JP2024517329A - インターロイキン－２２の治療的誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の新規誘導体、特に、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪一酸を含む誘導体、及び療法におけるそれらの使用に関する。

Description

本発明は、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の新規誘導体、特に、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含む誘導体に関し、脂肪酸は一酸である。本発明はまた、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、中枢神経系（ＣＮＳ）及び皮膚の疾患、障害及び状態の治療、予防及び改善を含む、それらの産生及び療法におけるそれらの使用のための方法を包含する。

ＩＬ－２２は、１７ＫＤａの分子量を有する１４６アミノ酸タンパク質である。それは、サイトカインのＩＬ－１０ファミリーに属し、遍在的に発現するＩＬ－１０受容体Ｂサブユニット（ＩＬ－１０ＲＡ２）、及び上皮限定発現を有するＩＬ－２２受容体Ａサブユニット（ＩＬ－２２ＲＡ１）からなるヘテロ二量体受容体を選択的に活性化する。それは、免疫細胞から放出されるが、上皮細胞を選択的に標的とするという点で独特のサイトカインである。したがって、ＩＬ－２２によって誘導されるシグナル伝達経路は、異なる組織（標的は、皮膚、腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓及び胸腺を含む）において関連性を有し得るが、ＩＬ－２２は、それらを上皮特異的な方法で活性化する。可溶性結合タンパク質であるＩＬ－２２ＢＰは、ＩＬ－２２を中和し、したがってその効果を調節する。

ＩＬ－２２は、化学的または機械的損傷、例えば、環境毒素またはトリプトファン中間体に応答するアリール炭化水素受容体の活性化、及び死にかけている細胞または侵入する病原体からのタンパク質、断片及びデブリに応答する、ｔｏｌｌ様受容体４などのパターン認識受容体の活性化を反映するシグナルに応答して放出される。ＩＬ－２２の放出は、ある特定のサイトカイン、特にＩＬ－２３及び程度は低いがＩＬ１βによって更に刺激される。したがって、ＩＬ－２２は、病原体感染及び免疫活性化を反映する合図に対する応答としても分泌される。

ＩＬ－２２の効果は、いくつかの活動／経路の調整された関与の結果である。ＩＬ－２２は、損傷時に上皮バリア組織及び臓器に作用して細胞を保護し、バリア機能を維持する（例えば、抗アポトーシス遺伝子プログラムの活性化を通じて）。これはまた、修復を加速し（例えば、成熟細胞の増殖及び幹細胞の活性化を誘導することによって）、線維症を予防し（例えば、上皮－間葉転移を低減し、ＮＬＲＰ３インフラマソームに拮抗し、肝星状細胞の老化を誘導することによって）、炎症を制御する（例えば、抗微生物ペプチド及び走化性シグナルを誘導することによって）。ＩＬ－２２は、高血糖症、高脂血症及び高インスリン血症などの糖尿病のまたは過体重の哺乳動物でしばしば観察される医学的状態を含む、様々な医学的状態を治療することができると報告されている。

しかしながら、ＩＬ－２２は、一般的に腎臓によって体から迅速に除去されるため、臨床診療におけるその使用が制限される。これはサイトカインの共通の特徴であり、半減期延長サイトカイン薬物開発候補は、例えば、腫瘍学及び免疫療法の治療のための薬物開発段階に達している。一般的に、これらの半減期延長サイトカインは、Ｆｃ融合溶液またはＰＥＧ化を使用する。したがって、循環ＩＬ－２２の半減期を延長するための既知の方法は、腎クリアランスを回避するために、７０ｋＤａを超えるようにＩＬ－２２のサイズを人工的に増加させることを試みる。ＩＬ－２２をＦｃ抗体断片にライゲートすることが、現在この効果に対する最良の解決策である。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＧｅｎｅｒｏｎ Ｓｈａｎｇｈａｉはいずれも、臨床開発において長時間作用型ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物を有する。ＩＬ－２２をポリエチレングリコールで修飾すること（ＰＥＧ化）は、腎クリアランスを回避するための別の既知の手段である。

しかしながら、これらの既存の解決策には欠点がないわけではない。入手可能なデータは、ＰＥＧ自体が免疫原性であり、ＰＥＧ含有空胞がＰＥＧ化生物製剤を有する細胞において観察されることを示唆する。活性の減少及び不均一性もまた、ＰＥＧ化の不利な態様である。Ｆｃ融合技術は非常によく知られているが、Ｆｃ抗体断片を添加することは、ＩＬ－２２の構造における大きな変化をもたらし、その特性に半減期延長を超えた影響を与える。Ｆｃ融合物のタンパク質のサイズを約１７ｋＤａから約８５ｋＤａに増加させるにつれて、拡散速度、分布及び受容体関与動態などの特性が影響を受ける可能性がある。例えば、ある種のＦｃ融合物は、ある特定の経路を介して投与するには、ゆっくりと吸収される、及び／または大きすぎる。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＧｅｎｅｒｏｎのどちらも、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物の用量制限有害作用として、中等度及び可逆的な皮膚反応を報告する。更に、効力は、大きな融合パートナーによって引き起こされる立体障害によって影響を受ける可能性がある。

更に、天然のＩＬ－２２は、数時間の非常に短い半減期を有し、その臨床的有用性を強く制限するであろうが、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物は、ヒトにおいて１週間以上の半減期を有することが報告されている。いくつかの条件では、天然ＩＬ－２２と比較して半減期が延長されたが、Ｆｃ融合物よりも半減期が短い強力な分子を有することは、例えば、最適な滴定、局所適用及び作用のために有益であろう。現在、この問題の解決策は説明されていない。

したがって、循環半減期及び局所組織区画及び生体液中の半減期を増強し、天然分子と比較して最適化された薬物動態及び薬力学的特性を実証する、ＩＬ－２２の新しい生体適合性修飾因子の必要性が当該技術分野に残存する。理想的には、それらは、天然分子の効力及び他の特性を維持し、また、既知の誘導体によって実証される毒性、免疫原性及び任意の他の有害反応を避けるべきである。

第１の態様では、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含むＩＬ－２２の誘導体であって、脂肪酸が、一酸である、誘導体が提供される。

本発明の実施形態では、脂肪一酸は、リンカーによってＩＬ－２２タンパク質に共有結合している。

脂肪一酸は、下式Ｉのもの：
Ｈ_３Ｃ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－＊
（式中、ｘは、１０～１８、任意選択で１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、ＩＬ－２２タンパク質またはリンカーへの結合点を示す）であり得る。それは、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸であり得る。有利には、脂肪酸は、Ｃ１６またはＣ１８一酸であり、最も有利には、Ｃ１６一酸である。

ＩＬ－２２タンパク質は、天然成熟ヒトＩＬ－２２（以下、「ｈＩＬ－２２」）またはそのバリアントであり得る。バリアントは、ｈＩＬ－２２の置換形態であり得、任意選択で、１位、２１位、３５位、６４位、１１３位及び／または１１４位で置換されている。それは、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択されるｈＩＬ－２２の置換を含み得る。有利には、バリアントは、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含む。それは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位にＣｙｓ残基を含み得る。それは、ｈＩＬ－２２内に変異を含み得、ｈＩＬ－２２と少なくとも１０％の配列同一性を有し得る。それは、ｈＩＬ－２２内に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の変異を含み得、該変異は、独立して、欠失、置換及び挿入からなる群から選択される。

バリアントは、ｈＩＬ－２２の伸長形態であってもよい。それは、Ｎ末端三量体などのＮ末端ペプチドを含み得る。有利には、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含む。それは、最大５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のアミノ酸のＮ末端ペプチドを含み得る。

リンカーは、任意選択でグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／またはリジン（Ｌｙｓ）を含む１つ以上のアミノ酸を含み得る。リンカーは、オキシエチレングリシン単位または複数の連結したオキシエチレングリシン単位、任意選択で２～５つのそのような単位、有利には２つの単位を含み得る。リンカーは、１つ以上のオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）残基を含み得る。それは、エチレンジアミン（Ｃ_２ＤＡ）基及び／またはアセトアミド（Ａｃ）基を含み得る。有利には、リンカーは、前述の要素の全てを組み合わせて含む。特に、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－Ａｃ、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃまたはγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり得る。

リンカーは、追加的または代替的に、ｈＩＬ－２２またはそのバリアント中のＣｙｓ残基に結合したＣｙｓ反応性リンカーであり得る。それは、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントの－７位、－５位、１位、６位、３３位、１１３位、１１４位または１５３位で結合し得る（ここで、－７位、－５位などは、本明細書で定義されるとおりである）。一例として、リンカーは、ｈＩＬ－２２の１位、６位、３３位、１１３位または１１４位で置換されたＣｙｓ残基に結合し得る。それは、ｈＩＬ－２２に対して－５位、－７位または１５３位でＣｙｓ残基に結合し得る。有利には、リンカーは、ｈＩＬ－２２の１位で置換されたＣｙｓ残基に結合している。一実施形態では、リンカーは、ｈＩＬ－２２の９５位もしくは１０６位で置換されたＣｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、バリアントは、任意選択で、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。本発明の例示的な誘導体は、本明細書において誘導体１として同定される。本発明の別の例示的な誘導体は、本明細書において誘導体２として同定される。

第２の態様では、脂肪一酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合させることを含む、第１の態様の誘導体を調製するためのプロセスが提供される。

第３の態様では、第１の態様の誘導体と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、吸入、注射、局所、経口または眼内投与に好適であり、任意選択で、注射は、腹腔内、皮下または静脈内である。

第４の態様では、療法に使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物が提供される。

第５の態様では、療法の方法であって、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量の誘導体を投与することを含む、方法において使用するための、第１の態様の誘導体または第２の態様の医薬組成物が提供される。

第６の態様では、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、ＣＮＳまたは皮膚の疾患、障害または状態を治療する方法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物が提供される。

代謝の疾患、障害または状態は、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高血糖症または高インスリン血症であり得る。

肝臓の疾患、障害または状態は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、慢性肝不全の急性憎悪（ＡＣＬＦ）、急性肝損傷、アセトアミノフェン誘導肝毒性、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変、または手術もしくは移植によって引き起こされた病的状態であり得る。

肺の疾患、障害または状態は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、化学損傷、ウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症であり得る。

腸の疾患、障害または状態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、化学損傷、ウイルス感染症または細菌感染症であり得る。

腎臓の疾患、障害または状態は、急性腎疾患または慢性腎疾患であり得る。

ＣＮＳの疾患、障害または状態は、多発性硬化症であり得る。

皮膚の疾患、障害または状態は、創傷、炎症疾患またはＧｖＨＤであり得る。

それぞれ、誘導体１（図１Ａ）及び誘導体２（図１Ｂ）として本明細書で同定される本発明の２つの誘導体の構造を図示する。 本明細書において、比較物１として同定される本発明の誘導体の比較物の構造を図示する。 本明細書で比較物２として同定される本発明の誘導体の比較物の構造を図示する。 それぞれがＣｙｓ反応性単位を含むリンカーに接続された、（Ａ）Ｃ１８二酸、（Ｂ）Ｃ１６二酸及び（Ｃ）Ｃ１４二酸の例を図示する。脂肪酸及びリンカーのこれらの組み合わせは、本明細書で比較物４～１３として同定される本発明の誘導体の比較物に用いられる。 比較物４として本明細書で同定されるＩＬ－２２タンパク質の構造を図示する。 本明細書で比較物９としてのＩＬ－２２タンパク質の構造を図示する。 比較物１３として本明細書で同定されるＩＬ－２２タンパク質の構造を図示する。 糖尿病マウスモデルの８日間の研究における、血中グルコースに対するｈＩＬ－２２及び骨格変異のみを有する比較ＩＬ－２２バリアント（本明細書では比較物１６として同定される）の毎日投与の効果（平均±ＳＥＭ）を図示する。 糖尿病マウスモデルの１６日間の研究における、（Ａ）血中グルコース及び（Ｂ）食物摂取量に対する、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物（具体的には、ｈＩＬ－２２にＮ末端融合したヒトＦｃ；以下「ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２」）と比較した、本発明の誘導体の比較物（本明細書では、比較物４として同定される）の毎日投与の効果（平均±ＳＥＭ；＊対応のないｔ検定を使用したｐ＜０．０５を意味する）を図示する。 糖尿病マウスモデルの１６日間の研究における、３つの異なる標的関与バイオマーカーに対する比較物４及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の毎日投与の効果（平均±ＳＥＭ；＊＊＊は、対応のないｔ検定を使用したｐ＜０．０００２を意味する）を図示する。 糖尿病マウスモデルの１６日間の研究における、３つの異なる標的関与バイオマーカーに対する比較物４及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の毎日投与の効果（平均±ＳＥＭ；＊＊＊は、対応のないｔ検定を使用したｐ＜０．０００３を意味する）を図示する。 糖尿病マウスモデルの１６日間の研究における、３つの異なる標的関与バイオマーカーに対する比較物４及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の毎日投与の効果（平均±ＳＥＭ；＊＊＊は、対応のないｔ検定を使用したｐ＜０．００２６を意味する）を図示する。 糖尿病マウスモデルの１３日間の研究における、血中グルコースに対する、比較物４及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比較した、本発明の誘導体（本明細書で比較物９として同定される）（３つの異なる用量）の比較物の毎日投与についての用量応答曲線（平均±ＳＥＭ）を図示する。 ２つの異なる肝臓酵素の血漿レベルによって証明されるように、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘導肝損傷マウスモデルの肝損傷の予防における比較物４及び９の効果を図示する。ダネット検定一要素線形モデルを使用して、ビヒクル＋ＡＰＡＰと比較して、＊はｐ＜０．０５、及び＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 ２つの異なる肝臓酵素の血漿レベルによって証明されるように、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘導肝損傷マウスモデルの肝損傷の予防における比較物４及び９の効果を図示する。ダネット検定一要素線形モデルを使用して、ビヒクル＋ＡＰＡＰと比較して、＊はｐ＜０．０５、及び＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 ＡＰＡＰ誘導肝損傷マウスモデルのアポトーシスの予防における比較物４及び９の効果を図示する。ＮＳは有意でないことを意味する。 ＡＰＡＰ誘導肝損傷マウスモデルの細胞増殖に対する比較物４及び９の効果を図示する。ＮＳは有意でないことを意味する。 プレドニゾロンと比較した、ブレオマイシン誘導肺損傷ラットモデルの、肺炎症の予防及び／または低減における比較物９の効果を図示する。 プレドニゾロンと比較した、ブレオマイシン誘導肺損傷ラットモデルの、肺線維症の予防及び／または低減における比較物９の効果を図示する。 プレドニゾロンと比較した、ブレオマイシン誘導肺損傷ラットモデルの、肺線維症の予防及び／または低減における比較物９の効果を図示する。 デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎マウスモデルにおける結腸炎症の予防における比較物９の効果を図示する。＊＊＊＊は、ビヒクル（ＤＳＳを含む）と比較したｐ＜０．０００１を意味する。 ＤＳＳ誘導大腸炎マウスモデルの粘膜上皮創傷の予防における、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比較した比較物９の効果を図示する。倍率４倍、スケールバー＝５００μｍ。 標的関与の尺度としての、ＤＳＳ誘導大腸炎マウスモデルにおける血漿再生島由来タンパク質３ガンマ（Ｒｅｇ３ｇ）レベルを図示する（Ｒｅｇ３ｇは、ＩＬ－２２の標的関与マーカーである）。 ２つの異なる肝臓酵素の血清レベルによって証明されるように、コンカナバリン（ＣｏｎＡ）誘導肝損傷マウスモデルの肝損傷の予防における比較物４の効果を図示する。 ２つの異なる肝臓酵素の血清レベルによって証明されるように、コンカナバリン（ＣｏｎＡ）誘導肝損傷マウスモデルの肝損傷の予防における比較物４の効果を図示する。

以下では、ギリシャ文字は書かれた名前ではなくシンボルで表される。例えば、α＝アルファ、ε＝エプシロン、γ＝ガンマ及びμ＝ミューである。アミノ酸残基は、それらのフルネーム、３文字のコードまたは１文字コードによって同定されてもよく、これらは全て完全に等価である。

「ＩＬ－２２の誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、共有結合した脂肪酸を有するＩＬ－２２タンパク質を指し、脂肪酸は一酸である。この用語は、脂肪一酸がＩＬ－２２タンパク質に直接共有結合している誘導体、及び共有結合がリンカーによる誘導体の両方を包含する。

脂肪酸の共有結合は、ペプチド及びタンパク質の半減期延長のための実証済みの技術であり、ペプチドまたはタンパク質から脂肪酸を区切る方法である。それは、インスリンＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）（デテミル）及びＴｒｅｓｉｂａ（登録商標）（デグルデク）、ならびにグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）誘導体Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）（リラグルチド）及びＯｚｅｍｐｉｃ（登録商標）（セマグルチド）などの１型及び２型糖尿病の市販製品で知られている。

脂肪酸結合は、アルブミンへの結合を可能にし、それにより腎排泄を防止し、タンパク質分解に対するある程度の立体保護を提供する。有利には、Ｆｃ融合またはＰＥＧ化と比較して、ＩＬ－２２に対する最小限の修飾を提供する。この点に関して、Ｆｃ融合及びＰＥＧ化は、ＩＬ－２２のサイズを腎クリアランスの閾値を超えて増加させることを目的とするが、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪一酸を含む誘導体は、ＩＬ－２２タンパク質のサイズと同様の小さいサイズを保持する。したがって、脂肪一酸結合は最小限の修飾であるため、得られる誘導体は、分布、拡散速度及び受容体関与（結合、活性化及び輸送）を含む天然様特性を維持し、免疫原性リスクを最小限に抑えると考えられる。

上記のように、脂肪酸結合は、糖尿病のためのインスリン及びＧＬＰ－１誘導体における治療有効性を証明している。しかしながら、ＩＬ－２２は、そのサイズ、配列及び生物学的特性の観点から非常に異なるタンパク質である。したがって、脂肪一酸が治療効果を維持しながらＩＬ－２２に共有結合し得ることは、本発明者には直感に反することであった。ＩＬ－２２に対するそのような最小限の修飾が、循環半減期の延長、または生体液（例えば、血漿または腸液）または組織調製物中での半減期の延長と組み合わせた高い効力（ｈＩＬ－２２と同一またはそれに近い）をもたらし得ることは特に驚くべきことであった。

したがって、第１の態様では、本発明は、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含むＩＬ－２２の誘導体であって、脂肪酸が、一酸である、誘導体に関する。脂肪一酸は、ＩＬ－２２タンパク質に直接またはリンカーを介して共有結合し得、リンカー自体は、様々なサブユニットを考案することができる。「ＩＬ－２２タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ｈＩＬ－２２などの天然ＩＬ－２２タンパク質またはそのバリアントを意味し得る。「バリアント」は、本明細書に更に定義されるように、天然タンパク質の配列と同様のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

天然では、ヒトＩＬ－２２タンパク質は、分泌のために３３個のアミノ酸のシグナルペプチドで合成される。成熟ヒトＩＬ－２２タンパク質（すなわち、ｈＩＬ－２２）は、長さが１４６個のアミノ酸であり、マウスＩＬ－２２（後者は長さが１４７個のアミノ酸である）と８０．８％の配列同一性を有する。ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号１として同定される。他のＩＬ－１０ファミリーメンバーと同様に、ＩＬ－２２構造は、６つのα－らせん（らせんＡ～Ｆと称される）を含有する。

したがって、本発明の誘導体は、ｈＩＬ－２２の天然アミノ酸配列を有し得る。あるいは、それらは、天然配列内の１つ以上のアミノ酸配列変異を有し得る。それらは、追加的または代替的に、天然配列に対する（すなわち、外部の）１つ以上のアミノ酸配列変異を含み得る。したがって、実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントに共有結合した脂肪一酸を含む。

「内で」、「に対して」、「に対応する」及び「等価である」などの表現は、天然タンパク質、例えば、ｈＩＬ－２２の配列を参照して、ＩＬ－２２タンパク質中の脂肪一酸の変化及び／または共有結合の部位を特徴付けるために本明細書で使用される。配列番号１において、ｈＩＬ－２２の第１のアミノ酸残基（アラニン（Ａｌａ））は、１位に割り当てられる。

したがって、ｈＩＬ－２２の配列内の変異は、配列番号１の残基番号１～１４６のうちのいずれかに対する変異である。例えば、ｈＩＬ－２２の残基１０における天然ＡｓｐのＧｌｕ置換は、本明細書において「Ｄ１０Ｅ」として表される。誘導体も、１０位で共有結合した脂肪一酸を有する場合、それは、本明細書では、残基「１０Ｅ」での結合と称される。

しかしながら、ｈＩＬ－２２の配列に対する変異は、配列番号１の残基番号１～１４６の外部の変異である。例えば、本明細書に定義される誘導体１は、長さが３個のアミノ酸のＮ末端ペプチドを含む。Ｎ末端ペプチドの残基は、ｈＩＬ－２２の残基１に結合した残基から開始して、負の番号を付けられる。すなわち、ｈＩＬ－２２の残基１に結合しているＮ末端ペプチドの第１の残基は、「－１」と示される。誘導体１は、ｈＩＬ－２２の第１の残基、すなわち、誘導体１の配列表における４位に共有結合した脂肪一酸を有し、これはＣｙｓであり、したがって、本明細書では「４Ｃ」と称される。しかしながら、例として、脂肪一酸が、－１位から始まるＮ末端ペプチドの第３残基、すなわちＧｌｕに共有結合していた場合、誘導体１の共有結合部位は、本明細書では「－３Ｇ」と称されていたであろう。しかしながら、当然、誘導体１の配列表で使用される番号付けは、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５に従って、１から始まる。したがって、誘導体１の配列表における１位は、本明細書で言及されるように、実際には残基－３である。

２つ、３つ、４つ、５つ以上の変異が、本発明の誘導体を形成するために天然配列内で行われ得る。例えば、この点に関して、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００を超える、または更に１２５を超える変異が行われ得る。天然配列中の残基１～１４６のうちのいずれかが変化し得る。変異のための例示的な残基は、ｈＩＬ－２２中の残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７８、７９、８２、８３、８４、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１３８、１３９、１４１、１４３、１４４、１４５及び／または１４６である。残基１、２１、３５、６４、１１３及び／または１１４における変異が特に有利である。残基９５及び／または１０６での変異もまた有利である。

天然配列内の変異は、典型的にはアミノ酸置換である。「置換」という用語は、本明細書で使用される場合、天然タンパク質中のアミノ酸を別のアミノ酸と置き換えることを意味し得る。それらは、保存的または非保存的置換であり得る。例示的な置換は、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｐ２Ｃ、Ｐ２Ｈ、Ｉ３Ｃ、Ｉ３Ｈ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｈ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｈ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｃ、Ｈ６Ｒ、Ｃ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｒ８Ｋ、Ｌ９Ｓ、Ｄ１０Ｅ、Ｄ１０Ｓ、Ｋ１１Ｃ、Ｋ１１Ｇ、Ｋ１１Ｖ、Ｓ１２Ｃ、Ｎ１３Ｃ、Ｎ１３Ｇ、Ｆ１４Ｓ、Ｑ１５Ｃ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１６Ｖ、Ｐ１７Ｌ、Ｙ１８Ｆ、Ｉ１９Ｑ、Ｔ２０Ｖ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｒ２２Ｓ、Ｆ２４Ｈ、Ｍ２５Ｅ、Ｍ２５Ｌ、Ｌ２６Ｓ、Ａ２７Ｌ、Ｅ２９Ｐ、Ａ３０Ｑ、Ｌ３２Ｃ、Ｌ３２Ｒ、Ａ３３Ｃ、Ａ３３Ｎ、Ｄ３４Ｆ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ３６Ｑ、Ｔ３７Ｃ、Ｔ３７Ｉ、Ｄ３８Ｌ、Ｖ３９Ｑ、Ｒ４０Ｗ、Ｌ４１Ｑ、Ｉ４２Ｐ、Ｅ４４Ｒ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４７Ｔ、Ｈ４８Ｇ、Ｈ４８Ｒ、Ｇ４９Ｎ、Ｖ５０Ｓ、Ｓ５１Ｃ、Ｍ５２Ａ、Ｍ５２Ｃ、Ｍ５２Ｌ、Ｍ５２Ｖ、Ｓ５３Ｃ、Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３Ｙ、Ｅ５４Ｄ、Ｅ５４Ｆ、Ｒ５５Ｑ、Ｒ５５Ｖ、Ｃ５６Ｑ、Ｌ５８Ｋ、Ｍ５９Ｉ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ６２Ｄ、Ｌ６３Ｃ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｆ６５Ｇ、Ｌ６７Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｅ６９Ｌ、Ｖ７０Ｓ、Ｌ７１Ｃ、Ｆ７２Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ｐ７３Ｃ、Ｐ７３Ｌ、Ｑ７４Ｔ、Ｒ７７Ｉ、Ｆ７８Ｑ、Ｑ７９Ｅ、Ｍ８２Ｙ、Ｑ８３Ｇ、Ｅ８４Ｒ、Ｖ８６Ａ、Ｆ８８Ｎ、Ａ９０Ｐ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｃ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９１Ｙ、Ｌ９２Ｒ、Ｓ９３Ｙ、Ｎ９４Ｃ、Ｎ９４Ｑ、Ｒ９５Ｋ、Ｒ９５Ｑ、Ｌ９６Ｅ、Ｓ９７Ｋ、Ｔ９８Ｃ、Ｔ９８Ｎ、Ｔ９８Ｓ、Ｃ９９Ｖ、Ｈ１００Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｇ１０３Ｄ、Ｄ１０４Ｙ、Ｄ１０５Ｙ、Ｌ１０６Ｅ、Ｌ１０６Ｑ、Ｈ１０７Ｌ、Ｈ１０７Ｎ、Ｉ１０８Ｌ、Ｑ１０９Ｙ、Ｒ１１０Ｃ、Ｒ１１０Ｋ、Ｎ１１１Ｋ、Ｖ１１２Ｅ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ、Ｋ１１４Ｒ、Ｌ１１５Ｖ、Ｋ１１６Ｙ、Ｄ１１７Ｅ、Ｔ１１８Ｇ、Ｖ１１９Ａ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｌ１２２Ａ、Ｇ１２３Ｖ、Ｇ１２６Ｙ、Ｅ１２７Ｃ、Ｉ１２８Ｖ、Ｋ１２９Ｖ、Ｇ１３２Ｙ、Ｅ１３３Ｑ、Ｌ１３４Ｐ、Ｄ１３５Ｍ、Ｌ１３７Ｄ、Ｆ１３８Ｒ、Ｍ１３９Ｌ、Ｍ１３９Ｒ、Ｌ１４１Ｑ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｅ、Ｃ１４５Ｅ、Ｉ１４６Ｒ及び／またはＩ１４６Ｖである。有利には、置換は、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択され得る。有利には、置換は、Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃであり得る。驚くべきことに、本発明で用いられる置換は、ＩＬ－２２活性に悪影響を及ぼさない。

置換の特定の組み合わせには、（ｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ３５Ｄ及びＮ６４Ｄ、（ｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｒ８Ｋ、Ｄ１０Ｅ、Ｋ１１Ｖ、Ｔ２０Ｖ、Ｈ４８Ｒ、Ｍ５２Ａ、Ｓ５３Ｋ、Ｅ５４Ｄ、Ｒ５５Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９５Ｑ、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｑ、Ｈ１０７Ｎ、Ｒ１１０Ｋ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｒ、Ｄ１１７Ｅ及びＩ１４６Ｖ、（ｉｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｒ８Ｋ、Ｄ１０Ｅ、Ｋ１１Ｖ、Ｔ２０Ｖ、Ｈ４８Ｒ、Ｍ５２Ａ、Ｓ５３Ｋ、Ｅ５４Ｄ、Ｒ５５Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９５Ｑ、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｑ、Ｈ１０７Ｎ、Ｒ１１０Ｋ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｒ、Ｄ１１７Ｅ及びＩ１４６Ｖ、（ｉｖ）Ａ１Ｇ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｖ）Ａ１Ｇ及びＮ６４Ｃ、（ｖｉ）Ａ１Ｇ及びＱ１１３Ｃ、（ｖｉｉ）Ａ１Ｇ及びＫ１１４Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＭ２５Ｌ、（ｉｘ）Ａ１Ｇ及びＭ５２Ｌ、（ｘ）Ａ１Ｇ及びＭ１３９Ｌ、（ｘｉ）Ａ１Ｇ及びＮ３６Ｑ、（ｘｉｉ）Ａ１Ｇ及びＤ１１７Ｅ、（ｘｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＮ２１Ｑ、（ｘｉｖ）Ａ１Ｇ及びＮ３５Ｑ、（ｘｖ）Ａ１Ｇ及びＮ６４Ｑ、（ｘｖｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ及びＮ３５Ｑ、（ｘｖｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｖｉｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｉｘ）Ａ１Ｇ及びＫ１１Ｃ、（ｘｘ）Ａ１Ｇ及びＮ１３Ｃ、（ｘｘｉ）Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｉ）Ａ１Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｉｉ）Ｈ６Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｖ）Ｉ３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖ）Ｐ２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖｉ）Ｌ３２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｍ５２Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ｎ１３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｉｘ）Ｎ２１Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＮ９４Ｃ、（ｘｘｘｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＰ７３Ｃ、（ｘｘｘｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＱ１１３Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ９１Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ１１０Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｓ１２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｖｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｓ５１Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｓ５３Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｔ３７Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｉｘ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＴ９８Ｃ、（ｘｘｘｘ）Ｑ１５Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｘｉ）Ｎ３５Ｃ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｘｉｉ）Ｈ６Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、（ｘｘｘｘｉｉｉ）Ａ３３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ、ならびに（ｘｘｘｘｉｖ）Ａ１Ｈ、Ｐ２Ｈ、Ｉ３Ｈ、Ｓ４Ｈ、Ｓ５Ｈ、Ｃ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｌ９Ｓ、Ｄ１０Ｓ、Ｋ１１Ｇ、Ｎ１３Ｇ、Ｆ１４Ｓ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１６Ｖ、Ｐ１７Ｌ、１８Ｆ、Ｙ１９Ｑ、Ｎ２１Ｑ、Ｒ２２Ｓ、Ｆ２４Ｈ、Ｍ２５Ｅ、Ｌ２６Ｓ、Ａ２７Ｌ、Ｅ２９Ｐ、Ａ３０Ｑ、Ｌ３２Ｒ、Ａ３３Ｎ、Ｄ３４Ｆ、Ｎ３５Ｈ、Ｔ３７Ｉ、Ｄ３８Ｌ、Ｖ３９Ｑ、Ｒ４０Ｗ、Ｌ４１Ｑ、Ｉ４２Ｐ、Ｅ４４Ｒ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４７Ｔ、Ｈ４８Ｇ、Ｇ４９Ｎ、Ｖ５０Ｓ、Ｍ５２Ｖ、Ｓ５３Ｙ、Ｅ５４Ｆ、Ｒ５５Ｖ、Ｃ５６Ｑ、Ｌ５８Ｋ、Ｍ５９Ｉ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ６２Ｄ、Ｌ６３Ｃ、Ｎ６４Ｗ、Ｆ６５Ｇ、Ｌ６７Ｑ、Ｅ６９Ｌ、Ｖ７０Ｓ、Ｌ７１Ｃ、Ｆ７２Ｄ、Ｐ７３Ｌ、Ｑ７４Ｔ、Ｒ７７Ｉ、Ｆ７８Ｑ、Ｑ７９Ｅ、Ｍ８２Ｙ、Ｑ８３Ｇ、Ｅ８４Ｒ、Ｖ８６Ａ、Ｆ８８Ｎ、Ａ９０Ｐ、Ｒ９１Ｙ、Ｌ９２Ｒ、Ｓ９３Ｙ、Ｎ９４Ｑ、Ｒ９５Ｋ、Ｌ９６Ｅ、Ｓ９７Ｋ、Ｔ９８Ｎ、Ｃ９９Ｖ、Ｈ１００Ｓ、Ｇ１０３Ｄ、Ｄ１０４Ｙ、Ｄ１０５Ｙ、Ｌ１０６Ｅ、Ｈ１０７Ｌ、Ｉ１０８Ｌ、Ｑ１０９Ｙ、Ｒ１１１Ｋ、Ｖ１１２Ｅ、Ｌ１１５Ｖ、Ｋ１１６Ｙ、Ｄ１１７Ｅ、Ｔ１１８Ｇ、Ｖ１１９Ａ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｌ１２２Ａ、Ｇ１２３Ｖ、Ｇ１２６Ｙ、Ｅ１２７Ｃ、Ｉ１２８Ｖ、Ｋ１２９Ｖ、Ｇ１３２Ｙ、Ｅ１３３Ｑ、Ｌ１３４Ｐ、Ｄ１３５Ｍ、Ｌ１３７Ｄ、Ｆ１３８Ｒ、Ｍ１３９Ｒ、Ｌ１４１Ｑ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｅ、Ｃ１４５Ｅ及びＩ１４６Ｒが含まれる。置換の他の特定の組み合わせには、（ｘｘｘｘｖ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ９５Ｃ、ならびに（ｘｘｘｘｖｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＬ１０６Ｃが含まれる。置換のいずれか及び全ての組み合わせが想定され、本発明の一部を形成する。

第１の態様の誘導体は、典型的には、アミノ酸置換を含み得、それにより、Ｃｙｓは、任意選択で、上記で同定される位置、例えば、１位、２位、３位、６位、１１位、１２位、１３位、１５位、２１位、３２位、３３位、３５位、３７位、５１位、５２位、５３位、６３位、６４位、７１位、７３位、９１位、９４位、９８位、１１０位、１１３位、１１４位及び／または１２７位うちのいずれかにおいて、天然残基を置換する。有利には、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含む（誘導体１及び誘導体２など）。別の好ましい実施形態では、バリアントは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位にＣｙｓ残基を含む。

代替的に、または追加で、天然配列内の変異は、アミノ酸挿入であってもよい。最大５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個または更には最大５０個のアミノ酸が、天然配列内に挿入され得る。この点に関して、三量体、五量体、七量体、八量体、九量体及び４４量体が特に有利である。例示的な配列を表１に示す。挿入は、天然配列の任意の位置で行うことができるが、らせんＡ（例えば、残基３０で）、ループＣＤ（例えば、残基７５で）、らせんＤ（例えば、残基８５で）及び／またはらせんＦ（例えば、残基１２４で）中のものが好ましい。

天然配列内の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の変異は、独立して、置換及び挿入からなる群から選択され得る。

天然配列内の変異はまた、配列番号１内に１つ以上のアミノ酸欠失を含み得るか、または代替的に含む。

したがって、ペプチドは、最大５つのアミノ酸欠失を含み得る。３つまたは２つ以下のアミノ酸欠失が好ましい。該欠失は、例えば、配列番号１内の別個の（すなわち、非連続的な）位置に存在し得る。変異はまた、配列番号１内に２つ、３つ、４つまたは５つの連続したアミノ酸の欠失であり得るか、または代替的に欠失であり、これは、最大５つの一連の隣接するアミノ酸が欠失してもよいことを意味する。

ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に対する配列変異は、存在する場合、典型的には、Ｎ末端にペプチドを付加するなどの伸長を含む。ペプチドは、最大５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個または更には５０個のアミノ酸からなり得る。単量体、三量体、八量体、１３量体、１５量体、１６量体、２１量体、２８量体は、この点に関して特に有利である。例示的な配列を表２に示す。好適には、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含む。特に好ましい例では、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２の１位（配列番号１）のＣｙｓ残基及びＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇの両方を含む。これにより、非常に良好な半減期及び効力を有する誘導体が作製されることが見出されている（実施例１の誘導体１を参照されたい）。

別の有利な実施形態では、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含まない。

ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に対する配列変異は、存在する場合、Ｃ末端にペプチドの付加を含み得る。ペプチドは、最大５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個または更には５０個のアミノ酸からなり得る。例示的なＣ末端ペプチド配列は、表２（Ｎ末端ペプチドについて）に示されるものを含む。七量体は、この点において特に有利であり、任意選択で、アミノ酸配列Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｃ（配列番号１９）を有する。

本発明の誘導体は、本明細書に記載される天然またはバリアントｈＩＬ－２２アミノ酸配列に加えて、Ｎ末端ペプチド及びＣ末端ペプチドの両方を含み得る。本明細書に記載のＮ末端ペプチド及びＣ末端ペプチドの任意の組み合わせが想定され、本発明に明示的に含まれる。

本発明は、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントに共有結合した脂肪酸（脂肪酸は一酸である）を含むＩＬ－２２の任意の誘導体に及ぶことを理解されたい。「バリアント」は、ｈＩＬ－２２と少なくとも１０％の配列同一性を有するタンパク質であり得る。例えば、バリアントは、ｈＩＬ－２２内に変異を有し得、ｈＩＬ－２２と少なくとも１０％の配列同一性を有し得る。実施形態では、バリアントは、ｈＩＬ－２２と少なくとも２０％、または更には少なくとも３０％の配列同一性を有する。バリアントは、ｈＩＬ－２２の「実質的にアミノ酸配列」を有し得、これは、ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列を意味し得る。したがって、実施形態では、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実験セクションに開示される本発明の特定の誘導体に組み込まれるものを含む例示的なＩＬ－２２タンパク質バリアントは、配列番号２０～２５に記載される。

当業者は、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージを計算する方法を理解するであろう。２つの配列のアラインメントは、最初に調製され、続いて配列同一性値が計算されなければならない。２つの配列の同一性パーセンテージは、以下に応じて異なる値を取ることができる：（ｉ）配列をアラインメントさせるために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装される）または３Ｄ比較からの構造的アラインメント、ならびに（ｉｉ）アラインメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）ならびにギャップペナルティ、例えば、関数形式及び定数。

アラインメントを行った後、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算する多くの異なる方法がある。例えば、以下によって同一性の数を分割することができる：（ｉ）最短配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置の数または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数。更に、同一性パーセンテージも、強く長さに依存していることを理解されたい。したがって、一対の配列が短いほど、偶然に生じることが予想され得る配列同一性が高くなる。

したがって、アミノ酸配列の正確なアラインメントは、複雑なプロセスであることを理解されたい。一般的な多重アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［４８、４９］は、本発明によるタンパク質の複数のアラインメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに好適なパラメータは次のとおりであり得る：タンパク質アラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップエクステンションペナルティ＝０．２及びマトリックス＝ゴネット。ＤＮＡ及びタンパク質アラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝－１及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれら及び他のパラメータを変更することが必要であり得ることを認識するであろう。

好ましくは、次いで、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージの計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００などのアラインメントから計算することができ、式中、Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除く、比較された位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上記に記載されるように、好適なパラメータのセットを使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して配列アラインメントを調製することと、（ｉｉ）Ｎ及びＴの値を以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することと、を含む。

類似の配列を同定するための代替的な方法は、当業者に既知であろう。

好適には、第１の態様の誘導体は、２００個以下のアミノ酸を含む。例えば、誘導体は、１９０個未満、１８０個未満、１７０個未満、１６０個未満または１５０個未満のアミノ酸を含む。好適には、誘導体は、少なくとも１４６個のアミノ酸を含むが、これは、ｈＩＬ－２２中のアミノ酸の数である。少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１６０個のアミノ酸、少なくとも１７０個のアミノ酸または更には少なくとも１８０個のアミノ酸を含み得る。本発明の誘導体は、上記の範囲内の任意の長さのタンパク質を含むことができるが、それらは典型的には長さが１４６～１８０個のアミノ酸である。

本発明の誘導体は、天然またはバリアントのアミノ酸配列を有するかどうかにかかわらず、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含み、脂肪酸は一酸である。脂肪一酸は、典型的には、リンカーによってＩＬ－２２タンパク質に共有結合している。脂肪一酸及びリンカーは、アミド結合を介して互いに好適に接続され、リンカーは、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合している。したがって、脂肪一酸及びリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質上の側鎖として存在し得る。共有結合した脂肪一酸がＩＬ－２２活性に悪影響を及ぼさないことは、本発明者らにとって驚くべきことであった。脂肪一酸の結合が、半減期の延長などの追加の利点と関連していることは、特に驚くべきことであった。

脂肪一酸は、任意の好適な脂肪一酸であり得る。特に、脂肪一酸は、下式Ｉのもの：
Ｈ_３Ｃ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－＊
（式中、ｘは、１０～１８、任意選択で１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、ＩＬ－２２タンパク質またはリンカーへの結合点を示す）であり得る。それは、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸であり得る。有利には、脂肪一酸は、Ｃ１６またはＣ１８一酸であり、最も有利には、Ｃ１６一酸である。

例えば、式Ｉの－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１０である直鎖アルキレンであり得る。この脂肪酸は、好都合には、Ｃ１２一酸、すなわち、１２個の炭素原子を有する脂肪モノカルボン酸と称され得る。あるいは、式Ｉの－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１２である直鎖アルキレンであり得る。この脂肪酸は、好都合には、Ｃ１４一酸、すなわち、１４個の炭素原子を有する脂肪モノカルボン酸と称され得る。同様に、式Ｉの－（ＣＨ_２）_ｘ－は、ｘが１４（Ｃ１６一酸）、１６（Ｃ１８一酸）または１８（Ｃ２０一酸）である直鎖アルキレンであり得る。好適には、第１の態様の誘導体は、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸、より好適には、Ｃ１６またはＣ１８一酸、更により好適には、Ｃ１６一酸を含む。

一酸は、アルブミンと非共有結合会合を形成することができ、それにより血流中の誘導体の循環を促進することができる。より短い一酸（例えばＣ１６一酸）は、低いアルブミン親和性を有し、したがってより長い一酸（例えばＣ１８一酸）よりも半減期が短い。しかしながら、それらは依然として長時間作用型の誘導体であり、予想される半減期は人では１日を超える。

一酸はまた、親油性であり、これは、それらが生体膜に結合する傾向があることを意味する。生体膜への組み込みによるこの非アルブミン依存性引延は、局所的なリザーバを形成し得、したがって、長時間の局所的作用を確実にする。これは、局所投与、経口投与、直腸坐剤もしくは直腸泡状物、または肺吸入における利点を提供すると仮定することができる。

脂肪酸の結合は、それ自体で、更に、タンパク質分解に対してＩＬ－２２タンパク質を安定させる。

第１の態様の誘導体は、脂肪一酸及びＩＬ－２２タンパク質の特定の組み合わせを含み得る。例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸は、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基及び／またはＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含むＩＬ－２２タンパク質に結合し得る。一例では、第１の態様の誘導体は、Ｃ１６一酸を含み、ＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基及びＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ（誘導体１になど）の両方を含む。

上記のように、脂肪一酸は、ＩＬ－２２タンパク質に結合しているリンカーに好適に接続される。リンカーは、１つ以上のアミノ酸、例えば、１つ以上のＧｌｕ及び／またはＬｙｓ残基を含む、いくつかのリンカー要素を含み得る。リンカーは、オキシエチレングリシン単位または複数の連結したオキシエチレングリシン単位、任意選択で２～５つのそのような単位、有利には２つの単位を含み得る。１つ以上のＯＥＧ残基、Ｃ_２ＤＡ及び／またはＡｃ基が、代替的にまたは追加的に含まれ得る。リンカーは、Ｃｙｓ反応性単位を含み得る。「Ｃｙｓ反応性単位」は、本明細書で使用される場合、Ｃｙｓの硫黄原子と反応して炭素－硫黄共有結合を作り出すことができる機能単位を意味し得る。Ｃｙｓ反応性単位は、いくつかの形態のうちのいずれかを有することができるが、好適には、脱離基に結合した炭素原子を含み、脱離基は、炭素－硫黄結合の形成中にＣｙｓの硫黄原子によって置換される。脱離基は、ハロゲン、任意選択で臭素原子であり得る。この臭化物脱離基は、Ａｃ官能基へのアルファであり得、有利には、ブロモ－Ａｃ官能基である。脱離基は、代替的に、メシレートまたはトシレートの形態の官能化ヒドロキシル基、または非官能化ヒドロキシル基であってもよい。更に、脱離基は、マレイミドまたは他の官能基であり得る。例示的なリンカーとしては、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃ、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃ及びγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃが挙げられるが、任意の好適なリンカーが用いられ得る。リンカーγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃが好ましい場合がある。

脂肪一酸またはリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質中の任意のアミノ酸残基に結合し得る。この点に関する例示は、ｈＩＬ－２２アミノ酸配列において、またはｈＩＬ－２２アミノ酸配列に対して残基－７、－５、１、６、３３、１１３、１１４及び１５３である。更なる例示的な残基は、ｈＩＬ－２２アミノ酸配列中の９５及び１０６である。天然残基は、典型的には、脂肪一酸またはリンカーの結合を可能にするために、ＣｙｓまたはＬｙｓで置換されている。あるいは、脂肪一酸またはリンカーは、天然のＣｙｓまたはＬｙｓ残基において結合することができる。好適には、脂肪一酸またはリンカーは、ｈＩＬ－２２の１位、６位、３３位、１１３位もしくは１１４位で置換されたＣｙｓ残基、またはｈＩＬ－２２に対して－５位、－７位もしくは１５３位のＣｙｓ残基に結合している。特に、脂肪一酸またはリンカーは、ｈＩＬ－２２の１位で置換されたＣｙｓ残基に結合し得る。脂肪一酸またはリンカーは、ｈＩＬ－２２の９５位または１０６位で置換されたＣｙｓ残基に結合し得る。

脂肪一酸またはリンカーのＩＬ－２２タンパク質への結合は共有結合である。例えば、Ｃｙｓ反応性脂肪一酸またはリンカーを使用して、脂肪一酸またはリンカーをＩＬ－２２タンパク質中のＣｙｓ残基に結合してもよい。脂肪一酸またはリンカーは、チオエーテル結合を介してＣｙｓ残基の硫黄原子に共有結合し得る。あるいは、Ｌｙｓ反応性脂肪一酸またはリンカーを使用して、脂肪一酸またはリンカーをＩＬ－２２タンパク質中のＬｙｓ残基に結合してもよい。脂肪一酸またはリンカーは、代替的に、ＩＬ－２２タンパク質のＮ末端の遊離アミン（－ＮＨ_２）基に共有結合してもよい（１位のアミノ酸に関係なく）。結合は、Ｃｙｓ結合と同様に進行することができるが、好適なＮ反応性種を含有する脂肪一酸またはリンカーの化学量論的量未満である。脂肪一酸またはリンカーは、アルデヒド（Ｎ反応性種）の形態で提示され得、古典的に知られている還元的アミノ化を用いて遊離アミンに共有結合し得る。

したがって、第１の態様の誘導体は、好適には、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって結合しているＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、バリアントは、任意選択で、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１６またはＣ１８一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したまたはＣ１６一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１６またはＣ１８一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１６一酸を含み、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含まないが、ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含み、リンカーは、任意選択で、該Ｃｙｓ残基に結合している。

第１の態様の例示的な誘導体は、配列番号２０～２５及び３４のうちのいずれかに記載されるＩＬ－２２タンパク質を含む。特に有利な誘導体が表３に示され、図１に示され、本明細書に例示される。

本発明の誘導体は、異なる立体異性形態で存在し得、本発明は、これらの全てに関する。

本発明の第２の態様によると、脂肪一酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合させることを含む、第１の態様の誘導体を調製するためのプロセスが提供される。

プロセスを使用して、本明細書に記載のまたは想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のいずれかを産生してもよいが、脂肪一酸がバリアントＩＬ－２２タンパク質に共有結合している場合に特に有利である。したがって、実施形態では、第２の態様で用いられるＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２の置換形態であり、任意選択で、１位、２１位、３５位、６４位、１１３位及び／または１１４位で置換されている。例示的な置換としては、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及び／またはＫ１１４Ｒが挙げられる。好ましくは、ＩＬ－２２タンパク質は、１位のＣｙｓ残基で置換されている。

脂肪一酸は、組換え手段を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によって得ることができる。好適な脂肪一酸は、市販されているか、または標準的な化学合成を使用して入手可能な出発材料から容易に導かれる。

ＩＬ－２２タンパク質は、組換え手段を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によって得ることができる。組換えｈＩＬ－２２の産生は以前に記載されており、当該技術分野で周知である。所望のバリアントＩＬ－２２タンパク質を同様の方法で産生することができる。この分野の熟練した研究者は、所望のバリアントＩＬ－２２タンパク質をコードする好適な核酸配列を容易に同定することができるであろう。したがって、当業者は、当該技術分野における既存の知識に基づいて、本発明のこの部分を容易に実行することができるであろう。好適には、ＩＬ－２２タンパク質は、標準的な技法を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類系で産生される。ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を用いて、組換えタンパク質の親和性精製を補助することができる。

この点に関して、本発明で使用されるＩＬ－２２タンパク質は、ニッケルカラムに対する親和性によって精製することができる１０未満、好ましくは６つのヒスチジン残基のＮ末端またはＣ末端付加である、発現後切断可能なＨｉｓタグを使用して調製することができる。Ｈｉｓタグは、遊離ＩＬ－２２タンパク質を残すために既知のプロテアーゼによって消化することができるリンカーを介してタンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結される。切断可能なＨｉｓタグは、アミノ酸配列、ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＳＧＳＧＳＥＶＬＦＱ（配列番号２６）を有し得、プロテアーゼ切断可能なリンカーは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）リンカーであり得、天然切断部位のそのコンセンサス配列は、ＥＮＬＹＦＱ／Ｓ（配列番号２７）であり、「￥」は、切断されたペプチド結合またはＥＶＬＦＱコンセンサス切断部位を有するヒトライノウイルス－１４ ３Ｃ（ＨＲＶ１４－３Ｃ）プロテアーゼ切断可能リンカーを示す。切断は、約１０μｇのプロテアーゼを２．５μｇのタンパク質及び１０ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに室温で４時間インキュベートすることによって達成され得る。

本発明を更に例示するために、タンパク質調製のための代表的なプロセスが以下のように提供される。このプロセスは、ＩＬ－２２タンパク質の所望のアミノ酸配列をコードするプラスミドＤＮＡを調製することを伴う。このプラスミドは、細胞株、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１に一過性にトランスフェクトされてもよく、細胞株は、既知のエンハンサーの添加によって成長が増加する前に、関連培地中で成長させる。次いで、分泌されたＩＬ－２２タンパク質は、タンパク質がニッケルカラム上で精製される前に、遠心分離及び滅菌濾過の既知の方法によって回収することができる。濃縮及び緩衝液交換後、脂肪一酸によるアルキル化（以下に更に記載される）、ならびに最終精製及び緩衝液交換の前に、Ｈｉｓタグは、ＨＲＶ１４－３Ｃプロテアーゼを使用して除去される。脱グリコシル化の有無にかかわらず、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、タンデム質量分析を用いたサイズ排除クロマトグラフィまたは液体クロマトグラフィ（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）を使用した最終産物の分析を使用して、最終産物の品質を確保することができる。

脂肪一酸は、直接、または第１の態様について記載されるリンカーを使用するかのいずれかで、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合し得る。リンカーは、当該技術分野で既知の任意の手段によって得ることができる。脂肪一酸及びリンカーを調製するための方法は、当業者に既知であろう。しかしながら、例として、脂肪二酸及びリンカーを調製するための代表的な方法は、用いられる場合、米国特許公開第ＵＳ２０１８／０１４０６７３号に記載されている。当業者は、開示された二酸を一酸に置き換える方法を知っているであろう。

したがって、ＩＬ－２２タンパク質への脂肪一酸またはリンカーの共有結合は、当該技術分野の標準的な手順を使用して行われ得る。したがって、リンカーは、用いる場合、ＩＬ－２２タンパク質の脂肪一酸への共有結合を可能にする。非限定的な例として、Ｃｙｓ反応性脂肪一酸またはリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質中のＣｙｓ残基の硫黄原子と反応させて、チオエーテル結合を形成してもよい。共有結合ステップのための好適な条件は、以下のように例示され得る：水中のトリスを、トリス及びＮａＣｌ緩衝液（１．３５ｍｇ／ｍＬ）中のＩＬ－２２タンパク質（７０ｍｇ）に添加して、ｐＨ８に調節する。ビス（ｐ－スルホナトフェニル）－フェニルホスフィン二水和物二カリウム（ＢＳＰＰ）塩（１２ｍｇ）を、水に溶解して添加し、室温で４時間ゆっくりと攪拌する。エタノール（０．５ｍＬ）中の１５－｛（Ｓ）－１－カルボキシ－３－［２－（２－｛［２－（２－｛［２－（２－ブロモアセチルアミノ）－エチルカルバモイル］エトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］メトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］プロピル－カルバモイル｝ペンタデカン酸（１９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩ゆっくりと攪拌した。ＭｉｌｉＱ水（１５０ｍＬ）を添加して、伝導度を２．５ｍＳ／ｃｍに低下させる。次いで、混合物を、結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）、溶出緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、流量６ｍＬ及び６０カラム体積にわたって０～８０％の溶出緩衝液の勾配を使用して、ＭｏｎｏＱ １０／１００ ＧＬカラム上でアニオン交換を使用して精製する。

本発明の誘導体は、クロマトグラフィ、電気泳動、示差溶解性または抽出などの当技術分野で既知の任意の好適な手順を使用して精製され得る。

本明細書に記載されるように、本発明者らは、脂肪一酸が、生物学的活性を維持しながら、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合し得ることを見出して驚いた。ＩＬ－２２に対するそのような最小限の修飾が、非常に長い循環半減期と組み合わせて高い効力（ｈＩＬ－２２に近い）をもたらし得ることは、特に驚くべきことであった。特性のこの特定の組み合わせは、非常に望ましい場合がある。

誘導体の効力は、ヒトＩＬ－２２受容体を発現する全細胞を用いたインビトロアッセイにおいて決定することができる。例えば、ヒトＩＬ－２２受容体の応答は、ＩＬ－２２Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２及びホスホ－ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）応答性レポーター遺伝子を過剰発現するベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞を使用して測定することができる。あるいは、ＩＬ－２２受容体を内因的に発現するＨｅｐＧ２細胞を使用してもよい。受容体の活性化は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化をもたらし、これは、例えば、ＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用して、またはｐＳＴＡＴ３をアッセイすることによって測定することができる。インビボ効力は、当該技術分野で知られているように、動物モデルまたは臨床試験で決定することができる。

半最大有効濃度（ＥＣ_５０）値は、しばしば薬物の効力の尺度として使用される。これは、最大効果の５０％を産生するのに必要な薬物の濃度を表すため、ＥＣ_５０値が低いほど、効力は良好である。本発明の誘導体は、好適には、１．５ｎＭ未満、１．２５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満または更には０．１ｎＭ未満の、細胞においてＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化を使用して測定される効力（ＥＣ_５０値）を有する（例えば、実施例１に記載されるように決定される）。本発明の誘導体は、好適に、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、７ｎＭ未満または更には５ｎＭ未満の、細胞においてｐＳＴＡＴ３をアッセイすることによって測定される効力（ＥＣ_５０値）を有する。

有利には、ＩＬ－２２の誘導体の効力は、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物の効力よりも高い場合がある。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ｈＩＬ－２２と比較して、そのＩＬ－２２－Ｆｃ融合物であるＵＴＴＲ１１４７Ａのインビトロ効力が３４倍低減したことを報告している（Ｓｔｅｆａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１８，１５２：２２４－２３５）。対照的に、ｈＩＬ－２２への脂肪一酸の共有結合は、効力の最小限の低減のみを引き起こすことが示されている（実施例１の誘導体１及び実施例１２の誘導体２を参照されたい）。ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物及び本発明の誘導体の両方は、ｈＩＬ－２２に対する改善された半減期及び少なくとも一部の設定における生物学的機能の観点から同等であり得るが、本発明の誘導体は、効力の最小限の損失という追加の利点を有し得る。

誘導体の循環排出半減期（Ｔ_１／２）は、誘導体をマウス、ラットまたはミニブタなどの好適な動物モデルに皮下または静脈内投与することによってインビボで決定され得る。好適な方法は当業者に既知であろう。非限定的な例として、第１の態様の誘導体は、マウスへの皮下または静脈内投与後、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間または更には少なくとも８時間の循環半減期を有する。誘導体は、ラットへの皮下または静脈内投与後、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間または更には少なくとも１３時間の循環半減期を有し得る。誘導体は、ミニブタへの皮下または静脈内投与後、少なくとも２５時間、少なくとも４０時間、少なくとも７０時間または更には少なくとも１００時間の循環半減期を有し得る。

本発明者らはまた、本発明の誘導体がインビボで迅速に吸収されることを見出した。有利には、皮下投与後の誘導体の吸収は、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物の吸収よりも速く生じ得る。平均吸収時間は、用量及び薬物投与後の最大血漿濃度とは独立しているため、取り込みを測定するための正確なパラメータである。これは、平均滞留時間、すなわち、吸収が完了したら、排出される前に薬物が体内に留まる時間に基づいて計算され得る。本発明の誘導体は、好適には、ブタにおいて１００時間未満、９０時間未満、８０時間未満、７０時間未満または更には６０時間未満の平均吸収時間を有する。

本発明の誘導体はまた、当該技術分野の標準的な方法を使用して測定され得る、高い物理的安定性及び／または溶解性などの良好な生物物理学的特性を有する。実際、一酸誘導体化バリアントは、ｈＩＬ－２２と比較して生物物理学的特性を顕著に変化させ、その治療可能性を改善する。注目すべきは、それらは、例えば、アルブミンへの結合及び脂質膜との相互作用を通じて、タンパク質分解及び腎クリアランスに対して安定化される。重要なことに、本発明者らは、インビトロで測定されるコンジュゲート誘導体の活性を損なうことなく、ＩＬ－２２タンパク質骨格の選択部位で、一酸含有脂肪酸部分のコンジュゲーションを行うことができることを見出した（実施例１を参照されたい）。

したがって、本発明の第３の態様によると、第１の態様の誘導体と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書に更に記載されるように、吸入、注射、局所、経口または眼内投与に好適であり得、任意選択で、注射は、腹腔内、皮下または静脈内である。一実施形態では、皮下投与が好ましい。一実施形態では、静脈内投与が好ましい。一実施形態では、経口投与が好ましい。一実施形態では、局所投与が好ましい。

第３の態様の医薬組成物は、本明細書に記載のまたは想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のうちのいずれかを含み得る。好適には、本明細書で誘導体１として同定されるＩＬ－２２の誘導体を含む。本明細書で誘導体２として同定されるＩＬ－２２の誘導体を含み得る。

第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物は、ｈＩＬ－２２と比較して増加した循環排出半減期を好適に実証するであろう。有利には、ｈＩＬ－２２と比較して、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％以上増加した循環排出半減期を実証する。

第３の態様の医薬組成物は、治療有効量の第１の態様の誘導体を薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることによって調製され得る。様々な賦形剤を有する薬学的に有効な成分の製剤は、当該技術分野で既知である。

第１の態様の誘導体の「治療有効量」は、対象に投与されるとき、疾患、障害または状態を治療するか、または所望の効果をもたらすために必要とされる誘導体の量である任意の量である。

例えば、使用される誘導体の治療有効量は、約０．００１ｍｇ～約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇであり得る。誘導体の量は、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ～約５０ｍｇの量であることが好ましい。

本明細書でいう「薬学的に許容されるビヒクル」とは、医薬組成物を製剤化する際に有用であることが当業者に知られている、あらゆる公知の化合物または公知の化合物の組み合わせである。

一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であり得、任意選択で、組成物は懸濁のための粉末の形態であり得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、不活性結合剤、防腐剤または染料としても作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。粉末では、ビヒクルは、本発明による微細化された誘導体と混合される微細化された固体である。粉末は、好ましくは最大９９％の誘導体を含有する。好適な固体ビヒクルとして、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース及びイオン交換樹脂が挙げられる。

別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであり得、組成物はクリームなどの形態であり得る。

しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、任意選択で医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤及び加圧組成物の調製に使用される。本発明による誘導体は、水、有機溶媒、両方の混合物または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、色素、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の好適な薬学的添加剤を含有することができる。非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例としては、水（上記のような添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価のアルコール及び多価のアルコール、例えば、グリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画ココナッツ油及びアラキス油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進剤であり得る。

したがって、本発明の医薬組成物を調製するためのプロセスは、当該技術分野で標準的である通常のステップを含み得る。

したがって、本発明の第４の態様によれば、療法に使用するための第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物が提供される。本発明の誘導体またはそれを含む医薬組成物を用いた対象の治療方法も提供される。本明細書に記載のまたは想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のうちのいずれかが、本発明のこれらの態様に明示的に含まれる。

本明細書で使用される場合、「治療」及び「療法」などの用語は、疾患、障害または状態の治療、改善または予防を明示的に含む。

ＩＬ－２２の誘導体またはそれを含む医薬組成物は、治療される対象に直接投与され得る。誘導体または医薬組成物は、吸入、注射、局所、経口、直腸または眼内を含む任意の手段によって投与することができる。吸入により投与する場合は、鼻または口を介することができる。好ましくは、誘導体または医薬組成物は、注射によって、典型的には皮下または静脈内投与される。前述のように、本発明の一酸誘導体の親油性は、局所投与、経口投与、直腸投与（例えば、坐剤または泡状物）または肺吸入においても有利であり得る。したがって、誘導体は、それらのより小さいサイズ及びより高い効力のために、投与の柔軟性（例えば、注射、吸入、局所適用、直腸もしくは経口投与、または眼送達による）において、Ｆｃ融合物に勝る明らかな利点を有する。治療される対象に、本発明の誘導体を投与することにより、ｈＩＬ－２２と比較して循環時間が増加し、疾患、障害または状態の治療に役立つことが理解されるであろう。上記のように、「治療すること」はまた、疾患、障害または状態を改善及び予防することを含む。

滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内及び特に皮下または静脈内注射によって利用することができる。誘導体は、滅菌水、生理食塩水または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。

吸入に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョン及び懸濁液が挙げられる。あるいは、誘導体は、Ｄｉｓｃｈａｌｅｒ（登録商標）またはＴｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）を介して微粉末またはエアロゾルの形態で投与されてもよい。鼻腔吸入は、好適には、微粉末またはエアロゾルの鼻腔スプレーまたは改変されたＤｉｓｃｈａｌｅｒ（登録商標）またはＴｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）の形態であってもよい。

局所製剤としては、溶液、クリーム、泡状物、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、チンキ剤及び粉末が挙げられる。それらは、皮膚上、すなわち、皮膚に直接適用されるか、または粘膜に適用されてもよい。

経口投与は、好適には、錠剤、カプセルまたは液体懸濁液もしくはエマルジョンを介してであり得る。経口投与のための液体ビヒクルの好適な例としては、水（添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価のアルコール及び多価のアルコール、例えば、グリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画ココナッツ油及びアラキス油）が挙げられる。本発明の誘導体は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステル及び酸化エチレンと共重合したその無水物）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。溶液、シロップ及びエリキシル剤もまた、本発明の一部を形成する。本発明による誘導体は、固体組成物形態で経口投与することもできる。経口投与に好適な固体組成物としては、丸薬、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び粉末が挙げられる。

直腸投与は、好適には、坐剤または泡状物を介してでもよい。

眼投与用の製剤は、典型的には、局所適用のための溶液、懸濁液及び軟膏、例えば、点眼剤の形態である。代替的に、滅菌溶液または懸濁液は、眼内注射によって利用することができる。誘導体は、滅菌水、生理食塩水または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。製剤は、結膜下、硝子体内、球後または前房内注射用のものであってもよい。

本発明の誘導体または医薬組成物は、それを必要とする任意の対象に投与され得る。「対象」は、本明細書で使用される場合、脊椎動物、哺乳動物または家畜であり得る。したがって、本発明による誘導体及び組成物を使用して、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、馬）、ペットを治療するか、または他の獣医学的用途で使用してもよい。最も好ましくは、対象は、ヒトである。誘導体及び組成物は、既に疾患、障害または状態の徴候を示すものに投与される必要があるだけではない。むしろ、それらは、将来的にそのような疾患、障害または状態の可能性に対する純粋な予防措置として、見かけ上健康な対象に投与することができる。

本発明によるＩＬ－２２の誘導体及び組成物は、疾患、障害または状態を治療するために、単剤療法（すなわち、その誘導体または組成物の唯一の使用）で使用され得ることを理解されたい。代替的に、本発明による誘導体及び組成物は、疾患、障害または状態を治療するための既知の療法の補助剤として、またはそれらと組み合わせて使用され得る。

必要とされるＩＬ－２２の誘導体の量は、その生物学的活性、半減期及びバイオアベイラビリティによって決定され、これは次に、投与様式、誘導体及び組成物の生理化学的特性、ならびに単剤療法として使用されているか、または併用療法で使用されているかに依存することを理解されたい。投与の頻度はまた、治療される対象内の誘導体の半減期に影響される。投与される最適な投与量は、当業者によって決定されてもよく、使用中の特定の誘導体、医薬組成物の強度、投与様式及び疾患、障害または状態の進行によって変化するであろう。対象の年齢、体重、性別、食事及び投与時間を含む、治療される特定の対象に依存する追加の要因は、投与量を調整する必要性をもたらす。

一般に、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量の本発明によるＩＬ－２２の誘導体が、どの誘導体または組成物が使用されるかに応じて、疾患、障害または状態を治療するために使用され得る。より好ましくは、１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重～５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ体重～１００μｇ／ｋｇ体重である。

ＩＬ－２２または組成物の誘導体は、疾患、障害または状態の発生の前、その間またはその後に投与され得る。１日用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えてもよい。代替的に、誘導体または組成物は、１日の間に２回以上の投与を必要とし得る。一例として、誘導体は、０．０７μｇ～７００ｍｇの１日用量（すなわち、７０ｋｇの体重を想定して）を２回（または治療される疾患、障害または状態の重症度に応じてそれ以上）として投与されてもよい。治療を受けている患者は、起床時に第１の用量を服用し、次いで夕方（２回投与レジメンの場合）に第２の用量を服用するか、またはその後は３時間または４時間の間隔で服用してもよい。代替的に、用量は、週に１回、２週間ごともしくは月に１回、またはより頻繁に、例えば、週に２回または３回与えられてもよい。製薬業界によって従来用いられているもの（例えば、インビボ実験、臨床試験など）などの既知の手順を使用して、本発明による誘導体及び組成物の特定の製剤ならびに精密な治療レジメン（薬剤の１日用量及び投与頻度など）を形成してもよい。

多くの研究が、特に肺、肝臓、腸、腎臓、皮膚、膵臓及び胸腺の複数の上皮損傷モデルにおけるＩＬ－２２の重要な効果を実証している。機構的には、例えば、抗アポトーシス、増殖、自然免疫、抗酸化ストレス、抗線維症及び幹細胞／前駆細胞動員内のいくつかの経路は、複数の研究者による研究においてＩＬ－２２効果を媒介することが十分に文書化されている。主要な機構的所見は、ヒト細胞株またはヒトエクスビボモデル（例えば、初代ヒト腸オルガノイド）を使用してインビトロで更に確認されている。したがって、上皮損傷における細胞死の予防、再生の確保及び炎症の制御におけるＩＬ－２２の強い役割は十分に確立されている。

多くの研究は、損傷を受けた遺伝子モデル（ＩＬ－２２ノックアウトまたはトランスジェニック過剰発現）を分析することによって行われる。これらの研究では、ＩＬ－２２の欠如またはＩＬ－２２の過剰発現は、損傷時に存在する。他の研究では、ＩＬ－２２は、損傷時に抗体で中和され、場合によっては、ＩＬ－２２は、急性損傷期を超えて中和される（例えば、亜急性または良好に再生期に入る）。他の研究は、外因的に投与されたＩＬ－２２の効果を調べることによって、治療シナリオに近づく。利用可能な文献を全体的に見ると、ノックアウト、過剰発現、損傷前もしくは損傷後のＩＬ－２２中和、または外因性タンパク質投与にかかわらず、異なるモデルが、損傷した臓器を保護し、再生を促すＩＬ－２２の同じ状況を描くことに注意することが重要である。これは、ＩＬ－２２の治療可能性に対する幅広い適用及び広い時間枠を示し、また、ｈＩＬ－２２よりも長時間作用型ＩＬ－２２タンパク質が必要とされる理由を示す。

したがって、本発明の第５の態様によると、療法の方法であって、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量の誘導体を投与することを含む、方法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物が提供される。そのような１日用量の投与については、本明細書に更に記載される。

本発明の第６の態様によると、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、ＣＮＳまたは皮膚の疾患、障害または状態を治療する方法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の医薬組成物が提供される。本明細書に記載のまたは想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のうちのいずれかが、本発明のこの態様に明示的に含まれる。

代謝の疾患、障害または状態は、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高血糖症または高インスリン血症であり得る。

肝臓の疾患、障害または状態は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、ＡＣＬＦ、アセトアミノフェン誘導肝毒性、急性肝損傷、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変、または手術もしくは移植によって引き起こされた病的状態であり得る。

肺の疾患、障害または状態は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、化学損傷、ウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症であり得る。

腸の疾患、障害または状態は、ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＧｖＨＤ、化学損傷、ウイルス感染症または細菌感染症であり得る。

腎臓の疾患、障害または状態は、急性腎疾患または慢性腎疾患であり得る。

ＣＮＳの疾患、障害または状態は、多発性硬化症であり得る。

皮膚の疾患、障害または状態は、創傷、炎症疾患またはＧｖＨＤであり得る。

ＩＬ－２２の誘導体、またはそれを含む医薬組成物を用いて、上記の疾患、障害または状態のうちの１つ以上などのＩＬ－２２治療に応答する状態を有する対象を治療する方法も提供される。

ＩＬ－２２の誘導体は、本発明の第１の態様について特定された特徴の全てを有する。医薬組成物は、本発明の第３の態様について特定された特徴の全てを有する。上記の疾患、障害または状態のうちの１つ以上などのＩＬ－２２治療に応答する状態を有する対象を治療する方法は、本発明の第４の態様について特定された特徴の全てを有する。

本明細書に記載のどのＩＬ－２２誘導体または組成物をどの患者に投与すべきかについての制限はない。むしろ、本明細書に記載の誘導体及び組成物のうちのいずれも、本明細書に記載される任意の患者に投与することができることが意図される。

本明細書に記載される特徴（任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）の全て、及び／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴及び／またはステップのうちの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記の態様のうちのいずれかと組み合わせることができる。

本発明のより良い理解のために、及びその実施形態がどのように実施され得るかを示すために、ここで実施例を参照するが、これはいかなる方法でも本発明を限定することを意図するものではない。

別段の指示がない限り、実施例に記載の研究に用いられる材料及び方法は、以下のとおりであった。

誘導体及び比較物
表４は、データセットに表されるＩＬ－２２の誘導体及び比較物の概要を提供する。

比較物１～１３及び１９は、様々な骨格、脂肪酸の種類、リンカー及び共有結合部位を有した。多くの場合、リンカーは、誘導体１及び２に従って、残基１Ｃに結合された。比較物１０は、１Ｃでの共有結合を例示するが、誘導体１及び１Ｃで共有結合した脂肪酸を有する他の全ての比較物に存在するＧ－Ｐ－Ｇ Ｎ末端ペプチドを欠く。

更なる比較物は、ｈＩＬ－２２、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２（組換え融合タンパク質）及び比較物１４～１８であり、これらは１つ以上の骨格変異のみを有するｈＩＬ－２２バリアントであった。

以下は、単に特許請求される発明を図示することを意図した例示的なプロトコルである。

実施例１－脂肪一酸を含む誘導体のインビトロ効力研究
方法
レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ及びＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼでトリプルトランスフェクトされたＢＨＫ細胞において効力を研究した。これは、ＩＬ－２２受容体媒介性ＳＴＡＴ３活性化を測定した、高感度、高スループットアッセイである。

安定したレポーターＢＨＫ細胞株を、以下のプラスミドを使用して生成した：（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）におけるｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）におけるＩＬ２２Ｒ、及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０における２ｘＫＺｄｅｌ２。したがって、細胞株は、ｐＳＴＡＴ３駆動プロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現した。

アッセイプロトコルの０日目に、細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、黒色、透明底）中の基底培地（５００ｍＬ：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；アルブミンを含有する）（５０ｍＬ）及び１％（ｗ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍＬ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、プレートを反転させることによって培地を除去した。新鮮な基底培地を１ウェル当たり５０μｌで添加し、細胞を６０分間インキュベートした。

ＩＬ－２２の誘導体を、二つ組で比較物としてｈＩＬ－２２とともに試験した。

したがって、５０μｌの希釈した誘導体または比較物（基底培地中で希釈）を各ウェルに添加し、プレートを４時間放置した。したがって、誘導体及び比較物は、それらがウェル中に既に存在する５０μｌの培地中に希釈されたため、２倍希釈された。１００μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ＋試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を添加することにより、４時間後に刺激を終了した。プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密封し、４５０ｒｐｍで１５分間振盪した後、遅くとも１２時間後までにＭｉｔｈｒａｓまたは同様のシステムを使用して読み取った。

データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。誘導体または比較物の半最大有効濃度（ＥＣ_５０）を、その効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、Ｌｏｇ（化合物）対応答－可変スロープ（４ｐ）を使用して決定した。ヒルスロープを標準として１に制限した。

結果
表５は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイにおいて測定した誘導体及び比較物のＥＣ_５０を示す。「ｎ」は、個々のアッセイ実行の数を示す。全てのアッセイ実行を同じ条件下で実施したが、別々の個々の実験を別々の日に実施した。

ＢＨＫ細胞アッセイが大量のアルブミンを含有したため、測定されたＥＣ_５０は、誘導体を試験するときにアルブミン結合の効果を組み込んだ。

骨格変異及び共有結合したＣ１６一酸を有する誘導体１は、ｈＩＬ－２２と同等の効力を有することが示された。

結論
誘導体１及びｈＩＬ－２２の驚くべき同等の効力が観察された。比較すると、及び前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のＦｃ融合について、インビトロでの効力が３４倍低減したことを報告している。

したがって、ＩＬ－２２の誘導体は、アルブミンの存在下で高い効力を維持する。Ｃｙｓ置換、Ｎ末端トリペプチド伸長及び脂肪一酸共有結合は、明らかに良好に耐容されることを示す。

したがって、データは、本発明の誘導体が良好なバイオアベイラビリティ及び効力を実証するため、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、ＣＮＳ及び皮膚の疾患、障害及び状態を含む多様な範囲の適応症に対して新しく改善された治療を提供することを図示する。

本発明のある特定の特徴が本明細書に図示及び説明されているが、当業者であれば多くの修正及び等価物が思い付くであろう。したがって、特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に含まれる全てのそのような修正及び等価物を網羅することが意図されていることが理解されるべきである。

実施例２－脂肪一酸を含む誘導体及び脂肪二酸を含む比較物の平均滞留時間及び効力の研究
方法
以下では、２つの方法について説明する。１つ目は、平均滞留時間（ＭＲＴ）を決定するためにラットにおいて誘導体１及び比較物１４、８、６及び４で実施された薬物動態研究に関する。２つ目は、同じ誘導体及び比較物についてのインビトロＥＣ_５０（ｎＭ）を決定するための効力アッセイに関する。

ラットにおけるインビボＭＲＴの測定
４匹のラットに誘導体または比較物を投与し、３つの血液試料を、以下：５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の各時点で採取した。各ラットは、研究の過程で１７の試料を採取された。最後の試料を採取した後、ラットを二酸化炭素によって安楽死させた。

血液試料（１００μｌ）を舌血によってラットから採取し、ＥＤＴＡチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＶｅｔＭｅｄ ２００Ｋ３Ｅ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ ｎｒ ０９．１２９３．１００）に移した。採血後２０分以内に、血液を８０００Ｇ、４℃で５分間遠心分離した。血漿試料（４０～５０μｌ）を半マイクロチューブに移した。

誘導体または比較物の血漿レベルを、前述のように社内開発の発光酸素チャネリング（ＬＯＣＩ（登録商標））アッセイを使用して測定した（Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，２００７，１２（２）：２４０－７）。アッセイ中に、濃度依存性ビーズ－分析物－免疫複合体を作製し、光出力をもたらし、これをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで測定した。抗体のビーズへのカップリング、抗体のビオチン化、及びＬＯＣＩ（登録商標）アッセイ手順を、前述のように行った（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１０，５１（１）：２１７－２４）。標準物質及び品質管理（ＱＣ）試料は、研究試料と同じマトリックスにおいて作製した。アッセイ精度（ＣＶ％）を評価し、試験した全ての試料について２０％未満であることが示された。

アッセイは、抗ヒトＩＬ－２２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ７８２２）コンジュゲートアクセプタービーズを、ビオチン化モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＭ７８２１；ヒトＩＬ－２２に対して産生）及び一般的なストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズとともに使用した。ラット血漿中のヒトＩＬ－２２の定量下限（ＬＬＯＱ）は４ｐＭであった。しかしながら、各誘導体または比較物を、同じ誘導体または比較物の標準物質列に対して測定した。ｈＩＬ－２２に対する各誘導体または比較物の交差反応性を測定し、アッセイ感度を調整するために使用した。

ＭＲＴを含む薬物動態パラメータ（すなわち、吸収が完了したら、排出される前に薬物が体内に留まる時間）は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ）を使用して計算した。

ＢＨＫ細胞におけるインビトロＥＣ_５０（ｎＭ）の測定
ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ及びＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼでトリプルトランスフェクトされたＢＨＫ細胞においてレポーター遺伝子アッセイを使用した。これは、ＩＬ－２２受容体媒介性ＳＴＡＴ３活性化を測定した、高感度、高スループットアッセイである。

安定したレポーターＢＨＫ細胞株を、以下のプラスミドを使用して生成した：（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）におけるｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）におけるＩＬ２２Ｒ、及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０における２ｘＫＺｄｅｌ２。したがって、細胞株は、ｐＳＴＡＴ３駆動プロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現した。

アッセイプロトコルの０日目に、細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、黒色、透明底）中の基底培地（５００ｍＬ：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；アルブミンを含有する）（５０ｍＬ）及び１％（ｗ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍＬ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、プレートを反転させることによって培地を除去した。新鮮な基底培地を１ウェル当たり５０μｌで添加し、細胞を６０分間インキュベートした。

誘導体１及び比較物１４、８、６及び４を試験した。アッセイ実行の「ｎ」数は、１～２４の範囲であった。

したがって、５０μｌの誘導体または比較物（基底培地中で希釈）を各ウェルに添加し、プレートを４時間放置した。したがって、誘導体及び比較物は、それらがウェル中に既に存在する５０μｌの培地中に希釈されたため、２倍希釈された。１００μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ＋試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を添加することにより、４時間後に刺激を終了した。プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密封し、４５０ｒｐｍで１５分間振盪した後、遅くとも１２時間後までにＭｉｔｈｒａｓまたは同様のシステムを使用して読み取った。

データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。各誘導体または比較物の半最大有効濃度（ＥＣ_５０）を、その効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、Ｌｏｇ（化合物）対応答－可変スロープ（４ｐ）を使用して決定した。ヒルスロープを標準として１に制限した。

結果
ラットにおける平均滞留時間、ならびに誘導体１及び試験した比較物のインビトロＥＣ_５０を表６に示す。「ｎ」は、個々のアッセイ実行の数を示す。全てのアッセイ実行を同じ条件下で実施したが、別々の個々の実験を別々の日に実施した。

データは、同じ骨格に結合した脂肪酸を一酸から二酸に変更したとき、平均滞留時間がｈＩＬ－２２に対して増加したことを示す（誘導体１と比較物６とのデータを比較する）。二酸の長さを増加させると、平均滞留時間も増加した（比較物８、６及び４のデータを比較する）。

データはまた、一酸の結合が、結合なしと比較して平均滞留時間を増加させるが、二酸の結合（誘導体１及び比較物６のデータを比較する）とは明確に対照的に、効力（誘導体１及び比較物１４のデータを比較する）に悪影響を及ぼさなかったことを示した。

結論
ラットで測定された平均滞留時間を使用して、この比較研究は、脂肪二酸鎖長の増加の影響が、野生型ヒトＩＬ－２２と比較して許容可能な効力の低減を伴う増加した半減期であることを確認した。同様の結果は、ミニブタの研究においても示された（実施例３を参照されたい）。ミニブタ（実施例３）で測定された半減期は、Ｃ１８脂肪二酸が、ＩＬ－２２のためのプロトラクターとして使用されたＦｃ融合物と同様の延長された半減期を有するが、Ｃ１６脂肪二酸は、両方よりも短い半減期を有し、全てが野生型ヒトＩＬ－２２よりもかなり長いことを示した。

ラットの現在のデータセットにおいて、我々は、脂肪一酸の結合により、同じ長さの脂肪二酸と比較して（誘導体１と比較物６とを比較）、実際に平均滞留時間が短くなることを示した。同時に、脂肪一酸脂質化を含む誘導体は、ＩＬ－２２野生型様比較物１４と同じ半減期を維持することが示されたが、平均滞留時間は同じものと比較して少なくとも４倍増加する。

本明細書に提示されるインビボ実施例において、我々はまた、効力の低減と半減期の増加との間のバランスが依然として生物学的効果をもたらし、本発明の誘導体を、薬物開発及び疾患の治療のための適切な候補にすることを示した。

脂肪一酸及び脂肪二酸の結合と長さとの間のこれらの比較データは、試験した全ての脂肪酸結合が、所望の投与または治療される疾患もしくは状態に応じて、異なる薬物開発目的に実際に好適であるという結論をもたらす。したがって、ＩＬ－２２タンパク質の引延手段としての脂肪一酸の最適な使用は、引延作用が所望されるが、二酸及びＦｃ融合物の場合よりも短い循環時間を有する状況であり得る。

実施例３－脂肪二酸を含む比較物の薬物動態研究
方法
ｈＩＬ－２２及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２を含む、マウス（ｎ＝２７）、ラット（ｎ＝４～８）及びミニブタ（ｎ＝２～５）における選択された比較物についての薬物動態研究を実施した。

（ｉ）マウス及びラット
８週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄マウス３０匹及びスプラーグドーリー雄ラット５匹を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。マウスを１０匹の群で収容した。動物を、実験の前に１週間順化させた。投与前に体重を測定したが、これは薬物動態計算に重要である。動物は実験中ずっと覚醒しており、食物及び水にアクセスできた。

全ての比較物を、マウスで使用するためのｐＨ７．４のＰＢＳ中０．３ｍｇ／ｍＬ溶液及びラットで使用するための０．５ｍｇ／ｍＬ溶液として調製した。２．０ｍｇ／ｋｇの用量をマウスで試験した。１ｍｇ／ｋｇの用量をラットで試験した。

比較物を動物に皮下投与した。投与後の特定の時点で血液試料を採取した。

マウスにまばらなサンプリングを使用した。したがって、２７匹のマウスに比較物を投与し、血液試料を以下：５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間及び４８時間の各時点で３匹の異なるマウスから採取した。したがって、各マウスは、研究の過程で２つの試料のみを採取された。最後の試料を採取した後、マウスを頸部脱臼によって安楽死させた。

５匹のラットに比較物を投与し、３つの血液試料を、以下：５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の各時点で採取した。各ラットは、研究の過程で１７の試料を採取された。最後の試料を採取した後、ラットを二酸化炭素によって安楽死させた。

血液試料（１００μｌ）を舌血によってマウス及びラットから採取し、ＥＤＴＡチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＶｅｔＭｅｄ ２００Ｋ３Ｅ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ ｎｒ ０９．１２９３．１００）に移した。採血後２０分以内に、血液を８０００Ｇ、４℃で５分間遠心分離した。血漿試料（４０～５０μｌ）を半マイクロチューブに移した。

（ｉｉ）ミニブタ
体重約１５ｋｇの９ヶ月齢の雌ゲッティンゲンミニブタを、Ｅｌｌｅｇａａｒｄ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇｓ Ａ／Ｓから得た。手術（カテーテルの挿入）の前に約１８日間の順化をさせ、その間にミニブタを社会化し、カテーテルからの皮下投与及び血液サンプリングのために訓練した。手術の３～５日前に、ミニブタを単一収容した。投与の６日前に、全てのミニブタは、２つの中心静脈カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃ－ＴＰＮＳ－６．５－９０－ＲＥＤＯ、シリコン、サイズ６．５フレンチ、１０６ｃｍ長タイプＴＰＮ）を挿入され、研究開始（投与）前の少なくとも５日の手術後の回復時間を可能にした。

全ての比較物を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の溶液として調製した。使用した用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ（静脈内投与）または０．２ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）であった。

投与中にミニブタをプロポフォールで軽く麻酔した。静脈内注射は、長い中央カテーテルを介してミニブタに投与した。投与後、カテーテルを１０ｍＬの滅菌生理食塩水でフラッシュした。２５Ｇの針を使用して、５ｍｍの深さで皮下注射を行った。針は、逆流を避けるために、注射後１０秒間皮膚に留めておいた。

静脈内投与後の以下：１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、２８時間、４８時間、７２時間、９６時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間、３１２時間、３３６時間、３６０時間、３８４時間、４０８時間、４３２時間及び４８０時間の時点でミニブタから血液試料を採取した。皮下投与後の以下：１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、４６時間、５２時間、７２時間、９６時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間、３１２時間、３３６時間、３６０時間、３８４時間、４０８時間、４３２時間及び４８０時間の時点で血液試料を採取した。

血液試料（１ｍＬ）を、ミニブタからＥＤＴＡチューブ（１．６ｍｇのＫ３ＥＤＴＡ／ｍＬの血液を得るためにＫ３ＥＤＴＡを含有する１．３ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））中に収集した。試料を、遠心分離（１０分、４℃、２０００Ｇ）するまで、最大３０分間湿った氷の上に保管した。２００μｌの血漿を、比較物の測定のためにＭｉｃｒｏｎｉｃチューブに移し、分析まで－２０℃で保管した。

（ｉｉｉ）試料処理
比較物の血漿レベルを、前述のように社内開発の発光酸素チャネリング（ＬＯＣＩ（登録商標））アッセイを使用して測定した（Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，２００７，１２（２）：２４０－７）。アッセイ中に、濃度依存性ビーズ－分析物－免疫複合体を作製し、光出力をもたらし、これをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで測定した。抗体のビーズへのカップリング、抗体のビオチン化、及びＬＯＣＩアッセイ手順を、前述のように行った（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１０，５１（１）：２１７－２４）。標準物質及び品質管理（ＱＣ）試料は、研究試料と同じマトリックスにおいて作製した。アッセイ精度（ＣＶ％）を評価し、試験した全ての試料について２０％未満であることが示された。

アッセイは、抗ヒトＩＬ－２２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ７８２２）コンジュゲートアクセプタービーズを、ビオチン化モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＭ７８２１；ヒトＩＬ－２２に対して産生）及び一般的なストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズとともに使用した。ラット血漿中のヒトＩＬ－２２の定量下限（ＬＬＯＱ）は４ｐＭであった。しかしながら、各比較物を、同じ比較物の標準物質列に対して測定した。ｈＩＬ－２２に対する各比較物の交差反応性を測定し、アッセイ感度を調整するために使用した。

血漿濃度－時間プロファイルを、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ）においてノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）を使用して、ミニブタについて測定した。計算は、個々の濃度、１／（Ｙ＊Ｙ）による重み付け、及び線形対数台形を使用して行った。循環排出半減期（Ｔ_１／２）が主要スクリーニングパラメータであったため、静脈内投与を使用した。クリアランス及び分布容積は、目的の二次的なパラメータであり、したがって、研究の１日目に頻繁に血液試料を採取する理由であった。

マウス及びラットにおける薬物動態を評価するために測定された唯一のパラメータは、循環排出半減期（Ｔ_１／２）であった。ミニブタでは、測定された追加のパラメータは、薬物投与後の最大（ピーク）血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）、Ｃ_ｍａｘに達するまでの時間（Ｔ_ｍａｘ）、薬物用量に対して正規化された血漿薬物濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ；薬物の用量の投与後の薬物への実際の身体曝露を反映する）（ＡＵＣ／Ｄ）、平均滞留時間（ＭＲＴ；すなわち、吸収が完了したら、排出される前に薬物が体内に留まる時間）、平均吸収時間（ＭＡＴ）及び投与用量の全身利用可能性（すなわち、バイオアベイラビリティ；Ｆ）であった。ＭＡＴは、皮下投与後のＭＲＴ（ＭＲＴ_ＳＣ）から静脈内投与後のＭＲＴ（ＭＲＴ_ＩＶ）を差し引いたＭＲＴとして計算する。

結果
表７はマウスで得られた結果を示し、表８はラットで得られた結果を示し、表９及び１０はミニブタで得られた結果を示す。ＮＤ＝決定せず。ＩＶ＝静脈内投与。ＳＣ＝皮下投与。

表７に示されるように、骨格変異のみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１４及び１６）は、投与経路にかかわらず、短い循環半減期を有した。Ｆｃ融合による引延（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）は、半減期をかなり増加させた。脂肪酸（Ｃ１８二酸；比較物４及び９）の共有結合は、マウスにおいて中間循環半減期をもたらした。比較物は、静脈内投与と比較して皮下投与された場合、マウスにおいてより長い時間循環した。

表８に示されるように、骨格変異のみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１４）は、短い循環半減期を有した。脂肪酸（比較物４、６及び９）の共有結合は、用いられた脂肪酸（Ｃ１６対Ｃ１８二酸）及び投与経路にかかわらず、ラットにおける循環半減期の増加をもたらした。比較物は、典型的には、静脈内投与と比較して皮下投与された場合、より長い間循環した。

脂肪一酸を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想される。実際、上記のデータから、Ｃ１６またはＣ１８脂肪酸の共有結合は、ラットにおけるより短い脂肪酸鎖と比較して、より長い脂肪酸鎖に対して比較的長い半減期を示し、静脈内投与と比較して皮下投与された場合、循環時間が延長されることが明らかである。脂肪二酸と比較して一般的に半減期が短いにもかかわらず、同じ傾向が一酸で予想され得る。

表９に示すように、骨格変異のみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１４及び１５）は、ｈＩＬ－２２と同等の短い循環半減期を有した。比較物のＦｃ融合物（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）及び他の全ての比較物（比較物４、９及び１３）は、顕著に増加した循環半減期を有した。比較物４、９及び１３は、静脈内に投与された場合、ミニブタにおいて５０時間を超える循環半減期を有し、これは、比較物ＩＬ－２２－Ｆｃ融合物と同等であった。

表１０に示されるように、比較物のＦｃ融合物（ｈＦｃ－ＩＬ－２２）と比較して、比較物９についてより速いＭＡＴが実証された。ＭＡＴは、Ｃ_ｍａｘの違いも考慮に入れるため、Ｔ_ｍａｘを単に比較するよりも薬物取り込みのより正確な尺度である（Ｔ_ｍａｘは、用量及びＣ_ｍａｘの両方の影響を受ける）。ミニブタは、ヒトと類似しているため、マウスまたはラットではなく、この研究に使用された。

結論
既知の脂肪酸アルキル化ＧＬＰ－１誘導体であるセマグルチドは、ミニブタで４６時間の半減期（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１５，５８（１８）７３７０－８０）、及び２のピーク対トラフ比を有する週１回の投与プロファイルに対応する、１６０時間のヒトにおける半減期を有する。Ｆｃ融合ＧＬＰ－１誘導体であるデュラグルチドの半減期は類似している。

したがって、ミニブタにおける比較物４、９及び１３によって実証された、皮下投与された場合には少なくとも４０時間、静脈内投与された場合には５０時間を超える半減期は、２のピーク対トラフ比を有するヒトにおける週１回の投与プロファイルに対応すると仮定される。

したがって、データは、比較物がＩＬ－２２の循環半減期を向上させ、最適化された薬物動態学的及び薬力学的特性を実証し、よって、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、眼、胸腺、膵臓、及び皮膚の疾患、障害及び状態を含む多様な範囲の適応症に対して新しく改善された治療を提供することを示す。

脂肪一酸を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想される。実際、上記のデータセット、ならびに本明細書に開示されるＩＬ－２２バリアントの効力、半減期及び平均滞留時間に関する前述及び以下の実施例から、脂肪二酸結合を含むＩＬ－２２タンパク質と比較して、脂肪一酸結合についての同様の生物学的効果が、本明細書に提示される脂肪二酸の結果と比較して一般的に半減期が短く、効力が高いにもかかわらず、期待され得ることが妥当であるとされている。これは、引延作用が所望されるが、二酸及びＦｃ融合物よりも循環時間が短い状況で特に望ましい場合がある。

実施例４－脂肪二酸を含む比較物のインビトロ効力研究
方法
２つのインビトロアッセイを用いて、配列番号１と比較して修飾を伴うＩＬ－２２タンパク質の効力を研究した。

１つ目は、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ及びＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼでトリプルトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるレポーター遺伝子アッセイであった。これは、ＩＬ－２２受容体媒介性ＳＴＡＴ３活性化を測定した、高感度、高スループットアッセイである。

安定したレポーターＢＨＫ細胞株を、以下のプラスミドを使用して生成した：（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）におけるｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）におけるＩＬ２２Ｒ、及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０における２ｘＫＺｄｅｌ２。したがって、細胞株は、ｐＳＴＡＴ３駆動プロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現した。

アッセイプロトコルの０日目に、細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、黒色、透明底）中の基底培地（５００ｍＬ：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；アルブミンを含有する）（５０ｍＬ）及び１％（ｗ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍＬ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、プレートを反転させることによって培地を除去した。新鮮な基底培地を１ウェル当たり５０μｌで添加し、細胞を６０分間インキュベートした。

比較物４、６、７及び９～１３を、比較物として骨格変異のみを有するｈＩＬ－２２及びｈＩＬ－２２バリアントとともに試験した。アッセイ実行の「ｎ」数は、１～２４の範囲であった。

したがって、５０μｌの比較物（基底培地中で希釈）を各ウェルに添加し、プレートを４時間放置した。したがって、比較物は、それらがウェル中に既に存在する５０μｌの培地中に希釈されたため、２倍希釈された。１００μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ＋試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を添加することにより、４時間後に刺激を終了した。プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密封し、４５０ｒｐｍで１５分間振盪した後、遅くとも１２時間後までにＭｉｔｈｒａｓまたは同様のシステムを使用して読み取った。

データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。各比較物の半最大有効濃度（ＥＣ_５０）を、その効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、Ｌｏｇ（化合物）対応答－可変スロープ（４ｐ）を使用して決定した。ヒルスロープを標準として１に制限した。

２つ目のインビトロ効力アッセイは、ＩＬ－２２Ｒａ及びＩＬ－１０Ｒｂを内因的に発現するヒト肝臓由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞におけるｐＳＴＡＴ３を測定した。

１日目に、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ ＃３５－４４０７ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に２５，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種した。播種及び継代に使用した細胞培地は ＤＭＥＭ（１ｘ）＋２５ｍＭ（４．５ｇ／ｌ）グルコース、－ピルビン酸塩（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１９６５－０２６）＋１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ＋１％（ｗ／ｖ）Ｐ／Ｓであった。２日目に、細胞はアッセイの準備ができていた。細胞を、ＤＭＥＭ＝Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１９６５－０２６）中０．１％（ｗ／ｖ）のＦＣＳ（すなわち、非常に低いアルブミン濃度）で飢餓状態にし、各ウェルに５０μｌを添加し、６０分間放置した。

標準として各比較物の７つの濃度（０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭ）で、技術的二つ組を使用して試験を行った。したがって、５０μｌの希釈した比較物（ＤＭＥＭ中０．１％（ｗ／ｖ）のＦＣＳで希釈）を各ウェルに添加し、プレートを１５分間放置した。したがって、比較物は、それらがウェル中に既に存在する５０μｌの培地中に希釈されたため、２倍希釈された。細胞を溶解するために、培地を細胞から除去し、新たに調製した５０μｌの１×溶解緩衝液（キットからのＳｕｒｅＦｉｒｅ溶解緩衝液）を各ウェルに添加した。プレートを３５０ｒｐｍで室温で１０分間攪拌した。

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ＳＴＡＴ３（ｐ－Ｔｙｒ７０５）アッセイプロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＴＧＲＳ３Ｓ＝５００－１０Ｋ－５０Ｋ））に従い、ＳＴＡＴ３のＩＬ－２２誘導リン酸化を測定した。この点に関して、４μｌの溶解物を、アッセイのために３８４ウェルプロキシプレートに移した（４μｌの陽性対照及び陰性対照を添加した）。使用直前に、アクセプターミックスを調製した（反応緩衝液中で活性化緩衝液を５倍に希釈し、希釈した緩衝液中のアクセプタービーズを５０倍に希釈することにより）。５μｌのアクセプターミックスを各ウェルに添加し、プレートをＴｏｐｓｅａｌ Ａ接着フィルムで密封し、室温で２時間インキュベートした。使用直前に、ドナーミックスを調製した（希釈緩衝液中でドナービーズを２０倍に希釈することにより）。２μｌのドナーミックスを、薄明りの下でウェルに添加した。プレートを再びＴｏｐｓｅａｌ Ａ接着フィルムで密封し、室温で２時間インキュベートした。プレートをＡｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙと互換性のあるプレートリーダーで読み取った。

データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。まず、非線形回帰を、ＰｒｉｓｍにおけるＬｏｇ（化合物）対応答可変スロープ（４ｐ）分析を使用して実施した。ヒルスロープを１に制限した。次いで、Ｙ＝対照化合物（ｈＩＬ－２２）からの上位をＰｒｉｓｍにおいて正規化に使用した。０％を各データセットの最小値に設定し、１００％をＹ＝上記の非線形回帰からの上位に設定した（対照について）。非線形回帰を上記のように繰り返し、試験した比較物の活性％／重量％及びＥＣ_５０を、それぞれ上位及びＥＣ_５０下の結果で読み取った。

結果
表１１は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイにおいて測定した主要比較物のＥＣ_５０を示す。

ＢＨＫ細胞アッセイが大量のアルブミンを含有したため、測定されたＥＣ_５０は、比較物を試験するときにアルブミン結合の効果を組み込んだ。

骨格変異のみを有するＩＬ－２２バリアントである比較物１７は、ｈＩＬ－２２と同等の効力を有することが示された。比較物１７と同じ骨格を有するが、中程度の親和性のアルブミン結合剤（Ｃ１６二酸）に共有結合した比較物６は、ｈＩＬ－２２と比較して４倍の効力の低減を示した。この場合もやはり同じ骨格を有するが、高い親和性のアルブミン結合剤（Ｃ１８二酸）に共有結合した比較物４は、ｈＩＬ－２２と比較して７倍のみの効力の低減を示した。

アルキル化位置及び骨格変異の走査は、比較物９～１２の結果を比較することによって、３５Ｑ、６４Ｑバックグラウンド（すなわち、３つのＩＬ－２２グリコシル化部位のうちの２つが変異した）においてオフセットで行われた。これらの比較物で得られた結果は、Ｃｙｓ置換及び脂肪酸共有結合がいくつかの（選択された）位置で耐容され得ることを実証し、これは本発明者らにとって驚くべきことであった。

脂肪一酸を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想される。実際、本明細書に開示されるＩＬ－２２バリアントの効力、半減期及び平均滞留時間に関する上記のデータセットならびに前述及び以下の実施例から、脂肪二酸の代わりに、脂肪一酸を含むＩＬ－２２誘導体について、Ｃｙｓ置換及び脂肪酸共有結合がいくつかの（選択）位置で耐容され得ることが妥当であるとされている。

表１２は、ｐＳＴＡＴ３のＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいて測定された主要比較物のＥＣ_５０を示す。

受容体の内因性発現レベル、ほとんどシグナル増幅がない、及びアルブミンがないＨｅｐＧ２細胞アッセイでは、比較物４は、ｈＩＬ－２２と比較して２．５倍低減した効力を有した（比較物４と同じ骨格を有するが脂肪酸を有しないｈＩＬ－２２バリアントである比較物１７と同様）。

表１３は、Ｎ末端伸長及びグリコシル化部位の変異における脂肪酸共有結合を評価するためのＢＨＫ及びＨｅｐＧ２細胞アッセイの両方からの結果を照合する。ＮＤ＝決定せず。

比較物９は、追加のＮ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ置換（３つのグリコシル化部位のうちの２つが変異した）により比較物４と異なるが、それらは同等の効力である（比較物９についてはわずかに効力が低くなる傾向がある）。

脂肪一酸結合を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想される。実際、これら２つの置換、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑの効果は、脂肪一酸を含む誘導体において同様の効果を有すると予想される。

比較物５及び７は、１５量体のＮ末端伸長を有し、伸長部（－７Ｃ）の脂肪酸結合のためのＣｙｓ残基を有するが、これは驚くべきことに良好に耐容されることが示されている。

この場合もやはり、脂肪一酸結合を含む本発明の誘導体に適用されるＮ末端伸長の同様の効果が予想され得る。上記のデータセットならびに本明細書に開示されるＩＬ－２２バリアントの効力、半減期及び平均滞留時間に関する前述の及び以下の実施例に基づいて、脂肪一酸結合を含む誘導体についても同様の結果が実際に予想されるが、一般的に、脂肪二酸結果と比較して半減期が短く、効力が高い。

結論
試験した比較物において脂肪酸共有結合で観察された効力の低減は、主にアルブミン結合によって駆動され、骨格置換はほとんど寄与しなかった。これは、比較物１７及びｈＩＬ－２２の驚くべき同等の効力により実証された。比較すると、及び前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のＦｃ融合について、インビトロでの効力が３４倍低減したことを報告している。

非常に低いアルブミンレベルを用いたＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいて、比較物４（ＢＨＫアッセイ（アルブミン結合を有するにおいて７倍の効力の低減を示した比較物）は、ｈＩＬ－２２と比較して効力の２．５倍の低減のみを示した。

比較物４及び９の同等の効力（表１３）は、３５Ｑ及び６４Ｑ変異が、効力に影響を及ぼすことなく驚くほど耐容されることを示した。

したがって、比較物は、アルブミンの存在下で高い効力を維持し、アルブミンの不在下でｈＩＬ－２２とほぼ同等の効力である。Ｃｙｓ置換及び脂肪酸共有結合は、いくつかの位置で耐容される。

したがって、データは、比較物が良好なバイオアベイラビリティ及び効力を実証するため、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓及び皮膚の疾患、障害及び状態を含む多様な範囲の適応症に対して新しく改善された治療を提供することを示す。上記のように、代わりに脂肪一酸を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想される。

実施例５－脂肪二酸を含む比較物の糖尿病におけるインビボ有効性研究
この研究は、糖尿病マウスモデルにおいて、本発明の誘導体の比較物を８～１６日間１日１回投与する効果を調査するように設計された。研究は、治療（予防ではない）様式で行われ、これは、投与が開始される前に糖尿病病理が発症したことを意味する。マウスモデルは脂肪肝（レプチン受容体ノックアウト）を有するため、肝疾患の代謝モデルとしても機能する。

方法
７～８週齢の雄Ｃ５７ＢＫＳ ｄｂ／ｄｂマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（－１０日目）から得、実験開始の少なくとも１週間前に順化させた。到着の１週間後（－３日目）、マウスを無作為化し、１０匹の群（または食物摂取研究のために単独で）で収容した。－３日目、及び研究の１～１６日目の各日に、血中グルコース及び食物摂取量を測定した。

比較物４を、更なる比較物としてＩＬ－２２のＦｃ融合物（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）及び陰性対照としてビヒクルのみとともに試験した。各薬剤を、糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウス（各群でｎ＝６～１０）において、１～１６日目の各日に、０．１、０．２５、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇの１日１回用量で皮下投与した。食物摂取量は、比較物／対照投与後に低減した。

血中グルコースは、研究期間にわたって毎日測定された。麻酔したマウスにおいて、終了時に眼血液試料を採取した。５００μｌの血液をＥＤＴＡチューブに収集した。試料を氷上に保管し、２０分以内に６０００Ｇで、４℃で５分間遠心分離した。血漿を０．７５ｍＬのマイクロチューブに分離し、構成要素濃度の後の測定のために直ちに凍結した。

比較物の濃度の測定と同様に、標的関与バイオマーカー（肝臓由来急性期タンパク質、ハプトグロビン及び血清アミロイドＰ構成要素（ＳＡＰ）、ならびに腸由来ペプチドＹＹ（ＰＹＹ））の血漿レベルを研究終了時に測定した。ハプトグロビンを、製造業者の指示に従って市販キットを使用してＣＯＢＡＳ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定した。ＰＹＹを、製造業者の指示に従って、マウス及びラットＰＹＹを認識する市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＡＬＰＣＯ）で測定した。ＳＡＰを、製造業者の指示に従って、マウスペントラキシン２／ＳＡＰを認識する市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。

結果
研究期間中の血中グルコースレベルを図８及び９Ａに示す。

図８から分かるように、ｈＩＬ－２２及び骨格変異のみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１６）は、ビヒクル対照と比較して、研究の経過にわたって血中グルコースを低減することができなかった。

図９Ａから分かるように、比較物４及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の両方は、特定の研究におけるより高い定常状態曝露レベルを反映するｈＦｃ－ｈＩＬ－２２のより高い標的関与にもかかわらず、研究の最終日に比較物４のわずかに高い有効性を有する正常レベルに向かって同等の方法で血中グルコースを低減した。ビヒクル対照と比較して、処置動物において食物摂取量の低減が観察された（図９Ｂを参照）。したがって、比較物４は、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と同様にｄｂ／ｄｂモデルにおいて血中グルコースを正常化した。上記のように、ｈＩＬ－２２または比較物１６では、そのような効果は観察されなかった。

研究終了時に測定された標的関与バイオマーカー、ハプトグロビン、ＳＡＰ及びＰＹＹのレベルをそれぞれ図１０Ａ～Ｃに示す。グラフから分かるように、３つの標的関与バイオマーカーは全て、比較物４及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によって上方制御され、比較物４よりもｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によって上方制御された。

図１１は、比較物９の用量応答データを示す（比較物４と同じであるが、２つのグリコシル化部位における追加の置換についてである）。試験した３つの用量（０．１、０．２５及び０．５ｍ／ｋｇ）は全て、経時的に血中グルコースを低減するのに有効であり、濃度の増加に伴って漸進的に低減した。

結論
試験した比較物及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の両方が、ｄｂ／ｄｂモデルにおいて血中グルコースを正常化し、それによりインビボ治療効果を実証した。重要なことに、ｈＩＬ－２２の投与ではそのような効果は見られず、長時間作用型比較物及びＦｃ融合物で得られた慢性曝露が治療効果に必要であることが実証された。抗糖尿病効果の作用様式はまだ完全には解明されていないが、肝臓に対するＩＬ－２２の効果（肝臓糖新生及び脂肪生成）が主要な寄与因子であると考えられている。

食物摂取量もまた、比較物４による処置により低減することが示され、したがって、肥満処置としての有効性を実証した。

標的関与バイオマーカーも、比較物及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によって上方制御されることが観察された。ｄｂ／ｄｂマウスで測定される特定のバイオマーカーは、ヒトに置き換えられることが知られている。

ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２を皮下投与した場合の循環半減期（Ｔ_１／２）が、特にマウスにおいて、比較物４よりも高いことに留意することが重要である（Ｔ_１／２はそれぞれ２０時間及び８時間である；表７を参照されたい）。したがって、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の曝露は定常状態でより高い。これは、標的関与バイオマーカー（ハプトグロビン、ＳＡＰ及びＰＹＹ）が、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２群において、示される実験において、それ自体より高い標的関与を示す比較物４群（図１０）よりも高かったという観察によって更に裏付けられる。したがって、より高い曝露及び標的関与にもかかわらず、１６日間の投与研究の最後の３日間において、Ｆｃ融合物（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）の有効性は、比較物４と比較して劣っていた。したがって、データは、比較物４が、糖尿病及び肝疾患のマウスモデルにおいて良好な治療有効性を実証することを示す。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて測定された特定のバイオマーカーはヒトに置き換えられることが知られているため、そのような治療有効性も置き換えられると予測するのが妥当である。この場合もやはり、代わりに脂肪一酸を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想され得る。

実施例６－脂肪二酸を含む比較物の肝損傷（ｉ）におけるインビボ有効性研究
この研究は、肝損傷マウスモデルにおいて、本発明の誘導体の比較物を投与する効果を調査するように設計された。研究は予防様式で行われ、これは、肝損傷は投与が開始された後にのみ誘導されたことを意味する。

方法
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｒｊマウスを得、研究開始前に１週間順化させた。肝損傷は、単回腹腔内用量（３００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍＬ／ｋｇ）のＡＰＡＰで誘導した。比較物４及び９を、ビヒクル対照（ｎ＝５～１０）とともに、ＡＰＡＰ投与の２時間前に１．５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。研究は、ＡＰＡＰ投与の２４時間後に終了した。血漿アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の測定のために、最後の出血を確保した。

血液試料をヘパリン処理チューブに収集し、血漿を分離し、分析まで－８０℃で保管した。ＡＬＴ及びＡＳＴを、製造業者の指示に従ってＣＯＢＡＳ ｃ５０１自動分析器で市販のキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して測定した。

肝臓を、組織学的分析のためにホルマリン固定及びパラフィン包埋に供した。

増殖をｋｉ６７免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって測定した。ＩＨＣ陽性染色を、ＶＩＳソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した画像分析によって定量化した。

アポトーシスを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイにおいて測定した。要約すると、パラフィン包埋切片を有するスライドをキシレン中で脱パラフィン処理し、一連の段階的なエタノールで再水和した。スライドをプロテイナーゼＫで前処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を過酸化水素で遮断した。ＴＵＮＥＬ混合物（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＰＯＤ，Ｒｏｃｈｅ）をスライドに添加し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）による増幅及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）による可視化を行った。最後に、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、カバースリップした。

結果
研究の終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルをそれぞれ図１２Ａ及び１２Ｂに示す。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、ビヒクル／ＡＰＡＰ対照と比較して、肝損傷前に比較物４または９で処置したマウスにおいて顕著に低減することが示された。

研究の終了時のＴＵＮＥＬ－及びｋｉ６７陽性細胞の数をそれぞれ図１３Ａ及び１３Ｂに示す。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の量は、ビヒクル／ ＡＰＡＰ対照と比較して、肝損傷の前に比較物４または９で処置したマウスにおいて（顕著に）低減した。ｋｉ６７陽性細胞の量は、ＡＰＡＰ処置群にわたって同等であった。

結論
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝損傷の指標として使用される肝臓酵素である。したがって、比較物４及び９は、ＡＰＡＰによって誘導される損傷から肝臓を保護することが示された。同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、本明細書に開示される他の比較物及び実際に誘導体からの同様の効果を予想することは合理的である。

ＴＵＮＥＬアッセイの結果は、比較物４及び９が、ビヒクル／ＡＰＡＰ対照と比較して、肝損傷によって引き起こされるアポトーシスから保護したことを示した。しかしながら、細胞増殖は、これらの比較物の影響を受けなかった。増殖は、損傷に対する応答として（対照に見られるように）生理学的に上方制御されたため、結果は、損傷の低減としての比較物４及び９の増殖作用の後に増殖の低減が続かないことを実証する（損傷に対する増殖の比率は増加する）。

したがって、データは、比較物がマウスモデルにおいて肝損傷からの保護において良好な有効性を実証することを示す。マウスにおいて測定された特定のバイオマーカーは、ヒトに置き換えられることが知られているため、観察された保護も置き換えられると予測することは合理的である。この場合もやはり、代わりに脂肪一酸を含む本発明の誘導体についても同様の結果が予想され得る。

実施例７－脂肪二酸を含む比較物の肝損傷におけるインビボ有効性研究
この研究は、肺損傷ラットモデルにおいて、本発明の誘導体の比較物を投与する効果を調査するように設計された。研究は、予防様式及び治療様式の両方で行われ、これは、投与が肺損傷が誘導される前に開始され、その後継続されたことを意味する。

方法
肺損傷を誘導するために、１日目に、１００μｌのブレオマイシンを単回用量として中咽頭吸引により雄スプラーグドーリーラットの肺に投与した（群２～６）。生理食塩水を陰性対照（群１）として投与した。

群３、４及び５の動物に、－１日目～３日目に、それぞれ０．５、１．５または４．５ｍｇ／ｋｇの比較物９を１日１回（皮下注射により）投与した。群６の動物に、－１日目～３日目に、１日１回、１０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンを（経口強制摂食により）投与した。

ラットからの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の可溶性コラーゲンを測定するために、肺を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した滅菌ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなし）で洗浄し（３×４ｍＬ）、動物ごとの洗浄液を１つのチューブに入れた。可溶性コラーゲンアッセイＳｉｒｃｏｌ Ｓ１０００（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、可溶性コラーゲンをＢＡＬＦ上清において測定した。

全ての動物を、４日目（終了安楽死）に剖検のために提出した。全ての動物から組織病理学的検査のために右肺を収集し、１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で膨張固定した後、ＮＢＦに浸漬固定した。３つの平行な縦断面を右尾肺葉からトリミングし、カセット０１に取り付けた。右頭蓋葉、中葉及び副肺葉も長手方向に切断し、カセット０２に取り付けた。

各カセットから２つのスライドを作製した。一方のスライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、他方のスライドをヘマトキシリン及びピクロシリウスレッド（Ｈ＆ＰＳＲ）で染色した。

次に、各スライドに、乱数ジェネレータを使用して乱数を割り当てた。検索表をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに記録し、スライド評価後にコピーを研究病理学者に提供した。したがって、肺当たり６つの切片を盲検で読み取った。

次いで、獣医病理学者は、炎症の重症度について各Ｈ＆Ｅ染色スライド上の各切片をスコア化した（０＝不在、１＝最小、２＝軽度、３＝中等度及び４＝重度）。群当たりの平均及び中央値スコアを計算した。病理学者はまた、線維症の重症度について、各Ｈ＆ＰＳＲ染色スライド上の各切片をスコア化した（０＝低～８＝高の改変アシュクロフトスコアを使用する）。群当たりの平均スコア及びスコア中央値を計算し、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ事後試験分析を行った。

結果
顕微鏡所見の概要を表１４に示し、各群の炎症及び線維症の平均スコア及びスコア中央値を明らかにする。

表１４の群１及び２を比較することによって証明されるように、ブレオマイシンは、ラットモデルにおいて肺の炎症及び線維症の両方を誘導した。平均スコア及びスコア中央値は、群３～５、すなわち、比較物９で処置したラットにおいて低かった。これらの低スコアは、プレドニゾロンで処置したラット（群６）で見られたものと同等であった。

研究における各動物の炎症及び線維化スコアの中央値も、それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂに示される。

図１４Ａに図示するように、陰性対照（群１）と比較して、ブレオマイシン／ビヒクル対照（群２）において、群の炎症スコア中央値が増加した。群の炎症スコア中央値は、ブレオマイシン／ビヒクル対照と比較して、比較物９（高用量群５で顕著に減少した）及びプレドニゾロン（群６）で処置したラットにおいて減少した。

図１４Ｂに図示するように、陰性対照（群１）と比較して、ブレオマイシン／ビヒクル対照（群２）において、群の線維症スコア中央値が増加した。しかしながら、群の線維症スコア中央値は、対照プレドニゾロンではなく、ブレオマイシン／ビヒクル対照と比較して、比較物９で処置したラットにおいて減少した（高用量群５で顕著に減少した）。

図１４Ｃに図示するように、ブレオマイシン誘導肺損傷後のＢＡＬＦ中の可溶性コラーゲンの量は、陰性対照（群１）と比較して、ブレオマイシン／ビヒクル対照（群２）において増加し、これは、プレドニゾロンによる処置（群６）により低減しなかった。しかしながら、ブレオマイシン／ビヒクル対照と比較して、比較物９で処置したラットからのＢＡＬＦにおいて（試験した全ての用量にわたって）、可溶性コラーゲンの量の顕著な低減が観察された。ＢＡＬＦ中の可溶性コラーゲンは線維症についての読み出しであるため、これらの結果は、直前に報告された組織学的データを確認する。

結論
顕微鏡研究の結果は、本発明の誘導体の比較物が、ラットモデルにおいて、ブレオマイシン誘導肺炎症及び線維症を予防及び／または低減することができることを示した。炎症に関して見られた効果は、肺の炎症の治療で知られているコルチコステロイドであるプレドニゾロンで観察された効果と同等であった。しかしながら、比較物は、線維症に対して独自の作用を有し、プレドニゾロンでは見られなかった。同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、本明細書に開示される他の比較物及び実際に誘導体からの同様の効果を予想することは合理的である。

実施例８－脂肪二酸を含む比較物の大腸炎におけるインビボ有効性研究
この研究は、大腸炎マウスモデルにおいて、本発明の誘導体の比較物を用いて投与する効果を調査するように設計された。研究は、予防様式及び治療様式の両方で行われ、これは、投与が結腸炎症が誘導されたのと同じ日に開始され、その後継続されたことを意味する。

方法
固形飼料を与えられた雌Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウスを、体重に基づいて５つの群（群当たりｎ＝８）に無作為化した。ＤＳＳを使用して、５つのうちの４つの群で大腸炎を誘導した。これらのマウスは、研究０日目～６日目の７日間、飲料水においてＤＳＳを与えられた。第５の群では、動物は、ＤＳＳなしで水を与えられ、したがって、健康な対照として機能した。研究０日目から、ＤＳＳマウスを、ビヒクル、比較物９（０．３５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与）、または比較物としてのＩＬ－２２－Ｆｃ融合物（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２；０．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与）で１日１回、１０日間処置した。体重、食物及び水分摂取量を毎日モニタリングした。

研究１０日目に、血液試料をマウスからＥＤＴＡチューブに収集し、血漿を分離し、分析まで－８０℃で保管した。製造業者の指示に従って、再生島由来タンパク質３ガンマ（Ｒｅｇ３ｇ）をＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ）を使用して二つ組で測定した。Ｒｅｇ３ｇは、ＩＬ－２２の標的関与マーカーである。

終了時に、立体解析学的分析のために腸を除去した。したがって、腸を氷冷生理食塩水で洗い流し、その内容物をサンプリングする前に穏やかに除去した。

腸を一晩ホルマリン（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＶＩＰ）に浸潤し、続いてパラフィンのブロックに包埋した。次に、系統的均一無作為サンプリング（ＳＵＲＳ）原理を使用して、ホルマリン固定腸を近位から遠位方向にサンプリングし、合計４つのスラブを得て、多重カセットに配置した。全ての組織スラブを、個々のスラブの同定が後の段階で可能であるような方法で配置した。パラフィンブロックをトリミングし、５μｍの上部を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ＋オブジェクトグラスに取り付けた。大腸については、上部まで５００μｍの距離で別の切片を切断し、各動物から合計８つの結腸切片を得た。

結腸炎症容積は、立体解析学的に、すなわち、結腸の二次元断面の三次元解釈を使用して測定した。立体容積の推定は、走査されたＨ＆Ｅ染色スライド上で、ｎｅｗＣＡＳＴシステム（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ）を使用して行った。総腸容積、粘膜の容積、粘膜下及び筋肉の容積、ならびに炎症組織の容積を、適切なサイズのグリッドシステムを使用してポイントカウントすることによって推定し、目的の構造に当たる全てのポイントがカウントされた。目的の構造に当たるポイントの数は、以下の数学的関係に従って容積に変換された：
式中、Ａ（ｐ）はポイント当たりの面積、ｐは目的の構造に当たるポイントの総数、ｔは断面間の距離である。群当たりの平均炎症容積を計算し、統計分析に供した。

結腸形態も、Ｈ＆Ｅ染色スライドを見ることによって終了時に評価した。

結果
結腸炎症容積を図１５に示す。ビヒクル対照（ＤＳＳも含有する）と比較して、いずれかの用量で比較物９で処置したマウスにおいて、炎症が予防されることが示された。特に、処置群について健康な対照（ＤＳＳを含まないビヒクル）と同じである結腸炎症容積から明らかなように、炎症は、比較物９で処置された群において正常レベルに留まった。同じことが、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で処置した群にも当てはまった。

終了時の結腸形態の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を図１６に示す。ＤＳＳ処置後、ビヒクル処置された動物（黒い矢印でマークされる）では粘膜上皮創傷を見ることができるが、いずれかの用量での比較物９またはｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で処置された動物においては見られない。これは、上皮組織に対する保護効果を実証する。

血漿Ｒｅｇ３ｇレベルを図１７に示す。ＤＳＳ処置は、基底Ｒｅｇ３ｇレベルの増加を誘導した（ビヒクルをＤＳＳなしビヒクルと比較する）。低用量（０．３５ｍｇ／ｋｇ）の比較物９群では更なる増加は検出されなかったが、高用量（１ｍｇ／ｋｇ）の比較物９群及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２群では見られた。比較物９（１ｍｇ／ｋｇ）群と比較して、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２（０．５ｍｇ／ｋｇ）群におけるより高いＲｅｇ３ｇレベルは、より低い用量にもかかわらずより高い標的関与を示し、これは、マウスにおけるｈＦｃ－ｈＩＬ－２２のより長い半減期（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２については３０時間のＴ１／２対比較物９については９．１時間のＴ１／２）に関連している可能性が高い。

結論
したがって、データは、本発明の誘導体の比較物が、マウスモデルにおける大腸炎及び粘膜上皮創傷からの保護において良好な有効性を実証することを示す。これは、腸の疾患、障害及び状態に対する新しい改善された治療が発見されたことを示す。特に、この所見は、炎症性腸疾患などの粘膜上皮損傷を特徴とする疾患を治療する可能性を実証する。同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、本明細書に開示される他の比較物及び実際に誘導体からの同様の効果を予想することは合理的である。

実施例９－脂肪二酸を含む比較物の肝損傷（ｉｉ）におけるインビボ有効性研究
この研究は、第２の肝損傷マウスモデル（第１のものは、実施例６で上述されている）において、本発明の誘導体の比較物を投与する効果を調査するように設計された。研究は予防様式で行われ、これは、肝損傷は投与が開始された後にのみ誘導されたことを意味する。

方法
Ｃ５７Ｂｌ６／６ｊ雄マウスを５つの群に分けた（群当たりｎ＝８）。比較物４を、ＣｏｎＡ処置と比較して－２６時間及び－２時間で、５つの群のうちの２つにおいて１ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。別の２つの群は、これらの時点でのみビヒクルを受けた。ＣｏｎＡを、３０秒間にわたって１５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内ボーラスとして４群全てに投与し、肝損傷を誘導した。第５の群は、健康な対照として、ＣｏｎＡ（上記のようにビヒクルのみ）を投与しなかった。

ＣｏｎＡ注射の８または２４時間後、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、最大量の血液を心臓穿刺（血餅活性化剤を含有するポリプロピレン血清ゲルチューブを使用して）により採取した。処置を受けていないマウス（群５）を８時間の時点で屠殺した。血液を、チューブを数回反転させることによって、各チューブ内の凝固活性化剤と混合した。チューブを室温で１５分間維持し、次いで２０００ｇで、４℃で１０分間遠心分離した。ＡＬＴ及びＡＳＴを、製造業者の指示に従って自動化システム（Ｋｏｎｅｌａｂ ２０）を使用して血清試料において測定した。

結果
研究の終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルをそれぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示す。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、試験した両方の時点で、ビヒクル／ＣｏｎＡ対照と比較して、肝損傷前に比較物４で処置したマウスにおいて低減することが示された。

結論
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝損傷の指標として使用される肝臓酵素である。したがって、比較物４は、実施例６でＡＰＡＰによって誘導された損傷から保護されたのと同様に、ＣｏｎＡによって誘導された損傷から肝臓を保護することが示された。マウスにおいて測定された特定のバイオマーカーはヒトに置き換えられることが知られているため、観察された保護も置き換えられるだろうと予測するのが妥当である。同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、本明細書に開示される他の比較物及び実際に誘導体からの同様の効果を予想することは合理的である。

実施例１０－Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃ修飾を有する比較物のインビトロ効力研究
方法
レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ及びＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼでトリプルトランスフェクトされたＢＨＫ細胞において効力を研究した。これは、ＩＬ－２２受容体媒介性ＳＴＡＴ３活性化を測定した、高感度、高スループットアッセイである。

安定したレポーターＢＨＫ細胞株を、以下のプラスミドを使用して生成した：（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）におけるｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）におけるＩＬ２２Ｒ、及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０における２ｘＫＺｄｅｌ２。したがって、細胞株は、ｐＳＴＡＴ３駆動プロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現した。

アッセイプロトコルの０日目に、細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、黒色、透明底）中の基底培地（５００ｍＬ：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；アルブミンを含有する）（５０ｍＬ）及び１％（ｗ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍＬ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、プレートを反転させることによって培地を除去した。新鮮な基底培地を１ウェル当たり５０μｌで添加し、細胞を６０分間インキュベートした。

比較物１及び２を、更なる比較物としてｈＩＬ－２２とともに二つ組で試験した。

したがって、５０μｌの希釈した比較物（基底培地中で希釈）を各ウェルに添加し、プレートを４時間放置した。したがって、比較物は、それらがウェル中に既に存在する５０μｌの培地中に希釈されたため、２倍希釈された。１００μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ＋試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を添加することにより、４時間後に刺激を終了した。プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密封し、４５０ｒｐｍで１５分間振盪した後、遅くとも１２時間後までにＭｉｔｈｒａｓまたは同様のシステムを使用して読み取った。

データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。各比較物の半最大有効濃度（ＥＣ_５０）を、その効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、Ｌｏｇ（化合物）対応答－可変スロープ（４ｐ）を使用して決定した。ヒルスロープを標準として１に制限した。

結果
表１５は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイにおいて測定された比較物のＥＣ_５０を示す。

ＢＨＫ細胞アッセイが大量のアルブミンを含有したため、測定されたＥＣ_５０は、比較物を試験するときにアルブミン結合の効果を組み込んだ。

アルブミンが存在するＢＨＫ細胞アッセイにおいて、比較物１は、ｈＩＬ－２２と比較して３倍低減した効力を有し、比較物２は、ｈＩＬ－２２と比較して５倍低減した効力を有した。

結論
培地中にアルブミンを含むＢＨＫ細胞アッセイでは、比較物１及び２は、ｈＩＬ－２２と比較して、効力の３倍または５倍の低減のみを示した。比較すると、及び前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のＦｃ融合について、インビトロでの効力が３４倍低減したことを報告している。

したがって、ＩＬ－２２の誘導体の比較物は、アルブミンの存在下であってもｈＩＬ－２２と効力が同様である。Ｃｙｓ及びＧｌｎ置換ならびに脂肪酸共有結合は、異なる位置で耐容される。実際、本発明者らは、Ｃｙｓに置換された天然アミノ酸を有する残基９５及び１０６へのコンジュゲーションが、ＩＬ－２２タンパク質の活性に対して影響が最小限であることを示し、したがって、特に魅力的なコンジュゲーション部位とみなされる。天然アミノ酸は、Ｒ９５及びＬ１０６である。同様の効力及び半減期を強調する膨大な量のデータに基づいて、本明細書に例示される脂肪二酸結合の代わりに脂肪一酸結合を有する本明細書に開示される本発明の誘導体から同様の効果を予想することは合理的であるが、半減期は、ｈＩＬ－２２と比較して短く、効力があまり低減しないと予想される。

実施例１１－Ｒ９５ＣまたはＬ１０６Ｃ修飾を有する比較物のインビトロ効力研究
方法
これらの実験は、異なる実験室で行ったため、実施例１０には含まれなかった。使用されたアッセイは同じであったが、当業者は、装置及び試料の取り扱いが実験から抽出された値に影響を与える可能性があることを理解するであろう。

レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ及びＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼでトリプルトランスフェクトされたＢＨＫ細胞において効力を研究した。これは、ＩＬ－２２受容体媒介性ＳＴＡＴ３活性化を測定した、高感度、高スループットアッセイである。

安定したレポーターＢＨＫ細胞株を、以下のプラスミドを使用して生成した：（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）におけるｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）におけるＩＬ２２Ｒ、及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０における２ｘＫＺｄｅｌ２。したがって、細胞株は、ｐＳＴＡＴ３駆動プロモーターの制御下で、ヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現した。

アッセイプロトコルの０日目に、細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、黒色、透明底）中の基底培地（５００ｍＬ：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；アルブミンを含有する）（５０ｍＬ）及び１％（ｗ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍＬ））に、１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで播種した。１日目に、プレートを反転させることによって培地を除去した。新鮮な基底培地を１ウェル当たり５０μｌで添加し、細胞を６０分間インキュベートした。

比較物３及び１９を、更なる比較物としてｈＩＬ－２２とともに二つ組で試験した。

したがって、５０μｌの希釈した比較物（基底培地中で希釈）を各ウェルに添加し、プレートを４時間放置した。したがって、比較物は、それらがウェル中に既に存在する５０μｌの培地中に希釈されたため、２倍希釈された。１００μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ＋試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号６０６６７５９）を添加することにより、４時間後に刺激を終了した。プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで密封し、４５０ｒｐｍで１５分間振盪した後、遅くとも１２時間後までにＭｉｔｈｒａｓまたは同様のシステムを使用して読み取った。

データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。各比較物の半最大有効濃度（ＥＣ_５０）を、その効力の尺度として評価した。ＥＣ_５０は、Ｌｏｇ（化合物）対応答－可変スロープ（４ｐ）を使用して決定した。ヒルスロープを標準として１に制限した。

結果
表１６は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイにおいて測定された比較物のＥＣ_５０を示す。

ＢＨＫ細胞アッセイが大量のアルブミンを含有したため、測定されたＥＣ_５０は、比較物を試験するときにアルブミン結合の効果を組み込んだ。

アルブミンが存在するＢＨＫ細胞アッセイにおいて、比較物３は、ｈＩＬ－２２と比較して１１倍低減した効力を有し、比較物１９は、ｈＩＬ－２２と比較して３倍低減した効力を有した。

結論
培地中にアルブミンを含むＢＨＫ細胞アッセイでは、比較物１９及び３は、ｈＩＬ－２２と比較して、効力の１１倍または３倍の低減のみを示した。比較すると、及び前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のＦｃ融合について、インビトロでの効力が３４倍低減したことを報告している。

実施例１２－Ｃ１６一酸脂質化を伴う誘導体２のインビトロ効力研究
方法
方法を実施例１１に記載のアッセイに従って実施し、同じ実験設定で実行した。

これらの実験は、異なる実験室で行ったため結果は表５に含まれなかった。使用されたアッセイ、細胞株及びプロトコルは同じであったが、当業者は、装置及び試料の取り扱いが実験から抽出された値に影響を与える可能性があることを理解するであろう。

誘導体２を、二つ組で比較物としてｈＩＬ－２２とともに試験した。

結果
表１７は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイにおいて測定した誘導体及び比較物のＥＣ_５０を示す。

ＢＨＫ細胞アッセイが大量のアルブミンを含有したため、測定されたＥＣ_５０は、誘導体を試験するときにアルブミン結合の効果を組み込んだ。

アルブミンが存在するＢＨＫ細胞アッセイにおいて、誘導体２は、ｈＩＬ－２２と比較して、低減した効力を有しなかった。

結論
培地中にアルブミンを含むＢＨＫ細胞アッセイでは、誘導体２は、ｈＩＬ－２２と比較して、低減した効力を示さなかった。比較すると、及び前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のＦｃ融合について、インビトロでの効力が３４倍低減したことを報告している。これにより、特許請求される誘導体がＮ末端にＧ－Ｐ－Ｇ伸長を含むことができることが確認されるが、これは生物学的効果に厳密には必要ではない。

本発明のある特定の特徴が本明細書に図示及び説明されているが、当業者であれば、多くの修正及び等価物が思い付くであろう。したがって、特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に含まれる全てのそのような修正及び等価物を網羅することが意図されていることが理解されるべきである。

Claims (15)

1. ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含むＩＬ－２２の誘導体であって、前記脂肪酸が、一酸である、前記誘導体。
2. 前記脂肪一酸が、リンカーによって前記ＩＬ－２２タンパク質に共有結合している、請求項１に記載の誘導体。
3. 前記脂肪酸が、
   （ｉ）下式Ｉのもの：
   Ｈ_３Ｃ－（ＣＨ_２）_ｘ－ＣＯ－＊
   （式中、ｘは、１０～１８、任意選択で１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、前記ＩＬ－２２タンパク質または前記リンカーへの結合点を示す）、
   （ｉｉ）Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８もしくはＣ２０一酸、
   （ｉｉｉ）Ｃ１６もしくはＣ１８一酸、及び／または
   （ｉｖ）Ｃ１８一酸である、請求項１または請求項２に記載の誘導体。
4. 前記ＩＬ－２２タンパク質が、天然成熟ヒトＩＬ－２２（ｈＩＬ－２２、配列番号１）またはそのバリアントである、先行請求項のいずれか１項に記載の誘導体。
5. 前記バリアントが、
   （ｉ）ｈＩＬ－２２の置換形態である、
   （ｉｉ）ｈＩＬ－２２の１位、２１位、３５位、６４位、１１３位及び／または１１４位で置換されている、
   （ｉｉｉ）Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択されるｈＩＬ－２２の置換を含む、
   （ｉｖ）ｈＩＬ－２２の１位にＣｙｓ残基を含む、
   （ｖ）ｈＩＬ－２２の９５位もしくは１０６位にＣｙｓ残基を含む、
   （ｖｉ）ｈＩＬ－２２内に変異を含み、ｈＩＬ－２２と少なくとも１０％の配列同一性を有する、及び／または
   （ｖｉｉ）ｈＩＬ－２２内に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の変異を含み、前記変異が、独立して、欠失、置換及び挿入からなる群から選択される、請求項４に記載の誘導体。
6. 前記バリアントが、
   （ｉ）ｈＩＬ－２２の伸長形態である、
   （ｉｉ）Ｎ末端ペプチドを含む、
   （ｉｉｉ）Ｎ末端三量体を含む、
   （ｉｖ）Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含む、及び／または
   （ｖ）最大５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のアミノ酸のＮ末端ペプチドを含む、請求項４または請求項５に記載の誘導体。
7. 前記リンカーが、
   （ｉ）任意選択でＧｌｕ及び／またはＬｙｓを含む１個以上のアミノ酸、
   （ｉｉ）オキシエチレングリシン単位もしくは複数の連結したオキシエチレングリシン単位、任意選択で２～５つのそのような単位、
   （ｉｉｉ）１つ以上のオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）残基、
   （ｉｖ）エチレンジアミン（Ｃ_２ＤＡ）基、
   （ｖ）アセトアミド（Ａｃ）基、
   （ｖｉ）γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ_２ＤＡ－Ａｃ、
   （ｖｉｉ）γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃ、及び／または
   （ｖｉｉｉ）γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃを含む、請求項２～６のいずれかに記載の誘導体。
8. 前記リンカーが、
   （ｉ）前記ｈＩＬ－２２もしくは前記そのバリアント中のＣｙｓ残基に結合したＣｙｓ反応性リンカーである、
   （ｉｉ）前記ｈＩＬ－２２もしくは前記そのバリアントの－７位、－５位、１位、６位、３３位、１１３位、１１４位もしくは１５３位で結合している、
   （ｉｉｉ）前記ｈＩＬ－２２の１位、６位、３３位、１１３位もしくは１１４位で置換されたＣｙｓ残基に結合している、
   （ｉｖ）前記ｈＩＬ－２２に対して－５位、－７位もしくは１５３位でＣｙｓ残基に結合している、
   （ｖ）前記ｈＩＬ－２２の１位で置換されたＣｙｓ残基に結合している、及び／または
   （ｖｉ）前記ｈＩＬ－２２の９５位もしくは１０６位で置換されたＣｙｓ残基に結合している、請求項２～７のいずれかに記載の誘導体。
9. 前記誘導体が、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０一酸を含み、前記バリアントが、任意選択で、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の１位のＣｙｓ残基を含み、前記リンカーが、任意選択で、前記Ｃｙｓ残基に結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の誘導体。
10. 前記誘導体が、本明細書で同定される誘導体１または誘導体２である、先行請求項のいずれか１項に記載の誘導体。
11. 請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が、吸入、注射、局所、経口または眼内投与に好適であり、任意選択で、前記注射が、腹腔内、皮下または静脈内である、前記医薬組成物。
12. 療法において使用するための、請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体または請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 療法の方法であって、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量の前記誘導体を投与することを含む、前記方法において使用するための、請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体または請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、中枢神経系（ＣＮＳ）または皮膚の疾患、障害または状態を治療する方法において使用するための、請求項１～１０のいずれかに記載の誘導体または請求項１１に記載の医薬組成物。
15. （ｉ）前記代謝疾患、障害または状態が、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、高脂血症、高血糖症または高インスリン血症である、
    （ｉｉ）前記肝臓の疾患、障害または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、慢性肝不全の急性憎悪（ＡＣＬＦ）、アセトアミノフェン誘導肝毒性、急性肝損傷、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変、または手術もしくは移植によって引き起こされた病的状態である、
    （ｉｉｉ）前記肺の疾患、障害または状態が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、化学損傷、ウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症である、
    （ｉｖ）前記腸の疾患、障害または状態が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、化学損傷、ウイルス感染症または細菌感染症である、
    （ｖ）前記腎臓の疾患、障害または状態が、急性腎疾患または慢性腎疾患である、
    （ｖｉ）前記ＣＮＳの疾患、障害または状態が、多発性硬化症である、あるいは
    （ｖｉｉ）前記皮膚の疾患、障害または状態が、創傷、炎症疾患またはＧｖＨＤである、請求項１４に記載の誘導体または医薬組成物。