JP2024515289A - Ｈ－ａｂｃ白質ジストロフィーの治療に有用な組成物および方法 - Google Patents

Abstract

Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの治療のための組成物および方法が開示されている。

Description

関連出願との相互参照

本出願は、２０２１年４月１６日に出願された米国仮出願第６３／１７５９９８号の優先権を主張し、その開示全体は、参照により本明細書に具体的に援用される。

（電子形式で提出された資料の参照による取り込み）
その全体が参照により本明細書に援用されるのは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、２０２２年４月１８日に作成され、７７，８２４バイトのサイズを有するＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔという名前のテキストファイルとしての配列表である。

（技術分野）
本発明は、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの分野と、その症状を改善するための低分子組成物、特に修飾アンチセンス分子の使用方法に関する。より具体的には、本発明は、チューブリンα４Ａ（ＴＵＢＢ４Ａ）をダウンモジュレートする修飾核酸ベースの治療薬を提供し、それによって、それを必要とする患者のジストニア、運動失調、変化した歩行および運動機能障害を改善する。

本発明が関係する技術水準を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文献が引用されている。なお、これらの引用文献はすべて記載が、本明細書においては参照により援用される。

大脳基底核と小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全症症（Ｈ－ＡＢＣとも呼ばれる）は、脳の２つの部分、すなわち身体の動作と運動を制御する大脳基底核と小脳を標的とした神経系の損傷が進行する稀な遺伝性疾患である（Ｈｅｒｓｈｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。Ｈ－ＡＢＣは白質ジストロフィーの一種で、脳の白質に影響を及ぼす疾患群である。本明細書で使用するＨ－ＡＢＣは、ジストニア、髄鞘形成不全、発達異常の多様な症状を伴う、より大きな関連障害群、例えばＴＵＢＢ４Ａ関連障害も指すことを意図している（Ｂｌｕｍｋｉｎら、２０１４；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２０１４；Ｐｉｚｚｉｎｏら、２０１４）。これらの疾患は、髄鞘形成過程の障害と関連しており、その結果、脳や脊髄の神経細胞を取り囲んで保護し、細胞間のメッセージ伝達を速める髄鞘が損傷する。通常、髄鞘形成は生後数年間に起こる。Ｈ－ＡＢＣでは、体内でミエリンを正常レベルで産生することができないため、髄鞘形成不全がみられ、脳の正常な髄鞘形成が妨げられる。場合によっては、脳外の神経が冒されることもある。残念ながら、大脳基底核と小脳のサイズと機能も低下する。その結果、Ｈ－ＡＢＣ患者はしばしば、筋肉や関節のこわばり、筋緊張の低下、動作の制御困難、バランスと協調性の問題などの運動障害を有する（Ｂｌｕｍｋｉｎら、２０１４；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２０１４；Ｐｉｚｚｉｎｏら、２０１４；Ｓｉｍｏｎｓら、２０１３）。

Ｈ－ＡＢＣはＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の突然変異によって引き起こされ、多くの場合、発症した人にランダムな突然変異として現れる。このような場合、両親とも保因者ではないので、この病気を持つ子供が生まれる可能性は極めて低い。片方の親が一部の細胞に突然変異を持つ（モザイク）可能性もわずかにあり、その場合は症状は出ないが、他の子供に障害を伝えることができる。

現在のところ、この病気の治療法は知られていない。Ｈ－ＡＢＣの症状を改善する新しい治療薬が緊急に必要とされている。

本発明に従って、標的細胞中のＴＵＢＢ４Ａレベルを低下させ、それによってそれを必要とする患者のＨ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの症状を改善する方法が提供される。例示的な方法は、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする合成阻害性核酸分子を含む組成物の治療有効量の投与を含み、ここで、ＴＵＢＢ４Ａレベルを低下させることにより、前記患者において、ｉ）運動発達遅延；ｉｉ）認知機能障害；ｉｉｉ）歩行機能障害；ｉｖ）運動失調；ｖ）意図振戦；ｖｉ）構音障害；ｖｉｉｉ）発声障害；およびｖｉｉｉ）異常髄鞘形成不全；のうちの１つ以上を軽減する。好ましい実施形態において、合成核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集ＴＵＢＢ４Ａ標的核酸に適したガイド鎖から選択される。また、それを必要とする患者において、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーに関連する疾患、障害および／または状態、またはそれらの症状を治療、発症遅延、改善、および／または軽減する方法も提供される。一態様において、本方法は、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする治療有効量の合成阻害性核酸を患者に投与することを含み、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーに関連する疾患、障害および／または状態、またはそれらの症状が、患者において治療され、阻害され、発症が遅延され、改善され、および／または軽減される。上記のように、合成核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集に適したガイド鎖から選択される。特定の実施形態において、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする合成阻害性核酸は、表３または表５に記載されており、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および／または取り込みを増加させるように改変されている。特定の実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする合成核酸は、ベクターにクローニングされる。他の実施形態において、白質ジストロフィーは、髄鞘形成不全に関連する疾患、障害および／または状態である。他の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結を含み、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾された糖を含み、または修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾された核酸塩基を含む。本発明の別の態様において、本方法は、白質ジストロフィーの治療に有用な追加の活性医薬剤の投与をさらに含む。

また、ＴＵＢＢ４Ａの発現を低下させるための組成物であって、生物学的に許容される担体中に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集に適したガイド鎖から選択される、ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸を標的とし、それに特異的にハイブリダイズする合成阻害性核酸分子を含む組成物も提供される。特定の実施形態において、合成阻害性核酸は、体液中での安定性および／または目的の細胞への取り込みを増加させるように修飾される。好ましい実施形態において、合成阻害性核酸は表３または表５に記載されている。核酸は任意選択でベクターにクローニングされる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルス関連ベクターなどがある。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは脂質ナノ粒子複合体中で投与される。合成阻害性核酸および、またはそれを含むベクターもしくは担体は、薬学的に許容される担体中に存在し得、それらは、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞投与、頭蓋内投与、非経口投与、筋肉内投与、および静脈内投与を含むがこれらに限定されない投与経路を介して製剤化される。好ましい実施形態において、組成物は、単回脳室内（ＩＣＶ）ボーラス注射用に製剤化される。
また、前述の方法のいずれかを実施するのに適した部品を含むキットも提供される。

［１］標的細胞中のＴＵＢＢ４Ａレベルを低下させ、それによりそれを必要とする患者におけるＨ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの症状を改善する方法であって、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする合成阻害性核酸分子を含む組成物の治療有効量の投与を含み、前記細胞中のＴＵＢＢ４Ａレベルを低下させ、前記患者において、
ｉ） 運動発達遅延；
ｉｉ） 認知機能障害；
ｉｉｉ） 歩行機能障害；
ｉｖ）運動失調；
ｖ） 意図振戦；
ｖｉ） 構音障害；
ｖｉｉ） 発声困難
ｖｉｉｉ） 異常髄鞘形成不全；
の１つ以上を減少させ、
合成核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集ＴＵＢＢ４Ａ標的核酸に適したガイド鎖から選択される、方法。
［２］それを必要とする患者において、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーに関連する疾患、障害および／または状態、またはそれらの症状を治療、発症遅延、改善、および／または軽減する方法であって、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする治療有効量の合成核酸を患者に投与することを含み、ここで、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーに関連する疾患、障害および／または状態、またはそれらの症状が、患者において治療され、阻害され、発症が遅延され、改善され、および／または軽減され、 合成核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集に適したガイド鎖から選択される、方法。
［３］ＴＵＢＢ４Ａを標的とする前記合成核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および／または取り込みを増加させるように改変される、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＴＵＢＢ４Ａを標的とする前記合成核酸が修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、［１］または［２］に記載の方法。
［５］前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする前記合成核酸をベクターにクローニングする、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびアデノウイルス関連ベクターから選択される、［１］～［５］に記載の方法。
［７］疾患、障害および／または状態が髄鞘形成不全に関連する、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記合成核酸が、表３または表５に提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、［４］に記載の方法。
［９］核酸が修飾され、ヒトＴＵＢＢ４Ａ核酸の一部と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％相補的な核酸塩基配列を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
［１０］修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結を含み、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾された糖を含み、または修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾された核酸塩基を含む、［９］に記載の方法。
［１１］白質ジストロフィーの治療に有用な追加の活性医薬剤をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
［１２］生物学的に許容される担体中に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集に適したガイド鎖から選択される、ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸を標的とし、それに特異的にハイブリダイズする合成核酸分子を含む、ＴＵＢＢ４Ａの発現を低下させるための組成物。
［１３］前記合成核酸が、体液中での安定性および／または目的の細胞での取り込みを増加させるように改変されている、［１２］に記載の組成物。
［１４］前記合成核酸が表３または表５に記載されている、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
［１５］前記合成核酸分子がベクター中に存在する、［１２］～［１４］のいずれかに記載の組成物。
［１６］ｅｘ ｖｉｖｏ細胞投与、頭蓋内投与、非経口投与および静脈内投与用に製剤化された［１２］～［１５］のいずれかに記載の組成物。
［１７］前記組成物が単回脳室内（ＩＣＶ）ボーラス注射用に処方される、［１２］～［１５］のいずれかに記載の組成物。
［１８］［１］～［１１］のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
［１９］前記合成核酸がＡＳＯ Ｈ１４またはＡＳＯ Ｈ１５である、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。

ＡＳＯのライブラリーは、ヒトＡ５４９Ｎ細胞を用いてエレクトロポレーション法により３反復でスクリーニングされた。異なる濃度（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ）のＡＳＯエレクトロポレーション後、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに供してＴＵＢＢ４Ａの 発現レベルを評価した。ＴＵＢＢ４Ａ発現はＧＡＰＤＨで標準化した（ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１Ａは、非標的コントロール（ＮＴＣ）（スクランブルオリゴで処置した細胞）とＡＳＯ Ｈ１－Ｈ５のＴＵＢＢ４ＡｍＲＮＡ発現を示す。図１Ｂは、ＡＳＯ Ｈ６－Ｈ１２のＴＵＢＢ４ＡｍＲＮＡ発現を示す。図１Ｃは、ＡＳＯ Ｈ１３－Ｈ１９のＴＵＢＢ４ＡｍＲＮＡ発現を示す。図１Ｄは、ＮＴＣ、ＡＳＯ Ｈ２Ａ、ＡＳＯ Ｈ２Ｂ、ＡＳＯ Ｈ１０Ａ、ＡＳＯ Ｈ１０Ｂ、ＡＳＯ Ｈ１１Ａ、ＡＳＯ Ｈ１１Ｂ、ＡＳＯ Ｈ１５Ａ、およびＡＳＯ Ｈ１５ＢのＴＵＢＢ４ＡｍＲＮＡ発現を示す。 ＡＳＯのライブラリーは、マウスＨＴ－２２細胞株を用いてエレクトロポレーション法により３反復でスクリーニングされた。異なる濃度（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ）のＡＳＯエレクトロポレーション後、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに供してＴＵＢＢ４Ａの 発現を評価した。ＴＵＢＢ４Ａ発現はｓｆｒｓ９で正規化した（ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図２ＡはＡＳＯ １－７のＴＵＢＢ４ａ ｍＲＮＡ発現を示す。図２ＢはＡＳＯ ８－１４のＴＵＢＢ４ａｍＲＮＡ発現を示す。図２Ｃは、ＡＳＯ Ｈ１５－Ｈ２１のＴＵＢＢ４ａｍＲＮＡ発現を示す。図２Ｄは、ＡＳＯ ４Ａ、ＡＳＯ ４Ｂ、ＡＳＯ ６Ａ、ＡＳＯ ６Ｂ、ＡＳＯ ７Ａ、およびＡＳＯ ７ＢのＴＵＢＢ４ＡｍＲＮＡ発現を示す。図２Ｅは、ＡＳＯ ２２－２４およびＮＴＣ ＡＳＯ１－ＡＳＯ３のＴＵＢＢ４ＡｍＲＮＡ発現を示す。 ＡＳＯによる効率的なＴＵＢＢ４Ａ 転写抑制。ＡＳＯ７Ａ（図３Ａ）、ＡＳＯ７Ｂ（図３Ｂ）、ＡＳＯ６Ａ（図３Ｃ）およびＡＳＯ６Ｂ（図３Ｄ）を注射した野生型マウスの大脳皮質、小脳、線条体における、注射１０日後のＴＵＢＢ４Ａ転写物のレベルを示すＲＴ－ｑＰＣＲデータ。 ＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞を２５０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、１０μｍのＢｉｏｓｐｒｉｎｇとＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＳＯで９６時間処置した。ＲＮＡを抽出してｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＴＵＢＢ４Ａのレベルを調べた。 ＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞を２５０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、１０μｍのＢｉｏｓｐｒｉｎｇとＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＳＯで９６時間処置した。ＴＵＢＢ４Ａのレベルを調べるために、ＲＮＡを抽出してＢｉｏｓｐｒｉｎｇを実施した。 ＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞を１ウェルあたり１００００細胞でプレーティングし、１０μｍのＢｉｏｓｐｒｉｎｇ ＡＳＯで２４時間処置した。ＤｉｇｉｔｏｎｉｎとＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを陽性対照として、生存率（図６Ａ）、細胞傷害性（図６Ｂ）、アポトーシス（図６Ｃ）を試験した。 ＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞を１ウェルあたり１００００細胞でプレーティングし、１０μｍのＢｉｏｓｐｒｉｎｇ ＡＳＯで４８、７２、９６時間処置した。ＤｉｇｉｔｏｎｉｎとＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを陽性対照として、生存率（図７Ａ）、細胞傷害性（図７Ｂ）、アポトーシス（図７Ｃ）を試験した。 ジムノシスを用いた対照ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおける潜在的ＡＳＯ候補の選択。ヒトｉＰＳＣ由来培地ニューロンを３７日目に処置し、４日後に再補充して、合計１週間処置した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａの発現を測定した。 ＡＳＯの毒性。ヒトｉＰＳＣ由来培地ニューロンを３７日目に処置し、４日後に再補充して、合計１週間処置した。ＡＳＯの潜在的毒性を評価するため、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＢＡＸ（図９Ａ）とＢＣＬ－２（図９Ｂ）の発現を測定した。ＢＡＸ／ＢＣＬ－２の比が１以上であればアポトーシスが多く、１未満であればアポトーシスが少ないことを示す（図９Ｃ）。 ジムノシスを用いた対照ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンに対する潜在的ＡＳＯ候補の用量反応。ヒトｉＰＳＣ由来培地ニューロンを１日目に処置し、４日後に再補充して、合計１週間処置した。ＲＮＡを抽出し ＴＵＢＢ４Ａの発現をｑＲＴ－ＰＣＲで測定した。 ＡＳＯの毒性。ヒトｉＰＳＣ由来培地ニューロンを３７日目に処置し、４日後に再補充して、合計１週間処置した。ＡＳＯの潜在的毒性を評価するため、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＢＡＸ（図１１Ａ）とＢＣＬ－２（図１１Ｂ）の発現を測定した。ＢＡＸ／ＢＣＬ－２の比が１以上であればアポトーシスが多く、１未満であればアポトーシスが少ないことを示す（図１１Ｃ）。 ＡＳＯ候補Ｈ１５をＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、ジムノシスを用いて変異ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}）におけるダウンレギュレーションを評価した。前回のダウンレギュレーションの結果を確認するため、野生型中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）を再実行した：ヒトｉＰＳＣ由来の中型ニューロンをｄ３７で処置し、ｄ４で再補充し、合計１週間処置した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａの発現を測定した。 ｉＰＳＣ由来ヒト変異ＭＳＮにおけるＡＳＯ毒性。ヒトｉＰＳＣ由来中型有棘ニューロンを３７日目に処置し、４日後に再補充した。ＡＳＯの潜在的毒性を評価するため、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＢＡＸ（図１３Ａ）とＢＣＬ－２（図１３Ｂ）の発現を測定した。ＢＡＸ／ＢＣＬ－２の比が１以上であればアポトーシスが多く、１未満であればアポトーシスが少ないことを示す（図１３Ｃ）。 マウスの皮質初代ニューロンを２００Ｋ細胞／ウェルでプレーティングし、１μｍと５μｍのバイオスプリングＡＳＯで１週間処置した。ＲＮＡを抽出してｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＴＵＢＢ４Ａのレベルを調べた。図１４ＡはＡＳＯ６－１からＡＳＯ７－４までのＴＵＢＢ４Ａ ＡＳＯのダウンレギュレーションを示す。図１４Ｂは、ＡＳＯ ８－１からＡＳＯ １８－３までのＴＵＢＢ４ＡＡＳＯのダウンレギュレーションを示す。 マウスの皮質一次ニューロンを１５０Ｋ細胞／ウェルでプレーティングし、１μｍと５μｍのバイオスプリングＡＳＯで１週間処置した。ＲＮＡを抽出してｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＴＵＢＢ４Ａのレベルを調べた。 マウス皮質ニューロンを２００００細胞／ウェルでプレーティングし、５μｍのＢｉｏｓｐｒｉｎｇ ＡＳＯで９６時間処置した。ＤｉｇｉｔｏｎｉｎとＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを陽性対照として、生存率（図１６Ａ）とアポトーシス（図１６Ｂ）を試験した。 ＡＳＯ注射後の運動結果を評価するため、野生型マウスにＡＳＯ ＩＣＶ注射後３０日目に運動行動ロータロッド（図１７Ａ）と握力（図１７Ｂと図１７Ｃ）を行った。 ＡＳＯ７－２（図１８Ａ）と７－３（図１８Ｂ）をＰ６０（成体）の齢でＩＣＶ注射し、２３－３０日後に組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションを測定した。 ＡＳＯ８－２（図１９Ａ）と８－３（図１９Ｂ）をＰ６０（成体）の齢でＩＣＶ注射し、２３－３０日後に組織を採取し、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションを決定した。 ＡＳＯ１８－１（図２０Ａ）と１８－３（図２０Ｂ）をＰ６０（成体）の齢でＩＣＶ注射し、２３－３０日後に組織を採取し、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションを決定した。Ｐ９０、Ｐ９７、Ｐ１０４注射後のマウスの体重を図２０Ｃに示す。

大脳基底核と小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全症（Ｈ－ＡＢＣ）は、チューブリンα４（ＴＵＢＢ４Ａ）の原因変異に関連するまれな髄鞘形成不全白質ジストロフィーである。例えば、ｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ （Ｄ２４９Ｎ）は罹患者の大多数に見られる反復変異である。ＴＵＢＢ４Ａのモノアレリック変異はまた、早期発症の脳症から成人発症のジストニア４型（ささやき発声障害）まで、より広い範囲の神経障害をもたらす可能性がある（Ｂｌｕｍｋｉｎら、２０１４；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２０１４；Ｐｉｚｚｉｎｏら、２０１４；Ｓｉｍｏｎｓら、２０１３）。Ｈ－ＡＢＣはこのスペクトラムの中にあり、典型的には小児期早期に始まり、ジストニア、運動失調、歩行変化、進行性の運動機能障害を特徴とし、生後１０年末までに歩行ができなくなる。現在までのところ、この進行性で障害を伴う小児疾患に対する治療法はない。ＴＵＢＢ４Ａ変異がどのようにＨ－ＡＢＣを引き起こすかを理解し、治療戦略の開発と前臨床試験を容易にするために、我々のグループはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチを用いて、ヘテロ接合体（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}） 、またはホモ接合体（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}）のＴＵＢＢ４Ａ 変異を保有するノックインマウスモデルを開発した。

以前の研究で、われわれは古典的Ｈ－ＡＢＣのマウスモデル（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}）を報告したが、このモデルは生存率の低下、振戦、異常歩行、運動失調を伴う進行性の運動機能障害を示し、この疾患の表現型の特徴を再現している。ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスの出生後１４日目、２１日目、４０日目における免疫標識とウェスタンブロットを用いた神経病理学的評価では、髄鞘形成の初期遅延とそれに続く最終的な脱髄が示された。時間の経過とともにミエリンタンパク質が減少し、アスパルトシクラーゼ活性（ＡＳＰＡ）陽性のオリゴデンドロサイト（中枢神経系の髄鞘細胞）が劇的に消失する。電子顕微鏡で脳の超薄切片を観察したところ、これらのマウスの脊髄と視神経では、髄鞘形成不全であり、ミエリンの喪失が進行していることが示された。さらに、ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスの培養オリゴデンドロサイトのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、成熟とミエリンマーカーの減少が示された。同様に、神経病理学的にも、線条体と小脳顆粒細胞で重度の神経細胞喪失が認められる。さらに、ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスの細胞では、神経細胞の生存率が低下し、微小管ダイナミクスが不安定になるなど、培養中の神経細胞への影響も認められた。ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスは、Ｈ－ＡＢＣの新規モデルマウスであり、ＴＵＢＢ４Ａ変異による微小管不安定性の可能性、オリゴデンドロサイト、線条体ニューロン、小脳顆粒細胞に対する細胞自律性の影響、および深遠な神経発達表現型をもたらす、この疾患における細胞生理の複雑さを示している。

また、ＴＵＢＢ４Ａの発現を効果的に低下させる新しい治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドを開発し、白質ジストロフィーの治療に新たなアプローチを提供している。

定義
本開示の一部を構成する以下の詳細な説明を参照することにより、本主題をより容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示される特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されるものではなく、本明細書で使用される用語は、例示として特定の実施形態を説明するためのものであり、特許請求される本発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。

本明細書において特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。したがって、文脈上別段の要求がない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。

上記および本開示全体を通じて使用されているように、以下の用語および略語は、特に断りのない限り、以下の意味を有するものと理解されるものとする。

本開示において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形の参照を含み、特定の数値への言及は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、少なくともその特定の数値を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、当業者に公知のそのような化合物およびその等価物の１つまたは複数などへの言及である。本明細書で使用する「複数」という用語は、一つ以上を意味する。値の範囲が表現されている場合、別の実施形態では、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞 「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は包括的で、組み合わせ可能である。

「含む、有する、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｈａｖｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、クレームがオープンであり、記載されていない構成要素についても読むことができることを示している。

特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に言及する場合の「本質的にからなる」という表現は、所定の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関連して使用される場合、この語句には、配列そのものと、配列の機能的かつ新規な特徴に影響を与えない分子修飾が含まれる。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という表現は、クレームが記載された構成要素のみを対象としていることを示している。

本明細書において、「成分」、「組成物」、「化合物組成物」、「化合物」、「薬物」、「薬理活性剤」、「活性剤」、「治療」、「療法」、「治療」、または「医薬品」という用語は、本明細書において互換的に使用され、対象（ヒトまたは動物）に投与された場合に、局所的および／または全身的な作用によって所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘導する化合物または化合物もしくは組成物を指す。「薬剤」および「試験化合物」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または細菌、植物、真菌、動物（特に哺乳類）の細胞や組織などの生物学的材料から作られた抽出物を示す。生物学的高分子には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および本明細書に記載のＴＵＢＢ４Ａ含有核酸またはそのコードされたタンパク質の活性を調節する能力を示す任意の核酸ベースの分子が含まれる。

本明細書で使用する「ＴＵＢＢ４Ａ」とは、βチューブリンファミリーのメンバーをコードする遺伝子のことである。ベータチューブリンは、ヘテロ二量体化して集合し、微小管を形成する２つのコアタンパク質ファミリー（アルファチューブリンとベータチューブリン）のうちの１つである。この遺伝子の変異は、白質形成不全白質ジストロフィー－６、常染色体優性ねじれジストニア－４およびＨ－ＡＢＣを引き起こし、現在ではより一般的にＴＵＢＢ４Ａ関連白質脳症と呼ばれている。ＴＵＢＢ４Ａの参照配列には、例えばＮＭ＿００１２８９１２３．１、ＮＭ＿００１２８９１２７．１、ＮＭ＿００１２８９１２９．１があり、ＧｅｎＢａｎｋに掲載されている。交互スプライシングの結果、異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが生じる。野生型ＴＵＢＢ４Ａ タンパク質の配列はＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０４３５０－ＴＢＢ４Ａ＿ｈｕｍａｎに掲載されている。ヒトの疾患との関連が知られているいくつかのＴＵＢＢ４Ａバリアントが同定され、以下の表１に示されている。本発明はＤ２４９Ｎ変異体に焦点を当てているが、この知見は既存の他のＴＵＢＢ４Ａ変異体にも一般化可能である。

表２は、ＴＵＢＢ４Ａ関連白質脳症のさまざまな型に関連する特定のアミノ酸変化の一覧である。

本明細書で使用される場合、「治療」または「療法」という用語（およびその異なる形態）には、予防的治療（例えば、予防的治療）、治癒的治療、または緩和的治療が含まれる。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語には、状態、疾患または障害の少なくとも１つの副作用または症状を緩和または軽減することが含まれる。

用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、本発明による医薬組成物による予防的処置を含む処置が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書において互換的に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類、（例えばマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、および爬虫類、両生類、ニワトリ、七面鳥などの非哺乳動物を含む。

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用される。デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはその類似体など、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドやヌクレオチドアナログなどの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。存在するならば、ポリマーの組み立て前または組み立て後に、ヌクレオチド構造に修飾を加えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることがある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合など、コンジュゲーション後にさらに修飾することができる。

本明細書で使用する「野生型」という用語は、当業者に理解されている当業者の用語であり、変異型または変種型とは区別される、自然界に存在する生物、系統、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、野生型から逸脱したパターンを有する性質を示すこと、または天然に存在しない成分を含む性質を示すことを意味すると解釈すべきである。

「天然に存在しない」や「人工的」という言葉は、人の手が加わっていることを示し、同じ意味で使われている。核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、この用語は、核酸分子またはポリペプチドが、自然界で、自然界に見られるように、それらが自然に関連する少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

「有効量」または「治療上有効な量」という用語は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療上有効な量は、治療される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方法などのうちの１つ以上によって変化し得、これらは当業者によって容易に決定され得る。この用語はまた、本明細書に記載される撮像方法のいずれか１つによる検出のための画像を提供する線量にも適用される。具体的な投与量は、選択された特定の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物との併用投与の有無、投与のタイミング、画像化される組織、および薬剤が運ばれる物理的送達システムの１つ以上によって変化する。

本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を用いる。以下を参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｆ． Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， （１９８７））； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｍ． Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ． Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ．（１９８８） ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ （Ｒ． Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．（１９８７））。

いくつかの実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， １９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用する場合、発現ベクターの制御機能は通常、１つ以上の制御エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、および本明細書に開示され、当技術分野で公知の他のものに由来する。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の発現系については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９．の第１６章と第１７章を参照のこと。

「ベクター」という用語は、細胞に感染、トランスフェクション、形質転換され、宿主細胞ゲノム内で、あるいは独立して複製することができる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子に関する。環状の二本鎖核酸分子は、制限酵素で処置すると切断され、それによって直鎖化される。ベクター、制限酵素、および制限酵素によって標的化されるヌクレオチド配列の知識の取り合わせは、当業者に容易に入手可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスのような任意のレプリコンを含み、このレプリコンに別の遺伝配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を、付着した配列またはエレメントの複製をもたらすように付着させることができる。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断し、２つの断片をライゲーションすることによってベクターに挿入することができる。

いくつかの実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の発現を誘導することが可能である（例えば、核酸を発現させるために組織特異的調節エレメントが使用される）。組織特異的調節エレメントは当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ球特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ、１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特にＴ細胞レセプターのプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ， ｅｔ ａｌ．， １９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター； Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ， １９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ．第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）を含む。例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ， １９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）やα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ， １９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３：５３７－５４６）などである。高レベルの発現を得るために、ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸をコドン最適化することができる。

核酸の非ウイルス性送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＮＡの薬剤強化取り込みなどがある。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^ＴＭおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質には、Ｆｅｉｇｎｅｒ， ＷＯ ９１／１７４２４； ＷＯ ９１／１６０２４のものがある。細胞への投与（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与など）または標的組織への投与（ｉｎ ｖｉｖｏ投与など）が可能である。

免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）；Ｂａｎｓｋｏｔａら、Ｃｅｌｌ １８５：２５０－２６５（２０２２）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７ （１９９５）； Ｂｅｈｒら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９ （１９９４）； Ｒｅｍｙら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４ （１９９４）； Ｇａｏら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２ （１９９５）； Ａｈｍａｄら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０ （１９９２）； 米国特許第４１８６１８３号、第４２１７３４４号、第４２３５８７１号、第４２６１９７５号、第４４８５０５４号、第４５０１７２８号、第４７７４０８５号、第４８３７０２８号、および第４９４６７８７号）。

核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、体内の特定の細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用している。ウイルスベクターは患者に直接投与することもできるし（ｉｎ ｖｉｖｏ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処置するために使用することもできる。改変された細胞は、任意選択で患者に投与することができる（ｅｘ ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースのシステムには、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスベクターなどがある。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞種や標的組織で高い導入効率が観察されている。

レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターで、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、通常高いウイルス力価を産生する。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存することになる。レトロウイルスベクターは、６－１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を持つシス作用の長い末端反復配列で構成されている。最小限のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製とパッケージングに十分であり、ベクターはその後、治療遺伝子を標的細胞に組み込み、永久的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、以下を参照のこと、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。

一過性の発現が望ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞種で非常に高い導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターでは、高い力価と発現レベルが得られている。このベクターは比較的シンプルなシステムで大量に生産できる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、例えば核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療手順において、標的核酸を細胞に導入するために使用され得る（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８９３（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ Ｃｌｉｎ．第４，７９７，３６８号； ＷＯ ９３／２４６４１； Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１ （１９９４）； Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１ （１９９４）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら， Ｍｏｌ．第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）に記載されている。

パッケージング細胞は通常、宿主細胞に感染可能なウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞には、アデノウイルスを封入した２９３細胞や、レトロウイルスを封入したψ２細胞やＰＡ３１７細胞などがある。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングした細胞株を作製することによって作製される。ベクターは通常、パッケージングとその後の宿主への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含み、その他のウイルス配列は発現させるポリヌクレオチドの発現カセットで置換される。欠けているウイルス機能は通常、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使われるＡＡＶベクターは通常、パッケージングと宿主ゲノムへの統合に必要なＡＡＶゲノムのＩＴＲ配列しか持っていない。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐとｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株でパッケージ化される。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させることもできる。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列がないため、かなりの量はパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって減らすことができる。

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載される１つ以上のベクターで一過性または非一過性にトランスフェクトされる。ある実施形態では、細胞は対象内で天然に存在するようにトランスフェクトされる。ある実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。ある実施形態では、細胞は細胞株など、対象から採取した細胞に由来する。

一態様において、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、それはｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。いくつかの実施形態において、本方法は、ヒトまたはヒト以外の動物から細胞または細胞の集団を採取することと、細胞または細胞を改変することとを含む。培養はｅｘ ｖｉｖｏのどの段階でも可能である。細胞は、ヒトまたはヒト以外の動物に再導入することができる。

一態様において、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて、前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ここで、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に連結される。

一態様において、本発明は、上記の方法および組成物に開示された要素のいずれか１つ以上を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ベクターシステムまたは上記のような代替送達システムのための構成要素を含む。各要素は個別に、または組み合わせて提供することができ、バイアル、ボトル、チューブなど、任意の適切な容器に入れて提供することができる。いくつかの実施形態では、キットは１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。

いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載される１つ以上の要素を利用するプロセスにおいて使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は任意の適切な容器で提供することができる。例えば、キットは１つ以上の反応バッファーまたは保存バッファー を提供することができる。試薬は、特定のアッセイで使用可能な形態で提供されることもあれば、使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮液または凍結乾燥形態）で提供されることもある。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の緩衝液であり得る。いくつかの実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。いくつかの実施形態において、緩衝液は約７～約１０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、キットは、ガイド配列と調節エレメントを作動可能に連結するようにベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。

ダウンモジュレーション核酸または阻害性核酸には、これらに限定されないが、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、トリプレックス形成分子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、外部ガイド配列などが含まれる。これらの核酸分子は、標的分子が持つ特定の活性の作用因子、阻害因子、調節因子、刺激因子として働くことができ、あるいは機能性核酸分子は、他のいかなる分子にも依存しないｄｅ ｎｏｖｏ活性を持つことができる。 特定の実施形態では、阻害性核酸が採用される。

アンチセンス分子は、正規または非正規の塩基対形成によって標的核酸分子と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、例えばＲＮａｓｅ Ｈを介したＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解によって標的分子の破壊を促進するように設計されている。あるいは、アンチセンス分子は、転写や複製など、標的分子で通常行われるはずのプロセシング機能を阻害するように設計されている。アンチセンス分子は標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を見つけることによってアンチセンス効率を最適化する方法は数多く存在する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択実験や、ＤＭＳやＤＥＰＣを用いたＤＮＡ修飾研究などが挙げられる。アンチセンス分子は、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２以下の解離定数（Ｋ_ｄ）で標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計と使用を助ける方法と技術の代表的なサンプルは、米国特許第５，１３５，９１７， ５，２９４，５３３， ５，６２７，１５８， ５，６４１，７５４， ５，６９１，３１７， ５，７８０，６０７， ５，７８６，１３８， ５，８４９，９０３， ５，８５６，１０３， ５，９１９，７７２， ５，９５５，５９０， ５，９９０，０８８， ５，９９４，３２０、５，９９８，６０２、６，００５，０９５、６，００７，９９５、６，０１３，５２２、６，０１７，８９８、６，０１８，０４２、６，０２５，１９８、６，０３３，９１０、６，０４０，２９６、６，０４６，００４、６，０４６，３１９、６，０５７，４３７号に記載されている。

トリプレックスを形成する機能性核酸分子は、二本鎖または一本鎖の核酸と相互作用できる分子である。トリプレックス分子が標的領域と相互作用すると、トリプレックスと呼ばれる構造が形成され、この構造では３本のＤＮＡ鎖がワトソン・クリック塩基対とフーグスティーン型塩基対の両方に依存した複合体を形成する。トリプレックス分子は、高い親和性と特異性で標的領域に結合できるため、好ましい。トリプレックスを形成する分子は、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで標的分子と結合することが好ましい。様々な異なる標的分子を結合させるためのトリプレックス形成分子の作製と使用方法の代表的な例は、米国特許第５，１７６，９９６号、第５，６４５，９８５号、第５，６５０，３１６号、第５，６８３，８７４号、第５，６９３，７７３号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号、および第５，９６２，４２６号に記載されている。遺伝子発現はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって極めて特異的な方法で効果的にサイレンシングすることができる。このサイレンシングはもともと二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加で観察された（Ｆｉｒｅ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：８０６－１１ （１９９８）； Ｎａｐｏｌｉ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：２７９－８９ （１９９０）； Ｈａｎｎｏｎ， Ｇ． Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１８：２４４－５１ （２００２））。ｄｓＲＮＡが細胞に入ると、 ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒによって切断され、３´末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む長さ２１－２３ヌクレオチドの二本鎖小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ． Ｍ．．、ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５：１８８－２００ （２００１）； Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０９：３６３－６ （２００１）； Ｈａｍｍｏｎｄ， Ｓ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０４：２９３－６ （２０００））。ＡＴＰ依存的なステップで、ｓｉＲＮＡは一般にＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるマルチサブユニットタンパク質複合体に組み込まれ、標的ＲＮＡ配列にｓｉＲＮＡを誘導する（Ｎｙｋａｎｅｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １０７：３０９－２１ （２００１））。ある時点でｓｉＲＮＡ二重鎖はほどけ、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したまま、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的ｍＲＮＡ配列の分解を指令するようである（Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １１０：５６３－７４ （２００２））。しかし、ＲＮＡｉやｓｉＲＮＡの効果、あるいはそれらの使用は、いかなる種類のメカニズムにも限定されない。

Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は二本鎖ＲＮＡで、塩基配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができ、それによって遺伝子発現を低下させたり、あるいは阻害したりすることができる。ある例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡの間の配列同一性領域内で、ｍＲＮＡなどの相同ＲＮＡ分子の特異的分解を誘発する。例えば、ＷＯ ０２／４４３２１は、３´オーバーハング末端と塩基対になったときに標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡの製造方法については参照として本明細書に組み込まれる。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ｄｉｃｅｒによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣した合成の短い二本鎖ＲＮＡを用いて哺乳動物細胞で達成することができる （Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１：４９４ ４９８（２００１）； Ｕｉ－Ｔｅｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４７９：７９－８２ （２０００））。ｓｉＲＮＡは化学的に、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできるし、短い二本鎖のヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が細胞内でｓｉＲＮＡに加工された結果であることもある。合成ｓｉＲＮＡは通常、アルゴリズムと従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて設計される。サプライヤーには、Ａｍｂｉｏｎ社（テキサス州オースティン）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（マサチューセッツ州アシュランド）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（コロラド州ラファイエット）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（バージニア州スターリング）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ドイツ、エスバースベルグ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（コロラド州ボルダー）、Ｑｉａｇｅｎ社（オランダ、ヴェント）などがある。ｓｉＲＮＡは、アンビオンのＳＩＬＥＮＣＥＲ．ＲＴＭ．ｓｉＲＮＡなどのキットを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。
本明細書において、宿主細胞におけるタンパク質の産生に言及する場合、「過剰発現」という用語は、そのタンパク質が天然に存在する環境で産生されるよりも多量に産生されることを意味する。

本明細書で使用する「遺伝子改変」という用語は、１つ以上の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を指す。遺伝子改変には、塩基対の置換、塩基配列が既知の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドの付加および欠失が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する「固体マトリックス」という用語は、ビーズ、微粒子、マイクロアレイ、マイクロ滴定ウェルや試験管の表面、ディップスティック、フィルターなど、あらゆる形式を指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロースなどである。

本明細書で使用する「標的核酸」とは、複合核酸混合物中に存在する核酸のあらかじめ定義された領域を指し、定義された野生型領域は、白質ジストロフィーに関連する少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異を含む。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離されるか、または手動で合成される。核酸分子は、トリエステル合成法を用いて手動で合成してもよいし、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成してもよい。

「相補的」という用語は、互いに複数の好ましい相互作用を形成できる２つのヌクレオチドを表す。例えば、アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することができるので相補的である。同様に、グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成できるので相補的である。したがって、ある核酸配列が次の塩基配列、チミン、アデニン、グアニン、シトシンを含む場合、この核酸分子の「相補体」は、チミンの代わりにアデニンを、アデニンの代わりにチミンを、グアニンの代わりにシトシンを、シトシンの代わりにグアニンを含む分子となる。相補体は親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるので、そのような相補体は親分子に高い親和性で結合することができる。

「プロモーターエレメント」という用語は、ベクターに組み込まれ、適切な細胞内に入ると、転写因子および／またはポリメラーゼの結合と、それに続くベクターＤＮＡの一部のｍＲＮＡへの転写を促進することができるヌクレオチド配列を表す。一実施態様において、本発明のプロモーターエレメントは、後者がｍＲＮＡに転写されるように、白質ジストロフィー特異的マーカー核酸分子の５´末端に先行する。次に宿主細胞の装置がｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。

当業者は、核酸ベクターが、プロモーターエレメントおよびＴＵＢＢ４Ａ ダウンモジュレーション核酸分子以外の核酸エレメントを含み得ることを認識するであろう。これらの他の核酸エレメントには、複製起点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、またはポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。

「レプリコン」とは、例えばプラスミド、コスミド、バクミド、プラスミド、ファージ、ウイルスなど、それ自身の制御下で複製が可能な遺伝子のことである。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。

「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳制御配列を有し、宿主細胞または生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸セグメントを指す。

本明細書で使用する場合、用語「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」は、核酸が、発現されると、例えば、生物学的アッセイ、免疫アッセイ、放射免疫アッセイ、または比色法、蛍光法、化学発光法、または他の方法によって容易に測定可能なレポーターシグナルを産生する産物をコードする遺伝子を含んでなる操作可能な遺伝子系を意味する。核酸はＲＮＡでもＤＮＡでもよく、直鎖でも環状でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよく、アンチセンスでもセンス極性でもよく、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントと作動可能に連結されている。必要な制御エレメントは、レポーターシステムの性質や、レポーター遺伝子がＤＮＡの形をしているかＲＮＡの形をしているかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどのエレメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。

上述のように、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に統合（共有結合）されてもされなくてもよい。細菌、酵母、植物、哺乳動物細胞などでは、導入された核酸はエピソームエレメントまたはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持される。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれ、その細胞または生物において安定に維持され、さらにレシピエント細胞または生物の後代細胞または生物に受け継がれる。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物に一時的にしか存在しないことがある。

「作動可能に連結された」という語は、コード配列の発現に必須の調節配列がコード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中の転写ユニットや他の転写制御エレメント（例えばエンハンサー）の配置に適用されることもある。

本明細書に記載される「ジムノシス」とは、一本鎖アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを、担体（例：トランスフェクション）またはコンジュゲーションの非存在下で細胞に送達し、配列特異的遺伝子サイレンシングを生じることを意味する。

「修飾されたバックボーン結合」という表現には、以下が含まれるが、これに限定されるものではない、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、エチルホスホネート結合、ホウ素リン酸結合、スルホンアミド、カルボニルアミド、ホスホロジアミデート、正に荷電した側鎖基を含むホスホロジアミデート結合、ホスホロジチオエート、 アミノエチルグリシン、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル；３´－アルキレンホスホネート；５´－アルキレンホスホネート，キラルホスホネート、ホスフィネート、３´－アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート；チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、２－５´結合ボラノホスホネートアナログ、逆極性を持つ結合、脱塩基連結（ａｂａｓｉｃ ｌｉｎｋａｇｅｓ）、短鎖アルキル連結、シクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、シロキサン骨格を持つ短鎖のヘテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合、スルフィド、スルホキシド、スルホン ホルムアセチル結合、チオホルムアセチル結合、メチレンホルムアセチル結合、チオホルムアセチル結合、リボアセチル結合、アルケン結合、スルファミン酸骨格、メチレンイミノ結合、メチレンヒドラジノ結合、スルホネート結合、アミド結合。

「修飾された糖」という語句には、限定されないが、２´フルオロ、２´フルオロ置換リボース、２´－フルオロ－Ｄ－アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２´－０－メトキシエチルリボース、２´－０－メトキシエチルデオキシリボース、２´－Ｏ－メチル置換リボース、モルホリノ、ピペラジン、およびロック核酸（ＬＮＡ）が含まれる。

「特異的結合対」とは、特異的結合メンバー（ｓｂｍ）と結合パートナー（ｂｐ）を含み、互いに特定の特異性を持ち、通常の状態では他の分子よりも優先的に結合するものである。特異的結合対の例としては、抗原と抗体、リガンドとレセプター、相補的ヌクレオチド配列などがある。当業者は、他の多くの例を知っている。さらに、「特異的結合対」という用語は、特異的結合メンバーおよび結合パートナーのいずれか一方または両方が大きな分子の一部を構成する場合にも適用される。特異的結合対が核酸配列を含む実施形態では、それらはアッセイの条件下で互いにハイブリダイズする長さ、好ましくは１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは１５または２０ヌクレオチド長以上であろう。

「試料」または「患者試料」または「生物学的試料」は一般に、特定の分子、好ましくは以下に示す表のような白質ジストロフィー特異的マーカー分子について検査され得る検体を指す。試料には、細胞、血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、涙液、胸水などの体液が含まれるが、これらに限定されない。

製品およびキット
前述の製品はいずれも、薬学的に許容される担体中にＴＵＢＢ４Ａ指向性ダウンモジュレーション核酸を含むキットに組み込むことができる。核酸は、哺乳動物細胞を形質導入できるベクター中に配置されていても、配置されていなくてもよい。他の態様において、キットは、ヒト野生型ＴＵＢＢ４Ａ および／または変異型ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸を発現するベクターを含み、目的の標的細胞においてこれを過剰発現させる。キットは、核酸の細胞内への送達を促進するナノ粒子製剤またはリポソーム製剤を任意選択に含むことができる。キットはまた、使用説明書、容器、投与用容器、アッセイ基質、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。

治療薬の開発とスクリーニングのための方法
本明細書で同定されたＴＵＢＢ４Ａの遺伝子変化は、Ｈ－ＡＢＣの病因と関連しているので、変異遺伝子およびそのコード産物の活性を調節する薬剤を同定する方法は、白質ジストロフィー、特にＨ－ＡＢＣの治療のための有効な治療薬の生成をもたらすはずである。

分子モデリングによって、変化したＴＵＢＢ４Ａタンパク質の活性部位に結合する能力を持つ特定の有機分子を、コンフォメーションや機能に必要な主要アミノ酸残基に基づいて同定することが容易になるはずである。コンビナトリアルケミストリーのアプローチにより、活性の高い分子を同定し、さらにスクリーニングを繰り返す。

薬物スクリーニングアッセイに使用されるポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で遊離したもの、固体支持体に固定されたもの、細胞内にあるもののいずれでもよい。薬剤スクリーニングの一つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定的に形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイで利用する。このような細胞は、生細胞でも固定細胞でも、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントと試験される薬剤との間の複合体形成を決定したり、ポリペプチドまたはフラグメントと既知の基質との間の複合体形成が試験される薬剤によって妨害される程度を調べたりすることができる。

薬物スクリーニングのための別の技術は、コードされたポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する化合物のハイスループット・スクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎ， ＰＣＴ公開出願ＷＯ ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べると、上記のような多数の異なる小さなペプチド試験化合物を、プラスチックピンなどの固体基質上で合成する。ペプチド試験化合物は標的ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法で検出される。

薬剤スクリーニングのためのさらなる技術として、ＴＵＢＢ４Ａ関連遺伝子が非機能的または改変された宿主真核細胞株または細胞（上記のような）の使用がある。これらの宿主細胞株や細胞はポリペプチドレベルで欠損している。宿主細胞株または細胞は、薬剤化合物の存在下で培養される。宿主細胞の細胞代謝速度を測定し、その化合物が欠損細胞の細胞代謝を調節できるかどうかを判定する。ＤＮＡ分子を導入する方法も、上述したように当業者にはよく知られている。

本発明のＨ－ＡＢＣ関連核酸またはその機能的断片を発現する宿主細胞は、白質ジストロフィーの発症を調節する能力について、潜在的な化合物または薬剤をスクリーニングする系を提供する。したがって、一実施形態では、本発明の核酸分子は、神経細胞シグナル伝達および神経細胞コミュニケーションおよび構造に関連する細胞代謝の側面を調節する薬剤を同定するためのアッセイに使用する組換え細胞株を作製するために使用することができる。また、本明細書では、ＴＵＢＢ４Ａを含む核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節できる化合物をスクリーニングする方法も提供する。

もう一つのアプローチは、変化したＴＵＢＢ４Ａ核酸によってコードされるポリペプチドの断片をファージ表面に発現するように操作したファージディスプレイライブラリーを使用することである。このようなライブラリーは、発現ペプチドと化学ライブラリーの成分との結合親和性が検出できる条件下で、コンビナトリアル化学ライブラリーと接触させる。米国特許第６，０５７，０９８号および第５，９６５，４５６号は、このようなアッセイを行うための方法と装置を提供している。このような化合物ライブラリーは、以下を含むがこれに限定されない多くの企業から市販されている。メイブリッジ・ケミカル社（英国コーンウォール州トレヴィレット）、コムジェネックス（ニュージャージー州プリンストン）、マイクロサワー（コネチカット州ニューミルフォード）、アルドリッチ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ａｋｏｓ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（スイス・バーゼル）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（フランス・パリ）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシア・モスクワ）、Ａｕｒｏｒａ（オーストリア・グラーツ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、Ａｋｏｓ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ （スイス、バーゼル）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ （フランス、パリ）、Ａｓｉｎｅｘ （ロシア、モスクワ）、Ａｕｒｏｒａ （オーストリア、グラーツ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ （スイス）、Ｂｉｏｎｅｔ （イギリス、カメルフォード）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ （カリフォルニア州、サンディエゴ）、Ｃｈｅｍ Ｄｉｖ （カリフォルニア州、サンディエゴ）。当業者であれば、他の入手先を知っており、同じものを容易に購入することができる。本明細書に記載のスクリーニングアッセイで治療上有効な化合物が同定されれば、医薬組成物に製剤化してＨ－ＡＢＣの治療に利用することができる。

合理的薬物設計の目標は、生物学的に活性なポリペプチドや、それらが相互作用する低分子化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）の構造類似体を作製し、例えば、ポリペプチドのより活性な形態や安定な形態、あるいはｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの機能を増強したり阻害したりするような薬物を作り出すことである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ， （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９－２１を参照。上述した１つのアプローチでは、目的のタンパク質または例えばタンパク質－基質複合体の三次元構造は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、コンピューターモデリング、または最も典型的な場合、これらのアプローチの組み合わせによって解明される。あまり多くはないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングによって得られることがある。合理的な薬剤設計の例として、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発がある（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５２７－５３３）。さらに、アラニンスキャンによってペプチドを分析することもできる （Ｗｅｌｌｓ， （１９９１） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３９０－４１１）。この手法では、アミノ酸残基をＡｌａで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を決定する。このようにしてペプチドの各アミノ酸残基を分析し、ペプチドの重要な領域を決定する。

また、機能アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、その結晶構造を解明することも可能である。原理的には、このアプローチは、その後の薬物設計の基礎となるファーマコアを生み出す。

機能的で薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を作製することで、タンパク質結晶構造解析を完全にバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗ＩＤＳの結合部位は元の分子の類似体であることが予想される。そして、化学的あるいは生物学的に生成されたペプチドのバンクからペプチドを同定・分離するために、この抗ｉｄを使用することができる。そして選択されたペプチドがファーマコアとして働くことになる。

別の実施形態では、改変されたＴＵＢＢ４Ａ核酸の利用可能性により、本明細書に以下に記載するように、本発明の白質ジストロフィー関連ＴＵＢＢ４Ａ核酸を有する実験用マウスの系統の作製が可能になる。本発明の白質ジストロフィー関連核酸を発現するトランスジェニックマウスは、白質ジストロフィーの発症および進行における変異ＴＵＢＢ４Ａタンパク質の役割を調べるモデル系を提供する。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は当業者に知られており、以下に述べる。一般的な方法は３つある：１． 目的の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを初期胚に組み込む； ２．新しく受精した卵子の前核にＤＮＡを注入する；および３． 遺伝子操作された胚性幹細胞を初期胚に組み込む。上記のようなトランスジェニックマウスを作製することで、標的タンパク質が様々な細胞代謝および神経細胞プロセスで果たす役割の分子的解明が容易になる。このようなマウスは、全動物モデルで治療薬候補を研究するためのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングツールであり、本発明に包含される。

本明細書において「動物」という用語は、ヒトを除くすべての脊椎動物を含む意味で使用される。また、胚や胎児の段階を含む、あらゆる発達段階にある動物個体も含まれる。「トランスジェニック動物」とは、標的組換えやマイクロインジェクション、組換えウイルスの感染など、細胞内レベルでの意図的な遺伝子操作によって、直接的または間接的に改変または受け取った遺伝情報を持つ１つ以上の細胞を含む動物である。「トランスジェニック動物」という用語は、古典的な交配や体外受精を包含するものではなく、むしろ１つ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子によって改変された、あるいは組換えＤＮＡ分子を受け取った動物を包含するものである。この分子は、決まった遺伝子座に特異的に標的化される場合もあれば、染色体中にランダムに組み込まれる場合もあり、染色体外複製ＤＮＡの場合もある。「生殖細胞系列トランスジェニック動物」とは、遺伝子の改変または遺伝情報が生殖細胞系列に導入され、それによって遺伝情報を子孫に伝達する能力が付与されたトランスジェニック動物を指す。もしそのような子孫が、実際、その改変や遺伝情報の一部または全部を持っているなら、それらもトランスジェニック動物である。

標的遺伝子を改変するために使用されるＤＮＡは、ゲノムソースからの単離、単離されたｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接合成、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない多種多様な技術によって得ることができる。

遺伝子導入の標的細胞として好ましいのは、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した着床前胚から得ることができる（Ｅｖａｎｓら， （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－１５６； Ｂｒａｄｌｅｙら， （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５－２５８； Ｇｏｓｓｌｅｒら， （１９８６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８３：９０６５－９０６９）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションやレトロウイルスを介した導入などの標準的な技術によって、ＥＳ細胞に効率よく導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、その後、ヒト以外の動物の胚盤胞と組み合わせることができる。導入されたＥＳ細胞はその後胚に定着し、キメラ動物の生殖細胞系列に寄与する。

望む変異を持つ遺伝子領域を不活性化または改変する技術が利用可能である。

本明細書で使用するノックイン動物とは、例えば内在性のマウス遺伝子を本発明のヒト白質ジストロフィー関連ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子に置換したものである。このようなノックイン動物は、白質ジストロフィーの発症を研究するための理想的なモデル系となる。 ノックアウト動物を作ることもできる。

本明細書で使用されるように、白質ジストロフィー関連核酸の全部または一部をコードする核酸配列が、特定の組織または細胞型におけるコードされたタンパク質の発現を指示する調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に連結されたベクターを使用して、白質ジストロフィー関連核酸、その断片の発現を「組織特異的方法」または「細胞型特異的方法」で標的化することができる。このような調節エレメントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方の応用に有利に働く。組織特異的タンパク質を誘導するためのプロモーターは、当技術分野でよく知られており、本明細書に記載されている。

本発明のトランスジェニックマウスの使用方法も本明細書で提供する。白質ジストロフィーに関連するＴＵＢＢ４Ａまたはそのコードタンパク質を含む核酸が導入されたトランスジェニックマウスは、例えば、白質ジストロフィーの発症を調節できる治療薬を同定するためのスクリーニング法を開発するのに有用である。

医薬組成物
機能性核酸誘導体などの治療薬、予防薬、または診断薬誘導体を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする対象に非経口投与することができる。非経口投与は、注射器、任意でペン型注射器を用いて、皮下、筋肉内または静脈内注射により行うことができる。あるいは、輸液ポンプを用いて非経口投与を行うこともできる。さらなる選択肢としては、治療薬、予防薬、診断薬を、好ましくはその目的のために特別に設計された組成物、粉末または液体で、鼻腔内または肺内に投与することである。

治療薬、予防薬または診断薬誘導体の注射用組成物（頭蓋内注射を含む）は、所望の最終製品を得るために成分を適宜溶解および混合する製薬業界の従来技術を使用して調製することができる。したがって、１つの手順によれば、治療薬、予防薬、または診断薬誘導体を、調製する組成物の最終容量よりやや少ない量の水に溶解することができる。必要に応じて等張化剤、保存剤、緩衝剤を加えることができ、必要に応じて酸、例えば塩酸、または塩基、例えば水酸化ナトリウム水溶液を用いて溶液のｐＨ値を調整する。最後に、溶液の量を水で調整することで、所望の成分濃度を得ることができる。

いくつかの実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸からなる群より選択され得る、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝液およびそれらの組み合わせの各々は、代替実施形態を構成する。

医薬製剤は、製薬業界でよく知られている従来の技術に従って調製することができる。このような技術には、有効成分を医薬担体または賦形剤と結合させるステップが含まれる。一般に、製剤は、有効成分を液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に関連させ、必要に応じて製品を成形する（例えば、送達のために特定の粒子サイズにする）ことによって調製される。本発明および／またはその実施形態の好ましい態様において、医薬製剤は、適切な溶媒、例えば水または通常の生理食塩水中、場合によっては無菌製剤中で、担体または他の薬剤とともに筋肉内投与用に調製される。

「医薬担体」または「賦形剤」は、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または１つ以上の核酸を動物に送達するための他の任意の薬学的に不活性なビヒクルであり得、当技術分野で公知である。賦形剤は液体でも固体でもよく、核酸および所定の医薬組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望のかさ、一貫性などを提供するように、計画された投与方法を念頭に置いて選択される。

本明細書で提供される組成物は、２種類以上のアンチセンス化合物を含むことができる。別の関連実施形態では、組成物は、第１の核酸を標的とする１つ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２の核酸標的を標的とする１つ以上の追加のアンチセンス化合物を含むことができる。あるいは、本明細書で提供される組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的とする２つ以上のアンチセンス化合物を含むことができる。２種類以上の化合物を併用してもよいし、順次使用してもよい。組成物はまた、他の非アンチセンス化合物治療薬と組み合わせることもできる。

本明細書に記載のアンチセンスオリゴマー化合物は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混和してもよい。このような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムとアカシアガムであり；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸から誘導される部分エステルとヘキシトールとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液はまた、例えばｐ－ヒドロキシ安息香酸エチルやｎ－プロピルなどの１つ以上の保存料を含むことができる。水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つまたは複数の保存剤と混和して活性成分を提供する。アンチセンスオリゴマー化合物組成物は、無菌注射可能な水性または油性懸濁液の形態であってもよい。懸濁液は、上述した適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、公知技術に従って処方することができる。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒中の滅菌注射液若しくは懸濁液、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる許容される車両および溶媒の中には、水、リンガー溶液、および生理食塩水がある。さらに、無菌の固定油を、溶媒または懸濁媒として慣例的に使用できる。この目的のために、合成モノ‐またはジ‐グリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射剤の調製にも使われる。

本開示はまた、保存または投与のために調製され、薬学的に許容される担体または希釈剤中に薬学的に有効な量の所望の化合物を含むアンチセンスオリゴマー化合物組成物を含む。治療用に許容される担体または希釈剤は、製薬技術分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．、１９８５）に記載されている。例えば、保存料や安定剤を提供することができる。安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルなどである。さらに、酸化防止剤や懸濁剤を使用することもできる。

本開示の医薬組成物は、水中油型エマルションの形態であることもできる。油性相は、植物油、鉱物油、またはこれらの混合物とすることができる。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えばアカシアガムまたはトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆、レシチン、および脂肪酸とヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル、無水物、例えばソルビタンモノオレエート、および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。

本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、治療に適した組成物を形成するために、安定剤、緩衝剤などの有無にかかわらず、任意の標準的な手段によって患者に投与することができる。リポソーム送達機構を使用したい場合は、リポソーム形成の標準プロトコールに従うことができる。したがって、本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、例えば筋肉内注射、局所注射、全身注射、または髄腔内注射などの任意の形態で投与することができる。

本開示はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾リポソーム、または長循環リポソーム、ステルスリポソーム）を含むアンチセンスオリゴマー化合物組成物の使用を特徴とする。これらの製剤は、標的組織におけるアンチセンス・オリゴマー化合物の蓄積を増加させる方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に抵抗し、それにより、カプセル化されたアンチセンスオリゴマー化合物の血液循環時間が長くなり、組織への曝露が促進される（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ， Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２６０１－２６２７（１９９５）およびＩｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ， Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４３：１００５－１０１１ （１９９５）。特に、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、長時間循環するリポソームはアンチセンスオリゴマー化合物の薬物動態および薬力学を向上させる（Ｌｉｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：２４８６４－２４８７０（１９９５）；Ｃｈｏｉら、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄら、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１０３９２号）。長時間循環するリポソームは、肝臓や脾臓のような代謝の激しいＭＰＳ組織への蓄積を避ける能力から、カチオン性リポソームと比較して、アンチセンスオリゴマー化合物をヌクレアーゼ分解からより大きく保護する可能性も高い。

本開示の製剤および方法によるアンチセンスオリゴマー化合物組成物の投与後、被験体は、プラセボ処置した被験体または他の適切な対照被験体と比較して、処置される疾患または障害に関連する１つ以上の症状の約１０％～約９９％の減少を示す。神経変性疾患の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達のためのいくつかの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＥｖｅｒｓら（２０１５） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８７：９０－１０３に記載されている。

以下の材料と方法は、本発明の実施を容易にするために提供される。
モデルマウスの作製
ヘテロ接合体ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}マウスは、ＴＵＢＢ４Ａ 遺伝子のエクソン４にｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（ｃ．７４５Ｇ＞Ａ）変異を挿入することにより、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）－Ｃａｓ－９技術を用いて作製した。マウスＴＵＢＢ４Ａ 遺伝子は１７番染色体に位置し、４つのエクソンを含む。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、オリゴヌクレオチド（ターゲティング配列を持ち、両側に１２０ｂｐの相同配列を持つ）を接合体に共注入した。得られたＣＲＩＳＰＲノックインマウスモデルは、ＴＵＢＢ４Ａ 遺伝子の一方の対立遺伝子（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}）にｃ．７４５Ｇ＞Ａのヘテロ接合性点突然変異を有している。これらのヘテロ接合体マウスを繁殖させ、ヘテロ接合体ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}動物に加えて、ｔａｅｉｐラットモデル（Ｌｉら、２００３年）で見られたホモ接合体変異に準じたホモ接合体ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスを作製した。すべての解析には、野生型（ＷＴ）、ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}およびＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスが含まれた。動物はすべての実験ステップで遺伝子型を決定された。マウスは清潔な施設内で１２時間明期：１２時間暗期のサイクルで飼育され、餌と水に自由にアクセスできた。方法および試験プロトコールは、改訂された米国国立衛生研究所実験動物福祉方針に準拠している。

組織プロセシング
マウスは、９０－１５０ｍｇ／ｋｇのケタミンと７．５－１６ｍｇ／ｋｇのキシラジンの混合物で体重に基づいて深く麻酔され、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流された。脳を採取し、１Ｘ ＰＢＳ中４％ＰＦＡで一晩後固定した後、１Ｘ ＰＢＳ中３０％ショ糖で組織を脱水した。脳を最適切断温度コンパウンド（Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ， ＳＡＫＵＲＡ， ４５８３， ＵＳＡ）に包埋し、クライオスタット型ミクロトーム（ＣＭ ３０５０ Ｓ， Ｌｅｉｃａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）で冠状切片または矢状切片（５０μｍ）としてスライスした。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成とスクリーニング
マウスとヒトのＡＳＯはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社とＢｉｏｓｐｒｉｎｇ社で設計合成された。両タイプのＡＳＯについて、最適なＡＳＯデザインを同定するためにｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを行った。マウスＡＳＯのスクリーニングにはマウスＨＴ－２２細胞を用い、ヒトＡＳＯのスクリーニングにはヒトＡ５４９９細胞を用いた。各細胞株の１００万個の細胞を、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーションシステム（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ、米国）を用いて、１００μＬの培地中、１０万個／ウェルのＡＳＯ濃度１μＭ、５μＭ、１０μＭで１５０Ｖの電圧でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を９６ウェルプレートに移し、インキュベーターに入れた。処置から４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ^ＴＭＲＮＡ ９６－ｗｅｌｌ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ ＃ １２１７３－０１１Ａ）を用いて、メーカーの指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。ＤＮＡａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した後、２００ｎｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ：１８０９１２００）を用いてｃＤＮＡに使用した。ＴＵＢＢ４ ＡのｍＲＮＡ発現レベル、 およびリファレンスとしてＳｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ， ａｒｇｉｎｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ－ｒｉｃｈ ９（ｓｆｒｓ９ ）をコードする内因性ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔａ Ｆｌｅｘ ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を用いたリアルタイムＰＣＲ解析（Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて定量した。結果はΔΔＣＴ法で分析された。

マウス脳室内（ＩＣＶ）注射
ＷＴ仔（Ｐ０－Ｐ１）にＴＵＢＢ４ＡＡＳＯを異なる用量で投与した。ＡＳＯは、ハミルトン１７００ガスタイトシリンジ（７６５３－０１、ハミルトン社製）を用いて、凍結麻酔したマウスにＩＣＶ注射で投与した。針はブレグマと眼球の間、ブレグマから２／５の距離に置き、深さ２ｍｍまで挿入した。総量２μＬが左心室に投与された。マウスはヒーティングパッドの上で回復させられ、その後ダムに戻された。

ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ｑＰＣＲを用いた用量反応決定
脳におけるＴＵＢＢ４ Ａの相対的発現を調べるため、ＩＣＶ注射１０日後にマウスを安楽死させ、異なる脳領域を採取し、スナップ凍結して－８０℃で保存した。ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、メーカーの指示に従って行った。ＴＵＢＢ４Ａ、 および参照用としてｈｐｒｔをコードする内因性ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔａ Ｆｌｅｘ ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ解析（Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて定量した。結果はΔΔＣＴ法で分析された。

以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示するために提供される。これらは本発明を何ら限定するものではない。

実施例Ｉ
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを介したＴＵＢＢ４ Ａの治療的抑制によるＨ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの治療効果

大脳基底核と小脳の萎縮を伴う髄鞘形成不全症（Ｈ－ＡＢＣ）は、チューブリンα４Ａ（ＴＵＢＢ４Ａ）の変異に関連するまれな白質ジストロフィーである。ｐ．Ａｓｐ．２４９Ａｓｎ（Ｄ２４９Ｎ）変異は、Ｈ－ＡＢＣ罹患者の大多数に見られる反復変異である。Ｈ－ＡＢＣは典型的には乳幼児期に発症し、ジストニア、運動失調、歩行変化、進行性の運動機能障害を特徴とする。我々は最近、この変異体を保有し、Ｈ－ＡＢＣ疾患の特徴を再現するＣＲＩＳＰＲノックインマウスモデルを用いた研究を行い、発表した。ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}のホモ接合体変異体は、進行性の運動機能障害、運動失調、生存率の低下（～Ｐ３２－Ｐ３７）、重度の髄鞘形成障害、線条体と小脳における神経細胞の萎縮を示す（Ｓａｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）この変異体がヘテロ接合体（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／＋}）にのみ存在する場合、運動能力や生存に影響を及ぼすことなく、ミエリンの欠損を特徴とする表現型の低下が観察される。したがって、ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}は、Ｈ－ＡＢＣ疾患の治療に対する新しい治療戦略をテストするためのユニークな前臨床ツールとなる。未発表のデータによると、ＴＵＢＢ４ Ａの両コピーを生殖細胞系列で欠失させたマウス（ＴＵＢＢ４Ａ^{ＫＯ／ＫＯ}）は正常に発育し、正常な運動機能を示し、髄鞘形成や神経細胞の欠損を示さない。これらのＴＵＢＢ４Ａ^{ＫＯ／ＫＯ}を ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／＋} マウスと交配させると、得られたＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／ＫＯ}マウスは、ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}と比較して、運動障害の改善、髄鞘形成不全の減少、神経層および小脳における神経細胞損失の減少、生存率の増加（～Ｐ１１０）を示した（ｎ＝８－９、ｐ＜０．０００１）。これらの結果から、Ｈ－ＡＢＣ関連疾患は、変異型ＴＵＢＢ４Ａの 全体的な発現と相関し、相対的に野生型チューブリンの温存と相関することが示唆される。従って、Ｈ－ＡＢＣを治療する一つのアプローチとして、Ｔｕｂｂ４ａの発現を全体的に減少させることを提案する。ＴＵＢＢ４Ａ抑制の治療可能性を評価するために、我々はヒトＴＵＢＢ４ＡおよびマウスＴＵＢＢ４Ａを標的とした新しいアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計した。ヒト細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＵＢＢ４ＡＡＳＯをスクリーニングし、ヒトＴＵＢＢ４Ａを還元する有望なＡＳＯ配列を見出した。以下の表３を参照。

ＡＳＯのライブラリーは、Ａ５４９Ｎ細胞を用いてエレクトロポレーション法により３反復でスクリーニングされた。異なる濃度（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ）のＡＳＯエレクトロポレーション後、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに供してＴＵＢＢ４Ａの 発現を評価した。ＴＵＢＢ４Ａの発現はＧＡＰＤＨを基準にしている（ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。結果を図１Ａ～１Ｄに示す。Ｈ－ＡＢＣ患者細胞から作製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いて、これらのＡＳＯの一部をさらに試験した。これらのＡＳＯは、他のＴＵＢＢ４Ａ 変異を有する患者の細胞を用いてさらに試験することができる。

同時に、マウスＡＳＯ配列をマウス細胞株でｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングし、ＡＳＯ配列を以下の表に示した。表４と図２Ａ－２Ｄを参照。

記載されたＡＳＯ配列は、野生型マウスにこれらの異なるＡＳＯ配列を単回脳室内（ＩＣＶ）ボーラス注射する経路を用いて、ＴＵＢＢ４Ａ レベルを最大に低下させるＡＳＯを同定するために、マウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏで 試験された。この方法は、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの症状を改善するために、ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ}マウスにも採用できる。

実施例ＩＩ
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＴＵＢＢ４Ａの治療抑制とヒト細胞における毒性の解析

ヒト細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴＵＢＢ４ＡＡＳＯをスクリーニングし、実施例Ｉに記載されたＡＳＯ配列を用いることにより、ヒトＴＵＢＢ４Ａを 標的とし、ヒトＴＵＢＢ４ Ａを減少させる新規アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が開発された。表５を参照。

これらのＡＳＯギャップマーには、３つの異なる修正が施されている。
１．フランキング５´および３´末端配列は２´－Ｏ－（２－メトキシエチル）－オリゴリボヌクレオチドであり、「＋」で示されている。
２．５´末端と３´末端の配列は「＠」で示されるロック核酸である。
３．５´末端と３´末端の配列は、ロック核酸と２´－Ｏ－（２－メトキシエチル）－オリゴリボヌクレオチドの混合骨格を含む。

表４および表５のＡＳＯライブラリー（ＡＳＯ Ｈ２－１～Ｈ１５－４）はＢｉｏｓｐｒｉｎｇ社で合成され、ジムノシスを用いてＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞でスクリーニングされた。細胞を１ウェル当たり２５万個プレーティングし、１０μｍのＡＳＯで９６時間処置した。その後、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに供してＴＵＢＢ４Ａの 発現を評価した。結果を図４に示す。

ＡＳＯのライブラリーはさらに、ジムノシスを用いてＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞でスクリーニングされた。細胞を１ウェル当たり２５万個プレーティングし、１０μｍのＡＳＯで９６時間処置した。その後、ＲＮＡを抽出してナノストリングを行い、ＴＵＢＢ４Ａの 発現レベルを検査した。結果を図５に示す。

図４と図５の結果は、ＡＳＯ Ｈ１４とＨ１５がＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションに特に適していることを示している。このデータはさらに、ＡＳＯ Ｈ１４およびＨ１５が、後続のＡＳＯを生成するためのモデル設計として使用するのに適していることを示している。ＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションと最適化されたＡＳＯの生成に特に適した標的として、ＡＳＯ Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１がある。

表３および５のＡＳＯについてＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションが確認された後、これらのＡＳＯをＡｐｏＴｏｘ－Ｇｌｏ Ｔｒｉｐｌｅｘキットを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験を行った。このキットは、細胞生存率、細胞毒性、アポトーシスを単一のアッセイウェル内で評価するための３つのアッセイケミストリーを組み合わせたものである。このアッセイの最初の部分では、２つのプロテアーゼ活性を同時に測定する。１つは細胞生存性のマーカーとして、もう１つは細胞毒性のマーカーとしてである。その後、細胞は第二の蛍光細胞不透過性ペプチド基質に暴露され、死細胞プロテアーゼ活性を測定し、失われた膜の完全性を判定し、ＡＳＯによるアポトーシスレベルを測定する。

最初に、投与２４時間後のＡＳＯのｉｎ ｖｉｔｒｏ 毒性を検出するために、２種類のＡＳＯが選択された。ＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞を１ウェルあたり１０，０００細胞ずつプレーティングし、１０μｍのＡＳＯで２４時間処置した。陽性対照として、２ウェルを１０μｍのＤｉｇｉｔｏｎｉｎまたはＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅで処置した。その後、各ウェルについて細胞生存率、細胞毒性、アポトーシスを試験した。結果を図６Ａ～６Ｃに示す。試験したＡＳＯはｉｎ ｖｉｔｒｏでは毒性を示さなかった。

予備的な結果が確認された後、さらにＡＳＯのｉｎ ｖｉｔｒｏ 毒性試験が行われた。ＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞を１ウェルあたり１０，０００細胞ずつプレーティングし、１０μｍのＡＳＯで４８、７２、９６時間処置した。陽性対照として、ウェルを１０μｍのＤｉｇｉｔｏｎｉｎまたはＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅで４８、７２、９６時間処置した。さらに、未処置のＳＨＹＳＹ５Ｙ細胞と未処置のビヒクルを４８、７２、９６時間後に試験した。結果を図７Ａ～７Ｃに示す。ここでも、試験したＡＳＯはｉｎ ｖｉｔｒｏでは毒性を示さなかった。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの ＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションと最小限の毒性に基づき、ＡＳＯ Ｈ１０－２、Ｈ１４、Ｈ１５をヒトｉＰＳＣ由来中型有棘ニューロン（ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮ）で試験した。これらのＡＳＯは、ｑＲＴ－ＰＣＲとＮａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイの両方で一貫したＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションを示したことから選択された。図４の結果は、Ｈ１０－２がＳＨ－ＳＹ４Ｙ細胞においてＴＵＢＢ４Ａを ５１．２％ノックダウンしたことを示しており、図５は、Ｈ１０－２がＳＨ－ＳＹ４Ｙ細胞においてＴＵＢＢ４Ａを ５４．４％ノックダウンしたことを示している。図４の結果は、Ｈ１４がＳＨ－ＳＹ４Ｙ細胞においてＴＵＢＢ４Ａを ６４．０％ノックダウンしたことを示しており、図５は、Ｈ１４がＳＨ－ＳＹ４Ｙ細胞においてＴＵＢＢ４Ａを ６０．５％ノックダウンしたことを示している。図４の結果は、Ｈ１５がＳＨ－ＳＹ４Ｙ細胞においてＴＵＢＢ４Ａを ５３．２％ノックダウンしたことを示しており、図５は、Ｈ１５がＳＨ－ＳＹ４Ｙ細胞においてＴＵＢＢ４Ａを ５３．３％ノックダウンしたことを示している。

ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮにおけるＴＵＢＢ４Ａ 遺伝子の発現は、ジムノシスを用いて検査した。ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮは３７日目にＡＳＯ候補物質で処置された。４日後、細胞をＡＳＯで再処置した。７日目にＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａの発現を測定した。結果を図８に示す。

ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮにおけるＡＳＯのＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションが確認された後、ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮにおけるＡＳＯの毒性試験が行われた。ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮは３７日目にＡＳＯ候補物質で処置された。４日後、細胞をＡＳＯで再処置した。７日目にＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＢＡＸと ＢＣＬ－２の発現を測定した。ＢＣＬ－２オンコプロテインは、急速に増殖する細胞に生存の利点を与えることによってプログラム細胞死を制御し、ＢＡＸタンパク質は、アポトーシス刺激に対する細胞の感受性を高めることによってアポトーシスを促進する。これらの機能により、ＢＡＸおよびＢＣＬ－２ タンパク質は、細胞毒性の指標として一般的に用いられている。ＢＡＸ／ＢＣＬ－２の比が１以上であればアポトーシスが多く、１未満であればアポトーシスが少ないことを示す。この実験の結果を図９Ａ－Ｃに示す。

本実験の結果から、試験したＡＳＯはＴＵＢＢ４Ａのダウンモジュレーションに有効であり、処置した細胞に対して無毒であることが示された。

実施例ＩＩＩ
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの投与量決定のための対照ｉＰＳ－ＭＳＮの用量応答解析

上述のＡＳＯがＴＵＢＢ４Ａのダウンモジュレーションに安全かつ有効であることを決定した後、ＡＳＯの適切な投与量を特定するために追加の実験を行った。ＡＳＯ候補の用量反応は、オリゴをリン酸緩衝生理食塩水やＣＳＦ模倣緩衝液などの生物学的に適合性のある緩衝液に懸濁したジムノシスを用いて、対照のＨｉＰＳ－ＭＳＮで行った。３７日目にＨｉＰＳＣ－ＭＳＮを１０μｍ、２０μｍ、３０μｍのＡＳＯ Ｈ１５で処置した。その後、ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮを同じ投与量で４日後に再処置した。最初の処置から７日後、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａの 発現を測定した。この実験の結果を図１０に示す。ＡＳＯの投与量が増えるにつれて、相対的な遺伝子発現は減少した。

投与量の増加とともにＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションが増加することが示された後、ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮにおいてＡＳＯの毒性が測定された。３７日目にＨｉＰＳＣ－ＭＳＮを１０μｍ、２０μｍ、３０μｍのＡＳＯ Ｈ１５で処置した。その後、ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮを同じ投与量で４日後に再処置した。最初の処置から７日後、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＢＡＸとＢＣＬ－２の発現を測定した。ＢＡＸ／ＢＣＬ－２の比が１以上であればアポトーシスが多く、１未満であればアポトーシスが少ないことを示す。この実験の結果を図１１Ａ－１１Ｃに示す。

さらに、ＡＳＯ Ｈ１５によるＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションを、変異体ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮ（ＴＵＢＢ４Ａ^{Ｄ２４９Ｎ}）を用いてジムノシスで解析した。変異型ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮは３７日目に３０μｍのＡＳＯ Ｈ１５で処置した。野生型ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮｓ細胞も、前回のダウンレギュレーションの結果を確認するため、３７日目に１０μｍ、２０μｍ、３０μｍのＡＳＯ Ｈ１５で処置した。その後、変異型と野生型のＨｉＰＳＣ－ＭＳＮを同じ投与量で４日後に回収した。最初の処置から７日後にＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴＵＢＢ４Ａの 発現を測定した。ＡＳＯ Ｈ１５は、変異型細胞でも野生型細胞でも同様のＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションを示した。この実験結果を図１２に示す。

変異型ＨｉＰＳ－ＭＳＮでＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションが増加したことを示した後、変異型細胞でＡＳＯの毒性が確認された。変異型ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮは３７日目に３０μｍのＡＳＯ Ｈ１５で処置した。野生型ＨｉＰＳＣ－ＭＳＮｓ細胞も、前回のダウンレギュレーションの結果を確認するため、３７日目に１０μｍ、２０μｍ、３０μｍのＡＳＯ Ｈ１５で処置した。その後、変異型と野生型のＨｉＰＳＣ－ＭＳＮを同じ投与量で４日後に回収した。最初の処置から７日後にＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＢＡＸと ＢＣＬ－２の 発現を測定した。この実験の結果を図１３Ａ～１３Ｃに示す。

実施例ＩＶ
マウス細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを介したＴｕｂｂ４ａの治療抑制と毒性の解析

マウス細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＵＢＢ４ＡＡＳＯをスクリーニングし、実施例Ｉに記載されたＡＳＯ配列を用いることにより、ヒトＴＵＢＢ４Ａを 標的とし、マウスＴＵＢＢ４ Ａを減少させる更なるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が開発された。表６を参照。

マウスＡＳＯはヒトＴＵＢＢ４Ａとの相同性を欠いている。そのため本発明者らは、別々にスクリーニングされる併用ヒトＡＳＯ配列を再設計した。我々はマウスＡＳＯで概念実証を確立し、ヒトＡＳＯは臨床試験に移行する。

ライブラリＡＳＯは、ジムノシスを用いてマウスの皮質初代ニューロン細胞でスクリーニングされた。ウェル当たり２０万個または１５万個の細胞をプレーティングし、１μｍと５μｍのＡＳＯで１週間処置した。その後、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに供してＴＵＢＢ４Ａの 発現を評価した。これらのアッセイの結果を図１４Ａ－１４Ｂおよび１５に示す。

表４と表６のＡＳＯについてＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションが確認された後、これらのＡＳＯをＡｐｏＴｏｘ－Ｇｌｏ Ｔｒｉｐｌｅｘキットを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験を行った。このキットは３つのアッセイケミストリーを組み合わせ、１つのアッセイウェルで細胞生存率とアポトーシスを評価する。このアッセイの最初の部分では、細胞生存率のマーカーとしてプロテアーゼ活性を同時に測定する。その後、細胞は第二の蛍光細胞不透過性ペプチド基質に暴露され、死細胞プロテアーゼ活性を測定し、失われた膜の完全性を判定し、ＡＳＯによるアポトーシスレベルを測定する。

いくつかのＡＳＯをスクリーニングし、投与９６時間後のＡＳＯのｉｎ ｖｉｔｒｏ 毒性を検出した。マウス皮質ニューロン細胞を１ウェルあたり２０，０００細胞でプレーティングし、５μｍのＡＳＯで９６時間処置した。陽性対照として、２ウェルを１０μｍのＤｉｇｉｔｏｎｉｎまたはＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅで処置した。その後、各ウェルについて細胞生存率とアポトーシスを検査した。結果を図１６Ａ～１６Ｂに示す。試験したＡＳＯはｉｎ ｖｉｔｒｏでは毒性を示さなかった。

実施例Ｖ
野生型マウスへのアンチセンス・オリゴヌクレオチド投与の解析

実施例ＩおよびＩＶで実施したスクリーニングアッセイを分析した結果、野生型マウスにおけるＡＳＯの効率および毒性の分析用にＡＳＯ７－２、７－３、８－２、８－３、１８－１および１８－３を選択した。５００ｎｍｏｌｅのＡＳＯを含む１５０μｇ／μＬ溶液を調製した。

Ｐ６０齢の成体マウス３０匹に、１５μｇ／ｇまたは３０μｇ／ｇのＡＳＯを脳室内（ＩＣＶ）注射した。表７に各ＷＴマウスの観察結果を示す。

ＡＳＯによって引き起こされた神経学的障害は、複数の方法で評価された。まず、注射後１週間ごとに体重（図２０Ｃ）と観察（上記表７に記載）を行い、マウスの体重減少やその他の有害症状を観察する。さらに、一般的な健康状態や身体状態、自発的な活動性、反射や音色（ｔｏｎｅ）の検査も行われる。

ＡＳＯ注射後の運動機能障害を評価するために、ロータロッドテストが行われる。この試験では、マウスはケージの床上に吊るされた水平方向に回転する円筒の上に置かれる。マウスは回転する円柱の上にとどまろうとする。そして、マウスがシリンダー上に留まっている時間が記録される。このテストは３段階で行われる。馴化段階である１日目に、マウスは５ＲＰＭの定常速度で１００秒間１回の試行を受ける。練習段階である２日目、マウスは５～３０ＲＰＭの緩やかな傾斜で３００秒ずつ３回試行した。試験段階である３日目に、マウスは５～３０ＲＰＭの緩やかな傾斜で３００秒ずつ３回の試行を受ける。注射から３０日後の各マウスの試験段階の結果を図１７Ａに示す。

ＡＳＯ注射後の握力をさらに評価するために、握力テストが行われる。前肢と後肢の握力をｋＧ／Ｆ単位で測定する。ＡＳＯを投与したマウスの前肢および後肢の握力を、握力計（０８０３１２－３ Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ， ＵＳＡ）を用いて検査した。前肢試験では、マウスを尾の近位部で保持し、両前足で水平な金属棒をつかませた。その後、マウスは着実に引き離され、マウスが金属棒を外したときの引っ張る力が記録された。後肢の握力測定では、マウスにメーターから背を向けたまま後肢前足で水平バーを掴ませ、尻尾は握力が切れるまでメーターの方に引っ張られた。各２分間に３回の試行を行った。図１７Ｂと１７Ｃは、３回の試行後の握力の平均結果を示している。

ＡＳＯのｉｎ ｖｉｖｏ毒性は、各マウスから組織と血液を採取して分析した。対象から摘出された組織には、血液、大脳皮質、小脳、脳幹、中脳、肝臓、その他の脳が含まれる。摘出後、組織はＲＮＡとタンパク質を抽出できるまで－８０℃で保存した。毒物検査と機能観察バッテリーの要約を表８に示す。

ＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションはさらに、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡの作成、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて評価された。上記のように、マウスはＰ６０齢（成体）でＡＳＯ ７－２をＩＣＶ注射された。注射から２３－３０日後に対象の組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションを決定した。結果を図１８Ａに示す。ＡＳＯ ７－２はいずれの投与量でも毒性を示した。３０μｇ／ｇの投与量では、ＷＴマウスはより早い時点で人道的に安楽死させられたため、線条体のダウンレギュレーションの値は１５μｇ／ｇと３０μｇ／ｇでは欠落している。

上記のように、マウスはＰ６０齢（成体）でＡＳＯ ７－３をＩＣＶ注射された。注射から２３－３０日後に対象の組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションを決定した。結果を図１８Ｂに示す。ＡＳＯ ７－３はいずれの投与量でも毒性を示した。上記と同様に、３０μｇ／ｇ投与では、ＷＴマウスはより早い時点で人道的に安楽死させられたため、線条体のダウンレギュレーションの値は１５μｇ／ｇと３０μｇ／ｇでは欠落している。

マウスはＰ６０齢（成体）でＡＳＯ ８－２をＩＣＶ注射された。注射から２３－３０日後に対象の組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションを決定した。結果を図１９Ａに示す。ＡＳＯ ８－２は３０μｇ／ｇの用量で致死性を示した。そのため、この線量では組織は採取されなかった。

上記のように、マウスはＰ６０齢（成体）でＡＳＯ ８－３をＩＣＶ注射された。注射から２３－３０日後に対象の組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションを決定した。結果を図１９Ｂに示す。ＡＳＯ ８－３はいずれの用量でも毒性を示さなかった。すべての組織は注射後３０日目に採取された。

上記のように、マウスはＰ６０齢（成体）でＡＳＯ １８－１をＩＣＶ注射された。注射から２３－３０日後に対象の組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションを決定した。結果を図２０Ａに示す。ＡＳＯ １８－１はいずれの投与量でも毒性を示さなかった。すべての組織は注射後３０日目に採取された。

上記のように、マウスはＰ６０齢（成体）でＡＳＯ １８－３をＩＣＶ注射された。注射から２３－３０日後に対象の組織を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＴＵＢＢ４Ａの ダウンレギュレーションを決定した。結果を図２０Ｂに示す。ＡＳＯ １８－３はいずれの用量でも毒性を示さなかった。すべての組織は注射後３０日目に採取された。特にＡＳＯ １８－３は、ｉｎ ｖｉｖｏで優れたＴＵＢＢ４Ａダウンレギュレーションと最小限の毒性の両方を示した。

したがって、ＡＳＯ １８－３と同様に、ｉｎ ｖｉｖｏで良好なＴＵＢＢ４Ａ ダウンレギュレーションと最小限の毒性をもたらすＡＳＯ ６－５、７－５、７－６、８－５、１８－５が合成された。Ｔｕｂｂ４ａのダウンレギュレーションの結果を図１５に示す。ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性結果を表９に示す。ＡＳＯの毒性は激減した。

実施例ＶＩ
Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの治療のためのＴＵＢＢ４Ａ活性を低下させる方法

Ｈ－ＡＢＣおよび関連するＴＵＢＢ４Ａ関連白質ジストロフィーは、現在のところ治療不可能である。上記の実施例で提供されたデータに基づくと、ＴＵＢＢ４Ａの発現をダウンレギュレーションすることで、Ｈ－ＡＢＣの疾患症状が軽減されることは明らかである。さらに、ＡＳＯの患者への投与が無毒であることも明らかである。注目すべきことに、アンチセンス分子の投与は、脊髄性筋萎縮症を含む他の神経変性疾患の治療にも使用されている（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２１２２９５２参照）。このパラダイムに従って、Ｈ－ＡＢＣまたは関連するＴＵＢＢ４Ａ関連白質ジストロフィーの症状を有する患者は、本明細書またはＥｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（上掲）に開示された方法を用いて、ＴＵＢＢ４Ａ発現をダウンレギュレートする抗ＴＵＢＢ４Ａアンチセンス分子の有効量を注射することにより治療することができ、それにより白質ジストロフィーの症状を緩和することができる。

参考文献
本発明の特定の特徴を本明細書で説明したが、多くの修正、置換、変更、および等価物が、当業者にはこれから生じるであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神に属するすべての修正および変更をカバーすることを意図していることを理解されたい。

Claims (19)

1. 標的細胞中のＴＵＢＢ４Ａレベルを低下させ、それによりそれを必要とする患者におけるＨ－ＡＢＣ白質ジストロフィーの症状を改善する方法であって、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする合成阻害性核酸分子を含む組成物の治療有効量の投与を含み、前記細胞中のＴＵＢＢ４Ａレベルを低下させ、前記患者において、
   ｉ） 運動発達遅延；
   ｉｉ） 認知機能障害；
   ｉｉｉ） 歩行機能障害；
   ｉｖ）運動失調；
   ｖ） 意図振戦；
   ｖｉ） 構音障害；
   ｖｉｉ） 発声困難
   ｖｉｉｉ） 異常髄鞘形成不全；
   の１つ以上を減少させ、
   合成核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集ＴＵＢＢ４Ａ標的核酸に適したガイド鎖から選択される、方法。
2. それを必要とする患者において、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーに関連する疾患、障害および／または状態、またはそれらの症状を治療、発症遅延、改善、および／または軽減する方法であって、ＴＵＢＢ４Ａを標的とする治療有効量の合成核酸を患者に投与することを含み、ここで、Ｈ－ＡＢＣ白質ジストロフィーに関連する疾患、障害および／または状態、またはそれらの症状が、患者において治療され、阻害され、発症が遅延され、改善され、および／または軽減され、 合成核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集に適したガイド鎖から選択される、方法。
3. ＴＵＢＢ４Ａを標的とする前記合成核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および／または取り込みを増加させるように改変される、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. ＴＵＢＢ４Ａを標的とする前記合成核酸が修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１または請求項２に記載の方法。
5. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする前記合成核酸をベクターにクローニングする、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
6. 前記ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびアデノウイルス関連ベクターから選択される、請求項１～５に記載の方法。
7. 疾患、障害および／または状態が髄鞘形成不全に関連する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記合成核酸が、表３または表５に提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
9. 核酸が修飾され、ヒトＴＵＢＢ４Ａ核酸の一部と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％相補的な核酸塩基配列を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
10. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結を含み、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾された糖を含み、または修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾された核酸塩基を含む、請求項９に記載の方法。
11. 白質ジストロフィーの治療に有用な追加の活性医薬剤をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
12. 生物学的に許容される担体中に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ編集に適したガイド鎖から選択される、ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸を標的とし、それに特異的にハイブリダイズする合成核酸分子を含む、ＴＵＢＢ４Ａの発現を低下させるための組成物。
13. 前記合成核酸が、体液中での安定性および／または目的の細胞での取り込みを増加させるように改変されている、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記合成核酸が表３または表５に記載されている、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
15. 前記合成核酸分子がベクター中に存在する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. ｅｘ ｖｉｖｏ細胞投与、頭蓋内投与、非経口投与および静脈内投与用に製剤化された請求項１２～１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 前記組成物が単回脳室内（ＩＣＶ）ボーラス注射用に処方される、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の組成物。
18. 請求項１～１１のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
19. 前記合成核酸がＡＳＯ Ｈ１４またはＡＳＯ Ｈ１５である、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。