドのいずれか１つをコードする。
本開示のベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１６４～１９３に記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域若しくは部分のいずれか１つ、又は配列番号１６４～１９３のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）の少なくとも一部又は領域を認識するか又はそれに結合する阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを送達する。阻害性ＲＮＡ剤をコードする異種ポリヌクレオチドは、細胞内でのそのような阻害性ＲＮＡのプロセシングを確実にするより大きなコンストラクト又はスキャフォルドの一部であり得る（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、神経細胞、例えば、ＤＧＣ、又はグルタミン酸作動性錐体ニューロン等）。表２～９に列挙されるｓｉＲＮＡのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、とりわけ、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３）の前駆体又は一部、例えばマイクロＲＮＡ遺伝子の５’隣接配列、３’隣接配列又はループ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、表２～９に列挙されるｓｉＲＮＡのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３）の前駆体又は一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前駆体又は２つ以上のマイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３）の一部を含み得る。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｅ－ｍｉＲ－３０及びＥ－ｍｉＲ－２１８－１の前駆体又は一部を含み得る。
したがって、本開示の目的は、異種ポリヌクレオチドを含み、５’から３’、例えばプロモーター（例えば、表１１に記載されるプロモーターのいずれか１つ）、任意にイントロン（例えば、表１２に記載されるイントロンのいずれか１つ）、Ｇｒｉｋ２ｍＲＮＡ発現を阻害する阻害性ＲＮＡ剤をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列を有する阻害性ＲＮＡ剤、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）、及びポリＡ配列（例えば、表１２に記載のポリＡ配列のいずれか１つ）を含有する発現ベクターに関する。発現ベクターはまた、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）～３’ＩＴＲ、５’ＩＴＲ（例えば、表１２に記載される５’又は３’ＩＴＲ配列のいずれか１つ）、プロモーター、任意にイントロン、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を阻害する阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含み得る。発現ベクターは、前述のベクターエレメントのいずれかに隣接するスペーサー及び／又はリンカー配列を更に含み得る。
特定の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、ステム－ループ構造を形成するステム及びループをコードするヌクレオチド配列を含み得、ループは、表２～９に列挙される阻害性ＲＮＡ剤のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域をコードする核酸配列を含み得て、ループ領域は、野生型マイクロＲＮＡ配列遺伝子（例えば、とりわけ、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３）から全体的又は部分的に誘導され得るか、又は完全に人工的であり得る。特定の例では、ループ領域は、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ａループ配列であり得る。いくつかの実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、２つのループ領域をコードする核酸配列を含み得、ループ領域は、野生型マイクロＲＮＡ配列（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３）に全体的又は部分的に由来し得る。特定の実施形態では、ループ領域は、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ領域及びＥ－ｍｉＲ－２１８－１ループ領域を含み得る。
更に、１つ以上のステム－ループ構造は、ガイド配列（例えば、アンチセンスＲＮＡ配列、例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つ等）と、ガイド配列の全部又は一部に相補的なパッセンジャー配列（例えば、配列番号３１～４５、８０～９６、１２１～１３２、１４５～１５０、２３４～２３７及び２４６～２４９のいずれか１つ）とを含み得る。例えば、パッセンジャー配列は、ガイド配列の１０、９、８、７、６、５、４、３、２若しくは１個のヌクレオチドを除く、ガイド配列のヌクレオチドの全てに相補的であり得るか、又はパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つに相補的であり得る。特定の例では、１つのステム－ループ構造は、配列番号１９のガイド配列及び配列番号３４のパッセンジャー配列を含んでもよく、第２のステム－ループ構造は、配列番号１４１のガイド配列及び配列番号１４７のパッセンジャー配列を含んでもよい。配列番号１９、３４、１４１、及び１４７のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するこれら４つの配列の任意の配列変異体は、ステム－ループ構造に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のステム－ループ構造は、配列番号４、１３５、及び２５８のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する配列を含み得る。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャフォルドには、本開示のガイド（すなわち、アンチセンス）配列が含まれる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャフォルドはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャフォルドを含み、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは５０～８００ヌクレオチド長（例えば、５０～８００、７５～７００、１００～６００、１５０～５００、２００～４００又は２５０～３００ヌクレオチド）であり得る。特定の例では、ｐｒｉ－ｍＲＮＡは、５０～１００ヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチド）、１００～２００ヌクレオチド（例えば、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０又は１９０～２００ヌクレオチド）、２００～３００ヌクレオチド（例えば、２００～２１０、２１０～２２０、２２０～２３０、２３０～２４０、２４０～２５０、２５０～２６０、２６０～２７０、２７０～２８０、２８０～２９０又は２９０～３００ヌクレオチド）、３００～４００ヌクレオチド（例えば、３００～３１０、３１０～３２０、３２０～３３０、３３０～３４０、３４０～３５０、３５０～３６０、３６０～３７０、３７０～３８０、３８０～３９０又は３９０～４００ヌクレオチド）、４００～５００ヌクレオチド（例えば、４００～４１０、４１０～４２０、４２０～４３０、４３０～４４０、４４０～４５０、４５０～４６０、４６０～４７０、４７０～４８０、４８０～４９０又は４９０～５００ヌクレオチド）、５００～６００ヌクレオチド（例えば、５００～５１０、５１０～５２０、５２０～５３０、５３０～５４０、５４０～５５０、５５０～５６０、５６０～５７０、５７０～５８０、５８０～５９０又は５９０～６００ヌクレオチド）、６００～７００ヌクレオチド（例えば、６００～６１０、６１０～６２０、６２０～６３０、６３０～６４０、６４０～６５０、６５０～６６０、６６０～６７０、６７０～６８０、６８０～６９０又は６９０～７００ヌクレオチド）又は７００～８００ヌクレオチド（例えば、７００～７１０、７１０～７２０、７２０～７３０、７３０～７４０、７４０～７５０、７５０～７６０、７６０～７７０、７７０～７８０、７８０～７９０、又は７９０～８００ヌクレオチド）であり得る。これらの操作されたスキャフォルドは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二本鎖ＲＮＡへのプレ－ｍｉＲＮＡのプロセシングを可能にする。したがって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ガイド（すなわち、アンチセンス配列）ＲＮＡをコードする配列を含む５’アーム、通常は野生型ｍｉＲＮＡ（例えば、とりわけ、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３）に由来するループ配列、及びガイド鎖に完全に又は実質的に相補的なパッセンジャー（すなわち、センス配列）鎖をコードする配列を含む３’アームを含む。プレｍｉＲＮＡの「ステム－ループ」構造は、一般に、５０ヌクレオチドよりも長く、例えば、５０～１５０ヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０又は１４０～１５０ヌクレオチド）、５０～１１０ヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０ヌクレオチド）又は５０～８０ヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０ヌクレオチド）の長さである。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは更に、それぞれ５’及び３’アームに隣接する５’隣接配列及び３’隣接配列を含む。隣接配列は、必ずしも他の配列（アーム領域又はガイド配列）と連続しておらず、構造化されておらず、対合されていない領域であり、全体的又は部分的に、１つ以上の野生型ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャフォルド（例えば、とりわけ、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３の１つ以上に全体的又は部分的に由来するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャフォルド）に由来してもよい。隣接配列は、それぞれ少なくとも４ヌクレオチド長、又は最大３００ヌクレオチド長以上（例えば、４～３００、１０～２７５、２０～２５０、３０～２２５、４０～２００、５０～１７５、６０～１５０、７０～１２５、８０～１００又は９０～９５ヌクレオチド）である。スペーサー配列は、前述の配列構造の間に介在するものとして存在する場合があり、ほとんどの場合、プレ－ｍｉＲＮＡ構造全体に対する機能性を妨害することなく柔軟性を提供するために、連結ポリヌクレオチド、例えば、１～３０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）を提供する。スペーサーは、スペーサーが二本鎖ＲＮＡのプロセシングを妨害せず、スペーサーがガイドＲＮＡと標的ｍＲＮＡ配列との結合／相互作用を妨害しない限り、天然に存在するＲＮＡ由来の天然に存在する連結基、天然に存在する連結基の一部、ポリＡ若しくはポリＵ、又はヌクレオチドのランダムな配列に由来し得る。
本明細書に開示される方法及び組成物によれば、ヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド（例えば、アンチセンス）鎖を含む５’ステム－ループアーム、及び任意に５’スペーサー配列、並びに（ｉｉ）パッセンジャー（例えば、センス）鎖及び任意に３’スペーサー配列を含む３’ステム－ループアームを更にコードし得る。別の例では、ヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はポリヌクレオチドは、（ｉ）パッセンジャー鎖及び任意に５’スペーサー配列を含む５’ステム－ループアーム、並びに（ｉｉ）ガイド鎖及び任意に３’スペーサー配列を含む３’ステム－ループアームを更にコードし得る。別の例では、ウリジンゆらぎ塩基がガイド鎖の５’末端に存在する。更なる例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、ガイド配列の上流にリーディング５’隣接領域を含み、隣接領域は、任意の長さであってもよく、全体的又は部分的に野生型マイクロＲＮＡ配列に由来してもよく、異種であってもよく、又は他の隣接領域若しくはループとは異なる起源のｍｉＲＮＡに由来してもよく、又は完全に人工的であってもよい。３’隣接領域は、サイズ及び原点において５’隣接領域を反映することができ、３’隣接領域は、ガイド配列の下流（すなわち、３’）にあり得る。更に別の例では、５’隣接配列及び３’隣接配列の一方又は両方が存在しない。
発現ベクター又はポリヌクレオチドは、第１の隣接領域（例えば、表８に記載の５’隣接領域のいずれか１つ）を更にコードするヌクレオチド配列を含み得、当該第１の隣接領域は、５’隣接配列、及び任意に、５’スペーサー配列を含む。特定の例では、第１の隣接領域は、当該パッセンジャー鎖の上流（すなわち、５’）に位置する。別の例では、ヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はポリヌクレオチドは、第２の隣接領域（例えば、表８に記載の３’隣接領域のいずれか１つ）をコードし、当該第２の隣接領域は、３’隣接配列、及び任意に３’スペーサー配列を含む。特定の例では、第１の隣接領域は、ガイド鎖に対して５’に位置する。
本明細書に開示される方法及び組成物によれば、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号１～３４、１３５～１４７、２２６～２２９、又は２５６のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を含み得る。特定の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号２５６と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号２５６の核酸配列を含み得る。別の特定の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号１～３４及び１３５～１４７のうちの１つ以上と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を含み得る。別の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号４６～６２のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を含み得る。別の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号９７～１０８のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を含み得る。更に別の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号１３３～１３８のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を含み得る。
別の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、以下をコードするヌクレオチド配列を含む：
（ａ）５’から３’に、以下を含ステム－ループ配列：
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号３１～４５、８０～９６、１２１～１３２、１４５～１５０、２３４～２３７及び２４６～２４９のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を有するパッセンジャー配列）と相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）マイクロＲＮＡループ領域であって、ループ領域がマイクロＲＮＡループ配列（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ａ、ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（例えば、配列番号４～２２５のいずれか１つから選択される核酸を有するマイクロＲＮＡループ配列）を含むマイクロＲＮＡループ領域、
（ｉｉｉ）ガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を有するガイド配列）を含む３’ステム－ループアーム、
（ｂ）パッセンジャー鎖に対して５’に位置する５’隣接領域（例えば、表１３に記載の５’隣接領域のいずれか１つ）、並びに
（ｃ）ガイド鎖に対して３’に位置する３’隣接領域（例えば、表１３に記載の３’隣接領域のいずれか１つ）であって、第２の隣接領域が、３’隣接配列、及び任意に、３’スペーサー配列を含む、３’隣接領域。いくつかの実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、以下をコードする核酸配列を含む：（ａ）５’から３’に、以下を含ステム－ループ配列：
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号３４及び１４７のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の同一性を有する核酸配列を有するパッセンジャー配列）と相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループ、（ｉｉ）マイクロＲＮＡループ領域であって、ループ領域がマイクロＲＮＡループ配列（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０ａ又はＥ－ｍｉＲ－２１８－１ループ配列（例えば、配列番号４又は１３５のいずれか１つから選択される核酸を有するマイクロＲＮＡループ配列）を含むマイクロＲＮＡループ領域、（ｉｉｉ）ガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号１９及び１４１のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を有するガイド配列）を含む３’ステム－ループアーム、
（ｂ）パッセンジャー鎖に対して５’に位置する５’隣接領域（例えば、表１３に記載の５’隣接領域のいずれか１つ）、並びに
（ｃ）ガイド鎖に対して３’に位置する３’隣接領域（例えば、表１３に記載の３’隣接領域のいずれか１つ）であって、第２の隣接領域が、３’隣接配列、及び任意に、３’スペーサー配列を含む、３’隣接領域。いくつかの実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、２つのステム－ループ配列を含む核酸配列を含み、（ａ）１つのステム－ループ配列は、配列番号１９のガイド配列又は配列番号１９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、配列番号４のマイクロＲＮＡループ領域又は配列番号４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、及び配列番号３４のパッセンジャー配列又は配列番号３４と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含み、（ｂ）第２のステム－ループ配列は、配列番号１４１のガイド（ｑｕｉｄｅ）配列又は配列番号１４１と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体、配列番号１３５のマイクロＲＮＡループ領域又は配列番号１３５と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含む第２のステム－ループ配列、及び配列番号１４７のパッセンジャー配列又は配列番号１４７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含む。好ましい実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、２つのステム－ループ配列を含む核酸配列を含み、（ａ）１つのステム－ループ配列は、配列番号１９のガイド配列、配列番号４のマイクロＲＮＡループ領域、及び配列番号３４のパッセンジャー配列を含み、（ｂ）第２のステム－ループ配列は、配列番号１４１のキッド配列、配列番号１３５のマイクロＲＮＡループ領域、及び配列番号１４７のパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号２５６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、配列番号２５６の核酸配列を有する。
別の例では、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、以下をコードするヌクレオチド配列を含む：
（ａ）５’から３’に、以下を含ステム－ループ配列：
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を有するガイド配列）を含む５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）マイクロＲＮＡループ領域であって、ループ領域がマイクロＲＮＡループ配列（例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ａ、ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（例えば、配列番号２１９、２２２、又は２２５のいずれか１つから選択される核酸を有するマイクロＲＮＡループ配列）を含むマイクロＲＮＡループ領域、
（ｉｉｉ）ガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号３１～４５、８０～９６、１２１～１３２、１４５～１５０、２３４～２３７及び２４６～２４９のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する核酸配列を有するパッセンジャー配列）と相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアーム、
（ｂ）ガイド鎖に対して５’に位置する５’隣接領域（例えば、表１３に記載の５’隣接領域のいずれか１つ）、並びに
（ｃ）パッセンジャー鎖に対して３’に位置する３’隣接領域（例えば、表１３に記載の３’隣接領域のいずれか１つ）であって、第２の隣接領域が、３’隣接配列、及び任意に、３’スペーサー配列を含む、３’隣接領域。
前述のガイド鎖及びパッセンジャー鎖の長さは、１９～５０（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６～３０、３１～３５、３６～４０、４１～４５、又は４６～５０）ヌクレオチド長であり得る。特定の例では、ガイド鎖の長さは１９ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２０ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２１ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２２ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２３ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２４ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２５ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは２６～３０ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは３１～３５ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは３６～４０ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは４１～４５ヌクレオチドである。別の例では、ガイド鎖の長さは４６～５０ヌクレオチドである。特定の例では、パッセンジャー鎖の長さは１９ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２０ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２１ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２２ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２３ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２４ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２５ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは２６～３０ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは３１～３５ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは３６～４０ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは４１～４５ヌクレオチドである。別の例では、パッセンジャー鎖の長さは４６～５０ヌクレオチドである。
ガイド及びパッセンジャー配列の長さは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が組み込まれるｍｉＲＮＡスキャフォルドに基づいて変化し得る。所与のガイドがｍｉＲＮＡスキャフォルドに適合される場合、ガイドの長さは、所与のｍｉＲＮＡスキャフォルドの天然の構造及びプロセシングに適応するように伸長され得る。例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０スキャフォルドによって産生されるガイド配列は、典型的には２２ヌクレオチド長である。ほとんどのスキャフォルドでは、ガイド配列は、標的ｍＲＮＡ配列に更に相補的であるように３’末端で伸長されるが、いくつかの場合、ｍｉＲＮＡスキャフォルドの配列に応じてガイドの５’開始部位を改変することを含み得る。
特定の場合には、ｍｉＲＮＡガイド及びパッセンジャー鎖の発現レベル及び／又はプロセシングパターンを改変して、所与のコンストラクトの標的化能力を改善又は改変することが望ましい場合がある。したがって、所与のｍｉＲＮＡフレームワーク／スキャフォルド内で、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の位置を交換することができ、これは、スタッファー配列（例えば、配列番号２５０又は配列番号２５１）を含む設計の状況であってもよく、スタッファーなしの設計の状況であってもよい。これは更に、二重コンストラクト又は連結された（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）コンストラクトの状況であってもよい。この変更に対応するために、ガイド及び／又はパッセンジャー鎖の配列は、テンプレート「親」設計から変更されてもよい。あるいは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の発現及び／又は処理パターンの変化に影響を及ぼすために、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖配列に改変を加えてもよい。
特定の例では、ベクター又はポリヌクレオチドはＥ－ｍｉＲ－３０ａ配列を含み、５’隣接領域は配列番号２１７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を含む（表１３参照）。
いくつかの実施形態では、ベクター又はポリヌクレオチドは、Ｅ－ｍｉＲ－３０ａ配列を含み、３’隣接領域は、配列番号２１８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を含む（表１３参照）。
別の例では、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が配列番号２１９のヌクレオチド配列、又は配列番号２１９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一の配列を含むＥ－ｍｉＲ－３０ａ構造を含む（表１３を参照）。
特定の例では、ベクター又はポリヌクレオチドはｍｉＲ－２１８－１配列を含み、５’隣接領域は配列番号２２０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を含む（表１３を参照）。
いくつかの実施形態では、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－２１８－１配列を含み、３’隣接領域は、配列番号２２１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を含む（表１３を参照）。
別の例では、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が配列番号２２２のヌクレオチド配列、又は配列番号２２２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一の配列を含むｍｉＲ－２１８－１構造を含む（表１３を参照）。
特定の例では、ベクター又はポリヌクレオチドはＥ－ｍｉＲ－１２４－３配列を含み、５’隣接領域は配列番号２２３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を含む（表１３を参照）。
いくつかの実施形態では、ベクター又はポリヌクレオチドは、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３配列を含み、３’隣接領域は、配列番号２２４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一のヌクレオチド配列を含む（表１３参照）。
別の例では、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が配列番号２２５のヌクレオチド配列、又は配列番号２２５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））同一の配列を含むＥ－ｍｉＲ－１２４－３構造を含む（表１３を参照）。
発現ベクターはプラスミドであり得、例えば、イントロン配列（例えば、配列番号２０５若しくは配列番号２０６のイントロン配列、又は配列番号２０５若しくは配列番号２０６の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体）、リンカー配列、又はスタッファー配列（例えば、配列番号２５０又は配列番号２５１）の１つ以上を含み得る。
したがって、本開示の目的は、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１、及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体を含むベクターに関する。例えば、ベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１、及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。別の例では、ベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１、及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。本開示のベクターは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１、及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを更に含み得る。
特に、ベクターは、配列番号：１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１、及び２５６～２６１のいずれか１つの配列、又は配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２０８～２２９、２３８～２４１、２５０～２５１、及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する変異体、及びプロモーター（例えば、表１１に列挙されるプロモーターのいずれか１つ）を含み得る。
上述の変異体は、例えば、個体間の対立遺伝子変異（例えば、多型）、選択的スプライシング形態等に起因する天然に存在する変異体を含み得る。変異体という用語はまた、他の供給源又は生物からの本開示の遺伝子配列を含む。変異体は、本開示による配列と実質的に相同であり得る。本開示の遺伝子の変異体はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記で定義された配列（又はその相補鎖）にハイブリダイズする核酸配列を含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、３０°Ｃ超、３５°Ｃ超、又は４２°Ｃ超の温度、及び／又は約５００ｍＭ未満若しくは２００ｍＭ未満の塩分が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＳＤＳ、ＳＳＣ等の他の試薬の温度、塩分及び／又は濃度を変更することによって調整することができる。
本開示は更に、目的の標的細胞に異種ポリヌクレオチドを送達するための非ウイルスベクター（例えば、本明細書に開示されるＧｒｉｋ２標的化阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミド）を提供する。他の場合では、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスベクターであり得る。
１つ以上の発現カセットが使用され得る。各発現カセットは、目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター配列（例えば、ニューロン細胞プロモーター）を含み得る。各発現カセットは、追加の調節エレメント、スペーサー、イントロン、ＵＴＲ、ポリアデニル化部位等からなり得る。発現カセットは、例えば２つ以上の阻害性ＲＮＡ剤をコードするポリヌクレオチドに対してポリシストロン性であり得る。発現カセットは、プロモーター、１つ以上の目的の阻害性ＲＮＡ剤をコードする核酸、及びポリＡ配列を更に含み得る。特定の例では、発現カセットは、５’－プロモーター配列、第１の目的の阻害性ＲＮＡ剤（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つ）をコードするポリヌクレオチド配列、第２の目的の阻害性ＲＮＡ剤（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つ）をコードする配列、及びポリＡ配列－３’を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、配列番号２５６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５６の配列を有する。好ましい実施形態では、発現カセットは、配列番号２５７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号２５７の配列を有する。
ウイルスベクターは、耐性ＡｍｐＲ、カナマイシン、ハイグロマイシンＢ、ジェネティシン、ブラストサイジンＳ、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ノウルセオトリシン又はピューロマイシンの遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸配列を更に含み得る。
例示的な発現カセット
本開示は、発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター））に組み込まれると、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズしてその発現を阻害する阻害性ＲＮＡ剤（例えば、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの核酸配列を有する阻害性ＲＮＡ剤）をコードする異種ポリヌクレオチドの発現を促進する発現カセットを提供する。一般に、核酸ベクターに組み込まれる発現カセットは、異種遺伝子調節配列（例えば、プロモーター（例えば、表１１に記載されるプロモーターのいずれか１つ）及び場合によりエンハンサー配列（例えば、表１２に記載のエンハンサー配列））、５’隣接配列（例えば、表１３に記載の５’隣接配列）、ステム－ループ５’アームを含むステム－ループ配列、ループ配列（例えば、表１３に記載のマイクロＲＮＡループ配列）、ステム－ループ３’アーム、３’隣接配列（例えば、表１３に記載の３’隣接配列）、任意に、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＲＰＥ）、及びポリＡ配列（例えば、配列番号２１３～２１６）を含有する異種ポリヌクレオチドを含むであろう。ＡＡＶベクターの場合、発現カセットは、その５’及び３’末端に、それぞれ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列（例えば、表１２に記載される５’又は３’ＩＴＲ配列のいずれか１つ）が隣接していてもよい。典型的には、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、本明細書に開示される方法及び組成物と併せて使用するために企図されるが、本明細書に開示される他のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ配列もまた使用され得る（上記の「ＡＡＶベクター」のセクションを参照）。コンストラクトの一般的な構造は、少なくとも５’から３’方向に向けられた以下のエレメントを含む：
（ｉ） ５’ＩＴＲ配列（ＡＡＶベクターのみについて；表１２を参照）；
（ｉｉ） プロモーター配列（例えば、表１１に列挙されるプロモーター配列のいずれか１つ）；
（ｉｉｉ） ５’隣接配列（例えば、表１３を参照）；
（ｉｖ） 配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するステム－ループ配列；
（ｖ） 任意に、ＷＰＲＥ配列；
（ｖｉ） ポリＡ配列（例えば、表１２を参照）；及び
（ｖｉｉ） ３’ＩＴＲ配列（ＡＡＶベクターのみについて；表１２を参照）。
特定の例では、配列番号：１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、７個以下（例えば、７、６、５、４、３、２、又は１個以下）のミスマッチヌクレオチド（すなわち、ミスマッチ）を有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、６個以下（例えば、６、５、４、３、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、５個以下（例えば、５、４、３、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、４個以下（例えば、４、３、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、３個以下（例えば、３、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、２個以下（例えば、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。更に別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、１個以下のミスマッチを有する。
別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、１０個以下（例えば、１０、９、８、７、又は６個以下）のミスマッチヌクレオチド（すなわち、ミスマッチ）を有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、９個以下（例えば、９、８、７、又は６個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、８個以下（例えば、８、７、又は６個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、７個以下（例えば、７、又は６個以下）のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、６個以下のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、５個以下のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、４個以下のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、３個以下のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、２個以下のミスマッチを有する。別の例では、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列に実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１６～３０、６３～７９、１０９～１２０、１３９～１４４、２３０～２３３、及び２４２～２４５のいずれか１つの阻害性ＲＮＡ配列と比較して、１個以下のミスマッチを有する。
多重遺伝子ｍｉＲＮＡカセット
フランク／ステム－ループ／フランクコンストラクト（例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）は、単一のｍｉＲＮＡ「カセット」として処理され得、連結され得る（例えば、１つ以上のプロモーターによって駆動される多重遺伝子配列で提供される）。２つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のプレ－ｍｉＲステム－ループ配列が、より長い転写物（例えば、イントロン等）の任意のポリヌクレオチド配列に、又は内在性マイクロＲＮＡ隣接配列（－５ｐ及び－３ｐ配列等の各ステム－ループに対する５’及び３’）の間に埋め込まれる場合がある。各プレ－ｍｉＲステム－ループ配列は、専用プロモーター（例えば、それぞれが個々のプレ－ｍｉＲステム－ループ配列の発現を独立して調節する別個のプロモーター配列を有する多重遺伝子コンストラクトとして、すなわち、各プロモーターは、個々のマイクロＲＮＡを産生するように互いに独立して機能する）の制御下で発現され得る。少なくとも５ｂｐ伸長ステムを提供することができる隣接配列がステム－ループのプロセシングに十分であったことが示されている（Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．４１：５９－６３，Ｊｕｌｙ ２００６、参照により本明細書に組み込まれる）。スペーサー配列は、第１のｍｉＲＮＡ発現カセットの３’隣接配列と、第２のｍｉＲＮＡ発現カセットの５’隣接配列との間に位置し得る。スペーサー配列は、コード又は非コード（例えば、イントロン）配列から誘導されてもよく、様々な長さのものであるが、ステム－ループ－フランク配列の一部とはみなされない（Ｒｏｕｓｓｅｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１４：３５２－６３，２０１９（これは参照によって本明細書に組み込まれる））。
例示的な発現カセットは、以下を含むヌクレオチド配列を含み得る：（ａ）Ｇｒｉｋ２ｍＲＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡ配列を含む第１のｍｉＲＮＡ配列をコードする第１のポリヌクレオチド；（ｂ）Ｇｒｉｋ２ｍＲＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡ配列を含む第２のｍｉＲＮＡ配列をコードする第２のポリヌクレオチド。例えば、発現カセットは、５’から３’に、以下を含み得る：（ａ）ガイド鎖の５’側に位置する第１の５’隣接領域であって、それに対して配列同一性の第１の５’隣接配列（例えば、表１３を参照）を含む当該第１の５’隣接領域；（ｂ）配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む第１のステム－ループ配列；（ｃ）当該パッセンジャー鎖の３’側に位置する第１の３’隣接領域（例えば、表１３を参照）及び３’スペーサー配列；（ｄ）ガイド鎖に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、表１３を参照）；（ｅ）配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、及び２３８～２１４のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む第２のステム－ループ配列；（ｆ）パッセンジャー鎖の３’側に位置する３’隣接配列（例えば、表１３を参照）を含む第２の３’隣接領域。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’から３’に、以下を含み得る：（ａ）ガイド鎖の５’側に位置する第１の５’隣接領域であって、それに対して配列同一性の第１の５’隣接配列（例えば、表１３を参照）を含む当該第１の５’隣接領域；（ｂ）配列番号４、１９及び３４のいずれか１つ以上のポリヌクレオチドを含む第１のステム－ループ配列；（ｃ）当該パッセンジャー鎖の３’側に位置する第１の３’隣接領域（例えば、表１３を参照）及び３’スペーサー配列；（ｄ）ガイド鎖に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、表１３を参照）；（ｅ）配列番号１３５、１４１及び１４７のいずれか１つ以上のポリヌクレオチドを含む第２のステム－ループ配列；（ｆ）パッセンジャー鎖の３’側に位置する３’隣接配列（例えば、表１３を参照）を含む第２の３’隣接領域。いくつかの実施形態では、第１のステム－ループ構造及び第２のステムループ構造の配列は、第１のステム－ループ構造が、配列番号第１３５、１４１及び１４７のいずれか１つのポリヌクレオチドを含み、第２のステム－ループ構造が、配列番号４、１９及び３４のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むように逆転される。
第１の５’隣接配列、第１の３’隣接配列、第２の５’隣接配列、及び第２の３’隣接配列は、表１３から選択することができる。
ポリシストロン性又は多重遺伝子ｒＡＡＶ発現コンストラクトは、順次の（例えば、連続的又は非連続的）ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドＸ１、例えば（Ｘ１）ｎから構成される導入遺伝子を含み得る。Ｘ１ポリヌクレオチドは、表３、５、７、及び９に列挙されたガイド－パッセンジャー対のいずれか１つ、表１３に列挙された５’及び３’隣接配列のいずれか１つ、並びに表１３に列挙されたループ配列のいずれか１つを含む。式（Ｘ１）ｎを有するポリシストロニック導入遺伝子は、導入遺伝子の５’末端に位置する単一のプロモーターの制御下にあり、その結果、プロモーター及び導入遺伝子は式プロモーター－（Ｘ１）ｎを有し、式中、ｎは１～１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）である。多重遺伝子コンストラクトは、ベクターの製造効率を改善するために、コンストラクトの３’末端にスタッファー配列（例えば、配列番号２５０又は配列番号２５１）を更に含むことができる。
二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーター発現カセット
２つ以上の（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）プレ－ｍｉＲステム－ループ配列を含有する多重遺伝子発現カセットは、各個々のプレ－ｍｉＲステム－ループ配列が専用のプロモーター配列に作動可能に連結されるように、各個々のプレ－ｍｉＲステム－ループ配列の発現を調節するための２つ以上のプロモーター配列を含み得る。そのような場合、発現コンストラクトは、式（プロモーター－Ｘ１）ｎの構造を特徴とし、式中、Ｘ１は、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１のいずれか１つのポリヌクレオチドであり、ｎは、１～１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）である。二次構造を形成することができる追加の調節エレメント、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化シグナル配列、イントロン及び／又は配列、例えば、本明細書に開示される調節エレメントのいずれか１つは、プロモーター－Ｘ１構造の５’末端及び／又は３’末端に作動可能に連結され得る。
特定の例では、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、それぞれが個々のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列）の制御下にある２つのプレ－ｍｉＲステム－ループ配列を含む。二重ｍｉＲＮＡカセットにおける２つのプロモーターは、同一のプロモーター又は異なるプロモーターであり得る。
具体的な一例では、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’に、以下を含むヌクレオチド配列を含む：（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のいずれか１つ、例えば表１１、例えばｈＳｙｎプロモーター又はＣａＭＫＩＩプロモーター）；（ｂ）第１のステム－ループ配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域（例えば、表１３を参照）；（ｃ）配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む第１のステム－ループ配列；（ｄ）第１のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域（例えば、表１３を参照）；（ｅ）第２のプロモーター配列（例えば、表１１を参照）、又はそれと少なくとも８５％（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％））の配列同一性を有するその変異体；（ｆ）第２のステム－ループ配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、表１３を参照）；（ｇ）配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む第２のステム－ループ配列；及び（ｈ）ポリヌクレオチドの３’側に位置する第２の３’隣接領域（例えば、表１３を参照）。所望であれば、ｈＳｙｎプロモーター及びＣａＭＫＩＩプロモーターは、サイトメガロウイルスのエンハンサー（例えば、ＣＡＧ又はＣＢＡ）、Ｕ６、Ｈ１又は７ＳＫプロモーターを含有する構成的プロモーターで置き換えられ得る。
別の例では、第１のプロモーターはＳＹＮプロモーター（例えば、表１１を参照）であり、第２のプロモーターはＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、表１１を参照）である。
前述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに記載される配列についての配列同一性が、１０～１５００（例えば、２０～１４００、３０～１３００、４０～１２００、５０～１１００、６０～１０００、７０～９００、８０～８００、９０～７００、１００～６００、２００～５００、又は３００～４００）ヌクレオチドの範囲にわたって決定され得る。例えば、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１０ヌクレオチドにわたって決定され得る。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が２０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が３０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が４０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が６０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が７０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が８０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が９０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が２００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が２５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が３００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が３５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が４００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が４５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が５００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が５５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が６００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が６５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が７００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が７５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が８００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が８５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が９００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が９５０ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１０００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１１００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１２００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１３００ヌクレオチドにわたって決定される。別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１４００ヌクレオチドにわたって決定される。更に別の例では、上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性が１５００ヌクレオチドにわたって決定される。
上記の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、シナプシンプロモーター及び／又はカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩプロモーターであるプロモーターを含み得る。
本明細書に開示される二重ｍｉＲＮＡ発現カセットと併せて使用するために好適であるマイクロＲＮＡループ配列は、Ｅ－ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列であり得る。
本開示の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットはまた、発現カセットの５’末端に５’－ＩＴＲ（例えば、表１２を参照されたい。）を、発現カセットの３’末端に３’－ＩＴＲ（例えば、表１２を参照）を組み込でもよい。
更に、本明細書に開示される二重ｍｉＲＮＡ発現コンストラクトは、第１の３’隣接領域の３’末端と第２のプロモーターの５’末端との間に作動可能に連結される第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、及び／又は、第２の３’隣接領域の第２の３’末端と３’ＩＴＲとの間に作動可能に連結される第２のポリＡシグナルを含み得る。第１のポリＡシグナルと第２のポリＡシグナルは、同一（例えば、両方ともＲＢＧ又はＢＧＨポリＡシグナルである）であってもよく、又は異なっていてもよい（例えば、第１のポリＡシグナルはＲＢＧポリＡであり、第２のポリＡシグナルはＢＧＨポリＡであり、又は、第１のポリＡシグナルはＢＧＨポリＡであり、第２のポリＡシグナルはＲＢＧポリＡである）。
複数のｍｉＲＮＡ配列を含有するＡＡＶベクターの製造における改善
単一又は二重ｍｉＲＮＡ発現カセット（例えば、本明細書に開示される発現カセット）をコードするプラスミドを使用するＡＡＶベクターの調製は、不適切なＡＡＶゲノムパッケージングによって妨害される可能性がある。第一に、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は短く（２００塩基未満）、プロモーターの長さに応じて、単一のｍｉＲＮＡの発現を制御する単一のプロモーターを有する導入遺伝子カセットの設計は、ＡＡＶの最大パッケージング容量（約４．８ｋｂ）よりも有意に短いＡＡＶゲノムをもたらし得る。したがって、予想される全ゲノム長が２．４ｋｂ未満（ＡＡＶのパッケージング能力の半分）である場合、単一のキャプシドに複数のベクターゲノムをロードすることが可能である。これは、適切な長さであればＡＡＶキャプシドにパッケージングすることができるＡＡＶゲノム二量体（又は三量体）の産生を可能にする適切なエンドヌクレアーゼニッキングなしにポリメラーゼのリードスルーによって媒介することができる。これはその後、ＡＡＶベクター粒子の集団に有意な不均一性を導入し、製剤の製造及び特性評価を著しく困難にする。
第２に、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに基づく導入遺伝子は、ヘアピンを含むため、本質的に有意な二次構造を有する。ＡＡＶゲノム内のこれらの内部二次構造は、ＡＡＶゲノムの複製及びパッケージング中に「偽」ＩＴＲとして機能し、切断事象、並びに完全及び部分ベクターゲノムの混合物を含むＡＡＶベクター粒子の異種集団をもたらし得ることが示されている。
本発明者らは、ＡＡＶパッケージング能力未満のサイズを有するＡＡＶゲノムを追加の配列（例えば、更なるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステム－ループ配列、第２のプロモーター配列、スタッファー配列（例えば、配列番号２５０又は配列番号２５１）、自己相補的ＡＡＶベクター等を使用する）でパディングすると、部分的（すなわち、切断型ＡＡＶゲノムのコピーの取り込みを回避することによってＡＡＶパッケージングが実質的に改善され、多重パッケージング事象が防止又は低減されることを発見した。したがって、本明細書に記載されるコンストラクトは、ベクターのサイズを最大ＡＡＶパッケージング容量により近い値に増加させるために上記の配列をＡＡＶ発現カセットに組み込むことによって、ＡＡＶゲノムの不適切なパッケージングを回避する。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の（例えば、１、２、又はそれ以上）スタッファー配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、発現カセットの３’末端に配置される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５０の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号２５１の核酸配列を有する。
例えば、単一のプロモーターの制御下で１つのｍｉＲＮＡを発現するコンストラクト又は２つの別個のプロモーターからの２つのｍｉＲＮＡを発現するコンストラクト（二重コンストラクトアプローチ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価によって予測されるようにｉｎ ｖｉｖｏで機能しない場合があり得る。これらの場合、ＡＡＶベクター粒子の均一な完全長の単一パッケージング集団を生成するゲノム長を確立するために以下の戦略を実施することができる。
第１に、単一のｍｉＲＮＡ「ガイド」の発現が望まれる場合、スタッファー配列（例えば、配列番号２５０又は配列番号２５１）を付加して、プロモーター又はｍｉＲカセット自体を破壊することなくＡＡＶベクターゲノムの全長を増加させることができる。このスタッファーは、導入遺伝子カセット（ポリＡ配列の３’）の下流に付加され得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号２５２～２５７のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する配列を含む。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号２５２～２５７のいずれか１つの配列を含む。このスタッファーの長さ及び含有量は、ＡＡＶパッケージングの均一性を改善する能力を維持しながら変更することができる。更に、このスタッファーは、プロモーターの上流（５’）に配置され得る。スタッファー配列は、ｓｃＡＡＶベクター又は一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクターの状況で利用され得る。
第２に、２つ以上のｍｉＲＮＡが発現されることになるが、単一のプロモーター戦略が選択される場合、ベクターは、複数のｍｉＲＮＡカセットのコンカテマー化によって調製され得る。同じスキャフォルドを使用した複数のｍｉＲＮＡカセット（例えば、最大５つのｍｉＲＮＡカセット）のコンカテマー化は、ベクターゲノム内の相同配列間の組換えをもたらし得るが、非相同な隣接及びループ配列を有する異なるスキャフォルドを使用したｍｉＲＮＡカセットのコンカテマー化は、このパッケージングの懸念を改善し得る。追加のｍｉＲＮＡカセットの包含が適切な長さのベクターゲノムをもたらさない場合、スタッファー配列を上記のように組み込んで長さを増加させ、パッケージング効率を改善することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号２５６～２５７のいずれか１つと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有する配列を含む。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号２５６～２５７のいずれか１つの配列を含む。
昆虫発現ベクター
本明細書に記載される阻害性ポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えばバキュロウイルスウイルスウイルスベクター）においてコードされ、昆虫発現系において発現され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ポリヌクレオチドを核酸ベクター（例えば、バキュロウイルスベクター又はバキュロウイルスベースのベクター、レトロウイルスベクター、又は他のウイルスベクター）に組み込み、昆虫細胞株（例えば、Ｓｆ９細胞）にトランスフェクトし、ポリヌクレオチド（複数可）の発現を可能にする条件下で培養することができる。例えば、昆虫細胞株（例えば、Ｓｆ９細胞）を、本開示の阻害性ポリヌクレオチドで一過性又は安定的にトランスフェクトすることができる。
バキュロウイルス送達ベクター及びそれに対応する改変宿主細胞は市販されている（例えば、ｐＡｃＧＰ６７、ｐＡｃＳＥＣＧ２ＴＡ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡｃＧＨＬＴ、ｐＡｃＡＢ４；ｐＢＡＣ－３、ｐＢＡＣ６、ｐＢＡＣｇｕｓ－６、ｐＢＡＣｓｕｒｆ－１、ｐＰｏｌｈ－ＦＬＡＧ、及びｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ）。バキュロウイルス及び昆虫細胞発現系のための方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７），ａｎｄ Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に記載されているように、当技術分野で周知である。当業者であれば、発現系がバキュロウイルス発現系に限定されないことを理解するであろう。重要なことは、発現系が本開示の阻害性ポリヌクレオチドの発現を可能にすることである。例えば、他の適切な昆虫発現系としては、昆虫ポックス（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘ）ウイルス系（昆虫マンマウイルス（ｍａｍｍａｖｉｒｕｓ））及び細胞質多角体症ウイルス（ＣＰＶ）系が挙げられる。
細菌発現ベクター
標準的な細菌ベクターには、例えばバクテリオファージＸ及びＭ１３、並びにプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＫＦ及びｐＥＴ２３Ｄが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸ベクターを、プラスミド又は代替の細菌発現ベクターに組み込み、ポリヌクレオチド（複数可）の発現を可能にする条件下で培養することができる。細菌宿主細胞と共に使用するのに適したクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）によって記載されている。例示的な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は異種ポリヌクレオチドを発現することができる任意の細菌株が含まれ得る。細菌発現ベクターに典型的に含まれるエレメントには、レプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域に固有の制限部位が含まれる。
医薬組成物
本明細書に記載の阻害性ポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適した生物学的に適合性の形態で哺乳動物（例えば、ヒト）対象に投与するための医薬組成物に製剤化され得る。
本明細書に開示される組成物は、対象（例えば、ヒト）に送達するための任意の適切なビヒクル中に製剤化され得る。例えば、それらは、薬学的に許容され得る懸濁液、分散液、溶液又はエマルジョンに製剤化され得る。適切な媒体としては、生理食塩水及びリポソーム調製物が挙げられる。より具体的には、薬学的に許容され得る担体は、非水溶液の滅菌水溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含み得る。組換えヒトアルバム（ｒＡｌｂｕｍｉｎ Ｈｕｍａｎ ＮＦ ＲＥＣＯＭＢＵＭＩＮ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ）もまた、ＡＡＶベクター（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ、英国ノッティンガム）と共に安定剤として使用され得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。静脈内投与に適したビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等が含まれる。
防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガス等も存在し得る。
コロイド分散系はまた、標的遺伝子送達のために使用され得る。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。
本明細書に記載の組成物は、遊離塩基の形態で、塩、溶媒和物の形態で、及びプロドラッグとして使用することができる。全ての形態は、本明細書に記載の方法の範囲内である。本開示の方法によれば、記載された化合物又はその塩、溶媒和物若しくはプロドラッグは、選択された投与経路に応じて様々な形態で患者に投与され得る。
したがって、本明細書に記載の組成物は、例えば、経口、非経口、髄腔内、脳室内、実質内、頬側、舌下、鼻、直腸、パッチ、ポンプ、又は経皮投与による投与のために製剤化されてもよく、それに応じて製剤化された医薬組成物である。非経口投与には、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、髄腔内、脳室内、実質内、直腸、及び局所投与様式が含まれる。非経口投与は、選択された期間にわたる連続注入によるものであり得る。
本明細書に記載の薬剤の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、及びアルコールの有無にかかわらずそれらの混合物、及び油中で調製され得る。通常の保管及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤が含まれていてもよい。適切な製剤の選択及び調製のための従来の手順及び成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１２，２２ｎｄ ｅｄ．）及び２０１８年に公開されたＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ４１ ＮＦ ３６）に記載されている。注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、シリンジによって容易に投与され得る程度まで流動性でなければならない。局所、局部、又は全身投与も適切であり得る。本明細書に記載の組成物は、有利には、例えば約１ｃｍ間隔で間隔を置いて標的部位に注射又は複数回注射を投与することによって接触させることができる。
本明細書に記載の組成物は、単独で又は薬学的に許容され得る担体と組み合わせて動物、例えばヒトに投与することができ、その割合は、化合物の溶解性及び化学的性質、選択された投与経路、及び標準的な製薬慣行によって決定される。
したがって、本開示は、本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）を含有する医薬組成物を提供する。特に、本開示は、本開示の阻害性ＲＮＡ剤を含むベクターを含む組成物を提供する。特定の例では、本開示は、本明細書に開示されるように、プロモーターに作動可能に連結された本開示の阻害性ＲＮＡを含むベクター（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶベクター）を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、（ａ）ウイルスキャプシドを含むＡＡＶベクター；及び（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する発現カセットを含む人工ポリヌクレオチドであって、発現カセットが、ＣＮＳ細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結された、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害する阻害性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、人工ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤を、薬学的に許容され得る賦形剤、及び任意に、徐放性マトリックス（例えば、生分解性ポリマー等）と組み合わせて、医薬組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容され得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容され得る担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤補助剤を指す。本明細書に開示される医薬組成物は、脳内（例えば、実質内又は脳室内）、筋肉内、静脈内、経皮、局所、経口、舌下、皮下、又は直腸投与のために製剤化され得る。
組成物の活性成分（例えば、Ｇｒｉｋ２を標的化する阻害性ＲＮＡ剤）は、単独で、又は別の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に従来の薬学的支持体との混合物として単位投与形態で投与することができる。適切な単位投与形態としては、経口経路形態、例えば、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は溶液、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、髄腔内、脳内、定位及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態が挙げられる。典型的には、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容され得るビヒクルを含有する。これらは、特に等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水又は生理食塩水を添加すると注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液、ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が促進される程度に流動性でなければならない。それは製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されていなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容され得る塩として本開示の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。
分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中及び油中で調製することもできる。通常の保管及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤が含まれていてもよい。本明細書に開示される阻害性ポリヌクレオチド剤は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容され得る塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これは、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から誘導することもできる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、コーティング（例えば、レシチン）の使用、分散液の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。いくつかの場合、本開示の医薬組成物は、例えば糖又は塩化ナトリウム等の等張剤を含み得る。
注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、必要量の活性薬剤を、必要に応じて上に列挙した他の成分のいくつかと共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、塩基性分散媒及び本明細書に開示されるものからの必要な追加の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末をその以前に滅菌濾過された溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥技術であり得る。製剤化すると、溶液は、投与量要件に適合する様式で、治療上有効な量で投与される。
製剤は、上記の注射液の種類等の様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用することができる。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。使用することができる滅菌水性媒体は、当技術分野で周知である。例えば、１回の投与量を１ｍＬの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍＬの皮下注入液に添加するか、又は提案された注入部位に注射することができる。治療される対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。投与を担当する医師は、いずれにせよ、適切な患者情報及び当技術分野で認識されている方法を使用して、個々の対象に対する適切な用量を決定することができる。
診断方法
対象（例えば、ヒト対象）は、例えば、当技術分野で周知の方法を使用して、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有すると診断され、したがって、本明細書に開示される組成物及び方法を使用して治療を必要とすると特定され得る。例えば、対象におけるてんかんの診断は、対象の脳におけるてんかん原性焦点及びてんかん様活動の重症度を同定するための神経生理学的試験によって導かれ得る。当技術分野で周知の例示的な神経生理学的試験方法には、脳波検査（ＥＥＧ）、脳磁検査（ＭＥＧ）、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、及び陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）が含まれる。ＥＥＧ及びＭＥＧは、皮質機能の連続的な測定を高い時間分解能で提供し、発作間（発作間の期間）のてんかん型放電の検出を容易にし、これは対象のてんかん状態の陽性診断を示し得る。対象の年齢、病歴、及び生活習慣に適切な基準（例えば、参照集団、例えば、非てんかん患者集団等）に対する対象の脳活動の比較を行って、対象のてんかんに関する診断を決定することができる。
対象は、限定されないが、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）、良性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、乳児痙攣、若年性ミオクロニーてんかん、若年性欠神てんかん、小児期欠神てんかん（ピクノーレプシー）、熱湯てんかん、レノックス－ガストー症候群、ランドークレフナー症候群、ドラベ症候群、進行性ミオクロヌスてんかん、反射性てんかん、ラスムッセン症候群、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹部てんかん、巨大両側性ミオクロヌス、月経随伴性てんかん、ジャクソニアン発作障害、ラフォーラ病、及び光感受性てんかんを含むいくつかのてんかん状態のいずれか１つを有すると診断され得る。てんかん状態がＴＬＥである場合、ＴＬＥは、焦点性発作又は全般発作を特徴とし得る。
開示される方法を使用しててんかん原性焦点を特定の脳領域（例えば、内側側頭葉、外側前頭葉、前頭葉等）に局在化させることに基づいて患者を診断することができるてんかんのタイプ。てんかんの脳活動の電気生理学的サインはまた、対象におけるてんかんの特定のタイプ又はサブタイプを識別するために使用され得る。例えば、皮質領域（例えば、海馬又は大脳皮質）における速い（２５０～６００Ｈｚ）鋭い波リップル（ＳＰＷ－Ｒ）の存在は、対象におけるＴＬＥの陽性診断を示し得る。別の例では、レノックス・ガストー症候群は、新皮質及び視床にわたって記録された高速泳動電気泳動振動（１０～１５ Ｈｚ）の存在を特徴とすることが多い。更に、入院患者施設内の対象のビデオモニタリングは、患者がてんかん発作の行動症状、例えば、全身性痙攣、一時的な欠伸（約１０秒間続く意識レベルの低下）、強直症、ミオクローヌス、腸又は膀胱の制御の喪失、舌の噛み込み、疲労、頭痛、発話困難、異常な行動（例えば、手又は口の動きのない凝視又は自動運動）、精神病及び／又は局所性脱力感を明白に示すように見える場合、患者のてんかんの診断を示し得る。てんかんと診断されている対象からの自己報告症状も、陽性診断を示し得る。そのような自己申告症状には、既視感（ｄｅｊａ ｖｕ）又は未視感（ｊａｍａｉｓ ｖｕ）の感覚、オーラ、記憶喪失、自発的で非挑発性の恐怖及び不安、吐き気、聴覚、視覚、嗅覚、味覚、又は幻触、視覚のゆがみ（例えば、マクロプシア又はミクロプシア）、解離又は脱実現、共感覚、不快感又は多幸感、恐怖、怒り、又は感情消失が含まれ得る。
医薬用途
てんかん状態と診断された、又はてんかん状態を発症するリスクがある対象のてんかん（例えば、ＴＬＥ）を、上記の組成物（例えば、阻害性ＲＮＡ剤又はそれをコードする核酸ベクター）の投与によって治療するための方法が本明細書に開示される。投与すると、本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害することができる。本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤によるＧｒｉｋ２の標的化は、Ｇｒｉｋ２が転写され、治療された又は治療された第１の細胞又は細胞群（例えば、ニューロン細胞；そのような細胞は、例えば、対象又は対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベルの低下によって現れ得る（例えば、１つ以上の細胞を本開示の阻害性ポリヌクレオチドと接触させることによって、又は本開示の阻害性ポリヌクレオチドを、細胞が存在している若しくは存在していた対象に投与することによって）。特定の例では、Ｇｒｉｋ２の発現は、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない又は処置されていない第２の細胞又は細胞群（阻害性ポリヌクレオチドで処置されていないか、又は目的の遺伝子を標的とする阻害性ポリヌクレオチドで処置されていない対照細胞（複数可））と比較して、第１の細胞又は細胞群で減少する。目的の遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２）のｍＲＮＡレベルの低下の程度は、以下に関して表され得る：
Figure 2024519861000029
遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）の発現レベルの変化は、目的の遺伝子の発現、例えば目的の遺伝子のタンパク質発現又はタンパク質の下流のシグナル伝達に機能的に関連するパラメータの減少に関して評価され得る。目的の遺伝子の発現レベルの変化は、発現コンストラクトから内因性又は異種の、目的の遺伝子を発現する任意の細胞において、当技術分野で公知の任意のアッセイによって決定され得る。
Ｇｒｉｋ２の発現レベルの変化は、細胞又は細胞群によって発現されるＧｌｕＫ２タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中で発現されるＧｌｕＫ２タンパク質のレベル）の低下によって現れ得る。上記で説明したように、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処置された細胞又は細胞群におけるＧｌｕＫ２タンパク質発現のレベルの変化は、同様に、対照細胞又は細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして表され得る。
Ｇｒｉｋ２遺伝子の発現の変化を評価するために使用され得る対照細胞又は細胞群には、本開示の阻害性ポリヌクレオチドとまだ接触していない細胞又は細胞群が含まれる。例えば、対照細胞又は細胞群は、阻害性ポリヌクレオチドによる対象の治療の前に、個々の対象（例えば、ヒト又は動物の対象）に由来し得る。
細胞又は細胞群によって発現されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該分野で公知の任意の方法を用いて決定され得る。例えば、試料中のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチド又はその一部、例えばｍＲＮＡを検出することによって決定され得る。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；生合成）、ＲＮＥＡＳＹ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、スイス）を使用することを含むＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式には、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ分析が含まれる。循環ｍＲＮＡは、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１２／１７７９０６（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を用いて検出され得る。目的の遺伝子の発現レベルはまた、核酸プローブを使用して決定され得る。本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、特定の配列、例えばｍＲＮＡに選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当技術分野の周知の従来の方法を使用して合成することができ、又は適切な生物学的調製物から誘導することができる。プローブは、標識されるように特別に設計されてもよい。プローブとして利用することができる分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が含まれるが、これらに限定されない。
単離されたｍＲＮＡは、サザン分析又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルを決定するための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡを、目的の遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。ｍＲＮＡは、固体表面に固定化され、例えば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロース等の膜に転写することによって、プローブと接触され得る。プローブ（複数可）はまた、固体表面に固定化されてもよく、ｍＲＮＡは、例えばＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ遺伝子チップアレイ中でプローブと接触される。当技術分野における公知のｍＲＮＡ検出方法は、目的の遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定する際の使用に適合させることができる。
試料中の目的の遺伝子の発現レベルを決定するための代替方法は、例えばＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，８５４，０３３号）又は任意の他の核酸増幅法による、試料中の例えばｍＲＮＡの核酸増幅及び／又は逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製するため）のプロセスと、それに続く当技術分野で周知の技術を使用して増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、そのような分子の検出に特に有用である。本開示の特定の態様では、目的の遺伝子の発現レベルは、定量的蛍光発生ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮ（商標）システム）又はＤＵＡＬ－ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイによって決定される。
目的の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ｄｏｔ等のハイブリダイゼーション分析に使用される）、又はマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ若しくは繊維（又は結合核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニターされ得る。米国特許第５，７７０，７２２号；同第５，８７４，２１９号；同第５，７４４，３０５号；同第５，６７７，１９５号；及び同第５，４４５，９３４号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。遺伝子発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
ｍＲＮＡ発現レベルはまた、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価され得る。このＰＣＲ法の使用は、本明細書に提示される実施例に記載及び例示されている。そのような方法は、目的の遺伝子の核酸の検出にも使用することができる。
更に、Ｇｒｉｋ２遺伝子の発現によって産生されるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定され得る。そのような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、過拡散クロマトグラフィー、流体又はゲル沈殿反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（単純又は二重）、免疫電気泳動、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイ等が挙げられる。そのようなアッセイは、目的の遺伝子によって産生されるタンパク質の存在又は複製を示すタンパク質の検出にも使用することができる。更に、上記アッセイを使用して、タンパク質機能の回復又は変化をもたらす目的のｍＲＮＡ配列の変化を報告し、それによって治療効果及び利益を対象に提供し、対象の障害を治療し、及び／又は対象の障害の症状を軽減することができる。
したがって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質発現を測定するための上述のアッセイを使用して、本明細書に開示される１つ以上の阻害性ＲＮＡ剤（例えば、表２に記載の阻害性ＲＮＡ剤のいずれか１つ）又はそれをコードする核酸ベクターによる治療的処置を必要とする対象（例えば、てんかんに罹患している対象、例えば、ＴＬＥ）を同定することができる。例えば、ＴＬＥを有すると同定された患者は、制御不能な（例えば、治療抵抗性、例えば慢性）発作を引き起こす脳の一方の半球の側頭葉内のてんかん原性焦点を呈し得る。本明細書で論じられるように、そのようなてんかん原性焦点は、例えば、再発性歯状回顆粒細胞の異常な発芽及び当該苔状線維によって形成された再発性シナプスでのＧｒｉｋ２の異常な（すなわち、増加した）発現に起因し得る。上記のアッセイを使用して、例えばてんかん原性半球の海馬及び健康な半球の同じ領域から採取された脳組織に対して小さな生検を実施することによって、対象が本明細書に開示されるＧｒｉｋ２阻害性ＲＮＡ剤の１つ以上を使用する治療から利益を得るかどうかに関して決定することができる。てんかん原性半球が非罹患半球と比較してより高い（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））レベルのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現を示すことを示すことは、患者が本明細書に開示される方法及び組成物を使用する治療から利益を得ることができることを示すであろう。ＴＬＥを有する対象が両方の脳半球にてんかん原性焦点を有する場合、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、上に開示されるアッセイを使用して、ＴＬＥ罹患対象からの１つ以上の半球から得られた海馬組織と健康な対照対象（例えば、ＴＬＥを有さない対象の死後組織から）の同じ半球（複数可）からの海馬組織との間で比較することができた。ＴＬＥ罹患対象のてんかん原性半球が、健康な対象の同じ半球（複数可）と比較して、より高い（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現を示すことを示すことは、ＴＬＥ罹患対象が開示された組成物及び方法による治療的処置から利益を得ることを示すであろう。治療を必要とすると疑われる対象の神経細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベル又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルもまた、疾患状態を示すことが知られているこれらの分析物の標準レベル又は参照レベルと比較することができる。
更に、上記のアッセイを利用して、対象（例えば、てんかんに罹患している対象、例えば、ＴＬＥ等）が本明細書に開示される組成物及び方法を用いた治療に応答したかどうかを決定することができる。例えば、上で論じられたように、てんかん原性脳半球（複数可）からの海馬脳組織は、本明細書に開示される組成物及び方法による処置の前に小さな生検によってＴＬＥ罹患対象から得ることができ、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現は、上述のアッセイを使用して評価され得る。次いで、対象に、本明細書に開示される方法及び組成物による処置を施すことができる。開示される方法及び組成物による治療（例えば、処置後１、５、１０、１５、３０、６０、９０、又はそれを超える日）後の患者の回復に続いて、２回目の生検を処置前に評価されたのと同じ脳領域にわたって実施してもよく、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを再度評価してもよい。ＴＬＥ罹患対象がより低い（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））レベルのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現を示すことを示す図は、対象が治療に応答性であったことを示す。あるいは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、１人以上の健康な対照対象からのそれらの発現に関して比較することができる。治療後のＴＬＥ罹患患者のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルが、１人以上の健康な対照対象のレベルと統計的に区別できないことを示すことは、患者が治療に反応性であることを示すであろう。治療された対象の神経細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベル又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、疾患状態の非存在を示すことが知られているこれらの分析物の標準レベル又は参照レベルと比較することもできる。
治療方法
てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有する対象は、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して処置され得る。組成物（例えば、阻害性ＲＮＡ剤含有組成物又はそれを含有するベクター）は、予防処置を必要とする対象（例えば、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有すると診断された又はそのリスクがある対象）に予防処置として投与され得る。てんかんを発症するリスクがある対象は、てんかんの初期症状を示し得るか、又は治療が投与されたときにまだ症候性ではない可能性がある。
投与経路
本明細書に開示される組成物は、標準的な方法を使用して対象（例えば、ＴＬＥを有すると同定された対象）に投与され得る。例えば、本明細書に開示される組成物は、例えば全身投与を含むいくつかの異なる経路のいずれかによって投与することができる。全身投与の非限定的な例としては、経腸（例えば、経口）又は非経口（例えば、静脈内、動脈内、経粘膜、腹腔内、皮膚上、粘膜内（例えば、鼻腔内又は舌下）、筋肉内、又は経皮）投与が挙げられる。追加の投与経路には、皮内、皮下及び経皮注射が含まれ得る。
本明細書に開示される組成物はまた、阻害性ＲＮＡ剤又はそれをコードする核酸ベクターの局所送達に適した方法を使用して投与され得る。局所投与の非限定的な例としては、皮膚上（例えば、局所）、関節内及び吸入経路が挙げられる。特に、開示される組成物は、対象の脳組織（例えば、神経細胞、例えば、ニューロン及び／又は星状膠細胞））に局所投与され得る。
特に、阻害性ＲＮＡ剤及びそれをコードする核酸ベクターは、てんかん型活動の増加を示すと判定された脳組織等の対象の脳組織に局所投与され得る。脳への局所投与は、一般に、選択されたシナプス結合細胞集団の細胞の少なくとも一部が組成物と接触するように、脳細胞（例えば、神経細胞）への阻害性ＲＮＡ剤又はそれをコードする核酸ベクターの送達に適した任意の方法を含む。ベクターは、ニューロン、星状膠細胞、又はその両方を含むＣＮＳの任意の細胞に送達され得る。一般に、ベクターは、例えば、脊髄、脳幹（延髄、橋、及び中脳）、小脳、間脳（例えば、視床及び視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質（例えば、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、又は前頭葉の皮質領域）、又はそれらの組み合わせの細胞、又はその中の細胞の任意の適切な亜集団を含むＣＮＳの細胞に送達される。送達のための更なる部位には、赤色核、扁桃体、嗅内皮質、及び視床の腹外側核又は前部核のニューロンが含まれる。
本開示のベクターは、定位注射又は微量注射によってＣＮＳの実質又は心室に直接送達され得る。特定の例では、本開示のベクターは、対象の脳内の１つ以上のてんかん焦点に直接送達され得る。例えば、対象に、本開示のベクターを、定位注射によって、不等皮質（例えば、海馬）又は新皮質（例えば、前頭葉）の一方又は両方の半球に直接投与してもよい。特定の例では、対象は、海馬の一方又は両方の半球への定位注射によって本開示のベクターを直接投与される。あるいは、本開示のベクターは、例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０を含むがこれらに限定されないＣＮＳ組織に対する指向性を示すベクターとの関連で、静脈内注射によって投与され得る。
本開示のベクターを特定の領域及びＣＮＳ細胞の特定の集団に特異的に送達するために、ベクターは定位的マイクロインジェクションによって投与され得る。例えば、対象は、定位置に外科的に固定された（頭蓋骨にスクリューされた）定位フレームベースを有し得る。定位フレームベース（例えば、基準マークを有するＭＲＩ適合性の定位フレームベース）を有する脳を、高分解能ＭＲＩを使用して画像化する。その後、ＭＲＩ画像は、定位ソフトウェアを実行するコンピュータに転送される。一連の冠状、矢状及び軸方向画像を使用して、本開示の組成物を脳に注射するために使用されるカニューレ又は注射針の標的注射部位及び軌跡を決定する。ソフトウェアは、軌跡を定位フレームに適した３次元座標に直接変換する。穴が入口部位の上方に穿孔され、定位装置は、注射針が所与の深さに埋め込まれた状態で位置決めされる。組成物（本明細書に開示される組成物等）は、標的部位に注射され得る。組成物がウイルス粒子を産生するのではなく組み込みベクターを含む場合、ベクターの広がりは小さく、主に注射部位からの受動拡散の機能である。拡散の程度は、流体担体に対するベクトルの比を調整することによって制御することができる。
追加の投与経路はまた、直接可視化下でのベクターの局所適用（例えば、表在性皮質適用、又は他の非定位的適用）を含み得る。ベクターは、髄腔内（例えば、大槽に直接）、心室内（例えば、脳室内（ＩＣＶ）注射の使用）、又は静脈内注射によって送達され得る。
一例では、本開示の方法は、定位注射による脳内又は脳室内投与を含む。しかしながら、他の既知の送達方法もまた、本開示に従って適合され得る。例えば、ＣＮＳにわたる組成物のより広範な分布のために、例えば腰椎穿刺によって脳脊髄液に注入することができる。組成物を末梢神経系に向けるために、組成物を脊髄、１つ以上の末梢神経節、又は目的の身体部分の皮膚の下（皮下又は筋肉内）に注射することができる。特定の状況では、組成物は血管内アプローチを介して投与することができる。例えば、組成物は、血液脳関門が妨害されている又は妨害されていない状況で動脈内（頸動脈）に投与することができる。更に、より全体的な送達のために、組成物は、マンニトールを含む高張性溶液の注入によって達成される血液脳関門の「開口部」中に投与することができる。
任意の所与の場合における投与のための最も適切な経路は、投与される特定の組成物、対象、治療される特定のてんかん、医薬製剤方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、対象の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、対象の食事、及び対象の排泄率に依存する。
併用療法
本明細書に開示される組成物は、他の治療薬又は物理的介入（例えば、リハビリテーション療法又は外科的介入）を含む１つ以上の追加の治療モダリティ（例えば、１、２、３又はそれ以上の更なる治療モダリティ）と組み合わせて、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を治療するために、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与され得る。２つ以上の薬剤を同時に投与することができる（例えば、全ての薬剤の投与は、１５分以内、１０分以内、５分以内、２分以内に行われる）。薬剤は、共製剤を介して同時に投与することもできる。２つ以上の薬剤はまた、２つ以上の薬剤の作用が重複し、それらの複合効果が、症状又は障害に関連する他のパラメータの減少が、１つの薬剤又は処置を単独で又は他の薬剤の非存在下で送達した場合に観察されるであろうものよりも大きいようなものであるように、連続的に投与され得る。２つ以上の処置の効果は、部分的に相加的であってもよく、完全に相加的であってもよく、又は相加的よりも大きくてもよい（例えば、相乗的）。各治療薬の連続的又は実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路、及び粘膜組織を介した直接吸収を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によって行うことができる。治療剤は、同じ経路又は異なる経路によって投与することができる。例えば、組み合わせの第１の治療薬は静脈内注射によって投与することができ、組み合わせの第２の治療薬は化合物含浸マイクロカセット中で局所的に投与することができる。第１の治療薬は、第２の治療薬の直前、最大１時間、最大２時間、最大３時間、最大４時間、最大５時間、最大６時間、最大７時間、最大８時間、最大９時間、最大１０時間、最大１１時間、最大１２時間、最大１３時間、１４時間、最大１６時間、最大１７時間、最大１８時間、最大１９時間、最大２０時間、最大２１時間、最大２２時間、最大２３時間、最大２４時間又は最大１～７、１～１４、１～２１若しくは１～３０日後に投与され得る。
対象がてんかんを有する又はてんかんを発症するリスクがあると診断された場合（例えば、ＴＬＥ）、第２の治療薬は、バルプロ酸、ラモトリギン、エトスクシミド、トピラマート、ラクトサミド、レベチラセタム、クロバザム、スチリペントール、ベンゾジアゼピン、フェニトイン、カルバマゼピン、プリミドン、フェノバルビタール、ガバペンチン、プレガバリン、チアガビン、ゾニサミド、フェルバメート、及び／又はバトリンを含むがこれらに限定されない１つ以上の抗てんかん薬（ＡＥＤ）を含み得る。いくつかの場合、第２の治療様式は、例えば、放射線手術（例えば、ガンマナイフ又はレーザーアブレーション）等の当技術分野で周知の方法を使用した、例えばてんかん原性脳領域（例えば、側頭葉切除術）の外科的切除等の外科的介入であり得る。本開示の方法及び組成物と共に投与することができる追加の治療様式には、迷走神経刺激、脳深部刺激、経頭蓋磁気刺激、及びケトン食療法が含まれる。
特定の例では、対象には、免疫抑制剤が投与されてもよく、この免疫抑制剤には、コルチコステロイド単独、又はタクロリムス若しくはラパマイシン（シロリムス）のレジメンが含まれ、例えば、ミコフェノール酸と組み合わせて、又はコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／若しくはメチルプレドニゾロンと組み合わせて投与され得る。当技術分野で周知の他の免疫抑制レジメンを、本開示の方法及び組成物と併せて使用することができる。そのような免疫抑制処置は、本明細書に記載の阻害性核酸分子（例えば、阻害剤ＲＮＡ剤）の投与前、投与後、又は投与と同時に投与され得る。
投薬
本明細書に記載されるように治療することができる対象は、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有すると診断された、又はてんかんを発症するリスクがある対象である。開示される方法及び組成物を使用して治療することができる対象には、例えば、てんかんの治療に関連する１つ以上の以前の治療的介入を受けたことがある対象、又はてんかんの治療のための以前の治療的介入を受けたことがない対象が含まれる。
本開示の阻害性ＲＮＡ剤は、以下の１つ以上（例えば、以下の２つ以上、３つ以上、４つ以上）をもたらすのに有効な量及び時間で投与され得る：（ａ）対象の細胞中のＧｒｉｋ２ｍＲＮＡ及び／又はＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを低下させる；（ｂ）障害の発症を遅らせる；（ｃ）対象の生存を増加させる；（ｄ）対象の進行のない生存を増加させる；（ｅ）ＧｌｕＫ２タンパク質機能の回復又は変化；（ｆ）発作再発のリスクを低下させる；（ｇ）ＣＮＳにおける興奮毒性及び関連する神経細胞死の軽減；（ｈ）ＣＮＳの患部（例えば、海馬）における生理学的興奮阻害バランスの回復；及び／又は（ｉ）てんかん（例えば、てんかん発作の頻度、持続期間又は強度、脱力感、不在、突然の錯乱、理解又は発話の困難、認知障害、運動障害、めまい、又はバランス若しくは協調の喪失、麻痺、及び情動調節不全）の１つ以上症状の軽減。
したがって、本開示は、てんかん（例えば、ＴＬＥ）の処置を必要とする対象においててんかん（例えば、ＡＳＯ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡ）を治療するための方法であって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的に結合し、ＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害する阻害性ＲＮＡをコードする阻害性ポリヌクレオチドを含む有効量のベクターを対象に投与することを含む方法に関する。特に、本発明は、てんかんの治療を必要とする対象においててんかんを治療する方法であって、治療有効量の本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤又はそれをコードする核酸ベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。
開示される方法及び組成物を利用して治療されるてんかんは、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）、良性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、乳児痙攣、若年性ミオクロニーてんかん、若年性欠神てんかん、小児期欠神てんかん（ピクノーレプシー）、熱湯てんかん、レノックス－ガストー症候群、ランドークレフナー症候群、ドラベ症候群、進行性ミオクロヌスてんかん、反射性てんかん、ラスムッセン症候群、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹部てんかん、巨大両側性ミオクロヌス、月経随伴性てんかん、ジャクソニアン発作障害、ラフォーラ病、及び光感受性てんかんであり得る。例えば、対象は、焦点発作又は全般発作を特徴とするＴＬＥ等のＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）と診断され得る。いくつかの場合、てんかんは、例えば、治療に反応しないてんかん（すなわち、薬物耐性てんかん、例えば薬物耐性ＴＬＥ）等の慢性てんかんであり得る。
てんかんの治療のために、並びに本明細書で論じられるように発作及びてんかん型放電の症状を改善するために、有用なポリヌクレオチドは、機能性ＲＮＡ、例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈｍｉＲＮＡをコードするベクターによって展開され得る。
開示された組成物は、当業者によって適切であると決定された量で投与することができる。いくつかの場合、ｒＡＡＶを、対象あたり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で投与する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶを、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４ＧＣ／ｋｇ（対象の総重量）の用量で投与する。
いくつかの場合、１×１０１２～５×１０１４ＧＣを投与する。いくつかの場合、１×１０１２～５×１０１４ＧＣの一定用量を小児患者又は成人患者に投与する。
いくつかの場合、投与量は、患者の脳質量１グラム当たりに患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与されるＧＣの数（例えば、髄腔内注射、例えば、後頭下穿刺又は腰椎穿刺）によって測定される。いくつかの場合、患者の脳質量のグラム当たり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０５ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０６ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０７ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０８ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０９ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０１０ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり５×１０１０ゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０９～１×１０１１のゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０９～５×１０１０のゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり２×１０９～９×１０１０のゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり５×１０９～１×１０１１のゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０１０～５×１０１０のゲノムコピーが投与される。いくつかの場合、患者の脳質量１グラム当たり１×１０１０～９×１０１０のゲノムコピーが投与される。患者（対象）の脳重量推定は、ＭＲＩ脳体積測定から得られ、これは脳質量に変換され、投与された薬物の正確な用量を計算するために利用される。公開されたデータベースを使用して、年齢範囲に基づいて脳重量を推定することもできる。
任意に、開示される薬剤は、本明細書に記載されるように、対象への送達に適した薬学的に許容され得る組成物の一部として投与され得る。開示される薬剤は、当業者によって容易に決定され得るように、所望の投与量を提供し、及び／又は治療上有益な効果を誘発するのに十分な量でこれらの組成物内に含まれる。
本明細書に記載される開示される組成物は、対象を処置するために、又は上記の結果（例えば、対象における疾患の１つ以上の症状の軽減）の１つを達成するために十分な量（例えば、有効量）及び時間にわたって投与され得る。開示される組成物は、１回又は複数回投与され得る。開示される組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、２日に１回、週に１回、週に２回、週に３回、隔週に１回、月に１回、隔月に１回、年に２回、又は年に１回投与され得る。治療は、別々の（例えば、注射）又は連続的（例えば、インプラント又は注入ポンプを介した治療）であり得る。対象は、治療に使用される組成物及び投与経路に応じて、本開示の組成物の投与後１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月又はそれ以上の治療有効性について評価され得る。治療有効性を評価する方法は、本明細書に開示されている（例えば、「医薬用途」を参照）。評価の結果に応じて、処置を継続又は中止してもよく、処置頻度又は投与量を変化させてもよく、又は患者を異なる開示される組成物で治療してもよい。対象は、個別の期間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月）又は疾患若しくは状態が緩和されるまで治療され得るか、又は治療は、治療される疾患若しくは状態の重症度及び性質に応じて慢性的であってもよい。例えば、ＴＬＥと診断され、本明細書に開示される組成物で処置される対象には、最初又はその後の処置ラウンドが治療的利益を誘発しない場合（例えば、本明細書に開示される症状のいずれか１つの低下又は対象の罹患した脳領域におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベル若しくはＧｌｕＫ２タンパク質レベルの低下）、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）追加の治療が施され得る。
キット
本開示はまた、てんかん（例えば、治療抵抗性ＴＬＥ等のＴＬＥ）の予防又は治療に使用するための、対象（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ）におけるＧｒｉｋ２遺伝子の発現を阻害する本明細書に開示される組成物を含むキットを提供する。キットは、任意に、組成物を対象に送達するための薬剤又はデバイスを含み得る。他の例では、キットは、シリンジ又は針等の１つ以上の滅菌アプリケータを含み得る。更に、キットは、任意に、他の薬剤、例えば麻酔薬又は抗生物質を含んでもよい。キットはまた、本明細書に開示される方法を実施するように医師等のキットの使用者に指示する添付文書を含むことができる。
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの説明を当業者に提供するために記載され、本開示の純粋に例示的なものであることを意図し、本発明者らがそれらの開示として見なす範囲を限定することを意図しない。
実施例１：Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ポリヌクレオチドの設計及び合成
Ｇｒｉｋ２標的化阻害性ポリヌクレオチド配列を、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ、例えば、配列番号１６４のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列に対するそれらの予測される相補性に基づいて設計し、当技術分野で公知の方法に従って合成した。阻害性ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイズするアンチセンスガイド鎖配列と、ガイド鎖に実質的に相補的なセンスパッセンジャー鎖配列とを含むステム－ループ配列を含む。抗Ｇｒｉｋ２ステム－ループ配列を、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨＳＹ５Ｙ又はマウスＮ２Ａ神経細胞株にトランスフェクトすることができる。全ＲＮＡを抽出することができ、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のレベルを定量し、ドローシャ切断部位及びダイサー切断部位を同定するために、低分子ＲＮＡ配列決定を行う。Ｇｒｉｋ２ノックダウン有効性を測定するために、コンストラクトをＨＥＫ ２９３細胞にヒトＧｒｉｋ２ ｃＤＮＡと同時トランスフェクトすることができ、ｍＲＮＡを抽出することができ、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対するリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を実施することができる。更に、合成ステム－ループＲＮＡをＳＨＳＹ５Ｙ細胞にトランスフェクトし、続いてｍＲＮＡ抽出及びＧｒｉｋ２ ＲＴ－ｑＰＣＲを行うことができる。
実施例２：Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する１つ以上の阻害性ポリリボヌクレオチドをコードするウイルスベクターの投与によるヒト対象におけるてんかんの治療
てんかん（例えば、ＴＬＥ、例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）を有すると診断されたヒト対象（例えば、小児対象又は成人対象）等の対象は、限定するものではないが、以下の１つ以上の（例えば、以下の２つ以上、３つ以上、４つ以上）を含む１つ以上のてんかん症状を軽減するために、本明細書に記載の組成物で治療することができる：（ａ）発作再発のリスク；（ｂ）ＣＮＳにおける興奮毒性及び関連する神経細胞死の軽減；（ｃ）ＣＮＳの患部における生理学的興奮阻害バランスの回復；（ｄ）てんかん（例えば、てんかん発作の頻度、持続期間又は強度、脱力感、不在、突然の錯乱、理解又は発話の困難、認知障害、運動障害、めまい、又はバランス若しくは協調の喪失、麻痺、及び情動調節不全）の１つ以上症状の軽減、並びに（ｅ）海馬における歯状回顆粒細胞の再発性苔状線維の病理学的発芽。治療方法は、任意に、投与前に本開示の組成物による処置の候補として対象を診断又は同定することを含み得る。組成物は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ポリヌクレオチド（例えば、本開示の阻害性ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド）又はそれ（例えば、ＡＡＶ９ベクター）をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクターのようなウイルスベクター、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、若しくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、又はレンチウイルスベクターから選択される血清型のいずれか１つを有するＡＡＶベクター）を含むことができる。例示的な阻害性ポリヌクレオチドは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１の核酸配列のいずれか１つと８５％以上（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上（例えば、１００％））の配列同一性を有し得るか、又はそれらは、配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９及び２３８～２４１の１つ以上（代表的なコンストラクト図については、図１Ｂ～図１Ｗ、図２Ｂ～図２Ｑ、図３Ｂ～図３Ｌ、図４Ｂ～図４Ｆ、図５Ｂ～図５Ｅ、及び図６Ａ～図６Ｂも参照）の配列を有し得る。更に、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、阻害性ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドの異種発現を促進する調節配列、例えばプロモーター配列を含有する発現カセットを組み込むことができる（表１１及び表１２を参照）。
対象は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下若しくは経皮投与を含む任意の適切な手段によって、又は動物の中枢神経系（例えば、定位注射、実質内注射、髄腔内注射又は脳室内注射）に直接投与することによって、組成物を投与され得る。組成物は、治療有効量で投与することができ、例えば、対象あたり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４ＧＣ／ｋｇ（対象の体重）の用量で、患者の脳質量１グラム当たり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５ＧＣの用量で投与される。対象の脳重量推定は、ＭＲＩ脳体積測定から得られ、これは脳質量に変換され、投与された薬物の正確な用量を計算するために利用される。公開されたデータベースを使用して、年齢範囲に基づいて脳重量を推定することもできる。薬剤は、隔月、１ヶ月に１回、２週間に１回、又は少なくとも１週間に１回以上（例えば、１週間に１、２、３、４、５、６、又は７回以上）投与することができる。組成物は、第２の治療薬（例えば、抗てんかん薬）、外科的介入（例えば、外科的切除、放射線手術、ガンマナイフ、又はレーザーアブレーション）、迷走神経刺激、脳深部電気刺激又は経頭蓋磁気刺激等の第２の治療様式と組み合わせて投与され得る。
組成物は、以下の１つ以上（例えば、以下の２つ以上、３つ以上、４つ以上）：（ａ）発作再発のリスク；（ｂ）ＣＮＳにおける興奮毒性及び関連する神経細胞死の軽減；（ｃ）ＣＮＳの患部における生理学的興奮阻害バランスの回復；（ｄ）てんかん（例えば、てんかん発作の頻度、持続期間又は強度、脱力感、不在、突然の錯乱、理解又は発話の困難、認知障害、運動障害、めまい、又はバランス若しくは協調の喪失、麻痺、及び情動調節不全）の１つ以上症状の軽減、並びに（ｅ）海馬における歯状回顆粒細胞の再発性苔状線維の病理学的発芽を１０％以上（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）軽減するのに十分な量で対象に投与され得る。上記のてんかんの症状は、神経学的検査、脳波、脳磁図、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ｆＭＲＩスキャン、ビデオグラフィー、及び視覚観察等の標準的な方法を使用して評価することができる。組成物の投与前後のてんかん症状の測定値を比較して、治療の有効性を評価することができる。上記のてんかんの症状の軽減の所見は、組成物が対象のてんかんを首尾よく治療したことを示す。
図１Ｂ～図１Ｗ、図２Ｂ～図２Ｑ、図３Ｂ～図３Ｌ、図４Ｂ～図４Ｆに示される黒丸の数字は、開示された抗Ｇｒｉｋ２コンストラクトの設計のための異なる理論的根拠に対応する。したがって、数値で指定された各論理は以下の通りである：
１． ＲＩＳＣアセンブリは、二本鎖からほつれたり遊離したりする傾向がより大きい５’末端を有するｍｉＲＮＡ鎖に有利である（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５：１９９－２０８（２００３）；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５：２０９－１６（２００３）；及びＭｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ １２：ｅ１６２７（２０２１））。本明細書に開示されるコンストラクトは、ガイド鎖の５’末端での塩基対合を不安定化することによって、ＲＩＳＣによるガイド選択に有利である（Ｕ－Ａ対、Ｕ－Ｇゆらぎ対、又はミスマッチの導入、又は１つのＧ－Ｃ対の削除）。
２． ＲＩＳＣアセンブリは、５’末端を有し、二本鎖からほつれたり、遊離したりする傾向が大きいｍｉＲＮＡ鎖に有利である。本明細書に開示されるコンストラクトは、パッセンジャー鎖の５’末端にＧ－Ｃ対を導入することによる、パッセンジャー鎖の５’末端での塩基対合を強固にすることによるＲＩＳＣによるパッセンジャー選択を嫌う。
３． 小さなガイドＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、アルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質のリン酸結合ポケットに固定され、その標的ＲＮＡとの塩基対合に利用できない（Ｍｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ １２：ｅ１６２７（２０２１）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３４：６６６－７０（２００５）；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３４：６６３－６（２００５）；及びＧｈｉｌｄｉｙａｌ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ １６：４３－５６（２０１０））。
４． ５’－Ｕは、ＡＧＯ２会合に最も好ましいヌクレオチドである（Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｌｅｎｃｅ ２：４（２０１１）；Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６５：８１８－２２（２０１０）；Ｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５０：３４４－５５（２０１３）；及びＣｚｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１９－３１（２０１１））。ガイド鎖の最初の（５’）ヌクレオチドとしてのＵの導入、及びパッセンジャー鎖の最初の（５’）ヌクレオチドとしてのＧ又はＣの導入は、ＡＧＯ２会合を促進する。
５． ガイドとその標的ｍＲＮＡとの間の３’ミスマッチの導入は、哺乳動物細胞における豊富なｍＲＮＡのより強力なサイレンシングをもたらす（Ｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５０：３４４－５５（２０１３）；Ｂｏｆｉｌｌ－Ｄｅ Ｒｏｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０３：１５７－６６（２０１６）；及びＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：５８９－９５（２００３））。シード領域（ガイドヌクレオチド２－８（ｇ２－ｇ８））及びガイド鎖の中央領域における広範な相補性は、ＡＧＯ２媒介ｍＲＮＡ標的切断にとって重要であるが、３’末端での塩基対合は必要ではない。実際、位置ｇ１８、ｇ１９、ｇ２０、ｇ２１での標的ｍＲＮＡとのミスマッチは、標的ｍＲＮＡによって媒介される非負荷活性であるＡＧＯ２からのガイドＲＮＡの放出を減衰させる。
６． ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間のシード領域（ガイド鎖ヌクレオチド位置２～８）のミスマッチは、ＲＩＳＣローディング中のパッセンジャー鎖の巻き戻しを促進し、それによってＲＩＳＣ成熟を促進する（Ｇｈｉｌｄｉｙａｌ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ １６：４３－５６（２０１０）；Ｔｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３０：２９９－３０８（２００７）；Ｍａｔｒａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １２３：６０７－２０（２００５）；及びＫａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５３－６０（２００９））。本明細書に開示されるコンストラクトは、ガイド鎖のシード領域にミスマッチを導入することによってガイドＲＩＳＣ複合体の成熟を促進するか、又はミスマッチをパッセンジャー鎖の対応する領域（パッセンジャー鎖ヌクレオチド位置２～８）の対合するヌクレオチドに変換することによって、パッセンジャーＲＩＳＣ複合体の成熟を低減又は防止する。
７． ステム領域とループ領域との接合部におけるＵ－Ｇゆらぎを置き換えるためのＧ－Ｃ又はＵ－Ａ塩基対合の導入は、ダイサータンパク質による切断を促進する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３：１１９１－２０３（２０１８））。
８． ステム－ループ構造に近接する隣接領域（すなわち、ドローシャ切断部位）にＧ－Ｃ塩基対合を導入すると、ドローシャによる開裂の精度が向上する。
９． Ｅ－ｍｉＲ－１２４のスキャフォルド構造を模倣することによる、ステム領域における対合又はミスマッチ塩基対の導入。
実施例３：合成阻害性ポリヌクレオチドを使用したＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏノックダウン有効性
本開示の阻害性ポリヌクレオチドを使用したノックダウンのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を決定するために、ステム－ループＲＮＡをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、ヌクレアーゼフリー二重鎖緩衝液中で再構成した。９５°Ｃで２分間インキュベートし、続いて室温まで徐々に冷却した後、分子内アニールしたオリゴヌクレオチドを得た。ｓｉＲＮＡ陰性対照（ｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ、カタログ番号ＡＭ４６２１）及びＧｒｉｋ２を標的化する２つの陽性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰｏｓｉｔｉｖｅ－１お酔いｓｉＰｏｓｉｔｉｖｅ－２、カタログ。番号４３９２４２０及び４３９２４２０）をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いた１０ｎＭのアニールされたステム－ループＲＮＡオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡによるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞のトランスフェクションを、製造業者のプロトコルに従って行った。ＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物（ＲＮＡｉＭＡＸのみ）を更なるトランスフェクション対照として使用した。４連でトランスフェクションを行った。細胞をトランスフェクション後７２時間まで３７°Ｃ、５％ＣＯ２で更に培養した後、細胞溶解及びｑＲＴ－ＰＣＲに供した。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現レベルをアクチン（ＡＣＴＢ）に対して正規化した。相対的Ｇｒｉｋ２発現レベルを、１００％に設定したｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ対照との比較によって得た。
陰性対照及びトランスフェクション試薬単独（ＲＮＡｉＭＡＸ）と比較して、試験した全てのステム－ループＲＮＡオリゴヌクレオチド並びに陽性対照は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウンを示した（図７）。統計学的に有意なノックダウン率（残存ｍＲＮＡ発現の４２％～６９％）がトランスフェクションの７２時間後に得られた。Ｇｒｉｋ２ノックダウン有効性が、ｍｉＲＮＡコンストラクトＡ、Ｃ及びＤと比較して、試験したコンストラクトによって維持された。
実施例４：ＲＮＡ配列決定は、マウスニューロンにおける好ましいマイクロＲＮＡプロセシング特性を示す。
ステム－ループ配列を内因性マイクロＲＮＡスキャフォルド（すなわち、Ｅ－ｍｉＲ－３０、Ｅ－ｍｉＲＮＡ－１２４－３又はＥ－ｍｉＲ－２１８－１）に組み込み、ＡＡＶゲノム（ｐｒｏ－ＡＡＶ）をコードするシスプラスミドにおいてニューロン特異的プロモーターｈＳｙｎ１の調節制御下でサブクローニングした（図５Ａ～５Ｅ）。プラスミドをＮ２Ａマウスニューロン細胞にトランスフェクトした。マウスＮ２Ａ神経芽細胞を２４ウェルプレートに９．０Ｅ４細胞／ウェルで播種し、２４時間後、細胞を２５０ｎｇのプラスミド及び１．２μｌのリポフェクタミン３０００／ウェルでトランスフェクトした。４８時間後、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、低分子ＲＮＡが濃縮されたＲＮＡを単離し、ライブラリー調製及び低分子ＲＮＡ配列決定に供した。マイクロＲＮＡ配列決定ライブラリーを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＢＩＯＯ製のＮＥＸＴＦＬＥＸ（登録商標）低分子ＲＮＡキットを使用して作製した。ＭｉＳｅｑプラットフォームで配列決定を行った。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。Ｔｒｉｚｏｌによって全ＲＮＡを抽出し、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）製のＮＥＢＮＥＸＴ（登録商標）キットを使用してマイクロＲＮＡ配列決定ライブラリーを生成した。配列決定をＮｏｖｏｇｅｎｅにおけるＨｉＳｅｑに対して行った。
合理的に設計されたｍｉＲＮＡを発現させ、プラスミドトランスフェクション後にマウスＮ２Ａニューロンにおいてプロセシングした。親配列（コンストラクトＡ、Ｃ、及びＤ）と比較して、合理的に設計されたマイクロＲＮＡコンストラクトは、ガイド対パッセンジャー（Ｇ：Ｐ）比の改善を示した（表１４を参照）。具体的には、コンストラクトＡのＧ：Ｐ比０．８は、コンストラクトＡと比較して、１つ以上の修飾を有する合理的に設計されたコンストラクト（コンストラクト番号１～４）の４つについて１１～２７の比に増加した。パッセンジャーの減少並びに潜在的なｍｉＲＮＡ成熟の改善の恩恵を受けて、ガイド鎖レベル（総ｍｉＲＮＡプール中のガイド鎖数の割合）が、コンストラクト番号１～４については０．２５％から１．３～２．６％に増加した。コンストラクトＣのＧ：Ｐ比１及びガイドレベル２．８％はコンストラクト番号３９、番号４０及び番号４１でそれぞれ１００及び５％～２１％超に増加した。コンストラクト番号５０及び番号５１は、コンストラクトＤのＧ：Ｐ比１に対して２０００を超える改善されたＧ：Ｐ比を示した。最後に、コンストラクト番号５１のガイドレベルは５．１％に増加した。
同様の結果が、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙを使用して観察された。元のコンストラクト及び再設計されたコンストラクトの両方におけるＧＩのＧ／Ｐ比は、Ｎ２Ａ細胞で観察されたものよりも高かった。これは、２つの細胞系における生合成／分解ホメオスタシスの違いに起因し得るか、又は配列決定ライブラリー調製に使用される異なるキットに起因し得る。
２つの再設計コンストラクト番号３（ＧＩ、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ａ）及び番号５１（ＭＷ、Ｅ－ｍｉＲ２１８－１）を選択し、２つのコンストラクト番号１００（図６Ａ、配列番号２５６）及び番号１０１（図６Ｂ、配列番号２５７）において２つの異なる順序で連結した。強いクラスター効果が両方のコンカテマーコンストラクトで観察され、Ｎ２Ａ細胞では単一コンストラクト番号１０２（図５Ｂ）及び番号１０３（図５ Ｃ）と比較してＭＷが増加し、ＧＩが抑制された。それにもかかわらず、いずれかのコンカテマーによって産生されたＧＩ及びＭＷの総産生は、スタッファー配列を有する単一コンストラクトで別々に産生されたものよりも高かった（表１５）。
元の４つのコンストラクトから４２の追加の再設計を生成した（コンストラクトＡ（表１６）、コンストラクトＢ（表１７）、コンストラクトＣ（表１８）及びコンストラクトＤ（表１９））。トランスフェクションの数及び配列決定のための試料を減らすために、Ｎ２Ａ細胞において２～３個のプラスミドの同時トランスフェクション（例えば、表１６、表１７及び表１８のコンストラクト番号７、番号４２及び番号２７の同時トランスフェクション）を行い、続いて低分子ＲＮＡ配列決定を行った。これらの再設計のほとんどは、元のコンストラクトと比較して改善されたガイド／パッセンジャー比を示した。特に、０．０１未満のガイド／パッセンジャー比を示したＧ９ガイドを含むコンストラクトＢは、９０．５のガイド／パッセンジャー比を示したコンストラクト番号３６をもたらす変化によって劇的に改善された（表１７）。ｈｓａ－ｍｉｒ－３０ａのスキャフォルド内のＧＩをコードする４つの再設計は、１００を超える改善されたガイド／パッセンジャー比を示した（表１６）。試料中のプラスミドとの同時トランスフェクションのために、総ｍｉＲＮＡプール中のガイド％は、各再設計コンストラクトについて過小評価され得る。
実施例５：ＧＬＵＫ２タンパク質は、再設計されたコンカテマーをコードするＡＡＶ９ベクターで処置した後、マウス皮質神経細胞で有意に減少する。
タンパク質収集のために、Ｐ０－Ｐ１ Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスから解離した皮質ニューロンを調製し、ニューロンを６ウェルプレートに５．５ｅ＋５細胞／ウェルの濃度で播種した。プレーティングの２又は３日後（ｉｎ ｖｉｖｏ日数、ＤＩＶ２－３）、培地の半分を除去し、ウイルスをＭＯＩ ７．５Ｅ＋４で添加した。ＤＩＶ１３で、マウスニューロン培養物を溶解し、溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥ及び免疫ブロットに使用した。免疫染色のために、以下の抗体を適用した：ウサギ抗ＧｌｕＫ２／３（クローンＮＬ９０４－９２１；Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びマウス抗β－アクチン（Ａ５３１６；Ｓｉｇｍａ）を一次抗体として使用し、ヤギで産生された適切な８００ｎｍフルオロフォア結合二次抗体（ＩＲＤｙｅ８００ヤギ抗マウスＬｉ－ＣＯＲ９２６－３２２１０又はＩＲＤｙｅ８００ヤギ抗ウサギＬｉ－ＣＯＲ９２６－３２２１１）を二次抗体として使用した。標的タンパク質を、Ｌｉ－ＣＯＲにおいて８００ｎｍで読み取ることによって検出した。Ｅｍｐｉｒｉａスタジオソフトウェアを用いて分析を行った。定量化のために、各レーンの蛍光シグナルの強度をベータ－アクチン発現によって、次いで対照条件によって正規化した。
ステム－ループＲＴ－ｑＰＣＲによるＲＮＡ収集及びｍｉＲＮＡ定量化のために、マウス皮質培養物をＤＩＶ １３で氷冷ＰＢＳ中ですすぎ、次いで７００μｌのＱｉａｚｏｌ（ＱＩＡＧＥＮ）中に掻き取った。ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ２１７００４）を用いて全ＲＮＡを抽出した。試料の全ＲＮＡ含有量及び質を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）Ｏｎｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）によって評価した。２０ｎｇの全ＲＮＡ又は合成オリゴＲＮＡ（１０３～１０９コピー）を、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット及びＧＩ又はＭＷ配列に特異的な逆転写プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写し、続いてＴＡＱＭＡＮ（商標）ｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ及びＧＩ又はＭＷに特異的なｑＰＣＲプライマー／プローブを用いることによってｑＰＣＲを行った。試料中のＧＩ又はＭＷのコピーを、合成ＧＩ又はＭＷオリゴＲＮＡを用いて確立された標準曲線から計算した。
結果
単一のコンストラクトベクター（番号１０２、配列番号２５２；番号１０３、配列番号２５３）と比較して、コンカテマーベクター番号１００及び番号１０１（それぞれ配列番号２５６及び２５７）は、ＧＩとＭＷの両方を産生し、したがってＭＣＮ細胞においてより高レベルの治療用ｍｉＲＮＡを産生した（図８Ａ）。クラスタ効果は、同じ転写物中でＧＩと連結された場合にＭＷ発現が増強されると思われるので存在し得る。陰性対照ＡＡＶ ９ ＲＮＡヌルベクター（Ｃｔｒｌ）は、ベクターゲノム中にスタッファー配列を保有するが、ｍｉＲＮＡコンストラクトを全く含有しない。一貫して、コンカテマーベクター番号１００及び番号１０１で処置したＭＣＮ試料では有意なＧＬＵＫ２低下が観察されたが、単一コンストラクトベクターでは観察されなかった（図８Ｂ）。
実施例６：Ｇｒｉｋ２転写物は、再設計されたコンカテマーをコードするＡＡＶ９ベクターで処置した後、ヒトＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎ細胞において有意に減少する。
ｉＰＳＣ誘導性ＩＣＥＬＬ（登録商標）ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎ（ＦｕｊｉｆｉｌｍカタログＲ １０３４）を解凍し、ＰＬＯ／マトリゲルコーティング６ウェルプレートに２Ｅ＋６細胞／ウェルの密度で細胞を播種した。２４時間後、ＡＡＶ９ベクター番号１００又はＲＮＡヌルベクター番号１０６（配列番号２６２）を２ｍＬの新鮮培地中、３Ｅ＋５のＭＯＩで細胞に添加した（条件あたりｎ＝４）。スパイクインＲＮＡオリゴ（５０，０００細胞あたり０．１ｎＭの９つのオリゴ混合物の３ｕＬ）を添加したＱｉａｚｏｌ溶解緩衝液を添加することによって、形質導入の１１日後に細胞を回収した。Ｑｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙキットを使用して大きなＲＮＡ及び低分子ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ濃縮画分を分離するためのプロトコルに従って、全ＲＮＡを抽出し、ｍｉＲＮＡを濃縮した。マイクロＲＮＡ配列決定ライブラリーを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＢＩＯＯ製のＮＥＸＴＦＬＥＸ（登録商標）低分子ＲＮＡキットを使用して作製した。配列決定をＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｇｅｎｅｗｉｚ）で行った。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーも調製し、配列決定した。
低分子ＲＮＡ配列決定分析は、合成ｍｉＲＮＡ ＧＩ及びＭＷが、コンストラクト番号１００で処置されたｉＰＳＣ由来ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎ細胞において、高いガイド／パッセンジャー比で生理活性レベルで処理されたことを示した（表２０）。５０％の形質導入効率で、Ｇｒｉｋ２転写物は、番号１００処置されたｉＰＳＣ由来ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎ細胞（ｎ＝４）において１８．５％減少した（図９）。
実施例７：コンカテマーベクターを形質導入したヒト海馬器官型切片では発作活動が抑制された。
ヒト器官型切片を３０～３２°Ｃに維持した記録チャンバーに個々に移し、５μＭのガバジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で酸素化（９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２）ＡＣＳＦを連続的に灌流し（２～３ｍＬ／分）、ＡＣＳＦは以下を含有した（ｍＭ単位）：ＮａＣｌ（１２６．０）、ＫＣｌ（３．５）、ＮａＨ２ＰＯ４（１．２）、ＮａＨＣＯ３（２６）、ＭｇＣｌ２（１．３）、ＣａＣｌ２（２．０）、及びグルコース（１０）、ｐＨ～７．４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）．歯状回の顆粒細胞層に配置された単極ニクロム線を用いて局所電場電位（ＬＦＰ）記録を行った。記録にはＤＡＭ－８０アンプを用いた（低フィルタ、０．１Ｈｚ；ハイパスフィルタ、３ＫＨｚ；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フロリダ州サラソータ）。コンピュータにＤｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデータをデジタル化し（２０ｋＨｚ）、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．１ソフトウェア（クランプ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて取得した。Ｃｌａｍｐｆｉｔ ９．２（ＰＣｌａｍｐ）及びＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ ６．０．１（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、ジョージア州ディケーター）を使用して、シグナルをオフラインで分析した。
結果
コンカテマーベクター番号１００（ベクターマップを図１４に示す。）は、４－ＡＰ／ガバジンの存在下での過興奮性条件下（図１０Ａ）及び生理学的条件下（図１０Ｂ）でｅｘ－ｖｉｖｏでＴＬＥ海馬からの自発発作を抑制した。
実施例８：ピロカルピンてんかんマウスモデルにおける生理学的及び行動研究は、てんかんの症状の改善を示す。
ＡＡＶ投与
ピロカルピンの全身注射によって少なくとも２ヶ月間以前にてんかん性にされていた雄のスイスマウスを定位フレームに入れた。４つの穴を開けて、ＡＡＶ９を海馬の背側及び腹側の歯状回に両側から注射した。ＡＡＶを含有する規定の体積の溶液を０．２μｌ／分（１．０μＬの２．５ｅ８ＧＣ／注入部位、２つの注入部位／半球、したがって５ｅ８ＧＣ／半球及び１ｅ９／脳）の速度でゆっくり注入した。
運動亢進
てんかんマウス（ＳＥ後２ヶ月超）の自発運動を、ＡＡＶ注射の１週間前及び２週間後に評価した（図１１Ａ）。非てんかんマウス（１８～２１週齢の野生型スイス雄性マウス）の自発運動も評価した。環境への馴化実験の１日前に、マウスを行動分析室に移し、マウスを９：００～１８：００の明／暗サイクルで室温（２０～２２°Ｃ）に保ち、食物及び水を自由に摂取させた。試験した動物と接触していた全ての材料を、その後、嗅覚合図を防ぐために酢酸で洗浄した。最初に、自発的な探索行動をオープンフィールド試験（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）で試験した。簡単に説明すると、マウスを５０×５０×５０ｃｍの青色ポリ塩化ビニルボックスの中央に１０分間置き、追跡ソフトウェアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｌｏｒ（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）に接続したビデオカメラで軌跡を記録した。１０分間の探索中にマウスの速度及びマウスがカバーした総距離を分析した。
ＥＥＧ電極の埋め込み及び記録
処置したマウスに、ＡＡＶ注射の３週間後に１つの深度ワイヤ電極を埋め込む。イソフルラン麻酔下で手術を行う。電極を歯状回（ＤＧ）内に定位的に配置する（ブレグマからのＰａｘｉｎｏｓ及びＷａｔｓｏｎ座標：ＡＰ－２．５５ｍｍ、ＭＬ＋１．６５ｍｍ、ＤＶ－２．２５ｍｍ）。追加のスクリューが小脳上に配置され、接地電極として機能する。電極及びねじは、歯科用セメントで頭蓋骨上に固定される。回復期間中、２４時間後及び４８時間後に動物に５ｍｇ／ｋｇのカルプロフェン（ＲＩＭＡＤＹＬ（登録商標））を皮下投与することになる。
脳波（増幅（１０００Ｘ）、０．１６～９７Ｈｚのパスでフィルタリング、５００Ｈｚで取得）を、遠隔計測システム（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ミネソタ州セントポール）を用いて５日間、１日あたり２４時間モニタリングした。
海馬内ＥＥＧトレースは、ＤＧに挿入された電極と小脳の上に配置された電極との間の電位の差を表す。
低分子ＲＮＡ配列決定分析
４週間後、動物を屠殺し、海馬を切除し、急速凍結した。溶解後、ＡＬＬＰＲＥＰ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＥＦ番号８０２０４）を用いて、同じマウス海馬組織から全ＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｏｍｅＳｃａｎのＮＥＸＴＦＬＥＸ（登録商標）Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｖ ３ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＵＤＩ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＯＶＡ－５１３２－２２）を用いたライブラリー調製のために、スパイクインＲＮＡオリゴ混合物（４５００分子／全ＲＮＡ １０ｐｇ）を添加した全ＲＮＡ ４００ｎｇを採取した。可能性のあるアダプターダイマーを、Ａｍｐｕｒｅビーズサイズ選択を使用して除去した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００を使用するクラスタリング及びＤＮＡ配列決定を、製造業者のプロトコルに従って行った。
結果
コンストラクト番号１００及びコンストラクト番号１０１は、１ｅ９ ＧＣ／脳の試験用量で、ｉｎ ｖｉｖｏでピロカルピンモデルの運動亢進表現型を減少させるのに有効であった（図１１Ａ）。ＲＮＡヌル対照コンストラクト（番号１０６）及び２つの単一コンストラクトを含む他の全てのコンストラクトは、治療後の運動亢進を減少させなかった。ＥＥＧ評価は、コンストラクト番号１００及びコンストラクト番号１０１が対照に対して１日当たりの平均発作数を減少させるのに有効であることを更に実証した（図１１Ｂ）。これらの結果に基づいて、２つのｍｉＲＮＡの発現を駆動する１つのプロモーターを有するコンストラクト番号１００及びコンストラクト番号１０１に見られるコンカテマー設計は、１つのｍｉＲＮＡの発現を駆動する１つのプロモーターを有するコンストラクト番号１０２及びコンストラクト番号１０３に見られる単一の設計よりも効果的であるようである。
５つの動物行動（ネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）、身震い、毛髪、ハンドリング、及び自発歩行）を３人の操作者が独立して採点した。ＲＮＡヌル対照ベクター番号１０６で処置したピロカルピン誘発てんかんマウスと比較して、Ｇｒｉｋ２標的化ベクターで処置したマウスの行動は改善され、コンストラクト番号１００は最も劇的な効果を示した（図１１Ｃ）。
マウスの海馬に両側注入されたコンストラクト番号１００ ＡＡＶ９ベクターから発現及び処理されたＧＩ及びＭＷの総コピー数を、低分子ＲＮＡ配列決定分析によって測定した。１０ｐｇの全ＲＮＡ（細胞あたりの平均量）あたり、３９２．２コピー及び５７３．１コピーのＧＩ、１３３１．３コピー及び２１３８．８コピーのＭＷを、それぞれ２つの海馬において決定した（表２１）。ｍｉＲＮＡの分子は生理学的活性範囲にある。ＧＩとＭＷの両方のガイド／パッセンジャー比は１００を超え、パッセンジャー鎖が５コピー／１０ｐｇ未満であり、生理活性レベル未満であったことを示した。
ピロカルピンてんかんマウスの脳におけるてんかん症状の軽減におけるこれらのマイクロＲＮＡコンストラクトの有効性を更に評価するために、注射用量を２．５×１０９ＧＣ／注射部位に補正し、半球あたり２つの注射部位を設け、用量応答研究を行った後に５×１０９ＧＣ／半球及び１×１０１０ＧＣ／脳を得た（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。ここでも、コンストラクト番号１００は、ｉｎ ｖｉｖｏで運動亢進と発作活性の両方を減少させるのに有効であることが証明された。独立した用量応答研究では、ＲＮＡヌル対照ベクターに対して脳あたり最高用量１Ｅ＋９及び１Ｅ＋１０のベクター番号１００で処置したピロカルピンマウスにおいて、運動亢進表現型（図１３Ａ）及び発作（図１３Ｂ）の用量依存的減少が観察された。
他の実施形態
本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、記載された開示の様々な修正及び変形が当業者には明らかであろう。本開示は特定の実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本開示は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者には明らかである本開示を実施するための記載された態様の様々な修正は、本開示の範囲内にあることが意図されている。
他の実施形態は、特許請求の範囲にある。
参照文献
本出願を通して、様々な参考文献が、本開示が関係する技術水準を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
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Ｂｏｕｄｒｅａｕ Ｒｙａｎ Ｌ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌｅｂｒｏｎ Ｅｄｇａｒｄｏ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂｅｖｅｒｌｙ Ｌ．，ＲＮＡｉ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｉｓｓｕｅ Ｒ１，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１１，Ｐａｇｅｓ Ｒ２１－Ｒ２７
Ｂｏｕｖｉｅｒ Ｇ．，Ｌａｒｓｅｎ Ｒ．Ｓ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍｏｒｅｎｏ Ａ．，Ｐａｕｌｓｅｎ Ｏ．，Ｓｊｏｓｔｒｏｍ Ｐ．Ｊ．（２０１８）．Ｔｏｗａｒｄｓ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｂａｔｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５１ １－７．１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２０１７．１２．０２０
Ｃｒｅｐｅｌ Ｖ，Ｍｕｌｌｅ Ｃ（２０１５）Ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０：８３－８８；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｐｈ．２０１４．１１．０１２．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｄｅｃ １３．
Ｅｎｇｌｏｔ，ＤＪ．，ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｓｅｉｚｕｒｅ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｓｅｃｔｉｖｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｆｏｒ ｅｘｔｒａ－ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．１２（２）：９７－２０１
Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｂ．，Ｒｅｉｓ Ｊ．，Ｇａｓｉｏｒ Ｍ．，Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ｒ．Ｍ．，Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．，Ｒｏｇａｗｓｋｉ Ｍ．Ａ．（２０１４）．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＧｌｕＫ１ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｓｅｉｚｕｒｅｓ，ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｄｉｓｃｈａｒｇｅｓ，ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４ ５７６５－５７７５．１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．５３０７－１３．２０１４
Ｇａｂｒｉｅｌ Ｓ，Ｎｊｕｎｔｉｎｇ Ｍ，Ｐｏｍｐｅｒ ＪＫ，Ｍｅｒｓｃｈｈｅｍｋｅ Ｍ，Ｓａｎａｂｒｉａ ＥＲＧ，Ｅｉｌｅｒｓ Ａ，Ｋｉｖｉ Ａ，Ｚｅｌｌｅｒ Ｍ，Ｍｅｅｎｃｋｅ Ｈ－Ｊ，Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ Ｅ ａ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｕ，Ｌｅｈｍａｎｎ Ｔ－Ｎ（２００４）Ｓｔｉｍｕｌｕｓ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４：１０４１６－１０４３０．
Ｇｒｕｂｅｒ Ａ．，Ｌｏｒｅｎｚ Ｒ．，Ｂｅｒｎｈａｒｔ Ｓ．Ｈ．，Ｎｅｕｂｏｃｋ Ｒ．，Ｈｏｆａｃｋｅｒ Ｉ．Ｌ（２００８）．Ｔｈｅ Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ Ｗｅｂｓｕｉｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３６：Ｗ７０－４
Ｈａｒｄｙ Ｊ．（２０１０）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ，６８（２），２０１－２０６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１０．１０．０１４
Ｍｅｌｙａｎ Ｚ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｂ．，Ｗｈｅａｌ Ｈ．Ｖ．（２００４）．Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４ ４５３０－４５３４．１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．５３５６－０３．２００４
Ｍｅｌｙａｎ Ｚ．，Ｗｈｅａｌ Ｈ．Ｖ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｂ．（２００２）．Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓＡＨＰ ａｎｄ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ ３４ １０７－１１４．１０．１０１６／Ｓ０８９６－６２７３（０２）００６２４－４
Ｍｕｌｌｅ Ｃ．，Ｓａｉｌｅｒ Ａ．，Ｐｅｒｅｚ－Ｏｔａｎｏ Ｉ．，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ－Ａｎｓｏｎ Ｈ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ Ｐ．Ｅ．，Ｂｕｒｅａｕ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ａｌｔｅｒｅｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｋａｉｎａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ＧｌｕＲ６－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３９２ ６０１－６０５．
Ｐｅｒｅｔ Ａ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｌ ａ．，Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ ＤＷ，Ｇｏｒｌｅｗｉｃｚ Ａ，Ｅｐｓｚｔｅｉｎ Ｊ，Ｍｕｌｌｅ Ｃ，Ｃｒｅｐｅｌ Ｖ（２０１４）Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｂｅｒｒａｎｔ ＧｌｕＫ２－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｋａｉｎａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｌｏｂｅ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ８：３４７－３５４．
Ｒｅｉｎｅｒ Ａ，Ａｒａｎｔ ＲＪ，ａｎｄ Ｉｓａｃｏｆｆ ＥＹ（２０１２）Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５ Ｋａｉｎａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １：２３４－２４０．
Ｒｅｐｒｅｓａ Ａ，Ｌｅ Ｇａｌｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ Ｇ，Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ（１９８９ａ）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎｄｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ９９：３４５－３５０．
Ｒｅｐｒｅｓａ Ａ，Ｒｏｂａｉｎ Ｏ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ Ｅ，Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ（１９８９ｂ）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ９９：３５１－３５５．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍｏｒｅｎｏ Ａ．，Ｈｅｒｒｅｒａｓ Ｏ．，Ｌｅｒｍａ Ｊ．（１９９７）．Ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃａｌｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎｅｕｒｏｎ １９ ８９３－９０１．１０．１０１６／Ｓ０８９６－６２７３（００）８０９７０－８．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍｏｒｅｎｏ Ａ．，Ｓｉｈｒａ Ｔ．Ｓ．（２００７ａ）．Ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｍｏｄｕｓ ｏｐｅｒａｎｄｉ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０ ６３０－６３７．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍｏｒｅｎｏ Ａ．，Ｓｉｈｒａ Ｔ．Ｓ．（２００７ｂ）．Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＳ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０３ ２１２１－２１３５．
Ｓａｐｒｕ Ｍｏｈａｎ Ｋ．，Ｙａｔｅｓ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ．，Ｈｏｇａｎ Ｓｈｅａ，Ｊｉａｎｇ Ｌｉｘｉｎ，Ｈａｌｔｅｒ Ｊｅｒｅｍｙ，Ｂｏｈｎ Ｍａｒｔｈａ Ｃ．（２００６）．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡｉ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９８：３８２－３９０
Ｓｍｏｌｄｅｒｓ Ｉ．，Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ Ｚ．Ａ．，Ｃｌａｒｋｅ Ｖ．Ｒ．，Ｗａｒｒｅ Ｒ．，Ｋｈａｎ Ｇ．Ｍ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ＧＬＵ（Ｋ５）－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｍｂｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５ ７９６－８０４．１０．１０３８／ｎｎ８８
Ｓｕｔｕｌａ Ｔ，Ｃａｓｃｉｎｏ Ｇ，Ｃａｖａｚｏｓ Ｊ，Ｐａｒａｄａ Ｉ，Ｒａｍｉｒｅｚ Ｌ（１９８９）Ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２６：３２１－３３０．
Ｔａｕｃｋ ＤＬ，Ｎａｄｌｅｒ Ｊ Ｖ（１９８５）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｉｎｉｃ ａｃｉｄ－ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５：１０１６－１０２２
Ｖａｌｂｕｅｎａ Ｓ．，Ｌｅｒｍａ Ｊ．（２０１６）．Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｔｈｅ ｈｉｄｄｅｎ ｌｉｆｅ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｇａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ ９２ ３１６－３２９．１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１６．１０．０１６
Ｗａｎｇ Ｌ．，Ｂａｉ Ｊ．，ａｎｄ Ｈｕ Ｙ．（２００７）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＡ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａＣａＭＫＩＩ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３５（１）：３７－４４
Ｚｉｎｎ，Ｅ．，Ｐａｃｏｕｒｅｔ，Ｓ．，Ｋｈａｙｃｈｕｋ，Ｖ．，Ｔｕｒｕｎｅｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｌ．Ｓ．，Ａｎｄｒｅｓ－Ｍａｔｅｏｓ，Ｅ．，… Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．（２０１５）．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ，１２（６），１０５６－１０６８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０７．０１９

Claims (242)

  1. ５’アーム（５ｐ）、ループ領域及び３’アーム（３ｐ）を含むステム－ループ領域を含むＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的に結合する単離されたポリヌクレオチドであって、前記ステム－ループ領域が、ガイド鎖配列及びパッセンジャー鎖配列を含み、前記ガイド鎖配列及びパッセンジャー鎖配列が、
    （ａ）前記ガイド鎖の５’末端のウラシル（Ｕ）－アデニン（Ａ）塩基対若しくはＵ－グアニン（Ｇ）塩基対、
    （ｂ）前記パッセンジャー鎖の５’末端のシトシン（Ｃ）－Ｇ対、
    （ｃ）前記ガイド鎖配列の５’末端のＵ、
    （ｄ）前記ガイド鎖配列と前記パッセンジャー鎖配列との間のシード領域におけるミスマッチ、及び／又は
    （ｅ）前記ポリヌクレオチドの前記ステム領域と前記ループ領域との接合部におけるＵ－Ｇゆらぎを置き換えるためのＣ－Ｇ塩基対又はＵ－Ａ塩基対を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
  2. （ａ）及び（ｃ）が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質へのガイド鎖配列ローディングを改善する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. （ｂ）が、ＲＩＳＣタンパク質へのパッセンジャー鎖配列ローディングを損なう、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. （ｄ）が、ＲＩＳＣローディング中に前記ガイド鎖配列からの前記パッセンジャー鎖配列のデカップリングを促進する、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  5. （ｅ）が、ダイサーによるステム領域からのループ領域の切断を改善する、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ガイド鎖配列の前記シード領域が、前記ガイド鎖配列のヌクレオチド２～７を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１７の核酸配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３２の核酸配列を有する、請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記ステム－ループ領域が、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１８の核酸配列を有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３３の核酸配列を有する、請求項１０又は１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記ステム－ループ領域が、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１９の核酸配列を有する、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３４の核酸配列を有する、請求項１３又は１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２０の核酸配列を有する、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３５の核酸配列を有する、請求項１６又は１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記ステム－ループ領域が、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２１の核酸配列を有する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３６の核酸配列を有する、請求項１９又は２０に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記ステム－ループ領域が、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２２の核酸配列を有する、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３７の核酸配列を有する、請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記ステム－ループ領域が、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２３の核酸配列を有する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３８の核酸配列を有する、請求項２５又は２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記ステム－ループ領域が、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２４の核酸配列を有する、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号３９の核酸配列を有する、請求項２８又は２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２５の核酸配列を有する、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号４０の核酸配列を有する、請求項３１又は３２に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２６の核酸配列を有する、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号４１の核酸配列を有する、請求項３４又は３５に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２７の核酸配列を有する、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号４２の核酸配列を有する、請求項３７又は３８に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２８の核酸配列を有する、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号４３の核酸配列を有する、請求項４０又は４１に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１４の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  44. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２９の核酸配列を有する、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
  45. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号４４の核酸配列を有する、請求項４３又は４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  47. 前記ガイド鎖配列が、配列番号３０の核酸配列を有する、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号４５の核酸配列を有する、請求項４６又は４７に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２２６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２３０の核酸配列を有する、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。
  51. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２３４の核酸配列を有する、請求項４９又は５０に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２２７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２３１の核酸配列を有する、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
  54. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２３５の核酸配列を有する、請求項５２又は５３に記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２２８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  56. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２３２の核酸配列を有する、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
  57. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２３６の核酸配列を有する、請求項５５又は５６に記載のポリヌクレオチド。
  58. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２２９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  59. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２３３の核酸配列を有する、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
  60. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２３７の核酸配列を有する、請求項５８又は５９に記載のポリヌクレオチド。
  61. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２３８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  62. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２４２の核酸配列を有する、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
  63. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２４６の核酸配列を有する、請求項６１又は６２に記載のポリヌクレオチド。
  64. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２３９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  65. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２４３の核酸配列を有する、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
  66. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２４７の核酸配列を有する、請求項６４又は６５に記載のポリヌクレオチド。
  67. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２４０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  68. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２４４の核酸配列を有する、請求項６７に記載のポリヌクレオチド。
  69. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２４８の核酸配列を有する、請求項６７又は６８に記載のポリヌクレオチド。
  70. 前記ステム－ループ領域が、配列番号２４１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  71. 前記ガイド鎖配列が、配列番号２４５の核酸配列を有する、請求項７０に記載のポリヌクレオチド。
  72. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号２４９の核酸配列を有する、請求項７０又は７１に記載のポリヌクレオチド。
  73. 前記ステム－ループ領域が、配列番号４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  74. 前記ガイド鎖配列が、配列番号６４の核酸配列を有する、請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
  75. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８１の核酸配列を有する、請求項７３又は７４に記載のポリヌクレオチド。
  76. 前記ステム－ループ領域が、配列番号４８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  77. 前記ガイド鎖配列が、配列番号６５の核酸配列を有する、請求項７６に記載のポリヌクレオチド。
  78. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８２の核酸配列を有する、請求項７６又は７７に記載のポリヌクレオチド。
  79. 前記ステム－ループ領域が、配列番号４９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  80. 前記ガイド鎖配列が、配列番号６６の核酸配列を有する、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
  81. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８３の核酸配列を有する、請求項７９又は８０に記載のポリヌクレオチド。
  82. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  83. 前記ガイド鎖配列が、配列番号６７の核酸配列を有する、請求項８２に記載のポリヌクレオチド。
  84. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８４の核酸配列を有する、請求項８２又は８３に記載のポリヌクレオチド。
  85. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  86. 前記ガイド鎖配列が、配列番号６８の核酸配列を有する、請求項８５に記載のポリヌクレオチド。
  87. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８５の核酸配列を有する、請求項８５又は８６に記載のポリヌクレオチド。
  88. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  89. 前記ガイド鎖配列が、配列番号６９の核酸配列を有する、請求項８８に記載のポリヌクレオチド。
  90. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８６の核酸配列を有する、請求項８８又は８９に記載のポリヌクレオチド。
  91. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  92. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７０の核酸配列を有する、請求項９１に記載のポリヌクレオチド。
  93. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８７の核酸配列を有する、請求項９１又は９２に記載のポリヌクレオチド。
  94. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５４の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  95. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７１の核酸配列を有する、請求項９４に記載のポリヌクレオチド。
  96. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８８の核酸配列を有する、請求項９４又は９５に記載のポリヌクレオチド。
  97. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  98. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７２の核酸配列を有する、請求項９７に記載のポリヌクレオチド。
  99. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号８９の核酸配列を有する、請求項９７又は９８に記載のポリヌクレオチド。
  100. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  101. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７３の核酸配列を有する、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。
  102. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９０の核酸配列を有する、請求項１００又は１０１に記載のポリヌクレオチド。
  103. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  104. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７４の核酸配列を有する、請求項１０３に記載のポリヌクレオチド。
  105. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９１の核酸配列を有する、請求項１０３又は１０４に記載のポリヌクレオチド。
  106. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  107. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７５の核酸配列を有する、請求項１０６に記載のポリヌクレオチド。
  108. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９２の核酸配列を有する、請求項１０６又は１０７に記載のポリヌクレオチド。
  109. 前記ステム－ループ領域が、配列番号５９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  110. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７６の核酸配列を有する、請求項１０９に記載のポリヌクレオチド。
  111. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９３の核酸配列を有する、請求項１０９又は１１０に記載のポリヌクレオチド。
  112. 前記ステム－ループ領域が、配列番号６０の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  113. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７７の核酸配列を有する、請求項１１２に記載のポリヌクレオチド。
  114. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９４の核酸配列を有する、請求項１１２又は１１３に記載のポリヌクレオチド。
  115. 前記ステム－ループ領域が、配列番号６１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  116. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７８の核酸配列を有する、請求項１１５に記載のポリヌクレオチド。
  117. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９５の核酸配列を有する、請求項１１５又は１１６に記載のポリヌクレオチド。
  118. 前記ステム－ループ領域が、配列番号６２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  119. 前記ガイド鎖配列が、配列番号７９の核酸配列を有する、請求項１１８に記載のポリヌクレオチド。
  120. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号９６の核酸配列を有する、請求項１１８又は１１９に記載のポリヌクレオチド。
  121. 前記ステム－ループ領域が、配列番号９８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  122. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１０の核酸配列を有する、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
  123. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２２の核酸配列を有する、請求項１２１又は１２２に記載のポリヌクレオチド。
  124. 前記ステム－ループ領域が、配列番号９９の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  125. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１１の核酸配列を有する、請求項１２４に記載のポリヌクレオチド。
  126. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２３の核酸配列を有する、請求項１２４又は１２５に記載のポリヌクレオチド。
  127. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１００の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  128. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１２の核酸配列を有する、請求項１２７に記載のポリヌクレオチド。
  129. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２４の核酸配列を有する、請求項１２７又は１２８に記載のポリヌクレオチド。
  130. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０１の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  131. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１３の核酸配列を有する、請求項１３０に記載のポリヌクレオチド。
  132. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２５の核酸配列を有する、請求項１３０又は１３１に記載のポリヌクレオチド。
  133. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  134. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１４の核酸配列を有する、請求項１３３に記載のポリヌクレオチド。
  135. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２６の核酸配列を有する、請求項１３３又は１３４に記載のポリヌクレオチド。
  136. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  137. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１５の核酸配列を有する、請求項１３６に記載のポリヌクレオチド。
  138. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２７の核酸配列を有する、請求項１３６又は１３７に記載のポリヌクレオチド。
  139. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０４の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  140. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１６の核酸配列を有する、請求項１３９に記載のポリヌクレオチド。
  141. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２８の核酸配列を有する、請求項１３９又は１４０に記載のポリヌクレオチド。
  142. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  143. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１７の核酸配列を有する、請求項１４２に記載のポリヌクレオチド。
  144. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１２９の核酸配列を有する、請求項１４２又は１４３に記載のポリヌクレオチド。
  145. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  146. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１８の核酸配列を有する、請求項１４５に記載のポリヌクレオチド。
  147. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１３０の核酸配列を有する、請求項１４５又は１４６に記載のポリヌクレオチド。
  148. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  149. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１１９の核酸配列を有する、請求項１４８に記載のポリヌクレオチド。
  150. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１３１の核酸配列を有する、請求項１４８又は１４９に記載のポリヌクレオチド。
  151. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１０８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  152. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１２０の核酸配列を有する、請求項１５１に記載のポリヌクレオチド。
  153. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１３２の核酸配列を有する、請求項１５１又は１５２に記載のポリヌクレオチド。
  154. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１３４の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  155. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１４０の核酸配列を有する、請求項１５４に記載のポリヌクレオチド。
  156. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１４６の核酸配列を有する、請求項１５４又は１５５に記載のポリヌクレオチド。
  157. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１３５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  158. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１４１の核酸配列を有する、請求項１５７に記載のポリヌクレオチド。
  159. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１４７の核酸配列を有する、請求項１５７又は１５８に記載のポリヌクレオチド。
  160. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１３６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  161. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１４２の核酸配列を有する、請求項１６０に記載のポリヌクレオチド。
  162. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１４８の核酸配列を有する、請求項１６０又は１６１に記載のポリヌクレオチド。
  163. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１３７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  164. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１４３の核酸配列を有する、請求項１６３に記載のポリヌクレオチド。
  165. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１４９の核酸配列を有する、請求項１６３又は１６４に記載のポリヌクレオチド。
  166. 前記ステム－ループ領域が、配列番号１３８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  167. 前記ガイド鎖配列が、配列番号１４４の核酸配列を有する、請求項１６６に記載のポリヌクレオチド。
  168. 前記パッセンジャー鎖配列が、配列番号１５０の核酸配列を有する、請求項１６６又は１６７に記載のポリヌクレオチド。
  169. 前記ポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、請求項１～１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  170. 前記ポリヌクレオチドが、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短ヘアピン適合ｍｉＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１～１６９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  171. 前記ポリヌクレオチドが、１９～２１ヌクレオチドである、請求項１～１７０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  172. 前記ポリヌクレオチドが、１９ヌクレオチドである、請求項１７１に記載のポリヌクレオチド。
  173. 前記ポリヌクレオチドが、２０ヌクレオチドである、請求項１７２に記載のポリヌクレオチド。
  174. 前記ポリヌクレオチドが、２１ヌクレオチドである、請求項１７３に記載のポリヌクレオチド。
  175. 前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡが、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３又は配列番号１７４の核酸配列によってコードされる、請求項１～１７４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  176. 前記ポリヌクレオチドが、細胞内のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを低下させることができる、請求項１～１７５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  177. 前記ポリヌクレオチドが、前記細胞中のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを少なくとも１０％、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％低下させる、請求項１７６に記載のポリヌクレオチド。
  178. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１７６又は１７７に記載のポリヌクレオチド。
  179. 前記細胞が、ニューロンである、請求項１７６～１７８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  180. 前記ニューロンが、海馬ニューロンである、請求項１７９に記載のポリヌクレオチド。
  181. 前記海馬ニューロンが、歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）又はグルタミン酸作動性錐体ニューロンである、請求項１８０に記載のポリヌクレオチド。
  182. 請求項１～１８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  183. 前記ベクターが、複製欠損である、請求項１８２に記載のベクター。
  184. 前記ベクターが、哺乳動物、昆虫、細菌又はウイルスベクターである、請求項１８２又は１８３に記載のベクター。
  185. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１８２～１８４のいずれか１項に記載のベクター。
  186. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス、及びカナリア痘ウイルスからなる群から選択される、請求項１８４又は１８５に記載のベクター。
  187. 前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１８６に記載のベクター。
  188. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ１０ベクターである、請求項１８７に記載のベクター。
  189. 発現カセットであって、配列番号１～１５、４６～６２、９７～１０８、１３３～１３８、２２６～２２９、及び２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、例えば、配列番号４、１３５、及び２５６～２６１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を含む、ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
  190. 前記発現カセットが、５’隣接領域、ループ領域及び３’隣接領域を含む、請求項１８９に記載の発現カセット。
  191. 前記５’隣接領域が、配列番号２１７、２２０、又は２２３のいずれか１つに記載の前記核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９０に記載の発現カセット。
  192. 前記３’隣接領域が、配列番号２１８、２２１、又は２２４のいずれか１つに記載の前記核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９０又は１９１に記載の発現カセット。
  193. 前記５’隣接領域が、５’スペーサー配列及び５’隣接配列を含む、請求項１９０～１９２のいずれか１項に記載の発現カセット。
  194. 前記３’隣接領域が、３’スペーサー配列及び３’隣接配列を含む、請求項１９０～１９３のいずれか１項に記載の発現カセット。
  195. 前記ループ領域が、Ｅ－ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－２１８－１又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３配列であるマイクロＲＮＡループ配列を含む、請求項１９０～１９４のいずれか１項に記載の発現カセット。
  196. 前記マイクロＲＮＡループ配列が、配列番号２１９、２２２又は２２５のいずれか１つの前記核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９５に記載の発現カセット。
  197. 前記発現カセットが、シナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター又はカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターを含む、請求項１９０～１９６のいずれか１項に記載の発現カセット。
  198. 発現カセットであって、５’から３’に、
    （ａ）第１のプロモーター配列と、
    （ｂ）配列番号１～９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドと、
    （ｃ）任意に、第２のプロモーター配列と、
    （ｄ）配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと少なくとも８５％の配列同一性を含む、ステム－ループ配列を含むポリヌクレオチドを含む、
    発現カセット。
  199. 配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列を含む前記ポリヌクレオチドが、ガイド配列と相補的又は実質的に相補的なパッセンジャー配列を含み、前記パッセンジャー配列が、ガイド配列に対して５’又は３’に位置する、請求項１９８に記載の発現カセット。
  200. 配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列を含む前記ポリヌクレオチドが、ガイド配列に対して５’に位置する５’隣接領域を含む、請求項１９８又は１９９に記載の発現カセット。
  201. 配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列を含む前記ポリヌクレオチドが、ガイド配列に対して３’に位置する３’隣接領域を含む、請求項１９８～２００のいずれか１項に記載の発現カセット。
  202. 配列番号１～１９、３４～６２、９７～１０８、１３３～１４７、２２６～２２９、又は２３８～２４１のいずれか１つの核酸配列を有するステム－ループ配列を含む前記ポリヌクレオチドが、前記ガイド配列とパッセンジャー配列との間に位置するループ領域を含み、前記ループ領域が、マイクロＲＮＡループ配列を含む、請求項１９８～２０１のいずれか１項に記載の発現カセット。
  203. 前記第１のプロモーター及び／又は任意に、前記第２のプロモーターが、ｈＳｙｎプロモーター又はＣａＭＫＩＩプロモーターからなる群から選択される、請求項１９８～２０２のいずれか１項に記載の発現カセット。
  204. 前記５’隣接領域が、配列番号２１７、２２０又は２２３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９８～２０３のいずれか１項に記載の発現カセット。
  205. 前記３’隣接領域が、配列番号２１８、２２１又は２２４のいずれか１つに記載の前記核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９８～２０４のいずれか１項に記載の発現カセット。
  206. 前記マイクロＲＮＡループ配列が、Ｅ－ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－２１８－１、又はＥ－ｍｉＲ－１２４－３配列である、請求項１９８～２０５のいずれか１項に記載の発現カセット。
  207. 前記マイクロＲＮＡループ配列が、配列番号２１９、２２２又は２２５のいずれか１つの前記核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２０６に記載の発現カセット。
  208. 前記発現カセットが、前記発現カセットの５’末端に５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、前記発現カセットの３’末端に３’－ＩＴＲ配列を含む、請求項１９８～２０７のいずれか１項に記載の発現カセット。
  209. 前記５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列である、請求項２０８に記載の発現カセット。
  210. 前記５’－ＩＴＲ配列が、配列番号２０８又は配列番号２０９の前記核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２０８又は２０９に記載の発現カセット。
  211. 前記３’－ＩＴＲ配列が、配列番号２１０～２１２のいずれか１つの前記核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２０８～２１０のいずれか１項に記載の発現カセット。
  212. エンハンサー配列を更に含む、請求項１９８～２１１のいずれか１項に記載の発現カセット。
  213. 前記エンハンサー配列が、配列番号２０７の前記核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２１２に記載の発現カセット。
  214. イントロン配列を更に含む、請求項１９８～２１３のいずれか１項に記載の発現カセット。
  215. 前記イントロン配列が、配列番号２０５又は配列番号２０６の前記核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２１４に記載の発現カセット。
  216. １つ以上のポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項１９８～２１５のいずれか１項に記載の発現カセット。
  217. 前記１つ以上のポリアデニル化シグナル配列が、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列である、請求項２１６に記載の発現カセット。
  218. 前記ＲＢＧポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２１３～２１５のいずれか１つに記載の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２１７に記載の発現カセット。
  219. 前記ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２１６の前記核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２１７に記載の発現カセット。
  220. 前記発現カセットが、請求項１８２～１８８のいずれか１項に記載のベクターに組み込まれる、請求項１９８～２１９のいずれか１項に記載の発現カセット。
  221. 前記発現カセットが、配列番号２５６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を含む、請求項１９８～２２０のいずれか１項に記載の発現カセット。
  222. 前記発現カセットが、配列番号２５６の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％の配列同一性を含む、請求項１９８～２２１のいずれか１項に記載の発現カセット。
  223. 細胞におけるＧｒｉｋ２発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１～１８１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項１８２～１８８のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１８９～２２２のいずれか１項に記載の発現カセットと接触させることを含む、細胞におけるＧｒｉｋ２発現を阻害する方法。
  224. 前記ポリヌクレオチドがＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、前記細胞におけるＧｒｉｋ２の発現を阻害又は低下させる、請求項２２３に記載の方法。
  225. 前記方法が、前記細胞中のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを低下させる、請求項２２３又は２２４に記載の方法。
  226. 前記方法が、前記細胞中のＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％低下させる、請求項２２５に記載の方法。
  227. 前記細胞がヒト細胞である、請求項２２３～２２６のいずれか１項に記載の方法。
  228. 前記細胞がニューロンである、請求項２２３～２２７のいずれか１項に記載の方法。
  229. 前記ニューロンが、海馬ニューロンである、請求項２２８に記載の方法。
  230. 前記海馬ニューロンが、ＤＧＣ又はグルタミン酸作動性錐体ニューロンである、請求項２２９に記載の方法。
  231. 前記ＤＧＣが、異常な再発性苔状線維軸索を含む、請求項２３０に記載の方法。
  232. 障害を治療又は改善することを必要とする対象における障害を治療又は改善する方法であって、請求項１～１８１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項１８２～１８８のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１８９～２２２のいずれか１項に記載の発現カセットを前記対象に投与することを含む、方法。
  233. 疾患又は障害を治療又は改善することを必要とする対象における疾患又は障害を治療又は改善する方法に使用するための、請求項１～１８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１８２～１８８のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１８９～２２２のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、組成物。
  234. 前記障害が、てんかんである、請求項２３２又は２３３に記載の方法。
  235. 前記てんかんが、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）、慢性てんかん、及び／又は難治性てんかんである、請求項２３４に記載の方法。
  236. 前記てんかんが、ＴＬＥである、請求項２３５に記載の方法。
  237. 前記ＴＬＥが、外側ＴＬＥ（ｌＴＬＥ）である、請求項２３６に記載の方法。
  238. 前記ＴＬＥが、内側ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）である、請求項２３６に記載の方法。
  239. 前記対象が、ヒトである、請求項２３３～２３８のいずれか１項に記載の方法。
  240. 請求項１～１６９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１８２～１８８のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１８９～２２２のいずれか１項に記載の発現カセットと、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  241. 請求項２４０に記載の医薬組成物と、添付文書とを含む、キット。
  242. 前記添付文書が、請求項２３２～２３９のいずれか１項に記載の方法における前記医薬組成物の使用説明書を含む、請求項２４１に記載のキット。
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