JP2024519413A - キメラａｂｃトランスポーターおよびスクリーニング法 - Google Patents

キメラａｂｃトランスポーターおよびスクリーニング法 Download PDF

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Abstract

本開示は、キメラＡＢＣトランスポータータンパク質ならびにキメラＡＢＣトランスポーターを使用して、ＡＢＣトランスポータータンパク質の周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子をスクリーニングする方法に関する。例えば、いくつかの実施形態では、スクリーニング法は、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、ＡＢＣトランスポーターに結合するがキメラＡＢＣトランスポーターには結合しない分子をスクリーニングすることとを伴う。本開示はまた、例えば、そのようなスクリーニングによって同定された、ＡＢＣトランスポータータンパク質の周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子に関する。【選択図】図３Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年３月１日に出願された米国仮出願第６３／３１５，２５５号、２０２１年６月２２日に出願された米国仮出願第６３／２１３，６５２号、および２０２１年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／１８１，１１８号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらは、いかなる目的に対しても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、キメラＡＢＣトランスポータータンパク質ならびにキメラＡＢＣトランスポーターを使用して、ＡＢＣトランスポータータンパク質の周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子をスクリーニングする方法に関する。例えば、いくつかの実施形態では、スクリーニング法は、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、ＡＢＣトランスポーターに結合するがキメラＡＢＣトランスポーターには結合しない分子をスクリーニングすることとを伴う。本開示はまた、例えば、そのようなスクリーニングによって同定された、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子に関する。
ＡＴＰ結合カセット（「ＡＢＣ」）トランスポーターは、原核生物および真核生物において、ならびに膜を通過する多くの種類の基質の、ＡＴＰを動力源とする移行に関与する真核生物細胞小器官において見出される内在性膜タンパク質のスーパーファミリーを構成する。ＡＢＣトランスポーターは、膜の内面からアクセス可能である（内向き立体配座（ｉｎｗａｒｄ－ｆａｃｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））か、または膜の外面からアクセス可能である（外向き立体配座（ｏｕｔｗａｒｄ－ｆａｃｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））かのいずれかの膜貫通細孔を有する。ＡＴＰの加水分解は、タンパク質における立体配座変化を駆動し、基質を、膜を横切って輸送するために、膜の内側から外側への、またはその逆の膜貫通細孔の「反転（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）」をもたらす。例えば、図６を参照されたい。
グラム陽性細菌は、単一の細胞質膜を有している。グラム陰性細菌は、外膜と、内膜／細胞質膜とを有している。外膜と内膜との間の空間が、周辺質である。例えば、グラム陰性細菌細胞では、ＡＢＣトランスポーターは、外膜と内膜（細胞質膜）との間のリポ多糖（ＬＰＳ）の輸送などの、特定の基質を外膜から内膜に、またその逆に反転させるために使用され得る。これとは対照的に、真核細胞は、細胞の外部をサイトゾルから分離している単一の膜を有している。真核生物細胞小器官は、一般に、サイトゾルを細胞小器官内腔から分離する単一の膜を有している。
様々な理由から、ＡＢＣトランスポーターの活性を阻害することが望ましい場合がある。例えば、細菌中のある特定のＡＢＣトランスポーターを阻害することができる分子が、効果的な抗生物質になる可能性がある。１つの可能な抗生物質標的はＭｓｂＡであり、これは、外膜への組込みのために、リポ多糖（ＬＰＳ）を細胞質から内膜／細胞質膜を横断して周辺質まで輸送する腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（グラム陰性）において高度に保存されたＡＢＣトランスポーターである。ＭｓｂＡは、外膜の主要な成分であり、グラム陰性細菌の増殖に必須であり、ＭｓｂＡの枯渇は、ＬＰＳトラフィッキングを妨害し、細胞溶解を引き起こし、ＭｓｂＡ ＡＴＰアーゼ活性をブロックすることは、細菌増殖を阻害する。ＭｓｂＡは、それがヒトＡＢＣトランスポーターと低い同一性を有するために、例えば、ヒトＰ－ｇｐは、ＭｓｂＡとわずか約３０％同一であるために、抗生物質の標的となり得る。
ＭｓｂＡなどのＡＢＣトランスポーターに結合し、その活性を阻害する分子を同定するためのグラム陰性細菌における以前のハイスループットスクリーニングの取り組みは、より透過性の外膜を有する変異体細胞型、例えば、ｉｍｐ大腸菌株を利用した。図３Ｅ。これらのスクリーニングは、細菌ＡＢＣトランスポーターの内向き立体配座に結合する分子を同定することに偏る傾向があった。これには問題がある。なぜなら、グラム陰性細胞における内向き立体配座に結合するために、分子はまず外膜と内膜／細胞質膜の両方を通過する必要があり、同定されたほとんどの分子はそうすることができず、したがって、典型的でない透過性を有する外膜がない野生型細胞においてＡＢＣトランスポーターの活性を阻害するのに効果がなかったためである。図６。同様に、グラム陽性細菌細胞中の内向き立体配座または真核細胞に結合する分子は、その標的に結合する前に、細胞膜を通過する必要がある。外向き立体配座にある場合に露出しているＡＢＣトランスポーター上の溶媒接触可能領域：周辺質、細胞外および／または内腔面、例えば、タンパク質の周辺質、細胞外および／または内腔面内で見られる周辺質、細胞外および／または内腔裂け目（ｌｕｍｉｎａｌ ｃｌｅｆｔ）に結合する分子を選択するハイスループットスクリーニング技術に適応することができる創薬の方法が必要である。ＡＢＣトランスポーターのこの部分に結合する分子は、それらの標的に結合するために多くの膜を通過する必要がなく、場合によっては、例えばトランスポーターの通常の基質と結合について競合することによって、またはタンパク質の外面上の通常の基質結合部位へのアクセスをブロックすることによって、ＡＢＣトランスポーターの阻害剤としてなお作用することもできる。
ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子をスクリーニングするために、本発明者らは、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポータータンパク質を使用するスクリーニング戦略を開発した。そのような分子は、例えば、スクリーニング条件下で、ＡＢＣトランスポーターには結合するが、キメラＡＢＣトランスポーターには結合しない分子が、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子として同定される対抗選択スクリーニングにおいて使用され得る。キメラＡＢＣトランスポーターならびにそれらを使用してＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面領域に結合する試験分子を同定する方法、ならびに関連する結合分子、分子複合体、キット、および同定された分子を使用する方法が本明細書に記載される。
本開示は、例えば、以下の実施形態のいずれか１つまたは組み合わせを含む。
実施形態１． 試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するかどうかを判定する方法であって、ａ）親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、ｂ）キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子と接触させることであって、試験分子がキメラＡＢＣトランスポーターに結合しない場合、試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合すると判定される、親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子と接触させることとを含む方法。
実施形態２． 試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するかどうかを判定する方法であって、ａ）親ＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップすることと、ｂ）外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子を選択することと、ｃ）親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、ｄ）キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する（ｂ）の試験分子と接触させることとを含み、試験分子がキメラＡＢＣトランスポーターに結合しない場合、試験分子は、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合すると判定される、方法。
実施形態３． キメラＡＢＣトランスポーターを試験分子と接触させる前に、キメラＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップすることをさらに含む、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４． 親ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターを、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩で処理することによって、親ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターが外向きの立体配座にトラップされる、実施形態２から３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＩＶ型またはＶ型ＡＢＣトランスポーターである、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＩＶ型ＡＢＣトランスポーターである、実施形態１から５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７． 親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、実施形態１から６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８． グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）種株－ＯＨ－２から選択される、実施形態７に記載の方法。
実施形態９． 親ＡＢＣトランスポーターが、大腸菌に由来する、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、実施形態７から９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１． 異なるＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、実施形態７から１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２． グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ種株－ＯＨ－２から選択される、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３． 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔ループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４． 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５． 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１６． 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１７． 周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全ておよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１８． 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、それぞれ、２つの異なる種に由来の相同遺伝子によってコードされる、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９． 親ＡＢＣトランスポーターが、大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）であり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がシュードモナス・サイクロトレランスの同等の領域（ＰｐＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がカンジダタス・アキュムリバクターの同等の領域（ＣａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスムの同等の領域（ＪａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がチオミクロスピラ・サイクリカの同等の領域（ＴｃＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がマグネトスピラ株－ＯＨ－２の同等の領域（ＭｑＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４． 分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔裂け目に結合する、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５． 分子の存在下で、親ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼアッセイを行うことをさらに含む、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６． 分子の存在下で、親ＡＢＣトランスポーターの細胞生存もしくは増殖アッセイおよび／またはＡＢＣトランスポーター機能アッセイを行うことをさらに含む、実施形態１から２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７． ２０μＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法によって同定された分子。
実施形態２８． １０μＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態２９． ２０ｎＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３０． ５００ｎＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３１． １ｎＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３２． １～２０μＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３３． １０～２０μＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３４． １ｎＭ～２０μＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３５． １ｎＭ～５００ｎＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、実施形態２７に記載の分子。
実施形態３６． ペプチドである、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法によって同定された分子。
実施形態３７． 小分子である、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法によって同定された分子。
実施形態３８． 抗体である、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法によって同定された分子。
実施形態３９． ペプチドの結合断片、小分子、または抗体である、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法によって同定された分子。
実施形態４０． 大環状分子である、実施形態３６に記載のペプチド。
実施形態４１． ６～１４－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、または８～１０－ｍｅｒ大環状分子である、実施形態４０に記載の大環状分子。
実施形態４２． 少なくとも１つの親油性側鎖と、少なくとも１つの正荷電側鎖とを有する、実施形態４０または４１に記載の大環状分子。
実施形態４３． 親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔裂け目に結合する、実施形態２７から４２のいずれか１つに記載の分子。
実施形態４４． 大環状分子ペプチドＧ１１１８、Ｇ１１１９、またはＧ１１２２。
実施形態４５． 大環状分子ペプチドＧ１３６５。
実施形態４６． Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩による処理によって親ＡＢＣトランスポーターが外向きの立体配座にトラップされる場合に、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質面への結合について大環状分子Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２と競合する分子。
実施形態４７． 競合アッセイにおいて、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２の親ＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する、実施形態４６に記載の分子。
実施形態４８． Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩による処理によって親ＡＢＣトランスポーターが外向きの立体配座にトラップされる場合に、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質面への結合について大環状分子Ｇ１３６５と競合する分子。
実施形態４９． 競合アッセイにおいて、Ｇ１３６５の親ＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する、実施形態４８に記載の分子。
実施形態５０． キメラＡＢＣトランスポーターを作製する方法であって、親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％を、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えることを含む方法。
実施形態５１． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５３． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５４． 親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全ておよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５５． 親ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターが、各々ＩＶ型またはＶ型ＡＢＣトランスポーターである、実施形態５０から５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６． 親ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターが、各々ＩＶ型ＡＢＣトランスポーターである、実施形態５０から５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７． 親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、実施形態５０から５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８． グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ株－ＯＨ－２から選択される、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９． グラム陰性細菌が、大腸菌である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、実施形態５７から５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１． 異なるＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、実施形態５７から６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２． 異なるＡＢＣトランスポーターが、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ株－ＯＨ－２から選択される細菌に由来する、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３． 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、それぞれ、２つの異なる種に由来の相同遺伝子によってコードされる、実施形態５０から６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４． 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、２つの異なるグラム陰性細菌種に由来するＭｓｂＡトランスポーターである、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、キメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態６６． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態６７． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態６８． 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態６９． 親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全ておよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、実施形態６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７０． 親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、実施形態６５から６９のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７１． グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ株－ＯＨ－２から選択される、実施形態７０に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７２． 親ＡＢＣトランスポーターが、大腸菌に由来する、実施形態７１に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７３． 親ＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、実施形態７０から７２のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７４． 異なるＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、実施形態７０から７３のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７５． グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ株－ＯＨ－２から選択される、実施形態７４に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７６． 異なるＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、実施形態７０から７５のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７７． 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、それぞれ、２つの異なる種に由来の相同遺伝子によってコードされる、実施形態６５から７６のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７８． 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、２つの異なるグラム陰性細菌種に由来するＭｓｂＡトランスポーターである、実施形態７７に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態７９． 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がシュードモナス・サイクロトレランスの同等の領域（ＰｐＭｓｂＡ）で置き換えられている親ＡＢＣトランスポーター大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）を含むキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態８０． 周辺質ループ１（Ｌ１、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８）、周辺質ループ３（Ｌ３、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１）、および周辺質ループ５（Ｌ５、ＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２）がカンジダタス・アキュムリバクターの同等の領域（ＣａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態８１． 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスムの同等の領域（ＪａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態８２． 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がチオミクロスピラ・サイクリカの同等の領域（ＴｃＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態８３． 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がマグネトスピラ株－ＯＨ－２の同等の領域（ＭｑＭｓｂＡ）置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
実施形態８４． ペプチド、小分子、抗体、ペプチドの結合断片、小分子の結合断片、または抗体の結合断片に結合した実施形態６５から８３のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーターを含む分子複合体。
実施形態８５． ペプチドが、大環状分子である、実施形態８４に記載の複合体。
実施形態８６． 大環状分子が、６～１４－ｍｅｒ大環状分子である、実施形態８５に記載の複合体。
実施形態８７． 親ＡＢＣトランスポーターと、実施形態２７から４９のいずれか１つに記載の分子とを含む分子複合体。
実施形態８８． ペプチドが、大環状分子である、実施形態８７に記載の複合体。
実施形態８９． 大環状分子が、６～１４－ｍｅｒ大環状分子である、実施形態８８に記載の複合体。
実施形態９０． 大環状分子が、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、Ｇ１１２２、またはＧ１３６５である、実施形態８９に記載の複合体。
実施形態９１． 実施形態６５から８３のいずれか１つに記載のキメラＡＢＣトランスポーターと、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法を実行するための試薬とを含むキットであって、任意選択で、キメラＡＢＣトランスポーターが、マトリックスまたはビーズに取り付けられており、任意選択で、キットが、下記：
ａ．そこからキメラＡＢＣトランスポーターが操作される、親ＡＢＣトランスポーターおよび／または異なるＡＢＣトランスポーター；
ｂ．ＡＢＣトランスポーターを取り付けるためのマトリックスまたはビーズ、任意選択で、ストレプトアビジン被覆ビーズ、アビジン被覆ビーズ、もしくは脱グリコシル化アビジン被覆ビーズ、または磁性ビーズ；
ｃ．マトリックスまたはビーズ上のＡＢＣトランスポーターを可溶化するための１つ以上のデタージェント；
ｄ．少なくとも１つの洗浄バッファー；
ｄ．少なくとも１つの溶出バッファー；
ｆ．少なくとも１つのポジティブまたはネガティブコントロール分子
のうちの１つ以上をさらに含む、キット。
実施形態９２． 使用説明書をさらに含む、実施形態９１に記載のキット。
実施形態９３． 個体における細菌感染症を治療する方法であって、有効量の実施形態２７から４９のいずれか１つに記載の分子を個体に投与することを含む方法。
実施形態９４． 対象において細菌感染症を治療するための、実施形態２７から４９のいずれか１つに記載の分子の使用。
実施形態９５． 配列：
ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｘ２－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－ＭｅＦ－Ｖ－Ｃを含むペプチドであって、式中、
ｉ．Ｘ１が、Ｗ、Ｖ、またはＹであり、
ｉｉ．Ｘ２が、ＷまたはＹであり、
ｉｉｉ．Ｘ３が、ＷまたはＹであり、
ｉｖ．Ｘ４が、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨであり、
ｖ．Ｘ５が、Ｎであり、Ｎが、Ｃ以外の任意の天然アミノ酸、またはＢｐｈ（（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸）、Ｄｏｐａ（Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）、ＭｅＦ（Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン）、およびＭｅＧ（Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン）から選択される非天然アミノ酸から選択され、
ｖｉ．Ｘ６が、Ｙ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、またはＶであり、
ｖｉｉ．Ｘ７が、Ｗ、Ｙ、またはＢｐｈであり、
ｖｉｉｉ．Ｘ８が、ＷまたはＹであり、
任意選択で、ペプチドが、Ｃ末端でのＣ残基に続くＧ残基をさらに含み、ＣｌａｃＦが、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈが、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａが、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦが、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンであり、ＭｅＧが、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシンである、ペプチド。
実施形態９６． Ｘ１が、ＷまたはＹである、実施形態９５に記載のペプチド。
実施形態９７． Ｘ１が、Ｗである、実施形態９６に記載のペプチド。
実施形態９８． Ｘ２が、Ｗである、実施形態９５から９７のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態９９． Ｘ３が、Ｗである、実施形態９５から９８のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１００． Ｘ４が、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨである、実施形態９５から９９のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１０１． Ｘ４が、Ｄである、実施形態１００に記載のペプチド。
実施形態１０２． Ｘ５が、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、またはＹである、実施形態９５から１０１のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１０３． Ｘ５が、ＶまたはＨである、実施形態１０２に記載のペプチド。
実施形態１０４． Ｘ５が、Ｖである、実施形態１０３に記載のペプチド。
実施形態１０５． Ｘ６が、ＤまたはＳである、実施形態９５から１０４のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１０６． Ｘ６が、Ｓである、実施形態１０５に記載のペプチド。
実施形態１０７． Ｘ７が、Ｗである、実施形態９５から１０６のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１０８． Ｘ８が、Ｗである、実施形態９５から１０７のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１０９． 実施形態９５から１０８のいずれか１つに記載のペプチドから形成された大環状分子であって、ＣｌａｃＦのＮ末端クロロアセチル基とＣ残基のスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合のために環化している、大環状分子。
実施形態１１０． アミノ酸配列：
ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｙ－Ｂｐｈ－ＭｅＦ－Ｘ２－Ｖ－Ｃを含むペプチドであって、式中、
ｉ．Ｘ１が、Ｖ、Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｄｏｐａ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｋ、またはＤであり、
ｉｉ． Ｘ２が、Ｒ、Ｖ、Ｄｏｐａ、またはＹであり、
ＣｌａｃＦが、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈが、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａが、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦが、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンである、ペプチド。
実施形態１１１． Ｘ１が、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｋ、またはＤである、実施形態１１０に記載のペプチド。
実施形態１１２． Ｘ１が、ＶまたはＹである、実施形態１１１に記載のペプチド。
実施形態１１３． Ｘ１が、Ｖである、実施形態１１０から１１２のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１１４． Ｘ２が、ＲまたはＹである、実施形態１１０から１１３のいずれか１つに記載のペプチド。
実施形態１１５． Ｘ２が、Ｒである、実施形態１１４に記載のペプチド。
実施形態１１６． 実施形態１１０から１１５のいずれか１つに記載のペプチドから形成された大環状分子であって、ＣｌａｃＦのＮ末端クロロアセチル基とＣ残基のスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合のために環化している、大環状分子。
実施形態１１７． ペプチドまたは大環状分子が、抗生物質または抗菌薬などの別の分子にコンジュゲートしており、任意選択で、コンジュゲーションが、配列のＣ末端アミノ酸残基におけるものである、実施形態９５から１１６のいずれか１つに記載のペプチドまたは大環状分子。
実施形態１１８． 抗生物質または抗菌薬が、ポリミキシン、例えば、ポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである、実施形態１１７に記載のペプチドまたは大環状分子。
ＡＢＣトランスポーターのタンパク質構造の図およびタンパク質が周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかの図を示す。各個々のアミノ酸は、一文字コードによって識別されるアミノ酸を囲む円によって表される。また、鎖上のいくつかのアミノ酸位置は、例えば、５０位および６０位と番号付けされる。図１Ａは、大腸菌由来のＭｓｂＡ ＡＢＣトランスポーターを示す。キメラＡＢＣトランスポーターを作製するために、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る周辺質または細胞外ループ領域を示し、ラベル付けする。異なるＡＢＣトランスポーター由来のＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る膜を通過するタンパク質の領域（「膜貫通セグメント」または「ＴＭセグメント」）も示される。長方形のボックスは、各タンパク質で置換され得る領域を示す。 異なるＡＢＣトランスポーターのタンパク質構造の図およびタンパク質が周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかの図を示す。各個々のアミノ酸は、一文字コードによって識別されるアミノ酸を囲む円によって表される。また、鎖上のいくつかのアミノ酸位置は、例えば、５０位および６０位と番号付けされる。図１Ｂは、ヒトＡＢＣトランスポーターＡＢＣＤ４を示す。これは、ＭｓｂＡと約２５～３０％の配列同一性を有する。キメラＡＢＣトランスポーターを作製するために、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る周辺質または細胞外ループ領域を示し、ラベル付けする。異なるＡＢＣトランスポーター由来のＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る膜を通過するタンパク質の領域（「膜貫通セグメント」または「ＴＭセグメント」）も示される。長方形のボックスは、各タンパク質で置換され得る領域を示す。 異なるＡＢＣトランスポーターのタンパク質構造の図およびタンパク質が周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかの図を示す。各個々のアミノ酸は、一文字コードによって識別されるアミノ酸を囲む円によって表される。また、鎖上のいくつかのアミノ酸位置は、例えば、５０位および６０位と番号付けされる。図１Ｃは、ヒトＡＢＣトランスポーターＡＢＣＣ１を示す。これは、ＭｓｂＡと約２５～３０％の配列同一性を有する。キメラＡＢＣトランスポーターを作製するために、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る周辺質または細胞外ループ領域を示し、ラベル付けする。異なるＡＢＣトランスポーター由来のＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る膜を通過するタンパク質の領域（「膜貫通セグメント」または「ＴＭセグメント」）も示される。長方形のボックスは、各タンパク質で置換され得る領域を示す。 異なるＡＢＣトランスポーターのタンパク質構造の図およびタンパク質が周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかの図を示す。各個々のアミノ酸は、一文字コードによって識別されるアミノ酸を囲む円によって表される。また、鎖上のいくつかのアミノ酸位置は、例えば、５０位および６０位と番号付けされる。図１Ｃは、ヒトＡＢＣトランスポーターＡＢＣＣ１を示す。これは、ＭｓｂＡと約２５～３０％の配列同一性を有する。キメラＡＢＣトランスポーターを作製するために、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る周辺質または細胞外ループ領域を示し、ラベル付けする。異なるＡＢＣトランスポーター由来のＡＢＣトランスポーターの同等の領域に置換され得る膜を通過するタンパク質の領域（「膜貫通セグメント」または「ＴＭセグメント」）も示される。長方形のボックスは、各タンパク質で置換され得る領域を示す。 ＡＢＣトランスポーターおよびキメラＡＢＣトランスポーターの３次元模式図ならびにそれらが周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかを示す。図２Ａの左パネルは、細胞膜（構造と交差する暗い帯）内に配置されたグラム陰性細菌ＭｓｂＡの３次元模式図を示す。図２Ａの中央パネルは、大環状分子－ＭｓｂＡ複合体の３次元模式図を示し、この中で、大環状分子は、タンパク質の周辺質面に、具体的に周辺質の裂け目に結合している。図２Ａの右パネルは、キメラＭｓｂＡ（ＭｓｂＡ－キメラ５）を示し、ここでは、リボンダイヤグラムの上部でのより暗い埋められたアミノ酸が、異なるＡＢＣトランスポーターにおける同等の領域から採取されたものである。そのようなキメラは、例えば、中央パネルに示された大環状分子などのＭｓｂＡの周辺質裂け目を含む周辺質面に結合する分子を選択するのを助けるために使用され得る。 ＡＢＣトランスポーターおよびキメラＡＢＣトランスポーターの３次元模式図ならびにそれらが周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかを示す。図２Ａの左パネルは、細胞膜（構造と交差する暗い帯）内に配置されたグラム陰性細菌ＭｓｂＡの３次元模式図を示す。図２Ｂの中央パネルは、キメラヒトＡＢＣＤ４トランスポーター（ＰＤＢ：６ＪＢＪ）を示し、ここでは、タンパク質の埋められたアミノ酸が、異なるＡＢＣトランスポーターにおける同等の領域から採取されたものである。図２Ｂの左パネルもまたキメラＭｓｂＡタンパク質を示し、２つのタンパク質のアーキテクチャにおける類似性を示している。図２Ｂの右パネルは、キメラヒトＡＢＣＣ１トランスポーター（ＰＤＢ：６ＢＨＵ）を示し、ここでは、リボンダイヤグラムの上部での埋められたアミノ酸が、異なるＡＢＣトランスポーターにおける同等の領域から採取されたものである。 ＡＢＣトランスポーターおよびキメラＡＢＣトランスポーターの３次元模式図ならびにそれらが周辺質／細胞外空間および細胞質／サイトゾルに対して膜内にどのように配置されているかを示す。図２Ａの左パネルは、細胞膜（構造と交差する暗い帯）内に配置されたグラム陰性細菌ＭｓｂＡの３次元模式図を示す。図２Ｃは、周辺質または細胞外の視点から見た３つのキメラタンパク質の各々の模式図を示す。各周辺質または細胞外ループがラベル付けされている。リボンダイヤグラム中の埋められたアミノ酸は、異なるＡＢＣトランスポーターにおける同等の領域に由来するものである。各細胞外ループもまたラベル付けされている。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ａは、ＥｃＭｓｂＡの周辺質面を標的化する大環状分子を同定するためのＩＮＳＩＴＥスクリーニング戦略の概略図を示す。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｂは、例示的な大環状分子阻害剤Ｇ１１１８およびＧ１３６５を示す。これらの阻害剤は、示されたようなチオエーテル結合を含有する（非天然アミノ酸：Ｃｌａｃ－Ｆ、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニン；ＭｅＦ、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン；Ｂｐｈ、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｃ～Ｄは、ＷＴ大腸菌ＭｓｂＡおよびＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５に対するＧ１１１８（図３Ｃ）およびＧ１３６５（図３Ｄ）の用量応答曲線を示す。ＩＣ５０値は、非線形４－パラメータ阻害モデルをフィットさせることによって決定し（実施例３を参照）、データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｅは、ｍｓｂＡ＋、ｍｓｂＡ－および阻害剤曝露大腸菌ＣＦＴ０７３ ＵＰＥＣ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）細胞（表１）を比較する代表的な電子顕微鏡写真を示す。Ｇ９０７は、図１１Ｄに記述されるＭｓｂＡのキノリン阻害剤である（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２０１８；Ｈｏら、２０１８）。内膜の精緻化は、矢印が付けられている。画像は、各条件について＞１０個の単離された細胞を表す。スケールバーは、０．１μｍである。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｆは、Ｇ１１１８を伴う大腸菌ｉｍｐ株（右パネル；矢印は内膜精緻化を示す）を、Ｇ１１１８を伴わない大腸菌ｉｍｐ株（左パネル）と比較する電子顕微鏡写真を示す。Ｇ１１１８のＩＣ５０を、５ｎＭであると決定した。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｇ～Ｌは、大腸菌株ｉｍｐ ＭｓｂＡＷＴ、ｉｍｐ ＭｓｂＡＨｉｇｈ、およびＵＰＥＣ ＷＴに対するＧ１３２５（図３Ｇ；ＩＣ５０＝１．２μＭ；ＥＣ５０＝１０μＭ）、Ｇ１３３０（図３Ｈ；ＩＣ５０＝１３μＭ；ＥＣ５０＝３０μＭ）、Ｇ１３６５（図３Ｉ；ＩＣ５０＝３００ｎＭ；ＥＣ５０＝２０μＭ）、Ｇ１３４９（図３Ｊ；ＩＣ５０＝５０μＭ；ＥＣ５０＝３０μＭ）、Ｇ１３２３（図３Ｋ；ＩＣ５０＝２．８μＭ）、およびＧ１３２０（図３Ｌ；ＩＣ５０＝１８５μＭ）の用量応答曲線を示す。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｍは、Ｇ０９２キノリンに対する潜在的な結合部位を示す。 大環状ＭｓｂＡ阻害剤を特徴づけするための戦略を示す。図３Ｎは、Ｇ１１１８（図３Ｎ）に対する潜在的な結合部位を示す。 ＭｓｂＡの周辺質裂け目におけるＧ１１１８およびＧ１３６５の結合を示す。図４Ａは、Ｇ１１１８－ＥｃＭｓｂＡ複合体のクライオ－ＥＭマップを示す。Ｇ１１１８およびＬＰＳがマップ上に示されている。図４Ｂは、ＭｓｂＡの周辺質裂け目におけるＧ１１１８の結合の図を示す。ＧＫＫ－テールは、明確にするために省略されている。図４Ｃ～Ｄは、Ｇ１１１８とＭｓｂＡとの間の選択相互作用の大写し図を示す。図４Ｅは、濃縮の最終ラウンドの後の配列決定の間のＧ１１１８ファミリー中の観察された大環状ｃＤＮＡの頻度プロットを示す（非天然アミノ酸は、ＭｅＦ＝Ｆ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン；ＭｅＧ＝Ｇ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシンである）。図４Ｆは、Ｇ１３６５－ＥｃＭｓｂＡ複合体のクライオ－ＥＭマップを示す。Ｇ１３６５が示されている。図４Ｇ～Ｈは、Ｇ１３６５とＭｓｂＡとの間の選択相互作用の大写し図を示す。図４Ｉは、濃縮の最終ラウンドの後の配列決定の間のＧ１３６５ファミリー中の観察された大環状ｃＤＮＡの頻度プロットを示す（非天然アミノ酸は、Ｂｐｈ＝Ｂ＊、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸；ＭｅＦ＝Ｆ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンである）。 ＭｓｂＡの周辺質裂け目におけるＧ１１１８およびＧ１３６５の結合を示す。図４Ｊは、Ｇ１３６５が外向き裂け目の膜露出領域の近くに結合することを示す。 ＭｓｂＡの周辺質裂け目におけるＧ１１１８およびＧ１３６５の結合を示す。図４Ｋ～Ｎは、Ｇ１３６５が外向き裂け目の膜露出領域の近くに結合することを示す。 外向き立体配座において不可欠な周囲の結合部位に結合したＬＰＳを示す。図５Ａは、内膜の内側小葉上のＭｓｂＡの周囲ＬＰＳ結合部位を示す。図５Ｂは、ＬＰＳとＭｓｂＡとの間の相互作用を強調するＬＰＳ結合部位の大写し図を示す。２’－ヒドロキシミリステート（２’－Ｃ１４）および２’’－ラウレートアシル（２’’－Ｃ１２）鎖がラベル付けされている。Ｋｄｏ残基は、明確にするために省略されている。 外向き立体配座において不可欠な周囲の結合部位に結合したＬＰＳを示す。図５Ｃは、低コピープラスミド（表１）からの大腸菌ＭｓｂＡの示されたＷＴまたは変異体対立遺伝子を発現する、大腸菌ＭＧ１６５５ ｍｓｂＡ－ｃＫＯ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）の増殖曲線を示す。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 外向き立体配座において不可欠な周囲の結合部位に結合したＬＰＳを示す。図５Ｄは、ｍｓｂＡ＋、ｍｓｂＡ－、および大腸菌ＣＦＴ０７３ ＵＰＥＣ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）株で示されたｍｓｂＡ変異体コンストラクトを表す細胞を比較する代表的な薄切片電子顕微鏡写真を示す。内膜の精緻化は、矢印で示されている。画像は、各バリアントについて＞１０個の単離された細胞を表す。スケールバーは、０．１μｍである。 外向き立体配座において不可欠な周囲の結合部位に結合したＬＰＳを示す。図５Ｅは、突然変異すると大腸菌の増殖不全を引き起こすアミノ酸を示す。 ＭｓｂＡによるＬＰＳの選択的認識および輸送のためのモデルを示す。パネル１－外向き立体配座では、ＬＰＳは、内膜に沿って周囲の結合部位に結合することができる。成熟Ｋｄｏ２－脂質Ａは、ＬＰＳの４’－リン酸側の正荷電の芳香族残基が選択的に結合する。パネル２－ＭｓｂＡは、内向き立体配座に戻り、ＬＰＳは周囲の結合部位（ＰＤＢ：６ＢＬ６）からの解放時に、局所的に濃縮される。中央空洞へのＬＰＳの拡散の促進は、ＭｓｂＡの正荷電残基の隆起部に沿って生じる。パネル３－ＬＰＳは、前に記載したように（ＰＤＢ：５ＴＶ４）入り口内の中央空間内に取り囲まれるようになる。パネル４－ＡＴＰ結合は、内膜の外側小葉へＬＰＳを放出する外向き状態をもたらす大きな立体配座変化を引き起こす。ＬＰＳは、その後の処理および外膜への輸送のために、ＭｓｂＡから拡散する。 結晶学データ収集および精密化統計を示す。 クライオ－ＥＭデータ取得パラメータおよびモデル精密化統計の概要を示す。 選択ＭｓｂＡホモログの多重配列アライメントを示す。図９Ａでは、大腸菌ＭｓｂＡ配列が参照として示され、キメラトランスポーター設計から選択された他の種に由来する推定上のホモログが含まれる。図９Ａでは、配列番号４は、大腸菌ＭｓｂＡタンパク質配列であり（１行目）、配列番号５は、シュードモナス・サイクロトレランスのＭｓｂＡタンパク質配列（２行目）であり、配列番号６は、カンジダタス・アキュムリバクターのＭｓｂＡタンパク質配列であり（３行目）、配列番号７は、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスムのＭｓｂＡタンパク質配列であり（４行目）、配列番号８は、チオミクロスピラ・サイクリカのＭｓｂＡタンパク質配列（５行目）であり、配列番号９は、マグネトスピラＯＨ－２のＭｓｂＡタンパク質配列（６行目）である。 選択ＭｓｂＡホモログの多重配列アライメントを示す。図９Ｂは、図９ＡにおけるＭｓｂＡホモログについての全体的な配列同一性を示す。 キメラＭｓｂＡトランスポーターのコンストラクトを示す。図１０Ａは、大腸菌ＭｓｂＡベースのキメラの例示的配列を示す。「ループ１」、「ループ２」、および「ループ３」と印を付けた領域は、操作されたキメラトランスポータータンパク質の生成において置換された膜貫通ヘリックスおよびループの周辺質領域を示す。図１０Ａでは、配列番号４は、大腸菌ＭｓｂＡタンパク質配列であり（１行目）、配列番号１２は、大腸菌ＭｓｂＡ－キメラ１タンパク質配列であり（２行目）、配列番号１３は、大腸菌ＭｓｂＡ－キメラ２タンパク質配列であり、配列番号１４は、大腸菌ＭｓｂＡ－キメラ３タンパク質配列であり（３行目）、配列番号１５は、大腸菌ＭｓｂＡ－キメラ４タンパク質配列であり（４行目）、配列番号１６は、大腸菌ＭｓｂＡ－キメラ５タンパク質配列である（５行目）。 キメラＭｓｂＡトランスポーターのコンストラクトを示す。図１０Ｂは、外向きの大腸菌ＭｓｂＡおよびＭｓｂＡ－キメラを示す。側面図が上部パネルに示されており、上面図は下部パネルに示されている。ＭｓｂＡ－キメラにおいて、ループ１～３（図１０Ａに示されるような）でアミノ酸置換を有する領域が示されている。 ＥｃＭｓｂＡキメラの精製および評価を示す。図１１Ａは、クマシーブリリアントブルー染色で可視化された、精製したＥｃＭｓｂＡキメラのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図１１Ｂは、示されたＵＶ（２８０ｎｍ）曲線とのサイズ排除クロマトグラフィープロファイルの重ね合わせを示す。 ＥｃＭｓｂＡキメラの精製および評価を示す。図１１Ｃは、ＷＴタンパク質と比べた、減少する濃度のＥｃＭｓｂＡキメラのＡＴＰアーゼ活性の比較を示す。データは、独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ＥｃＭｓｂＡキメラの精製および評価を示す。図１１Ｄは、キノリンおよびベンゾフェノン阻害剤の例示的化学構造を示す（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２０１８；Ｈｏら、２０１８）。データは、独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ＥｃＭｓｂＡキメラの精製および評価を示す。図１１Ｅは、精製したＥｃＭｓｂＡおよびＥｃＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５に対する化合物の用量応答曲線を示す。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ＩＣ５０値（図１１Ｅの括弧内）は、阻害用量応答曲線を非線形４パラメータ阻害モデルとフィットさせることによって決定した（実施例３）。 推定上のベンゾフェノン受容体部位を明らかにするＭｓｂＡ－キメラ５の結晶構造を示す。図１２Ａは、内向き立体配座にあるＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５の全体構造を示す。ＬＰＳは、球体で示されている。割り当てられたベンゾフェノンＧ７５８は、棒状のものとして示されている。Ｆｏ－Ｆｃマップ（１．５σメッシュ）は、Ｇ７５８がモデルおよび精密化内に含められる前に算出される。 推定上のベンゾフェノン受容体部位を明らかにするＭｓｂＡ－キメラ５の結晶構造を示す。図１２Ｂは、図１２ＡからのＦｏ－Ｆｃマップ、および２Ｆｏ－Ｆｃマップ（１．５σメッシュ）と共に、ＭｓｂＡ上の推定上のベンゾフェノン結合部位の大写し図を示す。Ｇ７５８は、推定では、抵抗マッピング研究の頻度（データは示さず）を通して同定された残基の周りの浅い疎水性ポケット内で結合する。 ＭｓｂＡ大環状分子阻害剤の生化学的および表現型活性の評価を示す。図１３Ａは、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエおよび緑膿菌に由来する、精製してアンフィポールで復元したＭｓｂＡホモログに対するＧ１１１８の用量応答曲線を示す。図１３Ｂは、大腸菌ＣＦＴ０７３（ＷＴ）およびＣＦＴ０７３ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）（ｉｍｐ）株に対するＧ１１１８の用量応答曲線を示す。データは、独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ＩＣ５０値（括弧内）は、用量応答曲線を非線形４パラメータ阻害モデルとフィットさせることによって決定した（実施例３）。 ＭｓｂＡ大環状分子阻害剤の生化学的および表現型活性の評価を示す。図１３Ｃは、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエおよび緑膿菌に由来する、精製してアンフィポールで復元したＭｓｂＡホモログに対するＧ１３６５の用量応答曲線を示す。図１３Ｄは、大腸菌ＣＦＴ０７３（ＷＴ）およびＣＦＴ０７３ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）（ｉｍｐ）株に対するＧ１１１８の用量応答曲線を示す。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ＩＣ５０値（括弧内）は、用量応答曲線を非線形４パラメータ阻害モデルとフィットさせることによって決定した（実施例３）。 構造研究において使用した複合体の生化学的評価を示す。図１４Ａは、構造試験においてＰＤ－１３６５耐性変異体（Ｇ１３６５・Ｉ２，Ｄｏｐａ３）の単離に使用されたＧ１１１８およびＧ１３６５誘導体の化学構造を示す。Ｇ１１１８またはＧ１３６５親大環状分子とは異なる誘導体の領域、すなわち、ＫＫ、Ｒ２、Ｉ２，Ｄｏｐａ３、およびＬ２Ｇ４Ｓ２ＧＥＥは、丸で囲まれて示されている。 構造研究において使用した複合体の生化学的評価を示す。図１４Ｂ～Ｆは、精製したＥｃＭｓｂＡに対するＧ１１１８およびＧ１３６５の親と誘導体の大環状分子の用量応答曲線を示す。図１４Ｇは、Ｆａｂ １２Ｇ７の存在下または非存在下での増加する濃度のＥｃＭｓｂＡのＡＴＰアーゼ活性の比較を示す。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である（図１４Ｂ～Ｇ）。ＩＣ５０値（図１４Ｂ－Ｆの括弧内）は、阻害用量応答曲線を非線形４パラメータ阻害モデルとフィットさせることによって決定した（実施例３）。 Ｇ１１１８との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１５Ａは、処理パイプラインを示す。 Ｇ１１１８との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１５Ｂは、Ｒｅｌｉｏｎで算出された局所分解能プロットを示す。図１５Ｃは、最終ラウンドの３Ｄ精密化からの全ての粒子の配向分布を示す。 Ｇ１１１８との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１５Ｄは、ｃｉｓＴＥＭにおける精密化からのＦＳＣプロットを示す。アライメントに使用した最大分解能は、４．５Åであった。 Ｇ１１１８との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１５Ｅは、クライオ－ＥＭマップから選択された密度を示す。 ＭｓｂＡの周辺質裂け目における大環状分子結合を示す。図１６Ａ～Ｂにおいて、Ｇ１１１８に結合したＭｓｂＡの静電表面は、大環状分子結合部位の複雑な化学環境を強調する。おおよその膜境界および非強制（ｎｏｎ－ｅｎｆｏｒｃｅｄ）Ｃ２対称軸がラベル付けされている。 ＭｓｂＡの周辺質裂け目における大環状分子結合を示す。図１６Ｃ～Ｄは、Ｇ１３６５に結合したＭｓｂＡの静電表面を示す。 Ｇ１３６５との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１７Ａは、処理パイプラインを示す。 Ｇ１３６５との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１７Ｂは、最終ラウンドの３Ｄ精密化からの全ての粒子の配向分布を示す。図１７Ｃは、ｃｉｓＴＥＭにおける精密化からのＦＳＣプロットを示す。アライメントに使用した最大分解能は、４．５Åであった。 Ｇ１３６５との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１７Ｄは、ＲＥＬＩＯＮで算出された局所分解能プロットを示す。 Ｇ１３６５との複合体中のＭｓｂＡについてのクライオ－ＥＭデータ処理を示す。図１７Ｅは、クライオ－ＥＭマップから選択された密度を示す。 保存された周囲ＬＰＳ結合部位を示す。図１８Ａは、対称的に関係するＬＰＳ部位を有するＭｓｂＡ－Ｇ１１１８－ＬＰＳ複合体を示す。図１８Ｂは、ＥｃＭｓｂＡの配列保存性分析を示す。 保存された周囲ＬＰＳ結合部位を示す。図１８Ｃは、内向きのＬＰＳ結合立体配座（ＰＤＢ：５ＴＶ４）におけるＭｓｂＡの表面上の静電位を示す。正荷電走行線がＬＰＳ結合部位から中央空洞に向かって存在する。欠落している側鎖原子を、ＭａｅｓｔｒｏのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄを通して付加した。外向きのＧ１１１８結合構造中のＬＰＳの結合位置が示されている。図１８Ｄでは、ＭｓｂＡ－Ｇ１１１８－ＬＰＳの構造（青色）を、内向きのＭｓｂＡ（白色、ＰＤＢ：５ＴＶ４）と整列させる。ＬＰＳの１５Å以内の残基を、アライメントに使用した。 ＭｓｂＡ周囲ＬＰＳ結合部位変異体の細胞増殖表現型の評価を示す。図１９Ａは、２％アラビノースの存在下で、ｐＬＭＧ１８ベクターから大腸菌ＭｓｂＡのＷＴまたは示された変異体を発現する（これらの条件下では、タグなしＷＴ ＥｃＭｓｂＡも発現される）大腸菌ＭＧ１６５５ ｍｓｂＡ－ｃＫＯ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）からの可溶化抽出物のα－ＦＬＡＧ－ＭｓｂＡおよびα－ＧｒｏＥＬウエスタンブロットを示す。ブロットは、ｎ＝２の独立した実験を代表する。 ＭｓｂＡ周囲ＬＰＳ結合部位変異体の細胞増殖表現型の評価を示す。図１９Ｂ～Ｅは、アラビノースの存在下または非存在下で、大腸菌ＭｓｂＡの示されたＷＴもしくは変異体対立遺伝子を発現する大腸菌ＭＧ１６５５ ｍｓｂＡ－ｃＫＯ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）、またはプラスミドを含まないコントロールの増殖曲線を示す。２％アラビノースを使用して、染色体からのＷＴ大腸菌ＭｓｂＡの発現を誘導したが、これに対してアラビノースの非存在下では、ＭｓｂＡの唯一の供給源は、大腸菌ＭｓｂＡのＷＴまたは示された変異体を発現するｐＬＭＧ１８ベクターからの構成的発現である。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ＭｓｂＡ周囲ＬＰＳ結合部位変異体の細胞増殖表現型の評価を示す。図１９Ｆ～Ｉは、アラビノースの存在下または非存在下で、大腸菌ＭｓｂＡの示されたＷＴもしくは変異体対立遺伝子を発現する大腸菌ＭＧ１６５５ ｍｓｂＡ－ｃＫＯ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）、またはプラスミドを含まないコントロールの増殖曲線を示す。２％アラビノースを使用して、染色体からのＷＴ大腸菌ＭｓｂＡの発現を誘導したが、これに対してアラビノースの非存在下では、ＭｓｂＡの唯一の供給源は、大腸菌ＭｓｂＡのＷＴまたは示された変異体を発現するｐＬＭＧ１８ベクターからの構成的発現である。 ＭｓｂＡ周囲ＬＰＳ結合部位変異体の細胞増殖表現型の評価を示す。図１９Ｊは、ＷＴタンパク質と比べた、減少する濃度のＥｃＭｓｂＡ変異体のＡＴＰアーゼ活性の比較を示す。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。
Ｉ．定義
特に明記されない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本開示に従って利用されるように、以下の用語は、特に明記されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。複数の従属請求項の文脈において、「または」の使用は、択一選択肢としてのみ、先行する複数の独立または従属請求項を指す。また、「要素」または「成分」などの用語には、特に明記されていない限り、１つのユニットで構成される要素と成分、および複数のサブユニットで構成される要素と成分の両方が含まれる。
本明細書で使用される場合、移行用語「～から本質的になる」は、特許請求された方法の工程に言及する場合、方法が、方法の基本的および新規の特性に重大な影響を与える、指定された工程を超える追加の工程を含まないことを意味する。本明細書で使用される場合、移行用語「～から本質的になる」は、キットなどの組成物または製品に言及する場合、それが、その基本的および新規の特性に重大な影響を与える、指定されたものを超える追加の成分を含まないことを意味する。
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別途の指示がない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「（ａｎ）ＡＢＣトランスポータータンパク質」への言及には、複数のそのようなトランスポータータンパク質が含まれ、「（ｔｈｅ）細胞」への言及には、１つ以上の細胞（または複数の細胞）および当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、といった具合である。
本明細書に記載される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率の範囲、または整数範囲は、別途指示がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、および適切な場合には、それらの分数（整数の１０分の１および１００分の１など）の値を含むと理解されるべきである。
単位、接頭辞、記号は、国際単位系（ＳＩ）承認済みの形式で示される。数値の範囲は、範囲を定義する数値を含める。本明細書に提供される表題は、本開示の様々な態様を限定するものではなく、これは明細書全体を参照することによって実現することができる。したがって、すぐ下で定義されている用語は、本明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。
本明細書で使用される「ＡＢＣトランスポーター」は、ＡＴＰ結合カセット（「ＡＢＣ」）トランスポーターを指す。ＡＢＣトランスポーターは、無機および有機小分子、例えば、アミノ酸、糖類、ヌクレオシド、ビタミン、および金属クラスターから、ペプチド、脂質分子、オリゴヌクレオチド、および多糖類を含むより大きな有機化合物に至る、膜を通過する多くの基質の、ＡＴＰを動力源とする移行に関与する原核生物および真核生物において見出される内在性膜タンパク質のスーパーファミリーを構成する。ＡＢＣトランスポーターは、一般に、「エクスポーター」および「インポーター」にグループ分けされ得るが、一部のＡＢＣトランスポーターは、別のグループ、非トランスポーターＡＢＣタンパク質に分類される場合がある。
ＡＢＣトランスポーターは、一般に少なくとも４つのドメイン：膜内に埋め込まれた２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）を含む特徴的なアーキテクチャを有する。ＮＢＤ上のＡＴＰの加水分解は、ＴＭＤにおける立体配座変化を駆動し、基質を、膜を通過して一方通行に輸送するために、膜の内側および外側からの交互のアクセスをもたらす。各ＴＭＤは、膜貫通アルファヘリックスから構成されており、各ＴＭＤは、典型的には、６～１０の膜貫通アルファヘリックスを有し、大部分のエクスポーターは、１つのＴＭＤ当たり６つの膜貫通アルファヘリックスを有する。ＮＢＤは高度に保存されている。対照的に、移行経路を作り出すＴＭＤは、例えば、ＡＢＣトランスポーターが輸送されている基質に依存して、より変化しやすい。
Ｔｈｏｍａｓら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃａｌｌｓ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ」、５９４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７６７～３７７５（２０２０）（ＡＢＣトランスポーター分類システムのその記載に関して、その全体が参照により組み込まれる）に記載される１つの分類システムは、ＡＢＣトランスポーターを、それらのＴＭＤフォールドに基づいて７つの別々のタイプ、Ｉ～ＶＩＩにグループ分けしている。この用語体系は、普遍的に適用することができ、他にも情報はあるが、特に、配列解析、相同性モデル化、Ｘ線結晶構造解析および単粒子クライオ電子顕微鏡法によって決定されたＡＢＣトランスポーター構造情報に基づいている。Ｉ型トランスポーターは、以下の膜貫通ヘリックス構成：（５－６）＋（５－６／８）を有している。ＩＩ型トランスポーターは、以下の膜貫通ヘリックス構成：１０＋１０を有している。ＩＩＩ型トランスポーターは、以下の膜貫通ヘリックス構成：４－８（Ｔ）＋６－７（Ｓ）を有している。ＩＶ型トランスポーターは、以下の膜貫通ヘリックス構成：６＋６を有している。Ｖ型トランスポーターもまた、６＋６の膜貫通ヘリックス構成を有しており、配列類似性および既知の基質特異性に基づいてＡＢＣＧ／ＡＢＣＡ／Ｗｚｍ型のものであるとさらに定義されている。ＶＩ型トランスポーターもまた、６＋６の膜貫通ヘリックス構成を有しており、別個の構造的特徴に基づいてＬｐｔＢ２ＦＧ型のものであるとさらに定義されている。ＶＩＩ型トランスポーターは、以下の膜貫通ヘリックス構成：４＋４を有している。したがって、本明細書で使用される場合、「ＩＶ型」ＡＢＣトランスポーターは、例えば、この分類システムの下でＩＶ型に分類されるＡＢＣトランスポーターを指し、「Ｖ型」は、このシステムの下分類されるＶ型トランスポーターを指す等々である。
本明細書で使用される「外向き立体配座」および「内向き立体配座」という用語は、ＡＢＣトランスポーターの２つの膜貫通ドメインまたは領域（ＴＭＤ）のアルファ－ヘリックスの立体配座を指し、それらが、膜の内側領域からアクセス可能である（内向き）か、または膜の外側からアクセス可能である（外向き）かのいずれかの膜貫通細孔を形成するような方法で詰め込まれている。例えば、グラム陰性細菌細胞では、内膜に組み込まれたＡＢＣトランスポーターは、細孔が細胞質に向かって開いている内向き立体配座および細孔が周辺質（内膜と外膜との間の空間）に向かって開いている外向き立体配座を有している。グラム陽性細菌細胞または真核細胞では、細胞膜に組み込まれたＡＢＣトランスポーターは、細孔が細胞質に向かって開いている内向き立体配座および細孔が細胞の外側に向かって開いている外向き立体配座を有している。ミトコンドリアなどの細胞内小器官の膜に組み込まれたＡＢＣトランスポーターでは、ＡＢＣトランスポーターは、細孔が細胞内小器官の内腔に対して開いている外向き立体配座および細孔が細胞質／サイトゾルに対して開いている内向き立体配座を有している。したがって、外向き立体配座は、細孔が小器官の内腔に対して開いているものである。
ＡＢＣトランスポーターの「周辺質、細胞外、および／または内腔面」という用語は、トランスポーターが位置している膜に依存して、トランスポーターが外向き立体配座にあるときにアクセス可能であるＡＢＣトランスポーターの面または領域を指す。「周辺質、細胞外、および／または内腔の裂け目」は、タンパク質の外向き立体配座においてアクセス可能であるアルファ－ヘリックスの詰め込みによって形成されたポケットまたは細孔を指す。いくつかの場合には、例えば、グラム陰性細菌のＡＢＣトランスポーターでは、ＡＢＣトランスポーターの外側にある部分は、周辺質に面し、一方他の場合には、それは、細胞の外部に面している（例えば、細胞外）か、またはそれは内腔に面しており、ここではＡＢＣトランスポーターは細胞内小器官内にある（例えば、内腔）。したがって、本明細書で使用される「周辺質の裂け目」は、膜貫通ドメインのアルファ－ヘリックスの詰め込みによって形成された、ＡＢＣトランスポーター中のポケットまたは細孔を指し、これは、周辺質にアクセス可能である。本明細書で使用される「細胞外の裂け目」は、膜貫通ドメインのアルファ－ヘリックスの詰め込みによって形成された、ＡＢＣトランスポーター中のポケットまたは細孔を指し、これは、細胞の外側の環境にアクセス可能である。本明細書で使用される「内腔の裂け目」は、膜貫通ドメインのアルファ－ヘリックスの詰め込みによって形成された、ＡＢＣトランスポーター中のポケットまたは細孔を指し、これは、例えばミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体などの細胞内小器官の内腔にアクセス可能である。
本明細書で使用される「キメラＡＢＣトランスポーター」は、周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの１つ以上および当該ループ（単数または複数）の両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているＡＢＣトランスポーターを指す。例として、図１Ａ～Ｂの図面は、３つの周辺質（または細胞外または内腔）に面するループを示しており、これらの各々は、膜を横切る２本のアルファヘリックスを連結する。本明細書で使用される場合、異なるＡＢＣトランスポーターから挿入される「同等の領域」（「対応する領域」とも呼ばれる）は、残基が親ＡＢＣトランスポーターから除去されるときに折り畳まれる場合、タンパク質内の同じ位置にある領域である。いくつかの場合には、除去されキメラＡＢＣトランスポーターに由来する領域と置き換わるＡＢＣトランスポーター中の領域は、配列アライメントおよび２つのタンパク質に関する構造情報を使用して決定され得る。
いくつかの場合には、キメラＡＢＣトランスポーターは、親ＡＢＣトランスポーターおよび「異なる種の相同遺伝子」に由来する異なるＡＢＣトランスポーターから形成される。本明細書で使用される場合、この語句は、２つの遺伝子が同じ遺伝子ファミリーのメンバーであり、大腸菌および別のグラム陰性細菌種などの２つの異なる細菌種に由来する代表的なＭｓｂＡタンパク質などの同じ分子を輸送することができることを意味している。
本明細書で使用される「グラム陰性細菌」という用語は、グラム染色法が使用されるときに、クリスタルバイオレット色素を保持しない細菌を指す。グラム染色は、一般の細菌の同定のための一般的な方法である。グラム染色法では、細菌はスライドガラス上に熱固定し、クリスタルバイオレット色素で染色し、ヨウ素で洗い流し、アルコールまたは別の有機溶媒で脱色した後、サフラニンで対比染色することができる。グラム反応は、細菌の生化学的特性および構造特性における根本的な差異を反映する。グラム陽性細菌は、それらが、溶媒が容易に浸透できない単一の厚い細胞壁を有するので、紫色のままである。グラム陰性細菌は、それらが溶媒による色素の除去を可能にする非常に薄い層を有する細胞壁を有するので、脱色される。最終段階において、サフラニンはグラム陰性細胞を赤色に染色する。
本明細書で使用される「グラム陽性細菌」という用語は、グラム染色法が使用されるときに、クリスタルバイオレット色素を保持する細菌を指す。グラム染色は、一般の細菌の同定のための一般的な方法である。グラム染色法では、細菌はスライドガラス上に熱固定し、クリスタルバイオレット色素で染色し、ヨウ素で洗い流し、アルコールまたは別の有機溶媒で脱色した後、サフラニンで対比染色することができる。グラム反応は、細菌の生化学的特性および構造特性における根本的な差異を反映する。グラム陽性細菌は、それらが、溶媒が容易に浸透できない単一の厚い細胞壁を有するので、紫色のままである。グラム陰性細菌は、それらが溶媒による色素の除去を可能にする非常に薄い層を有する細胞壁を有するので、脱色される。最終段階において、サフラニンはグラム陰性細胞を赤色に染色する。
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、２～５０個、２～１５個、２～１０個、２～８個、または６～１４個のアミノ酸のアミノ酸鎖を含む、ペプチド結合によって連結された５０個以下のアミノ酸の鎖を指す。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、５０ダルトン～２５００ダルトンの分子量を有する有機分子を指す。
本明細書で使用される「大環状分子（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ）」または「大環状分子（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、環状高分子または高分子の高分子環部分を指す。大環状分子は、５００ダルトン～２０００ダルトンのサイズの範囲である。本明細書のいくつかの場合には、大環状分子は、環状ペプチドまたはペプチド誘導体である。
本明細書で使用される「結合断片」という用語は、ＡＢＣトランスポーターに直接接触することが予想される小分子、ペプチド、または抗体などのより大きな分子の一部を指す。結合断片は、ハイスループットスクリーニングで使用され得る。
本開示において、「結合する」または「結合」または「特異的結合」および類似の用語は、ＡＢＣトランスポータータンパク質またはキメラＡＢＣトランスポータータンパク質に「結合する」分子に言及する場合、例えば、結合対のメンバー間の相互作用が、ランダムな分子会合によるもの（「非特異的結合」）によるものではあり得ないほど結合親和性が十分に強いことを意味する。したがって、結合は、選択的または特異的である。そのような結合は、典型的には、１００μＭ以下の解離定数（ＫＤ）（すなわち、１００μＭ以上の親和性に相当する）を必要とし、多くの場合、２０μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、または５００ｎＭ以下のＫＤを伴い得る。
本明細書で使用される「競合アッセイ」という用語は、試験されている分子が、参照分子の共通の標的への特異的結合を妨害または阻害するアッセイを指す。
「ＡＴＰアーゼアッセイ」という用語は、ＡＢＣトランスポータータンパク質などのタンパク質によるＡＴＰのＡＤＰへの変換の程度を測定するのに使用されるアッセイを指す。
「治療する」という用語、ならびにそれに由来する単語は、本明細書で使用される場合、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、例えば、少なくとも１つの症状または状態を低減すること、いくつかの場合には、例えば、約１００％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％を含む、様々な程度の治療がある。さらに、治療はまた、障害の１つ以上の状態もしくは症状の予防、改善、または阻害、ならびに障害、またはその症状の発症を遅延することも含む。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療されている疾患または状態、例えば感染症の症状の内の１つ以上をある程度まで軽減する投与されている本明細書に開示される分子の十分な量を指す。
必要に応じて、他の定義が以下のセクションに含まれる。
ＩＩ．キメラＡＢＣトランスポーター
いくつかの実施形態では、本発明は、キメラＡＢＣトランスポーターを含む。
いくつかの実施形態では、キメラＡＢＣトランスポーターを作製するために、出発物質は、特異的ＡＢＣトランスポーター（「親」ＡＢＣトランスポーター）である。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、真核細胞に由来する。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ヒトＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、グラム陽性細菌に由来する。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、グラム陰性細菌に由来する。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、細胞内小器官膜中に埋め込まれ得るものである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ株－ＯＨ－２から選択される、特定の細菌種に見出されるトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ＭｓｂＡ、例えば、大腸菌ＭｓｂＡである。
いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターが選択された後、いくつかの実施形態では、異なる生物体または種に由来する、同等であるが異なるＡＢＣトランスポーターが同定され、親トランスポーターを用いてキメラを形成するために、それからアミノ酸配列または領域が採取される。いくつかの場合には、目的は、親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子が、同等の領域であるが、キメラがその正確なアーキテクチャに適切に折り畳まれる以外は十分に類似している領域で異なるＡＢＣトランスポーターと結合しないほど、配列が十分に異なる、異なるＡＢＣトランスポーターを同定することである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターと２０～９９％の配列同一性を共有する異なるＡＢＣトランスポ－ターを探索することによって、異なるＡＢＣトランスポーターを同定する。いくつかの実施形態では、異なるＡＢＣトランスポーターは、試験されているものと相同な遺伝子に由来するが、異なる、任意選択で関連する種または生物体に由来する。例えば、いくつかの場合には、キメラは、２つの異なる細菌種もしくは属、またはヒトおよびマウス、またはヒトおよび霊長類などの種に由来する相同遺伝子のＡＢＣトランスポーター、例えば、２つの異なる細菌種に由来するＭｓｂＡタンパク質から構築されてもよい。いくつかの実施形態では、それらが知られている場合は親ＡＢＣトランスポーターの３次元構造が、異なるＡＢＣトランスポーターの３次元構造と比較される。
いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターがヒトタンパク質である場合、異なるＡＢＣトランスポーターは、異なる真核生物種からの相同遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、異なるＡＢＣトランスポーターは、異なる哺乳動物種の相同遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陽性細菌に由来する場合、異なるＡＢＣトランスポーターは、別のグラム陽性細菌に由来し、任意選択で、その他の種の相同遺伝子に由来するものである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する場合、異なるＡＢＣトランスポーターは、グラム陰性細菌に由来し、任意選択で、その他の種の相同遺伝子に由来するものである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターは、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、またはマグネトスピラ株－ＯＨ－２から選択される、２つの異なる種から選択される。いくつかの実施形態では、キメラＡＢＣトランスポーターは、真核細胞、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、もしくはマグネトスピラ株－ＯＨ－２、および／またはＭｓｂＡから選択される親ＡＢＣトランスポーターの領域と、真核細胞、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム、チオミクロスピラ・サイクリカ、もしくはマグネトスピラ株－ＯＨ－２、および／またはＭｓｂＡから選択される異なるＡＢＣトランスポーターの領域とを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターをそれらの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）フォールドに基づいて７つの別々のタイプ、Ｉ～ＶＩＩにグループ分けしている、Ｔｈｏｍａｓら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃａｌｌｓ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ」、５９４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７６７～３７７５（２０２０）（ＡＢＣトランスポーター分類システムのその記載に関して、その全体が参照により組み込まれる）の分類システムにおいて定義されるような、親ＡＢＣトランスポーターと同じタイプのＡＢＣトランスポーターである異なるＡＢＣトランスポーターを選択することは有利であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、Ｉ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、Ｉ型ＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ＩＩ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、ＩＩ型ＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ＩＩＩ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、ＩＩＩ型ＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ＩＶ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、ＩＶ型ＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、Ｖ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、Ｖ型ＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ＶＩ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、ＶＩ型ＡＢＣトランスポーターである。いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターは、ＶＩＩ型ＡＢＣトランスポーターであり、異なるＡＢＣトランスポーターは、ＶＩＩ型ＡＢＣトランスポーターである。
ＡＢＣトランスポーターは、一般に少なくとも４つのドメイン：膜内に埋め込まれた２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）（膜貫通セグメントは、ＴＭＤの一部であり得る）および２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）を含む特徴的なアーキテクチャを有する。各ＴＭＤは、膜貫通アルファヘリックスから構成されており、各ＴＭＤは、典型的には、６～１０の膜貫通アルファヘリックスを有し、大部分のエクスポーターは、１つのＴＭＤ当たり６つの膜貫通アルファヘリックスを有する。いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターは、分子が外向き立体配座にあるとき、周辺質、細胞外、または内腔空間に面するループと、そのようなループの両側に接続する膜貫通セグメントとを有する。（図１Ａ～１Ｃを参照されたい。）いくつかの実施形態では、トランスポーターは、３つのそのようなループを有する。いくつかの実施形態では、トランスポーターは、６つのそのようなループを有する。
図１Ａは、大腸菌由来のＡＢＣトランスポーターの模式図を示す。ＴＭＤは、膜領域を横断するアミノ酸鎖の一部であり、これらは典型的にはアルファ－ヘリックスである。模式図における６つのＴＭＤは、１～６でラベル付けされている。模式図は、膜の周辺質側のループおよび膜の細胞質側のループも示している。ループは、各々、ＴＭＤに接続する第１の端部と、ＴＭＤに接続する第２の端部と、周辺質または細胞質に接触する部分とを有する。示されたＡＢＣトランスポーターは、周辺質に対面する３つのループ（例えば、ＭｓｂＡのループ１、３、および５に対応するループ１、２、および３（ＭｓｂＡのループ２、４、および６は、細胞質に面している））を有する。長方形のボックスは、異なるＡＢＣトランスポーターに由来する同等の領域で置換され得る領域、すなわち、周辺質に対面するループのうちの少なくとも１つ、またはループのうちの３つ全て、およびＴＭＤセグメントの最大５０％を示す。
図１Ｂは、ヒトＡＢＣトランスポーターＡＢＣＤ４由来のＡＢＣトランスポーターの模式図を示す。模式図における６つのＴＭＤは、１から６までラベル付けされている。模式図は、膜の細胞外側のループおよび膜のサイトゾル側のループも示している。模式図では、細胞外側のループは、１から３までラベル付けされている。長方形のボックスは、異なるＡＢＣトランスポーターに由来の同等の領域で置換され得る領域を示す。
図１Ｃは、ヒトＡＢＣトランスポーターＡＢＣＣ１由来のＡＢＣトランスポーターの模式図を示す。このＡＢＣトランスポーターは、図１Ａおよび１Ｂにも示されている大腸菌およびヒトＡＢＣＤ４に由来するＡＢＣトランスポーターとは構造的に異なるが、同じ識別特性が多数存在する。例えば、細胞外ループがあるが、ＡＢＣＤ４のような３つの細胞外ループの代わりに、模式図に１から６までラベル付けされている６つの細胞外ループがある。同様に、１２個のＴＭＤがあり、これらは模式図では１から１２までラベル付けされている。長方形のボックスは、異なるＡＢＣトランスポーターに由来の同等の領域で置換され得る領域を示す。
図１Ａ～Ｃの３つの模式図の各々において、長方形のボックスは、異なるＡＢＣトランスポーターに由来の同等の領域で置換され得る領域を示す。いくつかの実施形態では、キメラにおいて置き換えられるループの両側のＴＭＤの最大５０％、０～５０％、１０～５０％、２５～５０％、０～１０％、０～２５％、または１０～２５％がまた置き換えられる。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％（すなわち、５０％、０～５０％、１０～５０％、２５～５０％、０～１０％、０～２５％、または１０～２５％）が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているキメラＡＢＣトランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているキメラＡＢＣトランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているキメラＡＢＣトランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているキメラＡＢＣトランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、２つ以上、または全ての周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％（すなわち、５０％、０～５０％、１０～５０％、２５～５０％、０～１０％、０～２５％、または１０～２５％）が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているキメラＡＢＣトランスポーターを含む。
いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターにおけるループおよび膜貫通セグメントの位置（すなわち、境界）の予測は、利用可能な場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の利用可能な実験構造テンプレートに基づいて、または代替的に、最も近い利用可能なＰＤＢ構造テンプレートと標準相同性モデル化手法およびソフトウェア（すなわち、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌｌ、Ｐｈｙｒｅ２、ＭＯＥ）を使用することによって、行うことができる。いくつかの実施形態では、好適なＰＤＢテンプレートの非存在下では、ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターにおけるループおよび膜貫通セグメントの位置（すなわち、境界）の予測はまた、標準的なデータベースまたはアルゴリズム（すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＴＭＨＭＭサーバなど）を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターならびに各々における少なくとも１つのループおよび／または膜貫通セグメントの位置が特定されたら、ＡＢＣトランスポーターの領域を、異なるＡＢＣトランスポーターに由来する領域で置き換えて、キメラＡＢＣトランスポーターを作り出すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、ＡＢＣトランスポーターに由来する領域がループ１である場合、異なるＡＢＣトランスポーターに由来する同等の領域もループ１である。いくつかの実施形態では、例えば、ＡＢＣトランスポーターに由来する領域が膜貫通セグメント／ＴＭＤ１の２５％である場合、異なるＡＢＣトランスポーターに由来する同等の領域も膜貫通セグメント／ＴＭＤ１の２５％である。
いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターがＭｓｂＡである場合、キメラＡＢＣトランスポーターは、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がシュードモナス・サイクロトレランスの同等の領域（ＰｐＭｓｂＡ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ１Ｇ５ＰＥＬ０）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６０７５２で入手可能なアミノ酸配列）を含む。（本明細書でのループという専門語は、周辺質および細胞質ループの両方と見なされ、Ｌ１、Ｌ３、およびＬ５は周辺質に面し、Ｌ２、Ｌ４、およびＬ６は細胞質に面している。したがって、ＥｃＭｓｂＡのＬ１、Ｌ３、およびＬ５は、図１Ａに示されるループ１、２、および３と同等である。）配列は、大腸菌タンパク質のアミノ酸配列に基づいており、これは寄託番号Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６０７５２を有する（参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｕｎｉｐｒｏｔ（ｄｏｔ）ｏｒｇ ｅｎｔｒｙ Ｐ６０７５２を参照されたい）。また、本明細書の配列表（表７）も参照されたい。
いくつかの実施形態では、キメラＡＢＣトランスポーターは、周辺質ループ１（Ｌ１、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５、ＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２）がカンジダタス・アキュムリバクター種ＳＫ－１２の同等の領域（ＣａＭｓｂＡ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ０１１ＮＬＬ４）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含む。
いくつかの実施形態では、キメラＡＢＣトランスポーターは、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスムの同等の領域（ＪａＭｓｂＡ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ３Ｇ２Ｅ７Ｎ４）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含む。
いくつかの実施形態では、キメラＡＢＣトランスポーターは、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上が、ＤＳＭ １４４７７由来のチオミクロスピラ・サイクリカの同等の領域（ＴｃＭｓｂＡ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｆ６ＤＣＹ０）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含む。
いくつかの実施形態では、キメラＡＢＣトランスポーターは、周辺質ループ１（Ｌ１）中の残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２がマグネトスピラ種株－ＯＨ－２の同等の領域（ＭｑＭｓｂＡ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｗ６ＫＣＮ７）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含む。
ＩＩＩ．キメラＡＢＣトランスポーターを使用するスクリーニング法
本開示は、特に、上述したようなタンパク質のキメラバージョンを使用して、特定のＡＢＣトランスポータータンパク質の周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子を同定する方法を包含する。いくつかの場合には、本方法は、タンパク質の周辺質、細胞外、および／または内腔の裂け目に結合する分子を同定する。
いくつかの実施形態では、方法は、試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するかどうかを判定することを含み、（ａ）上述されたように、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、（ｂ）キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子と接触させることとを含み、試験分子がキメラＡＢＣトランスポーターに結合しない場合、試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合すると判定される。
いくつかの場合には、例えば、（ａ）親ＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップすることと、次いで（ｂ）上記工程を完了する前に、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子を選択することによって、分子が外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合するかどうかを決定するために、分子が最初に試験される。したがって、この選択の後に、方法は、（ｃ）上述されたように、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、（ｄ）キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する（ｂ）の試験分子と接触させることとを含み、試験分子がキメラＡＢＣトランスポーターに結合しない場合、試験分子が、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合すると判定される。これらの方法のいずれかでは、いくつかの実施形態では、方法は、キメラＡＢＣトランスポーターを試験分子と接触させる前に、キメラＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップすることをさらに含む。上記方法において、ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターは、ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターをＭｇ２＋、ＡＴＰ、バナジン酸塩（例えば、バナジン酸塩またはオルトバナジン酸塩アニオン）で処理することによって、外向き立体配座にトラップされ得る。
これらの基本的工程もまた、例えば、図６に例示されている。図６に描写するように、ＡＢＣトランスポーターは、内向きおよび外向き立体配座の両方を有する。キノリンクラスにおけるものなどの以前に同定されたＡＢＣトランスポーターバインダーは、図６の左側の２番目のパネルに示すように、内向き立体配座に結合する。本明細書に記載されるように、トランスポーターを、Ｍｇ２＋、ＡＤＰ、およびバナジン酸塩の組み合わせなどの薬剤による処理によって外向き立体配座にトラップし、こうして、タンパク質の周辺質、細胞外、または内腔面を露出させ、付随する周辺質、細胞外、または内腔裂け目を露出させることもできる。図６。周辺質、細胞外、および／または内腔面もしくはその付随する裂け目に結合する分子を選択的に同定するために、上述した（図１Ａ～１Ｃ、２Ａ～２Ｃ、および６）適切なキメラＡＢＣトランスポーターを使用して対抗選択が実施され得る。親ＡＢＣトランスポーターに結合するが、適切なアッセイ条件下でキメラには結合しない分子、例えば、キメラヌルバインダーを選択することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ビーズまたはマトリックスプラットフォーム上などに固定化されている試験分子またはＡＢＣトランスポーターのいずれかを用いて実施される。いくつかの場合には、親ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターは、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンまたは試薬の類似のセットを使用して、ビーズまたはマトリックスプラットフォーム上に固定化される。固定化にビーズが使用される場合、それらは、例えば、フレークまたはチップ、球体、ペレットなどの任意の形状を有し得る。マトリックスは、ビーズまたはより小さい粒子から構成されてもよく、例えば、スラリーまたはゲルであってもよく、これが次にマイクロウェルプレートなどのプレートまたはチップ上に配置され得る。いくつかの実施形態では、マトリックスまたはビーズは、ストレプトアビジン、アビジン、または脱グリコシル化アビジンでコーティングされている。いくつかの実施形態では、ビーズは、例えば、磁気機器の使用によって、アッセイ中のビーズの収集を容易にするために、磁性ビーズである。例えば、いくつかの場合には、タンパク質がビオチン化され、次いでストレプトアビジンでコーティングされたマトリックスまたはビーズに曝露され、これにより、タンパク質がマトリックスまたはビーズに取り付けできるようにしてもよい。
親および／またはキメラＡＢＣトランスポーターが固定化されており、一方試験分子が溶液中にあるものなどの、本明細書のある特定のアッセイでは、特定のトランスポーターに結合すると判定される分子は、固定化されているトランスポーターのインキュベーションおよび洗浄後にアッセイ条件下で固定化されているトランスポーターに結合したままであるもの、したがって、溶出バッファーの添加時にタンパク質結合マトリックスまたはビーズから溶出するものとして特定され得る。アッセイにおいて特定のトランスポータータンパク質に結合しない分子は、溶出バッファーの添加時に溶出されない（例えば、微量レベルを超えて）もの、したがって、タンパク質結合マトリックスまたはビーズの洗浄時に固定化されているタンパク質から除去されるものとして特定され得る。
いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターまたはキメラＡＢＣトランスポーターは、それが正確な外向き立体配座を形成するために適切なフォールドおよび能力を維持するように、生態膜を模倣する界面活性剤または類似の分子中に可溶化される。ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターを可溶化させるための例示的な界面活性剤または関連する分子もしくはシステムとしては、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）が挙げられ、いくつかの実施形態では、０．０２％ＬＭＮＧ、ならびにドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）、ｂｒｉｊ－３５、グリコール－ジオスゲニン、ジギトニン、アンフィフォール、例えばアンフィフォールＡ８－３５、および脂質ナノディスクが挙げられる。例えば、界面活性剤は、トランスポーターを可溶化して、それを安定化させることができ、一方アンフィフォールは、タンパク質の疎水性部分を効果的に包み込み、それらを安定化させることができ、タンパク質はまた、脂質ナノディスクによって作り出された一種の脂質二重層内で安定化され得る。
いくつかの実施形態では、試験分子のライブラリーがスクリーニングされる。ライブラリーは、マトリックスまたはビーズ上のキメラＡＢＣトランスポーターと接触され、次いで、洗浄バッファーで少なくとも１回洗浄され、非結合分子を除去することができる。次いで、結合した試験分子が溶出され、分析される。関連するキメラＡＢＣトランスポーターでその外向き立体配座にあるものと比較して、外向き立体配座にあるＡＢＣトランスポーターに優先的に結合する分子は、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するものとして特定され得、なぜなら、それらの領域は、キメラＡＢＣトランスポーター中で突然変異しているためである。
いくつかの実施形態では、上記のスクリーニングで選択された分子に対して、例えば、親ＡＢＣトランスポーターおよびキメラＡＢＣトランスポーターのそれぞれに対するそれらの結合親和性を決定するために、またそれらがＡＢＣトランスポーターの機能にどのように影響を及ぼすかを決定するために、さらなる実験が実施される。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、同定された分子の存在下で、ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰ対ＡＤＰ活性を決定するために、ＡＴＰアーゼアッセイが実施される。いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する同定された分子は、ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼ活性の阻害剤として作用し得る。ＡＴＰアーゼアッセイは、当該技術分野において公知であり、様々な市販のキットが入手可能であり、例えば、Ｔａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ ＡＤＰ２ Ａｓｓａｙ（ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．＃３０１０－１Ｋ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＡＴＰ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．＃Ａ２２０６６）がそうである。
いくつかの実施形態では、同定された分子の親ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターに対する結合親和性を判定することができる。いくつかの場合には、これは、初期スクリーニングで使用されたものと同様なＥＬＩＳＡアッセイで行うことができ、例えば、ＩＣ５０値を得る。いくつかの場合には、例えば、マトリックスまたはビーズに結合した親ＡＢＣトランスポーターおよび溶液中に遊離するキメラＡＢＣトランスポーター（逆もまた同じ）を使用する、競合ＥＬＩＳＡアッセイが実施されてもよい。対応するキメラＡＢＣトランスポーターよりも優先して親ＡＢＣトランスポーターに結合する分子は、キメラＡＢＣトランスポーターの存在下および非存在下で、親ＡＢＣトランスポーターにほぼ同程度まで結合するはずである。そのようアッセイは、例えば、以前のスクリーニングで同定された特定の試験分子または分子が、トランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に対して選択的であることを確認するために実施されてもよい。いくつかの実施形態では、結合アッセイは、細胞の細胞膜中での、または別途その正常な細胞状態での親ＡＢＣトランスポーターに対する結合を試験するために、細胞培養物で実施されてもよい。他のタイプの結合アッセイは、当該技術分野において公知である。
いくつかの実施形態では、親ＡＢＣトランスポーターの機能に対するスクリーニングで同定された分子の効果を試験するために、１つ以上の機能性アッセイが実施されてもよい。例えば、いくつかの場合には、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合する分子は、トランスポーターの阻害剤として作用する。例えば、ＡＢＣトランスポーター活性の阻害が、例えば、細胞生存能力の喪失または細胞増殖の低減をもたらすと予想される場合、細胞生存アッセイまたは増殖アッセイを実行して、同定された分子の存在がこれらのパラメータに影響を及ぼすかを決定することができる。いくつかの場合には、トランスポーターの機能に対する分子の影響を決定するために、他のアッセイを実行してもよい。いくつかの場合には、分子の存在下および非存在下でのトランスポーターの基質の輸送を試験することができる。例えば、以下の実施例で試験されるＭｓｂＡの場合には、ある特定の結合分子は、電子顕微鏡（ＥＭ）分析に基づいて、タンパク質によるＬＰＳ輸送を遅くすることが判明した。ＬＰＳ輸送の欠如は、ＥＭによってはっきりと視認できる、細菌細胞の表面における内膜および外膜の積層を引き起こす。例えば、図３Ｅを参照されたい。当該ＡＢＣトランスポーターについての適切な機能性アッセイは公知であるか、または当該技術分野の知識に基づいて容易に開発することができる。
ＩＶ．スクリーニング法のための試験分子
いくつかの実施形態では、本開示は、特定のタイプの分子を試験するスクリーニング法、ならびに本明細書に記載のスクリーニング法のいずれかによって特定のＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面もしくは裂け目に結合するものとして同定された分子を含む。いくつかの場合には、同定された分子は、スクリーニング法で使用されるキメラＡＢＣトランスポーターに結合しないが、キメラがベースとしている親ＡＢＣトランスポーターには結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、親ＡＢＣトランスポーターに、スクリーニングに使用されるキメラＡＢＣトランスポーターよりも少なくとも１０倍緊密な親和性で結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、親ＡＢＣトランスポーターに、スクリーニングに使用されるキメラＡＢＣトランスポーターよりも少なくとも１００倍緊密な親和性で結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、親ＡＢＣトランスポーターに、スクリーニングに使用されるキメラＡＢＣトランスポーターよりも少なくとも１０００倍緊密な親和性で結合する。
いくつかの実施形態では、試験される分子は、ペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１４－ｍｅｒペプチド、例えば、６～１２－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、８～１２－ｍｅｒ、８～１０－ｍｅｒなどである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１４－ｍｅｒである。表３および図３Ｆを参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８～１０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～８－ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８－ｍｅｒである。図３Ｅおよび３Ｇ～Ｌ、ならびに表５を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、３～４０－ｍｅｒ、３～２０－ｍｅｒ、４～１６－ｍｅｒ、４～１４－ｍｅｒまたは６～１４－ｍｅｒであり、例えば、３－ｍｅｒ、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、１７－ｍｅｒ、１８－ｍｅｒ、１９－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、２１－ｍｅｒ、２２－ｍｅｒ、２３－ｍｅｒ、２４－ｍｅｒ、２５－ｍｅｒ、２６－ｍｅｒ、２７－ｍｅｒ、２８－ｍｅｒ、２９－ｍｅｒ、３０－ｍｅｒ、３１－ｍｅｒ、３２－ｍｅｒ、３３－ｍｅｒ、３４－ｍｅｒ、３５－ｍｅｒ、３６－ｍｅｒ、３７－ｍｅｒ、３８－ｍｅｒ、３９－ｍｅｒ、または４０－ｍｅｒである。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、６～１４－ｍｅｒの大環状分子、例えば、６～１２－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、８～１２－ｍｅｒ、８～１０－ｍｅｒなどである。いくつかの実施形態では、大環状分子は、１４－ｍｅｒの大環状分子である。表３および図３Ｆを参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状分子は、６～１０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、８～１０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、６～８－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、８－ｍｅｒの大環状分子である。図３Ｅおよび３Ｇ～Ｌ、ならびに表５を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状分子は、３～４０－ｍｅｒ、３～２０－ｍｅｒ、４～１６－ｍｅｒ、４～１４－ｍｅｒまたは６～１４－ｍｅｒであり、例えば、３－ｍｅｒ、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、１７－ｍｅｒ、１８－ｍｅｒ、１９－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、２１－ｍｅｒ、２２－ｍｅｒ、２３－ｍｅｒ、２４－ｍｅｒ、２５－ｍｅｒ、２６－ｍｅｒ、２７－ｍｅｒ、２８－ｍｅｒ、２９－ｍｅｒ、３０－ｍｅｒ、３１－ｍｅｒ、３２－ｍｅｒ、３３－ｍｅｒ、３４－ｍｅｒ、３５－ｍｅｒ、３６－ｍｅｒ、３７－ｍｅｒ、３８－ｍｅｒ、３９－ｍｅｒ、または４０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、少なくとも１つの親油性側鎖と、少なくとも１つの正荷電側鎖とを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書のスクリーニングで試験される分子は、小分子である。いくつかの実施形態では、試験される分子は抗体であり、これには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかの完全長抗体だけではなく、Ｆｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合断片、ナノボディ、一本鎖抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体も含まれ得る。
いくつかの実施形態では、試験される分子は、ペプチドの結合断片、小分子の結合断片、または抗体の結合断片（例えば、抗原結合断片）である。
大腸菌ＭｓｂＡのバインダーに対するスクリーニングで同定された特定の大環状分子も本明細書に包含される。いくつかの実施形態では、大環状分子は、１４－ｍｅｒの大環状分子であるＧ１１１８である。図３Ｆ、４Ａ～Ｄ、および６～を参照されたい。Ｇ１１１８は、大腸菌ＭｓｂＡに、例えば、ｉｍｐ大腸菌株（外膜は透過性である）におけるＭｓｂＡに５ｎＭのＩＣ５０で結合するものとして同定された。図３Ｆを参照されたい。Ｇ１１１８は、配列ＣｌＡｃ－ＦＷＷＬＷＤＤＶＳＷＷＭｅＦＶＣＮＨ２またはＣｌＡｃ－ＦＷＷＬＷＤＤＶＳＷＷＭｅＦＶＣＧＫＫＮＨ２を有する。いくつかの実施形態では、大環状分子はＧ１３６５であり、これは８－ｍｅｒの大環状分子である。図３Ｅ、３Ｇ～Ｌ、および４Ｊ～Ｎを参照されたい。Ｇ１３６５は、配列ＣｌＡｃ－ＦＶＹＢｐｈＭｅＦＲＶＣＮＨ２を有する。Ｇ１３６５は、ｉｍｐ大腸菌ＭｓｂＡに、例えば３００ｎＭの生化学的ＩＣ５０で結合するものとして同定され、これは、透過性外膜を有するｉｍｐ株で試験される場合、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（Ａ．ｂａｕ．））からのＭｓｂＡに対する親和性よりも少なくとも１０倍緊密な、大腸菌ＭｓｂＡに対する親和性を有する。図３Ｇ～Ｌおよび以下の表５を参照されたい。
試験された大環状ペプチド活性化因子は、１４－ｍｅｒのＧ１１１８（配列番号１または２）、ならびに大環状ペプチドＧ１１１９（ＣｌＡｃ－ＦＷＷＬＷＳＤＭｅＧＤＷＷＭｅＦＶＣ－ＮＨ２；配列番号１０）およびＧ１１２２（ＣｌＡｃ－ＦＲＹＬＷＭｅＡＷＧＬＶＷＤＮＣ－ＮＨ２；配列番号１１）、および８－ｍｅｒのＧ１３６５（配列番号３）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のスクリーニングで同定された分子は、ＡＢＣトランスポーターに２０μＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに１０μＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに２０ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに５００ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに１ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに１～２０μＭのＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに１０～２０μＭのＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに１ｎＭ～２０μＭのＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、この分子は、ＡＢＣトランスポーターに１ｎＭ～５００ｎＭのＫＤで結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、スクリーニング法で使用されるキメラＡＢＣトランスポーターに結合しないが、キメラがベースとしている親ＡＢＣトランスポーターには結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、親ＡＢＣトランスポーターに、スクリーニングに使用されるキメラＡＢＣトランスポーターよりも少なくとも１０倍緊密な親和性で結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、親ＡＢＣトランスポーターに、スクリーニングに使用されるキメラＡＢＣトランスポーターよりも少なくとも１００倍緊密な親和性で結合する。いくつかの場合には、同定された分子は、親ＡＢＣトランスポーターに、スクリーニングに使用されるキメラＡＢＣトランスポーターよりも少なくとも１０００倍緊密な親和性で結合する。結合親和性は、当該技術分野において公知の方法によって決定することができる。
いくつかの実施形態では、特定のＡＢＣトランスポーターに結合するものとして同定される分子は、他の試験分子をスクリーニングするために使用されるアッセイにおけるポジティブコントロールとして、または競合物質として使用され得る。例えば、いくつかの方法では、分子は、それが既に知られている分子と競合して、同じＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔面もしくは裂け目に結合することを決定することによって、ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔面もしくは裂け目に結合するものとして同定される。例えば、大腸菌ＭｓｂＡの場合、大環状分子Ｇ１１１８およびＧ１３６５、ならびにＧ１１１９およびＧ１１２２は、追加のバインダーを探すために、アッセイにおいて競合剤またはポジティブコントロールとして使用され得る。いくつかのそのような実施形態では、スクリーニングは、大腸菌ＭｓｂＡが、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩での処理によるなど、外向き立体配座にトラップされると、大腸菌ＭｓｂＡの周辺質面への結合についてＧ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２と競合する分子を同定し得る。いくつかの実施形態では、分子は、競合アッセイにおいて、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２のＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する。いくつかのそのような実施形態では、スクリーニングは、大腸菌ＭｓｂＡが、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩での処理によるなど、外向き立体配座にトラップされると、大腸菌ＭｓｂＡの周辺質面への結合についてＧ１３６５と競合する分子を同定し得る。いくつかの実施形態では、分子は、競合アッセイにおいて、Ｇ１３６５のＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する。
いくつかの実施形態では、１４－ｍｅｒの大環状ペプチドは、以下の配列：ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｘ２－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－ＭｅＦ－Ｖ－Ｃを含んでもよく、式中、Ｘ１は、Ｗ、Ｖ、またはＹであり；Ｘ２は、ＷまたはＹであり；Ｘ３は、ＷまたはＹであり；Ｘ４は、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨであり；Ｘ５は、Ｎであり、Ｎが、Ｃ以外の任意の天然アミノ酸、またはＢｐｈ（（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸）、Ｄｏｐａ（Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）、ＭｅＦ（Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン）、およびＭｅＧ（Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン）から選択される非天然アミノ酸から選択され；Ｘ６は、Ｙ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、またはＶであり；Ｘ７は、Ｗ、Ｙ、またはＢｐｈであり；Ｘ８は、ＷまたはＹであり；任意選択で、ペプチドは、Ｃ末端でのＣ残基に続くＧ残基をさらに含み、ＣｌａｃＦは、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈは、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａは、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦは、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンであり、ＭｅＧは、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシンである。
いくつかの場合には、Ｘ１はＷまたはＹである。いくつかの場合には、Ｘ１はＷである。いくつかの場合には、Ｘ２はＷである。いくつかの場合には、Ｘ３はＷである。いくつかの場合には、Ｘ４は、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨである。いくつかの場合には、Ｘ４はＤである。いくつかの場合には、Ｘ５は、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、またはＹである。いくつかの場合には、Ｘ５は、ＶまたはＨである。いくつかの場合には、Ｘ５はＶである。いくつかの場合には、Ｘ６は、ＤまたはＳである。いくつかの場合には、Ｘ６はＳである。いくつかの場合には、Ｘ７はＷである。いくつかの場合には、Ｘ８はＷである。上記実施形態のいくつかでは、大環状分子は、ＣｌａｃＦのＮ末端のクロロアセチル基とＣ残基のスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合のために環化している。
いくつかの実施形態では、８－ｍｅｒの大環状ペプチドは、以下の配列：ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｙ－Ｂｐｈ－ＭｅＦ－Ｘ２－Ｖ－Ｃを含んでもよく、式中、Ｘ１は、Ｖ、Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｄｏｐａ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｋ、またはＤであり、Ｘ２は、Ｒ、Ｖ、Ｄｏｐａ、またはＹであり、ＣｌａｃＦは、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈは、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａは、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦは、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンである。いくつかの場合には、Ｘ１は、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｋ、またはＤである。いくつかの場合には、Ｘ１は、ＶまたはＹである。いくつかの場合には、Ｘ１は、Ｖである。いくつかの場合には、Ｘ２は、ＲまたはＹである。いくつかの場合には、Ｘ２は、Ｒである。いくつかの実施形態では、大環状分子は、ＣｌａｃＦのＮ末端のクロロアセチル基とＣ残基のスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合のために環化している。
他の場合には、大環状分子は、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、またはＧ１１２２の配列（配列番号１または２（Ｇ１１１８の場合）、配列番号１０（Ｇ１１１９の場合）、または配列番号１１（Ｇ１１２２の場合））を有する。さらに他の場合には、大環状分子は、Ｇ１３６５の配列（配列番号３）を有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドまたは大環状分子は、抗生物質または抗菌薬などの別の分子にコンジュゲートしており、任意選択で、コンジュゲーションは、配列のＣ末端アミノ酸残基におけるものである。いくつかの実施形態では、抗生物質または抗菌薬は、ポリミキシン、例えば、ポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである。
Ｖ．分子複合体
いくつかの実施形態では、本開示は、ペプチド、小分子、または抗体、ペプチド、小分子、もしくは抗体の結合断片などの分子に結合した本明細書に記載されるＡＢＣトランスポーターを含む分子複合体を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＢＣトランスポーターと、大環状分子とを含む分子複合体を含み、この大環状分子は、いくつかの実施形態では、６～１４－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、または８～１０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、この分子は、２０μＭ以下、１０μＭ以下、２０ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１～２０μＭ、１０～２０μＭ、１ｎＭ～２０μＭ、および／または１ｎＭ～５００ｎＭのＫＤで、ＡＢＣトランスポーターに結合する。いくつかの実施形態では、本開示は、ペプチド、小分子、抗体、またはペプチド、小分子、もしくは抗体の結合断片などの分子に結合した本明細書に記載されるキメラＡＢＣトランスポーターを含む分子複合体を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、キメラＡＢＣトランスポーターと、大環状分子とを含む分子複合体を含み、この大環状分子は、いくつかの実施形態では、８～１０－ｍｅｒの大環状分子である。
いくつかの実施形態では、分子はペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１４－ｍｅｒペプチド、例えば、６～１２－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、８～１２－ｍｅｒ、８～１０－ｍｅｒなどである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１４－ｍｅｒである。表３および図３Ｆを参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８～１０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～８－ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８－ｍｅｒである。図３Ｅおよび３Ｇ～Ｌ、ならびに表５を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、３～４０－ｍｅｒ、３～２０－ｍｅｒ、４～１６－ｍｅｒ、４～１４－ｍｅｒまたは６～１４－ｍｅｒであり、例えば、３－ｍｅｒ、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、１７－ｍｅｒ、１８－ｍｅｒ、１９－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、２１－ｍｅｒ、２２－ｍｅｒ、２３－ｍｅｒ、２４－ｍｅｒ、２５－ｍｅｒ、２６－ｍｅｒ、２７－ｍｅｒ、２８－ｍｅｒ、２９－ｍｅｒ、３０－ｍｅｒ、３１－ｍｅｒ、３２－ｍｅｒ、３３－ｍｅｒ、３４－ｍｅｒ、３５－ｍｅｒ、３６－ｍｅｒ、３７－ｍｅｒ、３８－ｍｅｒ、３９－ｍｅｒ、または４０－ｍｅｒである。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、６～１４－ｍｅｒの大環状分子、例えば、６～１２－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、８～１２－ｍｅｒ、８～１０－ｍｅｒなどである。いくつかの実施形態では、大環状分子は、１４－ｍｅｒの大環状分子である。表３および図３Ｆを参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状分子は、６～１０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、８～１０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、６～８－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、８－ｍｅｒの大環状分子である。図３Ｅおよび３Ｇ～Ｌ、ならびに表５を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状分子は、３～４０－ｍｅｒ、３～２０－ｍｅｒ、４～１６－ｍｅｒ、４～１４－ｍｅｒまたは６～１４－ｍｅｒであり、例えば、３－ｍｅｒ、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、１７－ｍｅｒ、１８－ｍｅｒ、１９－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、２１－ｍｅｒ、２２－ｍｅｒ、２３－ｍｅｒ、２４－ｍｅｒ、２５－ｍｅｒ、２６－ｍｅｒ、２７－ｍｅｒ、２８－ｍｅｒ、２９－ｍｅｒ、３０－ｍｅｒ、３１－ｍｅｒ、３２－ｍｅｒ、３３－ｍｅｒ、３４－ｍｅｒ、３５－ｍｅｒ、３６－ｍｅｒ、３７－ｍｅｒ、３８－ｍｅｒ、３９－ｍｅｒ、または４０－ｍｅｒの大環状分子である。いくつかの実施形態では、大環状分子は、少なくとも１つの親油性側鎖と、少なくとも１つの正荷電側鎖とを有する。
いくつかの実施形態では、複合体中の分子は、小分子である。いくつかの実施形態では、この分子は抗体であり、これには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかの完全長抗体だけではなく、Ｆｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合断片、ナノボディ、一本鎖抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体も含まれ得る。
いくつかの実施形態では、この分子は、ペプチドの結合断片、小分子の結合断片、または抗体の結合断片（例えば、抗原結合断片）である。
いくつかの実施形態では、複合体中の分子は、Ｇ１１１８、Ｇ１３６５、Ｇ１１１９、またはＧ１１２２である。いくつかの実施形態では、複合体中の分子は、例えば、ＡＢＣトランスポーターが、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩での処理により、外向き立体配座にトラップされると、大腸菌ＭｓｂＡなどのＡＢＣトランスポーターの周辺質面への結合について大環状分子Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２と競合する。いくつかの実施形態では、分子は、競合アッセイにおいて、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２のＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する。いくつかの実施形態では、分子は、例えば、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩による処理によってＡＢＣトランスポーターが外向き立体配座にトラップされる場合に、大腸菌ＭｓｂＡなどのＡＢＣトランスポーターの周辺質面への結合について大環状分子Ｇ１３６５と競合する。いくつかの実施形態では、分子は、競合アッセイにおいて、Ｇ１３６５のＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する。
ＶＩ．使用
いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターは、細菌ＡＢＣトランスポーターである。例えば、いくつかの場合には、細菌ＡＢＣトランスポーターは、例えば、哺乳動物ＡＢＣトランスポーターに対して比較的低い配列相同性のために、抗生物質の標的候補である。いくつかの場合には、細菌ＡＢＣトランスポーターは、細菌種または病原体に由来するＭｓｂＡトランスポーターである。いくつかの場合には、本明細書のスクリーニング法は、細菌ＡＢＣトランスポーターを阻害する分子を同定するために使用されてもよい。そのような分子は、抗生物質活性を有し得る。例えば、本明細書に記載の大環状分子Ｇ１１１８およびＧ１３６５は、各々、大腸菌ＭｓｂＡのＬＰＳ輸送活性を阻害し、細胞増殖も阻害することが見出された。したがって、本開示はまた、細菌ＡＢＣトランスポーターに対する本明細書のスクリーニングで同定された分子の、細菌感染症などの対象における感染症の治療における使用も包含する。
ＶＩＩ．キット
本開示はまた、本明細書のスクリーニング法に関連する試薬を含むキットも含む。いくつかの場合には、キットは、キメラＡＢＣトランスポーターを含む。いくつかの場合には、キットは、特定のキメラＡＢＣトランスポーターを伴うかまたは伴わずに、本明細書のスクリーニング法で使用される試薬を含む。いくつかの場合には、キットは、親（非キメラ）ＡＢＣトランスポーターを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のキットは、マトリックスに取り付けられた親またはキメラＡＢＣトランスポーターを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書のキットは、ビーズなどのマトリックス粒子に取り付けられたＡＢＣトランスポーターを含んでもよい。そのようなビーズは、例えば、フレークまたはチップ、球体、ペレットなどの任意の形状を有し得る。いくつかの実施形態では、そのようなビーズはストレプトアビジン被覆ビーズ、アビジン被覆ビーズ、または脱グリコシル化アビジン被覆ビーズである。いくつかの実施形態では、そのようなビーズは、磁性ビーズである。ＡＢＣトランスポーターは、マトリックスに予め取り付けられてもそうでなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＢＣトランスポーターのビーズまたはマトリックスへのビオチン－ストレプトアビジンまたは類似のシステムを通してなどの取り付けを容易にするために、試薬が含まれる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のスクリーニング法に関連する試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、試験分子がＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するかどうかを判定するために必要な試薬の一部または全てを含んでもよい。キットは、例えば、ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターを可溶化するための１つ以上の界面活性剤を含んでもよい。ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターを可溶化させるための例示的な界面活性剤または関連する分子もしくはシステムとしては、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）が挙げられ、いくつかの実施形態では、０．０２％ＬＭＮＧ、ならびにドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）、ｂｒｉｊ－３５、グリコール－ジオスゲニン、ジギトニン、アンフィフォール、例えばアンフィフォールＡ８－３５、および脂質ナノディスクが挙げられる。キットは、例えば、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋、バナジン酸塩、および／もしくはオルトバナジン酸ナトリウム、またはＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップする他の試薬を含んでもよい。キットは、例えば、１つ以上の洗浄バッファーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、ＬＭＮＧ、ＡＴＰ、ＤＴＴ、および／またはオルトバナジン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の溶出バッファーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、定量ＰＣＲのための試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、試験分子の存在下または非存在下で、ＡＢＣトランスポーターに対してＡＴＰアーゼアッセイを実行するための試薬を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、キットは、試験分子または試験分子のライブラリー、例えば、ペプチド、小分子、および／または抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キット中のペプチドは、大環状分子であり得る。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチド、小分子、または抗体の結合断片である試験分子を含んでもよい。キットはまた、特定のＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合することが知られているポジティブコントロール、あるいはその位置で結合しない、またはキメラＡＢＣトランスポーターに結合するが、その親ＡＢＣトランスポーターには結合しないネガティブコントロールなどのコントロール分子を含んでもよい。
キットは、例えば、結合を検出するための検出試薬を含んでもよい。キットはまた、コントロール分子と、コントロール分子で使用される試薬とを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、キットはまた、使用指示書を含んでもよい。
以下は、本開示の方法および組成物の例である。これらの実施例は、本開示を限定することを意図したものではなく、それを例示することのみを目的としており、上記の一般的な説明を考慮して、様々な他の実施形態が実践され得ることが理解される。
序論
ＭｓｂＡは、リポ多糖（ＬＰＳ）を、内膜（ＩＭ）を横切ってその後細胞表面に輸送するための反転に関与するグラム陰性細菌において不可欠なＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターである。構造研究は、ＭｓｂＡによるＬＰＳ輸送のための交互アクセスメカニズムを明らかにしたが、基質選択性がどのように達成されるかは不明であった。アポＭｓｂＡの以前の構造は、大きなリン脂質二重層から遮蔽され、入り口内の中央空間にＬＰＳが結合した内向き立体配座を明らかにした。この封入された場所では、ＬＰＳは、全てのアシル鎖が疎水性空洞に閉じ込められた、保存された塩基性残基の環によって配位される。
偏りのないハイスループットスクリーニングを、精製されたＷＴ ＥｃＭｓｂＡで実施した。ＭｓｂＡ ＡＴＰアーゼ活性を監視することによって、キノリンおよびベンゾフェノンクラスの阻害剤が、膜に露出した結合部位を標的化することによって、内向き立体配座（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）をトラップすることが判明した。これらの取り組みは、ＭｓｂＡを潜在的な抗菌標的として立証したが、小分子シリーズは、その高い親油性および不良な生理化学的特性のために先に進めることができなかった。特に、これまで構造的に特徴づけされてきたＡＢＣトランスポーターの全ての小分子モジュレーターもまた、内向きの状態に結合し、伝統的な創薬手法が本質的にこれらの内向きの状態に偏っている可能性を高めている。したがって、ＭｓｂＡの輸送サイクルのいずれかの状態が創薬に許容されるかどうかは、根本的な未解決の問題である。
ＭｓｂＡにおける疎水性の膜に埋め込まれた結合部位を標的化することに関連する課題を克服するために、新しい阻害剤発見戦略が考案された。改善された生理化学的特性を有する阻害剤を発見するために、ＭｓｂＡの周辺質面上の溶媒接触可能領域が標的とされた。特に、ＭｓｂＡ輸送サイクルの重要な側面は、内向き状態から外向き状態への顕著なシフトであり、これにより、大きな、溶媒が接触可能な裂け目を周辺質に露出する（図６のパネル１）。生化学的条件下では、ＭｓｂＡは、潜在的な阻害剤発見のために、この周辺質の裂け目を安定化させる外向き立体配座にトラップされ得る。Ｉｄおよび図３Ａ。溶媒に露出した周辺質裂け目の方向に選択を偏らせるために、膜貫通セグメントの周辺質面が遠縁のＡＢＣトランスポーターに由来する配列でまとめて置き換えられているＭｓｂＡキメラを使用する対抗選択戦略を利用した（図３Ａおよび９Ａ～１２Ｂ、ならびに実施例７）。濃縮を伴う複数回のスクリーニング後に、Ｇ１１１８およびＧ１３６５を、ＭｓｂＡに結合する２つの大環状化合物として同定した。Ｇ１１１８およびＧ１３６５の両方は、ＭｓｂＡのそれらの結合において選択的かつ状態依存的であり、強力な生化学的および表現型活性を立証した。ＭｓｂＡとの複合体中のこれらの大環状分子の高分解能構造は、それらの状態に依存する阻害についての分子基盤を明らかにし、ＡＢＣトランスポーター中の外向きの裂け目を標的とする最初に知られたアンタゴニストを表す。したがって、本発明者らの戦略は、ＭｓｂＡの選択的モジュレーターの開発、ひいては他の困難な薬物標的の開発のためのテンプレートを提示する。
実施例１：キメラＭｓｂＡトランスポータータンパク質の調製および発現のための材料および方法
ａ．キメラタンパク質のデザイン
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６０７５２）に由来する野生型ＭｓｂＡトランスポーター配列をＢＬＡＳＴ検索で使用して、他のグラム陰性細菌種において相同タンパク質を同定した。ＢＬＡＳＴ検索を繰り返し行うことによって、周辺質ループ領域内を含む、約４０％のＥｃＭｓｂＡに対する全体的な配列同一性を有する候補ＭｓｂＡトランスポーターを、さらなる検討のために選択した。次いで、候補ＭｓｂＡホモログの複数の配列アライメントおよび構造相同性モデル（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）を、手動で分析し、その後のキメラコンストラクト操作のための候補物質を選択した。これらの分析に基づいて、次のグラム陰性細菌株に由来する候補ＭｓｂＡトランスポーター：シュードモナス・サイクロトレランス（ＰｐＭｓｂＡ）、カンジダタス・アキュムリバクター（ＣａＭｓｂＡ）、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ＪａＭｓｂＡ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ＴｃＭｓｂＡ）、およびマグネトスピラ株－ＯＨ－２（ＭｑＭｓｂＡ）を、ＥｃＭｓｂＡに対するキメラ化のために選択した。キメラを生成するために、周辺質ループ１（Ｌ１、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８）、周辺質ループ３（Ｌ３、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１）および周辺質ループ５（Ｌ５、ＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２）の対応する配列を、候補ＭｓｂＡホモログの同等の領域で同時に置き換えて、キメラコンストラクトを生成した（図１０Ａ）。
５つのキメラコンストラクトを合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、制限非依存性クローニング用に改変されたｐＥＴ－５２ｂ発現ベクター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中にクローニングした。次いで、大腸菌宿主Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、１７℃で６４時間の自己誘導発酵によって、キメラを過剰発現させた。細胞を採取し、野生型大腸菌ＭｓｂＡについて以前に記載されたように（ＥｃＭｓｂＡ；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ ５５７（７７０４）：１９６～２０１（２０１８））、キメラを精製した。候補ＣａＭｓｂＡ（ＭｓｂＡＣｈｉｍ２）、ＴｃＭｓｂＡ（ＭｓｂＡＣｈｉｍ４）、およびＭｑＭｓｂＡ（ＭｓｂＡＣｈｉｍ５）に由来する周辺質配列を使用して生成されたキメラは、容易に発現され、ＷＴ ＭｓｂＡと同様な回収収率で、大腸菌から精製され得た。精製されたＭｓｂＡキメラタンパク質用の最終バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．００５％のラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ；ｗｔ／ｖ）であった。タンパク質アリコートを急速冷凍して、－８０℃で保存した。
ｂ．タンパク質の発現および精製
大腸菌に由来する野生型（ＷＴ）ＭｓｂＡトランスポーター（Ｅ．ｃｏｌｉ；ＥｃＭｓｂＡ）、ならびに周辺質キメラを、ｎ－ドデシル－α－Ｄ－マルトシド（αＤＤＭ、クライオ－ＥＭ構造研究および示されたような一部の生化学的アッセイ用；Ａｎａｔｒａｃｅ）、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ、生化学的アッセイ用；Ａｎａｔｒａｃｅ）、または３α－ヒドロキシ－７α，１２α－ジ－（（Ｏ－β－Ｄ－マルトシル）－２－ヒドロキシエトキシ）－コラン（ＦＡ３、結晶学研究用）を可溶化界面活性剤として使用して、以前に記載されたように（Ｈｏら、２０１８）発現および精製した。エンテロバクター・クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ；ＥｎＭｓｂＡ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ＫｐＭｓｂＡ）、および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ＰａＭｓｂＡ）に由来するＷＴ ＭｓｂＡタンパク質を、ＬＭＮＧを可溶化界面活性剤として使用して、同様に発現および精製した。精製された野生型ＭｓｂＡキメラタンパク質用の最終バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０３％（ｗｔ／ｖ）のＤＤＭまたは０．０２％のＬＭＮＧ（ｗｔ／ｖ）であった。タンパク質アリコートを急速冷凍して、－８０℃で保存した。
いくつかの場合には、大腸菌ＢｉｒＡビオチンリガーゼに対する認識モチーフ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）が、アミノ末端ＦＬＡＧ親和性タグ配列の間に含まれ、精製されたＭｓｂＡの効率的な部位特異的ビオチン化（アビディティー）を可能にする。キメラのＡＴＰアーゼ活性および薬理学の評価は、これらの大きな配列変化が、既知のアンタゴニスト受容体部位の生化学的活性の顕著な喪失または明らかな構造変化なしに許容され得ることを明白にした。特に、マグネトスピラ・スピリラム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）株－ＯＨ－２に由来する候補ＭｓｂＡホモログからの配列でＥｃＭｓｂＡの周辺質面を置き換えたＭｓｂＡＣｈｉｍ５は、以前に同定された小分子ＭｓｂＡ阻害剤のキノリンおよびベンゾフェノンクラスの両方に対してなお感受性を維持していた。
大腸菌ＭｓｂＡ点変異体の生化学的評価については、ＷＴ ＥｃＭｓｂＡならびにＴｙｒ８７Ａｌａ／Ｔｒｐ９１Ａｌａ（ＥｃＭｓｂＡ Ｙ８７Ａ／Ｗ９１Ａ）およびＬｙｓ９５Ａｌａ／Ａｒｇ２３８Ａｌａ（ＥｃＭｓｂＡ Ｋ９５Ａ／Ｒ２３８Ａ）変異体を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、Ｐｔａｃプロモーターの下流の改変ｐ１５Ａプラスミド（ｐＬＭＧ１８）（Ｓｔｏｒｅｋら、２０１８）中にクローニングした。
大腸菌宿主ＢＬ２１を使用してＭｓｂＡを過剰発現させ、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間、誘導を実施した。
ＭｓｂＡを発現する細胞を採取し、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および２単位／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ（バッファーＡ）中に再懸濁した。微小溶液操作による細胞溶解の後に、ＬＭＮＧを１％（ｗｔ／ｖ）まで添加し、４℃で一晩穏やかに撹拌することによって、タンパク質可溶化を行った。１８５，０００×ｇで１時間の遠心分離後に、清澄化した上清を、バッファーＢ（０．００５％のＬＭＮＧ（ｗｔ／ｖ）を補充したバッファーＡ）で予備平衡化した抗ＦＬＡＧ Ｍ２－アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ）と、４℃で１～２時間穏やかに混合した。ＦＬＡＧ樹脂を重力流によって収集し、１０カラム容積のバッファーＢで２回洗浄し、３カラム容積の、０．２ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドを補充したバッファーＢで２回溶出させた。各野生型または変異体ＭｓｂＡタンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．００５％のＬＭＮＧ（ｗｔ／ｖ）中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ）上を通過させた。ＭｓｂＡを含有するピーク画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）遠心分離装置（５０Ｋの分子量カットオフ）を使用して、５～１０ｍｇ／ｍＬに濃縮させた。タンパク質アリコートを急速冷凍して、－８０℃で保存した。
ｃ．アンフィポール中への復元
アンフィポール組込みＭｓｂＡの使用が指示されている場合、界面活性剤中の精製されたＭｓｂＡを、１ｍｇ／ｍＬに調整し、以前に記載されたように（Ｈｏら、２０１８）、Ａ８－３５アンフィポール（ＺｏｏｎｅｎｓおよびＰｏｐｏｔ、２０１４）（Ａｎａｔｒａｃｅ）中に復元した。精製されたアンフィポール組込みＭｓｂＡタンパク質のための最終バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌであった。タンパク質アリコートを急速冷凍して、－８０℃で保存した。
ｄ．配列保存性解析
グラム陰性細菌の腸内細菌科ファミリーに由来するＭｓｂＡ配列（ｔａｘｉｄ：５４３）を、ＥｃＭｓｂＡをクエリー配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ６０７５２）として使用するｒｅｆｓｅｑ＿ｓｅｌｅｃｔデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索を用いて同定した。ＭｓｂＡホモログとしてアノテートされたこの検索からの合計で１１８個の配列を、Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ－ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＣＯＢＡＬＴ）（ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｇａｒｗａｌａ、２００７）を使用してアライメントした。多重配列アライメントをＣｈｉｍｅｒａＸにロードし、配列保存性を、ＡＬ２ＣＯにおけるｓｕｍ ｏｆ ｐａｉｒｓ法（ＰｅｉおよびＧｒｉｓｈｉｎ、２００１）を使用して判定した。
実施例２：ＭｓｂＡ結合大環状分子を同定するためのスクリーニング材料および方法
ａ．大環状ペプチドライブラリーデザイン
キメラＭｓｂＡタンパク質による対抗選択を使用して、ペプチド大環状分子を試験し、ＥｃＭｓｂＡの周辺質面に結合する分子を同定した（図３Ａ）。遺伝子的に再プログラムされたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システム（Ｋａｓｈｉｗａｇｉら、２０１３）においてＮ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニン（ＣｌＡｃ－Ｆ）を開始剤として使用することによって、チオエーテル－大環状ペプチドライブラリーを構築した。システインを除く全ての２０個の天然アミノ酸に加えて、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン（ＭｅＦ）および（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸（Ｂｐｈ）を追加することによって、遺伝子コードを設計した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳後に、開始剤のＬ－フェニルアラニン残基のＮ末端ＣｌＡｃ基と下流のシステイン残基のスルフヒドリル基との間にチオエーテル結合が自然発生的に形成され、大環状ペプチドを生成した。
ｂ．周辺質ＭｓｂＡ結合分子の選択
ＭｓｂＡに結合する大環状ペプチドの親和性選択を、０．０２％のＬＭＮＧ中で可溶化された部位特異的ビオチン化ＥｃＭｓｂＡを使用して実施し、選択全体を通して５０μＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇ２＋および２００μＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有させることによって、外向き立体配座にトラップした。簡単に言うと、１０μＭのｍＲＮＡライブラリーを、ペプチド－リンカー（１１μＭ）と、室温（ＲＴ）で３分間ハイブリダイズした。ｍＲＮＡライブラリーを、遺伝子的に再プログラムされたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システム中で、３７℃で３０分間翻訳して、ペプチド－ｍＲＮＡ融合ライブラリーを生成した（Ｇｏｔｏら、２０１１；Ｋａｗａｋａｍｉら、２０１３）。各反応物は、２μＭのｍＲＮＡ－ペプチド－リンカーコンジュゲート、１２．５μＭの開始剤ｔＲＮＡ（ＣｌＡｃ－Ｌ－Ｐｈｅでアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ）、および２５μＭの、特定された非正規／正規アミノ酸でアミノアシル化された各伸長（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ）ｔＲＮＡを含有した。１回目の選択において、翻訳を２０μＬのスケールで実施した。翻訳後に、反応物を１７ｍＭのＥＤＴＡでクエンチした。産物を、続いて、ＲＮアーゼＨ活性なし逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、４２℃で３０分間逆転写し、バッファーを、バナジン酸塩バッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２％のＬＭＮＧ（ｗｔ／ｖ）、５０ｕＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴおよび２００ｕＭのオルトバナジン酸ナトリウムに交換した。
親和性選択については、ペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ溶液を、２５０ｎＭのビオチン化ＥｃＭｓｂＡおよびシンク（ｓｉｎｋ）としての５００ｎＭのＥｃＭｓｂＡＣｈｉｍ５と４℃で６０分間インキュベートした。ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をさらに添加し、１０分間インキュベートして、ＥｃＭｓｂＡの周辺質面に結合する大環状分子を単離した。ビーズを冷バナジン酸塩バッファーで３回洗浄し、９５℃で５分間加熱することによって、ｃＤＮＡをビーズから溶出させ、親和性選択工程からの分別回収物を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）サーマルサイクラー（Ｒｏｃｈｅ）上のＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用する定量ＰＣＲによって評価した。親和性成熟を６回繰り返した後に、溶出前の洗浄ストリンジェンシーを高めることによってオフレート選択をさらに２回繰り返して、高親和性バインダーを同定した。ＭｉＳｅｑ次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、最終的な濃縮ｃＤＮＡの配列決定を行った。
ｃ．Ｇ１１１８およびＧ１３６５大環状分子の突然変異スキャン
Ｇ１１１８（以下の表４）大環状分子およびＧ１３６５（以下の表６）大環状分子の突然変異スキャンについては、翻訳後に、親配列に対するあらゆる単一アミノ酸変化がサンプリングされるように、各々が異なる位置において単一の「ＮＮＵ」縮重コドンを含有する複数のＤＮＡ鋳型をプールすることによって、これらの親配列に基づいて部位飽和ＤＮＡライブラリーを構築した。親ペプチドで使用されるアミノ酸に加えて、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｄｏｐａ（Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）、およびＭｅＧ（Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン）を追加することによって、遺伝子コードを設計した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳後に、上述したような２つの大環状分子ライブラリーを使用して、１回の親和性選択を独立して実施した。入力および回収された出力ＤＮＡプールを、ＮＧＳによるディープシーケンシングに供した。各単一の変異体についての濃縮係数を、次のように計算した：出力プールにおけるＮＧＳ頻度を入力プールにおけるＮＧＳ頻度で割って、親値で正規化する。
実施例３：ＭｓｂＡ酵素バリアントおよび菌株の特徴づけのための材料および方法
ａ．プラスミド
以下のプラスミド（表１）を大腸菌表現型研究に使用した。
Figure 2024519413000002
ｂ．ＭｓｂＡ ＡＴＰアーゼアッセイ
ＭｓｂＡのＡＴＰアーゼ活性を、Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ ＡＤＰ２ ＦＰ Ａｓｓａｙ（ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ Ｌａｂｓ）を使用して測定した。ＭｓｂＡ阻害剤のＩＣ５０を決定するために、化合物を２×ＭｓｂＡ酵素溶液と１０分間インキュベートし、次いで２×ＡＴＰ溶液を添加して、ＡＴＰアーゼ反応を開始させた。反応のための最終条件は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．１％のウシガンマグロブリン、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．００７％のＢｒｉｊ－３５および０．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＭｓｂＡ酵素、５０μＭのＡＴＰであった。以下の濃度を各ＭｓｂＡバリアントに使用した：アンフィポール中で復元された５ｎＭのＥｃＭｓｂＡ、ＥｎＭｓｂＡ、ＫｐＭｓｂＡおよび８０ｎＭのＰａＭｓｂＡ、ＬＭＮＧ界面活性剤中の１５ｎＭのＥｃＭｓｂＡおよびＥｃＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５、ＤＤＭ界面活性剤中の２２ｎＭのＥｃＭｓｂＡおよび２７ｎＭのＥｃＭｓｂＡ－１２Ｇ７複合体。酵素反応物を室温で１時間インキュベートし、次いで、Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎバッファーを添加することによってクエンチした。ＩＣ５０は、阻害用量応答曲線を非線形４パラメータ阻害モデル（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）とフィットさせることによって決定した。
ｃ．細胞内ＩＣ５０の決定
様々な菌株の細胞内ＩＣ５０（表２）を決定した。
Figure 2024519413000003
各化合物の８つの２倍希釈物２００ｎＬのアリコートを、Ｅｃｈｏ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒ（Ｌａｂｃｙｔｅ）を使用して、３８４ウェルプレートに２連で分注した。株を、０．００２％のＴｗｅｅｎを含む陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地中で１６時間一晩にわたって増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、０．００２％のＴｗｅｅｎおよび１０％のグリセロールを含む陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地中で、ＯＤ６００＝１で再懸濁させ、１００ｍｌのアリコートで凍結した。各実験について、アリコートを氷上で解凍し、０．００２％のＴｗｅｅｎを含む陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地中に、１：１０００で希釈した。１０μＬ細胞／ウェルを、化合物を含有する３８４ウェルプレートに添加した。プレートを３７℃で６時間インキュベートし、次いで、１０μＬのＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、発光を測定した。Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを使用して、ＩＣ５０を計算した。
ｄ．ＭｓｂＡ対立遺伝子で補った大腸菌の増殖の経時変化
大腸菌ＭｓｂＡのＷＴまたは変異体対立遺伝子を発現するｐＬＭＧ１８ベクターを担持する大腸菌ＭＧ１６５５ ｍｓｂＡ－ｃＫＯ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）の培養物を、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび２％のアラビノースを含むＬＢ ５ｍＬ中で３７℃にて一晩増殖させ、染色体からのＷＴ大腸菌ＭｓｂＡの発現を誘導した。一晩培養物をペレット化し、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＬＢ中にＯＤ６００＝１で再懸濁させた。次いで、各培養物を、５ｍＬのＬＢ、５ｍＬのＬＢ＋２％アラビノース中に、１：１００で希釈した。全ての培養物を、ローラードラム上、３７℃で増殖させ、ＯＤ６００を１時間ごとに測定した。増殖曲線を、異なる日に３回繰り返して作成した。
ｅ．ウエスタンブロット
大腸菌ＭｓｂＡのＷＴまたは変異体対立遺伝子を発現するｐＬＭＧ１８ベクターを担持する大腸菌ＭＧ１６５５ ｍｓｂＡ－ｃＫＯ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）の培養物を、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび２％のアラビノースを含むＬＢ ５ｍＬ中で３７℃にて一晩増殖させ、染色体からのＷＴ大腸菌ＭｓｂＡの発現を誘導した。プラスミドを含まないコントロール株を、同じ条件下であるが、クロラムフェニコールを含まずに増殖させた。一晩培養物を、５０ｍＬのコニカルチューブ内の同じ培地１５ｍＬ中で１：１００に希釈し、３７℃で３時間振盪しながら増殖させた。これらの培養物をペレット化し、１５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、ＬＢ中にＯＤ６００＝１で再懸濁させた。次いで、各培養物を、大腸菌ＭｓｂＡ対立遺伝子を発現する株またはプラスミドコントロールを有さない株では、２０ｍＬのＬＢ中で、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＭＳｂＡ対立遺伝子を発現する株では、２０ｍＬのＬＢ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ中で１：１００に希釈した。ＯＤ＝１の細胞の各々７．５ｍＬをペレット化し、２％のアラビノース試料として溶解させた。希釈した培養物を３７℃で３時間増殖させて、次いでペレット化および溶解させた。
溶解物を生成するために、各試料を１５ｍｇ／ｍＬのリゾチームを添加した５００μｌのＭＳＤ溶解バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中に再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。溶解物を、微量遠心機の最高速度で、４℃で１０分間ペレット化し、上清を清浄なチューブに移した。試料を、２０ウェル４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｍｉｄｉゲル（ＢｉｏＲａｄ）上のＭＥＳバッファー中に溶解し、ＧｒｏＥＬをローディングコントロールとして使用して、ローディングをＯＤ６００に正規化した。ニトロセルロースへのウエスタンブロットの転写を、ｉＢｌｏｔシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。Ｏｄｙｓｓｅｙ ＴＢＳブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ、＃９２７－５００００）で膜をブロックし、１：１０００の抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、＃Ｆ３１６５）＋１：１００００の抗ＧｒｏＥＬ（Ｅｎｚｏ、＃ＡＤＩ－ＳＰＳ－８７５）、続いて１：１００００のＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ抗マウスおよびＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ抗ウサギの各々（Ｌｉ－Ｃｏｒ、＃９２５－３２２１０および＃９２６－６８０７１）で検出した。
ｆ．ＭＩＣアッセイ
培養液のＭＩＣを、０．００２％のＴｗｅｅｎ－８０を含む陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地中で、以前に記載されたように（Ｈｏら、２０１８）決定した。
ｇ．ＰＤ－１３６５耐性変異体の単離
ＭＧ１６５５ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）を、１００μＬ／ウェルのミューラー・ヒントン液体培地＋０．００２％のＴｗｅｅｎ－８０＋５０μＭのＧ１３６５・Ｉ２，Ｄｏｐａ３（４×ＭＩＣ）を入れた９６ウェルプレート内に、０．００５のＯＤ６００にて接種し、３７℃で２日間増殖させた。Ｇ１３６５・Ｉ２，Ｄｏｐａ３は、２つのアミノ酸置換（Ｖａｌ２ＩｌｅおよびＴｙｒ３Ｄｏｐａ；図１４Ａ）を有するＧ１３６５に近い類似体である。増殖を表した２つのウェルからの培養物を、５０μＭのＧ１３６５・Ｉ２，Ｄｏｐａ３を含有するＬＢ寒天プレート上に画線塗布したところ、１つの培養物のみが、選択プレート上にコロニーを生成した。この耐性株からのＭｓｂＡ ＯＲＦをＰＣＲ増幅し、配列決定すると、残基２５２においてアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸変化をもたらす点突然変異が明らかになった。親株およびｍｓｂＡ（Ｄ２５２Ｎ）変異体に対するＭＩＣアッセイにより、Ｇ１３６５・Ｉ２，Ｄｏｐａ３のＭＩＣが、親株における１２．５μＭからＭＧ１６５５ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）ｍｓｂＡ（Ｄ２５２Ｎ）における１００μＭまで増加したことを確認した。
実施例４：電子顕微鏡法の材料および方法
示された大腸菌ＭｓｂＡ変異体を発現するｐＬＭＧ１８プラスミドでレスキューされた大腸菌ＣＦＴ０７３ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）またはＣＦＴ０７３ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）ｍｓｂＡ－ｃｏｎｄ－ｋｏ細胞の電子顕微鏡法を、以前に記載されたように（ＨＯら、２０１８）実施した。ＭｓｂＡの大環状分子または小分子阻害剤の使用が指示されている場合には、ＬＢ中で増殖させたＣＦＴ０７３ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）の一晩培養物を、ＬＢ中で１：１００に希釈し、３７℃で２．５時間、対数相まで増殖させ、次いでペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＬＢ中でＯＤ６００＝０．１で再懸濁させた。次いで、示された阻害剤の１０ｍＭストック５０μｌを、再懸濁させたＣＦＴ０７３ ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）の５ｍＬに添加し、培養物を３７℃で３時間インキュベートした。細胞をペレット化し、洗浄し、以前に記載されたように（ＨＯら、２０１８）、透過型電子顕微鏡用に固定化および処理した。
実施例５：大環状化合物の合成
ａ．ベンゾフェノン（Ｇ７５８）の合成
Figure 2024519413000004
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－メチルピペリジン－１－イル）アセテート。
アセトニトリル（４００ｍＬ）中の４－メチルピペリジン（２５．０ｇ、２５２．１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１０４．５ｇ、７５６．３ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（４９．２ｇ、２５２．１ｍｍｏｌ）の混合物を、２５℃で１２時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中０％～３０％の酢酸エチルで溶出させるカラムクロマトグラフィーによって精製し、ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－メチル－１－ピペリジル）アセテート（４５．０ｇ、１８９．９ｍｍｏｌ、収率７５．３％）を淡黄色固形物として得た。
Figure 2024519413000005
工程２：２－（４－メチルピペリジン－１－イル）酢酸。
酢酸（１５０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－メチル－１－ピペリジル）アセテート（４５．０ｇ、２１１．０ｍｍｏｌ）および塩酸（４Ｎ、３６９．２ｍＬ、１４７６．７ｍｍｏｌ）の溶液を２５℃で１４時間撹拌し、減圧下で濃縮して、クルード生成物を得た。このクルードを、さらに精製することなく直接使用した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 4.07 p.p.m. (s, 2H), 3.42 (br. s., 2H), 3.02 (br. s., 2H), 1.77 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.59 (br. s., 1H), 1.51 - 1.36 (m, 2H), 0.92 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
Figure 2024519413000006
工程３：２－（４－メチルピペリジン－１－イル）塩化アセチル。
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の２－（４－メチル－１－ピペリジル）酢酸（１．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）の混合物に、塩化オキサリル（１．４ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）およびＮ．Ｎ－ジメチルホルムアミド２滴を添加した。得られた混合物を２０℃で１．５時間撹拌し、減圧下で濃縮して、クルード２－（４－メチル－１－ピペリジル）塩化アセチル（１．０ｇ、５．７ｍｍｏｌ、収率８９．５％）を得た。クルードを、さらなる精製をせずに次の工程に直接使用した。
Figure 2024519413000007
工程４：ｔｅｒｔ－ブチル（２－ブロモ－６－クロロピリジン－３－イル）カルバメート。
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中、２－ブロモ－６－クロロ－ピリジン－３－アミン（２．５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（２．６ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（２９４．４ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２４３８．７８ｍｇ、２４．１ｍｍｏｌ）の溶液を３０℃で１２時間撹拌し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈した。溶液を、水（２×１５ｍＬ）、ブライン（１５ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中０％～３０％の酢酸エチルで溶出させるカラムクロマトグラフィーによって精製し、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－（２－ブロモ－６－クロロ－３－ピリジル）カルバメート（１．３ｇ、４．２ｍｍｏｌ、収率３５．１％）を白色固形物として得た。
Figure 2024519413000008
工程５：ｔｅｒｔ－ブチル（６－クロロ－２－（（３－フルオロピリジン－２－イル）（ヒドロキシ）メチル）ピリジン－３－イル）カルバメート。
テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－（２－ブロモ－６－クロロ－３－ピリジル）カルバメート（１．０ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ブチルリチウム（ヘキサン類中２．５Ｍ、１．６ｍＬ、３．９０ｍｍｏｌ）を－７８℃で添加した。混合物を－７８℃で１時間撹拌し、次いで３－フルオロ－２－ホルミルピリジン（６１０．１ｍｇ、４．８８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を－７８℃で４時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム（１０ｍＬ）を添加することによってクエンチした。溶液を、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水（２×１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中０％～４０％の酢酸エチルで溶出させるカラムクロマトグラフィーによって精製し、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［６－クロロ－２－
［（３－フルオロ－２－ピリジル）－ヒドロキシ－メチル］－３－ピリジル］カルバメート（５５０．０ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ、収率４７．８％）を黄色油状物として得た。
Figure 2024519413000009
工程６：ｔｅｒｔ－ブチル（６－クロロ－２－（３－フルオロピコリノイル）ピリジン－３－イル）カルバメート
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［６－クロロ－２－［（３－フルオロ－２－ピリジル）－ヒドロキシ－メチル］－３－ピリジル］
カルバメート（４６０．０ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）およびデスマーチンペルヨージナン（２．２ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）の混合物を、２０℃で３時間撹拌した。反応混合物を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、水（２×１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中０％～３０％の酢酸エチルで溶出させるカラムクロマトグラフィーによって精製し、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［６－クロロ－２－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）－３－ピリジル）カルバメート（３００．０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、収率６５．６％）を白色固形物として得た。
Figure 2024519413000010
工程７：ｔｅｒｔ－ブチル（６－シアノ－２－（３－フルオロピコリノイル）ピリジン－３－イル）カルバメート
Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［６－クロロ－２－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）－３－ピリジル）カルバメート（２３０．０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（５９．９ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、シアン化亜鉛（３８３．９ｍｇ、３．２７ｍｍｏｌ）およびシクロペンチル（ジフェニル）ホスファン鉄（７２．５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の混合物を、マイクロ波条件下で９０℃にて２時間加熱し、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル中０％～５０％の酢酸エチルで溶出させるカラムクロマトグラフィーによって精製し、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［６－シアノ－２－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）－３－ピリジル］カルバメート（１５０．０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、収率６７．０％）を白色固形物として得た。
Figure 2024519413000011
工程８：５－アミノ－６－（３－フルオロピコリノイル）ピコリノニトリルトリフルオロアセテート
ジクロロメタン（１６ｍＬ）中、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［６－シアノ－２－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）－３－ピリジル］カルバメート（１２０．０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（４．０ｍＬ、５１．２２ｍｍｏｌ）の溶液を、１５℃で１時間撹拌し、減圧下で濃縮して、クルード５－アミノ－６－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）ピリジン－２－カルボニトリルトリフルオロアセテート（８４．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、収率７１．４％）を黄色油状物として得た。
Figure 2024519413000012
工程９：Ｎ－（６－シアノ－２－（３－フルオロピコリノイル）ピリジン－３－イル）－２－（４－メチルピペリジン－１－イル）アセトアミド
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の２－（４－メチル－１－ピペリジル）塩化アセチル（１２１．８ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）および５－アミノ－６－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）ピリジン－２－カルボニトリル（８４．０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の混合物を、６０℃で２時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣を、逆相クロマトグラフィー（水中アセトニトリル２８～５８／０．０５％のＮＨ４ＯＨ）によって精製し、Ｎ－［６－シアノ－２－（３－フルオロピリジン－２－カルボニル）－３－ピリジル］－２－（４－メチル－１－ピペリジル）アセトアミド（９．４０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、収率６．８％）を白色固形物として得た。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ 9.34 p.p.m. (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.85 - 7.78 (m, 1H), 7.72 - 7.63 (m, 1H), 3.23 (s, 2H), 2.95 - 2.85 (m, 2H), 2.35 - 2.23 (m, 2H), 1.68 - 1.49 (m, 4H), 1.45 - 1.36 (m, 1H), 0.96 (d, J = 6.4 Hz, 3H). LCMS (m/z): [M+H]+ 計算値C20H20FN5O2, 381.16; 実測値382.1.
ｂ．Ｇ１１１８、Ｇ１３６５、および誘導体の合成
チオエーテル大環状ペプチドを、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して合成した。全てのアミノ酸のカップリング後に、脱保護したＮ末端を樹脂上でクロロアセチル化し、続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）脱保護カクテルを使用したグローバルな脱保護を行った。次いで、１０倍を超える過剰量のジエチルエーテルを添加することによって、ペプチドを脱保護溶液から沈殿させた。次いで、クルードペプチドペレットを溶解し、ジエチルエーテルを使用して３回再ペレット化した。最終洗浄後に、ペレットを放置して乾燥させ、次いで、ペレットをＤＭＳＯ中に再懸濁させ、続いて、システインのチオールとＮ末端クロロアセチル基との間のチオエーテル結合の形成を介して分子内環化させるためにトリエチルアミンを添加した。環化の完了時に、反応物をＡｃＯＨでクエンチし、環状ペプチドを標準的な逆相ＨＰＬＣ法を使用して精製した。分子質量を、シングル四重極ＬＣ／ＭＳ（ＬＣＭＳ－２０２０システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって確認した。
ｃ．他の１４－ｍｅｒペプチドの合成
さらなる１４－ｍｅｒペプチドを、下記式に従って設計し（例えば、ある特定のバリアントの図的表示については、図４Ｅを参照されたい）：ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｘ２－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－ＭｅＦ－Ｖ－Ｃ［式中、
ｉ．Ｘ１は、Ｗ、Ｖ、またはＹであり、
ｉｉ．Ｘ２は、ＷまたはＹであり、
ｉｉｉ．Ｘ３が、ＷまたはＹであり、
ｉｖ．Ｘ４は、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨであり、
ｖ．Ｘ５は、Ｎであり、Ｎが、Ｃ以外の任意の天然アミノ酸、またはＢｐｈ（（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸）、Ｄｏｐａ（Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）、ＭｅＦ（Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン）、およびＭｅＧ（Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン）から選択される非天然アミノ酸から選択され、
ｖｉ． Ｘ６は、Ｙ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、またはＶであり、
ｖｉｉ． Ｘ７は、Ｗ、Ｙ、またはＢｐｈであり、
ｖｉｉｉ． Ｘ８は、ＷまたはＹである］、
任意選択で、ペプチドが、Ｃ末端でのＣ残基に続くＧ残基をさらに含み、ＣｌａｃＦは、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈは、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａは、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦは、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンであり、ＭｅＧは、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシンである。この式に従い１１個の異なる分子もまた、上記実施例３で記載されたアッセイにおいて、ＭｓｂＡ ＡＴＰアーゼ活性に対する阻害効果について試験し、０．２～０．８μＭのＩＣ５０値を有することを見出した。大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）の阻害のための最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１００μＭを超え、ＵＰＥＣ ｉｍｐ株の細胞の増殖の阻害についてのＥＣ５０は、試験した分子のうちの１つを除く全てに対して約２～約８μＭであった（最後に試験された分子については１００μＭを超えた）。全体として、これらのデータは、大環状ペプチドＧ１１１８および上記式に従う関連するペプチドは、一般に、ＭｓｂＡおよびＭｓｂＡに関連する細胞活性を阻害することができることを示している。
実施例６：タンパク質構造決定に関する材料および方法
ａ．タンパク質結晶化
阻害剤Ｇ７５８を、ＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５に１０ｍｇ ｍｌ／Ｌで添加し、ＦＡ３において１ｍＭの最終濃度まで精製し、氷上で１時間インキュベートした。外因性ＬＰＳは、いかなる時点にも添加しなかった。Ｇ７５８－ＬＰＳ－ＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５複合体を、複合体と母液（１５０ｍＭのＮａＦ、１３％のＰＥＧ ３３５０、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）とを１：１（ｖ／ｖ）比で混合することによって、シッティングドロップ蒸気拡散法（ｓｉｔｔｉｎｇ－ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）を使用して、１９℃で結晶化させた。１週間で完全なサイズに達した後に、回折を改善するために、液体窒素中での急速凍結の前に、まず、１０％のエチレングリコール、１５％のＰＥＧ ３３５０、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中に３０分間浸漬し、次いで２０％のエチレングリコール、２０％のＰＥＧ ３３５０、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中にさらに３０分間浸漬することによって、結晶を脱水させた。
ｂ．構造決定、精密化および解析
回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅのビームライン１７ＩＤを使用して、１００Ｋで収集した。Ｘ線回折データを、ＳＴＡＲＡＮＩＳＯを用いて実施される異方性補正を含むａｕｔｏＰＲＯＣ（Ｖｏｎｒｈｅｉｎら、２０１１）を使用して、組込み、スケーリングした（Ｔｉｃｋｌｅら（２０２０）Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ；ｓｔａｒａｎｉｓｏ．ｇｌｏｂａｌｐｈａｓｉｎｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｔａｒａｎｉｓｏ．ｃｇｉ）。ＰＤＢ ６ＢＰＬからの１つのＭｓｂＡサブユニットを検索モデルとして使用して、ＰＨＥＮＩＸを用いた分子置換法（Ａｄａｍｓら、２０１０）によって、構造を決定した。初期解に対する手動調整を、Ｃｏｏｔにおけるリジッドボディ運動を通して実施した（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０）。Ｃｏｏｔにおける精密化およびモデル構築の反復ラウンドは、オミットマップの精査によって導かれた。精密化の初期段階におけるオミットマップの使用と組み合わせて、モデルにおいてキメラ５配列をＷＴ大腸菌ＭｓｂＡ配列で置き換えた。厳密な形状および二次構造の制限を、精密化全体を通して適用して厳密な立体化学を維持したが、非結晶学的対称性の制限は、最後まで適用しなかった。強いオミット密度が、Ｇ７５８、ＬＰＳ（入り口内の中央空間）について非常に早い段階で明らかであり、割り当てられない界面活性剤に似た密度であったが、これらは精密化の非常に遅い段階でだけモデル化された。最終のＧ７５８－ＬＰＳ－ＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５モデルの形状を、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎら、２０１０）を使用して評価した。全ての構造図は、ＰｙＭｏｌソフトウェア（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ．１．８（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．、２０１５））を用いて作製した。
ｃ．クライオ電子顕微鏡法（クライオ－ＥＭ）の試料調製およびデータ収集
精製したＭｓｂＡをＦａｂ １２Ｇ７と１：１（ｗ／ｗ）で混合した。ＭｓｂＡー１２Ｇ７複合体を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０３％のαＤＤＭからなるランニングバッファーを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、遊離Ｆａｂから分離した。ＭｓｂＡ－１２Ｇ７複合体を、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのＡＴＰおよび３．３ｍＭのバナジン酸ナトリウムと氷上で１時間インキュベートした。バナジン酸塩によってトラップされた試料を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のαＤＤＭ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのＡＴＰおよび１ｍＭのバナジン酸ナトリウムのランニングバッファーを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。ピーク画分を２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、３７μＭのＧ１１１８または６７μＭのＧ１３６５誘導体（図１４Ａ）および０．００７％Ｂｒｉｊ－３５とインキュベートした。リガンドと氷上で３０分間インキュベートした後、３．５μＬの各試料を、４℃および１００％の湿度でＶｉｔｒｏｂｏｔを使用してグロー放電Ｕｌｔｒａｆｏｉｌ ２／２ ２００メッシュグリッド上で凍結させた。２０ｅＶのスリット幅を有するＢｉｏＱｕａｎｔｕｍエネルギーフィルターおよびＫ２ Ｓｕｍｍｉｔ電子直接検出カメラ（Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を装備した３００ｋＶで動作されるＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上でクライオ－ＥＭデータを収集した。０．８４９Åの物理的ピクセルサイズを用いて、１６５，０００倍の公称倍率にて画像を記録した。各画像スタックは、０．２５秒のフレーム時間および約４０ｅ－／Å２の総露光量を有する４０のフレームを含有する。１．０～２．０μｍの固定デフォーカス範囲でデータを収集した。
ｄ．Ｇ１１１８についてのクライオ－ＥＭデータ処理
Ｇ１１１８についてのクライオ－ＥＭデータを、ｃｉｓＴＥＭ（Ｇｒａｎｔら、２０１８）を使用して処理した（図１５Ａ～Ｅ）。合計で９，９９９個のムービーを、ｃｉｓＴＥＭを使用してフルフレームモーションに補正し、１．３Åのピクセルサイズにビニングした。コントラスト伝達関数パラメータを、スペクトルの３０～４．０Åのバンドを使用して、ＣＴＦＦＩＮＤ－４とフィットさせ、８Åより良好なＣＴＥ分解能を有する５，９８４個の顕微鏡写真を、さらなる処理のために選択した。合計で１，２０６，８１９個の粒子を、ｃｉｓＴＥＭを使用して拾い上げた。２Ｄクラス平均において良好に整列した粒子を含むｃｉｓＴＥＭを使用して、アブイニシオ（Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ）モデルを生成した。完全なデータセットを、Ｃ１対称性を有するアビイニシオモデルに対して精密化した。コンセンサス精密化からの角度の割り当てを、アライメントなしの３Ｄ分類に使用した。最良クラスからの４１０，３８６個の粒子を、精密化に使用される分解能限界を繰り返し増大させることによって、さらに手動で精密化した。界面活性剤ミセルおよびＦａｂについての密度を、ＭｓｂＡの周りのマスクを使用することによって、２０Åにフィルタリングした。アライメントに使用した最大４Åの周波数を用いて、精密化を、３．０Åの分解能（ｃｉｓＴＥＭで決定されたフーリエシェルコリレーション（ＦＳＣ）＝０．１４３）に収束させた。モデル構築および図の作製については、マップを、以下のパラメータを用いてｃｉｓＴＥＭにおいて鮮鋭化した：１０Åの分解能からの平坦化、逆空間の起点からの－９０Å２のプレカットオフＢ－ファクターの適用および性能指数フィルターの適用。
ｅ．Ｇ１３６５についてのクライオ－ＥＭデータ処理
クライオ－ＥＭデータを、ｃｉｓＴＥＭ（Ｇｒａｎｔら、２０１８）とＲＥＬＩＯＮ（Ｓｃｈｅｒｅｓ、２０１２）との組み合わせを使用して処理した（図１７Ａ～Ｅ）。Ｇ６６７１で、合計で１０，２７３個の顕微鏡写真およびＧ３０８１では１７，５７５個の顕微鏡写真を収集した。各データセットを、ｃｉｓＴＥＭを使用してフルフレームモーションに補正し、１．１３２Åのピクセルサイズにビニングした。コントラスト伝達関数パラメータを、スペクトルの３０～４．０Åバンドを使用して、ＣＴＦＦＩＮＤ－４とフィットさせた。Ｇ６６７１で、合計で９３７，９７１個の粒子およびＧ３０８１では９９３，１５１個の粒子を、ｃｉｓＴＥＭを使用して拾い上げた。各データセットを、ｒｅｌｉｏｎにおいて一連の２Ｄおよび３Ｄ分類に個別に供した。大環状分子の正確な配置は、各データセットを個別に処理する場合の限定された分解能のために不可能であった。平均出力を増加させるために、Ｇ３０８１データセットからの２１８，８７７個の粒子およびＧ６６７１データセットからの２２２，９７５個の粒子をマージし、精密化をｃｉｓＴＥＭにおける一連の自動精密化に使用した。ＭｓｂＡマスクの外側の密度を、２０Åにフィルタリングした。ＭｓｂＡのモデル構築については、局所精密化の追加のラウンドを、４Åの高分解能限界を用いて行い、３．１Åマップを得た（ｃｉｓＴＥＭにおいて決定されたフーリエシェルコリレーション（ＦＳＣ）＝０．１４３）。追加の焦点を当てた精密化を、大環状分子モデル構築を補助する４．５Åの高分解能限界を有するＭｓｂＡのＴＭＤドメインのみを含むマスクを用いて行って、Ｇ１３６５の良好な密度を伴うマップ３．２Åを得た。モデル構築および図の作製については、マップを、以下のパラメータを用いてｃｉｓＴＥＭにおいて鮮鋭化した：８Åの分解能からの平坦化、ＭｓｂＡマップでは－９０Å２またはＴＭＤに焦点を当てた精密化では－１２０Å２のいずれかのプレカットオフＢ－ファクターの適用および性能指数フィルターの適用。静電マップを、ＡＰＢＳを用いてＰｙＭｏｌで計算した。
ｆ．モデル精密化
大腸菌ＭｓｂＡの相同性モデルを、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、２０１８）を使用して、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＭｓｂＡのＡＭＰＰＮＰ結合構造（ＰＤＢ：３Ｂ６０）に基づいて生成した。得られたモデルを、リジッドボディ－として、Ｇ１１１８クライオ－（ｃｒｙ－ｏ－）ＥＭマップにフィットさせた。モデルを、ＩＳＯＬＤＥ（Ｃｒｏｌｌ、２０１８）を用いたＣｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ、２００４）およびＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄら、２０１８；Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、２０２１）における手動調整、続いてｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔにおける実空間精密化（Ａｆｏｎｉｎｅら、２０１８）を通して精密化した。大環状分子をＣｏｒｉｎａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ＧｍｂＨ）を使用してパラメータ表記し、密度に手動でフィットさせた。Ｇ１１１８構造からのＭｓｂＡ座標を、その後、反復モデル構築前のＧ１３６５についての初期モデルとして使用した。モデルを、組込みＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアリングを用いたｐｈｅｎｉｘ．ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｃｒｙｏＥＭを使用して検証した。図は、ＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄら、２０１８；Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、２０２１）を使用して生成した。
実施例７：大環状分子ＭｓｂＡ阻害剤の発見および特徴づけ
ａ．対抗選択および外向き立体配座のトラッピング（予備的スクリーニング）を用いて、また用いずに選択された分子の比較
ＭｓｂＡの周辺質面に選択的に結合する１４－ｍｅｒの大環状分子を同定するための異なる選択スキームの能力を評価するために、いくつかの選択スキームの結果を、ＥＬＩＳＡアッセイによって比較した（表３）。多くのペプチドを用いて、ＭｓｂＡに対する特異的結合を示した。ペプチドは、バナジン酸塩に依存する結合と、キメラ存在下では回収率が低減しないことの両方を示す。
Figure 2024519413000013
表３の上部、左側に示すように、（ａ）溶液中で実施された、ＥｃＭｓｂＡをその外向き立体配座にトラップするためのバナジン酸塩の存在下で、およびキメラＭｓｂＡを使用する対抗スクリーニングを用いて実施された選択は、約２６％～２％の頻度で（表３；％ｆｒｅｑの欄の最初の６行）大環状分子のグループの同定をもたらした。スクリーニングを、（ｂ）溶液中で、バナジン酸塩を用いたが、対抗選択なしで、（ｃ）ビーズ上で、バナジン酸塩を用いないが、対抗選択を含めて、および（ｄ）ビーズ上で、バナジン酸塩を用いたが、対抗選択を用いずに実施した場合に、特定の大環状分子の同様なセットを同定した。（表３の最も左側の欄および「％ｆｒｅｑ」の欄を参照されたい。）その後、同定された大環状分子の各々に対して、ＥｃＭｓｂＡタンパク質をその外向き立体配座にトラップするためのバナジン酸塩の存在下および非存在下でＥＬＩＳＡアッセイを実施し、ＥｃＭｓｂＡへの結合と、無関係の膜タンパク質ＯｐｒＦへの結合と、ストレプトアビジンビーズ（ＳＡ）への結合とを試験した。結果は、（ａ）溶液中で、対抗スクリーニングを用いてバナジン酸塩を伴って選択された分子が、バナジン酸塩の存在下でＥｃＭｓｂＡに良好に結合するが、バナジン酸塩なしでは、その結合は不良であり（「＋／－比」の欄、最初の６行）、どちらの条件でもＯｐｒＦ単独またはストレプトアビジンビーズ単独のいずれにも十分に結合しなかった。条件（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）で同定されたスクリーニングでの分子の大部分は、それがバナジン酸塩で外向き立体配座にトラップされようがされまいが、ＥｃＭｓｂＡに同様な程度まで結合し、タンパク質を外向き立体配座にトラップすること、およびキメラタンパク質対抗スクリーニングを使用することは両方とも、ＥｃＭｓｂＡの周辺質面に結合する分子を同定する上でより効果的であることを示している。結合競合物質としてのキメラＥｃＭｓｂＡタンパク質の存在下および非存在下で、ビーズ上での同定された分子のＥｃＭｓｂＡへの結合を試験するために、競合ＥＬＩＳＡ実験も実施した。ＥｃＭｓｂＡの存在下および非存在下での結合の同様な程度、したがって１．０以上の比は、分子がＥｃＭｓｂＡに対して選択的であること、およびキメラがＥｃＭｓｂＡへの結合をめぐる競合物質として作用しないことを示している。（表３の右手側欄を参照されたい。）（ａ）のスクリーニング条件下で同定された分子は、アッセイにおいて１．０以上の比によって示されるように、キメラの存在下および非存在下で同様な程度の結合を有していた。これは、それらの分子のＥｃＭｓｂＡの周辺質面に対する結合と一致する。
ｂ．ＭｓｂＡ阻害剤Ｇ１１１８の部位指向性発見
大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）の水性周辺質裂け目を特異的に標的とする分子を濃縮させるために、構造に基づく相同性モデル化をまず用いて、膜貫通セグメントの周辺質面を、反復ＢＬＡＳＴ検索を使用して評価した（図９Ａ～１２Ｂ）、遠縁のグラム陰性細菌に由来する推定上のＭｓｂＡトランスポータータンパク質の配列で各々まとめて置き換える５つの特有のキメラコンストラクトの操作を誘導した。構築された５つのキメラのうち、キメラ２、キメラ４、およびキメラ５（ＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５）は、安定して発現されて、大腸菌から精製された（図１１Ａ～Ｂ）。キメラのＡＴＰアーゼ活性および薬理学の評価は、これらの大きな配列変化が、生化学的活性を維持しながら許容され得ることを明らかにした（図１１Ｃ）。特に、ＥｃＭｓｂＡの周辺質面全体をマグネトスピラ・スピリラムからのＭｓｂＡホモログに由来する配列で置き換えたＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５は、なお同等のＡＴＰアーゼ活性を維持し、以前に同定された野生型（ＷＴ）ＥｃＭｓｂＡの小分子阻害剤のキノリン（Ｇ２４７およびＧ９０７）とベンゾフェノン（Ｇ７５８）クラスの両方に対する感受性を示した（図１１Ｄ～Ｅおよび１２Ａ～Ｂ）。
次に、精製した外向き立体配座にトラップされたＷＴ ＥｃＭｓｂＡトランスポーターに対する大環状分子の選択、その後、膜貫通セグメントの周辺質面が、遠縁のグラム陰性細菌に由来する推定上のＭｓｂＡトランスポータータンパク質の配列でまとめて置き換えられた（図３Ａおよび９Ａ～１２Ｂ）同様にトラップされたＭｓｂＡキメラを使用する対抗選択が続いた。選択は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を組み込んだ（実施例２）、１０個の（ＫａｒｏｗおよびＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ、１９９３）分子を含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたペプチド大環状分子ｍＲＮＡディスプレイ１２～１４ｍｅｒライブラリーを使用した。８回の選択および対抗選択を行った後、１４－ｍｅｒの大環状分子、Ｇ１１１８は、ＷＴ ＥｃＭｓｂＡで著しい濃縮を示した（図３Ｂ）。Ｇ１１１８は、約１１０ｎＭの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）でＥｃＭｓｂＡのＡＴＰアーゼ活性に影響を与えることが見出され、周辺質裂け目の標的化（図３Ｃ）と一致する、精製されたＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５に対する３０分の１未満の力価（ＩＣ５０＞５μＭ）を示した。Ｇ１１１８はまた、関連するエンテロバクター・クロアカおよびクレブシエラ・ニューモニエのＭｓｂＡトランスポーターを、それぞれ、約２４０ｎＭおよび約１２０ｎＭのＩＣ５０で阻害したが（図１３Ａ～Ｄ）、ＥｃＭｓｂＡとのより低い配列同一性（約３９％）を有している緑膿菌ＭｓｂＡに対しては弱い活性のみを有していた（ＩＣ５０＝３．１μＭ）。Ｇ１１１８で処理された大腸菌細胞は、ＭｓｂＡの薬理学的阻害（図３Ｅ）と一致する、ＭｓｂＡの枯渇した細菌を反映する独特の内膜精緻化表現型（Ｄｏｅｒｒｌｅｒら、２００１）を引き起こした。Ｇ１１１８の比較的大きなサイズ（２，０８５Ｄａ）のために、細胞活性は、外膜（ＯＭ）透過性の欠陥を付与するｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）対立遺伝子を含有する細胞に限定され、測定された最小阻害濃度（ＭＩＣ）は約２１０μｇ／ｍＬであった（図１３Ｂ）。Ｇ１１１８のさらなる特徴づけについては、以下の実施例８で考察される。
ｃ．ＭｓｂＡ阻害剤Ｇ１３６５の部位指向性発見
ＯＭ透過性およびＷＴ大腸菌株に対する増殖阻害活性を有する大環状分子を発見するために、より小さい大環状分子足場を同定した。これらの小さい大環状分子足場もまた、８～１０ｍｅｒの大環状分子ライブラリーを使用してＥｃＭｓｂＡおよびＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５に対する追加の選択を実施することによって、周辺質裂け目においてＭｓｂＡを標的とする。また、第一級アミンを含む小さい両親媒性分子が細胞に蓄積する可能性が最も高いことが知られているため（Ｒｉｃｈｔｅｒら、２０１７）、親油性およびアミン含有側鎖に偏ったコドン表を利用した。
８－ｍｅｒの大環状分子、Ｇ１３６５を発見した。Ｇ１３６５は、ＭｓｂＡ－ｃｈｉｍ５トランスポーター（ＩＣ５０＞５μＭ）（図３Ｂおよび３Ｄ）と比べて、ＷＴ ＥｃＭｓｂＡに対する濃縮およびＡＴＰアーゼ阻害活性（ＩＣ５０＝１．３μＭ）を示した。生化学的アッセイにおいて、Ｇ１３６５は、関連するエンテロバクター・クロアカおよびクレブシエラ・ニューモニエのＭｓｂＡトランスポーターを、それぞれ約７００ｎＭおよび約６６０ｎＭのＩＣ５０で阻害した（図１３Ｃ）が、遠縁の緑膿菌のＭｓｂＡに対してより穏やかな阻害活性を有していた（ＩＣ５０＝７．６μＭ）。大腸菌ｉｍｐ４２１３のＧ１３６５処理は、オンターゲットＭｓｂＡ活性（図３Ｅ）と一致する、ＭｓｂＡの枯渇した細菌の内膜精緻化表現型を反映した。より大きな１４－ｍｅｒの大環状分子Ｇ１１１８とは対照的に、Ｇ１３６５は、インタクトな外膜を有するＷＴ大腸菌細胞の増殖を、約２０μＭのＩＣ５０で、６時間にわたって阻害することが判明した（図１３Ｂおよび１３Ｄ）が、一晩のＭＩＣは、決定することができなかった。全ゲノムシーケンス解析を、その後、Ｇ１３６５の誘導体に抵抗性の単離された大腸菌ｉｍｐ４２１３変異体に対して実施し（方法を参照）、ｍｓｂＡ中の単一のヌクレオチド突然変異が、ＭｓｂＡの周辺質裂け目内のアミノ酸変化、Ａｓｐ２５２Ａｓｎをもたらすことを明らかにした。Ｇ１３６５のさらなる特徴づけについては、以下の実施例９で考察される。
データは、ＭｓｂＡをＧ１３６５の細胞標的として総合的に特定し、インタクトな細菌外膜を横断することができる合成大環状分子を発見する可能性を際立たせている。
ｄ．追加の１４－ｍｅｒの大環状ペプチド活性化因子
試験された追加の大環状ペプチド活性化因子はＧ１１１９（ＣｌＡｃ－ＦＷＷＬＷＳＤＭｅＧＤＷＷＭｅＦＶＣ－ＮＨ２；配列番号１０）およびＧ１１２２（ＣｌＡｃ－ＦＲＹＬＷＭｅＡＷＧＬＶＷＤＮＣ－ＮＨ２；配列番号１１）であった。
Ｇ１１１９およびＧ１１２２のクライオ－ＥＭ解析は、それらが細胞外膜の積層を、Ｇ１１１８よりもさらに大きな程度まで引き起こすことを示した（Ｇ１１１９およびＧ１１２２についてのデータは示されず、Ｇ１１１８のデータについては図３Ｆを参照されたい）。Ｇ１１１８、Ｇ１１１９およびＧ１１２２によるＭｓｂＡのＡＴＰアーゼ活性の阻害についてのＩＣ５０を実施し（方法については、実施例８を参照されたい）、Ｇ１１１８およびＧ１１１９での５ｎＭのＩＣ５０値ならびにＧ１１２２での２ｎＭのＩＣ５０値を決定した。
式ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｘ２－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－ＭｅＦ－Ｖ－Ｃに従って設計した（上記実施例５を参照されたい）１１個の異なる分子も、ＭｓｂＡに対する阻害効果について試験した。上記実施例３で記載されたようなアッセイにおけるＡＴＰアーゼ活性について、０．２～０．８μＭのＩＣ５０値を有することを見出した。大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）の阻害のための最小阻害濃度（ＭＩＣ）（方法については、実施例３を参照）は、１００μＭを超え、ＵＰＥＣ ｉｍｐ株の細胞の増殖の阻害についてのＥＣ５０は、試験した分子のうちの１つを除く全てに対して約２～約８μＭであった（最後に試験された分子については１００μＭを超えた）。全体として、これらのデータは、大環状ペプチドＧ１１１８および上記式に従う関連するペプチドは、一般に、ＭｓｂＡおよびＭｓｂＡに関連する細胞活性を阻害することができることを示している。
実施例８：Ｇ１１１８は、ＭｓｂＡに結合する
ａ．Ｇ１１１８の生化学的特徴づけ
上記実施例１～５に記載の材料および方法を使用して、Ｇ１１１８を、ＭｓｂＡに結合する大環状分子として同定した。１４残基のペプチド大環状分子Ｇ１１１８を、８回の濃縮およびスクリーニング後に同定した。Ｇ１１１８は、ＥｃＭｓｂＡに対する強力な阻害活性（約１１０ｎＭの５０％阻害濃度（ＩＣ５０））を示し、対抗選択キメラに対するなお弱い活性を示した（ＩＣ５０＞５μＭ；図３Ｂ～Ｃおよび１３Ａ）。ｌｐｔ（ｉｍｐ４２１３）対立遺伝子を担持する外膜透過性大腸菌細胞のＧ１１１８処理（Ｓａｍｐｓｏｎら、１９８９）は、ＭｓｂＡの枯渇の特性である独特の内膜精緻化表現型２（図３Ｅ）を反映したが、インタクトな外膜を有するＷＴ大腸菌に対しては、活性は観察されなかった。Ｇ１１１８は、Ｍｇ２＋、ＡＴＰおよびバナジン酸塩による処理によって外向き立体配座にトラップされた精製したＷＴトランスポーターに対する大環状分子選択、その後の、同様にトラップされた周辺質キメラを使用した対抗選択で、周辺質裂け目以外の領域に結合する大環状分子を除去されることから同定された１４－ｍｅｒ大環状化合物である。Ｇ１１１８は、ＥｃＭｓｂＡに対する強力な阻害活性を有している。キメラＭｓｂＡとの対抗選択の後に、Ｇ１１１８は、ＷＴ ＥｃＭｓｂＡに対する著しい濃縮を示し続け、その阻害活性は、周辺質裂け目を標的化することと一致しており、それは、Ｇ１１１８が、精製したキメラに対して３０分の１未満の力価を示したためである。Ｇ１１１８で処理された大腸菌もまた、オンターゲット活性と一致する、ＭｓｂＡの枯渇した細菌の独特の膜精緻化表現型を反映した。しかしながら、Ｇ１１１８の細胞活性は、外膜（ＯＭ）透過性における欠損を付与するｉｍｐ４２１３対立遺伝子も含有する細胞に限定され、このことは、Ｇ１１１８がＯＭを横断してＭｓｂＡタンパク質に達することが困難であることを示唆している。Ｇ１１１８は、周辺質裂け目を標的化するＭｓｂＡの最初の強力かつ選択的な阻害剤に相当するため、その拮抗作用についての分子基盤を、上記実施例６に記載された構造生物学的方法を使用して研究した。
ｂ．Ｇ１１１８は、周辺質結合部位でＭｓｂＡに結合し、ＭｓｂＡを外向き状態でトラップする
Ｇ１１１８がＭｓｂＡを拮抗する分子メカニズムを明確にするために、ＡＤＰ－バナジン酸塩の存在下でのＭｓｂＡ－Ｇ１１１８複合体の３．０Åクライオ－ＥＭ構造を、粒子アライメントで補助するため抗体の抗原結合断片（Ｆａｂ）を使用して決定した（図４Ａ～Ｄ、１４Ａ～Ｃ、１５Ａ～Ｅ、および８）。材料および方法は、上記実施例６に記載された通りであった。Ｇ１１１８との複合体において、溶媒に露出した周辺ポケットが、ＭｓｂＡホモダイマーは、各ＭｓｂＡサブユニットの膜貫通ヘリックスＴＭ１、ＴＭ３およびＴＭ６の間に形成された外側に開いた立体配座（図４Ａ～Ｄ）をとる。周辺質裂け目中の単一のＧ１１１８大環状分子の存在を知らせるクライオ－ＥＭマップにおける強い特徴により、キメラ選択戦略の設計を検証する。Ｇ１１１８は、ＭｓｂＡの周辺質裂け目の複雑な物理化学的特性を補完する両親媒性ペプチドであり、極性、ファンデルワールスおよび疎水性の接触を補足し、溶媒が接触可能な表面積の約８８０Ａ２を埋める（図１６Ａ～Ｂ）。Ｇ１１１８の結合は、ＭｓｂＡが内向き立体配座に戻るのに必要な再配置とは互換性がなく（Ｈｏら、２０１８；Ｍｉら、２０１７；Ｗａｒｄら、２００７）、この大環状分子を、外向き立体配座にあるトランスポーターをロックして、ＬＰＳ輸送を妨げる状態依存的阻害剤として明確にしている。Ｇ１１１８は、ＭｓｂＡを阻害することによって細胞殺傷を引き起こすことが観察された（図３Ｅ）ので、共複合体構造は、生理学的に関連する阻害剤複合体に相当する可能性が高い。
ＭｓｂＡ上のＧ１１１８についての周辺質受容体部位は、膜－水性接触面の上下に延びるトランスポーターの中心軸の近くで見出されている（図４Ｂ、および１６Ａ～Ｂ）。ＭｓｂＡダイマーは、高度に対称であり（約０．４ÅのＣαＲＭＳＤ）、Ｇ１１１８は、Ｔｒｐ１０Ｇ１１１８とＴｒｐ１１Ｇ１１１８のインドール環を使用して疑似対称相互作用を行い、Ｌｅｕ４５、Ｌｅｕ５２、およびＩｌｅ２９２’の間にパックすることにより、ＴＭ１とＴＭ６’との間のトランスポーターの両側で、この固有の対称性を利用する（図４Ｃ）。Ｓｅｒ９Ｇ１１１８およびＴｒｐ３Ｇ１１１８は、それぞれ、ＭｓｂＡのＬｙｓ４９およびＳｅｒ２８９’の骨格カルボニルに結合した１対の水素結合を形成する（図４Ｄ）。Ｇ１１１８の極性面では、Ａｓｐ７Ｇ１１１８とＡｒｇ２９６との間で塩橋が直接観察され、これは以前にＬＰＳを内向き立体配座に配位させることが認められたＭｓｂＡの中央空洞内深くに高度に保存された塩基性残基である（図４Ｃ）（Ｈｏら、２０１８；Ｍｉら、２０１７）。Ｇ１１１８の濃縮された関連する配列の分析および突然変異スキャンによって、ＭｓｂＡと相互作用するのに必要とされる大環状分子の重要な相互作用および両親媒性を確認している（図４Ｅおよび表４）。
Figure 2024519413000014
上記表４は、大環状分子Ｇ１１１８の突然変異スキャンを示す。大環状分子のコアの２～１３位で示された置換を含有する各大環状分子についての濃縮係数が示されている（ここで、親値で正規化された、濃縮係数＝（％頻度［標的］／％頻度［入力］）である）。親と同一であるアミノ酸は、黒い枠線で示されている。天然アミノ酸は、標準的な一文字で示されている。非天然アミノ酸は、以下の通りである：（１）ＭｅＦ＝Ｆ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン；（２）ＭｅＧ＝Ｇ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン；（３）Ｄｏｐａ、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン；および（４）Ｂｐｈ＝Ｂ＊、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸。全体として、本発明者らの生化学的研究および構造研究は、ＡＢＣトランスポーターファミリー内の新規薬理学および受容体部位を特定する。
要約すると、複合体の構造は、突然変異分析のための残基の選択をガイドした。ＩＣ５０ｉｎ ｖｉｔｒｏ曲線は、これらの残基が大環状分子結合を弱めることを示した。逆に、ＲＮＡディスプレイ選択からの濃縮された配列の分析は、親和性についての大環状分子に対する残基の役割を指摘した。全体として、構造および細胞活性は、大環状分子選択戦略および周辺質裂け目を、本発明者らのタンパク質工学と選択戦略を決定的に検証する創薬可能な場所として検証した。Ｇ１１１８のサイズが大きいため、恐らくはＬＰＳリッチな外膜を透過する困難さが原因で、野生型の活性によって誘導体の最適化が妨げられた。
実施例９：Ｇ１３６５の同定
ａ．Ｇ１３６５の生化学的特徴づけ
ＯＭ透過性障壁を克服することができるより小さな大環状分子を選択する試みにおいて、別の一連の選択およびキメラ対抗選択を、８～１０ｍｅｒの大環状分子を使用して実施した。材料および方法は、実施例１～５に上述された通りであった。親油性および正荷電側鎖に偏ったコドン表も使用した。
これらの取り組みを用いて、Ｇ１３６５を同定した（実施例７および図３Ｂ）。Ｇ１３６５は、ＭｓｂＡに対して生化学的活性を示し（図３Ｄ；ＩＣ５０＝１．３μＭ）、Ｇ１３６５で処理された大腸菌ｌｐｔＤ（ｉｍｐ４２１３）細胞もまた、ＭｓｂＡ枯渇膜表現型を明らかにした（図３Ｅ）。とりわけ、Ｇ１３６５もまた、インタクトな外膜を有するＷＴ大腸菌細胞の増殖を６時間にわたって阻害し（約２０μＭのＩＣ５０；図１３Ｂおよび１３Ｄ）、インタクトな細菌外膜を横断することができる合成大環状分子を発見する可能性を際立たせている。具体的には、Ｇ１３６５および他の大環状分子のＭｓｂＡの通常および高いレベルのＭｓｂＡを発現するｉｍｐ大腸菌細胞（ＭｓｂＡ ＷＴおよびＭｓｂＡ Ｈｉｇｈならびに野生型大腸菌細胞（ＵＰＥＣ ＷＴ；すなわち通常のＯＭを有する）の生存率に対する効果を、大環状分子の異なる濃度で決定した（図３Ｅおよび３Ｇ～Ｌ、ならびに表５）。
Figure 2024519413000015
この実験でのＧ１３６５についての生化学的ＩＣ５０は３００ｎＭであり、野生型大腸菌細胞についてのＥＣ５０は、２０μＭであった。図３Ｇ～Ｌおよび以下の表５を参照されたい。Ｇ１３６５が大腸菌由来のＭｓｂＡに対して選択的であることをさらに確認するために、ｉｍｐ大腸菌および異なる細菌種、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕ．）の増殖阻害のＧ１３６５および他の大環状分子の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した。ｉｍｐ大腸菌でのＧ１３６５のＭＩＣは、１２．５μＭであったが、一方アシネトバクター・バウマニでは１００μＭを超え、濃度に約１０倍の差があり、Ｇ１３６５が、アシネトバクター・バウマニのＭｓｂＡと比較して大腸菌のＭｓｂＡと優先的に相互作用することを示している。他の試験された大環状分子についてのＭＩＣは、２つの細菌株間で違いはなく、それらが２つのＭｓｂＡタンパク質間で選択的ではないことを示している。その拮抗作用についての分子基盤を、上記実施例６に記載された構造的生物学の手法を使用して研究した。
ｂ．Ｇ１３６５は、ＭｓｂＡの周辺質裂け目内の深くに結合する
阻害の分子基盤を理解するために、ＭｓｂＡ－１２Ｇ７－Ｇ１３６５複合体のクライオ－ＥＭ構造を決定した。材料および方法は、上記実施例６に記載された通りであった。Ｇ１３６５の強力な誘導体との複合体中のＭｓｂＡの３．１Åクライオ－ＥＭ構造である（図１４Ａ～Ｂ、１７Ａ～Ｅ、および８）。とりわけ、Ｇ１３６５は、両親媒性分子であり、Ｇ１３６５のより小さなサイズは、Ｇ１１１８と比較して、Ｇ１３６５をＭｓｂＡの周辺質裂け目中にほぼ１０Å深く結合することを可能にする（図４Ａ、４Ｂ、４Ｆ、および１６Ａ～Ｄ）。ＭｓｂＡの中心軸に沿って結合するＧ１１１８とは異なり、Ｇ１３６５受容体部位は、周辺質裂け目の縁部で見出され（図４Ａ、４Ｂ、４Ｆ～Ｋ、および１６Ａ～Ｄ）、この両親媒性大環状分子が、脂質二重層から受容体部位に直接アクセスし得ることを示唆している。
Ｇ１３６５は、内向き状態への移行と互換性がないＭｓｂＡを外向き立体配座にトラップするので、Ｇ１３６５を状態依存的阻害剤として特定する。Ｇ１３６５への結合部位は、ＴＭ１、ＴＭ３、およびＴＭ６によって形成された結合部位を有するトランスポーターの膜露出領域に隣接し、Ａｒｇ６Ｇ１３６５のグアニジニウム側鎖は、脂質二重層の方向を向いている（図４Ｆ～Ｈ）。それぞれＭｅＦ５Ｇ１３６５とＡｒｇ１４８との間、およびＢｈｐ４Ｇ１３６５とＡｒｇ２９６との間のカチオン－π相互作用は、受容体部位内でのＧ１３６５の結合を安定化させる。伸長されたビフェニル残基Ｂｈｐ４Ｇ１３６５は、ＭｓｂＡの対称軸を超えて到達して、第２の大環状分子の結合を妨害する可能性が高い。Ｇ１３６５の濃縮された関連する配列および突然変異スキャンによって、ＭｓｂＡと相互作用するのに必要とされる大環状分子の重要な相互作用を確認している（図４Ｉおよび表５）。
Figure 2024519413000016
上記表６は、大環状分子Ｇ１３６５の突然変異スキャンを示す。上記表４と全く同じように、大環状分子のコアの２～７位で示された置換を含有する大環状分子についての濃縮係数（ここで、親値で正規化された、濃縮係数＝（％頻度［標的］／％頻度［入力］）である）である。親と同一であるアミノ酸は、黒い枠線で示されている。天然アミノ酸は、標準的な一文字で示されている。非天然アミノ酸は、以下の通りである：（１）ＭｅＦ＝Ｆ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン；（２）ＭｅＧ＝Ｇ＊、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン；（３）Ｄｏｐａ、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン；および／または（４）Ｂｐｈ＝Ｂ＊、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸。Ｇ１３６５の結合ポーズはまた、Ａｓｐ２５２Ａｓｎ耐性突然変異を論理的に説明することができ（上記実施例７）、なぜなら、これがＡｒｇ２９６とＧ１３６５との間の相互作用を妨害するはずだからである（図４Ｈ）。
予期せぬことに、Ｇ１３６５Ａｒｇ６のグアニジニウム側鎖は脂質二重層の方向を向いている。嵩高いビフェニル残基は、他のプロトマーカらＡｒｇ２９６に向かって、擬似対称軸を超えて到達する。この構造はまた、ＴＭ６上のＬｙｓ２９９の間の塩橋を破壊し、恐らくはＡｒｇ２９６とＧ１３６５との間の相互作用を妨害することによって、Ｄ２５２Ｎ耐性突然変異に対するメカニズムを論理的に説明する。Ｇ１３６５の構造は、２つの分子によってトラップされるＭｓｂＡの外向きに開いた立体配座が非常に類似していても、Ｇ１１１８と比較して独特の受容体部位を特定する。したがって、Ｇ１１１８と同様に、Ｇ１３６５は、結合設置面積が小さいにもかかわらず、ＭｓｂＡの状態依存的阻害剤である。
実施例１０：ＭｓｂＡ上の予想外のＬＰＳ結合部位の同定
ＭｓｂＡがどのように膜二重層内の大量のリン脂質ではなくその希少な基質ＬＰＳに最初に結合し、選択的輸送を達成するかは今や既知である。クライオ－ＥＭマップにおいては、十分に解明された２つのＬＰＳ分子は、ＭｓｂＡの周囲に結合している（図４Ａおよび１８Ａ～Ｄ）。これらの際立ったマップの特徴は、ＭｓｂＡダイマーの内膜小葉のレベルで、以前は認識されていなかった対称性の関連する配位部位に、脂質Ａの特徴的なビホスホグルコサミン頭部基を明確に配置することである（図１８Ａ）。重要なことに、可視化されたＬＰＳ分子は、ＭｓｂＡの内向き状態の入り口内の中央空間内で以前に観察された単一の結合部位（Ｈｏら、２０１８；Ｍｉら、２０１７）からは遠く離れている。ＬＰＳはクライオ－ＥＭに使用された試料には添加されていなかったので、外向き状態のＭｓｂＡ上のこれらの特有の周囲ＬＰＳ結合部位の同定は、それらが生理学的に関連のあることを示唆している。
ＭｓｂＡ上の周囲の内膜小葉ＬＰＳ結合部位は、ＴＭ２、ＴＭ４’およびＴＭ５’によって形成され、ＬＰＳの結合時に、８６５Å２のトランスポーター表面積が埋められる。ＭｓｂＡが結合したＬＰＳの３つの際立った特徴は、分子の脂質Ａコアに沿って広がっている（図５Ａ）。第１に、ＭｓｂＡからの高度に保存された塩基性側鎖が、脂質Ａのグルコサミン頭部基上の特徴的なリン酸に配位している（図１８Ｂ）。Ａｒｇ１８８およびＬｙｓ２４３が１－リン酸と塩橋を形成し（図５Ａ）、一方Ｌｙｓ９５およびＡｒｇ２３８が４’－リン酸と塩橋を形成している（図５Ｂ）。第２に、脂質Ａのヘキサ－アシル化尾部がトランスポーター上の伸長した疎水性表面と相互作用しており、ここでは２’－ヒドロキシミリスチン酸および２’’－ラウリン酸エステル結合が、それぞれ、Ｔｙｒ８７およびＴｒｐ９１の保存された芳香族側鎖に対してはめ込まれている。第３に、脂質Ａに由来する精緻化された３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（Ｋｄｏ）コア－糖類が、トランスポーター上の伸長した極性細胞内茎領域で配位されている（図１８Ｃ）。周囲ＬＰＳ結合部位で脂質Ａになされたこれらの戦略的な多点接触は、ＭｓｂＡがバルク膜リン脂質よりもＬＰＳに選択的に結合するための構造的基盤を明らかにしている。
ＭｓｂＡの外向き立体配座は、周辺質膜小葉への基質の解放と過去に関連付けられているため（Ｈｏら、２０１８；Ｍｉら、２０１７；Ｗａｒｄら、２００７）、この状態において内側小葉に沿ってＭｓｂＡに結合したＬＰＳを見出すことは、最初は驚きであった。ＬＰＳと相互作用する残基の標的化二重突然変異を生成した。この二重変異体を、ＷＴ ＭｓｂＡを欠く大腸菌細胞の増殖を助けるための能力について評価した（図１９Ａ～Ｊ）。脂質Ａの４’－リン酸に配位する塩基性残基（Ｌｙｓ９５およびＡｒｇ２３８）と、脂質Ａの２’－ヒドロキシミリスチン酸および２’’－ラウリン酸鎖エステルを支持する芳香族側鎖（Ｔｙｒ８７およびＴｒｐ９１）とが、不可欠であることが判明した。これは、それらのアラニンへの突然変異が、細胞増殖を阻止し、ＷＴ ＭｓｂＡの枯渇した細菌を反映する独特の内膜精緻化表現型を作り出したためである（図５Ｃ～Ｅ）（Ｄｏｅｒｒｌｅｒら、２００１）。対照的に、脂質Ａの１－リン酸に配位する側鎖（Ａｒｇ１８８およびＬｙｓ２４３）または近位の非ＬＰＳ相互作用残基は、必ずしも必要ではない。予想外に、（１）不可欠な周囲ＬＰＳ結合部位は、外向き立体配座にあるＭｓｂＡの内側小葉上で発見され、そして（２）重要な生理学的意義を有する以前には知られていない基質選択性決定因子が同定された。
実施例１１：考察
本開示は、ＡＢＣトランスポーターの強力かつ状態依存的阻害剤の部位指向性発見について考察する。本開示は、ＭｓｂＡの作用機序に関連するツールおよび新たな知見について考察する。これらのツールを用いると、内在性膜受容体部位に結合するリガンドの偏りのない発見に関連する多くの課題が克服された。
操作されたキメラタンパク質を使用して、外向き状態の溶媒に露出する裂け目を標的化することによって、ＡＢＣトランスポーターを選択的に阻害するために、部位指向性リガンド発見戦略が考案された。Ｇ１１１８およびＧ１３６５は、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリー内で新しい薬理学を定義する、外向きの裂け目内の今までに例のない受容体部位を標的とする２つの大環状化合物であり、これらの大環状分子は、さらなる抗菌物質の発見のための初期リード化合物に相当し得る。操作されたキメラを使用した類似した部位指向性リガンド発見の取り組みは、他のタンパク質クラスの新しい受容体部位を特定でき、新しい薬理学を発見するのに特に役立つ。
以前の研究は、ＭｓｂＡによって採用される輸送の交互のアクセスメカニズムに光を当ててはいたが（Ｈｏら、２０１８；Ｍｉら、２０１７；Ｗａｒｄら、２００７）、ＭｓｂＡがどのようにして大量の膜リン脂質より勝るＬＰＳに対する選択性を達成するかは不明なままであった。ＭｓｂＡの内向き構造は、中央空洞内に結合したＬＰＳを明らかにしたが、これらの構造は、輸送サイクルの中間状態を捉え、ＬＰＳがバルクリン脂質二重層から中央空洞にどのように選択的にロードされるかについての洞察を提供できない。本開示は、その基質に結合した外向き状態のＭｓｂＡの発見について考察しており、ＭｓｂＡが、トランスポーターの内膜小葉に沿って位置する保存された不可欠な側鎖ネットワークを通してまずＬＰＳを認識することを予期せずして明らかにする。これらの観察に基づいて、ＭｓｂＡによるＬＰＳ選択性のメカニズムの根底にあり得るいくつかの原理について以下に考察される。
今までは、ＡＢＣトランスポーターにおける外向き立体配座は、基質放出および触媒サイクルの終了と厳密に関連付けられてきた（Ｈｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎら、２００７）。上記実施例で考察したように、データはよりホリスティックなモデルを必要としており、それにより、外向き状態によって提示されるＬＰＳ結合部位が、トランスポーターの周りの内側小葉内のＬＰＳの局所的濃度を大きく増加させることに役立つ（図６）。外向き立体配座においては、ＭｓｂＡは、リン脂質に勝るＬＰＳに対する選択的な結合を達成するために、特徴的なビホスホグルコサミン頭部基、ヘキサアシル化鎖、およびＫｄｏ－コア糖類とのマルチポイント相互作用を通じて、周辺部位のコア脂質Ａの独特な化学構造を戦略的に標的とする（図５Ａ～Ｂ）。標的を絞った突然変異誘発および生理学的研究は、この以前には認識されなかったＬＰＳ結合部位において保存された残基の本質的な性質を確立した。内向き立体配座への移行の際の周囲の結合部位の妨害は、ＬＰＳを解放して、恐らくは、周囲の結合部位から入り口内の空間まで伸びる一連の塩基性残基に沿っての、中央空洞への選択的なローディングを容易にすると予想される（図１８Ｃ～Ｄ）。まとめると、ＭｓｂＡは、ＬＰＳの外側小葉への解放と基質の内側小葉への結合とを連動させ、以前にはＡＢＣエクスポーターサイクルの最後の段階と見なされていた外向き状態が、最初のものと固有かつ直接的に結び付く可能性があることを明らかにしている。
周囲ＬＰＳ認識複合体の可視化により、ＭｓｂＡがどのようにして成熟ＬＰＳ種と未成熟ＬＰＳ種との間を区別することができるかという最初の洞察を提供する。Ｌｙｓ９５およびＡｒｇ２３８側鎖は不可欠であり、脂質Ａの４’－リン酸への直接的塩橋を形成し（図５Ｂ）、前駆体の１－モノ－リン酸化脂質Ａ種が、なぜ輸送されないかの構造的根拠を提供する２３。Ｌｙｓ９５およびＡｒｇ２３８媒介相互作用の本質的性質もまた、４’－キナーゼＬｐｘＫのサプレッサー突然変異がなぜ同定されていないかを説明し、なぜＭｓｂＡおよびＬｐｘＫが染色体上連鎖されるか２４、またはなぜ一部の細菌中に単一の連結されたタンパク質として存在するか２５を論理的に説明する。さらに、Ｔｙｒ８７およびＴｒｐ９１側鎖は、不可欠であり、２’－ヒドロキシミリスチン酸および２”－ラウリン酸アシル鎖のエステル結合の直下にあり（図５Ｂ）、これらは、脂質Ａ生合成経路中の遅効性酵素、ＬｐｘＬおよびＬｐｘＭによって付加される２６、２７。この観察は、ヘキサ－アシル化ＬＰＳがＥｃＭｓｂＡの好ましい基質である理由についての分子的根拠を提供する２８、２９。周囲ＬＰＳ認識部位から浮かび上がる構図は、リン脂質よりもＬＰＳを選択的に濃縮することに加えて、ＭｓｂＡが、固有の品質管理を採用して、成熟したＬＰＳ種が内膜を越えて周辺質に輸送されるように選択されることを確実にすることである。この分子の洗練の度合いは、外膜障壁の組込みが未成熟ＬＰＳ種の通過によって損なわれないことを確実にする助けとなるであろう。全体として、本発明者らの知見は、脂質の選択的認識および輸送に光を当て、ＡＢＣトランスポーターが外向き立体配座を利用して、潜在的な基質を選択的に濃縮および取り調べることができるというパラダイムを導入する。
参考文献
Figure 2024519413000017
Figure 2024519413000018
Figure 2024519413000019
Figure 2024519413000020
Figure 2024519413000021
配列
以下の表は、本明細書に参照されているある特定の配列を説明する。以下に列挙されるある特定のペプチドの残基または官能基の間に、ダッシュが付加されている。
Figure 2024519413000022
Figure 2024519413000023
Figure 2024519413000024
Figure 2024519413000025
前述の発明は、理解の明確性のために、例示および実施例を用いていくらか詳細に記載されているが、説明および実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるものではない。本明細書において引用される全ての特許および科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

Claims (118)

  1. 試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するかどうかを判定する方法であって、
    ａ）親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の同等の領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、
    ｂ）キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子と接触させることであって、試験分子がキメラＡＢＣトランスポーターに結合しない場合、試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合すると判定される、キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子と接触させることと
    を含む方法。
  2. 試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合するかどうかを判定する方法であって、
    ａ）親ＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップすることと、
    ｂ）外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する試験分子を選択することと、
    ｃ）親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の領域が、異なるＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面の１つ以上の対応する領域で置換されているキメラＡＢＣトランスポーターを提供することと、
    ｄ）キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する（ｂ）の試験分子と接触させることであって、試験分子がキメラＡＢＣトランスポーターに結合しない場合、試験分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、および／または内腔面に結合すると判定される、キメラＡＢＣトランスポーターを、外向き立体配座にある親ＡＢＣトランスポーターに結合する（ｂ）の試験分子と接触させることと
    を含む方法。
  3. キメラＡＢＣトランスポーターを試験分子と接触させる前に、キメラＡＢＣトランスポーターを外向き立体配座にトラップすることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 親ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターを、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩で処理することによって、親ＡＢＣトランスポーターおよび／またはキメラＡＢＣトランスポーターが外向き立体配座にトラップされる、請求項２または３に記載の方法。
  5. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＩＶ型またはＶ型ＡＢＣトランスポーターである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＩＶ型ＡＢＣトランスポーターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）種株－ＯＨ－２から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 親ＡＢＣトランスポーターが、大腸菌に由来する、請求項８に記載の方法。
  10. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 異なるＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）種株－ＯＨ－２から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔ループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、請求項１３に記載の方法。
  15. 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、請求項１３に記載の方法。
  16. 少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、請求項１３に記載の方法。
  17. 周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全ておよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられているという点で、キメラＡＢＣトランスポーターが親ＡＢＣトランスポーターとは異なる、請求項１３に記載の方法。
  18. 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、それぞれ、２つの異なる種に由来の相同遺伝子によってコードされる、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 親ＡＢＣトランスポーターが、大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）であり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がシュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）の同等の領域（ＰｐＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  20. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がカンジダタス・アキュムリバクターの同等の領域（ＣａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  21. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）の同等の領域（ＪａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  22. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がチオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）の同等の領域（ＴｃＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  23. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＥｃＭｓｂＡであり、キメラＡＢＣトランスポーターが、周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）株－ＯＨ－２の同等の領域（ＭｑＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 分子が、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔裂け目に結合する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 分子の存在下で、親ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼアッセイを行うことをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 分子の存在下で、親ＡＢＣトランスポーターの細胞生存もしくは増殖アッセイおよび／またはＡＢＣトランスポーター機能アッセイを行うことをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ２０μＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法によって同定された分子。
  28. １０μＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  29. ２０ｎＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  30. ５００ｎＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  31. １ｎＭ以下のＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  32. １～２０μＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  33. １０～２０μＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  34. １ｎＭ～２０μＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  35. １ｎＭ～５００ｎＭのＫＤで親ＡＢＣトランスポーターに結合する、請求項２７に記載の分子。
  36. ペプチドである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法によって同定された分子。
  37. 小分子である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法によって同定された分子。
  38. 抗体である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法によって同定された分子子。
  39. ペプチドの結合断片、小分子、または抗体である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法によって同定された分子。
  40. 大環状分子である、請求項３６に記載のペプチド。
  41. ６～１４－ｍｅｒ、６～１０－ｍｅｒ、６～８－ｍｅｒ、または８～１０－ｍｅｒ大環状分子である、請求項４０に記載の大環状分子。
  42. 少なくとも１つの親油性側鎖と、少なくとも１つの正荷電側鎖とを有する、請求項４０または４１に記載の大環状分子。
  43. 親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔裂け目に結合する、請求項２７から４２のいずれか一項に記載の分子。
  44. 大環状分子ペプチドＧ１１１８（配列番号１もしくは２）、Ｇ１１１９（配列番号１０）、またはＧ１１２２（配列番号１１）。
  45. 大環状分子ペプチドＧ１３６５（配列番号３）。
  46. Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩による処理によって親ＡＢＣトランスポーターが外向きの立体配座にトラップされると、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質面への結合について大環状分子Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２と競合する分子。
  47. 競合アッセイにおいて、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、および／またはＧ１１２２の親ＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する、請求項４６に記載の分子。
  48. Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、およびバナジン酸塩による処理によって親ＡＢＣトランスポーターが外向きの立体配座にトラップされると、親ＡＢＣトランスポーターの周辺質面への結合について大環状分子Ｇ１３６５と競合する分子。
  49. 競合アッセイにおいて、Ｇ１３６５の親ＡＢＣトランスポーターへの結合を少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害する、請求項４８に記載の分子。
  50. キメラＡＢＣトランスポーターを作製する方法であって、親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％を、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えることを含む、方法。
  51. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項５０に記載の方法。
  52. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項５０に記載の方法。
  53. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項５０に記載の方法。
  54. 親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全ておよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項５０に記載の方法。
  55. 親ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターが、各々ＩＶ型またはＶ型ＡＢＣトランスポーターである、請求項５０から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 親ＡＢＣトランスポーターおよび異なるＡＢＣトランスポーターが、各々ＩＶ型ＡＢＣトランスポーターである、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、請求項５０から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）株－ＯＨ－２から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. グラム陰性細菌が、大腸菌である、請求項５８に記載の方法。
  60. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 異なるＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 異なるＡＢＣトランスポーターが、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）株－ＯＨ－２から選択される細菌に由来する、請求項６１に記載の方法。
  63. 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、それぞれ、２つの異なる種に由来の相同遺伝子によってコードされる、請求項５０から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、２つの異なるグラム陰性細菌種に由来するＭｓｂＡトランスポーターである、請求項６３に記載の方法。
  65. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、キメラＡＢＣトランスポーター。
  66. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  67. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大２５％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  68. 親ＡＢＣトランスポーターの少なくとも１つの周辺質、細胞外、または内腔に面するループおよびループの両側の膜貫通セグメントの最大１０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  69. 親ＡＢＣトランスポーターの周辺質、細胞外、または内腔に面するループのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全ておよび各ループの両側の膜貫通セグメントの最大５０％が、異なるＡＢＣトランスポーターの同等の領域で置き換えられている、請求項６５に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  70. 親ＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、請求項６５から６９のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  71. グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）株－ＯＨ－２から選択される、請求項７０に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  72. 親ＡＢＣトランスポーターが、大腸菌に由来する、請求項７１に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  73. 親ＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、請求項７０から７２のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  74. 異なるＡＢＣトランスポーターが、グラム陰性細菌に由来する、請求項７０から７３のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  75. グラム陰性細菌が、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダタス・アキュムリバクター、ジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）、チオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）、またはマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）株－ＯＨ－２から選択される、請求項７４に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  76. 異なるＡＢＣトランスポーターが、ＭｓｂＡである、請求項７０から７５のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  77. 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、それぞれ、２つの異なる種に由来の同じ遺伝子によってコードされる、請求項６５から７６のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  78. 親ＡＢＣトランスポーターと、異なるＡＢＣトランスポーターとが、２つの異なるグラム陰性細菌種に由来するＭｓｂＡトランスポーターである、請求項７７に記載のキメラＡＢＣトランスポーター。
  79. 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がシュードモナス・サイクロトレランス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）の同等の領域（ＰｐＭｓｂＡ）で置き換えられている親ＡＢＣトランスポーター大腸菌ＭｓｂＡ（ＥｃＭｓｂＡ）を含むキメラＡＢＣトランスポーター。
  80. 周辺質ループ１（Ｌ１、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３、ＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５、ＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２）がカンジダタス・アキュムリバクターの同等の領域（ＣａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
  81. 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がジャンシノバクテリウム・アガリシダムノスム（ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ）の同等の領域（ＪａＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
  82. 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がチオミクロスピラ・サイクリカ（ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｃｙｃｌｉｃａ）の同等の領域（ＴｃＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
  83. 周辺質ループ１（Ｌ１）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｌｅｕ４７～Ｐｒｏ６８、周辺質ループ３（Ｌ３）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ｍｅｔ１５９～Ｌｅｕ１７１、および周辺質ループ５（Ｌ５）中のＥｃＭｓｂＡ残基Ａｌａ２６２～Ｉｌｅ２９２のうちの１つ以上がマグネトスピラ（ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒａ）株－ＯＨ－２の同等の領域（ＭｑＭｓｂＡ）で置き換えられているＥｃＭｓｂＡを含むキメラＡＢＣトランスポーター。
  84. ペプチド、小分子、抗体、ペプチドの結合断片、小分子の結合断片、または抗体の結合断片に結合した請求項６５から８３のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーターを含む分子複合体。
  85. ペプチドが、大環状分子である、請求項８４に記載の複合体。
  86. 大環状分子が、６～１４－ｍｅｒ大環状分子である、請求項８５に記載の複合体。
  87. 親ＡＢＣトランスポーターと、請求項２７から４９のいずれか一項に記載の分子とを含む分子複合体。
  88. ペプチドが、大環状分子である、請求項８７に記載の複合体。
  89. 大環状分子が、６～１４－ｍｅｒ大環状分子である、請求項８８に記載の複合体。
  90. 大環状分子が、Ｇ１１１８、Ｇ１１１９、Ｇ１１２２、またはＧ１３６５である、請求項８９に記載の複合体。
  91. 請求項６５から８３のいずれか一項に記載のキメラＡＢＣトランスポーターと、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法を実行するための試薬とを含むキットであって、任意選択で、キメラＡＢＣトランスポーターが、マトリックスまたはビーズに取り付けられており、任意選択で、キットが：
    ａ．キメラＡＢＣトランスポーターがそこから操作される、親ＡＢＣトランスポーターおよび／または異なるＡＢＣトランスポーター；
    ｂ．ＡＢＣトランスポーターを取り付けるためのマトリックスまたはビーズ、任意選択で、ストレプトアビジン被覆ビーズ、アビジン被覆ビーズ、もしくは脱グリコシル化アビジン被覆ビーズ、または磁性ビーズ；
    ｃ．マトリックスまたはビーズ上のＡＢＣトランスポーターを可溶化するための１つ以上のデタージェント；
    ｄ．少なくとも１つの洗浄バッファー；
    ｅ．少なくとも１つの溶出バッファー；
    ｆ．少なくとも１つのポジティブまたはネガティブコントロール分子
    のうちの１つ以上をさらに含む、キット。
  92. 使用説明書をさらに含む、請求項９１に記載のキット。
  93. 個体における細菌感染症を治療する方法であって、有効量の請求項２７から４９のいずれか一項に記載の分子を個体に投与することを含む方法。
  94. 対象において細菌感染症を治療するための、請求項２７から４９のいずれか一項に記載の分子の使用。
  95. 配列：ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｘ２－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－ＭｅＦ－Ｖ－Ｃを含むペプチドであって、式中、
    ｉｘ．Ｘ１が、Ｗ、Ｖ、またはＹであり、
    ｘ．Ｘ２が、ＷまたはＹであり、
    ｘｉ．Ｘ３が、ＷまたはＹであり、
    ｘｉｉ．Ｘ４が、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨであり、
    ｘｉｉｉ．Ｘ５が、Ｎであり、Ｎが、Ｃ以外の任意の天然アミノ酸、またはＢｐｈ（（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸）、Ｄｏｐａ（Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）、ＭｅＦ（Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン）、およびＭｅＧ（Ｎ－メチル－Ｌ－グリシン）から選択される非天然アミノ酸から選択され、
    ｘｉｖ．Ｘ６が、Ｙ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、またはＶであり、
    ｘｖ．Ｘ７が、Ｗ、Ｙ、またはＢｐｈであり、
    ｘｖｉ．Ｘ８が、ＷまたはＹであり、
    任意選択で、ペプチドが、Ｃ末端でのＣ残基に続くＧ残基をさらに含み、ＣｌａｃＦが、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈが、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａが、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦが、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンであり、ＭｅＧが、Ｎ－メチル－Ｌ－グリシンである、ペプチド。
  96. Ｘ１が、ＷまたはＹである、請求項９５に記載のペプチド。
  97. Ｘ１が、Ｗである、請求項９６に記載のペプチド。
  98. Ｘ２が、Ｗである、請求項９５から９７のいずれか一項に記載のペプチド。
  99. Ｘ３が、Ｗである、請求項９５から９８のいずれか一項に記載のペプチド。
  100. Ｘ４が、Ｓ、Ｄ、Ｖ、またはＨである、請求項９５から９９のいずれか一項に記載のペプチド。
  101. Ｘ４が、Ｄである、請求項１００に記載のペプチド。
  102. Ｘ５が、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、またはＹである、請求項９５から１０１のいずれか一項に記載のペプチド。
  103. Ｘ５が、ＶまたはＨである、請求項１０２に記載のペプチド。
  104. Ｘ５が、Ｖである、請求項１０３に記載のペプチド。
  105. Ｘ６が、ＤまたはＳである、請求項９５から１０４のいずれか一項に記載のペプチド。
  106. Ｘ６が、Ｓである、請求項１０５に記載のペプチド。
  107. Ｘ７が、Ｗである、請求項９５から１０６のいずれか一項に記載のペプチド。
  108. Ｘ８が、Ｗである、請求項９５から１０７のいずれか一項に記載のペプチド。
  109. 請求項９５から１０８のいずれか一項に記載のペプチドから形成された大環状分子であって、ＣｌａｃＦのＮ末端クロロアセチル基とＣ残基のスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合のために環化している、大環状分子。
  110. アミノ酸配列：
    ［００１９２］ＣｌａｃＦ－Ｘ１－Ｙ－Ｂｐｈ－ＭｅＦ－Ｘ２－Ｖ－Ｃを含むペプチドであって、式中、
    ｉｉｉ．Ｘ１が、Ｖ、Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｄｏｐａ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｋ、またはＤであり、
    ｉｖ．Ｘ２が、Ｒ、Ｖ、Ｄｏｐａ、またはＹであり、
    ＣｌａｃＦが、Ｎ－クロロアセチルＬ－フェニルアラニンであり、Ｂｐｈが、（Ｓ）－３－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－アミノプロパン酸であり、Ｄｏｐａが、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンであり、ＭｅＦが、Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニンである、ペプチド。
  111. Ｘ１が、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｋ、またはＤである、請求項１１０に記載のペプチド。
  112. Ｘ１が、ＶまたはＹである、請求項１１１に記載のペプチド。
  113. Ｘ１が、Ｖである、請求項１１０から１１２のいずれか一項に記載のペプチド。
  114. Ｘ２が、ＲまたはＹである、請求項１１０から１１３のいずれか一項に記載のペプチド。
  115. Ｘ２が、Ｒである、請求項１１４に記載のペプチド。
  116. 請求項１１０から１１５のいずれか一項に記載のペプチドから形成された大環状分子であって、ＣｌａｃＦのＮ末端クロロアセチル基とＣ残基のスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合のために環化している、大環状分子。
  117. ペプチドまたは大環状分子が、抗生物質または抗菌薬などの別の分子にコンジュゲートしており、任意選択で、コンジュゲーションが、配列のＣ末端アミノ酸残基におけるものである、請求項９５から１１６のいずれか一項に記載のペプチドまたは大環状分子。
  118. 抗生物質または抗菌薬が、ポリミキシン、例えば、ポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである、請求項１１７に記載のペプチドまたは大環状分子。
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