CN117677704A - 用于治疗癫痫的方法和组合物 - Google Patents

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CN117677704A CN202280049211.7A CN202280049211A CN117677704A CN 117677704 A CN117677704 A CN 117677704A CN 202280049211 A CN202280049211 A CN 202280049211A CN 117677704 A CN117677704 A CN 117677704A
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贺晨霞
理查德·波特
安德鲁·梅塞
奥利维耶·达诺斯
阿普里尔·R·特珀
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Bio Regeneration Co ltd
French Uniquel Co
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Bordeaux
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Bio Regeneration Co ltd
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Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

公开了与反义治疗相关的方法和组合物，其用于通过靶向Grik2mRNA来在有此需要的对象中治疗癫痫，例如颞叶癫痫。具体地，本公开内容提供了能够抑制GluK2蛋白的表达并抑制过度兴奋的神经元回路中的癫痫样放电的抑制性RNA构建体。

Description

用于治疗癫痫的方法和组合物
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2022年4月28日，命名为“51460-007WO3_Sequence_Listing_4_28_22_ST25”，且大小为297,127字节。
技术领域
本公开内容属于癫痫领域。具体地，本公开内容涉及用于治疗癫痫例如如颞叶癫痫的方法和组合物。
背景技术
在全球范围内，每年估计有500万人被诊断出患有癫痫，癫痫是以癫痫发作(seizures)或突然反复发作的感觉障碍、意识丧失或与脑异常电活动相关的惊厥(convulsions)为特征的神经系统疾病。当患者经历两次或更多次无缘无故的癫痫发作时，就会出现癫痫的典型诊断。癫痫的病因包括遗传异常、既往脑部感染、产前损伤、发育障碍和其他神经系统问题，例如卒中或脑肿瘤，但约50％被诊断出患有癫痫的人没有已知的发生该病症的原因。
颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)是成人中部分性癫痫的最常见形式(占所有形式癫痫的30％至40％)。公知的是海马体在TLE的病理生理学中发挥着关键作用。在TLE的人患者和动物模型中，发生了神经元回路的异常重新布线(rewiring)。网络重组(“反应可塑性”)的最佳实例之一是复发性苔藓纤维(recurrent mossy fibers，rMF)的出芽，该纤维在海马体中的齿状颗粒细胞(dentate granule cell，DGC)上建立了新的病理生理学谷氨酸能突触(Tauck and Nadler,1985；Represa et al.,1989a,1989b；Sutula et al.,1989；Gabriel et al.,2004)导致反复的兴奋性循环。rMF突触通过异位红藻氨酸受体(kainate receptor，KAR)发挥作用(Epsztein et al.,2005；Artinian et al.,2011,2015)。KAR是由GluK1至GluK5亚基组装而成的四聚体谷氨酸受体。在异源表达系统中，GluK1、GluK2和GluK3可形成同聚受体，而GluK4和GluK5与GluK1至3亚基结合形成异聚受体。天然KAR广泛分布在脑中且在海马体中发现了高密度的受体(Carta et al,2016,EJN)，海马体是涉及TLE的关键结构。本发明人的先前研究已经证实，在缺乏GluK2KAR亚基的小鼠中，癫痫活动(包括发作间期尖峰和发作期放电)显著降低。此外，使用含有GluK2/GluK5的KAR的药理学小分子拮抗剂(其阻断异位突触KAR)之后，癫痫样活动显著降低(Peret etal.,2014)。这些数据支持这样的假设：在DGC中的rMF处异位表达的KAR在TLE中的慢性癫痫发作中发挥着重要作用。因此，在DGC中表达并由GluK2/GluK5构成的异常KAR被认为代表了用于治疗药物抗性癫痫(例如TLE)的有前景的靶标。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)策略已被提出用于许多疾病靶标。基于RNAi的治疗的成功应用受到限制。RNAi治疗面临多重挑战，例如需要重复给药和制剂挑战。然而，用于治疗顽固性TLE的基于可用RNAi的基因治疗是有限的。因此，迫切需要用于治疗癫痫病症例如如TLE(例如治疗难治性TLE)的新的治疗方式。
发明内容
本公开内容提供了用于在有此需要的对象(例如人)中治疗或预防癫痫(例如如颞叶癫痫(TLE))的组合物和方法。所公开的方法包括向诊断为患有癫痫或处于发生癫痫之风险中的对象施用治疗有效量的多核苷酸(例如抑制性多核苷酸)，例如如反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、shRNA、siRNA、微RNA或shmiRNA，其靶向由谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(Grik2)基因编码的mRNA；或编码其的核酸载体(例如慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，例如如AAV9载体)。所公开的多核苷酸表现出对RNA诱导的沉默复合物(RISC)蛋白的改善的加载，以增强RNA干扰介导的Grik2转录物的降解。本公开内容的特征还在于包含一种或更多种所公开的抑制性核酸(例如RNA)物质和编码其的核酸载体的药物组合物。
本公开内容部分地基于出乎意料的发现：本文中所述的抑制性多核苷酸表现出显著更高的指导链与随从链比率(G/P比率)，这支持抑制性多核苷酸的加工的直接、实质性提高以及随后在降低Grik2 mRNA和由此产生的GluK2蛋白二者的表达水平方面的改善。微RNA(microRNA，miRNA)治疗的挑战是转染的多核苷酸的低加工效率。因此，G/P比率的改善可以与成熟miRNA分子产生的提高相关，并且伴随地，与所施用的miRNA治疗的期望治疗效果的提高相关。
在第一方面中，本公开内容的特征在于与Grik2 mRNA特异性杂交的分离的抑制性多核苷酸，其包含含有5'臂(5p)、环区和3'臂(3p)的茎环区，其中所述茎环区包含指导链序列和随从链序列，并且指导链序列和随从链序列包含：(a)在指导链的5'末端处的尿嘧啶(U)-腺嘌呤(A)碱基对或U-鸟嘌呤(G)碱基对；(b)在随从链的5'末端处的胞嘧啶(C)-G对；
(c)在指导链序列的5'末端处的U，(d)在指导链与随从链序列之间的种子区中的错配；和/或(e)C-G碱基对或U-A碱基对，其用来替代在多核苷酸的茎区和环区的连接处的U-G摆动。
在一些实施方案中，a)和c)改善指导链序列向RNA诱导的沉默复合物(RISC)蛋白中的加载。在一些实施方案中，b)损害随从链序列向RISC蛋白中的加载。在一些实施方案中，d)促进RISC加载期间随从链序列与指导链序列的解偶联。在一些实施方案中，e)改善通过Dicer从茎区切割环区。在一些实施方案中，指导链序列的种子区包含指导链序列的核苷酸2至7。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:17的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:17的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:17的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:32的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:32的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:32的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:18的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:18的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:18的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:33的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:33的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:33的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:19的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:19的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:34的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:34的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:34的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:20的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:20的指导链包含1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:20的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:35的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:35的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:35的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:21的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:21的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:21的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:36的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:36的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:36的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:22的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:22的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:22的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:37的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:37的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:37的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:23的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:23的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:38的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:38的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:38的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:24的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:23的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:39的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:39的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:25的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:25的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:25的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:40的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:40的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:40的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:26的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:26的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:41的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:41的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:27的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:27的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:27的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:42的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:42的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:42的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:28的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:28的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:28的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:43的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:43的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:43的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:29的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:29的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:29的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:44的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:44的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:44的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:30的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:30的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:30的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:45的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:45的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:45的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:226的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:230的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:230的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:230的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:234的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:234的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:234的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:227的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:231的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:231的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:231的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:235的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:235的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:235的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:228的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:232的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:232的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:232的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:236的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:236的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:236的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:229的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:233的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:233的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:233的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:237的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:237的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:237的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:238的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:242的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:242的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:242的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:246的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:246的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:246的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:239的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:243的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:243的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:243的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:247的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:247的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:247的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:240的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:244的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:244的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:244的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:248的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:248的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:248的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:241的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:245的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:245的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:245的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:249的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:249的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表3中所示SEQ ID NO:249的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:47的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:64的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:64的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:64的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:81的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:81的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:81的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:65的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:65的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:65的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:82的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:82的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:82的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:49的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:66的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:66的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:66的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:83的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:83的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:83的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:50的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:67的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:67的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:67的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:84的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:84的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:84的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:51的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:68的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:68的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:68的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:85的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:85的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:85的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:52的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:69的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:69的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:69的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:86的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:86的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:86的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:53的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:70的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:70的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:70的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:87的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:87的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:87的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:71的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:71的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:71的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:88的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:88的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:88的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:55的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:72的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:72的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:72的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:89的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:89的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:89的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:56的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:73的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:73的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:73的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:90的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:90的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:90的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:57的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:74的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:74的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:74的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:91的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:91的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:91的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:58的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:75的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:75的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:75的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:92的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:92的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:92的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:59的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:76的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:76的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:76的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:93的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:93的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:93的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:60的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:77的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:77的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:77的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:94的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:94的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:94的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:61的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:78的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:78的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:78的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:95的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:95的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:95的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:62的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:79的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:79的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:79的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:96的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:96的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表5中所示SEQ ID NO:96的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:98的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:110的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:110的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:110的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:122的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:122的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:122的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:99的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:111的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:111的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:111的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:123的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:123的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:123的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:100的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:112的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:112的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:112的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:124的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:124的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:124的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:101的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:113的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:113的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:113的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:125的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:125的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:125的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:102的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:114的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:114的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:114的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:126的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:126的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:126的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:103的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:115的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:115的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:115的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:127的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:127的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:127的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:104的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:116的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:116的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:116的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:128的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:128的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:128的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:105的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:117的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:117的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:117的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:129的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:129的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:129的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:106的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:118的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:118的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:118的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:130的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:130的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:130的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:107的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:119的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:119的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:119的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:131的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:131的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:131的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:108的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:120的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:120的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:120的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:132的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:132的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表7中所示SEQ ID NO:132的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:134的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:140的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:140的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:140的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:146的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:146的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:146的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:135的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:141的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:141的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:141的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:147的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:147的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:147的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:136的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:142的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:142的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:142的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:148的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:148的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:148的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:137的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:143的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:143的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:143的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:149的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:149的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:149的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，茎环区是与SEQ ID NO:138的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，指导链序列具有SEQ ID NO:144的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:144的指导链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:144的任一个加粗核苷酸。在一些实施方案中，随从链序列具有SEQ ID NO:150的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:150的随从链含有1至7(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸改变(例如，替换、缺失、插入或错配)，其中所述改变不涉及表9中所示SEQ ID NO:150的任一个加粗核苷酸。
在一些实施方案中，抑制性多核苷酸包含反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，抑制性多核苷酸包含短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)、短发夹RNA(shorthairpin RNA，shRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹适配miRNA(short hairpin-adapted miRNA，shmiRNA)。
在一些实施方案中，多核苷酸是19至21个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是19个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是20个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是21个核苷酸。
在一些实施方案中，Grik2 mRNA由与SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQID NO:172、SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，Grik2mRNA由SEQ ID NO:164、SEQID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174的核酸序列编码。
在一些实施方案中，抑制性多核苷酸能够降低细胞中GluK2蛋白的水平(如本公开内容中进一步讨论的)。在一些实施方案中，多核苷酸将细胞中GluK2蛋白的水平降低至少10％、至少至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。在一些实施方案中，细胞是神经元，例如海马神经元(例如齿状颗粒细胞(DGC)或谷氨酸能锥体神经元)。在另一些实施方案中，包括其中细胞是神经元的那些实施方案，细胞是人细胞。
在另一个方面中，本公开内容的特征在于包含前述方面和实施方案中任一者的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，载体是复制缺陷型的。在一些实施方案中，载体是哺乳动物载体、昆虫载体、细菌载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，病毒载体选自腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、逆转录病毒、腺病毒、细小病毒、冠状病毒、负链RNA病毒、正黏病毒、弹状病毒、副黏病毒、正链RNA病毒、小核糖核酸病毒、甲病毒、双链DNA病毒、疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒。在一些实施方案中，载体是AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体是AAV5、AAV9或AAVrh10载体。
在另一个方面中，本公开内容的特征在于包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸编码或包含对应于本公开内容第一方面的茎环序列的多核苷酸，例如与SEQ ID NO:1至15、226至229和238至241中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的茎环区。在一些实施方案中，茎环区与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，茎环区具有SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:135的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:258的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％)序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:259的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:260的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:261的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:256的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:257的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。
在另一个方面中，本公开内容提供了包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:46至62中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的茎环序列。
在另一个方面中，本公开内容提供了包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:97至108中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的茎环序列。
在另一个方面中，本公开内容提供了包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:133至138中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的茎环序列。在一些实施方案中，茎环序列与SEQ ID NO:135的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，茎环链序列具有SEQ IDNO:135的核酸序列。
在一些实施方案中，表达盒包含5'侧翼区、环区和3'侧翼区。在一些实施方案中，5'侧翼区包含与SEQ ID NO:217、220或223中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，3'侧翼区包含与SEQ ID NO:218、221或224中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，5'侧翼区包含5'间隔区序列和5'侧翼序列。在一些实施方案中，3'侧翼区包含3'间隔区序列和3'侧翼序列。在一些实施方案中，环区包含微RNA环序列，所述微RNA环序列为E-miR-30、miR-218-1或E-miR-124-3序列。在一些实施方案中，微RNA环序列包含与SEQ ID NO:219、222或225中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，微RNA环序列包含与SEQ ID NO:222的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，微RNA环序列包含具有SEQ ID NO:222的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达盒包含突触蛋白(hSyn)启动子或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子。在一些实施方案中，表达盒包含组成型启动子，所述组成型启动子包含巨细胞病毒增强子(例如CAG或CBA)、U6、H1或7SK启动子。
在另一个方面中，本公开内容提供了表达盒，其从5'至3'包含：(a)第一启动子序列；(b)包含茎环序列的多核苷酸，所述茎环序列与SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229或238至241中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性；(c)任选地，第二启动子序列；以及(d)包含茎环序列的多核苷酸，所述茎环序列与SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229或238至241中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，表达盒从5'至3'包含：(a)第一启动子序列；(b)包含茎环序列的多核苷酸，所述茎环序列与SEQ IDNO:4的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性；(c)任选地，第二启动子序列；以及(d)包含茎环序列的多核苷酸，所述茎环序列与SEQ ID NO:135的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，表达盒从5'至3'包含：(a)第一启动子序列；(b)包含具有SEQ ID NO:4的核酸序列的茎环序列的多核苷酸；(c)任选地，第二启动子序列；以及(d)包含具有SEQ ID NO:135的核酸序列的茎环序列的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:258具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的序列。
在一些实施方案中，包含茎环序列的多核苷酸包含与指导序列互补或基本上互补的随从序列，其中随从序列位于相对于指导序列的5'或3'，所述茎环序列具有SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229或238至241中任一者或者其变体的核酸序列，其变体与其具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，包含茎环序列的多核苷酸包含5'侧翼区，所述5'侧翼区位于相对于指导序列的5'，所述茎环序列具有SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229或238至241中任一者或者其变体的核酸序列，其变体与其具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，包含茎环序列的多核苷酸包含3'侧翼区，所述3'侧翼区位于相对于指导序列的3'，所述茎环序列具有SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229或238至241中任一者或者其变体的核酸序列，其变体与其具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，包含茎环序列的多核苷酸包含位于指导序列与随从序列之间的环区，其中环区包含微RNA环序列，所述茎环序列具有SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229或238至241中任一者或者其变体的核酸序列，其变体与其具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。
在一些实施方案中，第一启动子和/或任选的第二启动子选自hSyn启动子或CaMKII启动子。第一和/或第二启动子还可以选自组成型启动子，所述组成型启动子包含巨细胞病毒增强子(例如CAG或CBA)、U6、H1和7SK启动子。
在一些实施方案中，5'侧翼区包含与SEQ ID NO:217、220或223中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，3'侧翼区包含与SEQ ID NO:218、221或224中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，微RNA环序列是E-miR-30、miR-218-1或E-miR-124-3序列。在一些实施方案中，微RNA环序列包含与SEQ ID NO:219、222或225中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，微RNA环序列包含与SEQ ID NO:222的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，微RNA环序列包含具有SEQ ID NO:222的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达盒包含在所述表达盒的5'末端上的5'-反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)序列和在所述表达盒的3'末端上的3'-ITR序列。在一些实施方案中，5'-ITR和3’ITR序列是AAV2 5'-ITR和3’ITR序列。在一些实施方案中，5'-ITR序列包含与SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，5'-ITR序列包含具有SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，5'-ITR序列包含具有SEQ IDNO:208的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，3'-ITR序列包含与SEQ ID NO:210、SEQID NO:211或SEQ ID NO:212的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，3'-ITR序列包含具有SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:212的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，3'-ITR序列包含具有SEQ IDNO:212的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达盒还包括增强子序列。在一个实施方案中，增强子序列可以位于本文中公开的表达盒或载体中，以增强表达盒或载体中的启动子的活性(例如，增强子序列可以位于本文中所述的表达盒或载体中的启动子序列的5')。在一些实施方案中，增强子序列包含与SEQ ID NO:207的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，增强子序列包含具有SEQ ID NO:207的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达盒还包含内含子序列。在一个实施方案中，内含子序列可以位于表达盒或载体中以改善抑制性多核苷酸(例如，ASO(例如，miRNA序列；例如，内含子可以位于抑制性多核苷酸的启动子与核酸序列之间)的表达。在一些实施方案中，内含子序列位于本文中所述的两个或更多个抑制性多核苷酸序列(例如，两个或更多个miRNA序列)之间。在一些实施方案中，内含子序列包含与SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:206的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，内含子序列包含具有SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:206的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达盒还包含一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)多腺苷酸化信号序列(例如，以改善本文中公开的表达盒或载体的抑制性多核苷酸的核输出、翻译和稳定性)。多腺苷酸化信号序列可以位于末端抑制剂多核苷酸序列(例如，本文中公开的ASO序列，例如miRNA序列)的3'和/或3’ITR序列的5'。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号序列是兔β-珠蛋白(rabbit beta-globin，RBG)多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，RBG多腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214或SEQ ID NO:215的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，RBG多腺苷酸化信号包含具有SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214或SEQ ID NO:215的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号序列是牛生长激素(bovine growthhormone，BGH)多腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，BGH多腺苷酸化信号序列包含与SEQ ID NO:216的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在一些实施方案中，BGH多腺苷酸化信号序列包含具有SEQ ID NO:216的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，表达盒还包含一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列位于表达盒的3'末端(例如，在多腺苷酸化序列与3’ITR序列之间)。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ IDNO:250的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列具有SEQ ID NO:250的核酸序列。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ IDNO:251的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ ID NO:251的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ ID NO:251的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列与SEQ ID NO:251的核酸序列具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)填充序列具有SEQ ID NO:251的核酸序列。
在一些实施方案中，任何前述方面和实施方案的表达盒从5'至3'包含：(a)5'ITR序列；(b)任选地，增强子序列；(c)第一启动子序列；(d)任选地，内含子序列；(e)包含茎环序列的多核苷酸；(f)任选地，第二启动子序列；(g)任选地，包含茎环序列的多核苷酸；(h)多腺苷酸化信号序列，例如RBG多腺苷酸化信号序列；(i)一个或更多个填充序列；以及(j)3'ITR。
在一些实施方案中，前述方面和实施方案的表达盒相对于SEQ ID NO:252至261中的任一者包含至少70％(例如，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，前述方面和实施方案的表达盒相对于SEQ ID NO:256和258至261中的任一者包含至少70％(例如，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，前述方面和实施方案的表达盒相对于SEQ ID NO:261包含至少70％(例如，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性。在一些实施方案中，表达盒具有SEQ ID NO:256的核酸序列。
在一些实施方案中，前述方面和实施方案的表达盒被并入到前述方面和实施方案的载体中。在一些实施方案中，载体是复制缺陷型载体。在一些实施方案中，载体是哺乳动物载体、昆虫载体、细菌载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、腺病毒、细小病毒、冠状病毒、负链RNA病毒、正黏病毒、弹状病毒、副黏病毒、正链RNA病毒、小核糖核酸病毒、甲病毒、双链DNA病毒、疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒。在一些实施方案中，载体是AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体是AAV5、AAV9或AAVrh10载体。
在另一个方面中，本公开内容提供了抑制细胞中Grik2表达的方法，该方法包括使细胞与至少一种的前述方面和实施方案的多核苷酸、前述方面和实施方案的载体、或前述方面和实施方案的表达盒接触。
在一些实施方案中，多核苷酸与Grik2 mRNA特异性杂交并抑制或降低细胞中Grik2的表达(如本公开内容中进一步讨论的)。在一些实施方案中，该方法使细胞中Grik2的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。在一些实施方案中，该方法降低细胞中GluK2蛋白的水平。在一些实施方案中，该方法使细胞中GluK2蛋白的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是神经元(例如，人神经元)。在一些实施方案中，神经元是海马神经元(例如，人海马神经元)。在一些实施方案中，海马神经元是DGC(例如，人DGC或锥体神经元)。在一些实施方案中，DGC包括复发性苔藓纤维轴突。细胞还可以是来源于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的神经元细胞，例如表达Grik2的iPSC来源的谷氨酸能神经元。
在另一个方面中，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗或改善病症的方法，该方法包括向对象施用至少一种的前述方面和实施方案的多核苷酸、前述方面和实施方案的载体、或前述方面和实施方案的表达盒。
在一些实施方案中，所述病症是癫痫。在一些实施方案中，癫痫是颞叶癫痫(TLE)、慢性癫痫和/或难治性癫痫。在一些实施方案中，癫痫是TLE。在一些实施方案中，TLE是侧向TLE(lateral TLE，ITLE)，例如单侧TLE和/或双侧TLE。在一些实施方案中，TLE是内侧TLE(mesial TLE，mTLE)。
在一些实施方案中，对象是人。
在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含前述方面和实施方案的多核苷酸、前述方面和实施方案的载体、或前述方面和实施方案的表达盒、以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。
在另一个方面中，本公开内容提供了药盒，其包含前述方面的药物组合物和包装插页。在一些实施方案中，包装插页包括在前述方面和实施方案的方法中使用药物组合物的说明书。
定义
为了方便起见，下面提供了说明书、实施例和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或根据上下文中含蓄地说明，否则以下术语和短语包括下面提供的含义。提供这些定义用来帮助描述一些具体实施方案，而不是旨在限制所要求保护的技术。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如果本领域术语的使用与本文中提供的其定义之间存在明显差异，则以说明书中提供的定义为准。
在本申请中，除非上下文另有明确说明，否则(i)“未用数量词修饰的名词”可理解为“至少一个/种”；(ii)术语“或”可理解为意指“和/或”；并且(iii)术语“包含”和“包括”可理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独呈现还是与一个或更多个另外的组分或步骤一起呈现。
术语“约”是指所列举值的±10％的量并且可以是所列举值的±5％或所列举值的±2％。
术语“3'非翻译区”和“3'UTR”是指相对于mRNA分子(例如，Grik2mRNA)的终止密码子的3'区。3'UTR不翻译成蛋白质，但包含对mRNA转录物的多腺苷酸化、定位、稳定和/或翻译效率重要的调节序列。3'UTR中的调节序列可包括增强子、沉默子、富含AU的元件、poly-A尾、终止子和微RNA识别序列。术语“3'非翻译区”和“3'UTR”也可以指编码mRNA分子的基因的相应区域。
术语“5'非翻译区”和“5'UTR”是指mRNA分子(例如Grik2 mRNA)中相对于起始密码子位于5'的区域。该区域对于翻译起始的调节至关重要。在一些生物体中，5'UTR可以完全不翻译，或者可翻译其一些区域。转录起始位点标志着5'UTR的开始，并在起始密码子之前的一个核苷酸结束。在真核生物中，5'UTR包括含有起始密码子的Kozak共有序列。5'UTR可包括对翻译调节重要的顺式作用调节元件，也称为上游开放阅读框。该区域还可能含有上游AUG密码子和终止密码子。鉴于其高GC含量，5'UTR可形成二级结构，例如在翻译调节中发挥作用的发夹环。术语“施用”是指通过任何有效途径向对象提供或给予治疗剂(例如，如本文中公开的与Grik2 mRNA结合并抑制其表达的抑制性多核苷酸，或编码其的载体)。在本文中和下文中描述了示例性的施用途径(例如，脑室内注射、鞘内注射、实质内注射、静脉内注射和立体定向注射)。
术语“腺相关病毒载体”或“AAV载体”是指来源于腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一种或更多种AAV野生型基因(例如rep和/或cap基因)，但保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列促进AAV病毒体的挽救、复制和包装。因此，AAV载体在本文中被定义为至少包括病毒复制和包装所需的顺式序列(例如功能性ITR)。ITR不需要是野生型多核苷酸序列并且可以通过例如核苷酸的插入、缺失或替换来改变，只要该序列提供功能性挽救、复制和包装即可。使用已知技术构建AAV表达载体，以至少提供在转录方向上作为有效连接的组分、包括转录起始区的控制元件、目的DNA(例如，编码本公开内容的抑制性RNA物质的多核苷酸)和转录终止区。
术语“腺相关病毒反向末端重复”和“AAV ITR”是指AAV基因组各末端侧翼的本领域公认的区域，其以顺式发挥作用，共同作为DNA复制的起点和病毒的包装信号。AAV ITR与AAVrep编码区一起提供了插入两个侧翼ITR之间的多核苷酸序列的有效切除和向哺乳动物基因组中的整合。AAV ITR区的多核苷酸序列是已知的。本文中使用的“AAV ITR”不一定包括野生型多核苷酸序列，其可以例如通过核苷酸的插入、缺失或替换而改变。另外，AAV ITR可来源于数种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16等。此外，AAV载体中选定的多核苷酸序列侧翼的5'和3’ITR不需要是相同的或者来源于相同的AAV血清型或分离物，只要它们如预期那样发挥作用，例如当细胞中存在AAV Rep基因产物时允许切除和挽救来自宿主细胞基因组或载体的目的序列，并允许将异源序列整合到接受体细胞基因组中即可。另外，AAV ITR可来源于数种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16等。
术语“反义寡核苷酸”和“ASO”是指能够通过互补碱基配对与靶mRNA分子(例如，Grik2 mRNA)杂交并通过mRNA去稳定和降解或抑制翻译来抑制其表达的抑制性多核苷酸。
术语“cDNA”是指作为mRNA序列的DNA等价物(即，尿嘧啶被胸腺嘧啶替换)的核酸序列。一般而言，关于特定基因(例如，Grik2基因)，术语cDNA和mRNA可以互换使用，因为本领域技术人员将理解，除了将尿嘧啶读出为胸腺嘧啶之外，cDNA序列与mRNA序列均相同。此外，在其中提及编码本文中公开的反义构建体的DNA序列或提及由其编码的RNA转录物的情况下，除非上下文另有说明，否则术语“DNA”和“RNA”可以互换使用来指代反义序列。此外，本文中公开的某些DNA序列(例如，编码Grik2反义序列的那些)可以含有RNA核苷酸，在这种情况下，该序列作为整体可以被称为“DNA序列”或“RNA序列”。
术语“编码序列”对应于编码蛋白质或其一部分的mRNA分子的核酸序列。相关地，“非编码序列”对应于不编码蛋白质或其一部分的mRNA分子的核酸序列。非编码序列的非限制性实例包括5'和3'非翻译区(untranslated region，UTR)、内含子、polyA尾、启动子、增强子、终止子和其他顺式调节序列。
当术语“互补”用于描述与第二核苷酸或核苷序列相关的第一核苷酸或核苷序列时，是指包含第一核苷酸序列的多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。例如，这样的条件可以是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃，12至16小时，然后洗涤(参见，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press)。可以应用其他条件，例如生物体内部可能遇到的生理相关条件。根据杂交的核苷酸或核苷的最终应用确定最适合的用于测试两个序列的互补性的一组条件的方法是本领域公知的。
本文中使用的“互补”序列还可以包括非沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对和/或由非天然和替代核苷酸形成的碱基对，或者可以完全由其形成，只要满足上述关于其进行杂交的能力即可。这样的非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摆动或Hoogstein碱基配对。如本文中所述的多核苷酸与靶序列之间的互补序列包括：包含第一核苷酸序列的多核苷酸与包含第二核苷酸序列的多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。这样的序列在本文中可被称为相对于彼此“完全互补”。当本文中第一序列相对于第二序列被称为“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的或者它们可以在杂交成为多至30个碱基对的双链体时形成一个或更多个(但通常不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)错配碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如与mRNA(例如Grik2 mRNA)结合并抑制其表达的能力。例如，如果多核苷酸的序列与目的mRNA的非中断部分基本上互补，则该多核苷酸与目的mRNA的至少一部分互补。
术语“互补区”是指与基因、初级转录物、序列(例如，靶序列)或加工的mRNA的全部或部分基本上互补从而干扰内源基因(例如Grik2)的表达的抑制性多核苷酸的区域。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域。一般而言，最耐受的错配位于末端区域，例如，在抑制性多核苷酸的5'-和/或3'-末端的5、4、3或2个核苷酸内。
术语“保守氨基酸替换”、“保守替换”或“保守突变”是指一种或更多种氨基酸针对表现出相似理化性质(例如极性、静电荷和/或空间体积)的一种或更多种不同氨基酸的替换。下表1中总结了二十种天然存在的氨基酸中的每一种的这些性质。
表1.天然存在的氨基酸的代表性理化性质
从该表中可以看出，保守氨基酸家族包括，(i)G、A、V、L和I；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H、K和R；(v)N和Q；以及(vi)F、Y和W。因此，保守突变或替换是用一种氨基酸替换相同氨基酸家族的成员的突变或替换(例如，用Ser替换Thr或用Lys替换Arg)。
短语“使细胞与抑制性多核苷酸(例如本文中公开的抑制性多核苷酸)接触”包括通过任何可能的手段接触细胞。使细胞与抑制性多核苷酸接触包括使细胞体外与抑制性多核苷酸接触或使细胞体内与抑制性多核苷酸接触。使细胞与抑制性多核苷酸接触还可以是指使细胞与编码抑制性多核苷酸的核酸载体或包含其的药物组合物接触。接触可以直接或间接进行。因此，例如抑制性多核苷酸可以通过进行该方法的个体与细胞物理接触，或者替代地，抑制性多核苷酸物质可以被置于允许或导致其随后与细胞接触的情况中。体外接触细胞可以例如通过将细胞与抑制性多核苷酸一起孵育来进行。体内接触细胞可以例如如下进行：通过将抑制性多核苷酸注射到细胞所在的组织中或其附近，或者通过将抑制性多核苷酸物质注射到另一区域(例如血流或皮下空间)，使得该物质随后将到达待接触的细胞所在的组织。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞还可以在体外与抑制性多核苷酸接触并随后移植到对象中。
使细胞与抑制性多核苷酸接触包括通过促进或影响细胞的摄取或吸收来将抑制性多核苷酸“引入”或“递送到细胞中”。抑制性多核苷酸或编码其的核酸载体的吸收或摄取可以通过独立的扩散性或活性细胞过程或者通过辅助剂或装置发生。将抑制性多核苷酸引入到细胞中可以是体外和/或体内的。例如，对于体内引入，可以将抑制性多核苷酸注射到组织部位或全身施用。体外引入到细胞中包括本领域已知的方法，例如电穿孔和脂质体转染。在另一个实例中，可以通过转导将抑制性多核苷酸引入到细胞中，例如通过编码抑制性多核苷酸的病毒载体的方式。病毒载体可以经历细胞加工(例如，细胞内化、衣壳脱落、抑制性多核苷酸的转录、以及通过Drosha和Dicer的加工)以便表达所编码的抑制性多核苷酸。另一些方法在下文中描述和/或这些方法是本领域已知的。
对于基因(例如，Grik2)而言，术语“破坏其表达”、“抑制其表达”或“降低其表达”是指阻止或降低功能性基因产物(例如，GluK2蛋白)的形成。如果基因产物实现其正常(野生型)功能，则该基因产物是功能性的。基因的破坏阻止或降低由该基因编码的功能性蛋白质的表达。被破坏的基因可以被例如干扰RNA分子(例如ASO)，例如本文中所述的那些破坏。
本文中所述的术语组合物、载体构建体或病毒载体的“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当施用于对象(包括哺乳动物，例如人)时足以引起有益的或期望的结果(包括临床结果)的量。因此，“有效量”或其同义词取决于其应用的上下文。例如，在治疗颞叶癫痫(TLE)的情况下，它是与不施用组合物、载体构建体或病毒载体所获得的响应相比足以实现治疗响应的组合物、载体构建体或病毒载体的量。对应于这样的量的本文中所述的给定组合物的量将根据多种因素而变化，所述因素例如给定的药剂，药物制剂，施用途径，疾病或病症的类型及其严重程度，对象的特性(例如，年龄、性别、体重)，正在治疗的宿主，和/或在癫痫的情况下，癫痫病灶的尺寸(例如，脑容量)等，但仍然可以通过根据本领域公知的方法确定。此外，本文中使用的本公开内容的组合物、载体构建体或病毒载体的“治疗有效量”是与对照相比在对象中产生有益或期望的结果的量。如本文中所定义，本公开内容的组合物、载体构建体、病毒载体或细胞的治疗有效量可以通过本领域已知的方法容易地确定。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。
术语“癫痫”是指临床上表现为反复癫痫发作的一种或更多种神经系统疾病。可根据电临床综合征按照国际抗癫痫联盟(International League Against Epilepsy，IILAE；Berg et al.,2010)的分类和术语对癫痫进行分类。这些综合征可以根据发病年龄、独特的构象(constellation)(手术综合征)和结构代谢原因进行分类，例如：(A)发病年龄：(i)新生儿期包括良性家族性新生儿癫痫(benign familial neonatal epilepsy，BFNE)、早期肌阵挛性脑病(early myoclonic encephalopathy，EME)、大田原综合征(Ohtaharasyndrome)；(ii)婴儿期包括婴儿期癫痫伴迁移性局灶性癫痫发作、韦斯特综合征(Westsyndrome)、婴儿期肌阵挛性癫痫(myoclonic epilepsy in infancy，MEI)、良性婴儿癫痫、良性家族性婴儿癫痫、德拉维特综合征(Dravet syndrome)、非进行性病症中的肌阵挛性脑病；(iii)儿童期包括热性惊厥附加症(febrile seizures plus，FS+)、Panayiotopoulos综合征、癫痫伴肌阵挛性失张力(以前为不稳定的)癫痫发作、良性癫痫伴中央颞区棘波(benign epilepsy with centrotemporal spikes，BECTS)、常染色体显性夜间额叶癫痫(autosomal-dominant nocturnal frontal lobe epilepsy，ADNFLE)、迟发性儿童枕叶癫痫(Gastaut型)、癫痫伴肌阵挛性失神、雷诺-加斯特奥综合征(Lennox-Gastautsyndrome)、癫痫性脑病伴睡眠期间持续棘慢波(continuous spike-and-wave duringsleep，CSWS)、Landau-Kleffner综合征(Landau-Kleffner syndrome，LKS)、儿童失神性癫痫(childhood absence epilepsy，CAE)；(iv)青春期-成年期包括青少年失神性癫痫(juvenile absence epilepsy，JAE)、青少年肌阵挛性癫痫(juvenile myoclonicepilepsy，JME)、癫痫伴单纯全身性强直-阵挛性癫痫发作、进行性肌阵挛性癫痫(progressive myoclonus epilepsies，PME)、常染色体显性癫痫伴听觉特征(autosomaldominant epilepsy with auditory features，ADEAF)、其他家族性颞叶癫痫；(v)不同年龄的发病包括家族性局灶性癫痫伴不同病灶(儿童至成人)、反射性癫痫；(B)独特的构象(手术综合征)包括内侧颞叶癫痫(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)、拉斯穆森综合征(Rasmussen syndrome)、痴笑样癫痫发作伴下丘脑错构瘤、偏侧惊厥-偏瘫-癫痫；(C)归因于结构代谢原因并由结构代谢原因组织的癫痫包括皮质发育畸形(半侧巨脑症、异位等)、神经皮肤综合征(结节性硬化症和Sturge-Weber)、肿瘤、感染、创伤、血管瘤、围产期损伤和卒中。术语“难治性癫痫”是指对于药物治疗是难治性的癫痫；也就是说，目前的药物治疗不能够有效治疗患者的疾病(参见例如Dario J.Englot et al.,2013)。
术语“外显子”是指基因(例如Grik2基因)编码区内的区域，其核苷酸序列决定相应蛋白质的氨基酸序列。术语“外显子”也是指从基因转录的RNA的相应区域。外显子被转录成前mRNA，并且可能包含在成熟mRNA中，这取决于基因的选择性剪接。成熟mRNA中包含的外显子在加工后被翻译成蛋白质。外显子的序列决定了蛋白质的氨基酸组成。或者，成熟mRNA中包含的外显子可以是非编码的(例如，不翻译成蛋白质的外显子)。
当在基因或核酸表达的情况下使用时，术语“表达”是指将基因中包含的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或者是通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过过程例如加帽、多腺苷酸化、甲基化和编辑修饰的mRNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP-核糖基化、肉豆蔻酰化和糖基化修饰的蛋白质(例如GluK2)。
术语“表达”是指一种或更多种以下事件：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；以及(4)翻译后修饰多肽或蛋白质。对象中目的基因的表达可以例如通过检测以下实现：从对象获得的样品中编码相应蛋白质的mRNA的量或浓度的降低或提高(如例如使用本文中所述或本领域已知的RNA检测程序(例如定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和RNA seq技术)评估的)，相应蛋白质的量或浓度的降低或提高(如例如使用本文中所述或本领域已知的蛋白质检测方法例如酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等评估的)，和/或相应蛋白质活性的降低或提高(例如，在离子通道的情况下，如使用本文中所述或本领域已知的电生理学方法评估的)。
术语“GluK2”，也称为“GluR6”、“GRIK2”、“MRT6”、“EAA4”或“GluK6”，是指谷氨酸离子型受体红藻氨酸类型亚基2蛋白，如目前使用的IUPHAR命名法中所命名的(Collingridge,G.L.,Olsen,R.W.,Peters,J.,Spedding,M.,2009.Anomenclature forligand-gated ion channels.Neuropharmacology 56,2–5)。术语“含GluK2的KAR”、“GluK2受体”、“GluK2蛋白”和“GluK2亚基”可通篇互换使用，并且通常是指由Grik2基因编码或表达的蛋白。
术语“指导链”和“指导序列”是指位于茎环结构的5'或3'茎环臂上的茎环RNA结构(例如shRNA或微RNA)的组分，其中指导链/序列包含能够与Grik2 mRNA结合并抑制其表达的Grik2 mRNA反义序列(例如，SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中的任一者或其变体，所述变体与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如100％))序列同一性)。指导链/序列还可以包含另外的序列，例如如间隔区或接头序列。指导序列可以与茎环RNA结构的随从链/序列互补或基本上互补(例如，具有不超过7、6、5、4、3、2或1个错配)。
术语“离子型谷氨酸受体”包括NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)、AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸)和红藻氨酸受体(KAR)类别的成员。功能性KAR可以由命名为GluK1、GluK2、GluK3、GluK4和GluK5亚基的五种亚基的同聚或异聚组合组装成四聚体组装体(Reiner et al.,2012)。在一些情况下，本公开内容的靶标是由GluK2和GluK5构成的KAR复合物。鉴于观察到GluK5亚基本身不形成功能性同聚通道，抑制Grik2基因的表达足以消除GluK2/GluK5红藻氨酸受体功能。
“表达抑制剂”是指具有抑制或降低基因(例如Grik2基因)的表达的生物学作用的物质(例如，本公开内容的抑制性RNA物质)。抑制基因例如Grik2基因的表达通常将导致靶细胞或组织中基因产物(蛋白质，例如GluK2蛋白质)的降低或甚至消除，尽管可以实现不同水平的抑制。抑制或降低表达通常称为敲低(knockdown)。
术语“分离的多核苷酸”是指包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分离的分子。这样的共价连接的核苷酸也可称为核酸分子。一般而言，“分离的”多核苷酸是指人造的、化学合成的、纯化的和/或相对于获得它的核酸序列是异源性的多核苷酸。
术语“微RNA”是指调节mRNA翻译并因此影响靶蛋白丰度的非编码RNA的短(例如，通常约22个核苷酸)序列。一些微RNA是从单个单顺反子基因转录的，而另一些则转录为多顺反子基因簇的一部分。微RNA的结构可包括5'和3'侧翼序列、包含茎和环序列的发夹序列。在细胞内进行加工期间，未成熟的微RNA被Drosha截断，这切掉了5'和3'侧翼序列。随后，微RNA分子从细胞核转移到细胞质，在那里它经历通过Dicer切割环区。微RNA的生物学作用通过与mRNA分子区域(通常是3'非翻译区)结合在翻译调节水平上发挥作用，并导致mRNA的切割、降解、去稳定和/或较低的翻译效率。微RNA与其靶标的结合通常由微RNA的发夹序列内的短(例如，6至8个核苷酸)“种子区/序列”介导。在本公开内容通篇，术语siRNA可以包含其等同miRNA，使得miRNA涵盖与其等同siRNA相同的碱基，所述碱基具有针对靶标(例如，在种子区中)的同源性。如本文中所述，微RNA可以是非天然存在的微RNA，例如具有一种或更多种异源核酸序列的微RNA。
术语“核苷酸”被定义为经修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸通常包括嘌呤和嘧啶，其包括胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。本文使用的术语“抑制性多核苷酸”被定义为上文定义的核苷酸或本文中公开的经修饰核苷酸的寡聚物。术语“抑制性多核苷酸”是指3'-5'或5'-3'取向的核酸序列，其可以是单链或双链的。在本公开内容的上下文中使用的抑制性多核苷酸可以特别地是DNA或RNA。该术语还可以包括“抑制性多核苷酸类似物”，其是指具有例如以下的抑制性多核苷酸：(i)经修饰主链结构，例如除了天然寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键联之外的主链，和(ii)任选地，经修饰糖部分，例如吗啉代部分而不是核糖或脱氧核糖部分。抑制性多核苷酸类似物支持能够通过沃森-克里克碱基配对与标准多核苷酸碱基进行氢键合的碱基，其中类似物主链以这样的方式呈现碱基：允许在抑制性多核苷酸类似物分子与标准多核苷酸(例如，单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式进行这样的氢键合。特别地，类似物是具有基本上不带电荷的含磷主链的那些。抑制性多核苷酸类似物中基本上不带电荷的含磷主链是这样的主链，其中大部分亚基键联(例如其键联的50％至100％，通常为其键联的至少60％至100％、或75％、或80％)是不带电荷的并且含有单个磷原子。此外，术语“抑制性多核苷酸”可包含相对于其正常转录方向是反转的抑制性多核苷酸序列，并且因此对应于与宿主细胞内表达的靶基因mRNA分子互补的RNA或DNA序列。反义指导链可以以多种不同的方式构建，前提是它能够干扰靶基因的表达。例如，反义指导链可以通过以下来构建：相对于其正常转录方向反向互补靶基因的编码区(或其一部分)，以允许其互补序列(例如，由反义基因和有义基因编码的RNA可以是互补的)的转录。抑制性多核苷酸不需要具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，并且靶基因的非编码区段在实现靶基因表达的反义抑制方面可以与编码区段例如ASO同样有效。在一些情况下，抑制性RNA与靶基因具有相同的外显子模式。
抑制性多核苷酸可以具有允许靶向Grik2 mRNA并与其杂交的任何长度(例如，抑制性多核苷酸与Grik2 mRNA的至少一个区域完全或基本上互补)，并且长度可以是约10至50个碱基对，例如，长度约15至50个碱基对或长度约18至50个碱基对，例如，长度约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基对，例如约15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开内容的一部分。
术语“随从链”和“随从序列”是指位于茎环结构的5'或3'茎环臂上的茎环RNA结构(例如shRNA或微RNA)的组分，其包含与Grik2 mRNA反义序列(例如SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中的任一者或其变体，所述变体与SEQ IDNO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))序列同一性)互补或基本上互补(具有不超过7、6、5、4、3、2或1个错配)的序列。随从链/序列还可以包含另外的序列，例如如间隔区或接头序列。随从序列可以与茎环RNA结构的指导链/序列互补或基本上互补。
术语“质粒”是指染色体外环状双链DNA分子，其中可以连接另外的DNA区段。质粒是一种载体，是能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。某些质粒能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌质粒和附加型哺乳动物质粒)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞之后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。某些质粒能够指导与其可操作连接的基因的表达。本文中使用的“基因”是指编码蛋白质、微RNA、siRNA、shRNA、shmiRNA并且还含有一种或更多种调节序列(例如，启动子、增强子、内含子、终止序列等)的多核苷酸。
术语“启动子”是指DNA上被RNA聚合酶结合的识别位点。聚合酶驱动多核苷酸的转录。适合与本文中所述的组合物和方法一起使用的示例性启动子描述于例如Sandelin etal.,Nature Reviews Genetics 8:424(2007)中，由于其涉及核酸调节元件，因此其公开内容通过引用并入本文。另外，术语“启动子”可以是指合成启动子，其是不天然存在于生物学系统中的调节性DNA序列。合成启动子包含与自然界中不存在的多核苷酸序列组合的天然存在的启动子的部分，并且可以使用多种多核苷酸、载体和靶细胞类型进行优化以表达重组DNA。
相对于参考多核苷酸或多肽序列的“百分比(％)序列同一性”被定义为在比对序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。出于确定百分比核酸或氨基酸序列同一性的目的，比对可以以本领域公知的多种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。使用公认且常规的方法，可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用序列比较计算机程序BLAST生成百分比序列同一性值。作为说明，给定的核酸或氨基酸序列A相对于、与、或针对给定的核酸或氨基酸序列B的百分比序列同一性(或者其可以表述为给定的核酸或氨基酸序列A相对于、与、或针对给定的核酸或氨基酸序列B具有一定的百分比序列同一性)计算如下：
100乘以(分数X/Y)
其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序(例如BLAST)评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y是B中核酸的总数目。应理解在核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度时，A相对于B的百分比序列同一性将不等于B相对于A的百分比序列同一性。不管候选序列与参考多核苷酸或多肽序列之间的百分比序列同一性如何，候选序列保留至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的参考多肽或多肽序列的功能(例如，降低如本文中定义的Grik2 mRNA的水平，或如本文中定义的GluK2蛋白的表达水平的能力)。
术语“可药用”是指适于与对象例如哺乳动物(例如人)的组织接触而没有过度毒性、刺激、变态响应以及与合理的收益/风险比相称的其他问题并发症的那些化合物、物质、组分和/或剂型。
本文中使用的术语“药物组合物”表示包含本文中所述的化合物(例如，抑制性核酸分子(例如，RNA)或含有其的载体)的组合物，其与可药用赋形剂一起配制，并且在一些情况下可以在政府管理机构的批准下作为用于在哺乳动物中治疗疾病的治疗方案的一部分来制造或销售。药物组合物可以被配制成例如以单位剂型(例如片剂、胶囊剂、囊片剂、胶囊锭或糖浆剂)经口施用、表面施用(例如作为乳膏剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂)、静脉内施用(例如，作为不含颗粒栓塞的无菌溶液并且在适于静脉内使用的溶剂系统中)、鞘内注射、脑室内注射、实质内注射或以任何其他可药用制剂施用。
“可药用赋形剂”是指除本文中所述的化合物之外并且具有在患者中基本上无毒和非炎性的性质的任何成分(例如，能够混悬或溶解活性化合物的载剂)。赋形剂可以包括，例如：抗黏剂、抗氧化剂、黏合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、软化剂(emollient)、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、香味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨(printing inks)、吸附剂、助悬剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性的赋形剂包括但不限于丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶(shellac)、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉乙醇酸钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
本文中所述的化合物(例如，抑制性核酸分子(例如，RNA)和包含其的载体)可以具有可电离基团，以便能够制备为可药用盐。这些盐可以是涉及无机酸或有机酸的酸加成盐，或者该盐可以在本文中所述化合物的酸性形式的情况下由无机或有机碱制备而成。通常，化合物可作为制备为可药用酸或碱的加成产物的可药用盐来制备或使用。用于制备合适盐的合适的可药用酸和碱以及方法是本领域公知的。盐可由可药用无毒酸和碱(包括无机和有机的酸和碱)制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙和镁，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子(包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺)。
本文中使用的术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号序列)。这样的调节序列描述于例如Perdew etal.,Regulation of Gene Expression(Humana Press,New York,NY,(2014))中；其通过引用并入本文。
术语“靶向”或其变化形式是指抑制性核酸分子(例如RNA)例如本文中所述的抑制性RNA物质通过互补碱基配对与Grik2基因或编码GluK2蛋白的mRNA特异性结合的能力。
术语“短干扰RNA”和“siRNA”是指含有双链核酸(其中每条链包含RNA、RNA类似物或RNA和DNA)的抑制性多核苷酸。siRNA分子可包含19至23个核苷酸(例如，21个核苷酸)。siRNA通常在每条链的3'末端上具有2bp突出端，使得siRNA中的双链体区包含17至21个核苷酸(例如，19个核苷酸)。通常，siRNA的反义链与靶基因/RNA的靶序列充分互补。siRNA分子在RNA干扰途径内起作用，导致通过与靶mRNA(例如Grik2 mRNA)结合并通过Dicer介导的mRNA切割降解mRNA来抑制mRNA表达。在本公开内容通篇，术语siRNA意指包括其等同miRNA，使得miRNA涵盖与其等同siRNA相同的碱基，所述碱基具有针对靶标的同源性。
术语“短发夹RNA”和“shRNA”是指含有50至100个核苷酸的单链RNA的抑制性多核苷酸，所述抑制性多核苷酸在细胞中形成茎环结构，所述结构含有5至30个核苷酸的环区，以及在环区两侧的15至50个核苷酸的长互补RNA，其通过互补RNA序列之间的碱基配对形成双链茎；并且在一些情况下，在形成茎的每条互补链之前和之后包含另外的1至500个核苷酸。例如，shRNA通常需要发夹3'的特定序列来终止RNA聚合酶的转录。这样的shRNA通常会绕过Drosha的加工，因为它们包含短的5'和3'侧翼序列。其他shRNA，例如从RNA聚合酶II转录的“shRNA样微RNA”，包含较长的5'和3'侧翼序列，并且需要Drosha在细胞核中进行加工，然后将切割的shRNA从核输出到胞质溶胶并在胞质溶胶中进一步被Dicer切割。与siRNA一样，shRNA以序列特异性的方式与靶mRNA结合，从而切割并破坏靶mRNA，并因此抑制靶mRNA的表达。
本文中使用的术语“特异性杂交”和“特异性结合”是指多核苷酸在该多核苷酸与靶核酸(例如，Grik2 mRNA)之间具有足够程度的互补性以诱导期望的作用(例如，降低或抑制从Grik2 mRNA表达GluK2)，同时对非靶核酸表现出最小的影响或没有影响。特异性杂交或结合可以在生理条件下发生。例如，当多核苷酸(例如，反义多核苷酸)中与相应靶核酸(例如，mRNA序列)处的核碱基互补的核碱基数目促进多核苷酸与靶核酸而不是与非靶核酸的退火时，发生特异性杂交或结合(例如，互补性对应于靶核酸与多核苷酸的结合部分的例如80％或更大(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％)的百分比序列同一性)。本领域技术人员将理解，在这样的情况下，多核苷酸(例如，反义寡聚物)中的核酸序列和靶核酸中的核酸序列具有高度互补性(例如，至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％互补，例如在限定数目的多核苷酸(例如，约7至22个核碱基)上。
术语“对象”和“患者”是指动物(例如，哺乳动物，例如人)。根据本文中所述的方法待治疗的对象可以是已被诊断出患有癫痫(例如，TLE)的对象，或处于发生该病症的风险中的对象。诊断可以通过本领域已知的任何方法或技术进行。根据本公开内容待治疗的对象可能已经接受了标准测试，或者可在没有检查的情况下由于存在与疾病或病症相关的一种或更多种危险因素已经被鉴定为处于危险中的对象。
术语“颞叶癫痫”或“TLE”是指以起源于脑颞叶的慢性和反复癫痫发作(癫痫)为特征的慢性神经病症。这种疾病与原初脑组织中的急性癫痫发作不同，因为TLE的特征为神经元网络的形态功能重组和来自海马齿状回颗粒细胞中的复发性苔藓纤维的出芽，而原初组织中的急性癫痫发作不会加剧这样的回路特异性重组。TLE可能是由脑的一个或两个半球中出现致癫痫病灶造成的。
术语“转导”及其变化形式是指将核酸物质(例如，载体，例如病毒载体构建体或其一部分)引入到细胞中并随后在细胞中表达由该核酸物质(例如，载体构建体或其一部分)编码的多核苷酸的方法。
术语“治疗”或其变化形式是指预防性和防护性治疗以及治愈性或疾病缓解治疗二者，包括对处于感染该疾病的风险中的患者、或怀疑感染该疾病的患者、以及生病或已被诊断为患有疾病或医学病症的患者的治疗。治疗还包括抑制临床复发。可向患有医学病症或最终可能罹患该病症的对象施用治疗以预防、治愈病症或复发性病症、延迟其发作、降低其严重程度、或改善其一种或更多种症状，或延长对象的存活(超出在不存在这样的治疗的情况下的预期存活)。“治疗方案”意指治疗疾病的模式，例如在治疗期间使用的给药模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可采用(部分或全部采用)“加载方案”，其可包括施用比医师在维持方案期间采用的剂量更大的药物剂量、比医师在维持方案期间施用药物更频繁地施用药物，或者这二者。短语“维持方案”或“维持期”是指这样的治疗方案(或治疗方案的一部分)，其用于在疾病治疗期间维持患者，例如以使患者长期(数月或数年)处于缓解状态。维持方案可采用连续治疗(例如，以固定间隔(例如每周、每月、每年等)施用药物)，或间歇治疗(例如，中断治疗、间歇治疗、复发时治疗或在达到特定的预定标准(例如，疾病表现)之后治疗。
术语“载体”包括核酸载体，例如，DNA载体(例如质粒)、RNA载体或其他合适的复制子(例如，病毒载体)。已开发多种载体用于将编码外源多核苷酸或蛋白的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。这样的表达载体的实例在例如WO 1994/011026中公开；由于其涉及适于表达目的核酸物质的载体，因此将其通过引用并入本文。适于与本文中所述的组合物和方法一起使用的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于在哺乳动物细胞中表达异源核酸物质(例如ASO)的附加序列元件。可用于表达本文中所述的抑制性核酸(例如RNA)物质的某些载体包括含有调节序列(例如指导基因转录的启动子和增强子区)的质粒。可用于表达本文中公开的抑制性核酸(例如，RNA)物质的其他可用载体包含增强这些多核苷酸的翻译率或改善由基因转录产生的核酸(例如，RNA)的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件包括，例如，5'和3'非翻译区、IRES和多腺苷酸化信号位点，以指导表达载体上携带的基因的有效转录。适于与本文中所述的组合物和方法一起使用的表达载体还可以含有编码用于选择含有这样的载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适的标志物的实例是编码针对抗生素(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素(nourseothricin)或博莱霉素(zeocin))的耐受性的基因。
本文中使用的术语“变体”是指通过相对于起始序列(例如参考序列)合理地包含一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6或7)个核苷酸修饰(替换、插入、缺失或错配)而获得的多核苷酸，例如本公开内容的抑制性多核苷酸序列或其互补体(例如，其实质上或完全的互补体)。这样的修饰可以改善多核苷酸的至少一种特性(例如，生物学功能)(例如，改善指导链的RISC加载或保留、降低随从链的RISC加载或保留、或提高指导与链产生的比率，并改善对靶核酸序列的抑制)。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅以彩色执行的绘图。带有彩色绘图的本专利或专利申请公开文件的副本将由专利局根据请求和必要费用的支付提供。
图1A至1W是包含嵌入内源性(E)-miR-30微RNA支架中的Grik2mRNA靶向反义序列GI(SEQ ID NO:16)或其变体的茎环结构的图像。茎环结构从5'至3包含：指导链，其含有GI反义序列或其合理设计的变体(SEQ ID NO:17至30 230至233、和242至245)；E-miR-30环序列；和随从序列(SEQ ID NO:31)或其合理设计的变体(SEQ ID NO:32至45、234至237、和246至249)。起始构建体(构建体A)在图1A中示出。相对于起始构建体的变化分别在图1B至1W中示出。小黑点对应于UG摆动对。带有数字的大黑点对应于实施例1中描述的设计基准。*Drosha和Dicer切割位点基于从起始构建体A获得的小RNA测序数据中观察到的最丰富的种类，该起始构建体A被递送到诱导多能干细胞(iPSC)来源的谷氨酸能神经元(GlutaNeurons)中。
图2A至2Q是包含嵌入内源性E-miR-124-3微RNA支架中的Grik2mRNA靶向反义序列G9(SEQ ID NO:63)或其变体的茎环结构的图像。茎环结构包含：指导链，其含有G9反义序列或其合理设计的变体(SEQ ID NO:64至79)；E-miR-124-3环序列；和随从序列(SEQ ID NO:80)或其合理设计的变体(SEQ ID NO:81至96])。起始构建体(构建体B)在图2A中示出。相对于起始构建体的变化分别在图2B至2Q中示出。在图2A至2I中所示构建体的特征在于从5'至3'包含随从链、环序列和指导链的茎环结构，而图2J至2Q特征在于从5'至3'包含指导链、环序列和随从链的茎环结构。小黑点对应于UG摆动对。带有数字的大黑点对应于实施例1中描述的设计基准。*Drosha和Dicer切割位点基于从起始构建体B获得的小RNA测序数据中观察到的最丰富的种类，该起始构建体B被递送到谷氨酸能神经元中。
图3A至3L是包含嵌入内源性E-miR-124-3微RNA支架中的Grik2mRNA靶向反义序列MW(SEQ ID NO:109)或其变体的茎环结构的图像。茎环结构从5'至3'包含：随从序列(SSEQID NO:121)或其合理设计的变体(SEQ ID NO:122至132)；E-miR-124-3环序列；和指导链，其含有MW反义序列或其合理设计的变体(SEQ ID NO:110至120)。起始构建体(构建体C)在图3A中示出。相对于起始构建体的变化分别在图3B至3L中示出。小黑点对应于UG摆动对。带有数字的大黑点对应于实施例1中描述的设计基准。*Drosha和Dicer切割位点基于从起始构建体C获得的小RNA测序数据中观察到的最丰富的种类，该起始构建体C被递送到谷氨酸能神经元中。
图4A至4F是包含嵌入内源性E-miR-218-1微RNA支架中的Grik2mRNA靶向反义序列MW(SEQ ID NO:139)或其变体的茎环结构的图像。茎环结构从5'至3'包含：指导链，其含有MW反义序列或其合理设计的变体(SEQ ID NO:140至144)；E-miR-218-1环序列；和随从序列(SEQ ID NO:145)或其合理设计的变体(SEQ ID NO:146至150)。起始构建体(构建体D)在图4A中示出。相对于起始构建体的变化分别在图4B至4F中示出。小黑点对应于UG摆动对。带有数字的大黑点对应于实施例1中描述的设计基准。*Drosha和Dicer切割位点基于从起始构建体D获得的小RNA测序数据中观察到的最丰富的种类，该起始构建体D被传递到谷氨酸能神经元中。
图5A-5E是含有本公开内容的单一微RNA构建体的AAV表达构建体的图像。一般性构建体结构从5'至3'的特征为：AAV 5’ITR；hSyn1启动子序列；从5'至3'包含5'微RNA侧翼序列、包含指导链或随从链序列的5'茎环臂、微RNA(E-miR)环序列、包含随从链或指导链序列的3'茎环臂、以及3'侧翼序列的茎环序列；多腺苷酸化序列(RGB PolyA)和AAV3’ITR(图5A)。图5B示出了含有构建体#3(SEQ ID NO:4)的茎环序列的AAV载体，构建体#102。图5C示出了含有构建体#51(SEQ ID NO:135)的茎环序列的AAV载体，构建体#103。图5D示出了含有构建体#39(SEQ ID NO:98)的茎环序列的AAV载体。图5E示出了含有构建体#40(SEQ ID NO:99)的茎环序列的AAV载体。
图6A和6B是含有本公开内容的多联体构建体的AAV表达构建体的图像。图6A示出了双微RNA AAV载体，构建体#100，其含有构建体#3(SEQ ID NO:4)和构建体#51(SEQ IDNO:135)的茎环序列，其中构建体#3相对于构建体#51在第5'位处。图6B示出了多联体AAV载体，其含有构建体#3(SEQ ID NO:4)和构建体#51(SEQ ID NO:135)的茎环序列，其中构建体#3相对于构建体#51在第3'位处。
图7是描绘如实施例3所示转染的SH-SY5Y细胞中通过RT-qPCR定量的人Grik2mRNA的相对表达水平的图。所有组的n＝4。单因素ANOVA，Dunnett多重比较检验(相对于siNegative)。**p<0.001；误差棒：标准偏差。图例：RNAiMAX＝仅转染试剂；siNegative＝siRNA阴性对照；siPositive＝siRNA阳性对照；A、C、D＝分别为构建体A、构建体C和构建体D；#1、#2、#3、#4、#39、#40、#50和#51＝分别为构建体#1、构建体#2、构建体#3、构建体#4、构建体#39、构建体#40、构建体#50和构建体#51。
图8A和8B是分别示出在用AAV载体转导之后小鼠皮质神经元(MCN)中miRNA GI和MW的表达以及GLUK2蛋白水平的图。图8A示出了通过茎环RT-qPCR进行的GI和MW量化。y轴表示在用AAV载体转导的细胞中表达的每10pg总RNA中GI或MW miRNA的分子数：从左至右，RNAnull载体(Ctrl)、包含相对于构建体#51(SEQ ID NO:135)在第5’位处的构建体#3(SEQ IDNO:4)的茎环序列的双miRNA多联体构建体#100(Seq ID:256)、包含相对于构建物#3在5'位处的构建体#51的茎环序列的双miRNA多联体构建体#101(SEQ ID NO:257)、仅包含GI序列的单一构建体(SEQ ID NO:252)，和仅包含MW序列的单一构建体(SEQ ID NO:253)。图8B示出了通过免疫印迹量化的GLUK2蛋白水平。对照孔为经AAV9.hSyn.GFP处理的、RNA null对照载体或未经处理的。该图示出了每种条件下归一化为β-肌动蛋白的GLUK2/GLUK3表达相对于AAV9.hSyn.GFP对照的倍数变化。**P<0.01。
图9是示出在用RNA null载体(Ctrl)或编码双miRNA多联体的AAV转导之后，在iPSC来源的谷氨酸能神经元细胞中通过RNA测序量化的Grik2 mRNA表达的图，双miRNA多联体即构建体#100(SEQ ID NO:256)，其包含相对于构建体#51(SEQ ID NO:135)在第5'位处的构建体#3(SEQ ID NO:4)的茎环序列。TPM，每百万份转录物。**FDR(P adj)<0.01。
图10A和10B是显示来自两名患有颞叶癫痫(TLE)患者的相邻人脑切片的癫痫样活动的图。一名患者的脑切片是在过度兴奋的条件下记录的，并且另一名患者的脑切片是在生理条件下记录的。图10A示出了在4-AP/加巴嗪存在下记录的来自TLE患者的相邻器官型海马切片。图的左侧示出了在由对照载体(AAV9.hSyn.GFP)转导之后记录的发作事件的原始迹线。图的右侧示出了描绘用构建体#100(AAV9.hSyn.构建体#3/构建体#51；SEQ ID NO:256)转导后癫痫样放电的原始迹线。与对照相比，构建体#100在超兴奋条件下显著抑制离体TLE海马的自发性癫痫发作。图10B示出了来自另一位TLE患者的器官型海马切片的神经元兴奋性；这些切片是在生理条件下记录的以记录在用RNA null对照和构建体#100转导之后的自发性癫痫发作活动。与对照相比，构建体#100在生理缓冲条件下显著抑制离体TLE海马的自发性癫痫发作。
图11A至C是描绘毛果芸香碱小鼠模型中癫痫相关表型的行为评估的图。慢性癫痫小鼠用RNA null对照载体(Ctrl)或构建体#100(SEQ ID NO:256)、构建体#101(SEQ ID NO:257)、仅包含GI序列的单一构建体(SEQ ID NO:252)和仅包含MW序列的单一构建体(SEQ IDNO:253)(n＝5)处理，所有这些均以1E+9GC/脑施加。*p<0.05，**p<0.01，曼-惠特尼检验。多联体载体(构建体#100和构建体#101)可有效改善体内毛果芸香碱模型中的癫痫相关表型。图11A示出了慢性癫痫小鼠在开放场地箱中探索10分钟期间所行走的总距离。癫痫小鼠是过度活跃的，并且相对于非癫痫小鼠移动大约两倍的距离。因此，用多联体载体处理的小鼠表现得更像非癫痫小鼠，并且治疗之后移动更短的距离。图11B示出了用RNA null对照、第一多联体(构建体#100)或第二多联体(构建体#101)处理的慢性癫痫小鼠的平均每日癫痫发作次数。图11C示出了基于五种动物行为(筑巢、摇动、毛发、处理和运动)的行为评分。Y轴代表五种行为的评分之和。对照代表用对照载体处理的癫痫小鼠。用构建体#100处理的小鼠表现出与正常非癫痫小鼠相似的行为。
图12A和12B是用RNA null对照载体(Ctrl)或构建体#100(SEQ ID NO:256)处理的毛果芸香碱小鼠所移动的距离或癫痫发作活动的图。在1E+10GC/脑的测试剂量下，构建体#100可有效降低体内毛果芸香碱小鼠模型中的过度运动表型和癫痫发作活动。图12A示出了慢性癫痫小鼠在开放场地箱中探索10分钟期间所行走的总距离。慢性癫痫小鼠用对照载体或构建体#100以1E+10GC/脑施用进行处理。****p<0.0001，曼-惠特尼检验。图12B示出了在用对照载体或构建体#100治疗一个月之后慢性癫痫小鼠的平均每日癫痫发作次数。**p<0.01，曼-惠特尼检验。
图13A和13B是描绘在用构建体#100处理的毛果芸香碱小鼠中剂量依赖性降低过度运动表型和癫痫发作的图。图13A示出了在开放场地箱中10分钟探索期间所行走的总距离。慢性癫痫小鼠用RNA null对照载体(Ctrl)或构建体#100、1E+8/1E+9/1E+10GC/脑处理。**p<0.01，曼-惠特尼检验。野生型小鼠(WT)的历史运动活动在单独的实验中进行了评估，但在此显示以供比较。图13B示出了在用对照载体或构建体#100处理之后慢性癫痫小鼠的平均每日癫痫发作次数。
图14是包括构建体#100的抑制性多核苷酸序列的载体图谱的图像。虽然构建体#100包括lac启动子序列、氨苄青霉素抗性(AmpR)启动子序列和卡那霉素抗性(KanR)序列，但也可以包括其他启动子和抗生素抗性序列(例如氯霉素抗性序列)作为替代。
具体实施方式
本文中描述了用于在对象(例如哺乳动物对象，例如人)中使用具有修饰的抑制性多核苷酸(例如，编码抑制性RNA物质的多核苷酸)治疗癫痫例如如颞叶癫痫(TLE；例如治疗难治性TLE)的组合物和方法，所述修饰被设计为影响(例如，改善)RNA诱导的沉默复合物(RISC)加载并且例如增强反义指导链的产生并最小化随从链的产生，从而促进Grik2 mRNA和GluK2表达的更大敲低，并降低随从链引起的脱靶效应和毒性的潜在风险。例如，治疗有效量的靶向由谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚单位2(Grik2)基因编码的mRNA的抑制性RNA分子(例如，反义寡核苷酸(ASO)、shRNA、siRNA、shmiRNA、或编码其的核酸载体，例如本文中描述的那些)可以例如根据本文中所描述的方法施用，以在有此需要的对象(例如人)中治疗癫痫。本文中还描述了含有编码靶向Grik2 mRNA的抑制性RNA物质的核酸载体(例如，病毒载体，例如如腺相关病毒(AAV)载体)的组合物用于治疗TLE。
1.Grik2
Grik2是编码离子型谷氨酸受体亚基(GluK2)的基因，所述GluK2可被内源性激动剂谷氨酸激活，并且也可以被激动剂红藻氨酸选择性地激活。与其他离子型谷氨酸受体一样，含GluK2的红藻氨酸受体(KAR)表现出通过谷氨酸的快速配体门控，其通过打开钠和钾可渗透的阳离子通道孔来起作用。KAR复合物可以由数个亚基组装为KAR亚基的异聚体或同聚体。这样的受体特征在于：胞外N端和大肽环，其共同形成配体结合结构域，和胞内C端。离子型谷氨酸受体复合物本身充当为配体门控的离子通道，并且在结合谷氨酸之后介导带电离子穿过神经元膜。一般而言，KAR是GluK1、GluK2和/或GluK3(之前分别称为GluR5、GluR6和GluR7)、GluK4(KA1)和GluK5(KA2)亚基的多聚体组装体(Collingridge,Neuropharmacology.2009Jan；56(1):2-5)。KAR复合物中涉及的亚基的多种组合通常由编码特定KAR亚基的mRNA的RNA剪接和/或RNA编辑(例如，通过腺苷脱氨酶将腺苷转化为肌苷)来确定。此外，这样的RNA修饰可影响受体的性质，例如如改变通道的钙渗透性。已知红藻氨酸受体活性的提高是致痫的。含GluK2的KAR是调节离子型谷氨酸受体活性并随后改善与癫痫发生相关的症状的合适靶标(Peret et al.,2014)。
2.颞叶癫痫
癫痫发生是导致癫痫形成的过程，并且在导致病理性神经元网络重组的细胞、分子和形态学变化发生时可出现潜伏。基于致痫灶的解剖起源，TLE的特征在于两种主要类型。起源于内侧颞叶(例如海马、海马旁回、下托和杏仁核等)的TLE称为内侧TLE(mesialTLE，mTLE)，而起源于外侧颞叶(例如颞新皮质)的TLE称为外侧TLE(lateral TLE，lTLE)。TLE的另外的特征特性可包括在海马的CA1、CA3、齿状门和齿状回(dentate gyrus，DG)区域中的神经元细胞死亡、GABA逆转电位的逆转、DG中的颗粒细胞(granule cell，GC)分散、以及导致齿状GC上形成病理生理性复发性兴奋性突触(rMF-DGC突触)的复发性GC苔藓纤维的出芽。
多种致病因素被认为是TLE的病因，其包括内侧颞叶硬化、创伤性脑损伤、脑感染(例如脑炎和脑膜炎)、缺氧性脑损伤、卒中、脑肿瘤、遗传综合征和热性惊厥。由于CNS的可塑性取决于发育状态和脑区域特异性易感性二者，因此并非所有患有脑损伤的患者都发生癫痫。海马体(包括DG)已被确定为特别容易受到导致TLE的损伤的脑区域，并且在一些情况下，与治疗抗性(即难治性)癫痫有关(Jarero-Basulto,J.J.,et al.
Pharmaceuticals,2018,11,17；doi:10.3390/ph11010017)。兴奋性谷氨酸信号传导的放大可促进自发性癫痫发作(Kuruba,et al.Epilepsy Behav.2009,14(Suppl.1),65–73)。
不希望受理论束缚，通过异位含GluK2的KAR起作用的异常rMF-DGC突触(Epszteinet al.,2005；Artinian et al.,2011,2015)可在TLE的慢性癫痫发作中发挥关键作用(Peret et al.,2014)。例如，在缺乏GluK2受体亚基或存在抑制GluK2/GluK5受体的药剂的转基因小鼠中，发作间期尖峰和发作事件(即癫痫样脑活动的电生理特征)降低(Peret etal.,2014；Crépel和Mulle,2015)。虽然在旨在测试这些理论的转基因动物模型中敲低或沉默GluK2是可行的，但设计对GluK2亚基具有选择性且可安全用于人中的抑制剂是具有挑战性的。GluK亚基是结构上保守的，并且其编码序列的DNA具有显著的同源性。脑中关于同聚和异聚离子型和代谢型谷氨酸受体的复杂基因表达模式进一步使任何治疗策略复杂化。本文中所公开的方法和组合物适合于通过以下来治疗TLE(例如mTLE或lTLE)：靶向Grik2mRNA并减少(例如敲低)神经元或星形胶质细胞中含GluK2的KAR的表达，这促进例如神经元回路(例如海马回路)中自发性癫痫样放电的降低。因此，本文中描述的组合物和方法靶向疾病的生理原因并可用于治疗。
3.靶向Grik2 mRNA的抑制性多核苷酸
TLE的临床管理非常困难，其中至少三分之一的TLE患者无法使用可获得药物来充分控制使人衰弱的癫痫发作。这些患者经常会出现难以治疗的反复癫痫发作。在这样情况下，TLE患者可能会诉诸于侵入性和不可逆的手术切除颞叶中的致痫灶，这可以导致不希望的认知缺陷。因此，相当一部分TLE患者需要新的治疗途径来治疗药物抗性TLE。本文中所述的组合物和方法提供了治疗导致TLE的发生和进展的潜在分子病理生理学的益处。
本文中所述的组合物(其是编码靶向Grik2 mRNA(例如SEQ ID NO:164至174中的任一者)的抑制性核酸构建体(例如抑制性RNA物质或编码其的核酸载体)的多核苷酸)可以根据本文中所述的方法被施用，以治疗癫痫例如TLE。本文中所述的方法和组合物可用于治疗患有任何类型的TLE(例如具有局灶性癫痫发作的TLE、具有全身性癫痫发作的TLE、mTLE或ILTLE)的TLE患者。此外，目前所公开的方法和组合物可用于治疗由任何病因引起的TLE，所述任何病因例如如内侧颞叶硬化、创伤性脑损伤、脑感染(例如脑炎和脑膜炎)、缺氧性脑损伤、卒中、脑肿瘤、遗传综合症，或热性惊厥。本文中所述的组合物和方法还可以作为预防性治疗施用于处于发生TLE风险的对象，例如处于TLE进展潜伏期的对象。
根据本文中所公开的方法和组合物，抑制性核酸(例如，抑制性RNA物质)可通过引起细胞(例如，神经元，例如如海马神经元，例如如齿状回的海马神经元，例如如齿状颗粒细胞(DGC)或谷氨酸能锥体神经元)中Grik2 mRNA的降解来抑制GluK2的表达，从而阻止将mRNA翻译成功能性GluK2蛋白。
本文中所公开的靶向Grik2 mRNA的抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)可起到减少一个或更多个脑区域中癫痫脑活动(例如，癫痫样放电)的发生频率或完全抑制其发生的作用。这样的脑区域可包括但不限于内侧颞叶、外侧颞叶、额叶，或更具体地，海马体(例如，DG、CA1、CA2、CA3、下托)或新皮质。由于DG的rMF-DGC中含GluK2的KAR的异常表达，因此在DG中癫痫脑活动的发生可被抑制。
因此，本公开内容提供了通过使细胞与有效量的具有与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、和238至241中任一者具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)或编码其的核酸载体(例如与SEQ ID NO:256具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的核酸载体)接触来降低CNS细胞(例如，DGC)中的癫痫样放电的方法和组合物。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％的序列同一性的miR-30茎环序列和与SEQ ID NO:34具有至少85％的序列同一性的miR-30随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包含具有SEQ ID NO:19的核酸序列同一性的miR-30指导序列、具有SEQ ID NO:4的核酸序列的miR-30茎环序列、以及具有SEQ ID NO:34的核酸序列的miR-30随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括与SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括与SEQ IDNO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列和与SEQ ID NO:147具有至少85％的序列同一性的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包含具有SEQ ID NO:141的核酸序列的miR-218-1指导序列、具有SEQ ID NO:135的核酸序列的miR-218-1茎环序列、以及具有SEQ ID NO:147的核酸序列的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括SEQ ID NO:135的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％的序列同一性的miR-30茎环序列、与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；以及(b)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列，和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)具有SEQID NO:19的序列的miR-30序列指导序列、具有SEQ ID NO:4的序列的miR-30茎环序列、和具有SEQ ID NO:34的序列的miR-30随从序列；以及(b)具有SEQ ID NO:141的序列的miR-218-1指导序列、具有SEQ ID NO:135的序列的miR-218-1茎环序列、和具有SEQ ID NO:147的序列的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子包括与SEQ ID NO:258具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:258的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:194至198中的任一者具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的hSyn启动子序列，(b)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30茎环序列，和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；以及(c)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列，和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:198具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的hSyn启动子序列，(b)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ IDNO:4具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30茎环序列，和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；以及(c)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列，和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)具有SEQ ID NO:198的序列的hSyn启动子序列，(b)具有SEQ ID NO:19的序列的miR-30序列指导序列、具有SEQ ID NO:4的序列的miR-30茎环序列、和具有SEQ ID NO:34的序列的miR-30随从序列；以及(c)具有SEQ ID NO:141的序列的miR-218-1指导序列、具有SEQ ID NO:135的序列的miR-218-1茎环序列、和具有SEQ ID NO:147的序列的miR-218-1随从序列。在一些实施方案中，核酸分子包括与SEQ IDNO:259具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:259的核酸序列。
在本文中所述的任何下列核酸分子的一些实施方案中，核酸分子可以包括可以控制一种或更多种(例如，两种)miRNA序列的表达的单个启动子，或各自可以控制单个miRNA构建体的表达的两个启动子。例如，在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包含(a)启动子序列；(b)miRNA序列，例如包括miR-30指导序列、miR-30茎环序列和miR-30随从序列的miR-30序列；(c)任选地，第二启动子序列；以及(d)第二miRNA序列，例如包括miR-218-1指导序列、miR-218-1茎环序列和miR-218-1随从序列的miR-218序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包含(a)启动子序列；(b)miRNA序列，例如包括miR-30指导序列、miR-30茎环序列和miR-30随从序列的miR-30序列；以及(c)第二miRNA序列，例如包括miR-218-1指导序列、miR-218-1茎环序列和miR-218-1随从序列的miR-218序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包含(a)启动子序列；(b)miRNA序列，例如包括miR-30指导序列、miR-30茎环序列和miR-30随从序列的miR-30序列；(c)第二启动子序列；以及(d)第二miRNA序列，例如包括miR-218-1指导序列、miR-218-1茎环序列和miR-218-1随从序列的miR-218序列。
在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:194至198中的任一者具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的hSyn启动子序列，(b)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30茎环序列，和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；(c)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列，和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列；以及(d)与SEQ ID NO:213、214和215中的一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的兔β-珠蛋白(RBG)聚腺苷酸(polyA)信号序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:198具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的hSyn启动子序列，(b)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30茎环序列，和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；(c)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列，和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列；以及(d)与SEQ ID NO:213、214和215中的一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的RBG polyA信号序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)具有SEQ ID NO:198的序列的hSyn启动子序列，(b)具有SEQ ID NO:19的序列的miR-30序列指导序列、具有SEQ ID NO:4的序列的miR-30茎环序列、和具有SEQID NO:34的序列的miR-30随从序列；(c)具有SEQ ID NO:141的序列的miR-218-1指导序列、具有SEQ ID NO:135的序列的miR-218-1茎环序列、和具有SEQ ID NO:147的序列的miR-218-1随从序列；以及(d)具有SEQ ID NO:213、214和215中的任一者的序列的RBG polyA信号序列。在一些实施方案中，核酸分子包括与SEQ ID NO:260具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:260的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:208具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的5’ITR序列，(b)与SEQ ID NO:198具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的hSyn启动子序列，(c)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30茎环序列，和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；(d)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1茎环序列，和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列；(e)与SEQ ID NO:213、214和215中的一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的RBG polyA信号序列；以及(f)与SEQ ID NO:212具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的3’ITR序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)具有SEQ ID NO:208的序列的5’ITR序列，(b)具有SEQ ID NO:198的序列的hSyn启动子序列，(c)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、具有SEQ ID NO:4的序列的miR-30茎环序列、和与SEQID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；(d)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、具有SEQ ID NO:135的序列的miR-218-1茎环序列、和具有SEQ ID NO:147的序列的miR-218-1随从序列；(e)与SEQ ID NO:213、214和215中一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的RBG polyA信号序列；以及(f)具有SEQ ID NO:212的序列的3'ITR序列。在一些实施方案中，核酸分子包括与SEQ ID NO:261具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:261的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)与SEQ ID NO:208具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的5’ITR序列，(b)与SEQ ID NO:198具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的hSyn启动子序列，(c)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30茎环序列、和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；(d)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-1茎环序列、和与SEQ ID NO:147具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1随从序列；(e)与SEQ ID NO:213、214和215中一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的RBG polyA信号序列；(f)与SEQ ID NO:250和251中一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的填充序列；以及(g)与SEQ ID NO:212具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的3’ITR序列。在一些实施方案中，核酸分子从5'至3'包括(a)具有SEQ ID NO:208的序列的5’ITR序列，(b)具有SEQ ID NO:198的序列的hSyn启动子序列，(c)与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-30序列指导序列、具有SEQ ID NO:4的序列的miR-30茎环序列、和与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的同一性的miR-30随从序列；(d)与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的miR-218-1指导序列、具有SEQ ID NO:135的序列的miR-218-1茎环序列、和具有SEQ IDNO:147的序列的miR-218-1随从序列；(e)与SEQ ID NO:213、214和215中一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的RBG polyA信号序列；(f)具有SEQ ID NO:250和251中一个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)的序列的填充序列；以及(g)具有SEQID NO:212的序列的3’ITR序列。
在一些实施方案中，核酸分子被编码在与SEQ ID NO:256的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的表达盒中。在一些实施方案中，表达盒具有SEQ ID NO:256的核酸序列。
本公开内容的抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)可以是GluK2抑制剂。特别地，GluK2抑制剂可以是Grik2 mRNA表达抑制剂。抑制GluK2的表达也可抑制GluK5的水平(Ruiz et al,J Neuroscience 2005)。虽然不希望受任何理论的束缚，但本公开内容基于以下原则：单独充分去除GluK2应当去除所有GluK2/GluK5异聚体，因为单独的GluK5亚基不能形成同聚组装体。
根据所公开的方法和组合物，本文中所公开的抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)可具有15至50个核苷酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25、30、35、40、45或者多至50个核苷酸)的长度。例如，本文中所公开的抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)可以具有15个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有16个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有17个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有18个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有19个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有20个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有21个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有22个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有23个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有24个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有25个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有25至30个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有30至35个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有35至40个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有40至45个核苷酸的长度。在另一个实例中，抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)具有45至50个核苷酸的长度。
本公开内容的抑制性RNA物质包括与Grik2 mRNA序列(例如，SEQ ID NO:164至174中的任一者)或其变体的区域至少基本上互补或完全互补的序列，所述互补性足以在胞内条件下产生特异性结合。在一些实施方案中，抑制性RNA物质包括与Grik2 mRNA序列例如SEQ ID NO:164或其与SEQ ID NO:164具有至少85％序列同一性的变体的区域至少基本上互补或完全互补的序列。例如，本公开内容考虑了具有反义序列的抑制性RNA物质，所述反义序列与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的至少7个(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更多个)连续核苷酸互补。在一个具体实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的7个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的8个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的9个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的10个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的11个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的12个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的13个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的14个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的15个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的16个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的17个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的18个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的19个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的20个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的21个连续核苷酸互补的反义序列。在另一实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的22个连续核苷酸互补的反义序列。在又一个实例中，抑制性RNA物质具有与Grik2 mRNA的一个或更多个区域的核苷酸100％互补的反义序列。
本公开内容考虑了抑制性RNA物质，当其与Grik2 mRNA的一个或更多个区域(例如，SEQ ID NO:164至174中描述的Grik2 mRNA区域中的任一者)结合时，与Grik2 mRNA形成长度为7至22(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22)个核苷酸的双链体结构。在一些实施方案中，本公开内容的抑制性RNA物质可以结合SEQ ID NO:64的序列内Grik2 mRNA的区域，并与Grik2 mRNA形成长度为7至22(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22)个核苷酸的双链体结构。例如，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是7个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是8个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是9个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2mRNA之间的双链体结构的长度可以是10个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是11个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是12个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是13个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是14个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是15个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是16个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是17个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是18个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是19个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是20个核苷酸。在另一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是21个核苷酸。在又一个实例中，抑制性RNA物质与Grik2 mRNA之间的双链体结构的长度可以是10个核苷酸。
根据所公开的方法和组合物，由抑制性RNA物质(例如与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、和238至241中任一者的核酸序列具有至少85％(至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多(例如100％))的序列同一性的物质)形成的双链体结构，例如由与SEQ ID NO:258的核酸序列具有至少85％序列同一性的抑制性RNA物质和Grik2 mRNA的一个或更多个区域形成的双链体结构可包括至少一个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)错配。例如，双链体结构可包含1个错配。在另一个实例中，双链体结构包含2个错配。在另一个实例中，双链体结构包含3个错配。在另一个实例中，双链体结构包含4个错配。在另一个实例中，双链体结构包含5个错配。在另一个实例中，双链体结构包含6个错配。在另一个实例中，双链体结构包含7个错配。在另一个实例中，双链体结构包含8个错配。在另一个实例中，双链体结构包含9个错配。在另一个实例中，双链体结构包含10个错配。在另一个实例中，双链体结构包含11个错配。在另一个实例中，双链体结构包含12个错配。在另一个实例中，双链体结构包含13个错配。在另一个实例中，双链体结构包含14个错配。在又一个实例中，双链体结构包含15个错配。
因此，本公开内容的一个目的涉及靶向Grik2 mRNA的分离的、合成的或重组的抑制性核酸分子(例如，抑制性RNA物质)。本公开内容的抑制性RNA物质可以是任何合适的类型，包括RNA或DNA抑制性多核苷酸。因此，所公开的方法和组合物特征在于Grik2表达抑制剂，其是抑制性RNA物质(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)。抑制性RNA物质(包括反义RNA分子和反义DNA分子)可通过与Grik2 mRNA结合并阻止蛋白质翻译或提高mRNA降解来发挥作用以直接阻断Grik2 mRNA的翻译，从而降低GluK2蛋白质的水平和活性。例如，具有至少约19个碱基并且与编码GluK2的mRNA转录物序列的独特区域互补的抑制性RNA物质可例如通过常规技术(例如本文中所公开的技术)来合成，并通过例如静脉内注射或输注以及本文中描述的其他途径(例如直接注射至脑区域)来施用。用于使用反义技术特异性减轻序列已知的基因的基因表达的方法在本领域中是公知的(例如，参见美国专利No.6,566,135、6,566,131、6,365,354、6,410,323、6,107,091、6,046,321、和5,981,732，其各自通过引用整体并入本文)。
在一个具体实例中，本公开内容的Grik2抑制性RNA物质可以是短干扰RNA(siRNA)。可以通过以下来降低Grik2基因表达：使对象或细胞与小双链RNA(dsRNA)或编码其的载体接触，从而导致产生能够通过以序列特异性方式(例如通过RNA干扰途径)降解mRNA而特异性抑制Grik2表达的小双链RNA。对于序列已知的基因，用于选择适当的dsRNA或dsRNA编码载体的方法是本领域已知的(例如，参见Tuschl,T.et al.
(1999)；Elbashir,S.M.et al.(2001)；Hannon,GJ.(2002)；McManus,MT.et al.(2002)；Brummelkamp,TR.et al.(2002)；美国专利No.
6,573,099和6,506,559；以及国际专利公开No.WO 01/36646、WO 99/32619和WO01/68836，其各自通过引用整体并入本文)。
本公开内容的Grik2抑制性RNA物质还可以是短发夹RNA(shRNA)。shRNA是产生紧密发夹环的RNA序列，其可用于通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA通常使用引入到靶细胞中的载体来表达，其中载体常常利用普遍存在的U6启动子以确保shRNA组成型表达。该载体通常传递给子细胞，使得基因沉默在细胞分裂后得以维持。shRNA发夹结构被细胞机器切割成siRNA，然后所述siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。该复合物结合并切割与其所结合的siRNA序列相匹配的mRNA。
另外，本公开内容的Grik2表达抑制剂可以是微RNA(miRNA)。miRNA在本领域中具有一般含义，并且是指例如长度通常为21至22个核苷酸(尽管已经报道了19个和多至23个核苷酸的长度)的微RNA分子，并且可用于抑制靶标mRNA的翻译。每个miRNA由较长的前体RNA分子(“前体miRNA”)加工。前体miRNA由非蛋白质编码基因转录。前体miRNA具有两个使其形成茎环或折回样结构的互补区域，所述结构在动物中被称为Dicer的核糖核酸酶III样核酸酶切割。经加工的miRNA通常是包含“种子序列”(通常为6至8个核苷酸)的茎的一部分，所述种子序列与靶mRNA的区域完全或基本互补。经加工的miRNA(也称为“成熟miRNA”)成为大复合物的一部分，以下调特定靶基因(例如，减少特定靶基因的翻译或降解特定靶基因的mRNA)。
此外，本公开内容的GluK2抑制剂可以是适应miRNA的shRNA(shmiRNA)。shmiRNA物质是指将反义序列并入含有微RNA侧翼和环序列的微RNA支架(例如，E-miR-30支架)的-5p或-3p臂内的嵌合分子。与shRNA相比，shmiRNA通常具有基于微RNA来源的序列的更长的茎环结构，其中-5p和-3p臂表现出完全或显著的互补性(例如，错配、G:U摆动)。由于其较长的序列和加工要求，shmiRNA通常由Pol II启动子表达。与基于shRNA的物质相比，这些构建体还显示出表现出较低的毒性。
多种miRNA可用于敲低Grik2 mRNA表达(以及随后敲低其基因产物，GluK2)。miRNA可以与不同的靶转录物或单个靶转录物的不同结合位点互补。多顺反子或多基因转录物也可用于增强靶基因敲低的效率。编码相同miRNA或不同miRNA的多个基因可以在单个转录物中一起被调节，或者作为在单个载体盒中的单独转录物被调节。本公开内容的miRNA可被包装到载体中，所述载体例如如病毒载体，包括但不限于重组腺相关病毒(rAAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和基于逆转录转座子的载体系统。
与Grik2 mRNA的有义靶序列互补(例如基本上或完全互补)的抑制性RNA通常是由以下编码的：DNA序列，其用于产生任何前述抑制剂(例如siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)。可以将编码目的双链RNA的DNA并入到基因盒(例如，其中DNA的转录受启动子控制的表达盒)中。
改进指导序列的RISC加载
RNA干扰中的一个步骤是将微RNA指导链组装成介导靶mRNA切割的RNA诱导的沉默复合物(RISC)蛋白质复合物。将微RNA产生为包含通过互补碱基配对与随从链杂交的指导链的双链双链体。将指导链组装成RISC复合物通常伴随着随从链的降解。RISC组装有利于具有5'末端的微RNA链，所述具有5'末端的微RNA链更容易磨损或从双链体中释放。本文中描述的构建体通过RISC通过使指导链5'末端处的碱基配对不稳定(例如，通过在指导链5'末端处或附近引入U-A对或U-G摆动对)并在随从链的5'末端处紧固碱基配对(例如，通过在随从链的5'末端处或其附近引入G-C对)被设计为有利于指导选择和加载而不利于随从选择。该策略是可实现的，因为如果指导链与靶mRNA之间的错配发生在指导链的第一核苷酸或靠近3'端(例如，在最后四个核苷酸内)，则指导链与靶mRNA之间的错配是可以被良好容忍的。这种策略不仅改善了通过指导链的在靶敲低，而且还降低了RISC蛋白复合物对随从链产生或保留的脱靶效应。
因此，本文中所述的抗Grik2反义分子(例如，微RNA、shRNA、siRNA或shmiRNA)包括一种或更多种修饰，所述修饰改善指导链的RISC加载或保留并降低随从链的RISC加载或保留、提高细胞内指导链与随从链的比率，以及提高靶Grik2 mRNA的敲低水平。
在本文中所述的数种构建体中提高了指导链5'末端处或附近的碱基配对不稳定性，以改善指导链的RISC加载或保留。例如，碱基配对不稳定性通过在数个构建体的指导链的5'末端处或附近引入U-A对或U-G摆动对来实现。
通过在随从链的5'末端引入碱基配对不稳定性，在本文中描述的数种构建体中降低了随从链的RISC加载或保留。碱基配对不稳定性是通过在随从链5'末端或附近添加C-G对而引入。
本公开内容的数种构建体还被设计为通过在指导链中引入5'末端尿嘧啶来增强指导链的RISC加载或保留。该5'端核苷酸不参与与靶mRNA(例如Grik2 mRNA)的杂交，并且通常锚定在Argonaute RISC催化组分2(Ago2)蛋白的磷酸盐结合袋中。
对于数种所公开的构建体，通过在指导链的种子区域(对应于指导链的第2至7个核苷酸；g2至g7)中引入一个或更多个错配(例如，1、2、3、4、5、6、7或更多个错配)降低了随从链的RISC加载或保留。该策略用于促进RISC加载期间随从链的展开和卸载(unloading)。虽然种子区域(指导核苷酸2-8，g2至g8)和指导链中间区域的广泛互补性对于Ago2介导的mRNA切割至关重要，但不需要在3'末端处的碱基配对。事实上，指导链的g18、g19、g20、g21位置处与靶mRNA的错配被确定会减弱指导链从Ago2中的释放，这是由靶mRNA介导的卸载活性。
对于本文中所公开的数种构建体，通过将U-G摆动对替换为C-G对来紧固茎区和环区连接处的碱基配对，改进了从抗Grik2构建体的茎环结构中的环区域的Dicer切割。本公开内容的Grik2 mRNA靶向构建体利用前述修饰来促进指导链与随从链产生的比率的提高并改善Grik2的沉默以用于治疗癫痫发作病症(例如，TLE)。
因此，本文中所述的抑制性RNA分子可包括茎环序列，所述茎环序列包含从以下中合理设计的指导链和随从链序列：嵌入E-miR-30微RNA支架中的抗Grik2序列GI(SEQ IDNO:16)和与其互补的序列(参见例如表2(例如，SEQ ID NO:1至15、226至229、和238至241))，或与其具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如100％))的序列同一性的其变体。
表2：含有反义序列GI或其变体的Grik2靶向构建体
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表2序列图解：
*如表2中所使用的术语“反义序列”是指反义序列GI或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
单下划线和 茎环序列；
带单下划线的大写斜体字符：指导链；
单下划线小写字符：E-miR-30环序列；
随从链；
大写粗体字符：经取代的核苷酸。
因此，本公开内容的Grik2靶向反义构建体可以包括下表3中所述的指导链(SEQID NO:16至30、230至233、和242至245)和随从链(SEQ ID NO：31至45、234至237、和246至249)对：
表3：从E-miR-30支架中的GI序列合理设计的指导链和随从链对
表3序列图解：
*如表3中所使用的术语“反义序列”是指反义序列GI或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
大写粗体字符：相对于构建体A的经修饰的指导链或随从链序列中的核苷酸。
本文中还公开了可包括茎环序列的抑制性RNA分子，所述茎环序列包含从以下中合理设计的指导链和随从链序列：嵌入E-miR-124-3微RNA支架中的抗Grik2序列G9(SEQ IDNO:63)和与其互补的序列(参见例如表4(例如，SEQ ID NO:46至62))，或与其具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如100％))的序列同一性的其变体。
表4：含有反义序列G9或其变体的Grik2靶向构建体
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表4序列图解：
*如表4中所使用的术语“反义序列”是指反义序列G9或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
单下划线和 茎环序列；
带单下划线的大写斜体字符：指导链；
单下划线小写字符：E-miR-124-3环序列；
随从链；
大写粗体字符：经取代的核苷酸。
因此，本公开内容的Grik2靶向反义构建体可以包括下表5中所述的指导链(SEQID NO:63至79)和随从链(SEQ ID NO:80至96)对：
表5：从miR-124支架中的G9序列合理设计的指导链和随从链对
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表5序列图解：
*如表5中所使用的术语“反义序列”是指反义序列G9或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
大写粗体字符：相对于构建体B的经修饰的指导链或随从链序列中的核苷酸。
本文中所述的抑制性RNA分子可以包括茎环序列，所述茎环序列包含从以下中合理设计的指导链和随从链序列：嵌入E-miR-124-3微RNA支架中的抗Grik2序列MW(SEQ IDNO:109)和与其互补的序列(参见例如表6(例如，SEQ ID NO:97至108))，或与其具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如100％))的序列同一性的其变体。
表6：含有反义序列MW或其变体的Grik2靶向构建体
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表6序列图解：
*如表6中所使用的术语“反义序列”是指反义序列MW或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
单下划线和 茎环序列；
带单下划线的大写斜体字符：指导链；
单下划线小写字符：E-miR-124-3环序列；
随从链；
大写粗体字符：经取代的核苷酸。
因此，本公开内容的Grik2靶向反义构建体可以包括下表7中所述的指导链(SEQID NO:109至120)和随从链(SEQ ID NO:121至132)对：
表7：从miR-124支架中的MW序列合理设计的指导链和随从链对
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表7序列图解：
*如表7中所使用的术语“反义序列”是指反义序列MW或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
大写粗体字符：相对于构建体C的经修饰的指导链或随从链序列中的核苷酸。
本文中所述的抑制性RNA分子可以包括茎环序列，所述茎环序列包含从以下中合理设计的指导链和随从链序列：嵌入E-miR-218微RNA支架中的抗Grik2序列MW(SEQ ID NO:109)和与其互补的序列(参见例如表8(例如，SEQ ID NO:133至138))，或与其具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如100％))的序列同一性的其变体。
表8：含有反义序列MW或其变体的Grik2靶向构建体
表8序列图解：
*如表8中所使用的术语“反义序列”是指反义序列MW或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
单下划线和 茎环序列；
带单下划线的大写斜体字符：指导链；
单下划线小写字符：E-miR-218环序列；
随从链；
大写粗体字符：经取代的核苷酸。
因此，本公开内容的Grik2靶向反义构建体可以包括下表9中所述的指导链(SEQID NO:139至144)和随从链(SEQ ID NO:145至146)对：
表9：从miR-218支架中的MW序列合理设计的指导链和随从链对
表9序列图解：
*如表9中所使用的术语“反义序列”是指反义序列MW或其具有1至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)修饰(例如，替换、缺失、插入或错配)的变体。
大写粗体字符：相对于构建体D的经修饰的指导链或随从链序列中的核苷酸。
前述序列表示为可并入到本公开内容的载体中的DNA(即cDNA)序列。这些序列还可以表示为从细胞内的载体中合成的相应RNA序列。本领域技术人员应当理解，除了用胸苷替换尿苷外，cDNA序列等同于mRNA序列，并且可用于本文中的相同目的，即产生用于抑制Grik2 mRNA表达的多核苷酸。在DNA载体(例如，AAV)的情况下，含有反义核酸的多核苷酸是DNA序列。在RNA载体的情况下，转基因盒并入本文中所述的反义DNA序列的RNA等价物中。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:1的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:2的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:2的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:3的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:3的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:4的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:4的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:5的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:5的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:6的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:6的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:7的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:7的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:8的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:8的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:9的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:9的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:10的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:10的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:10的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:11的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:11的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:11的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:12的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:12的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:12的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:13的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:13的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:14的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:14的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:15的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:15的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:226的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:226的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:226的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:226的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:227的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:227的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:227的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:227的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:228的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:228的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:228的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:228的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:229的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:229的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:229的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:229的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:238的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:238的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:238的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:238的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:239的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:239的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:239的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:239的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:240的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:240的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:240的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:240的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:241的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:241的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:241的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:241的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:46的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:46的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:46的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:46的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:47的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:47的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:47的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:47的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:48的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:48的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:49的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:49的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:49的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:49的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:50的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:50的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:50的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:50的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:51的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:51的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:51的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:51的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:52的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:52的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:52的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:52的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:53的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:53的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:53的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:53的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:54的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:54的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:55的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:55的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:55的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:55的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:56的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:56的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:56的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:56的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:57的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:57的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:57的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:57的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:58的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:58的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:58的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:58的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:59的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:59的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:59的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:59的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:60的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:60的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:60的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:60的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:61的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:61的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:61的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:61的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:62的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:62的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:62的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:62的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:97的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:97的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:97的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:97的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:98的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:98的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:98的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:98的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:99的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:99的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQ IDNO:99的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:99的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:100的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:100的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:100的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:100的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:101的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:101的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:101的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:101的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:102的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:102的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:102的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:102的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:103的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:103的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:103的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:103的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:104的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:104的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:104的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:104的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:105的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:105的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:105的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:105的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:106的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:106的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:106的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:106的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:107的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:107的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:107的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:107的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:108的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:108的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:108的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:108的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:133的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:133的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:133的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:133的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:134的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:134的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:133的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:134的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:135的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:135的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:135的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:135的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:136的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:136的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:136的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:136的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:137的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:137的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:137的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:137的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:138的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:138的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:138的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:138的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:258的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:258的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:258的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:258的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:259的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:259的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:259的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:259的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:260的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:260的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:260的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可以具有SEQ ID NO:260的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:261的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:261的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:261的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:261的核酸序列。
本公开内容的抑制性RNA序列可与SEQ ID NO:256的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。例如，抑制性RNA可与SEQ ID NO:256的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在另一个实例中，抑制性RNA可与SEQID NO:256的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性。在一个另外的实例中，抑制性RNA可具有SEQ ID NO:256的核酸序列。
具有摆动碱基对的抑制性多核苷酸
本公开内容的特征还在于具有一个或更多个摆动碱基对的抑制性RNA物质。四个主要的摆动碱基对是鸟嘌呤-尿嘧啶(G-U)、次黄嘌呤-尿嘧啶(I-U)、次黄嘌呤-腺嘌呤(I-A)和次黄嘌呤-胞嘧啶(I-C)，其中次黄嘌呤代表核苷肌苷。GU摆动碱基对已显示出与G-C、A-T和A-U的相似的热力学稳定性(Saxena et al,2003,J Biol Chem,278(45):44312-9)。
因此，本公开内容提供了抑制性RNA物质，其具有与SEQ ID NO:164至174中任一者的靶区域的补体具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性(例如，抑制性RNA可与Grik2基因序列的反义链具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性)的核苷酸序列。特别地，本公开内容的抑制性RNA物质可具有与相应比对的人Grik2 mRNA转录物(例如，SEQ ID NO:164至174中的任一者)不互补的1、2或3个核苷酸。因此，本公开内容的抑制性RNA物质可具有与SEQ ID NO:164至174中任一者的靶区域的补体具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))、至少86％(例如，至少86％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))、至少87％(例如，至少87％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))、至少88％(例如，至少88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))、至少89％(例如，至少89％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))或者至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的同一性的核苷酸序列。与比对的Grik2 mRNA序列的互补序列不是100％相同的核苷酸可能是摆动核苷酸。
针对Grik2转录物上特定区域设计的由反义RNA介导的脱靶效应的可能性可以使用任意数量的公开可用算法来测量。例如，在线工具siSPOTR(“siRNA序列非靶向降低的可能性”，其可在world-wide-web.sispotr.icts.uiowa.edu/sispotr/index.html_上获得，可被使用)。
本文中所公开的抑制性RNA物质靶向编码GluK2蛋白的mRNA(例如，包括SEQ IDNO:151至163中任一者的GluK2蛋白质，或至少包括SEQ ID NO:151的第1至509位氨基酸的GluK2蛋白质)。编码GluK2蛋白的mRNA可包括编码多肽的多核苷酸，所述多肽相对于具有SEQ ID NO:151至163中任一者的序列的多肽含有一或更多个氨基酸替换，例如一个或更多个保守氨基酸替换(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸替换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个保守氨基酸替换)。
Grik2蛋白和编码其的多核苷酸
本文中所公开的Grik2抑制性RNA物质可通过使用例如生物信息学工具通过使用Grik2 mRNA的序列作为起点来设计。Grik2 mRNA序列可存在于NCBI基因ID NO:2898中。在另一个实例中，编码SEQ ID NO:151的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO:151的第1至509个连续氨基酸的多核苷酸序列、或编码以下中任一者的氨基酸序列的多核苷酸序列：SEQ IDNO:151(UniProtKB Q13002-1)、SEQ ID NO:152(UniProtKB Q13002-2)、SEQ ID NO:153(UniProtKB Q13002-3)、SEQ ID NO:154(UniProtKB Q13002-4)、SEQ ID NO:155(UniProtKB Q13002-5)、SEQ ID NO:156(UniProtKB Q13002-6)、SEQ ID NO:157(UniProtKB Q13002-7)、SEQ ID NO:158(NCBI登录No.:NP_001104738.2)、SEQ ID NO:159(NCBI登录No.:NP_034479.3)、SEQ ID NO:160(NCBI登录No.:NP_034479.3)、SEQ ID NO:161(NCBI登录No.:XP_014992481.1)、SEQ ID NO:162(NCBI登录No.:XP_014992483.1)和SEQ ID NO:163(NCBI登录No.:NP_062182.1，可用作设计靶向编码GluK2蛋白的mRNA的核酸的基础。编码GluK2受体的多核苷酸序列可选自SEQ ID NO:164至174中的任一者。
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:151的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:151的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-1；GRIK2_HUMAN谷氨酸受体离子型，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:151)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:152的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-2；谷氨酸受体离子型的GRIK2_HUMAN同种型2，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFF KKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKESSIWLVPPYHPDTV
(SEQ ID NO:152)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:153的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-3；谷氨酸受体离子型的GRIK2_HUMAN同种型3，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARF
(SEQ ID NO:153)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:154的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-4；谷氨酸受体离子型的GRIK2_HUMAN同种型4，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQ LSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:154)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:155的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-5；谷氨酸受体离子型的GRIK2_HUMAN同种型5，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDAN GQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRAKTKLPQDYVFLPILESVSISTVLSSSPSSSSLSSCS
(SEQ ID NO:155)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:156的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-6；谷氨酸受体离子型的GRIK2_HUMAN同种型6，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKESSIWLVPPYHPDTV
(SEQ ID NO:156)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:157的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(UniProt Q13002-7；谷氨酸受体离子型的GRIK2_HUMAN同种型7，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRAKTKLPQDYVFLPILESVSISTVLSSSPSSSSLSSCS
(SEQ ID NO:157)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:158的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:158的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(NP_001104738.2；谷氨酸受体离子型的GRIK2_MOUSE同种型1前体，红藻氨酸2)：
MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSL QCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPSSGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:158)
GluK2多肽可以具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:159的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(NP_034479.3；谷氨酸受体离子型GRIK2_MOUSE的同种型2前体，红藻氨酸2)：
MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL
LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPSSGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKESSIWLVPPYHPDTV
(SEQ ID NO:159)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:160的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(NP_001345795.2；谷氨酸受体离子型的GRIK2_MOUSE同种型1前体，红藻氨酸2)：
MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL
LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPSSGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:160)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:161的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(XP_014992481.1；GRIK2_RHESUSMACAQUE同种型X1，谷氨酸受体离子型，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL
LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:161)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:162的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:162的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(XP_014992483.1；GRIK2_RHESUSMACAQUE同种型X1，谷氨酸受体离子型，红藻氨酸2)：
MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL
LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:162)
GluK2多肽可具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列或者可以是其变体,所述变体与SEQ ID NO:163的氨基酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性，其如下所示(NP_062182.1；谷氨酸受体离子型的GRIK2_RAT前体，红藻氨酸2)：
MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL
LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYVLLACLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMRQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA
(SEQ ID NO:163)
Grik2 mRNA可以是含有5'和3'非翻译区(UTR)并具有SEQ ID NO:164的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:164的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_021956.1:4592智人谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体1，mRNA)，如表10所示。
Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:165的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQID NO:165的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_021956.4:294-3020智人谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体1，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:166的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:166的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_175768.3:294-2903智人谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体2，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:167的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:167的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_001166247.1:294-2972智人谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体3，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:168的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:168的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_001111268.2小家鼠谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体4，mRNA)，如下文所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:169的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:169的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_010349.4小家鼠谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体5，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:170的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:170的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_001358866小家鼠谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体6，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:171的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:171的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq XM_015136995.2猕猴谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体7，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:172的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:172的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq XM_015136997.2猕猴谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，转录变体X1，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA可以是具有SEQ ID NO:173的核酸序列的多核苷酸或者可以是与SEQ ID NO:173的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体(RefSeq NM_019309.2褐家鼠谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基2(GRIK2)，mRNA)，如表10所示。
作为补充或替代，Grik2 mRNA包括对应于成熟GluK2肽编码序列并具有SEQ IDNO:174的核酸序列或者具有与SEQ ID NO:174的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的多核苷酸，如表10所示。
根据所公开的方法和组合物，Grik2 mRNA可包括5'UTR，例如由具有SEQ ID NO:175的核酸序列或者具有与SEQ ID NO:175的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的多核苷酸编码的5'UTR，如表10所示。
Grik2 mRNA还可包括3'UTR，例如由具有SEQ ID NO:176的核酸序列或者具有与SEQ ID NO:176的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的多核苷酸编码的3'UTR，如表10所示。
另外，Grik2 mRNA可包括编码Grik2信号肽序列的多核苷酸，例如信号肽序列由SEQ ID NO:177的核酸序列编码或者由与SEQ ID NO:177的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体编码，如表10所示。
另外，本公开内容的抑制性多核苷酸能够结合在Grik2转录物(对应于SEQ ID NO:177至193)的第1至16位外显子中的任一者内，其描述于下表10中。
表10：编码靶Grik2 mRNA序列的cDNA序列
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核酸载体
本文中所公开的核酸物质的有效胞内浓度可以通过编码该物质的多核苷酸的稳定表达(例如，通过整合到哺乳动物细胞的核或线粒体基因组中)来实现。核酸是靶向Grik2mRNA的抑制性RNA(例如，本文中所公开的抑制性RNA物质)。为了将这样的外源核酸引入到哺乳动物细胞中，可以将物质的多核苷酸序列并入到载体中。可以通过多种方法，包括转化、转染、直接摄取、弹轰击以及通过将载体封装在脂质体中将载体引入到细胞中。转染或转化细胞的合适方法的一些实例是磷酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、感染、脂转染和直接摄取。这样的方法在更详细描述于例如：Green et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第四版(Cold Spring Harbor University Press,New York(2014))；和Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,New York(2015))中，其各自的公开内容均通过引用并入本文。
本文中所公开的物质还可以通过将含有编码这样的物质的多核苷酸的载体靶向细胞膜磷脂而引入到哺乳动物细胞中。例如，通过将载体分子与VSV-G蛋白(对所有细胞膜磷脂都具有亲和力的病毒蛋白)连接可以将载体靶向细胞膜胞外表面上的磷脂。这样，可以使用本领域的习用和常规方法来产生构建体。
除实现高的转录和翻译速率之外，还可以通过将含有基因的多核苷酸整合到哺乳动物细胞的核基因组中来实现外源多核苷酸在哺乳动物细胞中的稳定表达。已经开发了多种用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送并整合到哺乳动物细胞的核DNA中的载体。表达载体的一些实例公开于例如WO 1994/011026中；其通过引用并入本文。用于本文中所述的组合物和方法的表达载体包含编码Grik2靶向抑制性RNA物质的多核苷酸序列，以及例如用于表达这些物质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外的序列元件。可使用的某些载体包括含有调节序列(例如指导基因转录的启动子和增强子区)的质粒。其他有用的载体含有提高这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件包括，例如，5'UTR区和3'UTR区、IRES和聚腺苷酸化信号序列位点，以指导表达载体上携带的基因的有效转录。适于与本文中所述的组合物和方法一起使用的表达载体还可以含有编码用于选择含有这样的载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适的标志物的实例是编码对抗生素(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)的抗性的基因。
调节序列
本文中所公开的抑制性RNA物质可以以足够高的水平表达以引发治疗益处。因此，多核苷酸表达可以由能够驱动所公开的抑制性RNA物质的稳健表达的启动子序列来介导。根据本文中所公开的方法和组合物，启动子可以是异源启动子。如本文中所使用的，术语“异源启动子”是指在自然界中未发现的与给定编码序列有效地连接的启动子。有用的异源控制序列通常包括来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。
可以使用异源启动子和其他控制元件(例如CNS特异性和诱导型启动子、增强子等)二者。启动子可以完全来源于内源基因(例如，Grik2基因)或者可以由来源于不同的天然存在的启动子的不同元件构成。或者，启动子可包括合成的多核苷酸序列。不同的启动子将指导基因在不同的组织或细胞类型中表达、或在不同的发育阶段表达、或响应于不同的环境条件或者响应于药物或转录辅因子的存在或不存在而表达。普遍存在的细胞类型特异性、组织特异性、发育阶段特异性和条件启动子，例如药物响应启动子(例如四环素响应启动子)是本领域公知的。
在哺乳动物系统中，存在三种启动子，并且其是构建表达载体的候选启动子：(i)控制大核糖体RNA转录的Pol I启动子；(ii)控制mRNA(其被翻译成蛋白质)、核内小RNA(snRNA)和内源微RNA(例如，来自前mRNA的内含子)转录的Pol II启动子；(iii)和独特地转录小非编码RNA的Pol III启动子。在设计用于体内表达RNA的构建体时，每种都具有要考虑的优点和限制。例如，Pol III启动子可用于在体内从DNA模板合成抑制性RNA物质(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)。为了更好地控制组织特异性表达，可以使用Pol II启动子(例如，用于miRNA的转录)。当使用Pol II启动子时，可以省略翻译起始信号，使得RNA充当为siRNA、shRNA或miRNA并且在体内不翻译成肽。
适合与本文中所述的组合物和方法一起使用的多核苷酸还包括编码在哺乳动物调节序列(例如，如启动子序列和任选的增强子序列)控制下的靶向Grik2 mRNA的抑制性RNA物质的多核苷酸。可用于在哺乳动物细胞中表达所公开的抑制性RNA物质的示例性启动子包括细胞类型特异性启动子。例如，可以使用神经元特异性启动子，例如图人突触蛋白1(hSyn)启动子或Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子来赋予Grik2抑制性RNA物质的神经元特异性表达。hSyn和CaMKII启动子的变体先前已描述于Hioki et al.GeneTherapy 14:872-82(2007)和Sauerwald et al.J.
Biol.Chem.265(25):14932-7(1990)中，由于其涉及特定的hSyn和CaMKII启动子序列，因此其公开内容通过引用并入本文。也可以替代地使用含有巨细胞病毒增强子(例如CAG或CBA)、U6、H1或7SK启动子的组成型启动子。这些启动子的序列是本领域已知的(这些启动子的序列也公开于例如WO 2022/011262中，其通过引用并入本文)。
在一个具体实例中，本公开内容的表达载体包括SYN启动子(例如，如人SYN启动子(hSyn)，例如SEQ ID NO:194至198中的任一者或者与SEQ ID NO:194至198中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体)。在另一个实例中，本公开内容的表达载体包括CAMKII启动子(例如，SEQ ID NO:199至204中的任一者或者与SEQ ID NO:99至204中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体)。
下表11中提供了适合与表达载体(例如，质粒或病毒载体，例如如AAV或慢病毒载体)一起使用的示例性启动子序列。
表11：示例性神经元特异性启动子序列
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在特定实例中，本公开内容的病毒载体并入神经元特异性启动子序列。在一个具体实例中，神经元特异性启动子是人Syn(hSyn)启动子，例如具有SEQ ID NO:194至198中任一者的核酸序列或者具有与SEQ ID NO:194至198中任一者的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的人Syn启动子。
在另一个实例中，神经元特异性启动子是CaMKII启动子序列，例如SEQ ID NO:199至204中任一者的CaMKII启动子序列或者与SEQ ID NO:199至204中任一者的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的CaMKII启动子序列。
另外的CaMKII启动子可包括描述于以下中的人αCaMKII启动子序列：Wang et al.(Mol.Biol.Rep.35(1):37-44,2007)，由于其涉及CaMKII启动子序列，因此其公开内容整体并入本文。
一旦编码所公开的抑制性RNA物质的多核苷酸已并入到哺乳动物细胞的核DNA中，则可以通过本领域已知的方法来诱导该多核苷酸的转录。例如，可以通过将哺乳动物细胞暴露于外部化学试剂(例如调节转录因子和/或RNA聚合酶与哺乳动物启动子的结合并因此调节基因表达的物质)来诱导表达。化学试剂可用于促进RNA聚合酶和/或转录因子与哺乳动物启动子的结合，例如通过除去已结合启动子的阻遏蛋白。或者，化学试剂可用于增强哺乳动物启动子对RNA聚合酶和/或转录因子的亲和力，使得位于启动子下游的基因的转录速率在存在化学试剂的情况下提高。通过以上机制增强多核苷酸转录的化学试剂的一些实例是四环素和多西环素。这些试剂是可商购获得的(Life Technologies，Carlsbad，CA)，并且可以根据既定方案施用至哺乳动物细胞中以促进基因表达。
可包含在用于本文中所述的组合物和方法中的多核苷酸中的其他DNA序列元件是增强子序列。增强子代表另一类调节元件，其诱导含有目的基因的多核苷酸中的构象变化，使得DNA采用有利于转录因子和RNA聚合酶在转录起始位点处结合的三维方向。因此，用于本文中所述的组合物和方法的多核苷酸包括编码Grik2靶向抑制性RNA物质的多核苷酸，并且另外包括哺乳动物增强子序列。现在已知来自哺乳动物基因的许多增强子序列，并且一些实例是来自编码哺乳动物球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的基因的增强子。用于本文中所述的组合物和方法中的增强子还包括来源于能够感染真核细胞的病毒的遗传物质的增强子。一些实例是在复制起点晚期侧的SV40增强子(第100至270个bp)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。Yaniv etal.,Nature 297:17(1982)中公开了诱导真核基因转录激活的另外的增强子序列。可以将增强子剪接到含有编码本公开内容的反义构建体的多核苷酸的载体中，例如，在该基因的5'或3'位处。在特定方向上，增强子位于启动子的5'侧处，所述启动子继而又位于相对于编码本公开内容的抑制性RNA物质的多核苷酸的5'处。增强子序列的一些非限制性实例在下表12中提供。
可包含在用于本文中所述的组合物和方法中的多核苷酸中的另外的调节元件是内含子序列。内含子序列是存在于前mRNA中的非蛋白质编码RNA序列，内含子序列在RNA剪接期间被去除以产生成熟的mRNA产物。内含子序列对于基因表达的调节是重要的，因为它们可以被进一步加工以产生其他非编码RNA分子。选择性剪接、无义介导的衰变和mRNA输出是已被证明受内含子序列调节的生物过程。内含子序列还可通过内含子介导的增强来促进转基因的表达。下表12中提供了内含子序列的一些非限制性实例。
可以与本公开内容的载体结合使用的另外的调节元件包括反向末端重复(ITR)序列。ITR序列可存在于例如AAV基因组的5'末端和3'末端，其各自通常包含约145个碱基对。一旦AAV载体并入到细胞中，AAV ITR序列通过促进互补链的合成而对于AAV基因组倍增特别重要。此外，ITR已被证明对于将AAV基因组整合到宿主细胞基因组中以及对于AAV基因组衣壳化至关重要。下表12中提供了ITR序列的一些非限制性实例。
适合与并入到本公开内容的载体中的另外的调节元件包括聚腺苷酸化序列(即，polyA序列)。PolyA序列是含有一段腺嘌呤碱基的RNA尾部。这些序列被附加至RNA分子的3'末端以产生成熟的mRNA转录物。与mRNA加工和运输相关的数种生物过程受PolyA序列调节，包括核输出、翻译和稳定性。在哺乳动物细胞中，polyA尾部的缩短导致mRNA降解的可能性提高。下表12中提供了polyA序列的一些非限制性实例。
表12：示例性调节序列
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在另一些实例中，本公开内容的病毒载体并入一种或更多种能够促进本公开内容的反义构建体表达的调节序列元件。在一个实例中，调节序列元件是内含子序列。例如，适合于包含在本公开内容的载体中的内含子序列可以是嵌合内含子，例如具有SEQ ID NO:205的核酸序列的嵌合内含子或者具有与SEQ ID NO:205的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的嵌合内含子。
在另一个实例中，内含子序列是免疫球蛋白重链可变4(VH4)内含子，例如具有SEQID NO:206的核酸序列的VH4序列或者具有与SEQ ID NO:206的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的VH4序列。
在一些实施方案中，从5'至3'，载体包括：(a)第一启动子序列；(b)内含子序列；(c)包含茎环序列的多核苷酸；(d)任选地，第二启动子序列；和(e)任选地，包含茎环序列的多核苷酸。
在另一个实例中，调节序列元件是增强子序列。例如，增强子序列可以是CMV增强子，例如具有SEQ ID NO:207的核酸序列的CMV增强子或者具有与SEQ ID NO:207的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的CMV增强子。
在一些实施方案中，从5'至3'，载体包括：(a)增强子序列；(b)第一启动子序列；(c)内含子序列；(d)包含茎环序列的多核苷酸；(e)任选地，第二启动子序列；和(f)任选地，包含茎环序列的第二多核苷酸。
在另一个实例中，调节序列元件是ITR序列，例如AAV ITR序列。例如，ITR序列可以是AAV 5'ITR序列，例如具有SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209的核酸序列的AAV 5'ITR序列或者具有与SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的AAV 5'ITR序列。
在另一个实例中，ITR序列是AAV 3'ITR序列，例如具有SEQ ID NO:210至212中任一者的核酸序列的AAV 3'ITR序列或者具有与SEQ ID NO:210至212中任一者的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的AAV 3'ITR序列。
在一些实施方案中，从5'至3'，载体包括：(a)5'ITR序列；(b)任选地，增强子序列；(c)第一启动子序列；(d)任选地，内含子序列；(e)包含茎环序列的多核苷酸；(f)任选地，第二启动子序列；(g)任选地，包含茎环序列的多核苷酸；和(h)3'ITR序列。
在另一个实例中，调节序列元件是聚腺苷酸化信号序列(即，polyA尾)。例如，适合与本文中所公开的载体一起使用的聚腺苷酸化信号序列包括兔β-珠蛋白(RBG)聚腺苷酸化信号序列，例如具有SEQ ID NO:213至215中任一者的核酸序列的RBG聚腺苷酸化信号序列或者具有与SEQ ID NO:213至215中任一者的核酸序列具有至少70％(例如，至少71％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的RBG聚腺苷酸化信号序列。可以与所公开的组合物和方法结合使用的另一种聚腺苷酸化信号序列是牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号序列，例如SEQID NO:216或者与SEQ ID NO:216的核酸序列具有至少70％(例如，至少71％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的序列同一性的其变体的BGH聚腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，从5'至3'，载体包括：(a)5'ITR序列；(b)任选地，增强子序列；(c)第一启动子序列；(d)任选地，内含子序列；(e)包含茎环序列的多核苷酸；(f)任选地，第二启动子序列；(g)任选地，包含茎环序列的多核苷酸；(h)聚腺苷酸化信号序列，例如RBG聚腺苷酸化信号序列；和(i)3'ITR序列。
病毒载体
病毒基因组提供了丰富的载体来源，可用于将外源多核苷酸有效递送到哺乳动物细胞中。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为这样的基因组中含有的多核苷酸通常通过广义或专门的转导并入到哺乳动物细胞的核基因组中。这些过程是天然病毒复制周期的一部分，并且不需要添加蛋白或试剂来诱导基因整合。病毒载体的一些实例是细小病毒(例如腺相关病毒(AAV))、逆转录病毒(例如逆转录病毒科病毒载体)、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、冠状病毒、负链RNA病毒(例如正粘病毒(例如，流感病毒))、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲病毒)、以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯性疱疹病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒))以及痘病毒(例如，牛痘、经修饰的痘苗病毒安卡拉(Modified Vaccinia Ankara，MVA)、鸡痘和金丝雀痘)。例如，其他病毒包括例如诺瓦克病毒、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、人乳头瘤病毒、人泡沫病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的一些实例是禽白血病-肉瘤、禽C型病毒、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、肿瘤逆转录病毒(oncoretrovirus)、HTLV-BLV组、慢病毒、甲型逆转录病毒、丙型逆转录病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:Theviruses and their replication,Virology,第三版(Lippincott-Raven,Philadelphia,(1996)))。另一些实例是鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿类白血病病毒、梅-帕猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴肉瘤病毒、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)和慢病毒。载体的另一些实例描述于例如McVeyet al.,(美国专利No.5,801,030)中，其教导通过引用并入本文。
AAV载体
本文中描述的组合物的核酸可以并入AAV载体和/或病毒颗粒中，以促进它们引入到细胞中，例如，结合本文中公开的方法。AAV载体可用于中枢神经系统，并且合适的启动子和血清型在例如Pignataroet al.,J Neural Transm 125(3):575-89(2017)中讨论，其公开内容通过引用并入本文中，因为它涉及用于CNS基因治疗的启动子和AAV血清型。可用于本文中所述的组合物和方法的rAAV载体是重组核酸构建体，其包括(1)待表达的异源序列(例如，编码Grik2 mRNA靶向抑制性RNA物质的多核苷酸)和(2)促进异源基因的表达和整合的病毒序列。病毒序列可包括以顺式方式将DNA复制和包装(例如，功能性ITR)至病毒颗粒中所需的那些AAV序列。这样的rAAV载体还可包含标记或报道基因。可用的rAAV载体具有全部或部分缺失的AAV WT基因的一个或更多个，但保留功能性侧翼ITR序列。AAV ITR可以是适合特定应用的任何血清型。使用rAAV载体的方法描述于例如Tai et al.,J.Biomed.Sci.7:279(2000)，以及Monahan and Samulski,Gene Delivery 7:24(2000)，其每一篇的公开内容均通过引用并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。
可用作用于并入本文中描述的核酸试剂的载体的AAV的实例(例如，抑制性RNA序列(例如，以下中的任一个：SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241))包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16。
本文中所述的核酸和载体可以并入到rAAV病毒颗粒中，以促进将核酸或载体引入到细胞中。AAV的衣壳蛋白构成病毒颗粒的外部非核酸部分，并由AAVcap基因编码。cap基因编码病毒颗粒组装所需的三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3。rAAV病毒体的构建已在例如以下中描述:US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；和US 6,376,237；以及Rabinowitz et al.,J.Virol.76:791(2002)和Bowles et al.,J.
Virol.77:423(2003),其每一篇的公开内容均通过引用并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。
可与本文中所述的组合物和方法结合使用的rAAV病毒颗粒包括来源于多种AAV血清型的那些，包括AAV 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和rh74。对于位于或递送至中枢神经系统的靶向细胞，AAV2、AAV9和AAV10可能特别地有用。不同血清型的AAV蛋白和AAV载体的构建和用途描述于例如Chao et al.,Mol.Ther.2:619(2000)；Davidson et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA97:3428(2000)；Xiao et al.,J.Virol.72:2224(1998)；Halbertet al.,J.Virol.74:1524(2000)；Halbert et al.,J.Virol.75:6615(2001)和Auricchioet al.,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)，其每一篇的公开内容均通过引用并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。
还与本文中描述的组合物和方法结合使用的是假型rAAV载体。假型载体包括具有来源于除给定血清型之外的血清型的衣壳基因的给定假型血清型的AAV载体(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16)。例如，AAV可以包括假型重组AAV(rAAV)载体，例如如rAAV2/8或rAAV2/9载体。用于产生和使用假型rAAV的方法是本领域已知的(参见例如Duanet al.,J.
Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert et al.,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin et al.,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio et al.,Hum.
Molec.Genet.10:3075-3081,(2001))。
病毒体衣壳内具有突变的AAV病毒体可用于比未突变的衣壳病毒体更有效地感染特定细胞类型。例如，合适的AAV突变体可具有配体插入突变，以促进将AAV靶向至特定细胞类型。AAV衣壳突变体(包括插入突变体、丙氨酸筛选突变体和表位标签突变体)的构建和表征描述于Wu et al.,J.
Virol74:8635(2000)中。可用于本文中所述方法的其他rAAV病毒颗粒包括通过病毒分子育种以及通过外显子改组产生的那些衣壳杂交体。参见，例如，Soong et al，Nat.Genet.,25:436(2000)以及Kolman and Stemmer,Nat.Biotechnol.19:423(2001))。
本公开内容的组合物和方法中使用的rAAV可以包括来自选自以下的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16、AAV-TT、AAVDJ8或其衍生物、修饰或假型，例如与例如选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的vpl、vp2和/或vp3序列具有至少80％或分更高的同一性,例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高即最高100％的同一性的衣壳蛋白。
可用于本文中所述方法的AAV载体可以是Anc80或Anc80L65载体，例如Zinn etal.,2015:1056-1068中描述的，其通过引用整体并入本文。AAV载体可包含以下氨基酸插入之一：LGETTRP(‘956、‘517、‘282或‘323的SEQ ID NO:14)或LALGETTRP(‘956、‘517、‘282或‘323的SEQ ID NO:15),如美国专利No.9,193,956；9458517；和9,587,282以及美国专利申请公开no.2016/0376323中所述，其各自均通过引用整体并入本文。或者，本文中所述方法中使用的AAV载体可以是AAV.7m8，如美国专利No.
9,193,956；9,458,517；和9,587,282以及美国专利申请公开no.
2016/0376323中所述的，其各自均通过引用整体并入本文。此外，本文中所述方法中使用的AAV载体可以是美国专利No.9,585,971中公开的任何AAV，例如AAV.PHP.B载体。本文中描述的方法中使用的另一种AAV载体可以是Chan et al.(Nat Neurosci.20(8):1172-1179,2017)中公开的任何载体，例如AAV.PHP.eB，其包含具有插入到第588至589位氨基酸之间的肽和修饰A587D/588G的AAV9衣壳蛋白。此外，本文中描述的方法中使用的AAV载体可以是美国专利No.9,840,719和WO 2015/013313中公开的任何AAV，例如AAV.Rh74或RHM4-1载体，其各自均通过引用整体并入本文。另外，本文中所述方法中使用的AAV载体可以是WO2014/172669中公开的任何AAV，例如AAV rh.74，其通过引用整体并入本文。本文中所述方法中使用的AAV载体还可以是AAV2/5载体，如Georgiadis et al.,2016，Gene Therapy 23:857-862和Georgiadis et al.,2018，Gene Therapy 25:450中所述，其各自均通过引用整体并入本文。在另外的实例中，本文中所述方法中使用的AAV载体可以是WO 2017/070491中公开的任何AAV，例如AAV2tYF载体，其通过引用整体并入本文。另外，本文中描述的方法中使用的AAV载体可以是AAVLK03或AAV3B载体，如Puzzo et al.,2017,Sci.Transl.Med.29(9):418中所述，其通过引用整体并入本文。在另外的实例中，本文种所述的方法中使用的AAV载体可以是美国专利No.8,628,966；US 8,927,514；US 9,923,120和WO 2016/049230中公开的任何AAV，例如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，其各自均通过引用整体并入本文。
此外，本文中所述方法中使用的AAV载体可以是在任何以下专利和专利申请中公开的AAV载体，其各自均通过引用整体并入本文：美国专利No.
7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请no.2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请No.PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。rAAV载体可具有与任何以下专利和专利申请中公开的AAV衣壳的vp1、vp2和/或vp3氨基酸序列具有至少80％或更高(例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高(例如，100％))同一性的衣壳蛋白，其各自均通过引用整体并入本文：美国专利No.
7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开no.2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请No.PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。
另外，rAAV载体可具有以下国际专利申请公开No.中公开的衣壳蛋白：WO 2003/052051(参见例如‘051的SEQ ID NO:2)，WO 2005/033321(参见例如‘321的SEQ ID NO:123和88)，WO 03/042397(参见例如‘397的SEQ ID NO:2、81、85和97)，WO 2006/068888(参见例如‘888的SEQ ID NO:的1和3至6)，WO 2006/110689(参见例如‘689的SEQ ID NO:5至38)，WO2009/104964(参见例如‘964的SEQ ID NO:1至5、7、9、20、22、24和31)，WO 2010/127097(参见例如‘097的SEQ ID NO:5至38)，和WO 2015/191508(参见例如‘058的SEQ ID NO:80至294)，以及美国申请公开No.20150023924(参见例如‘924的SEQ ID NO:1、5至10)，其各自的内容均通过引用整体并入本文，例如如具有与以下国际专利申请公开No.中公开的AAV衣壳的vp1、vp2和/或vp3氨基酸序列具有至少80％或更高(例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高(例如，100％))同一性的衣壳蛋白的rAAV载体：WO 2003/052051(参见例如'051的SEQ ID NO:2)，WO 2005/033321(参见例如'321的SEQ ID NO:123和88)，WO 03/042397(参见例如'397的SEQ ID NO:2、81、85和97)，WO 2006/068888(参见例如‘888的SEQ ID NO:1和3至6)，WO 2006/110689(参见例如‘689的SEQ ID NO:5至38)WO2009/104964(参见例如‘964的SEQ ID NO:1至5、7、9、20、22、24和31)，WO 2010/127097(参见例如‘097的SEQ ID NO:5至38)和WO 2015/191508(参见例如‘508的SEQ ID NO:80至294)，以及美国申请公开No.20150023924(参见例如‘924的SEQ ID NO:1、5至10))。
基于AAV的病毒载体的核酸序列以及制备重组AAV和AAV衣壳的方法教导于，例如，美国专利No.7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开no.2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；国际专利申请No.PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335；WO 2003/052051、WO 2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、WO 2010/127097和WO 2015/191508以及美国申请No.20150023924。
因此，rAAV载体可以包含含有来自两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的衣壳，所述AAV衣壳血清型例如如选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8或AAV.HSC16。
单链AAV(single-stranded AAV，ssAAV)载体可与所公开的方法和组合物结合使用。或者，可使用自互补AAV载体(self-complementary AAV vector，scAAV)(参见例如，Wu,2007,Human Gene Therapy,18(2):171-82,McCarty et al,2001,Gene Therapy,Vol.8,Number 16,Pages 1248-1254；和美国专利No.6,596,535；7,125,717和7,456,683；其各自均通过引用整体并入本文。
对中枢神经系统中的细胞(包括但不限于神经元和/或神经胶质细胞)具有向性的重组AAV载体可用于递送本公开内容的多核苷酸物质(例如，抑制性RNA物质)。这样的载体可包括非复制“rAAV”载体，特别是带有AAV5、AAV9或AAVrh10衣壳的那些。可以使用AAV变体衣壳，包括但不限于Wilson在美国专利No.7,906,111中描述的那些，其通过引用整体并入本文，特别优选AAV/hu.31和AAV/hu.32，以及Chatterjee在美国专利No.8,628,966、美国专利No.8,927,514和Smith et al.,2014,Mol Ther 22:1625-1634中描述的AAV变体衣壳，其各自均通过引用整体并入本文)。此外，Tordo et al.(Brain 141:2014-31,2018；其通过引用整体并入本文)公开的AAV-TT载体，其并入天然AAV2分离株中保守的氨基酸序列，也可以与本公开内容的组合物和方法结合使用。与AAV2、AAV9和AAVrh10相比，AAV-TT变体衣壳在整个CNS中表现出增强的向神经性和稳健的分布。类似地，Hammond et al.(PLoS ONE 12(2):e0188830,2017；其通过引用整体并入本文)中公开的AAV-DJ8载体表现出优异的向神经性并且可适合与本公开内容的组合物和方法一起使用。
在一个具体的实例中，本公开内容的特征在于包含这样的人工基因组的AAV9载体，所述人工基因组包含(i)包含在调节元件控制下并且侧翼为ITR的编码抑制性RNA序列(例如，SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中的任一者)的多核苷酸的表达盒；以及(ii)病毒衣壳，其具有AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列或者与AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性同时保留AAV9衣壳的生物学功能。编码的AAV9衣壳可具有美国专利No.7,906,111(其通过引用整体并入本文)中所示的SEQ ID NO:116的序列，以及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸替换并保留AAV9衣壳的生物学功能。
本文中还提供了包含这样的人工基因组的AAVrh10载体，所述人工基因组包含(i)表达盒，其包含在调节元件控制下且侧翼为ITR的多核苷酸；和(ii)病毒衣壳，其具有AAVrh10衣壳蛋白的氨基酸序列或者与AAVrh10衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性同时保留AAVrh10衣壳的生物学功能。编码的AAVrh10衣壳可具有美国专利No.9,790,427(其通过引用整体并入本文)中所示的SEQ IDNO:81的序列，以及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸替换并保留AAVrh10衣壳的生物学功能。
可选择在哺乳动物细胞(例如，神经元)中发挥功能的基因调节元件。包含有效地连接的组件的所得的构建体侧翼为(5'和3')功能性AAV ITR序列。具体的实例包括来源于AAV血清型的载体，其对哺乳动物CNS的细胞(特别是神经元)具有向性并在哺乳动物CNS的细胞(特别是神经元)中具有高转导效率。本专利申请提供了不同血清型转导效率的综述和比较。在某些实例中，基于AAV2、AAV5、AAV9和AAVrh10的载体例如通过转导神经元和/或神经胶质细胞来指导多核苷酸在CNS中的长期表达。
含有侧翼为AAV ITR的目的多核苷酸(例如，编码本文中所述的抑制性RNA物质的多核苷酸)的AAV表达载体可通过将选择的序列直接插入到具有从其中切除的主要AAV开放阅读框(open reading frame,“ORF”)的AAV基因组中来构建。也可缺失AAV基因组的其他部分，只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能。也可使用本领域熟知的技术来设计这样的构建体。参见例如美国专利No.5,173,414和5,139,941；国际公开No.
WO 92/01070(1992年1月23日公开)和WO 93/03769(1993年3月4日公开)。或者，可从病毒基因组或包含病毒基因组的AAV载体中切除AAV ITR，并使用标准核酸连接技术将其融合至存在于另一个载体中的所选核酸构建体的5'和3'末端。包含ITR的AAV载体已描述于例如美国专利No.5,139,941中。特别地，其中描述了数种AAV载体，其可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，“ATCC”)以登录号为、53222、53223、53224、53225和53226获得。另外，可以合成产生嵌合基因以包含相对于一种或更多种选定的核酸序列排列在5'和3'的AAV ITR序列。可以使用用于在哺乳动物CNS细胞中表达嵌合基因序列的优选密码子，并且在某些情况下，可以通过公知的方法进行多核苷酸的密码子优化。完整的嵌合序列由通过标准方法制备的重叠多核苷酸组装而成。为了产生AAV病毒体，使用已知技术例如通过转染将AAV表达载体引入到合适的宿主细胞中。许多转染技术是本领域公知的。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接显微注射到培养的细胞内、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导和使用高速微型射弹的核酸递送。
例如，除了本公开内容的核酸序列(例如SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中的任一者)之外，本公开内容的特定病毒载体可包含具有以下的的AAV载体质粒的骨架：来源于AAV2病毒的ITR、启动子例如如神经元启动子例如hSyn启动子和/或CaMKII启动子，具有或不具有野生型或突变形式的WPRE，以及兔β-珠蛋白polyA序列(参见表11和表12)。如果期望的话，hSyn启动子和CaMKII启动子可用含有本文中描述的构建体中的巨细胞病毒增强子(例如CAG或CBA)、U6、H1或7SK启动子的组成型启动子替代。
本公开内容还涉及rAAV，其包含(i)包含在调节元件控制下且侧翼为ITR的多核苷酸的表达盒，和(ii)AAV衣壳，其中所述多核苷酸编码抑制性RNA(例如ASO，例如如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA，并且特别是具有SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的核酸序列的抑制性RNA或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性)，其特异性结合至Grik2 mRNA(例如SEQ ID NO:164至193中所述的Grik2 mRNA的任一区域或部分)的至少一部分或区域并抑制(敲低)细胞(例如神经元)中GluK2蛋白的表达。
AAV载体可包含例如与Grik2 mRNA结合的抑制性RNA(例如siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)序列和hSyn启动子。例如，AAV载体可包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的核酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高(例如，100％)的序列同一性，以及hSyn启动子(例如具有SEQ ID NO:194至198中任一者的核酸序列或其变体的hSyn启动子，所述变体与SEQ ID NO:194至198中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高(例如100％))的序列同一性)。
或者，AAV载体可包含结合并抑制Grik2 mRNA表达的抑制性RNA(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)序列和CaMKII启动子。例如，所公开的AAV载体可包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258中任一者的核酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性)，以及CaMKII启动子(例如，具有SEQ ID NO:199至204中任一者的核酸序列或其变体的的CaMKII启动子，所述变体与SEQ ID NO:199至204中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如100％))的序列同一性)。在一些实施方案中，AAV载体可包含SEQ ID NO:4、19、34、135、141、147和258中任一者的核酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:4、19、34、135、141、147和258中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高(例如100％)))的序列同一性。
逆转录病毒载体
本文中所述的方法和组合物中使用的递送载体可以是逆转录病毒载体。可用于本文中所述的方法和组合物的一种类型的逆转录病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体(Lentiviral vectors,LV)，逆转录病毒的子集，其高效转导广泛范围的分裂和非分裂细胞类型，赋予多核苷酸稳定、长期的表达。Delenda,The Journal of Gene Medicine 6:S125(2004)中提供了用于包装和转导LV的优化策略的概述，其公开内容通过引用并入本文。
基于慢病毒的基因转移技术的使用依赖于重组慢病毒颗粒的体外产生，该颗粒携带高度缺失的病毒基因组，其中容纳目的多核苷酸。特别地，重组慢病毒通过以下在允许细胞系中的反式共表达来恢复：(1)包装构建体，即一起表达Gag-Pol前体和Rev(或者反式表达)的载体；(2)表达包膜受体的载体，其通常具有异源性质；以及(3)转移载体，其由缺少所有开放阅读框的病毒cDNA组成，但维持复制、衣壳化和表达所需的序列，其中插入了待表达的序列。
本文中所述的方法和组合物中使用的LV可包含5'-长末端重复序列(Longterminal repeat，LTR)、HIV信号序列、HIV Psi信号5'-剪接位点(SD)、δ-GAG元件、Rev响应元件(Rev Responsive Element，RRE)、3'-剪接位点(SA)、延伸因子(elongation factor，EF)1-α启动子和3'-自失活LTR(SIN-LTR)中的一种或更多种。慢病毒载体任选地包含中央多嘌呤束(central polypurine tract，cPPT)和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element，WPRE)，如US6,136,597中所述，其公开内容因涉及WPRE而通过引用并入本文。慢病毒载体还可包含pHR'骨架，其可以包含例如如下所提供的。
Lu et al.,Journal of Gene Medicine 6:963(2004)中描述的Lentigen LV可用于表达DNA分子和/或转导细胞。本文中所述的方法和组合物中使用的LV可以是5'-长末端重复序列(LTR)、HIV信号序列、HIV Psi信号5'-剪接位点(SD)、δ-GAG元件、Rev响应元件(RRE)、3'-剪接位点(SA)、延伸因子(EF)1-α启动子和3'-自失活LTR(SIN-LTR)。任选地，这些区域中的一个或更多个被执行类似功能的另一区域替换。
增强子元件可用于提高经修饰DNA分子的表达或提高慢病毒整合效率。本文中所述的方法和组合物中使用的LV可包含nef序列。本文中所述的方法和组合物中使用的LV可包含增强载体整合的cPPT序列。cPPT充当(+)链DNA合成的第二起点，并在其天然HIV基因组的中间引入部分链重叠。在转移载体骨架中引入cPPT序列极大提高了核转运以及整合到靶细胞DNA中的基因组的总量。本文中所述的方法和组合物中使用的LV可包含土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。WPRE通过促进转录物的核输出和/或通过提高新生转录物的聚腺苷酸化效率而在转录水平发挥作用，从而提高细胞中mRNA的总量。将WPRE添加至LV导致显著改善体外和体内二者中来自数种不同启动子的多核苷酸表达的水平。本文中所述的方法和组合物中使用的LV可包含cPPT序列和WPRE序列二者。该载体还可包含允许从单个启动子表达多个多肽的IRES序列。
除了IRES序列之外，允许表达多个多核苷酸的其他元件是可用的。本文中所述的方法和组合物中使用的载体可包含允许表达多于一种多核苷酸的多个启动子。允许未来鉴定的多个多核苷酸表达的另外的元件是可用的并且可在适合与本文中所述的组合物和方法一起使用的载体中使用。本文中所述的方法和组合物中使用的载体可以是临床级载体。
因此，逆转录病毒载体可与所公开的方法和组合物结合使用。由于逆转录病毒能够将其基因整合到宿主基因组中、转移大量外源遗传物质、感染广泛的物种和细胞类型并被包装在特殊的细胞系中，因此逆转录病毒可被选为基因递送载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入到病毒基因组中特定病毒序列的位置，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒颗粒，构建了包含gag、pol和/或env基因但不含LTR和/或包装组分的包装细胞系。当将包含cDNA与逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装到病毒颗粒中，然后将其分泌到培养基中。然后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。
另外，慢病毒载体可与本文中公开的方法和组合物组合使用。因此，本公开内容的目标涉及慢病毒载体，其包含结合并抑制Grik2 mRNA的表达的抑制性RNA(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)序列(例如，SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258中描述的抑制性RNA序列中的任一者)。
因此，慢病毒载体可包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258中任一者的核酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。慢病毒载体可包含结合并抑制Grik2 mRNA表达的抑制性RNA序列(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)和hSyn启动子。
慢病毒载体可包含例如结合Grik2 mRNA的抑制性RNA(例如siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)序列和hSyn启动子。例如，慢病毒载体可包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258至260中任一者的核酸序列或其变体，所述变体与SEQID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258至260中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如100％))的序列同一性，和hSyn启动子(例如，具有SEQID NO:194至198中任一者的核酸序列或其变体的hSyn启动子，所述变体与SEQ ID NO:194至198中任一者的核酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高(例如100％)的序列同一性。
或者，慢病毒载体可包含结合并抑制Grik2 mRNA表达的抑制性RNA(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)序列和CaMKII启动子。例如，所公开的慢病毒载体可包含SEQ IDNO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258至260中任一者的核酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229、238至241和258至260中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％,86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如100％))的序列同一性，和CaMKII启动子(例如具有SEQ ID NO:199至204中任一者的核酸序列或其变体的CaMKII启动子，所述变体与SEQ ID NO:199至204中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如100％)的序列同一性)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，其包含其他具有调节或结构功能的基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，就如同在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV1、HIV2)和猴免疫缺陷病毒(Simian ImmunodeficiencyVirus，SIV)。通过对HIV毒力基因进行多次减毒(例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef)产生慢病毒载体，使得载体在生物学上是安全的。慢病毒载体是本领域已知的，参见例如美国专利No.6,013,516和5,994,136，两者均通过引用并入本文。一般而言，载体是基于质粒或基于病毒的，并且被配置为携带用于并入外源核酸和用于选择核酸以及用于将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。目的载体的gag、pol和env基因也是本领域已知的。因此，将相关基因克隆到选定的载体中，并随后用于转化目的靶细胞。重组慢病毒能够感染非分裂细胞，其中合适的宿主细胞用两种或更多种携带包装蛋白的载体转染，包装蛋白即美国专利No.5,994,136中描述的gag、pol和env，以及rev和tat；其通过引用并入本文。该公开提供了第一载体和第二载体以产生包装细胞，所述第一载体可提供编码病毒gag和pol基因的核酸，所述第二载体可提供编码病毒env的核酸。将提供异源基因的载体引入到所述包装细胞产生生产细胞，其释放携带目的外源基因的感染性病毒颗粒。env可以是兼向型性包膜蛋白，其允许转导人和其他物种的细胞。通常，本公开内容的核酸分子或载体包含“控制序列”，其统指启动子序列、聚腺苷酸化信号序列、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites，“IRES”)、增强子等，它们共同提供编码序列在受体细胞中的复制、转录和翻译。并非所有这些控制序列均需要始终存在，只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。
对特定靶细胞例如海马神经元例如DGC表现出趋向性的核酸载体可用于递送本文中所述的抑制性多核苷酸。
病毒调节元件
病毒调节元件是用于将核酸分子引入宿主细胞的递送载剂的组分。病毒调节元件任选地是逆转录病毒调节元件。例如，病毒调节元件可以是来自HSC1或MSCV的LTR和gag序列。逆转录病毒调节元件可以来自慢病毒或者它们可以是从其他基因组区域鉴定的异源序列。随着其他病毒调节元件变得已知，这些元件可以与本文中描述的方法和组合物一起使用。
编码Grik2抑制性多核苷酸的病毒载体
本公开内容涉及用于递送异源多核苷酸的核酸载体，其中所述多核苷酸编码特异性结合Grik2 mRNA并抑制细胞中GluK2蛋白表达的抑制性RNA物质(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)构建体。因此，本公开内容的目标是提供这样的载体，其包含与Grik2mRNA的至少一个区域或部分(例如，选自以下的Grik2 mRNA的任一区域或部分：SEQ ID NO:164至193中的任一者或其变体，所述变体与SEQ ID NO:164至193中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性)完全或基本上互补的抑制性多核苷酸序列。本公开内容的载体可包含与Grik2mRNA的一个或更多个区域完全或基本上互补的抑制性多核苷酸序列的任何变体。另外，本公开内容的载体可包含与编码GluK2蛋白的任何变体的Grik2 mRNA完全或基本上互补的抑制性多核苷酸序列的任何变体。
因此，将编码目的双链RNA的DNA并入到基因盒，例如表达盒中，其中DNA的转录受启动子和/或其他调节元件控制。将DNA并入到表达目的Grik2抑制性RNA(例如SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中的任一者)的载体的这样的表达盒中，并被目的病毒载体包裹以递送至靶细胞。因此，本公开内容的病毒载体编码与任何Grik2 mRNA转录物同种型(例如，SEQ ID NO:164-174中的任一者)杂交的任何反义RNA。病毒载体编码例如表2、4、6和8中列出的任一种抑制性多核苷酸。
本公开内容的载体递送编码抑制性RNA的多核苷酸，所述抑制性RNA识别或结合Grik2 mRNA的至少一部分或区域(例如，SEQ ID NO:164至193或其变体中所述的Grik2mRNA的任一个区域或部分，所述变体与SEQ ID NO:164至193中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性)。编码抑制性RNA物质的异源多核苷酸可以是较大构建体或支架的一部分，其确保这样的抑制性RNA在细胞(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞，例如神经元细胞，例如DGC或谷氨酸能锥体神经元)内的加工。编码表2至9中列出的任一种siRNA的多核苷酸可包括微RNA基因(例如，E-miR-30、E-miR-218-1或E-miR-124-3等)的前体或一部分，例如微RNA基因的5'侧翼序列、3'侧翼序列或环序列。在一些实施方案中，编码表2至9中列出的任一种siRNA的多核苷酸可包含一种或更多种微RNA基因(例如，E-miR-30、E-miR-218-1或E-miR-124-3)的前体或一部分。在一些实施方案中，多核苷酸可包含两个或更多个微RNA基因(例如，E-miR-30、E-miR-218-1或E-miR-124-3)的前体或一部分。在优选的实施方案中，多核苷酸可以包含E-miR-30和E-miR-218-1的前体或一部分。
因此，本公开内容的目标涉及表达载体，其包包含异源多核苷酸并从5'至3'包含，例如启动子(例如表11中描述的启动子中的任一个)、任选的内含子(例如表12中描述的任一内含子)、编码抑制Grik2 mRNA表达的抑制性RNA物质的核苷酸序列(例如，具有SEQ IDNO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列的抑制性RNA物质或其变体，所述变体具有与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列具有至少85％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性))，以及polyA序列(例如，表12中描述的polyA序列中的任一者)。表达载体还可从5'反向末端重复序列(ITR)至3'ITR包含：5'ITR(例如表12中描述的5'或3'ITR序列中的任一种)、启动子、任选的内含子、编码抑制Grik2mRNA表达的抑制性RNA的核苷酸序列、polyA序列和3'ITR。表达载体还可包含与任何前述载体元件邻接的间隔区和/或接头序列。
在具体的实例中，表达载体或多核苷酸可包括编码形成茎环结构的茎和环的核苷酸序列，其中环包含编码表2至9中列出的任一种抑制性RNA物质的核苷酸序列。例如，表达载体或多核苷酸可包含编码环区域的核酸序列，其中环区域可以全部或部分来源于野生型微RNA序列基因(例如，E-miR-30、miR-218-1或E-miR-124-3等)或者完全是人工的。在一个具体的实例中，环区域可以是E-miR-30a环序列。在一些实施方案中，表达载体或多核苷酸可包含编码两个环区域的核酸序列，其中环区可域以全部或部分来源于野生型微RNA序列(例如，E-miR-30、E-miR-218-1或E-miR-124-3)。在一个具体的实施方案中，环区域可包含E-miR-30环区域和E-miR-218-1环区域。
此外，一个或更多个茎环结构可包含指导序列(例如，反义RNA序列，例如如SEQ IDNO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者)和随从序列(例如，SEQ ID NO:31至45、80至96、121至132、145至150、234至237和246至249中任一者)，随从序列与指导序列的全部或部分互补。例如，随从序列可与指导序列的除了指导序列的第10、9、8、7、6、5、4、3、2或1位核苷酸之外的所有核苷酸互补或随从序列可与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144,230至233和242至245中任一者互补。在一个具体的实例中，一个茎环结构可包含SEQ ID NO:19的指导序列和SEQ ID NO:34的随从序列，并且第二茎环结构可包含SEQ ID NO:141的指导序列和SEQ IS NO:147的随从序列。这四个序列(SEQ IDNO:19、34、141和147)的任何序列变体与SEQ ID NO:19、34、141和147的任一者具有至少85％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性，所述变体可包含在茎环结构中。在一些实施方案中，一种或更多种茎环结构可包含与SEQ IDNO:4、135和258中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少90％、95％、99％或更高(例如，100％))序列同一性的序列。
Pre-miRNA或pri-miRNA支架包含本公开内容的指导(即，反义)序列。pri-miRNA支架包含pre-miRNA支架，并且pri-miRNA长度可以是50至800个核苷酸(例如，50至800、75至700、100至600、150至500、200至400或250至300个核苷酸)。在一个具体的实例中，pri-mRNA可以是50至100个核苷酸(例如，50至60、60至70、70至80、80至90或90至100个核苷酸)、100至200个核苷酸(例如，110至120、120至130、130至140、140至150、150至160、160至170、170至180、180至190或190至200个核苷酸)、200至300个核苷酸(例如，200至210、210至220、220至230、230至240、240至250、250至260、260至270、270至280、280至290或290至300个核苷酸)、300至400个核苷酸(例如，300至310、310至320、320至330、330至340、340至350、350至360、360至370、370至380、380至390或390至400个核苷酸)、400至500个核苷酸(例如，400至410、410至420、420至430、430至440、440至450、450至460、460至470、470至480、480至490或490至500个核苷酸)、500至600个核苷酸(例如，500至510、510至520、520至530、530至540、540至550、550至560、560至570、570至580、580至590或590至600个核苷酸)、600至700个核苷酸(例如，600至610、610至620、620至630、630至640、640至650、650至660、660至670、670至680、680至690或690至700个核苷酸)、或700至800个核苷酸(例如、700至710、710至720、720至730、730至740、740至750、750至760、760至770、770至780、780至790或790至800个核苷酸)。这些工程化支架允许将pre-miRNA加工成包含指导链和随从链的双链RNA。因此，pre-miRNA包含：含有编码指导(即反义序列)RNA的序列的5'臂、通常来源于野生型miRNA的环序列(例如，E-miR-30、E-miR-218-1，或E-miR-124-3等)和包含编码与指导链完全或基本上互补的随从链(即有义序列)的序列的3'臂。Pre-miRNA“茎环”结构的长度通常比50个核苷酸，例如50至150个核苷酸(例如50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至110、110至120、120至130、130至140、或140至150个核苷酸)、50至110个核苷酸(例如，50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至110个核苷酸)或50至80个核苷酸(例如，50至60、60至70、70至80个核苷酸)长。Pri-miRNA还包含分别位于5'臂和3'臂侧翼的5'侧翼序列和3'侧翼序列。侧翼序列不一定与其他序列(臂区域或指导序列)相邻，是非结构化、不配对的区域，并且也可以全部或部分来源于一种或更多种野生型pri-miRNA支架(例如、pri-miRNA支架全部或部分来源于E-miR-30、E-miR-218-1或E-miR-124-3等中的一种或更多种)。侧翼序列各自的长度为至少4个核苷酸，或者长度为高至为300个核苷酸或更长(例如，4至300、10至275、20至250、30至225、40至200、50至175、60至150、70至125、80至100或90至95个核苷酸)。间隔区序列可以作为这样存在：插入前述序列结构之间，并且在大多数情况下提供连接多核苷酸，例如1至30个核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)，以提供灵活性而不干扰整体pre-miRNA结构的功能。间隔区可来源于来自天然存在的RNA的天然存在的连接基团、天然存在的连接基团的一部分、poly-A或poly-U、或核苷酸的随机序列，只要间隔区不干扰双链RNA的加工，间隔区也不干扰指导RNA与靶mRNA序列的结合/相互作用。
根据本文中公开的方法和组合物，包含核苷酸序列的多核苷酸或表达载体还可编码(i)5'茎环臂，其包含指导(例如，反义)链和任选的5'间隔区序列；以及(ii)3'茎环臂，其包含随从(例如，有义)链和任选的3'间隔序区列。在另一个实例中，包含核苷酸序列的多核苷酸或表达载体还可编码(i)5'茎环臂，其包含随从链和任选的5'间隔区序列；以及(ii)3'茎环臂，其包含指导链和任选的3'间隔区序列。在另一个实例中，尿苷摆动碱基存在于指导链的5'末端。在另外的实例中，表达载体或多核苷酸包含指导序列上游的前导5'侧翼区域，并且该侧翼区域可以是任何长度并且可以全部或部分来源于野生型微RNA序列，可以是异源的或来源于与其他侧翼区域或环不同来源的miRNA，或者可能是完全人工的。3'侧翼区域可以在大小和来源上镜像5'侧翼区域，并且3'侧翼区域可以在指导序列的下游(即3')。在又一实例中，5'侧翼序列和3'侧翼序列之一或两者不存在。
表达载体或多核苷酸可包含进一步编码第一侧翼区(例如表8中描述的5'侧翼区中的任一个)的核苷酸序列，所述第一侧翼区包含5'侧翼序列和任选的5'间隔区序列。在具体的实例中，第一侧翼区域位于所述随从链的上游(即5')。在另一个实例中，表达载体或多核苷酸包含编码第二侧翼区域(例如，表8中描述的3'侧翼区域中的任一个)的核苷酸序列，所述第二侧翼区域包含3'侧翼序列和任选的3'间隔区序列。在一个具体的实例中，第一侧翼区域位于指导链的5'处。
根据本文中公开的方法和组合物，表达载体或多核苷酸可包含与SEQ ID NO:1至34、135至147、226至229或256中的任一者具有至少85％(例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如100％))同一性的核酸序列。在一个具体的实例中，表达载体或多核苷酸可包含与SEQ ID NO:256具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体或多核苷酸可包含SEQ ID NO:256的核酸序列。在另一个具体的实例中，表达载体或多核苷酸可包含与SEQ ID NO:1至34和135至147中的一个或更多个具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核酸序列。在另一个实例中，表达载体或多核苷酸可包含与SEQ ID NO:46至62中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核酸序列。在另一个实例中，表达载体或多核苷酸可包含与SEQ ID NO:97至108中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核酸序列。在又一实例中，表达载体或多核苷酸可包含与SEQ ID NO:133至138中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核酸序列。
在另一个实例中，表达载体或多核苷酸包含编码以下的核苷酸序列：
(a)茎环序列，从5'至3'包含：
(i)5'茎环臂，其包含与指导核苷酸序列互补或基本上互补的随从核苷酸序列(例如与SEQ ID NO:31至45、80至96、121至132、145至150、234至237和246至249中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的随从序列)；
(ii)微RNA环区，其中该环区域包含微RNA环序列(例如，E-miR-30a、miR-218-1或E-miR-124-3环序列(例如，具有选自SEQ ID NO:4至225中任一者的核酸的微RNA环序列)；
(iii)3'茎环臂，其包含指导核苷酸序列(例如具有与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核酸序列的指导序列)；
(b)位于随从链5'的5'侧翼区域(例如，表13中描述的5'侧翼区域中的任一者)；和
(c)位于指导链3'的3'侧翼区域(例如，表13中描述的3'侧翼区域中的任一者)，其中第二侧翼区域包含3'侧翼序列和任选的3'间隔区序列。在一些实施方案中，表达载体或多核苷酸包含编码以下的核酸序列：(a)茎环序列，从5'至3'包含：
(i)5'茎环臂，其包含与指导核苷酸序列互补或基本上互补的随从核苷酸序列(例如具有与SEQ ID NO:34和147中的任一个具有至少85％(例如，至少86％，87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核酸序列的随从序列)；(ii)微RNA环区域，其中该环区域包含微RNA环序列(例如，E-miR-30a或E-miR-218-1环序列(例如，具有选自SEQ ID NO:4或135中的任一者的核酸的微RNA环序列)；(iii)3'茎环臂，其包含指导核苷酸序列(例如具有与SEQ ID NO:19和141中任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性的核酸序列的指导序列)；
(b)位于随从链5'的5'侧翼区域(例如，表13中描述的5'侧翼区域中的任一者)；和
(c)位于指导链3'的3'侧翼区域(例如，表13中描述的3'侧翼区域中的任一者)，其中第二侧翼区域包含3'侧翼序列和任选的3'间隔区序列。在一些实施方案中，表达载体或多核苷酸包含含有两个茎环序列的核酸序列，其中(a)一个茎环序列包含：SEQ ID NO:19或其变体(与SEQ ID NO:19具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性))的指导序列，SEQ ID NO:4或其变体(其与SEQ ID NO:4具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性)的微RNA环区域，和SEQ ID NO:34或其变体(其与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性)的随从序列，以及(b)第二茎环序列,其包含：SEQ IDNO:141或其变体(其与SEQ ID NO:141具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性)的指导序列，SEQ ID NO:135或其变体(其与SEQ ID NO:135具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性)的微RNA环区域，以及SEQ ID NO:147或其变体(其与SEQ IDNO:147具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性)的随从序列。在优选的实施方案中，表达载体或多核苷酸包括含有两个茎环序列的核酸序列，其中(a)一个茎环序列包含SEQ ID NO:19的指导序列、SEQ ID NO:4的微RNA环区域和SEQ ID NO:34的随从序列，以及(b)第二茎环序列包含SEQ ID NO:141的指导序列，SEQ ID NO:135的微RNA环区域和SEQ ID NO:147的随从序列。在一些实施方案中，表达载体或多核苷酸包含与SEQ ID NO:256具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，表达载体或多核苷酸具有SEQ ID NO:256的核酸序列。
在另一个实例中，表达载体或多核苷酸包含编码以下的核苷酸序列：
(a)茎环序列，从5'至3'包含：
(i)5'茎环臂，其包含指导核苷酸序列(例如具有与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性的核酸序列的指导序列)；
(ii)微RNA环区域，其中该环区域包含微RNA环序列(例如，E-miR-30a、miR-218-1或E-miR-124-3环序列(例如，具有选自SEQ ID NO:219、222或225中任一者的核酸的微RNA环序列))；
(iii)3'茎环臂，其包含与指导核苷酸序列互补或基本上互补的随从核苷酸序列(例如具有与SEQ ID NO:31至45、80至96、121至132、145至150、234至237和246至249中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)序列同一性的核酸序列的随从序列)；
(b)位于指导链5'的5'侧翼区域(例如，表13中描述的5'侧翼区域中的任一者)；和
(c)位于随从链3'的3'侧翼区域(例如，表13中描述的3'侧翼区域中的任一者)，其中第二侧翼区域包含3'侧翼序列和任选的3'间隔区序列。
上述指导链和随从链的长度可以是19至50(例如，19、20、21、22、23、24、25、26至30、31至35、36至40、41至45、或46至50)个核苷酸长。在一个具体的实例中，指导链的长度是19个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是20个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是21个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是22个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是23个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是24个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是25个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是26至30个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是31至35个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是36至40个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是41至45个核苷酸。在另一个实例中，指导链的长度是46至50个核苷酸。在一个具体的实例中，随从链的长度是19个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是20个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是21个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是22个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是23个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是24个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是25个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是26至30个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是31至35个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是36至40个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是41至45个核苷酸。在另一个实例中，随从链的长度是46至50个核苷酸。
指导链和随从序列的长度可能会根据指导链和随从链所并入的miRNA支架而变化。当给定的指导适应miRNA支架时，可延长指导的长度以适应给定miRNA支架的自然结构和加工。例如，由E-miR-30支架产生的指导序列通常为22个核苷酸长。对于大多数支架，指导序列在3'末端延伸以与靶mRNA序列另外地互补，但在一些情况下根据miRNA支架的序列，可能涉及修饰指导的5'起始位点。
在在某些情况下，可能期望修饰miRNA指导和随从链表达水平和/或加工模式，以提高或修改给定构建体的靶向能力。因此，在给定的miRNA框架/支架内，指导链和随从链的位置可能会交换；这可以是在包括填充序列(例如，SEQ ID NO:250或SEQ ID NO:251)的设计的情况下，或者可能是在无填充的设计的情况下。这还可以在双构建体或串联构建体的背景下。为了适应这种变化，指导链和/或随从链的序列可以根据模板“亲本”设计进行修饰。或者，可以对指导链序列和/或随从链序列进行修饰，以影响指导链和随从链表达和/或加工模式的变化。
在一个具体的实例中，载体或多核苷酸包含E-miR-30a序列，其中5'侧翼区域包含与SEQ ID NO:217具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核苷酸序列(参见表13)。
在一些实施方案中，载体或多核苷酸包含E-miR-30a序列，其中3'侧翼区包含与SEQ ID NO:218具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核苷酸序列(参见表13)。
在另一个实例中，载体或多核苷酸包含E-miR-30a结构，其中环区域包含SEQ IDNO:219的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:219具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的序列(参见表13)。
在一个具体的实例中，载体或多核苷酸包含miR-218-1序列，其中5'侧翼区域包含与SEQ ID NO:220具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核苷酸序列(参见表13)。
在一些实施方案中，载体或多核苷酸包含miR-218-1序列，其中3'侧翼区域包含与SEQ ID NO:221具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核苷酸序列(参见表13)。
在另一个实例中，载体或多核苷酸包含miR-218-1结构，其中环区域包含SEQ IDNO:222的核苷酸序列,或与SEQ ID NO:222具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的序列(参见表13)。
在一个具体的实例中，载体或多核苷酸包含E-miR-124-3序列，其中5'侧翼区域包含与SEQ ID NO:223具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核苷酸序列(参见表13)。
在一些实施方案中，载体或多核苷酸包含E-miR-124-3序列，其中3'侧翼区域包含与SEQ ID NO:224具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的核苷酸序列(参见表13)。
在另一个实例中，载体或多核苷酸包含E-miR-124-3结构，其中环区域包含SEQ IDNO:225的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:225具有至少90％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))同一性的序列(参见表13)。
表达载体可以是质粒并且可包含例如一个或更多个内含子序列(例如SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:206或其变体的内含子序列，所述变体与SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:206具有至少85％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如100％))的序列同一性)，接头序列或填充序列(例如，SEQ ID NO:250或SEQ IDNO:251)。
表13.微RNA序列
因此，本公开内容的目标涉及载体，其包含具有SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者或其变体的核酸序列的多核苷酸，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列具有至少85％(至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性。例如，载体可包含与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列具有至少90％(例如，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。在另一实例中，载体可包含与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列具有至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))序列同一性的多核苷酸。本公开内容的载体还可包含具有SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列的多核苷酸。
具体地，载体可包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者或其变体的序列，所述变体与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、208至229、238至241、250至251和256至261中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性，以及启动子(例如，表11中列出的启动子中的任一种)。
以上讨论的变体可以包括例如由于以下而导致的天然存在的变体：个体之间的等位基因变异(例如多态性)、可变剪接形式等。术语变体还包括来自其他来源或生物体的本公开内容的基因序列。变体可以与根据本公开内容的序列基本上同源。本公开内容的基因的变体还包含在严格杂交条件下与如上限定的序列(或其互补链)杂交的核酸序列。典型的严格杂交条件包括高于30℃、高于35℃或超过42℃的温度，和/或低于约500mM或低于200mM的盐度。杂交条件可通过例如改变温度、盐度和/或其他试剂例如SDS、SSC等的浓度来调节。
本公开内容还提供了用于将异源多核苷酸递送至目的靶细胞的非病毒载体(例如，包含编码本文中公开的Grik2-靶向抑制性RNA物质的多核苷酸的质粒)。在其他情况下，本公开内容的病毒载体可以是AAV载体、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或疱疹病毒载体。
可使用一种或更多种表达盒。每个表达盒可包含至少一个与编码目的RNA的序列可操作地连接的启动子序列(例如，神经元细胞启动子)。每个表达盒可由另外的调节元件、间隔区、内含子、UTR、聚腺苷酸化位点等组成。表达盒相对于编码例如两种或更多种抑制性RNA物质的多核苷酸可以是多顺反子的。表达盒还可包含启动子、编码一种或更多种目的抑制性RNA物质的核酸，和polyA序列。在一个具体的实例中，表达盒包含5'-启动子序列、编码第一目的抑制性RNA物质的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中的任一者)、编码第二目的抑制性RNA物质的序列(例如SEQID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中的任一者),以及polyA序列-3'。在优选的实施方案中，所述表达盒包含与SEQ ID NO:256具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述表达盒具有SEQ ID NO:256的序列。在优选的实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:257具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述表达盒具有SEQ ID NO:257的序列。
病毒载体还可包含编码抗生素抗性基因(例如抗性AmpR、卡那霉素、潮霉素B、遗传霉素、杀稻瘟素S、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、诺尔丝菌素或嘌呤霉素的基因)的核酸序列。
示例性表达盒
本公开内容提供了表达盒，当并入表达载体(例如，质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒载体))时，其促进编码与Grik2 mRNA杂交并抑制Grik2mRNA表达的抑制性RNA物质(例如，具有SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的核酸序列的抑制性RNA物质)的异源多核苷酸的表达。一般而言，并入到核酸载体中的表达盒将包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含异源基因调节序列(例如，启动子(例如，表11中描述的启动子中的任一者)和任选的，增强子序列(例如，表12中描述的增强子序列))、5'侧翼序列(例如，表13中描述的5'侧翼序列)、包含茎环5'臂的茎环序列、环序列(例如，表13中描述的微RNA环序列)、茎环3'臂、3'侧翼序列(例如表13中描述的3'侧翼序列)、任选的土拨鼠肝炎转录后调节元件(WRPE)和PolyA序列(例如，SEQ ID NO:213至216)。在AAV载体的情况下，表达盒可以分别在其5'和3'末端侧翼有5'ITR和3'ITR序列(例如，表12中描述的5'或3'ITR序列中的任一者)。通常，AAV2 ITR序列预期与本文中公开的方法和组合物结合使用，然而，也可以采用来自本文中公开的其他AAV血清型的ITR序列(参见上文“AAV载体”部分)。该构建体的总体结构从5'至3'方向至少包括以下元件：
(i)5'ITR序列(仅用于AAV载体；参见表12)；
(ii)启动子序列(例如，表11中列出的启动子序列中的任一者)；
(iii)5'侧翼序列(例如，参见表13)；
(iv)茎环序列，其与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高(例如，100％))序列同一性；
(v)任选地，WPRE序列；
(vi)PolyA序列(例如，参见表12)；和
(vii)3'ITR序列(仅用于AAV载体；参见表12)。
在一个具体的实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过7(例如，不超过7、6、5、4、3、2或1)个错配核苷酸(即，错配)。在另一个实例中，与SEQ IDNO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过6(例如，不超过6、5、4、3、2或1)个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过5(例如，不超过5、4、3、2、或1)个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ IDNO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过4(例如，不超过4、3、2、或1)个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过3(例如，不超过3、2、或1)个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过2(例如，不超过2或1)个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过1个错配。
在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过10个(例如，不超过10、9、8、7、或6个)错配核苷酸(即，错配)。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过9个(例如，不超过9、8、7、或6个)错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过8个(例如，不超过8、7、或6个)错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过7个(例如，不超过7或6个)错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过6个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过5个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过4个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过3个错配。在另一实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过2个错配。在另一个实例中，与SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列基本上互补的随从序列相对于SEQ ID NO:16至30、63至79、109至120、139至144、230至233和242至245中任一者的抑制性RNA序列具有不超过1个错配。
多基因miRNA盒
侧翼/茎环/侧翼构建体(例如，pri-miRNA)可以被视为单个miRNA“盒”并且可被串联(例如，以由一个或更多个启动子驱动的多基因排列提供)。超过一个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)pre-miR茎环序列可嵌入到较长转录物(例如，如内含子)的任意多核苷酸中或嵌入内源性microRNA侧翼序列(每个茎环的5'和3'，例如-5p和-3p序列)之间。每个pre-miR茎环序列可以在专用启动子的控制下表达(例如，作为具有单独的启动子序列的多基因构建体，其每个启动子序列独立地调节单独的pre-miR茎环序列的表达；即，每个启动子独立于另一个启动子发挥作用以产生单独的microRNA)。已经表明，可以提供至少5bp延伸茎的侧翼序列足以用于茎环的加工(Sun,et al.BioTechniques.41:59-63,July2006，其通过引用并入本文)。间隔区序列可以位于第一miRNA表达盒的3'侧翼序列和第二miRNA表达盒的5'侧翼序列之间。间隔区序列可以来源于编码或非编码(例如，内含子)序列并且具有多种长度，但不被认为是茎-环-侧翼序列的一部分(Rousset,F.et al.,Molecular Therapy:Nucleic Acids,14:352-63,2019,其通过引用并入本文)。
示例性表达盒可以包含含有以下的核苷酸序列：(a)第一多核苷酸，其编码含有与Grik2 mRNA杂交的指导RNA序列的第一miRNA序列；以及(b)编码含有与Grik2mRNA杂交的指导RNA序列的第二miRNA序列的的第二多核苷酸。例如，表达盒从5'至3'可以包含：(a)位于指导链5'处的第一5'侧翼区域，所述第一侧翼区域包含第一5'侧翼序列(例如，参见表13，与其序列同一，)；(b)第一茎环结构，其包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的多核苷酸；(c)位于所述过客链的3'处的第一3'侧翼区域(例如，参见表13)和3'间隔区序列；(d)位于指导链5'处的第二5'侧翼区域(例如，参见表13)；(e)第二茎环结构，其包含SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229和238至214中任一者的多核苷酸；(f)第二3'侧翼区域，其包含位于随从链3'处的3'侧翼序列(例如，参见表13)。在一些实施方案中，表达盒从5'至3'可包含：(a)位于指导链5'的第一5'侧翼区域，所述第一侧翼区域包含第一5'侧翼序列(例如，参见表13，与其序列同一性)；(b)第一茎环结构，其包含SEQ ID NO:4、19和34中的任意一者或更多者的多核苷酸：(c)位于所述随从链的3'处的第一3'侧翼区域(例如，参见表13)和3'间隔区序列；(d)位于指导链5'处的第二5'侧翼区域(例如，参见表13)；(e)第二茎环结构，其包含SEQ ID NO:135、141和147中任意一者或更多者的多核苷酸；(f)第二3'侧翼区域，其包含位于随从链3'处的3'侧翼序列(例如，参见表13)。在一些实施方案中，第一和第二茎环结构的序列颠倒，使得第一茎环结构包含SEQ ID NO:135、141和147中任一者的多核苷酸,并且第二茎环结构包含SEQ IDNO:4、19和34中任一者的多核苷酸。
第一5'侧翼序列、第一3'侧翼序列、第二5'侧翼序列和第二3'侧翼序列可选自表13。
多顺反子或多基因rAAV表达构建体可包含由连续的(例如，连续的或不连续的)miRNA编码多核苷酸X1，例如(X1)n构成的转基因。X1多核苷酸包含表3、5、7和9中列出的任一指导-随从对、表13中列出的5'和3'侧翼序列中的任一者、以及表13中列出的环序列中的任一者。具有式(X1)n,的多顺反子转基因，受位于转基因5'末端处的单个启动子控制，使得启动子和转基因具有式：启动子-(X1)n，其中n是1至10(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的整数。多基因构建体还可包含位于构建体的3'末端处的填充序列(例如，SEQ ID NO:250或SEQID NO:251)以提高载体的制备效率。
双miRNA双启动子表达盒
包含多于一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)pre-miR茎环序列的多基因表达盒可包含多于一种启动子序列以调节每个单独的pre-miR茎环序列的表达，使得每个单独的pre-miR茎环序列可操作地连接至专用启动子序列。在这样的情况下，表达构建体具有式(启动子-X1)n,的结构,其中X1是SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的多核苷酸，并且n是1至10(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的整数。另外的调节元件(例如增强子序列、终止子序列、聚腺苷酸化信号序列、内含子和/或能够形成二级结构的序列，例如本文中公开的调节元件中的任一者)可以可操作地连接至启动子-X1结构的5'末端和/或3'末端。
在一个具体的实例中，双miRNA表达盒包含两个pre-miR茎环序列，每个序列在单独的启动子序列(例如，本文中公开的启动子序列)的控制下。双miRNA盒中的两个启动子可以是相同的启动子或不同的启动子。
在一个具体的实例中，双miRNA表达盒包含核苷酸序列，其从5'至3'包含：(a)第一启动子序列(例如，本文(例如表11)中公开的任一启动子序列，例如hSyn启动子或CaMKII启动子；(b)位于第一茎-环序列的5'的第一5'侧翼区域(例如，参见表13)；(c)第一茎环序列，其包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的多核苷酸：(d)位于第一指导核苷酸序列3'的第一3'侧翼区域(例如，参见表13)；(e)第二启动子序列(例如，参见表11)或其变体，所述变体与第二启动子序列具有至少85％(至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％)的序列同一性)；(f)位于第二茎环序列5'处的第二5'侧翼区域(例如，参见表13)；(g)第二茎环序列，其包含SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中任一者的多核苷酸；以及(h)位于多核苷酸3'处的第二3'侧翼区域(例如，参见表13)。如果期望的话，hSyn启动子和CaMKII启动子可用包含巨细胞病毒增强子(例如CAG或CBA)、U6、H1或7SK启动子的组成型启动子替换。
在另一个实例中，第一启动子是SYN启动子(例如，参见表11)并且第二启动子是CAMKII启动子(例如，参见表11)。
前述双miRNA表达盒中描述的序列的序列同一性可以在10至1500个(例如，20至1400、30至1300、40至1200、50至1100、60至1000、70至900、80至800、90至700、100至600、200至500、或300至400个)核苷酸的范围内确定。例如，在10个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在20个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在30个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在40个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在50个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在60个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在70个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在80个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在90个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在100个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在150个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在200个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在250个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在300个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在350个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在400个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在450个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在500个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在550个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在600个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在650个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在700个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在750个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在800个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在850个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在900个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在950个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在1000个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在1100个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在1200个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在1300个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在另一个实例中，在1400个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。在又一实例中，在1500个核苷酸确定与上述双miRNA表达盒的序列同一性。
上述双miRNA表达盒可包含作为突触蛋白启动子和/或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子的启动子。
适合与本文中公开的双miRNA表达盒结合使用的微RNA环序列可以是E-miR-30、miR-218-1或E-miR-124-3环序列。
本公开内容的双miRNA表达盒还可在表达盒的5'末端并入5'-ITR(例如，参见表12)并在表达盒的3'末端并入3'-ITR(例如，参见表12)。
此外，本文中公开的双miRNA表达构建体可包含可操作地在第一3'侧翼区域的3'末端与第二启动子的5'末端之间连接的第一聚腺苷酸化(polyA)信号和/或可操作地在第二3'侧翼区域的第二3'末端与3'ITR之间连接的第二polyA信号。第一polyA信号和第二polyA信号可以是相同(例如，两者均是RBG或BGH polyA信号)或不同的(例如，第一polyA信号是RBG polyA并且第二polyA信号是BGH polyA；或者第一polyA信号是BGH PolyA并且第二PolyA信号是RBG PolyA)。
包含多个miRNA序列的AAV载体制备的改进
使用编码单或双miRNA表达盒(例如，本文中公开的表达盒)的质粒制备AAV载体可能会潜在地受到不适当的AAV基因组包装的阻碍。首先，pri-miRNA序列是短的(<200个碱基)，并且根据启动子长度，设计具有控制单个miRNA表达的单个启动子的转基因盒可产生显著地比最大包装容量AAV(约4.8kb)短的AAV基因组。因此，如果预期全基因组长度<2.4kb(AAV包装容量的一半)，则单个衣壳可负载有多于一个载体基因组。这可通过聚合酶通读来介导，而无需适当的核酸内切酶切口，这允许产生如果长度合适则可被包装到AAV衣壳中的AAV基因组二聚体(或三聚体)。这随后在AAV载体颗粒群体中引入了显著的异质性，这使得药品的制备和表征显著地更加困难。
其次，由于包含发夹，基于shRNA和miRNA的转基因本质上具有显著的二级结构。已经表明，AAV基因组内的这些内部二级结构可在AAV基因组复制和包装过程期间充当“假”ITR，产生截断事件和包含完整和部分载体基因组混合物的AAV载体颗粒异质群。
我们已经发现，具有低于AAV包装能力的尺寸的AAV基因组与另外的序列(例如，另外的pre-miRNA茎环序列、第二启动子序列、填充序列(例如，SEQ ID NO:250或SEQ ID NO:251),使用自互补AAV载体等)的连接(padding)通过避免并入部分(即截短的)AAV基因组的拷贝来显著地改善AAV包装，并防止或降低多重包装事件。因此，本文中描述的构建体通过将前述序列并入到AAV表达盒中以将载体尺寸提高至更接近最大AAV包装容量的值来避免AAV基因组的不当包装。在一些实施方案中，载体包含一个或更多个(例如，1、2或更多个)填充序列。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列位于表达盒的3'末端处。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:250的核酸序列具有至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列具有SEQ ID NO:250的核酸序列。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:251的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:251的核酸序列具有至少90％(例如，至少91％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ IDNO:251的核酸序列具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列与SEQ ID NO:251的核酸序列具有至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，一个或更多个填充序列具有SEQ ID NO:251的核酸序列。
例如，在某些情况下，表达单个启动子控制下的一种miRNA或来自两个独立启动子的两种miRNA(双构建体方法)的构建体可能无法按照体外/离体/计算机评价所预测的那样在体内发挥作用。在这些情况下，可实施以下策略来建立基因组长度，从而产生同质、全长、单独包装的AAV载体颗粒群。
首先，如果期望表达单个miRNA“指导”，则可添加填充序列(例如SEQ ID NO:250或SEQ ID NO:251)以提高AAV载体基因组的总长度，而不破坏启动子或miR盒本身。可将该填充物添加到转基因盒的下游(polyA序列的3')。在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ IDNO:252至257中任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、95％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，AAV载体包含SEQ IDNO:252至257中任一者的序列。该填充物的长度和内容可以改变，同时保留其提高AAV包装同质性的能力。此外，可将该填充子置于启动子的上游(5')。填充序列可以在scAAV载体或单链(ss)AAV载体的情况下使用。
其次，如果多于一种的miRNA待被表达，但选择单一启动子策略，则可通过多个miRNA盒的多联化(concatemerization)来制备载体。虽然使用相同支架的多个miRNA(例如，多至5个miRNA盒)的多联化可导致载体基因组内同源序列之间的重组，但使用具有非同源侧翼和环序列的不同支架的miRNA盒的多联化可以改善这种包装问题。如果包含另外的的miRNA盒不能产生适当长度的载体基因组，则可如上所述并入填充序列以增加长度来提高包装效率。在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO:256至257中的任一者具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、95％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，AAV载体包含SEQ ID NO:256至257中任一者的序列。
昆虫表达载体
本文中描述的抑制性多核苷酸还可在合适的昆虫表达载体(例如，病毒载体，例如杆状病毒病毒载体)中编码并在昆虫表达系统中表达。在一些实施方案中，可将本文中描述的抑制性多核苷酸并入到核酸载体(例如，杆状病毒载体或基于杆状病毒的载体、逆转录病毒载体或其他病毒载体)中，转染到昆虫细胞系(例如，Sf9细胞)中，并在允许多核苷酸表达的条件下培养。例如，可以用本公开内容的抑制性多核苷酸瞬时或稳定地转染昆虫细胞系(例如，Sf9细胞)。
杆状病毒递送载体和与其对应的经修饰宿主细胞是可商购获得的，例如pAcGP67、pAcSECG2TA、pVL1392、pVL1393、pAcGHLT、pAcAB4；pBAC-3、pBAC6、pBACgus-6、pBACsurf-1、pPolh-FLAG和pPolh-MAT。用于杆状病毒和昆虫细胞表达系统的方法是本领域公知的，如Summers and Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987),和Luckow and Summers,Bio/Technology 6:47(1988)中所述，其通过引用并入本文中。本领域技术人员应理解，表达系统不限于杆状病毒表达系统。重要的是表达系统允许表达本公开内容的抑制性多核苷酸。例如，其他合适的昆虫表达系统包括昆虫痘病毒系统(昆虫妈妈病毒)和质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus，CPV)系统。
细菌表达载体
标准细菌载体包括例如噬菌体X和M13，以及质粒，例如pBR322、pSKF和pET23D。在一些实施方案中，可将本文中描述的抑制性多核苷酸或编码其的核酸载体并入到质粒或替代细菌表达载体中并在允许多核苷酸表达的条件下培养。Pouwels et al.(CloningVectors:A Laboratory manual,Elsevier,New York,1985)已经描述了用于与细菌宿主细胞一起使用的合适的克隆和表达载体。示例性细菌菌株可包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能够表达异源多核苷酸的任何细菌菌株。细菌表达载体中通常包含的元件包括复制子、编码抗生素抗性以允许选择含有重组质粒的细菌的基因，以及质粒非必需区中以允许插入重组序列的独特限制性位点。
药物组合物
可将本文中所述的抑制性多核苷酸或编码其的核酸载体配制成药物组合物，用于以适合于体内施用的生物相容性形式施用于哺乳动物(例如，人)对象。
本文中公开的组合物可在任何合适的载剂中配制以递送至对象(例如，人)。例如，它们可以配制为可药用的混悬剂、分散液、溶液或乳剂。合适的介质包括盐水和脂质体制剂。更具体地，可药用载体可包括无菌水性或非水溶液、混悬剂和乳剂。重组人白蛋白(rAlbumin Human NF Prime)也可与AAV载体(Albumedix,NottinghamUK)一起用作稳定剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、以及可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。适合于静脉内施用的载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。
还可存在防腐剂和其他添加剂，例如如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
胶体分散系统也可用于靶向基因递送。胶体分散系统包括高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。
本文中描述的组合物可以以游离碱的形式、以盐、溶剂合物的形式使用以及作为前药使用。所有形式均在本文中描述的方法之内。根据本公开内容的方法，所描述的化合物或其盐、溶剂合物或前药可以根据所选择的施用途径以多种形式施用于患者。
因此，本文中所述的组合物可配制用于例如通过经口、肠胃外、鞘内、脑室内、实质内、经颊、舌下、经鼻、经直肠、经贴剂、经泵或经皮施用来施用，并且相应地配制药物组合物。肠胃外施用包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、经鼻、肺内、鞘内、脑室内、实质内、经直肠和表面施用模式。肠胃外施用可通过在选定的时间段内连续输注来进行。
本文中描述的试剂的溶液可在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散剂也可以在甘油、液体聚乙二醇、DMSO及其含或不含醇的混合物以及油中制备。在正常的储存和使用条件下，这些制剂可包含防腐剂，以预防微生物的生长。用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分描述于例如2018年出版的Remington’s PharmaceuticalSciences(2012,22nd ed.)and in The United States Pharmacopeia:The NationalFormulary(USP 41NF 36)。适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是达到其可容易地经注射器施用之程度的流体。局部、区域或全身施用也可以是合适的。本文中描述的组合物可以有利地通过向靶部位施用注射或多次注射来接触，所述靶部位间隔例如约1cm的间隔。
本文中所述的组合物可以单独或与本文中所述的可药用载体组合施用于动物例如人，如本文中所述，其比例由化合物的溶解度和化学性质、所选择的施用途径，和标准药学实践来确定。
因此，本公开内容提供了包含本文中公开的抑制性RNA物质(例如，siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)的药物组合物。具体地，本公开内容提供了包含含有本公开内容的抑制性RNA物质的载体的组合物。在一个具体的实例中，本公开内容提供了包含载体(例如慢病毒或AAV载体)的药物组合物，所述载体包含可操作地连接至启动子的本公开内容的抑制性RNA，如本文中所公开的。该药物组合物可以包含AAV载体，该AAV载体包含(a)病毒衣壳；和(b)人工多核苷酸，其包括侧翼为AAV ITR的表达盒，其中所述表达盒包含编码抑制性多核苷酸的多核苷酸，所述抑制性多核苷酸结合Grik2 mRNA并抑制Grik2 mRNA的表达，其可操作地连接至控制CNS细胞中的多核苷酸表达的一个或更多个调节序列。
本文中公开的抑制性RNA物质可与可药用的赋形剂和任选的持续释放基质例如可生物降解的聚合物组合，以形成药物组合物。“药学上的”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于哺乳动物,尤其是人时不产生不良(adverse)、变态或其他不良(untoward)反应的分子实体和组合物。可药用载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。本文中公开的药物组合物可以配制用于脑内(例如，实质内或脑室内)、肌内、静脉内、经皮、局部、经口、舌下、皮下或直肠施用。
单独的或与另一治疗剂组合的组合物的活性组分(例如，靶向Grik2的抑制性RNA物质)可作为与常规药物支持物的混合物以单位施用形式施用于有此需要的对象。合适的单位施用形式包括经口途径形式例如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂和经口混悬剂或溶液剂、舌下和经颊施用形式、气雾剂、植入物、皮下、经皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下、经皮、鞘内、脑内、立体定位和鼻内施用形式以及经直肠施用形式。通常，药物组合物包含对于能够注射的制剂而言是可药用的载剂。这些可以是特别等张的、无菌的盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这样盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，根据无菌水或生理盐水的情况，其在添加后允许可注射溶液的构成。
适合可注射使用的药物形式包括包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂、无菌水溶液或分散剂，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是易注射的流体。它必须在生产和储存条件下保持稳定，并且保存以防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。包含作为游离碱或可药用盐的本公开内容的化合物的溶液可以在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。
分散剂也可在甘油、液体聚乙二醇、二甲基亚砜及其混合物以及油中制备。在正常的储存和使用条件下，这些制剂可包含防腐剂，以预防微生物的生长。本文中公开的抑制性多核苷酸物质可配制成中性或盐形式的组合物。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)并且其与例如无机酸(例如盐酸或磷酸)，或例如有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及这样的有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载体也可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性可以通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下维持所需的粒径和使用表面活性剂来维持。
对微生物作用的预防可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在一些情况下，本公开内容的药物组合物可包含等张剂，例如糖或氯化钠。
可通过使用延迟吸收剂例如如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。通过将所需量的活性剂并入到具有上述列举的数种其他成分(根据需要)的适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般而言，分散剂通过将多种无菌活性成分并入到无菌载剂中来制备，所述无菌载剂包含基本分散介质和来自本文中公开的那些的所需的另外成分。至于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法可为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所期望成分的粉末。配制之后，溶液将以与剂量要求相容的方式并以治疗有效的这样的量施用。
该制剂容易以多种剂型例如上述可注射溶液的类型施用，但也可以采用药物释放胶囊等。例如，对于以水性溶液的肠胃外施用，如有必要，应将该溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水性溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。可以使用的无菌水性介质是本领域公知的。例如，可将一剂量溶解在1mL等张NaCl溶液中并添加至1000mL皮下灌注术液体或在拟输注部位处注射。根据接受治疗的对象的状况，剂量将必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的医师可使用适当的患者信息和本领域认可的方法来确定个体对象的适当剂量。
诊断方法
例如使用本领域公知的方法，对象(例如人对象)可被诊断为患有癫痫(例如，TLE)，并且因此被鉴定为需要使用本文中公开的组合物和方法进行治疗。例如，可在对象中通过神经生理学测试以确定对象的脑中的致癫痫病灶和癫痫样活动的严重性来指导癫痫的诊断。本领域公知的示例性神经生理学测试方法包括脑电图(electroencephalography，EEG)、脑磁图(magnetoencephalography，MEG)、功能MRI(functional MRI，fMRI)、单光子发射计算机体层摄影(single-photon emission computed tomography，SPECT)和正电子发射体层摄影(positron emission tomography，PET)。EEG和MEG提供了具有高时间分辨率的皮质功能的连续测量，并促进了发作间期(癫痫发作之间的时期)癫痫样放电的检测，这可以指示对象中癫痫病症的阳性诊断。可将对象的脑活动相对于适合对象的年龄、病史和生活方式的标准(例如，参考人群，例如如非癫痫患者人群)进行比较，以确定对象中关于癫痫的诊断。
对象可被诊断为患有多种癫痫病症中的任一种，包括但不限于TLE(例如，mTLE或lTLE)、良性中央回癫痫(benign Rolandic epilepsy)、额叶癫痫、婴儿痉挛症、少年肌阵挛癫痫、少年型失神性癫痫、小儿失神癫痫(癫痫小发作(类癫痫发作))、热浴性癫痫、伦诺克斯-加斯托综合征(Lennox-Gastaut syndrome)、获得性失语性癫痫(Landau-Kleffnersyndrome)、Dravet综合征、进行性肌阵挛性癫痫(progressive myoclonus epilepsy)、反射性癫痫、拉斯马森综合征(Rasmussen's syndrome)、边缘系统癫痫、癫痫持续状态(status epilepticus)、腹性癫痫、大规模双侧肌阵挛(massive bilateral myoclonus)、月经性癫痫、杰克逊癫痫病(Jacksonian seizure disorder)、拉福拉病(Lafora disease)和光敏性癫痫。在癫痫病症是TLE的情况下，TLE的特征可以是局灶性或全身性癫痫发作。
可使用所公开的方法基于将致癫痫病灶定位到特定脑区域(例如，内侧颞叶、外侧额叶、额叶等)来诊断患者的癫痫类型。癫痫脑活动的电生理学特征也可用于在对象中确定癫痫的特定类型或亚型。例如，皮质区(例如，海马或大脑皮层)中快速(250至600Hz)尖锐波波纹(SPW-R)的存在可以指示对象中TLE的阳性诊断。在另一个实例中，伦诺克斯-加斯托综合征通常以新皮质和丘脑中记录的快速电图振荡(10至15Hz)的存在为特征。此外，如果患者显示出明显地表现出癫痫发作的行为表现，例如全身抽搐、暂时失神(意识水平降低，持续约10秒的时间)、紧张、肌阵挛、肠或膀胱失控、咬舌、疲劳、头痛、说话困难、行为异常(例如凝视不动或手或嘴自动运动)、精神病和/或局部无力，则对住院设施中的对象进行视频监控可以指示患者中癫痫的诊断。来自被诊断为癫痫的对象自我报告的症状也可表明诊断呈阳性。这样的自我报告的症状可包括以前见过或从未见过的感觉、先兆(auras)、健忘症、自发且无端的恐惧和焦虑、恶心、听觉、视觉、嗅觉、味觉或触觉幻觉、视觉扭曲(例如，视物显大症或视物显小症)、解离或现实感丧失、联觉、烦躁或欣快感、恐惧、愤怒或不可言喻的感觉。
药物用途
本文中公开了用于通过施用上述组合物(例如，抑制性RNA物质或编码其的核酸载体)来在被诊断患有癫痫病症或处于发展癫痫病症的风险中的对象中治疗癫痫(例如，TLE)的方法。施用后，本公开内容的抑制性RNA物质能够结合Grik2 mRNA并抑制Grik2 mRNA的表达。本文中公开的抑制性RNA物质对Grik2的靶向可以通过第一细胞或细胞组(例如，神经元细胞；这样的细胞可存在于(例如)对象或来源于对象的样品中)表达的Grik2 mRNA水平的降低来表明，其中Grik2被转录且已被处理(例如，通过将一种或更多种细胞与本公开内容的抑制性多核苷酸接触，或通过将本公开内容的抑制性多核苷酸施用于存在或曾存在所述细胞的对象)。在一个具体的实例中，与与第一细胞或细胞组基本上相同但尚未如此处理的第二细胞或细胞组(未用抑制性多核苷酸处理或未用靶向目的基因的抑制性多核苷酸处理的对照细胞)相比，Grik2的表达在第一细胞或细胞组中降低。目的基因(例如，Grik2)的mRNA水平降低的程度可用以下表示：
基因(例如，Grik2基因)表达水平的变化可根据与目的基因的表达功能相关的参数(例如，目的基因的蛋白质表达或蛋白质下游的信号传导)的降低来评估。可在表达来自表达构建体的内源的或异源的目的基因的任何细胞中并通过本领域已知的任何测定来确定目的基因的表达水平的变化。
Grik2表达水平的变化可通过细胞或细胞组表达的GluK2蛋白水平(例如，来源于对象的样品中GluK2蛋白表达的水平)的降低来表明。如上所述，为了评估Grik2 mRNA抑制，经处理的细胞或细胞组中GluK2蛋白表达水平的变化可类似地表示为对照细胞或细胞组中蛋白质水平的百分比。
可用于评估Grik2基因表达变化的对照细胞或细胞组包括尚未与本公开内容的抑制性多核苷酸接触的细胞或细胞组。例如，在用抑制性多核苷酸处理对象之前，对照细胞或细胞组可以来源于个体对象(例如，人或动物对象)。
细胞或细胞组表达的Grik2 mRNA水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定。例如，样品中Grik2 mRNA的表达水平可通过检测转录的多核苷酸或其部分例如mRNA来确定。可使用以下RNA提取技术从细胞中提取RNA：包括例如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNEASY TMRNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland)。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核run-on测定、RT-PCR、RNA酶保护测定、northern印迹、原位杂交和微阵列分析。可以使用PCT公开WO2012/177906中描述的方法来检测循环mRNA，该公开的全部内容通过引用并入本文。还可以使用核酸探针来确定目的基因的表达水平。本文中使用的术语“探针”是指能够选择性结合特定序列例如mRNA的任何分子。探针可使用本领域公知和常规方法合成或来源于适当的生物制剂。可专门设计探针以用于标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，其包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)分析和探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法涉及将分离的mRNA与可与目的基因的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。可将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移至膜(例如硝化纤维素)。还可将探针固定在固体表面上并且使mRNA与(例如在AFFYMETRIX基因芯片阵列中的)探针接触。本领域已知的mRNA检测方法可适用于确定目的基因的mRNA水平。
用于确定样品中目的基因的表达水平的替代方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利No.4,683,202中所示的实验性实施方案)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193)、自我持续序列复制(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.
Sci.USA86:1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology6:1197)、滚环复制(Lizardi et al.,美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域公知的技术检测扩增的分子。如果这样的分子以非常低的数目存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。在本公开内容的具体方面中，通过定量荧光RT-PCR(即，TAQMANTM系统)或DUAL-萤光素酶测定来确定目的基因的表达水平。
可使用膜印迹(例如用于杂交分析，例如Northern、Southern、dot等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或任何固体支持物(包括结合的核酸))来监测目的基因的mRNA的表达水平。参见美国专利No.5,770,722；5,874,219；5,744,305；5,677,195；和5,445,934，其通过引用并入本文。基因表达水平的确定还可包括使用溶液中的核酸探针。
mRNA表达水平也可使用分支DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)进行评估。该PCR方法的使用在本文中提供的实施例中进行了描述和举例说明。这样的方法还可用于检测目的基因的核酸。
此外，可使用本领域已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定由Grik2基因表达产生的GluK2蛋白质的水平。这样的方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)、薄层色谱(thin layerchromatography，TLC)、超扩散色谱(hyperdiffusion chromatography)、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、western印迹、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。这样的测定还可用于检测指示由目的的基因产生的蛋白质的存在或复制的蛋白质。另外，以上测定可用于报告目的mRNA序列的变化，其导致蛋白质功能的恢复或变化，从而为对象提供治疗作用和益处，在对象中治疗病症，和/或在对象中减少病症的症状。
因此，用于测量Grik2 mRNA或GluK2蛋白表达的前述测定可用于鉴定需要用一种或更多种本文中公开的抑制性RNA物质(例如，表2中描述的任一种抑制性RNA物质)或编码其的核酸载体进行治疗性治疗的对象(例如，患有癫痫例如TLE的对象)。例如，被确定为患有TLE的患者可在脑的一个半球的颞叶内表现出致癫痫病灶，这导致无法控制的(例如，难治性的例如慢性的)癫痫发作。如本文所讨论的，这样的致癫痫病灶是由例如复发齿状颗粒细胞苔状纤维的异常出芽和由所述苔藓纤维形成的复发突触处的Grik2异常(即,提高)表达引起的。使用上述测定，可进行对象是否会受益于使用本文中公开的一种或更多种Grik2抑制性RNA物质的治疗的测定，例如通过对从致癫痫半球的海马体和从健康半球的同一区域收集的脑组织进行小活检。与未受影响的半球相比，A显示致癫痫半球表现出更高(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的Grik2 mRNA或GluK2蛋白的表达水平，这表明患者可受益于使用本文中公开的方法和组合物的治疗。在患有TLE的对象在两个脑半球均出现致癫痫病灶的情况下，可使用上文公开的测定，在从患有TLE的对象的一个或更多个半球获得的海马组织和从健康对照对象的相同半球获得的海马组织(例如，从没有TLE的对象的尸体解剖组织)之间比较Grik2mRNA或GluK2蛋白水平。与健康对象的相同半球相比，A显示患有TLE的对象的致癫痫半球表现出更高(例如，高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的Grik2 mRNA或GluK2蛋白的表达，这表明患有TLE的对象将受益于使用所公开的组合物和方法的治疗性治疗。怀疑需要治疗的对象的神经元细胞中的Grik2mRNA水平或GluK2蛋白水平也可以与已知指示疾病状态的这些分析物的标准或参考水平进行比较。
另外，上述测定可用于确定对象(例如，患有癫痫(例如TLE)的对象)是否对使用本文中公开的组合物和方法的治疗有响应。例如，如上所述，在使用本文中公开的组合物和方法治疗之前，可以通过小活检从患有TLE的对象获得来自致癫痫脑半球的海马脑组织，并且可使用前述测定评估Grik2mRNA或GluK2蛋白的表达。然后可根据本文中公开的方法和组合物对对象施用治疗。在用所公开的方法和组合物治疗之后(例如，治疗之后1、5、10、15、30、60、90或更多天)患者康复后，可在治疗之前在相同的脑区域上进行第二次活体组织检查并可再次评估Grik2 mRNA或GluK2蛋白的水平。A显示患有TLE的对象表现出较低(例如，低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，100％))的Grik2 mRNA或GluK2蛋白的表达水平，这表明对象对治疗有响应。或者，可以将Grik2 mRNA或GluK2蛋白水平与来自一个或更多个健康对照对象的相同的表达进行比较。显示患有TLE的患者中治疗后的Grik2 mRNA或GluK2蛋白水平与一个或更多个健康对照对象中的相同水平在统计上无法区分，这表明患者对治疗有响应。还可将治疗对象的神经元细胞中的Grik2 mRNA水平或GluK2蛋白水平与已知指示不存在疾病状态的这些分析物的标准或参考水平进行比较。
治疗方法
患有癫痫(例如，TLE)的对象可使用本文中描述的组合物和方法进行治疗。组合物(例如，含有抑制性RNA物质的组合物或含有其的载体)可作为预防性治疗施用于有此需要的对象(例如，诊断为患有癫痫或处于患有癫痫(例如，TLE)的风险中的对象。处于发生癫痫的风险中的对象可表现出癫痫的早期症状，或在施用治疗时可能尚未出现症状。
施用途径
可使用标准方法将本文中公开的组合物施用于对象(例如，确定为患有TLE的对象)。例如，本文中公开的组合物可以通过多种不同途径中的任一种来施用，包括例如全身施用。全身施用的非限制性实例包括肠内(例如，经口)或肠胃外(例如，静脉内、动脉内、经黏膜、腹膜内、经表皮、黏膜内(例如，鼻内或舌下)、肌内或经皮)施用。另外的施用途径可包括皮内、皮下和经皮注射。
本文中公开的组合物还可使用适合局部递送抑制性RNA物质或编码其的核酸载体的方法来施用。局部施用的非限制性实例包括经表皮(例如，表面)、关节内和吸入途径。具体地，所公开的组合物可以局部施用至对象的脑组织(例如神经细胞，例如神经元和/或星形胶质细胞))。
具体地，抑制性RNA物质和编码其的核酸载体可以局部施用至对象的脑组织，例如确定表现出提高的癫痫样活性的脑组织。对脑的局部施用通常包括适合于将抑制性RNA物质或编码其的核酸载体递送至脑细胞(例如，神经细胞)的任何方法，使得所选择的、突触连接的细胞群的至少一部分细胞与组合物接触。载体可被递送至CNS的任何细胞，包括神经元、星形胶质细胞或两者。一般而言，将载体递送至CNS的细胞，包括例如脊髓、脑干(髓质、脑桥和中脑)、小脑、间脑(例如丘脑和下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮质(例如，枕叶、颞叶、顶叶或额叶中的皮质区))的细胞或其组合的细胞，或者其中的任何合适的细胞亚群。用于递送的另外的部位包括红核、杏仁核、内嗅皮质和丘脑腹外侧核或前核中的神经元。
本公开内容的载体可以通过立体定位注射或显微注射的方式直接递送至CNS的实质或脑室中。在一个特定的实例中，可将本公开内容的载体直接递送至对象脑中的一个或更多个癫痫病灶。例如，可通过立体定位注射的方式将本公开内容的载体直接施用到异型皮质(例如，海马体)或新皮质(例如，额叶)的一个或两个半球中。在一个具体的实例中，通过直接向海马体的一个或两个半球进行立体定位注射来向对象施用本公开内容的载体。或者，本公开内容的载体可通过静脉内注射来施用，例如在表现出对CNS组织的向性的载体的情况下，包括但不限于AAV5、AAV9或AAVrh10。
为了将本公开内容的载体特异性地递送至特定区域和特定CNS的细胞群，可通过立体定位微注射来施用载体。例如，对象可将立体定位框架底座通过手术固定到位(拧入到颅骨中)。使用高分辨率MRI对具有立体定位框架底座(例如，具有基准标记的MRI兼容立体定位框架底座)的脑进行成像。然后将MRI图像传输到运行立体定位软件的计算机上。使用一系列冠状、矢状和轴向图像来确定用于将本公开内容的组合物注射到脑中的插管或注射针的靶注射部位和轨迹。该软件直接将轨迹转换为适合立体定位框架的三维坐标。在进入部位上方钻孔，并将立体定位装置定位，以及将注射针植入给定深度。可将组合物(例如本文中公开的组合物)在靶部位处注射。在组合物包含整合载体而不产生病毒颗粒的情况下，载体的传播较小并且主要是从注射位点被动扩散的功能。扩散程度可通过调节载体与流体载体的比率来控制。
另外的施用途径还可包括在直接可视化下局部应用载体，例如表面皮质施加或其他非立体定位施加。可将载体鞘内递送(例如，直接进入大池)、脑室内递送(例如，使用脑室(intracerebroventricular,ICV)注射)或通过静脉内注射。
在一个实例中，本公开内容的方法包括通过立体定位注射的脑内或脑室内施用。然而，也可以根据本公开内容采用其他已知的递送方法。例如，为了使组合物更广泛地分布在CNS中，可将其例如通过腰椎穿刺来注射到脑脊液中。为了将组合物引导至周围神经系统，可以将其注射到脊髓、一个或更多个周围神经节中、或者目的机体部分的皮肤下(皮下或肌内)。在某些情况下，组合物可通过血管内方法施用。例如，在血脑屏障受到干扰或未受到干扰的情况下，可将组合物动脉内(颈动脉)施用。此外，为了更全面地递送，可在通过输注包含甘露醇的高渗溶液实现血脑屏障“打开”的期间施用组合物。
在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于施用的特定组合物、对象、待治疗的特定癫痫、药物制剂方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、对象的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、对象的饮食和对象的排泄率。
组合治疗
本文中公开的组合物可与一种或更多种另外的治疗方式(例如，1、2、3或更多另外的治疗方式)(包括其他治疗剂或物理干预(例如，康复治疗或外科手术干预))组合施用于有此需要的对象(例如，人对象)以治疗癫痫(例如，TLE)。两种或更多种药剂可同时施用(例如，所有药剂的施用发生在15分钟、10分钟、5分钟、2分钟或更短的时间内)。这些药剂还可通过共制剂同时施用。两种或更多种药剂还可以顺序地施用，使得两种或更多种药剂的作用重叠并且它们的组合作用使得症状或与病症相关的其他参数的降低比用一种药剂或单独递送的治疗或在另一种不存在的情况下观察到的大。两种或更多种治疗的作用可以是部分累加的、完全累加的或大于累加的(例如，协同的)。每种治疗剂的顺序或基本上同时的施用可通过任何适当的途径进行，包括但不限于经口途径、静脉内途径、肌内途径、局部途径和通过黏膜组织的直接吸收。治疗剂可以通过相同途径或通过不同途径施用。例如，组合的第一治疗剂可通过静脉注射施用，而组合的第二治疗剂可以在化合物浸渍的微盒中局部施用。第一治疗剂可在第二治疗剂之前或之后立即、多至1小时、多至2小时、多至3小时、多至4小时、多至5小时、多至6小时、多至7小时、最多8小时、最长9小时、多至10小时、多至11小时、多至12小时、多至13小时、14小时、多至16小时、多至17小时、多至18小时、多至19小时、多至20小时、多至21小时、多至22小时、多至23小时、多至24小时或多至1至7、1至14、1至21或1至30天施用。
在对象被诊断为患有癫痫(例如，TLE)或处于发展癫痫(例如，TLE)风险中的情况下，第二治疗剂可包括一种或更多种抗癫痫药物(AED)，包括但不限于丙戊酸盐、拉莫三嗪(lamotrigine)、乙琥胺(ethosuximide)、托吡酯(topiramate)、拉考沙胺(lacosamide)、左乙拉西坦(levetiracetam)、氯巴占(clobazam)、司替戊醇(stiripentol)、苯二氮类药物(benzodiazepine)、苯妥英(phenytoin)、卡马西平(carbamazepine)、扑米酮(primidone)、苯巴比妥(phenobarbital)、加巴喷丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、噻加宾(tiagabine)、唑尼沙胺(zonisamide)、非尔氨酯(felbamate)和/或氨己烯酸(vigabatrin)。在一些情况下，第二治疗方式可以是手术干预，例如如使用本领域公知的方法，例如放射手术(例如伽玛刀或激光消融)对致癫痫脑区域进行手术切除(例如，颞叶切除)。可与本公开内容的方法和组合物一起施用的另外的治疗方式包括迷走神经刺激、深部脑刺激、经颅磁刺激和生酮饮食。
在具体的实例中，可向对象施用免疫抑制剂，包括单独的皮质类固醇，或者他克莫司(tacrolimus)或雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))例如与霉酚酸组合或与皮质类固醇(例如泼尼松龙和/或甲泼尼龙)组合的的方案。本领域公知的其他免疫抑制方案可与本公开内容的方法和组合物结合使用。这样的免疫抑制治疗可在施用本文中所述的抑制性核酸分子(例如，抑制剂RNA物质)之前、之后施用或与本文中所述的抑制性核酸分子(例如，抑制剂RNA物质)同时施用。
剂量
如本文中所述可被治疗的对象是被诊断为患有癫痫(例如，TLE)或处于发展癫痫的风险中的对象。可使用所公开的方法和组合物治疗的对象包括例如已经接受过一种或更多种与癫痫治疗相关的先前治疗干预的对象或者没有接受过用于治疗癫痫的先前治疗干预的对象。
本公开内容的抑制性RNA物质可以以有效产生以下一种或更多种(例如，2种或多种、3种或多种、4种或多种)的量和时间施用：(a)降低对象细胞中Grik2 mRNA和/或GluK2蛋白的水平，(b)延迟病症的发作，(c)提高对象的存活，(d)提高对象的无进展存活，(e)GluK2蛋白功能恢复或改变，(f)降低癫痫发作复发的风险；(g)降低CNS中的兴奋性毒性和相关的神经元细胞死亡；(h)恢复CNS中受影响区域(例如海马体)的生理兴奋-抑制平衡；和/或(i)减轻一种或更多种癫痫症状(例如，癫痫发作的频率、持续时间或强度、无力、失神、突然意识模糊、理解言语或产生言语困难、认知障碍、活动能力受损、头晕或失去平衡或协调、麻痹和情绪失调)。
因此，本公开内容涉及用于在有此需要的对象中治疗癫痫(例如，TLE)的方法，其中该方法包括施用有效量的载体，该载体包含编码特异性结合Grik2 mRNA并抑制对象中GluK2蛋白表达的抑制性RNA(例如，ASO，例如如siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)。具体地，本发明提供了在有此需要的对象中治疗癫痫的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文中公开的抑制性RNA物质或编码其的核酸载体。
待利用所公开的方法和组合物治疗的癫痫可以是TLE(例如，mTLE或lTLE)、良性中央回癫痫(benign Rolandic epilepsy)、额叶癫痫、婴儿痉挛症、少年肌阵挛癫痫、少年型失神性癫痫、小儿失神癫痫(类癫痫发作)、热浴性癫痫、伦诺克斯-加斯托综合征(Lennox-Gastaut syndrome)、获得性失语性癫痫(Landau-Kleffner syndrome)、Dravet综合征、进行性肌阵挛性癫痫(progressive myoclonus epilepsy)、反射性癫痫、拉斯马森综合征(Rasmussen's syndrome)、边缘系统癫痫、癫痫持续状态(status epilepticus)、腹性癫痫、大规模双侧肌阵挛(massive bilateral myoclonus)、月经性癫痫、杰克逊癫痫病(Jacksonian seizure disorder)、拉福拉病(Lafora disease)和光敏性癫痫。例如，对象可被诊断患有TLE(例如，mTLE或ILTLE)，例如以局灶性或全身性癫痫发作为特征的TLE。在一些情况下，癫痫可以是慢性癫痫，例如如难治性癫痫(即，药物抗性癫痫，例如药物抗性TLE)。
为了治疗癫痫并改善如本文中所讨论的癫痫发作和癫痫样放电的症状，可通过编码抑制Grik2 mRNA表达的功能性RNA(例如siRNA、shRNA、miRNA或shmiRNA)的载体来部署可用的多核苷酸。
所公开的组合物可以以本领域技术人员确定的合适的量施用。在一些情况下，将rAAV以以下剂量施用：105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝(GC)/对象。在一些实施方案中，将rAAV以以下剂量施用：105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014GC/kg(对象的总重)。
在一些情况下，施用1×1012至5×1014GC。在一些情况下，将1×1012至5×1014GC的固定剂量施用于儿童患者或成年患者。
在一些情况下，剂量通过施用于患者脑脊液(CSF)的GC数目(例如鞘内注射，例如经由枕下穿刺或腰椎穿刺)/克患者脑质量来测量。在一些情况下，施用105、106、107、108、109、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×105个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×106个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×107个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×108个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×109个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×1010个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用5×1010个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×109至1×1011个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用1×10 9至5×10 10个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用2×10 9至9×10 10个基因组拷贝/克患者脑质量。在一些情况下，施用5×109至1×10 11个基因组拷贝/克患者脑质量。在另外的情况下，施用1×10 10至5×10 10个基因组拷贝/克患者脑质量。在另外的实施方案中，施用1×10 10至9×10 10个基因组拷贝/克患者脑质量。患者(对象)的脑重量估计是通过MRI脑体积测定获得的，该脑体积被转换为脑质量并用于计算所施用药物的精确剂量。脑重量也可以使用公开的数据库根据年龄范围进行估计。
任选地，所公开的药剂可作为适合递送至对象的可药用组合物的一部分来施用，如本文中所述。所公开的药剂以足以提供期望剂量和/或引起治疗有益作用的量包含在这些组合物中，如本领域技术人员可以容易地确定的。
本文中所述公开的组合物可以以足以治疗对象或实现上述结局之一(例如，在对象中减轻疾病的一种或更多种症状)的量(例如，有效量)和时间来施用。所公开的组合物可施用一次或多于一次。所公开的组合物可以每日一次、每日两次、每日三次、每两天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每年两次或每年一次施用。治疗可以是离散的(例如，注射)或连续的(例如，通过植入物或输注泵的治疗)。根据用于治疗的组合物和施用途径，可在施用本公开内容的组合物之后1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长，评价对象的治疗效力。本文中公开了评价治疗效力的方法(参见例如“药物用途”)。根据评价的结局，可以继续或停止治疗，可以改变治疗频率或剂量，或者可用不同的公开的组合物治疗患者。取决于所治疗的疾病或病症的严重性和性质，可对对象进行不连续的一段时间(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)的治疗，或者直到疾病或病症得到缓解，或者治疗可以慢性的。例如，如果初始或后续轮次的治疗未引起治疗益处(例如，本文中公开的任一种症状的减轻或对象患病脑区域中Grik2 mRNA或GluK2蛋白水平的降低)，则可对诊断患有TLE并用本文中公开的组合物治疗的对象给予一种或更多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)另外的治疗。
试剂盒
本公开内容还提供了试剂盒，其包含本文中公开的组合物，其抑制对象中Grik2基因的表达(例如，靶向Grik2mRNA的抑制性RNA)，用于预防或治疗癫痫(例如，TLE，例如难治性TLE)。试剂盒可任选地包含用于将组合物递送至对象的装置或药剂。在另一些实例中，试剂盒可包含一个或更多个无菌施用器(applicator)，例如注射器或针头。此外，试剂盒可任选地包括其他药剂，例如麻醉剂或抗生素。试剂盒还可包括指导试剂盒的使用者(例如医师)来进行本文中公开的方法的包装说明书。
实施例
提出以下实例以向本领域普通技术人员提供对本文描述的组合物和方法可如何使用、制备和评价的描述，并且旨在仅作为本公开内容的示例，而并不旨在限制本发明人认为的其公开内容的范围。
实施例1：靶向Grik2mRNA的抑制性多核苷酸的设计和合成
Grik2-靶向抑制性多核苷酸序列基于其与人Grik2 mRNA(例如，SEQ ID NO:164的Grik2 mRNA序列)的预测互补性来设计并且根据本领域已知的方法合成。抑制性多核苷酸包含茎环序列，该茎环序列包含与Grik2mRNA的区域特异性杂交的反义指导链序列和与指导链基本上互补的有义随从链序列。可将抗Grik2茎环序列转染到人神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y或鼠N2A神经元细胞系中。可将总RNA提取，并进行小RNA测序，以量化指导链和随从链的水平，并确定Drosha和Dicer切割位点。为了测量Grik2敲低效力，可将构建体与人Grik2cDNA共转染到HEK293细胞中，可提取mRNA，并对Grik2mRNA进行实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)。另外，可将经合成的茎环RNA转染到SHSY5Y细胞中，然后进行mRNA提取和Grik2 RT-qPCR。
实施例2：通过施用编码一种或更多种靶向Grik2 mRNA的抑制性多核糖核苷酸的病毒载体来在人对象中治疗癫痫
可用本文中所述的组合物治疗被诊断患有癫痫(例如，TLE，例如如mTLE或ITLE)的对象，例如人对象(例如，儿童或成人对象)，以减轻一种或更多种癫痫症状，所述癫痫症状包括但不限于以下的一种或更多种(例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种)：(a)癫痫发作复发的风险；(b)减少CNS中的兴奋性毒性和相关的神经元细胞死亡；(c)恢复CNS的受影响区域的生理兴奋-抑制平衡；(d)一种或更多种癫痫症状的减轻(例如癫痫发作的频率、持续时间或强度、无力、失神、突然意识模糊、理解言语或产生言语困难、认知障碍、活动能力受损、头晕或失去平衡或协调、麻痹和情绪失调)，以及(e)海马体中齿状回颗粒细胞的复发苔藓纤维的病理性出芽。治疗方法可以任选地包括在施用之前诊断或确定对象作为使用本公开内容的组合物进行治疗的候选者。该组合物可包含靶向Grik2 mRNA的抑制性多核苷酸(例如，编码本公开内容的抑制性RNA序列的多核苷酸)或者包含编码其(例如，AAV9载体)的多核苷酸的核酸载体(例如，病毒载体，例如AAV载体，例如具有选自以下任一血清型的AAV载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或慢病毒载体)。示例性的抑制性多核苷酸可与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241的核酸序列中的任一者具有不超过85％(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，100％))的序列同一性，或者它们可具有SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229和238至241中的一个或更多个序列。(也参见图1B至1W、图2B至2Q、图3B至3L、图4B至4F、图5B至5E和图6A至6B的示例性构建体简图)。此外，病毒载体(例如，AAV载体)可并入包含抑制性多核苷酸和促进多核苷酸异源表达的调节序列(例如,如启动子序列)的表达盒(参见表11和12)。
可通过以下任何合适的方式向对象施用组合物：包括例如静脉内、腹膜内、皮下或经皮施用，或通过直接施用至动物的中枢神经系统的方式(例如立体定位、实质内、鞘内或脑室内注射)。该组合物可以以治疗有效量施用，例如以以下剂量施用：剂量为105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个基因组拷贝数(GC)/对象，剂量为105,106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个GC/kg(对象的总重量)，剂量为105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个GC/克患者脑质量。对象的脑重量估计是通过MRI脑体积确定获得的，该脑体积被转换为脑质量并用于计算所施用药物的精确剂量。脑重量也可以使用公开的数据库根据年龄范围进行估计。该物质可以每两个月、每月一次、每两周一次或至少每周一次或多次施用(例如，每周1、2、3、4、5、6或7次或更多)。组合物可与第二治疗方式组合施用，例如第二治疗剂(例如，抗癫痫药物)、手术干预(例如，手术切除、放射外科、伽马刀或激光消融)、迷走神经刺激、深部脑刺激或经颅磁刺激。
组合物可以以足以将以下一种或更多种(例如，2种或多种、3种或多更种、4种或更多种)降低10％或更多(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的量施用于对象：(a)癫痫发作复发的风险；(b)减少CNS中的兴奋性毒性和相关的神经元细胞死亡；(c)恢复CNS的受影响区域的生理兴奋-抑制平衡；(d)一种或更多种癫痫症状的减轻(例如癫痫发作的频率、持续时间或强度、无力、失神、突然意识模糊、理解言语或产生言语困难、认知障碍、活动能力受损、头晕或失去平衡或协调、麻痹和情绪失调)，以及(e)海马体中齿状回颗粒细胞的复发苔藓纤维的病理性出芽。上述癫痫的症状可使用标准方法进行评估，例如神经学检查、脑电图、脑磁图、CT扫描、PET扫描、fMRI扫描、摄像和目视观察。可将施用组合物之前和之后的癫痫症状的测量值进行比较以评价治疗的效力。上述癫痫的症状减轻的发现表明该组合物已成功在对象中治疗癫痫。
图1B至1W、图2B至2Q、图3B至3L、图4B至4F中所示的黑圈中的数字对应于所公开的抗Grik2构建体的设计的不同原理。因此，每个数字指定的基本原理如下：
RISC组装有利于具有5'末端的miRNA链具有更大磨损倾向性或从双链体中释放(Schwarz et al.,Cell 115:199-208(2003)；Khvorova et al.,Cell 115:209-16(2003)；和Medley et al.,Wiley Interdiscip.Rev.RNA 12:e1627(2021))。本文中公开的构建体通过使指导链5'末端处的碱基配对不稳定(引入UA对、UG摆动对、或错配、或缺失一个GC对)来有利于RISC的指导选择。
RISC组装有利于具有5'末端的miRNA链具有更大的磨损倾向性或从双链体中释放。本文中公开的构建体通过在随从链的5’末端处紧固碱基配对(通过在随从链的5’末端处引入GC对)来不利于RISC的随从选择。
将小指导RNA的5'端核苷酸锚定在Argonaute(AGO)蛋白的磷酸盐结合袋中，并无法与其靶RNA进行碱基配对(Medley et al.,Wiley Interdiscip.Rev.RNA 12:e1627(2021)；Ma et al.,Nature 434:666-70(2005)；Parker et al.,Nature 434:663-6(2005)；和Ghildiyal et al.,RNA 16:43-56(2010))。
5'-U是AGO2缔合的最优选核苷酸(Seitz et al.,Silence 2:4(2011)；Franket al.,Nature 465:818-22(2010)；De et al.,Mol.Cell 50:344-55(2013)；和Czech etal.,Nat.Rev.Genet.12:19-31(2011))。引入U作为指导链的第一(5')核苷酸，并引入G或C作为随从链的第一(5')核苷酸，这有利于AGO2缔合。
在指导与其靶mRNA之间引入3'错配会导致哺乳动物细胞中丰富的mRNA的更有效的沉默(De et al.,Mol.Cell 50:344-55(2013)；Bofill-De Ros Methods 103:157-66(2016)；和Amarzguioui et al.,Nucleic Acids Res.31:589-95(2003))。虽然种子区域(指导核苷酸2至8(g2至g8))和指导链的中间区域中的广泛互补性对于AGO2介导的mRNA靶标切割至关重要，但不需要3'末端处的碱基配对。事实上，g18、g19、g20、g21位与靶mRNA处的错配会减弱指导RNA从AGO2中的释放，这是由靶mRNA介导的卸载活性。
指导链和随从链之间的种子区域(指导链第2至8位核苷酸)的错配促进了RISC负载期间随从链的解旋，从而促进RISC成熟(Ghildiyal et al.,RNA 16:43-56(2010)；Tomari et al.,Cell 130:299-308(2007)；Matranga et al.,Cell 123:607-20(2005)；和Kawamata et al.,Nat.
Struct.Mol.Biol.16:953-60(2009))。本文中公开的构建体通过在指导链的种子区域中引入错配来促进指导-RISC复合物成熟，或者通过在随从链的相应区域中将错配转化为配对核苷酸来减少或防止随从-RISC复合物成熟(随从链第2至8位核苷酸)。
引入G-C或U-A碱基配对来替代茎区和环区连接处的U-G摆动，促进Dicer蛋白的切割(Liu et al.,Cell 173:1191-203(2018))。
在临近茎环结构的侧翼区域(即Drosha切割位点)引入GC碱基配对，有利于Drosha进行更高精度的切割。
通过模仿E-miR-124的支架结构在茎区引入配对或错配的碱基对。
实施例3：使用合成抑制性多核苷酸对Grik2 mRNA的体外敲低效力
为了确定使用本公开内容的抑制性多核苷酸的敲低的体外效力，通过IntegratedDNA Technologies合成茎环RNA，并在Nuclease Free Duplex缓冲液中重构。在95℃下孵育2分钟之后获得分子内退火的寡核苷酸并随后逐渐冷却至室温。siRNA阴性对照(siNegative，目录号AM4621)和两个靶向Grik2的阳性对照siRNA(siPositive-1和siPositive-2，目录号4392420和4392420)是从Life Technologies获得的。根据制造商的方案，使用LIPOFECTAMINETMRNAiMAX转染试剂，用10nM退火的茎环RNA寡核苷酸或siRNA转染SH-SY5Y细胞。将不含RNA(仅RNAiMAX)的转染混合物用作进一步的转染对照。将转染以一式四份进行。将细胞进一步在37℃、5％CO2下培养直至转染之后72小时，然后进行细胞裂解和qRT-PCR。将Grik2 mRNA的表达水平相对于肌动蛋白(ACTB)归一化。通过与设置为100％的siNegative对照比较来获得Grik2相对表达水平。
与阴性对照和单独的转染试剂(RNAiMAX)相比，所有测试的茎环RNA寡核苷酸以及阳性对照在SH-SY5Y细胞中均显示Grik2 mRNA敲低(图7)。在转染之后72小时获得统计学上显著的敲低率(剩余mRNA表达的42％至69％)。与miRNA构建体A、C和D相比，测试的构建体维持了Grik2敲低效力。
实施例4：RNA测序表明小鼠神经元中良好的microRNA加工特性。
将茎环序列嵌入内源性microRNA支架(即E-miR-30、E-miRNA-124-3或E-miR-218-1)中，并在编码AAV基因组(pro-AAV)的顺式质粒中的神经元特异性启动子hSyn1的调节控制下进行亚克隆(图5A至5E)。将质粒转染到N2A小鼠神经元细胞中。将小鼠N2A神经母细胞以9.0E4个细胞/孔接种到24孔板中，并在24小时之后，将细胞在250ng质粒和1.2μlLipofectamine 3000/孔的情况下进行转染。在48小时之后，使用Qiagen miRNeasy mini试剂盒分离富集小RNA的RNA，并进行文库制备和小RNA测序。使用来自Perkin Elmer/BIOO的小RNA试剂盒生成微RNA测序文库。测序在MiSeq平台上进行。
通过电穿孔转染SH-SY5Y细胞。总RNA用Trizol提取，并使用来自New EnglandBiolabs(NEB)的试剂盒生成微RNA测序文库。测序在Novogene的HiSeq上进行。
在质粒转染之后，将合理设计的miRNA在小鼠N2A神经元中表达并加工。与亲本序列(构建体A、C和D)相比，合理设计的微RNA构建体表现出改善的指导与随从(G:P)比率(参见表14)。具体地，将构建体A的G:P比率0.8提高至四个合理设计的构建体(构建体#1至4)的11至27的比率，与构建体A相比，所述合理设计的构建体具有一个或更多个修饰。受益于随从的降低以及潜在的miRNA成熟改善，对于构建体#1至4，将指导链水平(总miRNA池中的指导链计数百分比)从0.25％提高至1.3至2.6％。在构建体#39、#40和#41中，将构建体C的G:P比率1和指导水平2.8％分别提高至100以上和5％至21％。相对于构建体D的G:P比率1，构建体#50和#51表现出高于2000的改善的G:P比率。最后，将构建体#51指导水平提高至5.1％。
使用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y观察到类似的结果。原始构建体和重新设计的构建体二者中GI的G/P比均比N2A细胞中观察到的高。这可能是由于两个细胞系统中生物发生/降解稳态的差异，或者可能是由于用于测序文库制备的试剂盒不同。
表14.提高指导/随从比率
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选择两种重新设计的构建体#3(GI，E-miR-30a)和#51(MW，E-miR218-1)，并将其以两种不同的顺序串联在两个构建体#100(图6A，SEQ ID NO:256)和#101(图6B，SEQ ID NO:257)中。在N2细胞中，与单个构建体#102(图5B)和#103(图5C)相比，在两个多联体构建体中观察到强烈的簇效应，伴随MW增强和GI抑制。然而，由任一多联体产生的GI和MW的总产量比在携带填充序列的单个构建体中单独产生的GI和MW高(表15)。
表15.N2A细胞中重新设计的多联体构建体的测序分析
构建体(在质粒中) GI G:P GI％* MW G:P MW％*
#102(#3和填充,SEQ ID:252)) 37.4 0.7％
#103(#51和填充，SEQ ID:253) 375.0 0.8％
#100(#3+#51和填充，SEQ ID:256) 26.8 0.1％ 581.0 2.4％
#101(#51+#3和填充，SEQ ID:257) 61.8 0.4％ 690.0 6.9％
*指导计数/总miRNA池
从原始的四个构建体(构建体A(表16)、构建体B(表17)、构建体C(表18)和构建体D(表19)中产生42个另外的重新设计。为了降低转染和测序样品的数目，在N2A细胞中进行2至3个质粒的共转染(例如表16、17和18中构建体#7、#42和#27的共转染)，随后进行小RNA测序。这些重新设计的大多数相对于原始构建体表现出提高的指导/随从比率。具体地，包含G9指导的构建体B(其表现出低于0.01的指导/随从比率)通过导致构建体#36(其表现出90.5的指导/随从比率)的改变而显著地提高(表17)。在hsa-mir-30a支架中编码GI的四个重新设计表现出提高的100以上的指导/随从比率(表16)。由于与样品中的质粒共转染，每个重新设计构建体的总miRNA池中的指导百分比可能被低估。
表16.来自构建体A的hsa-mir-30a支架中对于GI的重新设计
*指导计数/总miRNA池
构建体#19、#20、#21和#22具有与表中#11和#13接近的重新设计特征，并且未在质粒转染和小RNA测序分析中进行实验测试。
表17.来自构建体B的hsa-mir-124-3支架中的对于G9的重新设计
构建体 指导％* G/P比率 共转染中的质粒数
B 0.24％ 0.0038 1
#25 1.3％ 1.6 3
#26 1.0％ 0.64 3
#27 1.0％ 1.1 3
#28 0.44％ 0.2 3
#29 0.49％ 0.3 3
#30 0.48％ 0.16 3
#35 0.22％ 3.7 3
#36 0.65％ 90.5 2
*指导计数/总miRNA池
表18.来自构建体C的hsa-mir-124-3支架中的对于MW的重新设计
构建体 指导％* G/P比率 共转染中的质粒数
C 1.7％ 0.63 1
#39 17.9％ 99 1
#40 11.7％ 无随从 1
#42 14.3％ 838 3
#43 10.3％ 75 3
#44 11.5％ 782 3
#45 13.1％ 666 3
#46 17.6％ 271 3
#47 12.4％ 1947 3
#48 9.7％ 60 3
#49 7.5％ 393 3
*指导计数/总miRNA池
表19.来自构建体D的hsa-mir-218-1支架中的对于MW的重新设计
*指导计数/总miRNA池
实施例5：在用编码重新设计的多联体的AAV9载体处理之后，小鼠皮质神经细胞中的GLUK2蛋白显著减少。
为了收集蛋白质，制备来自P0-P1 C57Bl6/J小鼠的解离皮质神经元，并将神经元以每孔5.5e+5个细胞的浓度接种到六孔板中。在平板接种之后两或三天(体内日，DIV2-3)，将一半培养基除去，并添加MOI 7.5E+4的病毒。在DIV 13，将小鼠神经元培养物裂解，并将裂解物用于SDS PAGE和免疫印迹。对于免疫染色，施加以下抗体：将兔抗GluK2/3(克隆NL904-921；Merck-Millipore)和小鼠抗β肌动蛋白(A5316；Sigma)用作一抗，并将山羊中产生的适当的800nm荧光团缀合的二抗(IRDye 800山羊抗小鼠Li-COR 926-32210或IRDye 800山羊抗兔Li-COR 926-32211)用作二抗。通过在Li-COR上在800nm处读取来检测靶蛋白。使用Empiria studio软件进行分析。为了量化，将每个泳道的荧光信号强度通过β肌动蛋白表达来归一化，并随后通过对照条件来归一化。
为了收集RNA和通过茎环RT-qPCR的miRNA量化，将小鼠皮质培养物在冰冷的PBS中在DIV 13冲洗，并随后刮入700μl Qiazol(QIAGEN)种。使用miRNeasy微型试剂盒(QIAGEN217004)提取总RNA。通过NANODROPTMOne分光光度计(Thermofischer)评估总RNA含量和样品品质。使用TaqMan微RNA逆转录试剂盒和针对GI或MW序列的逆转录引物，将20ng总RNA或合成寡RNA(103–109拷贝)逆转录为cDNA，随后使用TAQMANTM快速通用qPCR主混合物和对GI或MW具有特异性的qPCR引物/探针进行qPCR。样品中GI或MW的拷贝是根据用合成GI或MW寡RNA建立的标准曲线计算的。
结果
与单一构建体载体(#102，SEQ ID NO:252；#103,SEQ ID NO:253)相比，多联体载体#100和#101(分别为SEQ ID NO:256和257)产生GI和MW二者，并因此在MCN细胞中产生更高水平的治疗性miRNA(图8A)。簇效应可能存在，因为当在同一转录本中与GI串联时，MW表达显示增强。阴性对照AAV9 RNAnull载体(Ctrl)在载体基因组中携带填充序列，但不包含任何miRNA构建体。一致地，在用多联体载体#100和#101处理的MCN样品中观察到显著的GLUK2降低，但在单个构建体载体中没有观察到(FIG.8B)。
实施例6：在用编码重新设计的多联体的AAV9载体处理之后，人GlutaNeuron细胞中的Grik2转录物显著地减少。
将iPSC诱导的GlutaNeurons(Fujifilm Cat.R1034)解冻，并将细胞以2E+6个细胞/孔的密度接种到PLO/Matrigel包被的6孔板中。在24小时之后，将AAV9载体#100或RNA null载体#106(SEQ ID NO:262)以3E+5的MOI添加至2mL新鲜培养基中的细胞中(每个条件n＝4)。在转导之后11天，通过添加Qiazol裂解缓冲液以及添加spike-in RNA寡核苷酸(3uL 0.1nM九个寡核苷酸混合物/50,000个细胞)来收获细胞。按照使用QiagenmiRNeasy试剂盒分离大RNA和小RNA/miRNA富集的级分的方案来提取总RNA并富集miRNA。使用来自Perkin Elmer/BIOO的/>小RNA试剂盒生成微RNA测序文库。测序在HiSeq平台(Genewiz)上进行。也制备并测序了RNA-seq文库。
小RNA测序分析表明，将合成的miRNAGI和MW在构建体#100处理的iPSC来源的GlutaNeuron细胞中，以高指导/随从比率在生理活性水平下加工(表20)。在转导效率为50％的情况下，在#100处理的iPSC来源的GlutaNeuron细胞(n＝4)中，Grik2转录物减少18.5％(图9)。9).
表20.使用#100转导的iPSC来源的GlutaNeuron细胞的小RNA测序
实施例7：癫痫发作活性在用多联体载体转导的人海马器官切片中受到抑制。
将人器官切片单独转移至维持在30℃至32℃下的记录室中，并在5μM gabazine(Sigma-Aldrich)的存在下用含氧(95％O2和5％CO2)的ACSF连续灌注(2至3mL/分钟)；ACSF包含(以mM)：NaCl(126.0)、KCl(3.5),NaH2PO4(1.2)、NaHCO3(26)、MgCl2(1.3)、CaCl2(2.0)和葡萄糖(10)，pH约7.4(Sigma-Aldrich)。使用放置在齿状回颗粒细胞层中的单极镍铬合金线进行局部场电位(Local field potential，LFP)记录。使用DAM-80放大器进行记录(低滤波器，0.1Hz；高通滤波器，3KHz；World Precision Instruments，Sarasota，FL)；数据用Digidata 1440A(Molecular Devices)数字化(20kHz)至计算机，并使用Clampex 10.1软件(PClamp,Molecular Devices)采集。使用Clampfit 9.2(PClamp)和MiniAnalysis 6.0.1(Synaptosoft,Decatur,GA)离线分析信号。
结果
多联体载体#100(将载体图绘制在图14中)在4-AP/gabazine存在的过度兴奋状态下(图10A)和在生理条件下(图10B)抑制离体TLE海马体的自发性癫痫发作。
实施例8：毛果芸香碱癫痫小鼠模型的生理和行为研究表明癫痫症状的改善。
AAV施用
将先前因全身注射毛果芸香碱至少两个月而致癫痫的雄性瑞士小鼠置于立体定位框架中。钻四个孔以将AAV9双侧注射到海马体的背侧和腹侧齿状回。将一定体积的包含AAV的溶液以0.2μl/分钟的速度缓慢输注(1.0μL 2.5e8个GC/注射位点，两个注射位点/半球，因此5e8个GC/半球以及1e9/脑)。
兴奋性运动
在AAV注射之前1周和注射之后2周评价癫痫小鼠(在SE之后>2个月)的运动(图11A)。还评价了非癫痫小鼠(野生型瑞士雄性小鼠，18至21周龄)的运动。在实验之前1天将小鼠转移至行为分析室以习惯环境；将小鼠在室温(20至22℃)下保持在9:00至18:00的光/暗循环中，可随意获取食物和水。随后将与测试动物接触的所有物质用乙酸洗涤，以防止嗅觉提示。首先，用旷场试验来测试自发探索行为(Müller et al.,2009)。简言之，将小鼠放置到50×50×50cm蓝聚氯乙烯盒的中心，持续10分钟，并用与跟踪软件EthoVision Color(Noldus,The Netherlands)连接的摄像机记录轨迹；分析在10分钟探索期间小鼠的速度和行进的总距离。
EEG电极植入和记录
在AAV注射之后3周，将经处理的小鼠用一深度线电极植入。手术在异氟醚麻醉下进行。将电极立体定位地放置到齿状回(dentate gyrus，DG)中(来自前囟点的Paxinos和Watson坐标：AP-2.55mm,ML+1.65mm,DV-2.25mm)。将另外的螺钉放置于小脑上方，用作接地电极。将电极和螺钉用牙科水门汀固定在颅骨上。在恢复期间，在24小时和48小时之后向动物给予5mg/kg s.c.卡洛芬
使用遥感勘测系统(Data Sciences International,St.Paul,MN)监测EGG(放大(1000×)、以0.16至97Hz通道(pass)过滤、以500Hz采集)，持续5天，24小时/天。
海马内EEG迹线表示插入到DG中的电极与位于小脑上方的电极之间的电位差。
小RNA测序分析
在四周之后，将动物处死，切除海马并速冻。在裂解之后，通过使用DNA/RNA微型试剂盒(Qiagen，REF#80204)从相同的小鼠海马组织中提取总RNA。在GenomeScan中，使用具有用于Illumina(NOVA-5132-22)的UDI的/>SmallRNA-seq v3试剂盒，将添加有spike-ins RNA寡核苷酸混合物(4500个分子/10pg总RNA)的400ng总RNA用于文库制备。使用Ampure珠尺寸选择去除可能的适配子二聚体。根据制造商的方案使用NovaSeq6000进行聚类和DNA测序。
结果
在1e9个GC/脑的测试剂量下，构建体#100和构建体#101有效减少体内毛果芸香碱模型中的兴奋性运动表型(图11A)。所有其他构建体，包括RNA null对照构建体(#106)和两个单一构建体，在治疗之后均没有减少兴奋性运动。EEG评估进一步表明，与对照相比，构建体#100和构建体#101有效减少平均癫痫发作次数/天(图11B)。基于这些结果，构建体#100和构建体#101中存在的用一个启动子驱动两种miRNA表达的多联体设计显示出比构建体#102和构建体#103中存在的用一个启动子驱动一种miRNA表达的单一设计更有效。
三名操作员对五种动物行为(筑巢、摇动、除去毛发(hairs)、移动和运动)进行独立评分。与用RNA null对照载体#106处理的毛果芸香碱诱导的癫痫小鼠相比，用Grik2靶向载体处理的小鼠的行为得到改善，其中构建体#100显示出最显著的作用(图11C)。
通过小RNA测序分析测量从双侧注射到小鼠海马中的构建体#100AAV9载体表达和加工的GI和MW的拷贝总数。在两个海马中分别确定了392.2拷贝和573.1拷贝的GI每10pg总RNA(平均量/细胞)、1331.3拷贝和2138.8拷贝的MW每10pg总RNA(平均量/细胞)(表21)。miRNA的分子处于生理活性范围内。GI和MW二者的指导/随从比率均高于100，这表明随从链少于5拷贝/10pg并且低于生理活性水平。
表21.用多联体#100处理的两个海马的小RNA测序
为了进一步评估这些微RNA构建体在减轻毛果芸香碱癫痫小鼠的脑中癫痫症状方面的有效性，在进行剂量响应研究之后，将注射剂量修正为2.5×109个GC/注射位点，2个注射位点/半球，从而产生5×109个GC/半球以及1×1010个GC/脑(图12A和12B)。再次，构建体#100被证明有效减少体内兴奋性运动和减少癫痫发作活性二者。在独立的剂量响应研究中，与RNA null对照载体相比，在用最高剂量1E+9和1E+10/脑的载体#100处理的毛果芸香碱小鼠中观察到兴奋性运动表型的剂量依赖性减少(图13A)和癫痫发作减少(图13B)。
其他实施方案
在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下，本公开内容所述的多种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合具体实施方案描述了本公开内容，但是应当理解，所要求保护的本公开内容不应不适当地受限于这样的具体实施例。实际上，对于本领域技术人员显而易见的是，用于实施本公开内容的所述方式的各种修改均在本公开内容的范围内。
其他实施方案在权利要求的范围内。
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贯穿本申请，多种参考文献描述了本公开内容所属的现有技术。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开内容：
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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tgcaacaggc actagacatg g 21
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
tgcaatgggc actagacatg gg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
tacaacaggc actagacatg gg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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tacaatgggc actagacatg gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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tacaatgggc actagacatg g 21
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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tcgcacattc atcagctatg gtaa 24
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<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
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cagtcggctg agcgcagcgc ccccgccctg cccgccacgc ggcgaagacg cctgagcgtt 120
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ctggcgt 487
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
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ctggcgt 487
<210> 99
<211> 487
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<211> 487
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
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<211> 487
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 117
tagagcattg cagatggacc gc 22
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
<400> 118
tagagcattg cagatggacc gc 22
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
tagagcattg cagatggacc gc 22
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
tagagcattg cagatggacc gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
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<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
gcagtccatc tacaacactc tg 22
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
gaggttcatc tacaacactt ta 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
gaggtccatc tacaacactt ta 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
gcagtttatc tacaacactc tg 22
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
gaagtccatc tacaacactc tg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
gaagtttatc tacaacactc tg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
gaagtttatc tacaacactc ta 22
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
gaggttcatc tacaacactc ta 22
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
gaggtttatc tacaacactc ta 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
gaggtccatc tacaacactc ta 22
<210> 132
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
gcggtccatc tacaacactt ta 22
<210> 133
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgcaga gcattgcaga 120
tggactgggt tgcgaggtat gagtaaacag tccatacgca atgctccgtg gaacgtcacg 180
cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct gtctctttct 240
acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg tg 292
<210> 134
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgtaga gcattgcaga 120
tggcccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg gccatacgca atgctccatg gaacgtcacg 180
cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct gtctctttct 240
acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg tg 292
<210> 135
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgtaga gcattgcaga 120
tggaccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg tccatacgca atgctccatg gaacgtcacg 180
cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct gtctctttct 240
acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg tg 292
<210> 136
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgcaga gcattgcaga 120
tggcccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg gccatacgca atgctccgtg gaacgtcacg 180
cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct gtctctttct 240
acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg tg 292
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acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgcaga gcattgcaga 120
tggaccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg tccatacgca atgctccgtg gaacgtcacg 180
cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct gtctctttct 240
acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg tg 292
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<212> DNA
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acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgtaga gcattgcaga 120
tggactgggt tgcgaggtat gagtaaacag tccatacgca atgctccatg gaacgtcacg 180
cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct gtctctttct 240
acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg tg 292
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<212> DNA
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<220>
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cagtccatac gcaatgctcc a 21
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 151
Met Lys Ile Ile Phe Pro Ile Leu Ser Asn Pro Val Phe Arg Arg Thr
1 5 10 15
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Pro Met Gly Ala Glu Glu Leu Ala Phe Arg Phe Ala Val Asn Thr Ile
50 55 60
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Gln Lys Ile Asn Leu Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Ser Lys Lys Ala Cys
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Ser Ser Ala Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu Gly Val Pro
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130 135 140
Phe Tyr Val Ser Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Ser Leu Ser Arg Ala Ile
145 150 155 160
Leu Asp Leu Val Gln Phe Phe Lys Trp Lys Thr Val Thr Val Val Tyr
165 170 175
Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu Ile Lys Ala Pro
180 185 190
Ser Arg Tyr Asn Leu Arg Leu Lys Ile Arg Gln Leu Pro Ala Asp Thr
195 200 205
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210 215 220
His Val Ile Phe Asp Cys Ser His Glu Met Ala Ala Gly Ile Leu Lys
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Gln Ala Leu Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr Tyr His Tyr Ile Phe
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275 280 285
Val Ser Ser Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu Gln Ala Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
Gln Lys Ile Asn Leu Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Ser Lys Lys Ala Cys
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100 105 110
Ser Ser Ala Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu Gly Val Pro
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Phe Tyr Val Ser Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Ser Leu Ser Arg Ala Ile
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Leu Asp Leu Val Gln Phe Phe Lys Trp Lys Thr Val Thr Val Val Tyr
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325 330 335
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340 345 350
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405 410 415
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Leu Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu Glu Pro Tyr Val Leu Phe Lys Lys
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465 470 475 480
Arg Leu Val Glu Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln Asp Asp Ala Asn Gly
485 490 495
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500 505 510
Ala Val Ala Pro Leu Ala Ile Thr Tyr Val Arg Glu Lys Val Ile Asp
515 520 525
Phe Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Tyr Arg Lys
530 535 540
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Pro Asp Ile Trp Met Tyr Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Gly Val Ser Cys
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595 600 605
Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Gln Gln Gly Ser
610 615 620
Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly Ile Trp
625 630 635 640
Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala
645 650 655
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675 680 685
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Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Arg Gln Ser Val Leu Val Lys Ser
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725 730 735
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Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Glu Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu Gly
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Val Gln Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu Val
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Leu Ser Val Phe Val Ala Val Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Lys Lys
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Asn Ala Gln Leu Glu Lys Glu Ser Ser Ile Trp Leu Val Pro Pro Tyr
850 855 860
His Pro Asp Thr Val
865
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
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1 5 10 15
Val Lys Leu Leu Leu Cys Leu Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Gln Gly Thr
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 156
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<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 158
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<210> 159
<211> 869
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 159
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435 440 445
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450 455 460
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Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser Ala Asp
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Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Glu Asp Gly
675 680 685
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690 695 700
Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Arg Gln Ser Val Leu Val Lys Ser
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Asn Glu Glu Gly Ile Gln Arg Val Leu Thr Ser Asp Tyr Ala Phe Leu
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Pro Met Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala Ile Leu Gln
770 775 780
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785 790 795 800
Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Glu Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu Gly
805 810 815
Val Gln Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu Val
820 825 830
Leu Ser Val Phe Val Ala Val Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Lys Lys
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Asn Ala Gln Leu Glu Lys Glu Ser Ser Ile Trp Leu Val Pro Pro Tyr
850 855 860
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865
<210> 160
<211> 908
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 160
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Asn Arg Asn Arg Thr Leu Leu Pro Asn Thr Thr Leu Thr Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Gln Lys Ile Asn Leu Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Ser Lys Lys Ala Cys
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100 105 110
Ser Ser Ala Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu Gly Val Pro
115 120 125
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130 135 140
Phe Tyr Val Ser Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Ser Leu Ser Arg Ala Ile
145 150 155 160
Leu Asp Leu Val Gln Phe Phe Lys Trp Lys Thr Val Thr Val Val Tyr
165 170 175
Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu Ile Lys Ala Pro
180 185 190
Ser Arg Tyr Asn Leu Arg Leu Lys Ile Arg Gln Leu Pro Ala Asp Thr
195 200 205
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210 215 220
His Val Ile Phe Asp Cys Ser His Glu Met Ala Ala Gly Ile Leu Lys
225 230 235 240
Gln Ala Leu Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr Tyr His Tyr Ile Phe
245 250 255
Thr Thr Leu Asp Leu Phe Ala Leu Asp Val Glu Pro Tyr Arg Tyr Ser
260 265 270
Gly Val Asn Met Thr Gly Phe Arg Ile Leu Asn Thr Glu Asn Thr Gln
275 280 285
Val Ser Ser Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu Gln Ala Pro
290 295 300
Pro Lys Pro Asp Ser Gly Leu Leu Asp Gly Phe Met Thr Thr Asp Ala
305 310 315 320
Ala Leu Met Tyr Asp Ala Val His Val Val Ser Val Ala Val Gln Gln
325 330 335
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355 360 365
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675 680 685
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690 695 700
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<210> 161
<211> 908
<212> PRT
<213> 恒河猴（M. mulatta）
<400> 161
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<210> 162
<211> 908
<212> PRT
<213> 恒河猴
<400> 162
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1 5 10 15
Val Lys Leu Leu Leu Cys Leu Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Gln Gly Thr
20 25 30
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35 40 45
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Gln Gln Gly Ser
610 615 620
Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly Ile Trp
625 630 635 640
Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala
645 650 655
Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser Ala Asp
660 665 670
Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Glu Asp Gly
675 680 685
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690 695 700
Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Arg Gln Ser Val Leu Val Lys Ser
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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785 790 795 800
Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Glu Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu Gly
805 810 815
Val Gln Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu Val
820 825 830
Leu Ser Val Phe Val Ala Val Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Lys Lys
835 840 845
Asn Ala Gln Leu Glu Lys Arg Ser Phe Cys Ser Ala Met Val Glu Glu
850 855 860
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865 870 875 880
Ala Pro Val Ile Val Lys Thr Glu Glu Val Ile Asn Met His Thr Phe
885 890 895
Asn Asp Arg Arg Leu Pro Gly Lys Glu Thr Met Ala
900 905
<210> 163
<211> 908
<212> PRT
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 163
Met Lys Ile Ile Ser Pro Val Leu Ser Asn Leu Val Phe Ser Arg Ser
1 5 10 15
Ile Lys Val Leu Leu Cys Leu Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Gln Gly Thr
20 25 30
Thr His Val Leu Arg Phe Gly Gly Ile Phe Glu Tyr Val Glu Ser Gly
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Pro Met Gly Ala Glu Glu Leu Ala Phe Arg Phe Ala Val Asn Thr Ile
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115 120 125
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130 135 140
Phe Tyr Val Ser Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Ser Leu Ser Arg Ala Ile
145 150 155 160
Leu Asp Leu Val Gln Phe Phe Lys Trp Lys Thr Val Thr Val Val Tyr
165 170 175
Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu Ile Lys Ala Pro
180 185 190
Ser Arg Tyr Asn Leu Arg Leu Lys Ile Arg Gln Leu Pro Ala Asp Thr
195 200 205
Lys Asp Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu Met Lys Arg Gly Lys Glu Phe
210 215 220
His Val Ile Phe Asp Cys Ser His Glu Met Ala Ala Gly Ile Leu Lys
225 230 235 240
Gln Ala Leu Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr Tyr His Tyr Ile Phe
245 250 255
Thr Thr Leu Asp Leu Phe Ala Leu Asp Val Glu Pro Tyr Arg Tyr Ser
260 265 270
Gly Val Asn Met Thr Gly Phe Arg Ile Leu Asn Thr Glu Asn Thr Gln
275 280 285
Val Ser Ser Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu Gln Ala Pro
290 295 300
Pro Lys Pro Asp Ser Gly Leu Leu Asp Gly Phe Met Thr Thr Asp Ala
305 310 315 320
Ala Leu Met Tyr Asp Ala Val His Val Val Ser Val Ala Val Gln Gln
325 330 335
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Leu Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu Glu Pro Tyr Val Leu Phe Lys Lys
435 440 445
Ser Asp Lys Pro Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe Glu Gly Tyr Cys Ile
450 455 460
Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ser Thr Ile Leu Gly Phe Thr Tyr Glu Ile
465 470 475 480
Arg Leu Val Glu Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln Asp Asp Val Asn Gly
485 490 495
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His Pro Cys Asn Pro Asp Ser Asp Val Val Glu Asn Asn Phe Thr Leu
595 600 605
Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Arg Gln Gly Ser
610 615 620
Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly Ile Trp
625 630 635 640
Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala
645 650 655
Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser Ala Asp
660 665 670
Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Glu Asp Gly
675 680 685
Ala Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser Thr Tyr Asp Lys
690 695 700
Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Arg Gln Ser Val Leu Val Lys Ser
705 710 715 720
Asn Glu Glu Gly Ile Gln Arg Val Leu Thr Ser Asp Tyr Ala Phe Leu
725 730 735
Met Glu Ser Thr Thr Ile Glu Phe Val Thr Gln Arg Asn Cys Asn Leu
740 745 750
Thr Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Val Gly Thr
755 760 765
Pro Met Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala Ile Leu Gln
770 775 780
Leu Gln Glu Glu Gly Lys Leu His Met Met Lys Glu Lys Trp Trp Arg
785 790 795 800
Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Glu Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu Gly
805 810 815
Val Gln Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu Val
820 825 830
Leu Ser Val Phe Val Ala Val Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Lys Lys
835 840 845
Asn Ala Gln Leu Glu Lys Arg Ser Phe Cys Ser Ala Met Val Glu Glu
850 855 860
Leu Arg Met Ser Leu Lys Cys Gln Arg Arg Leu Lys His Lys Pro Gln
865 870 875 880
Ala Pro Val Ile Val Lys Thr Glu Glu Val Ile Asn Met His Thr Phe
885 890 895
Asn Asp Arg Arg Leu Pro Gly Lys Glu Thr Met Ala
900 905
<210> 164
<211> 4592
<212> DNA
<213> 智人
<400> 164
gctcgcgcgg ccggacattg tgggtgtgcg tgctggattt ctcccggatg ctctccgact 60
aacatggatg tcccaccatt ccttgcagtg gaaggttgtt ccttggcgca gtgagtgaag 120
aacatgcagc gattgctaat gggtttggga agcggagact ccttcctctc tctatgacca 180
tgccgtgatc gtgtctgcgg tcaccactcg acgcatcctc atttctaccc gaacccagga 240
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ggacttggga tccatccagt ggcctgaata tgacagaaag tcagaaaggg aagccagcaa 1680
atattacaga ttcattgtct aatcgttctt tgattgttac caccattttg gaagaaccat 1740
atgtcctgtt taagaagtct gacaaacctc tctatgggaa tgatcgattt gaaggctact 1800
gtattgatct tctacgagag ttatctacaa tccttggctt tacatatgaa attaggcttg 1860
tggaggatgg gaaatatgga gcccaggatg atgtgaatgg acaatggaat ggaatggttc 1920
gtgagctaat tgatcataaa gctgaccttg cagttgctcc actggctatt acctatgttc 1980
gtgagaaggt catcgacttt tcaaagccgt ttatgactct tggaataagt attttgtacc 2040
gcaagcccaa tggtacaaac ccaggcgtct tctccttcct gaatcctctc tcccctgata 2100
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gttctgagct catgcccaaa gcactctcca ccaggatagt gggaggcatt tggtggtttt 2340
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tatacaaatc caaaaaaaac gctcaattgg aaaagaggtc cttctgtagc gccatggtgg 3000
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tattgcta 10568
<210> 169
<211> 10655
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 169
acttgcgctc tcgctggcgg ctgcgtggcc gaggctggga gcccgggact tcccgctgaa 60
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 170
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accctctggt aacgaaacga acagattacc gtttaacatt tcttcatctt catactgctc 120
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<213> 恒河猴
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<212> DNA
<213> 智人
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acccgctgga agcaccaggt gtcagacaac aaagattcct tctatgtcag tctctaccca 360
gacttctctt cactcagccg tgccatttta gacctggtgc agtttttcaa gtggaaaacc 420
gtcacggttg tgtatgatga cagcactggt ctcattcgtt tgcaagagct catcaaagct 480
ccatcaaggt ataatcttcg actcaaaatt cgtcagttac ctgctgatac aaaggatgca 540
aaacccttac taaaagaaat gaaaagaggc aaggagtttc atgtaatctt tgattgtagc 600
catgaaatgg cagcaggcat tttaaaacag gcattagcta tgggaatgat gacagaatac 660
tatcattata tctttaccac tctggacctc tttgctcttg atgttgagcc ctaccgatac 720
agtggtgtta acatgacagg gttcagaata ttaaatacag aaaataccca agtctcctcc 780
atcattgaaa agtggtcgat ggaacgattg caggcacctc cgaaacccga ttcaggtttg 840
ctggatggat ttatgacgac tgatgctgct ctaatgtatg atgctgtgca tgtggtgtct 900
gtggccgttc aacagtttcc ccagatgaca gtcagttcct tgcagtgtaa tcgacataaa 960
ccctggcgct tcgggacccg ctttatgagt ctaattaaag aggcacattg ggaaggcctc 1020
acaggcagaa taactttcaa caaaaccaat ggcttgagaa cagattttga tttggatgtg 1080
atcagtctga aggaagaagg tctagaaaag attggaacgt gggatccagc cagtggcctg 1140
aatatgacag aaagtcaaaa gggaaagcca gcgaacatca cagattcctt atccaatcgt 1200
tctttgattg ttaccaccat tttggaagag ccttatgtcc tttttaagaa gtctgacaaa 1260
cctctctatg gtaatgatcg atttgaaggc tattgcattg atctcctcag agagttatct 1320
acaatccttg gctttacata tgaaattaga cttgtggaag atgggaaata tggagcccag 1380
gatgatgcca atggacaatg gaatggaatg gttcgtgaac taattgatca taaagctgac 1440
cttgcagttg ctccactggc tattacctat gttcgagaga aggtcatcga cttttccaag 1500
ccctttatga cacttggaat aagtattttg taccgcaagc ccaatggtac aaacccaggc 1560
gtcttctcct tcctgaatcc tctctcccct gatatctgga tgtatattct gctggcttac 1620
ttgggtgtca gttgtgtgct ctttgtcata gccaggttta gtccttatga gtggtataat 1680
ccacaccctt gcaaccctga ctcagacgtg gtggaaaaca attttacctt gctaaatagt 1740
ttctggtttg gagttggagc tctcatgcag caaggttctg agctcatgcc caaagcactg 1800
tccaccagga tagtgggagg catttggtgg tttttcacac ttatcatcat ttcttcgtat 1860
actgctaact tagccgcctt tctgacagtg gaacgcatgg aatcccctat tgactctgct 1920
gatgatttag ctaaacaaac caagatagaa tatggagcag tagaggatgg tgcaaccatg 1980
acttttttca agaaatcaaa aatctccacg tatgacaaaa tgtgggcctt tatgagtagc 2040
agaaggcagt cagtgctggt caaaagtaat gaagaaggaa tccagcgagt cctcacctct 2100
gattatgctt tcctaatgga gtcaacaacc atcgagtttg ttacccagcg gaactgtaac 2160
ctgacacaga ttggcggcct tatagactct aaaggttatg gcgttggcac tcccatgggt 2220
tctccatatc gagacaaaat taccatagca attcttcagc tgcaagagga aggcaaactg 2280
catatgatga aggagaaatg gtggaggggc aatggttgcc cagaagagga gagcaaagag 2340
gccagtgccc tgggggttca gaatattggt ggcatcttca ttgttctggc agccggcttg 2400
gtgctttcag tttttgtggc agtgggagaa tttttataca aatccaaaaa aaacgctcaa 2460
ttggaaaaga ggtccttctg tagtgccatg gtagaagaat tgaggatgtc cctgaagtgc 2520
cagcgtcggt taaaacataa gccacaggcc ccagttattg tgaaaacaga agaagttatc 2580
aacatgcaca catttaacga cagaaggttg ccaggtaaag aaaccatggc a 2631
<210> 175
<211> 293
<212> DNA
<213> 智人
<400> 175
gctcgcgcgg ccggacattg tgggtgtgcg tgctggattt ctcccggatg ctctccgact 60
aacatggatg tcccaccatt ccttgcagtg gaaggttgtt ccttggcgca gtgagtgaag 120
aacatgcagc gattgctaat gggtttggga agcggagact ccttcctctc tctatgacca 180
tgccgtgatc gtgtctgcgg tcaccactcg acgcatcctc atttctaccc gaacccagga 240
gccgaacgct agatcgggga agtgggtgcc gtgcgtgtgg gcacagaaac acc 293
<210> 176
<211> 1572
<212> DNA
<213> 智人
<400> 176
agctgggagg ccaaacaccc aagcacaaac tgtcgtcttt ttccaaacaa tttagccaga 60
atgtttcctg tggaaatatg caacctgtgc aaaataaaat gagttacctc atgccgctgt 120
gtctatgaac tagagactct gtgatctaag cagttgcaat gatcagactt gatttacaag 180
catcatggat caaccaagtt acacggggtt acactgttaa tcatgggttc ctcccttctt 240
ctgagtgaat gttaacatgc gcattttgtg gctgatttca aatgcagtcc agtgagaaat 300
tacaggttcc ttttgaagct caactgttgc caggagatgg aatatcaatg cccaacaggg 360
caaccaataa aagtgtcact aagaatataa atatttggaa tcagcaaaaa ctgtagtgtt 420
acaggaaaca gtacagtctt ctgaacaccc agatcataga ggtgatgatg ttactagccc 480
ccaactactc agtataatta ttgtctgaat gcaaagtatg tgtttatagg atgtgaaaaa 540
atgtaatgca aaacaaattt gaatcccatg gcagttggaa tataaagcag atgttcatca 600
cttattttcc ttttttcttt tcttattttt ttttttgaca gtctgtgtca ctgattgaga 660
tagaaatgcc aattatcaag gaaataatgt tttcttaagt tccctaaggc agaagattta 720
acatgcaatt ctaccagatc ccttcctatt cccccaacac cttttctcta acccccatat 780
cccaaataat aataataata ataataataa taataataat aataataaaa gcagttggtt 840
cagtgattct gaattaaaag gataatgttt tgcaatgttc aagttgtaaa aactggccga 900
gtattggctg tgtggaagac taaagctttc attctaacat tcagacatag caatccaaac 960
ccttgttcct gctgtaaatg aacttgatgg agcatgggca gatttcagtg atacgagaaa 1020
ggggactggt catctataga aaaatctgtg agagaacttg gaagtggact gcgtttatca 1080
atacagtcac aatgttaaat gaacaaaatt cttgaacagt tttttttcaa aaaatgttca 1140
ggtttatttg tggaaatgca agatttctat gaaaatagtt tttgtatgga aatttttgta 1200
atacttttta tcaacaaaac aagaacatgt gttcctgtca ggggtgtgat gtcaagcatg 1260
aatggtagtg cgtgtgcacc accaacgttt ggtgaaaact atttttatca agaaaaaagg 1320
aatcatagaa gagaaatatt ttcaagttag ataatataaa agctaggtgc actaccacca 1380
ctgcttacca tgccacaccc ctggtttcca cgaggctgac aacatactgt aatgaacaat 1440
tgtgtgtaaa atggtaaaag acacagacct cttgacaaca ttgtgataac agttgagtgc 1500
acacagtttg ctgtttgaat ccaatgcaca aaattaaaaa aaatcattaa aactatgttc 1560
attttacttt ca 1572
<210> 177
<211> 93
<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
atgaagatta ttttcccgat tctaagtaat ccagtcttca ggcgcaccgt taaactcctg 60
ctctgtttac tgtggattgg atattctcaa gga 93
<210> 178
<211> 408
<212> DNA
<213> 智人
<400> 178
gctcgcgcgg ccggacattg tgggtgtgcg tgctggattt ctcccggatg ctctccgact 60
aacatggatg tcccaccatt ccttgcagtg gaaggttgtt ccttggcgca gtgagtgaag 120
aacatgcagc gattgctaat gggtttggga agcggagact ccttcctctc tctatgacca 180
tgccgtgatc gtgtctgcgg tcaccactcg acgcatcctc atttctaccc gaacccagga 240
gccgaacgct agatcgggga agtgggtgcc gtgcgtgtgg gcacagaaac accatgaaga 300
ttattttccc gattctaagt aatccagtct tcaggcgcac cgttaaactc ctgctctgtt 360
tactgtggat tggatattct caaggaacca cacatgtatt aagatttg 408
<210> 179
<211> 168
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
gtggtatttt tgaatatgtg gaatctggcc caatgggagc tgaggaactt gcattcagat 60
ttgctgtgaa cacaattaac agaaacagaa cattgctacc caatactacc cttacctatg 120
atacccagaa gataaacctt tatgatagtt ttgaagcatc caagaaag 168
<210> 180
<211> 258
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
cctgtgatca gctgtctctt ggggtggctg ccatcttcgg gccttcacac agctcatcag 60
caaacgcagt gcagtccatc tgcaatgctc tgggagttcc ccacatacag acccgctgga 120
agcaccaggt gtcagacaac aaagattcct tctatgtcag tctctaccca gacttctctt 180
cactcagccg tgccatttta gacctggtgc agtttttcaa gtggaaaacc gtcacggttg 240
tgtatgatga cagcactg 258
<210> 181
<211> 182
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
gtctcattcg tttgcaagag ctcatcaaag ctccatcaag gtataatctt cgactcaaaa 60
ttcgtcagtt acctgctgat acaaaggatg caaaaccctt actaaaagaa atgaaaagag 120
gcaaggagtt tcatgtaatc tttgattgta gccatgaaat ggcagcaggc attttaaaac 180
ag 182
<210> 182
<211> 54
<212> DNA
<213> 智人
<400> 182
gcattagcta tgggaatgat gacagaatac tatcattata tctttaccac tctg 54
<210> 183
<211> 174
<212> DNA
<213> 智人
<400> 183
gacctctttg ctcttgatgt tgagccctac cgatacagtg gtgttaacat gacagggttc 60
agaatattaa atacagaaaa tacccaagtc tcctccatca ttgaaaagtg gtcgatggaa 120
cgattgcagg cacctccgaa acccgattca ggtttgctgg atggatttat gacg 174
<210> 184
<211> 144
<212> DNA
<213> 智人
<400> 184
actgatgctg ctctaatgta tgatgctgtg catgtggtgt ctgtggccgt tcaacagttt 60
ccccagatga cagtcagttc cttgcagtgt aatcgacata aaccctggcg cttcgggacc 120
cgctttatga gtctaattaa agag 144
<210> 185
<211> 108
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
gcacattggg aaggcctcac aggcagaata actttcaaca aaaccaatgg cttgagaaca 60
gattttgatt tggatgtgat cagtctgaag gaagaaggtc tagaaaag 108
<210> 186
<211> 114
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
attggaacgt gggatccagc cagtggcctg aatatgacag aaagtcaaaa gggaaagcca 60
gcgaacatca cagattcctt atccaatcgt tctttgattg ttaccaccat tttg 114
<210> 187
<211> 207
<212> DNA
<213> 智人
<400> 187
gaagagcctt atgtcctttt taagaagtct gacaaacctc tctatggtaa tgatcgattt 60
gaaggctatt gcattgatct cctcagagag ttatctacaa tccttggctt tacatatgaa 120
attagacttg tggaagatgg gaaatatgga gcccaggatg atgccaatgg acaatggaat 180
ggaatggttc gtgaactaat tgatcat 207
<210> 188
<211> 224
<212> DNA
<213> 智人
<400> 188
aaagctgacc ttgcagttgc tccactggct attacctatg ttcgagagaa ggtcatcgac 60
ttttccaagc cctttatgac acttggaata agtattttgt accgcaagcc caatggtaca 120
aacccaggcg tcttctcctt cctgaatcct ctctcccctg atatctggat gtatattctg 180
ctggcttact tgggtgtcag ttgtgtgctc tttgtcatag ccag 224
<210> 189
<211> 119
<212> DNA
<213> 智人
<400> 189
gtttagtcct tatgagtggt ataatccaca cccttgcaac cctgactcag acgtggtgga 60
aaacaatttt accttgctaa atagtttctg gtttggagtt ggagctctca tgcagcaag 119
<210> 190
<211> 218
<212> DNA
<213> 智人
<400> 190
gttctgagct catgcccaaa gcactgtcca ccaggatagt gggaggcatt tggtggtttt 60
tcacacttat catcatttct tcgtatactg ctaacttagc cgcctttctg acagtggaac 120
gcatggaatc ccctattgac tctgctgatg atttagctaa acaaaccaag atagaatatg 180
gagcagtaga ggatggtgca accatgactt ttttcaag 218
<210> 191
<211> 226
<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
aaatcaaaaa tctccacgta tgacaaaatg tgggccttta tgagtagcag aaggcagtca 60
gtgctggtca aaagtaatga agaaggaatc cagcgagtcc tcacctctga ttatgctttc 120
ctaatggagt caacaaccat cgagtttgtt acccagcgga actgtaacct gacacagatt 180
ggcggcctta tagactctaa aggttatggc gttggcactc ccatgg 226
<210> 192
<211> 251
<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
gttctccata tcgagacaaa attaccatag caattcttca gctgcaagag gaaggcaaac 60
tgcatatgat gaaggagaaa tggtggaggg gcaatggttg cccagaagag gagagcaaag 120
aggccagtgc cctgggggtt cagaatattg gtggcatctt cattgttctg gcagccggct 180
tggtgctttc agtttttgtg gcagtgggag aatttttata caaatccaaa aaaaacgctc 240
aattggaaaa g 251
<210> 193
<211> 1737
<212> DNA
<213> 智人
<400> 193
aggtccttct gtagtgccat ggtagaagaa ttgaggatgt ccctgaagtg ccagcgtcgg 60
ttaaaacata agccacaggc cccagttatt gtgaaaacag aagaagttat caacatgcac 120
acatttaacg acagaaggtt gccaggtaaa gaaaccatgg cataaagctg ggaggccaaa 180
cacccaagca caaactgtcg tctttttcca aacaatttag ccagaatgtt tcctgtggaa 240
atatgcaacc tgtgcaaaat aaaatgagtt acctcatgcc gctgtgtcta tgaactagag 300
actctgtgat ctaagcagtt gcaatgatca gacttgattt acaagcatca tggatcaacc 360
aagttacacg gggttacact gttaatcatg ggttcctccc ttcttctgag tgaatgttaa 420
catgcgcatt ttgtggctga tttcaaatgc agtccagtga gaaattacag gttccttttg 480
aagctcaact gttgccagga gatggaatat caatgcccaa cagggcaacc aataaaagtg 540
tcactaagaa tataaatatt tggaatcagc aaaaactgta gtgttacagg aaacagtaca 600
gtcttctgaa cacccagatc atagaggtga tgatgttact agcccccaac tactcagtat 660
aattattgtc tgaatgcaaa gtatgtgttt ataggatgtg aaaaaatgta atgcaaaaca 720
aatttgaatc ccatggcagt tggaatataa agcagatgtt catcacttat tttccttttt 780
tcttttctta tttttttttt tgacagtctg tgtcactgat tgagatagaa atgccaatta 840
tcaaggaaat aatgttttct taagttccct aaggcagaag atttaacatg caattctacc 900
agatcccttc ctattccccc aacacctttt ctctaacccc catatcccaa ataataataa 960
taataataat aataataata ataataataa taaaagcagt tggttcagtg attctgaatt 1020
aaaaggataa tgttttgcaa tgttcaagtt gtaaaaactg gccgagtatt ggctgtgtgg 1080
aagactaaag ctttcattct aacattcaga catagcaatc caaacccttg ttcctgctgt 1140
aaatgaactt gatggagcat gggcagattt cagtgatacg agaaagggga ctggtcatct 1200
atagaaaaat ctgtgagaga acttggaagt ggactgcgtt tatcaataca gtcacaatgt 1260
taaatgaaca aaattcttga acagtttttt ttcaaaaaat gttcaggttt atttgtggaa 1320
atgcaagatt tctatgaaaa tagtttttgt atggaaattt ttgtaatact ttttatcaac 1380
aaaacaagaa catgtgttcc tgtcaggggt gtgatgtcaa gcatgaatgg tagtgcgtgt 1440
gcaccaccaa cgtttggtga aaactatttt tatcaagaaa aaaggaatca tagaagagaa 1500
atattttcaa gttagataat ataaaagcta ggtgcactac caccactgct taccatgcca 1560
cacccctggt ttccacgagg ctgacaacat actgtaatga acaattgtgt gtaaaatggt 1620
aaaagacaca gacctcttga caacattgtg ataacagttg agtgcacaca gtttgctgtt 1680
tgaatccaat gcacaaaatt aaaaaaaatc attaaaacta tgttcatttt actttca 1737
<210> 194
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 194
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgc 429
<210> 195
<211> 469
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 195
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcc aattgcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcag 469
<210> 196
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 196
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc g 401
<210> 197
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 197
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcagg gcgcgcc 477
<210> 198
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 198
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcc aattgcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcagg gcgcgcc 477
<210> 199
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 199
gatgctgacg aaggctcgcg aggctgtgag cagccacagt gccctgctca gaagccccgg 60
<210> 200
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 200
gtctcccgcg cccgcgcccg tgtcgccgcc gtgcccgcga gcgggagccg gagtcgccgc 60
<210> 201
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 201
cgtgtgcaga tgcagggcgc cggtgccctg cgggtgcggg tgcaggagca gcgtgtgcag 60
<210> 202
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 202
ccccacgcca ccctttctgg tcatctcccc tcccgccccg cccctgcgca cactccctcg 60
<210> 203
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 203
tctccccggt aaagtctcgc ggtgctgccg ggctcagccc cgtctcctcc tcttgctccc 60
<210> 204
<211> 1289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 204
cattatggcc ttaggtcact tcatctccat ggggttcttc ttctgatttt ctagaaaatg 60
agatgggggt gcagagagct tcctcagtga cctgcccagg gtcacatcag aaatgtcaga 120
gctagaactt gaactcagat tactaatctt aaattccatg ccttgggggc atgcaagtac 180
gatatacaga aggagtgaac tcattagggc agatgaccaa tgagtttagg aaagaagagt 240
ccagggcagg gtacatctac accacccgcc cagccctggg tgagtccagc cacgttcacc 300
tcattatagt tgcctctctc cagtcctacc ttgacgggaa gcacaagcag aaactgggac 360
aggagcccca ggagaccaaa tcttcatggt ccctctggga ggatgggtgg ggagagctgt 420
ggcagaggcc tcaggagggg ccctgctgct cagtggtgac agataggggt gagaaagcag 480
acagagtcat tccgtcagca ttctgggtct gtttggtact tcttctcacg ctaaggtggc 540
ggtgtgatat gcacaatggc taaaaagcag ggagagctgg aaagaaacaa ggacagagac 600
agaggccaag tcaaccagac caattcccag aggaagcaaa gaaaccatta cagagactac 660
aagggggaag ggaaggagag atgaattagc ttcccctgta aaccttagaa cccagctgtt 720
gccagggcaa cggggcaata cctgtctctt cagaggagat gaagttgcca gggtaactac 780
atcctgtctt tctcaaggac catcccagaa tgtggcaccc actagccgtt accatagcaa 840
ctgcctcttt gccccactta atcccatccc gtctgttaaa agggccctat agttggaggt 900
gggggaggta ggaagagcga tgatcacttg tggactaagt ttgttcgcat ccccttctcc 960
aaccccctca gtacatcacc ctgggggaac agggtccact tgctcctggg cccacacagt 1020
cctgcagtat tgtgtatata aggccagggc aaagaggagc aggttttaaa gtgaaaggca 1080
ggcaggtgtt ggggaggcag ttaccggggc aacgggaaca gggcgtttcg gaggtggttg 1140
ccatggggac ctggatgctg acgaaggctc gcgaggctgt gagcagccac agtgccctgc 1200
tcagaagccc caagctcgtc agtcaagccg gttctccgtt tgcactcagg agcacgggca 1260
ggcgagtggc ccctagttct gggggcagc 1289
<210> 205
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 205
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60
cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120
tttctctcca cag 133
<210> 206
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 206
gtgagtatct cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca 60
ctgtgggtct ctctgttcac ag 82
<210> 207
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 207
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catg 304
<210> 208
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 208
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 209
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 209
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgg 106
<210> 210
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 210
gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 60
gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga 120
gcgcgcagag agggagtggc caa 143
<210> 211
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 211
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 110
<210> 212
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 212
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120
agcgcgcag 129
<210> 213
<211> 55
<212> DNA
<213> 穴兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 213
ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctca 55
<210> 214
<211> 127
<212> DNA
<213> 穴兔
<400> 214
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 215
<211> 132
<212> DNA
<213> 穴兔
<400> 215
gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 60
tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 120
gtctctcact cg 132
<210> 216
<211> 19
<212> DNA
<213> 牛（Bos taurus）
<400> 216
tagcaggcat gctggggag 19
<210> 217
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 217
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgac 129
<210> 218
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 218
gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt gtttactaaa 60
actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa atggtataaa 120
tta 123
<210> 219
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 219
ctgtgaagcc acagatggg 19
<210> 220
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 220
acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc ttggtcttac 60
ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctg 106
<210> 221
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 221
tggaacgtca cgcagctttc tacagcatga caagctgctg aggcttaaat caggattttc 60
ctgtctcttt ctacaaaatc aaaatgaaaa aagagggctt tttaggcatc tccgagatta 120
tgtg 124
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 222
ggttgcgagg tatgagtaaa 20
<210> 223
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 223
tctgccgcgg aaaggggaga agtgtgggct cctccgagtc gggggcggac tgggacagca 60
cagtcggctg agcgcagcgc ccccgccctg cccgccacgc ggcgaagacg cctgagcgtt 120
cgcgcccctc gggcgaggac cccacgcaag cccgagccgg tcccgaccct ggccccgacg 180
ctcgccgccc gccccagccc tgagggcccc tc 212
<210> 224
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 224
gagaggcgcc tccgccgctc ctttctcatg gaaatggccc gcgagcccgt ccggcccagc 60
gcccctcccg cgggaggaag gcgagcccgg cccccggcgg ccattcgcgc cgcggacaaa 120
tccggcgaac aatgcgcccg cccagagtgc ggcccagctg ccgggccggg gatctggccg 180
cgggacacaa aggggcccgc acgcctctgg cgt 213
<210> 225
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 225
atttaatgtc tatacaat 18
<210> 226
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 226
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gctgtgaagc cacagatgag cctgggtttt 180
atatcgagaa gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 227
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 227
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gctgtgaagc cacagatgag cctgggtttt 180
atatcgcgaa gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 228
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 228
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccat gctgtgaagc cacagatgag catgggtttt 180
atatcgagaa gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 229
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 229
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccat gctgtgaagc cacagatgag catgggtttt 180
atatcgcgaa gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 230
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 230
ttctcgatat ggagaaccca gg 22
<210> 231
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 231
ttctcgatat ggagaaccca gg 22
<210> 232
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 232
ttctcgatat ggagaaccca tg 22
<210> 233
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 233
ttctcgatat ggagaaccca tg 22
<210> 234
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 234
agcctgggtt ttatatcgag aa 22
<210> 235
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 235
agcctgggtt ttatatcgcg aa 22
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 236
agcatgggtt ttatatcgag aa 22
<210> 237
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 237
agcatgggtt ttatatcgcg aa 22
<210> 238
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 238
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gcugtgaagc cacagatggg cctgggtttt 180
atatcgagca gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 239
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 239
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gcugtgaagc cacagatggg cctgggtttt 180
atatcgagcg gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 240
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 240
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gcugtgaagc cacagatggg cctgggtttt 180
atatcgaggg gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 241
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 241
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gcugtgaagc cacagatggg cctgggtttt 180
atatcgagga gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa tta 313
<210> 242
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 242
ttctcgatat ggagaaccca gg 22
<210> 243
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 243
ttctcgatat ggagaaccca gg 22
<210> 244
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 244
ttctcgatat ggagaaccca gg 22
<210> 245
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 245
ttctcgatat ggagaaccca gg 22
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 246
cctgggtttt atatcgagca 20
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 247
cctgggtttt atatcgagcg 20
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 248
cctgggtttt atatcgaggg 20
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 249
cctgggtttt atatcgagga 20
<210> 250
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 250
atagtctatc caggttgagc atcctgctgg tggttacaag aaactgtttg aaactgtgga 60
ggaactgtcc tcgccgctca cagctcatgt aacaggcagg atccccctct ggctcaccgg 120
cagtctcctt cgatgtgggc caggactctt tgaagttgga tctgagccat tttaccacct 180
gtttgatggg caagccctcc tgcacaagtt tgactttaaa gaaggacatg tcacatacca 240
cagaaggttc atccgcactg atgcttacgt acgggcaatg actgagaaaa ggatcgtcat 300
aacagaattt ggcacctgtg ctttcccaga tccctgcaag aatatatttt ccaggttttt 360
ttcttacttt cgaggagtag aggttactga caattgccct tgttaatgtc tacccagtgg 420
gggaagatta ctacgcttgc acagagacca actttattac aaagattaat ccagagacct 480
tggagacaat taagcaggtt gatctttgca actaagtctc tgtcaatggg gccactgctc 540
acccccacat tgaaaatgat ggaaccgttt acaatattgg taattgcttt ggaaaaaatt 600
tttcaattgc ctacaacatt gtaaagatcc caccactgca agcagacaag gaagatccaa 660
taagcaagtc agagatcgtt gtacaattcc cctgcagtga ccgattcaag ccatcttacg 720
ttcatagttt tggtctgact cccaactata tcgtttttgt ggagacacca gtcaaaatta 780
acctgttcaa gttcctttct tcatggagtc tttggggagc caactacatg gattgttttg 840
agtccaatga aaccatgggg tttggcttca tattgctgac aaaaaaagga aaaagtacct 900
caataataaa tacagaactt ctcctttcaa cctcttccat cacatcaaca cctatgaaga 960
caatgggttt ctgattgtgg atctctgctg ctggaaagga tttgagtttg tttataatta 1020
cttatattta gccaatttac gtgagaactg ggaagaggtg aaaaaaaatg ccagaaaggc 1080
tccccaacct gaagttagga gatatgtact tcctttgaat attgacaagg ctgacacagg 1140
caagaattta gtcagctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200
atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260
atcaattac 1269
<210> 251
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 251
cgagtttaat tggtttatag aactcttca 29
<210> 252
<211> 3121
<212> DNA
<213> 智人
<400> 252
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga tccggtcggg cccgcggtac cgtcgagaag cttgatgtgg gcggagcttc 240
gaaggggcgg gcgcccgtgg ggcgggtcct gagtgggggc gggaccgggg ccggcacctg 300
ggtgaggttc tgcagagggc cctgcgtatg agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag 360
gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc 420
cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg 480
cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc 540
gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac 600
tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca 660
cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc 720
agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcaggg 780
cgcgcctagc ccgggctagg tcgactcgac tagggataac agggtaattg tttgaatgag 840
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g 3121
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<213> 智人
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cagagaccaa ctttattaca aagattaatc cagagacctt ggagacaatt aagcaggttg 2100
atctttgcaa ctaagtctct gtcaatgggg ccactgctca cccccacatt gaaaatgatg 2160
gaaccgttta caatattggt aattgctttg gaaaaaattt ttcaattgcc tacaacattg 2220
taaagatccc accactgcaa gcagacaagg aagatccaat aagcaagtca gagatcgttg 2280
tacaattccc ctgcagtgac cgattcaagc catcttacgt tcatagtttt ggtctgactc 2340
ccaactatat cgtttttgtg gagacaccag tcaaaattaa cctgttcaag ttcctttctt 2400
catggagtct ttggggagcc aactacatgg attgttttga gtccaatgaa accatggggt 2460
ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc aataataaat acagaacttc 2520
tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac aatgggtttc tgattgtgga 2580
tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac ttatatttag ccaatttacg 2640
tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct ccccaacctg aagttaggag 2700
atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc aagaatttag tcagctcccc 2760
aatacaactg ccactgcaat tctgtgcagt gacgagacta tctggctgga gcctgaagtt 2820
ctcttttcag ggcctcgtca agcatttgag tttcctcaaa tcaattacca gaagtattgt 2880
gggaaacctt acacatatgc gtatggactt ggcttgaatc actttgttcc agataggctc 2940
tgtaagctga atgtcaaaac taaagaaact tgggtttggc aagagcctga ttcataccca 3000
tcagaaccca tctttgtttc tcacccagat gccttggaag aagatgatgg tgtagttctg 3060
agtgtggtgg tgagcccagg agcaggacaa aagcctgctt atctcctgat tctgaatgcc 3120
aaggacttaa gtgaagttgc ccgggctgaa gtggagatta acatccctgt cacctttcat 3180
ggactgttca aaaaatcttg accggccggc tagcgaagca attcgttgat ctgaatttcg 3240
accacccata atacccatta ccctggtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta 3300
caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 3360
ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 3420
gcgagcgcgc ag 3432
<210> 257
<211> 3432
<212> DNA
<213> 智人
<400> 257
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga tccggtcggg cccgcggtac cgtcgagaag cttgatgtgg gcggagcttc 240
gaaggggcgg gcgcccgtgg ggcgggtcct gagtgggggc gggaccgggg ccggcacctg 300
ggtgaggttc tgcagagggc cctgcgtatg agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag 360
gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc 420
cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg 480
cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc 540
gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac 600
tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca 660
cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc 720
agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcaggg 780
cgcgcctagc ccgggctagg tcgactcgac tagggataac agggtaatta cgtttccaga 840
acgtctgtag cttttctcct ccttccctcc attttcctct tggtcttacc tttggcctag 900
tggttggtgt agtgataatg tagcgagatt ttctgtagag cattgcagat ggaccgggtt 960
gcgaggtatg agtaaacggt ccatacgcaa tgctccatgg aacgtcacgc agctttctac 1020
agcatgacaa gctgctgagg cttaaatcag gattttcctg tctctttcta caaaatcaaa 1080
atgaaaaaag agggcttttt aggcatctcc gagattatgt gtcacgggat ccgaattcgt 1140
ttgaatgagg cttcagtact ttacagaatc gttgcctgca catcttggaa acacttgctg 1200
ggattacttc ttcaggttaa cccaacagaa ggctaaagaa ggtatattgc tgttgacagt 1260
gagcgacttc tcgatatgga gaacccaggc cgtgaagcca cagatgggcc tgggttttat 1320
atcgagcagc tgcctactgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt 1380
ttactaaaac tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat 1440
ggtataaatt actcgagggg atccgatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc 1500
atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata 1560
gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggcggccgca tagtctatcc aggttgagca 1620
tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag gaactgtcct cgccgctcac 1680
agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc agtctccttc gatgtgggcc 1740
aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg tttgatgggc aagccctcct 1800
gcacaagttt gactttaaag aaggacatgt cacataccac agaaggttca tccgcactga 1860
tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata acagaatttg gcacctgtgc 1920
tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt tcttactttc gaggagtaga 1980
ggttactgac aattgccctt gttaatgtct acccagtggg ggaagattac tacgcttgca 2040
cagagaccaa ctttattaca aagattaatc cagagacctt ggagacaatt aagcaggttg 2100
atctttgcaa ctaagtctct gtcaatgggg ccactgctca cccccacatt gaaaatgatg 2160
gaaccgttta caatattggt aattgctttg gaaaaaattt ttcaattgcc tacaacattg 2220
taaagatccc accactgcaa gcagacaagg aagatccaat aagcaagtca gagatcgttg 2280
tacaattccc ctgcagtgac cgattcaagc catcttacgt tcatagtttt ggtctgactc 2340
ccaactatat cgtttttgtg gagacaccag tcaaaattaa cctgttcaag ttcctttctt 2400
catggagtct ttggggagcc aactacatgg attgttttga gtccaatgaa accatggggt 2460
ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc aataataaat acagaacttc 2520
tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac aatgggtttc tgattgtgga 2580
tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac ttatatttag ccaatttacg 2640
tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct ccccaacctg aagttaggag 2700
atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc aagaatttag tcagctcccc 2760
aatacaactg ccactgcaat tctgtgcagt gacgagacta tctggctgga gcctgaagtt 2820
ctcttttcag ggcctcgtca agcatttgag tttcctcaaa tcaattacca gaagtattgt 2880
gggaaacctt acacatatgc gtatggactt ggcttgaatc actttgttcc agataggctc 2940
tgtaagctga atgtcaaaac taaagaaact tgggtttggc aagagcctga ttcataccca 3000
tcagaaccca tctttgtttc tcacccagat gccttggaag aagatgatgg tgtagttctg 3060
agtgtggtgg tgagcccagg agcaggacaa aagcctgctt atctcctgat tctgaatgcc 3120
aaggacttaa gtgaagttgc ccgggctgaa gtggagatta acatccctgt cacctttcat 3180
ggactgttca aaaaatcttg accggccggc tagcgaagca attcgttgat ctgaatttcg 3240
accacccata atacccatta ccctggtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta 3300
caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 3360
ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 3420
gcgagcgcgc ag 3432
<210> 258
<211> 622
<212> DNA
<213> 智人
<400> 258
gtttgaatga ggcttcagta ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc 60
tgggattact tcttcaggtt aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca 120
gtgagcgact tctcgatatg gagaacccag gccgtgaagc cacagatggg cctgggtttt 180
atatcgagca gctgcctact gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt 240
gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300
atggtataaa ttatcacggg atccgaattc acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc 360
tccttccctc cattttcctc ttggtcttac ctttggccta gtggttggtg tagtgataat 420
gtagcgagat tttctgtaga gcattgcaga tggaccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg 480
tccatacgca atgctccatg gaacgtcacg cagctttcta cagcatgaca agctgctgag 540
gcttaaatca ggattttcct gtctctttct acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt 600
taggcatctc cgagattatg tg 622
<210> 259
<211> 1142
<212> DNA
<213> 智人
<400> 259
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcagg gcgcgcctag 480
cccgggctag gtcgactcga ctagggataa cagggtaatt gtttgaatga ggcttcagta 540
ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc tgggattact tcttcaggtt 600
aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgact tctcgatatg 660
gagaacccag gccgtgaagc cacagatggg cctgggtttt atatcgagca gctgcctact 720
gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt gtttactaaa actgaatacc 780
ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa atggtataaa ttatcacggg 840
atccgaattc acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc 900
ttggtcttac ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgtaga 960
gcattgcaga tggaccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg tccatacgca atgctccatg 1020
gaacgtcacg cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct 1080
gtctctttct acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg 1140
tg 1142
<210> 260
<211> 1282
<212> DNA
<213> 智人
<400> 260
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
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actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcagg gcgcgcctag 480
cccgggctag gtcgactcga ctagggataa cagggtaatt gtttgaatga ggcttcagta 540
ctttacagaa tcgttgcctg cacatcttgg aaacacttgc tgggattact tcttcaggtt 600
aacccaacag aaggctaaag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgact tctcgatatg 660
gagaacccag gccgtgaagc cacagatggg cctgggtttt atatcgagca gctgcctact 720
gcctcggact tcaaggggct actttaggag caattatctt gtttactaaa actgaatacc 780
ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa atggtataaa ttatcacggg 840
atccgaattc acgtttccag aacgtctgta gcttttctcc tccttccctc cattttcctc 900
ttggtcttac ctttggccta gtggttggtg tagtgataat gtagcgagat tttctgtaga 960
gcattgcaga tggaccgggt tgcgaggtat gagtaaacgg tccatacgca atgctccatg 1020
gaacgtcacg cagctttcta cagcatgaca agctgctgag gcttaaatca ggattttcct 1080
gtctctttct acaaaatcaa aatgaaaaaa gagggctttt taggcatctc cgagattatg 1140
tgctcgaggg gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 1200
cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 1260
aattttttgt gtctctcact cg 1282
<210> 261
<211> 1830
<212> DNA
<213> 智人
<400> 261
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
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gaaggggcgg gcgcccgtgg ggcgggtcct gagtgggggc gggaccgggg ccggcacctg 300
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gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc 420
cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg 480
cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc 540
gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac 600
tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca 660
cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc 720
agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcaggg 780
cgcgcctagc ccgggctagg tcgactcgac tagggataac agggtaattg tttgaatgag 840
gcttcagtac tttacagaat cgttgcctgc acatcttgga aacacttgct gggattactt 900
cttcaggtta acccaacaga aggctaaaga aggtatattg ctgttgacag tgagcgactt 960
ctcgatatgg agaacccagg ccgtgaagcc acagatgggc ctgggtttta tatcgagcag 1020
ctgcctactg cctcggactt caaggggcta ctttaggagc aattatcttg tttactaaaa 1080
ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa tggtataaat 1140
tatcacggga tccgaattca cgtttccaga acgtctgtag cttttctcct ccttccctcc 1200
attttcctct tggtcttacc tttggcctag tggttggtgt agtgataatg tagcgagatt 1260
ttctgtagag cattgcagat ggaccgggtt gcgaggtatg agtaaacggt ccatacgcaa 1320
tgctccatgg aacgtcacgc agctttctac agcatgacaa gctgctgagg cttaaatcag 1380
gattttcctg tctctttcta caaaatcaaa atgaaaaaag agggcttttt aggcatctcc 1440
gagattatgt gctcgagggg atccgatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc 1500
atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata 1560
gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggcggccgcc cggccggcta gcgaagcaat 1620
tcgttgatct gaatttcgac cacccataat acccattacc ctggtagata agtagcatgg 1680
cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 1740
cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg 1800
ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 1830
<210> 262
<211> 3103
<212> DNA
<213> 智人
<400> 262
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180
atcctctaga actatagcta gtcgacgacg gggtgaacta cgcctgagga tccgatcttt 240
ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 300
aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 360
gttgatctga agcaattcgt tgagtctgcc ttcgcccttg cccactctct cacctcctcc 420
ccccggctct gactgacttt actcccacag gtgagcggcg gatgcccttc tcctctggct 480
gtaattagtc ttggtttact tgtttctttt ctgtggctgt tgaaagcctt gaggggctct 540
ggagggccct ttgtgtgggg gagtgcttgg gggtgttgtt gtgtgtgtgt tggggagtct 600
ttgtgctctt ctgcctgtgc tgtgagtctg tggttgttgg gctttgtgtc tctcagtgtg 660
ttaggggagt tgctggggtg tgcccttgtg tgggggggct gtaggggaac aaaggctgtt 720
gtgggtgtgt gttggggggg tgagcagggg gtgtgggttt tgttggctgc aaccccccct 780
gcacccccct ccctagttgc tgagcatgcc tgctttggtg tgggctctta tgggttggtt 840
gggcttcttg ctggtggggg tggtgcaggt gggggtgctg gtgggtgggc tccttggctg 900
ggagggcttg gggaggggtt gtgcccctga gtctgtgctg ttaggttgta gctcagccat 960
tgcctttttt gtagagggtc agggacttcc tttgtcccaa atctgtgtga gctaaatctg 1020
ggaggtctct caccccctct agtggttggg taagtgtgtg tctgcaggaa ggaaagggtg 1080
ggagggcctt ttgtttcttc tcttcccctt ctccctctcc agccttgggc tgtcttgggg 1140
gatgctgcct ttggggggat gggcagggtg ggtttgcttc tggttgtgac tgtgctctag 1200
agcctctgct aacctgttct gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aattgctggt 1260
tattgtgctg tctctatttt ggcaaagaat tctctgaatt tcgaccaccc ataataccca 1320
ttaccctggt agatatagtc tatccaggtt gagcatcctg ctggtggtta caagaaactg 1380
tttgaaactg tggaggaact gtcctcgccg ctcacagctc atgtaacagg caggatcccc 1440
ctctggctca ccggcagtct ccttcgatgt gggccaggac tctttgaagt tggatctgag 1500
ccattttacc acctgtttga tgggcaagcc ctcctgcaca agtttgactt taaagaagga 1560
catgtcacat accacagaag gttcatccgc actgatgctt acgtacgggc aatgactgag 1620
aaaaggatcg tcataacaga atttggcacc tgtgctttcc cagatccctg caagaatata 1680
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tgtctaccca gtgggggaag attactacgc ttgcacagag accaacttta ttacaaagat 1800
taatccagag accttggaga caattaagca ggttgatctt tgcaactaag tctctgtcaa 1860
tggggccact gctcaccccc acattgaaaa tgatggaacc gtttacaata ttggtaattg 1920
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caaggaagat ccaataagca agtcagagat cgttgtacaa ttcccctgca gtgaccgatt 2040
caagccatct tacgttcata gttttggtct gactcccaac tatatcgttt ttgtggagac 2100
accagtcaaa attaacctgt tcaagttcct ttcttcatgg agtctttggg gagccaacta 2160
catggattgt tttgagtcca atgaaaccat ggggtttggc ttcatattgc tgacaaaaaa 2220
aggaaaaagt acctcaataa taaatacaga acttctcctt tcaacctctt ccatcacatc 2280
aacacctatg aagacaatgg gtttctgatt gtggatctct gctgctggaa aggatttgag 2340
tttgtttata attacttata tttagccaat ttacgtgaga actgggaaga ggtgaaaaaa 2400
aatgccagaa aggctcccca acctgaagtt aggagatatg tacttccttt gaatattgac 2460
aaggctgaca caggcaagaa tttagtcagc tccccaatac aactgccact gcaattctgt 2520
gcagtgacga gactatctgg ctggagcctg aagttctctt ttcagggcct cgtcaagcat 2580
ttgagtttcc tcaaatcaat taccagaagt attgtgggaa accttacaca tatgcgtatg 2640
gacttggctt gaatcacttt gttccagata ggctctgtaa gctgaatgtc aaaactaaag 2700
aaacttgggt ttggcaagag cctgattcat acccatcaga acccatcttt gtttctcacc 2760
cagatgcctt ggaagaagat gatggtgtag ttctgagtgt ggtggtgagc ccaggagcag 2820
gacaaaagcc tgcttatctc ctgattctga atgccaagga cttaagtgaa gttgcccggg 2880
ctgaagtgga gattaacatc cctgtcacct ttcatggact gttcaaaaaa tcttgaaagt 2940
agctagcgca tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca 3000
ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 3060
cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cag 3103

Claims (242)

1.特异性结合Grik2 mRNA的分离的多核苷酸，其包含含有5'臂(5p)、环区和3'臂(3p)的茎环区，其中所述茎环区包含指导链序列和随从链序列，并且所述指导链序列和随从链序列包含：
(a)在所述指导链的5'末端处的尿嘧啶(U)-腺嘌呤(A)碱基对或U-鸟嘌呤(G)碱基对；
(b)在所述随从链的5'末端处的胞嘧啶(C)-G对；
(c)在所述指导链序列的5'末端处的U；
(d)在所述指导链序列与随从链序列之间的种子区中的错配；和/或
(e)C-G碱基对或U-A碱基对，其用来替代在所述多核苷酸的茎区和环区的连接处的U-G摆动。
2.权利要求1所述的多核苷酸，其中(a)和(c)改善指导链序列向RNA诱导的沉默复合物(RISC)蛋白中的加载。
3.权利要求1或2所述的多核苷酸，其中(b)损害随从链序列向RISC蛋白中的加载。
4.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中(d)促进在RISC加载期间所述随从链序列与所述指导链序列的解偶联。
5.权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中(e)改善通过Dicer从所述茎区切割所述环区。
6.权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述指导链序列的种子区包含所述指导链序列的核苷酸2至7。
7.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:2的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
8.权利要求7所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:17的核酸序列。
9.权利要求7或8所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:32的核酸序列。
10.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:3的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
11.权利要求10所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:18的核酸序列。
12.权利要求10或11所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:33的核酸序列。
13.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:4的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
14.权利要求13所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:19的核酸序列。
15.权利要求13或14所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:34的核酸序列。
16.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:5的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
17.权利要求16所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:20的核酸序列。
18.权利要求16或17所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:35的核酸序列。
19.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:6的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
20.权利要求19所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:21的核酸序列。
21.权利要求19或20所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:36的核酸序列。
22.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:7的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
23.权利要求22所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:22的核酸序列。
24.权利要求22或23所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:37的核酸序列。
25.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:8的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
26.权利要求25所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:23的核酸序列。
27.权利要求25或26所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:38的核酸序列。
28.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:9的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
29.权利要求28所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:24的核酸序列。
30.权利要求28或29所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:39的核酸序列。
31.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:10的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
32.权利要求31所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:25的核酸序列。
33.权利要求31或32所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:40的核酸序列。
34.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:11的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
35.权利要求34所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:26的核酸序列。
36.权利要求34或35所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:41的核酸序列。
37.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:12的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
38.权利要求37所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:27的核酸序列。
39.权利要求37或38所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:42的核酸序列。
40.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:13的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
41.权利要求40所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:28的核酸序列。
42.权利要求40或41所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:43的核酸序列。
43.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:14的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
44.权利要求43所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:29的核酸序列。
45.权利要求43或44所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:44的核酸序列。
46.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:15的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
47.权利要求46所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:30的核酸序列。
48.权利要求46或47所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:45的核酸序列。
49.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:226的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
50.权利要求49所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:230的核酸序列。
51.权利要求49或50所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:234的核酸序列。
52.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:227的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
53.权利要求52所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:231的核酸序列。
54.权利要求52或53所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:235的核酸序列。
55.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:228的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
56.权利要求55所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:232的核酸序列。
57.权利要求55或56所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:236的核酸序列。
58.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:229的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
59.权利要求58所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:233的核酸序列。
60.权利要求58或59所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:237的核酸序列。
61.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:238的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
62.权利要求61所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:242的核酸序列。
63.权利要求61或62所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:246的核酸序列。
64.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:239的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
65.权利要求64所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:243的核酸序列。
66.权利要求64或65所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:247的核酸序列。
67.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:240的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
68.权利要求67所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:244的核酸序列。
69.权利要求67或68所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:248的核酸序列。
70.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:241的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
71.权利要求70所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:245的核酸序列。
72.权利要求70或71所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:249的核酸序列。
73.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:47的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
74.权利要求73所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:64的核酸序列。
75.权利要求73或74所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:81的核酸序列。
76.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:48的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
77.权利要求76所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:65的核酸序列。
78.权利要求76或77所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:82的核酸序列。
79.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:49的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
80.权利要求79所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:66的核酸序列。
81.权利要求79或80所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:83的核酸序列。
82.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:50的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
83.权利要求82所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:67的核酸序列。
84.权利要求82或83所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:84的核酸序列。
85.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:51的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
86.权利要求85所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:68的核酸序列。
87.权利要求85或86所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:85的核酸序列。
88.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:52的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
89.权利要求88所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:69的核酸序列。
90.权利要求88或89所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:86的核酸序列。
91.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:53的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
92.权利要求91所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:70的核酸序列。
93.权利要求91或92所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:87的核酸序列。
94.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:54的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
95.权利要求94所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:71的核酸序列。
96.权利要求94或95所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:88的核酸序列。
97.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:55的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
98.权利要求97所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:72的核酸序列。
99.权利要求97或98所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQ ID NO:89的核酸序列。
100.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:56的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
101.权利要求100所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:73的核酸序列。
102.权利要求100或101所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:90的核酸序列。
103.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:57的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
104.权利要求103所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:74的核酸序列。
105.权利要求103或104所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:91的核酸序列。
106.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:58的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
107.权利要求106所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:75的核酸序列。
108.权利要求106或107所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:92的核酸序列。
109.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:59的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
110.权利要求109所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:76的核酸序列。
111.权利要求109或110所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:93的核酸序列。
112.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:60的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
113.权利要求112所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:77的核酸序列。
114.权利要求112或113所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:94的核酸序列。
115.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:61的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
116.权利要求115所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:78的核酸序列。
117.权利要求115或116所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:95的核酸序列。
118.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:62的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
119.权利要求118所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:79的核酸序列。
120.权利要求118或119所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:96的核酸序列。
121.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:98的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
122.权利要求121所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:110的核酸序列。
123.权利要求121或122所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:122的核酸序列。
124.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:99的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
125.权利要求124所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:111的核酸序列。
126.权利要求124或125所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:123的核酸序列。
127.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:100的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
128.权利要求127所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:112的核酸序列。
129.权利要求127或128所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:124的核酸序列。
130.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:101的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
131.权利要求130所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:113的核酸序列。
132.权利要求130或131所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:125的核酸序列。
133.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:102的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
134.权利要求133所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:114的核酸序列。
135.权利要求133或134所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:126的核酸序列。
136.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:103的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
137.权利要求136所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:115的核酸序列。
138.权利要求136或137所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:127的核酸序列。
139.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:104的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
140.权利要求139所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:116的核酸序列。
141.权利要求139或140所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:128的核酸序列。
142.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:105的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
143.权利要求142所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:117的核酸序列。
144.权利要求142或143所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:129的核酸序列。
145.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:106的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
146.权利要求145所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:118的核酸序列。
147.权利要求145或146所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:130的核酸序列。
148.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:107的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
149.权利要求148所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:119的核酸序列。
150.权利要求148或149所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:131的核酸序列。
151.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:108的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
152.权利要求151所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:120的核酸序列。
153.权利要求151或152所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:132的核酸序列。
154.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:134的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
155.权利要求154所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:140的核酸序列。
156.权利要求154或155所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:146的核酸序列。
157.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:135的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
158.权利要求157所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:141的核酸序列。
159.权利要求157或158所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:147的核酸序列。
160.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:136的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
161.权利要求160所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:142的核酸序列。
162.权利要求160或161所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:148的核酸序列。
163.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:137的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
164.权利要求163所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:143的核酸序列。
165.权利要求163或164所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:149的核酸序列。
166.权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述茎环区是与SEQID NO:138的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
167.权利要求166所述的多核苷酸，其中所述指导链序列具有SEQ ID NO:144的核酸序列。
168.权利要求166或167所述的多核苷酸，其中所述随从链序列具有SEQID NO:150的核酸序列。
169.权利要求1至168中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含反义寡核苷酸(ASO)。
170.权利要求1至169中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹适配miRNA(shmiRNA)。
171.权利要求1至170中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为19至21个核苷酸。
172.权利要求171所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为19个核苷酸。
173.权利要求172所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为20个核苷酸。
174.权利要求173所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为21个核苷酸。
175.权利要求1至174中任一项所述的多核苷酸，其中所述Grik2 mRNA由SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174的核酸序列编码。
176.权利要求1至175中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸能够降低细胞中GluK2蛋白的水平。
177.权利要求176所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸使所述细胞中GluK2蛋白的水平降低至少10％、至少至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
178.权利要求176或177所述的多核苷酸，其中所述细胞是人细胞。
179.权利要求176至178中任一项所述的多核苷酸，其中所述细胞是神经元。
180.权利要求179所述的多核苷酸，其中所述神经元是海马神经元。
181.权利要求180所述的多核苷酸，其中所述海马神经元是齿状颗粒细胞(DGC)或谷氨酸能锥体神经元。
182.载体，其包含权利要求1至181中任一项所述的多核苷酸。
183.权利要求182所述的载体，其中所述载体是复制缺陷型的。
184.权利要求182或183所述的载体，其中所述载体是哺乳动物载体、昆虫载体、细菌载体或病毒载体。
185.权利要求182至184中任一项所述的载体，其中所述载体是表达载体。
186.权利要求184或185所述的载体，其中所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、腺病毒、细小病毒、冠状病毒、负链RNA病毒、正黏病毒、弹状病毒、副黏病毒、正链RNA病毒、小核糖核酸病毒、甲病毒、双链DNA病毒、疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒。
187.权利要求186所述的载体，其中所述载体是AAV载体。
188.权利要求187所述的载体，其中所述AAV载体是AAV5、AAV9或AAVrh10载体。
189.表达盒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1至15、46至62、97至108、133至138、226至229和238至241中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的茎环序列，例如相对于SEQ ID NO:4、135和256至261中任一者的核酸序列包含至少85％序列同一性的多核苷酸。
190.权利要求189所述的表达盒，其中所述表达盒包含5'侧翼区、环区和3'侧翼区。
191.权利要求190所述的表达盒，其中所述5'侧翼区包含与SEQ ID NO:217、220或223中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
192.权利要求190或191所述的表达盒，其中所述3'侧翼区包含与SEQ ID NO:218、221或224中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
193.权利要求190至192中任一项所述的表达盒，其中所述5'侧翼区包含5'间隔区序列和5'侧翼序列。
194.权利要求190至193中任一项所述的表达盒，其中所述3'侧翼区包含3'间隔区序列和3'侧翼序列。
195.权利要求190至194中任一项所述的表达盒，其中所述环区包含微RNA环序列，所述微RNA环序列为E-miR-30、miR-218-1或E-miR-124-3序列。
196.权利要求195所述的表达盒，其中所述微RNA环序列包含与SEQ ID NO:219、222或225中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
197.权利要求190至196中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含突触蛋白(hSyn)启动子或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子。
198.表达盒，其从5'至3'包含：
(a)第一启动子序列；
(b)包含茎环序列的多核苷酸，所述茎环序列与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229或238至241中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性；
(c)任选地，第二启动子序列；
(d)包含茎环序列的多核苷酸，所述茎环序列与SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229或238至241中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性。
199.权利要求198所述的表达盒，其中包含具有SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229或238至241中任一者的核酸序列的茎环序列的多核苷酸包含与指导序列互补或基本上互补的随从序列，其中所述随从序列位于相对于指导序列的5'或3'。
200.权利要求198或199所述的表达盒，其中所述包含具有SEQ ID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229或238至241中任一者的核酸序列的茎环序列的多核苷酸包含5'侧翼区，所述5'侧翼区位于相对于指导序列的5'。
201.权利要求198至200中任一项所述的表达盒，其中所述包含具有SEQID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229或238至241中任一者的核酸序列的茎环序列的多核苷酸包含3'侧翼区，所述3'侧翼区位于相对于所述指导序列的3'。
202.权利要求198至201中任一项所述的表达盒，其中所述包含具有SEQID NO:1至19、34至62、97至108、133至147、226至229或238至241中任一者的核酸序列的茎环序列的多核苷酸包含位于所述指导序列与所述随从序列之间的环区，其中所述环区包含微RNA环序列。
203.权利要求198至202中任一项所述的表达盒，其中所述第一启动子和/或任选地所述第二启动子选自hSyn启动子或CaMKII启动子。
204.权利要求198至203中任一项所述的表达盒，其中所述5'侧翼区包含与SEQ ID NO:217、220或223中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
205.权利要求198至204中任一项所述的表达盒，其中所述3'侧翼区包含与SEQ ID NO:218、221或224中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
206.权利要求198至205中任一项所述的表达盒，其中所述微RNA环序列是E-miR-30、miR-218-1或E-miR-124-3序列。
207.权利要求206所述的表达盒，其中所述微RNA环序列包含与SEQ ID NO:219、222或225中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
208.权利要求198至207中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含在所述表达盒的5'末端上的5'-反向末端重复(ITR)序列和在所述表达盒的3'末端上的3'-ITR序列。
209.权利要求208所述的表达盒，其中所述5'-ITR和3’ITR序列是AAV25'-ITR和3’ITR序列。
210.权利要求208或209所述的表达盒，其中所述5’-ITR序列包含与SEQID NO:208或SEQ ID NO:209的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
211.权利要求208至210中任一项所述的表达盒，其中所述3’-ITR序列包含与SEQ IDNO:210至212中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
212.权利要求198至211中任一项所述的表达盒，其还包含增强子序列。
213.权利要求212所述的表达盒，其中所述增强子序列包含与SEQ ID NO:207的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
214.权利要求198至213中任一项所述的表达盒，其还包含内含子序列。
215.权利要求214所述的表达盒，其中所述内含子序列包含与SEQ ID NO:205或SEQ IDNO:206的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
216.权利要求198至215中任一项所述的表达盒，其还包含一个或更多个多腺苷酸化信号序列。
217.权利要求216所述的表达盒，其中所述一个或更多个多腺苷酸化信号序列是兔β-珠蛋白(RBG)多腺苷酸化信号序列或牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号序列。
218.权利要求217所述的表达盒，其中所述RBG多腺苷酸化信号序列包含与SEQ ID NO:213至215中任一者的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
219.权利要求217所述的表达盒，其中所述BGH多腺苷酸化信号序列包含与SEQ ID NO:216的核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
220.权利要求198至219中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒被并入到权利要求182至188中任一项所述的载体中。
221.权利要求198至220中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒相对于SEQ ID NO:256的序列包含至少80％序列同一性。
222.权利要求198至221中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒相对于SEQ ID NO:256的序列包含至少85％、90％、95％、97％序列同一性。
223.抑制细胞中Grik2表达的方法，其包括使所述细胞与权利要求1至181中任一项所述的多核苷酸、权利要求182至188中任一项所述的载体、或权利要求189至222中任一项所述的表达盒中的至少一者接触。
224.权利要求223所述的方法，其中所述多核苷酸与Grik2 mRNA特异性杂交并抑制或降低所述细胞中的Grik2的表达。
225.权利要求223或224所述的方法，其中所述方法降低所述细胞中GluK2蛋白的水平。
226.权利要求225所述的方法，其中所述方法使所述细胞中GluK2蛋白的水平降低至少10％、至少10％、至少至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
227.权利要求223至226中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
228.权利要求223至227中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元。
229.权利要求228所述的方法，其中所述神经元是海马神经元。
230.权利要求229所述的方法，其中所述海马神经元是DGC或谷氨酸能锥体神经元。
231.权利要求230所述的方法，其中所述DGC包含异常的复发性苔藓纤维轴突。
232.在有此需要的对象中治疗或改善病症的方法，其包括向所述对象施用权利要求1至181中任一项所述的多核苷酸、权利要求182至188中任一项所述的载体、或权利要求189至222中任一项所述的表达盒中的至少一者。
233.组合物，其包含权利要求1至181中任一项所述的多核苷酸、权利要求182至188中任一项所述的载体、或权利要求189至222中任一项所述的表达盒，其用于在有此需要的对象中治疗或改善疾病或病症的方法。
234.权利要求232或233所述的方法，其中所述病症是癫痫。
235.权利要求234所述的方法，其中所述癫痫是颞叶癫痫(TLE)、慢性癫痫和/或难治性癫痫。
236.权利要求235所述的方法，其中所述癫痫是TLE。
237.权利要求236所述的方法，其中所述TLE是侧向TLE(lTLE)。
238.权利要求236所述的方法，其中所述TLE是内侧TLE(mTLE)。
239.权利要求233至238中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
240.药物组合物，其包含权利要求1至169中任一项所述的多核苷酸、权利要求182至188中任一项所述的载体、或权利要求189至222中任一项所述的表达盒、以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。
241.药盒，其包含权利要求240所述的药物组合物和包装插页。
242.权利要求241所述的药盒，其中所述包装插页包含在权利要求232至239中任一项所述的方法中使用所述药物组合物的说明书。
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