JP2024517669A - アンジオポエチン－２に特異的に結合する抗体、またはその断片 - Google Patents

Abstract

本発明は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に特異的に結合し、Ｔｉｅ２の活性化を誘導する抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、または配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、または配列番号２７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、または配列番号２８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；（ｂ）配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、または配列番号２９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、または配列番号３０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、または配列番号３１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片に関する。

Description

本発明は、新生血管形成誘導因子であるアンジオポエチン－２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２；Ａｎｇ２）に特異的に結合し、Ａｎｇ２と共にＴｉｅ２受容体に結合する抗Ａｎｇ２抗体またはその断片に関する。

アンジオポエチンタンパク質群は、血管の生成及び維持に重要な役割を行うタンパク質であって、４種のアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、Ａｎｇ４）が存在する。

アンジオポエチン－１は、Ｔｉｅ２受容体に結合し、血管の成熟、接着、移動及び生存に重要な役割をする。

反面、アンジオポエチン－２は、血管内皮細胞に存在する受容体Ｔｉｅ２に結合するが、拮抗的なリガンド（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｌｉｇａｎｄ）として作用して、Ｔｉｅ２の作用物質（ａｇｏｎｉｓｔ）であるアンジオポエチン－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１；Ａｎｇ１）とＴｉｅ２結合に対して競合することによって、Ｔｉｅ２による信号伝達を抑制する作用をする。このような作用メカニズムにより、ＶＥＧＦの過発現又は炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）状態では血管内皮細胞が活性化され、血管透過性（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）が増加するが、このとき、Ａｎｇ１が血管内皮細胞の安定化を誘導し、血管透過性を減少させる反面、活性化された血管内皮細胞で増加したＡｎｇ２はＡｎｇ１と競合することによって、Ａｎｇ１による血管内皮細胞の安定化を抑制する役割をする。したがって、Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦが存在するとき、血管内皮細胞の安定性を維持するＡｎｇ１－Ｔｉｅ２結合と、これを通じた信号伝達を阻害し、結果的に血管の新生血管形成を促進することによって、結果的に血管生成の増加、血管の不安定化、血管透過性の増加をもたらす。一方、Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２受容体の非活性を誘導するアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）としての役割以外に、リンパ管の形成及び維持を含むいくつかの特定の状況ではＴｉｅ２受容体の活性を誘導する作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）の特性が報告されたことがあるため、アンタゴニストとしての機能と弱い作用剤の機能の両方を有し、状況によって様々な機能を行うものと見なされる。

新生血管の形成過程は、癌の成長に必須の要素であるため、前記のようなＴｉｅ２依存的なＡｎｇ２の機能を阻害して新生血管の形成を抑制することによって癌の追加的な成長を防ごうとする試みがあったが、これらは、ほとんどの場合、Ａｎｇ２とＴｉｅ２の結合を阻害してアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）としての役割を防ぐ機能を有するものと知られている。Ａｎｇ２のＴｉｅ２に対する結合を妨げる抗体以外にも、Ｔｉｅ２受容体に直接結合してリン酸化及び活性化を誘導する組換えタンパク質や抗体も報告されたことがある。

最近は、Ａｎｇ２に結合してＴｉｅ２に共に結合することによって、Ｔｉｅ２クラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を通じてＴｉｅ２のリン酸化及び活性化を行う抗体も報告されたことがあるが、これは、単純にＡｎｇ２のアンタゴニストとしての役割を防ぐことに止まるものではなく、むしろ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用するようにすることによって、さらに効果的な血管正常化の可能性を提示したものである。

大韓民国公開特許第１０－２０２０－０１４４５３６号

本発明の目的は、新生血管形成誘導因子であるＡｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）に特異的に結合し、Ａｎｇ２と共にＴｉｅ２受容体に結合してＴｉｅ２受容体の活性化を効果的に誘導する抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を提供することである。

本発明の他の目的は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分とする薬学組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、新生血管の形成、血管透過性の増加、及び／又は正常血管生成の減少と関連する疾病の治療用薬学組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分とする癌の予防又は治療用薬学組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を含む、Ａｎｇ２の過発現と関連する疾病の診断用組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、これを用いた抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に特異的に結合し、Ｔｉｅ２の活性化を誘導する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、または配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、
配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、または配列番号２７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び
配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、または配列番号２８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
（ｂ）配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、または配列番号２９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、
配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、または配列番号３０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び
配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、または配列番号３１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本発明の一具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号６のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号７のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことが好ましく、
本発明の他の具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号１１のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号１４のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことが好ましいが、これに限定されない。

本発明の他の具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号１９のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号２２のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことが好ましいが、これに限定されない。

本発明の更に他の具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号２７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号３０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことが好ましいが、これに限定されない。

本発明の一具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変部位と、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５及び配列番号３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位とを含むことが好ましいが、これに限定されない。

本発明の一具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）抗体、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、またはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体であることが好ましいが、これに限定されない。

本明細書で使用された「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、可変領域配列が１つの種に由来し、及び不変領域配列が、可変領域配列がマウス抗体に由来し、不変領域配列がヒト抗体に由来した抗体のような、他の種に由来した抗体を含む。

本明細書で使用された用語「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウスのような、他の哺乳類種の生殖細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）に由来したＣＤＲ配列がヒト構造形成領域にグラフトされた抗体を含む。更なる構造形成領域の変形は、更に他の哺乳類種の生殖細胞に由来したＣＤＲ配列内だけでなく、ヒト構造形成配列内でなされることもできる。

また、本発明は、前記本発明の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片をコードする分離された核酸を提供する。

本発明の一具現例において、前記抗体またはその抗原結合断片は、アンジオポエチン－２に特異的に結合し、Ａｎｇ２と共にＴｉｅ２受容体に結合することが好ましいが、これに限定されない。

本発明の一具現例において、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。

また、本発明は、前記本発明の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成、または血管透過性の増加と関連する疾病の予防又は治療のための薬学組成物を提供する。

本発明の一具現例において、
前記Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成、または血管透過性の増加と関連する疾病は、癌、癌転移、炎症疾患、感染、心血管疾患、腎臓疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張症、喘息、または浮腫であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明の一具現例において、前記癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病を含むが、これらに限定されない。このような癌のさらに特定の例は、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平細胞腫を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃又は胃腸癌（胃腸癌と胃腸間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝細胞癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜や子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌や腎臓細胞癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫及び様々な形態の頭頸部癌、黒色腫、表在性拡散黒色腫、悪性黒色腫、末端黒子黒色腫、結節性黒色腫だけでなく、Ｂ細胞リンパ腫（低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中級／濾胞性ＮＨＬ；中級びまん性ＮＨＬ；高級免疫芽球ＮＨＬ；高級リンパ芽球ＮＨＬ；高級小非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球白血病；移植後リンパ増殖疾患（ＰＴＬＤ）だけでなく、母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するもののような）、メージュ症候群のような異常血管増殖を含むが、これらに限定されない癌である。

また、本発明は、前記本発明の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、正常血管生成の減少と関連する疾病の予防又は治療のための薬学組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記正常血管生成の減少と関連する疾病は、心筋梗塞、狭心症、脳硬塞、脳卒中、バージャー病、無血管壊死、足部潰瘍、または勃起不全であることが好ましいが、これに限定されない。

また、本発明は、前記本発明の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、アルツハイマー疾患；リウマチ性関節炎、多発性硬化症、又は乾癬のような炎症性自己免疫疾患；老化関連黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿性網膜症（ＤＲ）、又は緑内障のような眼科疾患；またはコロナウイルス１９のようなコロナウイルス感染疾患の予防又は治療のための薬学組成物を提供する。

また、本発明は、前記本発明の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を、放射線照射、化学療法剤、細胞毒性剤及び／又は免疫毒性剤と同時に、個別に、または順次に投与することを含む、癌治療に使用するための併用治療用組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記化学療法剤、細胞毒性剤及び／又は免疫毒性剤は、好ましくは、テモゾロミド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、５－ＦＵ、ダカルバジン、プロカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、イリノテカン、タキソール、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、グリベック、イレッサ、タルセバ及びネクサバール、ハーセプチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ及びＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡＴＭ）、より好ましくは、テモゾロミド、シスプラチン、オキサリプラチン、ビンブラスチン、タキソール、ゲムシタビン、グリベック及びイレッサから選択される１つ以上であるが、これに限定されない。

以下、本発明を説明する。

特に定義されない限り、本発明で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。

本発明は、Ａｎｇ２に特異的に結合するが、Ａｎｇ２とＴｉｅ２受容体との結合を阻害せず、Ａｎｇ２及びＴｉｅ２受容体と共に複合体（抗体／Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２）をなす抗体が、Ａｎｇ２と共にＴｉｅ２受容体と結合して、Ａｎｇ１のようにＴｉｅ２受容体を活性化させてＴｉｅ２下部信号伝達（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を誘導し、血管内皮細胞の安定化を誘導する二重作用（ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有する抗体またはその抗原結合断片を提供する。

また、Ａｎｇ２と共にＴｉｅ２受容体と結合して、Ａｎｇ１のようにＴｉｅ２受容体を活性化させる効果に加えて、癌細胞の成長及び／又は癌転移に関与する他のタンパク質、例えば、インテグリンとＡｎｇ２との結合を阻害して、より増進された癌細胞成長阻害及び／又は癌転移抑制の効果を有し、Ｔｉｅ２が発現しない細胞においてもこのような効果を発揮できる抗Ａｎｇ２抗体及びその医薬的用途が提供される。

本発明の一実施例において、上述した抗Ａｎｇ２抗体の重鎖相補性決定部位、軽鎖相補性決定部位、またはこれらの組み合わせ；あるいは重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。前記ポリペプチド分子は、抗体またはその抗原結合断片の作製だけでなく、Ａｎｇ２に対する拮抗剤の前駆体又は構成成分として機能することができる。例えば、前記ポリペプチド分子は、Ａｎｇ２抗原結合部位の役割をするものであってもよく、抗体と類似の構造を有するタンパク質骨格体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えば、ペプチボディー、ナノボディーなど）、二重特異抗体、多重特異抗体などの構成成分として含まれてもよい。

用語「拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」は、標的物（例えば、Ａｎｇ２）の生物学的活性のうちの１つ以上を部分的に又は完全に遮断、抑制または中和させるすべての分子を含む概念として解釈される。

用語「ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ペプチドと抗体のＦｃ部分などの不変部位の全部又は一部が融合された融合タンパク質であって、前記ペプチドが抗原結合部位（重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲまたは可変領域）として作用して、抗体と類似の骨格及び機能を有するタンパク質を意味する。

用語「ナノボディー」は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、抗体の単一可変ドメインをモノマー形態で含む抗体断片を意味し、完全な構造の抗体と類似に特定の抗原に対して選択的に結合する特性を有する。ナノボディーの分子量は、一般に約１２ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度であって、完全な抗体（２つの重鎖と２つの軽鎖を含む）の一般的な分子量（約１５０ｋＤａ～約１６０ｋＤａ）と比較して非常に小さく、場合によってはＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片よりも小さい。

用語「二重特異抗体」又は「多重特異抗体」は、２つ（二重特異抗体）またはそれ以上（多重特異抗体）の相異なる抗原を認識及び／又は結合するか、または同一の抗原の互いに異なる部位を認識及び／又は結合する抗体を意味するものであって、前記二重特異抗体又は多重特異抗体のうちの１つの抗原結合部位が前記ポリペプチドを含むものであってもよい。

具体例において、前記ポリペプチド分子は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８又は配列番号２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９又は配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号４、配列番号１２、配列番号２０又は配列番号２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択された１つ以上；
配列番号５、配列番号１３、配列番号２１又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６、配列番号１４、配列番号２２又は配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７、配列番号１５、配列番号２３又は配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択された１つ以上；またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。

具体例において、前記ポリペプチド分子は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４又は配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５又は配列番号３３のアミノ酸配列、またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。

「カバット（Ｋａｂａｔ）番号」、「カバット（Ｋａｂａｔ）定義」、「カバット（Ｋａｂａｔ）ラベリング」という用語は、本明細書で互いに交換的に使用する。本発明の属する技術分野で認められるこれらの用語は、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域や抗原結合部位の当該部位の他のアミノ酸残基よりさらに多様性を示す（即ち、高可変性の）アミノ酸残基に対するナンバリングシステムを指す（カバット（Ｋａｂａｔ）など（１９７１）ニューヨーク科学学会年鑑（Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ）１９０：３８２－３９１、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．など（１９９１）免疫学的に関心が持たれるタンパク質の配列、第５版、米国保健及び人的サービス部、米国国立保健院出版番号９１－３２４２）。

上述したように、前記二重特異抗体又は多重特異抗体は、互いに異なる２種またはそれ以上の抗原に対するそれぞれの抗原結合部位を含むことで、２種以上またはそれ以上の抗原を同時に認識及び／又は結合する抗体であって、前記抗原結合部位のうちの１つは、上述したポリペプチド分子を含むものであってもよい。具体的に、前記Ａｎｇ２抗原結合部位の役割をする前記ポリペプチド分子は、他の抗原に対する抗原結合部位と二量体又は多量体を形成して、二重特異抗体又は多重特異抗体を構成することができる。したがって、一具体例において、Ａｎｇ２抗原結合部位として前記ポリペプチド分子を含む二重特異抗体又は多重特異抗体が提供される。

更に他の例において、上述したポリペプチド分子１つ以上又は前記ポリペプチド分子がリンカーによって繰り返して連結された反復体（以下、「第１ペプチド」）と、構造的機能を有するポリペプチド（以下、「第２ペプチド」；例えば、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなど）の重鎖又は軽鎖の不変部位、または抗体のＦｃ断片）とを含むペプチド複合体を１つ以上（例えば、１～５個、または２～４個）含み、前記１つ以上のペプチド複合体が第２ペプチド（例えば、Ｆｃ断片）で結合されて多量体構造を有するタンパク質骨格体が提供される。

本発明において、抗体は、動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を全て含む。所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に治療目的でヒトに投与時に免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制するために、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を用いて、抗－アイソタイプ（ａｎｔｉ－ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因となる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗－アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来のアミノ酸が可変領域に存在しており、潜在的な抗－イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善するために開発されたものが、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変領域のうちの抗原の結合に重要な役割をするＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。

ヒト化抗体を作製するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なのは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れることができる最適化されたヒト抗体を選定することであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化されたヒト抗体骨格に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体の骨格に位置しながら抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸が存在する場合があるため、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するので、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須であるといえる。

一具体例によれば、前記抗体は、マウス由来抗体、マウス－ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。

本発明において、「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、その種類は特に制限されない。抗体は、最近、疾病治療剤の用途に多く使用されている。抗体は、生体外だけでなく、生体内でも非常に安定しており、半減期が長いので、大量発現及び生産に有利である。また、抗体は、本質的にダイマー（ｄｉｍｅｒ）構造を有するので、接着能（ａｖｉｄｉｔｙ）が非常に高い。

完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

用語「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖及びその断片を全て含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て含む意味で解釈される。

用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、及びＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合するにおいて主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」又は「特異的に認識」は、当業者に通常公知されている意味と同じものであって、抗原及び抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。

本発明で提供される抗体の抗原結合断片は、前記相補性決定部位を１つ以上含む断片であり得る。

用語「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体の構造に対するその断片であって、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）_２であってもよいが、これに限定されない。

前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域、及び重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であって、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体片であって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されるか、またはＣ－末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。前記リンカーは、１～１００個、又は２～５０個の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよく、当業界に適切な配列が知られている。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂを得ることができ、ペブシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて作製することができる。

用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を有する領域を意味する。例えば、前記ヒンジは、ヒト抗体に由来したものであってもよく、具体的に、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来したものであってもよい。

動物由来抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジで置換されるが、動物由来のＩｇＧ１ヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、２つの重鎖間の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が３個から２個に減少し、ヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が互いに異なる効果を示すようになる。したがって、ヒンジ領域の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ヒト化抗体の抗原結合の効率性を増加させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列を変形させるためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者によく知られている。

抗Ａｎｇ２抗体の可変部位を除いた部分は、ヒト抗体に由来した不変部位であり得、具体的に、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来した不変部位であってもよい。

抗Ａｎｇ２抗体は単クローン抗体であり得る。単クローン抗体は、当業界に広く知られている方法の通りに製造することができる。例えば、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技法を用いて製造されてもよい。または、抗Ａｎｇ２抗体は、マウス単クローン抗体を用いて、Ｓｃｈｗａｂｅｒなどの論文に記載された方法によりマウス由来の単クローン抗体に製造され得る（Ｓｃｈｗａｂｅｒ，Ｊ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｐ．，“Ｈｕｍａｎ ｘ Ｍｏｕｓｅ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｌｏｎｅｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｔｙｐｅｓ．” Ｎａｔｕｒｅ，２４４（１９７３），４４４－４４７）。

一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを用いて、Ａｎｇ２との結合能に基づいて個別の単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競合的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析、または細胞ベース分析（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のような機能性分析を通じて阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対して、Ａｎｇ２に対するそれぞれの親和度（Ｋｄ ｖａｌｕｅｓ）を検定する。

最終的に選択された抗体は、抗原結合部を除いた残りの部分がヒトの免疫グロブリン抗体化された抗体だけでなく、ヒト化抗体として製造して使用することができる。ヒト化抗体の製造方法は当業界によく知られている（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．，“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３（２００８），１６１９－１６３３）。

他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む新生血管形成の阻害のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を新生血管形成の阻害を必要とする患者に投与する段階を含む新生血管形成の阻害方法を提供する。前記新生血管形成の阻害方法は、前記投与する段階の前に、新生血管形成の阻害を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む血管透過性の減少のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を血管透過性の減少を必要とする患者に投与する段階を含む血管透過性の減少方法を提供する。前記血管透過性の減少方法は、前記投与する段階の前に、血管透過性の減少を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成、及び／又は血管透過性の増加と関連する疾病の予防及び／又は治療のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を、Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成及び／又は血管透過性の増加と関連する疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者に投与する段階を含む、Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成及び／又は血管透過性の増加と関連する疾病の予防及び／又は治療方法を提供する。前記予防及び／又は治療方法は、前記投与する段階の前に、Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成及び／又は血管透過性の増加と関連する疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む正常血管生成の誘導のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を正常血管生成の誘導を必要とする患者に投与する段階を含む正常血管生成の増加方法を提供する。前記正常血管生成の増加方法は、前記投与する段階の前に、正常血管生成の誘導を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、正常血管生成の減少と関連する疾病の予防及び／又は治療のための薬学組成物を提供する。他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を、正常血管生成の減少と関連する疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者に投与する段階を含む、正常血管生成の減少と関連する疾病の予防及び／又は治療方法を提供する。前記予防及び／又は治療方法は、前記投与する段階の前に、正常血管生成の減少と関連する疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。

他の例は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む、新生血管の形成及び／又は血管透過性の増加及び／又は正常血管形成の減少と関連する疾病の診断用組成物を提供する。

前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体は、薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群から選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記薬学組成物はまた、薬学組成物の製造に通常用いられる希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群から選択された１種以上をさらに含むことができる。

前記薬学組成物、あるいは前記抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量は、経口又は非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時に、タンパク質又はペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化されてもよい。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてもよい。

前記薬学組成物内の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。例えば、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的に０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的に０．１～５０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに制限されるものではない。前記１日投与量は、単位用量の形態で一つの製剤に製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、多用量容器内に入れて製造されてもよい。前記「薬学的有効量」は、所望の薬理的効果を示すことができる有効成分の含量又は投与量を意味するものであり得、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に定められ得る。

前記薬学的組成物は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化されてもよく、剤形化のために、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

特に、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を含む薬学組成物は、抗体または抗原結合断片を含むので、免疫リポソームに剤形化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られている方法により製造され得る。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール－誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法により製造され得る。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を通じてリポソームに接合され得る。

一方、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片はＡｎｇ２に特異的に結合するので、これを用いてＡｎｇ２を検出することができ、これを通じて、Ａｎｇ２の過発現の有無を確認することができる。したがって、本発明の更に他の例は、前記抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を含むＡｎｇ２検出用組成物、及びＡｎｇ２の過発現と関連する疾病の診断用組成物を提供する。

本発明は、Ａｎｇ２を阻害すると同時に、Ｔｉｅ２受容体を活性化させて下流信号伝達を促進する抗体を提案することによって、Ａｎｇ２による新生血管の形成を阻害し、血管透過性を減少させることができる新しい方法を提示する。また、本発明で提案される抗体は、癌以外の異常血管形成関連の疾患及び／又は血管透過性が増加して誘発される疾患の診断及び治療への応用可能性が期待される。前記抗体は、化学医薬品及びその他の抗癌治療剤との併用治療療法などに活用可能であり、Ａｎｇ２に特異的な認知作用を用いて抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、二重又は多重特異抗体（ｂｉ－又はｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、タンパク質骨格体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ）などに使用可能であると期待される。

抗Ａｎｇ２抗体がＡｎｇ２と共に、ＨＵＶＥＣ細胞においてＡＫＴとＥＲＫ ４２／４４をリン酸化させることを示すウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）の結果である。 抗Ａｎｇ２抗体がＡｎｇ２と共に、ＨＵＶＥＣ細胞において抗体濃度依存的にＡＫＴリン酸化を誘導することを示すＥＬＩＳＡの結果である。グラフにおいて最も高い値を有する曲線から順にクローンを列挙すると、最も高いクローンが１Ｄ３、その次が２Ｃ８、その次が１Ａ９、その次が１Ｈ１０、そして、最も低い値を有するクローンが対照群である６７クローンである。 抗Ａｎｇ２抗体のヒトＡｎｇ２とマウスＡｎｇ２に対する結合親和度をＥＬＩＳＡを通じて分析した。 抗Ａｎｇ２抗体がＡｎｇ２及びＴｉｅ２と結合して複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することを示すＥＬＩＳＡの結果である。 抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８がＡｎｇ２とＴｉｅ２の結合を妨げないことを示すＥＬＩＳＡの結果である。 抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８がＬＬＣ肺癌細胞腫瘍モデルでの腫瘍の成長を抑制することを示す（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｍｅａｎ）。 抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８とシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）の併用投与がＬＬＣ肺癌細胞腫瘍モデルでのそれぞれの単独投与と比較して著しく優れた腫瘍成長抑制効能を有することを示す（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｍｅａｎ）。 抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８と５ＦＵの併用投与がＭＣ３８大腸癌細胞腫瘍モデルでのそれぞれの単独投与と比較して著しく優れた腫瘍成長抑制効能を有することを示す（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｍｅａｎ）。

以下では、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。以下に記載された実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって明らかである。

実施例１：抗Ａｎｇ２抗体の製造及びスクリーニング
抗原としてヒトＡｎｇ２（配列番号１）に特異的に結合する抗体をＡｂＣｌｏｎ（大韓民国）社に注文依頼し、本発明の抗体の製造はＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１（１９７６）を参考にした。

要約すると、マウスにヒトＡｎｇ２を抗原としてアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合して２回注入した後、抗体の生成の有無をＥＬＩＳＡ法で確認した。２回免疫後、抗体の力価（１：５０００）が増加し、免疫されたマウスから脾臓を摘出してＢリンパ球を分離した後、ｓｐ２／０細胞と融合させた。融合された細胞をヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）が添加されている培地（ＨＡＴ ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、Ｂリンパ球とｓｐ２／０細胞が融合された細胞（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を選択的に選別した。得られたハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞を段階希釈法（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて陽性細胞と陰性細胞を分離する過程（ｃｌｏｎｉｎｇ）を繰り返し、抗原に反応する抗体を産生する単一クローン細胞を製造した。

前記得られた抗体産生ハイブリドーマ細胞を１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉａｕｍ）で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した後、遠心分離を通じて抗体を産生する細胞を除去し、抗体が分泌された培養液を分離して、親和性カラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ａｇａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ））を用いて抗体を純粋精製した。

実施例２：抗Ａｎｇ２抗体によるＴｉｅ２信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の活性化誘導のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
Ａｎｇ２は、血管内皮細胞に発現されたＴｉｅ２受容体と結合して弱い作用剤又は拮抗剤として作用する。本発明で開発された抗Ａｎｇ２抗体がＡｎｇ２に結合してＡｎｇ２－Ｔｉｅ２と複合体を形成することによって、Ｔｉｅ２受容体を活性化させて下部信号伝達を促進させる作用をするので、細胞ベース分析法を用いて抗Ａｎｇ２抗体のＴｉｅ２下部信号伝達に及ぼす影響を分析するために、ＥＲＫとＡＫＴのリン酸化実験を行った。Ｔｉｅ２下部信号伝達の活性化の程度を比較するために、Ａｎｇ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と他のＡｎｇ２対照抗体（大韓民国特許公開第１０－２０１５－０１３６０３１号）を共に処理したグループに対しても同じ試験を行った。

具体的に、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）細胞（２×１０^５個）をＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）培地を用いて３７℃で培養した後、８０～９０％の培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を示すと、０．５％のＦＢＳ基本培地（Ｌｏｎｚａ）に変え、３７℃で１６～２４時間培養した。抗Ａｎｇ２抗体６０ｎＭをＡｎｇ２タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）４０ｎＭと混合して３０分間置いた後、前記培養された細胞に処理し、１０分間さらに培養した。比較のために、Ａｎｇ２ ４０ｎＭ、及びＡｎｇ２ ４０ｎＭ＋抗Ａｎｇ２対照抗体６０ｎＭをそれぞれ処理したグループを準備した。ＰＢＳを用いて前記細胞を洗浄した後、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ（Ｒｉｐａ ｂｕｆｆｅｒ）、０．１５Ｍの塩化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び２ｍＭのＥＤＴＡ）を処理した後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を回収し、細胞溶解物を得た。

細胞溶解物３５μｇに還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が混合されたサンプルバッファー（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）を入れ、９５℃で５分間煮沸した後、１０％のトリス－グリシンゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜（ＧＶＳ）に移動させた。Ｔｉｅ２受容体の下部信号伝達（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に関与するＡｋｔ、ＥＲＫ ４２／４４のリン酸化の有無を確認するために、前記のブロット（ｂｌｏｔ）を５％（ｖ／ｖ）のスキムミルク（ソウル牛乳）が混合されたＰＢＳＴで１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化ＥＲＫ ４２／４４抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＥＲＫ ４２／４４抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）を処理した。前記得られた結果を図１に示した。

図１に示されたように、１Ａ９、１Ｄ３、２Ｃ８、１Ｈ１０クローンが、陰性対照群と比較してＡＫＴ及びＥＲＫの活性化シグナルを示した。

実施例３：抗Ａｎｇ２抗体によるＴｉｅ２下部信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の活性化誘導のＥＬＩＳＡ
抗Ａｎｇ２抗体のＴｉｅ２下部信号伝達に及ぼす影響を定量的に分析するために、ＡＫＴのリン酸化レベルをＥＬＩＳＡを通じて測定した。

ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）細胞（２×１０^５個）をＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）培地を用いて３７℃で培養した後、８０～９０％の培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を示すと、０．５％のＦＢＳ基本培地（Ｌｏｎｚａ）に変え、３７℃で１６～２４時間培養した。抗Ａｎｇ２抗体６０ｎＭをＡｎｇ２タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）４０ｎＭと混合して３０分間置いた後、前記培養された細胞に処理し、１０分間さらに培養した。比較のために、Ａｎｇ２ ４０ｎＭ、及びＡｎｇ２ ４０ｎＭ＋抗Ａｎｇ２対照抗体（ｈ１０Ｄ６－ＯＰＴＩ－６７、ＵＳ１０９３４３５０）６０ｎＭをそれぞれ処理したグループを準備した。ＰＢＳを用いて前記細胞を洗浄した後、溶解バッファー（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）を処理した後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を回収し、細胞溶解物を得た。

ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルのｐｓ ｈａｌｆ ａｒｅａプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）にＰａｔｈＳｃａｎRＰｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３） Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐａｉｒ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体を１：１００に希釈して５０μＬを入れ、コーティングした。その後、ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ））で前記プレートを４回洗った後、１％（ｖ／ｖ）のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）が含有されたＰＢＳＴで３７℃で２時間ブロッキングした。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳＴで前記プレートを４回洗った後、細胞溶解物を入れ、３７℃で２時間、捕捉抗体にリン酸化されたＡＫＴが結合するようにした。ＰＢＳＴを用いてプレートを４回洗った後、１％のスキムミルクに１：１０００に希釈した２次抗体を３７℃で１時間結合させた後、ＰＢＳＴで４回洗った。最後に、前記プレートに５０μＬのＴＭＢ基質（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ）を添加して１０分間発色反応を誘導し、その後、Ｓｔｏｐ溶液５０μＬを添加して反応を中止させ、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定した。前記得られた結果を図２に示した。

図２に示されたように、本発明の単クローン抗体１Ａ９、１Ｄ３、２Ｃ８、１Ｈ１０が、既知の対照抗体と比較して著しく強いＴｉｅ２下部信号（ｓｉｇｎａｌ）の誘導が確認できた。

実施例４：マウス抗Ａｎｇ２抗体の遺伝子クローニング
前記実施例１で得られたハイブリードマからＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてＲＮＡを分離した。そして、これを鋳型として、既存に公知された方法によってｃＤＮＡの合成及びクローニングを行った（Ｍｅｙｅｒ Ｌなど、“Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ” ２０１９，ＰＬｏＳ ＯＮＥ）。ｃＤＮＡの合成はＳｕｐｅｒｉｏｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用い、合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、ＴＯＰｃｌｏｎｅｒ Ｂｌｕｎｔ ｃｏｒｅ ｋｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いてベクターにクローニングし、ＤＮＡ塩基配列の分析を行って、各抗体のＣＤＲ、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列とアミノ酸配列を得た（表１～表８）。

表１は、マウス抗Ａｎｇ２抗体１Ａ９のＣＤＲ配列

表２は、マウス抗Ａｎｇ２抗体１Ａ９の可変領域配列

表３は、マウス抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８のＣＤＲ配列

表４は、マウス抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８の可変領域配列

表５は、マウス抗Ａｎｇ２抗体１Ｄ３のＣＤＲ配列

表６は、マウス抗Ａｎｇ２抗体１Ｄ３の可変領域配列

表７は、マウス抗Ａｎｇ２抗体１Ｈ１０のＣＤＲ配列

表８は、マウス抗Ａｎｇ２抗体１Ｈ１０の可変領域配列

実施例５：抗Ａｎｇ２抗体のヒトＡｎｇ２又はマウスＡｎｇ２への結合のＥＬＩＳＡ
抗Ａｎｇ２抗体とヒトＡｎｇ２又はマウスＡｎｇ２との結合能を確認するためにＥＬＩＳＡを行った。９６－ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐ^ＴＭｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍプレートを１μｇ／ｍＬのヒトＡｎｇ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）又はマウスＡｎｇ２（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｌ）でコーティングした。その後、ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ））で前記プレートを５回洗った後、１％（ｖ／ｖ）のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）が含有されたＰＢＳＴで常温で２時間ブロッキングした。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳＴで前記プレートを５回洗った後、３００ｎＭから３倍連続希釈した１０種類の濃度の抗Ａｎｇ２を入れ、常温で２時間結合させた。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０のＰＢＳＴを用いてプレートを５回洗った後、１％のスキムミルクに１：３０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を１時間結合させた後、ＰＢＳＴで６回洗った。最後に、前記プレートに１００μＬ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）のＴＭＢ基質（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ）を添加して１０分間発色反応を誘導し、その後、Ｓｔｏｐ溶液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４）１００μＬを添加して反応を中止させ、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定した。前記得られた結果を図３に示した。

実施例６：抗Ａｎｇ２抗体の抗体－Ａｎｇ２－Ｔｉｅ２複合体の形成の確認のためのＥＬＩＳＡ
抗Ａｎｇ２抗体とＡｎｇ２ Ｔｉｅ２受容体との複合体が形成されるか否かを確認するためにＥＬＩＳＡを行った。９６－ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐ^ＴＭｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍプレートを２μｇ／ｍｌのＴｉｅ２ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。その後、ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ））で前記プレートを５回洗った後、１％（ｖ／ｖ）のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）が含有されたＰＢＳＴで常温で２時間ブロッキングした。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳＴで前記プレートを５回洗った後、予め準備した抗Ａｎｇ２抗体とＡｎｇ２の複合体を入れ、常温で２時間Ｔｉｅ２に結合するようにした。抗Ａｎｇ２抗体とＡｎｇ２の複合体は、抗Ａｎｇ２抗体を６００ｎＭの濃度で１％のスキムミルクに入れた後、１％のスキムミルクを使用して３倍連続希釈して１０種類の濃度を製造し、Ａｎｇ２を１％のスキムミルクに１μｇ／ｍＬ希釈した試料と１：１で混合して製造した。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０のＰＢＳＴを用いてプレートを５回洗った後、１％のスキムミルクに１：３０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を１時間結合させた後、ＰＢＳＴで６回洗った。最後に、前記プレートに１００μＬ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）のＴＭＢ基質（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ）を添加して１０分間発色反応を誘導し、その後、Ｓｔｏｐ溶液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４）５０μＬを添加して反応を中止させ、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定した。前記得られた結果を図４に示した。

実施例７：Ａｎｇ２－Ｔｉｅ２結合に対する抗Ａｎｇ２抗体の競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡ
抗Ａｎｇ２抗体を用いてＡｎｇ２－Ｔｉｅ２結合競合（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡを行った。より具体的に、９６－ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐ^ＴＭｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍプレートを４μｇ／ｍｌのＴｉｅ２ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングした。その後、ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ））で前記プレートを５回洗った後、１％（ｖ／ｖ）のＢＳＡが含有されたＰＢＳＴで常温で２時間ブロッキングした。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳＴで前記プレートを５回洗った後、ビオチン標識されたヒトＡｎｇ２と抗Ａｎｇ２抗体の複合体、またはビオチン標識されたヒトＡｎｇ２と標識されていないヒトＡｎｇ２の混合物を入れ、常温で２時間、Ｔｉｅ２に結合するようにした。このとき、ビオチン標識されたヒトＡｎｇ２は、ヒトＡｎｇ２（＞１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌにＭｏｄｉｆｉｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ １μｌを混合し、Ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｉｘが入っているバイアル（ｖｉａｌ）のキャップを除去し、Ａｎｇ２－ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れて混合した後、常温で光を遮断して１５分以上反応させた後、１μｌのＱｕｅｎｃｈｅｒ ｒｅａｇｅｎｔを入れ、５分間反応させて製造した。抗Ａｎｇ２抗体とビオチン標識されたＡｎｇ２の複合体は、抗Ａｎｇ２抗体を１．２μＭの濃度で１％のＢＳＡに入れた後、１％のＢＳＡを使用して５倍連続希釈して１０種類の濃度を製造した後、ビオチン標識されたヒトＡｎｇ２を１％のＢＳＡに１μｇ／ｍＬで希釈した試料と１：１で混合して製造し、ビオチン標識されたヒトＡｎｇ２と標識されていないヒトＡｎｇ２の混合物は、Ａｎｇ２を１％のＢＳＡに１．２μＭの濃度で１％のＢＳＡに入れた後、１％のＢＳＡを使用して５倍連続希釈して１０種類の濃度を製造した後、ビオチン標識されたヒトＡｎｇ２を１％のＢＳＡに１μｇ／ｍＬで希釈した試料と１：１で混合して製造した。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０のＰＢＳＴを用いてプレートを５回洗った後、１％のＢＳＡに１：１００００に希釈したストレプトアビジンＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を１時間結合させた後、ＰＢＳＴで６回洗った。最後に、前記プレートに１００μＬ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）のＴＭＢ基質（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ）を添加して１０分間発色反応を誘導し、その後、Ｓｔｏｐ溶液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４）５０μＬを添加して反応を中止させ、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定した。前記得られた結果を図５に示した。

実施例８：抗Ａｎｇ２抗体のマウス腫瘍モデルでの腫瘍成長抑制効果
抗Ａｎｇ２抗体の腫瘍成長抑制効果を確認するためにマウス腫瘍モデルを使用した。腫瘍の大きさ（Ｖ）は、次のような式を用いて計算した：
Ｖ＝Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ^３）＝（ｌｅｎｇｔｈ×ｗｉｄｔｈ^２）／２

Ａ．ＬＬＣ肺癌細胞腫瘍モデル
抗Ａｎｇ２抗体の腫瘍成長抑制効果を確認するために、マウス肺癌細胞株であるＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＡＴＣＣ）細胞株を用いた肺癌ｓｙｎｇｅｎｅｉｃマウスモデルが用いられた。ＬＬＣ細胞株は、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。ＬＬＣ細胞（１×１０^６ ｉｎ １００μＬ ｏｆ ＰＢＳ＋１００μＬ ｍａｔｒｉｇｅｌ）を同じ遺伝子型のＣ５７ＢＬ／６マウス（中央実験動物）の皮下に接種した後、癌細胞接種日から７日、９日、１１日、１４日、１６日目に抗Ａｎｇ２抗体（２Ｃ８）を５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、腫瘍の大きさを測定した。

図６に示したように、抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８が腫瘍の成長を阻害することを確認した。

抗Ａｎｇ２抗体と既存の他の抗癌剤との併用投与の効果を確認するために、ＬＬＣ肺癌モデルにおいてＡｎｇ２抗体２Ｃ８とシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）の併用投与試験を行った。ＬＬＣ細胞株は、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。ＬＬＣ細胞（１×１０^６ ｉｎ １００μＬ ｏｆ ＰＢＳ）を同じ遺伝子型のＣ５７ＢＬ／６マウス（オリエント）の皮下に接種した後、腫瘍の体積が５０～１００ｍｍ^３に達したとき、週３回で２週間、Ａｎｇ２抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。シスプラチン（Ｓｉｇｍａ）は、５ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した。実験は、Ｉｇ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）、２Ｃ８グループ、シスプラチングループ、及び２Ｃ８＋シスプラチングループで行われた。

図７に示したように、抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８とシスプラチンを併用投与する場合、対照群と比較して、腫瘍の成長を約４８％抑制して、抗Ａｎｇ２抗体や５ＦＵの単独投与と比較して著しく有意な効能を示した。このような結果は、抗Ａｎｇ２抗体が他の抗癌剤との併用投与を通じて、既存の抗癌剤単独治療よりもはるかに強力に癌成長を抑制できることを示す。

Ｂ．ＭＣ３８大腸癌細胞成長モデル
抗Ａｎｇ２抗体の大腸癌モデルでの腫瘍成長抑制効果及び５ＦＵ（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）との併用投与の効果を確認するために、マウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を用いた大腸癌ｓｙｎｇｅｎｅｉｃマウスモデルが用いられた。ＭＣ３８細胞株は、１０％のＦＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。ＭＣ３８細胞（１×１０^６ ｉｎ １００μＬ ｏｆ ＰＢＳ）を同じ遺伝子型のＣ５７ＢＬ／６マウス（オリエント）の皮下に接種した後、腫瘍の体積が７０～１００ｍｍ^３に達したとき、３日間隔で計５回、Ａｎｇ２抗体（２Ｃ８）を５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。５ＦＵは、２０ｍｇ／ｋｇの用量で２回投与した。実験は、Ｉｇ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）、２Ｃ８グループ、５ＦＵ（Ｓｉｇｍａ）グループ、及び２Ｃ８＋５ＦＵグループで行われた。

図８に示したように、抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８と５ＦＵが単独で類似のレベルの腫瘍生長抑制効果を示し、それだけでなく、抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８と５ＦＵを併用投与する場合、対照群と比較して、腫瘍の成長を約５８％抑制して、抗Ａｎｇ２抗体や５ＦＵの単独投与と比較して著しく有意な効能を示した。このような結果は、抗Ａｎｇ２抗体が他の抗癌剤との併用投与を通じて、既存の抗癌剤単独治療よりもはるかに強力に癌成長を抑制できることを示す。

Claims (16)

1. アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に特異的に結合し、Ｔｉｅ２の活性化を誘導する抗体またはその抗原結合断片であって、
   （ａ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、または配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、
   配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、または配列番号２７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び
   配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、または配列番号２８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
   （ｂ）配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、または配列番号２９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、
   配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、または配列番号３０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び
   配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、または配列番号３１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
2. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
   （ａ）配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
   （ｂ）配列番号５のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号６のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号７のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
   （ａ）配列番号１０のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号１１のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
   （ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号１４のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
   （ａ）配列番号１８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号１９のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
   （ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号２２のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
5. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
   （ａ）配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、配列番号２７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と；
   （ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、配列番号３０のアミノ酸配列のＣＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖ＣＤＲと；を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変部位と、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５及び配列番号３３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位とを含む、請求項１に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体またはその抗原結合断片は、アンジオポエチン－２に特異的に結合し、Ａｎｇ２と共にＴｉｅ２受容体に結合する、請求項１に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片をコードする分離された核酸。
9. 前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２からなる群から選択されるものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
10. 前記抗体またはその抗原結合断片は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）抗体、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、またはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片。
11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成、または血管透過性の増加と関連する疾病の予防又は治療のための薬学組成物。
12. 前記Ａｎｇ２の過発現、新生血管の形成、または血管透過性の増加と関連する疾病は、癌、癌転移、炎症疾患、感染、心血管疾患、腎臓疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張症、喘息、または浮腫である、請求項１１に記載の薬学組成物。
13. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、正常血管生成の減少と関連する疾病の予防又は治療のための薬学組成物。
14. 前記正常血管生成の減少と関連する疾病は、心筋梗塞、狭心症、脳硬塞、脳卒中、バージャー病、無血管壊死、足部潰瘍、または勃起不全である、請求項１３に記載の薬学組成物。
15. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、
    アルツハイマー疾患；
    リウマチ性関節炎、多発性硬化症、又は乾癬のような炎症性自己免疫疾患；
    老化関連黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿性網膜症（ＤＲ）、又は緑内障のような眼科疾患；または
    コロナウイルス１９のようなコロナウイルス感染疾患の予防又は治療のための薬学組成物。
16. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片を、放射線照射、化学療法剤、細胞毒性剤及び／又は免疫毒性剤と同時に、個別に、または順次に投与することを含む、癌治療に使用するための併用治療用組成物。