JP2024515662A - Ｇｄ２に結合する二量体抗原受容体（ｄａｒ） - Google Patents

Ｇｄ２に結合する二量体抗原受容体（ｄａｒ） Download PDF

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Abstract

本開示は、ＧＤ２に結合する操作された二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現するトランスジェニックＴ細胞を提供し、ＤＡＲは、１つのポリペプチド鎖上の重鎖結合領域と、別個のポリペプチド鎖上の軽鎖結合領域を含む。二量体抗原受容体を構成する２つのポリペプチド鎖は、二量体化して抗原結合ドメインを形成することができる。トランスジェニックＴ細胞は、指向性細胞治療に使用することができる。本開示は、標的抗原に特異的に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）タンパク質構築物、二量体抗原受容体をコードする核酸、核酸を含むベクター、およびベクターを有する宿主細胞を提供する。

Description

本出願は、２０２１年４月２３日に出願された米国仮出願第６３／１７９，１４７号および２０２１年５月１３日に出願された米国仮出願第６３／１８８，２８４号に基づく米国特許法第１１９条の下での優先権の利益を主張し、それらの内容全体は参照によりその全体が組み込まれる。
技術分野
本開示は、標的抗原に特異的に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）タンパク質構築物、二量体抗原受容体をコードする核酸、核酸を含むベクター、およびベクターを有する宿主細胞を提供する。
背景
ＧＤ２は、ヒト神経芽細胞腫および黒色腫などの神経外胚葉由来の腫瘍で過剰発現するジシアロガングリオシドである。正常なヒト組織では、ＧＤ２発現は小脳および末梢神経に制限されている。マウス抗ＧＤ２モノクローナル抗体１４．１８は、マウス抗体１４．１８の可変領域とヒトＩｇＧ－Ｋの定常領域を含むキメラモノクローナル抗体（ｃｈ１４．１８、本明細書では１４．１８と称する）を操作するために使用された（Ｇｉｌｌｉｅｓ，１９８９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２）。マウス抗体１４．１８（ｈｕ１４．１８）のヒト化バージョンには、ヒトにおける抗体の免疫原性を低下させるように設計された可変領域フレームワーク変異が含まれている（米国特許第７，１６９，９０４号）。
殺腫瘍活性を向け直すためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて操作したＴ細胞の注入による養子免疫療法は、転移性癌の処置のための非常に特異性の高い処置方法となる可能性がある。癌に関連する抗原を標的とするために、様々なバージョンのＣＡＲが、開発されている。第一世代のＣＡＲは、活性化刺激（シグナル１）のみを送達するシグナル伝達ドメイン（ＴＣＲζ）を含むように操作された（Ｇｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１－５９３９，１９９９；Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（１）：１８２－１８７，２００１）（Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（５）：１９７６－１９８２，２００１；Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（１１）：６１２３－６１３１，２００１；Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：７０－７５，２００２）。第一世代のＣＡＲのみを移植したＴ細胞は、最適以下の活性化のために、限られた抗腫瘍効果を示した（Ｂｅｅｃｈａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３（６）：６３１－６４２，２０００）。第二世代のＣＡＲである、免疫グロブリン－ＣＤ２８－Ｔ細胞受容体（ＩｇＣＤ２８ＴＣＲ）は、共刺激ＣＤ２８（シグナル２）を第一世代の受容体に組み込んだものであり（Ｇｅｒｓｔｍａｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１０）：４５８４－４５９０，１９９７；Ｅｍｔａｇｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４（２４）：８１１２－８１２２，２００８；Ｌｏ，Ｍａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１０）：２７６９－２７８０，２０１０）、より大きい抗腫瘍能力をもつＣＡＲ－Ｔ細胞をもたらした（Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（６）：２７９１－２７９７，１９９８；Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（５）：１９７６－１９８２，２００１、Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：７０－７５，２００２）。ＴＣＲζまたはＣＤ２８のシグナルドメインを、同様の機能をもつ分子、例えば、ＦｃＲγ、４－１ＢＢおよびＯＸ４０などで置き換えることによって、様々なＣＡＲバリアントが開発されている（Ｅｓｈｈａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２）：７２０－７２４，１９９３）。
様々な腫瘍抗原に対するＴＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞が開発されている（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：２９７－３０６，２００４；Ｍａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１（１）：１２－２５，２００４；Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１０）：２７６９－２７８０，２０１０；Ｋｏｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（２１）：５９４９－５９６０，２０１２；Ｍａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）：２８６－２９６，２０１４；Ｋａｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１（１４）：３１４９－３１５９，２０１５；Ｊｕｎｇｈａｎｓら、２０１６ Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，７６（１４）：１２５７－１２７０）。Ｂ細胞上に発現する分子であるＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置において成功を示しており、ＦＤＡの承認を受けていて、いくつかの試験では最大７０％の奏効率が示されている。それにもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は非特異的活性化を示すことがあり、それにより不適切な免疫活性によって重篤な有害事象をもたらす可能性がある。
米国特許第７，１６９，９０４号明細書
Ｇｉｌｌｉｅｓ，１９８９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２ Ｇｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１－５９３９，１９９９ Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（１）：１８２－１８７，２００１ Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（５）：１９７６－１９８２，２００１ Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（１１）：６１２３－６１３１，２００１ Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：７０－７５，２００２ Ｂｅｅｃｈａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３（６）：６３１－６４２，２０００ Ｇｅｒｓｔｍａｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１０）：４５８４－４５９０，１９９７ Ｅｍｔａｇｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４（２４）：８１１２－８１２２，２００８ Ｌｏ，Ｍａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１０）：２７６９－２７８０，２０１０ Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（６）：２７９１－２７９７，１９９８ Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：７０－７５，２００２ Ｅｓｈｈａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２）：７２０－７２４，１９９３ Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：２９７－３０６，２００４ Ｍａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１（１）：１２－２５，２００４ Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１０）：２７６９－２７８０，２０１０ Ｋｏｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（２１）：５９４９－５９６０，２０１２ Ｍａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）：２８６－２９６，２０１４ Ｋａｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１（１４）：３１４９－３１５９，２０１５ Ｊｕｎｇｈａｎｓら、２０１６ Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，７６（１４）：１２５７－１２７０）
要旨
本明細書で提供されるのは、互いに会合してＧＤ２分子と結合する抗原結合ドメインを形成する第１および第２ポリペプチド鎖を有する二量体抗原受容体である。抗原結合ドメインは、第１ポリペプチド上に位置する抗体重鎖可変領域と第２ポリペプチド上に位置する抗体軽鎖可変領域で構成されているか、あるいは、第１ポリペプチド上に位置する抗体軽鎖可変領域と第２ポリペプチド上に位置する抗体重鎖可変領域で構成されている。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の後には、抗体の定常領域（それぞれ、ＣＨ１およびＣＬ）が続き、第１ポリペプチドには、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインがさらに含まれる。ＤＡＲの第１および第２ポリペプチドが宿主細胞によって発現されると、第１および第２ポリペプチドは、細胞の外側で抗体定常領域間のジスルフィド結合を介して互いに会合し、２つのポリペプチドの重鎖可変領域と軽鎖の会合を可能にして、細胞の外部に抗原結合ドメインを形成する。したがって、細胞の外部の抗体定常領域を介したＤＡＲの会合により、第１ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結されたＦａｂフラグメントが生成される。ＤＡＲを発現するＴ細胞などの宿主細胞は、例えば癌の処置において、細胞ベースの治療に使用することができる。
第１の態様では、ＧＤ２に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が本明細書において提供され、ＤＡＲは、ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ１）、（ｉｉｉ）随意のヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域を含む第１ポリペプチド；およびｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域と（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第２ポリペプチドを含む。あるいは、ＧＤ２に結合する本明細書に提供されるＤＡＲは、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、（ｉｉｉ）随意のヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域を含む第１ポリペプチド鎖；およびｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域と（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む第２ポリペプチド鎖を含み得る。本明細書で提供されるＤＡＲの第２ポリペプチドは、膜貫通領域を含まない。抗体重鎖定常領域と抗体軽鎖定常領域は、第１および第２ポリペプチドが会合してＤＡＲを形成するための二量体化ドメインを形成し、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域は、ＧＤ２に結合する抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＧＤ２ ＤＡＲは、ａ）（ｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ１）、（ｉｉｉ）随意のヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域から本質的になる第１ポリペプチド；およびｂ）（ｉ）抗体軽鎖可変領域と（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）から本質的になる第２ポリペプチドを含む。あるいは、ＧＤ２に結合する本明細書に提供されるＤＡＲでは、ＤＡＲは、ａ）（ｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、（ｉｉｉ）随意のヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域から本質的になる第１ポリペプチド；およびｂ）（ｉ）抗体重鎖可変領域と（ｉｉ）抗体重鎖定常領域から本質的になる第２ポリペプチドを含み得る。ＤＡＲの第１および第２ポリペプチドは、１またはそれを超えるジスルフィド結合を形成するそれらの抗体重鎖定常領域と抗体軽鎖定常領域を介して二量体化する。２つの成熟ポリペプチドである、膜貫通（第１の）ポリペプチドおよび分泌（第２の）ポリペプチドは、第１および第２ポリペプチドをコードする遺伝子を発現するように遺伝子組換えされた宿主細胞によって産生されると、細胞の外部でそれらの抗体定常ドメインのシステイン架橋を介して会合し、ＧＤ２結合ドメインを形成することができる。
ＧＤ２ ＤＡＲポリペプチドの抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域は、ＧＤ２抗体に由来することができ、これは、非限定的な例として、１４．１８抗体またはヒト化型（ｈｕ１４．１８）であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲの第１ポリペプチドは、１４．１８の重鎖可変領域（配列番号２）、または配列番号２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域を含み、１４．１８（配列番号５）の軽鎖可変領域、または配列番号５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲの第１ポリペプチドは、１４．１８（配列番号５）の軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含み、１４．１８（配列番号２）の重鎖可変領域、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、配列番号２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域は、配列番号２の重鎖可変領域のＣＤＲ配列を含む。様々な実施形態において、配列番号５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域は、配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ配列を含む。
さらなる実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲの第１ポリペプチドは、ｈｕ１４．１８の重鎖可変領域（配列番号３）、または配列番号３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域を含み、ｈｕ１４．１８（配列番号６）の軽鎖可変領域、または配列番号６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲの第１ポリペプチドは、ｈｕ１４．１８（配列番号６）の軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含み、ｈｕ１４．１８（配列番号３）の重鎖可変領域、または配列番号３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、配列番号３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域は、配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ配列を含む。様々な実施形態において、配列番号６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域は、配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ配列を含む。
第１または第２のＤＡＲポリペプチドの重鎖可変領域の後に、重鎖定常領域（ＣＨ１）、例えば配列番号４、または配列番号４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する定常領域が続く。第１または第２のＤＡＲポリペプチドの軽鎖可変領域の後には軽鎖定常領域が続き、これは軽鎖κ定常領域（配列番号７、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する定常領域）であってもよいし、軽鎖λ定常領域（配列番号８、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する定常領域）であってもよい。
第１ポリペプチドのヒンジ領域は随意であり、存在する場合、抗体もしくは他の免疫学的分子またはその一部からのヒンジ配列を含むことができ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥもしくはＩｇＤのヒンジ領域またはそれらのいずれかの一部から選択することができる。限定されるものではないが、１またはそれを超える天然起源のタンパク質に由来するヒンジ領域の少なくとも一部を含むヒンジ領域は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個またはそれを超えるアミノ酸、例えば、約３～約２０個のアミノ酸、約１０～約３０個のアミノ酸、約２０～約５０個のアミノ酸、約３０～約６０個のアミノ酸、約４０～約８０個のアミノ酸、約５０～約１００個のアミノ酸、約６０～約１２０個のアミノ酸、または約８０～約１５０個のアミノ酸、またはそれ以上のアミノ酸を含む。さらなる非限定的な例では、ＤＡＲの第１ポリペプチドのヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号１０）、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号９）またはＣＤ８α／ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号１１）を含み得るか、あるいはそれらのいずれかと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヒンジ領域を含み得る。
第１ポリペプチドの膜貫通領域は、非限定的な例として、ＣＤ８（配列番号１３）、ＣＤ２８（配列番号１２）、４－１ＢＢ（配列番号１４）、またはＣＤ３ζ（配列番号１５）の膜貫通領域、またはそれらのいずれかと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する膜貫通領域を含み得る。
第１ポリペプチドの細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号１６）、ＩＴＡＭ１、２および３を有するＣＤ３ζ（配列番号１９）、ＩＴＡＭ１を有するＣＤ３ζ（配列番号２０）、ＩＴＡＭ３を有するＣＤ３ζ（配列番号２２）、またはＣＤ２８（配列番号１７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０（配列番号１８）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２および／またはＣＤ２２６のいずれかの細胞内領域、またはそれらのいずれかと少なくとも９５％の同一性を有する細胞内アミノ酸配列からなる群から選択される１またはそれを超える細胞内アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞内領域は、ＩＴＡＭ１、２および３（配列番号１９）を有するＣＤ３ζ細胞内領域、または配列番号１９と少なくとも９５％％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する細胞内領域を含む。いくつかの実施形態では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号１６）、または配列番号１６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する細胞内領域を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号１６）と、ＩＴＡＭ１、２および３を有するＣＤ３ζ細胞内領域（配列番号１９）を含むか、またはそれらから本質的になる。
ＧＤ２ ＤＡＲのいくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＧＤ２ ＤＡＲのいくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本明細書に記載されるものなどの、ＧＤ２ ＤＡＲをコードする核酸分子が提供される。例えば、１またはそれを超える核酸分子は、宿主細胞によって発現され、本明細書に記載の第１および第２ポリペプチドを有するＤＡＲを産生することができる、１またはそれを超える前駆体ポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、ＤＡＲをコードする１またはそれを超える核酸分子は、例えば、産生された第１または第２ポリペプチドの膜挿入または分泌のための、１またはそれを超えるリーダー配列（シグナルペプチド）を含み得る１またはそれを超える前駆体ポリペプチドをコードする。さらに、ＤＡＲの第１および第２ポリペプチドをコードする核酸分子は、核酸分子が、成熟した第１ポリペプチドと成熟した第２ポリペプチドの両方の配列を含む単一のオープンリーディングフレームをコードするように、第１および第２ポリペプチドをコードする配列の間にペプチド「自己切断」または「２Ａ」配列を含めることができ、ここで、両方のポリペプチドをコードする配列は、シグナルペプチドをコードする配列に先行されており（すなわち、前駆体ポリペプチドとしてコードされている）、第１および第２ポリペプチドをコードする配列は、２Ａペプチドをコードする配列（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９）または２つの別個のポリペプチドの産生をもたらす他の配列によって分離されている。非限定的な例として、ＤＡＲをコードする本明細書において提供される核酸分子は、配列番号３０の前駆体ポリペプチド、または配列番号３０と９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する前駆体ポリペプチドをコードすることができ、ＤＡＲコード配列を発現する宿主細胞は第１および第２ポリペプチドを産生するか、あるいは、配列番号３４の前駆体ポリペプチド、または配列番号３４と９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する前駆体ポリペプチドをコードすることができ、ここで、ＤＡＲコード配列を発現する宿主細胞は第１および第２ポリペプチドを産生する。
本明細書で提供されるＤＡＲをコードすることができる核酸分子の他の配置には、限定されるものではないが、ＤＡＲの第１および第２の前駆体ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームが含まれ、このオープンリーディングフレームは、同じプロモーターの２つのポリペプチドの翻訳を可能にし得る配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。また、それぞれ独自のプロモーターを有する別個のオープンリーディングフレームとして第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドをコードする核酸分子も考慮される。ＤＡＲの両方のポリペプチドを一緒にコードする２つのベクターがさらに考慮される。これらの実施形態では、シグナルペプチドは、通常、第１ポリペプチドの膜組み込みおよび第２ポリペプチドの分泌を確実にするために、各ポリペプチドのＮ末端に含められる。シグナルペプチドの非限定的な例は、配列番号２３、２４、および２５として提供される。
ＤＡＲ前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子は、ＤＡＲの第１および第２ポリペプチドをコードする１またはそれを超える配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。ＤＡＲ前駆体ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが本明細書で提供され、ここでＤＡＲ前駆体ポリペプチドは、ＤＡＲの一方または両方のポリペプチドをコードすることができる。プロモーターは、例えば、真核細胞で活性なプロモーター、例えば哺乳動物細胞で活性なプロモーターであってよい。非限定的な例として、プロモーターは、ＪｅＴプロモーター（配列番号３９）、ＣＭＶプロモーター、ＨＴＬＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、またはＥＦ１α／ＨＴＬＶハイブリッドプロモーターであり得る。
いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲの少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸発現カセットが本明細書で提供され、この発現カセットは、ヒト遺伝子座の配列、例えばヒトＴＲＡＣ遺伝子の配列に隣接している。
いくつかの例示的な実施形態では、本明細書において提供される核酸は、ＧＤ２ ＤＡＲの第１および第２ポリペプチドをコードする配列番号３０の前駆体ポリペプチドをコードすることができ、配列番号３１と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸は、ＧＤ２ ＤＡＲの第１および第２ポリペプチドをコードする配列番号３４の前駆体ポリペプチドをコードすることができ、配列番号３５と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有し得る。
また、癌を処置するための医薬品を製造するための、本明細書に開示されるものなどのＧＤ２ ＤＡＲをコードする核酸分子の使用も本明細書で提供される。薬物は、例えば、ＧＤ２ ＤＡＲを発現する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの遺伝子操作された細胞であり得る。
別の態様では、本明細書に開示されるようなＧＤ２ ＤＡＲを発現するための、本明細書に提供される１またはそれを超える核酸分子を含む遺伝子操作された宿主細胞が提供される。細胞は、非限定的な例として、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＡＲポリペプチドをコードする１またはそれを超える核酸分子は、操作された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。例えば、少なくとも１つのＤＡＲポリペプチドをコードする１またはそれを超える核酸分子は、操作された宿主細胞のＴＲＡＣ遺伝子座に組み込むことができる。本明細書で提供される様々な実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲを発現し、Ｔ細胞受容体を発現しない。さらに、細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％がＧＤ２ ＤＡＲを発現してＴ細胞受容体を発現しないＴ細胞の集団が、本明細書で提供される。さらに、細胞の少少なくとも９０％または少なくとも９５％がＧＤ２ ＤＡＲを発現してＴ細胞受容体を発現しないＴ細胞の集団が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、Ｔ細胞（ＤＡＲ－Ｔ細胞）、例えば、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲ－Ｔ細胞は初代Ｔ細胞である。代替実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲを発現する遺伝子操作された細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＤＡＲ－ＮＫ細胞）、例えば、ヒトＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲ－ＮＫ細胞は初代ＮＫ細胞である
さらなる態様では、抗ＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞を、癌を有する対象に投与することによって癌を処置する方法が本明細書で提供される。細胞は、単回用量または複数回用量で、例えば約１０５～約１０９個の細胞で投与することができる。細胞は、細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％がＤＡＲ構築物を発現し、細胞の１０％未満、５％未満、または１％未満が内因性Ｔ細胞受容体を発現する（例えば、細胞の１％未満がＣＤ３陽性である）集団の細胞であり得る。
さらに、遺伝子操作されたＧＤ２ ＤＡＲ発現細胞を、癌を有する対象に投与することによって癌を処置する方法で用いるための、本明細書に開示されるＧＤ２ ＤＡＲを発現する、および／または、本明細書に記載されるようなＧＤ２ ＤＡＲをコードする核酸分子を含む、遺伝子操作された細胞が提供される。
さらに、癌を処置するための薬物を製造するための、本明細書に開示されるようなＧＤ２ ＤＡＲを発現する、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞の使用が提供される。
本開示によるさらなる実施形態は、特許請求の範囲および詳細な説明に記載されている。
図１Ａ～図Ｄは、二量体抗原受容体の４つの例示的な配置の構成およびドメインを示す図を提供する。Ａ）は、第１および第２ポリペプチドの定常抗体領域間のジスルフィド結合を示すＤＡＲの図である。膜貫通ドメインと２つの細胞内シグナル伝達領域を含む第１ポリペプチドは抗体の重鎖可変領域を含み、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含まない第２ポリペプチドは抗体の軽鎖可変領域を含む。Ｂ）は、第１および第２ポリペプチドの定常抗体領域間のジスルフィド結合を示すＤＡＲの図である。膜貫通ドメインと３つの細胞内シグナル伝達領域を含む第１ポリペプチドは抗体の重鎖可変領域を含み、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含まない第２ポリペプチドは抗体の軽鎖可変領域を含む。Ｃ）は、第１および第２ポリペプチドの定常抗体領域間のジスルフィド結合を示すＤＡＲの図である。膜貫通ドメインと２つの細胞内シグナル伝達領域を含む第１ポリペプチドは抗体の軽鎖可変領域を含み、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含まない第２ポリペプチドは抗体の重鎖可変領域を含む。Ｄ）は、第１および第２ポリペプチドの定常抗体領域間のジスルフィド結合を示すＤＡＲの図である。膜貫通ドメインと３つの細胞内シグナル伝達領域を含む第１ポリペプチドは抗体の軽鎖可変領域を含み、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含まない第２ポリペプチドは抗体の重鎖可変領域を含む。
図２Ａ～図Ｄは、いくつかの実施形態において、ＤＡＲを発現させるために宿主細胞にトランスフェクトすることができる核酸分子によってコードされ得る、二量体抗原受容体の前駆体の４つの例示的な配置の構成およびドメインを示す図を提供する。ＡおよびＢ）は、それぞれ図１Ｂおよび図１Ａに示されるＤＡＲの発現のための前駆体ポリペプチドの図を提供する。前駆体ポリペプチドには、第１ポリペプチドを膜に向かわせるためのリーダー配列、前駆体ポリペプチドを第１および第２ポリペプチドとして発現させることを可能にする「自己切断配列」、ならびに第２ポリペプチドを分泌するための第２のリーダー配列を含む。Ｃ）およびＤ）は、それぞれ図１Ｄおよび図１Ｃに示されるＤＡＲの発現のための前駆体ポリペプチドの図を提供する。前駆体ポリペプチドには、第１ポリペプチドを膜に向かわせるためのリーダー配列、前駆体ポリペプチドを第１および第２ポリペプチドとして発現させることを可能にする「自己切断配列」、ならびに第２ポリペプチドを分泌するための第２のリーダー配列を含む。
図３は、ＧＤ２に対する標識抗体（ｘ軸）を使用した、ＮＣＩ－Ｈ５２４、ＳＫ－ＭＥＬ－５、Ｋ５６２およびＨ４６０を含むいくつかの細胞株のフローサイトメトリーの結果を示す。
図４は、トランスフェクションの１４日後のトランスジェニックＴ細胞（ｘ軸）におけるＧＤ２（１４．１８）ＣＡＲ（抗ＧＤ２（１４．１８）－ｓｃＦｖ－２８ｚ）、ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＣＡＲ（抗ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）－ｓｃＦｖ－２８ｚ）、またはＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ（抗ＧＤ２（１４．１８）－ＤＡＲ－ＢＢｚ）の発現を検出するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ３を発現するトランスジェニックＣＡＲ－ＴおよびＤＡＲ－Ｔ発現トランスジェニック細胞はほとんどない（ｙ軸）。
図５は、ＧＤ２を発現する（ＧＤ２＋）か、またはＧＤ２の発現が非常に低いかもしくは全くない（ＧＤ２－と示す）細胞株と共培養した、ＧＤ２ ＣＡＲまたはＧＤ２－ＤＡＲのいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞の増殖の経時的なフローサイトメトリーモニタリングの結果を示す。「Ｔのみ」と標識されたカラムは、単独で培養されたＣＡＲ Ｔ細胞またはＤＡＲ Ｔ細胞を示す。抗ＧＤ２（１４．１８）－ｓｃＦｖ－２８ｚは、１４．１８（キメラ）抗ＧＤ２抗体のｓｃＦｖを用いて作製されたＣＡＲ構築物を示し；抗ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）－ｓｃＦｖ－２８ｚは、ｈｕ１４．１８（ヒト化）抗ＧＤ２抗体のｓｃＦｖを用いて作製されたＣＡＲ構築物を示し；抗ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ－ＢＢｚは、１４．１８（キメラ）抗ＧＤ２抗体の重鎖および軽鎖配列を用いて作製されたＤＡＲ構築物を示す。ｘ軸はＧＤ２構築物の発現；ｙ軸はＣＤ３の発現を示す。
図６Ａは、エフェクターとしてＧＤ２ ＣＡＲまたはＧＤ２ ＤＡＲのいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞と、ＳＫ－ＭＥＬ－５（ＧＤ２＋）標的細胞を使用したインビトロ細胞傷害性パーセントを示すグラフである。ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物でトランスフェクトした単離Ｔ細胞から作製したアッセイで使用した集団を文字「Ｔ」で示す。ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物でトランスフェクトしたＰＢＭＣから作製したアッセイで使用した集団を文字「Ｐ」で示す。抗ＧＤ２（１４．１８）－ｓｃＦｖ－２８ｚは、１４．１８（キメラ）抗ＧＤ２抗体のｓｃＦｖを用いて作製されたＣＡＲ構築物を示し；抗ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）－ｓｃＦｖ－２８ｚは、ｈｕ１４．１８（ヒト化）抗ＧＤ２抗体のｓｃＦｖを用いて作製されたＣＡＲ構築物を示し；抗ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ－ＢＢｚは、１４．１８（キメラ）抗ＧＤ２抗体の重鎖および軽鎖配列を用いて作製されたＤＡＲ構築物を示す。ＴＲＡＣ ＫＯは、Ｔ細胞受容体をノックアウトされているが、ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をトランスフェクトされていない対照Ｔ細胞である。また、凡例には、ＧＤ２ ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物を発現したアッセイにおいて使用されたトランスフェクトＴ細胞またはＰＢＭＣの集団のパーセンテージも示されている。図６Ｂは、エフェクターとしてＧＤ２ ＣＡＲまたはＧＤ２－ＤＡＲのいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞と、ＮＣＩ－Ｈ４６０（ＧＤ２－）標的細胞を使用したインビトロ細胞傷害性パーセントを示すグラフである。細胞の死滅は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＣＡ）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して測定した。細胞集団は図６Ａと同じ。
図７Ａは、ＴＲＡＣノックアウトのみ（ＴＲＡＣ ＫＯ）を有するＴ細胞、またはＧＤ２ ＣＡＲもしくはＧＤ２－ＤＡＲ構築物のいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞のいずれかからのＩＦＮ－γ放出（標的刺激の４８時間後）のレベルを示す棒グラフである。標的細胞には、Ｔ細胞のみ（標的対照なし）、ＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）細胞、またはＫ５６２（ＧＤ２－）細胞が含まれる。各アッセイセットは、以下を（左から右に）含む：ＴＲＡＣ ＫＯ；ＧＤ２（１４．１８）ＣＡＲ（単離Ｔ細胞）；ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＣＡＲ（単離Ｔ細胞）；ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ（単離Ｔ細胞）；ＧＤ２（１４．１８）ＣＡＲ（ＰＢＭＣ）；ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＣＡＲ（ＰＢＭＣ）；ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ（ＰＢＭＣ）。矢印は、ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ集団の値を示す。
図７Ｂは、ＴＲＡＣノックアウトのみ（ＴＲＡＣ ＫＯ）を有するＴ細胞、またはＧＤ２ ＣＡＲもしくはＧＤ２－ＤＡＲ構築物のいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞のいずれかからのＧＭ－ＣＳＦ放出（標的刺激の４８時間後）のレベルを示す棒グラフである。アッセイには、標的のない対照（Ｔ細胞のみ）、または標的細胞としてＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）またはＫ５６２（ＧＤ２－）細胞が含まれる。各アッセイセットは、以下を（左から右に）含む：ＴＲＡＣ ＫＯ；ＧＤ２（１４．１８）ＣＡＲ（単離Ｔ細胞）；ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＣＡＲ（単離Ｔ細胞）；ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ（単離Ｔ細胞）；１４．１８ ＣＡＲ（ＰＢＭＣ）；ｈｕ１４．１８ ＣＡＲ（ＰＢＭＣ）；１４．１８ ＤＡＲ（ＰＢＭＣ）。
図８は、ＳＫ－ＭＥＬ－５腫瘍細胞を接種し、次いでＰＢＳのみ、ＴＲＡＣノックアウトＴ細胞、ＤＡＲがｈｕ１４．１８重鎖および軽鎖可変領域を含むＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＤＡＲ－Ｔ細胞（抗ＧＤ２ ｈＤＡＲ Ｔと標識）、ならびに、ＤＡＲが１４．１８重鎖および軽鎖可変領域を含むＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ－Ｔ細胞（抗ＧＤ２ ｍＤＡＲ Ｔと標識）で処置したマウスの処置後７週間までのインビボ画像を提供する。
図９Ａは、図８に示すマウス群の処置時間にわたる平均腫瘍体積のグラフである。図９Ｂは、図８に示すマウス群の処置時間にわたる平均体重のグラフである。
図１０は、図８に示すマウスの生存曲線を提供する。
説明
本出願を通して、様々な刊行物、特許、および／または特許出願が参照される。刊行物、特許および／または特許出願の開示は、本開示が関係する最新技術をより完全に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
本明細書で提供される見出しは、単に読者の便宜のためのものであり、本開示の様々な態様を限定するものではなく、その態様は、本明細書を全体として参照することによって理解することができる。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、当業者によって一般的に理解される意味を有する。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、トランスジェニック細胞産生、タンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術に関する用語は周知であり、当技術分野で一般的に使用される。本明細書で提供される方法および技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来の手順に従って、本明細書で引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）を参照されたい。多くの基本的なテキストは、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，１９９５；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９６；およびＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，Ｎ．Ｊ．，１９９５；Ｐａｕｌ（ｅｄ．），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ，１９９３；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ；Ｃｏｄｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８６，およびＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５を含む標準的な抗体産生プロセスを記載している。本明細書で引用される参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。酵素反応および濃縮／精製技術も周知であり、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学に関連して使用される用語、ならびにその実験手順および技術は周知であり、当技術分野で一般的に使用される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置に使用することができる。
本明細書の文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに単語の単数使用は、１つの指示対象に明示的かつ明確に限定されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書における代替案（例えば、「または」）の使用は、代替案の一方もしくは両方またはそれらの任意の組合せを意味すると理解される。
本明細書で使用される「および／または」という用語は、特定の特徴または成分のそれぞれが、他方の有無にかかわらず、具体的に開示されると解釈されるべきである。例えば、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などのフレーズで使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などのフレーズで使用される「および／または」という用語は、次の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）の各々を包含することを意図する。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、ならびにそれらの文法上の変形は、リスト内の１つの項目または複数の項目が、列挙された項目に置換または追加され得る他の項目を排除しないように、非限定的であることを意図している。態様が「含む」という文言で本明細書に記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載されている他の類似の態様も包含されることが理解される。「から本質的になる」というフレーズは、指定された材料またはステップが、記載された組成物または方法の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないものと同様に含まれることを示す。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成について許容され得る誤差範囲内にある値または組成を指し、これは、その値または組成がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」または「およそ」は、当技術分野の慣行に従って、１または２以上の標準偏差以内を意味することができる。あるいは、「約」または「およそ」は、測定システムの制限に応じて、最大１０％（すなわち、±１０％）またはそれを超える範囲を意味し得る。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇ～５．５ｍｇの間の任意の数を含み得る。さらに、特に生物学的な系またはプロセスに関して、これらの用語は、１桁または５倍までの値を意味し得る。本開示において特定の値または組成が提供される場合、特に明記しない限り、「約」または「およそ」の意味は、その特定の値または組成について許容され得る誤差範囲内にあると想定されるべきである。
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」および「タンパク質」という用語および他の関連する用語は互換的に使用されてアミノ酸のポリマーを指し、特定の長さに限定されない。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドには、組換え型または化学合成型が含まれる。ポリペプチドには、前駆体分子および成熟分子も含まれる。前駆体分子には、まだ切断、例えば分泌シグナルペプチドによる切断、または特定のアミノ酸残基での非酵素的切断を受けていないものが含まれる。ポリペプチドには、切断を受けた成熟分子が含まれる。これらの用語は、タンパク質配列の天然タンパク質、組換えタンパク質および人工タンパク質、タンパク質断片およびポリペプチド類似体（例えばムテイン、バリアント、キメラタンパク質および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後に、または共有結合もしくは非共有結合で修飾されたタンパク質を包含する。２またはそれを超えるポリペプチド（例えば、２～６またはそれを超えるポリペプチド鎖）は、共有結合および／または非共有結合を介して互いに会合して、ポリペプチド複合体を形成することができる。ポリペプチド鎖の会合には、ペプチドの折り畳みも含まれ得る。したがって、ポリペプチド複合体は、複合体を形成するポリペプチド鎖の数に応じて、二量体、三量体、四量体、または高次複合体であり得る。２つのポリペプチド鎖を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が本明細書に記載されている。
本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語および他の関連する用語は互換的に使用されてヌクレオチドのポリマーを指し、いかなる特定の長さにも限定されない。核酸には、組換え型および化学合成型が含まれる。核酸には、ＤＮＡ分子（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体（例えば、ペプチド核酸および非天然ヌクレオチド類似体）、およびそれらのハイブリッドが含まれる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態では、本開示の核酸分子は、抗体、またはそのフラグメントもしくはｓｃＦｖ、誘導体、ムテインもしくは変異体をコードする連続したオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、核酸は、１種類のポリヌクレオチドまたは２またはそれを超える異なる種類のポリヌクレオチドの混合物を含む。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分をコードする核酸は、本明細書に記載されている。
「回収する」または「回収」または「回収すること」という用語、および他の関連する用語は、宿主細胞培養培地または宿主細胞溶解物または宿主細胞膜からタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を得ることを指す。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞から（例えば、哺乳類宿主細胞から）発現したタンパク質の分泌を媒介する分泌シグナルペプチド（リーダーペプチド配列）に融合させた組換えタンパク質として、宿主細胞により発現される。分泌タンパク質は、宿主細胞培地から回収することができる。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞溶解物から回収され得る分泌シグナルペプチド配列を欠く組換えタンパク質として、宿主細胞により発現される。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞膜から発現タンパク質を放出するために界面活性剤を使用して回収され得る膜結合タンパク質として、宿主細胞により発現される。一実施形態では、タンパク質を回収するために使用される方法に関係なく、タンパク質は、回収されたタンパク質から細胞残屑を除去する手順に供することができる。例えば、回収されたタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および／または透析にかけることができる。一実施形態では、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび／またはシリカでのクロマトグラフィーをはじめとするいずれか１つの手順または任意の組合せ手順または２またはそれを超える手順を含む。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡまたはＧ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の細胞壁成分）を含む。
「単離された」という用語は、他の細胞物質を実質的に含まないタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）またはポリヌクレオチドを指す。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に関連する成分（または抗体を産生するために使用される細胞発現系もしくは化学合成法に関連する成分）を実質的に含まないようにすることができる。単離されたという用語はまた、いくつかの実施形態では、同じ種の他の分子、例えば、異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列をそれぞれ有する他のタンパク質またはポリヌクレオチドを実質的に含まないタンパク質またはポリヌクレオチドを指す。所望の分子の純度または均一性は、ゲル電気泳動などの低分解能法およびＨＰＬＣまたは質量分析などの高分解能法を含む、当技術分野で周知の技術を使用してアッセイすることができる。一実施形態では、本開示のＤＡＲまたはその抗原結合部分の単離された前駆体ポリペプチド、ならびに第１および第２ポリペプチド鎖が単離される。
抗体は、様々な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から得ることができる。そのような抗体をアフィニティー精製にかけると、それらを特定の抗原特異性に対して濃縮することができる。そのような濃縮抗体調製物は、通常、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体で作製される。これらの調製物を数回のアフィニティー精製にかけることにより、抗原に対する特異的結合活性を有する抗体の割合を増加させることができる。このようにして調製された抗体は、「単一特異性」と呼ばれることが多い。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または９９．９％の抗体で構成することができる。抗体は、以下に記載されるような組換え核酸技術を使用して作製することができる。
「リーダー配列」または「リーダーペプチド」または「ペプチドシグナル配列」または「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチド」という用語は、ポリペプチドのＮ末端に位置するペプチド配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチド鎖を細胞分泌経路に導き、細胞膜の脂質二重層へのポリペプチドの組み込みおよび固定を導くことができる。典型的には、リーダー配列は約１０～５０アミノ酸長である。リーダー配列は、細胞質ゾルから小胞体への前駆体ポリペプチドの輸送を指示することができる。一実施形態では、リーダー配列には、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＣＤ１６リーダー配列を含むシグナル配列が含まれる。一実施形態では、シグナル配列は、例えばマウスまたはヒトＩｇガンマ分泌シグナルペプチドをはじめとする哺乳動物配列を含む。一実施形態では、リーダー配列は、マウスＩｇガンマリーダーペプチド配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２３）を含む。
本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」および関連用語は、抗原に結合する部分と、必要に応じて、抗原結合部分が抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進する立体構造をとることを可能にする、足場またはフレームワーク部分とを含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体類似体が挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替的なタンパク質足場、または移植されたＣＤＲもしくはＣＤＲ誘導体を有する人工骨格を含み得る。そのような足場には、限定されるものではないが、例えば抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するように導入された変異を含む抗体由来の足場、ならびに例えば生体適合性ポリマーを含む完全合成足場が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら、２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５３，Ｉｓｓｕｅ １：１２１－１２９；Ｒｏｑｕｅら、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣物（「ＰＡＭ」）を、ならびにフィブロネクチン成分を足場として利用する抗体模倣物に基づく足場を使用することができる。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む抗原結合タンパク質が本明細書に記載される。
抗原結合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンの構造を有することができる。一実施形態では、「免疫グロブリン」は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成される四量体分子を指し、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００～１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖には約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれている。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によりその全体があらゆる目的のために組み込まれる）。重鎖および／または軽鎖は、分泌のためのリーダー配列を含んでいても含まなくてもよい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの抗原結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、四量体免疫グロブリン分子とは異なるが、依然として標的抗原に結合するか、または２またはそれを超える標的抗原に結合する構造を有する合成分子であり得る。例えば、合成抗原結合タンパク質は、抗体フラグメント、１～６またはそれを超えるポリペプチド鎖、ポリペプチドの非対称集合体、または他の合成分子を含むことができる。標的抗原（例えば、ＧＤ２抗原）に特異的に結合する免疫グロブリン様特性をもつＤＡＲ構造を有する抗原結合タンパク質を本明細書に記載する。
免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
１またはそれを超えるＣＤＲを共有結合的または非共有結合的に分子に組み込んで、それを抗原結合タンパク質にすることができる。抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部として１または複数のＣＤＲを組み込んでもよく、１または複数のＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結してもよく、１または複数のＣＤＲを非共有結合的に組み込んでもよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２，１９９１のＫａｂａｔらの定義（「Ｋａｂａｔナンバリング」）に従う。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸の他のナンバリングシステムとしては、ＩＭＧＴ．ＲＴＭ．（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム；Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５－２０３；２００５）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０；２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７３：９２７－９４８；Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｍａｃｃａｌｌｕｍら、１９９６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６２：７３２－７４５、ａｎｄ Ａｈｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０９：６５７－６７０）が挙げられる。
本明細書で使用される単数または複数形の「抗体」および関連用語は、抗原に特異的に結合するインタクトな免疫グロブリン、またはその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびポリペプチドに特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。
抗体には、組換え産生された抗体および抗原結合部分が含まれる。抗体には、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体が含まれる。抗体には、単一特異性、多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性および高次特異性）が含まれる。抗体には、四量体抗体、軽鎖モノマー、重鎖モノマー、軽鎖二量体、重鎖二量体が含まれる。抗体には、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片およびＦａｂ断片が含まれる。抗体には、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）、ミニボディが含まれる。抗体には、モノクローナル集団およびポリクローナル集団が含まれる。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む抗体様分子が本明細書に記載される。
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」および他の関連する用語は、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合タンパク質の一部を指す。その抗原に特異的に結合する抗体の場合、これには、少なくとも１つのそのＣＤＲドメインの少なくとも一部が含まれる。抗原結合ドメインを形成する抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を有する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が本明細書に記載される。
「特異的結合」、「特異的に結合する」または「特異的に結合すること」という用語および他の関連する用語は、抗体または抗原結合タンパク質または抗体フラグメントに関連して本明細書で使用される場合、他の分子または部分と比較して抗原に非共有結合または共有結合で優先的に結合することを指す（例えば、抗体は他の利用可能な抗原と比較して特定の抗原に特異的に結合する）。一実施形態では、抗体は、１０－５Ｍまたはそれ未満、または１０－６Ｍまたはそれ未満、または１０－７Ｍまたはそれ未満、または１０－８Ｍまたはそれ未満、または１０－９Ｍまたはそれ未満、または１０－１０Ｍまたはそれ未満、または１０－１１Ｍまたはそれ未満の解離定数ＫＤで抗原に結合する場合、標的抗原に特異的に結合する。一実施形態では、それらの標的抗原（例えば、ＧＤ２抗原）に特異的に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が本明細書に記載される。
一実施形態では、抗体または抗原結合タンパク質もしくは抗体フラグメントの結合特異性は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、または酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって測定することができる。
一実施形態では、解離定数（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定することができる。表面プラズモン共鳴は、例えばＢＩＡＣＯＲＥシステム（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ部門）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイム相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
本明細書で使用される「エピトープ」および関連する用語は、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体またはその抗原結合部分によって）結合される抗原の一部を指す。エピトープは、抗原結合タンパク質によって結合される２またはそれを超える抗原の部分を含み得る。エピトープは、１つの抗原の非連続部分、または２またはそれを超える抗原の非連続部分（例えば、抗原の一次配列では連続していないが、抗原の三次構造および四次構造に関連して、抗原結合タンパク質が結合できるほど互いに十分に近いアミノ酸残基）を含むことができる。一般に、抗体の可変領域、特にＣＤＲはエピトープと相互作用する。一実施形態では、ＧＤ２抗原のエピトープに結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分が本明細書に記載される。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」、「抗体部分」、「抗体の抗原結合フラグメント」または「抗体の抗原結合部分」および他の関連する用語は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ；およびＦｖフラグメント、ならびにｄＡｂ；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。抗体の抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、および抗体フラグメントに抗原結合特性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。一態様では、ヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達領域に結合したＦａｂフラグメントを含む二量体抗原受容体が本明細書に記載される。
「Ｆａｂ」、「Ｆａｂフラグメント」という用語および他の関連する用語は、可変軽鎖領域（ＶＬ）、定常軽鎖領域（ＣＬ）、可変重鎖領域（ＶＨ）、および第１の定常領域（ＣＨ１）を含む一価のフラグメントを指す。Ｆａｂは抗原に結合することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである。Ｆ（Ａｂ’）２は、抗原結合能を有する。Ｆｄフラグメントは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含む。Ｆｖフラグメントは、ＶＬ領域およびＶＨ領域を含む。Ｆｖは抗原に結合することができる。ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（米国特許第６，８４６，６３４号および同第６，６９６，２４５号；米国特許出願公開第２００２／０２５１２号、同第２００４／０２０２９９５号、同第２００４／００３８２９１号、同第２００４／０００９５０７号、同第２００３／００３９９５８号；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）。一態様では、ヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達領域に結合したＦａｂフラグメントを含む二量体抗原受容体が本明細書に記載される。
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域とＶＨ領域とがリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して結合し、連続したタンパク質鎖を形成している抗体である。一実施形態では、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体の上に折り返されて、一価抗原結合部位を形成するのに十分な長さである（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３）。
ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含み、したがって各ドメインは別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成することができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８、およびＰｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対合から生じるダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリボディおよびテトラボディは、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体であり、これらは同じであっても異なっていてもよい。ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディ構築物は、本明細書に記載のいずれかの二量体抗原受容体（ＤＡＲ）由来の抗原結合部分を使用して調製することができる。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１またはそれを超える可変領域と定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（例えば、完全ヒト抗体）。これらの抗体は、様々な方法で調製することができ、その例は、組換え法によるもの、またはヒト重鎖および／もしくは軽鎖コード遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子組換えされたマウスの目的の抗原を用いる免疫化によるものなど、以下に記載されている。完全ヒト抗体重鎖可変領域および完全ヒト抗体軽鎖可変領域を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）は、本明細書に記載されている。
「ヒト化」抗体とは、１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および／または付加により、非ヒト種由来の抗体の配列と異なる配列を有する抗体を指し、その結果、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与された場合、非ヒト種抗体と比較して免疫応答を誘導する可能性が低く、かつ／またはあまり重症でない免疫応答を誘導する。例えば、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中の特定のアミノ酸を変異させて、ヒト化抗体を産生することができる。他の例では、ヒト抗体由来の１または複数の定常ドメインは、非ヒト種の１または複数の可変ドメインに融合させることができる。さらなる実施形態では、非ヒト抗体のＣＤＲ配列は、ヒト抗体のＣＤＲと置換されてもよく、または別の場合にはヒト抗体のフレームワークに操作されてもよい。他の例では、非ヒト抗体の１またはそれを超えるＣＤＲ配列中の１またはそれを超えるアミノ酸残基は、ヒト対象に投与された場合に、非ヒト抗体の可能性のある免疫原性を低下させるように変更され、ここで、変更されたアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的結合に重要ではないか、または行われるアミノ酸配列の変更は保存的変更であり、その結果、抗原へのヒト化抗体の結合は、抗原への非ヒト抗体の結合よりも有意に悪化しない。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同第５，８７７，２９３号に見出すことができる。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語および関連する用語は、第１の抗体由来の１またはそれを超える領域と、１またはそれを超える他の抗体由来の１またはそれを超える領域とを含む抗体を指す。一実施形態では、１またはそれを超えるＣＤＲは、非ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、すべてのＣＤＲがヒト抗体に由来する。別の実施形態では、２つ以上の非ヒト抗体由来のＣＤＲは、キメラ抗体において混合され、マッチングされる。例えば、キメラ抗体は、第１の非ヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第２の非ヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗体の重鎖由来のＣＤＲを含み得る。ＣＤＲ配列の外側のフレームワーク配列は、例えば、ヒト抗体配列であり得る。他の例では、ＣＤＲは、ヒトおよびマウス、またはヒトおよびウサギ、またはヒトおよびヤギなどの異なる種に由来し得る。当業者は、他の組合せが可能であることを理解するであろう。本明細書に開示されるいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態では、キメラ１４．１８抗体などのキメラＧＤ２抗体には、ヒト抗体の定常ドメインに融合した非ヒト種（例えば、マウス）のＧＤ２抗体の可変ドメインが含まれる。例えば、本明細書中に開示されるような組換え受容体において使用されるキメラＧＤ２重鎖またはその一部は、ヒト抗体定常領域に融合したマウス１４．１８抗体の重鎖可変領域を含むことができ、本明細書に開示されるような組換え受容体において使用されるキメラＧＤ２軽鎖またはその一部は、ヒト抗体定常領域に融合したマウス１４．１８抗体の軽鎖可変領域を含むことができる。
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗体のうちの１つに由来してもよいし、ヒト抗体などの１またはそれを超える異なる抗体に由来してもよいし、ヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の一例では、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体と同一、相同、またはそれに由来するか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、１または複数の鎖の残りは、別の種に由来する抗体と同一、相同、またはそれに由来するか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する。所望の生物活性（すなわち、標的抗原に特異的に結合する能力）を示すそのような抗体の断片も含まれる。
本明細書で使用される場合、「バリアント」ポリペプチドおよびポリペプチドの「バリアント」という用語は、参照ポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に挿入、欠失、および／または置換された１またはそれを超えるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体には、融合タンパク質が含まれる。同様に、バリアントポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列に挿入、欠失、および／または置換された１またはそれを超えるヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドバリアントには、融合ポリヌクレオチドが含まれる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」という用語は、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、およびグリコシル化などの別の化学部分へのコンジュゲーションを介して化学的に修飾されているポリペプチド（例えば、抗体）である。別段の指示がない限り、「抗体」という用語は、全長重鎖および全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片およびムテインを含み、その例は以下に記載される。
「ヒンジ」という用語は、一般にタンパク質の２つのドメイン間に見られ、構築物全体の柔軟性と、ドメインの一方または両方の互いに対する移動を可能にすることのできるアミノ酸セグメントを指す。構造的には、ヒンジ領域は、約１０～約１００個のアミノ酸、例えば、約１５～約７５個のアミノ酸、約２０～約５０個のアミノ酸、または約３０～約６０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長である。ヒンジ領域は、天然起源のタンパク質のヒンジ領域、例えば、ＣＤ８ヒンジ領域もしくはそのフラグメント、ＣＤ８αヒンジ領域もしくはそのフラグメント、抗体のヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体）、または抗体の定常ドメインＣＨ１とＣＨ２とを連結するヒンジ領域に由来し得る。ヒンジ領域は抗体に由来することができ、抗体の１またはそれを超える定常領域を含んでも含まなくてもよく、またはヒンジ領域は抗体のヒンジ領域と抗体のＣＨ３定常領域を含むか、またはヒンジ領域は抗体のヒンジ領域と抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含むか、またはヒンジ領域は非天然起源のペプチドであり、またはヒンジ領域はｓｃＦｖのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端の間に配置される。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリン分子由来の上部ヒンジ配列、コアヒンジ配列または下部ヒンジ配列を含む領域のいずれか１つまたは２またはそれを超える任意の組合せを含む。一実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１上部ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号４７）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１コアヒンジ配列ＣＰＸＣを含み、ＸはＰ、ＲまたはＳである（配列番号４８）。一実施形態では、ヒンジ領域は、下部ヒンジ／ＣＨ２配列ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号４９）を含む。一実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ（配列番号５０）を有するＦｃ領域（ＣＨ２）に連結されている。一実施形態では、ヒンジ領域は、上部ヒンジ、コアヒンジおよび下部ヒンジのアミノ酸配列を含み、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号５１）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれを超える鎖間ジスルフィド結合を形成することができる１つ、２つ、３つまたはそれを超えるシステインを含む。
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」という用語は、ヒンジ領域内またはヒンジ領域の後に始まり、重鎖のＣ末端で終わる抗体重鎖定常領域の部分を指す。Ｆｃ領域は、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含み、ヒンジ領域の一部を含んでも含まなくてもよい。一実施形態では、それぞれが半分のＦｃ領域を有する２つのポリペプチド鎖を二量体化させてＦｃ領域を形成することができる。Ｆｃ領域は、Ｆｃ細胞表面受容体および免疫補体系のいくつかのタンパク質に結合することができる。Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用（ＡＤＰ）、オプソニン化および／または細胞結合をはじめとする活性のいずれか１つ、または２またはそれを超える任意の組合せを含む、エフェクター機能を示す。一実施形態では、Ｆｃ領域は、これらの機能のいずれか１つまたは任意の組合せを増加または減少させる変異を含むことができる。Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ（例えば、ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（例えば、ＣＤ３２）および／またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、ＣＤ１６ａ）をはじめとするＦｃ受容体に結合することができる。Ｆｃ領域は、補体成分Ｃ１ｑと結合することができる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低下させるＬＡＬＡ－ＰＧ変異（例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇと同等）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインはタンパク質複合体の血清半減期を媒介し、Ｆｃドメイン中の変異はタンパク質複合体の血清半減期を増加または減少させることができる。一実施形態では、Ｆｃドメインはタンパク質複合体の熱安定性に影響を及ぼし、Ｆｃドメイン中の変異はタンパク質複合体の熱安定性を増加または減少させることができる。
本明細書で使用される「標識抗体」という用語または関連する用語は、標識されていないかまたは検出のために検出可能な標識もしくは部分に結合されている抗体およびその抗原結合部分を指し、検出可能な標識または部分は、放射性、比色、抗原性、酵素性、検出可能なビーズ（例えば、磁気ビーズまたは高電子密度（例えば、金）ビーズ）、ビオチン、ストレプトアビジンまたはプロテインＡである。限定されるものではないが、放射性核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）をはじめとする様々な標識を用いることができる。
本明細書で使用される「同一性パーセント」または「相同性パーセント」および関連する用語は、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド配列間の類似性の定量的測定値を指す。２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリペプチド配列のアラインメントを最適化するために導入する必要があり得るギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、２つのポリペプチド配列間で共有されるアラインメント位置の同一アミノ酸の数の関数である。同様に、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントを最適化するために導入する必要があり得るギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、２つのポリヌクレオチド配列間で共有されるアラインメント位置の同一ヌクレオチドの数の関数である。配列の比較および２つのポリペプチド配列間または２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の「同一性パーセント」または「相同性パーセント」は、そのデフォルトパラメータを使用してＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３の一部（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ））を使用して配列を比較することによって決定することができる。試験配列に関して「Ｙに対して少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」などの表現は、上記のように配列Ｙに整列させた場合、試験配列がＹの残基の少なくともＸ％と同一な残基を含むことを意味する。
一実施形態では、抗体のアミノ酸配列は、本明細書に記載のＤＡＲの抗原結合部分および／または抗体定常領域のアミノ酸配列のいずれかと類似しているが同一ではない場合がある。抗体とポリペプチドとの間の類似性は、本明細書に記載のＤＡＲまたはその抗原由来部分を構成する任意のポリペプチドの配列と少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。一実施形態では、類似のポリペプチドは、重鎖および／または軽鎖内にアミノ酸置換を含むことができる。一実施形態では、アミノ酸置換は、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）をもつ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。２またはそれを超えるアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度を上方に調整して、置換の保存的性質を修正することができる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。同様の化学的性質をもつ側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、細胞内シグナル伝達ドメインに融合した細胞外抗原結合タンパク質を含む単鎖融合タンパク質を指す。ＣＡＲ細胞外結合ドメインは、ヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体の可変重鎖領域および可変軽鎖領域を融合することに由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖまたはｓＦｖ）である。一実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）重鎖可変（ＶＨ）ドメインと軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含む抗原結合タンパク質を含み、ＶＨドメインとＶＬドメインとはペプチドリンカーによって一緒に結合されている、抗原結合タンパク質；（ｉｉ）ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｖ）細胞内シグナル伝達配列を含む細胞内ドメイン、を含む。開示される構築物は、ＤＡＲが標的化のために単鎖抗体を使用せず、代わりに別々の重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域を使用するという点で、ＣＡＲとは異なるＤＡＲである。
本明細書で使用される場合、「二量体抗原受容体」（ＤＡＲ）という用語は、２つのポリペプチド鎖：抗体の抗原結合領域（重鎖可変領域または軽鎖可変領域）とそれに続く抗体定常領域、膜貫通領域および細胞内シグナル伝達領域を含む第１ポリペプチドと、抗原結合領域（軽鎖可変領域または重鎖可変領域）とそれに続く抗体定常領域を含む第２ポリペプチドとを含む、操作された受容体を指す。第１ポリペプチドが重鎖可変領域を含む場合、第２ポリペプチドは軽鎖可変領域を含み、逆もまた同様で、その結果、細胞の外部の抗体定常領域を介したＤＡＲの会合により、第１ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結されたＦａｂフラグメントが生成される。第１ポリペプチドは膜貫通ドメインを介して細胞膜に固定されるが、第２ポリペプチドは膜貫通ドメインがないため細胞外に分泌され、そこで第２ポリペプチドと会合する。二量体抗原受容体を構成する２つのポリペプチド鎖は、二量体化してタンパク質複合体を形成し、標的抗原に特異的に結合するため抗体のような特性を有し得る。二量体抗原受容体は、指向性細胞治療に使用することができる。
本開示は、抗原結合細胞外部分、随意のヒンジ部分、膜貫通部分、ならびに共刺激領域および／または細胞内シグナル伝達領域を有する細胞内部分を有する抗ＧＤ２構築物を発現するように操作されたトランスジェニックＴ細胞を提供する。膜貫通領域と細胞内領域に結合したＦａｂフラグメント。一実施形態では、ＤＡＲ構築物は、Ｆａｂフラグメントと膜貫通領域との間に随意のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＤＡＲ構造は、例えば、Ｆａｂ形式の抗体を有するＤＡＲ構造を、同じ抗体のｓｃＦｖ形式を有するＣＡＲ構造と比較することに基づいて、予想外の驚くべき結果をもたらす。さらに、ヒンジ領域、膜貫通領域および２つの細胞内領域が同じであり得るので、ＤＡＲ形式とおよびＣＡＲ形式を直接比較することができる。しかし、ＤＡＲフォーマットは、標的抗原、抗原誘導性サイトカイン放出および／または抗原誘導性細胞傷害性を発現する細胞への結合において、対応するＣＡＲフォーマットと比較して優れた結果を提供し得る。
本開示は、１つのポリペプチド鎖上の重鎖結合領域および別個のポリペプチド鎖上の軽鎖結合領域を含むＤＡＲ構築物を提供する。二量体抗原受容体を構成する２つのポリペプチド鎖は、二量体化してタンパク質複合体を形成することができる。二量体抗原受容体は、標的抗原に特異的に結合するため、抗体様の特性を有する。二量体抗原受容体は、指向性細胞治療に使用することができる。
二量体抗原受容体（ＤＡＲ）ならびにそれらの様々な配置およびドメイン、ＤＡＲをコードする構築物、ならびにＤＡＲを発現する細胞、ならびに細胞治療におけるそれらの使用もまた、国際公開第２０１９／１７３８３７号および国際公開第２０２１／０４６４４５号に開示されており、これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「ベクター」および関連する用語は、外来遺伝物質（例えば、核酸導入遺伝子）に作動可能に連結され得る核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ベクターは、外来遺伝物質を細胞（例えば、宿主細胞）に導入するためのビヒクルとして使用することができる。ベクターは、導入遺伝子をベクターに挿入するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むことができる。ベクターは、ベクター導入遺伝子構築物を有する宿主細胞の選択を助けるために抗生物質耐性または選択可能な特性を付与する少なくとも１つの遺伝子配列を含み得る。ベクターは、一本鎖または二本鎖核酸分子であってよい。ベクターは、線状または環状核酸分子であってよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用する遺伝子編集方法に使用されるドナー核酸は、ベクターの一種であり得る。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、導入遺伝子に連結することができ、宿主細胞内で複製し、導入遺伝子を転写および／または翻訳することができる、線状または環状の二本鎖染色体外ＤＮＡ分子を指す。ウイルスベクターは、通常、導入遺伝子に連結することができるウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ骨格配列を含む。ウイルス骨格配列は、感染を無効にするが、宿主細胞ゲノムへのウイルス骨格および共連結導入遺伝子の挿入を保持するように修飾することができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターが挙げられる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。
「発現ベクター」とは、誘導性および／または構成的プロモーターおよびエンハンサーなどの、１またはそれを超える調節配列を含み得るベクターの一種である。発現ベクターは、リボソーム結合部位および／またはポリアデニル化部位を含み得る。発現ベクターは、１またはそれを超える複製起点配列を含むことができる。調節配列は、宿主細胞に形質導入される発現ベクターに連結された導入遺伝子の、転写、または転写と翻訳を指示する。１または複数の調節配列は、導入遺伝子の発現のレベル、タイミングおよび／または位置を制御することができる。調節配列は、例えば、導入遺伝子に直接に、あるいは１またはそれを超える他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その効果を発揮することができる。調節配列は、ベクターの一部であり得る。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎら、１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５－３６０６に記載されている。発現ベクターは、本明細書に記載の任意の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分の少なくとも一部をコードする核酸を含み得る。
導入遺伝子とベクターとの間に連結があり、ベクターに含まれている導入遺伝子配列の機能または発現を可能にする場合、導入遺伝子はベクターに「作動可能に連結」されている。一実施形態では、調節配列が導入遺伝子の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を及ぼす場合、導入遺伝子は調節配列に「作動可能に連結」されている。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語または他の関連する用語は、外因性核酸（例えば導入遺伝子）が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」宿主細胞は、外因性核酸（導入遺伝子）が導入された宿主細胞である。宿主細胞には、初代対象細胞とその子孫が含まれる。本明細書に記載の任意の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分の少なくとも一部をコードする外因性核酸は、宿主細胞に導入することができる。本明細書に記載の任意の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分の少なくとも一部を含む発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、宿主細胞は、本明細書に記載のＤＡＲまたはその抗原結合部分の少なくとも一部を含むポリペプチドを発現することができる。
本明細書で使用される「宿主細胞」もしくは「または宿主細胞の集団」という用語または関連する用語は、外来（外因性または導入遺伝子）核酸が導入された細胞（またはその集団）を指す。外来核酸は、導入遺伝子に作動可能に連結された発現ベクターを含むことができ、宿主細胞は、外来核酸（導入遺伝子）によってコードされる核酸および／またはポリペプチドを発現するために使用することができる。宿主細胞（またはその集団）は、培養細胞であってもよいし、対象から抽出されてもよい。宿主細胞（またはその集団）は、継代の回数に関係なく、初代対象細胞およびその子孫を含む。宿主細胞（またはその集団）には、不死化細胞株が含まれる。子孫細胞は、親細胞と比較して同一の遺伝物質を有していてもいなくてもよい。宿主細胞は子孫細胞を包含する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示されるように、抗体を発現するように任意の方法で修飾、トランスフェクト、形質導入、形質転換および／または操作された任意の細胞（その後代を含む）を記載する。一例では、宿主細胞（またはその集団）に、本明細書に記載の所望の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを導入することができる。宿主細胞およびその集団は、宿主のゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを有することができるか、または染色体外発現ベクターを有することができる。一実施形態では、宿主細胞およびその集団は、数回の細胞分裂後に存在するか、または一過性に存在し、数回の細胞分裂後に失われる染色体外ベクターを有することができる。
トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳ、メガヌクレアーゼをはじめとする周知のデザイナーヌクレアーゼを含む非ウイルス法を使用して、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用した遺伝子編集によって、調製することができる。導入遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して宿主細胞のゲノムに導入することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼには、操作されたジンクフィンガーモチーフ由来のＤＮＡ結合ドメインに融合した制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）の非特異的エンドヌクレアーゼドメインをそれぞれ含有する一対のキメラタンパク質が含まれる。ＤＮＡ結合ドメインは、宿主のゲノム内の特定の配列に結合するように操作することができ、エンドヌクレアーゼドメインは二本鎖切断を行う。ドナーＤＮＡは、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれか、および宿主細胞のゲノムの意図された挿入部位の両側の領域に相同な隣接配列を有する。宿主細胞のＤＮＡ修復機構は、相同ＤＮＡ修復による導入遺伝子の正確な挿入を可能にする。トランスジェニック哺乳動物宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（米国特許第９，５９７，３５７号、同第９，６１６，０９０号、同第９，８１６，０７４号および同第８，９４５，８６８号）を使用して調製された。トランスジェニック宿主細胞は、正確な導入遺伝子挿入を送達することができる、ＤＮＡ結合ドメインに融合した非特異的エンドヌクレアーゼドメインを含むという点で、ジンクフィンガーヌクレアーゼに類似する、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）を使用して調製することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼと同様に、ＴＡＬＥＮもまた、宿主のＤＮＡに二本鎖切断を導入する。トランスジェニック宿主細胞は、長さ約１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ上の認識部位を認識する部位特異的な低頻度切断エンドヌクレアーゼとして作用するメガヌクレアーゼを使用して調製することができる。メガヌクレアーゼには、真核生物の単細胞生物のミトコンドリアおよび葉緑体で最も頻繁に見られるＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号５２）ファミリーに由来するものが含まれる。ゲノムを修飾するために使用されるメガヌクレアーゼ系の例は、例えば、米国特許第９，８８９，１６０号に記載されている。トランスジェニック宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的に間隔を空けた短い回文配列リピート）を用いて調製することができる。
ＣＲＩＳＰＲは、標的特異的ドナーＤＮＡの組み込みのために、ガイドＲＮＡに結合したＣａｓエンドヌクレアーゼを使用する。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡのｇＲＮＡ結合領域の上流にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有する保存されたマルチヌクレオチドを含み、宿主細胞標的部位にハイブリダイズし、そこでＣａｓエンドヌクレアーゼが二本鎖標的ＤＮＡを切断する。ガイドＲＮＡは、特定の標的部位にハイブリダイズするように設計することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、挿入部位と相同性を有する隣接配列を有するドナーＤＮＡの部位特異的挿入を導入することができる。使用され得るＣａｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、ＣａｓＸ、ならびにＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、およびＣａｓＸのバリアントを含む関連酵素、ならびにＭＡＤ７などの酵素およびそのバリアント、ＣｅＣｐｆ１、ＰｒＣｐｆ１、Ｌｂ２Ｃｐｆ１、およびＬｂ２Ｃｐｆ１－ＫＹなどが挙げられる。ゲノムを修飾するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例は、例えば米国特許第８，６９７，３５９号；同第１０，０００，７７２号；同第９，７９０，４９０号；および同第１０，５７０，４１５号および米国特許出願公開第２０２０／０１０９３８２号、同第２０２１／０３０９９８１号、および同第２０２１／０１５５９１１号に記載されており、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの使用は、発現が不要または望ましくない可能性がある遺伝子を破壊するために使用することもでき、いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物（ＧＤ２ ＤＡＲ構築物など）の挿入は、ＴＣＲ鎖をコードする遺伝子、例えばＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的とすることができ、ＴＣＲがＣＡＲまたはＤＡＲを発現する細胞で発現されないようにすることができる。構築物の組み込み、遺伝子ノックアウトおよび標的遺伝子座における同時ノックイン／ノックアウトのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび方法は、例えば、米国特許出願公開第２０２０／０２２４１６０号；国際公開第２０２０／１７６７４０号および国際公開第２０２０／１８５８６７号に記載されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して調製することができ、宿主標的部位は、ＴＲＡＣ遺伝子（Ｔ細胞受容体アルファ定常領域）であってよい。ドナーＤＮＡは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれかを含み得る。エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたはリポフェクションを使用して、宿主細胞にドナーＤＮＡをジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと共送達することができる。
トランスジェニック宿主細胞は、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）に、ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸を担持するレトロウイルスベクターを形質導入することによって調製することもできる。形質導入は、基本的に、Ｍａら、２００４ Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１：１２－２５；およびＭａら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）：２８６－２９６，２０１４に記載されているように行うことができる（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。レトロウイルスベクターを、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用してＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトして、エコトロピックレトロウイルスを作製し、その後、一過性ウイルス上清（エコトロピックウイルス）を回収して、ＰＧ１３パッケージング細胞にＧａｌ－Ｖエンベロープを形質導入して、ヒト細胞に感染するレトロウイルスを作製することができる。ＰＧ１３細胞からのウイルス上清は、ＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８活性化の２～３日後に活性化Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）に形質導入するために使用することができる。活性化ヒトＴ細胞は、正常な健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のマニュアル通りに１００ｎｇ／ｍｌマウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｒａｒｔｉａｎ，ＮＪ）または抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）および３００～１０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ２で、５％ＦＢＳを補充したＡＩＭ－Ｖ増殖培地（ＧＩＢＣＯ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）中で２日間活性化することによって調製することができる。約５×１０６個の活性化ヒトＴ細胞を、３ｍｌのウイルス上清を用いて１０ｕｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）プレコート６ウェルプレートに形質導入し、１０００ｇで約１時間約３２℃で遠心分離することができる。形質導入後、形質導入されたＴ細胞は、５％ＦＢＳおよび３００～１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を補充したＡＩＭ－Ｖ増殖培地で増殖させることができる。
宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌であり得るか、あるいはそれは真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであり得る。一実施形態では、宿主細胞に、所望の抗体をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを導入し、それにより、トランスフェクト／形質転換宿主細胞による抗体の発現に適した条件下で培養されるトランスフェクト／形質転換宿主細胞を生成することができ、必要に応じて、トランスフェクト／形質転換宿主細胞から抗体を回収するか（例えば、宿主細胞溶解液から回収）、または培養培地から回収することができる。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、およびＹＢ２／０をはじめとする非ヒト細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０、Ｈｕｈ－７およびＰＥＲ．Ｃ６をはじめとするヒト細胞を含む。宿主細胞の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはそれらの誘導体、例えば無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯおよび関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９９８、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８：３１を参照）、またはＤＨＦＲが欠損したＣＨＯ株ＤＸ－Ｂ １１（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－２０参照）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら、１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１参照）、２９３，２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３などのヒト胚性腎細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、Ｙ０、ＮＳ０またはＳｐ２０などのリンパ球系細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であるが、ヒト宿主細胞ではない。通常、宿主細胞は、ポリペプチドコード核酸で形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞であり、その後、宿主細胞で発現させることができる。「トランスジェニック宿主細胞」または「組換え宿主細胞」というフレーズは、発現させるかまたは発現させない外来性核酸が導入された（例えば、形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされた）宿主細胞を示すために使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調節配列が核酸と作動可能に連結されるように宿主細胞に導入されない限り、その核酸を所望のレベルで発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。例えば突然変異または環境の影響に起因して後続の世代で特定の修飾が起こる可能性があるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないかもしれないが、依然として本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。ＤＡＲまたはその抗原結合部分を含む１またはそれを超えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結されたベクター（例えば、発現ベクター）を有する宿主細胞または宿主細胞の集団が本明細書に記載される。
宿主細胞または宿主細胞の集団は、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、Ｂリンパ球、単球を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞であり、ＧＤ２ ＤＡＲを発現する細胞は、ＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞と呼ばれることがある。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＮＫ細胞であり、ＧＤ２ ＤＡＲを発現する細胞は、ＧＤ２ ＤＡＲ－ＮＫ細胞と呼ばれることがある。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、臍帯血由来ＮＫ細胞および／または胎盤由来ＮＫ細胞を含む。
本開示のポリペプチド（例えば、二量体抗原受容体（ＤＡＲ））は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。一例では、ポリペプチドは、宿主細胞に導入され、発現を許容する条件下で宿主細胞によって発現される組換え発現ベクターに、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を挿入することによる組換え核酸法によって産生される。
組換え核酸操作のための一般的な技術は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｅｄ．，１９８９またはＦ．ＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）および定期更新に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する１またはそれを超える適切な転写または翻訳調節エレメントを担持する発現ベクターに作動可能に連結されている。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、転写を制御するための随意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。発現ベクターには、宿主細胞に複製能力を付与する起点または複製（ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含めることができる。発現ベクターは、トランスジェニック宿主細胞（例えば、形質転換細胞）の認識を容易にする選択を付与する遺伝子を含むことができる。
組換えＤＮＡは、タンパク質の精製に有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列もコードすることができる。タンパク質タグの例には、限定されるものではないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の宿主と共に使用するための好適なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）に見出すことができる。
発現ベクター構築物は、宿主細胞に好適な方法を使用して宿主細胞に導入することができる。核酸を宿主細胞に導入するための様々な方法が当技術分野で公知であり、それには、限定されるものではないが、エレクトロポレーション：塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；ウイルストランスフェクション；非ウイルストランスフェクション；微小投射体の衝突；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが感染因子である場合）が含まれる。適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が含まれる。
適切な細菌としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはＢａｃｉｌｌｕｓ属の種が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種由来の酵母、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなども、ポリペプチドの産生に使用することができる。様々な哺乳動物または昆虫の細胞培養系を用いて組換えタンパク質を発現させることもできる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓによって概説されている（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８）。適切な哺乳動物宿主細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製ポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して組換えタンパク質を発現させることによって調製される。次いで、タンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分を含むポリペプチド鎖はいずれも、トランスジェニック宿主細胞によって発現させることができる。
本明細書中に開示される抗体および抗原結合タンパク質は、細胞翻訳系を使用して産生することもできる。そのような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写を可能にしてｍＲＮＡを産生し、利用する特定の無細胞系（哺乳動物または酵母などの真核生物の無細胞翻訳系あるいは細菌などの原核生物の無細胞翻訳系）においてｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。
本明細書に開示される様々なポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。コドンの使用は、細胞における発現を改善するように選択することができる。そのようなコドンの使用は、選択される細胞型に依存することになる。特殊なコドン使用パターンが、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３ １００（２）：４３８－４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２（１）：９６－１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｎ Ｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ １２（５）：４４６－９；Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９６ ６０（３）：５１２－３８；およびＳｈａｒｐら、Ｙｅａｓｔ．１９９１ ７（７）：６５７－７８を参照されたい。
本明細書中に記載される抗体および抗原結合タンパク質はまた、化学合成によっても作製することができる（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌに記載されている方法による）。タンパク質に対する修飾は、化学合成によっても引き起こすことができる。
本明細書に記載の抗体および抗原結合タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に公知のタンパク質の単離／精製法によって精製することができる。非限定的な例としては、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いて）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分布またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、限定されるものではないが、濾過および透析をはじめとする当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって、異なる緩衝液に交換および／または濃縮することができる。
本明細書に記載の精製抗体および抗原結合タンパク質は、少なくとも６５％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは医薬品として使用するのに十分に純粋である。本明細書に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合部分はいずれも、トランスジェニック宿主細胞によって発現させ、その後、当技術分野で公知の任意の方法を使用して約６５～９８％の純度または高レベルの純度に精製することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体および抗原結合タンパク質（例えば、ＤＡＲ）は、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ－リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖または疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾されたポリペプチドは、脂質、多糖類または単糖類、およびリン酸塩などの非アミノ酸要素を含有することがある。一実施形態では、グリコシル化は、１またはそれを超えるシアル酸部分をポリペプチドにコンジュゲートさせるシアル化であり得る。シアル酸部分は、溶解度および血清半減期を改善する一方で、タンパク質の可能性のある免疫原性も低下させる。Ｒａｊｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１：３１；４０（３０）：８８６８－７６を参照されたい。
一実施形態では、本明細書に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）は、可溶性ポリペプチドになるように修飾することができ、これは抗体および抗原結合タンパク質を非タンパク質性ポリマーに連結することを含む。一実施形態では、非タンパク質性ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンを、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載のような方法で含む。
本開示は、薬学的に許容され得る賦形剤との混合物中に本明細書に記載されるＤＡＲ発現細胞のいずれかを含む治療用組成物を提供する。賦形剤は、担体、安定剤および賦形剤を包含する。薬学的に許容され得る賦形剤の賦形剤には、例えば、不活性希釈剤または増量剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、塩、緩衝剤、安定化剤、保存剤、凍結保護剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および等張剤が含まれる。
治療用組成物およびそれらを調製する方法は当技術分野で周知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０ｔｈ ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ Ｒ．，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）に見出される。治療用組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有することができる。生体適合性で生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーは、本明細書に記載の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の放出を制御するために使用することができる。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）は、抗体（またはその抗原結合タンパク質）の体内分布を制御するために使用することができる。他の潜在的に有用な非経口送達系としては、エチレン－酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系およびリポソームが挙げられる。製剤中の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の濃度は、投与される薬物の投与量および投与経路をはじめとする、いくつかの因子に応じて変化する。
本明細書中に記載のＧＤ２ ＤＡＲ発現細胞はいずれも、非毒性の酸付加塩などの薬学的に許容され得る塩の溶液で投与することができる。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどの高分子酸；塩酸、臭化水素酸、硫酸リン酸などの無機酸が挙げられる。ＤＡＲ発現細胞は、例えば、細胞培養培地、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、リンガー液またはタイロード液を含む組成物中に提供されてもよく、細胞集団の生存力または安定性を維持する、またはＤＡＲ発現細胞の増殖を可能にする成長因子または他のタンパク質を含んでもよい。
本明細書で使用される「対象」という用語は、脊椎動物、哺乳動物、および非哺乳動物を含むヒトおよび非ヒト動物を指す。一実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、オオカミ、カエルまたは魚であり得る。
「投与する」、「投与された」という用語および文法的変形は、当業者に公知の様々な方法および送達系のいずれかを使用した、対象への薬剤の物理的導入を指す。ＧＤ２ ＤＡＲ発現細胞を含む本明細書に開示される製剤の例示的な投与経路としては、例えば注射または注入による静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」というフレーズは、通常は注射による経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入、ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。一実施形態では、製剤は、非経口経路を介して、例えば経口的に投与される。他の非経口経路としては、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、膣内、直腸、舌下または局所が挙げられる。投与は、例えば、１回、複数回、および／または１またはそれを超える長期間にわたって行うこともできる。本明細書に記載されるＧＤ２ ＤＡＲ発現細胞はいずれも、当該分野で公知の方法および送達経路を使用して対象に投与することができる。
「有効量」、「治療有効量」もしくは「有効用量」という用語または関連する用語は互換的に使用されることがあり、対象に投与された場合、腫瘍もしくは癌抗原発現に関連する疾患または障害の測定可能な改善または予防をもたらすのに十分である、本明細書に記載のＤＡＲ発現細胞のいずれかの量を指す。本明細書で提供されるＤＡＲ－ＴまたはＤＡＲ－ＮＫ細胞の治療有効量は、単独でまたは組み合わせて使用される場合、抗体および組合せの（例えば、細胞増殖の阻害における）相対活性に応じて、ならびに処置される対象および疾患症状、対象の体重および年齢および性別、対象の疾患症状の重症度、投与様式などに応じて変化し、これらは当業者によって容易に決定することができる。
一実施形態では、治療有効量は、処置される対象および処置される障害の特定の態様によって決まり、既知技術を使用して当業者によって確認され得る。一般に、ＤＡＲを発現する細胞（例えば、ＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞またはＧＤ２ ＤＡＲ－ＮＫ細胞）は、事前のリンパ球枯渇の有無にかかわらず、約１×１０３～１×１０１２細胞／ｋｇでヒト対象に投与される。ＤＡＲ－Ｔ細胞は、毎日（例えば、１日１回、２回、３回、または４回）またはより少ない頻度（例えば、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月、または四半期ごと）で投与されてよい。さらに、当技術分野で公知のように、年齢、ならびに体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患の重症度の調整が必要な場合がある。
一実施形態では、治療有効量は、対象に投与される体重１ｋｇ当たり約１０３～１０１２個のＤＡＲ－Ｔ細胞の用量を含む。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載のＤＡＲのいずれかを含むポリペプチド鎖を発現する１またはそれを超える発現ベクターを有する。治療有効量は、既知技術を使用して当業者によって確認され得る、治療有効量および処置される疾患／障害を受ける対象を考慮することによって決定することができる。治療有効量は、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患／障害の重症度などの、対象に関係する因子を考慮することができる。治療有効量は、トランスジェニック宿主細胞の純度を考慮することができ、これは約６５％～９８％またはそれよりも高い純度であり得る。治療有効量のトランスジェニック宿主細胞は、一定期間にわたって少なくとも１回、または２回、３回、４回、５回、またはそれを超える回数、対象に投与することができる。期間は、１日、１週間、１ヶ月、または１年とすることができる。対象に投与されるトランスジェニック細胞の治療有効量は、毎回同じであってもよいし、投与事象ごとに増加または減少してもよい。治療有効量のトランスジェニック細胞は、トランスジェニック宿主細胞の投与前の腫瘍サイズまたは癌細胞数と比較して、癌細胞の腫瘍サイズまたは数が５％～９０％またはそれを超えて減少するまで、対象に投与することができる。
本開示は、１またはそれを超える腫瘍関連抗原の発現または過剰発現に関連する疾患／障害を有する対象を処置する方法を提供する。疾患は、腫瘍関連抗原、例えばＧＤ２抗原を発現する癌または腫瘍細胞を含む。一実施形態では、癌または腫瘍には、神経芽細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌、髄芽腫、星状細胞腫、骨肉腫および他の軟部組織肉腫が含まれる。
ＧＤ２二量体抗原受容体
本開示は、ＧＤ２に結合するＦａｂフラグメントを共に含む２つのポリペプチドを含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を提供し、Ｆａｂフラグメントは、第２ポリペプチドの成分である単一の膜貫通領域および細胞内領域に連結されている。本明細書で提供されるＤＡＲは、別々のポリペプチド鎖上に抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は抗原結合ドメインを形成する。本開示は、互いに会合して、ＧＤ２分子（例えば、標的抗原）に結合する抗原結合ドメインを形成する第１および第２ポリペプチド鎖を有する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を提供する。一実施形態では、ＧＤ２は、腫瘍、例えばヒト神経芽細胞腫および黒色腫を含む神経外胚葉起源の腫瘍で過剰発現する。
いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲは、Ｆａｂフラグメントと膜貫通領域との間に任意のヒンジ領域を含み、ヒンジ領域は、第１ポリペプチドの膜貫通領域のＮ末端である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲを発現する宿主細胞は、同じ抗ＧＤ２抗体のｓｃＦｖフォーマットを有するＣＡＲを発現する宿主細胞と比較して、ＧＤ２陽性標的細胞に応答して、例えばクローン増殖、サイトカイン放出、および／または細胞傷害性において、より大きな特異性を示すことができる。
本開示は、膜貫通ドメインを含む１つのポリペプチド鎖上の抗体重鎖可変領域および膜貫通ドメインを含まない別個のポリペプチド鎖上の抗体軽鎖可変領域、あるいは膜貫通ドメインを含む１つのポリペプチド鎖上の軽鎖可変領域および膜貫通ドメインを含まない別個のポリペプチド鎖上の重鎖可変領域を含む、ＧＤ２ ＤＡＲを提供する。ＤＡＲを構成する２つのポリペプチド鎖は、例えば、細胞の外部のその抗体定常領域を介して二量体化し、タンパク質複合体を形成することができる。ＤＡＲは、標的抗原に特異的に結合するため、抗体様特性を有する。二量体抗原受容体は、指向性細胞治療に使用される細胞によって発現させることができる。
本開示は、抗原結合細胞外部分、随意のヒンジ部分、膜貫通部分、ならびに共刺激領域および／または細胞内シグナル伝達領域を有する細胞内部分を有するＧＤ２ ＤＡＲ構築物を発現するように操作されたトランスジェニックＴ細胞を提供する。細胞外部分は、ＧＤ２発現疾患細胞に結合する高い親和性および結合活性を示し、Ｔ細胞の活性化および疾患細胞の死滅をもたらす一方で、正常細胞を温存する。ＧＤ２ ＤＡＲの細胞内部分は、抗原結合時にＴ細胞活性化を媒介する共刺激領域および／またはシグナル伝達領域を含み、これはＴ細胞増殖の増強、メモリーＴ細胞の形成および／またはＴ細胞の消耗の低減をもたらし得る。本明細書には、細胞内共刺激性領域およびシグナル伝達領域のタイプおよび数が異なるＧＤ２ ＤＡＲの複数の配置が記載されており、強力で迅速なエフェクター応答を生成するため、および／または、より長く持続するメモリーＴ細胞集団を生成するための、ＧＤ２ ＤＡＲ（例えば、細胞内４－１ＢＢ共刺激領域を含むＧＤ２ ＤＡＲ）を設計する際の柔軟性を提供する。
本開示は、第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖を有するＧＤ２ ＤＡＲを提供し、第１ポリペプチド鎖は抗体の重鎖可変領域を含み、第２ポリペプチド鎖は抗体の軽鎖可変領域を含み、第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖の両方が細胞によって発現される場合、第１ポリペプチド鎖は、遺伝子操作された細胞の外側の領域で１つまたは複数のジスルフィド結合によって第２ポリペプチド鎖に連結される。いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲは、抗体重鎖可変ドメイン領域および重鎖ＣＨ１領域、随意のヒンジ領域、膜貫通領域、および２～５個のシグナル伝達ドメインを有する細胞内領域を順に含む第１ポリペプチド鎖と、κまたはλ軽鎖定常領域であってよい対応する軽鎖定常領域（ＣＬ）を有する抗体軽鎖可変ドメイン領域を含む第２ポリペプチド鎖とを含み、ここで第１および第２の各ポリペプチド鎖のＣＨ１領域とＣＬ領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合で連結され得る（例えば、図１Ａおよび図１Ｂを参照）。
本開示はまた、第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖を有するＧＤ２ ＤＡＲを提供し、第１ポリペプチド鎖は抗体の軽鎖可変領域を含み、第２ポリペプチド鎖は抗体の重鎖可変領域を含み、第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖の両方が同じ細胞によって発現される場合、第１ポリペプチド鎖は、形質導入細胞の外側の領域で１つまたは複数のジスルフィド結合によって第２ポリペプチド鎖に連結される。いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲ構築物は、κまたはλ軽鎖定常領域であってよい対応する軽鎖定常（ＣＬ）領域を有する抗体軽鎖可変ドメイン領域、それに続いてヒンジ領域、膜貫通領域、および２～５個のシグナル伝達ドメインを有する細胞内領域を順に含む第１ポリペプチド鎖と、抗体重鎖可変ドメイン領域およびＣＨ１領域を含む第２ポリペプチド鎖とを含み、ここで第１および第２ポリペプチド鎖のＣＬおよびＣＨ１領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合で連結され得る（例えば、図１Ｃおよび１Ｄを参照）。いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲ構築物は、κまたはλ軽鎖定常領域であってよい対応する軽鎖定常（ＣＬ）領域を有する抗体軽鎖可変ドメイン領域、それに続いてヒンジ領域、膜貫通領域、および２～５個のシグナル伝達ドメインを有する細胞内領域を順に含む第１ポリペプチド鎖と、抗体重鎖可変ドメイン領域およびＣＨ１領域を含む第２ポリペプチド鎖から本質的になり、ここで第１および第２ポリペプチド鎖のＣＬおよびＣＨ１領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合で連結され得る。
ＧＤ２ ＤＡＲの第１ポリペプチド鎖は、例えば、配列番号２によるマウス１４．１８（１４．１８）重鎖可変領域；配列番号３によるヒト化１４．１８（ｈｕ１４．１８）重鎖可変領域；キメラ３Ｆ８（ｃｈ３Ｆ８）重鎖可変領域；またはヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８）重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域を含み得る。抗体重鎖定常領域は、ヒト抗体重鎖定常領域、例えばヒトＣＨ１ドメイン（例えば、配列番号４）に由来する配列を含む。様々な実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体に由来し得る。ＧＤ２ ＤＡＲの第２ポリペプチド鎖は、例えば、配列番号５によるマウス１４．１８（１４．１８）軽鎖可変領域；配列番号６によるヒト化１４．１８（ｈｕ１４．１８）軽鎖可変領域、；キメラ３Ｆ８（ｃｈ３Ｆ８）軽鎖可変領域；またはヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８）軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含み得る。抗体軽鎖定常領域は、ヒト抗体軽鎖定常領域、例えばκまたはλＣＬドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８）であり得るヒトＣＬドメインに由来する配列を含み得る。
上記の代わりに、ＧＤ２ ＤＡＲの第１ポリペプチド鎖は、例えば、配列番号５によるマウス１４．１８（１４．１８）軽鎖可変領域；配列番号６によるヒト化１４．１８（ｈｕ１４．１８）軽鎖可変領域、；キメラ３Ｆ８（ｃｈ３Ｆ８）軽鎖可変領域；またはヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８）軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含み得る。抗体軽鎖定常領域は、ヒト抗体軽鎖定常領域、例えばκまたはλＣＬドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８）であり得るヒトＣＬドメインに由来する配列を含み得る。ＧＤ２ ＤＡＲの第２ポリペプチド鎖は、例えば、配列番号２によるマウス１４．１８（１４．１８）重鎖可変領域；配列番号３によるヒト化１４．１８（ｈｕ１４．１８）重鎖可変領域；キメラ３Ｆ８（ｃｈ３Ｆ８）重鎖可変領域；またはヒト化３Ｆ８（ｈｕ３Ｆ８）重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域を含み得る。抗体重鎖定常領域は、ヒト抗体重鎖定常領域、例えばヒトＣＨ１ドメイン（例えば、配列番号４）に由来する配列を含む。一実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体に由来し得る。
本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲは、ヒンジ領域を有していても有していなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲは、ヒンジ領域を含み、ヒンジ領域は、約１０～約１２０アミノ酸長である。いくつかの非限定的な例では、ヒンジ領域は、ＣＤ２８ヒンジ領域またはそのフラグメント（例えば、配列番号９）、ＣＤ８αヒンジ領域またはそのフラグメント（例えば、配列番号１０）、ＣＤ２８とＣＤ８のヒンジ領域を組み合わせたヒンジ領域（例えば、配列番号１１）、あるいは抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を結合する抗体のヒンジ領域（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）、あるいはこれらのいずれかに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有する、そのいずれかに由来するヒンジ領域であり得る。抗体に由来するヒンジ領域は、抗体またはそのアミノ酸配列の１またはそれを超える定常領域を含んでもよく、含まなくてもよい。
様々な実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α（例えば、配列番号１３）、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８（例えば、配列番号１２）、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ－１ Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２ Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂからなる群から選択される膜タンパク質配列領域に由来し得る。
様々な実施形態では、シグナル伝達領域は、ＣＤ３－ζ鎖、４－１ＢＢ（例えば、配列番号１６）、ＣＤ２８（例えば、配列番号１７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０（例えば、配列番号１８）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２２６、およびそれらの組合せからのシグナル伝達領域からなる群から選択することができる。例えば、ＤＡＲの第１ポリペプチドのシグナル伝達領域は、これらのシグナル伝達領域のいずれかに由来する２つまたは３つのシグナル伝達領域を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達領域（配列番号１９）のＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ、２および／またはＩＴＡＭ３を有するＣＤ３ζに由来するシグナル伝達領域を含むシグナル伝達領域を有し、非限定的な例として、４－１ＢＢ（配列番号１６）、ＣＤ２８（配列番号１７）またはＯＸ４０（配列番号１８）共刺激ドメインであり得る少なくとも１つのさらなるシグナル伝達領域（または共刺激シグナル伝達ドメイン）を有する。いくつかの実施形態では、細胞内領域は、ＣＤ２８共刺激領域（例えば、配列番号１７）およびＣＤ３－ζ細胞内シグナル伝達配列（例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２）、または４－１ＢＢ共刺激およびＣＤ３－ζ細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達領域のＣＤ３－ζ部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）モチーフ１、２および３（例えば、長いＣＤ３－ζ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達領域のＣＤ３－ζ部分は、ＩＴＡＭモチーフの１つのみ、例えばＩＴＡＭ１、２または３のみ（例えば、短鎖ＣＤ３－ζ）を含む。
一実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ、または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ、または配列番号１１のＣＤ２８およびＣＤ８ヒンジ配列を含むヒンジ領域（例えば、長いヒンジ）を含む。一実施形態では、第１ポリペプチドはヒンジ領域を欠く。一実施形態では、膜貫通領域は、配列番号１２（ＣＤ２８由来）；配列番号１３（ＣＤ８由来）；配列番号１４（４－１ＢＢ由来）；または配列番号１５（ＣＤ３ζ由来）のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、細胞内領域は、配列番号１６（４－１ＢＢ由来）；配列番号１７（ＣＤ２８由来）；配列番号１８（ＯＸ４０由来）；配列番号１９（ＣＤ３ζＩＴＡＭ１、２および３）；配列番号２０（ＣＤ３ζＩＴＡＭ１）；配列番号２１（ＣＤ３ζＩＴＡＭ２）；および／または配列番号２２（ＣＤ３ζＩＴＡＭ３）からなる群から選択される細胞内配列のいずれか１つまたは２またはそれを超える任意の組合せからのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１ポリペプチド鎖は、配列番号２３、２４もしくは２５のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含むか、または第１ポリペプチドはリーダー配列を欠く。
第１および第２のＤＡＲポリペプチド（例えば、図２Ａ～Ｄ）の一方または両方の前駆体ポリペプチドを含む、本明細書に記載のＧＤ２ ＤＡＲをコードする核酸分子も提供される。様々な実施形態では、ＧＤ２ ＤＡＲコード配列は、発現カセット内で、真核細胞で機能するプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結させることができる。
本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲをコードする核酸配列を含むように遺伝子操作された宿主細胞がさらに含まれる。細胞は、様々な実施形態において、Ｔ細胞受容体発現についてノックアウトすることができ、非限定的な例として、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えばヒトＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。遺伝子操作された細胞は、初代細胞であり得る。本明細書に記載のＧＤ２ ＤＡＲを発現するように遺伝子操作された細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の集団は、集団の細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％がＧＤ２ ＤＡＲを発現する集団であり得る。本明細書に記載のＧＤ２ ＤＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞などの細胞の集団は、集団の細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％がＧＤ２ ＤＡＲを発現し、Ｔ細胞受容体を発現しない、例えば内因性Ｔ細胞受容体を発現しない集団であり得る。
ＧＤ２ ＤＡＲを発現する本明細書で提供される宿主細胞は、例えばＰＢＳ、ＨＢＳＳ、リンガー液またはタイロード液を含む緩衝液、塩溶液または細胞培地製剤中に医薬組成物として提供することができる。本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲを発現する宿主細胞を含む組成物は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、グリセロールまたは糖アルコールをさらに含むことができ、組成物は凍結組成物として提供することができる。本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲを発現する宿主細胞を含む組成物は、必要に応じて、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、ポリマー、抗酸化剤、酵素、小分子または細胞の安定性、生存性もしくは機能性に寄与し得る他の化合物を含むことができ、かつ／あるいは、限定されるものではないが、抗体（抗体ドメインを有する操作されたポリペプチドを含む）、サイトカイン、成長因子または小分子を含む、治療上の利益を提供し得る１またはそれを超える化合物を含むことができる。
本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲを発現する宿主細胞は、癌、例えば、神経芽腫、黒色腫、小細胞肺癌、髄芽腫、星状細胞腫または骨肉腫を有する対象を処置する方法において使用することができる。Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体発現を欠く可能性があり、いくつかの実施形態では、処置されている対象に関して同種異系であってよい。本方法は、本明細書で提供されるＧＤ２ ＤＡＲをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、有効量の宿主細胞集団を対象に投与するステップを含み得る。投与は、任意の実際的な経路を介して行うことができる。いくつかの例では、投与は静脈内投与である。いくつかの例では、投与には、腫瘍内注射または腫瘍周囲注射などの注射が含まれ得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の投薬量のＧＤ２ ＤＡＲ Ｔ細胞集団を、癌の発症または検出後に、必要に応じて疾患の処置に必要な期間にわたって投与することができる。
実施例
以下の実施例は、例示を意図しており、本開示の実施形態をさらに理解するために使用することができる。それらは、決して本教示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
実施例１．腫瘍細胞株におけるＧＤ２の発現。
フローサイトメトリーを使用して、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合させた抗ＧＤ２抗体を用いて、細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）（小細胞肺癌）ＳＫ－ＭＥＬ－５（ＧＤ２＋）（黒色腫）；Ｋ５６２（ＧＤ２－）（赤白血病（ＣＭＬ））；Ｈ４６０（ＧＤ２＋）（非小細胞肺癌）のＧＤ２を検出した。対照実験では、細胞をＡＰＣに結合させたＩｇＧと共にインキュベートした。図３は、Ｈ５２４およびＳＫ－ＭＥＬ－５には検出可能なＧＤ２発現があるのに対し、Ｋ５６２およびＨ４６０では細胞表面に検出可能なＧＤ２が少ないかまたは全くないことを示している。
実施例２．ヒトＰＢＭＣ細胞および初代Ｔ細胞の単離。
初代ヒトＴ細胞は、健康なヒトドナーから、バフィーコート（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ血液バンク）、新鮮血または白血球除去製品（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）のいずれかから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離によって単離した。いくつかの実験では、単離されたＴ細胞ではなくＰＢＭＣにＧＤ２ ＤＡＲおよびＣＡＲ構築物をトランスフェクトした。
Ｔ細胞を、ＥＡＳＹＳＥＰ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した磁気陰性選択によって、またはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）による陽性選択および活性化によって、製造業者の指示に従ってＰＢＭＣから単離した。
いくつかのトランスフェクションでは、被覆細胞培養フラスコ中でＰＢＭＣを１～２時間プレーティングすることによって単球を除去した後、Ｔ細胞をＰＢＭＣから増殖させ、その後、非接着性リンパ球をフラスコから洗浄し、次いで、製造業者の指示に従って新しいフラスコ中でＴ細胞ＴＲＡＮＳＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ）で活性化した。
単離したＴ細胞または単球を除去したＰＢＭＣから増殖させたＴ細胞集団を、新たに単離するか、またはＣＡＲもしくはＤＡＲ構築物によるトランスフェクションのために凍結保存から解凍した。細胞を、３００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を含む５％ ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＣＴＳ ＯＰＴＭＩＺＥＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ中で１０６細胞／ｍＬの密度で培養した。前駆体抗ＧＤ２ ＣＡＲまたは前駆体抗ＧＤ２ ＤＡＲのいずれかをコードする核酸分子によるトランスフェクションの前に、細胞を３ｕＬ／１０６細胞／ｍＬのＴ細胞ＴＲＡＮＳＡＣＴ（ＣＤ３およびＣＤ２８アゴニストを含有、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で２～３日間活性化した。
実施例３．Ｔ細胞受容体ノックアウト／ＤＡＲ－Ｔ細胞の調製。
活性化Ｔ細胞（約９×１０６（９ｅ６）細胞）または場合によってはＰＢＭＣを、ＧＤ２ ＤＡＲまたはＧＤ２ ＣＡＲのいずれかをコードする核酸でトランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ＣＡＲまたはＤＡＲ 構築物をＴＲＡＣ（Ｔ細胞受容体α定常）遺伝子（ＴＲＡ遺伝子、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９５５としても公知）に直接挿入して、操作されたＧＤ２受容体がゲノムに安定に組み込まれ、細胞表面で発現される細胞においてＴ細胞受容体がノックアウトされるようにした。
初代Ｔ細胞またはＰＢＭＣに導入された２つのＧＤ２ ＤＡＲ構築物は、ＤＡＲの第１および第２のポリペプチド鎖の抗体ドメインの配列のみが異なっていた。ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲには、抗ＧＤ２抗体１４．１８の重鎖および軽鎖可変領域が含まれていた（Ｍｕｊｏｏら（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：２８５７－２８６１）。ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲの第１ポリペプチドは、ヒト重鎖定常領域（配列番号４）に連結された抗ＧＤ２モノクローナル抗体１４．１８重鎖可変領域（配列番号２）を含み、ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲの第２ポリペプチドは、ヒトκ軽鎖定常領域（配列番号７）に連結された抗ＧＤ２モノクローナル抗体１４．１８軽鎖可変領域（配列番号５）を含んでいた。ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲには、ヒト化抗ＧＤ２抗体ｈｕ１４．１８の重鎖および軽鎖可変領域が含まれていた（米国特許第７，１６９，９０４号）。ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲの第１ポリペプチドは、ヒト重鎖定常領域（配列番号４）に連結された抗ＧＤ２ヒト化抗体ｈｕ１４．１８重鎖可変領域（配列番号３）を含み、ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲの第２ポリペプチドは、ヒトκ軽鎖定常領域（配列番号７）に連結された抗ＧＤ２ヒト化抗体ｈｕ１４．１８軽鎖可変領域（配列番号６）を含んでいた。
これらのＧＤ２ ＤＡＲの両方が、同一の配置（図１Ａ）ならびに同一のヒンジ、膜貫通領域および細胞内領域を有していた。
ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲの第１ポリペプチドには、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号２の１４．１８抗体重鎖可変領域、続いて重鎖ＣＨ１領域（配列番号４）、ＣＤ２８のヒンジ領域（配列番号９）、ＣＤ２８の膜貫通領域（配列番号１２）、４－１ＢＢの共刺激細胞内ドメイン（配列番号１６）、およびＩＴＡＭ１、２、および３を含むＣＤ３ζの内部シグナル伝達ドメイン（配列番号１９）が含まれていた。ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲの第２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号５の１４．１８抗体軽鎖可変領域と、それに続く軽鎖ＣＬκ領域（配列番号７）を含んでいた。第１および第２のポリペプチドをコードする核酸構築物には、それぞれ宿主細胞の膜への組み込みおよび宿主細胞からの分泌のための前駆体ポリペプチドの合成のために、第１および第２のポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドをコードする配列が含まれた：配列番号２３をコードする配列は、第１ポリペプチドのＶＨドメインをコードする配列に先行し、配列番号２４をコードする配列は、第２ポリペプチドのＶＬドメインをコードする配列に先行した。シグナルペプチドを含む２つの前駆体ポリペプチドは、第１ポリペプチドをコードする配列と第２ポリペプチドをコードする配列とがＴ２Ａアミノ酸配列（配列番号２６）をコードする配列によって連結された、単一の転写単位によってコードされ、それにより、単一の転写産物によってコードされる２つのポリペプチドは、翻訳され、２つの成熟ポリペプチド（配列番号３２および配列番号３３）にプロセシングされ、細胞の外側でその抗体定常領域を介してジスルフィド結合を介して会合してＤＡＲとなる。Ｔ２Ａ配列（配列番号３０）によって連結された２つの前駆体ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３１として提供される。配列番号３１の核酸配列は、Ｔ細胞にトランスフェクトされる発現カセットを提供するために、ＪｅＴプロモーター（配列番号３９）に作動可能に連結された。
ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲをコードする第２のＧＤ２ ＤＡＲ構築物には、抗ＧＤ２抗体ｈｕ１４．１８の重鎖および軽鎖可変領域が含まれていた。ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲの第１ポリペプチドには、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号３のｈｕ１４．１８重鎖可変領域、続いて重鎖ＣＨ１領域（配列番号４）、ＣＤ２８のヒンジ領域（配列番号９）、ＣＤ２８の膜貫通領域（配列番号１２）、４－１ＢＢの共刺激細胞内ドメイン（配列番号１６）、およびＩＴＡＭ１、２、および３を含むＣＤ３ζの内部シグナル伝達ドメイン（配列番号１９）が含まれていた。ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲの第２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号６のｈｕ１４．１８軽鎖可変領域と、それに続く軽鎖ＣＬκ領域（配列番号７）を含んでいた。第１および第２のポリペプチドをコードする核酸構築物には、それぞれ宿主細胞の膜への組み込みおよび宿主細胞からの分泌のための前駆体ポリペプチドの合成のために、第１および第２のポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドをコードする配列が含まれた：配列番号２３をコードする配列は、第１ポリペプチドのＶＨドメインをコードする配列に先行し、配列番号２４は、第２ポリペプチドのＶＨドメインをコードする配列に先行した。シグナルペプチドを含む２つの前駆体ポリペプチドは、第１ポリペプチドをコードする配列と第２ポリペプチドをコードする配列とがＴ２Ａアミノ酸（配列番号２６）をコードする配列によって連結された、単一の転写単位によってコードされ、それにより、単一の転写産物によってコードされる２つのポリペプチドは、翻訳され、２つの成熟ポリペプチド（配列番号３６および配列番号３７）にプロセシングされ、細胞の外側でその抗体定常領域を介してジスルフィド結合を介して会合してＤＡＲとなる。Ｔ２Ａ配列によって連結されたＧＤ２ ｈｕ１４．１８ ＤＡＲの２つのポリペプチドをコードする核酸配列を、配列番号３５として提供する。配列番号３５の核酸配列は、Ｔ細胞にトランスフェクトされる発現カセットを提供するために、ＪｅＴプロモーター（配列番号３９）に作動可能に連結された。
また、ＧＳリンカー（配列番号３８）によって連結された、配列番号２および配列番号５の抗ＧＤ２ １４．１８抗体重鎖および軽鎖配列に基づくｓｃＦｖを、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号９）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号１２）、およびＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１７）、ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１９）に連結した、ＧＤ２ ＣＡＲ構築物も生成された。別の構築物には、同じＧＳリンカー（配列番号３８）によって連結され、同様にＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号９）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号１２）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１７）、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１９）にも連結された、配列番号３および配列番号６のｈｕ１４．１８抗体重鎖および軽鎖配列が含められた。これらのＣＡＲをコードする構築物は、初代Ｔ細胞へのトランスフェクション用の発現カセット内のＪｅＴプロモーター（配列番号３９）にも連結された。
Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子を同時にノックアウトしたＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞およびＧＤ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。ＪｅＴプロモーターの下流にクローニングされた上記のＧＤ２ ＤＡＲおよびＣＡＲ構築物（配列番号３９）を、ＡＡＶベクターｐＡＡＶ－ＭＣＳにおいて、Ｃａｓ９媒介性組み込みの標的部位（配列番号４２）に隣接するＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８７５５）の５’と３’との間の相同領域（それぞれ配列番号４０および配列番号４１）にクローニングした。ＪｅＴプロモーターに作動可能に連結され、ＴＲＡＣ遺伝子相同領域に隣接するＧＤ２ ＤＡＲまたはＣＡＲ構築物を含有する細菌クローンを配列決定によって確認した。
Ｃａｓ９を用いたＣＡＲまたはＤＡＲのノックイン／ＴＣＲノックアウトのために、まず、配列番号４２の標的配列を含むＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡと、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ（両方ともアイオワ州コーラルビルのＩＤＴ製）とを組み合わせ、混合物を９５℃で５分間加熱することによって、ＲＮＰ複合体を作製した。次いで、混合物をベンチトップ上で約２０分間室温（１８～２５℃）に冷却して、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を作製した。各トランスフェクションについて、核局在化配列（ＩＤＴ）を含む１０μｇの野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質を２００ｐｍｏｌのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖と混合し、混合物を４℃で３０分間インキュベートしてＲＮＰを形成した。
ＧＤ２ ＤＡＲ構築物のＣａｓ９媒介挿入のためのドナーＤＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子由来の５’および３’相同配列（それぞれ配列番号４０および配列番号４１）に隣接する、配列番号３１のＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲ構築物または配列番号３５のＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲ構築物のいずれかを含むｐＡＡＶプラスミドから作製した。配列番号４５（１７１ｂｐ）および配列番号４６（１６１ｂｐ）のより短い相同アームを有するドナーフラグメントは、配列：Ａ＊ＴｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴ（配列番号４３）を有するフォワードプライマー、および配列：ＧＡＣＣＴＣＡＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＴＧ（配列番号４４）を有するリバースプライマーを用いて作製した。フォワードプライマー（配列番号４３）は、５’末端から１番目と２番目、３番目と４番目、および４番目と５番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含んでいた（アスタリスク（＊）で示す）。フォワードオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端から３番目、４番目および５番目のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾されていた（ｍＣ、ｍＡ、およびｍＣと命名）。リバースプライマー（配列番号４４）は化学修飾を全く行わなかったが、５’末端リン酸を含んでいた。ＰＣＲを基本に上記のように行って、１７１および１６１ｂｐｓのＴＲＡＣ遺伝子座相同アーム（配列番号４５および配列番号４６）が隣接する、ＧＤ２ ＤＡＲ発現カセットを有する二本鎖ドナーＤＮＡ分子が作製された。得られた二本鎖ＧＤ２ ＤＡＲドナーＤＮＡ断片を、Ｃａｓ９ ＲＮＰと共に二本鎖分子として活性化Ｔ細胞の独立したトランスフェクションに使用した。
ＧＤ２ ＣＡＲ構築物を含むドナーＤＮＡを、ＧＤ２ ＤＡＲ構築物を含むドナーと同じ方法で設計し、合成した。同じプライマー（配列番号４３および配列番号４４）を使用して、１７１および１６１ｂｐの相同アームを有する二本鎖ドナー断片を作製した。
ＧＤ２ ＣＡＲおよびＧＤ２ ＤＡＲドナーＤＮＡと、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰによる細胞のトランスフェクションは、基本的に米国特許出願公開第２０２０／０２２４１６０号；国際公開第２０２０／１７６７４０号、および国際公開第２０２０／１８５８６７号（これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように行った。Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびドナー断片によるエレクトロポレーションの後、細胞を培養培地に希釈し、５％血清置換および３７℃の３００Ｕ／ｍｌ ＩＬ２を補充したＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ中で、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞が増殖培養に入ったら、２または３日ごとに細胞数を取得し、細胞濃度を１ｍＬあたり５×１０５（５ｅ５）～１×１０６（１ｅ６）に維持した。
対照細胞として使用するために、単離されたＴ細胞をドナー断片の非存在下、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰでトランスフェクトした。そのような細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有していたが、ＧＤ２ ＤＡＲまたはＣＡＲ構築物が挿入されていないため、ＴＣＲノックアウト（ＴＲＡＣ ＫＯ）細胞である。
図４は、１４日間の培養後、Ｔ細胞受容体の検出にはＣＤ３に対する標識抗体を、ＧＤ２ ＤＡＲまたはＣＡＲの検出にはＧＤ２を模倣する抗イディオタイプ抗体１Ａ７を使用した、フローサイトメトリーの結果を提供する。２つのバージョンのＧＤ２ ＣＡＲでトランスフェクトした細胞は、Ｔ細胞受容体発現がない場合に（ｙ軸）、集団の約３６％がＧＤ２ ＣＡＲを発現していた（ｘ軸）。ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲトランスフェクト細胞集団では、Ｔ細胞受容体発現がない場合、ＧＤ２ ＤＡＲを発現する細胞の割合が若干低くなった（約３０％）。ＧＤ２ ＤＡＲを発現する細胞のほぼすべてが、Ｔ細胞受容体を発現しなかった（すなわち、ＣＤ３陰性であった）（下のパネル）。
実施例３：ＣＡＲ－ＴおよびＤＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ増殖。
ＧＤ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＤＡＲ－Ｔ細胞のクローン増殖を、ＧＤ２を発現した細胞（ＧＤ２＋）と、対照として、ＧＤ２の検出可能な発現がない細胞（ＧＤ２－）で試験した（図３）。ＧＤ２ ＣＡＲおよびＤＡＲトランスフェクト細胞集団を、ＮＣＩ－Ｈ５４２ ＧＤ２＋細胞、ならびにＳＫ－ＭＥＬ－５ ＧＤ２＋細胞、Ｋ５６２ ＧＤ２－細胞、およびＨ４６０ ＧＤ２－細胞と別々に共培養した。７日間の共培養後にフローサイトメトリーを用いて細胞増殖レベルを測定した（図５）、このとき、Ｔ細胞受容体発現の非存在下でＧＤ２ ＤＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞集団の割合を基本的に実施例２のように評価した。図５は、共培養細胞の非存在下で同じ時間培養されたＧＤ２ ＤＡＲまたはＣＡＲを発現する集団の割合と比較した場合（左端のパネル）、ＤＡＲ－Ｔ細胞の割合はＧＤ２＋細胞との共培養によって増加したが、ＣＡＲ－Ｔ細胞については同様ではなく、ＧＤ＋細胞との共培養の７日後にＴ細胞集団に占める割合は増加しなかったことを示す。
実施例４．インビトロ細胞傷害性アッセイ。
インビトロ細胞傷害性アッセイのために、細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２４（小細胞肺癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－５（黒色腫）およびＨ４６０（非小細胞肺癌）を、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ遺伝子を有するレンチウイルスを用いて形質導入した。ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現する単一細胞クローンを選択し（ＮＣＩ－Ｈ５２４－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ／ｐｕｒｏおよびＳＫ－ＭＥＬ－５－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ／ｐｕｒｏ）、アッセイで使用するために増殖させた。
抗ＧＤ２ ＣＡＲ－ＴまたはＤＡＲ－Ｔ細胞を、ＧＤ２＋ＮＣＩ－Ｈ５２４－Ｆｌｕｃ／ＧＦＰ／ｐｕｒｏまたはＳＫ－ＭＥＬ－５－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ／ｐｕｒｏ細胞、またはＧＤ２－Ｈ４６０－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ／ｐｕｒｏ細胞と共培養した。エフェクター対標的細胞の比は、Ｈ５２４細胞を標的として使用する場合は０．３：１～３：１の範囲であり、ＳＫ－ＭＥＬ－５細胞およびＨ４６０細胞を標的として使用する場合は１０：１～１．２５：１の範囲であった。一晩インキュベーションした後、細胞をフローサイトメトリーに供してＧＦＰ発現細胞集団を測定し、抗ＧＤ２ ＣＡＲまたはＤＡＲ Ｔ細胞による特異的標的細胞の殺傷を測定した。
ルシフェラーゼに基づくアッセイは、９６ウェルプレートにおいて行った。１００μｌのホタルルシフェラーゼ標識ＮＣＩ－Ｈ５２４細胞を５×１０５細胞／ｍｌで添加し、１００μｌのＴ細胞を添加して、３：１、１：１および０．３：１のＥ：Ｔ比を得た。腫瘍のみの対照については培地１００μｌを添加し、完全溶解対照については０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含有する培地１００μｌを添加した。Ｔ細胞を添加した後プレートを２４時間インキュベートし、その時点で、７５μｌのアッセイ培養物を黒色壁９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに移し、７５μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。インキュベーションの５分後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて発光を測定し、腫瘍のみの対照および完全溶解対照に対して正規化した後に細胞傷害性を計算した。
ＳＫ－ＭＥＬ－５およびＨ４６０細胞を標的として使用するアッセイを、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザーアッセイを使用して行った。Ｅ－Ｐｌａｔｅ Ｖｉｅｗ ９６（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、ＳＫ－ＭＥＬ－５およびＨ４６０細胞を１ウェルあたり１×１０４細胞で播種し、プレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ機器（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に戻した。一晩インキュベートした後、培地を１００μｌの新鮮な培地に交換し、１００μｌのＴ細胞を添加して、１０：１、５：１、２．５：１および１．２５：１のＥ：Ｔ比を得た。腫瘍のみの対照については培地１００μｌを添加し、完全溶解対照については０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する培地１００μｌを添加した。リアルタイムのインピーダンスモニタリングのために、プレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ機器（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に戻した。ＲＴＣＡソフトウェアｐｒｏ（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞傷害性を計算した。
単離されたＴ細胞をトランスフェクトして調製されたＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞、ならびにＰＢＭＣをトランスフェクトして調製したＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞は、用量依存的にＨ５２４（ＧＤ２＋）標的細胞を死滅させ、ＳＫ－ＭＥＬ－５（ＧＤ２＋）標的細胞も死滅させたが（図６Ａ）、ＧＤ２－Ｈ４６０細胞に対して細胞傷害性を示さなかった（図６Ｂ）。しかしながら、ほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞調製物は、ＧＤ２－Ｈ４６０細胞に対する細胞傷害性を示した（図６Ｂ）。
実施例５：インビトロサイトカイン分泌アッセイ。
ＧＤ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＧＤ２ ＤＡＲ－Ｔ細胞および対照Ｔ細胞をＩＬ－２で一晩栄養飢餓にし、次いでＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）またはＫ５６２（ＧＤ２－）細胞と共培養した。４０時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離して、サイトカインＩＦＮ－γ（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘ Ｓｅｔ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはＧＭ－ＣＳＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＨｕｍａｎ ＧＭ－ＣＳＦ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡキット）を検出するための上清を製造者の説明書に従って回収した。
９６ウェルプレートに、５×１０５細胞／ｍｌの１００μｌのＮＣＩ－Ｈ５２４またはＫ－５６２細胞を添加し、Ｔ細胞については１００μｌの培地のみを添加した。１００μｌのＴ細胞を１．５×１０６細胞／ｍｌで添加して、Ｅ：Ｔ比を３：１にした。プレートをインキュベーションのためにインキュベーターに戻した。インキュベーションの４８時間後、上清を回収し、ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＳＣＦのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
図７Ａは、単独で、またはＮＣＩ－Ｈ５２４細胞もしくはＫ５６２細胞と共に培養されたＧＤ２ ＤＡＲ構築物およびＧＤ２ ＣＡＲ構築物でトランスフェクトされた細胞によって分泌されたＩＦＮ－γの量を示す。ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ構築物をトランスフェクトしたＴ細胞とＰＢＭＣはともに、ＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）細胞とともに培養すると大量のＩＦＮ－γを発現したが、Ｋ５６２（ＧＤ２－）細胞とともに培養するとＩＦＮ－γをほとんど発現しなかった。１つのＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、ＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）細胞上で有意な量のＩＦＮ－γ産生を示したが、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｋ５６２（ＧＤ２－）細胞と共に培養した場合、さらに大量のＩＦＮ－γを産生し、単独で培養した場合にもかなりの量のＩＦＮ－γを産生した。
図７Ｂは、単独でまたはＮＣＩ－Ｈ５２４細胞もしくはＫ５６２細胞と共に培養したＧＤ２ ＤＡＲおよびＧＤ２ ＣＡＲ構築物でトランスフェクトした細胞によって分泌されたＧＭ－ＣＳＦの量を示す。ＧＤ２（１４．１８）ＤＡＲ構築物でトランスフェクトされたＴ細胞とＰＢＭＣは両方とも、ＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）細胞と共に培養した場合にＩＦＮ－γを発現したが、Ｋ５６２（ＧＤ２－）細胞と共に培養した場合には検出不能な量のＧＭ－ＣＳＦを産生した。ＧＤ２（ｈｕ１４．１８）ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、再びＮＣＩ－Ｈ５２４（ＧＤ２＋）細胞上で有意な量のＧＭ－ＣＳＦ産生を示したが、ＩＦＮ－γ産生に関しては、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｋ５６２（ＧＤ２－）細胞とともに培養するとさらに大量のＩＦＮ－γを産生し、単独で培養した場合もかなりの量のＩＦＮ－γを産生した。
実施例６：マウスモデルにおけるインビボ腫瘍殺傷。
抗ＧＤ２ ＣＡＲまたはＤＡＲ Ｔ細胞の殺腫瘍活性を、ルシフェラーゼを発現したＳＫ－ＭＥＬ－５（ＧＤ２＋）腫瘍細胞株（ｔｕｍｏｒ－Ｆｌｕｃ）を使用して異種移植マウスモデルで試験した。合計約３×１０６細胞のｔｕｍｏｒ－Ｆｌｕｃ細胞を１００μＬのＰＢＳに懸濁し、次いで各マウスの右側腹部に皮下注射した。
１５日後、５×１０７（５×１０６ ＧＤ２ ＤＡＲ陽性）抗ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲまたは５×１０７（１．２５×１０７ ＧＤ２ ＤＡＲ陽性）抗ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲのいずれかで単回処置したＴ細胞を、２００μＬのＰＢＳ中で尾静脈を介して投与した。同量のＴＲＡＣノックアウトＴ細胞を対照群に静脈内投与し、第４の群には２００μＬのＰＢＳのみを投与した。
図８に示すように、ＩＶＩＳイメージングからの生物発光を用いて、各動物の腫瘍量をモニタリングした。経時的な腫瘍体積および動物体重を図９に示す。これは、ＧＤ２ ＤＡＲ処置マウスは、実験の間に腫瘍が着実に増えた対照群と比較して、腫瘍がほとんど確立されず、対照群で示される体重減少もなかったことを示している。図１０は、ＧＤ２－ｈｕ１４．１８ ＤＡＲ－Ｔ細胞処置群のすべてのマウスが研究終了（約８週間）まで生存し、他のどの群よりも生存率が高かったことを示している。ＧＤ２－１４．１８ ＤＡＲ－Ｔ細胞処置群の生存率は研究終了時に６０％であったが、ＰＢＳ処置およびＴＲＡＣノックアウト処置はそれぞれ１０％および２０％の生存率しかもたらさなかった。

Claims (56)

  1. ＧＤ２に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する、遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団であって、前記ＤＡＲが、
    ａ．アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域を含む第１ポリペプチド；および
    ｂ．アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域と（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２ポリペプチドであって、前記第２ポリペプチドは膜貫通領域を含まない、第２ポリペプチド；
    を含み、
    前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、前記ＤＡＲを形成するための二量体化ドメインを形成し、
    前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＧＤ２に結合する抗原結合ドメインを形成する、遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  2. 前記ＤＡＲが、
    ａ．（ｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と（ｖ）細胞内領域から本質的になる第１ポリペプチド；および
    ｂ．（ｉ）抗体軽鎖可変領域と（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域から本質的になる第２ポリペプチド
    を含む、請求項１に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  3. ＧＤ２に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団であって、前記ＤＡＲが、
    ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域を含む第１ポリペプチド鎖；および
    ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域と（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む第２ポリペプチド鎖であって、前記第２ポリペプチドは膜貫通領域を含まない第２ポリペプチド鎖；
    を含み、
    前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を形成するための二量体化ドメインを形成し、
    前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＧＤ２に結合する抗原結合ドメインを形成する、遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  4. 前記ＤＡＲが、
    ａ．（ｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域と、（ｖ）細胞内領域から本質的になる第１ポリペプチド；および
    ｂ．（ｉ）抗体重鎖可変領域と（ｉｉ）抗体重鎖定常領域からなる第２ポリペプチド
    を含む、請求項３に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  5. 前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が１またはそれを超えるジスルフィド結合を介して二量体化する、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  6. 前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群から選択される抗体由来のヒンジ配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  7. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８ヒンジ領域もしくはＣＤ８α／ＣＤ２８ヒンジ領域、またはそれらのいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有するヒンジ領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  8. 前記ヒンジが、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号９）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有するヒンジ領域を含む、請求項７に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  9. 前記膜貫通領域が、ＣＤ８、ＣＤ２８、４－１ＢＢもしくはＣＤ３ζ膜貫通領域、またはそれらのいずれかと少なくとも９５％の同一性を有する膜貫通領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  10. 前記膜貫通領域が、ＣＤ２８（配列番号１２）由来の膜貫通ドメイン配列、またはそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  11. 前記細胞内領域が、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号１６）、ＩＴＡＭ１、２および３を有するＣＤ３ζ（配列番号１９）、ＩＴＡＭ１を有するＣＤ３ζ（配列番号２０）、ＩＴＡＭ３を有するＣＤ３ζ（配列番号２２）、またはＣＤ２８（配列番号１７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０（配列番号１８）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２および／またはＣＤ２２６のいずれかの細胞内領域からなる群から選択される１またはそれを超える細胞内アミノ酸配列、またはそれらのいずれかと少なくとも９５％の同一性を有する細胞内アミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞。
  12. 前記細胞内領域が、ＩＴＡＭ１、２および３（配列番号１９）を有するＣＤ３ζを含む、請求項１１に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  13. 前記細胞内領域が４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号１６）をさらに含む、請求項１２に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  14. 前記抗体重鎖可変領域が、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  15. 前記抗体軽鎖定常領域が、配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  16. 前記抗体重鎖可変領域が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  17. 前記抗体軽鎖定常領域が、配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  18. 前記第１のポリペプチド鎖が配列番号３２の前記アミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  19. 前記第２ポリペプチド鎖が配列番号３３の前記アミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  20. 前記第１ポリペプチド鎖が配列番号３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  21. 前記第２ポリペプチド鎖が配列番号３７の前記アミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  22. 前記ＤＡＲが、
    ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８の前記ヒンジ領域（配列番号９）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有するヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８の前記膜貫通領域（配列番号１２）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有する膜貫通ドメイン；および（ｖ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン（配列番号１６）を含む細胞内領域、およびＩＴＡＭ１、２および３（配列番号１９）を含むＣＤ３ζ細胞内領域を含むか、またはそれから本質的になる第１ポリペプチド鎖；ならびに
    ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖定常領域を含むか、またはそれから本質的になる第２ポリペプチドであって、前記第２ポリペプチドは膜貫通領域を含まない、第２ポリペプチド
    を含む、請求項１または請求項２に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  23. ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８の前記ヒンジ領域（配列番号９）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有するヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８の前記膜貫通領域（配列番号１２）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有する膜貫通ドメイン；および（ｖ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン（配列番号１６）を含む細胞内領域、およびＩＴＡＭ１、２および３（配列番号１９）を含むＣＤ３ζ細胞内領域を含むかまたは、それから本質的になり；かつ
    ｂ）第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖定常領域を含むかまたはそれから本質的になり、前記第２のポリペプチド鎖が膜貫通ドメインを含まない、
    請求項１または２に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  24. 前記ＤＡＲが、
    （ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８の前記ヒンジ領域（配列番号９）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有するヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８の前記膜貫通領域（配列番号１２）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有する膜貫通ドメイン；および（ｖ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン（配列番号１６）を含む細胞内領域、およびＩＴＡＭ１、２および３（配列番号１９）を含むＣＤ３ζ細胞内領域を含むか、またはそれから本質的になる第１ポリペプチド鎖；ならびに
    （ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖定常領域を含むか、またはそれから本質的になる第２ポリペプチドであって、前記第２ポリペプチドは膜貫通領域を含まない、第２ポリペプチド
    を含む、請求項３または請求項４に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  25. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８の前記ヒンジ領域（配列番号９）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有するヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８の前記膜貫通領域（配列番号１２）またはそれと少なくとも９５％の同一性を有する膜貫通ドメイン；および（ｖ）４－１ＢＢ細胞内ドメイン（配列番号１６）を含む細胞内領域、およびＩＴＡＭ１、２および３（配列番号１９）を含むＣＤ３ζ細胞内領域を含むかまたは、それから本質的になり；かつ
    （ｂ）第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖可変領域；および（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖定常領域を含むかまたはそれから本質的になり、前記第２のポリペプチド鎖が膜貫通ドメインを含まない、
    請求項１または２に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  26. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）配列番号２の前記アミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖可変領域；およびｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、（ｉ）配列番号５の前記アミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖可変領域を含む、請求項２２または請求項２３に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  27. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）配列番号３の前記アミノ酸配列を含むＧＤ２抗体重鎖可変領域；およびｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、（ｉ）配列番号６の前記アミノ酸配列を含むＧＤ２抗体軽鎖可変領域を含む、請求項２２または請求項２３に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  28. 前記遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団が、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１から２７のいずれかに記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  29. 少なくとも１つの核酸配列が、配列番号３２のポリペプチドおよび配列番号３３のポリペプチドをコードする、請求項２８に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  30. 少なくとも１つの核酸配列が配列番号３０の前駆体ポリペプチドをコードする、請求項２９に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  31. 少なくとも１つの核酸配列が、配列番号３１、またはそれと少なくとも６５％の同一性を有する配列を含む、請求項３０に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  32. 少なくとも１つの核酸配列が、配列番号３６のポリペプチドおよび配列番号３７のポリペプチドをコードする、請求項２８に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  33. 少なくとも１つの核酸配列が配列番号３４の前駆体ポリペプチドをコードする、請求項３２に記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  34. 少なくとも１つの核酸配列が、配列番号３５、またはそれと少なくとも６５％の同一性を有する配列を含む、請求項３３に記載の遺伝子組換え宿主細胞、または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  35. Ｔリンパ球、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、Ｂリンパ球または単球を含む、請求項１～３４のいずれかに記載の遺伝子組換え宿主細胞または遺伝子組換え宿主細胞の集団。
  36. 前記細胞が初代細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞の集団。
  37. 前記細胞がヒト細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞の集団。
  38. 前記集団がＴ細胞を含む、請求項３５に記載の宿主細胞の集団。
  39. 前記ＤＡＲを発現する前記細胞の少なくとも９０％が前記Ｔ細胞受容体を発現しない、請求項３５に記載の宿主細胞の集団。
  40. 前記ＤＡＲを発現する前記細胞の少なくとも９５％が前記Ｔ細胞受容体を発現しない、請求項３５に記載の宿主細胞の集団。
  41. 薬学的に許容され得る賦形剤と、請求項３５～４０のいずれかに記載の宿主細胞の集団とを含む医薬組成物。
  42. バッグ、バイアル、チューブ、またはディッシュで提供される、請求項４１に記載の医薬組成物。
  43. 前記組成物が凍結されている、請求項４１に記載の医薬組成物。
  44. 癌を有する対象を処置する方法であって、請求項１～４０のいずれかに記載の宿主細胞の前記集団、または請求項４１～４３のいずれかに記載の前記医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
  45. 前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、食道癌、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、髄芽腫、星状細胞腫または骨肉腫である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記癌が黒色腫または骨肉腫である、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記細胞集合が、数日間、数週間または数ヶ月間にわたって複数回投与される、請求項４４～４６のいずれかに記載の方法。
  48. ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｉｉ）膜貫通領域、および（ｉｖ）細胞内領域を含む第１ポリペプチド；および
    ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２ポリペプチドであって、前記第２ポリペプチドが膜貫通ドメインを含まない、第２ポリペプチド；
    をコードする少なくとも１つの核酸分子であって、
    前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域は、前記ＤＡＲを形成するための二量体化ドメインを形成し、
    前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域は、ＧＤ２に結合する抗原結合ドメインを形成する、
    少なくとも１つの核酸分子。
  49. ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｉｉ）膜貫通領域、および（ｉｖ）細胞内領域を含む第１ポリペプチド鎖；および
    ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む第２ポリペプチド鎖であって、前記第２ポリペプチド鎖が膜貫通ドメインを含まない、第２ポリペプチド鎖；
    をコードする少なくとも１つの核酸分子であって、
    前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域は、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を形成するための二量体化ドメインを形成し、
    前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域は、ＧＤ２に結合する抗原結合ドメインを形成する、
    少なくとも１つの核酸分子。
  50. アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（１）重鎖リーダー配列（２）抗体重鎖可変領域、（３）抗体重鎖定常領域、（４）任意のヒンジ領域、（５）膜貫通領域、（６）細胞内領域、（７）自己切断配列、（８）軽鎖リーダー配列、（９）抗体軽鎖可変領域、および（１０）抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記自己切断配列が、前記前駆体ポリペプチドを第１および第２のポリペプチド鎖に切断することを可能にする、核酸分子。
  51. アミノ末端からカルボキシル末端へ向かって並んだ複数のポリペプチド領域：（１）軽鎖リーダー配列（２）抗体軽鎖可変領域、（３）抗体軽鎖定常領域、（４）任意のヒンジ領域、（５）膜貫通領域、（６）細胞内領域、（７）自己切断配列、（８）重鎖リーダー配列、（９）抗体重鎖可変領域、および（１０）抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記自己切断配列が、前記前駆体ポリペプチドを第１および第２のポリペプチド鎖に切断することを可能にする、核酸分子。
  52. 前記抗体重鎖可変領域が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の１またはそれを超える核酸分子。
  53. 前記抗体重鎖定常領域が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の１またはそれを超える核酸分子。
  54. 前記抗体軽鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の１またはそれを超える核酸分子。
  55. 前記抗体軽鎖定常領域が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の１またはそれを超える核酸分子。
  56. 配列番号３１または配列番号（ＥＱ ＩＤ ＮＯ）３５のアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の核酸分子。
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