CN117279940A - 与血管生成素-2特异性结合的抗体或其片段 - Google Patents
与血管生成素-2特异性结合的抗体或其片段 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117279940A CN117279940A CN202280029146.1A CN202280029146A CN117279940A CN 117279940 A CN117279940 A CN 117279940A CN 202280029146 A CN202280029146 A CN 202280029146A CN 117279940 A CN117279940 A CN 117279940A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- angiopoietin
- antibody
- amino acid
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 102000009075 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 102
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 99
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 99
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 75
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 24
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 claims description 21
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 20
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 10
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 4
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 3
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010228 Erectile Dysfunction Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003790 Foot Ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031953 Hereditary hemorrhagic telangiectasia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012667 Diabetic glaucoma Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 21
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 21
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 21
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 101000924533 Homo sapiens Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 15
- 102000047825 human ANGPT2 Human genes 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 12
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 12
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 12
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 11
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 10
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 8
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 7
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000009792 yinqiao Substances 0.000 description 5
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 101000732672 Mus musculus Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 4
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 4
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102100033402 Angiopoietin-4 Human genes 0.000 description 2
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 2
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 2
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010069801 angiopoietin 4 Proteins 0.000 description 2
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229940084651 iressa Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940127084 other anti-cancer agent Drugs 0.000 description 2
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 2
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 208000017805 post-transplant lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000031852 Gastrointestinal stromal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 description 1
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029488 Nodular melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000020243 first infant milk formula Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- -1 glibenc Chemical compound 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035168 lymphangiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 201000000564 macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 201000000032 nodular malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 201000002628 peritoneum cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- UHTHHESEBZOYNR-UHFFFAOYSA-N vandetanib Chemical compound COC1=CC(C(/N=CN2)=N/C=3C(=CC(Br)=CC=3)F)=C2C=C1OCC1CCN(C)CC1 UHTHHESEBZOYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000241 vandetanib Drugs 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种抗血管生成素‑2抗体或其抗原结合片段，与血管生成素2(Ang2)特异性结合并诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶的激活的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含：(a)重链互补决定区；以及(b)轻链互补决定区，上述(a)重链互补决定区包含：序列2、序列10、序列18或序列26的氨基酸序列的CDRH1；序列3、序列11、序列19或序列27的氨基酸序列的CDRH2；以及序列4、序列12、序列20或序列28的氨基酸序列的CDRH3，上述(b)轻链互补决定区包含：序列5、序列13、序列21或序列29的氨基酸序列的CDRL1；序列6、序列14、序列22或序列30的氨基酸序列的CDRL2；以及序列7、序列15、序列23或序列31的氨基酸序列的CDRL3。
Description
技术领域
本发明涉及与作为新生血管形成诱导因子的血管生成素-2(Angiopoietin-2；Ang2)特异性结合并与血管生成素-2(Ang2)一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)受体结合的抗血管生成素-2抗体或其片段。
背景技术
血管生成素蛋白组为在血管的生成及保持中起到重要作用的蛋白质，存在4种血管生成素(血管生成素-1(Ang1)、血管生成素-2、血管生成素-3(Ang3)、血管生成素-4(Ang4))。
血管生成素-1与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合，在血管成熟、附着、移动及存活中起到重要作用。
相反，血管生成素-2虽然与存在于血管内皮细胞的受体内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合，但却起到拮抗性的配体(antagonistic ligand)的作用，通过与作为内皮细胞TEK酪氨酸激酶的激动物质(agonist)的血管生成素-1(Angiopoietin-1；Ang1)与内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合进行竞争来起到抑制通过内皮细胞TEK酪氨酸激酶的信号传导的作用。由于这样的作用机制，在血管内皮生长因子(VEGF)的过表达或炎症(inflammation)状态下，血管内皮细胞被激活，增加血管通透性(vascular permeability)，在此情况下，血管生成素-1诱导血管内皮细胞的稳定并减少血管通透性，与之相反，激活的血管内皮细胞中增加的血管生成素-2通过与血管生成素-1竞争来起到抑制由血管生成素-1引起的血管内皮细胞的稳定的作用。因此，在血管内皮生长因子存在时，血管生成素-2抑制保持血管内皮细胞的稳定性的血管生成素-1-内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Ang1-Tie2)结合以及通过其的信号传导，结果促进血管的新生血管形成，从而引起血管生成增加、血管的不稳定化以及血管通透性增加。另一方面，据报告，除诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体的灭活的拮抗剂(antagonist)的作用以外，血管生成素-2还具有在包括淋巴管形成及保持在内的几种特定状况下诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体的活性的激动剂(agonist)的特性，因此，认为同时具有作为拮抗剂的功能和弱激动剂(agonist)的功能并根据状况发挥多种功能。
新生血管形成过程为癌症生长所必需的因素，因此，尝试通过抑制如上所述的内皮细胞TEK酪氨酸激酶依赖性的血管生成素-2的功能来抑制新生血管形成以阻止癌症的进一步生长，但在大部分情况下，这种尝试仅具有通过抑制血管生成素-2与内皮细胞TEK酪氨酸激酶的结合来阻止其作为拮抗剂的作用的功能。除阻碍血管生成素-2与内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合的抗体以外，还报告有与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体直接结合来诱导磷酸化和激活的重组蛋白或抗体。
近来，还报告有与血管生成素-2结合并一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合，通过内皮细胞TEK酪氨酸激酶聚集(Tie2 clustering)来使内皮细胞TEK酪氨酸激酶磷酸化及激活的抗体，这不止单纯阻止血管生成素-2的拮抗剂作用，还起到激动剂的作用，从而提示更为有效的血管正常化的可能性。
现有专利文献
韩国专利公开号第10-2020-0144536号
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供与作为新生血管形成诱导因子的血管生成素-2特异性结合并与血管生成素-2一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合来有效诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体的激活的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一目的在于，提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的药物组合物。
本发明的另一目的在于，提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于治疗与新生血管形成、血管通透性增加和/或正常血管生成减少相关的疾病的药物组合物。
本发明的还有一目的在于，提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的用于诊断与血管生成素-2过表达相关的疾病的组合物。
本发明的又一目的在于，提供编码的上述抗体或其抗原结合片段、包含上述核酸的载体及宿主细胞、利用它们的制备抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的方法。
技术方案
为了实现上述的目的，本发明提供一种抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，作为与血管生成素2特异性结合并诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶激活的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含：
(a)重链互补决定区(CDR)；以及(b)轻链互补决定区。上述(a)重链互补决定区包含：序列2、序列10、序列18或序列26的氨基酸序列的CDRH1；
序列3、序列11、序列19或序列27的氨基酸序列的CDRH2；以及
序列4、序列12、序列20或序列28的氨基酸序列的CDRH3。上述
(b)轻链互补决定区包含：序列5、序列13、序列21或序列29的氨基酸序列的CDRL1；
序列6、序列14、序列22或序列30的氨基酸序列的CDRL2；以及
序列7、序列15、序列23或序列31的氨基酸序列的CDRL3。
在本发明的一实例中，优选地，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列2的氨基酸序列的CDRH1、序列3的氨基酸序列的CDRH2以及序列4的CDRH3；以及
(b)轻链互补决定区，包含序列5的氨基酸序列的CDRL1、序列6的氨基酸序列的CDRL2以及序列7的氨基酸序列的CDRL3。
在本发明的再一实例中，优选地，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列10的氨基酸序列的CDRH1、序列11的氨基酸序列的CDRH2以及序列12的CDRH3；以及
(b)轻链互补决定区，包含序列13的氨基酸序列的CDRL1、序列14的氨基酸序列的CDRL2以及序列15的氨基酸序列的CDRL3，但不限定于此。
在本发明的再一实例中，优选地，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列18的氨基酸序列的CDRH1、序列19的氨基酸序列的CDRH2以及序列20的CDRH3；以及
(b)轻链互补决定区，包含序列21的氨基酸序列的CDRL1、序列22的氨基酸序列的CDRL2以及序列23的氨基酸序列的CDRL3，但不限定于此。
在本发明的另一实例中，优选地，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列26的氨基酸序列的CDRH1、序列27的氨基酸序列的CDRH2以及序列28的CDRH3；以及
(b)序列29的氨基酸序列的CDRL1、序列30的氨基酸序列的CDRL2以及序列31的氨基酸序列的CDRL3，但不限定于此。
在本发明的一实例中，优选地，上述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，包含选自由序列8、序列16、序列24及序列32组成的组中的氨基酸序列；以及轻链可变区，包含选自由序列9、序列17、序列25及序列33组成的组中的氨基酸序列，但不限定于此。
在本发明的一实例中，优选地，上述抗体或其抗原结合片段为鼠(murine)抗体、嵌合(chimeric)抗体或人源化(humanized)抗体，但不限定于此。
本说明书中使用的“嵌合抗体(chimeric antibody)”包括可变区序列源自一个物种以及恒定区序列、可变区序列源自小鼠抗体而恒定区源自人类抗体等的源自其他物种的抗体。
本说明书中使用的术语“人源化抗体(humanized antibody)”包括将源自小鼠等其他哺乳动物种类的生殖细胞(germline)的CDR序列嫁接到人类结构形成区域的抗体。追加的结构形成区域的修饰不仅可以发生在源自其他哺乳动物种类的生殖细胞的CDR序列内，还可以发生在人类结构形成序列内。
并且，本发明提供编码上述本发明的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
在本发明的一实例中，优选地，上述抗体或其片段与血管生成素-2特异性结合并与血管生成素-2一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合，但不限定于此。
在本发明的一实例中，优选地，上述抗原结合片段选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab’及F(ab’)2组成的组中，但不限定于此。
并且，本发明提供包含上述本发明的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防或治疗与血管生成素-2过表达、新生血管形成或血管通透性增加相关的疾病的药物组合物。
在本发明的一实例中，
优选地，上述与血管生成素-2过表达、新生血管形成或血管通透性增加相关的疾病为癌症、癌转移、炎症疾病、感染、心血管疾病、肾脏疾病、遗传性出血性毛细血管扩张症、哮喘或水肿，但不限定于此。
在本发明的一实例中，上述癌症包括癌肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病，但不限定于此。这样的癌症的更为特定的例有扁平细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、非得扁平细胞瘤)、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃或胃肠癌(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌及多种形态的头部和颈部癌、黑色素瘤、浅表弥漫性黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤，还包括：B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)非霍奇金淋巴瘤；中度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤；中度弥漫性非霍奇金淋巴瘤；高度免疫母细胞非霍奇金淋巴瘤；高度淋巴母细胞非霍奇金淋巴瘤；高度小无龟裂细胞非霍奇金淋巴瘤；大肿瘤非霍奇金淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性骨髓母细胞白血病；移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，不仅如此，还包括痣病、水肿(与脑癌相关的疾病等)、梅格斯综合征等异常血管增生，但不限定于此。
并且，本发明提供包含上述本发明的血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防或治疗与正常血管生成减少相关的疾病的药物组合物。
在本发明的一实例中，优选地，上述与正常血管生成减少相关的疾病为心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑卒中、伯格氏病、缺血性坏死、足部溃疡或勃起功能障碍，但不限定于此。
并且，本发明提供一种包含上述本发明的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的药物组合物，上述药物组合物用于预防或治疗如下疾病：阿尔茨海默病；类风湿关节炎、多发性硬化症或银屑病等炎症性自身免疫疾病；老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病视网膜病变(DR)或青光眼等眼科疾病；或者新型冠状病毒感染等冠状病毒感染疾病。
并且，本发明提供一种用于癌症治疗的联合治疗用组合物，上述癌症治疗包括将上述本发明的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段与放射线照射、化疗剂、细胞毒剂和/或免疫毒剂同时、单独或依次给药。
在本发明的一实例中，优选地，上述化疗剂、细胞毒剂和/或免疫毒剂为选自替莫唑胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂、5-FU、达卡巴嗪、丙卡巴嗪、长春碱、长春新碱、伊立替康、泰素、紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、格列卫、易瑞沙、特罗凯及多吉美、赫赛汀、贝伐单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、索拉非尼、舒尼替尼及ZD6474(ZACTIMATM)中的一种以上，更优选地，为选自替莫唑胺、顺铂、奥沙利铂、长春花碱、紫杉醇、吉西他滨、格列卫及易瑞沙中的一种以上，但不限定于此。
以下，说明本发明。
若无其他定义，则本发明中使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的命名法为本发明所属技术领域中众所周知且通常使用的。
本发明提供如下抗体或其抗原结合片段：虽然与血管生成素-2特异性结合，但不抑制血管生成素-2与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体的结合，与血管生成素-2和内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体一同形成复合物(抗体/血管生成素-2/内皮细胞TEK酪氨酸激酶)的抗体与血管生成素-2一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合来像血管生成素-1一样激活内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体，从而具有诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶下游信号(Tie2 downstreamsignaling)并诱导血管内皮细胞的稳定化的双重功能(dual function)。
并且，提供如下抗血管生成素-2抗体及其医学用途：除与血管生成素-2一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合来像血管生成素-1一样激活内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体的效果以外，还抑制与癌细胞的生长和/或癌转移相关的其他蛋白质，例如整联蛋白与血管生成素-2的结合来具有更为增进的癌细胞生长抑制和/或癌转移抑制效果，从而也可以在在不表达内皮细胞TEK酪氨酸激酶的细胞内发挥上述效果。
在本发明的一实施例中，提供一种多肽分子，包含：前述说明的抗血管生成素-2抗体的重链互补决定区、轻链互补决定区或它们的组合；或者重链可变区、轻链可变区或它们的组合。上述多肽分子不仅可以在抗体或其抗原结合片段的制备中发挥功能，还可以发挥对于血管生成素-2的拮抗剂的前体或构成成分的功能。例如，上述多肽分子可以起到血管生成素-2抗原结合部位的作用，可有包含具有与抗体相似结构的蛋白质支架(proteinscaffold；例如肽抗体、纳米抗体)、双特异抗体、多特异抗体等的构成成分。
术语“拮抗剂(antagonist)”解释为包括部分或完全阻断、抑制或中和目标物(例如血管生成素-2)的生物活性中的一种以上的全部分子在内的概念。
术语“肽抗体(肽+抗体(peptide+antibody))”是指作为肽与抗体的Fc部分等恒定区的全部或一部分融合的融合蛋白，上述肽起到抗原结合部位(重链和/或轻链CDR或可变区)的作用，具有与抗体相似的支架和功能的蛋白质。
术语“纳米抗体”也称为单域抗体(single-domain antibody)，是指以单体形态包含抗体的单可变结构域的抗体片段，与完整的抗体相似地，具有选择性地与特定抗原结合的特性。纳米抗体的分子量通肠为约12kDa至约15kDa，与完整的抗体(包含两个重链与连个轻链)通常的分子量(约150kDa至约160kDa)相比非常小，根据情况，比Fab片段或scFv片段更小。
术语“双特异抗体″或″多特异抗体”是指识别和/或与两个(双特异抗体)或以上(多特异抗体)不同抗原结合，或者识别和/或与相同抗原的互不相同的部位结合的抗体，上述双特异抗体或多特异抗体中的一个抗原结合部位可以包含上述多肽。
在具体例中，上述多肽分子可以包含：选自由包含序列2、序列10、序列18或26的氨基酸序列的多肽、包含序列3、序列11、序列19或序列27的氨基酸序列的多肽以及包含序列4、序列12、序列20或序列28的氨基酸序列的多肽组成的组中的一种以上；
选自由包含序列5、序列13、序列21或序列29的氨基酸序列的多肽、包含序列6、序列14、序列22或序列30的氨基酸序列的多肽以及包含序列7、序列15、序列23或序列31的氨基酸序列的多肽组成的组中的一种以上；或者它们的组合。
在具体例中，上述多肽分子可以包含序列8、序列16、序列24或序列32的氨基酸序列以及序列9、序列17、序列25或序列33的氨基酸序列或者它们的组合。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”、“Kabat标签”可以在本说明书中互换使用。在本发明所属技术领域中得到认可的这些术语是指示出抗体的重链与轻链的可变区或抗原结合部位的相关部位比其他氨基酸残基更为多样性的(即，超可变性的)有关氨基酸残基的编号系统(Kabat等(1971)，纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad，Sci)190：382-391，Kabat，E.A.等(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，美国卫生与公众服务部，美国国立卫生研究院出版号91-3242)。
如上述所述，上述双特异抗体或多特异抗体包含对互不相同的两种或以上抗原的各抗原结合部位，同时识别和/或与两种或以上抗原结合，上述抗原结合部位中的一个可以包含前述说明的多肽分子。具体地，起到上述血管生成素-2抗原结合部位作用的上述多肽分子可以通过与有关其他抗原的抗原结合部位形成二聚体或多聚体来构成双特异抗体或多特异抗体。因此，在一具体例中，提供包含上述多肽分子作为血管生成素-2抗原结合部位的双特异抗体或多特异抗体。
在其他例中，提供如下蛋白质支架：包含一个以上(例如1个至5个或2个至4个)包含一个以上前述说明的多肽分子或上述多肽分子通过接头反复连接的反复体(以下称“第一肽”)与发挥结构性功能的多肽(以下称“第二肽”；例如，抗体(IgG、IgA、IgE、IgD、IgM等)的重链或轻链的恒定区或抗体的Fc片段)的肽复合物，上述一个以上肽复合物在第二肽(例如Fc片段)中结合而具有多聚体结构。
在本发明中，抗体包括动物来源抗体、嵌合抗体、人源化抗体及人类抗体。通过向被免疫动物免疫所希望的抗原来生产的动物来源抗体，在以治疗目的向人类给药时通常会引起免疫排斥反应，为了抑制这样的免疫排斥反应而开发了嵌合抗体(chimericantibody)。嵌合抗体为利用基因工程学将成为抗同种型(anti-isotype)反应的原因的动物来源抗体的恒定区取代为人类抗体的恒定区。虽然与动物来源抗体相比，嵌合抗体在抗同种型反应中可以得到相当程度的改善，但可变区中仍存在动物来源氨基酸，因此包含着潜在性的对于抗独特型(anti-idiotypic)反应的副作用。为改善这样的副作用而开发的是人源化抗体(humanized antibody)。这通过将嵌合抗体的可变区中在抗原的结合中起到重要作用的CDR(互补决定区(complementaritiy determining regions))部位移植到人类抗体支架(framework)来制备。
用于制备人源化抗体的CDR移植(grafting)技术中最为重要的是，选择能够最佳接受动物来源抗体的CDR部位的最优化的人类抗体，为此可以利用抗体数据库、结晶结构(crystal structure)的分析、分子建模技术等。然而，即使将动物来源抗体的CDR部位移植到最优化的人类抗体支架中，仍存在位于动物来源抗体的支架中并给抗原结合带来影响的氨基酸的情况，相当一部分仍存在抗原结合力得不到保存的情况，因此可以说用于复原抗原结合力的追加的抗体工程技术的应用是必需的。
根据一具体例，上述抗体可以为小鼠来源抗体、小鼠-人类嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
在本发明中，“抗体”是指在免疫系统内通过抗原的刺激产生的物质，其种类不受特别限制。近来，抗体以疾病治疗剂的用途多有使用。抗体不仅在生物体外，在生物体内的也很稳定且半衰期长，因此有利于大量表达及生产。并且，抗体本质上具有二聚体(dimer)结构，因此亲合力(avidity)非常高。
完整的抗体为具有两个全长(full length)轻链及两个全长重链的结构，各个轻链与重链通过二硫键连接。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(6)及伊普西龙(ε)型，亚型有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)及阿尔法2(α2)。轻链的恒定区有卡帕(κ)及兰布达(λ)型。
术语“重链(heavy chain)”解释为包括包含具有用来赋予对抗原的特异性的充分的氨基酸序列的可变区结构域VH及3个恒定区结构域CH1、CH2及CH3与铰链(hinge)的全长重链及其片段在内的含义。并且，术语“轻链(light chain)”解释为包括包含具有用来赋予对抗原的特异性的充分的可变区序列的氨基酸序列的可变区结构域VL及恒定区结构域CL的全长轻链及其片段在内的含义。
术语“互补决定区(CDR，complementarity determining region)”是指免疫球蛋白的重链及轻链的超变区(hypervariable region)的氨基酸序列。重链及轻链可以分别包含3个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3及CDRL1、CDRL2、CDRL3)。上述CDR可以在抗体与抗原或表位的结合中提供主要的接触残基。另一方面，在本说明书中，术语“特异性结合”或“特异性识别”与本发明所属技术领域的普通技术人员通常公知的含义相同，是指通过抗原与抗体的特异性相互作用来引起免疫反应。
本发明中提供的抗体的抗原结合片段可以为包含一个以上上述互补决定区的片段。
术语“抗原结合片段”作为相对于免疫球蛋白全部结构的片段，是指包含能够与抗原结合的部分的多肽的一部分。例如，可以为scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab’或F(ab’)2，但不限定于此。
在上述抗原结合片段中，Fab为具有轻链及重链的可变区与轻链的恒定区及重链的第一个恒定区(CH1)的结构，具有1个抗原结合部位。Fab’在重链CH1结构域的C-末端具有包含一个以上半胱氨酸残基的铰链区(hinge region)，这一点有别于Fab。F(ab’)2抗体通过Fab’的铰链区的半胱氨酸残基之间形成二硫键来生成。Fv为仅具有重链可变区及轻链可变区的最小的抗体片段，生成Fv片段的重组技术使本发明所属技术领域中广为人知的。双链Fv(two-chain Fv)通过非共价键连接重链可变区与轻链可变区，单链Fv(single-chainFv)通常通过肽接头使重链的可变区与单链的可变区以共价键连接或者在C-末端直接连接，从而像双链Fv一样形成如二聚体的结构。上述接头可以为由1个至100个或2个至50个任意氨基酸形成的肽接头，适当的序列在本发明所属技术领域中是公知的。上述抗原结合片段可以利用蛋白水解酶来获得(例如，使用木瓜蛋白酶有限切割完整抗体可以获得Fab，利用胃蛋白酶切割可以获得F(ab’)2片段)，可以通过基因重组技术制备。
术语“铰链区(hunge region)”为包含抗体的重链的区域，存在于CH1与CH2区域之间，是指提供抗体内抗原结合部位的灵活性(flexibility)功能的区域。例如，上述铰链可以源自人类抗体，具体地，可以源自IgA、IgE或IgG，例如，可以源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在动物来源抗体经过嵌合化(chimerization)过程的情况下，虽然动物来源的IgG1铰链取代为人类IgG1铰链，动物来源IgG1铰链的长度比人类IgG1铰链短，两个重链之间的二硫键(disulfide bond)从三个减少为两个，铰链的刚性(rigidity)示出互不相同的效果。因此，铰链区的修饰(modification)可以增加人源化抗体的抗原结合有效性。用于修饰上述铰链区的氨基酸序列的氨基酸的缺失、附加或取代方法是本发明所属技术领域的普通技术人员熟知的。
抗血管生成素-2抗体除可变区以外的部分可以为源自人类抗体的恒定区，具体地，可以为源自IgA、IgE或IgG的恒定区，例如，可以为源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
抗血管生成素-2抗体可以为单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本发明所属技术领域中广为人知的方法制备。例如，可以利用噬菌体展示(phage display)技术制备。或者，抗血管生成素-2抗体可以利用小鼠单克隆抗体通过Schwaber等的论文记载的方法制备为小鼠来源的单克隆抗体(Schwaber，J and Cohen，E.P.，″Human x Mouse Somatic CellHybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types，″Nature，244(1973)，444-447)。
另一方面，可以利用典型的酶联免疫吸附测定(ELISA，Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay)设计基于与血管生成素-2的结合能力筛选单独的个别的单克隆看题。对于结合物，可以通过用于检验分子相互作用的竞争性酶联免疫吸附测定(Competitive ELISA)等功能性分析或基于细胞的分析(cell-based assay)等功能性分析来检验抑制活性。然后，对于基于强的抑制活性选择的单克隆抗体成员，分别检验它们对于血管生成素-2的亲和力(Kd值(values))。
最终选择的抗体除抗原结合部位以外的剩余部分不仅可以制备为被人类免疫球蛋白化为抗体，还可以制备为人源化抗体。人源化抗体的制备方法是本发明所属技术领域中广为人知的(Almagro，J.C.and Fransson，J.，″Humanization of antibodies，″Frontiers in Bioscience，13(2008)，1619-1633)。
其他例提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于抑制新生血管形成的药物组合物。其他例提供抑制新生血管形成的方法，包括向需要抑制新生血管形成的患者给药药学上有效量的上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的步骤。上述抑制新生血管形成的方法还可以在上述给药步骤之前包括确认需要抑制新生血管形成的患者的步骤。
其他例提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于减少血管通透性的药物组合物。其他例提供减少血管通透性的方法，包括向需要减少血管通透性的患者给药药学上有效量的上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的步骤。上述减少血管通透性的方法还可以在上述给药步骤之前包括确认需要减少血管通透性的患者的步骤。
其他例提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防和/或治疗与血管生成素-2过表达、新生血管形成和/或血管通透性增加相关的疾病的药物组合物。其他例提供预防和/或治疗与血管生成素-2过表达、新生血管形成和/或血管通透性增加相关的疾病的方法，包括向需要预防和/或治疗与血管生成素-2过表达、新生血管形成和/或血管通透性增加相关的疾病的患者给药药学上有效量的上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的步骤。上述预防和/或治疗方法还可以在上述给药步骤之前包括确认需要预防和/或治疗与血管生成素-2过表达、新生血管形成和/或血管通透性增加相关的疾病的患者的步骤。
其他例提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于诱导正常血管生成的药物组合物。其他例提供增加正常血管生成的方法，包括向需要诱导正常血管生成的患者给药药学上有效量的上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的步骤。上述增加正常血管生成的方法还可以在上述给药步骤之前包括确认需要诱导正常血管生成的患者的步骤。
其他例提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分的用于预防和/或治疗与正常血管生成减少相关的疾病的药物组合物。其他例提供预防和/或治疗与正常血管生成减少相关的疾病的方法，包括向需要预防和/或治疗与正常血管生成减少相关的疾病的患者给药药学上有效量的上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的步骤。上述预防和/或治疗方法还可以在上述给药步骤之前包括确认需要预防和/或治疗与正常血管生成减少相关的疾病的患者的步骤。
其他例提供包含上述抗体或其抗原结合片段的用于诊断与新生血管形成和/或血管通透性增加和/或正常血管形成减少相关的疾病的组合物。
上述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体，上述载体为药物的配制中通常使用的，可以为选自由乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等组成的组中的一种以上，但不限定于此。并且，上述药物组合物还可以包含选自由药物组合物的制备中通常使用的稀释剂、赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、助悬剂、保存剂等组成的组中的一种以上。
上述药物组合物或上述抗体或其抗原结合片段的药学上有效量可以通过口服或胃肠外给药。在胃肠外给药的情况下，可以为静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、病灶给药、鼻内给药、肺内给药及直肠内给药等。口服给药时，由于蛋白质或肽会被消化，因此口服用组合物可以给活性药剂包衣或以保护不被分解的方式配制。并且，上述组合物可以通过能够使活性物质移动到目标细胞的任意的装置来给药。
上述药物组合物内的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的含量可以根据配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、代谢速度及反应敏感性等因素而多种多样的处方。例如，上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的1天给药量可以为0.001mg/kg至1000mg/kg的范围，具体地，可以为0.01mg/kg至100mg/kg的范围，更具体地，可以为0.1mg/kg至50mg/kg的范围，但不限定于此。上述1天给药量能够以单位剂量形态配制为一个制剂，或者适当地分量来配置，或者装入多剂量容器内来制备。上述“药学上有效量”可以表示能够表现出所希望的药理效果的有效成分含量或给药量，可以根据配制方法、给药方式、患者的年龄、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、代谢速度及反应敏感性等因素来多种多样地确定。
上述药物组合物可以剂型化为油或水性媒质中的溶液、悬混液、糖浆剂或乳化液形态，或者剂型化为提取剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂等形态，还可以包含用于剂型化的分散剂或稳定剂。
尤其，包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含抗体或抗原结合片段，因此可以剂型化为免疫脂质体。包含抗体的脂质体可以根据本发明所属技术领域中广为人知的方法制备。上述免疫脂质体作为包含磷脂酰胆碱、胆固醇及聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，可以通过逆向蒸发法制备。例如，抗体的Fab’片段可以通过二硫键取代反应来与脂质体连接。
另一方面，上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段与血管生成素-2特异性结合，因此可以利用其检测血管生成素-2，可以通过其确认血管生成素-2的过表达与否。因此，本发明的其他例提供包含上述抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段的血管生成素-2检测用组合物及与血管生成素-2过表达相关的疾病的诊断用组合物。
发明的效果
本发明提出通过在抑制血管生成素-2的同时激活内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体来促进下游信号传导的抗体，从而揭示可以抑制由血管生成素-2引起的新生血管形成并减少血管通透性的新的方法。并且，本发明中提出的抗体有望应用在除癌症以外的非正常血管形成相关疾病和/或因血管通透性增价而诱发的疾病的诊断及治疗中。上述抗体能够在与化学药品及其他抗癌治疗剂的联合治疗方法中使用，利用血管生成素-2特异性的识别作用，有望在抗体片段(antibody fragment)、双或多特异性抗体(bi-或multi-specificantibody)、蛋白质支架等中使用。
附图说明
图1为示出抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2一同在HUVEC细胞中进行AKT和ERK 42/44磷酸化的蛋白质印迹法(western blot)结果。
图2为示出抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2一同在HUVEC细胞中抗体浓度依赖性地诱导AKT磷酸化的酶联免疫吸附测定结果。图中从具有最高值的曲线开始依次列出克隆，最高的克隆为1D3，然后是2C8，然后是1A9，然后是1H10，具有最低值的克隆是作为对照组的67克隆。
图3通过酶联免疫吸附测定分析抗血管生成素-2抗体对于人类血管生成素-2以及小鼠血管生成素-2的结合亲和度。
图4为示出抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2及内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合来形成复合物(complex)的酶联免疫吸附测定结果。
图5为示出抗血管生成素-2抗体2C8不抑制血管生成素-2与内皮细胞TEK酪氨酸激酶的结合的酶联免疫吸附测定结果。
图6示出抗血管生成素-2抗体2C8在LLC肺癌细胞肿瘤模型中抑制肿瘤生长的情况(误差条：平均值的标准误(error bar：standard error of mean))。
图7示出抗血管生成素-2抗体2C8与顺铂(cisplatin)的联合给药在LLC肺癌细胞肿瘤模型中比分别单独给药的情况具有显著优秀的肿瘤生长抑制效果(误差条：平均值的标准误)。
图8示出抗血管生成素-2抗体2C8与5FU的联合给药在MC38大肠癌细胞肿瘤模型中比分别单独给药的情况具有显著优秀的肿瘤生长抑制效果(误差条：平均值的标准误)。
具体实施方式
以下，通过实施例更为具体地说明本发明，但这些实施例仅用于例示，而不是限制本发明的范围。本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，以下记载的实施例可以在不脱离本发明的本质性要旨的范围内进行变形。
实施例1：抗血管生成素-2抗体的制备及筛选
作为抗原，向Abclon(韩国)公司委托与人类血管生成素-2(序列1)特异性结合的抗体，本发明的抗体的制备参考Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.6，511(1976)。
简单来说，将人类血管生成素-2作为抗原与免疫佐剂(adjuvant)(西格玛公司(Sigma))混合并向小鼠注射2次后，通过酶联免疫吸附测定确定是否生成抗体。2次免疫后，从增加抗体的效价(1∶5000)来免疫的小鼠中摘取脾脏并分离B淋巴细胞后，与sp2/0细胞融合。在添加有次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterine)、脱氧胸苷(thymidine)的培养基(HAT培养基(medium))中培养融合的细胞来选择性地筛选B淋巴细胞与sp2/0细胞融合的细胞(杂交瘤(hybridoma))。利用连续稀释法(serial dilution method)使获得的杂交瘤细胞重复分离阳性细胞与阴性细胞的过程(克隆(cloning))来制备用于生产与抗原反应的抗体的单克隆细胞。
在包含10％(v/v)的胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM，Dulbeco’sModified Eagle’s Mediaum)中以37℃、5％CO2的条件下培养上述获得的抗体生产杂交瘤细胞后，通过离心分离提高生产抗体的细胞后，分离已分离抗体的培养液并利用亲和柱(蛋白A/G琼脂糖柱(Protein A/G agarose column)，Protein A/G(GenDEPOT公司))来纯化抗体。
实施例2：通过抗血管生成素-2抗体诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶信号(Tie2signaling)的激活的蛋白印迹法
血管生成素-2通过与血管内皮细胞中表达的内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合来起到弱激动剂或拮抗剂的作用。本发明中开发的抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2结合来与血管生成素-2-内皮细胞TEK酪氨酸激酶形成复合物，通过激活内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体来起到促进下游信号传导的作用，为了利用基于细胞的分析法分析抗血管生成素-2抗体给内皮细胞TEK酪氨酸激酶下游信号传导带来的影响，进行ERK和AKT磷酸化实验。为了比较内皮细胞TEK酪氨酸激酶下游信号传导的激活程度，对于与血管生成素-2(义翘神州公司(Sino Biological))和其他血管生成素-2对照抗体(韩国专利公开号第10-2015-0136031号)一同处理的组进行相同的试验。
具体地，利用EGM-2(龙沙公司(Lonza))培养基在37℃的温度下培养HUVEC(龙沙公司(Lonza))细胞(2×105个)后，当汇合(confluency)到80％～90％时，更换0.5％的胎牛血清基础培养基(FBS Basal media)(龙沙公司)并在37℃的温度下培养16小时至24小时。混合60nM的抗血管生成素-2抗体与40nM的血管生成素-2蛋白(义翘神州公司)并放置30分钟后，向上述培养的细胞处理后再培养10分钟。为了比较，分别准备处理40nM的血管生成素-2以及处理40nM的血管生成素-2+60nM的抗血管生成素-2对照抗体的组。利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤上述细胞后，处理裂解缓冲液(lysis buffer)(BIOSESANG公司(Ripa缓冲液(buffer))，0.15M的氯化钠(Sodium chloride)、1％的Triton X-100、1％的脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)、0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)、50mM的Tris-HCl、pH7.5，以及2mM的乙二胺四乙酸(EDTA))后，以13000rpm离心分离15分钟回收上清液来获得细胞裂解物。
向35μg的细胞裂解物中加入混合有还原剂(reducing agent)的样品缓冲液(sample buffer)(BIOSESANG公司)并在95℃的温度下沸腾5分钟后，在10％的Tris-Glycine gel中电泳，移动到硝酸纤维素膜(GVS)。为了确认与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体的下游信号相关的Akt、ERK42/44的磷酸化与否，使用混合有5％(v/v)的脱脂牛奶(skimmilk)(首尔牛奶)的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)封闭(blocking)上述印迹(blot)1小时后，处理抗磷酸化Akt抗体(Cell signaling公司)、抗AKT抗体(Cell signaling公司)、抗磷酸化ERK42/44抗体(Cell signaling公司)、抗ERK42/44抗体(圣克鲁兹公司(Santa cruz))。上述获得的结果如图1所示。
如图1所示，与阴性对照组相比，1A9、1D3、2C8、1H10克隆示出AKT及ERK激活信号。
实施例3：通过抗血管生成素-2抗体诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶下游信号(signaling)的激活的酶联免疫吸附测定
为了以定量的方式分析抗血管生成素-2抗体给内皮细胞TEK酪氨酸激酶下游信号传导带来的影响，通过酶联免疫吸附测定测定AKT磷酸化水平。
利用EGM-2(龙沙公司)培养基在37℃的温度下培养HUVEC(龙沙公司)细胞(2×105个)后，当汇合到80％～90％时，更换0.5％的胎牛血清基础培养基(龙沙公司)并在37℃的温度下培养16小时至24小时。混合60nM的抗血管生成素-2抗体与40nM的血管生成素-2蛋白(义翘神州公司)并放置30分钟后，向上述培养的细胞处理后再培养10分钟。为了比较，分别准备处理40nM的血管生成素-2以及处理40nM的血管生成素-2+60nM的抗血管生成素-2(h10D6-OPTI-67，US 10934350)的组。利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤上述细胞后，处理裂解缓冲液(BIOSESANG公司)后，以13000rpm离心分离15分钟回收上清液来获得细胞裂解物。
为了酶联免疫吸附测定，以1∶100的比例稀释PathScan Phospho-Akt1(Ser473)夹心酶联免疫吸附测定抗体对(Sandwich ELISA Antibody Pair)(Cell signaling公司)的捕获(capture)抗体并向96孔ps半区(96well ps half area)酶标板(Greiner bio-one公司)放入50μL来包被(coating)。然后，使用磷酸盐吐温缓冲液(包含0.05％(v/v)的吐温20(Tween-20)的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Saline))洗涤上述酶标板4次后，使用含有1％(v/v)的脱脂牛奶的磷酸盐吐温缓冲液在37℃的温度下封闭2小时。然后，使用包含0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤上述酶标板4次后放入细胞裂解物在37℃的温度下使磷酸化的AKT与捕获抗体结合2小时。使用磷酸盐吐温缓冲液洗涤酶标板4次后，使由1％的脱脂牛奶以1∶1000稀释的二抗在37℃的温度下结合1小时后，使用磷酸盐吐温缓冲液洗涤4次。最后，向上述酶标板加入50μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物(科门泰克公司(Kementec))诱导显色反应10分钟，然后，加入50μL的终止(Stop)溶液来终止反应，在酶标仪(plate reader)(伯腾公司(BioTek))上测定OD450值。上述获得的结果如图2所示。
如图2所示，可以确认与现有已知的对照抗体相比，本发明的单克隆抗体1A9、1D3、2C8、1H10诱导显著强的内皮细胞TEK酪氨酸激酶下游信号(signal)。
实施例4：小鼠抗血管生成素-2抗体的基因克隆
利用AccuPrep通用核糖核酸提取试剂盒(AccuPrep Universal RNA extractionkit)(百奥尼公司(Bioneer))从上述实施例1中获得的杂交瘤中分离核糖核酸(RNA)。然后，以此为模板根据现有公知的方法进行互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成及克隆(Meyer L等，Asimplified workflow for monoclonal antibody sequencing 2019，PLoS ONE)。互补脱氧核糖核酸合成使用SuperiorScript III互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(cDNA Synthesiskit)(恩智公司(Enzynomics))，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增合成的互补脱氧核糖核酸并利用TOPcloner Blunt core试剂盒(kit)(恩智公司)在载体中克隆，进行脱氧核糖核酸(DNA)碱基序列分析来获得编码各抗体的互补决定区(CDR)、重链可变区及轻链可变区碱基序列和氨基酸序列(表1至表8)。
表1
表1为小鼠抗血管生成素-2抗体1A9的CDR序列。
表2
表2为小鼠抗血管生成素-2抗体1A9的可变区序列。
表3
/>
表3为小鼠抗血管生成素-2抗体2C8的CDR序列。
表4
表4为小鼠抗血管生成素-2抗体2C8的可变区序列。
表5
表5为小鼠抗血管生成素-2抗体1D3的CDR序列。
表6
表6为小鼠抗血管生成素-2抗体1D3的可变区序列。
表7
表7为小鼠抗血管生成素-2抗体1H10的CDR序列。
表8
表8为小鼠抗血管生成素-2抗体1H10的可变区序列。
实施例5：抗血管生成素-2抗体与人类血管生成素-2或小鼠血管生成素-2结合的酶联免疫吸附测定
为了确认抗血管生成素-2抗体与人类血管生成素-2或小鼠血管生成素-2的结合能力，进行酶联免疫吸附测定。在96孔MaxiSorpTM平底(96-well MaxiSorpTMflat-bottom)酶标板包被1μg/mL的人类血管生成素-2(义翘神州公司)或小鼠血管生成素-2(Acrobiosystemsl)。然后，使用磷酸盐吐温缓冲液(包含0.05％(v/v)的吐温20的磷酸盐缓冲溶液)洗涤上述酶标板5次后，在常温下使用含有1％(v/v)的脱脂牛奶的磷酸盐吐温缓冲液封闭2小时。然后，使用包含0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液洗涤上述酶标板5次后，放入从300nM开始3倍连续稀释的10种浓度的抗血管生成素-2并在常温下结合2小时。利用含有0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液洗涤5次后，将在1％的脱脂牛奶中以1∶3000稀释的山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶(Goat anti-Mouse IgG/HRP)(索莱宝公司(Solarbio))结合1小时后，使用磷酸盐吐温缓冲液洗涤6次。最后，向上述酶标板加入100μL(微升(microliter))的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物(科门泰克公司)来诱导显色反应10分钟，然后，加入100μL的终止溶液(2M的硫酸(H2SO4))来终止反应，在酶标仪(伯腾公司)上测定OD450值。上述获得的结果如图3所示。
实施例6：用于确认抗血管生成素-2抗体的抗体-血管生成素-2-内皮细胞TEK酪氨酸激酶复合物的形成的酶联免疫吸附测定
为了确认是否形成抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2及内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体之间的复合物，进行酶联免疫吸附测定。在96孔MaxiSorpTM平底酶标板包被2μg/ml的内皮细胞TEK酪氨酸激酶ECD(义翘神州公司)。然后，使用磷酸盐吐温缓冲液(包含0.05％(v/v)的吐温20的磷酸盐缓冲溶液)洗涤上述酶标板5次后，使用含有1％(v/v)的脱脂牛奶的磷酸盐吐温缓冲液在常温下封闭2小时。然后，使用包含0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液洗涤上述培养板5次后，放入预先准备的抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2的复合物在常温下反应2小时来与内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合。抗血管生成素-2抗体与血管生成素-2的复合物按照如下方式制备：以600nM的浓度将抗血管生成素-2抗体放入1％的脱脂牛奶后，使用1％的脱脂牛奶3倍连续稀释来制备为10种浓度，将血管生成素-2与在1％的脱脂牛奶中稀释为1μg/mL的试样以1∶1混合来制备。使用含有0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液洗涤酶标板5次后，将在1％的脱脂牛奶中以1∶3000稀释的山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶(索莱宝公司)结合1小时后，使用磷酸盐吐温缓冲液洗涤6次。最后，向上述酶标板加入100μL(微升)的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物(科门泰克公司)来诱导显色反应10分钟，然后，加入100μL的终止溶液(2M的硫酸)来终止反应，在酶标仪(伯腾公司)上测定OD450值。上述获得的结果如图4所示。
实施例7：抗血管生成素-2抗体对于血管生成素-2-内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合的竞争(competition)酶联免疫吸附测定
利用抗血管生成素-2抗体进行血管生成素-2-内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合竞争酶联免疫吸附测定(binding competition ELISA)。更具体地，在96孔MaxiSorpTM平底酶标板包被4μg/ml的内皮细胞TEK酪氨酸激酶ECD(义翘神州公司)。然后，使用磷酸盐吐温缓冲液(包含0.05％(v/v)的吐温20的磷酸盐缓冲溶液)洗涤上述酶标板5次后，使用含有1％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐吐温缓冲液在常温下封闭2小时。然后，使用包含0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液洗涤5次后，放入标记有生物素(Biotin)的人类血管生成素-2与抗血管生成素-2抗体复合物或标记有生物素的人类血管生成素-2与没有标记的人类血管生成素-2的混合物在常温下与内皮细胞TEK酪氨酸激酶结合2小时。在此情况下，标记有生物素的人类血管生成素-2以如下方式制备：向10μl的标记有生物素的人类血管生成素-2(＞1mg/ml)混合1μl的改良试剂(Modifier reagent)后，去掉装有生物素偶联混合物(Biotin conjugation mix)的小瓶(vial)的盖子(cap)并放入血管生成素-2-改良溶液(modifier solution)后，在常温下避光反应15分钟后，放入1μl的猝灭剂(Quencherreagent)并反应5分钟来制备。抗血管生成素-2抗体与标记有生物素的血管生成素-2的复合物以如下方式制备：以1.2μM的浓度将抗血管生成素-2抗体放入1％的牛血清白蛋白中后，使用1％的牛血清白蛋白5倍稀释来制备为10种浓度后，与将标记有生物素的人类血管生成素-2在1％的牛血清白蛋白中稀释为1μg/mL的试样以1∶1混合来制备；标记有生物素的人类血管生成素-2与没有标记的人类血管生成素-2的混合物以如下方式制备：以1.2μM的浓度将血管生成素-2放入1％的牛血清白蛋白中后，使用1％的牛血清白蛋白5倍连续稀释来制备为10种浓度后，与将标记有生物素的人类血管生成素-2在1％的牛血清白蛋白中稀释为1μg/mL的试样以1∶1混合来制备。使用含有0.05％的吐温20的磷酸盐吐温缓冲液洗涤酶标板5次后，与在1％牛血清白蛋白中以1∶10000稀释的链霉亲和素辣根过氧化物酶(streptavidin HRP)(Abcam公司)结合1小时后，使用磷酸盐吐温缓冲液洗涤6次。最后，向上述酶标板加入100μL(微升)的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物(科门泰克公司)来诱导显色反应10分钟，然后，加入50μL的终止溶液(2M的硫酸)来终止反应，在酶标仪(伯腾公司)上测定OD450值。上述获得的结果如图5所示。
实施例8：抗血管生成素-2抗体在小鼠肿瘤模型中的肿瘤生长抑制效果
为了确认抗血管生成素-2抗体的肿瘤生长抑制效果，使用小鼠肿瘤模型。利用如下式计算肿瘤的大小(V)：
V＝肿瘤体积(mm3)＝(长×宽2)/2(V＝Tumor volume(mm3)＝(length×width2)/2)。
A.LLC肺癌细胞肿瘤模型
为了确认抗血管生成素-2的肿瘤生长抑制效果，使用了利用作为小鼠肺癌细胞株的Lewis肺癌(LLC，Lewis lung carcinoma，ATCC公司)细胞株的肺癌同源(syngeneic)小鼠模型。在添加有10％的胎牛血清(Gibco公司)的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)(威健公司(Welgene))中培养LLC细胞株。将LLC细胞(100μL的包含1×106个细胞的磷酸盐缓冲溶液+100μL的基质(in 100μL of PBS+100μL matrigel))接种到相同基因型的C57BL/6小鼠(中央实验动物)的皮下后，从癌细胞接种日起，分别在第7天、第9天、第1天、第14天、第16天向腹腔内注射5mg/kg剂量的抗血管生成素-2抗体(2C8)并测量肿瘤的大小。
如图6所示，确认到抗血管生成素-2抗体2C8抑制肿瘤生长。
为了确认抗血管生成素-2抗体与现有其他抗癌剂的联合给药效果，在LLC肺癌模型中进行血管生成素-2抗体2C8与顺铂的联合给药试验。在添加有10％的胎牛血清(Gibco公司)的杜氏改良伊戈尔培养基(威健公司)中培养LLC细胞株。将LLC细胞(100μL的包含1×106个细胞的磷酸盐缓冲溶液+100μL的基质)接种到相同基因型的C57BL/6小鼠(Orient公司)的皮下后，当肿瘤的大小到达50mm3-100mm3时，每周向腹腔内给药5mg/kg剂量的血管生成素-2抗体3次共2周。以5mg/kg剂量给药顺铂(西格玛公司)1次。实验在Ig(对照组(control group))、2C8组(group)、顺铂组(cisplatin group)及2C8+顺铂组中进行。
如图7所示，在抗血管生成素-2抗体2C8与顺铂联合给药的情况下，与对照组(control)相比，肿瘤生长被抑制约48％，与单独使用抗血管生成素-2抗体或5FU相比，示出非常显著的功效。上述结果示出，与单独使用现有的抗癌剂治疗相比，通过抗血管生成素-2抗体与其他抗癌剂联合给药可以更为显著强力地抑制癌症生长。
B.MC38大肠癌细胞生长模型
为了在大肠癌模型中确认抗血管生成素-2抗体抑制肿瘤生长的效果以及与5-氟尿嘧啶(5FU，5-fluorouracil)的联合给药效果，使用了利用作为小鼠大肠癌细胞株的MC38细胞株的大肠癌同源小鼠模型。在添加有10％的胎牛血清(威健公司)的杜氏改良伊戈尔培养基(威健公司)中培养MC38细胞株。将MC38细胞株(100μL的包含1×106个细胞的磷酸盐缓冲溶液)接种到相同基因型的C57BL/6小鼠(Orient公司)的皮下后，当肿瘤的大小到达70mm3-100mm3时，每间隔3天向腹腔内给药5次。给药2次20mg/kg剂量的5FU。实验在Ig(对照组)、2C8组、5FU(西格玛公司)组及2C8+5FU组中进行。
如图8所示。抗血管生成素-2抗体2C8与5FU单独示出相似水平的肿瘤生长抑制效果，在联合给药抗血管生成素-2抗体2C8与5FU的情况下，与对照组相比，肿瘤生长被抑制约58％，与单独使用抗血管生成素-2抗体或5FU相比，示出非常显著的功效。上述结果示出，与单独使用现有的抗癌剂治疗相比，通过抗血管生成素-2抗体与其他抗癌剂联合给药可以更为显著强力地抑制癌症生长。
Claims (16)
1.一种抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，与血管生成素2特异性结合并诱导内皮细胞TEK酪氨酸激酶激活，其特征在于，
包含：
(a)重链互补决定区；以及
(b)轻链互补决定区，
上述(a)重链互补决定区包含：
序列2、序列10、序列18或序列26的氨基酸序列的CDRH1；
序列3、序列11、序列19或序列27的氨基酸序列的CDRH2；以及
序列4、序列12、序列20或序列28的氨基酸序列的CDRH3，
上述(b)轻链互补决定区包含：
序列5、序列13、序列21或序列29的氨基酸序列的CDRL1；
序列6、序列14、序列22或序列30的氨基酸序列的CDRL2；以及
序列7、序列15、序列23或序列31的氨基酸序列的CDRL3。
2.根据权利要求1所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列2的氨基酸序列的CDRH1、序列3的氨基酸序列的CDRH2以及序列4的CDRH3；以及
(b)轻链互补决定区，包含序列5的氨基酸序列的CDRL1、序列6的氨基酸序列的CDRL2以及序列7的氨基酸序列的CDRL3。
3.根据权利要求1所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列10的氨基酸序列的CDRH1、序列11的氨基酸序列的CDRH2以及序列12的CDRH3；以及
(b)轻链互补决定区，包含序列13的氨基酸序列的CDRL1、序列14的氨基酸序列的CDRL2以及序列15的氨基酸序列的CDRL3。
4.根据权利要求1所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列18的氨基酸序列的CDRH1、序列19的氨基酸序列的CDRH2以及序列20的CDRH3；以及
(b)轻链互补决定区，包含序列21的氨基酸序列的CDRL1、序列22的氨基酸序列的CDRL2以及序列23的氨基酸序列的CDRL3。
5.根据权利要求1所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区，包含序列26的氨基酸序列的CDRH1、序列27的氨基酸序列的CDRH2以及序列28的CDRH3；以及
(b)序列29的氨基酸序列的CDRL1、序列30的氨基酸序列的CDRL2以及序列31的氨基酸序列的CDRL3。
6.根据权利要求1所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，包含选自由序列8、序列16、序列24及序列32组成的组中的氨基酸序列；以及
轻链可变区，包含选自由序列9、序列17、序列25及序列33组成的组中的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其片段与血管生成素-2特异性结合并与血管生成素-2一同与内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体结合。
8.一种分离的核酸，其特征在于，编码权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab’及F(ab’)2组成的组中。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗体或其抗原结合片段为鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
11.一种药物组合物，用于预防或治疗与血管生成素-2过表达、新生血管形成或血管通透性增加相关的疾病，其特征在于，包含权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，上述与血管生成素-2过表达、新生血管形成或血管通透性增加相关的疾病为癌症、癌转移、炎症疾病、感染、心血管疾病、肾脏疾病、遗传性出血性毛细血管扩张症、哮喘或水肿。
13.一种药物组合物，用于预防或治疗与正常血管生成减少相关的疾病，其特征在于，包含权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，上述与正常血管生成减少相关的疾病为心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑卒中、伯格氏病、缺血性坏死、足部溃疡或勃起功能障碍。
15.一种药物组合物，其特征在于，
包含权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段作为有效成分，
上述药物组合物用于预防或治疗如下疾病：
阿尔茨海默病；
包括类风湿关节炎、多发性硬化症或银屑病在内的炎症性自身免疫疾病；
包括老年性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病变或青光眼在内的眼科疾病；或者
包括新型冠状病毒感染在内的冠状病毒感染疾病。
16.一种用于癌症治疗的联合治疗用组合物，其特征在于，上述癌症治疗包括将权利要求1至7中任一项所述的抗血管生成素-2抗体或其抗原结合片段与放射线照射、化疗剂、细胞毒剂和/或免疫毒剂同时、单独或依次给药。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2021-0052895 | 2021-04-23 | ||
| KR1020220028751A KR102459211B1 (ko) | 2021-04-23 | 2022-03-07 | 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편 |
| KR10-2022-0028751 | 2022-03-07 | ||
| PCT/KR2022/003351 WO2022225182A1 (ko) | 2021-04-23 | 2022-03-10 | 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117279940A true CN117279940A (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=89218286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280029146.1A Pending CN117279940A (zh) | 2021-04-23 | 2022-03-10 | 与血管生成素-2特异性结合的抗体或其片段 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117279940A (zh) |
-
2022
- 2022-03-10 CN CN202280029146.1A patent/CN117279940A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6694850B2 (ja) | ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体 | |
| US9808507B2 (en) | Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody | |
| CA2851135C (en) | Anti c-met antibody and uses thereof | |
| EP2829552B1 (en) | Bispecific chimeric proteins with DARPin-molecules | |
| US10934350B2 (en) | Humanized or affinity-matured anti ang-2 antibody and uses thereof | |
| KR102196450B1 (ko) | Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제 | |
| JP6689847B2 (ja) | がんの治療における使用のための抗−ｃｋ８抗体 | |
| US20210269533A1 (en) | Anti-c-met antibody and uses thereof | |
| US9457081B2 (en) | Combination therapy using c-Met inhibitor and beta-catenin inhibitor | |
| US9717715B2 (en) | Method of combination therapy using an anti-C-Met antibody | |
| US9499622B2 (en) | Anti-EGFR/anti-HER2 bispecific antibodies with anti-EGFR DARPins | |
| KR102312922B1 (ko) | Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체 | |
| KR102459211B1 (ko) | 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편 | |
| EP4328242A1 (en) | Antibody specifically binding to angiopoietin-2, or fragment thereof | |
| CN117279940A (zh) | 与血管生成素-2特异性结合的抗体或其片段 | |
| KR102106160B1 (ko) | 항 Ang2 항체 | |
| KR20240040172A (ko) | 안지오포이에틴-2의 에피토프 및 이에 결합하는 항체 | |
| KR20150028087A (ko) | 항 Ang2 항체를 포함하는 혈관누수 차단제 | |
| KR20230097598A (ko) | 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편 | |
| KR20230097590A (ko) | 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편 | |
| KR102195957B1 (ko) | Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체 | |
| WO2022075482A1 (ja) | がん治療用医薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |