CN117561067A - 用于治疗h-abc脑白质营养不良的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于治疗H‑ABC脑白质营养不良的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月16日提交的美国临时申请号63/175,998的优先权，其通过引用的方式并入本文，如同其全文被完整阐述一样。
以电子形式提交的材料的引用并入
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技术领域
本发明涉及H-ABC脑白质营养不良领域以及使用小分子组合物、特别是修饰的反义分子来缓解其症状的方法。更具体地，本发明提供了基于修饰的核酸的治疗剂，其下调微管α4A(TUBB4A)，从而改善有需要的患者的肌张力障碍、共济失调、步态改变和运动功能障碍。
背景技术
在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献，以描述本发明所属领域的现有技术。这些引用中的每一个都通过引用并入本文，如同其全文被完整阐述一样。
伴有基底神经节和小脑萎缩的髓鞘形成不足，也称为H-ABC，是一种罕见的遗传性病症，它会逐渐损害神经系统，特别针对大脑的两个部分：基底神经节和小脑，这两个部分控制着身体的动作和运动(Hersheson等人,2013；Simons等人,2013)。H-ABC是脑白质营养不良的一种，是一组影响大脑白质的病况。如本文所用，H-ABC还意指一大组相关病症，例如，与TUBB4A相关的病症，其具有不同的肌张力障碍、髓鞘形成不足和发育异常的表现(Blumkin等人,2014；Ferreira等人,2014；Pizzino等人,2014)。这些疾病与髓鞘形成过程受损有关，导致髓鞘受损，髓鞘包围并保护大脑和脊髓中的神经细胞，并加速细胞之间的信息传输。通常，髓鞘形成发生在生命的最初几年。在H-ABC中，由于身体无法产生正常水平的髓磷脂，因此会出现髓鞘形成不足，从而阻止或以其他方式阻碍大脑的正常髓鞘形成。在某些情况下，大脑外部的神经可能会受到影响。不幸的是，这种病况还会降低基底神经节和小脑的尺寸和功能。因此，H-ABC患者经常出现运动问题，包括肌肉和关节僵硬、肌张力低、控制移动动困难以及平衡和协调问题(Blumkin等人,2014；Ferreira等人,2014；Pizzino等人,2014；Simons等人,2013)。
H-ABC是由TUBB4A基因突变引起的，该基因在患病者中通常表现为随机突变。在这些情况下，父母都不是携带者，生产另一个患有这种疾病的孩子的可能性极低。父母中有一方有可能在某些细胞中携带突变(镶嵌现象)，这意味着他们不会出现症状，但仍然能够将这种病症传递给其他孩子。
目前，这种疾病尚无已知的治疗方法。迫切需要用于缓解和改善H-ABC症状的新的治疗剂。
发明内容
根据本发明，提供了一种降低靶细胞中TUBB4A水平的方法，从而改善有需要的患者的H-ABC脑白质营养不良的症状。示例性方法需要在所述患者中施用治疗有效量的包含靶向TUBB4A的合成的抑制性核酸分子的组合物，其中降低TUBB4A水平可减少以下一项或多项：i)运动发育迟缓；ii)认知功能障碍；iii)步态功能障碍；iv)共济失调；v)意向性震颤；vi)构音障碍；vii)发音障碍；和viii)异常的髓鞘形成不足。在优选的实施方案中，所述合成的核酸分子选自反义寡核苷酸、shRNA、siRNA和适用于CRISPR编辑TUBB4A靶向核酸的引导链。还提供了在有需要的患者中治疗、延迟发作、缓解和/或减少与H-ABC脑白质营养不良相关的疾病、病症和/或病况或其症状的方法。一方面，所述方法包括向患者施用治疗有效量的靶向TUBB4A的合成的抑制性核酸，其中与H-ABC脑白质营养不良相关的疾病、病症和/或病况或其症状在患者中得到治疗、抑制、被延迟发作、改善和/或减轻。如上所述，所述合成的核酸分子选自反义寡核苷酸、shRNA、siRNA和适用于CRISPR编辑的引导链。在某些实施方案中，所述靶向TUBB4A的合成的抑制性核酸列于表3或表5中并进行了修饰以增加体内稳定性和/或摄取。在某些实施方案中，将编码所述反义寡核苷酸的合成的核酸克隆到载体中。在其他实施方案中，脑白质营养不良是与髓鞘形成不足相关的疾病、病症和/或病况。在其他实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接(linkage)，所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖，或者所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。在本发明的另一个方面，所述方法还包括施用用于治疗脑白质营养不良的另外的活性药剂。
还提供了用于减少TUBB4A的表达的组合物,其包含靶向TUBB4A编码核酸并与其特异性杂交的合成的抑制性核酸分子，其选自反义寡核苷酸、shRNA、siRNA和适用于生物学可接受载体中的CRISPR编辑的引导链。在某些实施方案中，所述合成的抑制性核酸被修饰以增加在体液中的稳定性和/或在目的细胞中的摄取。在优选的实施方案中，所述合成的抑制性核酸列于表3或表5中。任选地将所述核酸克隆到载体中。所述载体可以是质粒载体、AAV载体和腺病毒相关载体。在某些实施方案中，所述寡核苷酸在脂质纳米颗粒复合物中施用。所述合成的抑制性核酸和/或包含其的载体(vector)或载体(carrier)可以存在于药学上可接受的载体中，所述载体通过施用途径配制，所述施用途径包括但不限于离体细胞施用、颅内施用、肠胃外施用、肌内、和静脉内施用。在优选的实施方案中，所述组合物被配制用于单次脑室内(ICV)推注注射。
还提供了包含适合于实施任何前述方法的组分的试剂盒。
附图说明
图1A-1D：使用电穿孔法在人类A549N细胞中筛选ASO文库，重复3次。以不同浓度(0.1μM、0.5μM、1μM和5μM)进行ASO电穿孔后，提取RNA并进行qPCR以评估TUBB4A表达水平。将TUBB4A表达标准化为GAPDH(n＝3，***p<0.0001)。图1A示出了非靶向对照(NTC)(用加扰的寡核苷酸处理的细胞)和ASO H1-H5的TUBB4A mRNA表达。图1B示出了ASO H6-H12的TUBB4A mRNA表达。图1C示出了ASO H13-H19的TUBB4A mRNA表达。图1D示出了NTC、ASO H2A、ASO H2B、ASO H10A、ASO H10B、ASO H11A、ASO H11B、ASO H15A、和ASO H15B的TUBB4A mRNA表达。
图2A-2E：使用电穿孔法在小鼠HT-22细胞中筛选ASO文库，重复3次。以不同浓度(0.1μM、0.5μM、1μM和5μM)进行ASO电穿孔后，提取RNA并进行qPCR以评估TUBB4A表达。将TUBB4A表达标准化为sfrs9(n＝3，***p<0.0001)。图2A示出了ASO 1-7的TUBB4A mRNA表达。图2B示出了ASO 8-14的TUBB4A mRNA表达。图2C示出了ASO H15-H21的TUBB4A mRNA表达。图2D示出了ASO 4A、ASO 4B、ASO 6A、ASO 6B、ASO 7A和ASO 7B的TUBB4A mRNA表达。图2E示出了ASO 22-24和NTC、ASO1-ASO3的TUBB4A mRNA表达。
图3A-3D:有效的ASO介导的TUBB4A转录物抑制RT-qPCR数据示出了注射了ASO 7A(图3A),ASO 7B(图3B),ASO 6A(图3C)和ASO 6B(图3D)的野生型小鼠在注射后10天的大脑皮层、小脑、纹状体中的TUBB4A转录物的水平。
图4：SHYSY5Y细胞以250000个细胞/孔铺板，并用10μm的Biospring和MicrosynthASO处理96小时。提取RNA以进行用于检测TUBB4A的水平的qRT-PCR。
图5：SHYSY5Y细胞以250,000个细胞/孔铺板，并用10μm的Biospring和MicrosynthASO处理96小时。提取RNA以进行用于检测TUBB4A的水平的Biospring。
图6A-6C：SHYSY5Y细胞以10000个细胞/孔铺板，并用10μm的Biospring ASO处理24小时。使用洋地黄皂苷和星形孢菌素作为阳性对照来测试细胞活力(图6A)、细胞毒性(图6B)和细胞凋亡(图6C)。
图7A-7C:SHYSY5Y细胞以10000个细胞/孔铺板，并用10μm的Biospring ASO处理48、72和96小时。使用洋地黄皂苷和星形孢菌素作为阳性对照来测试细胞活力(图7A)、细胞毒性(图7B)和细胞凋亡(图7C)。
图8：使用Gymnosis，在对照人类iPSC衍生神经元上选择潜在的ASO候选物。人类iPSC衍生的中型神经元在第37天进行处理，并在四(4)天后重新补充，总共处理一周。提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A表达。
图9A-9C:ASO毒性。人类iPSC衍生的中型神经元在第37天进行处理，并在四(4)天后重新补充，总共处理一周。为了评估ASO的潜在毒性，提取了RNA并使用qRT-PCR测定BAX(图9A)和BCL-2(图9B)表达。BAX/BCL-2的比率>1表明细胞凋亡较多，而比率<1表明细胞凋亡较少(图9C)。
图10：使用Gymnosis，潜在ASO候选物在对照人类iPSC衍生神经元上的剂量反应。人类iPSC衍生的中型神经元在第37天进行处理，并在四(4)天后重新补充，总共处理一周。提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A表达。
图11A-11C:ASO毒性。人类iPSC衍生的中型神经元在第37天进行处理，并在四(4)天后重新补充，总共处理一周。为了评估ASO的潜在毒性，提取了RNA并使用qRT-PCR测定BAX(图11A)和BCL-2(图11B)表达。BAX/BCL-2的比率>1表明细胞凋亡较多，而比率<1表明细胞凋亡较少(图11C)。
图12：使用Gymnosis，使用Tris-EDTA缓冲液中的ASO候选物H15来评估突变的人类iPSC衍生神经元(TUBB4AD249N)的下调。重新运行野生型中型多棘神经元(MSN)以确认之前的下调结果：人类iPSC衍生的中型神经元在第37天进行处理，并在四(4)天后重新补充，总共处理一周。提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A表达。
图13A-13C:ASO对iPSC衍生的人类突变型MSN的毒性。人类iPSC衍生的中型多棘神经元在第37天进行处理，并在四(4)天后重新补充，总共处理一周。为了评估ASO的潜在毒性，提取了RNA并使用qRT-PCR测定BAX(图13A)和BCL-2(图13B)表达。BAX/BCL-2的比率>1表明细胞凋亡较多，而比率<1表明细胞凋亡较少(图13C)。
图14A-14B:将小鼠皮层原代神经元以200K个细胞/孔铺板，并用1μm和5μm的Biospring ASO处理1周。提取RNA以进行用于检测TUBB4A的水平的qRT-PCR。图14A示出了TUBB4A ASO将ASO 6-1下调至ASO 7-4。图14B示出了TUBB4A ASO将ASO 8-1下调至ASO 18-3。
图15：将小鼠皮层原代神经元以150K个细胞/孔铺板，并用1μm和5μm的BiospringASO处理1周。提取RNA以进行用于检测TUBB4A的水平的qRT-PCR。
图16A-16B:将小鼠皮层神经元以20000个细胞/孔铺板，并用5μm的Biospring ASO处理96小时。使用洋地黄皂苷和星形孢菌素作为阳性对照来测试细胞活力(图16A)和细胞凋亡(图16B)。
图17A-17C:ASO ICV注射在野生型小鼠中后30天进行运动行为旋转棒(图17A)和握力(图17B和图17C)以评估ASO注射后的运动结果。
图18A-18B:ASO 7-2(图18A)和7-3(图18B)在P60(成年)龄时被ICV注射并在23-30天后收集组织。提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A下调。
图19A-19B:ASO 8-2(图19A)和8-3(图19B)在P60(成年)龄时被ICV注射并在23-30天后收集组织，提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A下调。
图20A-20C:ASO 18-1(图20A)和18-3(图20B)在P60(成年)龄时被ICV注射并在23-30天后收集组织，提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A下调。在P90、P97和P104注射后小鼠的体重显示于图20C中。
具体实施方式
基底神经节和小脑的髓鞘形成不足和萎缩(H-ABC)是一种罕见的髓鞘形成不足性脑白质营养不良，其与微管蛋白α4(TUBB4A)的致病变异相关。例如，p.Asp249Asn(D249N)是一种在大多数受影响个体中反复出现的变异。TUBB4A中的单等位基因突变还可能导致更大范围的神经系统病症，从早发性脑病到4型成人类肌张力障碍(耳语性发音障碍)(Blumkin等人,2014；Ferreira等人,2014；Pizzino等人,2014；Simons等人,2013)。H-ABC在此范围内，通常始于儿童早期，其特征是肌张力障碍、共济失调、步态改变和进行性运动功能障碍，伴有在生命的第一个十年结束前丧失行走能力。迄今为止，没有可用于这种进行性和致残性儿科病症的治疗方法。为了解TUBB4A突变如何导致H-ABC并促进治疗策略的开发和临床前测试，我们的团队使用CRISPR-Cas9方法开发了一种携带杂合(TUBB4AD249N)或纯合(TUBB4AD249N/D249N)TUBB4A突变的敲入小鼠模型。
在早期的研究中，我们描述了经典H-ABC小鼠模型(TUBB4AD249N/D249N)，其表现出存活率下降、伴有震颤的渐进性运动功能障碍、步态异常和共济失调，从而概括了该疾病的表型特征。在出生后第14天(P14)、P21和终末期P40使用免疫标记和western印迹对TUBB4AD249N/D249N小鼠的神经病理学评估显示髓鞘形成的初始延迟，随后是最终的髓鞘脱失。随着时间的推移，髓鞘蛋白会减少，并且天冬氨酸环化酶活性(ASPA)阳性少突胶质细胞(CNS中的髓鞘形成细胞)急剧减少。用于电子显微镜的超薄脑切片进一步证明了这些小鼠的脊髓和视神经髓鞘形成不足和髓鞘持续丢失。此外，对TUBB4AD249N/D249N小鼠培养物中的少突胶质细胞的体外研究表明成熟度和髓鞘标志物降低。同样，神经病理学表明了纹状体和小脑颗粒细胞中的神经元严重丢失。此外，还注意到培养物中神经元的影响，其中来自TUBB4AD249N/D249N小鼠的细胞中神经元存活率降低以及微管动力学不稳定。TUBB4AD249N/D249N小鼠为H-ABC提供了一种新的小鼠模型，并表明了这种病症中细胞生理学的复杂性，以及TUBB4A突变引起的潜在微管不稳定性，从而导致对少突胶质细胞、纹状体神经元和小脑颗粒细胞的细胞自主影响，以及严重的神经发育表型。
我们还开发了新的治疗性反义寡核苷酸，可有效下调TUBB4A的表达，从而为治疗脑白质营养不良提供一种新方法。
定义
通过参考形成本公开的一部分的以下详细描述，可以更容易地理解本主题。应当理解，本发明不限于本文描述和/或示出的特定产品、方法、条件或参数，并且本文所用的术语仅用于通过示例的方式描述特定实施方案，而不旨在限制所要求保护的发明。
除非本文另有定义，否则与本申请相关的科技术语应具有本领域普通技术人类员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。
除非另有说明，否则在上文和本公开全文中使用的以下术语和缩写应理解为具有以下含义。
在本公开中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，并且对特定数值的引用至少包括该特定值，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“一种化合物”是指本领域技术人类员已知的一种或多种此类化合物及其等同物，等等。如本文所用，术语“多种”是指多于一种。当表达值的范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。同样，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，可以理解为所述特定值形成另一实施方案。所有范围都是包含性的和可组合的。
术语“包含、具有或包括”表明权利要求是开放的并且可以含有未记载的组分。
当涉及特定核苷酸或氨基酸时，短语“基本上由……组成”是指具有给定SEQ IDNO.的特性的序列。例如，当涉及氨基酸序列使用时，该短语包括序列本身和不会影响该序列的功能和新特性的分子修饰。
短语“由……组成”表示权利要求仅涉及所记载的组分。
如本文所用，术语“组分”、“组合物”、“化合物的组合物”、“化合物”、“药物”、“药物活性剂”、“活性剂”、“治疗剂”、“疗法”、“治疗”或“药物”在本文中可互换使用以指代一种或多种化合物或物质的组合物，当施用于受试者(人类或动物)时，通过局部和/或全身作用诱导所需的药理学和/或生理学效果。术语"试剂"和"测试化合物”表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物，所述生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞或组织。生物大分子包括siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、肽，肽/DNA复合物、以及任何基于核酸的分子，其能够调节本文所述的含TUBB4A的核酸或其编码的蛋白质的活性。
如本文所用，“TUBB4A”是指编码β微管蛋白家族成员的基因。β微管蛋白是异二聚化和组装形成微管的两个核心蛋白家族(α和β微管蛋白)之一。该基因的突变导致髓鞘形成性脑白质营养不良-6和常染色体显性扭转性肌张力障碍-4和H-ABC，现在更常称为TUBB4A相关性脑白质病。TUBB4A的参考序列包括例如NM_001289123.1、NM_001289127.1、NM_001289129.1，其可在GenBank上找到。交替剪接导致编码不同的同种型的多个转录变体。野生型TUBB4A蛋白序列见于UniProt，登录号P04350-TBB4A_human。多种已知与人类疾病相关的TUBB4A变体已被鉴定并列于下表1中。本发明专注于D249N变体，然而这些发现可推广到其他现有的TUBB4A突变。
表2列出了与不同形式的TUBB4A相关性脑白质病相关的某些氨基酸变化。
如本文所用，术语“治疗”或“疗法”(以及其不同形式)包括预防性(例如预防的)、治愈性或姑息性治疗。如本文所用，术语“治疗”包括缓解或减少病况、疾病或病症的至少一种不利或负面影响或症状。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指动物，例如人类，向其提供使用根据本发明的药物组合物的治疗，包括预防性治疗。如本文所用，术语“受试者”是指人类和非人类动物。术语“非人类动物”和“非人类哺乳动物”在本文中可互换使用并且包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、马和非哺乳动物，例如爬行动物、两栖动物、鸡和火鸡。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可能被非核苷酸组分中断。聚合后可进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。
如本文所用，术语“野生型”是技术人类员理解的本领域术语，是指生物体、菌株、基因或特征的典型形式，如其在自然界中出现的，有别于突变体或变体形式。如本文所用，术语“变体”应理解为具有偏离野生型或包含非天然成分的模式的品质的表现。
术语“非自然存在的”或“工程化的”可互换使用，表示人力的参与。当涉及核酸分子或多肽时，这些术语是指核酸分子或多肽至少基本上不含它们在自然界中与其天然相关并且如在自然界中存在的至少一种其他成分。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益或所需结果的药剂的量。治疗有效量可根据以下一项或多项而变化：受治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，这些可由本领域普通技术人类员容易地确定。该术语还适用于将提供用于通过本文所述的任何一种成像方法进行检测的图像的剂量。具体剂量可根据以下一项或多项而变化：选择的特定药剂、要遵循的给药方案、是否与其他化合物联合施用、施用时间、要成像的组织以及携带它的物理递送系统。
除非另有说明，否则本发明的实施采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见Sambrook,Fritsch和Maniatis,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编,(1987))；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))、Harlow和Lane,编.(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,以及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,编(1987))。
在一些实施方案中，载体能够使用哺乳动物表达载体驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中的表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed,1987.Nature 329:840)和pMT2PC(Kaufman等人.,1987.EMBO J.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由一个或多个调控元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40，以及本文公开的和本领域已知的其他启动子。对于原核细胞和真核细胞的其他合适的表达系统，参见例如第16章和第17章，Sambrook,等人,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL.第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
术语"载体"涉及可以被感染、转染或转化成细胞并独立地或在宿主细胞基因组内复制的单链或双链环状核酸分子。可以切割环状双链核酸分子，从而在用限制酶处理后线性化。载体、限制酶的种类以及限制酶靶向的核苷酸序列的知识对于本领域技术人类员来说是容易获得的，并包括任何复制子(例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒)，在其上可以连接另一个遗传序列或元件(DNA或RNA)，从而复制所连接的序列或元件。通过用限制酶切割载体并将两个片段连接在一起，可以将本发明的核酸分子插入载体。
在一些实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸(例如，反义寡核苷酸)优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括：白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人,1987.Genes Dev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275)、特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,1989.EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白(Baneiji等人,1983.Cell 33:729-740；Queen和Baltimore,1983.Cell 33:741-748)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985.Science 230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子，美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。发育调节的启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,1990.Science 249:374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,1989.GenesDev.3:537-546)。为了获得高水平的表达，可以对TUBB4A编码核酸进行密码子优化。
核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人类工病毒粒子和试剂增强的DNA摄取。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355并且脂质转染试剂是商业销售的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Feigner、WO91/17424；WO91/16024的那些。递送可以是到细胞(例如体外或离体施用)或到靶组织(例如体内施用)的。
脂质:核酸复合物，包括靶向脂质体如免疫脂质复合物的制备是本领域技术人类员公知的(参见，Crystal,Science 270:404-265(1995)；Blaese等人,Cancer GeneTher.2:291-297(1995)；Behr等人,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等人,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等人,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等人,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸利用了高度进化的过程，用于将病毒靶向体内的特定细胞并将病毒有效载荷运送到细胞核。病毒载体可直接施用于患者(体内)或它们可用于体外处理细胞，并且可任选地将修饰的细胞施用于患者(离体)。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。可以使用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法整合到宿主基因组中，通常会导致插入的转基因长期表达。此外，在许多不同的细胞类型和靶组织中都观察到了高转导效率。
逆转录病毒的趋向性可以通过整合外源包膜蛋白来改变，从而扩大靶细胞的潜在靶标群体。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择将取决于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用的长末端重复序列组成，其包装容量高达6-10kb的外源序列。最小的顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(参见，例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommnerfelt等人,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。
在优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率并且不需要细胞分裂。使用此类载体，已获得高滴度和表达水平。该载体可以在相对简单的系统中大量生产。
腺相关病毒(“AAV”)载体也可用于用靶核酸转导细胞，例如在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和离体基因治疗程序(参见，例如，West等人,Virology160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994))。重组AAV载体的构建描述于许多出版物中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin,等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；和Samulski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)。
包装细胞通常用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因治疗的病毒载体通常是通过产生将核酸载体包装成病毒颗粒的细胞系来产生的。载体通常包含包装和随后整合到宿主中所需的最少病毒序列，其他病毒序列被用于要表达的多核苷酸的表达盒替换。缺失的病毒功能通常由包装细胞系反式提供。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的ITR序列，这些序列是包装和整合到宿主基因组中所需的。病毒DNA被包装在一个细胞系中，该细胞系包含一个编码其他AAV基因的辅助质粒，即rep和cap，但缺少ITR序列。也可以用腺病毒作为辅助病毒来感染细胞系。辅助病毒促进AAV载体的复制和辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒没有大量包装。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒对热处理比AAV更敏感。
在一些实施方案中，将宿主细胞用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。在一些实施方案中，将细胞转染，如其在受试者中自然发生的那样。在一些实施方案中，被转染的细胞取自受试者。在一些实施方案中，细胞来源于取自受试者的细胞，例如细胞系。
在一方面，本发明提供了在真核细胞中修饰靶多核苷酸的方法，所述方法可以在体内、离体或体外进行。在一些实施方案中，该方法包括从人类或非人类动物取样细胞或细胞群，并修饰细胞。培养可以在离体的任何阶段进行。可以将一个或多个细胞重新引入人类或非人类动物。
在一方面，本发明提供了在真核细胞中修饰靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中，该方法包括使CRISPR复合物与靶多核苷酸结合以实现所述靶多核苷酸的切割，从而修饰把靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包含与引导序列复合的CRISPR酶，该引导序列与所述靶多核苷酸内的靶序列杂交，其中所述引导序列与tracr mate序列连接，而tracr mate序列又与tracr序列杂交。
在一方面，本发明提供了包含上述方法和组合物中公开的任何一种或多种元件的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含载体系统或替代递送系统的组分，例如上述那些。元件可以单独提供或组合提供，并且可以提供在任何合适的容器(例如小瓶、瓶或管)中。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种语言的说明书，例如多于一种语言的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种试剂，用于利用本文所述的一种或多种元件的方法。试剂可以提供在任何合适的容器中。例如，试剂盒可提供一种或多种反应或储存缓冲液。试剂可以以可用于特定试验的形式提供，或以在使用前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如以浓缩物或冻干形式)提供。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施方案中，缓冲液是碱性的。在一些实施方案中，缓冲液具有约7至约10的pH。在一些实施方案中，该试剂盒包含一种或多种对应于引导序列的寡核苷酸，用于插入载体中以便可操作地连接引导序列和调控元件。在一些实施方案中，试剂盒包含同源重组模板多核苷酸。
下调或抑制性核酸包括但不限于反义分子、适体、核酶、三链体形成分子、RNA干扰(RNAi)、CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)RNA(crRNA)和外部引导序列。这些核酸分子可以作为靶分子所具有的特定活性的影响剂(affector)、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其他分子的新发活性。在某些实施方案中，使用抑制性核酸。
反义分子被设计为通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用旨在通过例如RNase H介导的RNA-DNA杂交降解促进靶分子的破坏。替代地，反义分子被设计为中断通常发生在靶分子上的加工功能，例如转录或复制。可以根据靶分子的序列设计反义分子。存在通过发现靶分子的最容易接近的区域来优化反义效率的多种方法。示例性方法是使用DMS和DEPC的体外选择实验和DNA修饰研究。优选地，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶分子。有助于设计和使用反义分子的方法和技术的代表性示例可以在美国专利号5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6,057,437中找到。
形成三链体的功能性核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，就会形成称为三链体的结构，其中存在依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对形成复合物的三股DNA。三链体分子是优选的，因为它们可以以高亲和力和特异性结合靶区域。优选地，三链体形成分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。关于如何制备和使用三链体形成分子来结合多种不同靶分子的代表性实例可以在美国专利号5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426中找到。基因表达也可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异性的方式有效地沉默。这种沉默最初是通过添加双链RNA(dsRNA)观察到的(Fire,A.等人,Nature,391:806-11(1998)；Napoli,C.等人,Plant Cell,2:279-89(1990)；Hannon,G.J.,Nature,418:244-51(2002))。一旦dsRNA进入细胞，它就会被RNaseIII样酶，即Dicer酶，切割成长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA)，其在3'端包含2个核苷酸突出端(Elbashir,S.M.等人,Genes Dev.,15:188-200(2001)；Bernstein,E.等人,Nature,409:363-6(2001)；Hammond,S.M.等人,Nature,404:293-6(2000))。在依赖ATP的步骤中，siRNA被整合到多亚基蛋白复合物中，通常称为RNAi诱导沉默复合物(RISC)，它将siRNA引导至靶RNA序列(Nykanen,A.等人,Cell,107:309-21(2001))。在某些时候，siRNA双链体解开，反义链似乎仍然与RISC结合，并通过内切和外切核酸酶的组合指导互补mRNA序列的降解(Martinez,J.等人,Cell,110:563-74(2002))。然而，RNAi或siRNA的效果或它们的使用不限于任何类型的机制。
小干扰RNA(siRNA)是一种双链RNA，可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而降低甚至抑制基因表达。在一个实例中，siRNA在siRNA和靶RNA之间的序列同一性区域内触发同源RNA分子(例如mRNA)的特异性降解。例如，WO 02/44321公开了当与3'突出端碱基配对时能够序列特异性降解靶mRNA的siRNA，这些siRNA的制备方法以引用方式并入本文。可以使用合成的短双链RNA模拟dicer酶产生的siRNA，在哺乳动物细胞中实现序列特异性基因沉默(Elbashir,S.M.等人,Nature,411:494 498(2001)；Ui-Tei,K.等人,FEBS Lett,479:79-82(2000))。siRNA可以是化学合成或体外合成的，也可以是短双链发夹样RNA(shRNA)在细胞内加工到siRNA中的结果。合成siRNA通常使用算法和传统的DNA/RNA合成仪设计。供应商包括Ambion(Austin,Tex.)、ChemGenes(Ashland,Mass.)、Dharmacon(Lafayette,Colo.)、Glen Research(Sterling,Va.)、MWB Biotech(Esbersberg,德国),Proligo(Boulder,Colo.)和Qiagen(Vento,荷兰)。还可以使用试剂盒，如Ambion的SILENCER.RTM.siRNA在体外合成siRNA。
如本文所用，当涉及在宿主细胞中产生蛋白质时，术语“过表达”是指蛋白质的产生量大于其在其天然存在环境中产生的量。
如本文所用，术语“遗传改变”是指与一个或多个核酸分子的野生型或参考序列的改变。遗传改变包括但不限于已知序列的核酸分子的碱基对取代、添加和缺失至少一个核苷酸。
如本文所用，术语“固体基质”是指任何形式，例如珠、微粒、微阵列、微量滴定孔或试管的表面、浸棒或过滤器。所述基质的材料可以是聚苯乙烯、纤维素、乳胶、硝化纤维、尼龙、聚丙烯酰胺、葡聚糖或琼脂糖。
如本文所用，"靶核酸”是指存在于复杂核酸混合物中的核酸的先前限定的区域，其中所述限定的野生型区域包含至少一种已知的与脑白质营养不良相关的核苷酸变异。可以通过cDNA克隆或消减杂交或手动合成从天然来源分离所述核酸分子。可以通过三酯合成方法或通过使用自动DNA合成仪来人类工合成所述核酸分子。
术语“互补的”描述了可以彼此形成多种有利相互作用的两个核苷酸。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，因为它们可以形成两个氢键。同样，鸟嘌呤和胞嘧啶是互补的，因为它们可以形成三个氢键。因此，如果核酸序列包含以下碱基序列：胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶，该核酸分子的“补体”是包含替代胸腺嘧啶的腺嘌呤、替代腺嘌呤的胸腺嘧啶、替代鸟嘌呤的胞嘧啶和替代胞嘧啶的鸟嘌呤的分子。因为补体可以包含与亲本核酸分子形成最佳相互作用的核酸序列，所以这样的补体可以与其亲本分子以高亲和力结合。
术语“启动子元件”描述了掺入载体中的核苷酸序列，该核苷酸序列一旦进入适当的细胞，便可以促进转录因子和/或聚合酶的结合以及随后将载体DNA的部分转录成mRNA。在一个实施方案中，本发明的启动子元件在脑白质营养不良特异性标志物核酸分子的5'端之前，使得后者被转录成mRNA。然后宿主细胞机制将mRNA翻译成多肽。
本领域技术人类员将认识到，核酸载体可以包含除启动子元件以外的核酸元件和TUBB4A下调核酸分子。这些其他核酸元件包括但不限于复制起点、核糖体结合位点、编码抗药性酶或氨基酸代谢酶的核酸序列以及编码分泌信号、定位信号或对多肽纯化有用的信号的核酸序列。
“复制子”是能够在很大程度上在其自身控制下复制的任何遗传元件，例如质粒、粘粒、杆粒、质体、噬菌体或病毒。复制子可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链。
“操纵子”是指可以具有转录和翻译控制序列的核酸片段，所述转录和翻译控制序列例如启动子、增强子、翻译起始信号(例如ATG或AUG密码子)、聚腺苷酸化信号，终止子等，并且其促进多肽编码序列在宿主细胞或生物中的表达。
如本文所用，术语“报告子”、“报告子系统”、“报告子基因”或“报告子基因产物”应表示可操作的遗传系统，其中核酸包含编码产物的基因，所述产物表达后可产生(例如通过生物测定、免疫测定、放射免疫测定、或通过比色、荧光、化学发光或其他方法)易于测量的报告子信号。所述核酸可以是RNA或DNA、线性的或环状的、单链的或双链的、反义或有义极性的，并且可操作地连接至必要的控制元件以表达报道子基因产物。所需的控制元件将根据报道子系统的性质而有所不同，并且无论所述报道子基因是DNA还是RNA形式，但是其可以包括但不限于，如启动子、增强子、翻译控制序列、聚A附加信号、转录终止信号等的元件。
如上所述，所引入的核酸可以或可以不整合(共价连接)到受体细胞或生物的核酸中。例如，在细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中，所导入的核酸可以保持为游离基因元件或独立的复制子，例如质粒。或者，所引入的核酸可以整合到受体细胞或生物的核酸中，并稳定地维持在该细胞或生物中，并进一步传递或遗传给受体细胞或生物的后代细胞或生物。最后，所引入的核酸可能仅短暂地存在于受体细胞或宿主生物中。
术语“可操作地连接”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于DNA分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。这种相同的定义有时适用于表达载体中转录单元和其他转录控制元件(例如，增强子)的排列。
本文所述的“Gymnosis”需要在不存在任何载体(例如：转染)或缀合的情况下将单链反义寡脱氧核苷酸递送至细胞，从而产生序列特异性基因沉默。
短语“修饰的主链连接”包括但不限于：硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接、乙基膦酸酯连接、硼酸磷酸酯连接、磺酰胺、羰基酰胺、二氨基磷酸酯、包含带正电荷的侧基的二氨基磷酸酯连接、二硫代磷酸酯、氨基乙基甘氨酸、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯；3'-亚烷基膦酸酯；5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、3'-氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯；硫酰烷基-膦酸酯、硫酰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、2-5'连接的硼酰膦酸酯类似物、极性倒转的连接、无碱基连接、短链烷基连接、环烷基核苷间连接、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、具有硅氧烷主链的短链杂原子或杂环核苷间连接、硫化物、亚砜、砜、甲乙酰基连接、硫甲乙酰连接、亚甲基甲乙酰连接、硫甲乙酰连接、核糖乙酰连接、烯烃连接、氨基磺酸酯主链、亚甲基亚氨基连接、亚甲基肼连接、磺酸酯连接和酰胺连接。
短语“修饰糖”包括但不限于，2'氟、2'氟取代的核糖、2'-氟-D-阿拉伯糖核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基核糖、2'-O-甲氧基乙基脱氧核糖、2'-O-甲基取代的核糖、吗啉、哌嗪和锁核酸(LNA)。
“特异性结合对”包括特异性结合成员(sbm)和结合伴侣(bp)，它们彼此具有特定的特异性，并且在正常条件下优先于其他分子彼此结合。特异性结合对的实例是抗原和抗体、配体和受体以及互补核苷酸序列。技术人类员知道许多其他实例。此外，术语“特异性结合对”也适用于特异性结合成员和结合伴侣之一或两者均包含一部分大分子的情况。在其中特异性结合对包含核酸序列的实施方案中，它们将具有在试验条件下彼此杂交的长度，优选大于10个核苷酸长，更优选大于15或20个核苷酸长。
“样品”或“患者样品”或“生物样品”通常是指可以测试特定分子的样品，所述分子优选脑白质营养不良特异性标志物分子，例如下表中所示的标志物。样品可以包括但不限于细胞、体液，包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪、胸水等。
生产的试剂盒和制品
任何上述产品都可以被并入试剂盒中，该试剂盒可以在药学上可接受的载体中包含TUBB4A定向下调核酸。核酸可以或可以不位于能够转导哺乳动物细胞的载体中。在其他方面，该试剂盒包含表达人类野生型TUBB4A和/或突变型TUBB4A编码核酸的载体，用于在感兴趣的靶细胞中过表达相同的核酸。该试剂盒可任选地包括纳米颗粒或脂质体制剂，其有助于将核酸递送到细胞中。该试剂盒还可包含用于施用的使用说明、容器、器皿、试验底物或其任意组合。
治疗剂的开发和筛选方法
由于本文鉴定的TUBB4A的遗传改变与H-ABC的病因有关，因此确认调节突变基因及其编码产物活性的试剂的方法应该导致产生用于治疗脑白质营养不良，特别是H-ABC的有效治疗剂。
分子建模应有助于根据功能所需的构象或关键氨基酸残基确认具有与改变的TUBB4A蛋白的活性位点结合的能力的特定有机分子。将使用组合化学方法来确认具有最大活性的分子，然后将开发这些分子的迭代以用于进一步的筛选循环。
用于药物筛选试验的多肽或片段可以在溶液中游离、固定至固体支持物上或固定在细胞内。一种药物筛选方法利用真核或原核宿主细胞，其优选地在竞争性结合试验用表达所述多肽或片段的重组多核苷酸稳定转化。活细胞或固定形式的此类细胞可用于标准结合试验。例如，可以确定多肽或片段与被测试剂之间的复合物的形成，或者检查多肽或片段与已知底物之间的复合物的形成受被测试剂干扰的程度。
另一种药物筛选技术为对编码的多肽具有合适结合亲和力的化合物提供高通量筛选，并详细描述于Geysen，PCT公开申请WO 84/03564，1984年9月13日公开。简言之，大量不同的小肽测试化合物，例如上述那些，是在固体基质(例如塑料针(plastic pins)或一些其他表面)上合成的。将肽测试化合物与靶多肽反应并洗涤。然后通过本领域公知的方法检测结合的多肽。
另一种药物筛选技术涉及使用具有非功能性或改变的TUBB4A相关基因的宿主真核细胞系或细胞(如上文所述)。这些宿主细胞系或细胞在多肽水平上是有缺陷的。所述宿主细胞系或细胞在药物化合物存在下生长。测量宿主细胞的细胞代谢速率以确定该化合物是否能够调节缺陷细胞中的细胞代谢。如上所述，引入DNA分子的方法也是本领域普通技术人类员公知的。
表达本发明的与H-ABC相关的核酸或其功能片段的宿主细胞提供了一种系统，在该系统中筛选具有调节脑白质营养不良发展的能力的潜在化合物或试剂。因此，在一个实施方案中，本发明的核酸分子可用于产生重组细胞系，用于在试验中确认调节与神经元信号传导和神经元细胞通讯和结构相关的细胞代谢方面的药剂。本文还提供了筛选化合物的方法，所述化合物能够调节由含TUBB4A的核酸编码的蛋白质的功能。
另一方法需要使用工程改造的(engineered)噬菌体展示文库，以在噬菌体表面表达由改变的TUBB4A核酸编码的多肽片段。然后在可检测到表达的肽与化学文库组分之间的结合亲和力的条件下，使此类文库与组合化学文库接触。美国专利号6,057,098和5,965,456提供了进行这种试验的方法和设备。此类化合物文库可从许多公司购买，包括但不限于Maybridge Chemical Co.,(Trevillet,Cornwall,英国)、Comgenex(Princeton,N.J.)、Microsour(New Milford,Conn.)Aldrich(Milwaukee,Wis.)Akos Consulting andSolutions GmbH(巴塞尔,瑞士)、Ambinter(巴黎,法国)、Asinex(莫斯科,俄罗斯)、Aurora(Graz,奥地利)、BioFocus DPI(瑞士)、Bionet(Camelford,英国)、Chembridge(San Diego,Calif.)、Chem Div(San Diego,Calif.)。技术人类员知道其他来源并且可以很容易地购买相同的设备。一旦在本文所述的筛选试验中鉴定出治疗有效的化合物，它们就可以被配制成药物组合物并用于治疗H-ABC。
合理药物设计的目标是产生感兴趣的生物活性多肽或与之相互作用的小分子的结构类似物(例如，激动剂、拮抗剂、抑制剂)，以形成药物，其是例如更高活性或稳定形式的多肽，或例如在体内增强或干扰多肽的功能。参见，例如Hodgson,(1991)Bio/Technology9:19-21。在上面讨论的一种方法中，感兴趣的蛋白质或例如蛋白质-底物复合物的三维结构通过以下方法解析：X射线晶体学、核磁共振、计算机建模或最通常地，方法的组合。较少情况下，可以通过基于同源蛋白质结构的建模获得关于多肽结构的有用信息。合理药物设计的一个例子是HIV蛋白酶抑制剂的开发(Erickson等人,(1990)Science 249:527-533)。此外，肽可以通过丙氨酸扫描进行分析(Wells,(1991)Meth.Enzym.202:390-411)。在该技术中，氨基酸残基被Ala取代，并确定其对肽活性的影响。以这种方式分析肽的每个氨基酸残基以确定肽的重要区域。
也可以分离出一种目标特异性抗体，通过功能试验选择，然后解析其晶体结构。原则上，这种方法产生的药核(pharmacore)可以作为后续药物设计的基础。
人类们可以通过产生针对功能性、药理学活性抗体的抗独特型抗体(anti-ids)来完全绕过蛋白质晶体学。作为镜像的镜像，anti-ids的结合位点应该是原始分子的类似物。然后可以使用anti-id从化学或生物产生的肽库中识别和分离肽。选定的肽将被用作药核。
在另一个实施方案中，改变的TUBB4A核酸的可用性能够产生携带本发明的脑白质营养不良相关的TUBB4A核酸的实验室小鼠品系，如下文所述。表达本发明的与脑白质营养不良相关的核酸的转基因小鼠提供了模型系统，其中可以检查突变的TUBB4A蛋白在脑白质营养不良的发展和进展中的作用。在实验室小鼠中引入转基因的方法是本领域技术人类员已知的并且在下文中描述。三种常见方法包括：1.将编码目的外源基因的逆转录病毒载体整合到早期胚胎中；2.将DNA注入新受精卵的原核；以及3.将经过基因处理的胚胎干细胞整合到早期胚胎中。上述转基因小鼠的产生将有助于对靶蛋白在各种细胞代谢和神经元过程中的作用进行分子阐明。这样的小鼠在整个动物模型中提供了研究推定的治疗药物的体内筛选工具，并且被本发明涵盖。
本文使用的术语“动物”包括人类以外的所有脊椎动物。它还包括处于各个发育阶段(包括胚胎和胎儿阶段)的个体动物。“转基因动物”是指任何含有一个或多个带有遗传信息的细胞的动物，这些遗传信息通过在亚细胞水平上的有意遗传操作(例如通过靶向重组、显微注射或重组病毒感染)而直接或间接地被改变或接收。术语“转基因动物”旨在涵盖经典的杂交或体外受精，而是旨在涵盖其中一个或多个细胞被重组DNA分子改变或接受重组DNA分子的动物。该分子可以被特异性靶向特定的遗传基因座，被随机整合在染色体中，或者它也可以是染色体外复制的DNA。术语“生殖细胞系转基因动物”是指这样的转基因动物，其中将遗传改变或遗传信息引入生殖细胞，从而赋予将遗传信息转移给后代的能力。如果这些后代实际上拥有某些或全部这种改变或遗传信息，那么它们也是转基因动物。
用于改变靶基因的DNA可以通过多种技术获得，包括但不限于从基因组来源分离、从分离的mRNA模板制备cDNA、直接合成或其组合。
用于转基因导入的靶细胞的优选的类型是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可以从体外培养的植入前胚胎中获得(Evans等人,(1981)Nature 292:154-156；Bradley等人,(1984)Nature 309:255-258；Gossler等人,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.83:9065-9069)。可以通过标准技术(例如DNA转染)或通过逆转录病毒介导的转导将转基因有效地引入ES细胞。此后，可以将所得的转化的ES细胞与来自非人类动物的胚泡合并。此后，引入的ES细胞定植在胚胎中并有助于所得嵌合体动物的种系。
技术可用于失活或改变任何遗传区域为所需的突变。
如本文所用，敲入动物是其中例如内源鼠基因已被本发明的人类脑白质营养不良相关的TUBB4A基因替代的动物。这种敲入动物为研究脑白质营养不良的发展提供了理想的模型系统。还创建了敲除动物。
如本文所用，可以使用载体以“组织特异性方式”或“细胞类型特异性方式”靶向脑白质营养不良相关核酸及其片段的表达，其中编码全部或部分脑白质营养不良相关的核酸的核酸序列可操纵地连接至调节序列(例如，启动子和/或增强子)，所述调节序列指导特定组织或细胞类型中所编码的蛋白的表达。这样的调节元件可以有利地用于体外和体内应用。指导组织特异性蛋白的启动子是本领域众所周知的，并在本文中进行了描述。
本文还提供了本发明的转基因小鼠的使用方法。例如，已经向其中引入了包含脑白质营养不良相关的TUBB4A的核酸或其编码的蛋白质的转基因小鼠，可用于开发筛选方法以筛选治疗剂以确认能够调节脑白质营养不良的发生的那些。
药物组合物
含有治疗剂、预防剂或诊断剂衍生物，例如功能性核酸衍生物的药物组合物可以肠胃外施用于需要这种治疗的受试者。肠胃外施用可以借助注射器，任选地笔状注射器，通过皮下、肌内或静脉内注射进行。或者，可以通过输液泵进行肠胃外施用。其他的选择是经鼻或经肺施用专门为此目的而设计的治疗剂、预防剂或诊断剂，优选以组合物、粉末或液体的形式。
治疗剂、预防剂或诊断剂衍生物的可注射组合物，包括颅内注射，可以使用制药工业的常规技术来制备，包括适当地溶解和混合成分以得到所需的最终产品。因此，根据一种方法，可以将治疗剂、预防剂或诊断剂衍生物溶于一定量的水中，该量略小于待制备的组合物的最终体积。可根据需要加入等渗剂、防腐剂和缓冲剂，并在必要时使用酸(例如，盐酸)或碱(例如，氢氧化钠水溶液)调节溶液的pH值。最后，可以用水调节溶液的体积以提供所需的成分浓度。
在一些实施方案中，缓冲剂可以选自由以下组成的组：醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠，和tris(羟甲基)-氨基甲烷、二辛酸、三辛酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的每一个以及它们的组合构成一个替代实施方案。
可以方便地以单位剂量形式存在的药物制剂可以根据制药工业中众所周知的常规技术来制备。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂相结合的步骤。一般而言，通过将活性成分与液体载体、细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要的话，将产品成型(例如，形成用于递送的特定粒度)来制备制剂。在本发明和/或其多个实施方案的优选实施方案中，所述药物制剂在适当的溶剂(例如水或生理盐水)中，可能在无菌制剂中与载体或其他试剂一起制备以用于肌内施用。
“药物载体”或“赋形剂”可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药理学惰性媒介物，并且是本领域已知的。赋形剂可以是液体或固体，并且根据计划的施用方式进行选择，以便当与核酸和给定药物组合物的其他组分组合时提供所需的体积(bulk)、稠度等。
本文提供的组合物可以含有两种或更多种反义化合物。在另一个相关的实施方案中，组合物可以含有一种或多种靶向第一核酸的反义化合物，特别是寡核苷酸，以及一种或多种靶向第二核酸靶标的另外的反义化合物。或者，本文提供的组合物可包含靶向同一核酸靶标的不同区域的两种或更多种反义化合物。两种或更多种组合的化合物可以一起或依次使用。组合物还可以与其他非反义化合物治疗剂组合。
本文所述的反义寡聚化合物可以与适合于制造水性悬浮液的赋形剂混合。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。反义寡聚化合物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。悬浮液可以根据已知技术使用上文提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油(fixed oil)通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射剂。
本公开还包括制备用于储存或施用的反义寡聚化合物组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的所需化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是制药领域众所周知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(MackPublishing Co.，AR Gennaro编辑，1985)中。例如，可以提供防腐剂和稳定剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
本公开的药物组合物还可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯胶和黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。
本公开的反义寡聚化合物可以通过任何标准手段施用于患者，使用或不使用稳定剂、缓冲剂等，以形成适合治疗的组合物。当需要使用脂质体递送机制时，可以遵循脂质体形成的标准方案。因此，本公开的反义寡聚化合物可以以任何形式施用，例如肌内或通过局部、全身或鞘内注射。
本公开的特征还在于反义寡聚化合物组合物的用途，所述组合物包含含有聚(乙二醇)脂质的表面修饰的脂质体(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)。这些制剂提供了一种用于增加反义寡聚化合物在靶组织中积累的方法。此类药物载体可抵抗单核吞噬系统(MPS或RES)的调理作用和消除作用，从而实现更长的血液循环时间并增强封装的反义寡聚化合物的组织暴露(Lasic等人,Chem.Rev.95:2601-2627(1995)和Ishiwata等人,Chem.Pharm.Bull.43:1005-1011(1995)。长循环脂质体增强反义寡聚化合物的药代动力学和药效学，特别是与已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比(Liu等人J.Biol.Chem.42:24864-24870(1995)；Choi等人,PCT公开号WO 96/10391；Ansell等人,PCT公开号WO 96/10390；Holland等人,PCT公开号WO 96/10392)。与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可能在更大程度上保护反义寡聚化合物免受核酸酶降解，因为它们能够避免在代谢侵袭性MPS组织(如肝脏和脾脏)中积累。
在施用根据本公开的制剂和方法的反义寡聚化合物组合物后，与安慰剂治疗的受试者或其他合适的对照受试者相比，测试受试者会表现出与所治疗的疾病或病症相关的一种或多种症状减少约10％至约99％。多种用于递送治疗神经退行性病症的反义寡核苷酸的方法描述于Evers等人，(2015)Advanced Drug Delivery Reviews 87:90-103中，其通过引用并入本文。
提供以下材料和方法以帮助进行实施本发明。
小鼠模型的生成
通过在TUBB4A基因的外显子4中插入p.Asp249Asn(c.745G>A)突变，使用规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas-9技术生成杂合TUBB4AD249N小鼠。小鼠TUBB4A基因位于由4个外显子组成的17号染色体上。将Cas9 mRNA、gRNA和寡核苷酸(带有靶向序列，两侧结合有120bp同源物)共同注射到受精卵中。由此产生的CRISPR敲入小鼠模型在TUBB4A基因的一个等位基因(TUBB4AD249N)中具有c.745G>A的杂合点突变。除了杂合的TUBB4AD249N动物外，这些杂合小鼠被培育以产生纯合的TUBB4AD249N/D249N小鼠，这与在taeip大鼠模型中看到的纯合突变(Li等人,2003)保持一致。所有分析均包括野生型(WT)、TUBB4AD249N和TUBB4AD249N /D249N小鼠。在所有实验步骤对动物进行基因分型。小鼠在12小时光照:12小时黑暗循环下保持在清洁设施中，并可以自由获取食物和水。方法和研究方案符合修订后的美国国立卫生研究院实验动物福利政策。
组织处理
根据体重使用90-150mg/kg的氯胺酮和7.5-16mg/kg的甲苯噻嗪的混合物将小鼠深度麻醉，用1X PBS初始冲洗后，用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛(PFA)(Thermo Fisher Scientific,美国)经心脏灌注。收集大脑并用1X PBS中的4％PFA后固定过夜，然后将组织在1X PBS中的30％蔗糖中脱水。将大脑嵌入最佳切割温度化合物(O.C.T.化合物，SAKURA，4583，美国)中，然后在低温切片机(CM 3050S，Leica biosystems，美国)上切成冠状或矢状(50μm)切片。
反义寡核苷酸合成与筛选
小鼠和人类ASO是在Microsynth和Biospring公司设计和合成的。收到冻干粉末形式的ASO后，将ASO悬浮在Tris-EDTA缓冲液(未经处理的载体)中。对于这两种类型的ASO，进行体外筛选以确定最佳ASO设计。为了筛选小鼠ASO，我们使用小鼠HT-22细胞，对于人类ASO筛选，我们使用人类A5499细胞。在NEPA21电穿孔系统(NEPAGENE，美国)上，以100000个细胞/孔，在100μL培养基中，以150V的电压，以1μM、5μM和10μM的ASO浓度，对每种细胞系的一百万个细胞进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到96孔板上并置于培养箱中。处理后48小时，用PBS洗涤细胞，使用PureLinkTM RNA 96-孔试剂盒(ThermoFisher Scientific,Cat#12173-011A)根据制造商的说明进行RNA提取。用DNAase(Invitrogen)处理后，使用SuperScriptTM IV第一链合成系统(ThermoFisher Scientific,Cat:18091200)将200ngRNA用于cDNA。在Applied Biosystems Quanta Flex 7(ThermoFisher Scientific，美国)上使用实时PCR分析(Taqman chemistry)量化TUBB4A，以及编码剪接因子的内源管家基因的mRNA表达水平，以富含精氨酸/丝氨酸-9(sfrs9)作为参照。使用ΔΔCT方法分析结果。
小鼠脑室内(ICV)注射
对WT幼仔(P0-P1)施用不同剂量的TUBB4A ASO。使用Hamilton 1700气密注射器(7653-01，Hamilton Company)将ASO通过ICV注射施用于被低温麻醉的小鼠。将针放置在前囟和眼睛之间，距前囟距离的2/5处，插入深度2mm。向左室注射总体积2μL。让小鼠在加热垫上恢复并随后将其重新放归至母鼠(dam)。
使用RNA提取、cDNA合成和qPCR测定剂量反应
为了测定脑中TUBB4A的相对表达，在ICV注射10天后，将小鼠安乐死，收集不同的脑区域，速冻并保存在-80℃。使用RNeasy96通用组织试剂盒(Qiagen)，根据制造商的说明进行RNA提取。在Applied Biosystems Quanta Flex 7(ThermoFisher Scientific，美国)上使用实时PCR分析(Taqman chemistry)量化TUBB4A，以及作为参照的编码hprt的内源管家基因的mRNA表达水平。使用ΔΔCT方法分析结果。
提供以下实施例以说明本发明的某些实施方案。它们不意图以任何方式限制本发明。
实施例I
反义寡核苷酸介导的TUBB4A的治疗性抑制用于治疗H-ABC脑白质营养不良
基底神经节和小脑的髓鞘形成不足和萎缩(H-ABC)是一种与管状α4A(TUBB4A)突变相关的罕见的脑白质营养不良。p.Asp.249Asn(D249N)突变是在大多数受H-ABC影响的个体中发现的反复出现的变体。H-ABC通常始于婴儿期，其特征是肌张力障碍、共济失调、步态改变和进行性运动功能障碍。我们最近描述并发表了使用带有这种变体的CRISPR敲入小鼠模型的研究，并概括了H-ABC疾病特征。TUBB4AD249N/D249N的纯合变体表现出进行性运动功能障碍、共济失调、被限定的存活(decreed survival)(～P32-P37)、严重的髓鞘形成缺陷以及纹状体和小脑的神经元萎缩(Sase等人,2020)。当变体仅以杂合状态TUBB4AD249N/+存在时，观察到以髓鞘缺陷为特征的表型减少，但不影响运动能力和存活。因此，TUBB4AD249N/D249N是一种独特的临床前工具，用于测试治疗H-ABC疾病的新治疗策略。我们未发表的数据显示，TUBB4A两个拷贝的种系缺失的小鼠(TUBB4AKO/KO)发育正常，表现出正常的运动功能，并且没有髓鞘形成或神经元缺陷。当这些TUBB4AKO/KO与TUBB4AD249N/+小鼠杂交时，所得的TUBB4AD249N/KO小鼠相对于TUBB4AD249N/D249N表现出运动缺陷改善、髓鞘形成缺陷减少、层和小脑神经元损失减少以及存活增加(～P110)(n＝8-9，p<0.0001)。总之，这些结果表明H-ABC相关疾病与突变型TUBB4A(野生型微管蛋白的一种相对保留)的总体表达相关。因此，我们建议治疗H-ABC的一种方法是减少Tubb4a的总体表达。为了评估TUBB4A抑制的治疗潜力，我们设计了针对人类TUBB4A和小鼠TUBB4A的新的反义寡核苷酸(ASO)。我们在人类细胞系中体外筛选了人类TUBB4A ASO，并发现了有前景的ASO序列，其可以减少人类TUBB4A。参见下表3。
表3-人类TUBB4A ASO序列
*硫代磷酸酯键
+号-2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸(2'-MOE)
5'Me-5'甲基
使用电穿孔法在A549N细胞中筛选ASO文库，重复3次。以不同浓度(0.1μM、0.5μM、1μM和5μM)进行ASO电穿孔后，提取RNA并进行qPCR以评估TUBB4A表达。将TUBB4A表达标准化为GAPDH(n＝3，***p<0.0001)。该结果示于图1A-1D中。这些ASO的选择在下面的由H-ABC患者细胞产生的诱导多能干细胞(iPSC)上进行了进一步测试。可以使用来自具有其他TUBB4A突变的患者的细胞进一步测试这些ASO。
与此同时，我们在小鼠细胞系上体外筛选了小鼠ASO序列，ASO序列列于下表中。请参见表4和图2A-2D。
所列出的ASO序列在小鼠中进行了体内测试，使用单次脑室内(ICV)推注途径将这些不同的ASO序列注射到野生型小鼠中，可用于鉴定最大限度降低TUBB4A水平的ASO。这种方法也可用于TUBB4AD249N/D249N小鼠，以改善H-ABC脑白质营养不良的症状。
实施例II
人类细胞中反义寡核苷酸介导的TUBB4A的治疗性抑制和毒性分析
通过在人类细胞系中体外筛选人类TUBB4A ASO并使用实施例I中描述的ASO序列，开发了靶向并减少人类TUBB4A的新反义寡核苷酸(ASO)。参见表5。
这些ASO缺口体(gapmer)包括三种不同的修饰-
1.5'和3'末端序列侧是2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸，表示为“+”
2.5'和3'末端序列侧是锁核酸，表示为“@”
3.5'和3'末端序列侧包括锁核酸和2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸的混合主链。
*硫代磷酸酯键
+号-2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸(2'-MOE)
@-锁核酸(LNA)
m-5’甲基
表4和表5中的ASO文库(ASO H2-1至H15-4)在Biospring公司合成，并使用gymnosis在SHYSY5Y细胞中进行筛选。将细胞以250000个细胞/孔铺板，并用10μm的ASO处理96小时。然后提取RNA并进行qPCR以评估TUBB4A表达。该结果示于图4中。
使用gynosis在SHYSY5Y细胞中进一步筛选ASO文库。将细胞以250000个细胞/孔铺板，并用10μm的ASO处理96小时。然后提取RNA以进行Nanostring用于测试TUBB4A表达的水平。该结果示于图5中。
图4和5的结果表明ASO H14和H15特别适合下调TUBB4A。该数据进一步表明ASOH14和H15非常适合用作后续生成其他ASO的模板设计。特别适合下调TUBB4A和生成优化的ASO的其他靶标包括ASO H13、H16和H1。
在确认表3和表5的ASO的TUBB4A下调后，使用ApoTox-Glo Triplex试剂盒测试这些ASO的体外毒性。该试剂盒组合了三种检测化学物质，可在单个检测孔内评估细胞活力、细胞毒性和细胞凋亡。该测定的第一部分涉及同时测量两种蛋白酶活性，一种作为细胞活力的标记，另一种作为细胞毒性的标记。然后将细胞暴露于第二种荧光细胞不渗透性肽底物，以测量死细胞蛋白酶活性，以确定丢失的膜完整性，从而测量ASO的细胞凋亡水平。
最初，选择两种ASO在施用24小时后检测ASO的体外毒性。将SHYSY5Y细胞以10000个细胞/孔铺板，并用10μm的ASO处理24小时。作为阳性对照，用10μm洋地黄皂苷或星形孢菌素处理两个孔。然后测试每孔的细胞活力、细胞毒性和细胞凋亡。该结果示于图6A-6C中。所测试的ASO在体外没有显示出毒性。
初步结果得到确认后，对另外的ASO进行了体外毒性测试。将SHYSY5Y细胞以10000个细胞/孔铺板，并用10μm的ASO处理48、72或96小时。作为阳性对照，将孔用10μm洋地黄皂苷或星形孢菌素处理48、72或96小时。此外，未处理的SHYSY5Y细胞和未处理的载体在48、72或96小时后进行测试。该结果示于图7A-7C中。同样，所测试的ASO在体外没有显示出毒性。
基于TUBB4A下调和最小体外毒性，ASO H10-2、H14和H15在人类iPSC来源的中型多棘神经元(HiPSC-MSN)上进行了测试。选择这些ASO是因为它们通过qRT-PCR和Nanostring检测显示出一致的TUBB4A下调。图4中的结果显示H10-2在SH-SY4Y细胞中对TUBB4A有51.2％的敲低，而图5显示H10-2在SH-SY4Y细胞中对TUBB4A有54.4％的敲低。图4中的结果表明H14在SH-SY4Y细胞中对TUBB4A有64.0％的敲低，而图5显示H14在SH-SY4Y细胞中对TUBB4A有60.5％的敲低。图4中的结果显示H15在SH-SY4Y细胞中对TUBB4A有53.2％的敲低，而图5显示H15在SH-SY4Y细胞中对TUBB4A有53.3％的敲低。
使用Gymnosis在HiPSC-MSN中测试TUBB4A基因表达。第37天时用ASO候选物处理HiPSC-MSN。四天后，用ASO重新处理细胞。在第7天，提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A表达。该结果示于图8中。
在HiPSC-MSN中确认ASO的TUBB4A下调后，测试了ASO在HiPSC-MSN中的毒性。第37天时用ASO候选物治疗HiPSC-MSN。四天后，用ASO重新处理细胞。在第7天，提取RNA，并使用qRT-PCR测定BAX和BCL-2表达。BCL-2癌蛋白通过为快速增殖的细胞提供生存优势来调节程序性细胞死亡，而BAX蛋白通过增强细胞对凋亡刺激的敏感性来促进细胞凋亡。由于这些功能，BAX和BCL-2蛋白通常用作细胞毒性的指示。BAX/BCL-2的比率>1表明细胞凋亡较多，而比率<1表明细胞凋亡较少。该实验的结果示于图9A-C中。
该实验的结果表明，所测试的ASO能够有效下调TUBB4A，并且对所处理的细胞无毒。
实施例III
用于反义寡核苷酸的剂量测定的对照iPS-MSN的剂量反应分析
在确定上述ASO对于下调TUBB4A是安全且有效的后，进行了另外的实验以确定ASO的适当剂量。ASO候选物的剂量反应是使用gymnosis在对照HiPS-MSN上进行的，其中寡核苷酸悬浮在生物相容性缓冲液中，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水和CSF模拟缓冲液。第37天时用10μm、20μm和30μm ASO H15处理HiPSC-MSN。四天后使用相同的剂量重新处理HiPSC-MSN。初始处理后7天，提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A表达。该实验的结果示于图10中。随着ASO剂量的增加，相对基因表达下降。
证明了TUBB4A的下调随着剂量的增加而增加后，在HiPSC-MSN中确定了ASO的毒性。第37天时用10μm、20μm和30μm ASO H15处理HiPSC-MSN。四天后使用相同的剂量重新处理HiPSC-MSN。初始处理后7天，提取RNA并使用qRT-PCR测定BAX和BCL-2表达。BAX/BCL-2的比率>1表明细胞凋亡较多，而比率<1表明细胞凋亡较少。该实验的结果示于图11A-11C中。
使用突变型HiPSC-MSN(TUBB4AD249N)进一步分析ASO H15对TUBB4A的下调。第37天时用30μm ASO H15处理突变型HiPSC-MSN。还通过在第37天用10μm、20μm和30μm ASO H15处理细胞来重新对野生型HiPSC-MSN细胞进行实验，以确认之前的下调结果。四天后使用相同的剂量对突变型和野生型HiPSC-MSN进行再处理。初始处理后7天，提取RNA并使用qRT-PCR测定TUBB4A表达。ASO H15在突变型和野生型细胞中均表现出相似的TUBB4A下调。该实验的结果示于图12中。
证明了TUBB4A的下调在突变型HiPS-MSN中增加后，在突变型细胞中证实了ASO的毒性。第37天时用30μm ASO H15处理突变型HiPSC-MSN。还通过在第37天用10μm、20μm和30μm ASO H15处理细胞来重新对野生型HiPSC-MSN细胞进行实验，以确认之前的下调结果。四天后使用相同的剂量对突变型和野生型HiPSC-MSN进行再处理。初始处理后7天，提取RNA并使用qRT-PCR测定BAX和BCL-2表达。该实验的结果示于图13A-13C中。
实施例IV
小鼠细胞中反义寡核苷酸介导的Tubb4a的治疗性抑制和毒性分析
通过在小鼠细胞系中体外筛选TUBB4A ASO并使用实施例I中描述的ASO序列，开发了靶向并减少小鼠TUBB4A的另外的反义寡核苷酸(ASO)。参见表6。
*硫代磷酸酯键
+号-2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸(2'-MOE)
@-锁核酸(LNA)
m-5’甲基
小鼠ASO缺乏与人类TUBB4A的同源性。这就是为什么我们重新设计了单独筛选的伴随人类ASO序列。我们将利用小鼠ASO进行概念验证，并将人类ASO转化为临床试验。
使用gymnosis在小鼠皮质原代神经元细胞中筛选ASO文库。将细胞以200000或150000个细胞/孔铺板，并用1μm和5μm的ASO处理一周。然后提取RNA并进行qPCR以评估TUBB4A表达。这些测定的结果示于图14A-14B和图15中。
在确认表4和表6的ASO的TUBB4A下调后，使用ApoTox-Glo Triplex试剂盒测试这些ASO的体外毒性。该试剂盒组合了三种检测化学物质，可在单个检测孔内评估细胞活力和细胞凋亡。该测定的第一部分涉及同时测量蛋白酶活性作为细胞活力的标记。然后将细胞暴露于第二种荧光细胞不渗透性肽底物，以测量死细胞蛋白酶活性，以确定丢失的膜完整性，从而测量ASO的细胞凋亡水平。
筛选了多种ASO以检测ASO施用96小时后的体外毒性。将小鼠皮质神经元细胞以20000个细胞/孔铺板，并用5μm的ASO处理96小时。作为阳性对照，用10μm洋地黄皂苷或星形孢菌素处理两个孔。然后测试每孔的细胞活力和细胞凋亡。该结果示于图16A-16B中。所测试的ASO在体外没有显示出毒性。
实施例V
用反义寡核苷酸治疗野生型小鼠的分析
在对实施例I和IV中进行的筛选测定进行分析之后，选择ASO 7-2、7-3、8-2、8-3、18-1和18-3来分析野生型小鼠中的ASO效率和毒性。制备含有500纳摩尔ASO的150μg/μL溶液。
30只P60龄的成年小鼠接受脑室内(ICV)注射15μg/g或30μg/g ASO。表7描述了每只WT小鼠的观察结果。
通过多种方式评估ASO引起的神经功能缺损。首先，自注射后每周称重(图20C)并进行观察(在上表7中列出)以监测小鼠的体重减轻和其他不良症状。此外，还会进行一般的健康和身体状况、自发活动以及额外的反射和张力测试。
为了评估ASO注射后的运动功能障碍，进行了旋转棒测试。在该测试中，将小鼠放置在悬挂在笼子地板上方的水平取向的、旋转的圆柱体上。小鼠试图停留在旋转的圆柱体上。然后记录小鼠在圆柱体上停留的时长。该测试分三个阶段进行。在第1天，即适应阶段，以5RPM的稳定速率让小鼠接受一次100秒的试验。在第2天，即练习阶段，小鼠接受了3次试验，每次300秒，以5-30RPM逐渐增加。在第3天，即测试阶段，小鼠接受了3次试验，每次300秒，以5-30RPM逐渐增加。注射后30天，每只小鼠的测试阶段结果如图17A所示。
为了进一步评估注射ASO后的握力，进行了握力测试。前肢和后肢的握力均以kG/F为单位测量。使用握力计(080312-3Columbus Instruments,Columbus,OH,美国)测试ASO治疗的小鼠的前肢和后肢握力。对于前肢测试，在尾巴的近端部分抓住小鼠，并让其用两只爪子抓住水平金属杆。然后将小鼠平稳地拉开，一旦小鼠松开金属棒，就记录拉力。对于后肢握力测量，让小鼠用后肢爪子抓住水平杆，同时背对仪表，将尾巴稳定地直接拉向仪表，直到它们的抓握松开。每2分钟进行3次试验。图17B和17C显示了三次试验后握力的平均结果。
通过收集每只小鼠的组织和血液来分析ASO的体内毒理学。从受试者体内取出的组织包括：血液、皮质、小脑、脑干、中脑、肝脏和大脑的其余部分。取出后，将组织保存在-80℃下，直到可以提取RNA和蛋白质。表8提供了毒理学和功能观察组(Functionalobservation battery)的总结。
使用RNA提取、cDNA创建和RT-qPCR进一步评估TUBB4A的下调。如上所述，小鼠在P60龄时(成年)接受ICV注射ASO 7-2。注射后23-30天收集受试者的组织。提取RNA并通过qRT-PCR测定TUBB4A下调。结果示于图18A中。ASO 7-2在两种剂量下均显示出毒性。对于30μg/g剂量，WT小鼠在较早的时间点被人道安乐死，因此，对于15和30μg/g，纹状体下调值缺失。
如上所述，小鼠在P60龄时(成年)接受ICV注射ASO 7-3。注射后23-30天收集受试者的组织。提取RNA并通过qRT-PCR测定TUBB4A下调。结果示于图18B中。ASO 7-3在两种剂量下均显示出毒性。如上所述，对于30μg/g剂量，WT小鼠在较早的时间点被人道安乐死，因此，对于15和30μg/g，纹状体下调值缺失。
小鼠在P60龄时(成年)接受ICV注射ASO 8-2。注射后23-30天收集受试者的组织。提取RNA并通过qRT-PCR测定TUBB4A下调。结果示于图19A中。ASO 8-2在30μg/g剂量下显示出致死。因此，在该剂量没有收集组织。
如上所述，小鼠在P60龄时(成年)接受ICV注射ASO 8-3。注射后23-30天收集受试者的组织。提取RNA并通过qRT-PCR测定TUBB4A下调。结果示于图19B中。ASO 8-3在任一剂量下均未表现出毒性。所有组织在注射后30天收集。
如上所述，小鼠在P60龄时(成年)接受ICV注射ASO 18-1。注射后23-30天收集受试者的组织。提取RNA并通过qRT-PCR测定TUBB4A下调。结果示于图20A中。ASO 18-1在任一剂量下均未表现出毒性。所有组织在注射后30天收集。
如上所述，小鼠在P60龄时(成年)接受ICV注射ASO 18-3。注射后23-30天收集受试者的组织。提取RNA并通过qRT-PCR测定TUBB4A下调。结果示于图20B中。ASO 18-3在任一剂量下均未表现出毒性。所有组织在注射后30天收集。特别地，ASO 18-3表现出良好的TUBB4A下调和最小的体内毒性。
因此，与ASO 18-3类似，合成了ASO 6-5、7-5、7-6、8-5和18-5，以产生良好的TUBB4A下调和最小的体内毒性。Tubb4a下调的结果如图15所示。表9提供了体内毒性结果。ASO的毒性大大降低。
实施例VI
下调TUBB4A活性用于治疗H-ABC脑白质营养不良的方法
H-ABC和相关的与TUBB4A有关的脑白质营养不良目前无法治疗。根据以上实施例中提供的数据，很明显，下调TUBB4A表达可减少H-ABC的疾病表现。此外，很明显，给患者施用ASO是无毒的。值得注意的是，反义分子的施用已成功用于治疗其他神经退行性疾病，包括脊髓性肌萎缩症(参见clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02122952)。遵循此范例，可以使用本文或上文Evers等人公开的下调TUBB4A表达的方法通过注射有效量的抗TUBB4A反义分子来治疗具有H-ABC或相关的与TUBB4A有关的脑白质营养不良症状的患者，从而减轻脑白质营养不良的症状。
参考文献
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虽然本文已经描述了本发明的某些特征，但是本领域的普通技术人类员现在将想到许多修改、替换、变化和等同物。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真正精神内的所有此类修改和变化。
序列表
<110> 费城儿童医院(The Children's Hospital of Philadelphia)
<120> 用于治疗H-ABC脑白质营养不良的组合物和方法
<130> CHOP-132US00
<150> US 63/175,998
<151> 2021-04-16
<160> 114
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H1
<220>
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<221> 修饰的碱基
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<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<400> 9
ggutaaaggt gaggc 15
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<221> 修饰的碱基
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ggacttgcag gtguag 16
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gaactgcagc tcgga 15
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aagctaaggt cggcagg 17
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<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<400> 13
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<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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<400> 14
guaggtctca tccguau 17
<210> 15
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<220>
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<222> (1)..(15)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 15
ggucagaagc ctcga 15
<210> 16
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<212> DNA
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<220>
<223> ASO H16
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<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<400> 16
gcgagctcca aagguauu 18
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<220>
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<222> (1)..(18)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(18)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 17
agcgagctcc aaagguau 18
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H18
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 18
agcgagctcc aaaggua 17
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> ASO H19
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(18)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 19
aaagcgagct ccaaaggu 18
<210> 20
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 20
aaagcgagct ccaaagg 17
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H21
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 21
ggacttgcag gtguaga 17
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H2A
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
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<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
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<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 22
ugcacgctca gcaucu 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H2B
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 23
ugcacgctca gcaucu 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(16)
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<400> 24
ggacttgcag gtguag 16
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 25
ggacttgcag gtguag 16
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(12)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
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gaactgcagc tcgga 15
<210> 27
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(12)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(12)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(11)
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
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<220>
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<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(12)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
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<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> 修饰的碱基
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ugucgatgca gtagguc 17
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 32
ugucgatgca gtaggu 16
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<400> 33
ccucgttgtc gatgcag 17
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 36
gcucgtctac ctccuu 16
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
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<400> 37
ugctcgtcta cctccu 16
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 38
ucucgtccat gccuucg 17
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 39
ccauctcgtc catgccu 17
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 40
ucuucgaact cgcccuc 17
<210> 41
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 41
ccucctcttc gaacuc 16
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 13
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 42
ggucagaggt aaggc 15
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 14
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 43
ugcacgattt cccgcau 17
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 15
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 44
guugtcgatg caguagg 17
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 16
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(5)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
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<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 45
ccucgttgtc gatgcagua 19
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 17
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 46
cucgttgtcg atgcagu 17
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 18
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 47
ugctcgtcta ccucc 15
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 19
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(18)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(18)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 48
gugctgttgc cgatgaag 18
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 20
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 49
gugctgttgc cgauga 16
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 21
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(5)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(19)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 50
aucucgtcca tgcctucgc 19
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 22
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(18)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 51
ccauctcgtc catgccuu 18
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 23
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 52
uccatctcgt ccaugcc 17
<210> 53
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<212> DNA
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<220>
<223> ASO 24
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
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<400> 53
uucgaactcg cccucu 16
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 54
cucutcgaac tcgcccu 17
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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<400> 55
ccucgttgtc gatgcag 17
<210> 56
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
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ccucgttgtc gatgcag 17
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
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gcucgtctac ctccuuc 17
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 58
gcucgtctac ctccuuc 17
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 59
gcucgtctac ctccuu 16
<210> 60
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(11)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(16)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 60
gcucgtctac ctccuu 16
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTC Control
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<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
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<223> 5'甲基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(16)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
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uacgcgacuu augcgg 16
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<211> 16
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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<221> misc_feature
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<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
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<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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ugcacgctca gcaucu 16
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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ugcacgctca gcaucu 16
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
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<222> (1)..(1)
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<221> misc_feature
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<223> 5'甲基
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<222> (15)..(18)
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<221> misc_feature
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cugcacgctc agcaucug 18
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ggacttgcag gtguag 16
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<220>
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<222> (1)..(1)
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<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
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<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 锁核酸
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<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 67
ggacttgcag gtguag 16
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
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<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
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<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
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<221> misc_feature
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<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
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<221> misc_feature
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aggacttgca ggtguaga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ASO H10-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 锁核酸
<400> 69
ggacttgcag gtguag 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H11-1
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<400> 70
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 锁核酸
<400> 71
gaactgcagc tcgga 15
<210> 72
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO H11-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 锁核酸
<220>
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<223> 5'甲基
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<220>
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<223> 5'甲基
<220>
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ugctcgtcta cctccu 16
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<212> DNA
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<222> (1)..(3)
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<222> (3)..(3)
<223> 5'甲基
<220>
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<222> (5)..(5)
<223> 5'甲基
<220>
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<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 5'甲基
<400> 111
ugctcgtcta ccucc 15
<210> 112
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<212> DNA
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<220>
<223> ASO 18-2
<220>
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<222> (1)..(15)
<223> 硫代磷酸酯键
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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<220>
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<222> (3)..(3)
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<220>
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<222> (5)..(5)
<223> 5'甲基
<220>
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<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 5'甲基
<400> 112
ugctcgtcta ccucc 15
<210> 113
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 18-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
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<222> (1)..(4)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
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<222> (4)..(4)
<223> 5'甲基
<220>
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<222> (6)..(6)
<223> 5'甲基
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<222> (9)..(9)
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<220>
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<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(17)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 5'甲基
<400> 113
cugctcgtct accuccu 17
<210> 114
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO 18-5
<220>
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<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'甲基
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<222> (4)..(13)
<223> 硫代磷酸酯键
<220>
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<222> (5)..(5)
<223> 5'甲基
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<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 5'甲基
<220>
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<222> (11)..(12)
<223> 5'甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 5'甲基
<400> 114
ugctcgtcta ccucc 15
Claims (19)
1.一种降低靶细胞中的TUBB4A水平，从而改善有需要的患者的H-ABC脑白质营养不良的症状的方法，所述方法包括在所述患者中施用治疗有效量的包含靶向TUBB4A的合成的抑制性核酸分子的组合物，其中在所述细胞中降低TUBB4A水平并降低以下的一种或多种：
i)运动发育迟缓；
ii)认知功能障碍；
iii)步态功能障碍；
iv)共济失调；
v)意向性震颤；
vi)构音障碍；
vii)发音障碍；和
viii)异常髓鞘形成不足；
其中所述合成的核酸分子选自反义寡核苷酸、shRNA、siRNA和适用于CRISPR编辑TUBB4A靶向核酸的引导链。
2.一种在有需要的患者中治疗、延迟发作、缓解和/或减少与H-ABC脑白质营养不良相关的疾病、病症和/或病况或其症状的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的靶向TUBB4A的合成的核酸，其中所述患者中与H-ABC脑白质营养不良相关的疾病、病症和/或病况或其症状得到治疗、抑制，延迟发作、缓解和/或减少，其中所述合成的核酸分子选自反义寡核苷酸、shRNA、siRNA和适用于CRISPR编辑的引导链。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中靶向TUBB4A的所述合成的核酸被修饰以增加体内稳定性和/或摄取。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中靶向TUBB4A的所述合成的核酸是修饰的反义寡核苷酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将编码所述反义寡核苷酸的所述合成的核酸克隆到载体中。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述载体选自质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、AAV载体和腺病毒相关载体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症和/或病况与髓鞘形成不足相关。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述合成的核酸是表3或表5中提供的反义寡核苷酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸被修饰并且具有与人类TUBB4A核酸的一部分至少90％、至少95％、至少99％或100％互补的核碱基序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接，所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖，或者所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包含可用于治疗脑白质营养不良的另外的活性药剂。
12.一种用于降低TUBB4A表达的组合物，其包含靶向TUBB4A编码核酸并与其特异性杂交的合成的核酸分子，其选自反义寡核苷酸、shRNA、siRNA和适用于生物学可接受载体中的CRISPR编辑的引导链。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述合成的核酸被修饰以增加在体液中的稳定性和/或在目的细胞中的摄取。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述合成的核酸列于表3或表5中。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的组合物，其中所述合成的核酸分子存在于载体中。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的组合物，其被配制用于离体细胞施用、颅内施用、肠胃外施用和静脉内施用。
17.根据权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于单次脑室内(ICV)推注注射。
18.一种试剂盒，其包含用于实施权利要求1-11中任一项所述的方法。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述合成的核酸是ASO H14或ASOH15。
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