JP2024511980A - 移植拒絶反応の判定方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、移植拒絶反応の判定のための移植レシピエントの生体試料の調製及び分析のための方法を提供し、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料におけるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を測定することと、（ｂ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を測定することと、（ｃ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応を示すカットオフ閾値を超えているかどうか、及び移植レシピエントが、免疫応答の減少又は増加を示すＴＴＶの量の増加又は減少を有するかどうかをそれぞれ判定することと、を含む。【選択図】図１
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１６２，７５０号及び２０２２年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３１４，６４７号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１６２，７５０号及び２０２２年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３１４，６４７号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
移植片傷害及び／又は移植片拒絶反応の迅速な検出は、移植レシピエントにとって依然として課題である。従来の生検ベースの試験は、侵襲性で高価であり、移植傷害及び／又は移植拒絶反応の診断の遅れにつながる可能性がある。したがって、従来の生検ベースの試験よりも感度が高く、より特異的な移植傷害及び／又は移植拒絶反応のための非侵襲的試験の必要性が存在する。
本開示は、移植拒絶反応の判定のための移植レシピエントの生体試料の調製及び分析に関し、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料におけるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を測定することと、（ｂ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を測定することと、（ｃ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応を示すカットオフ閾値を超えているかどうか、及び移植レシピエントが、免疫応答の減少又は増加を示すＴＴＶの量の増加又は減少を有するかどうかをそれぞれ判定することと、を含む。
本開示はまた、移植拒絶反応の判定のための移植レシピエントの生体試料の調製及び分析に関し、移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量を測定することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能（臓器の健康状態のマーカーとして）とその機能のＴＴＶの量（免疫抑制のマーカーとして）との組み合わせが、移植拒絶反応を示すカットオフ閾値を超えているかどうかを判定することと、を含む。ＴＴＶとｄｄ－ｃｆＤＮＡとの組み合わせは、拒絶反応のバイオマーカー及び免疫抑制の正味の状態のバイオマーカーとして機能し得る。
本開示は、更に移植拒絶反応を判定するための移植レシピエントの生体試料の調製及び分析に関し、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のＴＴＶ ＤＮＡの量を測定することと、（ｂ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを測定することと、（ｃ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、並びにＴＴＶ ＤＮＡの量に基づいて、移植レシピエントの拒絶反応のリスクを判定することと、を含む。
Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖｉａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題され、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４０６０３として２０１９年７月３日に出願されたＷＯ２０２０／０１０２５５は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題され、２０２０年５月２９日に出願された米国仮出願第６３／０３１，８７９号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
少なくとも１つの態様において、本発明は、移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法に関し、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、配列決定リードに基づいてドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、（ｃ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を測定することと、（ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応を示すカットオフ閾値を超えているかどうか、及び移植レシピエントが、それぞれ免疫応答の減少又は増加を示すＴＴＶの量の増加又は減少を有するかどうかを判定することと、を含む。
少なくとも１つの態様において、本発明は、移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法に関し、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、配列決定リードに基づいてドナー由来無細胞ＤＮＡの量及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を定量化することと、（ｃ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能（臓器の健康状態のマーカーとして）とその機能のＴＴＶの量（免疫抑制のマーカーとして）との組み合わせがカットオフ閾値を超えているかどうかを判定することと、を含む。ＴＴＶとｄｄ－ｃｆＤＮＡとの組み合わせは、拒絶反応のバイオマーカー及び免疫抑制の正味の状態のバイオマーカーとして機能し得る。
少なくとも別の態様において、本発明は、移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法に関し、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、配列決定リードに基づいて、血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを定量化することと、（ｃ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のＴＴＶ ＤＮＡの量を測定することと、（ｄ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、並びにＴＴＶ ＤＮＡの量に基づいて、移植レシピエントの拒絶反応のリスクを判定することと、を含む。
少なくとも別の態様において、本発明は、移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法に関し、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、配列決定リードに基づいて、血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージ、並びに血液、血漿、血清、又は尿試料中のＴＴＶ ＤＮＡの量を定量化することと、（ｃ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、並びにＴＴＶ ＤＮＡの量に基づいて、移植レシピエントの拒絶反応のリスクを判定することと、を含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定し、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及びＴＴＶの量の関数である。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定し、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量、ＴＴＶの量、及び全無細胞ＤＮＡの量の関数である。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定し、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数及びＴＴＶのリード数の関数である。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定し、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数、ＴＴＶのリード数、及び全無細胞ＤＮＡのリード数の関数である。いくつかの実施形態において、関数は、多項式関数である。いくつかの実施形態において、関数は、対数関数である。いくつかの実施形態において、関数は、指数関数である。いくつかの実施形態において、関数は、線形関数である。いくつかの実施形態において、関数は、非線形関数である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントの拒絶反応のリスクは、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、又は決定木機械学習解析を使用して判定される。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、移植レシピエントの血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能をパラメータとして組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数又はその機能をパラメータとして組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージをパラメータとして組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のＴＴＶ ＤＮＡの量をパラメータとして組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、移植レシピエントの血液、血漿、血清、若しくは尿試料中の全無細胞ＤＮＡの量又はその機能をパラメータとして更に組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、全無細胞ＤＮＡのリード数又はその機能をパラメータとして更に組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、移植後の時間をパラメータとして更に組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、移植レシピエント及び／又は移植ドナーの年齢をパラメータとして更に組み込む。いくつかの実施形態において、機械学習解析は、移植レシピエント及び／又は移植ドナーの性別をパラメータとして更に組み込む。
いくつかの実施形態において、血液、血漿、血清、又は尿試料は、移植後１８ヶ月未満、移植後１７ヶ月未満、移植後１６ヶ月未満、移植後１５ヶ月未満、移植後１４ヶ月未満、移植後１３ヶ月未満、又は移植後１２ヶ月未満の移植レシピエントから得られる。いくつかの実施形態において、血液、血漿、血清、又は尿試料は、移植後０～２ヶ月、移植後２～４ヶ月、移植後４～６ヶ月、移植後６～９ヶ月、移植後９～１２ヶ月、又は移植後１２～１８ヶ月に移植レシピエントから得られる。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントの拒絶反応のリスクは、少なくとも０．８１、少なくとも０．８２、又は少なくとも０．８３、又は少なくとも０．８４、又は少なくとも０．８５、又は少なくとも０．８６、又は少なくとも０．８７、又は少なくとも０．８８、又は少なくとも０．８９、又は少なくとも０．９０の感度で判定される。いくつかの実施形態において、移植レシピエントの拒絶反応のリスクは、少なくとも０．８１、少なくとも０．８２、又は少なくとも０．８３、又は少なくとも０．８４、又は少なくとも０．８５、又は少なくとも０．８６、又は少なくとも０．８７、又は少なくとも０．８８、又は少なくとも０．８９、又は少なくとも０．９０の特異性で判定される。いくつかの実施形態において、移植レシピエントの拒絶反応のリスクは、少なくとも０．８６、又は少なくとも０．８７、又は少なくとも０．８８、又は少なくとも０．８９、又は少なくとも０．９０、又は少なくとも０．９１、又は少なくとも０．９２、又は少なくとも０．９３、又は少なくとも０．９４、又は少なくとも０．９５の曲線下面積（ＡＵＣ）で判定される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス３である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス４である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス５である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス６である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス７である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス９である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１０である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１３である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１４である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１５である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１７である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１８である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス１９である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２０である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２１である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２４である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２５である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２６である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス２９である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶは、トルクテノウイルス３１である。いくつかの実施形態において、ＴＴＶの量の減少は、移植レシピエントにおける免疫応答の増加又は免疫活性の増加を示す。いくつかの実施形態において、ＴＴＶの量の増加は、移植レシピエントにおける免疫応答の減少又は免疫活性の減少を示す。
いくつかの実施形態において、ＴＴＶの量は、定量ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＶの量は、リアルタイムＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＶの量は、デジタルＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＶの量は、高スループット配列決定、次世代配列決定、又は合成による配列決定などの配列決定によって測定される。
いくつかの実施形態において、移植ドナーは、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、移植ドナーは、非ヒト哺乳動物対象（例えば、ブタ）である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒト対象である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、腸、胸腺、及び子宮から選択される、１つ以上の移植された臓器を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、肝臓移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、心臓移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、肺移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、膵臓移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腸管移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、胸腺移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、子宮移植を受けている。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子座は、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態において、標的化増幅は、ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅のためのプライマーは、２００～５０，０００、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００対の順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、増幅産物を得るために、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００，又は２０，０００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００の標的遺伝子座で増幅を行うことを含む。
いくつかの実施形態において、標的化増幅は、ネスティッドＰＣＲを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅のためのプライマーは、第１のユニバーサルプライマー、及び２００～５０，０００、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００を含み、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００の標的特異的プライマー、並びに第２のユニバーサルプライマー、及び２００～５０，０００、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００－５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００の内側標的特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、増幅産物を得るために、第１のユニバーサルプライマー、及び２００～５０，０００、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００，又は２０，０００～５０，０００の標的特異的プライマーを使用して、単一反応体積において５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００の標的遺伝子座で増幅を行うことを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、増幅産物を得るために、第２のユニバーサルプライマー、及び２００～５０，０００、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００，又は２０，０００～５０，０００の内側標的特異的プライマーを使用して、単一反応体積において５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００の標的遺伝子座で増幅を行うことを含む。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージ又はその機能である。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、又は２．０％のｄｄ－ｃｆＤＮＡである。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、移植される臓器の種類に従って調整される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、移植される臓器の数に従って調整される。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対濃度に比例する。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数又はその機能である。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量に、移植レシピエントの体重、ＢＭＩ、又は血液量を乗じたものとして表される。
いくつかの実施形態において、本方法は、高スループット配列決定を行う前に、増幅産物にタグを付着させることを更に含み、タグが、配列決定適合性アダプターを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的化増幅を行う前に、抽出された無細胞ＤＮＡにタグを付着させることを更に含み、タグが、増幅のためのアダプターを含む。いくつかの実施形態において、タグは、試料特異的バーコードを含み、本方法は、高スループット配列決定の前に複数の試料からの増幅産物をプールすることと、高スループット配列決定の間に単一の実行で増幅産物のプールを一緒に配列決定することと、を更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、同じ移植レシピエントについてステップ（ａ）～（ｄ）を長期的に繰り返すことと、ＴＴＶ若しくはその機能の量の長期的変化、及びドナー由来無細胞ＤＮＡ若しくはその機能の量の長期的変化を判定することと、を更に含む。
少なくとも別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおいて免疫抑制療法を投与する方法であって、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料におけるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を測定することと、（ｂ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を測定することと、（ｃ）ＴＴＶの量又はその機能、及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能に従って、免疫抑制療法の投薬量を滴定することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、同じ移植レシピエントについてステップ（ａ）～（ｂ）を長期的に繰り返すことと、ＴＴＶの量又はその機能の長期的変化、及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の長期的変化を判定することと、を更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＴＴＶの量又はその機能の長期的変化、及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の長期的変化に従って、免疫抑制療法の投薬量を滴定することを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントがＴＴＶの量の長期的な減少及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量の長期的な増加を有する場合、免疫抑制療法の投薬量を増加させることを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントがＴＴＶの量の長期的な増加及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量の長期的な減少を有する場合、免疫抑制療法の投薬量を減少させることを含む。
いくつかの実施形態において、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量は、移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことと、増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、配列決定リードに基づいてドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、によって測定される。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、移植ドナーの遺伝子型を判定することを含まない。
いくつかの実施形態において、例えば、トレーサーＤＮＡ、又は内部キャリブレーションＤＮＡは、以下のうちの１つ以上が事前に知られているＤＮＡの組成物を指す：長さ、配列、ヌクレオチド組成、量、又は生物学的起源。トレーサーＤＮＡは、ヒト対象に由来する生体試料に添加して、当該試料中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するのに役立てることができる。また、生体試料自体以外の反応混合物に添加することもできる。
いくつかの実施形態において、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）は、同じ種の２つのメンバーのゲノム間で異なり得る単一ヌクレオチドを指す。この用語の使用は、各バリアントが生じる頻度のいかなる制限も意味しない。
いくつかの実施形態において、例えば、配列は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列又は遺伝子配列を指す。これは、個体におけるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又は鎖の一次物理的構造を指し得る。これは、そのＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子内に見出されるヌクレオチドの配列、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子に対する相補鎖を指し得る。これは、コンピュータ上でのその表現としてのＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子に含まれる情報を指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、遺伝子座は、個体のＤＮＡ若しくはＲＮＡ上の特定の目的領域を指し、１つ以上のＳＮＰ、可能性のある挿入若しくは欠失の部位、又はいくつかの他の関連する遺伝子変異の部位を含むが、これらに限定されない。疾患関連ＳＮＰはまた、疾患関連遺伝子座を指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、多型対立遺伝子、別名「多型遺伝子座」は、遺伝子型が所与の種内の個体間で変化する対立遺伝子又は遺伝子座を指す。多型対立遺伝子のいくつかの例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復、欠失、重複及び反転が挙げられる。
いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子は、特定の遺伝子座を占めるヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、例えば、遺伝子データ、別名「遺伝子型データ」は、１つ以上の個体のゲノムの態様を記述するデータを指す。これは、遺伝子座の１つ又は１セット、部分的又は全体的な配列、部分的又は全体的な染色体、又はゲノム全体を指し得る。これは、１つ又は複数のヌクレオチドの同一性を指し得、これは、一連の連続したヌクレオチド、又はゲノム内の異なる位置からのヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを指し得る。遺伝子型データはコンピュータ上であるが、配列中の物理的ヌクレオチドを化学的にコードされた遺伝子データとみなすことも可能である。遺伝子型データは、個体「に関する」、個体「の」、個体「での」、個体「からの」又は個体「に関する」と言うことができる。遺伝子型データは、遺伝物質に対してこれらの測定が行われる遺伝子型判定プラットフォームからの出力測定を指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、遺伝物質、別名「遺伝子試料」は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）を含む１つ以上の個体からの、組織又は血液などの物理的物質を指す。
いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子データは、１つ以上の対立遺伝子のセットに関する遺伝子型データのセットを指す。これは、段階的なハプロタイプのデータを指し得る。これは、ＳＮＰ同一性を指し得、挿入、欠失、反復及び変異を含む、核酸の配列データを指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子状態とは、１つ以上の対立遺伝子のセットにおける遺伝子の実際の状態を指す。これは、対立遺伝子データによって説明される遺伝子の実際の状態を指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子の比率又は対立遺伝子比率は、試料又は個体中に存在する遺伝子座における各対立遺伝子の量間の比率を指す。試料が配列決定によって測定された場合、対立遺伝子の比率は、遺伝子座における各対立遺伝子にマッピングする配列リードの比率を指し得る。試料が強度ベースの測定方法によって測定された場合、対立遺伝子比率は、測定方法によって推定される、その遺伝子座に存在する各対立遺伝子の量の比率を指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子数は、特定の遺伝子座にマッピングする配列の数を指し、その遺伝子座が多型である場合、対立遺伝子の各々にマッピングする配列の数を指す。各対立遺伝子がバイナリ方式でカウントされる場合、対立遺伝子数は整数となる。対立遺伝子が確率的にカウントされる場合、対立遺伝子数は、分数であってもよい。
いくつかの実施形態において、例えば、プライマー、別名「ＰＣＲプローブ」は、ＤＮＡ分子が同一又はほぼ同一であり、プライマーが標的多型遺伝子座にハイブリダイズするように設計された領域を含み、ＰＣＲ増幅などの増幅を可能にするように設計されたプライミング配列を含む、単一のＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）又はＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）の集合体を指す。プライマーはまた、分子バーコードを含んでいてもよい。プライマーは、個々の分子ごとに異なるランダム領域を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、例えば、ハイブリッド捕捉プローブは、ＰＣＲ又は直接合成などの様々な方法によって生成され、試料中の特定の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の１つの鎖に相補的であることを意図している、場合によっては修飾された任意の核酸配列を指す。外因性ハイブリッド捕捉プローブを調製した試料に添加し、変性－アニールプロセスを通じてハイブリダイゼーションして、外因性－内因性断片の二本鎖を形成してもよい。次いで、これらの二本鎖は、様々な手段によって試料から物理的に分離され得る。
いくつかの実施形態において、例えば、配列リードは、クローン配列決定方法を使用して測定した、ヌクレオチド塩基の配列を表すデータを指す。クローン配列決定は、単一の、又はクローンの、又はクラスターの１つの元のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を表す配列データを生成し得る。配列リードはまた、ヌクレオチドが正しく呼び出された可能性を示す配列の各塩基位置に、関連する品質スコアを有し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、配列リードをマッピングすることは、特定の生物のゲノム配列における配列リードの起点の位置を判定するプロセスである。配列リードの起点の位置は、リード及びゲノム配列のヌクレオチド配列の類似性に基づく。
いくつかの実施形態において、例えば、配列リードをマッピングすることは、特定の生物のゲノム配列における配列リードの起点の位置を判定するプロセスである。配列リードの起点の位置は、リード及びゲノム配列のヌクレオチド配列の類似性に基づく。
いくつかの実施形態において、例えば、ドナー起源のＤＮＡ又はＲＮＡとは、元々遺伝子型が移植ドナーのものと本質的に同等であった細胞の一部であったＤＮＡ又はＲＮＡを指す。ドナーは、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ）であり得る。
いくつかの実施形態において、例えば、レシピエント起源のＤＮＡ又はＲＮＡとは、元々遺伝子型が移植レシピエントのものと本質的に同等であった細胞の一部であったＤＮＡ又はＲＮＡを指す。
いくつかの実施形態において、例えば、移植レシピエント血漿とは、同種移植片又は異種移植片を受けている患者、例えば、臓器移植レシピエントの女性からの血液の血漿部分を指す。
いくつかの実施形態において、例えば、遺伝子座に対応するＤＮＡ若しくはＲＮＡの優先的濃縮、又は遺伝子座におけるＤＮＡ若しくはＲＮＡの優先的濃縮とは、遺伝子座に対応する濃縮前ＤＮＡ若しくはＲＮＡ混合物中のＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子のパーセンテージよりも高い、遺伝子座に対応する濃縮後ＤＮＡ若しくはＲＮＡ混合物中のＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子のパーセンテージをもたらす任意の技術を指す。この技術は、遺伝子座に対応するＤＮＡ又はＲＮＡ分子の選択的増幅を含んでもよい。この技術は、遺伝子座に対応しないＤＮＡ又はＲＮＡ分子を除去することを含んでもよい。この技術は、方法の組み合わせを含んでもよい。濃縮度は、遺伝子座に対応する濃縮後混合物中のＤＮＡ又はＲＮＡ分子のパーセンテージを、遺伝子座に対応する濃縮前混合物中のＤＮＡ又はＲＮＡ分子のパーセンテージで割ったものとして定義される。優先的濃縮は、複数の遺伝子座で行われてもよい。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２０を超える。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２００を超える。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２，０００を超える。優先的濃縮が複数の遺伝子座で行われる場合、濃縮度は、遺伝子座のセット中の全ての遺伝子座の平均濃縮度を指し得る。
いくつかの実施形態において、例えば、増幅とは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子のコピー数を増加させる技術を指す。
いくつかの実施形態において、例えば、選択的増幅とは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの特定の領域に対応する、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの特定の分子、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子のコピー数を増加させる技術を指し得る。また、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの非標的化分子又は領域を増加させるよりも、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの特定の標的化分子、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの標的化領域のコピー数を増加させる技術を指し得る。選択的増幅は、優先的濃縮方法であり得る。
いくつかの実施形態において、例えば、ユニバーサルプライミング配列とは、例えば、ライゲーション、ＰＣＲ、又はライゲーション媒介ＰＣＲによって標的ＤＮＡ分子の集団に付加され得るＤＮＡ配列を指す。標的分子の集団に加えられると、ユニバーサルプライミング配列に特異的なプライマーを使用して、単一の増幅プライマー対を使用して標的集団を増幅することができる。ユニバーサルプライミング配列は、標的配列に関連する必要はない。
いくつかの実施形態において、例えば、ユニバーサルアダプター、又は「ライゲーションアダプター」若しくは「ライブラリタグ」とは、標的二本鎖ＤＮＡ分子の集団の５’末端及び３’末端に共有結合することができるユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡ分子である。アダプターの添加は、ＰＣＲ増幅が行われ得る標的集団の５’末端及び３’末端にユニバーサルプライミング配列を提供し、単一の増幅プライマー対を使用して、標的集団由来の全ての分子を増幅する。
いくつかの実施形態において、例えば、標的化とは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの混合物中の遺伝子座のセットに対応するＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子を選択的に増幅するか又は別様に優先的に濃縮するために使用される方法を指す。
移植拒絶反応を監視するためのドナー由来無細胞ＤＮＡの分析
一態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の量を定量化する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含み、各プライマー対が、１００ｂｐ以下の標的配列を増幅するように設計される、標的化増幅を行うことと、増幅産物中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含む。
一態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の量を定量化する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含み、各プライマー対が、１００ｂｐ以下の標的配列を増幅するように設計される、標的化増幅を行うことと、増幅産物中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含む。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の量を定量化する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、抽出ステップが、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、破裂した白血球から放出されるレシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、標的化増幅を行うことと、増幅産物中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含む。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）を検出する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、標的化増幅を行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことを更に含む。いくつかの実施形態において、ユニバーサル増幅は、破裂した白血球から放出されるレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒトである。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、臓器移植、組織移植、細胞移植、及び流体移植から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、心臓／肺移植、胃移植、精巣移植、陰茎移植、卵巣移植、子宮移植、胸腺移植、顔面移植、手移植、脚移植、骨移植、骨髄移植、角膜移植、皮膚移植、膵島細胞移植、心臓弁移植、血管移植、及び輸血から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ＳＰＫ移植を受けている。
いくつかの実施形態において、定量化ステップは、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡの合計のうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを判定することを含む。いくつかの実施形態において、定量化ステップは、血液試料の体積単位当たりのドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数を判定することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの定量化された量を使用して、移植の活性拒絶反応（ａｃｔｉｖｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の発生又は発生の可能性を検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。
いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約５０～１００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、７５ｂｐ以下の標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６０～７５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。
いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも１，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも２，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも５，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも１０，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、多型遺伝子座である標的遺伝子座における１つ以上の対立遺伝子の量を測定することを更に含む。いくつかの実施形態において、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座は、単一反応において増幅される。
いくつかの実施形態において、定量化ステップは、マイクロアレイを使用して増幅された標的遺伝子座を検出することを含む。いくつかの実施形態において、定量化ステップは、マイクロアレイを使用することを含まない。
いくつかの実施形態において、標的化増幅は、（ｉ）少なくとも５００～５０，０００の異なるプライマー対、又は（ｉｉ）少なくとも５００～５０，０００の標的特異的プライマー及びユニバーサル又はタグ特異的プライマー５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座を同時に増幅することを含む。
更なる態様において、本発明は、移植レシピエント内の移植拒絶反応の尤度を判定する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、標的化増幅を行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含み、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が多いほど、移植拒絶反応の尤度が高いことを示す。
更なる態様において、本発明は、移植レシピエント内の移植が急性拒絶反応を起こしていると診断する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、標的化増幅を行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含み、１％超（又は１．１％、又は１．２％、又は１．３％、又は１．４％、又は１．５％、又は１．６％、又は１．７％、又は１．８％、又は１．９％、又は２．０％）の量のｄｄ－ｃｆＤＮＡは、移植が急性拒絶反応を起こしていることを示す。
いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、抗体媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応である。
いくつかの実施形態において、１％未満（又は０．９％、又は０．８％、又は０．７％、又は０．６％、又は０．５％）のｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が境界性拒絶反応を起こしているか、他の損傷を受けているか、又は安定しているかのいずれかを示す。
更なる態様において、本発明は、対象における免疫抑制療法を監視する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的化増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、標的化増幅を行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含み、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化が、移植状態を示す。
いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化がないこと又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。
いくつかの実施形態において、１％を超える（又は１．１％、又は１．２％、又は１．３％、又は１．４％、又は１．５％、又は１．６％、又は１．７％、又は１．８％、又は１．９％、又は２．０％）ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が、急性拒絶反応を起こしていることを示す。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、抗体媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応である。
いくつかの実施形態において、１％未満（又は０．９％、又は０．８％、又は０．７％、又は０．６％、又は０．５％）のｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が境界性拒絶反応を起こしているか、他の損傷を受けているか、又は安定しているかのいずれかを示す。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植ドナー及び／又は移植レシピエントの遺伝子型を判定することを含まない。
いくつかの実施形態において、本方法は、多型遺伝子座である標的遺伝子座における１つ以上の対立遺伝子の量を測定することを更に含む。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子座は、少なくとも１，０００の多型遺伝子座、又は少なくとも２，０００の多型遺伝子座、又は少なくとも５，０００の多型遺伝子座、又は少なくとも１０，０００の多型遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態において、約５０～１００ｂｐ長、又は約５０～９０ｂｐ長、又は約６０～８０ｂｐ長、又は約６０～７５ｂｐ長、又は約６５ｂｐ長のアンプリコンにおいて増幅される標的遺伝子座。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒトである。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、膵島細胞移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、骨髄移植、心臓弁移植、又は皮膚移植から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ＳＰＫ移植を受けている。
いくつかの実施形態において、抽出ステップは、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、破裂した白血球から放出されたレシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を更に含む。
いくつかの実施形態において、ユニバーサル増幅ステップは、破裂した白血球から放出されるレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植後に移植レシピエントから複数の血液試料を長期的に採取することと、採取した各血液試料についてステップ（ａ）～（ｅ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントからの血液試料を、約３ヶ月、又は約６ヶ月、又は約１２ヶ月、又は約１８ヶ月、又は約２４ヶ月などの期間にわたって採取及び分析することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから、約１週間、又は約２週間、又は約３週間、又は約１ヶ月、又は約２ヶ月、又は約３ヶ月などの間隔で血液試料を採取することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間を用いて非ＡＲに対する急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際に、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の感度を有する。
いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間で非ＡＲに対するＡＲを同定する際に、少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％の特異性を有する。
いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間で非ＡＲに対するＡＲを同定する際に、少なくとも０．８、又は０．８５、又は少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する。
いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間で正常で安定した同種移植片（ＳＴＡ）に対するＡＲを同定する際に、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の感度を有する。
いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間でＳＴＡに対するＡＲを同定する際に、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の特異性を有する。
いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間でＳＴＡに対するＡＲを同定する際に、少なくとも０．８、又は０．８５、又は少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５、又は少なくとも０．９８、又は少なくとも０．９９のＡＵＣを有する。
いくつかの実施形態において、本方法は、０．５％以下のブランク上限（ＬｏＢ）、及び０．５％以下の検出限界（ＬｏＤ）によって決定される感度を有する。いくつかの実施形態において、ＬｏＢは、０．２３％以下であり、ＬｏＤは、０．２９％以下である。いくつかの実施形態において、感度は、定量化限界（ＬｏＱ）によって更に決定される。いくつかの実施形態において、ＬｏＱは、ＬｏＤの１０倍であり、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも５倍大きくてもよく、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも１．５倍大きくてもよく、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも１．２倍大きくてもよく、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも１．１倍大きくてもよく、又はＬｏＱは、ＬｏＤ以上でもよい。いくつかの実施形態において、ＬｏＢは、０．０４％以下であり、ＬｏＤは、０．０５％以下であり、かつ／又はＬｏＱは、ＬｏＤに等しい。
いくつかの実施形態において、本方法は、対応する試行スパイクレベルの関数として、測定されたドナー分率の線形回帰分析から得られた線形性値を評価することによって決定される精度を有し、線形性値が、Ｒ２値であり、Ｒ２値が、約０．９８～約１．０である。いくつかの実施形態において、Ｒ２値は、０．９９９である。いくつかの実施形態において、本方法は、スロープ値及びインターセプト値を計算するために、対応する試行スパイクレベルの関数として、測定されたドナー分率に対して線形回帰を使用することによって決定される精度を有し、スロープ値が、約０．９～約１．２であり、インターセプト値が、約－０．０００１～約０．０１である。いくつかの実施形態において、スロープ値は、約１であり、インターセプト値は、約０である。
いくつかの実施形態において、本方法は、変動係数（ＣＶ）を計算することによって決定される精度を有し、ＣＶが、約１０．０％未満である。ＣＶは、約６％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＶは、約４％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＶは、約２％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＶは、約１％未満である。
いくつかの実施形態において、ＡＲは、抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）である。いくつかの実施形態において、ＡＲは、Ｔ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）である。
本明細書において、移植レシピエントからの試料中の移植ドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の検出方法が更に開示される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、移植レシピエントは、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒトである。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、膵島細胞移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、骨髄移植、心臓弁移植、又は皮膚移植から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ＳＰＫ移植を受けている。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントに対して、移植手術の日、又は移植手術後、移植手術の最大１年後に行われてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエントの血液試料からドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の標的遺伝子座を増幅する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエントからの血液試料中のドナー由来の無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）を検出する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）増幅された標的遺伝子座を標的遺伝子座に特異的にハイブリダイズするプローブと接触させることと、ｅ）標的遺伝子座とプローブとの結合を検出し、それによって、血液試料内のｄｄ－ｃｆＤＮＡを検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、検出可能なマーカーで標識される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエント内の移植拒絶反応の尤度を判定する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することと、を含み、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が多いほど、移植拒絶反応の尤度が高いことを示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエント内の移植が急性拒絶反応を起こしていると診断する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することと、を含み、１％超（又は１．１％、又は１．２％、又は１．３％、又は１．４％、又は１．５％、又は１．６％、又は１．７％、又は１．８％、又は１．９％、又は２．０％）の量のｄｄ－ｃｆＤＮＡは、移植が急性拒絶反応を起こしていることを示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、移植拒絶反応は、抗体媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、１％未満（又は０．９％、又は０．８％、又は０．７％、又は０．６％、又は０．５％）のｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が境界性拒絶反応を起こしているか、他の損傷を受けているか、又は安定しているかのいずれかを示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、対象における免疫抑制療法を監視する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することと、を含み、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化が、移植状態を示す。いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応を示し、免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、標的遺伝子座は、約５０～１００ｂｐ長、又は約６０～８０ｂｐ長のアンプリコンで増幅される。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、約６５ｂｐ長である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することを更に含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、移植ドナー及び移植レシピエントの遺伝子型を判定することを含まない。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、マイクロアレイを使用して増幅された標的遺伝子座を検出することを更に含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座は、単一反応において増幅される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、ＤＮＡは、標的遺伝子座で優先的に濃縮される。
いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座における試料中のＤＮＡを優先的に濃縮することは、複数の環状化前プローブ（ｐｒｅ－ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｐｒｏｂｅ）を得ることであって、各プローブが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、プローブの３’及び５’末端が、少数の塩基によって、遺伝子座の多型部位から分離されているＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１～２５、２６～３０、３１～６０、又はこれらの組み合わせである、複数の環状化前プローブを得ることと、環状化前プローブを試料からのＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ハイブリダイズしたプローブ末端間のギャップを埋めることと、環状化前プローブを環状化することと、環状化プローブ（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｐｒｏｂｅ）を増幅することと、を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座におけるＤＮＡを優先的に濃縮することは、複数のライゲーション媒介ＰＣＲプローブを得ることであって、各ＰＣＲプローブが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、上流及び下流ＰＣＲプローブが、ＤＮＡの一方の鎖上の、少数の塩基によって遺伝子座の多型部位から分離されているＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１～２５、２６～３０、３１～６０、又はそれらの組み合わせである、複数のライゲーション媒介ＰＣＲプローブを得ることと、ライゲーション媒介ＰＣＲプローブを第１の試料からのＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ＤＮＡポリメラーゼを使用してライゲーション媒介ＰＣＲプローブ末端間のギャップを埋めることと、ライゲーション媒介ＰＣＲプローブをライゲーションすることと、ライゲーションされたライゲーション媒介ＰＣＲプローブを増幅することと、を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座においてＤＮＡを優先的に濃縮することは、多型遺伝子座を標的とする複数のハイブリッド捕捉プローブを得ることと、ハイブリッド捕捉プローブを試料中のＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ハイブリダイズしていないＤＮＡのいくつか又は全てをＤＮＡの第１の試料から物理的に除去することと、を含む。
いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブは、多型部位に隣接しているが、重複していない領域にハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブは、多型部位に隣接しているが、重複していない領域にハイブリダイズするように設計され、隣接する捕捉プローブの長さは、約１２０塩基未満、約１１０塩基未満、約１００塩基未満、約９０塩基未満、約８０塩基未満、約７０塩基未満、約６０塩基未満、約５０塩基未満、約４０塩基未満、約３０塩基未満、及び約２５塩基未満からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブは、多型部位と重複する領域にハイブリダイズするように設計され、複数のハイブリッド捕捉プローブが、各多型遺伝子座について少なくとも２つのハイブリッド捕捉プローブを含み、各ハイブリッド捕捉プローブが、その多型遺伝子座における異なる対立遺伝子に相補的であるように設計される。
いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座でＤＮＡを優先的に濃縮することは、複数の内側順方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、内側順方向プライマーの３’末端が、多型部位から上流の、少数の塩基によって多型部位から分離されているＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、又は３１～６０塩基対からなる群から選択される、複数の内側順方向プライマーを得ることと、任意選択的に、複数の内側逆方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、内側逆方向プライマーの３’末端が、多型部位から上流の、少数の塩基によって多型部位から分離されているＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、又は３１～６０塩基対からなる群から選択される、複数の内側逆方向プライマーを得ることと、内側プライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを増幅して、アンプリコンを形成することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法はまた、複数の外側順方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側順方向プライマーが、内側順方向プライマーから上流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、複数の外側順方向プライマーを得ることと、任意選択的に、複数の外側逆方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側逆方向プライマーが、内側逆方向プライマーからすぐ下流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、複数の外側逆方向プライマーを得ることと、第１のプライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせること、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを増幅することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法はまた、複数の外側逆方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側逆方向プライマーが、内側逆方向プライマーからすぐ下流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、複数の外側逆方向プライマーを得ることと、任意選択的に、複数の外側順方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側順方向プライマーが、内側順方向プライマーから上流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、複数の外側順方向プライマーを得ることと、第１のプライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせること、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを増幅することと、を含む。
いくつかの実施形態において、第１の試料を調製することは、第１の試料中のＤＮＡにユニバーサルアダプターを付加することと、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して第１の試料中のＤＮＡを増幅することと、を更に含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンの少なくとも一部は、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、又は４５ｂｐ未満であり、分率は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡの増幅は、１つ又は複数の個々の反応体積で行われ、各個々の反応体積が、１００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、２００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、５００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、１，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、２，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、５，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、１０，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、２０，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、５０，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、又は１００，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対を含む。
いくつかの実施形態において、試料を調製することは、試料を複数の部分に分割することを更に含み、各部分のＤＮＡが、複数の多型遺伝子座のサブセットで優先的に濃縮される。いくつかの実施形態において、内側プライマーは、望ましくないプライマー二重鎖を形成する可能性が高いプライマー対を同定し、望ましくないプライマー二重鎖を形成する可能性が高いと同定されたプライマーの対のうちの少なくとも１つを複数のプライマーから除去することによって選択される。いくつかの実施形態において、内側プライマーは、標的化された多型遺伝子座の上流又は下流のいずれかにハイブリダイズするように設計されている領域を含み、任意選択的に、ＰＣＲ増幅を可能にするように設計されたユニバーサルプライミング配列を含む。いくつかの実施形態において、プライマーの少なくともいくつかは、個々のプライマー分子ごとに異なるランダム領域を更に含む。いくつかの実施形態において、プライマーの少なくともいくつかは、分子バーコードを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）標的遺伝子座を含む核酸試料に対して多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、（ｉ）少なくとも１，０００の異なるプライマー対、又は（ｉｉ）少なくとも１，０００の標的特異的プライマー及びユニバーサル若しくはタグ特異的プライマーのいずれかを使用して、少なくとも１，０００の異なる標的遺伝子座を同時に増幅して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することと、（ｂ）増幅産物を配列決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、マイクロアレイを使用することを含まない。
いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）標的遺伝子座を含む無細胞ＤＮＡ試料に対して多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、（ｉ）少なくとも１，０００の異なるプライマー対、又は（ｉｉ）少なくとも１，０００の標的特異的プライマー及びユニバーサル若しくはタグ特異的プライマーのいずれかを使用して、少なくとも１，０００の異なる標的遺伝子座を同時に増幅して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することと、（ｂ）増幅産物を配列決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、マイクロアレイを使用することを含まない。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植ドナー及び移植レシピエントの一方又は両方から遺伝子型データを得ることも含む。いくつかの実施形態において、移植ドナー及び移植レシピエントの一方又は両方から遺伝子型データを得ることは、ドナー及びレシピエントからのＤＮＡを調製することを含み、調製することが、調製されたＤＮＡを得るために複数の多型遺伝子座でＤＮＡを優先的に濃縮することと、任意選択的に、調製されたＤＮＡを増幅することと、複数の多型遺伝子座での調製された試料中のＤＮＡを測定することと、を含む。
いくつかの実施形態において、染色体上の複数の多型遺伝子座の対立遺伝子数の予測される確率の結合分布モデルを構築することは、移植ドナー及び移植レシピエントの一方又は両方から得られた遺伝子データを使用して行われる。いくつかの実施形態において、第１の試料は、移植レシピエント血漿から単離されており、移植レシピエントから遺伝子型データを得ることは、調製された試料に対して行われたＤＮＡ測定からレシピエント遺伝子型データを推定することによって行われる。
いくつかの実施形態において、優先的濃縮は、２倍以下、１．５倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０５倍以下、１．０２倍以下、１．０１倍以下、１．００５倍以下、１．００２倍以下、１．００１倍以下、及び１．０００１倍以下からなる群から選択される倍率の、調製された試料と第１の試料との間の対立遺伝子バイアスの平均度（ａｖｅｒａｇｅ ｄｅｇｒｅｅ）をもたらす。いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座は、ＳＮＰである。いくつかの実施形態において、調製された試料中のＤＮＡの測定は、配列決定によって行われる。
いくつかの実施形態において、診断ボックスは、移植レシピエントにおける移植状態を判定するのを助けるために開示され、診断ボックスは、開示される方法の調製及び測定ステップを実行することが可能である。
いくつかの実施形態において、対立遺伝子数は、バイナリではなく、確率的である。いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座での調製された試料中のＤＮＡの測定値を使用して、移植が１つ又は複数の連鎖したハプロタイプを受け継いでいるかどうかを判定する。
いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の確率の結合分布モデルを構築することは、染色体中の異なる位置で染色体が交差する確率に関するデータを使用して、その染色体上の多型対立遺伝子間の依存性をモデル化することによって行われる。いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の結合分布モデルを構築すること、及び各々の仮説の相対確率を決定するステップは、参照染色体の使用を必要としない方法を用いて行われる。
いくつかの実施形態において、各仮説の相対確率を決定することは、調製された試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の推定分率を利用する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の確率を計算し、各仮説の相対確率を決定する際に使用される調製された試料からのＤＮＡ測定値は、一次遺伝子データを含む。いくつかの実施形態において、最大確率を有する仮説に対応する移植状態の選択は、最大尤度推定値又は最大事後推定値を使用して実行される。
いくつかの実施形態において、移植状態を呼び出すことはまた、結合分布モデル及び対立遺伝子数確率を使用して決定された状態仮説の各々の相対確率と、リード数分析からなる群から得られた統計技術を使用して計算された状態仮説の各々の相対確率とを組み合わせることと、ヘテロ接合率、ドナー遺伝情報が使用される場合にのみ利用可能な統計量、特定のドナー／レシピエント状況についての正規化された遺伝子型シグナルの確率、第１の試料又は調製された試料の推定移植分率を使用して計算される統計量、及びそれらの組み合わせを比較することと、を含む。
いくつかの実施形態において、信頼度推定値は、呼び出された移植状態について計算される。いくつかの実施形態において、本方法はまた、呼び出された移植状態に基づいて臨床措置（ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎ）をとることを含む。
いくつかの実施形態において、判定された移植状態を表示するレポートは、本方法を使用して生成される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法とともに使用されるように設計された移植状態を判定するためのキットが開示され、本キットは、複数の内側順方向プライマー及び任意選択的に複数の内側逆方向プライマーを含み、プライマーの各々は、標的染色体及び任意選択的に更なる染色体上の多型部位のうちの１つからすぐ上流及び／又は下流のＤＮＡの領域ハイブリダイズするように設計され、ハイブリダイゼーション領域は、少数の塩基によって多型部位から分離されており、少数が、１、２、３、４、５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、３１～６０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、より短いｃｆＤＮＡを選択するための選択ステップを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｃｆＤＮＡを濃縮するためのユニバーサルアプリケーションステップを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量がカットオフ閾値を上回るという判定は、移植の急性拒絶反応を示す。機械学習を使用して、拒絶反応と非拒絶反応とを判定してもよい。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％）として表される。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡのコピー数として表される。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡのコピー数に、移植レシピエントの体重又は血液量を乗じたものとして表される。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、患者の体重又は血液量を考慮に入れる。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、以下のうちの１つ以上を考慮に入れる：血漿の体積当たりのドナーゲノムコピー、血漿の体積当たりの無細胞ＤＮＡ収率、ドナー身長、ドナー体重、ドナー年齢、ドナー性別、ドナー民族性、ドナー臓器質量、ドナー臓器、生体対死亡ドナー、関連対無関連ドナー、レシピエント身長、レシピエント体重、レシピエント年齢、レシピエント性別、レシピエント民族性、クレアチニン、ｅＧＦＲ（糸球体濾過率の推定値）、ｃｆＤＮＡメチル化、ＤＳＡ（ドナー特異的抗体）、ＫＤＰＩ（腎臓ドナープロファイル指標）、薬剤（免疫抑制、ステロイド、血液希釈剤など）、感染症（ＢＫＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＵＴＩ）、レシピエント及び／又はドナーＨＬＡ対立遺伝子又はエピトープミスマッチ、腎臓同種移植病理学のＢａｎｆｆ分類、並びに正当対監視又はプロトコル生検。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされる。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。
多重増幅
いくつかの実施形態において、本方法は、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列を決定する前に、１つの反応混合物中の複数の多型遺伝子座を増幅するための多重増幅反応を行うことを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列を決定する前に、１つの反応混合物中の複数の多型遺伝子座を増幅するための多重増幅反応を行うことを含む。
特定の例示的な実施形態において、核酸配列データは、多重増幅反応を用いて作成される一連のアンプリコンの複数のコピーの高スループットＤＮＡ配列決定を行うことによって作成され、一連のアンプリコンの各々のアンプリコンは、多型遺伝子座のセットの少なくとも１つの多型遺伝子座に広がり、このセットの多型遺伝子座の各々が増幅される。例えば、これらの実施形態において、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００の多型遺伝子座（例えば、ＳＮＰ遺伝子座）にわたってアンプリコンを増幅するマルチプレックスＰＣＲを行ってもよい。この多重反応は、単一の反応として、又は異なる部分集合の多重反応のプールとして設定することができる。本明細書で提供される多重反応方法（例えば、本明細書に開示される大規模マルチプレックスＰＣＲ）は、改良された多重化、したがって、感度レベルを達成するのに役立つように増幅反応を行う例示的なプロセスを提供する。
いくつかの実施形態において、増幅は、直接多重化ＰＣＲ、連続ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、二重ネスティッドＰＣＲ、片側及び片側半（ｏｎｅ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ｓｉｄｅｄ）ネスティッドＰＣＲ、完全ネスティッドＰＣＲ、片側完全ネスティッドＰＣＲ、片側ネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、三重ヘミネスティッドＰＣＲ、セミネスティッドＰＣＲ、片側セミネスティッドＰＣＲ、逆セミネスティッドＰＣＲ法、又は片側ＰＣＲを用いて行われ、これらは、２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号、米国公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国出願第１３／３００，２３５号、米国公開第２０１２／０２７０２１２号及び２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用される。いくつかの実施形態において、核酸試料において標的遺伝子座を増幅する方法は、（ｉ）核酸試料と、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００の異なる標的遺伝子座を同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリとを接触させ、単一反応混合物を生成することと、（ｉｉ）この反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えばＰＣＲ条件）に供して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することとを伴う。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５％が増幅される。様々な実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、又は０．０５％未満が、プライマーダイマーである。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態である（例えば、固相ではなく液相に溶解する）。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態であり、固体支持体に固定されていない。いくつかの実施形態において、プライマーは、マイクロアレイの一部ではない。
特定の実施形態において、多重増幅反応は、反応の少なくとも１／２について、制限されたプライマー条件で行われる。いくつかの実施形態において、制限されたプライマー濃度は、多重反応のうちの反応の１／１０、１／５、１／４、１／３、１／２、又は全てで使用される。ＰＣＲなどの増幅反応において制限されたプライマー条件を達成する上で考慮すべき因子が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態において、多重増幅反応は、例えば、２，５００～５０，０００の多重反応を含んでいてもよい。特定の実施形態において、以下の範囲の多重反応が行われる。範囲の下限で１００、２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００から、範囲の上限で２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００及び１００，０００まで。
一実施形態において、マルチプレックスＰＣＲアッセイは、１つ以上の染色体上の潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰ又は他の多型若しくは非多型の遺伝子座を増幅するように設計され、これらのアッセイは、単一反応で使用され、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲアッセイの数は、５０～２００ＰＣＲアッセイ、２００～１，０００ＰＣＲアッセイ、１，０００～５，０００ＰＣＲアッセイ又は５，０００～２０，０００ＰＣＲアッセイ（それぞれ、５０～２００反応分、２００～１，０００反応分、１，０００～５，０００反応分、５，０００～２０，０００反応分、２０，０００より多い反応分）であってもよい。一実施形態において、少なくとも約１０，０００ＰＣＲアッセイ（１０，０００反応分）のマルチプレックスプールは、潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰ遺伝子座単一反応を増幅し、血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料から得られたｃｆＤＮＡを増幅するように設計される。各遺伝子座のＳＮＰ頻度は、クローンによって、又はアンプリコンを配列決定するいくつかの他の方法によって判定されてもよい。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡ試料は、２つの試料に分割され、並行な５，０００反応分のアッセイが行われる。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡ試料は、ｎ個の試料に分割され、並行な（約１０，０００／ｎ）反応分のアッセイが行われ、ここで、ｎは、２～１２又は１２～２４又は２４～４８又は４８～９６である。
一実施形態において、本明細書に開示される方法は、高効率な高度に多重化された標的化ＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅し、その後、高スループット配列決定によって、各標的遺伝子座での対立遺伝子頻度を判定する。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする１つの技術は、互いにハイブリダイズする可能性が低いプライマーを設計することを伴う。ＰＣＲプローブは、典型的にはプライマーと呼ばれ、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、又は少なくとも５０，０００の潜在的なプライマー対との間の潜在的に有害な相互作用又はプライマーと試料ＤＮＡとの間の意図していない相互作用の熱力学的モデルを作成し、次いで、このモデルを用いて、プール中の他の設計と不適合な設計を除外することによって選択される。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする別の技術は、標的化ＰＣＲに対して、部分的又は完全なネスティング手法を用いることである。これらの手法の１つ又は組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００又は少なくとも５０，０００のプライマーの多重化が可能になり、得られた大部分のＤＮＡを含む増幅されたＤＮＡは、配列決定されると、標的遺伝子座にマッピングする。これらの手法の１つ又は組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて多数のプライマーの多重化が可能になり、得られた増幅されたＤＮＡは、標的遺伝子座にマッピングする５０％より多い、８０％より多い、９０％より多い、９５％より多い、９８％より多い、又は９９％より多いＤＮＡ分子を含む。
マルチプレックスＰＣＲから得られた遺伝子データを分析するために、バイオインフォマティクス法が使用される。本明細書に開示される方法に有用及び関連するバイオインフォマティクス法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／００２５１０９号に見出すことができる。
高スループット配列決定
いくつかの実施形態において、アンプリコンの配列は、高スループット配列決定を行うことにより決定される。
いくつかの実施形態において、アンプリコンの配列は、高スループット配列決定を行うことにより決定される。
移植レシピエント及び／又は移植ドナーの遺伝子データは、これらに限定されないが、遺伝子型判定マイクロアレイ及び高スループット配列決定を含む群から得られるツール及び／又は技術を使用して、適切な遺伝子材料を測定することによって、分子状態から電子状態に変換され得る。いくつかの高スループット配列決定法としては、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定、パイロシーケンシング、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡプラットフォーム、ＩＬＬＵＭＩＮＡのゲノムアナライザ、又はＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭの４５４配列決定プラットフォーム、ＨＥＬＩＣＯＳのＴＲＵＥ ＳＩＮＧＬＥ ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧプラットフォーム、ＨＡＬＣＹＯＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲの電子顕微鏡配列決定法、又は任意の他の配列決定法が挙げられる。いくつかの実施形態において、高スループット配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）上で行われ、続いて、ヒト参照ゲノムへの脱多重化及びマッピングが行われる。これらの方法は全て、ＤＮＡの試料に格納された遺伝子データを、処理される途中のメモリデバイスに典型的に格納される遺伝子データのセットに物理的に変換する。
いくつかの実施形態において、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列は、マイクロアレイ分析を行うことによって決定される。一実施形態において、マイクロアレイは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＮＰマイクロアレイ、又はＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＳＮＰマイクロアレイであってもよい。
いくつかの実施形態において、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析を行うことによって決定される。ｑＰＣＲは、特定の時間（概して増幅サイクルごとに）における蛍光の強度を測定し、標的分子（ＤＮＡ）の相対量を決定する。ｄｄＰＣＲは、各分子が１つのドロップレット内にあるため、実際の分子数（標的ＤＮＡ）を測定し、したがってそれを別個の「デジタル」測定値とする。これは、ｄｄＰＣＲが試料の陽性分率、すなわち適切な増幅により蛍光している液滴の数を測定するため、絶対的な定量化を提供する。この陽性分率は、鋳型核酸の初期量を正確に示す。
トレーサーＤＮＡ及びその使用
試料中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するためのトレーサーＤＮＡは、２０２０年５月２９日に出願され、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題された米国仮出願第６３／０３１，８７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、非ヒト起源のＤＮＡ分子を含む。
試料中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するためのトレーサーＤＮＡは、２０２０年５月２９日に出願され、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題された米国仮出願第６３／０３１，８７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、非ヒト起源のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、約５０～５００ｂｐ、又は約７５～３００ｂｐ、又は約１００～２５０ｂｐ、又は約１２５～２００ｂｐ、又は約１２５ｂｐ、又は約１６０ｂｐ、又は約２００ｂｐ、又は約５００～１，０００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、同じ又は実質的に同じ長さを有するＤＮＡ分子、例えば約１２５ｂｐ、又は約１６０ｂｐ、又は約２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、異なる長さを有するＤＮＡ分子、例えば、約１２５ｂｐの長さを有する第１のＤＮＡ分子、約１６０ｂｐの長さを有する第２のＤＮＡ分子、及び約２００ｂｐの長さを有する第３のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、異なる長さを有するＤＮＡ分子を使用して、試料中の無細胞ＤＮＡのサイズ分布を判定する。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは標的配列を含み、標的配列は、プライマーの対に結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡの少なくとも一部は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列をバーコードで置き換えることによって、内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対はまた、バーコードを含むトレーサーＤＮＡの一部を増幅することもできる。
いくつかの実施形態において、バーコードは、任意のバーコードである。いくつかの実施形態において、バーコードは、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、複数の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、プライマーの第１の対に結合可能なプライマー結合部位の第１の対の間に位置する第１のバーコードと、プライマーの第２の対に結合可能なプライマー結合部位の第２の対の間に位置する第２のバーコードを含む、第１の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２の標的配列は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列をバーコードで置き換えることによって、１つ以上の内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計される。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のバーコードは、任意のバーコードである。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のバーコードは、第１又は第２のプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の第１及び／又は第２の標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の第１及び／又は第２の標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、同じ又は実質的に同じ配列を有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、異なる配列を有するＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、第１の標的配列を含む第１のＤＮＡと、第２の標的配列を含む第２のＤＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に位置する異なるバーコードを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に位置する異なるバーコードを有し、異なるバーコードは、同じ長さ又は実質的に同じ長さを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に位置する異なるバーコードを有し、異なるバーコードは、異なる長さを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、異なる内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計され、したがって、異なるプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡの量及び第２のＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡにおいて同じ又は実質的に同じである。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡの量及び第２のＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡにおいて異なる。
トレーサーＤＮＡを使用した全無細胞ＤＮＡの量の判定
特定の実施形態において、トレーサーＤＮＡを使用して、本明細書に記載の方法の正確さ及び精度を改善し、より広い入力範囲にわたる定量化に役立ち、異なるサイズ範囲での異なるステップの効率を評価し、及び／又は入力材料の断片サイズ分布を計算することができる。
特定の実施形態において、トレーサーＤＮＡを使用して、本明細書に記載の方法の正確さ及び精度を改善し、より広い入力範囲にわたる定量化に役立ち、異なるサイズ範囲での異なるステップの効率を評価し、及び／又は入力材料の断片サイズ分布を計算することができる。
本発明のいくつかの実施形態は、生体試料中の全無細胞ＤＮＡの量を定量化する方法に関し、本方法は、ａ）生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡが、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡに由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の前に、第１のトレーサーＤＮＡを全血試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の後及び無細胞ＤＮＡの単離の前に、第１のトレーサーＤＮＡを血漿試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡを添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡを添加することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、標的化増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡを添加することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的化増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡを添加することを更に含む。
いくつかの実施形態において、試料中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡのＮＯＲ（バーコードによって識別可能）、試料ＤＮＡのＮＯＲ、及び血漿試料に添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡのＮＯＲと試料ＤＮＡのＮＯＲとの間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量化する。いくつかの実施形態において、バーコードのＮＯＲと対応する内因性ゲノム配列のＮＯＲとの間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量化する。いくつかの実施形態において、この情報を血漿体積とともに使用して、血漿の体積当たりのｃｆＤＮＡの量を計算することもできる。いくつかの実施形態において、これらは、ドナーＤＮＡのパーセンテージを乗じて、全ドナーｃｆＤＮＡ及び血漿の体積当たりのドナーｃｆＤＮＡを計算することができる。
したがって、一態様において、本発明は、生体試料中の全無細胞ＤＮＡの量を定量化する方法に関し、本方法は、ａ）生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含む。
更なる態様において、移植レシピエントの生体試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化する方法に関し、本方法は、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量化することであって、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量化される、定量化することと、を含む。
更なる態様において、本発明は、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量化することであって、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量化される、定量化することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を閾値と比較することによって、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定することであって、閾値は、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定される、判定することと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態において、閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの配列決定リード数の関数である。
いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の範囲外である場合、試料にフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値を上回る場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値未満である場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の前に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を全血試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の後及び無細胞ＤＮＡの単離の前に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を血漿試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、標的化増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的化増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる配列を有する複数のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる濃度を有する複数のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を使用して、試料中の無細胞ＤＮＡのサイズ分布を判定する。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、非ヒト起源の複数のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物はそれぞれ標的配列を含み、標的配列は、プライマー対のうちの１つに結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む。いくつかの実施形態において、バーコードは、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡのリード数と試料ＤＮＡのリード数との間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量化する。いくつかの実施形態において、バーコードのリード数と対応する内因性ゲノム配列のリード数との間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量化する。
いくつかの実施形態において、標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、５０～５００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、７５～３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、１００～２５０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、１２５～２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約１６０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約１２５ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、５００～１，０００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも１００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも２００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも５００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも１，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも２，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも５，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的化増幅は、単一反応体積において少なくとも１０，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。
いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約３５～２００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約５０～１００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６０～７５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、同種移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、異種移植を受けている。
いくつかの実施形態において、移植は、ヒト移植である。いくつかの実施形態において、移植は、ブタ移植である。いくつかの実施形態において、移植は、非ヒト動物からの移植である。
いくつかの実施形態において、移植は、臓器移植、組織移植、又は細胞移植である。いくつかの実施形態において、移植は、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、心臓／肺移植、胃移植、精巣移植、陰茎移植、卵巣移植、子宮移植、胸腺移植、顔面移植、手移植、脚移植、骨移植、骨髄移植、角膜移植、皮膚移植、膵島細胞移植、心臓弁移植、血管移植、又は輸血である。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植拒絶反応を、抗体媒介性移植拒絶反応、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応、移植片傷害、ウイルス感染、細菌感染、又は境界性拒絶反応として判定することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のがんの可能性を定量化することを更に含む。がんスクリーニング、検出、及びモニタリングは、ＰＣＴ特許公開第２０１５／１６４４３２号、同第２０１７／１８１２０２号、同第２０１８／０８３４６７号、及び同第２０１９／２００２２８号に開示されており、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、本発明は、患者をスクリーニングして、１つ以上のがん治療に対する患者の予測される応答性又は耐性を判定することに関する。この判定は、標的遺伝子の野生型対変異型の存在、又は場合によっては標的遺伝子の増加又は過剰発現を判定することによって行うことができる。そのような標的スクリーニングの例としては、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＫＩＴ等が挙げられる。例えば、様々なＫＲＡＳ変異が本発明によるスクリーニングに好適であり、これらに限定されないが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ａ１８Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎを含む。加えて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第２０１５／１６４４３２号、同第２０１７／１８１２０２号、同第２０１８／０８３４６７号、及び同第２０１９／２００２２８号。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、レシピエント遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー及び／又はレシピエント遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法を実施する前に、ドナー又はレシピエントのいずれかの遺伝子型判定は必要とされない。
いくつかの実施形態において、生体試料は、血液試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、血清試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、尿試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、リンパ液である。いくつかの実施形態において、試料は、固形組織試料である。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから複数の生体試料を長期的に採取することと、採取した各試料についてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、を更に含む。
いくつかの実施形態において、定量化ステップは、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡの合計のうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを判定することを含む。いくつかの実施形態において、定量化ステップは、ドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数を判定することを含む。いくつかの実施形態において、定量化ステップは、血液試料の体積単位当たりのドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数を判定することを含む。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおける移植を、急性拒絶反応を生じているものとして診断する方法に関し、本方法は、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量化することとを含み、閾値を超えるドナー由来無細胞ＤＮＡの量は、移植が急性拒絶反応を生じていることを示し、閾値が、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定され、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列リードを使用して定量化される。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおける免疫抑制療法をモニタリングする方法に関し、本方法は、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含み、時間間隔にわたるドナー由来無細胞ＤＮＡのレベルの変化が、移植状態を示し、ドナー由来無細胞ＤＮＡのレベルが、全無細胞ＤＮＡの量に応じてスケーリングされ、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量化される。
いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化がないこと又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、破裂した白血球から放出されたレシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、白血球を破裂又はアポトーシスさせることに起因するレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する、ユニバーサル増幅ステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植後に移植レシピエントから複数の血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料を長期的に採取することと、採取した各試料についてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントからの血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料を、約３ヶ月、又は約６ヶ月、又は約１２ヶ月、又は約１８ヶ月、又は約２４ヶ月などの期間にわたって採取及び分析することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから、約１週間、又は約２週間、又は約３週間、又は約１ヶ月、又は約２ヶ月、又は約３ヶ月などの間隔で血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料を採取することを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量がカットオフ閾値を上回るという判定は、移植の急性拒絶反応を示す。機械学習を使用して、拒絶反応と非拒絶反応とを判定してもよい。機械学習は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１９８１として２０１９年７月１６日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｌｌｉｎｇ Ｐｌｏｉｄｙ Ｓｔａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ」と題されたＷＯ２０２０／０１８５２２に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされる。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％）として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量に、移植レシピエントの体重、ＢＭＩ又は血液量を乗じたものとして表される。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、患者の体重、ＢＭＩ又は血液量を考慮に入れる。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、以下のうちの１つ以上を考慮に入れる：血漿の体積当たりのドナーゲノムコピー、血漿の体積当たりの無細胞ＤＮＡ収率、ドナー身長、ドナー体重、ドナー年齢、ドナー性別、ドナー民族性、ドナー臓器質量、ドナー臓器、生体対死亡ドナー、ドナーとレシピエントとの家族関係（又はその欠如）、レシピエント身長、レシピエント体重、レシピエント年齢、レシピエント性別、レシピエント民族性、クレアチニン、ｅＧＦＲ（糸球体濾過率の推定値）、ｃｆＤＮＡメチル化、ＤＳＡ（ドナー特異的抗体）、ＫＤＰＩ（腎臓ドナープロファイル指標）、薬剤（免疫抑制、ステロイド、血液希釈剤など）、感染症（ＢＫＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＵＴＩ）、レシピエント及び／又はドナーＨＬＡ対立遺伝子又はエピトープミスマッチ、腎臓同種移植病理学のＢａｎｆｆ分類、並びに正当対監視又はプロトコル生検。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも５０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも６０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対してＡＲを同定する際の特異性が少なくとも５０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも６０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。
全無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応を呼び出すための閾値の調整
本発明のいくつかの実施形態は、移植レシピエントの生体試料におけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化する方法に関し、本方法は、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含み、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量化される。
本発明のいくつかの実施形態は、移植レシピエントの生体試料におけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化する方法に関し、本方法は、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的化増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、を含み、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量化される。
いくつかの実施形態は、血漿量当たりのドナーＤＮＡの固定閾値、又は本明細書に記載されるように調整又はスケーリングされたもの等の固定されていないもののいずれかを使用する。これを判定する方法は、トレーニングデータセットを使用してパフォーマンスを最大化するアルゴリズムを構築することに基づいてもよい。また、患者の体重、年齢、又は他の臨床的要因などの他のデータを考慮してもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定することを更に含む。いくつかの実施形態において、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を判定し、カットオフ閾値を全無細胞ＤＮＡの量に従って調整又はスケーリングする。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数の関数である。
いくつかの実施形態において、本方法は、より正確に移植拒絶反応を評価するために、試料中の全ｃｆＤＮＡの量を考慮したスケール又は動的閾値メトリックを適用することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値を上回る場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値未満である場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。
実施例
実施例１
この非限定的な実施例のワークフローは、Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）に開示されているワークフローに対応し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。
実施例１
この非限定的な実施例のワークフローは、Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）に開示されているワークフローに対応し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。
血液試料
男性及び女性の成人又は若年成人の患者が、関連した、若しくは関連していない生体ドナー、又は関連していない死亡したドナーから腎臓を移植された。移植手術後の患者の採血の時点は、同種移植片生検の時点、又はラボプロトコルに基づいて事前に指定された様々な時間間隔であった。典型的には、試料は生検マッチングされ、臨床的機能障害及び生検時、又はプロトコル生検時（この時点では、ほとんどの患者は臨床的機能障害を有していなかった）に採血された。加えて、一部の患者は、移植後に連続血液採取を受けた。試験試料の選択は、（ａ）適切な血漿が利用可能であること、及び（ｂ）試料が生検情報と関連付けられているかに基づく。完全な３００試料コホートのうち、７２．３％は、生検の日に採血された。
男性及び女性の成人又は若年成人の患者が、関連した、若しくは関連していない生体ドナー、又は関連していない死亡したドナーから腎臓を移植された。移植手術後の患者の採血の時点は、同種移植片生検の時点、又はラボプロトコルに基づいて事前に指定された様々な時間間隔であった。典型的には、試料は生検マッチングされ、臨床的機能障害及び生検時、又はプロトコル生検時（この時点では、ほとんどの患者は臨床的機能障害を有していなかった）に採血された。加えて、一部の患者は、移植後に連続血液採取を受けた。試験試料の選択は、（ａ）適切な血漿が利用可能であること、及び（ｂ）試料が生検情報と関連付けられているかに基づく。完全な３００試料コホートのうち、７２．３％は、生検の日に採血された。
血液試料中のｄｄ－ｃｆＤＮＡ測定
無細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血漿試料から抽出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で製造業者の指示に従って定量化した。無細胞ＤＮＡを、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されているＮａｔｅｒａライブラリプレップキットを使用して、ライブラリ調製に入力した。ライブラリをプラトーにするために、１８サイクルのライブラリ増幅の修正を伴った。精製されたライブラリは、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されているように、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋを使用して定量化した。標的の濃縮は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．３２：１２３３－１２４１（２０１２）に記載の修正バージョンを使用して、１３，３９２個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を標的としてマルチプレックスＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を用いて達成した。次いで、試料当たり１０００万～１１００万リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎ（登録商標）で５０サイクルの単一末端でアンプリコンを配列決定した。
無細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血漿試料から抽出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で製造業者の指示に従って定量化した。無細胞ＤＮＡを、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されているＮａｔｅｒａライブラリプレップキットを使用して、ライブラリ調製に入力した。ライブラリをプラトーにするために、１８サイクルのライブラリ増幅の修正を伴った。精製されたライブラリは、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されているように、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋを使用して定量化した。標的の濃縮は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．３２：１２３３－１２４１（２０１２）に記載の修正バージョンを使用して、１３，３９２個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を標的としてマルチプレックスＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を用いて達成した。次いで、試料当たり１０００万～１１００万リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎ（登録商標）で５０サイクルの単一末端でアンプリコンを配列決定した。
ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲの統計分析
各試料において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡを測定し、拒絶状態と相関させ、結果をｅＧＦＲと比較した。該当する場合、全ての統計的検定は両側であった。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡの分布は、群間で激しく歪んでいたため、データは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定、続いてＤｕｎｎ多重比較検定を用いて、Ｈｏｌｍ補正ありで分析した。ｅＧＦＲ（ｍｇ／ｄＬでの血清クレアチニン）は、成人及び小児患者について前述のように計算した。簡単に述べると、ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン－１．１５４×年齢－０．２０３×（黒人の場合は１．２１０）×（女性の場合は０．７４２）である。
各試料において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡを測定し、拒絶状態と相関させ、結果をｅＧＦＲと比較した。該当する場合、全ての統計的検定は両側であった。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡの分布は、群間で激しく歪んでいたため、データは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定、続いてＤｕｎｎ多重比較検定を用いて、Ｈｏｌｍ補正ありで分析した。ｅＧＦＲ（ｍｇ／ｄＬでの血清クレアチニン）は、成人及び小児患者について前述のように計算した。簡単に述べると、ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン－１．１５４×年齢－０．２０３×（黒人の場合は１．２１０）×（女性の場合は０．７４２）である。
拒絶反応のマーカーとしてのｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲ（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）のパフォーマンスを評価するために、試料を、ＡＲ群及び非拒絶群（ＢＬ＋ＳＴＡ＋ＯＩ）に分けた。この分類を使用して、以下の所定のカットオフを使用して、試料をＡＲとして分類した：ｄｄ－ｃｆＤＮＡについては１％超、ｅＧＦＲについては６０．０未満。
各マーカーの性能パラメータ（感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）及び曲線下面積（ＡＵＣ））を計算するために、ブートストラップ法を使用して、患者内の反復測定を考慮した。簡単に述べると、各ブートストラップステップにおいて、各患者から単一の試料を選択した。患者間の独立性を仮定することにより、パフォーマンスパラメータ及びその標準誤差を計算した。これを１０，０００回繰り返した。最終信頼区間は、標準正規分位のブートストラップ標準誤差の平均を有するパラメータのブートストラップ平均を用いて計算した。感度及び特異性の標準誤差は、二項分布を仮定して計算し、ＰＰＶ及びＮＰＶについては正規近似を使用し、ＡＵＣについてはＤｅＬｏｎｇ法を使用した。パフォーマンスは、プロトコル生検と同時に採取された試料からなるサブコホートを含む、一致した生検を有する全ての試料について計算した。
ドナータイプ（生存する関連者、生存する非関連者、及び死亡した非関連者）によるｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルの差異もまた評価した。有意性は、上述のように、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定を用いて判定された。経時的なｄｄ－ｃｆＤＮＡの相互変動及び内部変動を、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ上の対数変換を用いた混合効果モデルを使用して評価し、患者内及び患者間の標準偏差の９５％信頼区間（ＣＩ）を、尤度プロファイル法を使用して計算した。
事後分析は、（ａ）ＮＰＶを最大化するための異なるｄｄ－ｃｆＤＮＡ閾値、並びに（ｂ）ＡＲ診断のためのＰＰＶを改善し得る経験的拒絶ゾーンを定義するためのｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲを組み合わせたものを評価した。全ての分析は、ＦＳＡ（Ｄｕｎｎ検定の場合）、ｌｍｅ４（混合効果モデリングの場合）、及びｐＲＯＣ（ＡＵＣ計算の場合）パッケージを使用してＲ ３．３．２を用いて行った。
生検試料
任意選択的に、腎生検を、病理学者によって盲検様式で分析し、活性拒絶反応（ＡＲ）について２０１７年のＢａｎｆｆ分類によって等級付けし、移植内Ｃ４ｄ染色を行って、急性体液性拒絶反応を評価した。活動性尿路感染症（ＵＴＩ）又は他の感染症の症例では、生検は行わなかった。移植「傷害」は、その以前の定常状態ベースライン値からの血清クレアチニンの２０％超の増加、及び活性拒絶（ＡＲ）、境界性拒絶（ＢＬ）、又は他の傷害（ＯＩ）（例えば、薬物毒性、ウイルス感染）のいずれかとして分類される関連する生検として定義された。活性拒絶反応は、最低でも以下の基準によって定義された：（１）間質性炎症（ｉ）スコア＞２を伴う尿細管炎（ｔ）スコア＞２若しくは血管変化（ｖ）スコア＞０のいずれかからなるＴ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、（２）糸球体炎（ｇ）スコア＞０若しくは尿細管周囲毛細血管炎スコア（ｐｔｃ）＞０若しくはｖ＞０を有し、Ｃ４ｄ＝２の原因不明の急性尿細管壊死／血栓性微小血管障害（ＡＴＮ／ＴＭＡ）を伴う、陽性ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）からなるＣ４ｄ陽性抗体媒介拒絶反応（ＡＢＭＲ）、又は（３）ｇ＋ｐｔｃ≧２かつＣ４ｄが０若しくは１のいずれかである原因不明のＡＴＮ／ＴＭＡを伴う陽性ＤＳＡからなるＣ４ｄ陰性ＡＢＭＲ。境界変化（ＢＬ）は、説明される原因（例えば、ポリオマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）／感染性原因／ＡＴＮ）なしで、ｔ１＋ｉ０、又はｔ１＋ｉ１、又はｔ２＋ｉ０によって定義された。ＢＬ変化に使用される他の基準は、ｇ＞０及び／若しくはｐｔｃ＞０、又はＤＳＡを伴わないｖ＞０、又はＣ４ｄ若しくは陽性ＤＳＡ、又は非ゼロｇ又はｐｔｃスコアを伴わない陽性Ｃ４ｄであった。正常（ＳＴＡ）同種移植片は、Ｂａｎｆｆスキーマによって定義されるような顕著な損傷病理の不在によって定義された。
任意選択的に、腎生検を、病理学者によって盲検様式で分析し、活性拒絶反応（ＡＲ）について２０１７年のＢａｎｆｆ分類によって等級付けし、移植内Ｃ４ｄ染色を行って、急性体液性拒絶反応を評価した。活動性尿路感染症（ＵＴＩ）又は他の感染症の症例では、生検は行わなかった。移植「傷害」は、その以前の定常状態ベースライン値からの血清クレアチニンの２０％超の増加、及び活性拒絶（ＡＲ）、境界性拒絶（ＢＬ）、又は他の傷害（ＯＩ）（例えば、薬物毒性、ウイルス感染）のいずれかとして分類される関連する生検として定義された。活性拒絶反応は、最低でも以下の基準によって定義された：（１）間質性炎症（ｉ）スコア＞２を伴う尿細管炎（ｔ）スコア＞２若しくは血管変化（ｖ）スコア＞０のいずれかからなるＴ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、（２）糸球体炎（ｇ）スコア＞０若しくは尿細管周囲毛細血管炎スコア（ｐｔｃ）＞０若しくはｖ＞０を有し、Ｃ４ｄ＝２の原因不明の急性尿細管壊死／血栓性微小血管障害（ＡＴＮ／ＴＭＡ）を伴う、陽性ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）からなるＣ４ｄ陽性抗体媒介拒絶反応（ＡＢＭＲ）、又は（３）ｇ＋ｐｔｃ≧２かつＣ４ｄが０若しくは１のいずれかである原因不明のＡＴＮ／ＴＭＡを伴う陽性ＤＳＡからなるＣ４ｄ陰性ＡＢＭＲ。境界変化（ＢＬ）は、説明される原因（例えば、ポリオマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）／感染性原因／ＡＴＮ）なしで、ｔ１＋ｉ０、又はｔ１＋ｉ１、又はｔ２＋ｉ０によって定義された。ＢＬ変化に使用される他の基準は、ｇ＞０及び／若しくはｐｔｃ＞０、又はＤＳＡを伴わないｖ＞０、又はＣ４ｄ若しくは陽性ＤＳＡ、又は非ゼロｇ又はｐｔｃスコアを伴わない陽性Ｃ４ｄであった。正常（ＳＴＡ）同種移植片は、Ｂａｎｆｆスキーマによって定義されるような顕著な損傷病理の不在によって定義された。
実施例２
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。実施例１に記載のワークフローは、２０２０年５月２９日に出願された、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題する米国仮出願第６３／０３１，８７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、無細胞ＤＮＡの抽出の前に血漿試料にＳＮＰ遺伝子座を各々含有する１つ以上のトレーサーＤＮＡを添加することによって修正される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対もまた、トレーサーＤＮＡを増幅する。試料中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡの配列リード数（バーコードによって識別可能）、試料ＤＮＡの配列リード数、及び血漿試料に添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。実施例１に記載のワークフローは、２０２０年５月２９日に出願された、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題する米国仮出願第６３／０３１，８７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、無細胞ＤＮＡの抽出の前に血漿試料にＳＮＰ遺伝子座を各々含有する１つ以上のトレーサーＤＮＡを添加することによって修正される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対もまた、トレーサーＤＮＡを増幅する。試料中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡの配列リード数（バーコードによって識別可能）、試料ＤＮＡの配列リード数、及び血漿試料に添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。
実施例３
非病原性及び遍在性ウイルスであるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）は、固形臓器移植レシピエントにおける免疫抑制及び移植拒絶反応に関連する。本発明者らは、腎移植レシピエント（ｎ＝６８７）及び健康な正常対照（ｎ＝５６）における血漿ＴＴＶ力価コピー／ｍＬ（ｃｐｓ／ｍＬ）を定量化した。ＴＴＶ力価は、移植後最初の３ヶ月間に約４対数倍に劇的に増加した後、わずかに減少し、経時的に安定した。低いＴＴＶレベルは、低リスクの拒絶反応（中央値７．７０Ｅ＋０５）と比較して、高リスクの同種移植拒絶反応（中央値７．４９Ｅ＋０４）に有意に対応する（ｐ＜０．００１）。移植後１８ヶ月以内の生検拒絶反応データを有する移植試料のサブグループのロジスティック回帰分析（ｎ＝８２）は、ＴＴＶ力価をドナー分率推定値（ＤＦＥ）＋ドナー由来無細胞ＤＮＡ、移植後の時間、年齢及び性別（ＤＦＥ＋）と組み合わせた場合、ＤＦＥ＋単独（ＡＵＣ＝０．８７）又はＴＴＶ単独（ＡＵＣ＝０．７２）と比較して、曲線下面積（ＡＵＣ）がＡＵＣ＝０．８９に増加することを明らかにした。ＴＴＶを追加すると、移植後１８ヶ月以内のサブグループにおけるＤＦＥ＋と比較した場合、感度（０．８４、９５％ＣＩ［０．６４、０．９５］対０．８０、９５％ＣＩ［０．５９、０．９３］）及び特異性（０．８６、９５％ＣＩ［０．７４、０．９４］対０．８２、９５％ＣＩ［０．７０、０．９１］）を増加させた。全体として、これらの結果は、ＴＴＶが免疫抑制及び同種移植拒絶反応に関連する非侵襲性バイオマーカーであることを示唆している。
非病原性及び遍在性ウイルスであるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）は、固形臓器移植レシピエントにおける免疫抑制及び移植拒絶反応に関連する。本発明者らは、腎移植レシピエント（ｎ＝６８７）及び健康な正常対照（ｎ＝５６）における血漿ＴＴＶ力価コピー／ｍＬ（ｃｐｓ／ｍＬ）を定量化した。ＴＴＶ力価は、移植後最初の３ヶ月間に約４対数倍に劇的に増加した後、わずかに減少し、経時的に安定した。低いＴＴＶレベルは、低リスクの拒絶反応（中央値７．７０Ｅ＋０５）と比較して、高リスクの同種移植拒絶反応（中央値７．４９Ｅ＋０４）に有意に対応する（ｐ＜０．００１）。移植後１８ヶ月以内の生検拒絶反応データを有する移植試料のサブグループのロジスティック回帰分析（ｎ＝８２）は、ＴＴＶ力価をドナー分率推定値（ＤＦＥ）＋ドナー由来無細胞ＤＮＡ、移植後の時間、年齢及び性別（ＤＦＥ＋）と組み合わせた場合、ＤＦＥ＋単独（ＡＵＣ＝０．８７）又はＴＴＶ単独（ＡＵＣ＝０．７２）と比較して、曲線下面積（ＡＵＣ）がＡＵＣ＝０．８９に増加することを明らかにした。ＴＴＶを追加すると、移植後１８ヶ月以内のサブグループにおけるＤＦＥ＋と比較した場合、感度（０．８４、９５％ＣＩ［０．６４、０．９５］対０．８０、９５％ＣＩ［０．５９、０．９３］）及び特異性（０．８６、９５％ＣＩ［０．７４、０．９４］対０．８２、９５％ＣＩ［０．７０、０．９１］）を増加させた。全体として、これらの結果は、ＴＴＶが免疫抑制及び同種移植拒絶反応に関連する非侵襲性バイオマーカーであることを示唆している。
背景移植医師は、移植前の状態、導入及び維持免疫抑制レジメン、移植片の機能、抗拒絶反応療法、栄養状態、及び基礎となる併存疾患の間の複雑な相互作用から生じる、患者の免疫抑制の正味の状態を評価することにおいて、依然として課題に直面している。免疫抑制剤の治療薬モニタリングは、現在の臨床診療で最も広く使用されている戦略と思われる。しかしながら、このアプローチは、厳密には薬物動態的な性質であり、所与の濃度でのＴ細胞応答における個体間変動又は併用免疫抑制レジメンの相乗効果を捕捉しない。免疫抑制の状態を反映する非侵襲性バイオマーカーの開発は、固形臓器移植レシピエントにおける維持免疫抑制を調整するための移植において、依然としてニーズが満たされていない。
ＴＴＶは、非常に蔓延している非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その血漿レベルは、宿主の免疫状態に関連している可能性がある。いくつかの研究は、同種異系移植レシピエントにおけるＴＴＶ血漿ＤＮＡレベルの有意な増加を報告し、ウイルス力価の上昇と免疫抑制及び拒絶反応などの移植関連合併症との相関を示唆している。したがって、本発明者らの主な目的は、ＴＴＶ力価が免疫抑制及び腎移植拒絶反応のリスクと関連しているかどうかを判定することであった。
方法
患者試料。腎移植レシピエントの血漿又はｃｆＤＮＡ試料（Ｐｒｏｓｐｅｒａ試験からのｎ＝６８７）を使用して、ＴＴＶをスクリーニングした。健康なヒト血漿は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。全ての試料は、米国に拠点を置く診療所からのものであり、患者は、研究使用に対する同意を提供した。移植後の期間は１０日～４０年であり、中央値は９ヶ月であった。全ｃｆＤＮＡ、ドナーの状態、ドナーの関係、性別、及びドナー分率推定値が既知であった。試料のサブグループでは、ＢＡＮＦＦ分類に従って、臨床的解釈を伴う組織学的生検で証明された移植拒絶反応状態も見られた。
患者試料。腎移植レシピエントの血漿又はｃｆＤＮＡ試料（Ｐｒｏｓｐｅｒａ試験からのｎ＝６８７）を使用して、ＴＴＶをスクリーニングした。健康なヒト血漿は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。全ての試料は、米国に拠点を置く診療所からのものであり、患者は、研究使用に対する同意を提供した。移植後の期間は１０日～４０年であり、中央値は９ヶ月であった。全ｃｆＤＮＡ、ドナーの状態、ドナーの関係、性別、及びドナー分率推定値が既知であった。試料のサブグループでは、ＢＡＮＦＦ分類に従って、臨床的解釈を伴う組織学的生検で証明された移植拒絶反応状態も見られた。
血漿からの核酸の抽出。２つの核酸抽出方法を使用して、ヒト血漿からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出した。まず、ＭａｇＭＡＸ（商標）ウイルス／病原体核酸単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ａ４２３５２）を使用して、製造業者のマニュアルに従って、３００μｌの血漿からＤＮＡ及びＲＮＡを単離し、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ抽出機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のプロトコルを自動化した。簡潔に、１０μｌのプロテイナーゼＫ、５３０μｌの結合溶液、及び２０μｌの全核酸磁気ビーズを、３００μｌの血漿に添加し、１２分間インキュベートし、ビーズを洗浄緩衝液及び８０％のエタノールで洗浄し、５０μｌの溶出溶液に核酸を溶出した。第２の核酸単離法は、Ｎａｔｅｒａの社内抽出法であった。
ＴＴＶプライマー、プローブ、及び参照の設計。ＴＴＶ ＤＮＡを定量化するために、本発明者らは、Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｈｉｒｏａｋｉ ｅｔ． ａｌ．「Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＴ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎｓ．」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８８．２（２００１）：３５８－３６８による設計に基づいて、プライマー及びプローブセットを用いたＴＴＶ定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを開発した。プライマー及びプローブを、ＴＴＶウイルス遺伝子型１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１７６１０．１）の完全なゲノムの５’－ＵＴＲのよく保存された領域（ヌクレオチド位置３０７５～３８５３及び１～３５２）に基づいて設計した（表１）。ゲノムデータベースＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑにおけるプライマーの分析により、これらのＴＴＶプライマーが、アネロウイルス科株の９３％をカバーすると推定されることが明らかになった。
Ｏｋａｍｏｔｏらの論文では、順方向及び逆方向のプライマーは、２つの不完全に指定された塩基を有する（表１）。Ｏｋａｍｏｔｏの順方向プライマーは、Ａ、Ｇ、又はＴであり得る記号「Ｄ」を有し、逆方向プライマーは、Ａ又はＧであり得る記号「Ｒ」を有する。本発明者らは、ＴＴＶウイルス遺伝子型１ａの配列に一致するように、これらの記号の両方をヌクレオチド「Ａ」で置換した。更に、プローブについては、単一のＴＡＭＲＡクエンチャーをＺＥＮ／Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（登録商標）（３’ＩＡＢｋＦＱ）の二重クエンチプローブに切り替え、単一クエンチプローブと比較して、バックグラウンドが低減され、優れた性能を発揮した（表１）。
この実験を行った時点で、市販のＴＴＶ参照ＤＮＡは利用できなかった。ＴＴＶのインビトロ転写は、様々な細胞株で調査されており、ウイルス産生につながる長期複製を達成することは困難である。学術研究室は、配列をベクターにクローニングすることによってＴＴＶゲノムを増幅したが、実験時点で、これらは産業用途に利用できなかった。したがって、５’ＵＴＲの同等に保存された配列は、異なるＴＴＶ亜株の約８３％をカバーするＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイの参照標準として機能するように設計された。この５００ｂｐのｇＢｌｏｃｋは、プライマー及びプローブに一致するヌクレオチド位置を含む（表１）。プライマー、プローブ、及びｇＢｌｏｃｋは、ＩＤＴによって製造された。
ＴＴＶの定量化。ＴＴＶ ＤＮＡを、２５μｌの反応体積中、鋳型としての５μｌの核酸溶液、４００ｎＭの順方向／逆方向プライマー、８０ｎＭのプローブ、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号４４４４９６４）、分子グレードの水、及びＴａｑＭａｎ（商標）外因性内部陽性対照（ＩＰＣ）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号４３０８３２１）を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。ｑＰＣＲサイクル条件は、１）５０℃で２分間の保持（ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）活性化）、２）９５℃で２分間の保持（ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）Ｆａｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの活性化）、並びに３）９５℃で１秒間の変性ステップ及び６０℃で２０秒間のアニーリング／伸長ステップによる４０サイクルのＰＣＲである。全ての反応を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。蛍光チャネルは、ＴＴＶ標的核酸についてはＦＡＭ、ＩＰＣについてはＶＩＣ、クエンチャーについてはＮＦＱ－ＭＧＢ、及びＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックスに存在する受動的参照についてはＲＯＸであった。各反応プレートに、１Ｅ＋０７、１Ｅ＋０６、１Ｅ＋０５、１Ｅ＋０４、１Ｅ＋０３、１Ｅ＋０２コピー／ｍＬ（ｃｐｓ／ｍＬ）、及び３つの陰性対照（分子グレードの水）、細胞株ＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、及び増幅対照－ＩＰＣブロックなし）で構成されるＴＴＶ参照ｇＢｌｏｃｋ標準をプレーティングした。ＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイは、Ｌｏｇ１Ｅ＋０３～１Ｅ＋１０ｃｐｓ／ｍＬの定量化検出範囲を有し、理論的検出限界（ＬＯＤ）は、２５μｌのＰＣＲ反応において１コピーであり、これは、３００μｌの血漿中に存在する３３コピーに対応する。
統計及びデータ解析。移植後の経時的なＴＴＶ力価の二変量解析をプロットして、ウイルス負荷動態を観察した。正則化ロジスティック回帰モデルを使用して、移植拒絶反応とＴＴＶ力価との間の関連性の効果サイズを推定した。いくつかの統計的検定（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ、Ｍａｎｔｅｌ－Ｈａｅｎｓｚｅｌ）、閾値ベースのモデル及び機械学習モデル（決定木、ロジスティック回帰、及びランダムフォレスト）を、データセットのサブグループで評価した。特徴重要度解析及び感度／特異性比較を使用して、拒絶反応を予測する上でのＴＴＶの重要性を判断した。統計及び機械学習試験の直交法として様々なモデルを用いた。テストとモデルとの間の一致は、本発明者らの発見により多くの自信を提供することができる。データ解析及びグラフィカルプロットの生成には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏソフトウェアｖ１．７．２、ＪＭＰ１２、Ｒ、及びＪｕｐｙｔｅｒを適用した。
マルチパラメータＡＩ法の説明。拒絶反応の予測の質に対する追加のＴＴＶ力価効果を定量化するために、ＴＴＶを特徴として組み込んだ機械学習モデルを、他の特徴を考慮して、変化していないものに対して比較した。他の特徴には、ＤＦＥ、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量、レシピエントの年齢、レシピエントの性別、ドナーの状態、ドナー／レシピエントの関係、及び移植後の時間が含まれた。ロジスティック回帰の場合、Ｌ２正則化パラメータは、訓練セットの交差検証を使用して導出した。ランダムフォレストの場合、過剰適合を回避するために、小さな最大深度の木を選択した。全てのモデルを、試験セット上で評価した。本発明者らは、ＴＴＶを特徴として組み込んだかどうかの、上記のモデル間の様々な閾値の曲線下面積（ＡＵＣ）、感度、及び特異性を比較した。また、上記の結果を、ＤＦＥ、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量、及びＴＴＶを予測因子として直接使用した閾値ベースのモデルと比較した。
結果
移植後のＴＴＶ負荷は、最初の３ヶ月でピークに達した。本発明者らは、ヒト血漿中のＴＴＶ力価コピー／ｍＬ（ｃｐｓ／ｍＬ）を測定するためのＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイを開発した。本発明者らは、ＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイを使用して、腎移植レシピエント（ｎ＝６８）及び健康で正常な対照（ｎ＝５６）の血漿試料をスクリーニングした。ＭａｇＭＡＸ（商標）ウイルス／病原体核酸単離キットを使用して、移植レシピエント血漿試料の７５％及び全ての対照からウイルス核酸を抽出した。生検一致試料の第２のコホートからの核酸を、Ｎａｔｅｒａの社内抽出法を使用して抽出した。Ｐｒｏｓｐｅｒａ及びＴＴＶスクリーニングの時点で、移植後１０日から２６年の血漿を採取した。ＴＴＶは、移植レシピエントの試料の９７％に存在したのに対し、健康で正常な対照では６１％であった。
移植後のＴＴＶ負荷は、最初の３ヶ月でピークに達した。本発明者らは、ヒト血漿中のＴＴＶ力価コピー／ｍＬ（ｃｐｓ／ｍＬ）を測定するためのＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイを開発した。本発明者らは、ＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイを使用して、腎移植レシピエント（ｎ＝６８）及び健康で正常な対照（ｎ＝５６）の血漿試料をスクリーニングした。ＭａｇＭＡＸ（商標）ウイルス／病原体核酸単離キットを使用して、移植レシピエント血漿試料の７５％及び全ての対照からウイルス核酸を抽出した。生検一致試料の第２のコホートからの核酸を、Ｎａｔｅｒａの社内抽出法を使用して抽出した。Ｐｒｏｓｐｅｒａ及びＴＴＶスクリーニングの時点で、移植後１０日から２６年の血漿を採取した。ＴＴＶは、移植レシピエントの試料の９７％に存在したのに対し、健康で正常な対照では６１％であった。
移植レシピエントは、正常対照（範囲＝０～１．４９Ｅ＋０５ｃｐｓ／ｍＬ；中央値＝３．２０Ｅ＋０２ｃｐｓ／ｍＬ）よりも有意に高い（ｐ≦１．０８Ｅ－０８）ＴＴＶ力価レベル（範囲＝０～２．２４Ｅ＋１０ｃｐｓ／ｍＬ；中央値＝４．２５Ｅ＋０５ｃｐｓ／ｍＬ）を有した（図１）。ＴＴＶ力価が高いことは、全てではないにしても、ほとんどの移植レシピエントが免疫抑制されているという事実を反映している。ＴＴＶ力価は、移植後最初の３ヶ月間に約４対数倍に劇的に増加した後、わずかに減少し、経時的に安定する（図１）。これは、導入、次いで維持免疫抑制療法レジメンに対応し得る。
低いＴＴＶレベルは、高リスクの同種移植拒絶反応に対応する。ＴＴＶが移植片拒絶のリスクを予測する可能性を有するかどうかを判定するために、ＴＴＶ力価を、高い又は低い同種移植拒絶反応のリスクの間で比較した。拒絶反応のリスクは、患者のＰｒｏｓｐｅｒａ結果（これは、ドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）を測定するＮａｔｅｒａの移植拒絶反応評価試験である）からＤＦＥによって判定した。低いＴＴＶレベルは、低リスクの拒絶反応（中央値７．４９Ｅ＋０４）と比較して、高リスクの拒絶反応（中央値７．７０Ｅ＋０５）に有意に対応する（ｐ＜０．００１）（図２）。高リスクの同種移植拒絶反応は、ＴＴＶ負荷の低下と一致する免疫活性の増加を示唆している。
ＴＴＶは、Ｐｒｏｓｐｅｒａの感度及び特異性の改善を提供する。本発明者らは、ＴＴＶが拒絶反応に関連しているかどうかを評価することを目的とした。その場合、このバイオマーカーを使用して、より高い感度と特異性でＰｒｏｓｐｅｒａの呼び出しを改善することができる。本発明者らは、試料の特定のサブグループ（ｎ＝１７１）に関する、生検で証明された拒絶反応の情報を有していた。これらの試料は、偽陰性（ｎ＝２０）、偽陽性（ｎ＝２１）、真陰性（ｎ＝８４）、及び真陽性（ｎ＝４７）の試料の混合物であった。この試料セットからのＰｒｏｓｐｅｒａ結果は、感度が７０．１％、特異性が８０．０％、ＰＰＶが６９．１％、ＮＰＶが８０．８％であった。
Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ及びＭａｎｔｅｌ－Ｈａｅｎｓｚｅｌの統計的検定、並びに閾値ベースの決定木、ロジスティック回帰、及びランダムフォレストの機械学習試験は、試料のセット全体を分析する場合、ＴＴＶが有意に感度及び／又は特異性を改善しないことが判明した。本発明者らは、ＴＴＶ力価に関して、移植後１１日～２５年の広範囲の時間がデータセットにかなりのノイズを加えたと仮定した。導入療法及び維持免疫抑制レジメンは、移植後最初の１８ヶ月で最も高い用量である。これは、文献に示されているように、最大レベルの免疫抑制及びＴＴＶ力価に対する最大の効果を提供する。したがって、本発明者らは、移植後１８ヶ月以内の試料のサブグループ（ｎ＝８２）に対して、ロジスティック回帰及びランダムフォレスト機械学習解析を行った。
移植後１８ヶ月以内の試料のサブグループでは、ロジスティック回帰ベースの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、ＤＦＥ＋単独（ＡＵＣ＝０．８７）又はＴＴＶ単独（ＡＵＣ＝０．７２）と比較して、ＴＴＶ力価をＤＦＥ＋に組み合わせた場合、ＡＵＣがＡＵＣ＝０．８９に増加したことを明らかにしている（図３）。ＴＴＶは、ロジスティック回帰ベースのモデルにおいて、ＤＦＥ＋単独と比較した場合、感度（０．８４、９５％ＣＩ［０．６４、０．９５］対０．８０、９５％ＣＩ［０．５９、０．９３］）及び特異性（０．８６、９５％ＣＩ［０．７４、０．９４］対０．８２、９５％ＣＩ［０．７０、０．９１］）を増加させた。これらの予備的な結果が小さな試料セットから導き出され、ＴＴＶ力価の患者間変動のために信頼区間は広いことに留意されたい。長期的な試料を使用した追加の研究により、ＴＴＶがＰｒｏｓｐｅｒａに追加され得る価値が更に定量化されるであろう。
まとめ。ＴＴＶ陽性移植血漿試料の割合、ＴＴＶ力価範囲、及び動態は、文献と一致しており、これは、本発明者らのＴＴＶ ｑＰＣＲアッセイが感度が高く、頑強であることを示唆している。本発明者らは、低いＴＴＶレベルが高リスクの同種移植拒絶反応に有意に対応することを示す。また、本発明者らは、ＴＴＶは、移植後１８ヶ月以内の試料において、ＤＦＥ＋単独と比較して、ＰｒｏｓｐｅｒａのＡＵＣを増加させ、感度及び特異性を増加させることを見出した。総合して、本発明者らのデータは、移植後１８ヶ月以内に最大の有用性を有する、Ｐｒｏｓｐｅｒａと併せて、移植拒絶反応の免疫抑制及びリスク層別化のための非侵襲性バイオマーカーとしてのＴＴＶ定量化の価値についての証拠を提供する。
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Claims (31)
- 移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法であって、
（ａ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、前記抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での前記抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、前記増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、前記配列決定リードに基づいてドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、
（ｃ）前記移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を測定することと、
（ｄ）前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応を示すカットオフ閾値を超えているかどうか、及び前記移植レシピエントが、免疫応答の減少又は増加を示すＴＴＶの量の増加又は減少を有するかどうかを判定することと、を含む、方法。 - 移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法であって、
（ａ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、前記抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での前記抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、前記増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、前記配列決定リードに基づいてドナー由来無細胞ＤＮＡの量及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を定量化することと、
（ｃ）前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能と、前記ＴＴＶの量又はその機能との組み合わせが、移植拒絶反応を示すカットオフ閾値を超えているかどうかを判定することと、を含む、方法。 - 前記ＴＴＶが、トルクテノウイルス１である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、ヒト対象である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、膵臓、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、胸腺、及び子宮から選択される１つ以上の移植された臓器を受けている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＴＶの量が、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、又は配列決定によって測定される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（ｂ）が、２００～５０，０００対の順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを使用する２００～５０，０００の標的遺伝子座のＰＣＲ増幅を含み、任意選択的に、ステップ（ｂ）が、５００～２０，０００対の順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを使用する５００～２０，０００の標的遺伝子座のＰＣＲ増幅を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カットオフ閾値が、全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージ又はその機能である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カットオフ閾値が、ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対濃度に比例する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 移植レシピエントにおいて免疫抑制療法を投与する方法であって、
（ａ）前記移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の量を測定することと、
（ｂ）前記移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を測定することと、
（ｃ）前記ＴＴＶの量又はその機能、及び前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能に従って、免疫抑制療法の投薬量を滴定することと、を含む、方法。 - 前記ＴＴＶが、トルクテノウイルス１である、請求項１１に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、ヒト対象である、請求項１１又は１２に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、膵臓、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、胸腺、及び子宮から選択される１つ以上の移植された臓器を受けている、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＴＶの量が、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、又は配列決定によって測定される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量が、
前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、前記抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での前記抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことと、
前記増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、前記配列決定リードに基づいて、前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量化することと、によって測定される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。 - 同じ移植レシピエントについてステップ（ａ）～（ｂ）を長期的に繰り返すことと、前記ＴＴＶの量又はその機能の長期的変化、及び前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の長期的変化を判定することと、を更に含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＴＶの量又はその機能の前記長期的変化、及び前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の前記長期的変化に従って、前記免疫抑制療法の前記投薬量を滴定することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記移植レシピエントがＴＴＶの量の長期的な減少及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量の長期的な増加を有する場合、免疫抑制療法の前記投薬量を増加させることを含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記移植レシピエントがＴＴＶの量の長期的な増加及びドナー由来無細胞ＤＮＡの量の長期的な減少を有する場合、免疫抑制療法の前記投薬量を減少させることを含む、請求項１８に記載の方法。
- 移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法であって、
（ａ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、前記抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での前記抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、前記増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、前記配列決定リードに基づいて、前記血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを定量化することと、
（ｃ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料中のトルクテノウイルス（ＴＴＶ）ＤＮＡの量を測定することと、
（ｄ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料中の前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は前記全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、並びに前記ＴＴＶ ＤＮＡの量に基づいて、前記移植レシピエントの拒絶反応のリスクを判定することと、を含む、方法。 - 移植拒絶反応の判定に有用な移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料に由来する増幅されたＤＮＡの組成物を調製する方法であって、
（ａ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、前記抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での前記抽出されたＤＮＡの標的化増幅を行うことによって、増幅されたＤＮＡの組成物を調製し、前記増幅されたＤＮＡを高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを取得し、前記配列決定リードに基づいて、前記血液、血漿、血清、若しくは尿試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージ、並びに前記血液、血漿、血清、又は尿試料中のトルクテノウイルス（ＴＴＶ）ＤＮＡの量を定量化することと、
（ｃ）前記移植レシピエントの前記血液、血漿、血清、又は尿試料中の前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び／又は前記全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、並びに前記ＴＴＶ ＤＮＡの量に基づいて、前記移植レシピエントの拒絶反応のリスクを判定することと、を含む、方法。 - 前記ＴＴＶが、トルクテノウイルス１である、請求項２１又は２２に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、ヒト対象である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、膵臓、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、胸腺、及び子宮から選択される１つ以上の移植された臓器を受けている、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＴＶの量が、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、又は配列決定によって測定される、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（ｂ）が、２００～５０，０００対の順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを使用する２００～５０，０００の標的遺伝子座のＰＣＲ増幅を含み、任意選択的に、ステップ（ｂ）が、５００～２０，０００対の順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを使用する５００～２０，０００の標的遺伝子座のＰＣＲ増幅を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植レシピエントの前記拒絶反応のリスクが、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、又は決定木機械学習解析を使用して判定される、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、又は決定木機械学習解析が、移植後の時間、移植レシピエント及び／若しくは移植ドナーの年齢、移植レシピエント及び／若しくは移植ドナーの性別、又は前記血液、血漿、血清、若しくは尿試料中の全無細胞ＤＮＡの量若しくはその機能から選択される１つ以上のパラメータを更に組み込む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液、血漿、血清、又は尿試料が、移植後１８ヶ月未満の前記移植レシピエントから得られる、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の方法。
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