JP2024513990A - ガンマ・デルタｔ細胞に富む新規組成物、その調製方法、およびその使用 - Google Patents

ガンマ・デルタｔ細胞に富む新規組成物、その調製方法、およびその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、治療効果の高いgdT細胞を豊富に含む新規組成物である。このような組成物の製造方法および養子免疫療法におけるその使用方法も提供される。

Description

本出願は、2021年4月16日に出願された米国仮出願第63/175,689号および2021年10月7日に出願された米国仮出願第63/253,323号の優先権を主張するものであり、これらの出願は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
1. 技術分野
本発明は、分子生物学、細胞生物学、および免疫学に関する。本明細書に提供されるのは、NK様特性を有するガンマデルタT（gdT）細胞に富む新規組成物、その調製方法、およびその使用方法である。
2. 背景技術
gdT 細胞は先天性と適応性の両方の特性を備え、幅広い抗原特異性と NK 様の細胞傷害性を持ち。又、gdT細胞は様々な腫瘍に浸潤し、広範囲の腫瘍細胞を死滅させることができる。この様に、gdT細胞をがん免疫療法などの免疫療法に利用する多くのアプローチが試みられてきたが、成功例は限られていた。主な理由は、治療効果のあるgdT細胞を選択的かつ効率的に増殖させる方法がまだ確立されていないためである。従って、治療の可能性を秘めた gdT 細胞が豊富な細胞集団を取得する方法に対するニーズは満たされてない。本開示はこの必要性に対処し、関連する利点を提供する。
3. 発明の概要
本明細書に提供されるのはgdT細胞が豊富な細胞集団を製造する方法であって、（i）リン酸化抗原、（ii）サイトカイン、および（iii）ヒト血小板溶解物（HPL）を添加した培地中でgdT細胞が含有される供給源細胞集団の培養することを含有する方法である。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、 細胞集団は培養中にフィーダー細胞や腫瘍細胞と接触されない。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法はgdT細胞のポジティブ選択を含まない。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、細胞集団は3～40日間、4～40日間、5～40日間、6～40日間、7～40日間、10～40日間、10～30日間、6～20日間、12～20日間、または14～18日間培養される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、αβT（abT）細胞を枯渇させることをさらに含有する。いくつかの実施形態において、abT細胞は培養の半減期前後に枯渇する。いくつかの実施形態において、細胞を14～18日間培養し、4日目から10日目の間にabT細胞を枯渇させる。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態では、サイトカインは培養中に補充される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、週1回、週2回、週3回、隔日、または毎日補充される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、サイトカインは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）．インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-12（IL-12）、インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-18（IL-18）、インターロイキン-21（IL-21）、インターロイキン-33（IL-33）、またはこれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、サイトカインはIL-2である。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、サイトカインは200 - 3000IU／mLの濃度で補充される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原は培養中に補充されない。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原は、クロドロネート、エチドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート（ゾレドロン酸）、ネリドロネート、イバンドロネート、およびパミドロネートからなる群より選択されるビスホスホネートである。いくつかの実施形態において、リン酸化抗原はゾレドロネートである。本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原は、ブロモヒドリンピロホスフェート（BrHPP）、4-ヒドロキシ-ブト-2-エニルピロホスフェート（HMBPP）、イソペンテニルピロホスフェート（IPP）、およびジメチルアリルピロホスフェート（DMAPP）からなる群より選択される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原は0.1 - 20μMの濃度で補充される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、HPLは1 - 20vol％の濃度で補充される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、培地は600 - 5000mg/L 濃度のグルコースを含有する。 いくつかの実施形態において、培地は無血清培地である。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、細胞集団は空気透過性表面を含む装置内で培養される。いくつかの実施形態において、装置はG-Rex装置である。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、供給源細胞集団は、末梢血単核球(PBMC)、骨髄、臍帯血、またはそれらの組み合わせを含有する。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団はＰＢＭＣを含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、末梢血からPBMCの取得することをさらに含有する。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態にあいて、供給源細胞集団中のgdT細胞は培養中に少なくとも1,000倍増殖される。いくつかの実施形態において、得られる細胞集団の少なくとも75%がgdT細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、得られる細胞集団中の細胞の表面に標的化部分を付加することをさらに含有する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的化部分に結合した第1のリンカーと細胞表面に結合した第2のリンカーとの間の相互作用を介して細胞表面に複合体形成される。いくつかの実施形態にあいて、標的化部分は、得られる細胞集団によって外因的に発現される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、培養後に細胞集団を凍結保存することをさらに含有する。
本明細書に記載の方法によって得られる細胞の集団も本明細書に提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、少なくとも70％のgdT細胞を含有する細胞の集団であって、（1）gdT細胞が細胞当たり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現する；（2）gdT細胞の少なくとも30％がCD69＋である；または（1）および（2）の両方である。 いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも500個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、または少なくとも3000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、または80％がCD69＋である。
明細書に提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％が終末分化エフェクター（TDEM）細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される細胞集団は、少なくとも1 × 106、少なくとも5 × 106、少なくとも1 × 107、少なくとも5 × 107、少なくとも1 × 108、少なくとも5 × 108、少なくとも1 × 109、少なくとも5 × 109、少なくとも1 × 1010、少なくとも5 × 1010、または少なくとも1 × 1011のgdT細胞を含有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される細胞集団は、 gdT 細胞に対してポジティブ選択されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される細胞集団は、供給源細胞集団が単一のドナーから得られた、又は由来した細胞集団である為、20日以下培養されたものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される細胞集団中のgdT細胞は、（1）細胞当たり平均で少なくとも400のCD56分子；（2）細胞当たり平均で少なくとも400のCD16分子；（3）細胞当たり平均で少なくとも400のNKG2D分子；（4）細胞当たり平均で少なくとも400のCD107a分子を発現する；(5)細胞当たり平均で最大2800のPD-1分子；(6)細胞当たり平均で少なくとも5000のDNAM-1分子；(7)細胞当たり平均で少なくとも400のCD69分子；または(8)細胞当たり平均で少なくとも100のグランザイムB (Granzyme B) 分子；またはそれらの組み合わせ。
本明細書に提供される細胞集団のいくつかの実施形態では、gdT細胞の少なくとも30％がVδ2 T細胞である。
本明細書に提供される細胞集団のいくつかの実施形態では、gdT細胞の少なくとも10％が細胞表面に複合体化された標的化部分を含有する。
いくつかの実施形態において、標的化部分は核酸ではない。いくつかの実施形態において、標的部分は、標的細胞上の生物学的マーカーに特異的に結合する抗体または抗原結合単位である。いくつかの実施形態において、生物学的マーカーは腫瘍抗原である。
いくつかの実施形態において、ｇｄＴ細胞は、抗体または抗原結合断片を含有するキメラ抗原受容体 (CAR) またはＴ細胞受容体 (TCR) を発現する。
いくつかの実施形態において、標的化部分はgdT細胞によって産生されない。いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的化部分に結合した第1のリンカーと細胞表面に結合した第2のリンカーとの間の相互作用を介して細胞表面に複合体形成される。いくつかの実施形態において、第1のリンカーは第1のポリヌクレオチドであり、第2のリンカーは第2のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、(1) 第1のポリヌクレオチドは4 ~ 500のヌクレオチドを有し、(2)第2のポリヌクレオチドは4 ~ 500のヌクレオチドを有し、または (1) および (2) の両方を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される細胞集団は凍結保存される。
いくつかの実施形態において、本明細書には、本明細書に提供される細胞集団および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される細胞集団または医薬組成物は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも3ヶ月、または少なくとも6ヶ月間、0℃以下で保存された後でも、その治療効力を維持することができる。
本明細書には、養子免疫療法における本明細書に提供される細胞集団または医薬組成物の使用も提供する。
本明細書には、疾患または病気の治療における本明細書に提供される細胞集団または医薬組成物の使用も提供する。
本明細書には、本明細書に提供される細胞集団または医薬組成物を被験者に投与することを含有し、それを必要とする被験者の疾患または病気を治療する方法も提供される。
いくつかの実施形態において、疾患または病気は腫瘍または癌である。いくつかの実施形態において、疾患または病気は、自己免疫疾患、神経細胞疾患、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム、病原性疾患、HIV、他のウイルス感染、真菌感染、原虫感染、または細菌感染である。いくつかの実施形態において、被験者はヒトである。
4. 図面の簡単な説明
図1Aおよび図1Bはそれぞれ、gdT細胞を濃縮した細胞集団を調製する方法を例示するフローチャートである。 図1Aおよび図1Bはそれぞれ、gdT細胞を濃縮した細胞集団を調製する方法を例示するフローチャートである。 図2は、培養の異なる日における細胞集団の細胞数とグルコース取り込みを示す折れ線グラフである。 図3A-3Cは、本明細書に記載の方法に従って調製した細胞集団を分析したフローサイトメトリーの結果である（16日目）。示されるように、染色された分子には、TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、およびCD25(図3A)、CD38、CD56、CD69、CD107a、およびNKG2D(図3B)、とPD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色(図3C)が含まれる。 図3A-3Cは、本明細書に記載の方法に従って調製した細胞集団を分析したフローサイトメトリーの結果である（16日目）。示されるように、染色された分子には、TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、およびCD25(図3A)、CD38、CD56、CD69、CD107a、およびNKG2D(図3B)、とPD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色(図3C)が含まれる。 図3A-3Cは、本明細書に記載の方法に従って調製した細胞集団を分析したフローサイトメトリーの結果である（16日目）。示されるように、染色された分子には、TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、およびCD25(図3A)、CD38、CD56、CD69、CD107a、およびNKG2D(図3B)、とPD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色(図3C)が含まれる。 図4A-4Cは、16日目に得られた細胞集団（16日間のVδ2 Ｔ細胞）のPI-TCR Vδ2＋ゲートされた集団を分析するフローサイトメトリーの結果を示す。示されるように、染色された分子には、TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1(図4A)、CD36、CD69、PD-1、CD103、およびCCR7 (図4B)、とTNFα、INFγ、グランザイムB (Granzyme B)、およびCD107a (図4C) が含まれた。 図4A-4Cは、16日目に得られた細胞集団（16日間のVδ2 Ｔ細胞）のPI-TCR Vδ2＋ゲートされた集団を分析するフローサイトメトリーの結果を示す。示されるように、染色された分子には、TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1(図4A)、CD36、CD69、PD-1、CD103、およびCCR7 (図4B)、とTNFα、INFγ、グランザイムB (Granzyme B)、およびCD107a (図4C) が含まれた。 図4A-4Cは、16日目に得られた細胞集団（16日間のVδ2 Ｔ細胞）のPI-TCR Vδ2＋ゲートされた集団を分析するフローサイトメトリーの結果を示す。示されるように、染色された分子には、TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1(図4A)、CD36、CD69、PD-1、CD103、およびCCR7 (図4B)、とTNFα、INFγ、グランザイムB (Granzyme B)、およびCD107a (図4C) が含まれた。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図5A-5Qは、蛍光色素標識されたマウス抗体（QuantumTM Simply Cellular(R) キット）の標準曲線を示す。図5A：抗ヒトCD56、図5B：抗ヒトCD16、 図5C：抗ヒトNKG2D、図5D：抗ヒトNKp44、図5E：抗ヒトNKp46、図5F：抗ヒトIFNγ、図5G：抗ヒトDNAM-1、図5H：抗ヒトグランザイムB、図5I：抗ヒトTIGIT、図5J：抗ヒトTNFα、図5K：抗ヒトCD18、図5L：抗ヒトTCR Vδ2、図5M：抗ヒトNKp30、図5N：抗ヒトPD1、図5O：抗ヒトCD69、図5P：抗ヒトCD107a、図5Q：抗ヒトCCR7。 図6は、16日目に得られた細胞集団から単離されたVδ2 T細胞 (16日Vδ2 T細胞) の記憶タイプを表す2次元ドットプロットである。 図7A-7Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞を分析したフローサイトメトリーの結果である。示されるように、染色された分子に、 TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、CD25（図3A）、CD38、CD56、CD69、CD107a、およびNKG2D（図7B）、とPD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色（図7C）が含まれた。 図7A-7Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞を分析したフローサイトメトリーの結果である。示されるように、染色された分子に、 TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、CD25（図3A）、CD38、CD56、CD69、CD107a、およびNKG2D（図7B）、とPD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色（図7C）が含まれた。 図7A-7Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞を分析したフローサイトメトリーの結果である。示されるように、染色された分子に、 TCRab、TCRvd2、CD16、CD3、CD25（図3A）、CD38、CD56、CD69、CD107a、およびNKG2D（図7B）、とPD-1、NKp30、NKp44、NKp46、PI染色（図7C）が含まれた。 図8A-8Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞のPI-TCRVδ2+ゲートされた集団を分析したフローサイトメトリーの結果である。示されるように、染色された分子に TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1（図8A）、CD36、CD69、PD-1、CD103、およびCCR7（図8B）、とTNFα、INFγ、グランザイムB (Granzyme B)、およびCD107a（図8C）が含まれる。 図8A-8Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞のPI-TCRVδ2+ゲートされた集団を分析したフローサイトメトリーの結果である。示されるように、染色された分子に TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1（図8A）、CD36、CD69、PD-1、CD103、およびCCR7（図8B）、とTNFα、INFγ、グランザイムB (Granzyme B)、およびCD107a（図8C）が含まれる。 図8A-8Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞のPI-TCRVδ2+ゲートされた集団を分析したフローサイトメトリーの結果である。示されるように、染色された分子に TCRVδ2、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1（図8A）、CD36、CD69、PD-1、CD103、およびCCR7（図8B）、とTNFα、INFγ、グランザイムB (Granzyme B)、およびCD107a（図8C）が含まれる。 図9は、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞のPI-TCRVδ2+ゲートされた集団の記憶タイプを示す2次元ドットプロットである。 図10A-10Bは、ヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3に対する細胞傷害性アッセイの結果である。図10Aは、トラスツズマブ存在下でのControl-gdT細胞の細胞傷害性とトラスツズマブ単独の細胞傷害性を比較した結果である。図10Bは、ACE-gdT細胞-HER2（トラスツズマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。 図11A - 11Cは、3つの癌細胞株に対する細胞傷害性アッセイの結果を示す： CD20陽性ヒトリンパ腫細胞株Raji細胞（図11A）、CD20陽性ヒトリンパ腫細胞株Daudi（図11B）、およびヒトリンパ腫細胞株K562（図11C）。各パネルは、ACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。 図11A - 11Cは、3つの癌細胞株に対する細胞傷害性アッセイの結果を示す： CD20陽性ヒトリンパ腫細胞株Raji細胞（図11A）、CD20陽性ヒトリンパ腫細胞株Daudi（図11B）、およびヒトリンパ腫細胞株K562（図11C）。各パネルは、ACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。 図12A-12Cは、Raji細胞に対する細胞傷害性アッセイの結果である。各パネルは、ACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。3つの異なるドナーの新鮮なPBMCに由来する細胞集団を試験した： 図12A：ドナー1、図12B：ドナー2、および図12C： ドナー3。 図13A-13Cは、Daudi細胞に対する細胞傷害性アッセイの結果である。各パネルは、ACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。3つの異なるドナーの新鮮なPBMCに由来する細胞集団を試験した： 図13A：ドナー1、図13B：ドナー2、および図13C：ドナー3。 図14A-14Cは、Raji細胞に対する細胞傷害性アッセイの結果である。各パネルは、ACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。3つの異なるドナーの凍結保存PBMCに由来する細胞集団を試験した： 図14A：ドナー1、図14B：ドナー2、図14C：ドナー3。 図15A-15Cは、Daudi細胞に対する細胞傷害性アッセイの結果である。各パネルは、ACE-gdT細胞-CD20（リツキシマブ）細胞とControl-gdT細胞の細胞傷害性を比較した結果である。3つの異なるドナーの凍結保存PBMCに由来する細胞集団を試験した： 図15A：ドナー1、図15B：ドナー2、図15C：ドナー3。 図16A-16Bは、培養の異なる日における細胞集団の総細胞数を示す。図16A：バッチ1；図16B：バッチ2。 図17A-17Bは、Raji細胞に対する細胞傷害性アッセイの結果である。各パネルは、5vol% HPLまたは20vol% HPLで培養した細胞集団の細胞傷害性を比較した結果である。FIG.17A: Control-gdT 細胞; FIG.17B: ACE-gdT 細胞-CD20 (リツキシマブ). 図18A-18Bは、G-Rex（空気透過性）またはT-フラスコ（空気不透過性）で培養した細胞集団の総細胞数（図18A）および細胞生存率（図18B）を示す折れ線グラフである。 図19A-19Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20の両方の抗腫瘍活性を示すマウスモデル研究の結果である。図19Aは、マウスにおける腫瘍細胞の蛍光画像である。図19Bは、統計的分析を示す。図19Cに生存曲線を示す。
注：ET、ET比、E:T、E:T比は、エフェクター細胞（E）と標的細胞（T）の比を意味する。
図19A-19Cは、Control-gdT細胞とACE-gdT細胞-CD20の両方の抗腫瘍活性を示すマウスモデル研究の結果である。図19Aは、マウスにおける腫瘍細胞の蛍光画像である。図19Bは、統計的分析を示す。図19Cに生存曲線を示す。
注：ET、ET比、E:T、E:T比は、エフェクター細胞（E）と標的細胞（T）の比を意味する。
5. 発明を実施するための形態
当技術分野で理解されているように、Tリンパ球、又はT細胞は細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす免疫細胞である。T細胞は細胞表面にCD3とT細胞受容体（TCR）を発現しており、TCRの明確な表面発現によって異なるサブタイプに分けられる。アルファベータT細胞、abT細胞、αβT細胞 は、TCR-α鎖とTCR-β鎖の両方を発現するT細胞サブセットを指す同等の用語である。ガンマデルタT細胞、gdT細胞、または「γδT細胞」は、TCR-γ鎖（例えば、Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、またはVγ11）とTCR-δ鎖（例えば、Vδ1、Vδ2、Vδ3、またはVδ5）の両方を細胞表面に発現するT細胞サブセットを指す同等の用語である。(Pistoia et al., 2018, Front Immunol. 9: 984.; WO2020117862A1を参照) 。abT細胞の活性化はMHC/HLAに依存するが、gdT細胞は自然免疫細胞に類似し、抗原プロセッシングを必要とせず、MHCに依存しない方法で活性化することができる。
各TCR鎖には可変（V）領域、定常（C）領域、膜貫通領域、細胞質尾部がある。V領域には抗原結合部位がある。ヒトgdT細胞には大きく分けて2つのサブタイプがある：末梢血で優勢なものは主にデルタ可変2鎖（Vδ2）を発現し、非造血組織で優勢なものは主にデルタ可変1鎖（Vδ1）を発現する。Vδ2 gdT細胞は一般にVγ9を共発現し、末梢gdT細胞の50-95％を占める。
GdT細胞は腫瘍内に浸潤し、固形腫瘍と造血器腫瘍の両方を含む広範囲の腫瘍細胞を死滅させることができる。gdT細胞の抗腫瘍機能は、皮膚がん、B細胞リンパ腫、前立腺がん、メラノーマ、間葉系膠芽腫などのさまざまな腫瘍で観察された。gdT細胞の抗腫瘍活性については様々な側面が観察された。ある側面では、gdT細胞は、悪性細胞によって発現されるストレス分子や非ペプチド性代謝産物など、従来とは異なる抗原を認識するストレスセンサーとして知られている。例えば、gdT細胞はナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）を発現することができ、形質転換はNKG2Dのリガンドの発現を誘導する1つの細胞ストレスであるため、gdT細胞上のNKG2DとNKG2Dリガンド、例えばMHCクラスIポリペプチド関連配列A（MICA）との結合は、形質転換細胞の標的特異的死滅を引き起こす。NKG2Dに加え、CD226（DNAM-1）、自然細胞傷害性活性化レセプター3（NCR3；NKp30）、NCR2（NKp44）など、他のNKレセプターの発現も腫瘍認識に関与し、gdT細胞の抗がん機能を活性化することが示されている。
更に、ヒトgdT細胞はCD16を発現し、抗体依存性細胞傷害（ADCC）の誘導に関与する。gdT細胞上でのTNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）やFasリガンド（FASL）などのTNF受容体の発現も腫瘍細胞を死滅させることができる。gdT細胞の抗腫瘍活性はサイトカイン産生にも反映される。gdT 細胞によって産生される IFNγ や TNFα などの炎症促進性サイトカインは、腫瘍細胞表面のMHC分子を誘導し、他の免疫細胞に影響を与えることによって、抗腫瘍免疫をさらに活性化することができる。グランザイム（例えば、グランザイムB）やパーフォリンなどの細胞傷害性分子の発現増加は、腫瘍細胞を直接死滅させることができる。gdT細胞はB細胞に抗腫瘍効果あるIgEの産生を促すことができる。その為、gdT細胞、特にNK様の特性を持つgdT細胞は、がん免疫療法において大きな可能性を秘めている。
ヒトgdT細胞は通常に循環Tリンパ球の1-5％を占めるにすぎない。関心が高まっているにもかかわらず、gdT細胞を用いたがん免疫療法の臨床的成功は限られている (Yazdanifar et al., 2020, Cells. 9(5):1305; Kabelitz et al., 2020. Cell Mol Immunol. 17(9):925-939; Wu et al., Int J Biol Sci. 10(2):119-35)。制限要因の一つはgdT細胞を増殖させるために、現在利用可能な方法が時間がかかりすぎるか、十分な数、純度、および／または効力を持つgdT細胞を得る効果がないことである。従って、強力な抗腫瘍活性を持つ特定のサブセットgdT細胞を選択的に増殖させる方法が必要とされている。
本明細書に提供されるのは、NK様特性を有するgdT細胞が豊富な細胞集団または医薬組成物の効率的な生産を可能にする方法である。本明細書に提供される細胞集団のgdT細胞は、高い細胞傷害性を有し、癌、感染症、自己免疫疾患などの特定の疾患や病気の治療において大きな治療的可能性を有する。
本開示を更に説明する前に、本開示は本明細書に記載される特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的であり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書で特に定義しない限り、本開示で使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別途要求されない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。一般に本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質と核酸、化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにその技術は当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである。
5.1 製造方法
本明細書に提供されるのはgdT細胞が豊富な細胞集団を製造する方法であって、（i）リン酸化抗原、（ii）サイトカイン、および（iii）ヒト血小板溶解物（HPL）を添加した培地中で供給源細胞集団の培養することを含有する方法である。いくつかの実施形態において、gdT細胞を活性化し、増殖させるのに十分な条件下で培養は行われる。いくつかの実施形態において、生体外 (ex vivo) で培養は行われる。いくつかの実施形態において、試験管内(in vitro) で培養は行われる。
本明細書に使用される場合、「供給源細胞集団」という用語は、 適切な供給源から直接単離して得られた複数の細胞を指す。供給源は自然のものであり得る。例えば、供給源細胞集団はヒト末梢血や非造血組織であり得る。続いて、供給源細胞集団を体外 (ex vivo) で培養して、所望の細胞集団を調製することができる。例えば、供給源細胞集団は、様々な培養技術、および/または特定の細胞タイプに対するネガティブもしくはポジティブ選 択によって、均質性、実質的な均質性、または1つ以上の細胞 タイプ（例えばabT細胞）を枯渇させるように精製することができ る。供給源細胞集団を培養して、特定の亜集団を濃縮することもできる。本明細書に使用する場合、“gdT細胞が濃縮された”細胞集団は、その細胞集団が由来する供給源細胞集団よりもgdT細胞の割合が多い。いくつかの実施形態において、gdT細胞が豊富な細胞集団は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％のgdT細胞をあり得る。細胞集団が由来する供給源細胞集団と比較して gdT 細胞の割合が増加している場合、gdT細胞が豊富な細胞集団はgdT 細胞が 50% 未満であることもあり得る。
本明細書に提供される方法は、ＮＫ様特性を有するｇｄＴ細胞が豊富な細胞集団を産生するのに十分な時間の条件下で供給源細胞集団を培養することが含有される。本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも4日間、例えば、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも18日間、少なくとも21日間、少なくとも28日間、またはそれ以上、例えば、約30日間、約35日間、約40日間、約45日間、または約50日間培養される。いくつかの実施形態において、この方法は細胞集団を少なくとも7日間、例えば少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも14日間、または少なくとも16日間培養することを含有する。本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、細胞集団は4～40日間、7～35日間、7～28日間、または7～21日間、7～18日間、10～30日間、12～20日間、または14～18日間培養される。ある実施形態において、細胞集団は4～25日間培養される。いくつかの実施形態において、細胞集団は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40日間培養される。いくつかの実施形態において、細胞集団は4、7、10、12、14、17、22、または25日の間培養される。ある実施形態において、細胞集団は12日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は13日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は14日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は15日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は16日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は17日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は18日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は19日間培養することができる。ある実施形態において、細胞集団は20日間培養することができる。細胞集団は約25日間培養できる。細胞集団は約30日間培養できる。細胞集団は約35日間培養できる。細胞集団は約40日間培養できる。細胞集団は約45日間培養できる。細胞集団は約50日間培養できる。
TCRα/β T細胞、あるいはabT細胞は、養子細胞療法において移植片対宿主反応を誘導することが知られている。生着細胞集団からabT細胞を除外することで、養子細胞療法におけるGvHDの発症を減少させる、あるいは予防することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法はabT細胞を枯渇させることをさらに含有する。abT細胞は培養中の異なる時期に枯渇させることができる。いくつかの実施形態において、abT細胞は培養の初期に枯渇させる。いくつかの実施形態おいて、abT細胞は培養終了時に枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は培養の前半で枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は培養の後半で枯渇させる。供給源細胞集団にT細胞が比較的少ない状況なら、abT細胞を枯渇させる前に全ての細胞を数日間増やさせることは有益である。いくつかの実施形態において、abT細胞は2日目以降、3日目以降、4日目以降、5日目以降、または6日目以降に枯渇させる。更に、abT細胞の割合が特定な閾値に達する前にabT細胞を枯渇させることはgdT細胞の最も効率的な増殖を達成するのに役立つ。従って、いくつかの実施形態において、abT細胞は細胞集団の30％、25％、20％、15％、12％、10％、9％、または8％に達する前に枯渇させる。一般に、枯渇しなければ、培養の最初の 20 日間で abT 細胞の割合が増加することを観察される。従って、いくつかの実施形態において、abT細胞は培養14日目以前、12日目以前、10日目以前、9日目以前、8日目以前、または4日目以前に枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は培養の半減期前後に枯渇させる。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は30～40日間培養され、18日目から25日目の間にabT細胞を枯渇させる。いくつかの実施形態において、細胞は14～18日間培養され、4日目から10日目の間にabT細胞を枯渇させる。いくつかの実施形態において、細胞は約14～18日間培養され、6日目または7日目にabT細胞を枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、または18日目に枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は7日目、8日目、9日目、10日目、12日目、14日目または16日目に枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は4日目、5日目、6日目、7日目、または8日目に枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は6日目に枯渇させる。いくつかの実施形態において、abT細胞は7日目に枯渇させる。ある実施形態において、abT細胞は8日目に枯渇させる。いくつかの実施形態において、細胞集団はabT細胞の枯渇後3-25日間さらに培養される。いくつかの実施形態において、細胞集団はabT細胞の枯渇後3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23または25日間さらに培養される。
本明細書に記載の方法で使用される培地には、(i)リン酸化抗原を添加することができる。当技術分野で理解されるように、「リン酸化抗原」は、活性がリン酸部分の存在に依存するT細胞アゴニスト、より詳細にはgdT細胞アゴニストである。特定のリン酸化抗原がgdT細胞を特異的に活性化させることも当技術分野で知られる (Espinosa et al., Microbes and Infections 2001; Belmant et al., Drug discovery today 2005; US20100189681A1) 。いくつかの実施形態において、リン酸化抗原はビスホスホネートである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用されるビスホスホネートは、クロドロネート、エチドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート（ゾレドロン酸）、ネリドロネート、イバンドロネート、およびパミドロネートからなる群より選択される。いくつかの実施形態にあいて、本明細書に記載の方法で使用されるビスホスホネートはゾレドロネートである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用されるリン酸化抗原は、ブロモヒドリンピロリン酸（BrHPP）、４-ヒドロキシ-ブタ-２-エニルピロリン酸（HMBPP）、イソペンテニルピロリン酸（IPP）、およびジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）からなる群より選択される。
リン酸化抗原は培地中に0.1～20μMの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、リン酸化抗原は、約0.1、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、11.5、12、13、13.5、14、15、16、17、18、または19μMの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、リン酸化抗原は、約0.1μMで添加される。リン酸化抗原は約0.5μMで添加することができる。リン酸化抗原は約1μMで添加することができる。リン酸化抗原は約1.5μMで添加することができる。リン酸化抗原は約2μMで添加することができる。リン酸化抗原は約3μMで添加することができる。リン酸化抗原は約4μMで添加することができる。リン酸化抗原は約5μMで添加することができる。リン酸化抗原は約6μMで添加することができる。リン酸化抗原は約7μMで添加することができる。リン酸化抗原は約8μMで添加することができる。リン酸化抗原は約9μMで添加することができる。リン酸化抗原は約10μMで添加することができる。リン酸化抗原は約12μMで添加することができる。リン酸化抗原は約15μMで添加することができる。リン酸化抗原は約18μMで添加することができる。リン酸化抗原は約20μMで添加することができる。リン酸化抗原は本明細書に開示され、または当技術分野で知られている任意のリン酸化抗原であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるリン酸化抗原はゾレドロネートであり、培地中に0.1～20μMの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、ゾレドロネートは、約0.1、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、11.5、12、13、13.5、14、15、16、17、18、または19μMの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ゾレドロネートは約0.1μMで添加される。ゾレドロネートは約0.5μMで添加することができる。ゾレドロネートは約1μMで添加することができる。ゾレドロネートは約1.5μMで添加することができる。ゾレドロネートは約2μMで添加することができる。ゾレドロネートは約3μMで添加することができる。ゾレドロネートは約4μMで添加することができる。ゾレドロネートは約5μMで添加することができる。ゾレドロネートは約6μMで添加することができる。ゾレドロネートは約7μMで添加することができる。ゾレドロネートは約8μMで添加することができる。ゾレドロネートは約9μMで添加することができる。ゾレドロネートは約10μMで添加することができる。ゾレドロネートは約12μMで添加することができる。ゾレドロネートは約15μMで添加することができる。ゾレドロネートは約18μMで添加することができる。ゾレドロネートは約20μMで添加することができる。
本明細書に記載の方法で使用される培地には、(ii)サイトカインを添加することができる。サイトカインには、インターロイキン、リンパカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、およびケモカインを含む。一実施形態において、サイトカインは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-12（IL-12）からなる群より選択される、 インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-18（IL-18）、インターロイキン-21（IL-21）、インターロイキン-33（IL-33）、インスリン様成長因子1（IGF-1）、インターロイキン-1 b（IL-1b）、インターフェロン-γ（IFN-g）および間質細胞由来因子-1（SDF-1）からなる群より選択される。培養中のgdT細胞に対して同様の生理学的効果を促進する能力に関してサイトカインと同じ活性を有する化合物も、例えばサイトカイン模倣物を含め、本明細書に開示する方法に使用できる。
いくつかの実施形態において、サイトカインは、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-33、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、サイトカインはIL-2である。
いくつかの実施形態において、1種類以上のサイトカインを使用することができる。サイトカインは同時に培地に添加することもできるし、異なる時期に添加することもできる。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、培養中に少なくとも２つの異なるサイトカインの組み合わせを培地に添加することができる。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、培地は培養の初期には第一のサイトカインを添加し、培養の後半期には第二のサイトカインを添加することができる。第１および第２のサイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群より個別で選択することができる。いくつかの実施形態において、第1および第2のサイトカインは、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、およびIL-33からなる群より個別で選択することができる。
本明細書に記載の方法で使用されるサイトカインは、ヒトまたは動物由来のものであり得る。いくつかの実施形態において、サイトカインはヒト由来である。野生型タンパク質、または野生型タンパク質の活性を維持して培養中のｇｄＴ細胞に対する同様の生理学的効果を促進する任意の生物学的に活性な断片もしくは変異体であり得る。サイトカインは、例えばペプチド、ポリペプチドまたは生物学的に活性なタンパク質のような他の分子と融合または複合化した可溶性の形態であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト組換えサイトカインが使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、1 - 10000U／mlの範囲の濃度のサイトカインを添加した培養液を使用することを含有する。いくつかの実施形態において、サイトカイン濃度は100 - 1000U/mlの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、サイトカインは培地中に100 - 2500IU/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは培地中に200 - 3000IU/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、 約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1600、約1700、約1800、約1900、約2000、約2100、約2200、約2300、約2400、約2500、約2600、約2700、約2800、約2900、または約3000 IU/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは約100 IU/mLの濃度で添加される。サイトカインは約200 IU/mLの濃度で添加することができる。サイトカインは約350 IU/mLの濃度で添加することができる。サイトカインは約500 IU/mLの濃度で添加することができる。サイトカインは約700 IU/mLの濃度で添加することができる。サイトカインは約1000 IU/mLの濃度で添加することができる。サイトカインは約1500 IU/mLの濃度で添加することができる。サイトカインは約2000 IU/mLの濃度で添加することができる。
当業者であれば、培地中のサイトカイン濃度を評価するために別の単位が使用され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、サイトカインは培地中に0.0612 - 1.53 μg/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは培地中に0.05～5 μg/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.2、約2.4、約2.6、約2.8、約3.0、約3.2、約3.4、約3.6、約3.8、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、または約5.0 μg/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは約0.1μg/mL添加される。サイトカインは約0.2 μg/mL添加することができる。サイトカインは約0.3 μg/mL添加することができる。サイトカインは約0.4 μg/mL添加することができる。いくつかの実施形態において、サイトカインは約0.5 μg/mL添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは約1.0 μg/mL添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは約1.5 μg/mL添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは約2 μg/mL添加される。
サイトカインは、本明細書に開示され、または当技術分野で知られている任意のサイトカインであり得る。少なくとも2つのサイトカインが使用される場合、サイトカインは培地に約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、 約950、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1600、約1700、約1800、約1900、約2000、約2100、約2200、約2300、約2400、約2500、約2600、約2700、約2800、約2900、または約3000 IU/mLの合計濃度で添加される。いくつかの実施形態において、サイトカインは培地に約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1. 3、 約1.4、 約1.5、 約1.6、 約1.7、 約1.8、 約1.9μg、 約2.0μg、 約2.2、 約2.4、 約2.6、 約2.8、 約3. 0、約3.2、約3.4、約3.6、約3.8、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、 約5.0 μg/mLの合計濃度で添加される。
いくつかの実施形態において、IL-2が使用され、本明細書に開示される方法は1 - 10000U／mlの範囲の濃度のIL-2を添加した培養液を使用することを含有する。いくつかの実施形態において、IL-2濃度は100 - 1000 IU/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、IL-2は培地中に100 - 2500 IU/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は培地中に200 - 3000 IU/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、 約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1600、約1700、約1800、約1900、約2000、約2100、約2200、約2300、約2400、約2500、約2600、約2700、約2800、約2900、または約3000 IU/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は約100IU／mLの濃度で添加される。IL-2は約200 IU/mLの濃度で添加することができる。IL-2は約350 IU/mLの濃度で添加することができる。IL-2は約500 IU/mLの濃度で添加することができる。IL-2は約700 IU/mLの濃度で添加することができる。IL-2は約1000 IU/mLの濃度で添加することができる。IL-2は約1500 IU/mLの濃度で添加することができる。IL-2は約2000 IU/mLの濃度で添加することができる。
当業者であれば、培地中のIL-2濃度を特徴評価するために別の単位が使用され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、IL-2は培地中に0.0612 - 1.53μg/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は培地中に0.05 - 5μg/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.2、約2.4、約2.6、約2.8、約3.0、約3.2、約3.4、約3.6、約3.8、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、または約5.0 μg/mLの濃度で添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は約0.1μg/mLで添加される。IL-2は約0.2 μg/mLで添加することができる。IL-2は約0.3 μg/mLで添加することができる。IL-2は約0.4 μg/mLで添加することができる。いくつかの実施形態において、IL-2は約0.5 μg/mLで添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は約1.0 μg/mLで添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は約1.5 μg/mLで添加される。いくつかの実施形態において、IL-2は約2 μg/mLで添加される。
本明細書に記載の方法で使用される培地には、(iii)HPLを添加することができる。HPLはStemCell Technologies社、Sigma Aldrich社、Millipore社などから市販されている。HPLは培地中に0.5～30vol%の濃度で添加することができる。いくつかの実施形態において、HPLは1 - 20vol％の濃度で添加される。いくつかの実施形態において、HPLは5 - 20vol％の濃度で添加される。いくつかの実施形態において、HPLは5 - 15vol％の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、HPLは培地中に約0.5％、約1％、約1.5％、約1.6％、約2％、約2.5％、約2.6％、約3％、約3.約5％、約3.6％、約4％、約4.5％、約4.6％、約5.0％、約5.1％、約5.5％、約5.6％、約6％、約6.1％、約6.5％、約6.6％、約7％、約7.1％、約7.5％、約7. 6%、約8%、約8.1%、約8.5%、約8.6%、約9%、約9.1%、約9.5%、約9. 6％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、または約30％（体積％、vol％、または％（v/v））の濃度で添加される。いくつかの実施形態において、HPLは培養液中に約5％の濃度で添加される。HPL濃度は2%程度とすることができる。HPL濃度は3%程度とすることができる。 HPL濃度は4%程度とすることができる。HPL濃度は6%程度とすることができる。HPL濃度は7%程度とすることができる。HPL濃度は8%程度とすることができる。HPL濃度は9%程度とすることができる。HPL濃度は10%程度とすることができる。HPL濃度は12%程度とすることができる。HPL濃度は15%程度とすることができる。HPL濃度は18%程度とすることができる。HPL濃度は20%程度とすることができる。HPL濃度は25%程度とすることができる。HPL濃度は30%程度とすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される培養液は無血清であり得る。いくつかの実施形態において、培地はヒトまたは動物由来血清の使用を避ける合成培地などの血清代替培地であり得る。無血清培地で培養したサンプルは、濾過、沈殿、汚染、血清の供給などの問題が避けられるという利点がある。
Iscoves培地や、RPMI-1640（Gibco社、Sigma Aldrich社、Biological Industries社、STEMCELL Technologies社、Life Technologies社などから入手可能）、AIM-V、X-VIVO 10、X-VIVO 15、X-VIVO 20（Lonza社）など、gdT 細胞増殖用に対して適した基礎培地が数多く入手可能である。培養液には、本明細書に定義する他の培地因子を添加することができる。本明細書に記載の方法で使用される培地は、gdT細胞の増殖および／または活性化に有用な他の成分をさらに含有することができる。添加可能な他の成分の例としては、アルブミンなどの精製タンパク質、低密度リポタンパク質（LDL）などの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイド、細胞の成長および／または生存を支援または促進する他のサプリメントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用される培地は、600 - 5000 mg/Lの濃度のグルコースを含有する。培地は約500mg/Lから約1000mg/Lまで、約500mg/Lから約1500mg/Lまで、約500mg/Lから約2000mg/Lまで、約750mg/Lから約1000mg/Lまで、約750mg/Lから約1500mg/Lまで、約750mg/Lから約2000mg/Lまで、約1000mg/Lから約1500mg/Lまで、約1000mg/Lから約2000mg/Lまで、約1000mg/Lから約3000mg/Lまで、または約1000mg/Lから約4000mg/Lまでのグルコース含量を有し得る。いくつかの実施形態において、細胞は約1250mg/Lのグルコース含量を有する培地中で維持され得る。高い細胞密度培養が維持される例などの場合によっては、細胞は約1000 mg/Lから約5000 mg/Lまで、約1000 mg/Lから約4000 mg/Lまで、約2000 mg/Lから約5000 mg/Lまで、または約2000 mg/Lから約4000 mg/Lまでのグルコース含量を有する培養液中で維持されることができる。いくつかの実施形態において、培地は、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、または4900 mg/Lの濃度のグルコースを含有する。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、培地は培養中に交換されることができる。当技術分野で知られているように、培地交換とは、培養装置内の古い培地を除去し、新しい培地を添加する手順を指す。培養液は半分で交換できる。また、培地は全量交換することもできる。培地交換は週に1回、週に2回、週に3回、1日おき、または毎日行うことができる。いくつかの実施形態において、培養液は2日ごと、あるいは3日ごとに交換することができる。
ある実施形態において、細胞は培養中に新鮮な培地で再播種される。一般的に、さらなる増殖をサポートする密度に希釈または調整さる為、細胞は再播種される。細胞は培養中に 1 回または複数回再播種できる。いくつかの実施形態において、細胞は週に1回、週に2回、週に3回、1日おき、または毎日再播種され得る。いくつかの実施形態において、細胞は培養中に少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、または少なくとも5回再播種することができる。いくつかの実施形態において、細胞は2日ごと、あるいは3日ごとに再播種される。培養期間全体には、特定の日に培地を交換し、別の日に再播種することが含まれる。いくつかの実施形態において、細胞密度は、約0.5 x 106から約1 x 106細胞/mL、約0.5 x 106から約1.5 x 106細胞/mLまで、約0.5 x 106から約2 x 106細胞/mLまで、約0. 75×106から約1×106個/mLまで、約0.75×106から約1.5×106個/mLまで、約0.75×106から約2×106個/mLまで、約1×106から約2×106個/mLまで、または約1×106から約1. 5×106細胞/mLまで、約1×106から約2×106細胞/mLまで、約1×106から約3×106細胞/mLまで、約1×106から約4×106細胞/mLまで、約1×106から約5×106細胞/mLまで、約1×106から約10×106細胞/mLまで、約1×106から約15×106細胞/mLまで、約1×106から約20×106細胞/mLまで、または約1×106から約30×106細胞/mLまでの範囲に調整される。当業者であれば、日常的な実践として培地交換手順（頻度、タイミング、交換される量など）を最適化することができるであろう。
一般に、培地交換または再播種の間、培養開始時に使用した培地と同じ成分が添加される新鮮な培地には、リン酸化抗原（例えば、ゾレドロネート）、サイトカイン（例えば、IL-2）およびHPLを含む。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、培地交換または再播種に使用される新鮮培地は、ゾレドロネートを添加されない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原（例えば、ゾレドロネート）は培養の初期に使用される培地中にのみ添加される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原（例えば、ゾレドロネート）は培養の終盤に使用される培地中に添加されない。例えば、いくつかの実施形態において、リン酸化抗原（例えば、ゾレドロネート）は培養期間の最終日、最後の2日間、最後の3日間、最後の4分の1、最後の3分の1、または後半に使用される培養培地中に添加されない。abT細胞を枯渇させることを含有する本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、リン酸化抗原（例えば、ゾレドロネート）は、abT枯渇前に使用される培養培地に添加されるが、abT枯渇後には添加されない。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、サイトカイン（例えば、IL-2）は培養中に添加される。サイトカイン（例えばIL-2）は、培地交換や再播種を行わない日に補充することができる。いくつかの実施形態において、サイトカイン（例えば、IL-2）は週1回、週2回、週3回、隔日、または毎日補充され得る。
いくつかの実施形態において、細胞は培養中に適切な培地で、5％CO2を含む加湿雰囲気中に37℃で培養される。
例示の目的で、本明細書に記載の方法は細胞を16日間培養することを含有し、以下の手順を含む。
図示されているように、例示的な16日間の培養手順では、abT細胞は6日目に枯渇される。完全培地には、サイトカイン（例えば、350または700 IU/mL IL-2）、リン酸化抗原（例えば、1 μMのゾレドロネート）、およびHPL（例えば、5vol%）が添加される。サイトカインは、直接補充、培地交換、または再播種によって、ほぼ毎日または隔日で添加されるが、リン酸化抗原（例えば、1μMのゾレドロネート）は、abT枯渇の前にのみ培地中に補充される。当業者であれば、図示された手順が日常的な実践として修正され、さらに最適化され得ることを理解するであろう。
gdT細胞を含有する供給源細胞集団は、様々なサンプルから得ることができる。サンプルは造血系サンプルまたはその一部である（すなわち、供給源細胞集団は造血系サンプルまたはその一部から得られる）。造血系サンプルには、血液（末梢血または臍帯血など）、骨髄、リンパ組織、リンパ節組織、胸腺組織、およびそれらの分画または濃縮部分が含まれる。いくつかの実施形態において、サンプルは血液サンプルである。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は臍帯血またはその 分画から得ることができる。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は末梢血またはその 分画から得ることができる。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は、バフィーコート細胞、白血球生成物、末梢血単核球（PBMC）、低密度単核球（LDMC）などの末梢血の分画から得ることができる。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団はPBMCを含有する。いくつかの実施形態において、サンプルはヒト血液またはその分画である。細胞は、密度勾配遠心分離のような当分野で公知の技法を用いて血液サンプルから得ることができる。PBMCは、例えば、Ficoll-PaqueTM PLUS（GE Healthcare社製）システムのようなアフェレーシス装置を用いて被験者から採取することができる。
いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は非造血組織サンプルか ら得ることができる。非造血組織とは、血液、骨髄、リンパ組織、リンパ節組織、胸腺組織以外の組織である。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は血液や滑液などの特定種類な生物学的流体のサンプルからは得られない。非造血組織としては、消化管（結腸や腸など）、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、膵臓、子宮、膣、その他の皮膚、粘膜、漿膜などの組織が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非造血組織サンプルから供給源細胞集団を取得する方法は当分野で既知である。例えば、非造血組織サンプルからの細胞排出を促進するように構成された合成足場上で非造血組織サンプルを培養することによって、非造血組織サンプルから供給源細胞集団を得ることができる。
GdT細胞はがん組織サンプルにも常在する可能性がある。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団はヒト癌組織サンプル（例えば、血液癌組織または固形腫瘍組織）から得ることができる。癌組織サンプルは、例えば、乳房または前立腺の腫瘍であり得る。いくつかの実施形態においては、供給源細胞集団はヒト癌組織 以外のサンプル（例えば、相当数の腫瘍細胞を含まない組織）から 得ることができる。例えば、供給源細胞集団は、近傍または隣接する癌組織から切り離された健常組織の領域から採取することができる。
供給源細胞集団は、ヒトまたは非ヒト動物組織から 得ることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ヒトまたはヒト以外の動物組織から供給源細胞集団を得ることをさらに含有する。いくつかの実施形態において、サンプルはヒトから得られる。いくつかの実施形態において、サンプルは非ヒト動物被験体から得られる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法に従って調製された細胞集団は移植に使用される。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される 方法はドナーから供給源細胞集団を得ることをさらに含有する。ドナーは健康な人間であり得る。ドナーは病気の人間でも構わない。いくつかの実施形態において、移植の受領者は人間である。移植は自家移植であり得る。移植は同種移植であり得る。当技術分野で理解されているように、「自家」という用語は、材料に関して使用される場合、その材料が、後に再導入される同じ個体に由来することを意味し、「同種」という用語は、材料に関して使用される場合、その材料が同じ種の異なる個体に由来する移植片であることを意味する。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は自家ドナーから得られ る。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は同種ドナーから得られたものである。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は健常な同種ドナーから得られ、本明細書に記載の方法を用いて調製された細胞集団はがん患者への移植に用いられる。
いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は新鮮に調製されたサンプルから得ることができる。源細胞集団は、本明細書に開示した方法で培養する直前に解凍した凍結保存サンプルから得ることもできる。凍結保存されたPBMCの解凍には、37℃のウォーターバスを使用することができる。
いくつかの実施形態において、供給源細胞集団はPBMCを含有し、本明細書に記載の方法はドナーの末梢血からPBMCを得ることを含有する。ドナーは自家ドナーであり得る。PBMCは新鮮に調製することができる。ＰＢＭＣは凍結保存されるものであり得るし、本明細書に開示される方法において供給源細胞集団として使用される直前に解凍する。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、培養中の供給源細胞集団中のgdT細胞を少なくとも1,000倍に増殖することができる。いくつかの実施形態において、gdT細胞は、培養中に少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも2,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも15,000倍、少なくとも20,000倍、少なくとも30,000倍、少なくとも40,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも60,000倍、少なくとも70,000倍、少なくとも80,000倍、または少なくとも100,000倍、増殖される。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は単一のドナーに由来する。いくつかの実施形態において、供給源細胞集団は、複数のド ナーまたは複数のドナー（例えば、2、3、4、5、または2-5、 2-10、または5-10かそれ以上のドナー）に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法によって生成される細胞集団は、わずか1人のドナーからの臨床的に適切な数（少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個か、少なくとも1012個、または約107個から約1012個）のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、単一のドナーから供給源細胞集団を入手した時点から40日未満（例えば、約30日、約20日、約2週間、または約1週間）以内に、臨床的に適切な数（例えば、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個か、少なくとも1012個、または約107個から約1012個）のgdT細胞を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法は単一のドナーから供給源細胞集団を得た時点から30日未満以内に臨床的に適切な数のgdT細胞を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法は単一のドナーから供給源細胞集団を得た時点から20日未満以内に臨床的に適切な数のgdT細胞を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、単一のドナーから供給源細胞集団を得た時点から約2週間（例えば、14 - 18日）以内に、臨床的に適切な数のgdT細胞を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、単一のドナーから供給源細胞集団を得た時点から16日以内に、臨床的に適切な数のgdT細胞を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は単一のドナーから供給源細胞集団を得た時点から16日以内に、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、または少なくとも1011個のgdT細胞の集団を提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は単一のドナーから供給源細胞集団を得た時点から16日以内に、少なくとも1010個のgdT細胞の集団を提供することができる。
いくつかの実施形態において、gdT細胞を増殖させる本明細書に提供される方法は5日未満の集団倍加時間を含有することができる。いくつかの実施形態において、培養中のgdT細胞の倍加時間は、4.5日未満、4.0日未満、3.9日未満、3.8日未満、3.7日未満、3.6日未満、3.5日未満、3.4日未満、3. 3日未満、3.2日未満、3.1日未満、3.0日未満、2.9日未満、2.8日未満、2.7日未満、2.6日未満、2.5日未満、2.4日未満、2.3日未満、2.2日未満、2. 1日未満、2. 0日未満、46時間未満、42時間未満、38時間未満、35時間未満、32時間未満、30時間未満、29時間未満、28時間未満、27時間未満、26時間未満、25時間未満、24時間未満、23時間未満、22時間未満、21時間未満、20時間未満、19時間未満、18時間未満、17時間未満、16時間未満、15時間未満、14時間未満、13時間未満、または12時間未満。
本明細書に提供される方法は、細胞集団中にgdT細胞を豊富にもたらす。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも50％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られる細胞集団の少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも87％、または少なくとも90％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも75％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも80％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも85％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも90％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、得られた細胞集団の少なくとも95％がgdT細胞である。
Tab細胞は反応性が高く、移植片対宿主病を引き起こす可能性があるため、本明細書に提供する患者への投与に適した細胞集団は低レベルのabT細胞のみを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は約10％未満のabT細胞、例えば約5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1.5％未満、1％未満、0.5％未満、0.2％未満、0.1％未満または0.05％未満のabT細胞を有する細胞集団を生産する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって調製された細胞集団は約1％未満のabT細胞を含む。
細胞表面マーカーの発現の増減は、例えばCD69を含め、本明細書に記載の方法で調製した細胞集団を評価するために追加的または代替的に用いることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって調製された細胞集団のgdT細胞のうち、CD69を発現する割合が増殖前の供給源集団と比較して多い。例として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製された細胞集団のgdT細胞の約30％以上、例えば約35％以上、約40％以上、約45％以上、約50％以上、約55％以上、約60％以上、約65％以上、約70％以上、約75％以上、約80％以上、約85％以上、約90％以上がCD69を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法によって調製された細胞集団は供給源の細胞集団と比較して、CD69の平均発現量が多い。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって調製された細胞集団は低レベルのPD-1および／またはTIM-3を発現する。表面マーカーに関する詳細は、以下のセクション5.2に記載されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、得られた細胞集団中の細胞の表面に標的化部分を加えることをさらに含有する。本明細書に使用される標的化部分は標的細胞上の生物学的マーカーへの特異的結合を示す。いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的化部分に結合した第１のリンカーと細胞に結合した第２のリンカーとの間の相互作用を介して細胞表面に複合体形成される。いくつかの実施形態において、標的化部分は、キメラ抗原受容体（”CAR”）またはT細胞受容体（”TCR”）などの受容体タンパク質の細胞外ドメインとして、本明細書に提供されるgdT細胞の表面上に外因的に発現される。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法はCAR又はTCRをコードする核酸をgdT細胞に導入することをさらに含有する。詳細は以下の5.2.1～5.2.3項を参照。
本明細書に記載されている方法のいくつかの実施形態では、細胞は空気透過性装置内で培養される。空気透過性装置、すなわち空気透過性細胞培養装置は、空気透過性の表面を備えた組織培養用の容器である。いくつかの実施形態において、細胞はこのような空気透過性の表面に播種することができる。いくつかの実施形態において、空気透過性装置はG-Rex装置である。当該技術分野で知られているように、G-Rex装置は、ガス交換を損なうことなく大容量の培地を支える空気透過性膜を底部に有する細胞培養フラスコである(Bajgain et al., 2014, Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 14015)。いくつかの実施形態において、空気透過性装置はバイオリアクターであり得る。いくつかの実施形態において、バイオリアクターはWAVEバイオリアクターであり得る。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは攪拌槽型バイオリアクターであり得る。
gdT細胞を増殖させるために当技術分野で現在使用されているいくつかの方法にはフィーダー細胞、または特定の細菌成分などの微生物病原体由来の抗原とともにｇｄＴ細胞を培養するステップが含まれる。フィーダー細胞は同種PBMC、または形質転換細胞（例えば、EBV形質転換リンパ芽球細胞株）、またはその両方である。細菌成分は、例えば、結核菌低分子ペプチド抗原（Mtb-Ag）、ブドウ球菌腸毒素A（SEA）、および連鎖球菌プロテインAであり得る。フィーダー細胞や病原性成分の使用は、細胞の移植患者に潜在的なリスクをもたらす。従って、フィーダー細胞、細菌成分、または潜在的な移植患者にとって有害となる可能性がある異物を臨床投与前に確実に除去することが重要である。フィーダー細胞は並列培養し、使用前に照射する必要があり、照射が不十分な場合、フィーダー細胞がgdT細胞より過剰増殖し、細胞調製が汚染される可能性がある。フィーダー細胞や微生物病原体を含まない生体外 (Ex vivo) 培養は、培養手順を簡略化する為有利である。また、取り扱いが少ないならば、栽培中に混入する汚染のリスクも低くなる。従って、フィーダーや微生物病原体を使用せずに、臨床的に適切な数のgdT細胞を作製することは費用対効果に優れ、より安全である。本明細書に提供される方法は、フィーダー細胞や微生物病原体を使用する必要なく、十分な活性を有する臨床的に適切な数のgdT細胞を産生することができる。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、gdT細胞の増殖および／または活性を刺激するためにフィーダー細胞、または細菌成分などの微生物病原体を使用しない。
生体外 (Ex vivo)でgdT細胞を豊富にするいくつかの方法はgdT細胞をポジティブに選択することを含む。当技術分野で理解されているように、ポジティブ選択とは、標的細胞を選択するために、所望の細胞集団のポジティブな特徴（表面マーカーの発現など）を使用することを含む手順を指す。このようなポジティブな特徴を持たない細胞は破棄される。例として、細胞集団におけるgdT細胞のポジティブ選択では、例えば、TCRVδ2+に対する抗体と結合したビーズを使用して、gdT細胞を捕捉することができる。結合していない細胞は廃棄される。ポジティブ選択は、所望の細胞タイプの純度が高い細胞集団を調製するために用いることができる。しかし、ポジティブ選択と所望の細胞型 (gdT など) の付随的損失という追加のステップも、結果として得られる細胞集団の品質に影響を与える可能性がある。本明細書に提供される方法により、ポジティブ選択を使用せずに、高純度のgdT細胞を含む細胞集団の調製が可能になる。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法はgdT細胞のポジティブ選択を含まない。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法はポジティブ選択を含まない。
図１Ａは、以下を含む本明細書に記載の方法の例示的な手順を提供する: (S11) 装置内で、リン酸化抗原、第一のサイトカイン、および(iii) HPLを添加した培地で細胞集団を培養し、(S12) 細胞集団からabT細胞を枯渇させ、(S13)リン酸化抗原無しの培地で細胞集団を少なくとも１日間培養する。
図１Ｂは、以下を含む本明細書に記載の方法の例示的な手順も提供する: (1) 1 日目: 0.1-20 μM ゾレドロネートおよび 200-3000 IU/ml IL-2 を添加した完全増殖培地中の空気透過性装置に5-200 × 106 PBMC を播種し、(2) 2日目および4日目：培地に100-2500 IU/ml IL-2を補充し、(3) 6日目：abT細胞を枯渇させ、残りの細胞を100-2500 IU/mlのIL-2を添加した完全増殖培地に再播種すし、(4) 7-13日目：1日おきに培地に100-2500IU/mlのIL-2を補充し、必要に応じて細胞を再播種し、(5) 14日目：培地を完全増殖培地に変更する。
当業者であれば理解できるように、本明細書に開示された方法の様々な態様の多種多様な組み合わせや順列が存在する。このような組み合わせおよび順列は、本開示の範囲内であることが明示的に企図される。
5.2 gdT細胞が豊富な細胞集団
本明細書に記載の方法によって得られる細胞集団も本明細書に提供される。本明細書に開示される細胞集団は、特定のバイオマーカーの発現によって示されるように、NK様特性を有するgdT細胞が豊富である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは脊椎動物の細胞集団である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは哺乳動物細胞集団である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団はヒト細胞集団、非ヒト霊長類細胞集団、イヌ細胞集団、ネコ細胞集団、またはげっ歯類細胞集団である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団はマウス細胞集団である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団はサル細胞集団である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団はヒト細胞集団である。
従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団のgdT細胞は脊椎動物gdT細胞である。いくつかの実施形態において、gdT細胞は哺乳動物gdT細胞である。いくつかの実施形態において、gdT細胞はヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、gdT細胞はマウスgdT細胞であり得る。いくつかの実施形態において、gdT細胞はサルgdT細胞であり得る。いくつかの実施形態において、gdT細胞はヒトgdT細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は1 × 106 - 1 × 1011個の細胞を含有し、細胞の35 - 100%がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は、約1 × 106、約1.5 × 106、約2 × 106、約2.5 × 106、約3 × 106、約3 × 106、約4 × 106、約4.5 × 106、約5 × 106、約5.5 × 106、約6 × 106、約6.5 × 106、約7 × 106、約7.5 × 106、約8 × 106、約8.5 × 106、約9 × 106、約9.5 × 106、約1 × 107、約1.5 × 107、約2 × 107、約2.5 × 107、約3 × 107、約3.5 × 107、約4×107、約4.5×107、約5×107、約5.5×107、約6×107、約6.5×107、約7×107、約7.5×107、約8×107、約8.5×107、約9×107、約9.5×107、約1×108、約1.5×108、約2×108、約2. 5 × 108, 約 3 × 108, 約 3.5 × 108, 約 4 × 108, 約 4.5 × 108, 約 5 × 108, 約 5.5 × 108, 約 6 × 108, 約 6.5 × 108, 約 7 × 108, 約 7.5 × 108, 約 8 × 108, 約 8.5 × 108, 約 9 × 108, 約 9.5 × 108, 約 1 × 109, 約 1.5 × 109, 約 2 × 109, 約 2. 5 × 109, 約 3 × 109, 約3.5 × 109, 約 4 × 109, 約4.5 × 109, 約 5 × 109, 約 5.5 × 109, 約 6 × 109, 約 6.5 × 109, 約 7 × 109, 約 7.5 × 109, 約 8 × 109, 約 8.5 × 109, 約 9 × 109, 約 9.5 × 109, 約 1 × 1010, 約 1.5 × 1010, 約 2 × 1010, 約 2. 5×1010、 約3×1010、 約3.5×1010、 約4×1010、 約4.5×1010、 約5×1010、 約5.5×1010、 約6×1010、 約6.5×1010、 約7×1010、 約7.5×1010、 約8×1010、 約8.5×1010、 約9×1010、 約9.5×1010、 または約1×1011個の細胞を含有し、細胞の35 - 100％がgdT細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は、約1×106個の細胞を含有する。本明細書に開示される細胞集団は、約5 × 106個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約1 × 107 個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約5 × 107 個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約1 × 108個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約5 × 108個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約1 × 109個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約5 × 109個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約1 × 1010個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約5 × 1010個の細胞を含有し得る。本明細書に開示される細胞集団は、約1 × 1011個の細胞を含有し得る。
本明細書に開示される細胞集団は、35-100％のgdT細胞を含有する。本明細書に開示された細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞の少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも90％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％がgdT細胞である。本明細書に開示される細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞の少なくとも70％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも75％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも80％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも85％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも90％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも95％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも98％がgdT細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、gdT細胞についてポジティブ選択されていない。
本明細書に提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞の30％以下がabT細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞集団中の細胞の29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％以下がabT細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は5％以下のabT細胞を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は2％以下のabT細胞を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は1％以下のabT細胞を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は0.5％以下のabT細胞を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は0.1％以下のabT細胞を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団はabT細胞を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は検出可能なabT細胞を持たない。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は、少なくとも0.5 × 106, 1 × 106, 2 × 106, 3 × 106, 4 × 106, 5 × 106, 5.5 × 106, 6 × 106, 6.5 × 106, 7 × 106, 7.5 × 106, 8 × 106, 8.5 × 106, 9 × 106, 9.5 × 106, 1 × 107, 1.5 × 107, 2 × 107, 2.5 × 107, 3 × 107, 3.5 × 107, 4 × 107, 4.5 × 107, 5 × 107, 5.5 × 107, 6 × 107, 6.5 × 107, 7 × 107, 7.5 × 107, 8 × 107, 8.5 × 107, 9 × 107, 9.5 × 107, 1 × 108, 1.5 × 108, 2 × 108, 2.5 × 108, 3 × 108, 3.5 × 108, 4 × 108, 4.5 × 108, 5 × 108, 5.5 × 108, 6 × 108, 6.5 × 108, 7 × 108, 7.5 × 108, 8 × 108, 8.5 × 108, 9 × 108, 9.5 × 108, 1 × 109, 1.5 × 109, 2 × 109, 2.5 × 109, 3 × 109, 3.5 × 109, 4 × 109, 4.5 × 109, 5 × 109, 5.5 × 109, 6 × 109, 6.5 × 109, 7 × 109, 7.5 × 109, 8 × 109, 8.5 × 109, 9 × 109, 9.5 × 109, 1 × 1010, 1.5 × 1010, 2 × 1010, 2.5 × 1010, 3 × 1010, 3.5 × 1010, 4 × 1010, 4.5 × 1010, 5 × 1010, 5.5 × 1010, 6 × 1010, 6.5 × 1010, 7 × 1010, 7.5 × 1010, 8 × 1010, 8.5 × 1010, 9 × 1010, 9.5 × 1010, または 1 × 1011 個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は、少なくとも 1 × 106, 5 × 106, 1 × 107, 5 × 107, 1 × 108, 5 × 108, 1 × 109, 5 × 109, 1 × 1010, 5 × 1010, または 1 × 1011個 のgdT細胞を含有する. いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は少なくとも5 × 106個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1 × 107個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5 × 107個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1 × 108個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5 × 108個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1 × 109個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5 × 109個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1 × 1010個のgdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5 × 1010個のgdT細胞を含有する。
本明細書で提供される細胞集団のgdT細胞は、Vδ1 細胞、Vδ2 T細胞、Vδ3 T細胞、Vδ5 T細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含有することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも30％のgdT細胞はVδ2 T細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％はVδ2 T細胞である。いくつかの実施形態において、gdT細胞はVγ9Vδ2 T細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がVγ9Vδ2 T細胞である。
当技術分野で知られているように、gdT 細胞は記憶タイプの次の 4 つのサブセットに更に分割できる：(1) CD45RA+CD27- を特徴とする終末分化エフェクター記憶 (TDEM または TEMRA) 細胞、(2) CD45RA-CD27+を特徴とする中枢記憶（CMまたはTCM）細胞、(3) CD45RA+CD27+を特徴とするナイーブ細胞；および (4) CD45RA-CD27-(Guerra-Maupome et al., 2019, ImmunoHorizons. 3 (6) 208-218; Dieli et al., 2003, J Exp Med.198(3):391-7)を特徴とするエフェクター記憶細胞（EMまたはTEM）。NK様特性を有するgdT細胞が豊富な細胞集団は、主にエフェクター記憶細胞を含有することも特徴とする。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、EMおよびTDEM細胞は本明細書で提供される細胞集団のgdT細胞の少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、 少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、または少なくとも98％を構成する。いくつかの実施形態において、EM細胞およびTDEM細胞はgdT細胞の少なくとも75％を構成する。いくつかの実施形態において、EM細胞およびTDEM細胞はgdT細胞の少なくとも80％を構成する。いくつかの実施形態において、EM細胞およびTDEM細胞はgdT細胞の少なくとも85％を構成する。いくつかの実施形態において、EM細胞およびTDEM細胞はgdT細胞の少なくとも90％を構成する。いくつかの実施形態において、EM細胞およびTDEM細胞はgdT細胞の少なくとも95％を構成する。いくつかの実施形態において、EM細胞およびTDEM細胞はgdT細胞の少なくとも98％を構成する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも10％のTDEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも10~90％のTDEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも10％のTDEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、または90％のTDEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％がTDEM細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも30％のTDEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも40％のTDEM細胞を含有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも50％のTDEM細胞を含有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも60％のTDEM細胞を含有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも70％のTDEM細胞を含有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも80％のTDEM細胞を含有することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも10％のEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも10~90％のEM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、または90％のEM細胞を含有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は5％以下のナイーブ細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、1％、2％、3％、4％、または5％以下のナイーブ細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は1～5％のナイーブ細胞を含有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は5％以下のCM細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、1％、2％、3％、4％、または5％以下の中枢記憶細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は1～5％のCM細胞を含有する。
CD69の発現はgdT細胞の活性化を示す。本明細書に開示される細胞集団のいくつかの実施形態において、少なくとも30％がCD69+細胞である。本明細書で開示される細胞集団は、gdT細胞の少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも77％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、 少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％がCD69+gdT細胞であることを含有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、または少なくとも80％が、CD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも30％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも35％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも40％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも45％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも50％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも55％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも60％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも65％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも70％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも75％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも80％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも85％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも90％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも95％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも96％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも97％はCD69+である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞の少なくとも98％はCD69+である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、少なくとも5 × 105、 1 × 106、 2 × 106、 3 × 106、 4 × 106、 5 × 106、 5.5 × 106、 6 × 106、 6.5 × 106、7 × 106、 7.5 × 106、 8 × 106、 8.5 × 106、 9 × 106、 9.5 × 106、 1 × 107、1.5 × 107、 2 × 107 、2.5 × 107、 3 × 107、 3.5 × 107、 4 × 107、 4.5 × 107、 5 × 107、 5.5 × 107、 6 × 107、 6.5 × 107、 7 × 107、 7.5 × 107、 8 × 107、 8.5 × 107、 9 × 107、 9.5 × 107、 1 × 108、 1.5 × 108、 2 × 108、 2.5 × 108、 3 × 108、 3.5 × 108、 4 × 108、 4.5 × 108、 5 × 108、 5.5 × 108、 6 × 108、 6.5 × 108、 7 × 108、 7.5 × 108、 8 × 108、 8.5 × 108、 9 × 108、 9.5 × 108、 1 × 109、 1.5 × 109、 2 × 109、 2.5 × 109、 3 × 109、 3.5 × 109、 4 × 109、 4.5 × 109、 5 × 109、 5.5 × 109、 6 × 109、 6.5 × 109、 7 × 109、 7.5 × 109、 8 × 109、 8.5 × 109、 9 × 109、 9.5 × 109、 1 × 1010、 1.5 × 1010、 2 × 1010、 2.5 × 1010、 3 × 1010、 3.5 × 1010、 4 × 1010、 4.5 × 1010、 5 × 1010、 5.5 × 1010、 6 × 1010、 6.5 × 1010、7 × 1010、7.5 × 1010、8 × 1010、 8.5 × 1010、 9 × 1010、 9.5 × 1010、または1 × 1011 個のCD69+gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞集団は少なくとも1 × 106個のCD69+gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5×106個のCD69+gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1×107個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5×107個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1×108個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5×108個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1×109個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5×109個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも1×1010個のCD69+ gdT細胞を含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも5×1010個のCD69+ gdT細胞を含有する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも400個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、20000、 25000、 30000、 35000、 40000、45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、100000、 110000、120000、 130000、 140000、150000、 160000、 170000、 180000、 190000、200000、 210000、 220000、 230000、 240000、250000、 260000、 270000、 280000, 290000、300000、 310000、 320000、330000、340000、 350000、 360000、 370000, 380000, 390000, 400000、 410000、 420000、430000、440000、 450000、 460000、 470000, 480000、 490000、 または500000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも5000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約5000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも10000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約10000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも20000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約20000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも30000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約30000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも40000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約40000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも50000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約50000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも60000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約60000から約70000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも70000個のCD69分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約70000から約100000個のCD69分子を発現する。
本明細書に開示される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも500、 600、 700、 800、 900、 1000、 1500、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000, 25000, 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、100000、110000、 120000、 130000、 140000、 150000、160000、 170000、 180000、 190000、 200000、210000、 220000、 230000、 240000、 250000、260000、 270000、 280000、 290000、 300000、310000、 320000、 330000、 340000、 350000、360000、 370000、 380000、 390000、 400000、410000、 420000、 430000、 440000、 450000、460000、 470000、 480000、 490000、 または 500000個のCD69分子を発現する。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも5000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約5000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも10000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも20000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約20000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも30000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約30000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも40000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約40000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも50000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも60000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約70000個のCD69分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、CD69発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも70000個のCD69分子を発現する。CD69発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約100000個のCD69分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD69を発現するgdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、130000、140000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、100000、110000、 120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のCD69分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の30-100％がDNAM-1を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がDNAM-1を発現する。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも50％がDNAM-1を発現する。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも60％がDNAM-1を発現する。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも70％がDNAM-1を発現する。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも80％がDNAM-1を発現する。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも90％がDNAM-1を発現する。
本明細書に提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも300，400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現する。gdT細胞は細胞あたり平均で約400から約300,000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも500個、少なくとも600個、少なくとも700個、少なくとも800個、少なくとも900個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、または少なくとも3000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも1000個のDNAM-1分子を発現する。gdT細胞はて細胞あたり平均で約1000から300000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも5000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも10000個のDNAM-1分子を発現する。gdT細胞はて細胞あたり平均で約10000から300000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも20000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも50000個のDNAM-1分子を発現する。gdT細胞はて細胞あたり平均で約50000から300000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも80000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも100000個のDNAM-1分子を発現する。gdT細胞はて細胞あたり平均で約100000から300000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも150000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも200000個のDNAM-1分子を発現する。gdT細胞はて細胞あたり平均で約200000から300000個のDNAM-1分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、 55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、または210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、または300000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物中のgdT細胞の30-100％が、細胞当たり平均で500-300000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現する。DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約400から約300,000個のDNAM-1分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも1000個のDNAM-1分子を発現する。DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約1000から300000個のDNAM-1分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも5000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも10000個のDNAM-1分子を発現する。DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から300000個のDNAM-1分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも20000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも50000個のDNAM-1分子を発現する。DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から300000個のDNAM-1分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも80000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも100000個のDNAM-1分子を発現する。DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約100000から300000個のDNAM-1分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも150000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも200000個のDNAM-1分子を発現する。DNAM-1発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約200000から300000個のDNAM-1分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、DNAM-1発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも300，400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、240,000、250,000、260,000、270,000、280,000、290,000、または300,000 DNAM-1分子を発現する。
本明細書に記載の細胞集団の抗腫瘍活性は、NK細胞傷害性受容体（例えば、CD56、CD16、NKG2D、NKp44、NKp46）および脱顆粒マーカー（例えば、CD107a）の発現の増強にも反映される。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、（1）細胞傷害性受容体（例えば、CD56、CD16、NKG2D、NKp44およびNKp46）、および／または（2）脱顆粒マーカー（例えば、CD107a）を発現するgdT細胞の割合が増加する。本明細書において提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、（1）細胞傷害性受容体（例えば、CD56、CD16、NKG2D、NKp44およびNKp46）および／または（2）脱顆粒マーカー（例えば、CD107a）を発現するgdT細胞は、細胞当たり平均でより多くの分子を発現する（すなわち、細胞当たり分子数、または「NMC」がより高い）。本明細書で提供される細胞集団は、例えば、INFγ、DNAM-1、グランザイムB、TIGIT、CD18、NKp30、CCR7、CD25、CD38、CD36、およびCD103を含むgdT細胞の治療可能性を示す付加的マーカーの発現亢進、およびPD-1などのgdT細胞の活性の欠如を示すマーカーの発現低下において、さらに評価することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも40％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも50％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも60％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも70％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約30％から約80％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約40％から約80％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約50％から約80％がCD56を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約60％から約80％がCD56を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、 6500、 7000、 7500、8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、30000、 35000、 40000、 45000、 50000、55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、100000、 110000、120000、130000、 140000、 150000、 160000、 170000、180000、190000、 または 200000、210000、 220000、230000、 240000、 250000、 260000、 270000、280000、 290000、 300000、310000、 320000、 330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも1000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約1000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも5000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約5000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも10000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも20000個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも30000個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも50000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも60000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも70000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約80000個のCD56分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、または80％がCD56を発現し、CD56発現gdT細胞は細胞当たり平均で少なくとも400、 500、 600、 700、 800、 900、 1000、 1500、2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも1000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で約1000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも5000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で約5000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも10000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で約10000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも20000個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも30000個のCD56分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも50000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で約50000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも60000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で約60000から約80000個のCD56分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも70000個のCD56分子を発現する。本明細書で提供されるCD56発現gdT細胞は、細胞当たり平均で約70000から約80000個のCD56分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD56発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、190000、 または 200000、 210000、220000、 230000、 240000、 250000、 260000、270000、280000、 290000、 300000、 310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、4000000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のCD56分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも20％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも40％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも50％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも60％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも70％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも80％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約20％から約90％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約30％から約90％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約40％から約90％がCD16を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約60％から約90％がCD16を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、 6500、 7000、7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、30000、35000、 40000、 45000、 50000、 55000、60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、100000、 110000、120000、 130000、 140000、150000、 160000、 170000、 180000、 190000、200000、 210000、 220000、 230000、240000、250000、 260000、 270000、 280000、 290000、 300000、 310000、 320000、330000、 340000、 350000、 360000、 370000、380000、 390000、 400000、 410000、 420000、430000、 440000、 450000、 460000、 470000、480000、 490000、 または500000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態では、組成物におけるgdT細胞の10％ - 100％が、細胞あたり平均で400 - 500000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも1000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約1000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも5000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約5000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも10000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも20000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも30000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも50000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも60000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも70000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも80000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約100000個のCD16分子を発現することができる。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約90000個のCD16分子を発現することができる。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約80000から約90000個のCD16分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、40000、45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、 190000、 200000、 210000、220000、 230000, 240000, 250000, 260000, 270000, 280000, 290000、 300000、 310000、 320000、 330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のCD16分子をは発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも400個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも1000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約1000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも5000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約5000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも10000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも20000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも30000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも50000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも60000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約90000個のCD16分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも70000個のCD16分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞当たり平均少なくとも80000個のCD16分子を発現する。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約90000個のCD16分子を発現することができる。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約100000個のCD16分子を発現することができる。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約90000個のCD16分子を発現することができる。本明細書で提供されるCD16発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約80000から約90000個のCD16分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD16発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、 4000、 4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、 190000、 200000、 210000、220000、 230000、 240000、 250000、 260000、270000、 280000、 290000、300000、 310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、4000000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のCD16分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも40％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも50％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも60％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも70％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも80％がNKG2Dを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも90％がNKG2Dを発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも1000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約1000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも5000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約5000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも10000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも20000個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも30000個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも50000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも60000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも70000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約100000個のNKG2D分子を発現することができる。本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。
いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の30 - 100％は、細胞当たり平均で少なくとも40 - 500000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、130000、 140000、 150000、160000、170000、 180000、 190000、 200000、 210000、220000、230000、240000、250000、 260000、 270000、280000、 290000、 300000、 310000、 320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも1000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約1000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも5000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約5000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも10000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約10000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも20000個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも30000個のNKG2D分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも50000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約50000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも60000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約60000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも70000個のNKG2D分子を発現する。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約100000個のNKG2D分子を発現することができる。本明細書で提供されるNKG2D発現gdT細胞は、細胞あたり平均で約70000から約80000個のNKG2D分子を発現することができる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKG2D発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、 4000、 4500、5000、 5500、 6000、 6500、 7000、 7500、 8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、 190000、 200000、 210000、220000、 230000、 240000、 250000、 260000、270000、 280000、290000、300000、 310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、4000000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、または500000個のNKG2D分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態では、gdT細胞の少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がNKp44を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp44分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の1 - 100％は、細胞あたり平均で400 - 200000個のNKp44分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKp44発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp44分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKp44発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp44分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態では、gdT細胞の少なくとも4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がNKp46を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp46分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp46分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の4％ - 100％は、細胞当たり平均で400 - 200000個のNKp46分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKp46発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp46分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、または80％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも10％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも20％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも40％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも50％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも60％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも70％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも80％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約10％から約80％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約10％から約70％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約10％から約60％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約20％から約80％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の約20％から約60％がCD107aを発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCD107a分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、または80％がCD107aを発現する。いくつかの実施形態において、CD107a発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、 25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、または200,000個のCD107a分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物中のgdT細胞の10-80％は、細胞あたり平均で400 - 200000個のCD107a分子を発現する。いくつかの実施形態において、CD107a発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、 15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、または200,000個のCD107a分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも0.1％がIFNγを発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも0.1％、0.2％、0.5％、0. 7％、1％、2％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、32％、35％、37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、または100％がIFNγを発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、 15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、900,000、95,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、または200,000個の IFNγ分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、IFNγ発現gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、 9500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 130000, 140000, 150000, 160000, 170000, 180000, 190000, または 200000個のIFNγ分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の0.1％～100％が、細胞当たり平均で100～200000個のIFNγ分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、IFNγ発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、 8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、 120000、 130000、 140000、150000、 160000、 170000、 180000、 190000、 または200000個の IFNγ分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の10-100％がグランザイムBを発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がグランザイムBを発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のグランザイムB分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、グランザイムB発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のグランザイムB分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の30％-100％が、細胞あたり平均で400-200000個のグランザイムB分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、グランザイムB発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、110000、 120000、 130000、 140000、 150000、160000、 170000、 180000、 190000、 または 200000個のグランザイムB分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の0-80％がTIGITを発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、または60％がTIGITを発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、100000、 110000、 120000、 130000、 140000、150000、 160000、 170000、 180000、 190000、 または200000個のTIGIT分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、TIGIT発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、 190000、 または 200000 個のTIGIT分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の30％～100％が、細胞当たり平均で400～200000個のTIGIT分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、TIGIT発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、 190000、 または 200000 個のTIGIT分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の10 - 100％がCD18を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がCD18を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCD18分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD18発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCD18分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の30-100％は、細胞当たり平均で400-200000個のCD18分子を発現する。本明細書に提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CD18発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCD18分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の5-100％がNKp30を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がNKp30を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp30分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKp30発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のNKp30分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の30 - 100％は、細胞当たり平均で400 - 200000個のNKp30分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、NKp30発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、 9500、 10000、 15000、 20000、 25000、 30000、 35000、 40000、 45000、 50000、 55000、 60000、 65000、 70000、 75000、 80000、 85000、 90000、 95000、 100000、 110000、120000、 130000、 140000、 150000、 160000、170000、 180000、 190000、 または 200000個のNKp30分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の1 - 20％がCCR7を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも1％、2％、5％、10％、12％、15％、または20％がCCR7を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCCR7分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CCR7発現gdT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCCR7分子を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の30 - 100％は、細胞あたり平均で400-200000個のCCR7分子を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、CCR7発現gdT細胞はそれぞれ、少なくとも400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、 9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、または200000個のCCR7分子を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の0.5％ - 100％がCD25を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がCD25を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の30-100％がCD38を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がCD38を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の0 - 10％がCD36を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の0.1％ - 10％がCD36を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2.5％、5％、7.5％、または10％がCD36を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の0-10％がCD103を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、または10％がCD103を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の1 - 60％がPD-1を発現する。いくつかの実施形態において、組成物におけるgdT細胞の少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、32％、35％、37％、40％、42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％または60％がPD-1を発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の30 - 100％が抗体依存性細胞傷害反応を媒介することができる。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％が抗体依存性細胞傷害応答を媒介することができる。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、少なくとも5×107、6×107、7×107、7.5×107、8×107、9×107、1×108、2×108、2.5×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、7.5×108、8×108、9×108、1×109、2×109、2.5×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、 5×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、2.5×1010、3×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、5×1010、5.5×1010、6×1010、6.5×1010、7×1010、7.5×1010、8×1010、8.5×1010、9×1010、9.5×1010、または1×1011のgdT細胞が抗体依存性細胞傷害応答を媒介することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、少なくとも70％のgdT細胞を含有する細胞の集団であって、（1）gdT細胞が細胞当たり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現し、（2）gdT細胞の少なくとも30％がCD69＋であり、または（1）および（2）の両方である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は少なくとも70％のgdT細胞を含有し、（1）gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現し、（2）gdT細胞の少なくとも30％はCD69＋である。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも500個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、または少なくとも3000個のDNAM-1分子を発現する。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、または少なくとも80％がCD69＋である。いくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％がTDEM細胞である。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、標的細胞との共培養後、(1)gdT細胞の40 - 100％がTNFαを発現するか、(2)gdT細胞の60 - 100％がCD107aを発現するか、または(1)と(2)の両方が発現する。ここで、標的細胞はがん細胞、腫瘍細胞、HIVか、他のウイルス感染細胞、真菌感染細胞または原虫感染細胞であり、あるいは標的細胞はRaji、Daudi、K562、または他の液体腫瘍であり、あるいは標的細胞はA549、SK-OV-3、BT-474、または他の固形腫瘍である。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、標的細胞と共培養した後にgdT細胞の少なくとも60％がCD107aを発現するように活性化される。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、標的細胞と共培養した後にgdT細胞の少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がCD107aを発現するように活性化される。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、標的細胞との共培養後にgdT細胞の少なくとも40％がTNF-αを発現するように活性化される。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、標的細胞と共培養した後にgdT細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％がTNF-αを発現するように活性化される。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、癌細胞との共培養後、（1）CD69＋gdT細胞の少なくとも40％がTNFαを発現する；（2）CD69＋gdT細胞の少なくとも40％がグランザイムBを発現する；又は（1）及び（2）の両方が発現する。いくつかの実施形態において、癌細胞との共培養後、CD69+ gdT細胞の少なくとも40％がTNFαを発現する。いくつかの実施形態において、癌細胞との共培養により、CD69+ gdT細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がTNFαを発現する。いくつかの実施形態において、癌細胞との共培養により、CD69+ gdT細胞の少なくとも40％がグランザイムBを発現する。いくつかの実施形態において、癌細胞との共培養により、CD69＋gdT細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がグランザイムBを発現する。
当業者であれば理解できるように、本明細書に開示され たマーカーの様々な側面の多種多様な組み合わせや順列 を用いて、本明細書に記載された細胞集団を評価することができる。このような組み合わせや順列は、本開示の範囲内として明示的に企図される。以下にいくつか例を挙げる。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、（1）細胞当たり平均で少なくとも400個のCD56分子を発現し、（2）細胞当たり平均で少なくとも400個のCD16分子を発現し、（3）細胞当たり平均で少なくとも400個のNKG2D分子を発現し、(4)細胞当たり平均で少なくとも400個のCD107a分子を発現し、(5)細胞当たり平均で最大2800個のPD-1分子；(6)細胞当たり平均で少なくとも5000個のDNAM-1分子を発現し、または(7)細胞当たり平均で少なくとも400個のCD69分子を発現し；またはそれらの組み合わせを発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞は、（1）細胞あたり平均で約30000 - 約70000個のCD69分子を発現し（2）細胞あたり平均で約60000 - 約80000個のCD56分子を発現し（3）gdT細胞は、細胞あたり平均で約80000 - 約90000個のNKG2D分子を発現し、（4）gdT細胞は、細胞あたり平均で約10000 - 約300000個のDNAM-1分子を発現し、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、（1）40 - 100％のCD69＋細胞を含有し、（2）50 - 80％のCD56＋細胞を含有し、（3）20 - 90％のCD16＋細胞を含有し、（4）90 - 100％のNKG2D＋細胞を含有し、（5）20 - 60％のCD107a＋細胞を含有し、または（6）90 - 100％のDNAM-1＋細胞を含有し、あるいはそれらの任意の組合せを含有する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、（1）CD69＋gdT細胞の少なくとも95％がDNAM-1を発現し、（2）CD69＋gdT細胞の少なくとも25％がグランザイムBを発現し、又は（1）及び（2）の両方が発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞の少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％がCD3を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞の少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％がNKG2Dを発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％がCD107aを発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、細胞は多くても25％、20％、15％、10％、または5％がPD-1を発現する。本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、（1）細胞の少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％がCD3を発現し、（2）細胞の少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％がNKG2Dを発現し、 (3) 少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の細胞がCD107aを発現し、(4) 多くとも25％、20％、15％、10％、または5％の細胞がPD-1を発現し、または(1) - (4)の任意の組み合わせを発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、（1）細胞の少なくとも40％がCD56を発現し、（2）細胞の少なくとも30％がCD16を発現し、（3）細胞の少なくとも50％がNKG2Dを発現し、（4）細胞の少なくとも30％がCD107aを発現し、または（5）細胞の多くとも25％がPD-1を発現し、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、(1)ガンマデルタT細胞の少なくとも4％が、細胞当たり少なくとも400個のNKp46分子を発現し、(2) ガンマデルタT細胞の少なくとも10％が、細胞当たり少なくとも400個のCD56分子を発現し、(3)ガンマデルタT細胞の少なくとも10％が、細胞当たり少なくとも400個のCD16分子を発現し、(4)ガンマデルタT細胞の少なくとも30％が、細胞当たり少なくとも400個のNKG2D分子を発現し、(5) ガンマデルタT細胞の少なくとも1％が、細胞当たり少なくとも400個のNKp44分子を発現し、(6) ガンマデルタT細胞の0 - 100％がCD25を発現し、(7) ガンマデルタT細胞の30 - 100％がCD38を発現し、(8) ガンマデルタT細胞の0 - 60％がPD-1を発現し、(9) ガンマデルタT細胞の5 - 100％がNKp30を発現し、(10) ガンマデルタT細胞の10 - 100％がCD18を発現し、(11) ガンマデルタT細胞の0 - 80％がTIGITを発現し、(12) ガンマデルタT細胞の30 -100％がDNAM-1を発現し、(13) ガンマデルタT細胞の0 - 10％がCD36を発現し、(14) ガンマデルタT細胞の0 - 10％がCD103を発現し、(15) ガンマデルタT細胞の1 -20 %がCCR7を発現し、(16) ガンマデルタT細胞の0 -100 %がIFNγを発現し、(17) ガンマデルタT細胞の10 -100 %がグランザイムBを発現し、(18) ガンマデルタT細胞の30 -100 %がCD3+Vδ2+を発現し、(19)ガンマデルタT細胞の30 - 100％が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)応答を媒介することができ、または(20)ガンマデルタT細胞の少なくとも80％が、細胞当たり少なくとも400個のCD69分子を発現し、または(1)-(2)に関する任意の組み合わせを発現する。
本明細書で提供される細胞集団のいくつかの実施形態において、（1）ガンマデルタT細胞の少なくとも4％がNKp46を発現し、NKp46発現ガンマデルタT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400個のNKp46分子を発現し、(2) ガンマデルタT細胞の少なくとも10％がCD56を発現し、CD56発現ガンマデルタT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400個のCD56分子を発現し、(3) ガンマデルタT細胞の少なくとも10％がCD16を発現し、CD16発現ガンマデルタT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400個のCD16分子を発現し、(4) ガンマデルタT細胞の少なくとも30％がNKG2Dを発現し、NKG2D発現ガンマデルタT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも40個のNKG2D分子を発現し、(5) ガンマデルタT細胞の少なくとも1％がNKp44を発現し、NKp44発現ガンマデルタT細胞は、細胞当たり平均で少なくとも400個のNKp44分子を発現し、または(6)ガンマデルタT細胞の少なくとも80％がCD69を発現し、CD69発現ガンマデルタT細胞は、細胞あたり平均で少なくとも400個のCD69分子を発現し、または(1)～(6)の任意の組み合わせを発現する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は単離される。いくつかの実施形態において、細胞集団はヒトまたは動物の体から単離することができる。いくつかの実施形態において、単離された細胞集団は、生体内で当該細胞集団と関連している1つ以上の細胞集団を実質的に含まない。
本明細書に開示される細胞集団は、本明細書に記載される培養方法によって得ることができる。詳細は5.1項を参照。いくつかの実施形態において、例えば、本明細書で開示される細胞集団は、細胞集団から由来されたか、単一のドナーから得られた供給源細胞集団だから、20日以内に生体外で培養されたものである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、gdT細胞についてポジティブ選択されていない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、CD69+細胞についてポジティブ選択されていない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団は、いかなるマーカーについてもポジティブ選択されていない。いくつかの実施形態において、細胞集団はフィーダー細胞（例えば、形質転換細胞）や外来抗原（例えば、微生物成分）を含まない。
5.2.1 修飾された細胞集団
本明細書で提供される細胞集団は、治療の可能性を高めるためにさらに修飾することができる。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、得られた細胞集団中の細胞の表面に標的化部分を加えることをさらに含有する。本明細書では、gdT細胞が豊富な細胞集団も提供され、gdT細胞の少なくとも10%が細胞表面に複合体化した標的化部分を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団におけるgdT細胞の10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％は、標的細胞上の生物学的マーカーに特異的結合を示す標的化部分を少なくとも含有する。
本明細書で使用する「標的化部分」という用語は、標的に対する優先的相互作用または結合を示すことによって、標的と非標的を区別することができる。いくつかの実施形態において、標的化部分は標的細胞上の生物学的マーカーに特異的結合を示す。標的化部分は、標的細胞上の生物学的マーカーなどの所望の標的に対する結合親和性を有するか、または有するように生成されることに基づいて選択され得る（US 10,744,207参照）。いくつかの実施形態において、生物学的マーカーは腫瘍抗原またはがん抗原であり得る。
本明細書で使用する「特異的に結合する」という用語は、分子が標的分子（例えば、エピトープまたはタンパク質）に対して、代替物質と比較して、より頻繁に、より迅速に、より持続的に、より高い親和性で、または上記の何らかの組み合わせで相互作用することを意味する。標的分子（例えば、抗原）と特異的に結合する標的化部分（例えば、抗体）は、例えば、免疫測定法、ELISA、Bio-Layer Interferometry（「BLI」）、SPR（例えば、Biacore）、または当業者に知られている他の技術によって同定され得る。通常、特定の反応は、バックグラウンド・シグナルまたはノイズの少なくとも2 倍であり、バックグラウンドの 10 倍を超える場合もあり得る。抗体の特異性に関する議論については、例えば、Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New Yorkの332-336ページを参照する。標的分子に特異的に結合する標的化部位は、別の分子に対する親和性よりも高い親和性で標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態において、標的分子を特異的に結合する標的化部分は、別の分子に対する親和性よりも少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍大きい親和性で標的分子を結合することができる。いくつかの実施形態において、特定の標的分子に特異的に結合する標的化部分は、本明細書中に記載されるアッセイまたは他の当技術分野で知られているアッセイを使用して結合を検出できないほど低い親和性で別の分子に結合する。異なるタンパク質のポリペプチド配列の特定の領域内の相同性および異なる分子の構造類似性により、特異的結合には複数の標的を認識する分子が含まれる可能性がある。いくつかの実施形態において、第一の標的と特異的に結合する標的化部分（例えば、抗体）は、第二の標的と特異的に結合してもしなくてもよいことが理解される。従って、「特異的結合」は必ずしも排他的結合、すなわち単一の標的への結合を必要とするわけではない（ただし、排他的結合を含むこともできる）。従って、標的化部分（例えば抗体）は、いくつかの実施形態において、1つ以上の標的に特異的に結合することができる。
本明細書で使用される「結合親和性」という用語は、一般に、標的化部分と標的分子（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総合の強さを指す。標的化部分と標的分子の結合は可逆的なプロセスであり、結合の親和性は通常、平衡解離定数(KD)として報告される。KDは、解離速度（koffまたはkd）と会合速度（konまたはka）の比である。結合対のKDが低いほど、親和性は高くなる。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、そのいずれも本開示の目的に使用することができる。いくつかの実施形態において、「KD」または「KD値」は当技術分野で知られているアッセイ、例えば、結合アッセイによって測定され得る。KDは放射性標識抗原結合アッセイ（RIA）で測定することができる (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881) 。KDまたはKD値は、例えばGatorシステム（Probe Life）、またはOctet-96システム（Sartorius AG）を用いた生物層干渉法（BLI）を使用して測定することもできる。KDまたはKD値は、例えばBIAcoreTM-2000またはBIAcoreTM-3000（BIAcore, Inc, Piscataway, NJ）を用いて、Biacoreによる表面プラズモン共鳴アッセイ（SPR）を使用して測定することもできる。いくつかの実施形態において、「特異的に結合する」とは、例えば、標的化部分が約0.1mM以下のKDで分子標的と結合することを意味する。いくつかの実施形態において、「特異的に結合する」とは、標的化部分が約10μM以下または約1μM以下のKDで標的と結合することを意味する。いくつかの実施形態において、「特異的に結合する」とは、標的化部分が約0.1μM以下、約0.01μM以下、または約1nM以下のKDで標的と結合することを意味する。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、5×10-9M以下、10-9M以下、5×10-10M以下、10-10M以下、5×10-11M以下、10-11M以下、5×10-12M以下、または10-12M以下 、もしくは10-12 Mから10-7 Mまで、10-11 Mから10-7 Mまで、10-10 Mから10-7 Mまで、10-9 Mから10-7 Mまで、10-8 Mから10-7 Mまで、10-10 Mから10-8 Mまで、10-9 Mから10-8 Mまで、10-11 Mから10-9 Mまで、あるいは10-10 Mから10-9 Mまでの範囲のKDで生物学的マーカーに結合する。いくつかの実施形態において、KDは1、5、10、11、15、20、21、25、30、31、35、40、41、45、50、51、55、60、61、65、70、71、75、80、81、85、90、91、95、100、101、105、110、111、115、120、121、 125、130、131、135、140、141、145、150、151、155、160、161、165、170、171、175、180、181、185、190、191、195、200、201、205、210、211、215、220、221、225、230、231、235、240、241、または245 nM未満である。
標的化部分を向けることができる生物学的マーカーには、細胞表面マーカーが含まれる。細胞表面マーカーの非限定的な例としては、炭水化物；糖脂質；糖タンパク質；造血系細胞上に存在するCD（分化クラスター）抗原（例えば、CD2、CD4、CD8、CD21など）；γ-グルタミルトランスプチダーゼ；接着タンパク質（ICAM-1、ICAM-2、ELAM-1、VCAM-1など）；ホルモン、成長因子、サイトカイン、その他のリガンド受容体；イオンチャネル；および免疫グロブリンμ鎖の膜結合型。いくつかの実施形態において、標的細胞に関連する生物学的マーカーは、標的細胞表面に細胞当たり約100000、50000、 10000、 5000、 1000、 750、 500、 100、 50、 またはそれ以下のコピー数で存在する。いくつかの実施形態において、標的細胞の集団における標的細胞の表面に関連する生物学的マーカーの平均密度は、細胞あたり約100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50、またはそれ以下のコピー数である。いくつかの実施形態において、生物学的マーカーは、標的細胞またはそれが存在する組織を取り囲む流体中のマーカーの濃度が、細胞が生物学的マーカーを分泌する場所など、標的細胞からより遠い流体または組織中に見出されるよりも高くなることによって、標的細胞と関連付けられる。特に興味深いのは、疾患または疾患状態に関連する生物学的マーカーであり、さらに特に興味深いのは、疾患または疾患状態に関連する標的細胞（異常細胞など）によって発現される疾患関連生物学的マーカーである。
膨大な種類の疾患関連生物学的マーカーが同定され、対応する標的化部位が作製されてきた。例えば、α-フェトタンパク質（AFP）、C反応性タンパク質（CRP）、癌抗原-50（CA-50）、卵巣癌に関連する癌抗原-125（CA-125）、乳癌に関連する癌抗原-15-3（CA15-3）、消化器癌に関連する癌抗原-19（CA-19）、癌抗原-242（CA-242）、 卵巣がんに関連するがん抗原-125（CA-125）、乳がんに関連するがん抗原-15-3（CA15-3）、消化器がんに関連するがん抗原-19（CA-19）およびがん抗原-242、カルサイノエンブリオニック抗原（CEA）、がん関連抗原（CAA）、クロモグラニンA、 上皮ムチン抗原（MC5）、ヒト上皮特異抗原（HEA）、ルイス（a）抗原、メラノーマ抗原、メラノーマ関連抗原100、25、150、ムチン様癌関連抗原、多剤耐性関連蛋白（MRPm6）、多剤耐性関連蛋白（MRP41）、 Neu癌遺伝子タンパク質（C-erbB-2）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）、P糖タンパク質（mdr1遺伝子産物）、多剤耐性関連抗原、p170、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原（PSA）、CD56、NCAM（US 10,744,207参照）に直接作用する標的部位などである。
いくつかの実施形態において、生物学的マーカーは、糖脂質、糖タンパク質、造血系統の細胞上に存在する分化クラスタ抗原、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ.鎖の膜結合型、α-フェトタンパク質、C反応性タンパク質、クロモグラニンA、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異的抗原、ルイス(a)抗原、多剤耐性関連抗原、Neu癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、P糖タンパク質、 多剤耐性関連抗原、p170、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、NCAM、ガングリオシド分子、MART-1、熱ショックタンパク質、シアリル-Tn、チロシナーゼ、MUC-1、HER-2/neu、KSA、PSMA、p53、RAS、EGF-R、VEGF、またはMAGEである。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、ペプチド、タンパク質、またはアプタマーである。いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的細胞上の生物学的マーカーに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含有し得る。生物学的マーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野で知られている任意の生物学的マーカーであり得る。いくつかの実施形態において、標的化部分は、腫瘍抗原または癌抗原に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含有し得る。本明細書で提供される方法はさらに、腫瘍抗原を細胞表面に特異的に結合させる抗体またはその抗原結合単位を添加することを含有する。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的細胞上の生物学的マーカーに特異的に結合する抗体または抗原結合単位を含有する。当技術分野で理解されるように、本明細書で使用される「抗体」という用語およびその文法的等価物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のいずれかの組み合わせなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、少なくとも１つ抗原結合部位は通常に免疫グロブリン分子の可変領域内にある。本明細書で使用する場合、この用語は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、単一ドメイン抗体（sdAbs；例えば、 ラクダ科の抗体、アルパカ抗体）、一本鎖Fv（scFv）抗体、重鎖抗体（HCAbs）、軽鎖抗体（LCAbs）、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一特異性抗体、一価抗体、および抗原結合部位を含有する任意の他の修飾免疫グロブリン分子（例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン分子）を包含する。抗体には、マウス抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体も含まれるが、これらに限定されるものではない。抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つの主要なクラスの免疫グロブリン、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）のいずれかであり、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる重鎖定数ドメインの同一性に基づく。本明細書で使用する「抗体」という用語は、特に明示しない限り、インタクトな抗体の「抗原結合単位」を含む。本明細書で使用する「抗原結合単位」という用語は、インタクトな抗体の抗原決定可変領域である部分または断片を指す。抗原結合単位の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、直鎖抗体、一本鎖抗体分子(例えば、scFv)、重鎖抗体(HCAbs)、軽鎖抗体(LCAbs)、ジスルフィド結合scFv(dsscFv)、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ミニボディ、二重可変ドメイン抗体(DVD)、単一可変ドメイン抗体(sdAbs；例えば、ラクダ抗体、アルパカ抗体)、重鎖単一可変ドメイン抗体（VHH）、抗体断片から形成される二重特異性抗体または多重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗原結合単位を含有する標的化部分は、IgGサブタイプのモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、標的化部分は癌抗原と特異的に結合する抗体または抗原結合単位である。がん抗原は、HER2/neu（ERBB2）、HER3（ERBB3）、EGFR、VEGF、VEGFR2、GD2、CTLA4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33（Siglec-3）、CD52（CAMPATH-1抗原）、CD326（EpCAM）、CA-125（MUC16）、 MMP9、DLL3、CD274（PD-L1）、CEA、MSLN（メソセリン）、CA19-9、CD73、CD205（DEC205）、CD51、c-MET、TRAIL-R2、IGF-1R、CD3、MIF、葉酸受容体α（FOLR1）、CSF1、OX-40、CD137、TfR、MUC1、CD25（IL-2R）、CD115（CSF1R）、IL1B、 CD105（エンドグリン）、KIR、CD47、CEA、IL-17A、DLL4、CD51、アンジオポエチン2、ニューロピリン-1、CD37、CD223（LAG-3）、CD40、LIV-1（SLC39A6）、CD27（TNFRSF7）、CD276（B7-H3）、Trop2、クローディン1（CLDN1）、PSMA、TIM-1（HAVcr-1）、CEACAM5、CD70、LY6E、 BCMA、CD135（FLT3）、APRIL、TF（F3）、ネクチン-4、FAP、GPC3、FGFR3、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化NK細胞受容体からなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、抗CD20抗体（例えば、リツキシマブ）を含有する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、抗HER2抗体（例えば、トラスツズマブ）を含有する。
5.2.2 ACE 細胞
いくつかの実施形態において、標的化部分はgdT細胞によって産生されない。いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的化部分に結合した第1のリンカーと細胞表面に結合した第2のリンカーとの間の相互作用を介して細胞表面に複合体化される。標的化部分に結合した第一リンカーと細胞表面に結合した第二リンカーとの間の相互作用を介して細胞表面に複合化した標的化部分を有するgdT細胞は、"ACE-gdT細胞 "と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、標的化部分と細胞の表面は、1nm - 400nmの長さで隔てられる。いくつかの実施形態において、標的化部分と細胞の表面は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、 58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、または390nmの長さで隔てられる。いくつかの実施形態において、標的化部分と細胞の表面は、1nm - 20nmまたは1nm - 33nmの長さで隔てられる。いくつかの実施形態において、標的化部分と細胞の表面は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32nmの長さで隔てられる。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的化部分に別個に結合したリンカーと細胞との間の相互作用を介して、本明細書で提供される細胞集団のgdT細胞に添加され得る。いくつかの実施形態において、第1および第2のリンカーは同じである。いくつかの実施形態において、第1のリンカーと第2のリンカーは異なる。いくつかの実施形態において、リンカーは、結合した細胞によって産生されない外因性リンカーである。
いくつかの実施形態において、第1および第2のリンカーは、互いに反応して共有結合を形成する反応性基を含有し、標的化部分は、2つの反応性基の間に形成された共有結合を介して細胞表面に複合体化される。各反応性基は第一にそれが結合している実体（標的化部分または治療薬など）と直接反応させて共有結合を形成することができる (US 10,744,207を参照)。いくつかの実施形態において、標的化部分は、結合基を介して第1のリンカーおよび／または第2のリンカーに結合した。いくつかの実施形態において、結合基はNHSエステルまたは他の活性化エステル、アルキルもしくはアシルハライド、二官能性架橋剤、あるいはマレイミド基である。
いくつかの実施形態において、リンカーは非共有結合的に相互作用する結合対であり得る。結合組のメンバーは、DNA結合ドメインと標的DNA、ロイシンジッパーと標的DNA、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン、ホルモンとホルモン受容体、レクチンと糖質、細胞膜受容体と受容体リガンド、酵素と基質、抗原と抗体、アゴニストとアンタゴニスト、ポリヌクレオチド（RNAまたはDNA）ハイブリダイゼーション配列、アプタマーとターゲット、ジンクフィンガーとターゲットDNAを含むがこれらに限定されず、互いに特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、2つのリンカーは、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、5×10-9M以下、10-9M以下、5×10-10M以下、10-10M以下、5×10-11M以下、10-11M以下、5×10-12M以下、または10-12M以下、 または10-12Mから10-7Mまで、10-11Mから10-7Mまで、10-10Mから10-7Mまで、10-9Mから10-7Mまで、10-8Mから10-7Mまで、10-10Mから10-8Mまで、10-9Mから10-8Mまで、10-11Mから10-9Mまで、または10-10Mから10-9Mまでの範囲のKDで互いに結合する。いくつかの実施形態において、第1のリンカーと第2のリンカーとの間のKDは1、5、10、11、15、20、21、25、30、31、35、40、41、45、50、51、55、60、61、65、70、71、75、80、81、85、90、91、95、100、101、105、 110、111、115、120、121、125、130、131、135、140、141、145、150、151、155、160、161、165、170、171、175、180、181、185、190、191、195、200、201、205、210、211、215、220、221、225、230、231、235、240、241、または245 nM未満である。いくつかの実施形態において、2つのリンカーは250nM未満の結合親和性（KD）を有する。
第１のリンカーと第２のリンカーとの間の相互作用は、直接的または間接的であり得る。いくつかの実施形態において、第一リンカーと第二リンカーは直接相互作用する。一般に、直接相互作用とは、中間化合物との相互作用を必要としない相互作用のことである。いくつかの実施形態において、第一および第二リンカーは間接的に相互作用する。一般に、間接的相互作用は1つ以上の中間化合物によって媒介される。中間体化合物は、一方または両方のリンカーと同じタイプでも異なるタイプでもよい。いくつかの実施形態において、第1および第2のリンカーは、中間体化合物との同時相互作用を介して間接的に相互作用する。例えば、第1リンカーと第2リンカーは同じ抗体であることができ、中間体化合物として同じ抗原（1つまたは複数のコピー）と同時に結合することによって間接的に相互作用する。
いくつかの実施形態において、第1のリンカーは第1のポリヌクレオチドであり、第2のリンカーは第2のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第1のポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらのアナログ、もしくはそれらの任意の組み合わせからなる化合物である。いくつかの実施形態において、第2のポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはそれらのアナログ、またはそれらの任意の組み合わせからなる化合物である（米国特許第10,744,207号参照）。いくつかの実施形態において、2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つは独立してDNA、RNAまたはペプチド核酸（PNA）分子、またはそれらの組み合わせであり得る（米国特許第10,744,207号参照）。いくつかの実施形態において、第1および第2のポリヌクレオチドは、一本鎖DNA（ssDNA）であり得る。
いくつかの実施形態において、（1）第1のポリヌクレオチドは4 - 500ヌクレオチドを有し、（2）第2のポリヌクレオチドは4 - 500ヌクレオチドを有し、または（1）および（2）の両方を有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドの長さは、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、300、400または500ntである。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは、20 - 200ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは、20 - 100ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは、20 - 80ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは、20 - 60ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは約20個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは約40個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のポリヌクレオチドは約60個のヌクレオチドを有する。
2つのポリヌクレオチドリンカーは、直接的または間接的に相互作用することができる。いくつかの実施形態において、第1および第2のポリヌクレオチドは、相補性を介して互いにハイブリダイズすることなどにより、直接相互作用することができる。いくつかの実施形態において、第1のポリヌクレオチドは第1の一本鎖領域を含有し、第2のポリヌクレオチドは第1の一本鎖領域に相補的な第2の一本鎖領域を含有し、標的化部分は第1の一本鎖領域と第1の一本鎖領域に相補的な第2の一本鎖領域との間の相互作用を介して細胞の表面に複合体化される。いくつかの実施形態において、第1の一本鎖領域および第2の一本鎖領域は、互いに十分にまたは完全に相補的である。いくつかの実施形態において、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドは、互いに十分にまたは完全に相補的である。例えば、2つのポリヌクレオチドは少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の相補性を共有する。いくつかの実施形態において、リンカーは約90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、またはそれ以下のGC含量を有するように設計される。いくつかの実施形態において、リンカーは約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上のGC含量を有するように選択される。いくつかの実施形態において、リンカーは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のヌクレオチドが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20回繰り返されるか、またはリンカーの末端に達するまで繰り返される配列（例えば、AAA ...、またはATAT ...）を含有するか、またはそれらからなるように設計される。いくつかの実施形態において、リンカーは約30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、またはそれ以上のTmを有するように選択される（米国特許第10，744，207号参照）。
いくつかの実施形態において、第1または／および第2のポリヌクレオチドは、以下の表から選択される配列を含有する。群からなる：20-mer poly-CA, 20-mer poly-GGTT, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, and SEQ ID NO:26. 。
いくつかの実施形態において、第1および第2のリンカーは、中間体化合物との相互作用を介して間接的に相互作用する2つのポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、中間体化合物はアダプターポリヌクレオチドである。アダプターポリヌクレオチドは、DNA、RNA、ヌクレオチド類似体、非正規ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなることができる。アダプターポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖であり得る。一般に、部分二重鎖アダプターは、1つまたは複数の一本鎖領域および1つまたは複数の二本鎖領域を含有する。二本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズした2つの別個のオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチド二重鎖」とも呼ばれる）を含有し得、ハイブリダイゼーションは1つまたは複数の3'オーバーハング、1つまたは複数の5'オーバーハング、ミスマッチおよび／または対になっていないヌクレオチドから生じる1つまたは複数のバルジ、またはこれらの任意の組み合わせを残すことができる。第1のリンカーポリヌクレオチドおよび第2のリンカーポリヌクレオチドの両方と相互作用するアダプターポリヌクレオチドは、連続したバックボーンを含有し得る。例えば、第一のリンカーポリヌクレオチドと第二のリンカーポリヌクレオチドは、アダプターポリヌクレオチドの異なる部分との相補性を介して相互作用することができる。あるいは、第1のリンカーポリヌクレオチドは二本鎖リンカーの第1の鎖にハイブリダイズすることができ、第2のリンカーポリヌクレオチドは二本鎖リンカーの第2の鎖にハイブリダイズすることができ、アダプターの第1および第2の鎖は互いにハイブリダイズして、第1および第2のリンカーが二本鎖アダプターポリヌクレオチドとの配列相補性を介して間接的に相互作用するようにできる。アダプターポリヌクレオチドは、2本以上の二本鎖アダプターポリヌクレオチド（例えば、2、3、4、5、またはそれ以上）が鎖状にハイブリダイズし、第1のリンカーポリヌクレオチドが鎖の一方の末端にハイブリダイズし、第2のリンカーポリヌクレオチドが鎖の他方の末端にハイブリダイズする場合など、不連続なバックボーンを含有することもできる（US 10,744,207参照）。
リンカーは、標的化部分（例えば、抗体）または治療単位（例えば、細胞）に、当技術分野で知られている任意の適切な手段によって結合することができる。リンカーは共有結合または非共有結合を介して結合したものである。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞の表面またはタンパク質中のネイティブ基など、部位（例えば、抗体）または治療単位のネイティブ官能基に結合したものである。細胞表面は、アミノ酸や糖など、任意の適切なネイティブな官能基を含むことができる。例えば、マレイミド、ジスルフィド、アシル化のプロセスを含む試薬を用いて、細胞表面タンパク質上のシステインと直接共有結合を形成することができる。アミド結合を形成するために、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩でアミドカップリングを用いることができる。ジアゾニウムカップリング、アシル化、アルキル化を細胞表面のチロシンに用いて、アミド結合の連結を形成することができる。オリゴヌクレオチドと細胞表面との結合である直接的な共有結合を形成するために、アミノ酸（20アミノ酸または任意の非天然アミノ酸）のいずれかを使用することができる。20種類のアミノ酸とは、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン（必須アミノ酸）、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、チロシン、非必須アミノ酸、さらにアルギニンおよびヒスチジンである。いくつかの実施形態において、ネイティブ官能基はリジン、システイン、チロシン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトリプトファンなどのアミノ酸であり得る。他の実施形態において、ネイティブな官能基はリジンである。いくつかの他の実施形態において、ネイティブ官能基は、N末端セリンまたはスレオニンであり得る（US 10,744,207参照）。
いくつかの実施形態において、リンカーは、カップリング基を用いて標的化部分または治療単位に結合し得る。例えば、カップリング基は、活性化エステル（例えば、NHSエステル、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）エステル、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）エステルなど、またはアルキルもしくはアシルハライド（例えば、-Cl、-Br、-I）であり得る。いくつかの実施形態において、活性化エステルは単離及び／又は精製される。いくつかの実施形態では、活性化エステルはインサイチュで生成および／または使用される。場合によっては、カップリング基は、ネイティブな官能基（例えば、アミノ酸）を予め修飾することなく、治療薬（例えば、治療薬として使用される細胞の表面）に直接結合することができる。例えば、リンカーは、標的化部分（例えば、抗体、アプタマー）または細胞表面上のアミノ酸との結合（例えば、アミド結合またはエステル結合）の形成により、標的化部分または治療単位に結合させることができる。いくつかの実施形態において、カップリング基はNHSエステルであり、標的化部分または治療単位上の求核ネイティブ官能基と反応し、アシル化生成物を生じる。例えば、本来の官能基はアミンであり、NHSエステルを介して結合してアミドを形成する。あるいは、ネイティブな官能基はヒドロキシル基またはスルフヒドリル基であり得、これらはNHSエステルを介して結合し、それぞれエステルまたはスルフヒドリルエステル結合を形成し得る（US 10,744,207参照）。
いくつかの実施形態において、リンカーは、二官能性架橋剤を使用して標的化部分または治療単位に結合したものであり得る。二官能性架橋剤は、ペプチド、タンパク質、高分子、半導体ナノ結晶、基質など2つの異なる機能的標的に結合できる2つの異なる反応性基を含むことができる。2つの反応性基は同一でも異なっていてもよく、チオール、カルボキシレート、カルボニル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、活性水素、エステル、スルフヒドリルまたは光反応性部位などの反応性基が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、架橋剤は、官能性末端に1つのアミン反応性基およびチオール反応性基を有し得る。他の実施形態において、二官能性架橋剤は、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルと、アミンおよびスルフヒドリル含有分子の共有結合を可能にするマレイミド基と含有するNHS-PEO-マレイミドであり得る。リンカーを標的化部分または治療単位に結合するために使用され得るヘテロ二官能性架橋剤のさらなる例には、これらに限定されないが、以下が含まれる： アミン反応性+スルフヒドリル反応性架橋剤、カルボニル反応性+スルフヒドリル反応性架橋剤、アミン反応性+光反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性+光反応性架橋剤、カルボニル反応性+光反応性架橋剤、カルボン酸反応性+光反応性架橋剤、アルギニン反応性+光反応性架橋剤（US 10,744,207参照）。
代表的な架橋剤は以下のカテゴリーに分類される（例示的な官能基を有する）： 1. アミン反応性：架橋剤はアミン（NH2）含有分子、例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、NHSエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキザール、エポキシドおよびオキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、アルキンなどにカップリングし、 2.チオール反応性：架橋剤はスルフヒドリル（SH）含有分子、例えばハロアセチルおよびアルキルハライド誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール-ジスルフィド交換試薬にカップリングし、 3.カルボキシレート反応性：架橋剤はカルボン酸（COOH）を含有分子、例えばジアゾアルカンやジアゾアセチル化合物、例えばカルボニルジイミダゾールやカルボジイミドにカップリングし、 4.ヒドロキシル反応性：架橋剤はヒドロキシル（-OH）含有分子、例えば、エポキシドおよびオキシラン、カルボニルジイミダゾール、過ヨウ素酸塩による酸化、N,N'-ジスクシンイミジルカーボネートまたはN-ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、酵素的酸化、アルキルハロゲン、イソシアネートとカップリングし、 5. アルデヒドおよびケトン反応性：架橋剤はアルデヒド(-CHO)またはケトン(R2CO)を含有分子、例えばシッフ塩基形成または還元アミノ化のためのヒドラジン誘導体にカップリングし、6. 活性水素反応性：例えばマンニッヒ縮合およびヨウ素化反応用のジアゾニウム誘導体であり、 そして7. 光反応性：例えば、アリールアジドおよびハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体（US 10,744,207参照）。
いくつかの反応性基は、複数の官能基と反応することができる。このように、各カテゴリーにはサブカテゴリーがあり、それぞれのサブカテゴリーにはさまざまな化学物質が含まれている。各カテゴリーに該当する化学物質は、例えば、Greg T Hermanson著BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996年において当該技術分野で知られており、参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な架橋剤には、ポリエチレングリコール（PEG）も含まれ、ポリエチレンオキシド（PEO）とも呼ばれる。スペーサーは、純粋な炭化水素スペーサーアームを備えた試薬の代替品として使用できる。PEGスペーサーは試薬と結合体の水溶性を向上させ、結合体の凝集の可能性を減少させ、架橋の柔軟性を増加させ、その結果スペーサー自体に対する免疫原性反応を減少させる。異なるPEG鎖長の不均一な混合物を含む典型的なPEG試薬とは対照的に、これらのPEO試薬は定義された分子量とスペーサー5アームの長さを持つ均質な化合物であり、架橋アプリケーションの最適化と特性評価に高い精度を提供する。例えば、スクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ヘキサエチレングリコール]エステルは実施例において、5mgのNHS-PEO6-マレイミドを溶解してストック溶液を作製するために使用された。(Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, Ill. 61105).
いくつかの実施形態において、結合により、カルボキシル基もしくはカルボニル基、またはそれらのアミノもしくはチオ等価物が生じ得る。このような基の例としては、ケトン、イミド、チオン、アミド、イミダミド、チオアミド、エステル、イミドエステル、チオエステル、カルバメート、尿素、チオ尿素、カーボネート、カルボニミデートおよびカルボンチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、結合はヒドラゾンまたはオキシム結合が生じ得る。いくつかの実施形態において、結合はジスルフィド結合が生じ得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、ネイティブケミカルライゲーション（NCL）法を用いて結合したものであり得る。リンカーおよびカップリング基のその他の例は、WO2010118235A1に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、リンカーはPEG領域またはNHSエステルを含有する。いくつかの実施形態において、標的化部分は、NHSエステル、活性化エステル、アルキルもしくはアシルハライド、二官能性架橋剤、またはマレイミド基を介して第1のリンカー（例えば、ポリペプチド）に結合される。
得られた細胞集団の細胞表面に標的化部分を加える例示的な手順を以下に示す。当業者であれば、これらの手順の変形および他の代替方法を採用して、細胞表面に標的部分を追加することによって本明細書に記載の細胞集団を改変できると理解するであろう。
いくつかの実施形態において、ACE-gdT細胞は、リンカーとして相補的ポリヌクレオチドを用いて調製される。例示的な方法には、以下が含まれ得る： (A）第1のssDNAリンカーをgdT細胞にカップリングさせることにより、gdT-ssDNA結合体を調製し、 (B）標的化部分に第2のssDNAリンカーをカップリングさせることにより、標的化部分-ssDNA結合体を調製し、そして（C）gdT-ssDNA結合体と標的化部分-ssDNA結合体を混合し、相補的なssDNAリンカーをハイブリダイズさせることによって、ACE-gdT細胞を調製する。
例示の目的で、ステップ(A)はステップ(a1)～(a4)を含み得る：(a1）第1のssDNA（例えば、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、またはSEQ ID NO:3）を得、(a2）第1のssDNAの5'末端をチオール基で修飾し（5'末端チオール修飾第1のssDNA）、細胞リンカーストックを得（例えば、Zimmermann, J, 2010, Nat. Protoc. 5(6):975-985; Integrated DNA Technologies社からも市販されている)、 (a3) 10-500μLの細胞リンカーストックと0.1-10μLのNHS-マレイミド（SMCC, Fisher Scientific）を混合し、1-60分間インキュベートし、そして（a4）ステップ（a3）で得られた混合物を1×106 -1×109gdT細胞と1-60分間インキュベートする。
同様に、ステップ(B)はステップ(b1)～(b4)を含み得る： (b1）第2のssDNA（例えば、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:6）を得、(b2）第2のssDNAの5'末端をチオール基で修飾し（5'末端チオール修飾第2のssDNA）、標的化部分リンカーストックを得（例えば、Zimmermann, J, 2010参照、Integrated DNA Technologiesからも市販されている）、(b3) 10-500μLの標的化部分リンカーストックと0.1-10μLのNHS-マレイミド (SMCC, Fisher Scientific) を混合し、1-60分間インキュベートし、 そして（b4）ステップ（b3）から得られた混合物を10-100μLの標的化部分ストック（例えば、リツキシマブまたはトラスツズマブ）と10分-3時間インキュベートする。
いくつかの実施形態において、ステップ（C）は相補的なssDNAリンカーが複合体を形成させるように、gdT-ssDNA結合体および100-500μLの標的化部分-ssDNA結合体を混合することを含み得る。
5.2.3 CARとTCRを発現する細胞
いくつかの実施形態において、標的化部分は、本明細書において受容体タンパク質の細胞外ドメインとして提供されるgdT細胞の表面上に外因的に発現される。受容体タンパク質は、標的化部分、細胞内ドメインおよび膜貫通配列から構成され得る細胞外ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、受容体タンパク質はキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施形態において、受容体タンパク質はT細胞受容体（TCR）である。
5.2.3.1 CARs
いくつかの実施形態において、受容体はCARであり、本明細書で提供される細胞集団中のgdT細胞はCARを発現するように改変されている。CARは、免疫細胞（T細胞など）を腫瘍表面抗原に再標的化する合成受容体である (Sadelain et al., Nat. Rev. Cancer. 3(1):35-45 (2003); Sadelain et al., Cancer Discovery 3(4):388-398 (2013))。CARは、抗原結合と免疫細胞活性化の両方の機能を提供する操作された受容体である。CARは、モノクローナル抗体などの抗体の特異性をgdT細胞のような免疫細胞に移植するために使用することができる。第1世代受容体は抗原認識を担う scFv などの抗体由来の腫瘍結合要素をT 細胞活性化を引き起こす CD3zeta または Fc 受容体シグナル伝達ドメインに結び付ける。活性化シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインを組み合わせた第2世代 CAR の出現により、化学療法抵抗性の B 細胞悪性腫瘍患者において有望な結果が得られた (Brentjens et al., Science Translational Medicine 5(177):177ra38 (2013); Brentjens et al., Blood 118(18):4817-4828 (2011); Davila et al., Science Translational Medicine 6(224):224ra25 (2014); Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368(16):1509-1518 (2013); Kalos et al., Science Translational Medicine 3(95):95ra73 (2011)) 。CARの細胞外抗原結合ドメインは通常、モノクローナル抗体（mAb）、あるいは受容体やそのリガンドから得られる。CARによる抗原結合は、細胞内ドメインの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ITAM）のリン酸化を引き起こし、細胞溶解誘導、サイトカイン分泌、増殖に必要なシグナル伝達カスケードを開始する。
いくつかの実施形態において、CARは「第1世代」、「第2世代」または「第3世代」CARであり得る。(例えば、 Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013); Jensen et al., Immunol. Rev. 257:127-133 (2014); Sharpe et al., Dis. Model Mech. 8(4):337-350 (2015); Brentjens et al., Clin. Cancer Res.13:5426-5435 (2007); Gade et al., Cancer Res. 65:9080-9088 (2005); Maher et al., Nat. Biotechnol. 20:70-75 (2002); Kershaw et al., J. Immunol. 173:2143-2150 (2004); Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol.21(2):215-223 (2009); Hollyman et al., J. Immunother. 32:169-180 (2009)参照)。
「第1世代」CARは通常、T細胞受容体鎖の細胞質/細胞内ドメインに融合される膜貫通ドメインに融合した細胞外抗原結合ドメイン、例えば、単鎖可変断片（scFv）で構成される。「第1世代」CAR は通常、内因性 T 細胞受容体 (TCR) からのシグナルの主な伝達物質である CD3ζ鎖の細胞内ドメインを持っている。「第1世代」CARはde novo抗原認識を提供し、HLAを介した抗原提示とは無関係に単一の融合分子内のCD3ζ鎖シグナル伝達ドメインを通じて、CD4+とCD8+の両方のT細胞の活性化を引き起こすことができる。「第2世代」CAR は、T 細胞などの免疫細胞を活性化できる細胞内シグナル伝達ドメインに融合したがん抗原結合ドメインと、T 細胞などの免疫細胞の効力と持続性を増強するように設計された共刺激ドメインで含有される(Sadelain et al., Cancer Discov. 3:388-398 (2013)) 。従って、CARの設計は抗原認識とシグナル伝達を組み合わせることができ、この2つの機能は生理学的にはTCRヘテロ二量体とCD3複合体という2つの別々の複合体が果たす。"第2世代 "CARは、CARの細胞質尾部に様々な共刺激分子、例えばCD28、4-1BB、ICOS、OX40などの細胞内ドメインを含み、細胞に追加のシグナルを与える。「第2世代」CARは、例えばCD28や4-1BBドメインによる共刺激と、例えばCD3ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方を提供する。「第2世代」CARがT細胞の抗腫瘍活性を向上させることが研究で示されている。"第3世代 "CARは、例えばCD28と4-1BBドメインの両方が含有されることにより、複数の共刺激を提供し、例えばCD3ζ活性化ドメインが含有されることにより、活性化を提供する。AR の「第 4 世代」は第 2 世代 CAR に基づいているが、CAR 活性化により構成的または誘導的に発現されるインターロイキン 12 (IL-12) などのタンパク質が含まれる。これらの第4世代CARで形質導入されたT細胞は、万能性サイトカイン媒介殺傷にリダイレクトされたT細胞（TRUCK）と呼ばれる。これらのCARの活性化は、エキソサイトーシス（パーフォリン、グランザイム）あるいはデスリガンド-デ受容体（Fas-FasL、TRAIL）システムなどのいくつかの相乗的なメカニズムを介して、腫瘍の殺傷を促進するために所望のサイトカインの産生と分泌を促進する。さらに、「第5世代」のCARも現在研究されている。これらは第2世代のCARに基づいているが、転写因子STAT3との結合部位を持つ切断された細胞質IL-2受容体β鎖ドメインを含んでいる。この受容体の抗原特異的活性化は、TCR（CD3ζドメインを介して）、共刺激性（CD28ドメイン）、サイトカイン（JAK-STAT3/5）シグナル伝達を同時に引き起こし、T細胞の完全な活性化と増殖を促進するために生理学的に必要な3つの相乗的シグナルを効果的に提供する。デュアル CAR、スプリット CAR、誘導性スプリット CAR など、前述の CAR の追加変形は、輸血された T 細胞の特異性と制御をさらに強化するために生成される。(Tokarew et al., British journal of cancer, 120.1 (2019): 26-37).
上述したように、CARは、CARを発現する免疫細胞で機能するシグナル伝達ドメインも含んでいる。このようなシグナル伝達ドメインは、例えば、CDζまたはFc受容体 γ から由来することができる (see Sadelain et al., Cancer Discov. 3:388-398 (2013)) 。一般に、シグナル伝達ドメインは、T細胞のような形質導入された免疫細胞において、持続性、トラフィッキング、および／またはエフェクター機能を誘導する (Sharpe et al., Dis. Model Mech. 8:337-350 (2015); Finney et al., J. Immunol. 161:2791-2797 (1998); Krause et al., J. Exp. Med. 188:619-626 (1998)) 。CDζ、またはFc受容体γの場合、シグナル伝達ドメインはそれぞれのポリペプチドの細胞内ドメイン、またはシグナル伝達に十分な細胞内ドメインの断片に対応する。
CD3ζ. 非限定的な実施形態において、CARは、免疫細胞が、例えば、Ｔ細胞を活性化または刺激することができ、CD3ζポリペプチドに由来するシグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ζの細胞内ドメインに由来するシグナル伝達ドメインを含有することができる。CD3ζは、3つの免疫受容体-チロシンベースの活性化モチーフ（ITAM）を含有し、抗原が結合した後、細胞、例えばT細胞のようなリンパ系の細胞に活性化シグナルを伝達する。CD3ζポリペプチドは、GenBank番号NP_932170（NP_932170.1、GI:37595565；下記参照）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有することができる。ある実施形態において、CD3ζポリペプチドは、以下に提供されるCD3ζポリペプチド配列のアミノ酸52-164のアミノ酸配列、またはシグナル伝達活性に十分なその断片を有する。例示的なCARは、以下に示すCD3ζポリペプチド配列のアミノ酸52-164から構成されるCD3ζポリペプチドを含有する細胞内ドメインを有する。別の例示的なCARは、以下に示すCD3ζポリペプチドのアミノ酸52から164から構成されるCD3ζを含有する細胞内ドメインを有する。さらに別の例示的なCARは、以下に示すCD3ζポリペプチドのアミノ酸52から164から構成されるCD3ζを含有する細胞内ドメインを有する。CD3ζ内のドメイン（例えば、シグナルペプチド、アミノ酸1-21；細胞外ドメイン、アミノ酸22-30；膜貫通ドメイン、アミノ酸31-51；細胞内ドメイン、アミノ酸52-164）についてはGenBank NP_932170を参照する。
1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD
61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA
121 EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR (NP_932170; SEQ ID NO:27) 。
特定の非限定的実施形態において、CARの細胞内ドメインは、少なくとも1つの共刺激性シグナル伝達ドメインをさらに含有し得る。いくつかの実施形態において、CARの細胞内ドメインは、2つの共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得る。このような共刺激シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の活性化を高めることを与える。共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28ポリペプチド、4-1BBポリペプチド、OX40ポリペプチド、ICOSポリペプチド、DAP10ポリペプチド、2B4ポリペプチド、CD27ポリペプチド、CD30ポリペプチド、CD40ポリペプチドなどから由来し得る。4-1BB、ICOSまたはDAP-10から構成する共刺激性シグナル伝達領域を含有する細胞内ドメインを含有するCARは以前に記載される（参考文献として本明細書に組み込まれる米国7,446,190参照、4-1BB、ICOSおよびDAP-10の代表的な配列も記載されている）。いくつかの実施形態において、CARの細胞内ドメインは、本明細書に開示されるように、CD28および4-1BB (Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013) 参照)、またはCD28およびOX40、もしくは共刺激リガンドの他の組み合わせなどの2つの共刺激分子から構成される共刺激シグナル伝達領域を含有し得る。
CD28. 分化クラスター28（CD28）はT細胞に発現するタンパク質で、T細胞の活性化と生存のための共刺激シグナルを提供する。CD28はCD80（B7.1）とCD86（B7.2）の受容体である。ある実施形態において、CARはCD28由来の共刺激性シグナル伝達ドメインを含有し得る。例えば、本明細書に開示されるように、CARはCD28の細胞内／細胞質ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインとして機能し得る細胞内／細胞質ドメインの少なくとも一部を含有し得る。CD28ポリペプチドは、以下に提供するGenBank番号P10747（P10747.1、GI:115973）またはNP_006130（NP_006130.1、GI:5453611）を有する配列、またはその断片に対応するアミノ酸配列を有し得る。必要であれば、細胞内ドメインに加えて、CD28配列を本発明のCARに含めることができる。例えば、CARはCD28ポリペプチドの膜貫通部分を含有し得る。ある実施形態において、CARは、CD28のアミノ酸180-220に対応するCD28の細胞内ドメインを含有するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。他の実施形態において、CARは、アミノ酸153-179に対応するCD28の膜貫通ドメインを含有するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。例示的なCARは、CD28の細胞内ドメインに対応する共刺激性シグナル伝達ドメインを含有し得る。例示的なCARは、CD28由来の膜貫通ドメインも含有し得る。従って、例示的なCARはCD28由来の2つのドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインを含有し得る。ある実施形態において、CARは、アミノ酸153-220から構成されるCD28の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、CARはCD28のアミノ酸117-220を含有する。他の例示的なCARは、CD28の膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含有し得る。ある実施形態において、CARは、以下に提供されるCD28ポリペプチドのアミノ酸153-179から構成されるCD28ポリペプチド由来の膜貫通ドメインを含有し得る。CD28内のドメイン、例えばシグナルペプチド、アミノ酸1-18；細胞外ドメイン、アミノ酸19-152；膜貫通ドメイン、アミノ酸153-179；細胞内ドメイン、アミノ酸180-220についてはGenBank NP_006130を参照する。所望であれば、特定の描写されたドメインより短いまたは長いCD28の配列をCARに含めることができると理解される。
1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD
61 SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP
121 PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR
181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (NP_006130; SEQ ID NO:28) 。
4-1BB. 4-1BBは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9とも呼ばれ、腫瘍壊死因子（TNF）のリガンドとして働き、刺激活性を持つ。ある実施形態において、CARは、4-1BB由来の共刺激性シグナル伝達ドメインを含有し得る。4-1BBポリペプチドは、GenBank番号P41273(P41273.1, GI:728739)またはNP_001552(NP_001552.2, GI:5730095)を有する配列、またはその断片に対応するアミノ酸配列を有し得る。ある実施形態において、CARは、アミノ酸214-255に対応する4-1BBの細胞内ドメイン、またはその断片を含有する共刺激性ドメインを有し得る。他の実施形態において、CARは、アミノ酸187から213に対応する4-1BBの膜貫通ドメイン、またはその断片を有し得る。例示的なCARは、以下に提供されるような4-1BBポリペプチド（例えば、NP_001552のアミノ酸214-255）を含有する細胞内ドメインを有し得る。4-1BB内のドメイン、例えばシグナルペプチド、アミノ酸1-17；細胞外ドメイン、アミノ酸18-186；膜貫通ドメイン、アミノ酸187-213；細胞内ドメイン、アミノ酸214-255についてはGenBank NP_001552を参照する。所望であれば、特定の描写されたドメインより短いまたは長い4-1BBの配列をCARに含めることができると理解される。
1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR
61 TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC
121 CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE
181 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG
241 CSCRFPEEEE GGCEL (NP_001552; SEQ ID NO:29) 。
OX40. OX40は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4前駆体あるいはCD134とも呼ばれ、TNFRスーパーファミリー受容体のメンバーである。ある実施形態において、CARはOX40由来の共刺激性シグナル伝達ドメインを含有し得る。OX40ポリペプチドは、以下に示すGenBank番号P43489（P43489.1、GI:1171933）またはNP_003318（NP_003318.1、GI:4507579）を有する配列、またはその断片に対応するアミノ酸配列を有し得る。ある実施形態において、CARは、アミノ酸236-277に対応するOX40の細胞内ドメイン、またはその断片からなる共刺激性ドメインを有し得る。他の実施形態において、CARは、OX40のアミノ酸215-235に対応するOX40の膜貫通ドメインを含有するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。OX40内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸1-28、細胞外ドメイン、アミノ酸29-214；膜貫通ドメイン、アミノ酸215-235；細胞内ドメイン、アミノ酸236-277については、GenBank NP_003318を参照する。所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いOX40の配列をCARに含めることができると理解される。
1 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ
61 NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK
121 PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ
181 GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL
241 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI (NP_003318; SEQ ID NO:30) 。
ICOS. 誘導性T細胞共刺激因子前駆体（ICOS）はCD278とも呼ばれ、活性化T細胞に発現するCD28スーパーファミリーの共刺激分子である。ある実施形態において、CARはICOS由来の共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得る。ICOSポリペプチドは、以下に示すGenBank番号NP_036224（NP_036224.1, GI:15029518）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ある実施形態において、CARは、ICOSのアミノ酸162-199に対応するICOSの細胞内ドメインを含有する共刺激性ドメインを有し得る。他の実施形態において、CARは、ICOSのアミノ酸141-161に対応するICOSの膜貫通ドメインを含有するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ICOS内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸1-20、細胞外ドメイン、アミノ酸21-140；膜貫通ドメイン、アミノ酸141-161；細胞内ドメイン、アミノ酸162-199については、GenBank NP_036224を参照する。所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまた長いICOSの配列をCARに含めることができると理解される。
1 MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ
61 ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK
121 VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY
181 MFMRAVNTAK KSRLTDVTL (NP_036224; SEQ ID NO:31) 。
DAP10. DAP10は造血細胞シグナルトランスデューサーとも呼ばれ、造血細胞において受容体の大きなファミリーと会合するシグナル伝達サブユニットである。ある実施形態において、CARは、DAP10由来の共刺激ドメインを含有し得る。DAP10ポリペプチドは、以下に示すGenBank番号NP_055081.1（GI:15826850）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ある実施形態において、CARは、アミノ酸70-93、またはその断片に対応するDAP10の細胞内ドメインを含有する共刺激性ドメインを有し得る。他の実施形態において、CARは、アミノ酸49-69、またはその断片に対応するDAP10の膜貫通ドメインを有し得る。DAP10内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸1-19；細胞外ドメイン、アミノ酸20-48；膜貫通ドメイン、アミノ酸49-69；細胞内ドメイン、アミノ酸70-93については、GenBank NP_055081.1を参照する。所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いDAP10の配列をCARに含めることができると理解される。
1 mihlghilfl lllpvaaaqt tpgersslpa fypgtsgscs gcgslslpll aglvaadava
61 sllivgavfl carprrspaq edgkvyinmp grg (SEQ ID NO:32) 。
CD27: CD27（TNFRSF7）は、ヒトCD8+およびCD4+ T細胞、NKT細胞、NK細胞サブセット、造血前駆細胞のサブセットに発現し、FOXP3+ CD4 T細胞およびB細胞サブセットに誘導される膜貫通型受容体である。これまでの研究で、CD27は積極的に共刺激シグナルを提供し、in vivoでのヒトT細胞の生存率と抗腫瘍活性を向上させることが判明している。Song and Powell; Oncoimmunology 1, no. 4 (2012): 547-549を参照する。ある実施形態において、CARはCD27由来の共刺激ドメインを含有し得る。CD27ポリペプチドは、以下に示すUniProtKB/Swiss-Prot番号：P26842.2（GI：269849546）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ある実施形態において、CARは、CD27の細胞内ドメインまたはその断片からなる共刺激性ドメインを含有し得る。他の実施形態では、CARはCD27の膜貫通ドメインまたはその断片を有し得る。所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いCD27の配列をCARに含めることができると理解される。
1 MARPHPWWLC VLGTLVGLSA TPAPKSCPER HYWAQGKLCC QMCEPGTFLV KDCDQHRKAA
61 QCDPCIPGVS FSPDHHTRPH CESCRHCNSG LLVRNCTITA NAECACRNGW QCRDKECTEC
121 DPLPNPSLTA RSSQALSPHP QPTHLPYVSE MLEARTAGHM QTLADFRQLP ARTLSTHWPP
181 QRSLCSSDFI RILVIFSGMF LVFTLAGALF LHQRRKYRSN KGESPVEPAE PCHYSCPREE
241 EGSTIPIQED YRKPEPACSP (SEQ ID NO:33) 。
CD30: CD30とそのリガンド（CD30L）は、それぞれ腫瘍壊死因子受容体（TNFR）と腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーのメンバーである。CD30は多くの点で、OX40と同様の動作をし、TCR刺激によって誘導される増殖とサイトカイン産生を促進する。Goronzy と Weyand, Arthritis research & therapy 10, no. S1 (2008): S3. ある実施形態において、CARはCD30由来の共刺激ドメインを含有し得る。CD30ポリペプチドは、以下に示すGenBank番号：AAA51947.1（GI：180096）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ある実施形態において、CARは、CD30の細胞内ドメインまたはその断片を含有する共刺激性ドメインを有し得る。別の実施形態では、CARはCD30の膜貫通ドメインまたはその断片を有し得る。所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いCD30の配列をCARに含めることができると理解される。
1 MRVLLAALGL LFLGALRAFP QDRPFEDTCH GNPSHYYDKA VRRCCYRCPM GLFPTQQCPQ
61 RPTDCRKQCE PDYYLDEADR CTACVTCSRD DLVEKTPCAW NSSRVCECRP GMFCSTSAVN
121 SCARCFFHSV CPAGMIVKFP GTAQKNTVCE PASPGVSPAC ASPENCKEPS SGTIPQAKPT
181 PVSPATSSAS TMPVRGGTRL AQEAASKLTR APDSPSSVGR PSSDPGLSPT QPCPEGSGDC
241 RKQCEPDYYL DEAGRCTACV SCSRDDLVEK TPCAWNSSRT CECRPGMICA TSATNSCARC
301 VPYPICAAET VTKPQDMAEK DTTFEAPPLG TQPDCNPTPE NGEAPASTSP TQSLLVDSQA
361 SKTLPIPTSA PVALSSTGKP VLDAGPVLFW VILVLVVVVG SSAFLLCHRR ACRKRIRQKL
421 HLCYPVQTSQ PKLELVDSRP RRSSTQLRSG ASVTEPVAEE RGLMSQPLME TCHSVGAAYL
481 ESLPLQDASP AGGPSSPRDL PEPRVSTEHT NNKIEKIYIM KADTVIVGTV KAELPEGRGL
541 AGPAEPELEE ELEADHTPHY PEQETEPPLG SCSDVMLSVE EEGKEDPLPT AASGK (SEQ ID NO:34) 。
CD40: CD40とそのリガンドであるCD40LあるいはCD154は、T細胞依存性のB細胞活性化に役立つものとして最初に同定された。この経路は現在、APCを活性化し、T細胞を活性化する可能性を高めるメカニズムとして認識されている。CD154を介したCD40刺激は、CD28-CD80/CD86の初期共刺激経路に重要なフィードバック機構を提供する。Goronzy と Weyand, Arthritis research & therapy 10, no. S1 (2008): S3. ある実施形態において、CARはCD40由来の共刺激ドメインを含有し得る。CD40ポリペプチドは、以下に示すUniProtKB/Swiss-Prot番号：P25942.1（GI：269849546）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ある実施形態において、CARは、CD40の細胞内ドメインまたはその断片を含有する共刺激性ドメインを有し得る。他の実施形態において、CARはCD40の膜貫通ドメインまたはその断片を有し得る。所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いCD40の配列をCARに含めることができると理解される。
1 MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL
61 PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV
121 LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN
181 KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD
241 DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ (SEQ ID NO:35) 。
CARの細胞外ドメインは、新生タンパク質を小胞体に誘導し、その後細胞表面に移動させるリーダーペプチドやシグナルペプチドと融合させることができる。シグナルペプチドを含むポリペプチドが細胞表面で発現されると、シグナルペプチドは一般に、小胞体におけるポリペプチドのプロセシングと細胞表面への転位過程でタンパク質分解的に除去されていることが理解される。従って、CARのようなポリペプチドは、一般にシグナルペプチドを欠く成熟タンパク質として細胞表面に発現するが、ポリペプチドの前駆体はシグナルペプチドを含む。CARがグリコシル化され、かつ／または細胞膜に固定されるためには、シグナルペプチドまたはリーダーが不可欠である。シグナル配列またはリーダーは、一般的に新しく合成されたタンパク質のN末端に存在するペプチド配列で、分泌経路への進入を指示する。シグナルペプチドは、融合タンパク質としてCARの細胞外抗原結合ドメインのN末端に共有結合している。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸MALPVTALLLPLALLLHAARP（SEQ ID NO:36 ）から構成されるCD8ポリペプチドを含有する。CD8シグナルペプチドの使用は例示的なものであることが理解される。当技術分野でよく知られているように、任意の適切なシグナルペプチドをCARに適用して、免疫細胞における細胞表面発現を提供することができる。(Gierasch Biochem.28:923-930 (1989); von Heijne, J. Mol. Biol. 184 (1):99-105 (1985) 参照)。特に有用なシグナルペプチドは、本明細書で開示されるポリペプチドのシグナルペプチドのいずれかを含め、本明細書で提供される免疫細胞で天然に発現される細胞表面タンパク質に由来し得る。従って、本明細書で提供される免疫細胞の細胞表面でCARを発現させるために、任意の適切なシグナルペプチドを利用することができる。
特定の非限定的実施形態において、CARの細胞外抗原結合ドメインは、細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結するリンカー配列またはペプチドリンカーを含有し得る。非限定的な一実施例において、リンカーは、GGGGSGGGSGGGGS（SEQ ID NO:37）に記載される配列を有するアミノ酸を含有する。
I特定の非限定的実施形態において、CARは、CARのドメインを互いに連結するスペーサー領域または配列も含有し得る。例えば、シグナルペプチドと抗原結合ドメインの間、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間、膜貫通ドメインと細胞内ドメインの間、および／または細胞内ドメイン内のドメイン間、例えば刺激性ドメインと共刺激性ドメインの間にスペーサーを含み得る。スペーサー領域は、様々なドメインと他のポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な柔軟性を持つことができ、例えば抗原結合ドメインが抗原認識を容易にするために配向に柔軟性を持つことを可能にする。スペーサー領域は、例えば、IgGのヒンジ領域、免疫グロブリンのCH2CH3（定数）領域、および／またはCD3（分化クラスタ3）の一部、もしくはスペーサーとして適切な他の配列であり得る。
CARの膜貫通ドメインは一般に、膜の少なくとも一部にまたがっている疎水性のαヘリックスを含有する。膜貫通ドメインが異なれば、受容体の安定性も異なる。抗原が認識されると、受容体が集まり、シグナルが細胞に伝達される。ある実施形態において、CARの膜貫通ドメインは、免疫細胞において天然に発現している別のポリペプチドに由来し得る。ある実施形態において、CARは、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、または免疫細胞に発現する他のポリペプチド由来の膜貫通ドメインを有し得る。任意に、膜貫通ドメインは、CARに結合した抗原から細胞内シグナル伝達および／または共刺激ドメインへのシグナル伝達において機能する限り、膜貫通ドメインは免疫細胞において天然には発現していないポリペプチドに由来することができる。ポリペプチドの膜貫通ドメインを含有するポリペプチド部分は、ポリペプチドからの付加的な配列、例えば、膜貫通ドメインのN末端またはC末端に隣接する付加的な配列、またはポリペプチドの他の領域を所望により含み得ることが理解される。
CD8. 分化クラスタ8（CD8）は、T細胞受容体（TCR）の共受容体として機能する膜貫通型糖タンパク質である。CD8は主要組織適合複合体（MHC）分子に結合し、クラスI MHCタンパク質に特異的である。ある実施形態では、CARはCD8由来の膜貫通ドメインを含有し得る。CD8ポリペプチドは、以下に示すGenBank番号NP_001139345.1（GI:225007536）を有する配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有することができる。ある実施形態において、CARは、アミノ酸183-203、またはその断片に対応するCD8の膜貫通ドメインを含有するアミノ酸配列を有し得る。ある実施形態において、例示的なCARは、CD8ポリペプチド由来の膜貫通ドメインを有する。非限定的な一実施形態では、CARは、アミノ酸183から203を含有するCD8ポリペプチド由来の膜貫通ドメインを含有することができる。さらに、CARは、以下に示すCD8ポリペプチドのアミノ酸137-182を含有するヒンジドメインを含有することができる。別の実施形態において、CARは、以下に示すCD8ポリペプチドのアミノ酸137-203を含有することができる。さらに別の実施形態において、CARは、以下に示すCD8ポリペプチドのアミノ酸137-209を含有することができる。CD8内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸1-21；細胞外ドメイン、アミノ酸22-182；膜貫通ドメイン、アミノ酸183-203；細胞内ドメイン、アミノ酸204-235については、GenBank NP_001139345.1を参照する。所望であれば、アミノ酸183-203の膜貫通ドメイン以外のCD8の配列もCARに含めることができると理解される。さらに、所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いCD8の配列をCARに含めることができると理解される。
1 malpvtalll plalllhaar psqfrvspld rtwnlgetve lkcqvllsnp tsgcswlfqp
61 rgaaasptfl lylsqnkpka aegldtqrfs gkrlgdtfvl tlsdfrrene gyyfcsalsn
121 simyfshfvp vflpakpttt paprpptpap tiasqplslr peacrpaagg avhtrgldfa
181 cdiyiwapla gtcgvlllsl vitlycnhrn rrrvckcprp vvksgdkpsl saryv (NP_001139345.1; SEQ ID NO:38) 。
CD4. T細胞表面糖タンパク質CD4とも呼ばれるクラスター分化4（CD4）は、Tヘルパー細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞などの免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ある実施形態において、CARはCD4に由来する膜貫通ドメインを含有し得る。CD4は様々なアイソフォームで存在する。所望の機能を達成するために、どのアイソフォームも選択できると理解される。例示的なアイソフォームとしては、アイソフォーム1（NP_000607.1、GI:10835167）、アイソフォーム2（NP_001181943.1、GI:303522479）、アイソフォーム3（NP_001181944.1、GI:303522485；またはNP_001181945.1、GI:303522491；またはNP_001181946.1、GI:303522569）などが含まれる。例示的なアイソフォーム配列の一つであるアイソフォーム1を以下に示す。ある実施形態において、CARは、アミノ酸397-418またはその断片に対応するCD4の膜貫通ドメインを含有するアミノ酸配列を有し得る。CD4内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸1-25；細胞外ドメイン、アミノ酸26-396；膜貫通ドメインアミノ酸、397-418；細胞内ドメイン、アミノ酸419-458についてはGenBank NP_000607.1を参照する。所望であれば、アミノ酸397-418の膜貫通ドメイン以外のCD4の配列もCARに含めることができると理解される。さらに、所望であれば、特定の定義されたドメインより短いまたは長いCD4の配列をCARに含めることができると理解される。
1 mnrgvpfrhl llvlqlallp aatqgkkvvl gkkgdtvelt ctasqkksiq fhwknsnqik
61 ilgnqgsflt kgpsklndra dsrrslwdqg nfpliiknlk iedsdtyice vedqkeevql
121 lvfgltansd thllqgqslt ltlesppgss psvqcrsprg kniqggktls vsqlelqdsg
181 twtctvlqnq kkvefkidiv vlafqkassi vykkegeqve fsfplaftve kltgsgelww
241 qaerasssks witfdlknke vsvkrvtqdp klqmgkklpl hltlpqalpq yagsgnltla
301 leaktgklhq evnlvvmrat qlqknltcev wgptspklml slklenkeak vskrekavwv
361 lnpeagmwqc llsdsgqvll esnikvlptw stpvqpmali vlggvaglll figlgiffcv
421 rcrhrrrqae rmsqikrlls ekktcqcphr fqktcspi (NP_000607.1; SEQ ID NO:39) 。
FcRγ 活性化型IgG受容体FcγRは、細胞内チロシンベースの活性化モチーフ（ITAM）を有するFc受容体共通γ鎖（FcRγ）を含む多量体複合体を形成し、その活性化が酸化バースト、サイトカイン放出、貪食、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、脱顆粒を引き起こす。ある実施形態において、CARはFcRγ由来の膜貫通ドメインを含有し得る。ある実施形態において、CARは、FcRγ由来の共刺激ドメインを含有し得る。FcRγポリペプチドは、以下に示すNCBI Reference Sequence配列：NP_004097.1（GI：4758344）を有する配列、またはその断片に対応するアミノ酸配列を有し得る。ある実施形態において、CARは、FcRγの細胞内ドメインまたはその断片を含有する共刺激性ドメインを有し得る。別の実施形態において、CARは、FcRγの膜貫通ドメインまたはその断片を有し得る。
1 MIPAVVLLLL LLVEQAAALG EPQLCYILDA ILFLYGIVLT LLYCRLKIQV RKAAITSYEK
61 SDGVYTGLST RNQETYETLK HEKPPQ (SEQ ID NO:40)
明細書で提供されるCARは、上記に開示されるような標的化部分を含み得る。本明細書で提供されるGdT細胞は、細胞内でCD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、BCMA、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、CEA、Her2、GD2、MAGE、GPC3、メソセリン、PSMA、ROR1、EGFR、MUC1、およびNY-ESO-1からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とするCARを発現し得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるgdT細胞は、CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、BCMA、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、CEA、Her2、GD2、MAGE、GPC3、メソセリン、PSMA、ROR1、EGFR、MUC1、及びNY-ESO-1からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする抗体又は抗原結合単位を有するCARを発現し得る。
例示的な目的のために、いくつかの実施形態において、CARは標的化部分として抗CD19抗体を含有する。いくつかの実施形態において、CARは標的化部分として抗BCMA抗体を含有する。いくつかの実施形態において、CARは標的化部分として抗CD22抗体を含有する。いくつかの実施形態において、CARは抗CD20抗体（例えば、リツキシマブ）を含有する。いくつかの実施形態において、CARは抗HER2抗体（例えば、トラスツズマブ）を含有する。
5.2.3.2 TCRs
いくつかの実施形態において、標的化部分は、受容体タンパク質の一部として細胞表面に外因的に発現される。いくつかの実施形態において、受容体タンパク質はTCRである。TCRは抗原特異的分子であり、抗原提示細胞（APC）や有核細胞の表面にあるMHCの産物に関連して提示された抗原性ペプチドを認識する役割を担っている。このシステムは、T細胞にTCRを介して、細胞によって発現される細胞内抗原（ウイルスタンパク質を含む）の配列全体を認識する潜在的能力を付与するもので、それらは短いペプチドに加工され、細胞内MHC分子に結合し、ペプチド-MHC複合体として細胞表面に送達される。このシステムは、外来タンパク質（例えば、変異したがん抗原やウイルスタンパク質）や異常発現したタンパク質をT細胞の標的にすることができる。(e.g., Davis と Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al.,(1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544)。
TCRとペプチド-MHC複合体の相互作用は、結合の親和性（あるいは解離速度）によって、T細胞を様々な活性化状態に誘導することができる。TCR認識プロセスは、T細胞が正常で健康な細胞と、例えばウイルスや悪性腫瘍を介して形質転換した細胞とを識別することを可能にする。TCRの多様なレパートリーを提供することで、MHC分子に結合した外来ペプチドに対する結合親和性がT細胞活性を刺激するための閾値を超えるTCRが1つ以上存在する可能性が高くなる (Manning と Kranz (1999) Immunology Today, 20, 417-422).
in vitro培養によって同定されたヒトまたはマウスのT細胞クローンから単離された野生型TCRは、結合親和性が比較的低いことが示されている。(KD = 1 - 300 μΜ) (Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544). これは、胸腺で発生する T 細胞が自己ペプチド MHC リガンドに対してネガティブに選択され (耐性誘導)、親和性が高すぎる T 細胞が削除されることが部分的に原因である (Starr et al. (2003) Annu Rev Immunol, 21 , 139-76) 。これらの比較的低い親和性を補うために、T細胞は、細胞表面分子CD4とCD8がMHC分子（それぞれクラスIIとクラスI）に結合し、シグナル伝達活性を媒介する際にTCRと相乗効果を発揮する共受容体システムを進化させてきた。CD8 はこのプロセスにおいて特に効果的であり、親和性が非常に低い (例えば、KD =300 μΜ)TCR が強力な抗原特異的活性を媒介できるようにする。
特定のペプチド-MHC複合体に対してより高い親和性を持つTCRを生成するために、指示進化を用いることができる。使用できる方法には、酵母表示法(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92)、ファージ表示法(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54)、T細胞表示法(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)などがある。この3つのアプローチはすべて、野生型TCRの通常の低い親和性を示すTCRを操作または修飾して、同族ペプチド-MHC複合体（T細胞が特異的であった元の抗原）に対する親和性を高めることが含まれる。
このように、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるgdT細胞は、細胞表面でTCRを外因的に発現することができる。いくつかの実施形態において、TCRは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれTRACおよびTRBCによってコードされる）を含有する。ヒトTRACは、UniProtKB/Swiss-Prot番号：P01848.2（Accession: P01848.2 GI: 1431906459）に対応するアミノ酸配列を有し得る。ヒトTRBCは、GenBank配列ALC78509.1（Accession: ALC78509.1 GI: 924924895）に対応するアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、TCRは、ガンマ鎖（γ）およびデルタ（δ）鎖（それぞれTRGCおよびTRDCによってコードされる）を含有する。ヒトTRGCは、UniProtKB/Swiss-Prot： P0CF51.1（アクセッション：P0CF51.1 GI：294863156）に対応するアミノ酸配列、またはUniProtKB/Swiss-Prot： P03986.2 (Accession: P03986.2 GI: 1531253869)に対応するアミノ酸配列を有し得る。ヒトTRDCは、UniProtKB/Swiss-Prot： B7Z8K6.2 (Accession: B7Z8K6.2 GI: 294863191)に対応するアミノ酸配列を有し得る。αβ鎖（またはγδ鎖）の細胞外領域は、抗原の認識と関与を担当する。抗原結合は、3つの二量体(εγ, εδ, ζζ)としてαβ (または γδ)鎖の細胞内ドメインと会合する多量体CD3複合体を介して下流のシグナル伝達を刺激する。
本明細書で提供されるTCRは、特定の抗原に結合するように遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるgdT細胞は、細胞内の腫瘍抗原を標的とする標的化部分を有するTCRを発現し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、CD19、CD20、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、BCMA、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、CEA、Her2、GD2、MAGE、GPC3、メソセリン、PSMA、ROR1、EGFR、MUC1、およびNY-ESO-1からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、標的部分は抗体または抗原結合単位であり、本明細書で提供されるgdT細胞は、CD19、CD22、CD30、CD123、CD138、CD33、CD70、BCMA、CS1、C-Met、IL13Ra2、EGFRvIII、CEA、Her2、GD2、MAGE、 GPC3、メソセリン、PSMA、ROR1、EGFR、MUC1、およびNY-ESO-1からなる群より選択される腫瘍抗原を標的化する抗体または抗原結合単位を有するTCRを発現することができる。
例示的な目的のために、いくつかの実施形態において、TCRは標的化部分として抗CD19抗体を含有する。いくつかの実施形態において、TCRは標的化部分として抗BCMA抗体を含有する。いくつかの実施形態において、TCRは標的化部分として抗CD22抗体を含有する。いくつかの実施形態において、TCRは抗CD20抗体（例えば、リツキシマブ）を含有する。いくつかの実施形態において、TCRは抗HER2抗体（例えば、トラスツズマブ）を含有する。
5.2.3.3 CAR/TCRによるgdT細胞の産生方法
本明細書で開示されるCARまたはTCRを組換え発現するように本明細書で提供されるgdT細胞を修飾することに関して、CARまたはTCRをコードする1つまたは複数の核酸を、適切な発現ベクターを使用して細胞に導入され得る。(例えば、 Rozenbaum et al., Frontiers in immunology 11 (2020): 1347). いくつかの実施形態において、上記セクション5.1に記載の培養方法を含有し、NK様特性を有するCAR gdT細胞又はTCR gdT細胞に豊富に含まれる細胞集団を製造する方法が本明細書において提供され、CAR又はTCRをコードする核酸をgdT細胞に導入することをさらに含有する。当業者であれば理解できるように、CARまたはTCRをコードする核酸は、培養中の異なる時期に導入することができる。いくつかの実施形態において、核酸は培養の初期に導入される。いくつかの実施形態において、核酸は培養の終盤に導入される。いくつかの実施形態において、CARまたはTCRをコードする核酸は、培養の4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目、20日目、21日目、22日目、23日目、24日目、25日目、26日目、27日目、28日目、29日目、または30日目に導入することができる。いくつかの実施形態において、CARまたはTCRをコードする核酸は、gdT細胞が一定期間（例えば、1-10日、1-8日、1-6日、1-4日、または1-2日）増殖した後に導入される。いくつかの実施形態において、CARまたはTCRをコードする核酸は、2日目以降、3日目以降、4日目以降、5日目以降、または6日目以降に導入することができる。 abT細胞の枯渇を伴ういくつかの実施形態において、核酸はabT細胞の枯渇の前または後にgdT細胞に導入することができる。当業者であれば、手順をさらに最適化することができるだろう。
例示の目的で、PBMCから、NK様特性を有するCAR gdT細胞に豊富に含まれる細胞集団を製造する例示的な方法を以下に提供し、細胞を16日間培養することを含有し、以下の手順を含む:
標的gdT細胞には、CARまたはTCRをコードする1つまたは複数の核酸を導入することができる。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子砲撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどがある。いくつかの実施形態において、DNAトランスフェクションおよびトランスポゾンを使用することができる。いくつかの実施形態において、スリーピングビューティーシステムまたはピギーバックシステムが使用される。(例えば、 Ivics et al., Cell, 91 (4): 501-510 (1997); Cadinanos et al. (2007) Nucleic Acids Research. 35 (12): e87). ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質系が含まれる。試験管内（in vitro）および生体内（in vivo）で送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
いくつかの実施形態において、CARまたはTCRをコードする核酸は、レトロウイルスベクターなどの適切なベクターにクローニングされ、周知の分子生物学的技術を用いて標的gdT細胞細胞に導入され得る (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) 参照)。細胞での発現、特にヒト免疫細胞での発現に適した任意のベクターを使用することができる。ベクターは、標的細胞におけるコードされた核酸の発現を提供するプロモーターのような適切な発現エレメントを含む。レトロウイルスベクターの場合、随意に応じて細胞を活性化して形質導入効率を高めることができる。(Parente-Pereira et al., J. Biol. Methods 1(2) e7 (doi 10.14440/jbm.2014.30) (2014); Movassagh et al., Hum. Gene Ther. 11:1189-1200 (2000); Rettig et al., Mol. Ther. 8:29-41 (2003); Agarwal et al., J. Virol. 72:3720-3728 (1998); Pollok et al., Hum. Gene Ther.10:2221-2236 (1998); Quinn et al., Hum. Gene Ther. 9:1457-1467 (1998) 参照; DynabeadsTM human T cell activator products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAなどの市販の方法も参照)。
ある実施形態において、ベクターはレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターであり、CARやTCRを標的細胞に導入するために採用される。CARまたはTCRを発現するように細胞を遺伝子修飾するためには、一般にレトロウイルスベクターが導入に採用される。しかしながら、任意の適切なウイルスベクターまたは非ウイルス送達系を使用することができると理解される。レトロウイルスベクターと適切なパッケージングラインの組み合わせも適しており、その場合、カプシドタンパク質はヒト細胞への感染に機能する。様々な両種指向性ウイルス産生細胞株が知られており、これにはPA12 (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-437 (1985))；PA317 (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902(1986))；CRIP (Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:6460-6464 (1988))が含まれるが、これらに限定されない。非両種指向性粒子も適しており、例えば、VSVG、RD114またはGALVエンベロープで偽タイプ化された粒子、および当技術分野で公知の他のものである (Relander et al., Mol. Therap. 11:452-459 (2005)) 。考えられる形質導入方法には、細胞と生産細胞の直接共培養 (例えば、 Bregni et al., Blood 80:1418-1422 (1992))、またはウイルス上清単独または適切な増殖因子およびポリカチオンの有無にかかわらず濃縮されたベクターストックとの培養も含まれる (例えば、Xu et al., Exp. Hemat. 22:223-230 (1994); Hughes, et al. J. Clin. Invest.89:1817-1824 (1992) 参照)。
一般に、選択されたベクターは高い感染効率と安定した統合および発現を示す。(例えば、 Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430 (1997); Kido et al., Current Eye Research15:833-844 (1996); Bloomer et al., J. Virol. 71:6641-6649 (1997); Naldini et al., Science 272:263 267 (1996); and Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.94:10319-10323 (1997) 参照)。使用できる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス由来ベクター、またはエプスタイン・バーウイルスなどのヘルペスウイルスが含まれる。(例えば、Miller, Hum. Gene Ther. 1(1):5-14 (1990); Friedman, Science 244:1275-1281 (1989); Eglitis et al., BioTechniques6:608-614 (1988); Tolstoshev et al., Current Opin. Biotechnol. 1:55-61 (1990); Sharp, Lancet 337:1277-1278 (1991); Cornetta et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.36:311-322 (1989); Anderson, Science226:401-409 (1984); Moen, Blood Cells17:407-416 (1991); Miller et al., Biotechnology7:980-990 (1989); Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990 (1993); and Johnson, Chest 107:77S- 83S (1995) 参照)。レトロウイルスベクターは特によく開発され、臨床現場で使用される(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:370 (1990); Anderson et al., U.S. Pat. No. 5,399,346)。
本明細書に開示された融合タンパク質および／または合成受容体を発現させるために特に有用なベクターには、ヒト遺伝子治療に使用されてきたベクターが含まれる。非限定的な一実施形態において、ベクターはレトロウイルスベクターである。T細胞や、人工T細胞を含む他の免疫細胞における発現のためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている(Scholler et al., Sci. Transl. Med. 4:132-153 (2012; Parente-Pereira et al., J. Biol. Methods 1(2):e7 (1-9)(2014); Lamers et al., Blood117(1):72-82 (2011); Reviere et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737 (1995) 参照) 。ある実施形態において、ベクターは、モロニーマウス白血病ベースのレトロウイルスベクターであるSGFγレトロウイルスベクターなどのSGFレトロウイルスベクターとなる。SGFベクターについては以前述される (例えば、 Wang et al., Gene Therapy 15:1454-1459 (2008) 参照) 。
本明細書で使用するベクターは、特定の宿主細胞での発現に適したプロモーターを採用している。プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであり得る。特定の実施形態において、発現ベクターのプロモーターは、造血幹細胞などの幹細胞における発現を可能にする。特定の実施形態において、発現ベクターのプロモーターは、T細胞などの免疫細胞における発現を可能にする。ベクターが標的細胞での発現に適した発現エレメントを含む限り、非ウイルスベクターも使用できる。レトロウイルスベクターのような一部のベクターは、宿主ゲノムに組み込むことができる。所望であれば、標的化統合は、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、および／またはクラスター化規則的インタースペース短パリンドロミック反復（CRISPR）、相同組換え、非相同末端接合、マイクロホモロジー媒介末端接合、ホモロジー媒介末端接合などの技術を使用して実施され得る (Gersbach et al., Nucl. Acids Res. 39:7868-7878 (2011); Vasileva, et al. Cell Death Dis. 6:e1831. (Jul 23 2015); Sontheimer, Hum. Gene Ther. 26(7):413-424 (2015); Yao et al. Cell Research volume 27, pages 801-814(2017)) 。
ベクターおよび構築物は、レポーターを含むように任意に設計することができる。例えば、ベクターはレポータータンパク質を発現するように設計することができ、これは宿主染色体に組み込まれた核酸などのベクターやベクター上に提供される核酸を含有する細胞の同定に有用である。ある実施形態において、レポーターは、融合タンパク質または合成受容体とともにバイシストロンまたはマルチシストロン発現構築物として発現され得る。例示的なレポータータンパク質には、mCherry、緑色蛍光タンパク質（GFP）、EBFP、EBFP2、Azurite、およびmKalama1などの青色蛍光タンパク質、ECFP、Cerulean、およびCyPetなどのシアン蛍光タンパク質、ならびにYFP、Citrine、Venus、およびYPetなどの黄色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質を含有するが、これらに限定されない。
アッセイは、日常的な分子生物学的技法を使用して、本明細書に開示された融合タンパク質または合成受容体の形質導入効率を決定するために使用することができる。蛍光タンパク質のようなマーカーが構築物に含まれている場合、遺伝子導入効率は、T細胞のような形質導入された（例えば、GFP+）免疫細胞の割合を定量するためのFACS分析、および／または定量的PCRによってモニターすることができる。確立された共培養系を用いて、がん抗原を発現した線維芽細胞 AAPC（対対照）が、合成受容体（例えば CAR）を発現した T 細胞のような形質導入免疫細胞からサイトカインを直接放出の可否（IL-2、 IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF の細胞上清 LUMINEX（Austin TX）アッセイ）、T細胞増殖（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）標識による）、およびT細胞生存（アネキシンV染色による）を決定することができる。CD80や4-1BBLがT細胞の生存、増殖、有効性に及ぼす影響を評価することができる。T細胞をがん抗原陽性の標的細胞による反復刺激にさらし、T細胞の増殖とサイトカイン応答が反復刺激によって同程度に保たれるか、あるいは減弱するかを決定することができる。がん抗原 CAR 構築物は、同等のアッセイ条件下で並べて比較することができる。クロム放出アッセイを用いて、複数のE:T比による細胞傷害性アッセイを実施することができる。
5.2.4 医薬組成物
本明細書には、本明細書に記載のgdT富化細胞集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、医薬組成物が対象とする疾患の治療に適した活性薬剤などの、1つ以上の追加の活性剤をさらに含有し得る。例えば、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体は、本明細書に記載の細胞集団からのADCC応答を刺激または増強することができるので、本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物と組み合わせて使用することができる。
薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または医薬組成物の他の成分と有害な相互作用をすることなく、活性薬剤とともに個体への薬物投与に適した材料を指す。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は水性製剤である。このような製剤は、典型的には溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散液、乳濁液、多相材料を含むこともできる。「水性製剤」という用語は、少なくとも50% w/wの水を含有する製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも50% w/wの水を含有する溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50% w/wの水を含有する懸濁液として定義される。本明細書で提供される医薬組成物に使用できる薬学的に許容される担体には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体としては、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのアミノ酸またはポリペプチド；抗酸化剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤などを含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結保存され、医師または患者が使用前に溶媒および／または希釈剤を添加する。そして、本明細書に記載される医薬組成物に使用できる凍結保存溶液には、例えば、DMSOが含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、実質的に汚染物質を含まない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は、検出可能なレベルの汚染物質を有さない。汚染物質には、例えばエンドトキシン、マイコプラズマ、細菌成分、フィーダー細胞（例えば形質転換細胞）などが含まれる。
本明細書で提供される医薬組成物中の細胞集団は、gdT細胞に豊富に含まれている。いくつかの実施形態において、医薬品として使用するための細胞集団は少なくとも50％のgdT、例えば60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上または99％以上のgdT細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬品として使用するための細胞集団は少なくとも80％のgdTを含有する。いくつかの実施形態において、医薬品として使用するための細胞集団は少なくとも85％のgdTを含有する。いくつかの実施形態において、医薬品として使用するための細胞集団は少なくとも90％のgdTを含有する。いくつかの実施形態において、医薬品として使用するための細胞集団は少なくとも95％のgdTを含有する。いくつかの実施形態において、細胞集団はCD69+ gdT細胞に豊富に含まれる。いくつかの実施形態において、医薬品として使用するための細胞集団は、少なくとも70％のgdT細胞を含有し、(1)gdT細胞は細胞当たり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現すし、(2)gdT細胞の少なくとも30％はCD69＋であり、又は(1)及び(2)の両方である。いくつかの実施形態において、細胞集団は少なくとも70％のgdT細胞を含有し、(1)gdT細胞は細胞当たり平均で少なくとも400個のDNAM-1分子を発現し、(2)gdT細胞の少なくとも30％はCD69+である。いくつかの実施形態において、gdT細胞は細胞あたり平均で少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2000、または少なくとも3000個のDNAM-1分子を発現する。Iいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、または少なくとも80％がCD69＋である。医薬品として使用する細胞集団のいくつかの実施形態において、gdT細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％がTDEM細胞である。
本明細書で提供される医薬組成物は、一例として、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、髄腔内）投与用に製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与用に処方される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物に含まれる担体は、非経口投与（例えば、注射または点滴による）に適している。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、静脈内投与用に処方される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物に含まれる担体は、静脈内投与に適している。
本明細書で提供される医薬組成物は、0℃以下で保存することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団または医薬組成物は、0℃以下で少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、または少なくとも1年間で保存した場合、その治療効力を維持することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団または医薬組成物は、4℃、0℃、または-20℃以下で保存される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団または医薬組成物は、生物学的材料（例えば、ヒト細胞または動物細胞）を保存するために設計された容器内で、4℃、0℃、-20℃、または-80℃の低温で保存される。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される細胞集団又は医薬組成物は、凍結培地中に製剤化され、少なくとも約1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、1年、2年、3年、又は少なくとも5年の長期保存のために、液体窒素フリーザー（-195℃）又は超低温フリーザー（-65℃、-80℃、又は-120℃）などの極低温保存装置に入れられる。凍結培地は、pHを約6.0-約6.5、約6.5-約7.0、約7.0-約7.5、約7.5-約8.0または約6.5-約7.5の間に維持する生理学的pH緩衝剤とともに、ジメチルスルホキシド（DMSO）、および／または塩化ナトリウム（NaCl）、および／またはデキストロース、および／またはデキストラン硫酸、および／またはヒドロキシエチルスターチ（HES）を含むことができる。凍結保存された細胞集団と医薬組成物は、それらの機能性を保持することができる。いくつかの実施形態において、製剤中に防腐剤は使用されない。凍結保存された細胞集団と医薬組成物は、解凍し、同種 の既製細胞製品として複数の患者に投与（例えば、点滴）する ことができる。いくつかの実施形態において、細胞集団は解凍され、投与される前に、本明細書に記載の抗体、タンパク質、ペプチド、及び／又はサイトカインによる刺激によってさらに処理される。いくつかの実施形態において、凍結保存された細胞集団は、投与される前に、本明細書に記載される標的化部分を付加するように修飾され得る。
5.3 使用方法
本明細書で開示される細胞集団は、NK様特性を有し、標的細胞を殺傷し、免疫応答を調節することができるgdT細胞が豊富する。従って、本明細書で提供される細胞集団および医薬組成物は、医薬品として使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物を被験体に投与することを含有し、それを必要とする被験体の疾患または障害を治療するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、必要とする被験体の疾患または障害を治療するため、本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物の使用が本明細書に提供される。いくつかの実施形態おいて、必要とする被験体の疾患または障害の治療用の薬剤を調製するため、本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物の使用が本明細書に提供される。
疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態を有する被験体に関連して、本明細書で使用される「治療する」という用語およびその文法的同等語は、治療される疾患もしくは障害に関連する症状、症状の重症度、および／または症状の頻度を抑制、除去、軽減、および／または改善する作用を指す。例えば、がんまたは腫瘍に関連して使用される場合、「治療する」という用語およびその文法的同等語は、がんもしくは腫瘍の重篤度を軽減する作用、またはがんもしくは腫瘍の進行を遅延させるあるいは遅らせる作用を指し、これには（a）がんもしくは腫瘍の成長を阻害する、または発育を阻止する、（b）がんもしくは腫瘍を退縮させる、または（c）がんもしくは腫瘍の存在に関連する1つまたは複数の症状を遅延させる、改善する、または最小化することが含まれる。
本明細書で使用される「投与する」という用語およびその文法的同等語は、本明細書に記載される方法またはその他当該技術分野で公知の方法により、治療薬または医薬組成物を被験体の体内に送達する、または送達させる行為を指す。治療薬とは、化合物、ポリペプチド、抗体、細胞、または細胞集団のことである。治療薬または医薬組成物の投与には、被験者の体内に送達される治療薬または医薬組成物を処方することが含まれる。
本明細書で使用される「有効量」、「治療有効量」、という用語およびそれらの文法的同等語は、単独でまたは医薬組成物の一部として、単回投与でまたは一連の投与の一部として、被験体に投与された場合に疾患、障害または病態の症状、病様、または特性に対して検出可能なプラスの効果を有することが可能な量の薬剤を被験体に投与することを指す。治療有効量は、関連する生理学的効果を測定することによって確認することができる。正確な必要量は被験者の年齢、体重、全身状態、治療される症状の重篤度、臨床医の判断などにより、被験者ごとに異なる。個々の場合における適切な「有効量」は、当業者であれば日常的な実験を使用して決定することができる。
本明細書で使用される「被験者」という用語は、あらゆる動物（例えば、脊椎動物）を指す。被験者には、特定の治療を受けることになるヒト、非ヒト霊長類、サル、イヌ、ネコ、齧歯動物などが含まれるが、これらに限定されない。被験者はヒトであり得る。被験者は哺乳類でもあり得る。被験者は家畜であり得る。被験者はペットであり得る。被験者が特定の病気や病態に罹患している場合もある。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団および医薬組成物は、癌、感染症または炎症性疾患の治療に使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団および医薬組成物は、それを必要とする被験体において免疫応答を調節するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、治療有効量を本明細書に記載の細胞集団に投与することを含有し、それを必要とする対象において癌、感染性疾患または炎症性疾患を治療する方法である。あるいは、細胞集団を含有する医薬組成物の治療有効量を投与する。
いくつかの実施形態において、疾患または障害は、癌、腫瘍、自己免疫疾患、神経細胞疾患、HIV感染、造血細胞関連疾患、代謝症候群、病原性疾患、ウイルス感染、真菌感染、原虫感染、または細菌感染であり得る。したがって、本明細書に記載の方法によって調製されたものを含む、本明細書に提供される細胞集団、ならびに本明細書に提供される医薬組成物は、例えば、がん治療、自己免疫疾患治療、神経疾患治療、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）除菌、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム治療、病原性疾患治療、ウイルス感染症治療、真菌感染症治療、原虫感染症治療、および細菌感染症治療に使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞集団および医薬組成物は、異常細胞に関連する疾患または障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、増殖亢進性疾患である。
上記のように、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物は、gdT細胞の表面に複合化された標的化部分を有するように修飾される。いくつかの実施形態において、細胞集団または医薬組成物は、異常細胞に関連する疾患または障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、異常細胞は、標的化部分が特異的に結合する抗原を発現し、標的化部分と抗原との間の相互作用は、gdT細胞のADCC応答を誘導し、その結果、疾患細胞を死滅させる。
いくつかの実施形態において、腫瘍または癌の治療における、本明細書で提供される細胞集団または医薬組成物の使用もまた提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団または医薬組成物を被験体に投与することを含有し、それを必要とする被験体の腫瘍または癌を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、腫瘍またはがんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、腫瘍またはがんは血液がん、または液体がんである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物のgdT細胞は、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含有する標的化部分を細胞表面に有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団または医薬組成物で治療され得る疾患または障害は、有棘細胞腫、有棘細胞癌、音響神経腫、有棘黒子性黒色腫、有棘細胞腫、急性好酸球性白血病、 急性リンパ芽球性白血病、急性巨核球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、 腺様嚢胞がん、腺腫、腺腫様歯原性腫瘍、副腎皮質がん、成人T細胞白血病、侵攻性NK細胞白血病、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、肺胞軟部肉腫、無芽球性線維腫、肛門がん、未分化大細胞リンパ腫、甲状腺未分化癌、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形横紋筋腫、基底細胞癌、基底様癌、B細胞白血病、B細胞リンパ腫、ベリニ管癌、胆道がん、膀胱がん、芽腫、骨がん、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、ブレナー腫瘍、気管支腫瘍、気管支肺胞がん、褐色腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明がん、カルチノイド腫瘍、がん腫、陰茎がん、原発部位不明がん、がん肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚性腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸がん、胆管がん、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛がん、脈絡叢乳頭腫、 慢性リンパ性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、透明細胞腫、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、デゴス病、皮膚線維肉腫原形腫、真皮様嚢腫、脱形成性小円形細胞腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、異形成性神経上皮腫瘍、胚性がん、 内胚葉洞腫瘍、子宮内膜がん、子宮内膜子宮体がん、子宮内膜様腫瘍、腸症関連T細胞リンパ腫、上衣芽細胞腫、上衣肉腫、赤血球白血病、食道がん, 感覚神経芽腫, ユーイングファミリー腫瘍, ユーイングファミリー肉腫, ユーイング肉腫, 頭蓋外胚細胞腫瘍, 肝外胆管がん, 乳房外パジェット病, 卵管がん, 胎内胎児, 線維腫, 線維肉腫, 濾胞性リンパ腫, 濾胞性甲状腺がん、胆嚢がん、胆嚢がん、神経節腫、神経節尿腫、胃がん、胃リンパ腫、消化管がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚芽腫、妊娠性絨毛がん、妊娠性絨毛腫瘍、骨巨細胞腫、多形膠芽腫、神経膠腫、小脳膠腫症、 グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫瘍、毛様細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、血管芽腫、血管外皮腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞がん、肝脾性T細胞リンパ腫、遺伝性乳がん卵巣がん症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンズリンパ腫、下咽頭がん、視床下部神経膠腫、 炎症性乳がん、眼内黒色腫、膵島細胞がん、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎臓がん、クラツキン腫瘍、クルーケンベルグ腫瘍、喉頭がん、喉頭がん、悪性黒子、白血病、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、麦芽リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様がん、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞がん、中皮腫、潜伏性原発を伴う転移性扁平上皮頸部がん、転移性尿路上皮がん、混合性ミュラー腫瘍、単球性白血病、口腔がん、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉症、菌状息肉症、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔がん、上咽頭がん、上咽頭がん、腫瘍、神経鞘腫、神経芽腫、神経線維腫、神経鞘腫、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚がん、非小細胞肺がん 眼腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳房パジェット病、膵臓腫瘍、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、血管周囲上皮細胞腫、咽頭がん、褐色細胞腫、中間分化松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性胸水リンパ腫、原発性肝細胞がん、原発性肝がん、原発性腹膜癌、原始神経外胚葉性腫瘍、前立腺癌、腹膜偽粘液腫、直腸癌、腎細胞癌、15番染色体上のナッツ遺伝子が関与する呼吸器癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター転移、仙尾部奇形腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫症、脂腺がん、続発性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ-ライディッヒ細胞腫瘍、性索-間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞がん、皮膚がん、小青色円形細胞腫、小細胞がん、 小細胞肺癌、小細胞リンパ腫、小腸癌、軟部肉腫、ソマトスタチノーマ、すす疣贅、脊髄腫瘍、脊髄腫瘍、脾臓辺縁帯リンパ腫、扁平上皮癌、胃癌、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、表面上皮間質腫瘍、滑膜肉腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、T細胞白血病、T細胞リンパ腫、T細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ管がん、精巣がん、 肉腫、咽頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂尿管移行細胞がん、移行細胞がん、尿道がん、尿路性器新生物、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣がん、ヴェルナー・モリソン症候群、疣状癌、視覚路神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍である。
いくつかの実施形態において、養子免疫療法における本明細書に記載の細胞集団または医薬組成物の使用が提供される。「養子免疫療法」という用語は、一般に、増殖亢進性疾患、HIVまたは他のウイルス感染性疾患、真菌感染性疾患、細菌感染性疾患、原虫感染性疾患、自己免疫疾患、神経細胞疾患、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム、または病原性疾患などの疾患の治療のために、被験体に免疫細胞を移入することを指す。
養子免疫療法は自家免疫療法、つまり細胞集団を採取した同じ患者に戻すこともできるし、免疫療法は同種免疫療法、つまりある人のgdT細胞が別の患者に移植されることもあり得る。同種異系移植が関与する場合、細胞集団には ab T 細胞が実質的に含まれない。例示的な目的のために、治療方法は以下を含むことができる：ドナー個体からソース細胞集団（例えば、PBMC）を得ること；本明細書に記載のようにソース細胞集団を培養し、NK様gdT細胞に豊富に含まれる細胞集団を産生すること；および細胞集団をレシピエント個体に投与すること。
治療される患者または被験者は、本明細書に記載される疾患または障害を有するヒト患者であり得る。いくつかの実施形態において、被検体は癌患者である。いくつかの実施形態において、対象はウイルス感染患者（例えば、CMV感染患者またはHIV感染患者）である。いくつかの実施形態において、 被験者いくつかの実施形態において、は癌または腫瘍を患い、および／またはその治療を受けている。
gdT細胞は非MHC拘束性であるため、移植された宿主を異物と認識せず、移植片対宿主病を引き起こしにくい。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞集団および医薬組成物は、「市販品」としても使用可能であり、例えば同種養子免疫療法のための任意の受容体に移植することができる。本明細書に記載されているように、本明細書に記載されている方法によって得られたgdT細胞は、活性化されていない状態でも細胞傷害性プロフィールを発現するため、腫瘍細胞や他の病原体を殺すのに効果的であると考えられる。例えば、本明細書に記載のように得られるgdT細胞は、活性化の非存在下でCD69、NKG2D、IFN-γ、TNF-α、およびグランザイムBの1つまたは複数、好ましくはすべてを発現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって得られたgdT細胞は、高レベルのNKG2Dを発現し、したがって悪性腫瘍に関連するNKG2Dリガンド（例えば、MICA）に応答する。
場合によっては、治療有効量の上記細胞集団または医薬組成物を（例えば、癌の治療のために）被験体に投与することができる。いくつかの場合において、細胞集団または医薬組成物の治療有効量には、投与量当たり約10×1012、約9×1012、約8×1012、約7×1012、約6×1012、約5×1012、約4×1012、 約3×1012、約2×1012、約1×1012、約9×1011、約8×1011、約7×1011、約6×1011、約5×1011、約4×1011、約3×1011、約2×1011、約1×1011、約9×1010、約7. 5 x 1010, 約 5 x 1010, 約 2.5 x 1010, 約 1 x 1010, 約 7.5 x 109, 約 5 x 109, 約 2.5 x 109, 約 1 x 109, 約 7.5 x 108, 約 5 x 108, 約 2.5 x 108, 約 1 x 108, 約 7. 5×107、約5×107、約2,5×107、約1×107、約7.5×106、約5×106、約2,5×106、約1×106、約7.5×105、約5×105、約2.5×105、または約1×105のgdT細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、投与量は、約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、または5×109のgdT細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、投与量は少なくとも約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、または5×109個の細胞を含有する。いくつかの実施形態において、投与量は、最大約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、または5×109のgdT細胞を含有する。
いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞集団又は医薬組成物は、治療期間にわたって約10×1012、約9×1012、約8×1012、約7×1012、約6×1012、約5×1012、 約4×1012、約3×1012、約2×1012、約1×1012、約9×1011、約8×1011、約7×1011、約6×1011、約5×1011、約4×1011、約3×1011、約2×1011、約1×1011、約9×1010、約7. 5 x 1010, 約 5 x 1010, 約 2.5 x 1010, 約 1 x 1010, 約 7.5 x 109, 約 5 x 109, 約 2.5 x 109, 約 1 x 109, 約 7.5 x 108, 約 5 x 108, 約 2.5 x 108, 約 1 x 108, 約 7. 5×107、約5×107、約2,5×107、約1×107、約7.5×106、約5×106、約2,5×106、約1×106、約7.5×105、約5×105、約2.5×105、または約1×105のgdT細胞含み得る。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞集団または医薬組成物は、治療期間にわたって少なくとも10×1012、少なくとも9×1012、少なくとも8×1012、少なくとも7×1012、少なくとも6×1012、少なくとも5×1012、少なくとも4×1012、 少なくとも 3 x 1012, 少なくとも 2 x 1012, 少なくとも 1 x 1012, 少なくとも 9 x 1011, 少なくとも 8 x 1011, 少なくとも 7 x 1011, 少なくとも 6 x 1011, 少なくとも 5 x 1011, 少なくとも 4 x 1011, 少なくとも 3 x 1011, 少なくとも 2 x 1011, 少なくとも 1 x 1011, 少なくとも 9 x 1010, 少なくとも 7. 5 x 1010, 少なくとも 5 x 1010, 少なくとも 2.5 x 1010, 少なくとも 1 x 1010, 少なくとも 7.5 x 109, 少なくとも 5 x 109, 少なくとも 2.5 x 109, 少なくとも 1 x 109, 少なくとも 7.5 x 108, 少なくとも 5 x 108, 少なくとも 2.5 x 108, 少なくとも 1 x 108, 少なくとも 7. 5×107個、少なくとも5×107個、少なくとも2,5×107個、少なくとも1×107個、少なくとも7.5×106個、少なくとも5×106個、少なくとも2,5×106個、少なくとも1×106個、少なくとも7.5×105個、少なくとも5×105個、少なくとも2.5×105個、または少なくとも1×105個のgdT細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、治療上有効な量の細胞集団または医薬組成物は、治療期間にわたって最大10×1012、最大9×1012、最大8×1012、最大7×1012、最大6×1012、最大5×1012、 最大4 x 1012、最大3 x 1012、最大2 x 1012、最大1 x 1012、最大9 x 1011、最大8 x 1011、最大7 x 1011、最大6 x 1011 、最大5 x 1011 、最大4 x 1011、最大3 x 1011、最大2 x 1011、最大1 x 1011、最大9 x 1010 、最大7. 5 x 1010、最大5 x 1010、最大2.5 x 1010、最大1 x 1010、最大7.5 x 109 、最大5 x 109、最大2.5 x 109、最大1 x 109、最大7.5 x 108、最大5 x 108、最大2.5 x 108、最大1 x 108 、最大7. 5 x 107、最大5 x 107、最大2,5 x 107、最大1 x 107、最大7.5 x 106、最大5 x 106、最大2,5 x 106、最大1 x 106、最大7.5 x 105、最大5 x 105、最大2.5 x 105、または最大1 x 105個のgdT細胞を含み得る。
いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞集団又は医薬組成物の投与量は、約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、又は5×108gdT細胞/kgを含み得る。いくつかの実施形態において、投与量は、最大約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、または5×108gdT細胞/kgを含み得る。いくつかの実施形態において、投与量は、約1.1×106 - 1.8×107gdT細胞/kgを含み得る。
いくつかの実施形態において、被験体は治療中に1回投与される。いくつかの実施形態において、被験体は治療中に少なくとも2回投与される。いくつかの実施形態において、被験体は、初回投与および1回または複数回（例えば、2、3、4、または5回）の後続投与を受ける。ある実施形態において、1回または複数回の後続投与は、前回の投与後15日未満（例えば、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、または2日）に投与される。例示の目的で、いくつかの実施形態において、被験体は、3回の投与にわたって合計約5×107個のgdT細胞を受け、例えば、被験体は、3×107個のgdT細胞の初回投与、1.5×107個のgdT細胞の2回目の投与、及び1.5×107個のgdT細胞の3回目の投与を受け、各投与は、前回の投与から４、３、または２日以内に投与される。当業者であれば、必要かつ適切な投与量を調整し、最適化することができるであろう。
いくつかの実施形態において、1つまたは複数の追加治療剤が被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞集団及び医薬組成物は、疾患の治療に通常使用される他の確立された治療法の補助として、または併用して、疾患の治療のための薬剤として使用される。追加治療薬は、本明細書で提供される細胞集団または医薬 集団を投与する前、同時、または投与後に投与することができ る。追加治療剤は、免疫療法剤、細胞傷害性剤、成長阻害剤、放射線療法剤、抗血管新生剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。追加治療薬は、対象の体内の標的（例えば、対象自身の免疫系）および／または移入されたgdT細胞に作用することができる免疫療法薬であり得る。いくつかの実施形態において、追加治療薬は腫瘍抗原を標的とする抗体である。
組成物の投与は、任意の好都合な方法で行うことができる。本明細書に記載の細胞集団および医薬組成物は、経動脈的、皮下的、皮内的、腫瘍内的、節内的、髄内的、筋肉内的、静脈内注射により、または腹腔内、例えば、皮内または皮下注射により被験体に投与することができる。gdT細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、感染部位に直接注入することができる。
範囲：本開示を通じて、本発明の様々な側面は範囲形式で示すことができる。範囲形式による説明は単に便宜的かつ簡潔にするためのものであり、本発明の範囲を融通無碍に限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1から6までのような範囲の記述は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までのような小範囲と、その範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、6などが具体的に開示されていると考えるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。
5.4 実施例
以下に提供される例は、説明のみを目的としており、別段の指定がない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
例示的な遺伝子およびポリペプチドは、GenBank番号、GI番号および／またはSEQ ID NOを参照して本明細書に記載される。当業者は、GenBank（ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）およびEMBL（embl.org/）を含むがこれらに限定されない配列ソースを参照することにより、相同配列を容易に同定できることが理解される。
試験で使用されたいくつかの培地は、「完全増殖培地」または「完全培地」と呼ばれた。完全増殖培地はRPMI-1640をベースとし、1-30vol%のHPLと100-2500IU/mL（0.0612-1.53μg/mL）のヒトIL-2を添加し、そして完全培地はRPMI-1640をベースとし、1-30vol%のHPLを添加した。後述の試験で使用したHPLとIL-2の実際の濃度は分けて示した。
5.4.1 NK様特性を有するgdT細胞を豊富に含む組成物の調製
gdT細胞（NK様性質を持つT細胞）を豊富に含む細胞集団を、図1Bに示した手順に従って調製した： 0日目に、凍結保存したヒトPBMCのバイアルを37℃の水浴中で融解した。1mLの解凍したPBMC を再懸濁し、室温で400×gで3-5分間遠心分離した。細胞を再懸濁し、再懸濁した細胞のうち3×107個を、1μMのゾレドロン酸をさらに添加した完全増殖培地（5%(v/v)のHPLおよび700IU/mL(0.4284μg/mL)のヒトIL-2）を含むG-Rex装置に移し、培養容量をG-Rex装置の最大容量まで満たした。ヒトIL-2は2日目と4日目の間に補充した。6日目に、拡大した細胞集団中のTCRα/β T細胞を抗TCRα/β-Biotinで標識し、抗Biotin MicroBeadsを用いて製造者の指示に従って枯渇させた。溶出された細胞は、細胞密度1×106個/mLで、より大きなG-Rex装置に再播種された。8日目から16日目の間に、細胞を再播種し、培地を交換し、必要に応じてヒトIL-2を補充した。培養細胞は、その後の適用のために 16 日目に収集されました。
グルコースレベルは0、2、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16日目にモニターした（Kabelitz et al, 2020. Cell Mol Immunol. 17(9):925-939)。細胞数は0、6、8、10、13、16日目にモニターされた。異なる日に得られた細胞懸濁液の各サンプルを等量のトリパンブルーと混合し、培養中の総細胞数を算出した。図2に示すように、上述の方法は、16日間で3x107個のヒトPBMCを1.55x1010個の細胞集団まで急速に増殖させた。
5.4.2 フローサイトメトリーによる細胞集団の特性解析
上記セクション5.4.1の試験で16日目に取得された細胞（以下、「16日目の得られた細胞集団」または「Ctrl-gdT細胞」と呼ぶ）を、フローサイトメトリーで特徴付けた。まず細胞を室温で400 x gで3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、1mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で洗浄した。細胞懸濁液を再度遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをDPBSで再懸濁し、0.1 mLの細胞懸濁液（5 x 105細胞）を1.5 mLのエッペンドルフチューブに分注した。次に5 x 105個の細胞を、それぞれTCRα/β、TCRVδ2、CD16、CD3、CD25、CD38、CD56、CD69、CD107a、NKG2D、PD-1、NKp30、NKp44、NKp46に対する蛍光色素結合した抗体で染色した（すべての抗体はBioLegendから購入）。組成物中の細胞の生存率は、ヨウ化プロピジウム (PI, ThermoFisher Scientific) 陰性染色によって決定した。細胞を室温で400 x gで3分間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを1mLのDPBSで再懸濁した。遠心分離を繰り返し、0.5mLのDPBS再懸濁細胞をフローサイトメトリーでTCRα/β+、TCRVδ2+、CD16+、CD3+、CD25+、CD38+、CD56+、CD69+、CD107a+、NKG2D+、PD-1+、NKp30+、NKp44+、NKp46+およびPI+集団のパーセンテージおよび/または平均蛍光強度（MFI）を分析した。結果を図3A - 3Cに示し、下表に要約する。
16日目に得られた細胞集団中のTCRVδ2+細胞を、フローサイトメトリーにより、TCRVδ2+、CD18+、TIGIT+、NKG2D+、DNAM-1+、CD36+、CD69+、PD-1+、CD103+、CCR7+、TNFα+、IFNγ+、グランザイムB+、およびCD107a+集団のパーセンテージおよび/またはMFIについてさらに分析した。具体的には、16日目の得られた細胞集団の細胞を、CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1、CD36、CD69、PD-1、CD103、CCR7、TNFα、IFNγ、グランザイムB、CD107a、CD45RA、CD27とともに、TCRVδ2に対する蛍光色素結合した抗体で共染色した（すべての抗体はBioLegend社から購入）。生存率はPI染色によって決定された。PI-TCRVδ2+ゲート集団（PI陰性細胞およびTCRVδ2陽性細胞）は、上記のマーカーのパーセンテージ/MFIでさらに解析された。パーセンテージは、PI-TCRVδ2+細胞（すなわちgdT細胞）の数を総数（分母）として計算し、それぞれのゲートマーカー陽性gdT集団におけるMFI値を求めた。結果を図4A-4Cに示し、以下に要約する。
MFI から細胞あたりの平均分子数 (「NMC」) への変換: フローサイトメトリー結果のMFI値もNMCに換算した。本明細書で使用するNMCとは、細胞表面で平均的に検出される分子の数を指す。例えば、ある細胞集団の50％が受容体Xを検出可能に発現し、各細胞が約400分子の受容体Xを発現している場合、この受容体X発現部分集団における受容体XのNMCは、200（分母として使用される全細胞数）ではなく、400（分母として使用される検出可能な発現を有する細胞数）であるべきである。MFIをNMCに変換するために、QuantumTM Simply Cellular(R)キット（Bangs Laboratories, Inc. Inc. #817) から得られた標準曲線が作成された。QuantumTM Simply Cellular(R) キットに含まれる5本のマイクロスフェア（漸増量の抗マウスIgG Fc抗体でコーティングされた4 つの集団「#1、#2、#3 および #4」、1 つは未コーティングのブランク）を使用した。10μLの#1、#2、#3、#4、およびブランクマイクロスフェアを含む抗マウスIgG Fc抗体結合マイクロスフェアを、それぞれ5μg/mLの対応する抗体と、合計0.1mLの反応容量で、室温で10分間インキュベートした。
ミクロスフェアを0.5mLのDPBSで洗浄し、細胞懸濁液を400×gで、5分間室温で遠心分離した。上清を除去し、浮遊したQSC（QuantumTM Simply Cellular(R) kit）ミクロスフェアをフローサイトメトリーで分析した。取得した各マイクロスフェアの MFI をメーカー提供の計算シート（QuickCal V2.3）の各欄に記入し、メーカーの指示に従い、各抗体の対応する標準曲線を作成した。各抗体について、標準曲線を作成した後、対応する抗体で染色された細胞集団のMFIをQuickCalシートに記入し、細胞表面上の対応する受容体の平均数に換算した。
次の MFI/NMC 変換は、例示の目的で以下に提供される。例えば、セクション5.4.2に記載された試験では、「NKG2D+ PI- TCRVδ2+細胞集団」（またはNKG2D発現gdT集団）のMFIは6193であり; QuickCalシートは、試験で使用したマウス抗ヒトNKG2D IgGの標準曲線に基づき、このMFI値を17347のNMCに変換し（図5C；xはMFIを表し、yはNMCを表す）、これは、試験では平均して 17,347 個の NKG2D 分子が細胞表面で検出されたことを意味する。特に、「NKG2D+ PI- TCRVδ2+細胞集団」がMFI値を測定する目的でゲーティングされたため、計算されたNMC値はgdT集団全体のNKG2D発現部分集団における細胞あたりのNKG2D分子の平均数に相当した。別の例として、セクション5.4.8に記載された試験では、5vol%HPL群における「PI-TCRVδ2+細胞集団」（またはgdT細胞集団）のMFIは18488であり； QuickCalシートは、試験で使用したマウス抗ヒトNKG2D IgGの標準曲線に基づき、このMFI値を61721のNMCに変換し（図5C）、これは、この試験では平均して61721個のNKG2D分子が細胞表面で検出されたことを意味する。ここで、MFI値はゲーティングされた「PI- TCRVδ2+細胞集団」で測定されたため、計算されたNMC値はgdT細胞集団全体におけるNKG2DのNMCに相当した。
以下の抗体の定常曲線を図5A-5Qに示す： PE 結合したマウス抗ヒト CD56 IgG（図 5A）、PE-Cy7 結合したマウス抗ヒト CD16 IgG（図 5B）、マウス抗ヒト NKG2D IgG（図 5C）、マウス抗ヒト NKp44 IgG（図 5 D）、マウス抗ヒトNKp46 IgG（図5E）、マウス抗ヒトIFNγ IgG（図5F）、マウス抗ヒトDNAM-1 IgG（図5G）、Alexa647結合したマウス抗ヒトグランザイムB IgG（図5 H）、マウス抗ヒトTIGIT IgG（図5I）、FITC結合したマウス抗ヒトTNFα IgG（図5J）、マウス抗ヒトCD18 IgG（図5K）、マウス抗ヒトTCRVd2 IgG（図5L）、マウス抗ヒトNKp30 IgG（図5 M）、マウス抗ヒトPD-1 IgG（図5N）、PE結合したマウス抗ヒトCD69 IgG（図5O）、APC結合したマウス抗ヒトCD107a IgG（図5P）、およびマウス抗ヒトCCR7 IgG（図5Q）。
PI-TCRVδ2+ゲート集団の表現型も解析し、ナイーブ細胞（CD45RA+CD27+）、CM細胞（CD45RA-CD27+）、EM細胞（CD45RA-CD27-）、TDEM細胞（CD45RA+CD27-）を区別した。図６に示すように、PI-TCRVδ2+ゲート細胞は主にEM細胞(CD45RA-CD27-; 26.43%)およびTDEM細胞(CD45RA+CD27-; 73.57%)に豊富した。
NK細胞傷害性受容体（CD56、CD16、DNAM-1、NKG2D、NKp44、NKp46）および脱顆粒マーカー（CD107a）の発現は、gdT細胞のNK様抗腫瘍活性を増強し、一方、gdT細胞中のEM細胞およびTDEM細胞の豊富化は、腫瘍の炎症性微小環境への局在を助ける。CD69発現はgdT細胞の活性化を示す。従って、本明細書に記載の培養方法は、16 日目に得られた細胞集団の細胞における（1）NK細胞傷害性受容体（CD56、CD16、DNAM-1、NKG2D、NKp44およびNKp46）、（2）脱顆粒マーカー（CD107a）、および（3）活性化マーカー（CD69）の発現の増加で示されるように、PBMC 内でNK様特性を有するgdT細胞を迅速かつ選択的に増殖させた。
5.4.3 ACE-gdT細胞の調製
ACE-gdT-CD20細胞の調製： ACE-gdT-CD20細胞は、相補的な細胞リンカーとリツキシマブリンカーを用いて、Ctrl-gdT細胞（セクション5.4.1に記載したように調製した16日目の得られた細胞集団）にリツキシマブ（市販の抗CD20抗体）を結合させることにより得られ、以下のステップを含んでいた：
(A’) 細胞リンカーを調製し、細胞リンカー（第1のssDNA）をCtrl-gdT細胞に結合させて、gdT-ssDNA結合体を調製するステップ;
(B’) リツキシマブリンカーを調製し、リツキシマブリンカー（第1のssDNAに相補的な第2のssDNA）をリツキシマブに結合して、リツキシマブ-ssDNAコンジュゲートを調製するステップ；および
(C’) 相補的なssDNAリンカーをハイブリダイズさせることにより、ACE-gdT-CD20細胞を調製するため、gdT-ssDNA 結合体と100-500μLのリツキシマブ-ssDNA 結合体を混合するステップ。
ステップ(A')には以下のステップ(a1')～(a4')が含まれる:
(a1'）第1のssDNAが得られた（SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、またはSEQ ID NO:3）;
(a2'）第1のssDNAの5'末端をチオール基で修飾され（5'末端チオール修飾第1のssDNA）、細胞リンカーストックを得られた（例えば、Zimmermann, J, 2010を参照；Integrated DNA Technologiesからも市販されている）;
(a3'）10-500μLの細胞リンカーストックおよび0.1-10μLのNHS-マレイミド（SMCC、Fisher Scientificから市販）を混合し、1-60分間インキュベートした；そして
(a4'）ステップ（a3'）で得られた混合物を1×106～1×109個のCtrl-gdT細胞と混合し、1～60分間インキュベートした。
ステップ(B')には以下のステップ(b1')～(b4')が含まれる:
(b1'）第2のssDNAが得られた（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:6）;
(b2'）第2のssDNAの5'末端をチオール基で修飾され（5'末端チオール修飾第2のssDNA）、リツキシマブリンカーストックを得られた（例えば、Zimmermann, J, 2010を参照；Integrated DNA Technologiesからも市販されている）;
(b3'）10-500μLのリツキシマブリンカーストックおよび0.1-10μLのNHS-マレイミド（SMCC、Fisher Scientificから市販されている）を混合し、1-60分間インキュベートし；そして
(b4'）ステップ（b3'）で得られた混合物を10-100μLのリツキシマブストック（リツキサン(R)）と混合し、10分～3時間インキュベートした。
ACE-gdT-HER2細胞の調製： ACE-gdT-HER2細胞は、相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを用いて、Ctrl-gdT細胞（セクション5.4.1に記載されているように調製された16日目の結果細胞集団）にトラスツズマブ（市販の抗HER2抗体）を結合させることにより得られたが、これには以下のステップが含まれていた:
(A''）細胞リンカーを調製し、細胞リンカー（第1のssDNA）をCtrl-gdT細胞に結合させて、gdT-ssDNA結合体を調製するステップ;
(B''）トラスツズマブリンカーを調製し、トラスツズマブリンカー（第1のssDNAに相補的な第2のssDNA）をトラスツズマブに結合して、トラスツズマブ-ssDNA結合体を調製するステップ；および
(C''）相補的なssDNAリンカーをハイブリダイズさせることにより、ACE-gdT-HER2細胞を調製するため、gdT-ssDNA 結合体と100-500μLのトラスツズマブ-ssDNA 結合体を混合するステップ。
ステップ（A''）には以下のステップ（a1''）～（a4''）が含まれる:
(a1''）第1のssDNAが得られた（SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、またはSEQ ID NO:3）;
(a2''） 第1のssDNAの5'末端をチオール基で修飾され（5'末端チオール修飾第1のssDNA）、細胞リンカーストックを得られた（例えば、Zimmermann, J, 2010を参照；Integrated DNA Technologiesからも市販されている）;
(a3''）10-500μLの細胞リンカーストックおよび0.1-10μLのNHS-マレイミド（SMCC、Fisher Scientificから市販）を混合し、1-60分間インキュベートした；そして
(a4''）ステップ（a3''）で得られた混合物を1×106～1×109個のCtrl-gdT細胞と混合し、1-60分間インキュベートした。
ステップ（B''）には以下のステップ（b1''）～（b4''）が含まれる:
(b1''）第2のssDNAが得られた（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:6）;
(b2''）第2のssDNAの5'末端をチオール基で修飾され（5'末端チオール修飾第2のssDNA）、トラスツズマブリンカーストックを得られた（例えば、Zimmermann, J, 2010を参照；Integrated DNA Technologiesからも市販されている）;
(b3''）10-500μLのトラスツズマブリンカーストックおよび0.1～10μLのNHS-マレイミド（SMCC、Fisher Scientificから市販されている）を混合し、1-60分間インキュベートし；そして
(b4'）ステップ（b3''）で得られた混合物を10-100μLのトラスツズマブストックと混合し、10分-3時間インキュベートする。
5.4.4 フローサイトメトリーによるACE-gdT細胞の特性解析
上記セクション5.4.1で述べた16日目の結果細胞集団を2つの群に分けた: 一つは、対照群（Ctrl-gdT）として使用し、もう一つは、上記セクション5.4.3に記載の方法を用いて、ACE-gdT-CD20群を調製するためにさらに修飾した。簡単に説明すると、各群50万個の細胞を、それぞれTCRα/β、TCRVδ2、CD16、CD3、CD25、CD38、CD56、CD69、CD107a、NKG2D、PD-1、NKp30、NKp44、NKp46に対する蛍光色素結合した抗体で個別に染色した。組成物中の細胞の生存率は、PI陰性染色によって決定された。細胞を室温で400 x gで3分間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを1mLのDPBSで再懸濁した。遠心分離を繰り返し、0.5mLのDPBS再懸濁細胞をフローサイトメトリーでTCRα/β+、TCRVδ2+、CD16+、CD3+、CD25+、CD38+、CD56+、CD69+、CD107a+、NKG2D+、PD-1+、NKp30+、NKp44+、NKp46+およびPI+集団のパーセンテージについて分析した。結果を図7A～7Cに示し、以下に要約する。
TCRVδ2+ gdT 細胞: 各群のTCRVδ2+細胞をさらにフローサイトメトリーでTCRVδ2+、CD18+、TIGIT+、NKG2D+、DNAM-1+、CD36+、CD69+、PD-1+、CD103+、CCR7+、TNFα+、IFNγ+、グランザイムB+、CD107a+、CD45RA、CD27集団のパーセンテージおよび/またはMFIを解析した。対照群またはCryo-ACE-gdT-CD20群における細胞を、TCRVδ2 CD18、TIGIT、NKG2D、DNAM-1、CD36、CD69、PD-1、CD103、CCR7、TNFα、IFNγ、グランザイムB（GZMB）、CD107a、CD45RAおよびCD27に対する蛍光色素結合した抗体で共染色した。生存率はPI染色によって決定された。
図8A-8Cに示され、以下に要約されるように、対照群とCryo-ACE-gdT-CD20群の両方におけるPI-TCRVδ2+ゲート集団は、パーセンテージ/MFIでさらに解析された。パーセンテージは、PI-TCRVδ2+細胞（すなわちgdT細胞）の数を総数（分母）として計算し、それぞれのゲートマーカー陽性gdT集団におけるMFI値を求めた。
PI-TCRVδ2+ゲート集団の表現型も分析し、ナイーブ細胞（CD45RA+CD27+）、CM細胞（CD45RA-CD27+）、EM細胞（CD45RA-CD27-）、およびTDEM細胞（CD45RA+CD27-）を区別した。図9に示すように、対照群のPI-TCRVδ2+ゲート細胞は、主にEM細胞（CD45RA-CD27-；26.43％）とTDEM細胞（CD45RA+CD27-；73.57％）集団に富んだ。一貫して、ACE-gdT-CD20群のPI-TCRVδ2+ゲート細胞は、主にEM細胞（CD45RA-CD27-；21.47％）とTDEM細胞（CD45RA+CD27-；78.53％）に富んでいた。
5.4.5 Ctrl-gdT細胞およびACE-gdT-HER2細胞の細胞傷害性
xCELLigence Real Time Cell Analysis System (xCELLigence RTCA system, ACEA Biosciences Inc.)を用いて、標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害性を測定した。96ウェルxCELLigence E-Platesを使用し、ウェルをエフェクター細胞単独コントロールウェル（ESA）、標的細胞単独コントロールウェル（TSA）、実験ウェル、標的細胞全溶解コントロールウェル（TML）に分けた。上記のように調製したACE-gdT-HER2およびCtrl-gdT細胞集団をエフェクター細胞として使用し、接着性卵巣がん細胞株であるSK-OV-3細胞株（HTB-77、ATCC）を標的細胞として使用した。
2×104個のSK-OV-3細胞をTSAウェル、実験ウェル、TMLウェルにそれぞれ播種し、2-4時間静置した。 標的細胞の細胞指数（CI）が0.5に達した時点で、E:T比（標的細胞数に対するエフェクター細胞数の比）が1、2、5または10になるようにエフェクター細胞（ACE-gdT-HER2またはCtrl-gdT）をESAウェルと実験ウェルに加えた。TML細胞に溶解バッファーが添加し、ウェル内の標的細胞がすべて溶解されたため、ウェルのCIを測定した。TSAウェルにはエフェクター細胞も溶解バッファーも添加しなかった。
コントロール-gdT細胞も、異なる濃度（10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL）のトラスツズマブ存在下で播種した。これらのサンプルのE:T比は2であった。
xCELLigence E-PlateをxCELLigence Real Time Cell Analysis Systemに18時間入れ、CI（37℃、5％炭酸ガス）の変化をリアルタイムで検出した。xCELLigence E-Plateの底面に付着した標的細胞が多いほど、検出されたCIは高くなる。したがって、CIは、以下の式に従って、実験ウェルで溶解された標的細胞のパーセンテージを換算するために使用された: 溶解した標的細胞のパーセンテージ (%) = {1 - [(実験ウェルのCI - ESAウェルのCI - TMLウェルのCI) ÷ (TSAウェルのCI - TMLウェルのCI)]}× 100%
図10Aに示すように、トラスツズマブ単独ではいかなる濃度でも標的細胞SK-OV-3を死滅させなかったが、トラスツズマブ存在下では、標的細胞SK-OV-3の最大22％がコントロールgdT細胞によって溶解された。この結果は、本明細書に開示されるように調製された細胞集団の細胞傷害性を実証し、これは抗体の存在に用量依存性であり、コントロールgdT細胞がADCC反応を媒介することを実証した。図10Bにさらに示すように、ACE-gdT-HER2細胞はE/Tが1、2、5および10でそれぞれ0％、18％、68％および92％のSK-OV-3を死滅させたが、コントロール-gdT細胞はE/Tが1、2、5および10でそれぞれ0％、0％、15％および58％のSK-OV-3を死滅させた。この結果は、ACE-gdT-HER2細胞で観察されたように、SK-OV-3に対するCtrl-gdT 細胞の細胞傷害性がトラスツズマブ結合によりさらに増強されたことを示した。
5.4.6 Ctrl-gdT細胞およびACE-gdT-CD20細胞の細胞傷害性
CD20+ヒトリンパ腫細胞株Daudi、CD20+ヒトリンパ腫細胞株Raji、およびCD20-ヒトリンパ腫細胞株K562はATCCから購入し、標的細胞として使用した。標的細胞を遠心沈殿し（400 x g、3分間）、1mLのRPMI増殖培地で再懸濁し、2 x 106cells/mlに調整した。600万個の標的細胞を、製造元の指示に従い、5μMの蛍光色素カルボキシフルオレセイン・スクシンイミジルエステル（CFSE、ThermoFisher Scientific社製）を使用してDPBS中で室温で10分間染色した。染色した細胞をDPBSで2回洗浄し、24ウェル細胞培養プレートに播種した（1ウェル当たり100万個）。セクション5.4.3に記載されているように調製したACE-gdT-CD20（リツキシマブ結合gdT細胞）およびCtrl-gdT細胞集団をエフェクター細胞として使用した。
CFSE 染色した標的細胞 (2x105) を、24 ウェル細胞培養プレート中、E:T 比 2:1、5:1 または 10:1 でエフェクター細胞と 37℃、5% CO2 で 4 時間共培養した。細胞培養物を回収し、1:500希釈のPIで染色した。細胞傷害性はフローサイトメトリーにより測定した: 溶解した標的細胞のパーセンテージ (%) = 10000個のゲーティングされたCFSE+標的細胞におけるPI+細胞の数。
結果（溶解した標的細胞のパーセンテージ）を図11A-11Cに示す。図11Aの棒グラフは、ＣＤ２０陽性ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉを死滅させるため、異なるエフェクター（E）とターゲット（T）の比率でコントロールｇｄＴ細胞とリツキシマブ結合ｇｄＴ細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す。CD20陽性Raji-Lucモデルにおいて、対照群のコントロールgdT細胞（Ctrl-gdT）がE:T比2:1～10:1で発揮した細胞傷害性は21.95±0.21%～43.13±1.29%であったのに対し、ACE-gdT-CD20細胞は標的細胞の39.14±0.86%～69.38±2.77%を死滅させた。図11Bの棒グラフは、CD20陽性ヒトリンパ腫細胞株Daudiを死滅させるため、異なるエエフェクター(E)と標的(T)の比率でコントロールgdT細胞とACE-gdT-CD20細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す。CD20陽性Daudi-Lucモデルにおいて、対照群のコントロールgdT細胞（Ctrl-gdT）がE:T比2:1～10:1で発揮した細胞傷害性は19.68±1.38%～43.66±0.66%であったのに対し、ACE-gdT-CD20細胞は41.19±0.6%～71.22±1.42%の標的細胞を死滅させた。図11Cの棒グラフは、CD20陰性ヒトリンパ腫細胞株K562を死滅させるため、異なるエエフェクター(E)と標的(T)の比率でコントロールgdT細胞とリツキシマブ結合したgdT細胞との間の細胞傷害機能の比較を示す。CD20陰性K562ヒトリンパ腫細胞株モデルにおいて、対照群のコントロールgdT細胞（Ctrl-gdT）がE:T比2:1～10:1の範囲で標的細胞の9.31±0.80%～44.12±1.41%を死滅させ、ACE-gdT-CD20細胞は同範囲のE:T比で標的細胞の11.59±1.76%～49.93±2.31%を死滅させた。上記のように、Ctrl-gdT細胞はすべての腫瘍細胞株に対して用量依存的な細胞傷害性を示したが、ACE-gdT-CD20細胞集団はCD20+腫瘍細胞株に対して増強された細胞傷害性を示した。
5.4.7 凍結保存中の細胞傷害性維持
後述の試験は、凍結保存が本明細書に開示された細胞集団の細胞毒性に影響を与えないことを確認するためのものであった。標的細胞（Daudi細胞とRaji細胞）は上記のように調製した。本試験で使用したエフェクター細胞には、(1) フレッシュな16日目の産生細胞集団、(2) セクション5.4.3に記載の方法で調製したフレッシュなACE-gdT-CD20細胞集団、(3) 凍結保存し解凍した16日目の産生細胞集団、(4) 凍結保存し解凍したACE-gdT-CD20細胞集団が含まれる。3人の異なるドナー（ドナー1、2、3）に由来するPBMC細胞を並行実験で使用した。
CFSE染色した標的細胞（2x105）を、24ウェル細胞培養プレートのウェル内でE:T比2:1、5:1および10:1でエフェクター細胞と37℃、5%CO2の条件下で4時間共培養した。細胞培養物を回収し、1:500希釈のPIで染色した。細胞傷害性はフローサイトメトリーにより測定した: 溶解した標的細胞のパーセンテージ (%) = 10000個のゲーティングされたCFSE+標的細胞中のPI+細胞数。
結果を図12A-12C（Rajiモデルの新鮮細胞集団）、図13A-13C（Daudiモデルの新鮮細胞集団）、図14A-14C（Rajiモデルの凍結保存細胞集団）、図15A-15C（Daudiモデルの凍結保存細胞集団）に示し、以下に要約する。パネルA、B、Cはそれぞれドナー1、2、3の結果に対応する。Daudi-Lucモデルでは、フレッシュCtrl-gdT細胞（フレッシュ16日培養PBMC細胞）がE:T比1:1～10:1で発揮した細胞傷害性は9.18±0.62%～38.59±1.93%であったのに対し、フレッシュACE-gdT-CD20細胞（フレッシュCD20結合16日培養PBMC細胞）は16.99±1.16%～55.95±2.21%の標的細胞を死滅させた。Raji-Lucモデルでは、凍結保存したCtrl-gdT細胞（凍結保存した16日培養PBMC細胞）はE:T比1:1から10:1まで4.40±0.28%～41.96±1.85%であったのに対し、凍結保存したACE-gdT-CD20細胞（凍結保存したCD20結合16日培養PBMC細胞）は9.50±1.05%～68.13±0.47%の標的細胞を死滅させた。Daudi-Lucモデルでは、凍結保存したCtrl-gdT細胞（凍結保存した16日培養PBMC細胞）の細胞毒性は、E:T比1:1から10:1までで5.83±0.95％-56.94±2.47％であったのに対し、凍結保存したACE-gdT-CD20細胞（凍結保存したCD20結合16日培養PBMC細胞）は10.02±1.29％～74.01±1.51％の標的細胞を死滅させた。
上記のように、この試験で使用した細胞集団の細胞傷害性は、凍結保存・融解後もほぼ維持された。
5.4.8 ヒト血小板溶解液の効果
セクション5.4.1に記載されている、NK様特性を有するgdT細胞が豊富な細胞集団を調製するための方法を繰り返し、培地に3つの異なる濃度のHPL(1、5、または20体積%のHPL)を添加した。培養期間中、グルコースレベルと細胞数をモニターした。異なる日にサンプルを採取し、等量のトリパンブルーと混合し、細胞数をカウントした。培養中の総細胞数は、それに従って計算された。
図16A-16Bは、培養中に測定された細胞数を示しており、細胞生存率データとともに上記の表にさらに要約されている。示されたように、gdT細胞集団の急速な増殖は5vol%および20vol%のHPL群の両方で観察され、5vol%のHPL群は培養終了時に最大の増殖を示した。
PI-TCRVδ2+ゲート細胞集団のマーカー・プロファイリングは、上記セクション5.4.2および5.4.4に記載の方法に従って実施。パーセンテージは、PI-TCRVδ2+細胞（すなわちgdT細胞）の数を総数（分母）として計算したが、（マーカー陽性亜集団の代わりに）gdT集団におけるMFIベースのNMC値を各マーカーについて測定したことに留意されたい。結果は以下のように要約される。まとめると、これらの結果は、5% または 20 vol% の HPL を含む培地で培養して得られた細胞集団における gdT 細胞の NK 様細胞傷害特性を実証するものであった。
また、以下に示すように、5vol％および20vol％のHPL群の両方で得られた細胞集団は、主に EM 細胞と TDEM 細胞であり、約 1% のナイーブ細胞と約 1% の CM 細胞のみが含まれ、得られた細胞集団の治療可能性を再び裏付けられる。
得られた細胞集団の細胞傷害性も分析した。簡単に説明すると、標的Raji細胞を96ウェルプレート（ウェルあたり5,000個）に播種し、5 および 20 vol% HPL群の両方で得られた細胞集団を E:T 比2:1、5:1、および10:1でRaji細胞と4時間共培養した。この培養液を、上記セクション5.4.5および5.4.6で述べた蛍光ベースの細胞毒性アッセイで分析した。
図17A-17Bに示すように、5および20vol%HPL群の両方で強力な細胞傷害性が観察された。より高い細胞毒性が5％HPL群で観察されたが、これはgdT細胞上のDNAM1発現の増加（NMCで測定）および／またはこの群におけるTDEM細胞のパーセンテージの増加の結果であると考えられる。
5.4.9 容器の影響
セクション 5.4.1 に記載されている、NK 様特性を持つ gdT 細胞が豊富な細胞集団を調製する方法を繰り返し、違いは、(1) 空気透過性の細胞培養容器（G-Rex device）、(2) 空気不透過性の細胞培養容器（Tフラスコ）など異なる細胞培養容器を使用したことである。培養期間中、グルコースレベルと細胞数をモニターした。異なる日にサンプルを採取し、等量のトリパンブルーと混合し、細胞数をカウントした。培養中の総細胞数はそれに応じて計算された。図18Aに示すように、G-Rexで培養した場合、細胞集団は7日目から16日目にかけて急速に増殖したが、空気不透過性のT-フラスコで培養した場合は増殖しなかった。Tフラスコで培養した場合にも、細胞生存率の低下が観察された（図18B）。
PI-TCRVδ2+ゲート細胞集団のCD56、CD16、DNAM-1、NKG2D、CD69について、上記セクション5.4.2および5.4.4に記載した方法に従ってマーカープロファイリングを行った。マーカー陽性集団のパーセントとMFIベースのNMCの両方を下記に要約した。パーセンテージは、PI-TCRVδ2+細胞（すなわちgdT細胞）の数を総数（分母）として計算したが、（マーク陽性亜集団の代わりに）gdT集団におけるMFIベースのNMC値を各マーカーについて決定したことに留意されたい。示されたように、gdT細胞の特定の活性化マーカー（CD56、CD16、DNAMなど）の発現が、G-Rex群で有意に高いことが観察された。
また、下記に示すように、G-Rex培養群とT-フラスコ培養群の細胞集団は、主にEM細胞とTDEM細胞であり、ナイーブ細胞は約1％、CM細胞は約1％のみであった。
これらの結果は、細胞傷害性受容体（CD56、CD16、DNAM-1）を含む活性化受容体の細胞あたりの割合と平均数、およびTDEM集団の割合の高さによって実証されるように、通気性の良い容器を用いて調製された細胞集団は、より優れた増殖能力と高い傷害性を保持していることを示した。示されるように、G-Rex群ではTDEM細胞のパーセンテージが有意に高いことが観察された。
5.4.10 αβT減少の効果
セクション5.4.1に記載した、NK様特性を有するgdT細胞に豊富な細胞集団を調製する方法を、(1)abT細胞の枯渇を6日目に実施、(2)abT細胞の枯渇を実施せず、(3)abT細胞の枯渇を16日目に実施、または(4)abT細胞の枯渇を0日目に実施して繰り返した。
培養期間中、細胞数をモニターした。異なる日にサンプルを採取し、等量のトリパンブルーと混合し、細胞数をカウントした。培養中の総細胞数はそれに応じて計算された。16日目には、第1群は1.55x1010細胞、第2群は5x109細胞、第3群は2.74x109細胞で、第4群は増殖不能であった。第2群では枯渇前のabT細胞は8.52％であったのに対し、第3群では枯渇前のabT細胞は20％であった。
これらの結果から、abT細胞は数日間（例えば1～5日間）の生体外培養で細胞集団を枯渇させることができることが示された。さらに、第3群の細胞数が第2群より少なかったことから、abT細胞のパーセンテージが比較的低い（例えば、10％未満）ときに枯渇させることが、培養終了時までにgdT細胞の数を最も多くするのに役立つことが示された。
マーカーのプロファイリングも、上記セクション5.4.2および5.4.4に記載の方法に従って実施する。
5.4.11 細胞傷害性マーカーとしてのCD69+
得られた細胞集団の細胞傷害性の陽性マーカーとしてCD69受容体を評価するために、上記のセクションで述べた細胞傷害性アッセイを実施することが可能である。例えば、Raji細胞を標的細胞として使用し、(1)CD69+ gdT細胞および(2) セクション5.4.1に記載されているように調製された16日目の結果細胞集団から単離されたCD69- gdT細胞をエフェクター細胞として使用することが可能である。
CD69+細胞とCD69-細胞は異なる方法で分離できる。例えば、16日目の結果細胞集団からTCRVδ2+細胞を分離し、CD69磁性マイクロビーズ（Miltenyi社製）を用いてCD69+細胞（マイクロビーズ結合）とCD69-細胞（溶出）を分離することができる。別の例として、ヒトCD69 MicroBead Kit II（Miltenyi Biotech社製）を使用し、単離キット製造元の指示に従ってCD69+ gdT細胞を単離することができる。簡単に説明すると、40μLのautoMACSランニングバッファーに懸濁した約1x107個の採取したgdT細胞を、キットに付属の10μLのビオチン結合した抗CD69抗体と4℃で15分間インキュベートする。バインディングは比例して拡大することができる。前述の混合物を細胞107個あたり約20μLの抗Biotin MicroBeadsと30μLのautoMACSランニングバッファーと混合し、合計100uLの混合物を4℃で15分間インキュベートする。染色した細胞を107細胞あたり1-2mLのautoMACSランニングバッファーで洗浄し、その後400 xgで5分間遠心する。遠心分離した細胞を108細胞あたり500μLのautoMACSランニングバッファーで再懸濁し、平衡化した除去カラムにロードして、gdT細胞のCD69+とCD69-の集団を分離する。
CD69+とCD69-gdT細胞の割合が異なる集団は、gdT細胞のCD69+集団とCD69-集団の分離割合を、例えばCD69+とCD69-の割合が0:1、1:2、1:1、2:1、1:0で混合することにより調製できる。混合集団は、上記のセクションで説明した方法で、マーカープロファイル分析および細胞傷害性アッセイにかけることができる。
5.4.12 マウスモデルにおけるCtrl-gdT細胞とACE-gdT-CD20細胞による殺腫瘍作用
12週齢の雌性SCID-Beigeマウス（BioLasco Taiwan Co, Ltd.）に、1x105個のCD20発現Raji/Luc細胞を100μLの無血清培地にて0日目に静脈注射し、以下の3群に分けた: 媒介物群、コントロール-gdT群、ACE-gdT-CD20群。ACE-gdT-CD20（リツキシマブ結合したgdT）細胞集団とセクション5.4.3に記載したように調製したCtrl-gdT細胞集団をエフェクター細胞として使用した。
1x107個のエフェクター細胞（ACE-gdT-CD20細胞またはCtrl-gdT細胞）を、それぞれコントロール群とACE-gdT-CD20群のマウスに静脈内注射した。媒介物群のマウスには、同量の無血清培地を注射した。同じ治療を3日目、7日目、10日目にも繰り返した。各マウスの生物発光は、IVIS in vivoイメージングシステム（PerkinElmerなど）でモニターした。
図19A-19Cに示すように、ACE-gdT-CD20細胞集団は強力な抗腫瘍活性を示し、治療期間中も腫瘍負荷を抑制した。ACE-gdT-CD20を投与したマウスは、他の2群に比べ生存期間が有意に改善した。
5.4.13 液体腫瘍モデルマウスにおけるCD69+ gdT細胞による殺腫瘍作用
セクション5.4.11に記載のCD69+ gdT細胞とCD69- gdT細胞を混合し、CD69+細胞の量が異なる組成物を調製する。これらの細胞集団の殺腫瘍活性をマウスモデルで測定した。
1回投与: 5×105個のルシフェラーゼ発現標的細胞（Raji）を0日目に35匹の雌性免疫不全NSGマウス（Jackson Laboratory）またはSCID-Beigeマウス（BioLasco Taiwan Co., Ltd.)のそれぞれに静脈内注射する。マウスを7群に分け、エフェクター細胞としてCD69+ Ctrl-gdT細胞を異なる量投与した。第1群：2×106、第2群：5×106、第3群：1×107、第4群：2×107、第5群：3×107、第6群：5×107、第7群：0（培地のみ）である
発光は、0、3、8、11、18、25および32日目にin vivoイメージングシステム（例えば、AMI HTX（Spectral Imaging）；IVIS（PerkimElmer））で検出される。CD69+Ctrl-gdT細胞を投与したマウスの生物発光画像は、用量依存的な腫瘍縮小を示すことが期待される。
複数回投与: 標的細胞は上記と同じものを使用し、エフェクター細胞（CD69+ Ctrl-gdT）は以下の治療計画に従って様々な量を使用する。
発光は、0、3、8、11、15、18、22、25、32、39、46、53および60日目にin vivoイメージング（例えば、AMI HTX（Spectral Imaging）；IVIS（PerkimElmer））で検出される。マウスの生物発光像は、CD69+ Ctrl-gdT細胞を投与したマウスにおいて用量依存的な腫瘍縮小を示すと予想され、少なくとも合計1.5x107個のCD69+ Ctrl-gdT細胞を注入すれば強力な抗腫瘍活性が期待される。単位投与量が少ない場合（例えば、グループ1-3では7.5 x106）、有意な治療効果を得るためには複数回の注射が必要であることが予想される。単位投与量が多い場合（例えば、グループ6では6 x107）、たった1回の注射でも強力な抗腫瘍活性が期待できる。注射回数が少なければ、患者のコンプライアンスに役立つ。
5.4.14 固形腫瘍モデルマウスにおけるCD69+ gdT細胞の殺腫瘍作用
SK-OV-3細胞（CELL BIOLABS Inc）を標的細胞として、セクション5.4.13に記載の試験（単回投与および複数回投与の両方）を繰り返す。
マウスの生物発光像は、CD69+ Ctrl-gdT細胞を投与したマウスにおいて用量依存的な腫瘍縮小を示すと予想され、少なくとも合計1.5x107個のCD69+ Ctrl-gdT細胞を注入すれば強力な抗腫瘍活性が期待される。単位投与量が少ない場合（例えば、グループ1-3では7.5 x106）、有意な治療効果を得るためには複数回の注射が必要であることが予想される。単位投与量が多い場合（例えば、グループ6では6 x107）、たった1回の注射でも強力な抗腫瘍活性が期待できる。注射回数が少なければ、患者のコンプライアンスにも役立つ。
5.4.15 異なるサプリメントを用いたNK様特性を持つgdT細胞の調製
セクション5.4.1に記載されている、NK様特性を持つgdT細胞を豊富化した細胞集団を調製する方法を、培養液中の5vol%のHPLを、(1)HPL、(2)ヒトAB血清、または(3)胎児子牛血清(FCS)で異なる濃度(各サプリメントについて1vol%、5vol%、または20vol%)に置き換えて並行して繰り返す。 培養期間中、細胞数をモニターし、上記のセクションで述べたマーカープロファイル解析と細胞傷害性アッセイを実施する。HPL群では、gdT細胞の増殖がより多く、NK細胞傷害性がより高いことを示す分子プロファイルが観察されると予想される。
前述の説明は、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明の特許出願の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本明細書に開示された精神から逸脱しないいかなる変更または修正も、本発明の特許出願の範囲内に含まれるべきである。
本明細書で言及されるすべての刊行物は、例えば、本明細書で開示される組成物および方法論であって、現在記載される発明に関連して使用され得るものを記載および開示する目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本明細書に記載の発明者らが先願発明またはその他の理由によりそのような開示を先取りする権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
6.電子的に提出された配列表への参照
本出願は、2022年4月9日に作成され、サイズが33,393バイトである「GDT_ST25.TXT」と題されたASCIIテキストファイルとして、本出願とともに配列表を参照により組み込む。

Claims (59)

  1. ガンマデルタＴ（ｇｄＴ）細胞に富む細胞集団を製造する方法であって、ｇｄＴ細胞を含有する供給源細胞集団を、（ｉ）リン酸化抗原、（ｉｉ）サイトカイン、および（ｉｉｉ）ヒト血小板溶解物（「ＨＰＬ」）を添加した培地中で培養することを含む、方法。
  2. 前記培養中に前記細胞集団がフィーダー細胞または腫瘍細胞と接触しない、請求項１に記載の方法。
  3. ｇｄＴ細胞の正の選択を含まない、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記細胞集団が、３～４０日間、４～４０日間、５～４０日間、６～４０日間、７～４０日間、１０～４０日間、１０～３０日間、６～２０日間、１２～２０日間、または１４～１８日間培養される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. アルファベータＴ（ａｂＴ）細胞を枯渇させることをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ａｂＴ細胞を前記培養の半期頃に枯渇させる、請求項５に記載の方法。
  7. 前記細胞が１４～１８日間培養され、前記ａｂＴ細胞を４日目から１０日目までの間に枯渇させる、請求項５に記載の方法。
  8. 前記サイトカインが前記培養中に補充される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記サイトカインが、週１回、週２回、週３回、隔日、または毎日補充される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記サイトカインが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、またはそれらの任意の組合せである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記サイトカインがＩＬ－２である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記サイトカインが２００～３０００ＩＵ／ｍＬの濃度になるように添加される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記リン酸化抗原が前記培養中に補充されない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記リン酸化抗原が、クロドロネート、エチドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ゾレドロネート（ゾレドロン酸）、ネリドロネート、イバンドロネート、およびパミドロネートからなる群より選択されるビスホスホネートである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記リン酸化抗原がゾレドロネートである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記リン酸化抗原が、ブロモヒドリンピロリン酸（ＢｒＨＰＰ）、４－ヒドロキシ－２－ブテニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からなる群より選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記リン酸化抗原が０．１～２０μＭの濃度になるように添加される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＨＰＬが１～２０ｖｏｌ％の濃度になるように添加される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記培地がグルコースを６００～５０００ｍｇ／Ｌの濃度で含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記培地が無血清培地である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記細胞集団が、空気透過性の表面を有する装置中で培養される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記装置がＧ－Ｒｅｘ装置である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記供給源細胞集団が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、臍帯血、またはそれらの組合せを含有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記供給源細胞集団がＰＢＭＣを含有する、請求項２３に記載の方法。
  25. 末梢血から前記ＰＢＭＣを得ることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記供給源細胞集団内の前記ｇｄＴ細胞を前記培養中に１，０００倍以上増殖させる、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 請求項１から２６までのいずれか一項に記載の方法であって、この結果得られる細胞集団の７５％以上がｇｄＴ細胞である、方法。
  28. 請求項１から２７までのいずれか一項に記載の方法であって、この結果得られる細胞集団内の細胞の表面に標的化部分を付与することをさらに含む、方法。
  29. 前記標的化部分にコンジュゲートした第１のリンカーと前記細胞表面にコンジュゲートした第２のリンカーとの間の相互作用を介して、前記標的化部分が前記細胞表面と複合体を形成する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記標的化部分が外因的に発現される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記培養後に前記細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法により得られた、細胞集団。
  33. ｇｄＴ細胞を７０％以上含有する細胞集団であって、（１）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均４００個以上のＤＮＡＭ－１分子を発現するか、（２）前記ｇｄＴ細胞の３０％以上がＣＤ６９＋であるか、または（１）と（２）のいずれでもある、細胞集団。
  34. 前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均して、ＤＮＡＭ－１分子を５００個以上、１０００個以上、２０００個以上、または３０００個以上発現する、請求項３３に記載の細胞集団。
  35. ＣＤ６９＋が、前記ｇｄＴ細胞の４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、または８０％以上を占める、請求項３３または３４に記載の細胞集団。
  36. 前記ｇｄＴ細胞の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、または８０％以上が、最終分化型エフェクター（ＴＤＥＭ）細胞である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  37. ｇｄＴ細胞が、１×１０６個以上、５×１０６個以上、１×１０７個以上、５×１０７個以上、１×１０８個以上、５×１０８個以上、１×１０９個以上、５×１０９個以上、１×１０１０個以上、５×１０１０個以上、または１×１０１１個以上含有される、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の細胞集団。
  38. 前記細胞集団がｇｄＴ細胞の正の選択を受けていない、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の細胞集団。
  39. 請求項３３から３８のいずれか一項に記載の細胞集団であって、単一のドナーから得られた供給源細胞集団に由来するため、２０日以内に培養された、細胞集団。
  40. （１）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均４００個以上のＣＤ５６分子を発現するか、（２）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均４００個以上のＣＤ１６分子を発現するか、（３）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均４００個以上のＮＫＧ２Ｄ分子を発現するか、（４）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均４００個以上のＣＤ１０７ａ分子を発現するか、（５）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均２８００個以上のＰＤ－１分子を発現するか、（６）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均５０００個以上のＤＮＡＭ－１分子を発現するか、（７）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均４００個以上のＣＤ６９分子を発現するか、もしくは（８）前記ｇｄＴ細胞が１細胞当たり平均１００個以上のグランザイムＢ分子を発現するか、またはそれらの任意の組合せである、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の細胞集団。
  41. 前記ｇｄＴ細胞の３０％以上がＶδ２Ｔ細胞である、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の細胞集団。
  42. 前記ｇｄＴ細胞の１０％以上が、前記細胞表面と複合体を形成した標的化部分を有する、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の細胞集団。
  43. 前記標的化部分が核酸ではない、請求項４２に記載の細胞集団。
  44. 前記標的化部分が、標的細胞上の生物学的マーカーに特異的に結合する抗体または抗原結合ユニットである、請求項４２または４３に記載の細胞集団。
  45. 前記生物学的マーカーが腫瘍抗原である、請求項４４に記載の細胞集団。
  46. 前記抗体または抗原結合フラグメントを含有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、前記ｇｄＴ細胞が発現する、請求項４４または４５に記載の細胞集団。
  47. 前記標的化部分が前記ｇｄＴ細胞によって産生されない、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  48. 前記標的化部分にコンジュゲートした第１のリンカーと前記細胞表面にコンジュゲートした第２のリンカーとの間の相互作用を介して、前記標的化部分が前記細胞表面と複合体を形成する、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  49. 前記第１のリンカーが第１のポリヌクレオチドであり、前記第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである、請求項４８に記載の細胞集団。
  50. （１）前記第１のポリヌクレオチドが４～５００個のヌクレオチドを有するか、（２）前記第２のポリヌクレオチドが４～５００個のヌクレオチドを有するか、または（１）および（２）のいずれでもある、請求項４９に記載の細胞集団。
  51. 請求項３２から５０のいずれか一項に記載の細胞集団であって、凍結保存された細胞集団。
  52. 請求項３２から５１のいずれか一項に記載の細胞集団と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
  53. 少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、または少なくとも６ヶ月間、０℃以下で保存後も治療効力を維持し得る、請求項３２から５１のいずれか一項に記載の細胞集団または請求項５２に記載の医薬組成物。
  54. 請求項３２から５３のいずれか一項に記載の細胞集団または医薬組成物の養子免疫療法における使用。
  55. 請求項３２から５３のいずれか一項に記載の細胞集団または医薬組成物の疾患または障害の治療における使用。
  56. 疾患または障害を治療することを必要としている対象において疾患または障害を治療する方法であって、請求項３２から５３のいずれか一項に記載の細胞集団または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  57. 前記疾患または障害が腫瘍または癌である、請求項５５または請求項５６に記載の使用。
  58. 前記疾患または障害が、自己免疫疾患、神経細胞疾患、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム、病原性疾患、ＨＩＶもしくは他のウイルス感染症、真菌感染症、原虫感染症、または細菌感染症である、請求項５５または請求項５６に記載の使用。
  59. 前記対象がヒトである、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
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