JP2024510760A - Ｃｄ３およびｃｄ１９に二重特異性を有するｐｅｇ化ｔ細胞エンゲージャー - Google Patents

Ｃｄ３およびｃｄ１９に二重特異性を有するｐｅｇ化ｔ細胞エンゲージャー Download PDF

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Abstract

T細胞上のCD3およびB細胞上のCD19に対する二重親和性を有するT-BsAb(T-細胞-結合二重特異性抗体)、および自己免疫疾患の処置におけるその使用が提供される。特に、CD3およびCD19に対する二重親和性を有するPEG化T-BsAb、ならびに多発性硬化症(MS)および他の自己免疫疾患の処置におけるその使用が提供される。

Description

本国際特許出願は、2021年3月19日に出願の国際特許出願番号：PCT/CN2021/081765の利益を主張するものであり、その全内容はあらゆる目的のために参照により包含される。
本発明は、T細胞上のCD3およびB細胞上のCD19に対する二重親和性を有するT-BsAb(T-細胞-エンゲイジング二重特異性抗体)、および自己免疫疾患の処置におけるその使用に関する。特に、本発明は、CD3およびCD19に対する二重親和性を有するPEG化T-BsAbならびに多発性硬化症(MS)および他の自己免疫疾患の処置におけるその使用に関する。
自己免疫疾患は80以上の種類がある。遺伝、食事、感染および化学物質への曝露が関与している可能性がある(Campbell, A. W. 2014, Autoimmune Dis 2014, 152428)。B細胞は、自己組織を損傷する自己抗体を分泌し、抗原を提示し、炎症性T細胞を活性化し、サイトカインを産生することによって、自己免疫疾患の発症において重要な役割を果たしている(Sabatino, J. J. et. al. 2019, Nat Rev Neurosci 20, 728-745; Lee, D. S. W. et. al. 2020, Nat Rev Drug Discov, 1-21)。B細胞を枯渇させることは、自己免疫疾患の有効な治療戦略であることが証明されている((Hofmann, K. et. al. 2018, Front Immunol 9, 835)。FDAが承認したB細胞枯渇療法は、天疱瘡やMSのような臓器特異的疾患から、ANCA関連脈管炎、リウマチ性関節炎(RA)および全身性エリテマトーデス(SLE)のような全身性疾患まで、多数の自己免疫疾患に適用されている(Barnas, J. L., et. al. 2019, Curr Opin Immunol 61, 92-99)。これらの療法は主に、モノクローナル抗体を基礎とし、CD20やCD19などの表面マーカーを持つB細胞を標的とする(Townsend, M. J., et. al. 2010, Immunological Reviews 237, 264-283; Frampton, J. E. 2020, Drugs 80, 1259-1264)。しかし、抗CD20抗体(オクレリズマブ(ocrelizumab)、オファツムマブ(ofatumumab)、リツキシマブ(Rituximab))は、従来の免疫抑制療法に対して極めて難治性である、自己抗体を分泌する長寿命の形質細胞を効果的に除去することができない (Chen, D. et al. 2016, The Journal of Immunology 196, 1541-1549)。実際、リツキシマブ(Rituximab)での処置を受けたMS患者の約20％は、48週目に疾患の再発を経験している(Stephen L. Hauser, 2008, The New Engl and Journal of Medicine 358, 12)。抗CD20抗体療法では十分に除去されない、長期間生存する自己反応性形質細胞が、一定のサブセットのMS患者において疾患を再活性化させている可能性がある。CD19+B細胞は、多発性硬化症の発病においてより重要な役割を果たし、抗-CD19モノクローナル抗体は、MSのEAE(実験的自己免疫性脳脊髄炎)動物モデルの処置において、抗CD20抗体よりも優れた治療効果を示すことが報告されている(Chen, D. et al. 2016, The Journal of Immunology 196, 1541-1549)。しかし、抗-CD19抗体は、B細胞のほぼすべてのサブセットを標的として枯渇させ、これは、患者にウイルス感染の深刻な脅威を与える可能性がある。最近の研究では、B細胞枯渇剤を投与された患者は、ウイルス感染のリスクがより高く、重症化率や死亡率がより高いことが示された(Loarce-Martos, J. et al. 2020, Rheumatol Int 40, 2015-2021)。
すべてのCD19+ B細胞が自己免疫性の発病に関与しているわけではないので、すべてのCD19+ B細胞を枯渇させるのではなく、病態特異的なB細胞を標的とすることが、MSのような自己免疫疾患を処置するための、より効率的で有望かつ安全な治療法である。
一部の研究者は、T細胞ではなくCD19+ B細胞を標的にしてB細胞を細胞溶解することにより、ALL(急性リンパ芽球性白血病)を治療するとして承認されたT-BsAbまたはBiTE(二重特異性T細胞エンゲージャー(Engager、関連物質))であるブリナツモマブが、自己免疫疾患の処置の候補となる可能性を提案している(Musette, P. et. al. 2018, Front Immunol 9, 622)。しかしながら、臨床研究では、ブリナツモマブで処置された患者において、サイトカイン放出症候群(CRS)や中枢神経系(CNS)毒性が頻発することが示されている。ブリナツモマブの神経毒性が、炎症性サイトカインの急速な放出の原因である可能性が示唆されている(Topp, M. S. et al. 2012, Blood 120, 670-670; Portell, C. A., et. al. 2013, Clin Pharmacol 5, 5-11; Bargou, R. et al. 2008, Science 321, 974-977; Topp, M. S. et al. 2011, J Clin Oncol 29 2493-2498; Topp, M. S. et al. 2012, Blood 120, 5185-5187)。慢性疾患を処置する薬物の安全性の要件は、腫瘍に対する薬よりも厳格であることは十分に期待されるところである。自己免疫疾患は慢性疾患であるため、ブリナツモマブを自己免疫疾患の処置に使用するには、頻繁かつ重篤なCRSおよびCNS毒性が障壁となる。さらに、ブリナツモマブは循環半減期が1.25時間と短いため、携帯用ミニポンプによる持続的な点滴注入を介して投与され、これは、長時間の持続注入に伴う高い感染リスクに加え、癌患者に入院を強いることに繋がる(自己免疫疾患患者の治療における課題)(Portell, C. A., et. al. 2013, Clin Pharmacol 5, 5-11; Topp, M. S. et al. 2012, Blood 120, 5185-5187)1,2.
ブリナツモマブは血液癌の処置において大成功を収めたが、上記のような問題や課題から、T細胞との結合親和性を弱めたT-BsAbを開発することで、重度のCRS毒性と強力な細胞毒性を切り離し、サイトカインの放出を最小限に抑えながら、細胞毒性T細胞を効果的に活性化し、病的標的細胞との免疫シナプスを形成して標的細胞を死滅させることが望まれている。
一態様において、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の、式Ia:
［式中
Pは、非免疫原性ポリマーであり;
Tは、多官能性(例えば三官能性)小分子リンカー部分であり、かつ一つ、二つまたはそれ以上の同一または異なるポリペプチドと部位特異的にコンジュゲート(会合)できる一つ、二つまたはそれ以上の官能基を有し;
A1およびA2は、それぞれ独立して、抗体、例えば単鎖抗体(例えば単鎖の可変断片、scFv)、単一ドメイン抗体(ナノボディ)またはFabから選択され、ここで、A1およびA2の一方は抗原CD3を認識してそれに結合し、他方は抗原CD19を認識してそれに結合する］で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該対象に投与することを含む方法を提供する。抗原CD19を認識してそれに結合する抗体またはFabは、CD19の細胞外部分に結合し得る。抗原CD3を認識してそれに結合する抗体またはFabは、T細胞受容体複合体の中のCD3複合体サブユニット、すなわちCD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD3ゼータ、およびCD3エータのいずれか一つと結合することができる(Kuhns, M. S., et. al. 2006, Immunity 24, 133-139; 2008, Risueno, R. M.,. PLoS One 3, e1747)。
本発明の別の態様は、自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の、式Ib：
Figure 2024510760000002
 ［式中:
Pは、非免疫原性ポリマーであり;
Bは、Hであるか、または、C1-20アルキルおよびアリール、例えばC1-10アルキルおよびアリールから選択される末端キャッピング基であり、ここで、前記アルキルまたはアリールの一つまたはそれ以上の炭素は、場合によりヘテロ原子と置き換えられており;
Tは、二官能性スペーサーでの誘導体化および／または伸長の後、A1およびA2またはこれらの誘導体と部位特異的にコンジュゲートできる、一つ、二つまたはそれ以上の官能基を有する三官能性(例えばアミノ酸)リンカーであり、ここで、Tと(L1)aとの間の結合およびTと(L2)bとの間の結合は同一または異なっていてもよく;
L1およびL2は、それぞれ独立して、二官能性リンカー(例えばペプチド)であり;
aおよびbはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される整数であり;
A1およびA2は、それぞれ独立して、抗体、例えば単鎖抗体(例えば単鎖の可変断片、scFv)、単一ドメイン抗体(ナノボディ)またはFabから選択され、ここで、A1およびA2の一方は抗原CD3を認識してそれに結合し、他方は抗原CD19を認識してそれに結合し;そして
yは、1～10から選択される整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される整数である］
で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該対象に投与することを含む方法を提供する。
一態様において、抗原CD19を認識してそれに結合する抗体またはFabは、CD19の細胞外部分に結合し得る。いくつかの実施態様において、抗原CD19を認識してそれに結合する抗体は、抗CD19 scFvである。
いくつかの実施態様において、抗CD19 scFvは、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2024510760000003
本発明の別の態様において、抗原CD3を認識してそれに結合する抗体またはFabは、T細胞受容体複合体の中のCD3複合体サブユニット、すなわちCD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、およびCD3ゼータエータのいずれか一つと結合し得る。いくつかの実施態様において、抗原CD3を認識してそれ結合する抗体は、抗CD3 scFvである。
いくつかの実施態様において、抗CD3 scFvは、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2024510760000004
非免疫原性ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、炭水化物を基礎とするポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル-メタクリルアミド(HPMA)およびこれらのコポリマーからなる群から選択され得る。好ましくは、非免疫原性ポリマーは、PEG、例えば分岐状PEGまたは線状PEGである。いくつかの実施態様において、線状PEGまたは分岐状PEGの少なくとも一つの末端は、H、メチルまたは低分子量のアルキル基でキャッピングされている。PEGの総分子量は、3,000～100,000ダルトン、例えば、5,000～80,000ダルトン、10,000～60,000ダルトン、または20,000～40,000ダルトンであり得る。PEGは、不変の結合または開裂可能な結合を介して三官能性リンカーT部分に結合できる。
(L1)aまたは(L2)b内の結合、(L1)aとタンパク質A1との間の結合、(L2)bとタンパク質A2との間の結合、TとL1との間の結合またはTとL2との間の結合を形成する官能基(例えば、部位特異的コンジュゲーションのための官能基)は、アルキルハライド、酸ハロゲン化物(acid halide)、アルデヒド、ケトン、エステル、無水物、カルボン酸、アミド、アミン、ヒドラジド、アルキルヒドラジン、ヒドロキシ、エポキシド、チオール、マレイミド、2-ピリジルジチオバリアント、芳香族スルホンまたはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル(DBCO)、カルボニル、2-アミノ-ベンズアルデヒドまたは2-アミノ-アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、カリウムアシルトリフルオロボレート、O-カルバモイルヒドロキシルアミン、trans-シクロオクテン、テトラジン、トリアリールホスフィンなどからなる群から選択され得る。
いくつかの実施態様において、(L1)aおよび(L2)bは、それぞれ独立して、アジドおよびアルキンから形成される結合、マレイミドおよびチオールから形成される結合を含む。他の実施態様において、(L1)a、(L2)bおよびTは、それぞれ独立して、アミノ酸または、2～50個のアミノ酸単位を有するペプチドであり得る。いくつかの例において、アルキンは、ジベンゾシクロオクチル(DBCO)であり得る。
いくつかの他の実施態様において、Tはリシンであり、PはPEGであり、yは1であり、アルキンはジベンゾシクロオクチル(DBCO)である。
いくつかの実施態様において、A1およびA2の一方は、アジドタグ付き抗体、抗体鎖、抗体断片、単鎖抗体または単一ドメイン抗体から誘導されることができ、ここで、アジドは、それぞれの(L1)aまたは(L2)bにおいてアルキンにコンジュゲートしており；A1およびA2の他方は、チオールタグ付き抗体、抗体鎖、抗体断片、単鎖抗体または単一ドメイン抗体から誘導されることができ、ここで、チオールはそれぞれの(L1)aまたは(L2)bにおいてマレイミドにコンジュゲートしている。
上記の分子または化合物は、以下の工程を含む方法に従って製造することができる：(i)二つの異なるポリペプチド、例えば、二つの異なる抗体またはその改変形態と部位特異的にコンジュゲートできる末端二官能基を有する非免疫原性ポリマーを調製すること；および(ii)非免疫原性ポリマーを、抗CD3抗体(またはその抗原結合断片)および抗CD19抗体(またはその抗原結合断片)またはこれらの改変形態と段階的に部位特異的にコンジュゲートすることで、式IaまたはIbの化合物を形成すること。
あるいは、上記のPEG化T-BsAb分子または化合物は、チオールタグを有する抗CD3および抗CD19融合タンパク質を調製し、次いでPEGマレイミドなどのチオール特異的PEG試薬で融合タンパク質をPEG化すること、を含む方法に従って製造することができる。
本明細書に記載の方法および化合物で処置される自己免疫疾患には、天疱瘡、視神経脊髄炎/視神経脊髄炎-関連障害(NOD/NMOD)、多発性硬化症(MS)、ANCA関連脈管炎、リウマチ性関節炎(RA)、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)および全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、乾癬/乾癬性関節炎、アジソン病、グレーブス病、アトピー性皮膚炎、エリテマトーデス、1型糖尿病およびそのたのものが含まれる。上記のリストは排他的なものではなく、当業者であれば、本明細書に具体的に記載されていない他の自己免疫疾患も含めることを意図していることに気づくであろう。
いくつかの実施態様において、処置される自己免疫疾患はMSである。いくつかの実施態様において、前記疾患は、テクフィデラ(Tecfidera)、ジレニア(Gilenya)、タイサブリ(Tysabri)、オーバジオ(Aubagio)、マベンクラッド(Mavenclad)、コパキソン(Copaxone)、IFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アレムツズマブ(Alemtuzumab))、ナタリズマブ(Natalizumab)、抗CD19剤(イネビリズマブ(Inebilizumab)、オベキセリマブ(Obexelimab))、または抗CD20剤(リツキシマブ(Rituximab)、オクレリズマブ(ocrelizumab)、オファツムマブ(ofatumumab))などの化合物での従来の免疫抑制性療法に対して抵抗性または難治性を示すMSである。
いくつかの実施態様において、処置される疾患は、抗CD19または抗CD20モノクローナル抗体などのB細胞枯渇剤の投与に関連する療法に抵抗性または難治性を示す自己免疫疾患である。他の実施態様において、処置される疾患は、抗CD3x抗CD20の二重特異性抗体の投与に関連する療法に対して抵抗性または難治性を示す自己免疫疾患である。
いくつかの実施形態において、式IaまたはIbで示される化合物またはその薬学的に許容できる塩は、自己免疫疾患の処置の開始時(例えば、第一選択療法として)またはその後の処置(例えば、第二選択療法、第三選択療法または第四選択療法として)において対象に投与される。いくつかの実施態様において、自己免疫疾患はMSである。いくつかの実施態様において、化合物は、処置の中止後に再発したMSの処置に有効である。
いくつかの実施態様において、式IaまたはIbで示される化合物またはその薬学的に許容できる塩は、0.05mg/kg/回～50mg/kg/回の量で投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の化合物は、各処置サイクルについて4～8週間ごとに1～8回、または4～8週間に1～4回投与され、次いで、所望の結果が示されるまで、各サイクルについて1週間の休薬期間を設ける。
いくつかの実施態様において、有効量の本化合物は、自己免疫疾患を処置するための別の治療剤と同時にまたは順次に投与される。
本方法および化合物の利点は、本明細書に記載のPEG化抗CD3x抗CD19 T-BsAbsが、毒性を低減し、および／または先行医薬により遭遇した問題を克服することである。
別の態様において、本発明は、式IaまたはIbで示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を含み、場合により薬学的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、自己免疫疾患を処置するための第二の治療剤をさらに含む。いくつかの実施態様において、第二の治療剤は、小分子剤、例えばテクフィデラ(Tecfidera)、ジレニア(Gilenya)、タイサブリ(Tysabri)、オーバジオ(Aubagio)、マベンクラッド(Mavenclad);ペプチド剤、例えばコパキソン(Copaxone)、タンパク質生物製剤、例えばIFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アレムツズマブ(Alemtuzumab))、ナタリズマブ(Natalizumab);B細胞枯渇剤、例えば抗CD19剤(イネビリズマブ(Inebilizumab)、オベキセリマブ(Obexelimab)、第II相試験中)、抗CD20剤(リツキシマブ(Rituximab)、オクレリズマブ(ocrelizumab)、オファツムマブ(ofatumumab))から選択され得る。
一態様において、本発明は、対象において自己免疫疾患(例えばMS)を予防、処置または軽減するための医薬の製造における、式Ia、Ibで示される化合物またはその薬学的に許容できる塩、または上記の組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象において自己免疫疾患(例えばMS)の予防、処置または軽減に使用するための、式IaまたはIbで示される化合物またはその薬学的に許容できる塩、または上記の組成物を提供する。
本発明の一つまたはそれ以上の実施形態の詳細は、以下の説明および図面に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
実施例1におけるヒトCD19またはヒトCD3E&CD3Dタンパク質への結合親和性を比較するELISAアッセイ。
実施例2におけるJY108では、CD19-細胞に対する薬物特異的細胞毒性は観察されなかった。
実施例2におけるJY108によるPBMC中のB細胞の除去。
実施例2におけるJY108の有効性に対するE:T比の影響。
実施例2におけるJY108の有効性に対する細胞株の影響
実施例3におけるプレB ALL腫瘍モデルに対するJY108のインビボ有効性。
実施例4におけるJY108の薬物動態性質。
実施例5におけるトランスジェニック動物モデルにおける標的へのJY108の結合
実施例5におけるJY108のエフェクターとしてのトランスジェニックマウス(hCD3hCD19)の脾臓細胞。
実施例6において、JY108の単回投与量10mg/kgで急性毒性はなかった。
実施例7において、JY108によるヒト全血からのサイトカイン放出が少なかった。
実施例8において、JY108により、EAEの症状は有意に改善された。
実施例8における組織病理学的切片のLFB染色。
実施例8におけるJY108によるMOG特異的自己抗体の枯渇。
実施例9におけるJY108とMEDI-551の直接比較。
実施例10におけるJY108によるCD19+ B細胞の部分除去。
実施例10において、Breg細胞はMEDI-551およびJY108の両方に対して抵抗性である。
本発明の詳細な説明
本発明において、T細胞のヒトCD3およびB細胞のヒトCD19に対する二重親和性を有するPEG化T-BsAbsを用いて、自己免疫疾患、特にMSを処置する方法が提供される。PEG化T-BsAbsは、サイトカイン放出を最小限にしながら、病原性CD19発現B細胞を選択的に枯渇させることができる。
A.処置する方法
一態様において、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の、式Ia：
［式中
Pは、非免疫原性ポリマーであり;
Tは、多官能性(例えば三官能性)小分子リンカー部分であり、かつ一つ、二つまたはそれ以上の同一または異なるポリペプチドと部位特異的にコンジュゲートできる一つ、二つまたはそれ以上の官能基を有し;
A1およびA2は、それぞれ独立して、抗体、例えば単鎖抗体(例えば、単鎖の可変断片、scFv)、単一ドメイン抗体(ナノボディ)またはFabから選択され、ここで、A1およびA2の一方は、抗原CD3を認識してそれに結合し、他方は、抗原CD19を認識してそれに結合する］
で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該対象に投与することを含む方法を提供する。抗原CD19を認識してそれに結合する抗体またはFabは、CD19の細胞外に結合し得る。CD3を認識してそれに結合する抗体またはFabは、T細胞受容体複合体中のCD3複合体サブユニット、すなわちCD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD3ゼータエータのいずれか一つに結合することができる。
本発明の別の態様は、自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の、式Ib：
［式中:
Pは、非免疫原性ポリマーであり;
Bは、Hであるか、または、C1-20アルキルおよびアリール、例えばC1-10アルキルおよびアリールから選択される末端キャッピング基であり、ここで、前記アルキルまたはアリール中の一つまたはそれ以上の炭素は、場合によりヘテロ原子と置き換えられており;
Tは、二官能性スペーサーによる誘導体化および／または伸長の後にA1およびA2またはこれらの誘導体と部位特異的にコンジュゲートできる、一つ、二つまたはそれ以上の官能基を有する三官能性(例えばアミノ酸)リンカーであり、ここで、Tと(L1)aとの間の結合およびTと(L2)bとの間の結合は同一または異なっていてもよく;
L1およびL2は、それぞれ独立して、二官能性リンカー(例えばペプチド)であり;
aおよびbはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される整数であり;
A1およびA2は、それぞれ独立して、抗体、例えば単鎖抗体(例えば、単鎖の可変断片、scFv)、単一ドメイン抗体(ナノボディ)またはFabから選択され、ここで、A1およびA2の一方は、抗原CD3を認識してそれに結合し、他方は、抗原CD19を認識してそれに結合し;そして
Yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される整数である］
で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該対象に投与することを含む方法を提供する。
一態様において、抗原CD19を認識してそれに結合する抗体またはFabは、CD19の細胞外部分に結合し得る。いくつかの実施態様において、抗原CD19を認識してそれに結合する抗体は抗CD19 scFvである。
いくつかの実施態様において、抗CD19 scFvは、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2024510760000007
本発明の別の態様において、抗原CD3を認識しそれに結合する抗体またはFabは、T細胞受容体複合体中のCD3複合体サブユニット、すなわちCD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、およびCD3ゼータエータのいずれか一つに結合し得る。いくつかの実施態様において、抗原CD3を認識してそれに結合する抗体は、抗CD3 scFvである。
いくつかの実施態様において、抗CD3 scFvは、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2024510760000008
B.ポリマー部分P
化合物における非免疫原性ポリマーPは、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、炭水化物を基礎とするポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル-メタクリルアミド(HPMA)およびこれらのコポリマーからなる群から選択され得る。好ましくは、非免疫原性ポリマーは、PEG、例えば分岐状PEGまたは線状PEGである。いくつかの実施態様において、線状PEGまたは分岐状PEGの少なくとも一つの末端は、H、メチルまたは低分子量のアルキル基でキャッピングされている。PEGの総分子量は、3,000～100,000ダルトン、例えば、5,000～80,000ダルトン、10,000～60,000ダルトン、または20,000～40,000ダルトンであり得る。PEGは、不変の結合または開裂可能な結合を介して三官能性リンカーT部分に結合できる。
ポリマーは、官能基化、活性化、または反応パートナーとコンジュゲート化が可能な末端基を含み得る。末端基の非限定的な例としては、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオールおよびハライドなどが挙げられる。
いくつかの実施態様において、yは1であり、式Ibは、ペンダントポリマー鎖を有する化合物を示す。末端Bは、キャッピング基として機能してもよい。
いくつかの実施態様において、yは、2、3、4、5または6であり、式Ibは、分岐状ポリマー部分を含む化合物を示す。いくつかの実施態様において、［B-P］y中のBは、メチル、エチルおよびブチルなどの低分子量のC1-10アルキル基であり、ここで、炭素の一つまたはそれ以上は、ヘテロ原子(例えば、O、SおよびN)と置き換えられていてもよい。
本発明の別の実施態様において、代替の分岐状PEGを使用することができる。分岐状P部分は、式：
(B-PEG)mL-Si-Fiで示される化合物から誘導され得る。
式中：
PEGは、ポリエチレングリコールである。mは、好ましくは3000～50000ダルトンまたは所望によりそれ以上の総分子量を有するポリマーを提供するような、1より大きい整数である。Bは、メチルまたは他の低分子量のアルキル基である。Lは、二つまたはそれ以上のPEGが結合している官能性結合部分である。このような結合部分の例としては、任意のアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、リシン、または1,3-ジアミノ-2-プロパノール、トリエタノールアミン、二つを超える官能基が結合している任意の5員または6員の芳香環または脂肪族環が挙げられる。Sは、任意の開裂不可能なスペーサーである。Fは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、アミノ基などの末端官能基である。Iは0または1である。
iが0に等しい場合、式は、
(B-PEG)mL
［式中、PEG、m、BおよびLは、上記と同じ定義を有する］である。
C.三官能性リンカーT
Tは、P、(L1)aおよび(L2)bを結合する三官能性リンカーを示す。Tは、3つの官能基(非限定的例として、ヒドロキシル、アミノ、ヒドラジニル、カルボキシル、チオールおよびハライドを含む)の任意の組み合わせを有する分子から誘導され得る。三官能性リンカーの官能基は同一または異なっていてもよい。三官能性リンカーの官能基の一つまたはそれ以上は、Tと反応パートナーとの間の反応の前または後に、一つまたはそれ以上の他の基に変換され得る。例えば、ヒドロキシル基はメシレート基またはトシレート基に変換され得る。ハライドは、アジド基によって置換されていてもよい。Tの酸官能基は、末端アルキンを有するアミノ基とのカップリングによってアルキン官能基に変換され得る。
いくつかの実施態様において、Tは、システイン、リシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたは遺伝的にコードされるアルケンリシン(例えばN6-(ヘキサ-5-エノイル)-L-リシン)、2-アミノ-8-オキソノナン酸、m-またはp-アセチル-フェニルアラニン、β-ジケトン側鎖を有するアミノ酸(例えば2-アミノ-3-(4-(3-オキソブタノイル)フェニル)プロパン酸)、(S)-2-アミノ-6-(((1R,2R)-2-アジドシクロペンチルオキシ)カルボニルアミノ)ヘキサン酸、アジドホモアラニン、ピロリシンアナログN6-((プロプ-2-イン-1-イルオキシ)カルボニル)-L-リシン、(S)-2-アミノ-6-ペント-4-インアミドヘキサン酸、(S)-2-アミノ-6-((プロプ-2-イニルオキシ)カルボニルアミノ)ヘキサン酸、(S)-2-アミノ-6-((2-アジドエトキシ)カルボニルアミノ)ヘキサン酸、p-アジドフェニルアラニン、パラ-アジドフェニルアラニン、Nε-アクリロイル-l-リシン、Nε-5-ノルボルネン-2-イルオキシカルボニル-l-リシン、N-ε-(シクロオクト-2-イン-1-イルオキシ)カルボニル)-L-リシン、N-ε-(2-(シクロオクト-2-イン-1-イルオキシ)エチル)カルボニル-L-リシンおよび遺伝的にコードされるテトラジンアミノ酸(例えば4-(6-メチル-s-テトラジン-3-イル)アミノフェニルアラニン)からなる群から選択される天然または非天然アミノ酸から誘導され得る。
D.二官能性リンカーL1およびL2
リンカー部分L1およびL2はそれぞれ、リンカー鎖、内部結合および／または末端結合を含む。前記リンカー鎖は、アミノ酸または2～50個のアミノ酸残基を有するペプチド、または-(CH2)mXY(CH2)n-、-X(CH2)mO(CH2CH2O)p(CH2)nY-、-(CH2)mX-Y(CH2)n-、-(CH2)mヘテロシクリル-、-(CH2)mX-、-X(CH2)mY-から独立して選択され得て、ここで、m、nおよびpは、それぞれの場合において、独立して、0～25の範囲の整数であり;XおよびYは、それぞれの場合において、C(=O)、CR1R2、NR3、S、Oまたは不存在からなる群から独立して選択され、ここで、R1およびR2は、独立して、水素、C1-10アルキルまたは(CH2)1-10C(=O)を示し、R3は、HまたはC1-10アルキルであり、ここで、ヘテロシクリルは、マレイミド、歪んだアルケンおよびアルキン、アジドまたはテトラゾリル部分から誘導される。
一態様において、リンカー鎖は、-(CH2)aC(O)NR1(CH2)b-、-(CH2)aO(CH2CH2O)c-、-(CH2)aヘテロシクリル-、-(CH2)aC(O)-、-(CH2)aNR1-、-CR1=N-NR1-、-CR1=N-O-、-CR1=N-NR2-CO-、-N=N-CO-、-S-S-から独立して選択され、ここで、a、bおよびcはそれぞれ、すべてのサブユニットを含む0～25から独立して選択される整数であり；R1およびR2は、独立して、水素またはC1-C10アルキルを示す。
L1およびL2のヘテロシクリル結合基(内部位置または末端位置で)は、マレイミドを基礎とする部分から誘導され得る。適当な前駆体の非限定例には、N-サクシニミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N-サクシニミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、κ-マレイミドウンデカン酸N-サクシニミジル エステル(KMUA)、γ-マレイミド酪酸N-サクシニミジルエステル(GMBS)、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-(α-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMAS)、サクシニミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N-サクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチラート(SMPB)およびN-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)が含まれる。
あるいは、L1およびL2のヘテロシクリル結合基は、テトラゾリル、trans-シクロオクテン、アジドまたは歪んだアルキンであり得る。例えば、ヘテロシクリルトリアゾリル結合は、二つの異なるリンカー部分：アジドおよび歪んだアルキンのコンジュゲーションから形成され得る。このように、ヘテロシクリル基は結合点としても機能し得る。
いくつかの実施態様において、(L1)aおよび／または(L2)bは、
X1-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dC(O)-、または
X3-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dX2(CH2)eN R2、を含み、
ここで、X1、X2およびX3は、同一または異なっていてもよく、独立してヘテロシクリル基を示し;
a、b、c、dおよびeはそれぞれ、1～25から独立して選択される整数であり;そして
R1およびR2は、独立して、水素またはC1-C10アルキルを示す。
いくつかの実施態様において、X1および／またはX3は、マレイミドを基礎とする部分から誘導される。いくつかの実施態様において、X2はトリアゾリル基を示す。いくつかの実施態様において、R1およびR2はそれぞれ、水素を示す。いくつかの実施態様において、a、b、c、dおよびeはそれぞれ、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から独立して選択される整数である。
いくつかの他の非限定例示的実施態様において、リンカー部分L1およびL2はそれぞれ、N-サクシニミジル-4-(ヨードアセチル)-アミノベンゾエート(SIAB)、N-サクシニミジルヨードアセテート(SIA)、N-サクシニミジルブロモアセテート(SBA)およびN-サクシニミジル3-(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)から選択されるハロアセチルを基礎とする部分から誘導され得る。
E.結合基
本発明の化合物またはコンジュゲートの様々な部分は、様々な化学結合を介して結合され得る。例としては、アミド、エステル、ジスルフィド、エーテル、アミノ、カルバメート、ヒドラジン、チオエーテルおよびカーボネートがあるが、これらに限定されない。
例えば、PEG部分(P)の末端ヒドロキシル基が活性化され、次にリシン(T)と結合されることで、式IaまたはIbのPとTとの間に望ましい結合点が提供され得る。一方、TとL1またはL2との間の結合基は、リンカーL1またはL2のアミノ基とリジン(T)のカルボキシル基との反応から得られるアミドであってもよい。あるいは、TとL1またはL2との間の結合基は、Tのアミノ基とリンカーL1またはL2の活性化カルボキシル基との反応から得られるアミドであってもよい。化合物またはコンジュゲートの望ましい特性に応じて、抗体部分(A)と隣接リンカー(L1またはL2)との間、およびL1またはL2の個々のリンカー間またはリンカー内に、適切な結合基が導入され得る。
いくつかの実施態様において、化合物またはコンジュゲートの様々な部分間の結合基は、互いに固有の化学的親和性および選択性を有する一対の官能基のカップリングから誘導され得る。これらのタイプのカップリングまたは環形成は、特定のポリペプチドまたは抗体部位を導入するための部位特異的コンジュゲーションを可能にする。部位特異的コンジュゲーションにつながるこれらの官能基の非限定例としては、チオール、マレイミド、2'-ピリジルジチオバリアント、芳香族またはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル(DBCO)、カルボニル、2-アミノ-ベンズアルデヒドまたは2-アミノ-アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、カリウムアシルトリフルオロボレート、O-カルバモイルヒドロキシルアミン、trans -シクロオクテン、テトラジンおよびトリアリールホスフィンがある。
いくつかの実施態様において、(L1)aまたは(L2)bは、それぞれ独立して、アジドおよびアルキンから形成される結合、またはマレイミドおよびチオールから形成される結合を含み得る。他の実施態様において、(L1)a、(L2)bおよびTはそれぞれ、アミノ酸または2～50個のアミノ酸単位を有するペプチドであり得る。
いくつかの実施態様において、アルキンはジベンゾシクロオクチル(DBCO)であり得る。他の実施態様において、Tはリジンであり、PはPEGであり、そしてyは1であり、アルキンはジベンゾシクロオクチル(DBCO)である。別の実施形態では、A1およびA2の一方は、アジドタグ付き抗体、抗体鎖、抗体断片、単鎖抗体または単一ドメイン抗体から誘導され得て、ここで、アジドは、それぞれの(L1)aまたは(L2)bにおいてアルキンにコンジュゲートされており；A1およびA2の他方は、チオールタグ付き抗体、抗体鎖、抗体断片、単鎖抗体または一本鎖ドメイン抗体から誘導され得て、チオールはそれぞれの(L1)aまたは(L2)bにおいてマレイミドにコンジュゲートされている。
F.CD3およびCD19に二重特異性を有するPEG化T-BsAbの合成
いくつかの実施態様において、PはPEG部分を示す。いくつかの例示的な実施態様において、ヒドロキシル基またはカルボキシル基などのPEGの末端官能基を活性化し、Boc保護化リジンなどの三官能性小分子部分とコンジュゲートさせて、末端分岐状ヘテロ二官能性PEGを形成する。次に、新たに形成されたカルボキシル基を、アルキン基を有する小分子スペーサーとのカップリングによってアルキン基に変換させる。Boc脱保護後の裸のアミノ基は、マレイミド基を有する別の小分子スペーサーとコンジュゲートされ、末端分岐状マレイミド／アルキンヘテロ二官能性PEGを形成する。得られたマレイミド／アルキン末端分岐状ヘテロ二官能性PEGは、連続してチオールタグ付き単鎖抗CD3抗体およびアジドタグ付き単鎖抗CD19抗体と部位特異的にコンジュゲートされ、PEG化T-BsAbを形成する。
合成の詳細は、「Long Acting Multi-Specific Molecules and Related Methods」と題する特許出願WO 2018/075308Alに記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に包含される。
G.組成物／製剤
本発明はまた、本発明のPEG化T-BsAb分子を含み、任意に薬学的に許容できる担体とともに製剤化される組成物、例えば医薬組成物を提供する。例えば、本発明の医薬組成物は、CD3およびCD19の両方に結合するPEG化T-BsAb分子を含み得る。
本発明の治療用製剤は、所望する程度の純度を有するPEG化T-BsAbと任意の生理学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 1980, 16th edition, Osol, A. Ed.)を凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される用量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、例えばホスフェート、シトレート、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のタンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン;単糖類、二糖類、および他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む);キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);および／または非イオン性界面活性剤、例えばツイーン(TWEEN)、プルロニック(PLURONICS)、またはポリエチレングリコール(PEG)を含む。
製剤はまた、処置する特定の適応症に必要な一つを超える活性化合物、好ましくは互いに不利に影響しない相補的な活性を有する活性化合物を含有していてもよい。例えば、製剤はさらに別の抗体または抗自己免疫疾患剤を含んでいてもよい。このような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタシレート)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン中に封入され得る。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 1980, 16th edition, Osol, A. Ed.に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適当な例としては、PEG化T-BsAb分子を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放可能なマトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えば、LUPRON DEPOT(乳酸-グリコール酸コポリマーおよびリュープロリドアセテートからなる注射用ミクロスフェア)、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸などが挙げられる。エチレン-ビニルアセテートや乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子の放出を100日以上可能にし、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間体内に留まると、37℃で湿気にさらされる結果、変性または凝集が起こり、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与するメカニズムに応じて、安定化のための合理的な戦略が考案し得る。例えば、凝集メカニズムがチオ-ジスルフィド交換を介した分子間S-S結合形成であることが発見した場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発などにより、安定化を達成することができる。
本発明の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。併用療法に使用され得る治療薬の例としては、テクフィデラ(Tecfidera)、ジレニア(Gilenya)、タイサブリ(Tysabri)、オーバジオ(Aubagio)、マベンクラッド(Mavenclad);ペプチド剤、例えばコパキソン(Copaxone)、組み換えポリペプチドまたはタンパク質、例えばIFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アレムツズマブ(Alemtuzumab))、ナタリズマブ(Natalizumab);B細胞枯渇剤、例えば抗CD19剤(イネビリズマブ(Inebilizumab)、第II相試験中のオベキセリマブ(Obexelimab))、抗CD20剤(リツキシマブ(Rituximab)、オクレリズマブ(ocrelizumab)、オファツムマブ(ofatumumab)などがある。
インビボ投与に用いる製剤は無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜で濾過することにより容易に達成できる。無菌注射液は、活性化合物を必要量で、適切な溶媒よ、必要に応じて上に列挙した成分の一つまたは組み合わせに取り込むことにより調製することがで、次いで滅菌精密濾過を行う。一般に、分散液は、活性化合物を塩基性分散媒と上記に列挙した成分のうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことにより調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ無菌濾過した溶液から活性成分の粉末と所望の追加成分を得る真空乾燥と凍結乾燥(凍結乾燥)である。
H.用量
単一剤形を製造するように担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象および特定の投与様式に応じて変動する。単一剤形を製造するように担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、この量は、薬学的に許容できる担体との組み合わせで、活性成分の約0.01％～約99％、好ましくは約0.1％～約70％、最も好ましくは約1％～約30％の範囲である。
用量レジメンは、最適な所望の反応(例えば、治療的反応)が得られるように調整される。例えば、単一のボーラスが投与されてもよく、数回に分割した用量が経時的に投与されてもよく、用量は治療状況の緊急性によって指示されるように比例的に減少または増加されてもよい。投与の容易性および用量の均一性のために、投与単位剤形で非経腸組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位剤形とは、処置される対象に対する単位用量として適した物理的に離散した単位を示し；各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算されたあらかじめ定めされた量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の独特な特性および達成されるべき特定の治療効果、および(b)個人の過敏症の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、直接これに依存する。
本発明のPEG化T-BsAbを投与する場合、用量はの約0.0001～100mg/kg(宿主体重)、より通常は0.05～50mg/kg(宿主体重)の範囲である。例えば、用量は、0.01mg/kg体重、0.1mg/kg体重、1mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重または50mg/kg体重または0.1～10mg/kgの範囲内である。例示的な処置レジメンは、週に2回または3回、週に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、1ヶ月に1回、3ヶ月に1回または3～6ヶ月に1回の投与を必要とする。本発明のPEG化T-BsAb分子の好ましい用量レジメンは、静脈内投与を介する0.25mg/kg体重または1mg/kg体重を含み、PEG化T-BsAb分子は以下の投与スケジュールのいずれかを用いて投与される：(i)4週間ごとに8回投与し、次に3ヶ月ごとに投与する；(ii)2週間ごとに投与する；(iii)1mg/kg体重を1回投与し、次いで2週間ごとに0.25mg/kg体重を投与する。
あるいは、PEG化T-BsAb分子は徐放性製剤として投与され得て、その場合は投与回数を少なくする必要がある。用量と頻度は、患者におけるPEG化T-BsAb分子の半減期に依存する。一般に、高分子量のPEGで修飾されたT-BsAbは半減期が長い。投与量と投与頻度は、処置が予防的か治療的かに応じて変動する。予防的適用において、比較的低用量は長期間にわたって、比較的少ない間隔で投与される。一生処置を続ける患者もいる。治療的適用において、疾患の進行が抑えられるか終息するまで、また好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量の投与が必要とされることがある。その後、予防レジームで投与され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。選択される用量レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、採用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、採用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医療技術において周知の同様の要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存する。
本発明のPEG化T-BsAb分子の「治療的有効用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の予防をもたらす。例えば、MSの処置の場合、「治療的有効用量」は、未処置の対象と比較して、臨床スコアを好ましくは少なくとも約20％低下させ、より好ましくは少なくとも約40％低下させ、さらに好ましくは少なくとも約60％低下させ、さらに好ましくは少なくとも約80％低下させる。臨床スコアを低下させる剤または化合物の能力は、ヒト疾患における有効性が予測できる動物モデル系で評価され得る。あるいは、組成物のこの性質は、当業者に知られているアッセイによってインビトロでCD19+ B細胞を枯渇させる化合物の能力を調べることによって評価され得る。治療有効量の治療用化合物は、臨床スコアを低下させるか、または対象の症状を改善し得る。当業者であれば、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
I.投与
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の一つまたはそれ以上を使用して、一つまたはそれ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動する。本発明のPEG化T-BsAbの好ましい投与経路には、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、脊髄投与または他の非経腸投与の経路、例えば注射または注入による投与が含まれる。本明細書で使用される「非経腸投与」という語句は、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものであり、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。
あるいは、本発明のPEG化T-BsAbは、非経腸経路、例えば、局所投与、上皮投与または粘膜投与の経路、例えば、鼻腔内投与、経口投与、膣投与、直腸投与、舌下投与または局所投与の経路を介して投与され得る。
活性化合物は、移植物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの放出制御製剤のように、化合物が急速に放出されないように保護する担体とともに調製され得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など、生分解性で生体適合性のあるポリマーを用いてもよい。このような製剤を調製するための多くの方法は特許を取得しているか、当業者には一般的に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, 1978, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New Yorkを参照すること。
治療用組成物は、当該技術分野で知られている医療器具を用いて投与され得る。例えば、本発明の治療用組成物は、米国特許第5399163号、同第5383851号、同第5312335号、同第5064413号、同第4941880号、同第4790824号、および同第4596556号に開示されている装置のような無針皮下注射装置を用いて投与され得る。本発明に有用な周知の移植物およびモジュールの例としては、米国特許第4487603号、同第4486194号、同第4447233号、同第4447224号、および同第4475196号に記載されているものが挙げられる。これらの特許は引用により本明細書に包含される。このような他の多くの移植物、送達システム、およびモジュールは当業者に知られている。
J.処置
PEG化T-BsAbsで処置される疾患は、天疱瘡、視神経脊髄炎/視神経脊髄炎-関連障害(NOD/NMOD)、多発性硬化症(MS)、ANCA関連脈管炎、リウマチ性関節炎(RA)、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)および全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎、エリテマトーデス、1型糖尿病を含むがこれらに限定されないいずれかの自己免疫疾患であり得る。
本発明の一態様において、自己免疫疾患は多発性硬化症(MS)である。
別の態様において、自己免疫疾患は、以下に列挙するような以前の治療に対して難治性または抵抗性である。本発明の目的のために、難治性または抵抗性の自己免疫疾患は、以前の療法または処置に反応しないものとして定義される。自己免疫疾患は、処置開始時に抵抗性または難治性である場合もあれば、処置中に抵抗性または難治性になる場合もある。難治性自己免疫疾患には、処置開始時に反応しないもの、最初は短期間反応するがその後反応しなくなるものが含まれる。難治性自己免疫疾患には、従来の療法の一つによる処置には反応するが、その後の治療には反応しないものも含まれる。本発明の目的上、難治性自己免疫疾患はまた、処置により有効であると思われるが、処置中止後最大1年以内、場合によっては最大5年以内またはそれ以上に再発するものも包含する。従来の療法では、小分子剤、例えば、テクフィデラ(Tecfidera)、ジレニア(Gilenya)、タイサブリ(Tysabri)、オーバジオ(Aubagio)、マベンクラッド(Mavenclad);ペプチド剤、例えばコパキソン(Copaxone)、組み換えポリペプチドまたはタンパク質、例えばIFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アレムツズマブ(Alemtuzumab))、ナタリズマブ(Natalizumab);B細胞枯渇剤、例えば抗CD19剤(イネビリズマブ(Inebilizumab)、第II相試験中のオベキセリマブ(Obexelimab))、抗CD20剤(リツキシマブ(Rituximab)、オクレリズマブ(ocrelizumab)、オファツムマブ(ofatumumab))またはこれらの組み合わせを採用することができる。限定ではなく説明を容易にするために、難治性自己免疫疾患は抵抗性自己免疫疾患と互換性があることが理解されよう。
本発明の目的のために、抵抗性または難治性自己免疫疾患の処置の成功は、抵抗性または難治性の症状または状態が、本明細書に記載の処置の非存在下で観察されるものと比較した場合に、処置中および／または処置後に予防され、最小化され、または減弱されることを意味すると理解されるものとする。最小化され、減弱され、または予防された難治性の状態は、例えば、当該分野の当業者によって企図される臨床スコアによって限定され得る。一例において、難治性または抵抗性MS自己免疫疾患の処置の成功は、当該分野の当業者によって企図されるスコアが、本明細書に記載の処置の非存在下で観察されるスコアを下回る場合に起こるとみなされるものとする。いくつかの態様において、抵抗性または難治性の自己免疫疾患は、天疱瘡、視神経脊髄炎／視神経脊髄炎-関連障害(NOD／NMOD)、および多発性硬化症(MS)、ANCA関連脈管炎、リウマチ性関節炎(RA)、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)、および全身性エリテマトーデス(SLE)のような全身性疾患の一つまたはそれ以上であり得る。
特定の一態様において、抵抗性または難治性の自己免疫疾患は多発性硬化症(MS)である。
本発明は、小分子剤、ペプチド剤、タンパク質生物製剤、B細胞枯渇剤に対して抵抗性または難治性である自己免疫疾患を処置する方法を提供する。好ましい一態様において、本発明は、B細胞枯渇剤に対して抵抗性または難治性である自己免疫疾患を処置する方法を提供する。より好ましい態様において、本発明は、上記の従来療法に対して抵抗性または難治性であるMSを処置する方法を提供する。さらに好ましい態様において、本発明は、B細胞枯渇療法に対して抵抗性または難治性であるMSを治療する方法を提供する。
本発明の代替的態様において、本発明の処置方法は、本明細書に記載の化合物の有効量を、自己免疫疾患を有する哺乳動物に投与することを含む。別の態様において、本発明の処置方法は、抵抗性または難治性の自己免疫疾患を有する哺乳動物に、本明細書に記載の化合物の有効量を投与することを含む。さらに別の態様において、本発明は、小分子、ペプチド剤、タンパク質生物製剤、B細胞枯渇剤に対して抵抗性または難治性である自己免疫疾患を、第2の薬剤と組み合わせて処置する方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明の処置は、本明細書に記載の化合物の有効量を単独でまたは、第2の小分子、ペプチド剤、タンパク質生物学的製剤、および／またはB細胞枯渇剤と組み合わせて同時または順次に投与することを含む。PEG化T-BsAbsは、別の剤と同時または別の剤の投与後に投与され得る。したがって、本発明で採用される化合物は、第2の剤の処置中または処置後に投与され得る。例えば、第2の剤の非限定的リストには、小分子剤、例えばテクフィデラ(Tecfidera)、ジレニア(Gilenya)、タイサブリ(Tysabri)、オーバジオ(Aubagio)、マベンクラッド(Mavenclad);ペプチド剤、例えばコパキソン(Copaxone)、タンパク質生物製剤、例えばIFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アレムツズマブ(Alemtuzumab))、ナタリズマブ(Natalizumab);B細胞枯渇剤、例えば抗CD19剤(イネビリズマブ(Inebilizumab)、第II相試験中のオベキセリマブ(Obexelimab))、抗CD20剤(リツキシマブ(Rituximab)、オクレリズマブ(ocrelizumab)、オファツムマブ(ofatumumab))が含まれる。
本発明の特定の好ましい実施態様において、自己免疫疾患を処置する方法は、式:
［式中、mPEGの分子量は、10000～40000から選択され;aおよびbはそれぞれ、1～20から独立して選択される整数であり;Xは、C、N、Oから選択され;R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-10アルキルまたはシクロアルキルから選択される］
を有する化合物を投与することを含む。
本発明の特定の一実施態様において、自己免疫疾患を処置する方法は、以下の構造：
を有する化合物を投与することを含む。
式中、SCACD19(抗CD19 scFv)は、以下のアミノ酸配列を有し:
Figure 2024510760000011

そして
SCACD3(抗CD3 scFv)は、以下のアミノ酸配列を有する:
Figure 2024510760000012
上記の構造を有する化合物を、本明細書では「JY108」と称する。
K.用語の定義
本明細書で使用される用語「アルキル」とは、典型的には約1～25原子の長さの炭化水素鎖を意味する。このような炭化水素鎖は、好ましくは飽和であるが必ずしも飽和である必要はなく、分枝鎖であっても直鎖であってもよいが、典型的には直鎖が好ましい。用語C1-10アルキルとは、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10個の炭素を有するアルキル基を含む。同様に、C1-25アルキルには、1～25個の炭素を有するすべてのアルキルが含まれる。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、n-ペンチル、2-メチル-1-ブチル、3-ペンチル、3-メチル-3-ペンチルなどが挙げられる。本明細書において、「アルキル」は、3個以上の炭素原子が言及される場合、シクロアルキルを含む。特に断らない限り、アルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。
本明細書で使用される「官能基(function group)」または「官能基(functional group)」という用語は、有機合成の通常の条件下で、それが結合している実体と、典型的にはさらなる官能基を有する別の実体との間に共有結合を形成するために使用され得る基を意味する。「二官能性リンカー」とは、二つの官能基を有するリンカーであって、コンジュゲートの他の部位と介して二つの結合を形成するものを意味する。
本明細書で使用される用語「誘導体」とは、新たな官能基を導入するか、元の化合物の性質を調整する目的で、構造部分を追加して化学的に修飾した化合物を意味する。
本明細書で使用される用語「保護基」とは、特定の反応条件下で、分子内の特定の化学反応性官能基の反応を阻止またはブロックする部位を意味する。
本明細書で使用される用語「PEG」または「ポリ(エチレングリコール)」は、ポリ(エチレンオキシド)を意味する。本発明で使用するためのPEGは、典型的には、-(CH2CH2O)nn-の構造を含む。PEGは、種々の分子量、構造または幾何学形体を有し得る。PEG基は、典型的な合成反応条件下で容易に化学変換を受けないキャッピング基を含み得る。キャッピング基の例としては、-OC1-25アルキルまたは-Oアリールがある。
本明細書で使用される「リンカー」または「結合」という用語は、抗体およびポリマー部分などの相互結合部分を結合するために使用される原子または原子の集合体を意味する。リンカーは開裂可能であっても開裂不可能であってもよい。開裂可能なリンカーには、特定の生物学的または化学的条件下で開裂し得る基または部位を包含する。例としては、酵素的に開裂可能なジスルフィドリンカー、1,4-または1,6-ベンジルの除去、トリメチルロックシステム、ビシンベースの自己開裂可能なシステム、酸-不安定シリルエーテルリンカー、その他の光-不安定リンカーなどが挙げられる。
本明細書で使用される「結合基(linking group)」または「結合基(linkage group)」という用語は、化合物またはコンジュゲートの様々な部位を結合する官能基または部分を意味する。結合基の例としては、アミド、エステル、カルバメート、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバジド、カルボジイミド、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基、およびエステラーゼ不安定基が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、リンカー部分およびポリマー部分は、アミドまたはカルバメート結合基を介して互いに結合され得る。
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書ではポリマー中のアミノ酸残基の配置を表すために、互換的に使用される。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、希少アミノ酸や合成アミノ酸アナログに加えて、標準的な20種類の天然に存在するアミノ酸で構成されることがある。長さまたは翻訳後の修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)に関係なく、アミノ酸の鎖であれば何でもよい。
「組換え」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とは、組換えDNA技術によって産生された、すなわち、所望のペプチドをコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から産生されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。「合成」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、化学合成によって調製されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。用語「組換え」は、例えば細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、またはネイティブな核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されたこと、または細胞がそのように修飾された細胞から誘導されることを示す。本発明の範囲内には、一つまたはそれ以上の前述の配列と異種配列を含む融合タンパク質が含まれる。異種ポリペプチド、核酸、または遺伝子は、外来種に由来するもの、または同じ種に由来する場合、その元の形態から実質的に修飾されたものである。二つの融合ドメインまたは配列は、天然に存在するタンパク質または核酸において互いに隣接していなければ、互いに異種である。
「単離された」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とは、それが天然関連の他のタンパク質、脂質、および核酸から分離されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味する。ポリペプチド／タンパク質は、精製調製物の乾燥重量に対して少なくとも10％(すなわち、10％～100％の間の任意の割合、例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％および99％)を構成し得る。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析など、任意の適切な標準法によって測定され得る。本発明に記載の単離されたポリペプチド／タンパク質は、天然源から精製されてもよく、組換えDNA技術によって製造されてもよく、化学的方法によって製造されてもよい。
「抗原」とは、免疫学的反応を誘発する、あるいはその反応の産物に結合する物質を意味する。用語「エピトープ」とは、抗体またはT細胞が結合する抗原の領域を意味する。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体断片を特に網羅する。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み得で、一般に、インタクトな抗体の抗原結合および／または可変領域、および／またはFcR結合能力を保持する抗体のFc領域を含む。抗体断片の例としては、線形抗体;単鎖抗体分子;および抗体断片から形成された多重特異性抗体がある。好ましくは、抗体断片はIgG重鎖の定常領域全体を保持し、IgG軽鎖を含む。
本明細書で使用される場合、用語「Fc断片」または「Fc領域」または「Fc」は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。
本明細書において「従来の抗体」という用語は、全長モノクローナル抗体またはその改変体(modified version)を意味する。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る可能な天然起源の変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一の抗原部位に向けられる。さらに、一般的に異なる決定基(エピトープ)に向けられる異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられるものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるものではない。例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256, p495-497(本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、参照により本明細書に包含される)により最初に記載されたハイブリードーマ法により作製され得て、組換えDNA法により作製され得る(例えば、引用により本明細書に包含される米国特許第4,816,567号参照)。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al., 1991, Nature, 352, p624-628 and Marks et al., 1991, J Mol Biol, 222, p581-597に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得て、これらの各々は引用により本明細書に包含される。
本明細書におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分が、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる(米国特許第4,816,567号; Morrison et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81, p6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312, p604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314, p452-454;国際特許出願第PCT/GB85/00392号(それぞれ引用により本明細書に包含される)を参照すること)。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、ここで、レシピエントの超可変領域の残基は、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域の残基によって置き換えられているものである。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体に見出されていない残基を含み得る。これらの修飾は抗体の性能をさらに向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、通常は二つの可変ドメインを実質的にすべて含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR残基のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列の残基である。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定数領域(Fc)の少なくとも一部を含む。さらに詳しくは、Jones et al., 1986, Nature, 321, p522-525 (1986); Riechmann et al., 1988, Nature, 332, p323-327; Presta, 2003, Curr Op Struct Biol, 13(4), p519-525;米国特許第5,225,539号(それぞれの内容は、引用により本明細書に包含される)を参照すること。「ヒト抗体」とは、ヒトハイブリドーマ、ヒトファージディスプレイライブラリまたはヒト抗体配列を発現するトランスジェニックマウスから得られるような、完全にヒトの配列を有する抗体を意味する。
用語「医薬組成物」とは、この組成物は、インビボまたはエクスビボで診断または治療的使用に特に適している、活性物質と不活性または活性な担体との組み合わせを意味する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。「薬学的に許容できる担体」は、対象に投与された後、または対象に投与された際、望ましくない生理学的効果を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、活性成分と適合性があり、活性成分を安定化させることができるという意味でも、「許容できる」であるべきである。活性物質の送達のための医薬担体として、一つまたはそれ以上の可溶化剤を利用してもよい。薬学的に許容できる担体の例としては、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤などが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
追加の適切な医薬担体および希釈剤、ならびにそれらの使用のための医薬必需品は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経腸投与、脊髄投与または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適している。治療用化合物は、一つまたはそれ以上の薬学的に許容できる塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を付与しない塩を意味する(例えば、Berge, S. M., et al. 1977, J. Pharm. Sci. 66, p1-19)を参照のこと)。
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」とは、障害を有するか、または障害を発症する危険性のある対象に、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、または障害に対する素因を治癒、軽減、緩和、治療、発症遅延、予防、または改善する目的で、化合物または薬剤を投与することを意味する。
「有効量」とは、処置対象に治療効果を与えるために必要な活性化合物／薬剤の量を意味する。有効用量は、当業者が認識するように、処置される状態の種類、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療処置との併用の可能性に依存して変動する。自己免疫疾患を処置するための組み合わせの治療有効量は、未処置の対象と比較して、例えば、臨床的スコアの減少または症状の進行の遅延を引き起こす量である。
本明細書で開示されるように、多数の値の範囲が提供される。文脈上明らかに別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限の間の各介在値も、下限の単位の10分の1まで具体的に開示されることが理解される。任意の所定の値または所定の範囲内の介在する値と、所定の他の任意の所定の値または所定の範囲内の介在する値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本発明の範囲内に包含される。これらの小さい範囲の上限と下限は、それぞれ独立に範囲に含まれることも除外されることもあり、小さい範囲にどちらか、どちらも、または両方の上限が含まれる各範囲も、所定の範囲内の特に除外された上限を条件として、本発明に包含される。所定の範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除いた範囲も本発明に含まれる。
用語「約」とは、一般に、示された数値のプラスマイナス10％を意味する。例えば、「約10%」は9%～11%の範囲を示しえて、「約1」は0.9～1.1を意味し得る。このような場合、四捨五入など、文脈から「約」の他の意味が明らかになることもあり、例えば「約1」は0.5～1.4を意味し得る。
以下の実施例は、本発明をさらに理解するためのものであるが、本発明の有効範囲を制限することを意味するものではない。
実施例1：抗CD3x抗CD19に対するPEG化BsAb(JY108)の標的結合性
ブリナツモマブのようなTCRに強い親和性を有するT-BsAb(CD3および腫瘍関連抗原を標的とする)は、臨床において重度のCRSを引き起こすことが多い過剰なサイトカイン放出に関連することから、JY108の標的結合性をBiaCoreアッセイおよびELISAアッセイにより評価した。
1) BiaCoreアッセイ
装置：BiaCore
試料：抗CD3 scFv(SCACD3)、抗CD3 scFv-PEG(抗CD3-PEG)、抗CD19 scFv(SCACD19)、抗CD19 scFv-リンカー(抗CD19-リンカー)、JY108およびブリナツモマブ。抗CD3 scFv(SCACD3)は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有し、抗CD19 scFv(SCACD19)は配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有する。これらの試料の調製方法は、WO 2018/075308 Alに詳細に記載されている。
一般的な手順：希釈したヒトCD19(AcroBiosystems, Cat. CD19-H5259)またはヒトCD3E&3D(AcroBiosystems, Cat. CDD-H52W0)をFc捕捉法を介してセンサーチップ上に捕捉した。捕捉時間はそれぞれ、ヒトCD3E&CD3Dでは12秒、ヒトCD19では12～30秒とし、捕捉流速は10L/minとした。各試料は6～8濃度に連続希釈した。分析物の会合時間は180s、解離時間は420sとし、分析物の流速は30L/minとした。表面再生には10mM グリシン-HCl緩衝液を用い、接触時間は30秒、流速は30L/minとした。各サイクルにおけるフローセル1と緩衝液のブランク注射は、Response Units減算のための二重参照として使用した。すべてのデータはBiaCore T2000 Evaluationソフトウェア(バージョン3.1)を用いて処理した。結合動態データを表1に示す。
表1に示すように、JY108のヒトCD3E&CD3Dに対するKD(結合親和性)は3.31×10-8Mであり、ブリナツモマブに対するKDは1.14×10-9Mであった。JY108の親和性はブリナツモマブの親和性より約30倍弱い。JY108のCD3に対する親和性の低下は、抗CD3 scFv-PEGの標的に対する親和性も非PEG化抗CD3 scFvのそれよりも弱い(14倍)ことから、大きなPEGの阻害効果によるものと考えられる。
同様に、JY108のヒトCD19に対するKDは1.44×10-9Mであるのに対し、ブリナツモマブに対するKDは2.07×10-10Mであった。ここでも、PEGによる阻害効果がJY108のヒトCD19に対する親和性を弱めたと考えられる。予想通り、ヒトCD19に対する抗CD19 scFvリンカー(リンカーははるかに小さいPEG11)のKDは1.11×10-10Mであり、抗CD19 scFvのKD(6.53×10-11M)と同様である。
2)ELISAアッセイ
ヒトCD3E&CD3Dタンパク質との結合を評価するために、SCACD3、CD3-PEG(PEG化SCACD3)、ブリナツモマブおよびJY108の3ロット(それぞれ2ロットはpH6.8、1ロットはpH4.7緩衝液)の試料溶液を、各試料について30μg/mL、1μg/mLおよび0.01μg/mLといった4つの濃度でCBSを用いて調製した。プレートにはSCACD3、CD3-PEGおよびJY108をそれぞれ100μl/ウェルでコーティングした。同様に、ヒトCD19タンパク質との結合を評価するために、SCACD19、CD19-リンカー、ブリナツモマブおよびJY108の3ロット(それぞれpH6.8緩衝液で2ロット、pH4.7緩衝液で1ロット)の試料溶液を、各試料について10μg/mL、1μg/mLといった2つの濃度でCBSを用いて調製し、100μl/ウェルでプレートにコーティングした。コーティング後、各プレートをPBST(200μL/ウェル)で3回洗浄した。次に、各プレートをPBST中の5％BSAで37℃で、2時間ブロックした。ブロックした後、各プレートをPBSTで3回洗浄し、次いでPBST中の0.5％BSA(10μg/mL、1μg/mL、0μg/mL、100μL/ウェル)中の1μg、0.1μgおよび0μgのいずれかのヒトCD19-Fcタンパク質(Acrobiosystems、コード：CD9-H5259)、またはPBST中の0.5％BSA(10μg/mL、100μl/ウェル)中の1μgヒトCD3E&CD3D(Acrobiosytems、コード：CDD-H52W0)を対応するウェルに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、次いでPBSTで3回洗浄した。次に、1μg/mLのHRPコンジュゲート抗ヒトIgG(GenScript、コード：A01854)100μLを各ウェルに添加した。プレートを37℃で1.5時間インキュベートした。インキュベーション後、各プレートをPBSTで3回洗浄し、次いで各ウェルに100μLのTMBを添加した。各プレートの展開反応を15分間暗所に置き、100μL/ウェルの停止液で終了させた。各プレートをマイクロプレートリーダーでOD450nmで読み取り、結果を図1に示した。
図1の結果から、コーティング濃度1μg/mlにおいて、試験試料のヒトCD3E&CD3Dに対する親和性は以下のようにランク付けできる：SCACD3＞ブリナツモマブ＞JY108＞SCACD3-PEG。ヒトCD19に結合する試料についても同様の順位が観察された(SCACD19＞ブリナツモマブ＞JY108＞SCACD19-リンカー)。
結論：BiacoreアッセイとELISAアッセイの結果は一致しており、PEG化T-BsAb JY108はCD3およびCD19の両方に対する親和性が有意に低下していることが示された。これら2つのアッセイで観察されたPEG化による親和性の低下は、サイトカイン放出の減少など、JY108に有益な効果をもたらすことが期待される。
実施例2：CD19+細胞株および正常B細胞に対するJY108のインビトロ有効性
標的への結合が減少したにもかかわらず、様々な標的細胞に対するPEG化T-BsAb JY108の有効性を試験するために、以下の実験を行った。
一般的な手順：100μlの培地中で4×104、10×104または20×104(E:T比はそれぞれ2:1、5:1または10:1)に拡大したエフェクター細胞を、指示された用量のJY108とともに室温で30分間インキュベートした。2×104個のCD19+またはCD19-標的細胞(Raji、Nalm-6、REHまたはK562)を添加し、37℃で24時間、または指示通りにインキュベートした。エフェクター細胞のみのウェルには、標的細胞を含まない100μLの培地を加え、標的細胞のみのウェルには、エフェクター細胞を含まない100μLの培地を加えた。各ウェルに20μLのMTS試薬を添加し、メーカーのマニュアルに従って37℃でインキュベートした。培養後、OD490nmの吸光度を記録し、死細胞の割合を計算式：
［式中、OD実験は、JY108、エフェクター細胞および標的細胞を含むウェルの、設計されたE:T比でのOD490を意味し、ODPBMCは、標的細胞を含まない、指示されたJY108用量のエフェクター細胞のみのOD490を意味し、OD標的は、JY108およびエフェクター細胞を含まない標的細胞のみのOD490を意味し、OD培地は、JY108、エフェクター細胞、標的細胞を含まない等容量の培地のOD490を意味しる］に基づいて算出した。この手順は、PBMC中のB細胞を除くすべての細胞株に対するJY108のインビトロ有効性アッセイに使用し、その場合は蛍光抗体染色し、次いでフローサイトメトリーにより検出した。
1)JY108によるCD19-細胞への薬物特異的細胞毒性はなかった
JY108がCD19-細胞を標的とするかどうかを調べるため、CD19発現が陰性である白血病細胞株K562を用いて実験を行った。図2の結果では、E：T＝5：1で1μg／mLの濃度でも、JY108の存在下と非存在下(陰性対照はJY108を含まない)で殺細胞効果に有意差は認められなかった。この結果は、JY108が安全であり、CD19陰性細胞に対して薬物特異的細胞毒性を引き起こさないことを示している。
2)JY108による健常人ドナーのPBMC中のB細胞の排除
JY108がPBMCからCD19陽性細胞を排除できるかどうかを調べるため、4種類の濃度(対照0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/mlおよび10μg/ml)のJY108をPBMCに添加し、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、PBMC試料を1μlのFITC標識抗CD19で30分間染色し、次いでフローサイトメトリーで検出した。結果を図3に示す。対照試料(JY108無添加)ではCD19陽性細胞が6.93％であったのに対し、JY108は0.1μg/mlの濃度でCD19陽性細胞をバックグラウンドレベルまで有意に減少させた。この結果は、JY108がPBMCからCD19陽性細胞を効率的に除去できることを明確に示している。
3)JY108の有効性に田出E:T比の影響
E:T比の違いにより、JY108は同じ標的細胞に対して異なる毒性を示した。図4の結果から、E:T=5:1におけるJY108のNalm-6殺傷に対するEC50は37.56ng/mLであり、E:T=10:1におけるJY108のEC50は14.68ng/mlであった。この結果では、エフェクター細胞の数が多ければ多いほど、所望の殺細胞を達成するために必要なJY108の量は少なくて済むことが示された。しかしながら、E:T比の増加に伴うJY108の細胞毒性の増加は、他のパラメータが変化しない場合には定常に達した(データは示さず)。
4)JY108の有効性に対する細胞株の作用
JY108は、異なるCD19+細胞株に対して異なる殺傷効果を示す(図 5)。実験設定では、REHに対するJY108のEC50は10.38ng/mLであり、Raji細胞に対するJY108のEC50は159.3ng/mLであった。
結論：JY108のEC50はすべてのアッセイにおいてng/mLレベルであり、一桁ng/mLから数百ng/mLまで、異なるE:T比、異なるPBMCドナー、異なる作用時間、異なるCD19陽性細胞株で認められた。インビトロでの病理学的CD19+細胞の殺傷は薬物特異的であり、JY108の薬物設計に期待されたものと一致している。
実施例3：プレB ALL腫瘍モデルに対するJY108のインビボ有効性
JY108のインビボ有効性を試験するために、REH腫瘍細胞を集め、計数し、次いで細胞濃度を10×107/mLに調整した。拡大PBMC細胞は30×107/mLに調整した。等量拡大のBMC細胞およびREH腫瘍細胞は、動物に接種する直前に混合した。JY108は滅菌PBSを用いてそれぞれ200μg/mL、50μg/ml、12.5μg/mlの濃度に調製した。マウスを無作為に5匹/群に分けた。調製したJY108の尾静脈投与(100μL/マウス)を行った。JY108注射後、REHと拡大PBMC細胞を等量混合したものをマウスに皮下接種した(200μL/マウス)。
図6の結果では、JY108は1.25μgの用量でREH腫瘍の成長を効果的に阻害できることが示された。実験群のマウスと対照群のマウスとの間に体重の有意差はなく、これは、実験用量のJY108は動物に毒性作用を引き起こさないことが示唆されている。
実施例4：JY108の薬物動態特性
JY108はHisタグ付きSCACD3およびHisタグのないSCACD19を含む。したがって、インタクトなJY108分子を検出するために、抗Hisタグ付き抗体およびCD19抗原をELISAに使用することができる。実施例1に記載の同様のELISAアッセイでは、ヒトCD19-Fcを1μg／ウェルでコーティング剤として使用し、抗Hisを検出抗体として使用した。図7に示す結果から、野生型C57BL/6におけるJY108のT1/2は24.28hrであることが示された。
試験動物におけるJY108の半減期は、報告されているように約2時間である対照薬ブリナツモマブよりもはるかに長い。齧歯類におけるPEG化タンパク質の代謝はヒトにおける代謝の約5倍速いことから(US 2011/0112021 A1)、JY108のヒト体内における半減期は120時間を超えることが予想され、これは、JY108の臨床的有効性に大きく寄与すると考えられる。
実施例5：JY108の毒性評価モデル動物としてのヒト化トランスジェニックマウス(hCD3ehCD19)の選択
本試験では、両方の標的遺伝子(CD3εおよびCD19)のヒト化トランスジェニックマウスを構築し、分子の毒性およびインビボでの有効性を評価するために使用した。
1)動物モデルの標的に対するJY108の結合(図8)
SCACD3、SCACD19およびJY108をそれぞれベンダーのLightning-Link(登録商標)のプロトコールに従ってFITC標識した。hCD3ehCD19トランスジェニックマウスの脾臓組織を採取し、リンパ球単離液で細かく砕く、次いで遠心分離して浮遊マウスリンパ球を得た。リンパ球を集め、洗浄した後、冷FACS緩衝液(3％FBS含有PBS)を用いて細胞懸濁液を5×106cells/mlに調整した。再懸濁した細胞を100μL/チューブに分注した。FICT(またはPE、APC)標識抗体を細胞懸濁液に添加し、反応混合物を暗所、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、各洗浄時に400gで5分間遠心した。フローサイトメトリーで細胞を分析する前に、500μLのFACS緩衝液(3%FBS添加冷たいPBS)を用いて細胞を再懸濁した。
図8Aにおいて、フローサイトメトリーの結果では、組換えヒトCD3(FITC-hCD3)がマウスT細胞(PE-mTCR-b)上に発現し、組換えヒトCD19(APC-hCD19)がマウスB細胞(PE-mCD45)上に発現していることが示された。図8Bにおいて、結果では、トランスジェニックマウスの脾臓細胞の10.7％がマウスTCR-bおよびFITC標識SCACD3の両方で二重染色され、トランスジェニックマウスの脾臓細胞の53.6％がマウスTCR-bおよびFITC標識JY108の両方で二重陽性であったがことが示された。図8Cにおいて、トランスジェニックマウスの脾臓細胞の33.3％がマウスCD45RおよびSCACD19の両方に二重陽性であり、トランスジェニックマウスの脾臓細胞の13.1％がマウスCD45RおよびJY108の両方に二重陽性であった。図8A、8Bおよび8Cの結果を総合すると、hCD3ehCD19トランスジェニックマウスのリンパ球はSCACD3、SCACD19およびJY108に特異的に結合していることが示された。
2)JY108のエフェクターとしてのトランスジェニックマウス(hCD3hCD19)の脾臓細胞
トランスジェニックマウス由来のT細胞を評価した結果、これらはJY108のインビトロ細胞毒性アッセイにおいて期待通りのエフェクター細胞として使用できることが見出された。実施例2の結果と同様に、hCD3ehCD19トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞も、図9に示すように、Raji、Nalm-6、およびReH標的細胞を効果的に死滅させることができた。
結論：以上の結果から、トランスジェニックマウスhCD3hCD19は、JY108の毒性評価に使用できる動物モデルであることが示された。
実施例6：JY108の単回投与10mg/kgでは急性毒性はなかった
hCD3ehCD19トランスジェニックマウスに10mg/kgのJY-108を静脈内投与(n=3、単回投与)し、急性毒性を観察した。陰性対照群と比較して、実験群のhCD3ehCD19ホモ接合トランスジェニックマウスは、体重(p>0.05)、摂餌量に有意な変化は認められなかったが、水消費量はわずかに増加した(図10)。
実施例7：JY108によるヒト全血からのサイトカイン放出の減少
サイトカイン急性発症またはサイトカイン放出症候群は、T細胞関与抗体薬(例えばブリナツモマブ)の主な臨床的副作用の一つである。JY108の親和性を低下させることで、対照薬であるブリナツモマブと比較してサイトカイン放出が減少し、安全性プロファイルが改善されるかどうかを評価するため、JY108とブリナツモマブをそれぞれ様々な濃度(0.0005μg/ml、0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/mlおよび5μg/ml)で、2人の健常人ドナーのヒト全血(HWB)と24時間インキュベートした。培養の2時間、6時間、24時間で放出されたサイトカインをBDTM Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2 (Catalog No:551809)を用いてフローマイクロスフィア技術で測定した。2人のドナーの平均値を算出した。24時間にわたる各サイトカインの最高値を図11に示した。その結果、JY108により誘導されたIL2、IL6、TNF、IFN-γおよびIL10などのサイトカイン放出は、いずれも対照薬であるブリナツモマブにより誘導されたものより低かった。したがって、JY108はブリナツモマブよりもインビボでのサイトカイン急性発症とそれに伴う副作用が有意に低いことが予測される。
実施例8：JY108はEAEを有意に改善した
本試験の目的は、MSの自己免疫疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)に対するJY108の有効性を試験することである。
1)EAEモデルの作製
C57BL/6トランスジェニックマウス(hCD3ehCD19ホモ接合体)を用いて、標準的なプロトコールに従ってEAEモデルを作製した。モデル作製前に、百日咳毒素(PTX)の100μg/mLストック溶液をPBSで調製し、4℃で保存した。各注射日に、PTXストック溶液をPBS中で1μg/mLの使用液に希釈した。0日目に、等体積のMOG1-125タンパク質(2mg/mL)および完全フロイントアジュバント(CFA、4mg/mL)を、混合物が均一になるまでホモジナイザーで十分に乳化させた。次に、MOG1-125とCFAのエマルジョンをマウスの胸部および腹部の両側に皮下注射し(150μL/マウス)、次いでPTXを200μL/マウス尾静脈注射した)。2日目に、PTXを200μL/マウスで2回目の尾静脈注射を行った。各マウスの体重を毎日測定し、Konoの5スコア基準(グレード1：尾引きずり；グレード2：尾引きずりおよび後肢脱力；グレード3：後肢部分麻痺；グレード4：後肢完全麻痺；グレード5：瀕死状態)に従って、動物の疾病症状を臨床スコア(CS)で評価した(Hou, Y. et al.)
2)JY108によるEAE症状の有意な軽減
EAEの症状は11日目にトランスジェニックマウスに現れ始め、時間とともに悪化し続けた。16日目に、CSは3に達した。次に、症状のあるEAEモデルマウスを16日目に無作為に群分けし、実験群と対照群の臨床スコアと体重が同程度になるようにした(各群n=4)。実験群にはJY108を60μg／匹で1日おきに尾静脈投与し(計7回)、28日目に投与を中止し、対照群(図12のモデル群)にはビヒクルをi.v.注射した。2群のマウスの疾患症状をモニターし、CSを毎日記録した。
図12に示すように、JY108群は、初回投与後に症状の有意な緩和を示し、後に回復し、次に、比較的低いCSで安定した状態を維持した。JY108を投与していないモデル群(対照群)のマウスは、群分けの開始時に症状の悪化傾向を示し、次いでわずかに寛解したが、症状スコアは比較的高いレベルで安定したままであった。体重曲線は、EAEの臨床的症状プロファイル、つまり症状が重度の場合は体重が低く、症状が寛解している場合は体重が高いとよく相関していると表す。EAE状態が、食物に到達する能力を含むマウスの移動性に影響を与えるかもしれない。
3)組織病理組織切片のLFB染色
EAE症状が改善しているという観察された証拠をさらに裏付けるために、マウスの脊髄および脳組織を病理学的検査手順に従って染色した。画像の取得には、Nikon (Eclipse Ci-L)顕微鏡とCaseViewer2.2を備えた3DHISTECHスライススキャナー(PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000)を使用した。
LFB(Luxol Fast Blue)色素はミエリン鞘リポタンパク質に引き寄せられ、CNS組織を特異的に染色する。結果を図13に示す。脊髄については、LFB染色結果では、健康な動物の白質のミエリンが均一で均一に染色できることを示し、明らかな脱髄は観察されなかった。モデル群において、白質の周囲の広い領域が消失し、LFB染色されたミエリンが明るく不連続になり、これは、多くの神経線維が脱髄されたことを示している。対照的に、JY108処置動物の脊髄は、EAEモデル群よりも多くのLFB染色領域を示し、染色はより連続的であった。この結果は、モデルにおける脱髄の重症度がJY108によって大幅に軽減されることを示している。
臨床的症状の改善、体重変化、および組織LFB染色の病理学的切片分析の結果に基づいて、JY108はEAE症状の改善に有効であるという結論に達することができた。
JY108によるMOG特異的自己抗体の枯渇
EAEマウスにおけるJY108の有効性をさらに理解するために、22日目に動物のMOG特異的自己抗体を検査した。プレートをコーティングするためにMOG1-125タンパク質を使用したことを除いて、実施例1および4に記載のELISA法と同様の手順をこのアッセイに使用した。図14に示す結果は、JY108が血清中のMOG特異的抗体レベルを効率的に低下させることを実証した(図14)。
実施例9:JY108とMEDI-551との直接比較
MEDI-551(イネビリズマブ(Inebilizumab))は、MS処置用に現在臨床試験中の抗CD19モノクローナル抗体である。前臨床結果では、EAEモデルにおいてMEDI-551が市販のモノクローナル抗CD20抗体よりも有効であることを示された。直接比較するために、この実験のEAEモデルは実施例8に記載のと同じ方法で構築し、MEDI-551処置群(250μｇ／動物の単回i.v.注射)を実験に含めた。EAEモデル作成後12日目に、雄動物を無作為に4つの群(n=7)分けした:MEDI-551処置群、モデル群(対照)、JY108を60μg/動物および80μg/動物で処置した2つの群、合計5回の投与(14日目、15日目、17日目、19日目、および21日目)。各動物の臨床スコアを毎日記録した(18日目を除く)。雌マウスをEAE誘導11日目に同様に群分けし(n=7)、JY108(30、50、75μg/匹)およびMEDI551(250μg/匹)で処理した。
図15に示すように、JY108の60μg／動物および80μｇ／動物の両方での投与により、ビヒクル処置EAEモデル群と比較した場合、雄マウスのEAE症状を有意に改善した。さらに、雄マウスのEAE症状の改善には、80μg/動物のJY108が60μg/動物よりも効果的であった。同様の結果は、1匹あたり30μg、50μg、および75μgのJY108で処置した雌EAEマウスでも得られたが、MEDI551での処置は効果がなかった。EAE誘導後7日目に投与されたMEDI-551は雄マウスのEAE症状を遅らせることができると報告されているが(Chen, D. et al. 2014, J Immunol 193, 4823-4832)、驚くべきことに、この実験において14日目に投与した同じ化合物では、重度の病気のEAE動物に対していかなる治療効果も示さなかった(p＞0.05)(図15)。
実施例10:EAE改善におけるJY108のメカニズム
1)JY108によるCD19+ B細胞の部分除去
EAE症状の改善におけるJY108のメカニズムをより良く例示するために、実施例9に記載のと同じ方法を用いて、EAE実験における脾臓B細胞を15日目に検査した。結果を図16に示す。驚くべきことに、MEDI-551はほとんど効果を示さなかったが、JY108はCD19+ B細胞を完全に除去したが、JY108はCD19+ B 細胞を、EAEモデルの68.2%から、60μg/動物ではJY108処置群の37.1%に、80μg/動物では39.1%に、部分的にのみ除去した。
2)Breg細胞はMEDI-551およびJY108の両方に抵抗性がある
JY108は、EAE症状の改善においてMEDI-551よりも高い効率を示したが(図15)、総CD19+ B細胞の枯渇においてはMEDI-551ほど有効ではなかった(図16)。矛盾しているように見える結果は、JY108処理後に他の関連する免疫細胞に何が起こったのかを調べるように促した。実施例5に記載の方法を用いて、EAE実験における動物由来の脾臓細胞をPE-抗CD19およびFITC-B10(Bregのマーカー)で二重染色し、フローサイトメトリーによりカウントした。図17Aに示すように、免疫抑制性Breg細胞のレベルは5つの群すべての間で同様であり、これは、試料が収集された時点でJY108およびMEDI551の両方がBreg細胞にほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。
MOG特異的B細胞は、CNSミエリン形成損傷に対する自己抗体の主要な供給源であるため、ベンダーのマニュアルに記載されているプロトコールに従ってELISPOTを実行し、試験動物の脊髄におけるMOG特異的B細胞を比較した。図17Bに示される結果は図16の結果と一致しており、これは、JY108およびMEDI551の両方がMOG特異的B細胞を効果的に枯渇させたことを示している。
結論:図17からの結果では、他のメカニズムが関与している可能性があり、それがEAE症状の改善におけるJY108の有効性がMEDI551よりも高いことにつながる、と示している。

Claims (28)

  1. 対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の、式(Ia)：
    ［式中、
    Pは、非免疫原性ポリマーであり;
    Tは、多官能性(例えば、三官能性)小分子リンカー部分であり、かつ一つ、二つまたはそれ以上の同一または異なるポリペプチドと部位特異的にコンジュゲートできる一つ、二つまたはそれ以上の官能基を有し;
    A1およびA2は、それぞれ独立して、抗体、例えば単鎖抗体、単一ドメイン抗体(ナノボディ)またはFabから選択され、ここで、A1およびA2の一方は抗原CD3を認識してそれに結合し、他方は抗原CD19を認識してそれに結合する］
    で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該対象に投与することを含む方法。
  2. 対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の、式(Ib)：
    ［式中、
    Pは、非免疫原性ポリマーであり;
    Bは、Hであるか、またはC1-10アルキルおよびアリールから選択されるキャッピング基であり、ここで、前記アルキルまたはアリールの一つまたはそれ以上の炭素は、場合によりヘテロ原子と置き換えられており;
    Tは、二官能性スペーサーでの誘導体化および／または伸長の後、A1およびA2またはこれらの誘導体と部位特異的にコンジュゲートできる、一つ、二つまたはそれ以上の官能基を有する三官能性(例えば、アミノ酸)リンカーであり、ここで、Tと(L1)aとの間の結合およびTと(L2)bとの間の結合は同一または異なっていてもよく;
    L1およびL2は、それぞれ独立して、二官能性リンカー(例えば、ペプチド)であり;
    aおよびbはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される整数であり;
    A1およびA2は、それぞれ独立して、抗体、例えば単鎖抗体、単一ドメイン抗体(ナノボディ)またはFabから選択され、ここで、A1およびA2の一方は抗原CD3を認識してそれに結合し、他方は抗原CD19を認識してそれに結合し;そして
    yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される整数である］
    で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該対象に投与することを含む方法。
  3. 自己免疫疾患が、天疱瘡、視神経脊髄炎/視神経脊髄炎-関連障害(NOD/NMOD)、多発性硬化症(MS)、ANCA関連脈管炎、リウマチ性関節炎(RA)、クローン病、炎症性腸疾患(IBD)および全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎、エリテマトーデス、1型糖尿病などからなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
  4. 自己免疫疾患が、テクフィデラ、ジレニア、タイサブリ、オーバジオ、またはマベンクラッドでの療法などの従来の小分子薬物療法に対して抵抗性または難治性である、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 自己免疫疾患が、コパキソン、IFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ、アレムツズマブ)、またはナタリズマブでの療法などの従来のタンパク質薬物療法に対して抵抗性または難治性である、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  6. 自己免疫疾患が、抗CD19剤(イネビリズマブ、オベキセリマブ)または抗CD20剤(リツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ)での療法などのB細胞枯渇療法に対して抵抗性または難治性である、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  7. A1およびA2が、それぞれ独立して、Fab、単鎖抗体および単一ドメイン抗体(ナノボディ)から選択される、請求項１～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. TとA1との間の結合、TとA2との間の結合、Tと(L1)aとの間の結合、Tと(L2)aとの間の結合、(L1)aとA1との間の結合、(L2)bとA2との間の結合、(L1)a内の結合および(L2)b内の結合が、それぞれ独立して、アルキルハライド、酸ハライド、アルデヒド、ケトン、エステル、無水物、カルボン酸、アミド、アミン、ヒドラジド、アルキルヒドラジン、ヒドロキシ、エポキシド、チオール、マレイミド、2-ピリジルジチオバリアント、芳香族またはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルケン、アルキン、ジベンゾシクロオクチル(DBCO)、2-アミノ-ベンズアルデヒドまたは2-アミノ-アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、カリウムアシルトリフルオロボレート、O-カルバモイルヒドロキシルアミン、trans-シクロオクテン、テトラジンおよびトリアリールホスフィンからなる群から選択される官能基から誘導される、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
  9. L1およびL2がそれぞれ、-(CH2)mXY(CH2)n-、-X(CH2)mO(CH2CH2O)p(CH2)nY-、-(CH2)mX-Y(CH2)n-、-(CH2)mヘテロシクリル-、-(CH2)mX-、-X(CH2)mY-、およびアミノ酸または2～50個のアミノ酸残基を有するペプチドからなる群から独立して選択されるスペーサーを含み;ここで、m、n、およびpは、それぞれの場合において、独立して0～25の範囲の整数であり;XおよびYは、それぞれの範囲において、C(=O)、CR1R2、NR3、S、O、または不存在からなる群から独立して選択され、ここで、R1およびR2は、独立して水素、C1-10アルキルまたは(CH2)1-10C(=O)を示し、R3は、HまたはC1-10アルキルであり、ここで、ヘテロシクリルは、マレイミド、歪んだアルケンおよびアルキン、アジドまたはテトラゾリル部分から誘導される、請求項2～8のいずれか一項に記載の方法。
  10. Pが、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、炭水化物を基礎とするポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル-メタクリルアミド(HPMA)、またはこれらのコポリマーを含む、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
  11. PがPEGを含み、BがメチルまたはC1-10アルキルである、請求項2～10のいずれか一項に記載の方法。
  12. Pが、3000Da～80000Daの範囲の分子量のPEGを含む、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
  13. Pが、線状PEGを含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. Pが、分岐状PEGを含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の方法。
  15. TとPとの結合が、開裂不可能または開裂可能である、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。
  16. TとPとの結合が、アミド、エステル、カルバメート、カーボネート、イミド、イミン、ヒドラゾン、スルホン、エーテル、チオエーテル、チオエステルおよびジスルフィドからなる群から選択される、請求項1～15のいずれか一項に記載の方法。
  17. Tが、システイン、リシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたは遺伝的にコードされるアルケンリシン(例えばN6-(ヘキサ-5-エノイル)-L-リシン)、2-アミノ-8-オキソノナン酸、m-またはp-アセチル-フェニルアラニン、β-ジケトン側鎖を担持するアミノ酸(例えば2-アミノ-3-(4-(3-オキソブタノイル)フェニル)プロパン酸)、(S)-2-アミノ-6-(((1R,2R)-2-アジドシクロペンチルオキシ)カルボニルアミノ)ヘキサン酸、アジドホモアラニン、ピロリシンアナログN6-((プロプ-2-イン-1-イルオキシ)カルボニル)-L-リシン、(S)-2-アミノ-6-ペント-4-インアミドヘキサン酸、(S)-2-アミノ-6-((プロプ-2-イニルオキシ)カルボニルアミノ)ヘキサン酸、(S)-2-アミノ-6-((2-アジドエトキシ)カルボニルアミノ)ヘキサン酸、p-アジドフェニルアラニン、パラ-アジドフェニルアラニン、Nε-アクリロイル-l-リシン、Nε-5-ノルボルネン-2-イルオキシカルボニル-l-リシン、N-ε-(シクロオクト-2-イン-1-イルオキシ)カルボニル)-L-リシン、N-ε-(2-(シクロオクト-2-イン-1-イルオキシ)エチル)カルボニル-L-リシン、および遺伝的にコードされるテトラジンアミノ酸(例えば4-(6-メチル-s-テトラジン-3-イル)アミノフェニルアラニン)からなる群から選択される天然または非天然アミノ酸から誘導される、請求項1～16のいずれか一項に記載の方法。
  18. Tが、リシンまたはシステインから誘導される、請求項17に記載の方法。
  19. Pが末端マレイミドまたは2-ピリジルジチオバリアントまたは芳香族スルホンまたはビニルスルホンを有するPEGから誘導され、Tがシステインから誘導され、PとTとの間の結合がチオエーテルまたはジスルフィドである、請求項1～18のいずれか一項に記載の方法。
  20. Pが末端マレイミドを有するPEGから誘導され、ここで、(L1)a-T-(L2)bは3～100個のアミノ酸残基、例えば3～50個のアミノ酸残基を有するペプチドである、請求項19に記載の方法。
  21. A1が抗CD3単鎖抗体であり、および／または、A2が抗CD19単鎖抗体である、請求項1～20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 化合物が、
    ［式中、mPEGは、10000～80000Daの分子量を有し;
    aおよびbは、それぞれ独立して、1～20から選択される整数であり;
    Xは、C、N、Oから選択され;
    R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-10アルカンまたはシクロヘキサンから選択される］
    からなる群から選択される、請求項2～6のいずれか一項に記載の方法。
  23. 化合物が、約0.05～約50mg/kg/回の量で投与される、請求項1～22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 化合物が、約0.25～約10mg/kg/回の量で投与される、請求項23に記載の方法。
  25. 化合物が、各処置サイクルにおいて、4～8週間ごとに1～8回、または4～8週間ごとに1～4回投与され、次いで、所望の結果が示されるまで、各サイクルごとに1週間の休薬期間が設けられる、請求項1～24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 化合物が、第二の剤、例えばテクフィデラ、ジレニア、タイサブリ、オーバジオ、マベンクラッド、コパキソン、IFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗体(アレムツズマブ、アレムツズマブ)、ナタリズマブ、抗CD19剤(イネビリズマブ、オベキセリマブ)、抗CD20剤(リツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ)と組み合わせて、同時にまたは順次に投与される、請求項1～25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 哺乳動物において抵抗性または難治性自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の請求項1または2に記載の式(Ia)または(Ib)で示される化合物またはその薬学的に許容できる塩を、該哺乳動物に投与することを含む、方法。
  28. 化合物が、約0.25～約10mg/kg/回の量で投与される、請求項27に記載の方法。
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