JP2024510483A - 改善されたオリゴヌクレオチド合成 - Google Patents

改善されたオリゴヌクレオチド合成 Download PDF

Info

Publication number
JP2024510483A
JP2024510483A JP2023556964A JP2023556964A JP2024510483A JP 2024510483 A JP2024510483 A JP 2024510483A JP 2023556964 A JP2023556964 A JP 2023556964A JP 2023556964 A JP2023556964 A JP 2023556964A JP 2024510483 A JP2024510483 A JP 2024510483A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
liquid composition
oligonucleotide
moiety
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023556964A
Other languages
English (en)
Inventor
ラルフ・アイゼンフート
カール・リュディガー・ハウグ
ダニエル・ザムゾン
アーネ・ベルテルマン
ギード・クロセイン
Original Assignee
バッヘン・ホールディング・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バッヘン・ホールディング・アクチエンゲゼルシャフト filed Critical バッヘン・ホールディング・アクチエンゲゼルシャフト
Publication of JP2024510483A publication Critical patent/JP2024510483A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/02—Phosphorylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

脱プリン化のレベルを低減する、オリゴヌクレオチドの合成のための改善されたプロトコールが提供される。ヒドロキシル基からのジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断のための液体組成物、およびオリゴヌクレオチドの化学合成におけるその使用が開示される。

Description

本発明は、一般に、工業スケールまたは実験室スケールでのオリゴヌクレオチド合成の分野に関する。オリゴヌクレオチドの合成のための改善された方法が開示される。本発明は、反復的オリゴヌクレオチド合成の間に、場合により置換されたトリアリールメチル残基、好ましくは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基を含む（一時的）保護基を効率的に除去する方法を対象とする。本発明のさらなる態様は、液体組成物、およびオリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基を除去するためのその使用を対象とする。
一般的に言えば、化学的オリゴヌクレオチド合成の反復的方法は、通常、鎖伸長に関与しない塩基／塩基アナログおよびリボース／リボースアナログ部分に位置するこれらの官能基のための第１の種類の保護基の使用、ならびに主鎖伸長を制御するための第２の種類の保護基の使用に依拠する。後者の種類は、付加されるビルディングブロックに含まれる一時的保護基である。その機能は、ビルディングブロックの二重挿入および／またはビルディングブロック部分の多量体化を回避することである。第１および第２の種類の保護基は、典型的には、互いに対してオルトゴナルであり、これは、１つの種類が他の種類の保護基に影響を及ぼさない条件下で除去することができることを意味する。
通常、第１の種類の保護基は、アルカリ条件下で切断可能であり、鎖構築が終了したらそれらが除去されるだけであるという点で「永久的」であり；第２の種類の一時的保護基は、典型的には、酸性条件下で切断可能であり、合成サイクル毎に１回除去される。トリアリールメチル保護基は、通常、一時的保護のために使用される。したがって、カップリングサイクルは、保護されたビルディングブロックをオリゴヌクレオチド主鎖の未保護末端にカップリングし、それに続いて、その後のカップリングサイクルのために調製するために、このようにして伸長したオリゴヌクレオチドを脱保護する工程を含む。それぞれの工程後の試薬からの分離を容易にするために、成長しているオリゴヌクレオチド鎖は、通常、固体支持体または可溶性修飾タグである支持部分に結合している。
ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成のために、合成サイクルは、通常、リボース部分のヒドロキシル基、例えば、５’－ヒドロキシル基の選択的脱保護によって開始する。次に、成長しているオリゴヌクレオチド鎖は、適切に保護されたヌクレオシドホスホラミダイトおよび活性化試薬とともにインキュベートされる。ＤＭＴ（ジメトキシトリチル、別名ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル）基は、一時的保護基としてしばしば使用される。カップリング反応から得られる三配位ホスファイトトリエステルは、次いで、酸化または硫化され、ホスフェートトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または混合主鎖構造のルーチン合成を可能にする。任意的なキャッピング工程を使用して、任意の未反応ヒドロキシル基をブロックし、それによって、その後のカップリングラウンドにおいて、単一のヌクレオシドサブユニットのみの非存在によって標的オリゴヌクレオチドとは異なる欠失配列の出現を回避する。
ホスホネートオリゴヌクレオチド合成のために、ＤＭＴなどの酸感受性一時的保護基を有するヌクレオシドＨ－ホスホネートモノエステルが使用される。ヌクレオシド間のＨ－ホスホネートジエステル連結は、典型的には、鎖構築の最後で酸化または硫化される。使用される反応条件に応じて、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロセレノエートまたはホスホロアミデートアナログ、および他の誘導体が、この工程において作製される。
一時的トリアリールメチル型保護基を除去する工程は、高品質のオリゴヌクレオチドの合成にとって驚くほど困難であることが判明している。トリアリールメチル型保護基、特に、ＤＭＴ基は、有機合成において、周知であり、よく使用される。さまざまな切断プロトコールが存在し、トリチルアミンの切断のための一例は、特許文献１に記載されている。
しかしながら、オリゴヌクレオチド合成の文脈において、ＤＭＴ切断工程は、酸誘導塩基切断のリスクをもたらす。いずれの反応も酸で触媒されるからである。この副反応は、グアニンおよびアデニン型塩基で特に顕著であり、脱プリン化と称される。脱プリン化を回避するために、さまざまな戦略が探索されている。代替の一時的保護基である塩基性を低減する核酸塩基保護基、ならびにジヌクレオチドおよびトリヌクレオチドを使用するカップリングスキームが試験されているが、これらのアプローチは、ルーチンオリゴヌクレオチド合成のためのその価値を証明していない。加えて、切断反応自体および反応条件が研究されている。非特許文献１は、最初のプロトン化工程に関与すると思われる４，４’－ジメトキシトリチルアミンの脱アミノ化とは対照的に、非水溶液中でのヌクレオチドからのＤＭＴ基の切断が、協奏的な一般的な酸触媒機構により起こる可能性があることを実証した。
ＨａｂｕｓおよびＡｇａｒｗａｌ（特許文献２）は、２％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）および０．１％の低級アルコール、例えば、エタノールもしくはメタノール、および／または０．１～１％の１Ｈ－ピロールを含む脱トリチル化剤が脱プリン化を抑制することを教示している。非特許文献２および非特許文献３は両方とも、脱トリチル化試薬中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）の濃度を３％から１０％に増加させること、および脱プリン化よりも脱トリチル化に有利に働くように、脱トリチル化剤とオリゴヌクレオチドとの間の接触時間を最小限に保つことを教示している。このアプローチは、原薬（ＡＰＩ）として極めて有用なものなどのオリゴヌクレオチドの工業スケールの生産のために依然として使用されている。しかしながら、脱トリチル化試薬とオリゴヌクレオチドとの間の接触時間を制限することで、液体ハンドリングシステムの最大ポンプ能力が制限されるので、プロセスのスケーラビリティを激しく制限する。
米国特許第８２９９２０６号 ＷＯ９６／０３４１７号
Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９、７、５２～５７頁） Ｓｅｐｔａｋ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６、第２４巻、第１５号、３０５３～３０５８頁） Ｃｈｅｒｕｖａｌｌａｔｈ（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００３、７、９１７～９２０頁）
脱プリン化、すなわち、望まない塩基切断を抑制しながら、成長しているオリゴヌクレオチドの（主鎖関連）ヒドロキシル基を脱保護するための方法であって、スケーラブルでオリゴヌクレオチドの大スケール生産に適している方法の、長期間望まれていた依然として満たされていない必要性が存在する。
本発明は、この課題に対する解決手段を提供する。
一態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基からの場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基の切断のための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール（すなわち、２，２，２－トリフルオロエタノール、ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（すなわち、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、ＨＦＩＰ）、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐｋａを有する、使用を提供する。液体組成物Ｃは、特に、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基の切断を生じさせながら、酸誘導核酸塩基切断、特に、脱プリン化を抑制するために特に使用される。
本明細書において使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、異なって指示されない限り、「１つまたはそれ以上」を意味する。
したがって、本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断、特に、脱プリン化を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、使用にも関する。
本明細書において使用される場合、「非プロトン性溶媒」は、水素結合供与体ではない溶媒である。そのため、非プロトン性溶媒は、Ｏ－ＨまたはＮ－Ｈ結合なしの溶媒である。
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断、特に、脱プリン化を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、使用に関する。
当業者に公知であるように、「核酸塩基切断」は、典型的には、アデニンおよびグアニンなどのプリン型核酸塩基で起こり、これは、「脱プリン化」と称される。アデニンは、特に、脱プリン化する傾向がある。
「塩基と強酸の塩」という用語が、前記塩基および前記強酸の分子の集団であって、塩基分子の一部および酸分子の一部が、例えば、静電相互作用によって、互いに会合している、集団を指すことが当業者に理解されるであろう。典型的には、強酸は、プロトンを塩基にプロトンを供与する。しかしながら、これは、液体組成物Ｃ内の前記塩基のすべての分子および前記強酸のすべての分子が常に互いと会合していることを意味すると解釈されるべきではない。実際に、当業者に公知であるように、塩の溶液は、溶媒和形態のイオンを含む。加えて、強酸による塩基のプロトン化に、例えば、場合により置換されたトリアリールメチル残基（例えば、ＤＭＴ基）を含む保護基が除去される酸素原子にプロトンが移動することによって、プロトン化された塩基（すなわち、塩のカチオン）の脱プロトン化が続く。強酸はまた、そもそも塩基とは異なる種をプロトン化し、そのような種との、例えば、オリゴヌクレオチドの核酸塩基との水素結合に関わる。したがって、本文全体を通して使用される場合、「非プロトン性溶媒および塩基と強酸の塩を含む液体組成物であって、塩のカチオンが、１～４の範囲内のｐｋａを有する」という表現は、「非プロトン性溶媒、そのプロトン化形態が１～４の範囲内のｐＫａを有する塩基、および強酸を含む液体組成物」という表現と同義である。両方の表現は、本文全体を通して、互換的に使用される。
そのため、本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断、特に、脱プリン化を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、そのプロトン化形態が１～４の範囲内のｐＫａを有する塩基と、１未満のｐＫａを有する強酸とを含む液体組成物Ｃの使用に関する。
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断、特に、脱プリン化を抑制するための、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール（別名１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール）、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、使用にも関する。
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断、特に、脱プリン化を抑制するための、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒、トリフルオロエタノール、ならびに塩基と強酸の塩を含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、使用にも関する。
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断を抑制するための、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒、ヘキサフルオロイソプロパノール、ならびに塩基と強酸の塩を含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、使用にも関する。
ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）は、好ましいトリアリールメチル保護基（またはトリアリールメチル残基）であり、ＤＭＴ切断のための好ましい塩または強酸および塩基の組合せを、本明細書の以下に詳述する。異なって指示されない限り、ジメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル保護基、ジメトキシトリチル残基、ＤＭＴ基、およびＤＭＴ残基という用語は、互換的に使用され、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基を指す。
この文脈において使用される場合、「抑制する」という用語は、（望ましくない）核酸塩基切断（例えば、脱プリン化）の速度を低減するような広い意味で理解される。核酸塩基切断は、トリアリールメチル型保護基、例えば、ＤＭＴ保護基の切断の際に、完全にまたは部分的に防止される。
核酸塩基切断／脱プリン化の度合いを使用して、望ましくない核酸塩基切断に関する異なる脱トリチル化プロトコールが比較される。簡潔には、合成されたオリゴヌクレオチド（支持体が支援する合成が使用される場合に、支持体から切断されたオリゴヌクレオチド）のＨＰＬＣ－ＭＳ分析から得られたクロマトグラムにおいて、核酸塩基切断に由来する／脱プリン化に由来する副生成物のピーク面積を合計して、すべての特定された核酸塩基切断に由来する／脱プリン化に由来する副生成物の合計されたピーク面積を得る。次いで、パーセント（％）での核酸塩基切断／脱プリン化の度合いは、核酸塩基切断に由来する／脱プリン化に由来する副生成物の合計されたピーク面積を、個々のオリゴヌクレオチド合成の生成物（すなわち、標的オリゴヌクレオチド）の面積によって割り、それに続いて１００％を掛けて、パーセント（％）での値に達することによって決定される。
一部の実施形態において、核酸塩基切断を抑制することは、トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）が本発明の液体組成物Ｃの代わりに使用される点でのみ異なる同等の脱トリチル化工程との比較において、核酸塩基切断の度合いを少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％低減することである。同じように、一部の実施形態において、脱プリン化を抑制することは、トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）が本発明の液体組成物Ｃの代わりに使用される点でのみ異なる同等の脱トリチル化工程との比較において、脱プリン化の度合いを少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％低減することである。
この文脈において、「同等の切断工程」および「同等の脱トリチル化工程」という用語は、類似の条件下で、例えば、同じ基質、スケール、温度、時間、および脱トリチル化カクテルの体積で、脱トリチル化カクテルの組成、例えば、トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）対本発明の液体組成物Ｃに関してのみ異なって、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基を除去する工程を指す。
「核酸塩基切断の度合いまたは脱プリン化の度合いのこの文脈における「低減する」という用語の意味は、当業者によって理解され、以下の通り例示される：脱トリチル化のために本発明の液体組成物Ｃを使用する第１の合成Ａの脱プリン化の度合いを、脱トリチル化のためにトルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）を使用する第２の合成Ｂの脱プリン化の度合いによって割ると、０．９５の商を提供する場合、脱プリン化の度合いは、５％低減されると言われる。
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基の切断を生じさせながら、アデニンまたはグアニン、特に、アデニンの切断を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、使用に関する。
別の態様において、本発明は、ヒドロキシル基からの場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基の切断における使用のための液体組成物Ｃであって、組成物は、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、液体組成物Ｃを提供する。
本発明の一態様は、ヒドロキシル基からのジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基の切断における使用のための液体組成物Ｃであって、組成物は、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有し、非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されておらず、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択される、液体組成物Ｃに関する。
そのため、本発明の一態様は、ヒドロキシル基からのジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基の切断における使用のための液体組成物Ｃであって、組成物は、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、そのプロトン化形態が１～４の範囲内のｐＫａを有する塩基と、１未満のｐＫａを有する強酸とを含み、非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されておらず、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択される、液体組成物Ｃに関する。
本発明の液体組成物Ｃの一部の実施形態において、前記液体組成物は、ヒドロキシル基からのジ（ｐ－（メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基の切断における使用のためのものであり、ここで、ＤＭＴ基を持つヌクレオシド部分は、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含む。
別の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドから場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）およびｃ）の順序を反復する工程；ならびに
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下の工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、
方法に関する。
そのため、本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下の工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、そのプロトン化形態が１～４の範囲内のｐＫａを有する塩基と、１未満のｐＫａを有する強酸とを含む、
方法に関する。
一部の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドから、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）リン（ＩＩＩ）原子をリン（Ｖ）原子に酸化または硫化し、それによって、所望の種類のヌクレオシド間連結を作出する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程または工程ｄ）を実行する前に工程ｂ）およびｃ）の順序を反復する工程のいずれか；ならびに
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基はまた、トリアリールメチル系残基、トリアリールメチル型基、またはトリチル型残基、トリアリールメチル基、またはトリチル基などと指定される。
本発明の一部の実施形態は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下の工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）リン（ＩＩＩ）原子をリン（Ｖ）原子に酸化または硫化し、それによって、所望の種類のヌクレオシド間連結を作出する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程または工程ｄ）を実行する前に工程ｂ）およびｃ）の順序を反復する工程のいずれか；ならびに
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、
方法に関する。
前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ａ）の少なくとも一反復では、ＤＭＴ保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル基は、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含むヌクレオシド部分の一部である。
前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｅ）は、行われ、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程を含む。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｅ）は、行われ、４～９９回、９～９９回、１４～９９回、１９～９９回、１９～４９回、１９～２９回、４～２２回、または４～１９回、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程を含む。
前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｅ）は、行われ、４～９９回、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程を含み、ただし、工程ｂ）の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１反復において、ＤＭＴ保護基が切断される主鎖ヒドロキシル基は、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含むヌクレオシド部分の一部である。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｅ）は、行われ、９～９９回、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程を含み、ただし、工程ｂ）の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１反復において、ＤＭＴ保護基が切断される主鎖ヒドロキシル基は、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含むヌクレオシド部分の一部である。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｅ）は、行われ、１９～９９回、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程を含み、ただし、工程ｂ）の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１反復において、ＤＭＴ保護基が切断される主鎖ヒドロキシル基は、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含むヌクレオシド部分の一部である。
前述の工程ａ）からｆ）を含む方法の一部の実施形態において、
－ 工程ａ）は、式Ｉに記載の化合物：
Figure 2024510483000001
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの繰り返し単位ｎについて同じまたは異なる保護基であり；
ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分である］
を準備する工程を含み；
－ 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み；
－ 工程ｅ）は、場合により、一連の工程ｂ）からｄ）を反復する工程を含む。
一部の実施形態において、式Ｉに記載の化合物は、以下の式Ｉ－ａの記載の化合物：
Figure 2024510483000002
 ［式中、
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの繰り返し単位ｎについて同じまたは異なる保護基であり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分であり；
ＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なる核酸塩基であり；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈであるか、またはＲＩＩおよびＲＩは、化学構造＋－ＣＨ２－Ｏ－＋＋、＋－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－＋＋、または＋－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－＋＋（ここで、＋は、４’炭素原子（すなわち、ＲＩＩが結合する炭素原子）との結合点であり、＋＋は、２’炭素（すなわち、ＲＩが結合する炭素原子）との結合点である）のメチレンまたはエチレン架橋を一緒に形成する］
である。
一部の実施形態において、式ＩまたはＩ－ａにおけるＺは、それぞれの繰り返し単位ｎについて、Ｏである。
一部の実施形態において、式Ｉおよび／またはＩ－ａにおけるＣＡは、単結合である。一部の実施形態において、式Ｉおよび／またはＩ－ａにおけるＬは、単結合である。一部の実施形態において、式Ｉおよび／またはＩ－ａにおけるＣＡおよびＬは、単結合である。式Ｉおよび／またはＩ－ａにおけるＣＡおよびＬの両方が単結合である場合、それらは、支持部分をヌクレオシドｘ０に連結する同じ単結合を一緒に表すことが理解されるであろう。
一部の実施形態において、式Ｉおよび／またはＩ－ａにおける整数ｎは、０～１５０、０～１００、０～７５、０～５０、０～３５、０～３０、０～２０、０～１０、４～３０、９～３０、９～２５、または９～２０の範囲内である。式Ｉおよび／またはＩ－ａにおける整数ｎが０である場合、保護基Ｒ１は、式Ｉおよび／またはＩ－ａに記載の化合物に依然として含まれ、ｎが０ではなかった場合に第１の繰り返し単位ｎのリン原子への共有結合に関わるであろうヌクレオシドｘ０の酸素原子に結合することが理解されるであろう。
工程ａ）が式Ｉおよび／またはＩ－ａに記載の化合物を準備する工程を含む一部の実施形態において、－ＯＲ１基を持つ末端ヌクレオシドｘｎは、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含むヌクレオシドである。
例えば、一実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、以下の工程ａ＊）からｆ＊）：
ａ＊）式Ｉに記載の化合物
Figure 2024510483000003
 ［式中：
Ｒ１は、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの繰り返し単位ｎについて同じまたは異なる保護基であり；
ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合（すなわち、ＣＡは欠けている）であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合（すなわち、Ｌは欠けている）であり；
ＳＭは、支持部分である］
を準備する工程；
ｂ＊）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、式Ｉに記載の化合物から、場合により置換されたトリアリールメチル残基Ｒ１を含む保護基を切断する工程；
ｃ＊）工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ＊）前記リン（ＩＩＩ）部分をリン（Ｖ）部分に酸化または硫化する工程；
ｅ＊）場合により、工程ｂ）からｄ）の順序のいずれかを反復する工程；および
ｆ＊）リンカー部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法に関する。
本明細書に示される工程の順番が変更されてもよいこと、および任意として示される工程が省略されてもよいことに留意すべきである。
前述の工程ａ）からｆ）を含む方法の一部の実施形態において、
－ 工程ａ）は、式ＩＩＩに記載の化合物
Figure 2024510483000004
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
Ｙは、Ｏであり；
Ｚは、Ｈであり；
ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分である］
を準備する工程を含み；
－ 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をＨ－ホスホネートビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み；
－ 工程ｅ）は、場合により、工程ｄ）を実行する前に工程ｂ）およびｃ）の順序を反復することによって、所望のオリゴヌクレオチド配列を構築する工程を含む。
一部の実施形態において、式ＩＩＩに記載の化合物は、以下の式ＩＩＩ－ａの記載の化合物：
Figure 2024510483000005
 ［式中、
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、Ｏであり；
Ｚは、Ｈであり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分であり；
ＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なる核酸塩基であり；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈであるか、またはＲＩＩおよびＲＩは、化学構造＋－ＣＨ２－Ｏ－＋＋、＋－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－＋＋、または＋－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－＋＋（ここで、＋は、４’炭素原子（すなわち、ＲＩＩが結合する炭素原子）との結合点であり、＋＋は、２’炭素（すなわち、ＲＩが結合する炭素原子）との結合点である）のメチレンまたはエチレン架橋を一緒に形成する］
である。
一部の実施形態において、式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩ－ａにおけるＣＡは、単結合である。一部の実施形態において、式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩ－ａにおけるＬは、単結合である。一部の実施形態において、式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩ－ａにおけるＣＡおよびＬは、単結合である。式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩ－ａにおけるＣＡおよびＬの両方が単結合である場合、それらは、支持部分をヌクレオシドｘ０に連結する同じ単結合を一緒に表すことが理解されるであろう。
一部の実施形態において、式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩａにおける整数ｎは、０～１５０、０～１００、０～７５、０～５０、０～３５、０～３０、０～２０、０～１０、４～３０、９～３０、９～２５、または９～２０の範囲内である。式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩａにおける整数ｎが０である場合、保護基Ｒ１は、式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩａに記載の化合物に依然として含まれ、ｎが０ではなかった場合に第１の繰り返し単位ｎのリン原子への共有結合に関わるであろうヌクレオシドｘ０の酸素原子に結合することが理解されるであろう。
工程ａ）が式ＩＩＩおよび／またはＩＩＩａに記載の化合物を準備する工程を含む一部の実施形態において、－ＯＲ１基を持つ末端ヌクレオシドｘｎは、プリン型核酸塩基、好ましくは、アデニンおよびグアニンからなる群から選択される核酸塩基、特に、アデニンを含むヌクレオシドである。
式Ｉ－ａおよびＩＩＩ－ａのいずれかにおけるそれぞれの核酸塩基ＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なり、場合により保護されている、すなわち、１つまたはそれ以上の保護基を持つことが理解されるであろう。当業者は、核酸塩基保護基に精通しており、特定の合成のためにそれらを選択する方法を知っている。特に、例えば、アデニン、グアニン、およびシトシンに存在するような、任意の環外アミノ基が保護される。表Ｔ－１は、通常使用される保護基の非限定的な概略を示す。
一部の実施形態において、式Ｉ－ａおよび／または式ＩＩＩ－ａにおいて：
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、２－メトキシエチル－１－オキシ）、－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）３（すなわち、トリメチルシリルオキシ）、－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ（ＣＨ３）３）（すなわち、ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリルオキシ）、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ（ＣＨ３）３）３（すなわち、（（トリイソプロピルシリル）オキシ）－メチルオキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において、Ｈである。
一部の実施形態において、式Ｉ－ａおよび／またはＩＩＩ－ａにおいて：
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において、Ｈである。
一部の実施形態において、式Ｉ－ａおよび／またはＩＩＩ－ａにおいて：
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、環外アミノ基がベンゾイル保護されているアデニン、環外アミノ基がイソブチリル保護されているグアニン、環外アミノ基がベンゾイルまたはアセチル保護されているシトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において、Ｈである。
別の例として、本発明は、オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、以下の工程ａ＊）からｆ＊）：
ａ＊）式ＩＩＩに記載の化合物
Figure 2024510483000006
 ［式中：
Ｒ１は、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、Ｏであり、Ｚは、Ｈであり；
ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合（すなわち、ＣＡは欠けている）であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合（すなわち、Ｌは欠けている）であり；
ＳＭは、支持部分である］
を準備する工程；
ｂ＊）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、式ＩＩＩに記載の化合物から、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基を切断する工程；
ｃ＊）工程ｂ＊）から得られる遊離ヒドロキシル基をＨ－ホスホネートビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ＊）前記リン（ＩＩＩ）部分をリン（Ｖ）部分に酸化または硫化する工程；
ｅ＊）場合により、工程ｄ’）の前に、追加のビルディングブロックのその後のカップリングのために、工程ｂ）およびｃ）を反復する工程；ならびに
ｆ＊）リンカー部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチドという表現は、ホスホジエステル結合によってまたは下記の式Ａに示されるアナログ構造によって連結された少なくとも２つのヌクレオシドを含む任意のオリゴマー、およびその任意の異性体形態および立体異性体に関する最も一般的な方法で使用される。好ましい実施形態において、本発明の意味におけるオリゴヌクレオチドは、式Ａに記載の構造またはその塩：
Figure 2024510483000007
 ［ここで、式Ａにおいて：
＊および＊＊は、別のものとはそれぞれ独立して、ヌクレオシド部分のそれぞれとの結合点（すなわち、それぞれ、先行および後のヌクレオシド部分）またはＨ（すなわち、オリゴヌクレオチドの末端の場合において）を表し；
Ｘ１は、ＳおよびＯから選択され；
Ｘ２は、任意の考えうる安定な原子または官能基であり、好ましくは、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＮＨＲ、Ｃ３～Ｃ２０－（ヘテロ）芳香族部分、－ＣＨ３、－Ｆ、－Ｃｌ、－ＳＨ、－ＳｅＨ、および－ＳＲからなる群から選択され、
ここで、Ｒは、任意の残基、好ましくは、３０個超の炭素原子を有さない残基、好ましくは、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルケニル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルキニル残基、Ｃ６～Ｃ２０アリール残基、Ｃ３～Ｃ１９ヘテロアリール残基からなる群から選択される残基であり、前述の残基は、重水素、ハロゲン、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルケニル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルキニル残基、Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）シクロアルキル残基、Ｃ６～Ｃ２０アリール残基、および／またはＣ３～Ｃ１９ヘテロアリール残基で場合により置換される］
を含むか、またはそれからなるリンカーを介して互いとコンジュゲートされた２つ以上のヌクレオシド部分を含む。
本発明全体を通して使用される場合、「アルキル」、「ヘテロアルキル」という用語は、最も広い意味で理解される。これは、例えば、メチルまたはエチルまたはイソプロピルである。ヘテロアルキルは、例えば、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＰなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含む。これはまた、アルコキシ（例えば、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３、－ＯＭｅ））および－ＮＨＣＨ３もしくは－Ｎ（ＣＨ３）２、またはその塩などの類似の残基を包含する。好ましくは、アルキルは、重水素、ハロゲン、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルケニル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルキニル残基、Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）シクロアルキル残基、Ｃ６～Ｃ２０アリール残基、および／またはＣ３～Ｃ１９ヘテロアリール残基で場合により置換された、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキルである。
本発明全体を通して使用される場合、「アルケニル」および「ヘテロアルケニル」という用語は、最も広い意味で理解され、１つ、２つまたはそれ以上の二重結合を有する。ヘテロアルケニルは、例えば、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＰなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含む。好ましくは、アルケニルは、重水素、ハロゲン、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルケニル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルキニル残基、Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）シクロアルキル残基、Ｃ６～Ｃ２０アリール残基、および／またはＣ３～Ｃ１９ヘテロアリール残基で場合により置換された、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルケニルである。
本発明全体を通して使用される場合、「アルキニル」および「ヘテロアルキニル」という用語は、最も広い意味で理解され、１つ、２つまたはそれ以上の三重結合を有する。ヘテロアルキニルは、例えば、Ｎ、Ｏ、ＳまたはＰなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含む。好ましくは、アルキニルは、重水素、ハロゲン、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルケニル残基、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ２～Ｃ２０（ヘテロ）アルキニル残基、Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）シクロアルキル残基、Ｃ６～Ｃ２０アリール残基、および／またはＣ３～Ｃ１９ヘテロアリール残基で場合により置換された、分枝状、非分枝状もしくは環状Ｃ１～Ｃ２０（ヘテロ）アルキニルである。
本発明全体を通して使用される場合、「アリール」および「ヘテロアリール」という用語は、最も広い意味で理解される。ヘテロアリールは、好ましくは環状構造中に、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓおよび／またはＰなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含む。
ヌクレオシド間の連結の種類は、オリゴヌクレオチドのすべての位置において、必ずしも同じではない。例えば、オリゴヌクレオチド鎖の中央は、ホスホジエステル結合を含み、ホスホロチオエート結合は、鎖の先端に存在する。
それぞれのヌクレオシドが、２つのヒドロキシル部分（すなわち、ヒドロキシル基またはヒドロキシル基に由来する部分、典型的には、式Ａの残基をヌクレオチド部分と連結するエステル結合に関与する）を含み、これらが、ヌクレオシド間の連結、すなわち、隣接するヌクレオシドの間に位置するリン（Ｖ）部分とのホスホエステル型結合に関与することは式Ａから明らかである。ヒドロキシル部分の１つは、先行するヌクレオシドへのヌクレオシド間の連結に関与し、他のヒドロキシル部分は、その後のヌクレオシドへのヌクレオシド間の連結に関与する。したがって、これらのヒドロキシル部分は、本文全体を通して「主鎖ヒドロキシル部分」または「主鎖ヒドロキシル基」と称される。明らかに、最初および最後のヌクレオシド単位は、１つのみのヌクレオシド間の連結に関与する。
したがって、それらは、遊離主鎖ヒドロキシル基（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるようなホスホリボース主鎖の場合において、いわゆる５’ＯＨ基および３’ＯＨ基）を含むか、またはヒドロキシル部分は、別の部分に、例えば、キャッピング構造に連結される。
本明細書において、「ヌクレオシド間の連結」および「ヌクレオシド間連結」という用語は、互換的に使用される。
オリゴヌクレオチドは、さまざまな目的のために、追加部分にコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、末端主鎖ヒドロキシル基を通してまたはヌクレオシド部分の他の官能基を介してであり、これは、オリゴヌクレオチド鎖の末端またはその中に位置する。例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’ＯＨ基は、細胞の分解を阻害し、効力を改善するために、ビニルホスホネートによって修飾される。さらなる例は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）へのコンジュゲーションであり、これは、肝細胞への標的化オリゴヌクレオチド送達のために興味が持たれる。多くの場合に、３または４つのＧａｌＮＡｃ部分を収容するように枝分かれしたＧａｌＮＡｃ構造は、例えば、オリゴヌクレオチドの５’ＯＨ基に（参照、例えば、ＷＯ２０１６０５５６０１号）、３’ＯＨ基に（参照、例えば、ＷＯ２００９０７３８０９号）コンジュゲートされるか、または一価ＧａｌＮＡｃ部分は、リンカーを介して、オリゴヌクレオチド鎖内のその後のリボース部分の２’位にコンジュゲートされる（参照、例えば、ＷＯ２０１９０７５４１９号）。
ヌクレオシド単位は、糖部分、通常、リボース部分、および核酸塩基を含むグリコシルアミンである。本明細書において使用される場合、ヌクレオシドまたはヌクレオシド単位という表現は、天然に存在するヌクレオシド、および非天然化合物を包含し、ここで、リボース部分および／または核酸塩基は、機能的等価物または脱塩基部位によって修飾または置き換えられている。天然ヌクレオシドの例には、限定されるものではないが、アデノシン、グアノシン、シチジン、リボチミジン、ウリジン、デスオキシウリジン、デスオキシチミジン、イノシン、デスオキシアデノシン、デスオキシグアノシン、デスオキシシチジン、およびそのメチル化誘導体が含まれる。さらなる例は、キューオシン、アルカエオシン、ウィブトシン、リシジン、およびＮ６－トレオニルカルバモイルアデノシンである。非天然ヌクレオシドは、変更されたリボース部分を含み、これは、例えば、「ロックド」（すなわち、２’酸素および４’炭素を接続するメチレン架橋を含む）であるか、エチレン架橋を示すか、または－Ｆ、－ＯＭｅ（－Ｏ－ＣＨ３）、および／もしくは２－メトキシエチル－１－オキシ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、別名ＭＯＥ、－Ｏ－メトキシエチル）置換基を持つ。さらに、リボース部分は、機能的等価体によって、例えば、アラビノースなどの別のペントース、マンノースなどのヘキソース、またはグリセリン部分によって置き換えられる。本明細書において使用される場合、核酸塩基という表現は、非天然核酸塩基、および例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、およびチミンなどの天然に存在する核酸塩基を包含する。
非天然核酸塩基は、それらが相補的核酸塩基と特異的相互作用が可能であるという点で天然核酸塩基の機能的等価体である。相補的核酸塩基間の相互作用は、ワトソン－クリック型塩基対形成として公知である水素結合によって媒介される。そのような非天然核酸塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体であり、これらは、別の核酸塩基と特異的相互作用が可能である。本明細書において、プリンに由来する核酸塩基は、プリン型核酸塩とも称され、ピリミジンに由来する核酸塩は、ピリミジン核酸塩基とも称される。アデニンおよびグアニンは、天然に存在するプリン型核酸塩基である。シトシン、チミン、およびウラシルは、天然に存在するピリミジン型核酸塩基である。
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に理解される。オリゴヌクレオチドの非限定的な例は、デオキシ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル核酸アナログ（ｃＥｔ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、トリシクロＤＮＡ、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ギャップマー、グリセリン核酸、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジアステレオマー的に純粋なホスホロチオエート、ならびにその誘導体およびアナログであることが、上記の説明から得られる。「オリゴヌクレオチド」という表現は、オリゴヌクレオチド部分のペプチド、炭水化物などのような他の部分とのコンジュゲートをさらに含む。オリゴヌクレオチドの特に興味深い例は、修飾リボース部分、例えば、－Ｆ、－ＯＭｅ（－Ｏ－ＣＨ３）、または２－メトキシエチル－１－オキシ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、別名ＭＯＥ、－Ｏ－メトキシエチル置換基）から選択される２’置換基を有する修飾リボース部分を含むヌクレオシド、および天然標的配列とワトソン－クリック型塩基対形成が可能な核酸塩基からのホスホロチオエートビルトである。当業者は、上記の部分が、多数の立体異性体を有し、そのすべてが上記の定義に包含されるという事実をよく承知している。「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、同じ配列を本質的に有するオリゴヌクレオチド分子の集団であり、これは、多数の別個の立体異性体の混合物であるか、または１つの特定の立体異性体形態が濃縮されているか、または１つの特定の立体異性体形態から本質的になる。
オリゴヌクレオチドが、本明細書において使用される場合、場合により、当技術分野において公知の任意の対イオン、例えば、塩化物イオン、アセテートイオン、カーボネートイオン、炭化水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、トリフルオロ酢酸（すなわち、トリフルオロアセテート ＴＦＡ）イオン、臭化物イオン、過塩素酸イオ、アンモニウムイオンおよび／または保護基の残基のカチオンもしくはアニオンなどのようなアニオンまたはカチオンを持つことが当業者に理解されるであろう。さらに、オリゴヌクレオチドは、場合により、例えば、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、チオアニソールまたは１，２－エタンジチオールなどの１つまたはそれ以上の微量のスカベンジャーに共有結合的または非共有結合的に会合している。
本明細書において使用される場合、「ヌクレオシドビルディングブロック」という表現は、オリゴヌクレオチド鎖の構築を可能にするモノマーまたはオリゴマービルディングブロックを指す。当業者は、基本的に、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む一時的保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基の使用に適合した任意のカップリング化学が、本発明の方法において使用されること、およびリン部分の化学的性質が、その結果として変わることを容易に理解するであろう。一部の実施形態において、ビルディングブロックは、Ｈ－ホスホネート部分を含む。他の実施形態において、ビルディングブロックは、例えば、ＷＯ２０１９２００２７３号において教示されるようなリンＶ試薬である。さらに他の実施形態において、ビルディングブロックは、式ＩＩに示される一般構造のホスホラミダイトビルディングブロック：
Figure 2024510483000008
 ［式中：
Ｒ１は、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基であり；
ｍは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの位置について（すなわち、末端位置についておよびそれぞれの繰り返し単位ｍについて）独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの位置について（すなわち、末端位置およびそれぞれの繰り返し単位ｍについて）同じまたは異なる保護基であり；
Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なる保護基であり；
ヌクレオシドｘｍ０～ｘｍのそれぞれは、同じまたは異なる］
である。
本発明の方法の一部の実施形態において、前記方法は、前述の工程ａ）からｆ）を含み、（工程ｃ）の）ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、式ＩＩに記載の化合物
Figure 2024510483000009
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｍは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの位置について（すなわち、末端位置についておよびそれぞれの繰り返し単位ｍについて）独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの位置について同じまたは異なる保護基であり；
Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なる保護基であり；
ヌクレオシドｘｍ０～ｘｍのそれぞれは、同じまたは異なる］
である。
モノヌクレオシドホスホラミダイトビルディングブロックの特定の非限定的な例を図１および２に示す。式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにおけるヌクレオシドｘｍ０～ｘｍおよびｘ０～ｘｎが、リボースまたはリボースアナログ部分（別名リボースサロゲート）の同一性および置換パターンに関して、核酸塩基に関して、および任意の保護基の存在および同一性に関して、互いに異なることに留意すべきである。
一部の実施形態において、式ＩＩに記載の化合物は、以下の式ＩＩ－ａの記載の化合物：
Figure 2024510483000010
 ［式中、
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｍは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの位置について独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの位置について同じまたは異なる保護基であり；
Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なる保護基であり；
ＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なる核酸塩基であり；
ＲＩＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３からなる群から選択され；
ＲＩＶは、それぞれの出現において独立して、Ｈであるか、またはＲＩＩＩおよびＲＩＶは、化学構造＋－ＣＨ２－Ｏ－＋＋、＋－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－＋＋、または＋－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－＋＋（ここで、＋は、４’炭素原子（すなわち、ＲＩＶが結合する炭素原子）との結合点であり、＋＋は、２’炭素（すなわち、ＲＩＩＩが結合する炭素原子）との結合点である）のメチレンまたはエチレン架橋を一緒に形成する］
である。
一部の実施形態において、式ＩＩおよび／またはＩＩ－ａにおけるＺは、それぞれの位置について（すなわち、末端位置についておよびそれぞれの繰り返し単位ｍについて）Ｏである。
一部の実施形態において、異なるカップリング化学を有する異なる種類のビルディングブロックは、異なるカップリングサイクルにおいて使用される。例えば、ホスホロチオエート結合ヌクレオシドは、Ｐ（Ｖ）化学を使用して導入され、ホスホジエステル結合ヌクレオシドは、Ｐ（ＩＩＩ）化学を使用して導入される。
一部の実施形態において、式ＩＩおよび／またはＩＩ－ａにおいて、ｍは、０～２の整数であり、すなわち、ビルディングブロックは、モノヌクレオシド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックである。式ＩＩおよび／またはＩＩ－ａにおける整数ｍが０である場合、保護基Ｒ１は、式ＩＩおよび／またはＩＩ－ａに記載の化合物に依然として含まれ、ｍが０ではなかった場合に第１の繰り返し単位ｍのリン原子への共有結合に関わるであろうヌクレオシドｘｍ０の酸素原子に結合することが理解されるであろう。
式ＩＩＩ－ａにおけるそれぞれの核酸塩基ＢＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なり、場合により保護されている、すなわち、１つまたはそれ以上の保護基を持つことが理解されるであろう。当業者は、核酸塩基保護基に精通しており、特定の合成のためにそれらを選択する方法が公知である。特に、例えば、アデニン、グアニン、およびシトシンに存在するような、任意の環外アミノ基が保護される。表Ｔ－１は、通常使用される保護基の非限定的な概略を示す。
一部の実施形態において、式ＩＩ－ａにおいて：
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、２－メトキシエチル－１－オキシ）、および－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）３（すなわち、トリメチルシリルオキシ）、－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ（ＣＨ３）３）（すなわち、ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリルオキシ）、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ（ＣＨ３）３）３（すなわち、（（トリイソプロピルシリル）オキシ）－メチルオキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＶは、それぞれの出現において、Ｈである。
一部の実施形態において、式ＩＩ－ａにおいて：
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＶは、それぞれの出現において、Ｈである。
一部の実施形態において、式ＩＩ－ａにおいて：
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、環外アミノ基がベンゾイル保護されているアデニン、環外アミノ基がイソブチリル保護されているグアニン、環外アミノ基がベンゾイルまたはアセチル保護されているシトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＶは、それぞれの出現において、Ｈである。
「保護基」という用語は、本明細書において使用される場合、その後のプロセスの工程における反応から基をブロックするために、例えば、オリゴヌクレオチドの主鎖または核酸塩基で副反応を防止するために、官能基の化学修飾によって分子に導入される基として最も広い意味で理解される。式Ｉ、Ｉ－ａ、ＩＩ、およびＩＩ－ａの好適な保護基Ｒ２についての典型的な例は、２－シアノエチル基であり；式ＩＩのＲ３およびＲ４の両方についての典型的な例は、イソプロピル基である。そのため、一部の好ましい実施形態において、式Ｉおよび／またはＩ－ａのＲ２は、それぞれの位置において（すなわち、それぞれの繰り返し単位ｎについて）、２－シアノエチル基である。一部の好ましい実施形態において、式ＩＩおよび／またはＩＩ－ａのＲ２は、それぞれの位置において（すなわち、それぞれ出現において）、２－シアノエチル基である。一部の好ましい実施形態において、式ＩＩ／ＩＩ－ａのＲ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ３およびＲ４は両方ともイソプロピル基である。あるいは、式ＩＩおよび／またはＩＩ－ａに記載の化合物において、Ｒ２およびＲ３は、エチレン架橋を形成し、ホスホラミダイトは、式Ｂのキラル基の形態をとる（ここで、＊＊は、主鎖ヒドロキシル基への結合点を表す）。
Figure 2024510483000011
本発明の方法において使用されるビルディングブロックは、例えば、副反応から核酸塩基の環外アミノ基をブロックするために、さらなる保護基を示す。好適なヌクレオシド誘導体は、市販されている。表Ｔ－１は、ヌクレオシドビルディングブロックのために通常使用される保護基の非限定的な概略を示す。
Figure 2024510483000012
本発明について特に興味が持たれるのは、場合により置換されたトリアリールメチル残基をそれぞれ含む保護基であり、これらは、同じヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックの多重挿入を回避するために、一時的ヒドロキシル保護基として使用される。当業者は、場合により置換されたトリアリールメチル残基をそれぞれ含むそのような保護基の特性が、それらの置換パターンに応じて変わるという事実をよく承知している。カルボカチオン脱離基を安定化する置換基は、切断を容易にし、その結果、対応する保護基は、あまり酸性ではない条件下で切断される。本発明は、好ましくは、少なくとも１つの置換基を含む場合により置換されたトリアリールメチル残基をそれぞれ含む保護基とともに使用され、これは、例えば、少なくとも１つの置換基において、カルボカチオンを安定化する効果を示し、カルボカチオンを安定化する誘起効果および／またはカルボカチオンを安定化するメソメリー効果を示す。例えば、トリアリールメチル保護基は、メトキシ基およびハロゲン原子からなる群から選択される少なくとも１つの置換基を含む。
場合により置換されたトリアリールメチル残基をそれぞれ含む好ましい保護基は、ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル（ＭＭＴ）基、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基、トリ（ｐ－メトキシフェニル）メチルエーテル（ＴＭＴ）基、４，４’－ジメトキシ－３’’－［Ｎ－（イミダゾリルメチル）］トリチル（ＩＤＴ）基、４，４’－ジメトキシ－３’’－［Ｎ－（イミダゾリルエチル）カルバモイル］トリチルエーテル（ＩＥＴ）基、ビス（４－メトキシフェニル）－１’－ピレニルメチル（Ｂｍｐｍ）基、および４－（１７－テトラベンゾ［ａ，ｃ，ｇ，ｉ］フルオレニルメチル）－４’，４’’－ジメトキシトリチル（Ｔｂｆ－ＤＭＴ）基を含む。ＤＭＴ基が特に好ましい。場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基は、本発明による方法において使用される異なるビルディングブロックについて、同じまたは異なる。
本明細書において、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基を切断するプロセスは、「脱トリチル化」と称される。
本明細書に記載される方法の工程ａ）は、支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程を含む。これは、最も広い可能な意味で理解される。例えば、多くの標準的なヌクレオシドのための固体支持体にロードされたヌクレオシドは、数多くの中から、ＭｅｒｃｋおよびＣｙｔｉｖａなどの商業的供給業者から簡単に入手される。あるいは、適切に保護されたヌクレオシドは、所与の支持部分にロードされる。当業者は、この目的のための大量の可能性がある固定化戦略を承知しており、ルーチン的にそれを選択するであろう。一般的に言えば、特定の実施形態の文脈において異なって指示されない限り、第１のヌクレオシド（式ＩおよびＩＩＩにおいてヌクレオシドｘ０と称される）は、任意の考えられる方法で支持部分に固定化される。例えば、第１のヌクレオシドは、主鎖ヒドロキシル基の１つを介して、またはリボース／リボースアナログ部分もしくは核酸塩基に位置する別の官能基を介して、共有結合的に連結される。特定の実施形態の文脈において異なって指示されない限り、工程ａ）が、支持部分に結合したオリゴヌクレオチドを準備する工程を含む場合、これが、オリゴヌクレオチドがその末端ヌクレオシドの１つを介して支持部分に結合する実施形態に限定されないことに留意すべきである。しかしながら、ホスホリボース主鎖の５’末端に次のビルディングブロックの付加を含むオリゴヌクレオチド合成の多くの方法のように、３’末端を介した固定化は、特に一般的である。
リンカー部分を使用して、支持部分とヌクレオシドとの間の連結が確立される。本明細書において使用される場合、「リンカー部分」という表現は、少なくとも２つの官能基を示す部分を指し、ここで、前記基の一方は、支持部分上の官能基に結合することができ、他方は、ヌクレオシド上の官能基に結合することができる。一例として、コハク酸リンカーまたはハイドロキノンジアセテートリンカーは、ヌクレオシドのヒドロキシル基（例えば、リボース部分の３’ヒドロキシル基）の支持部分上に存在するアミノ基（例えば、ジビニルベンゼンによるポリ（スチレン）の共重合から得られるポリマー樹脂のアミノメチル基）への連結を媒介する。他の通常使用されるリンカーは、いわゆる、ユニバーサルリンカー、例えば、米国特許第７２０２２６４号に記載される「Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ」型のものである。前記ユニバーサルリンカーなどのリンカーで修飾された支持部分が使用される場合、本方法の工程ａ）は、第１のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを、ユニバーサルリンカーを介して支持部分にロードする工程を含む。
鎖構築の最後に、新たに合成されたオリゴヌクレオチドは、支持部分から切断され、すなわち、オリゴヌクレオチドと支持部分との間、または適用可能な場合、オリゴヌクレオチドとリンカーとの間の結合は、オリゴヌクレオチドを遊離させるために破壊される（工程ｆ））。しかしながら、一部の場合において、キャッピング部分を第１のヌクレオシドに付着させることが望ましい。これは、支持部分間、または適用可能な場合、リンカーと第１のヌクレオシドとの間にキャッピング部分を含むことによって達成される。言い換えれば：キャッピング部分は、支持部分からのオリゴヌクレオチドの最終切断の間に、オリゴヌクレオチドから除去されない点で、リンカー部分とは異なる。したがって、本明細書において使用される場合、「キャッピング部分」という表現は、オリゴヌクレオチド鎖の最終ヌクレオシドにコンジュゲートされる任意の部分を指す。キャッピング部分は、最終オリゴヌクレオチド生成物に含まれる。キャッピング部分が第１のヌクレオシドとリンカー部分との間または第１のヌクレオシドと支持部分との間に存在する場合において、これは、オリゴヌクレオチドの３’末端に付着する。そのような戦略についての例は、例えば、ＷＯ２００９０７３８０９号に記載される３’ＧａｌＮａｃコンジュゲートの挿入である。
当技術分野において公知の任意の支持部分が、本発明で使用される。本明細書において使用される場合、「支持部分」という用語は、合成されるオリゴヌクレオチドが、繋ぎ止められ、合成されたオリゴヌクレオチドの液相からの分離を可能にする、任意の巨視的構造または分子構造を指す。そのため、この用語は、「樹脂」および「［樹脂］」という用語を包含し、これは、固相オリゴヌクレオチド合成のために有用な特定の構造として最も広い意味で理解される。「樹脂」、「固体支持体」および「固相」という用語は、本明細書において互換的に使用される。固相オリゴヌクレオチド合成のために、支持部分は、不溶性の固体またはゲル様基材である。好適な固体支持体の広く使用される例は、コントロールされた多孔質ガラス（ＣＰＧ）、例えば、長鎖アルキルアミン－ＣＰＧビーズ支持体、架橋ポリスチレンビーズ、および架橋ポリスチレン－ＰＥＧ複合体、例えば、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）樹脂である。本方法の工程ａ）は、さまざまな溶媒による洗浄工程によって固体支持体を条件付ける工程を含む。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、支持部分は、固体支持体である（したがって、方法は、オリゴヌクレオチドの固相合成のための方法である）。
当業者には、支持体支援合成後に、支持体（すなわち、支持部分）からオリゴヌクレオチド（すなわち、完全に構築されたオリゴヌクレオチド鎖）を切断する方法が公知である。支持体および支持部分という用語は、本明細書において互換的に使用される。典型的には、（本発明の方法の工程ｆ）におけるような）そのような切断は、支持体結合オリゴヌクレオチドを、有機アミンまたは水酸化アルカリなどの塩基で処理することによって達成され、ここで、濃アンモニア水（すなわち、水酸化アンモニウム水溶液）は、最も一般的であり、本明細書において最も好ましい。この塩基（例えば、アンモニア）処理は、室温または加熱下、例えば、４０～６０℃で、例えば、オートクレーブまたは密閉容器中で行われる。そのようなアルカリ条件下、典型的な核酸塩基保護基は、同様に切断される。通常ではないが、非限定的な例として、グアニンの環外アミノ基から任意のイソブチリル基、アデニンの環外アミノ基から任意のベンゾイル基、およびシトシンの環外アミノ基から任意のベンゾイル基またはアセチル基は、典型的には、そのようなアルカリ条件下で切断される（すなわち、除去される）。式Ｉ、Ｉ－ａ、ＩＩ、およびＩＩ－ａの保護基Ｒ２はまた、典型的には、それらがアルカリ条件下で、したがって、切断工程ｆ）の間に、切断され（すなわち、除去され）るように、選択される。２－シアノエチル保護基であるＲ２は、この戦略のための主要な例である。任意の２－シアノエチル保護基Ｒ２は、塩基処理の過程において除去されて、支持体からの切断が生じる。しかしながら、当業者に公知であるように、切断工程ｆ）は、異なる種類の塩基によるその後の処理を含む。最初に、例えば、アセトニトリルなどの好適な溶媒中のジエチルアミンまたはトリメチルアミンなどの有機アミンの溶液を、好ましくは室温で、使用して、２－シアノエチル保護基を除去し、それに続いて、濃アンモニア水による処理を行って、支持体からの切断、および核酸塩基保護基などの塩基に不安定な永久的保護基の除去を生じる。
さらに、「支持部分」という用語は、液相からそれが繋ぎ止められた合成されたオリゴヌクレオチドを有するタグの分離を可能にする任意の分子タグを包含する。液相合成のために、支持部分は、例えば、ＷＯ２０１２１５７７２３号に開示されているように、溶解性を改変するタグである。そのような支持部分は、偽固相保護基とも称される。それらは、疎水性部分に付着することによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖の溶解性を改変するように本質的に機能する。これは、簡単な沈殿または抽出工程によって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖の他の試薬からの分離を可能にする。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、支持部分は、偽固相保護基である（したがって、方法は、オリゴヌクレオチドの液相合成のための方法である）。
先述に基づいて、当業者には、「支持部分」という用語が、本明細書において使用される場合、実体の集団、例えば、ビーズ様粒子または分子タグを指し、可読性の目的のためにのみ単数形で使用されることが明らかであろう。
方法の工程ｃ）、すなわち、ビルディングブロックの成長しているオリゴヌクレオチド鎖へのカップリング、およびｄ）、すなわち、リン（ＩＩＩ）部分の酸化または硫化は、選択されるカップリング化学に依存し、当業者によってルーチン的に行われる。除去が困難な欠失配列の形成を回避するために、本発明の方法は、工程ｃ）または工程ｄ）の後に、未反応の遊離ヒドロキシル基をブロックする（キャッピングとも称される）さらなる工程を含む。一部の実施形態において、前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法は、工程ｃ）の後または工程ｄ）の後に、未反応の遊離ヒドロキシル基をブロックする工程ｇ）をさらに含む。これらの実施形態において、工程ｇ）は、工程ｃ）または工程ｄ）の少なくとも１反復後に行われるが、典型的には、同じ伸長サイクル（すなわち、カップリングサイクル）の工程ｃ）および工程ｄ）の両方の後ではない。そのため、一部の実施形態において、さらなる工程ｇ）は、工程ｃ）または工程ｄ）の少なくとも１反復後に行われる。一部の実施形態において、さらなる工程ｇ）は、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）のそれぞれの反復において、少なくとも１回、好ましくは、正確に１回行われる。一部の実施形態において、さらなる工程ｇ）は、工程ｃ）のそれぞれの反復後に行われる。一部の実施形態において、さらなる工程ｇ）は、工程ｄ）のそれぞれの反復後に行われる。異なって指示されない限り、特許請求の範囲および本方法の説明において示される工程の順番は、必ずしも縛られないことに留意すべきである。また、本方法は、さらなる工程を含んでいてもよい。例えば、構築されたオリゴヌクレオチド部分は、本方法の切断工程ｆ）を実行する前に、別の部分にコンジュゲートされる。さらに、当業者は、例えば、溶媒の組成物をプロセスの工程間に変更する場合、または以前の方法の工程から微量の試薬を除去するために、介在する洗浄工程を使用する。別の例として、本発明の方法の工程ｆ）は、最後の（および単離された、すなわち、伸長サイクルの部分ではない）工程ｂ）まで進んで、工程ｃ）の最後の反復のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックに由来する５’末端ヒドロキシル保護基Ｒ１を除去する。この最後のＲ１の除去はまた、工程ｆ）の後に行われてもよい。
本明細書において開示される方法の工程ｂ）において、主鎖ヒドロキシル基からの一時的保護基の切断は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって行われる。本明細書において使用される場合、「組成物Ｃ」という表現は、指定の成分を含む切断組成物に関する。参照符号「Ｃ」は、可読性を改善するために付加され、任意の限定を意味するものとして解釈されるべきではない。
場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む位置次的保護基の切断は、通常、周囲温度、例えば、１５～３５℃の温度で行われる。しかしながら、反応が、任意の好適な温度、例えば、０℃～９０℃の温度で行われてもよいことが理解されるべきである。液体組成物Ｃとのインキュベーションは、特定の時間的制約はなく、例えば、少なくとも５分間、１０分間、２０分間、または３０分間行われる。インキュベーションは、撹拌床反応器、スパージ床反応器（窒素ガスを反応溶液に通すことによってかき混ぜが達成される）、バッチ反応器において、液体組成物Ｃを化合物と混合して、脱保護すること、または液体組成物Ｃを、必要な時間、カラム反応器を通して循環させることを含む。切断工程は、数回、新鮮な組成物Ｃを用いて反復される。
オリゴヌクレオチド合成の方法を、液体ハンドリングシステムの最大流速を増加させる必要性なくスケールアップすることができることが、本発明の特定の利点である。さらにまた、１０％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を使用する標準的な脱保護プロトコールと比較して、本発明の方法は、液体を供給し、液体を反応容器から排出するための同じ液体ハンドリングシステムを使用しながら、バッチサイズを少なくとも５倍、好ましくは、少なくとも１０、２０、３０または４０倍の倍数まで増加することを可能にする。明確性の目的のために、反応容器を、より多くの量の試薬を収容するように変更してもよいことに留意されたい。
本出願の方法は、特に、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、または３５ｍｏｌを上回るスケールで使用される。これは、予想される最終生成物の最大理論量が、１回の単一合成プロセスについて、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、または３５ｍｏｌであることを意味する。予想される最終生成物の理論量は、すべてのその後のプロセスの工程が１００％の効率である（すなわち、所望の生成物の定量的収率で進行する）という仮定の下で、工程ａ）において提供される支持部分に結合した出発のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドのモル量に基づいて計算される。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、合成は、オリゴヌクレオチド生成物１００ｍｍｏｌ以上のスケールで行われる。
固相オリゴヌクレオチド合成は、通常、成長しているオリゴヌクレオチド鎖がそこに繋ぎ止められている固体支持体が充填されたカラム反応器を使用して行われる。カラム反応器は、典型的には、ボトムフリットおよびトップフリットを含み、固体支持体がその間に充填されている。反応容器のサイズおよび直径は、意図される合成のスケールに従って選択される。例えば、５、１０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、または３００リットルの最小内部体積を有するカラム反応器が使用される。ある特定の実施形態において、１～５００リットル、５～４５０リットル、１０～４００リットル、５０～３００リットル、または１００～３００リットルの最大内部体積を有するカラム反応器が使用される。本発明者らは、驚くべきことに、カラム反応器を通る液体組成物Ｃの流速が、場合により、むしろ低い、例えば、３００ｃｍ／時間より低い、２９０ｃｍ／時間より低い、２８０ｃｍ／時間より低い、２７０ｃｍ／時間より低い、２６０ｃｍ／時間より低い、２５０ｃｍ／時間より低い、２４０ｃｍ／時間より低い、２３０ｃｍ／時間より低い、２２０ｃｍ／時間より低い、２１０ｃｍ／時間より低い、２００ｃｍ／時間より低い、１９０ｃｍ／時間より低い、１８０ｃｍ／時間より低い、または１６０ｃｍ／時間より低いことを見出した。これは、プロセスのスケーラビリティを劇的に増加させる。そのため、前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、前記方法は、カラム反応器において行われ、カラム反応器を通る液体組成物Ｃの流速は、工程ｂ）の少なくとも１反復において、３００ｃｍ／時間より低い。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、前記方法は、カラム反応器において行われ、カラム反応器を通る液体組成物Ｃの流速は、工程ｂ）のそれぞれの反復において、３００ｃｍ／時間より低い。
代替として、本発明者らは、バッチ反応器が本発明の方法で使用されることを見出した。一実施形態において、バッチ反応器は、撹拌床反応器である。そのような反応器は、混合デバイス、ならびに例えば、溶媒および溶解した構成要素を排出する場合に、反応器の内側で支持体を保持するためのボトムフリットまたは濾布を含む。さらなる例として、１～１０００リットル、５～６５０リットル、５～３００リットル、１０～６００リットル、５０～５００リットル、または１０００リットル超の最大内部体積を有するバッチ反応器が使用される。さらなる例として、５、１０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００リットルの最小内部体積を有するバッチ反応器が使用される。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｂ）の少なくとも１反復は、バッチ反応器において行われる。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、少なくとも工程ｂ）は、バッチ反応器において行われる。前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法の一部の実施形態において、工程ｂ）のそれぞれの反復は、バッチ反応器において行われる。
好ましい実施形態において、組成物Ｃ（場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ保護基を切断するための組成物として使用できる）と支持部分（例えば、反応器における固相）に結合したオリゴヌクレオチドとの間の接触時間は、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、またはさらに１時間超である。
そのような同等の長い時間間隔は、同等の大きなサイズの反応器（例えば、カラム反応器またはバッチ反応器）のために、中程度のポンプ流量を有する標準的なポンプの使用を可能にする。そのような長い接触時間は、例えば、本発明において定義される塩基およびアルコールなしのジクロロ酢酸（ＤＣＡ）などのより多くの含有量の酸を含有する切断溶液などの当技術分野において通常使用される切断溶液のために使用される場合、望ましくない核酸塩基の切断、特に、脱プリン化をもたらす。
当業者に公知であるように、オリゴヌクレオチド合成（支持体が使用される場合、支持体からの切断を含む）に、典型的には、オリゴヌクレオチドを単離する工程が続く。
そのため、一部の実施形態において、前述の工程ａ）からｆ）を含む本発明の方法は、以下の工程ｈ）：
ｈ）支持体を切断されたオリゴヌクレオチドを単離する工程
をさらに含む。
化学オリゴヌクレオチド合成の際にオリゴヌクレオチドを単離する手段は、当業者の通常の知識の部分を形成する。典型的には、オリゴヌクレオチドを単離するそのような工程は、１つまたはそれ以上の精製工程、および１つまたはそれ以上の固体形態のオリゴヌクレオチドを得るのを支援する工程を含む。オリゴヌクレオチド精製のために、典型的には、クロマトグラフ法、特に、イオン交換（特に、陰イオン交換）クロマトグラフィー、および例えば、疎水性相互作用ＨＰＬＣの形態の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣが使用される。これらの技法は、当業者に公知である。加えて、オリゴヌクレオチドを単離する工程は、限外濾過および／または脱塩工程を含む。例えば、支持体支援オリゴヌクレオチド合成において支持体からオリゴヌクレオチドを切断した後に得られる溶液は、限外濾過および／または脱塩、イオン交換クロマトグラフィー、ならびに限外濾過および／または脱塩の別のラウンドに提供される。あるいは、支持体を切断されたオリゴヌクレオチドは、例えば、疎水性相互作用ＨＰＬＣの形態の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣに提供される。後者の方法は、好ましくは、オリゴヌクレオチドが、５’末端ヒドロキシル保護基、例えば、ＤＭＴ基を依然として持つ場合に、行われる。前記５’保護基は、酸性溶液をカラムに通過させることによって、ＲＰ－ＨＰＬＣカラムにおいてさらに除去される。５’末端保護基が、精製の前に、例えば、オリゴヌクレオチドが支持体から切断される前に除去されている場合、イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。精製には、典型的には、固体形態のオリゴヌクレオチドを得るのを支援する１つまたはそれ以上の工程が続く。例えば、凍結乾燥および噴霧乾燥が、使用される。一部の場合において、ある特定の対イオンとの塩の形態のオリゴヌクレオチドを得ることが望ましい。そのような場合において、典型的には、凍結乾燥または噴霧乾燥の前に、塩交換が行われる。
好ましくは、液体組成物Ｃに含まれる塩は、非常に吸湿性ではなく、切断組成物Ｃ（すなわち、液体組成物Ｃ）中に存在する有機溶媒の混合物に可溶性である。そのような塩は、弱塩基と強酸の反応から得られる。当業者は、酸および塩基が塩を形成する方法、および塩形成が、典型的には、含まれるイオンの電荷に応じてある特定の化学量論で起こることを承知している。単一の酸性官能基を有し、したがって、単一のプロトンを供与する酸は、一塩基酸と称され、そのコンジュゲート塩基（すなわち、脱プロトン化形態）は、単一の負電荷を有する。そのような一塩基酸、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）またはメタンスルホン酸（ＭＳＡ）の分子が、プロトンを、単一の塩基性官能基を有する（プロトン化の際に単一の正電荷をもたらす）塩基、例えば、ピリジン誘導体などに供与する場合に、塩形成は、典型的には、前記酸および前記塩基の１：１の化学量論で起こる。前記塩が、上記に示したように、本発明の液体組成物Ｃに溶解することが理解される。
液体組成物Ｃに含まれる塩基は、強酸を脱プロトン化するように機能し、強酸よりも酸性が低い塩基のプロトン化形態（すなわち、塩のカチオン）をもたらす（下記を参照）。液体組成物Ｃに含まれる塩基の総モル量が、強酸の総モル量に等しいまたはそれ以上であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態において、液体組成物Ｃにおいて、前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に等しいまたはそれ以上である。一部の実施形態において、液体組成物Ｃにおいて、前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して、１．０～３．０、１．０～２．０、１．００～１．５０、１．００～１．４０、１．００～１．３０、１．００～１．２０、１．００～１．１０、またはさらに１．０００～１．０５０当量の範囲内である。塩基の総モル量が、前記液体組成物Ｃに添加される塩基の総モル量を指し、塩基のプロトン化分子と非プロトン化分子との間を区別しないことが理解されるであろう。同様に、強酸のモル量が、前記液体組成物Ｃに添加される強酸の総モル量を指し、強酸のプロトン化分子と非プロトン化分子との間を区別しないことが理解されるであろう。組成物Ｃの塩基、強酸、または少なくとも１種のアルコールなどのある特定の種の「総モル量」という用語は、２種以上の塩基または酸またはアルコールのモル量の合計を指す。例えば、組成物Ｃに含有される塩基が、４－シアノピリジンおよび３－シアノピリジンの混合物である場合、前記塩基の総モル量は、４－シアノピリジンおよび３－シアノピリジンのモル量の合計である。同じ理論は、例えば、前記強酸および前記アルコールに適用される。
本出願の文脈において、弱塩基は、そのコンジュゲートされた酸が１～４のｐＫａを有する塩基である。同様に、本出願の文脈において、強酸は、１未満のｐＫａを有する酸である。本明細書において使用される場合、異なって指示されない限り、ｐＫａは、２５℃で、水（すなわち、水溶液）中でそのように決定可能である。酸または塩基のｐＫａ値を決定する手段は、当業者に公知であり、最も一般的な酸および塩基について、ｐＫａ値は、文献から容易に利用可能である。例えば、本明細書で参照する液体組成物Ｃの塩基、特に、芳香族環状アミン塩基（例えば、ピリジン誘導体）のｐＫａ値は、Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗ．Ｊ．Ｇａｌｌｏｗａｙ、Ｊ．Ｖａｕｇｈａｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９６４、３５９１～３５９６頁から取得されるか、またはそこに開示される手順に従って決定される。
好ましい酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、およびスルホン酸を含む。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される強酸は、カルボン酸、鉱酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸である。
好ましい塩基は、環状アミンおよび複素環アミンを含む。塩基は、ピリミジン、ピリジン、ピラジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾールまたはトリアゾールからなる群から選択され、これは、場合により、電子供与性基または電子求引性基で置換される。例えば、塩基は、１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換された、ピリミジン、ピリジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾール、および１，２，４－トリアゾールである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、環状アミンであり、好ましくは、環状アミンは、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾール、およびトリアゾールからなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、環状アミンであり、好ましくは、環状アミンは、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾール、およびトリアゾールからなる群から選択され、これは、場合により、電子供与性置換基または電子求引性置換基で置換される。本明細書において、「基」、「残基」、「部分」、および「置換基」という用語は、互換的に使用され、その結果、例えば、「電子求引性基」および「電子求引性置換基」という用語は、互換的に使用される。電子求引性置換基は、塩素、フッ素、もしくは臭素原子などのハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、またはカルボキサミド基からなる群から選択される。別の例として、塩基は、１つまたはそれ以上の電子供与性置換基で置換されたピリミジンまたはピラジンである。電子供与性置換基は、メトキシ基である。本明細書において、残基（すなわち、置換基または基）は、それらの全名称、例えば、塩素原子もしくはシアノ基、または例えば、Ｃｌ（塩素の代わり）または－ＣＮ（シアノ基の代わり）の形態によって互換的に表される。そのような場合において、特に、２個以上の原子が残基に含まれる場合、ハイフンを使用して、前記残基がコア構造に結合する原子、例えば、シアノ基の炭素原子が示される。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、ハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、およびカルボキサミド基からなる群から選択される１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換されているピリジンである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基が、シアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、および３－クロロピリジンからなる群から選択される。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基が、－ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、およびＩからなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基が、－ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦからなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基が、－ＣＮ、Ｃｌ、およびＢｒからなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基が、－ＣＮおよびＣｌからなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基が、－ＣＮによって置換されているピリジンである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、３－シアノピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、４－クロロピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、３－クロロピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、４－ブロモピリジンである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、３－ブロモピリジンである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、式Ｓ－１の環状アミン：
Figure 2024510483000013
 ［ここで、式Ｓ－１において：
Ｑ１は、ＮまたはＣ－Ｒ７であり；
Ｑ２は、ＮまたはＣ－Ｒ８であり；
Ｑ３は、ＮまたはＣ－Ｒ９であり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル基、および電子求引性置換基からなる群から選択され；
ただし、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３が、Ｎではない場合、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９からなる群から選択される少なくとも１つの置換基は、電子求引性置換基であり；およびさらに、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３の１つだけが、Ｎである］
である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、式Ｓ－１の環状アミンであり、ここで：
Ｑ１は、ＮまたはＣ－Ｒ７であり；
Ｑ２は、ＮまたはＣ－Ｒ８であり；
Ｑ３は、ＮまたはＣ－Ｒ９であり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル基、ならびに－ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦからなる群から選択される電子求引性置換基からなる群から選択され；
ただし、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３が、Ｎではない場合、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９からなる群から選択される少なくとも１つの置換基は、電子求引性置換基であり；およびさらに、Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３の１つだけが、Ｎである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、式Ｓ－１の環状アミンであり、ここで：
Ｑ１は、Ｃ－Ｒ７であり；
Ｑ２は、Ｃ－Ｒ８であり；
Ｑ３は、Ｃ－Ｒ９であり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、互いに独立して、Ｈ、ならびに－ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＦからなる群から選択される電子求引性置換基からなる群から選択され；
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは正確に１つの置換基は、電子求引性置換基である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、式Ｓ－１の環状アミンであり、ここで：
Ｑ１は、Ｃ－Ｒ７であり；
Ｑ２は、Ｃ－Ｒ８であり；
Ｑ３は、Ｃ－Ｒ９であり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、互いに独立して、Ｈ、ならびに－ＣＮ、Ｃｌ、およびＢｒからなる群から選択される電子求引性置換基からなる群から選択され；
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは正確に１つの置換基は、電子求引性置換基である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される塩基は、式Ｓ－１の環状アミンであり、ここで：
Ｑ１は、Ｃ－Ｒ７であり；
Ｑ２は、Ｃ－Ｒ８であり；
Ｑ３は、Ｃ－Ｒ９であり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、互いに独立して、Ｈ、ならびに－ＣＮおよびＣｌからなる群から選択される電子求引性置換基からなる群から選択され；
ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは正確に１つの置換基は、電子求引性置換基である。
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基からジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって；
－ 塩基は、ハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、およびカルボキサミド基からなる群から選択される１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換されているピリジンであり；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、
使用に関する。
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基からジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって；
－ 塩基は、正確に１つの水素残基がシアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンであり、より好ましくは、塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、
使用に関する。
本発明のさらなる態様は、ヒドロキシル基からのジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断における使用のための液体組成物Ｃであって、組成物は、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、ここで：
－ 非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されておらず、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、またはアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択され；
－ 塩基は、ハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、およびカルボキサミド基からなる群から選択される１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換されているピリジンであり；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、およびスルホン酸からなる群から選択される、
液体組成物Ｃに関する。
本発明のさらなる態様は、ヒドロキシル基からのジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断における使用のための液体組成物Ｃであって、組成物は、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、ここで：
－ 非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されておらず、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択され；
－ 塩基は、正確に１つの水素残基がシアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンであり、より好ましくは、塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、
液体組成物Ｃに関する。
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下の工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、ここで：
－ 塩基は、ハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、およびカルボキサミド基からなる群から選択される１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換されているピリジンであり；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、
方法に関する。
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下の工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、ここで：
－ 塩基は、正確に１つの水素残基がシアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンであり、より好ましくは、塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、
方法に関する。
切断組成物に含まれる塩は、脱保護反応において、プロトン供与体として作用する。したがって、当業者は、そのプロトン化されたカチオンのｐＫａが、切断されるトリアリールメチル基の性質に対応するように、塩を選択する。例えば、２つのメトキシ置換基を有する場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基の切断のために、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ、好ましくは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル）基の切断のために使用される塩は、好ましくは、１～２．５のｐＫａ、好ましくは、１～２のｐＫａを有するプロトン化されたカチオンを含む。一部の実施形態において、液体組成物Ｃに含有される塩基のプロトン化形態（すなわち、塩のカチオン）は、１～４、１～３．５、１～３、１～２．５、または１～２の範囲内のｐＫａを有する。例は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、ピリミジン、２－メチルピラジン、２，５－ジメチルピラジン、および３－ブロモピリジンのコンジュゲートされた酸である。好ましくは、本発明の切断組成物は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、４－シアノピリジニウムクロリド、４－シアノピリジニウムスルホン酸塩、例えば、４－シアノピリジニウムアルキルスルホン酸塩または４－シアノピリジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、３－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－シアノピリジニウムクロリド、３－シアノピリジニウムスルホン酸塩、例えば、３－シアノピリジニウムアルキルスルホン酸塩または３－シアノピリジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、ピリミジニウムトリフルオロ酢酸塩、ピリミジニウムクロリド、ピリミジニウムスルホン酸塩、例えば、ピリミジニウムアルキルスルホン酸塩またはピリミジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、２－メチルピラジニウムトリフルオロ酢酸塩、２－メチルピラジニウムクロリド、２－メチルピラジニウムスルホン酸塩、例えば、２－メチルピラジニウムアルキルスルホン酸塩または２－メチルピラジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、２，５－ジメチルピラジニウムトリフルオロ酢酸塩、２，５－ジメチルピラジニウムクロリド、および２，５－ジメチルピラジニウムスルホン酸塩、例えば、２，５－ジメチルピラジニウムアルキルスルホン酸塩または２，５－ジメチルピラジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩からなる群から選択される塩を含む。４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩が特に好ましい。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、塩基と強酸の塩は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－クロロピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、および４－クロロピリジニウム塩酸塩からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、塩基と強酸の塩は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、および３－クロロピリジニウムトリフルオロ酢酸塩からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、塩基と強酸の塩は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩である。
組成物Ｃは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコール、またはその混合物を含む。トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、またはその混合物の使用が特に好ましい。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノールである。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、ヘキサフルオロイソプロパノールである。
切断組成物中の前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総量よりも少なくとも２、５、１０、２０、４０、６０、７０、８０、または１００倍高い。
一部の実施形態において、組成物Ｃ中の前記アルコールのモル濃度は、組成物Ｃに含有される前記塩のカチオンのモル濃度よりも少なくとも２倍である。実施形態において、組成物Ｃが、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールの２つ以上を含み、組成物Ｃ中の前記アルコールのモル濃度は、組成物Ｃの液体体積によって割ったアルコールのそれぞれのモル量の合計として計算されることが理解されるべきである。一部の実施形態において、組成物Ｃ中の前記アルコールのモル濃度は、組成物Ｃに含有される前記塩のカチオンのモル濃度よりも少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、または５０倍である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃ中の前記アルコールのモル濃度は、組成物Ｃに含有される前記塩基のモル濃度よりも少なくとも２倍である。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃ中の前記アルコールのモル濃度は、組成物Ｃに含有される前記塩基のモル濃度よりも少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、または５０倍である。「前記アルコール」という用語は、そのような混合物が液体組成物Ｃ中に存在する場合、アルコールの混合物、例えば、ＴＦＥおよびＨＦＩＰの混合物を包含する。同様に、「前記塩基」という用語は、そのような混合物が液体組成物Ｃ中に存在する場合、塩基、例えば、４－シアノピリジンおよび３－シアノピリジンの混合物を包含する。
一部の実施形態において、組成物Ｃは、カルボカチオンスカベンジャーをさらに含む。本明細書において使用される場合、「カルボカチオンスカベンジャー」という表現は、形成されたカルボカチオンに結合し、それによって、カルボカチオンの望まない副反応を防止するために使用される求核性化合物、または水素化物アニオンの形式的な供与によってカルボカチオンを消費する化合物に関する。カルボカチオンスカベンジャーの例は、アルコールおよびフェノール［例えば、メタノール、エタノール、フェノール、クレゾール、水］、フェノールエーテル［例えば、アニソール、１，３－ジメトキシベンゼン（ジメチルアニソール）、１，３，５－トリメトキシベンゼン］；チオエーテル［例えば、ジメチルスルフィド、メチルエチルスルフィド、チオアニソール－、シラン－例えば、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、トリエチルシラン（ＴＥＳ）］、Ｎ－複素環［例えば、ピロール、３－メチルピロール、２，４－ジメチルピロール、インドール、２－メチルインドール、スクシンイミド、フタルイミド］、チオールおよびチオフェノール［例えば、１，２－エタンジチオール（ＥＤＴ）、１，４－ジチオエリスロール（ＤＴＥ）、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）、１，４－ベンゼンジメタンチオール（ＢＤＭＴ）、１，４－ブタンジチオール、２－メルカプトエタノール、システイン、チオフェノール、ｐ－チオクレゾール］、およびポリアルキルベンゼン［例えば、１，３，５－トリメチルベンゼン、ペンタメチルベンゼン］である。
組成物Ｃに含まれる非プロトン性溶媒は、好ましくは、ハロゲン化されていない。
好適な溶媒は、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、または（ヘテロ）芳香族エーテルからなる群から選択され、好ましくは、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、およびジフェニルエーテルからなる群から選択される。組成物Ｃは、非プロトン性のハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族溶媒、ならびトリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールの群から選択されるアルコールに加えてさらなるハロゲン化溶媒を含む。
本発明の使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、ハロゲン化炭化水素溶媒、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択される。
ハロゲン化炭化水素溶媒の非限定的な例は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン、およびクロロホルムを含む。（ヘテロ）芳香族溶媒の非限定的な例は、ベンゼンである。アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒の非限定的な例は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、およびメシチレンである。（ヘテロ）芳香族エーテルの非限定的な例は、ジフェニルエーテルである。アルキル（ヘテロ）アリールエーテルの非限定的な例は、アニソールである。
本発明の使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されていない（すなわち、その化学構造中に任意のハロゲン原子を含まない）。本発明の使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の液体組成物Ｃの一部の実施形態において、非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃの一部の実施形態において、非プロトン性溶媒は、トルエンである。本発明の液体組成物Ｃの一部の実施形態において、非プロトン性溶媒は、アニソールである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の６０～９９％、７０～９８％、８０～９８％、８１～９８％、または８１～９５％を占める。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の１～４０％、２～３０％、２～２０％、２～１９％、または５～１９％を占める。
「液体組成物Ｃの体積全体」という用語は、アルコール、非プロトン性溶媒、および液体組成物Ｃを形成するために組み合わされる任意の他の液体構成要素の体積の組合せを指す。塩基のような固体構成要素を溶解することによる体積全体の変化は、それが室温で固体である場合、前記「液体組成物Ｃの体積全体」について考慮されない。同様に、オリゴヌクレオチドおよび支持体の体積は、前記「液体組成物Ｃの体積全体」の一部と考慮されない。例えば、液体組成物Ｃが、ＴＦＥ（アルコールとして）、トルエン（非プロトン性溶媒として）、ＴＦＡ（強酸として）、および４－シアノピリジン（塩基として）からなる場合、「液体組成物Ｃの体積全体」は、ＴＦＥ、トルエン、およびＴＦＡの体積の組合せである。「総体積」という用語は、例えば、アルコールが、実際には、アルコールの混合物、例えば、ＴＦＥおよびＨＦＩＰの混合物である場合、前記「総体積」は、アルコール、例えば、ＴＦＥおよびＨＦＩＰの体積の合計を指すことを表すために使用される。同じ論理は、プロトン性溶媒の「総体積」に適用される。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において：
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の６０～９９％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の１～４０％を占める。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において：
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の７０～９８％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の２～３０％を占める。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において：
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の８１～９８％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の２～１９％を占める。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において：
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の８１～９５％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の５～１９％を占める。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃの体積全体は、切断される（すなわち、除去される）場合により置換されたトリアリールメチル残基を含むヒドロキシル保護基、好ましくは、ＤＭＴ基１ミリモル（ｍｍｏｌ）あたり５～１００ｍＬ、１０～９０ｍＬ、１０～８０ｍＬ、２０～７５ｍＬ、１０～７０ｍＬ、１０～６０ｍＬ、２０～５０ｍＬ、２０～４０ｍＬ、または２５～３７．５ｍＬの範囲内である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃにおいて、強酸の総モル量は、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基の総モル量に対して、０．８０～１５．０、１．０～１３．０、２．０～１２．５０、または２．３０～１２．５０当量の範囲内である。ＤＭＴ基などの保護基を指す場合の「総モル量」という用語は、これらの化合物の１分子あたりの前記保護基の量を掛けた、個々の保護基を持つ化合物の総モル量を指す。例えば、組成物Ｃが、１分子あたり正確に１つのＤＭＴ基を有する化合物１モルを含む場合、組成物ＣにおけるＤＭＴ基の総モル量は、前記化合物の総モル量に等しく、この例においても１モルであろう。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃにおいて、前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して、２．０～１５０．０、２．０～１２０．０、２．０～１００．０、２．０～９５．０、２．５～９５．０、３．０～９５．０、３．０～９０．０、３．０～８５．０、３．０～８０．０、３．０～７５．０、３．０～７０．０、または３．０～６５．０当量の範囲内である。「核酸塩基の総モル量」という用語は、液体組成物Ｃに含まれるすべての核酸塩基のモル量全体を指す。本質的にすべて、または少なくともほとんどが、オリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド分子）のヌクレオシド単位の部分である核酸塩基が、場合により置換されたトリアリールメチル残基を含む保護基、好ましくは、ＤＭＴ基から、切断されることが理解される。例えば、組成物Ｃが、その分子がそれぞれ５つの核酸塩基を含む化合物１モルを含む場合、前記組成物Ｃ中の核酸塩基の総モル量は、５モルである。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃにおいて：
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基の総モル量に対して０．８０～１５．０当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して２．０～１５０．０当量の範囲内である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃにおいて：
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基の総モル量に対して１．０～１３．０当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して２．０～１００．０当量の範囲内である。
本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、液体組成物Ｃにおいて：
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基の総モル量に対して２．０～１２．５当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して３．０～９５．０当量の範囲内である。
一部の好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからＤＭＴ基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ＤＭＴ基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
一部の好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからＤＭＴ基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ＤＭＴ基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
一部の好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからＤＭＴ基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ＤＭＴ基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒、トリフルオロエタノール、ならびに塩基と強酸の塩を含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
一部の好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、工程ａ）からｆ）：
ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからＤＭＴ基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ＤＭＴ基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を含み、
液体組成物Ｃは、ハロゲン化されていないおよび／または（ヘテロ）芳香族非プロトン性溶媒、ヘキサフルオロイソプロパノール、ならびに塩基と強酸の塩を含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有する、
方法を提供する。
上記の実施形態における塩は、例えば、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、４－シアノピリジニウムクロリド、４－シアノピリジニウムスルホン酸塩、例えば、４－シアノピリジニウムアルキルスルホン酸塩または４－シアノピリジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、３－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－シアノピリジニウムクロリド、３－シアノピリジニウムスルホン酸塩、例えば、３－シアノピリジニウムアルキルスルホン酸塩または３－シアノピリジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、ピリミジニウムトリフルオロ酢酸塩、ピリミジニウムクロリド、ピリミジニウムスルホン酸塩、例えば、ピリミジニウムアルキルスルホン酸塩またはピリミジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、２－メチル－ピラジニウムトリフルオロ酢酸塩、２－メチル－ピラジニウムクロリド、ａ ２－メチル－ピラジニウムスルホン酸塩、例えば、２－メチル－ピラジニウムアルキルスルホン酸塩または２－メチル－ピラジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩、２，５－ジメチル－ピラジニウムトリフルオロ酢酸塩、２，５－ジメチル－ピラジニウムクロリド、および２，５－ジメチル－ピラジニウムスルホン酸塩、例えば、２，５－ジメチル－ピラジニウムアルキルスルホン酸塩または２，５－ジメチル－ピラジニウムｐ－トルエンスルホン酸塩からなる群から選択される。４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩が特に好ましい。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、塩基と強酸の塩は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、４－シアノピリジニウムメタンスルホン酸塩、４－シアノピリジニウム塩酸塩、３－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－シアノピリジニウムメタンスルホン酸塩、３－シアノピリジニウム塩酸塩、４－クロロピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、４－クロロピリジニウムメタンスルホン酸塩、４－クロロピリジニウム塩酸塩、３－クロロピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、３－クロロピリジニウムメタンスルホン酸塩、および３－クロロピリジニウム塩酸塩からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、塩基と強酸の塩は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、４－シアノピリジニウムメタンスルホン酸塩、３－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩、４－クロロピリジニウム塩酸塩、および３－クロロピリジニウムトリフルオロ酢酸塩からなる群から選択される。本発明の液体組成物Ｃ、その使用および方法の一部の実施形態において、塩基と強酸の塩は、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩である。
本発明の方法に関して本明細書において説明された説明および詳細は、異なって指示されない限り、本発明による液体組成物Ｃの使用および液体組成物自体に同様に適用可能である。
本発明の使用および／または方法の一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、ハロゲン化炭化水素溶媒、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、ハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、およびカルボキサミド基からなる群から選択される１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換されているピリジンであり；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、カルボン酸、鉱酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の使用および／または方法の一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基がシアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンであり；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の使用および／または方法の一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基がシアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンであり：
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の６０～９９％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の１～４０％を占め；
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して０．８０～１５．０当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して２．０～１５０．０当量の範囲内であり；
－ 前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して１．０～３．０当量の範囲内である。
本発明の使用および／または方法および／または液体組成物Ｃの一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、正確に１つの水素残基がシアノ基およびハロゲン原子からなる群から選択される電子求引性置換基によって置換されているピリジンであり：
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の６０～９９％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の１～４０％を占め；
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して０．８０～１５．０当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して２．０～１５０．０当量の範囲内であり；
－ 前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して１．０～３．０当量の範囲内である。
本発明の使用および／または方法および／または液体組成物Ｃの一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の使用および／または方法および／または液体組成物Ｃの一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され：
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の７０～９８％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の２～３０％を占め；
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して１．０～１３．０当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して２．０～１００．０当量の範囲内であり；
－ 前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して１．０～２．０当量の範囲内である。
本発明の使用および／または方法および／または液体組成物Ｃの一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され：
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の７０～９８％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の２～３０％を占め；
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して２．０～１２．５当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して３．０～９５．０当量の範囲内であり；
－ 前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して１．００～１．５０当量の範囲内である。
本発明の使用および／または方法の一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の使用および／または方法の一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、ジクロロメタン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され：
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の８１～９８％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の２～１９％を占め；
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して２．０～１２．５当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して３．０～９５．０当量の範囲内であり；
－ 前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して１．０００～１．０５０当量の範囲内である。
本発明の使用および／または方法および／または液体組成物Ｃの一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される。
本発明の使用および／または方法および／または液体組成物Ｃの一部の実施形態において：
－ 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 組成物Ｃに含有される塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択され：
－ 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され；
－ 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の８１～９８％を占め；
－ 液体組成物Ｃに含有されるアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の２～１９％を占め；
－ 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して２．０～１２．５当量の範囲内であり；
－ 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して３．０～９５．０当量の範囲内であり；
－ 前記塩基の総モル量は、前記強酸の総モル量に対して１．０００～１．０５０当量の範囲内である。
本発明の方法の一部の実施形態において、
－ 工程ａ）は、式Ｉに記載の化合物
Figure 2024510483000014
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの繰り返し単位ｎについて同じまたは異なる保護基であり；
ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分である］
を準備する工程を含み；
－ 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み、ここで；
ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックは、式ＩＩに記載の化合物：
Figure 2024510483000015
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｍは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの位置について独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの位置について同じまたは異なる保護基であり；
Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なる保護基であり；
ヌクレオシドｘｍ０～ｘｍのそれぞれは、同じまたは異なる］
であり；
－ 工程ｅ）は、場合により、一連の工程ｂ）からｄ）を反復する工程を含む。
本発明の方法の一部の実施形態において、
－ 工程ａ）は、式Ｉ－ａに記載の化合物
Figure 2024510483000016
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｎは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの繰り返し単位ｎについて同じまたは異なる保護基であり；
ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分であり；
ＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なる核酸塩基であり；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈであるか、またはＲＩＩおよびＲＩは、化学構造＋－ＣＨ２－Ｏ－＋＋、＋－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－＋＋、または＋－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－＋＋（ここで、＋は、４’炭素原子（すなわち、ＲＩＩが結合する炭素原子）との結合点であり、＋＋は、２’炭素（すなわち、ＲＩが結合する炭素原子）との結合点である）のメチレンまたはエチレン架橋を一緒に形成する］
を準備する工程を含み；
－ 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み、ここで；
ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックは、式ＩＩ－ａに記載の化合物：
Figure 2024510483000017
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｍは、０以上の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの位置について独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
Ｒ２は、それぞれの位置について同じまたは異なる保護基であり；
Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なる保護基であり；
ＢＮは、それぞれの出現において同じまたは異なる核酸塩基であり；
ＲＩＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）、－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３、および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）３からなる群から選択され；
ＲＩＶは、それぞれの出現において独立して、Ｈであるか、またはＲＩＩＩおよびＲＩＶは、化学構造＋－ＣＨ２－Ｏ－＋＋、＋－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－＋＋、または＋－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－＋＋（ここで、＋は、４’炭素原子（すなわち、ＲＩＶが結合する炭素原子）との結合点であり、＋＋は、２’炭素（すなわち、ＲＩＩＩが結合する炭素原子）との結合点である）のメチレンまたはエチレン架橋を一緒に形成する］
であり；
－ 工程ｅ）は、場合により、一連の工程ｂ）からｄ）を反復する工程を含む。
本発明の方法の一部の実施形態において、
－ 工程ａ）は、式Ｉ－ａに記載の化合物
Figure 2024510483000018
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｎは、０～１５０の範囲内の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて、Ｏであり；
Ｒ２は、それぞれの出現において２－シアノエチル基であり；
ＣＡは、単結合であり；
Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
ＳＭは、支持部分であり；
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、および－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＩは、それぞれの出現において、Ｈである］
を準備する工程を含み；
－ 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み、ここで；
ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックは、式ＩＩ－ａに記載の化合物：
Figure 2024510483000019
 ［式中：
Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
ｍは、０～２の範囲内の整数であり；
Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
Ｚは、それぞれの位置について、Ｏであり；
Ｒ２は、それぞれの出現において、２－シアノエチル基であり；
Ｒ３およびＲ４は両方とも、イソプロピル基であり；
ＢＮは、それぞれの出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択され；
ＲＩＩＩは、それぞれの出現において独立して、Ｈ、Ｆ、および－Ｏ－ＣＨ３（すなわち、メトキシ）からなる群から選択され；
ＲＩＶは、それぞれの出現において、Ｈである］
であり；
－ 工程ｅ）は、場合により、一連の工程ｂ）からｄ）を反復する工程を含む。
実施される実験および達成される結果を含む以下の図面および実施例は、例示的な目的のためだけに提供され、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
ホスホリボース主鎖を有するオリゴヌクレオチドの合成に好適なビルディングブロックの非限定的な例。（ａ）ホスホラミダイトアプローチによるＤＮＡの合成のためのビルディングブロック；（ｂ）ホスホラミダイトアプローチによるＲＮＡの合成のためのビルディングブロック（「Ｄｍｔ」および「ＤＭＴ」という用語は、本明細書において互換的に使用される）；（ｃ）２’－Ｏ－メチルリボースを有するホスホラミダイトビルディングブロック；（ｄ）２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）リボースを有するホスホラミダイトビルディングブロック；（ｅ）２’－フルオロリボースを有するホスホラミダイトビルディングブロック。 リボースサロゲート（ａ）アラビノース核酸（ＡＮＡ）を得るための保護されたビルディングブロック、（ｂ）２’－フルオロアラビノース核酸（ＦＡＮＡ）を得るためのビルディングブロック、（ｃ）トレオース核酸（ＴＮＡ）を得るためのビルディングブロックを含有する、オリゴヌクレオチドアナログの合成のためのホスホラミダイトビルディングブロックを示す。以下の種類のビルディングブロックは、立体異性体として得られ、示された構造は、これらの化合物の１つ：（ｄ）１’，３’－アンヒドロトレイトール核酸（ＨＮＡ）を得るためのビルディングブロック、（ｅ）ロックド核酸（ＬＮＡ）を得るためのビルディングブロック、（ｆ）エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）を得るためのビルディングブロック、（ｇ）三環式核酸（ｔｃ－ＤＮＡ）を得るためのビルディングブロック、（ｈ）シクロヘキサン核酸（ＣｅＮＡ）を得るためのビルディングブロックを表し、（ｉ）は、リボースがグリセリンによって置き換えられている（ＧＮＡ）ビルディングブロックを示す。アンロックド核酸（ＵＮＡ）を得るための保護されたビルディングブロック（ｊ）は、リボースの酸化的環切断によって得られる。 粗５’－ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＴＴ Ｔ－３’（配列番号１）の分析的ＨＰＬＣトレース。破線 － ＥＯＰ４１４９９９４／０２：トルエン中の１０％ＤＣＡを使用するＤＭＴ脱保護（２×１０分）；純度（ＨＰＬＣ）：８９％。 実線 － ＥＯＰ４１４９９９４／０１：切断カクテルを使用するＤＭＴ脱保護（２×１０分）；純度（ＨＰＬＣ）：９３％。キャッピングは、カップリングサイクルのそれぞれにおいて行わなかった。 粗５’－ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ－３’（配列番号２）の分析的ＨＰＬＣトレース。破線 － ＥＯＰ４１４９４６７／２２：トルエン中の１０％ＤＣＡを使用するＤＭＴ脱保護（２×１０分）；純度（ＨＰＬＣ）：５０％。 実線 － ＥＯＰ４１４９４６７／２４：切断カクテルを使用するＤＭＴ脱保護（２×１０分）；純度（ＨＰＬＣ）：６４％。キャッピングは、カップリングサイクルのそれぞれにおいて行わなかった。 粗５’－ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ－３’（配列番号２）の分析的ＨＰＬＣトレース。破線 － ＥＯＰ４１４９４６７／０１：トルエン中の１０％ＤＣＡを使用するＤＭＴ脱保護（１×１分）；純度（ＨＰＬＣ）：６８％。 実線 － ＥＯＰ４１４９４６７／０２：切断カクテルを使用するＤＭＴ脱保護（２×１０分）；純度（ＨＰＬＣ）：７９％。 図５ｂは、図５ａの拡大図であり、両方の試料に対応するトレースを重ね合わせている。 粗５’－ＡＡＡ ＡＴ－３’の分析的ＨＰＬＣトレース。実線 － ＥＯＰ４１５３１５６／０３－５：ＤＣＭ中の２．０％ＤＣＡ、０．１％エタノール（ｖ／ｖ）を使用するＤＭＴ脱保護（５＋２０分）；純度（ＨＰＬＣ－ＭＳ ＵＶトレース）：９１％。破線 － ＥＯＰ４１５３１５６／０４－５：本発明の切断カクテルを使用するＤＭＴ脱保護（５＋２０分）；純度（ＨＰＬＣ－ＭＳ ＵＶトレース）：９４％。 図６ｂは、図６ａの拡大図であり、ピークは、表Ｂ．１およびＢ．２にリストされるように、ピークＩＤが割り当てられている。 粗５’－［ｍＡｓ］［ｆＣｓ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｆＡ］［ｆＡ］［ｍＧ］［ｆＣ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｍＡ］［ｍＡ］［ｍＣ］［ｆＡ］［ｍＧ］［ｆＧ］［ｍＵ］［ｆＣ］［ｍＵ］［ｍＡ］［ｍＧｓ］［ｍＡｓ］［ｍＡ］－３’の分析的ＨＰＬＣトレース。実線 － ＥＯＰ４１５０４３０／２８－１：最後のサイクルにおける本発明の切断カクテルを使用するＤＭＴ脱保護（５＋５＋５＋２０分）；純度（ＨＰＬＣ－ＭＳ ＵＶトレース）：７８％。破線 － ＥＯＰ４１５０４３０／３６－１：最後のサイクルにおけるトルエン中の１０％のＤＣＡを使用するＤＭＴ脱保護（５＋５＋５＋２０分）；純度（ＨＰＬＣ－ＭＳ ＵＶトレース）：５０％。 図７ｂは、図７ａの拡大図であり、表Ｃ．１およびＣ．２に記載される脱プリン化生成物を含有する標的生成物およびピーク範囲にマークする。
本発明を、実施例、図面および特許請求の範囲によって説明する。
一般的な方法
１．重量増加および収率の決定
理論的重量増加を決定するために、ジメトキシトリチル基の質量を、合成のスケールに従って、出発樹脂の量から減算した。塩基保護核酸塩基のβ－シアノエチルホスフェートトリエステルの合計を、配列について適用されるカップリングサイクルに従って追加した。実験的重量増加を、乾燥樹脂の決定された質量マイナス出発樹脂の質量の間の相違として計算し、ここで、ジメトキシトリチル基は、すでに減算された。収率は、実験的重量増加と理論的重量増加との間の比としてパーセントで与えられる。
より詳細に、実験的重量増加は、すべての伸長サイクルおよび最終ジメトキシトリチル除去工程の終了後の乾燥した樹脂上のオリゴヌクレオチドの質量から固体支持体の質量を減算することによって決定した。固体支持体の質量を決定するために、ジメトキシトリチル基の質量を、合成のスケールおよびジメトキシトリチル基の分子量に従って、出発樹脂（ジメトキシトリチル基を有する固体支持体からなる）の質量から減算した。理論的最大重量増加を、すべての工程において定量的収率と仮定して、配列に適用されたカップリングサイクルに従って、核酸塩基保護ヌクレオシドのβ－シアノエチル保護ホスフェートトリエステルの合計として決定した。異なって指示されない限り、収率は、パーセント（％）で与え、実験的重量増加を理論的最大重量増加によって割り、それに続いて１００％を掛けて、パーセントの値にすることによって得た。
２．純度の決定
異なって指示されない限り、オリゴヌクレオチドの純度を、Ｃ１８固定相を使用する分析的逆相ＨＰＬＣによって決定し、溶出は、グラジエントによってもたらされた（溶出液Ａ：ＨＦＩＰ／ＴＥＡ／Ｈ２Ｏ；溶出液Ｂ：メタノール）。検出波長は２６０ｎｍであった。他に指定されない限り、報告されるパーセント（％）でのオリゴヌクレオチド純度は、標的オリゴヌクレオチドのピーク下面積を、すべての意味があるピークの面積の合計によって割り、それに続いて１００％を掛けて、パーセント（％）の値にすることによって得た。異なって指示されない限り、ＵＶトレースは、０．０５％の最小相対面積閾値を適用して、積分した。異なって指示されない限り、純度の決定は、支持体を切断されたオリゴヌクレオチドを使用して行った。異なって指示されない限り、そのような支持体を切断されたオリゴヌクレオチドは、セクション「３．オリゴヌクレオチドの合成」において述べたようにして得た。
脱プリン化アッセイ
ＡおよびＧの脱プリン化に対する長い接触時間の影響を、トルエン中の１０％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を有する脱トリチル化カクテル、および２×１０分の切断時間を比較することによって評価した。アデノシンは、最も脱プリン化しやすいので、以下の配列を選択した。
キャッピング工程を、すべての合成サイクルにおいて省略した。したがって、任意の観察された鎖破壊は、異なる脱トリチル化プロトコールの結果であると予想される。
脱保護カクテルの優位性は、標準的な条件であるトルエン中の１０％のＤＣＡおよび２×１０分の切断時間との比較によって示される。配列５’－ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＴＴ Ｔ－３’（配列番号１）について、４％の純度の増加が観察された（参照、図３）。１０％のＤＣＡプロトコールの場合において、１５３７Ｄａ［Ｍ－Ｈ］－の種が、ＬＣ－ＭＳによって検出された。この種は、５’－リン酸化－ＴＴＴ ＴＴ－３’配列に割り当てられた。この種は、脱プリン化の結果であると考えられる。
より困難な２０ｍｅｒｅの５’－ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ－３’（配列番号２）について、１４％の純度の増加が観察された（参照、図４）。
３．オリゴヌクレオチドの合成
一般的なプロトコール（ＧＰ）Ａ：ホスホラミダイト溶液の調製
ベンゾイル保護アデノシン（ＡＢｚ）、ベンゾイル保護シチジン（ＣＢｚ）［または、具体的に示される場合、アセチル保護シチジン（ＣＡｃ）］、イソブチリル保護グアノシン（ＧｉＢｕ）、チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）の任意の２’－修飾（２’－デオキシ、２’－フルオロまたは２’－Ｏ－メチル、すなわち、２’－メトキシ）を有する５’－ＤＭＴ保護ヌクレオシドホスホラミダイト誘導体を、典型的には、乾燥アセトニトリル、または乾燥アセトニトリルおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの組合せに、０．２Ｍの濃度で溶解した。モレキュラーシーブ（３Å）を添加し、ヘッドスペースに窒素を流した。次いで、溶液を、最低１２時間乾燥させた。
一般的なプロトコール（ＧＰ）Ｂ：アミン塩を使用する脱トリチル化
脱トリチル化カクテルを、典型的には、塩基および強酸、または塩基および強酸から構成される事前に形成された塩を、示された非プロトン性溶媒、フッ素化アルコール、および適切な場合、追加のカルボカチオンスカベンジャーの混合物に溶解することによって調製した。個々の脱トリチル化カクテルにおけるこれらの構成要素の比を、以下の表において編集されたそれぞれの合成例について示す。
脱トリチル化カクテルを、典型的には、以下の通り混合した：塩基（０．７５～１．６％、ｗ／ｖ）および強酸（０．５～１．０％、ｖ／ｖ）、または代替的に事前に形成された塩形態（５．０％、ｗ／ｖ）を、フッ素化アルコールの溶液（２～１９％、ｖ／ｖ）、および場合により、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、トルエン、またはアニソール中のカルボカチオンスカベンジャー（７６～９６％、ｖ／ｖ）に添加した。以下の塩基を使用した：４－シアノピリジン（０．７５～１．０％、ｗ／ｖ）、３－シアノピリジン（１．０％、ｗ／ｖ）、３－クロロピリジン（１．６％、ｗ／ｖ）。以下の強酸を使用した：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．５～１．０％、ｖ／ｖ）、メタンスルホン酸（０．８％、ｗ／ｖ）。塩基と強酸の以下の事前に形成された塩を使用した：４－クロロピリジニウム塩酸塩（５．０％、ｗ／ｖ）。フッ素化アルコール２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）（５～１９％、ｖ／ｖ）または１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）（２～５％、ｖ／ｖ）を使用した。以下のカルボカチオンスカベンジャーを使用した：エタンジチオール（ＥＤＴ）（１．４％、ｖ／ｖ）、１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）（２．７％、ｖ／ｖ）、１，４－ジチオエリスロール（ＤＴＥ）（２．３％、ｗ／ｖ）、１，４－ベンゼンジメタンチオール（ＢＤＭＴ）（２．５％、ｗ／ｖ）、Ｈ２Ｏ（１％、ｖ／ｖ）、およびトリエチルシラン（ＴＥＳ）（１．９％、ｖ／ｖ）。
例として、「１．０：０．７：１９：８０、４－シアノピリジン：ＴＦＡ．ＴＦＥ：トルエン、ｍ：ｖ：ｖ：ｖ」と記載される脱トリチル化カクテルは、ＴＦＥ（１９％（ｖ／ｖ））、ＴＦＡ（０．７％（ｖ／ｖ））、およびトルエン（８０．３％（ｖ／ｖ））の混合物に４－シアノピリジン（１．０％（ｍ／ｖ））を溶解して得られる溶液を指す。異なって指示されない限り、「ｍ：ｖ：ｖ：ｖ」と書かれる比は、質量ｇの体積ｍＬに対する比を指す。
本明細書において、「ｍ：ｖ」および「ｗ：ｖ」という表現は、互換的に使用され、異なって指示されない限り、ｍおよびｗは、質量（ｇ）を指し、ｖは、体積（ｍＬ）を指す。同じように、「ｍ／ｖ」および「ｗ／ｖ」という表現は、本明細書において、互換的に使用され、ここで再び、異なって指示されない限り、ｍおよびｗは、質量（ｇ）を指し、ｖは、体積（ｍＬ）を指す。
脱トリチル化の前に、樹脂を、典型的には、溶媒、例えば、ＤＣＭまたはトルエンで洗浄した。脱トリチル化を、脱トリチル化カクテルを使用して行った、上記参照。樹脂上の保護されたオリゴヌクレオチドを、１～４回または２～３回、典型的にはそれぞれ５～２０分間、およびＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（商標）がロードされた固体支持体について、典型的には、それぞれ３０～７０分間、脱保護した。次いで、樹脂を、典型的には、アセトニトリルで洗浄した。
一般的なプロトコール（ＧＰ）Ｃ：トルエン中の１０％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）（ｖ／ｖ）を使用する脱トリチル化
脱トリチル化を、典型的には、市販のトルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）を使用して１分間の１工程、または２×１０分間の２工程（すなわち、それぞれ１０分で２反復）を行った。次いで、樹脂を、典型的には、アセトニトリルで洗浄した。
一般的なプロトコール（ＧＰ）Ｄ：ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２％のＤＣＡおよび０．１％のエタノール（ｖ／ｖ）を使用する脱トリチル化
脱トリチル化を、典型的には、３１０秒の接触時間で１回、または１０＋１０分、５＋５分、５＋１０分、もしくは５＋２０分の２工程（すなわち、２反復）で行った。次いで、樹脂を、典型的には、アセトニトリルで洗浄した。
一般的なプロトコール（ＧＰ）Ｅ：トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）を使用する脱トリチル化
トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）を用いるトリチル化を、典型的には、２～４工程（すなわち、２～４反復）で行った。脱トリチル化の時間は、典型的には、反復あたり５～２０分であった。ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（商標）がロードされた固体支持体について、脱トリチル化時間は、典型的には、反復あたり５＋５＋２０分であり、これは、脱トリチル化溶液を、第１および第２の工程において、それぞれ５分間、ならびに第３の工程において、２０分間、樹脂と接触させる３工程（すなわち、反復）を示す。樹脂を、典型的には、脱トリチル化手順の終了後に、アセトニトリルで洗浄した。
オリゴヌクレオチドの合成のための標準的なプロトコール：
異なって指示されない限り、合成を、３’から５’の方向で所望の順序に従って、３’－ホスホラミダイトヌクレオシドを使用して、１０ｍＬのシリンジ反応器において手動で（Ｒ－１）、１Ｌの撹拌床反応器において手動で（Ｒ－２）、または２５ｍＬのスパージ床反応器（Ｎ２ガスをフィルター反応器にバブリングすることによるかき混ぜ）において自動で（Ｒ－３）行った。すべての反応器の種類は、反応器において樹脂を保持する、ならびに溶媒および試薬を排出するための、フィルター、フリット、または適切なポアサイズの膜を備えていた。
合成を、典型的には、樹脂の重量および置換（およそ、０．３４～０．４１ｍｍｏｌ／ｇまたは０．２～０．４ｍｍｏｌ／ｇ）に基づいて、４０μｍｏｌ、２．５ｍｍｏｌ、または０．０４～５．０ｍｍｏｌのスケールで実行した。市販のＤＭＴ保護ポリスチレン出発樹脂（第１のヌクレオシドまたはＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（商標）のいずれかで官能化）を、典型的には、使用した。市販の出発樹脂のヌクレオシドおよびＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（商標）の群を、典型的には、コハク酸エステルまたはアミドによって、ポリスチレン支持体に連結した。
第１のカップリングサイクルの前に、樹脂を、反応器に移し、アセトニトリル（ＡＣＮ、４０～５０ｍＬ／ｇ）で１０分間洗浄した。添加されるヌクレオシドホスホラミダイトのそれぞれについて、異なって指示されない限り、表１による１回のカップリングサイクルを行った。
Figure 2024510483000020
脱トリチル化を、典型的には、ＧＰ Ｂに記載される脱トリチル化カクテルを用いて、ＧＰ Ｃのトルエン中の１０％（ｖ／ｖ）のＤＣＡ、ＧＰ Ｄに示されるＤＣＭ中の２％（ｖ／ｖ）のＤＣＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）のエタノール、またはＧＰ Ｅのトルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）を使用して行った。
カップリングを、典型的には、ＧＰ Ａで調製された溶液中のホスホラミダイトを使用し、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール活性化剤（ＥＴＴ、０．５Ｍ）を添加して、行った。
酸化を、典型的には、水およびピリジン（１：９、ｖ／ｖ）溶液の混合物中のヨウ素溶液（５０ｍＭ）を使用して行った。実施例において、２５ｍＬのスパージ床反応器（Ｒ－３）を使用した場合、樹脂質量あたりの酸化体積は、１７．７ｍＬ／ｇであった。
チオール化（すなわち、硫化）を、典型的には、ピリジン中０．２Ｍのキサンタン水素化物溶液を使用して、またはアセトニトリルおよびピリジンの混合物（１：１、ｖ／ｖ）中０．１Ｍのキサンタン水素化物溶液を使用して、行った。実施例において、２５ｍＬのスパージ床反応器（Ｒ－３）を使用した場合、樹脂質量あたりのチオール化体積は、１７．７ｍＬ／ｇであった。
典型的な合成サイクル（すなわち、カップリングサイクル）が、酸化またはチオール化のいずれかを含むことに留意すべきである。両方の場合において、リン（ＩＩＩ）連結基は、リン（Ｖ）連結基に変換される。
キャッピングを、典型的には、Ｃａｐ Ａ（アセトニトリル中の２０％の無水酢酸、ｖ／ｖ）およびＣａｐ Ｂ（Ｎ－メチルイミダゾール、２，６－ルチジン、アセトニトリル、２０：３０：５０、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物（１：１、ｖ／ｖ）を用いて行った。実施例において、２５ｍＬのスパージ床反応器（Ｒ－３）を使用した場合、樹脂質量あたりのキャッピング体積は、８．７ｍＬ／ｇであった。
洗浄工程を、典型的には、アセトニトリルを使用して行った。脱トリチル化の前にのみ、ＤＣＭ（例えば、脱トリチル化カクテルの溶媒としてＤＣＭを使用する場合）またはトルエン（例えば、脱トリチル化カクテルのための溶媒としてトルエンまたはアニソールを使用する場合）を、洗浄工程のために使用した。実施例において、２５ｍＬのスパージ床反応器（Ｒ－３）を使用した場合、脱トリチル化前のＤＣＭおよびトルエン洗浄体積は、１４ｍＬ／ｇであり、樹脂質量あたりのＡＣＮ洗浄体積は、４４ｍＬ／ｇであった。活性化剤洗浄は、場合によってのみ行った。異なって指示されない限り、活性化剤洗浄を行った。この用語は、カップリング工程のために指定されたアセトニトリルおよび活性化剤の溶液を使用する洗浄工程を指す（すなわち、アセトニトリル中の０．５ＭのＥＴＴ）。
異なって指示されない限り、典型的なカップリングサイクルのそれぞれの工程は、撹拌（撹拌床反応器）または振とう（シリンジ反応器）または窒素バブリングによるかき混ぜ（スパージ床反応器）下で、示された時間、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を持つ固体支持体を個々の試薬溶液（例えば、脱トリチル化工程のための脱トリチル化カクテルまたは洗浄工程のためのニート溶液）と接触させる工程、それに続いて、反応器の内側で支持体に結合した成長しているオリゴヌクレオチドを保持するように、個々の溶液をフィルターに通して排出する工程を含んでいた。典型的なカップリングサイクルの工程、例えば、脱トリチル化工程を、１回またはそれ以上の回数、反復する。そのような場合において、前述の手順は、単純に反復され、すなわち、試薬溶液を、反応器から排出し、樹脂上のオリゴヌクレオチドを、個々の溶液の別のバッチで処理し、それに続いて、溶液を排出する。実施例１～１０において、それぞれの脱トリチル化工程の反復の数、および反復あたりの脱トリチル化カクテルとの接触時間を、表形式で具体的に示す。例えば、それぞれ１０分の接触時間での２反復は、２×１０分または１０＋１０分と称される。
異なって指示されない限り、合成は、２２℃で行った。
合成サイクルを、適切なヌクレオシドホスホラミダイトを使用して、順序に従って反復した。
最後の５’－ＤＭＴ脱トリチル化を、洗浄工程を含む以前のサイクルにおいて使用されたものと同じ手順を使用して行った。次いで、樹脂を、最低１６時間、減圧下で乾燥した。
すべてのカップリングサイクルおよび最後の脱トリチル化工程の終了後、樹脂を秤量し、試料のトライアル切断および脱保護を行った。この目的のために、典型的には、１０～５０ｍｇの乾燥樹脂を、好適な反応容器（例えば、２ｍＬのＰＰチューブ）に秤量した。水酸化アンモニウム水溶液（すなわち、アンモニア水溶液、２５～２８％（ｗ／ｖ）、１～２ｍＬ）を添加した。チューブを、閉じ、シールし、振とうし、オリゴヌクレオチドの長さおよび配列に応じて、４５～５５℃に２～２０時間加熱した。場合により、アセトニトリル中のジエチルアミン（ＤＥＡ）による処理は、アンモニア水による処理の前に行われる。上清を、典型的には、シリンジを使用して除去し、第２のチューブ（２～５ｍＬ）に移した。アンモニアを、典型的には、真空遠心分離を使用して、または窒素ガスのわずかな流れを用いて除去した。次いで、溶液（支持体を切断されたオリゴヌクレオチドを含有する）を、所望の濃度までＨ２Ｏで希釈し、それに続いて、ＨＰＬＣまたはＨＰＬＣ－ＭＳを介して分析した。
４．脱プリン化アッセイ
アッセイ方法Ａ：
ＡおよびＧの脱プリン化に対する長くした（すなわち、延長した）接触時間の影響を、２×１０分の切断時間を使用して、個々の脱トリチル化カクテル（ＧＰ Ｂによる）を標準的な脱トリチル化カクテル（トルエン中の１０％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、ＧＰ Ｃ）と比較することによって、評価した。アデノシンは、最も脱プリン化しやすいので、好適な配列を選択した。
アッセイ方法Ａを使用する脱プリン化アッセイの合成および結果を、下記に実施例５としてリストする。
アッセイ方法Ｂ：
脱トリチル化プロトコールＧＰ Ｂを、脱プリン化を低減または排除するのを特異的に支援する脱トリチル化プロトコールを記載する先行技術（ＷＯ９６０３４１７Ａ１号）と比較した。この先行技術から、ＤＣＭ中の２％（ｖ／ｖ）のＤＣＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）のエタノールからなる脱トリチル化混合物を、比較のために選択した（ＧＰ Ｄ）。５ｍｅｒのＤＮＡ ５’－ＡＡＡ ＡＴ－３’を、標的オリゴヌクレオチドとして選択した。
脱プリン化副生成物を、２５～２８％（ｗ／ｖ）のアンモニア水による標準的な切断および脱保護の間の、脱プリン化脱塩基部位に対応する質量を有する生成物および脱プリン化脱塩基部位の分解反応の結果として生成した副生成物として、支持体を切断されたオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ－ＭＳ分析によって特定した（例えば：Ｓ．Ｐｏｕｒｓｈａｈｉａｎら、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０２１、４０、７５～１０９頁を参照されたい）。多数の異なる脱プリン化生成物が観察されたので、ＨＰＬＣ－ＭＳ測定のＵＶトレースを、最小相対面積閾値を適用することなく、積分した。これは、それらの個々の質量に従って、脱プリン化関連副生成物に関するより小さなピークの排除を回避する。
アッセイ方法Ｂを使用する脱プリン化アッセイの合成および結果を、下記に実施例７としてリストする。これらの分析のクロマトグラムを、図６ａおよび６ｂとして示す。これらのクロマトグラムにおいて、ピークは、ピークＩＤが割り当てられた。以下の表Ｂ．１において、これらのピークＩＤは、質量分析データに基づいてオリゴヌクレオチドまたは断片に割り当てられる（計算および検出されたモノアイソトピック質量を提供した）。これは、これらのオリゴヌクレオチドまたは断片の推定構造を示す表Ｂ．２に続く。個々のＨＰＬＣ－ＭＳ測定のＵＶトレースから、すべての特定された脱プリン化生成物のピーク面積の合計を、生成物（すなわち、標的オリゴヌクレオチド、全長生成物とも称される）のピーク面積によって割り、それに続いて１００％を掛けて、パーセント（％）の値にすることによって、脱プリン化の度合いを、決定した。
Figure 2024510483000021
Figure 2024510483000022
Figure 2024510483000023
Figure 2024510483000024
Figure 2024510483000025
Figure 2024510483000026
Figure 2024510483000027
アッセイ方法Ｃ：
脱トリチル化プロトコールＧＰ ＢおよびＧＰ Ｅを、２’位に電子求引性置換基を有するオリゴヌクレオチドの合成に適用した（例えば、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｆ－デオキシリボース）。
２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅヌクレオシドの両方、ならびにホスホジエステル（ＰＯ）およびホスホロチオエート（ＰＳ）が混合した主鎖を有する２３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５’－［ｍＡｓ］［ｆＣｓ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｆＡ］［ｆＡ］［ｍＧ］［ｆＣ］［ｍＡ］［ｆＡ］［ｍＡ］［ｍＡ］［ｍＣ］［ｆＡ］［ｍＧ］［ｆＧ］［ｍＵ］［ｆＣ］［ｍＵ］［ｍＡ］［ｍＧｓ］［ｍＡｓ］［ｍＡ］－３’を、標的オリゴヌクレオチドとして選択した。この標的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド原薬（ＡＰＩ）において通常見出されるビルディングブロックを表す。以下の表記法を使用した：「ｍ」は、個々のヌクレオシドサブユニットのリボース部分が２’－Ｏ－Ｍｅ基を持つことを示し；「ｆ」は、個々のヌクレオシドサブユニットのリボース部分が２’－Ｆ（フルオロ）置換基を持つことを示し：「ｓ」は、個々のヌクレオシドサブユニットの３’位のヌクレオシド間連結基がホスホジエステル基の代わりにホスホロチオエート基であることを示す。
脱トリチル化性能を評価するために、全体的な純度を使用した。脱プリン化の度合いを具体的に決定するために、アデニン核酸塩基が欠けている脱塩基部位の量を、ＨＰＬＣ－ＭＳによって定量した。アンモニア処理の間の２’－Ｆ／２’－ＯＭｅオリゴヌクレオチドの脱塩基部位の安定性に起因して、脱塩基部位を使用して、脱プリン化を直接定量した。脱塩基副生成物が他の副生成物と同時溶出するので、問題のピークを、ＵＶトレース（ＨＰＬＣ－ＭＳ）において積分し、異なる脱塩基副生成物の相対量を、最大エントロピーアルゴリズムを使用するＢｒｕｋｅｒデータ分析ソフトウェアにおける電荷解析を適用した後に質量トレースの積分によって決定した。
アッセイ方法Ｃを使用する脱プリン化アッセイの合成および結果を、下記に実施例８としてリストする。これらの分析のクロマトグラムを、図７ａおよび７ｂとして示す。これらのクロマトグラムにおいて、ピークは、ピークＩＤが割り当てられた。以下の表Ｃ．１において、これらのピークＩＤは、質量分析データに基づいてオリゴヌクレオチドまたは断片に割り当てられる（計算および検出されたモノアイソトピック質量を提供した）。これは、これらのオリゴヌクレオチドまたは断片の推定構造を示す表Ｃ．２に続く。
脱プリン化の度合いを決定するための、質量トレースにおけるＣ．１－２の相対含有量を、Ｃ．１－２を含有するピークについて決定し、ＵＶトレースにおける個々のピークの相対面積を掛けた。脱プリン化の度合いを、ＵＶトレースにおけるＣ．１－２のそのようにして得られた補正面積を、ＵＶトレースにおける生成物（すなわち、標的オリゴヌクレオチドまたは全長生成物）の面積によって割り、それに続いて１００％を掛けて、パーセント（％）の値にすることによって、得た。
Figure 2024510483000028
Figure 2024510483000029
実施例１：比較例－トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）を用いる脱トリチル化。
Figure 2024510483000030
合成ＥＯＰ４１４８５０３／３４、３７、７０、７３および４１４９４６７／０１、２１を、ＧＰ Ｃに従って実施した。
２つの異なるモデル配列を、先行技術の標準的な脱トリチル化カクテルを使用して合成した。２つまたは４つの合成を、それぞれのモデル配列について行った。ＧＰ Ｃを、１×１分または２×１０分の脱保護時間で、脱トリチル化のために使用した。両方の合成のプロトコールは、脱保護時間に関してのみ異なり、すべての他の合成パラメーターは、一定に保った。比較は、先行技術において使用された標準的な脱トリチル化カクテル（トルエン中の１０％のＤＣＡ、ｖ／ｖ）が、脱トリチル化カクテルとオリゴヌクレオチドとのより長い接触時間が生じた場合に、不利であることを実証する。
実施例２：本発明による組成物を用いる脱トリチル化
Figure 2024510483000031
合成ＥＯＰ ４１４８５０３／３５、４１、４８および４１４９４６７／０２を、ＧＰ Ｂを使用して、上記に記載されたようにして行った。
ＥＯＰ４１４８５０３／３５および４１４９４６７／０２について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＥＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７９ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ ４１４８５０３／４８について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＥＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（７９ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／４１について、ＴＦＥ（０．２３Ｌ）、ＥＤＴ（１７ｍＬ）、４－シアノピリジン（１２ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（８．４ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（０．９５Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
２つの異なるモデル配列を、本発明による脱トリチル化プロトコールを使用して合成した。脱トリチル化プロトコールＧＰ Ｃを、２×１０分の脱トリチル化時間でのＧＰ Ｂによって置き換えたという事実を除き、それぞれの配列についての合成パラメーターは、実施例１と同一であった。実施例１の結果との比較（ＥＯＰ ４１４８５０３／４８対ＥＯＰ ４１４８５０３／３４；ＥＯＰ ４１４９４６７／０２対ＥＯＰ ４１４９４６７／０１；ＥＯＰ ４１４８５０３／４１対ＥＯＰ ４１４８５０３／３７を比較する）は、本発明による液体組成物Ｃが、従来技術の標準的な脱トリチル化方法、すなわち、１×１分の脱保護時間でトルエン中の１０％（ｖ／ｖ）のＤＣＡと比較して、改善された重量増加および純度を提供することを実証する。この効果は、より厳しい２０ｍｅｒ配列（ＥＯＰ ４１４９４６７／０２対ＥＯＰ ４１４９４６７／０１）のために特に顕著である：本発明により合成された試料は、全体的により明確な不純物プロファイルを示し；全体的な純度は１１％増加した。対応する分析的クロマトグラムを図５に示す。これらの観察は、本発明による脱保護方法および組成物が、不純物形成を抑制しながら、保護基の改善された除去を可能にすることを示唆する。本発明のプロトコールと比較して従来技術のプロトコールの不利な点は、より長い接触時間を回避できない場合に、さらにより明白である（ＥＯＰ ４１４８５０３／４８対ＥＯＰ ４１４８５０３／７０；ＥＯＰ ４１４９４６７／０２対ＥＯＰ ４１４９４６７／２１；ＥＯＰ ４１４８５０３／４１対ＥＯＰ ４１４８５０３／７３を比較する）。
ＥＯＰ ４１４９４６７／０２において、脱トリチル化溶液の体積は、反復あたり２．５ｍＬ／１００μｍｏｌの出発材料（すなわち、出発樹脂上に１００μｍｏｌのＤＭＴ保護ＯＨ基）であった。４０μｍｏｌの合成スケールのために、脱トリチル化体積は、１．０ｍＬであった。これは、反復あたり９２μｍｏｌの酸を含有し、これは、最後の脱トリチル化工程の間に、ＤＭＴ基に対して２．３当量、および核酸塩基に対して０．１２当量を表す。脱トリチル化カクテルは、反復あたり２．６ｍｍｏｌのＴＦＥを含有し、これは、第１のサイクルにおける核酸塩基に対して６６当量のＴＦＥ、および５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが終了した時に核酸塩基に対して３．３当量のＴＦＥと等しい。
実施例３：本発明による組成物を用いる脱トリチル化－さまざまなカルボカチオンスカベンジャーの使用
Figure 2024510483000032
Figure 2024510483000033
合成を、ＧＰ Ｂを使用して、上記に記載されたようにして行った。
ＥＯＰ４１４８５０３／５３について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＤＯＤＴ（２．７ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７７．６ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／５０について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＤＴＥ（２．３ｇ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７０％（ｖ／ｖ）、０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７８ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／５２について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＢＤＭＴ（２．５ｇ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７８ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／５５について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＴＥＳ（１．９ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７８ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／５４について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７９ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４９４６７／０７について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（７９ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／５１について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４９４６７／０６について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（８０ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
この実施例は、シラン［例えば、トリエチルシラン（ＴＥＳ）］、チオールまたはチオフェノール［例えば、３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）、１，４－ジチオエリスロール（ＤＴＥ）、１，４－ベンゼンジメタンチオール（ＢＤＭＴ）］などのさまざまな種類の通常のカルボカチオンスカベンジャーおよび水を、例えば、使用することができることを示す。
実施例４：本発明による組成物を用いる脱トリチル化－異なるフッ素化アルコールの使用
Figure 2024510483000034
合成を、脱トリチル化のためにＧＰ Ｂを使用して、上記に記載されたようにして行った。
ＥＯＰ４１４８５０３／６３について、ＨＦＩＰ（５ｍＬ）、ＥＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（９３ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／６６について、ＴＦＥ（５ｍＬ）、ＥＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（９３ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
ＥＯＰ４１４８５０３／６７について、ＨＦＩＰ（２ｍＬ）、ＥＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（９６ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
この実施例は、脱トリチル化カクテル中のフッ素化アルコールの濃度を変更することができること、およびＴＦＥ以外のフッ素化アルコールを使用することができることを示す。
実施例５：脱プリン化に対する効果（脱プリン化アッセイ、アッセイ方法Ａ）
Figure 2024510483000035
脱トリチル化のために使用されるＧＰ Ｂ対ＧＰ Ｃ：ＥＯＰ４１４９９９４／０１、ＥＯＰ４１４９９９４／０２、ＥＯＰ４１４９４６７／２２について２×１０分、およびＥＯＰ４１４９４６７／２４について３×１０分で、実験を、一般的なプロトコール「脱プリン化アッセイ、アッセイ方法Ａ」において説明されたようにして、キャッピングなしで行った。
ＥＯＰ ４１４９９９４／０１および４１４９４６７／２４について、ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＤＯＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（７７．６ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
本発明の脱トリチル化カクテルの利益は、標準的な条件、すなわち、トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）、および２×１０分の脱トリチル化時間との比較によって示される。配列５’－ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＴＴ Ｔ－３’（配列番号１）について、４％の純度の増加が観察された（参照、図３）。１０％のＤＣＡプロトコールの場合において、１５３７Ｄａ［Ｍ－Ｈ］－の種が、ＬＣ－ＭＳによって検出された。より困難な２０ｍｅｒのＤＮＡ ５’－ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＴ－３’（配列番号２）について、１４％の純度の増加が観察された（参照、図４）。
実施例６：２’位に電子求引性置換基を有するオリゴヌクレオチドの合成（例えば、ＲＮＡ合成、ＧＰ Ｂを脱トリチル化のために使用した）
Figure 2024510483000036
合成ＥＯＰ ４１４９４６９／０１およびＥＯＰ ４１４９４６８／０１を、ＧＰ Ｂを使用して、上記に記載されたようにして行った。
ＴＦＥ（１９ｍＬ）、ＥＤＴ（１．４ｍＬ）、４－シアノピリジン（１．０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（７９ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
両方の合成は、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅ置換を有するオリゴヌクレオチドへのＧＰ Ｂの適用性を示す。さらにまた、ＥＯＰ ４１４９４６９／０１は、ホスホジエステル（ＰＯ）およびホスホロチオエート（ＰＳ）が混合した主鎖を有するオリゴヌクレオチドへの適用性を実証する。
実施例７：脱プリン化アッセイ（アッセイ方法Ｂ）
Figure 2024510483000037
Figure 2024510483000038
実施例７における合成（表Ｅ．７．１において編集された通り）を、ＧＰ Ｂ、ＧＰ Ｄ、またはフッ素化アルコールをエタノールに置き換えたＧＰ Ｂに類似のプロトコールのいずれかを使用して、セクション「３．オリゴヌクレオチドの合成」、特に、表１に示される通り、０．１０ｍｍｏｌスケールで行った。
合成ＥＯＰ４１５３１５６／０３－１～－５を、低減された脱プリン化を伴う脱トリチル化を記載する先行技術（ＷＯ９６／０３４１７号）に対する参照として、異なる脱トリチル化時間を用いるＧＰ Ｄに従って実施した。ＤＣＡ（９．０ｍＬ、０．２４Ｍ）、エタノール（０．４５ｍＬ、１７ｍＭ）をＤＣＭ（４４１ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化混合物を調製した。脱トリチル化溶液の体積は、反復あたり３．７５ｍＬ／１００μｍｏｌの出発材料（すなわち、出発樹脂上に１００μｍｏｌのＤＭＴ保護ＯＨ基）であった。この体積は、反復あたり０．９０ｍｍｏｌの酸を含有し、これは、最後の脱トリチル化工程の間に、ＤＭＴ基に対して９．０当量、および核酸塩基に対して１．８当量を表す。
合成ＥＯＰ ４１５３１５６／０４－１～－５を、ＧＰ Ｂに従って実施した。ＴＦＥ（８５．５ｍＬ）、４－シアノピリジン（４．５０ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（３．２ｍＬ、９２ｍＭ）をＤＣＭ（３６１ｍＬ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。脱トリチル化溶液の体積は、反復あたり３．７５ｍＬ／１００μｍｏｌの出発材料（すなわち、出発樹脂上に１００μｍｏｌのＤＭＴ保護ＯＨ基）であった。この体積は、反復あたり０．３５ｍｍｏｌの酸を含有し、これは、最後の脱トリチル化工程の間に、ＤＭＴ基に対して３．５０当量、および核酸塩基に対して０．７０当量を表す。ＤＣＭを、先行技術との良好な比較可能性を確実にし、溶媒効果を排除するために、非プロトン性溶媒として選択した。一般的な合成条件および脱トリチル化時間は、ＥＯＰ ４１５３１５６／０３－１～－５に記載される脱トリチル化カクテルを用いて実施された合成と同等であった。
３１０秒の最も短い脱トリチル化時間を、先行技術（ＷＯ９６／０３４１７号）を考慮して選択し、ここで、３１０秒は、フロースループロトコールにおいて好ましい脱トリチル化時間である。バッチ反応器のセットアップについて、この脱トリチル化時間は、不完全な脱トリチル化、したがって低い純度（それぞれ、ＥＯＰ ４１５３１５６／０３－１、純度３５％、およびＥＯＰ ４１５３１５６／０４－１、純度５１％）をもたらす。本発明の脱トリチル化カクテルは、恐らくより速い脱トリチル化の結果として、より高い純度をもたらす。２つの脱トリチル化工程（すなわち、２反復）（１０＋１０分、５＋５分、５＋１０分、５＋２０分）を伴う延長された脱トリチル化手順もすべて、本発明の脱トリチル化カクテルにより、より高い純度をもたらす。
本発明の脱トリチル化カクテルにより達成される改善された純度が、より高いアルコール濃度の単なる結果ではないことを実証するために、１９％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いる追加の合成を実施した（合成ＥＯＰ ４１５３１５６／２０－１～－５）。エタノール（８６ｍＬ）、４－シアノピリジン（４．５ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（３．２ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（０．３６Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。脱トリチル化溶液の体積は、脱トリチル化の反復あたり３．７５ｍＬ／１００μｍｏｌの出発材料（すなわち、出発樹脂上に１００μｍｏｌのＤＭＴ保護ＯＨ基）であった。すべての場合において、脱トリチル化が、１９％（ｖ／ｖ）のエタノールの存在によって著しく妨害されたので、全長生成物はほとんど観察されなかった。ＤＣＭおよびトルエンは、ＧＰ Ｂ（例えば、実施例２、４、および５を参照されたい）を使用する脱トリチル化反応に両方とも好適であることが示されたので、ＥＯＰ ４１５３１５６／２０－１～－５においてＴＦＥをエタノールで置き換える場合に得られた非常に不十分な結果は、このアルコールの変更に主に寄与する。
次に、脱トリチル化の度合いを、表Ｅ．７．１にリストされたすべての合成についてＨＰＬＣ－ＭＳ（図６．ａ、６．ｂ）によって決定し、結果を、表Ｅ．７．２において編集する。この目的のために、すべての特定された脱プリン化生成物（表Ｂ．１およびＢ．２を参照されたい）のピーク面積を合計し、生成物（すなわち、標的オリゴヌクレオチド、全長生成物とも称される）のピーク面積によって割り、それに続いて１００％を掛けて、パーセント（％）の値にした。
Figure 2024510483000039
すべての脱トリチル化時間について、本発明の組成物／方法は、ＷＯ９６／０３４１７号の組成物／方法よりも低い脱プリン化の度合いを与えた。ＥＯＰ４１５３１５６／０３－５およびＥＯＰ４１５３１５６／０４－５のクロマトグラムを、図６に提供する。
実施例８：２’位に電子求引性置換基を有するオリゴヌクレオチドの合成（脱プリン化アッセイ、アッセイ方法Ｃ）
Figure 2024510483000040
合成ＥＯＰ４１５０４３０／２８－１を、脱トリチル化のためにＧＰ Ｂを使用して、０．１ｍｍｏｌスケールで実施した。ＴＦＥ（０．４６Ｌ）、４－シアノピリジン（２４ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（１７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（１．９Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
合成ＥＯＰ４１５０４３０－３６－１を、脱トリチル化のためにＧＰ Ｅを使用して、０．１ｍｍｏｌスケールで実施した。ＤＣＡ（０．３０Ｌ）をトルエン（２．７Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
表Ｅ．８から結論付けられるように、脱トリチル化のためにＧＰ Ｂを使用する合成（ＥＯＰ４１５０４３０／２８－１）において得られた純度は、より高く、脱プリン化の度合いは、ＧＰ Ｅの通常の脱トリチル化溶液のトルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）（ＥＯＰ４１５０４３０／３６－１）によるよりも低い。トルエン中の１０％のＤＣＡ（ｖ／ｖ）で、脱トリチル化は、一部の工程において不完全であり、標的生成物の前に短く溶出する多くの量の副生成物をもたらす（図７ａ、７ｂ）。
実施例９：本発明による組成物を用いる脱トリチル化－異なるハロゲン化されていない非プロトン性溶媒の使用
Figure 2024510483000041
Figure 2024510483000042
合成ＥＯＰ ４１５３１５６／０５－１、３、４および４１５３１５６／１２－２、５、ならびにＥＯＰ ４１５３１５６／１５－１～－５を、脱トリチル化カクテル中のＤＣＭをトルエンまたはアニソールのいずれかで置き換える以外は、実施例７のＥＯＰ ４１５３１５６／０４－１～－５と同じ条件下（表Ｅ．７．１を参照されたい）で実施した。脱トリチル化溶液の体積は、脱トリチル化の反復あたり３．７５ｍＬ／１００μｍｏｌの出発材料（すなわち、出発樹脂上に１００μｍｏｌのＤＭＴ保護ＯＨ基）であった。これは、反復あたり０．３５ｍｍｏｌの酸を含有し、この体積は、最後の脱トリチル化工程の間に、ＤＭＴ基に対して３．５０当量、および核酸塩基に対して０．７０当量を表す。脱トリチル化カクテルは、反復あたり９．９ｍｍｏｌのＴＦＥを含有し、これは、第１のサイクルにおける核酸塩基に対して９９当量のＴＦＥ、および５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが終了した時に核酸塩基に対して２０当量のＴＦＥと等しい。
ＴＦＥ（８６ｍＬ）、４－シアノピリジン（４．５ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（３．２ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（０．３６Ｌ）に溶解することによって、合成ＥＯＰ ４１５３１５６／０５－１、３、４および４１５３１５６／１２－２、５の脱トリチル化カクテルを調製した。同様に、ＴＦＥ（８６ｍＬ）、４－シアノピリジン（４．５ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（３．２ｍＬ、９２ｍＭ）をアニソール（０．３６Ｌ）に溶解することによって、ＥＯＰ ４１５３１５６／１５－１～－５の脱トリチル化カクテルを調製した。
表Ｅ．９にリストされる例は、トルエンを含む脱トリチル化カクテル、およびアニソールを含む脱トリチル化カクテルの両方が、脱トリチル化手順ＧＰ Ｂに従って、５ｍｅｒのＤＮＡ ５’－ＡＡＡ ＡＴ３’の合成の成功をもたらすことを示す。ハロゲン化されていない溶媒の使用は、工業スケールの合成のために大きな環境的利益を提示する。
実施例１０：本発明による組成物を用いる脱トリチル化－異なる塩基および強酸の使用
Figure 2024510483000043
Figure 2024510483000044
Figure 2024510483000045
合成ＥＯＰ ４１５３１５６／０６－１～－５を、ＧＰ Ｂに従って、０．１ｍｍｏｌスケールで実施した。ＴＦＥ（８６ｍＬ）、３－クロロピリジン（７．０ｇ、０．１４Ｍ）、ＴＦＡ（４．５ｍＬ、０．１３Ｍ）をトルエン（０．３６Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
合成ＥＯＰ ４１５３１５６／１１－１～－５を、ＧＰ Ｂに従って、０．１ｍｍｏｌスケールで実施した。ＴＦＥ（８６ｍＬ）、３－シアノピリジン（４．５ｇ、９６ｍＭ）、ＴＦＡ（３．２ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（０．３６Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
合成ＥＯＰ４１５３１５６／１３－１～－５を、ＧＰ Ｂに従って、０．１ｍｍｏｌスケールで実施した。ＴＦＥ（８６ｍＬ）、４－シアノピリジン（４．５ｇ、９６ｍＭ）、メタンスルホン酸（ＭＳＡ）（２．７ｍＬ、９２ｍＭ）をトルエン（０．３６Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
合成ＥＯＰ４１５３１５６／１４－１～－３を、ＧＰ Ｂに従って、０．１ｍｍｏｌスケールで実施した。ＴＦＥ（４９ｍＬ）、４－クロロピリジン－ＨＣｌ（１３ｇ、０．３３Ｍ）をトルエン（０．２０Ｌ）に溶解することによって、脱トリチル化カクテルを調製した。
５ｍｅｒのＤＮＡ ５’－ＡＡＡ ＡＴ－３’を、この実施例に記載されるすべての脱トリチル化カクテルを用いて成功裏に合成し、本発明の方法が、塩基および強酸の良好な変動性を可能にすることを示す。用いられたピリジン塩基のプロトン化形態（すなわち、ピリジニウムイオン／塩のカチオン）のｐＫａ値は、文献（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａ．、Ｇａｌｌｏｗａｙ，Ｗ．Ｊ．、Ｖａｕｇｈａｎ，Ｊ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（要約）１９６４、３５９１～３５９６頁）から取得することができる：３－シアノピリジン（プロトン化形態：ｐＫａ＝１．３５）、４－シアノピリジン（プロトン化形態：ｐＫａ＝１．８６）、３－クロロピリジン（プロトン化形態：ｐＫａ＝２．８１）、４－クロロピリジン（プロトン化形態：ｐＫａ＝３．８３）。そのため、ピリジニウムイオンのｐＫａ値は、１．３５～３．８３のｐＫａ値の範囲をカバーする。同様に、用いられた強酸は、広い範囲の酸のクラスをカバーする：ＴＦＡは、カルボン酸であり、ＭＳＡは、スルホン酸であり、ＨＣｌ（事前に形成されたＨＣｌ塩の形態で使用される）は、鉱酸である。

Claims (24)

  1. オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、ヒドロキシル基から、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断を生じさせながら、核酸塩基切断を抑制するための、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含む液体組成物Ｃの使用であって、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、使用。
  2. オリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下の工程ａ）からｆ）：
    ａ）支持部分に結合したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護されている主鎖ヒドロキシル部分を含む、工程；
    ｂ）前記化合物を液体組成物Ｃとともにインキュベートすることによって、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドからジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基を切断し、それによって、遊離主鎖ヒドロキシル部分を作製する工程；
    ｃ）工程ｂ）から得られる遊離主鎖ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分と反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護されたヒドロキシル基をさらに含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン原子との間の共有結合的連結を生成する、工程；
    ｄ）場合により、リン部分を修飾する工程；
    ｅ）場合により、工程ｂ）～ｃ）またはｂ）～ｄ）の順序を反復する工程；および
    ｆ）支持部分からオリゴヌクレオチドを切断する工程
    を含み、
    液体組成物Ｃは、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有する、
    方法。
  3. － 工程ｃ）において使用されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックのリン部分は、リン（ＩＩＩ）部分であり；
    － 方法は、リン（ＩＩＩ）原子をリン（Ｖ）原子に酸化または硫化し、それによって、所望の種類のヌクレオシド間連結を作出するさらなる工程ｄ）を含み；
    － 工程ｅ）は、場合により、工程ｂ）からｄ）の順序を反復する工程または工程ｄ）を実行する前に工程ｂ）およびｃ）の順序を反復する工程のいずれかを含む、
    請求項２に記載の方法。
  4. － 工程ａ）は、式Ｉに記載の化合物
    Figure 2024510483000046
     ［式中、
    Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
    ｎは、０以上の整数であり；
    Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
    Ｚは、それぞれの繰り返し単位ｎについて独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
    Ｒ２は、それぞれの繰り返し単位ｎについて同じまたは異なる保護基であり；
    ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
    ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
    Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
    ＳＭは、支持部分である］
    を準備する工程を含み；
    － 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み；
    － 工程ｅ）は、場合により、一連の工程ｂ）からｄ）を反復する工程を含む、
    請求項２～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、式ＩＩに記載の化合物
    Figure 2024510483000047
     ［式中、
    Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
    ｍは、０以上の整数であり；
    Ｙは、それぞれの繰り返し単位ｍについて独立して、ＳおよびＯからなる群から選択され；
    Ｚは、それぞれの位置について独立して、ＯおよびＳからなる群から選択され；
    Ｒ２は、それぞれの位置について同じまたは異なる保護基であり；
    Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なる保護基であり；
    ヌクレオシドｘｍ０～ｘｍのそれぞれは、同じまたは異なる］
    である、
    請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. － 工程ａ）は、式ＩＩＩに記載の化合物
    Figure 2024510483000048
     ［式中、
    Ｒ１は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基であり；
    ｎは、０以上の整数であり；
    Ｙは、Ｏであり；
    Ｚは、Ｈであり；
    ヌクレオシドｘ０～ｘｎのそれぞれは、同じまたは異なり；
    ＣＡは、キャッピング部分または単結合であり；
    Ｌは、リンカー部分または単結合であり；
    ＳＭは、支持部分である］
    を準備する工程を含み；
    － 工程ｃ）は、工程ｂ）から得られる遊離ヒドロキシル基をＨ－ホスホネートビルディングブロックと反応させる工程であって、ビルディングブロックは、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基によって保護された主鎖ヒドロキシル部分を含み、それによって、前記遊離ヒドロキシル基の酸素原子と前記ビルディングブロックのリン（ＩＩＩ）原子との間の共有結合的連結を生成する工程を含み；
    － 工程ｅ）は、場合により、工程ｄ）を実行する前に工程ｂ）およびｃ）の順序を反復することによって、所望のオリゴヌクレオチド配列を構築する工程を含む、
    請求項２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 工程ｃの後または工程ｄ）の後に、未反応の遊離ヒドロキシル基をブロックする工程ｇ）をさらに含む、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 少なくとも工程ｂ）は、バッチ反応器において行われる、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 方法は、カラム反応器において行われ、カラム反応器を通る液体組成物Ｃの流速は、工程ｂ）の少なくとも１反復において、３００ｃｍ／時間を下回る、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 合成は、オリゴヌクレオチド生成物１００ｍｍｏｌ以上のスケールで行われる、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 方法は、以下の工程ｈ）：
    ｈ）支持体を切断されたオリゴヌクレオチドを単離する工程
    をさらに含む、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、ハロゲン化炭化水素溶媒、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択される、請求項２～１１のいずれか１項に記載の方法または請求項１に記載の使用。
  13. 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されていない、請求項２～１２のいずれか１項に記載の方法または請求項１および１２のいずれか１項に記載の使用。
  14. ヒドロキシル基からのジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル保護基の切断における使用のための液体組成物Ｃであって、組成物は、非プロトン性溶媒と、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ペンタフルオロプロパノール、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－メチル－２－プロパノール、およびノナフルオロ第三級ブチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１種のアルコールと、塩基と強酸の塩とを含み、塩のカチオンは、１～４の範囲内のｐＫａを有し、強酸は、１未満のｐＫａを有し、非プロトン性溶媒は、ハロゲン化されておらず、（ヘテロ）芳香族溶媒、アルキル（ヘテロ）芳香族溶媒、（ヘテロ）芳香族エーテル、およびアルキル（ヘテロ）アリールエーテルからなる群から選択される、液体組成物Ｃ。
  15. 組成物Ｃに含有される塩基は、環状アミンであり、
    好ましくは、環状アミンは、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾール、およびトリアゾールからなる群から選択される、
    請求項２～１３のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２もしくは１３のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４に記載の液体組成物。
  16. 組成物Ｃに含有される塩基は、ハロゲン原子、シアノ基、アルデヒド基、ケト基、カルボキシエステル基、およびカルボキサミド基からなる群から選択される１つまたはそれ以上の電子求引性置換基で置換されているピリジンである、請求項２～１３もしくは１５のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～１５のいずれか１項に記載の液体組成物。
  17. 塩基は、４－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－クロロピリジン、３－クロロピリジン、およびその混合物からなる群から選択される、請求項２～１３もしくは１５～１６のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～１６のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の液体組成物。
  18. 組成物Ｃに含有される強酸は、カルボン酸、鉱酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、請求項２～１３もしくは１５～１７のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～１７のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～１７のいずれか１項に記載の液体組成物。
  19. 組成物Ｃに含有される強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、スルホン酸、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、強酸は、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、およびその混合物からなる群から選択される、請求項２～１３もしくは１５～１８のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～１８のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～１８のいずれか１項に記載の液体組成物。
  20. 組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒は、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、メシチレン、アニソール、およびその混合物からなる群から選択される、請求項２～１３もしくは１５～１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～１９のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～１９のいずれか１項に記載の液体組成物。
  21. 液体組成物Ｃに含有される少なくとも１種のアルコールは、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、およびその混合物からなる群から選択される、請求項２～１３もしくは１５～２０のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～２０のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～２０のいずれか１項に記載の液体組成物。
  22. － 液体組成物Ｃに含有される非プロトン性溶媒の総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の６０～９９％を占め；
    － 液体組成物Ｃに含有されアルコールの総体積は、液体組成物Ｃの体積全体の１～４０％を占める、
    請求項２～１３もしくは１５～２１のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～２１のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～２１のいずれか１項に記載の液体組成物。
  23. 組成物Ｃにおける前記アルコールのモル濃度は、組成物Ｃに含有される前記塩基のモル濃度の少なくとも２倍超である、請求項２～１３もしくは１５～２２のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～２２のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～２２のいずれか１項に記載の液体組成物。
  24. 液体組成物Ｃにおいて、
    － 前記強酸の総モル量は、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル基の総モル量に対して０．８０～１５．０当量の範囲内であり；
    － 前記アルコールの総モル量は、核酸塩基の総モル量に対して２．０～１００．０当量の範囲内である、
    請求項２～１３もしくは１５～２３のいずれか１項に記載の方法、または請求項１、１２、１３もしくは１５～２３のいずれか１項に記載の使用、または請求項１４～２３のいずれか１項に記載の液体組成物。
JP2023556964A 2021-03-19 2022-03-18 改善されたオリゴヌクレオチド合成 Pending JP2024510483A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21163788 2021-03-19
EP21163788.9 2021-03-19
PCT/EP2022/057241 WO2022195111A1 (en) 2021-03-19 2022-03-18 Improved oligonucleotide synthesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024510483A true JP2024510483A (ja) 2024-03-07

Family

ID=75111538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023556964A Pending JP2024510483A (ja) 2021-03-19 2022-03-18 改善されたオリゴヌクレオチド合成

Country Status (6)

Country Link
EP (2) EP4276104A2 (ja)
JP (1) JP2024510483A (ja)
CN (1) CN117836304A (ja)
CA (1) CA3207897A1 (ja)
DK (1) DK4161942T3 (ja)
WO (1) WO2022195111A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024061842A1 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Bachem Holding Ag Improved oligonucleotide synthesis

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996003417A1 (en) 1994-07-25 1996-02-08 Hybridon, Inc. Improved methods of detritylation for oligonucleotide synthesis
US7202264B2 (en) 2003-01-31 2007-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Supports for oligomer synthesis
US8299206B2 (en) 2007-11-15 2012-10-30 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
JP5979139B2 (ja) 2011-05-17 2016-08-24 味の素株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
AU2015329974B2 (en) 2014-10-10 2019-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag GaINAc phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
HRP20231063T1 (hr) 2017-10-13 2023-12-22 Novo Nordisk Health Care Ag Postupci i pripravci namijenjeni inhibiranju eksprimiranja ldha
SG11202008827XA (en) 2018-04-13 2020-10-29 Bristol Myers Squibb Co Novel phosphorous (v)-based reagents, processes for the preparation thereof, and their use in making stereo-defined organophoshorous (v) compounds

Also Published As

Publication number Publication date
EP4161942B1 (en) 2023-08-02
CN117836304A (zh) 2024-04-05
DK4161942T3 (da) 2023-10-23
WO2022195111A1 (en) 2022-09-22
EP4276104A2 (en) 2023-11-15
CA3207897A1 (en) 2022-09-22
EP4161942A1 (en) 2023-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2207779B1 (en) Method of synthesis of morpholino oligomers
US5962674A (en) Synthesis of oligonucleotides containing alkylphosphonate internucleoside linkages
US20090131632A1 (en) Method of synthesis of morpholino oligomers
JP2002517404A (ja) オリゴヌクレオチド合成のためのアクチベーター
KR102316282B1 (ko) 올리고뉴클레오타이드 조성물 및 이를 제조하는 방법
JP2024510483A (ja) 改善されたオリゴヌクレオチド合成
AU2018223027A1 (en) Post-synthetic orthogonal amidation plus metal catalyzed azide-alkyne cycloaddition click chemistry on siRNA
EP1317466B1 (en) Synthons for oligonucleotide synthesis
CA2721969C (en) Process for the manufacture of oligonucleotides
WO2022214692A1 (en) Pseudo solid phase protecting group and methods for the synthesis of oligonucleotides and oligonucleotide conjugates
JP7199410B2 (ja) 改善されたイメテルスタットの調製方法
WO2024019137A1 (ja) オリゴヌクレオチドの製造方法
WO2024061842A1 (en) Improved oligonucleotide synthesis
Zatsepin et al. Efficient conjugation and preferential DNA binding of oligonucleotides containing 2′-O-(2-oxoethyl) arabinouridine
Eritja Nucleic Acids Chemistry: Modifications and Conjugates for Biomedicine and Nanotechnology
JP2005518451A (ja) ホスフィチル化化合物を製造する方法
AU2008321409B8 (en) Method of synthesis of morpholino oligomers
WO2009007736A1 (en) Oxidation process