JP2024509124A - 絨毛間質細胞組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、周産期間質細胞の組成物及びその使用方法を提供する。具体的には、本発明は、羊膜間質細胞、ホウォートンゼリー間質細胞、胎盤固有間質細胞、絨毛膜間質細胞、または絨毛膜絨毛間質細胞を含む組成物、ならびに、移植片対宿主病の処置、線維症の低減、炎症の軽減、免疫寛容の誘導、及び単一または多臓器の線維症の処置のための、その組成物の使用方法を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０２１年２月２６日に出願された「ＶＩＬＬＩ ＳＴＲＯＭＡＬ ＣＥＬＬＳ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題された米国仮出願第６３／１５４，０２７号に対する優先権を主張し、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、一般に、周産期間質細胞組成物に関し、より具体的には、絨毛膜絨毛由来間質細胞の組成物、ならびに組織線維症及び組織炎症を処置するその組成物の使用に関する。

背景情報
移植後の拒絶反応は、依然として、高い罹患率及び死亡率と関連する医学的障害である。移植拒絶反応は、急性（短期）または慢性（長期）に分類することができる。急性拒絶反応は、それほど一般的ではないが、広範囲の免疫抑制剤の進歩により管理することができる。他方では、慢性拒絶反応は、好適な処置を有さず、これは、満たされていない重要な臨床ニーズを表す。造血幹細胞移植の場合、ドナー細胞がレシピエントの細胞を「非自己」として認識し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）として既知のプロセスで宿主組織に対する広範な攻撃に参加する時、拒絶反応が特徴的である。慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）は、移植患者の３０～６０％で発症する主要な免疫学的合併症であり続けている。臨床的ｃＧＶＨＤは、急性拒絶反応の特徴を有するが、主に、閉塞性動脈障害及び間質性線維症を特徴とする進行性同種移植傷害などの自己免疫症候群に似た、より多様な要素も有する。例えば、肺のｃＧＶＨＤは、気流閉塞を伴う閉塞性細気管支炎として現れ得る。同様に、肝臓では、肝臓のｃＧＶＨＤは、胆管減少症及び線維症と関連し得る。明らかに、ｃＧＶＨＤは、臓器同種移植片拒絶反応と関連する病理の多くを共有する。従って、免疫調節分子は、ｃＧＶＨＤを処置する新薬を開発する際の大きな関心のあるものである。

間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、多分化能、遊走能力、及び推定される免疫特権状態の組み合わせのために、治療用途及び再生用途を有する。さらに、ＭＳＣは、損傷部位に遊走した後に遭遇する環境の合図に反応する。当初、ドナー幹細胞の送達による利点は、臓器修復の改善がもたらされる、損傷した組織への局在化及び健康な細胞への分化によるものであると考えられたが、生着及び生存のレベルは、５％未満であり、数字は、治療に関連するには小さすぎると考えられる。さらに、ＭＳＣ（骨髄、ＢＭ、または脂肪由来、ＡＳＣ）の有益な効果の１つは、パラクリンシグナル伝達による局所細胞／組織環境の調節と関連している。高齢者及び高齢動物から分離されたＭＳＣ（ＢＭ及び脂肪由来）は、部分的に分子プロファイルの変化が原因で、加齢に伴い再生能力を失うことを、最近の証拠は示唆する。従って、高齢のドナー由来のＭＳＣが、若いドナーに由来するＭＳＣほど、有効である可能性は低い。多くの重要な疑問は、古いＭＳＣの再生能力の悪化に関連する因子の喪失または獲得を中心に展開している。

周産期間質細胞（ＰＳＣ）は、出生後の赤ちゃんの周囲の組織に由来する細胞である。ＰＳＣは、正常な妊娠中の自然免疫調節機能の一部（すなわち、免疫寛容、抗炎症など）を活用することを目的として、細胞治療分野で関心を集めている。さらに、ＰＳＣは、他の方法では、廃棄される、倫理的に供給された材料から大量に収集することができる。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と同様に、ＰＳＣは、免疫調節特性と、ｉｎ ｖｉｖｏで臓器の線維化を調節する能力について研究されている。骨髄由来の間葉系間質細胞が、ＧＶＨＤを調節する能力において広く研究されているが、ＰＳＣについてはほとんど情報が得られていない。さらに、ヒト化ＧＶＨＤモデルにおいて、ＰＳＣに関する情報は入手できない。さらに、異なる組織供給源由来のＰＳＣをｉｎ ｖｉｖｏで比較する報告はなく、組織供給源が潜在的な治療効果にどのように影響し得るかを理解する上でギャップが残されている。

ホウォートンゼリー（ＷＪ）のＭＳＣ、ならびに「若い」ＭＳＣ（すなわち、ＰＳＣ）の豊富な供給源である全絨毛膜由来（ＣＳＣ）及び絨毛膜絨毛由来ＭＳＣ（ＣＶＣ）は、生体の組織から単離されたＭＳＣと比較していくつかの利点をもたらし得る。これらには、組織供給源の無制限の利用可能性、非侵襲性の単離、及び多数のＭＳＣにつながる分離効率の向上を含む。さらに、最新の文献は、ＷＪ－ＭＳＣが、胚性幹細胞のいくつかの有益な特徴を示し、以前に報告されているような腫瘍形成及び浸潤と関連する因子を欠いていることが報告されている。

本発明は、羊膜、胎盤、ホウォートンゼリー、絨毛膜、絨毛膜絨毛、及び臍帯組織から単離された周産期間質組織細胞が、移植片対宿主病の処置及び／または予防用に、特に、組織線維症、例えば、特発性肺線維症及び多臓器線維症の処置及び／または予防、に有用であるという独創的な発見に基づいている。

一実施形態では、本発明は、以下の細胞型：（ｉ）羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、（ｉｉ）胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、（ｉｉｉ）ホウォートンゼリー周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）、（ｉｖ）全絨毛膜由来間質細胞（ＣＳＣ）、及び（ｖ）絨毛膜絨毛由来間質細胞（ＣＶＣ）、のうちの少なくとも１つと、薬学的に許容される担体を含む周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの少なくとも２つを含む上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの少なくとも３つを含む上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの少なくとも４つを含む上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの５つ全てを含む上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、ＡＰＳＣ、ＰＰＳＣ、ＷＰＳＣ、またはＣＶＣのうちの少なくとも１つがＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７３、ＣＤ２１０、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される分子マーカーを発現する上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、ＡＰＳＣ、ＰＰＳＣ、ＷＰＳＣ、またはＣＶＣのうちの少なくとも１つがＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ１１９、ＣＤ８５ｂ、ＣＤ１７８、ＣＤ４０、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される分子マーカーを発現しない上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、該細胞が複数のドナーに由来する上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、該細胞が同じ血液型の複数のドナーに由来する上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、該細胞が互いに組織適合性があると判定されている複数のドナーに由来する上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、該細胞が同じものを含むか、または類似のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を含むと判定されている複数のドナーに由来する上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、上記のＰＳＣ組成物を提供し、該細胞が、１人以上のドナーに由来し、それの上記ＤＮＡが、分析されて、該細胞が、限定されないが、常染色体優性疾患、例えば、家族性高コレステロール血症、Ｉ型神経線維腫症、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ハンチントン病、常染色体劣性疾患、例えば、鎌状赤血球性貧血、嚢胞性線維症、テイ・サックス病、フェニルケトン尿症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、ムコ多糖症、リソソーム酸リパーゼ欠損症、糖原病、例えば、ガラクトース血症、Ｘ連鎖性疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、及び血友病を含む遺伝性疾患に関連するものを含む遺伝子変異を含まないことが確認されている。

別の実施形態では、本発明は、該細胞が任意の病原性ウイルスまたは他の微生物病原体を含まないと判定されている１人以上のドナーに由来する上記のＰＳＣ組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象の慢性炎症及びそれに伴う組織線維症を低減する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、上記の特許請求の範囲のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む。

別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の線維症を処置または予防する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、先行請求項のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む。

別の実施形態では、本発明は、対象が、例えば、感染症、化学療法、がん、ＣＯＰＤ、環境損傷、例えば、アスベスト、石炭粉塵などにより引き起こされる肺もしくは肺線維症、または疾患、例えば、がんもしくは嚢胞性線維症；例えば、アルコール依存症、脂肪肝疾患、ＮＡＳＨ、Ｂ型肝炎、もしくはＣ型肝炎により引き起こされる肝線維症；例えば、疾患、感染症、心臓発作、もしくは脳卒中により引き起こされる心臓線維症；リンパ節の石灰化線維症を特徴とする縦隔線維症；後腹膜腔の線維症；骨髄線維症；皮膚の線維化：または強皮症もしくは全身性硬化症を含む上記の方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、線維性組織が肺、肝臓、心臓、膵臓、血管、大腸、小腸、腎臓、皮膚、間質、または瘢痕組織を含む上記の方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、組織内のコラーゲン含有量及び／またはコラーゲン沈着が、ＰＳＣ組成物の投与前の該組織内のコラーゲン含有量またはコラーゲン沈着と比較して減少している上記の方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、組織内の線維化スコアが、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内線維化スコアと比較して減少している上記の方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、上記の方法を提供し、線維化スコアは、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア及びＩｓｈａｋスコアからなる群より選択される。

別の実施形態では、本発明は、線維症の分子マーカーは、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内の該分子マーカーと比較して、組織内で減少しており、任意に、線維症の分子マーカーは、αｖ－インテグリン発現、活性型ＭＭＰ－２、ｐＡＫＴ／ＡＫＴ発現比、ｍｉＲ１９９発現、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、及び／または、任意に、抗線維化分子マーカーは、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内の該分子マーカーと比較して、組織内で増加しており、さらに、任意に、抗線維化分子マーカーは、カベオリン－１発現である上記の方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の組織または臓器の炎症を低減または予防する方法を提供し、方法は、上記の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む。

別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の組織または臓器の炎症を低減または予防する方法を提供し、方法は、上記の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含み、組織内の炎症の分子マーカーが、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内の該分子マーカーと比較して減少しており、任意に、炎症の分子マーカーは、ＴＮＦα発現、ＩＮＦγ発現、ＩＬ－１７発現、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。

別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の炎症の組織または臓器を低減または予防する方法を提供し、それを必要とする対象に上記の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物のいずれかを投与することを含み、組織内のＣＤ４５＋Ｔ細胞の浸潤は、ＰＳＣ組成物の投与前と比較して減少している。

別の実施形態では、本発明は、対象の免疫寛容を誘導する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、上記の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物のいずれかを投与することを含み、任意に、炎症誘発性成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の増殖が阻害され、寛容原性未熟ｍｏＤＣの増殖が誘導され、炎症誘発性ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（二重陽性）、及び／またはＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖が阻害され、及び／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋Ｔ細胞の増殖が阻害され、及び／または、任意に、単球集団における成熟マーカーＣＤ１ａ及びＣＤ８３の発現の減少が成熟ｍｏＤＣ増殖の阻害を示し、単球集団における未成熟マーカーＣＤ８５ｄ及びＣＤ１４の発現増加が未成熟ｍｏＤＣ増殖の増加を示す。

別の実施形態では、本発明は、対象が単一もしくは多臓器線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患する上記の方法のいずれかを提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象の単一もしくは多臓器線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法を提供し、それを必要とする対象に、上記の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物のいずれかを投与することを含む。

別の実施形態では、本発明は、ＰＳＣ組成物が絨毛膜絨毛由来間質細胞（ＣＶＣ）及び薬学的に許容される担体を含む上記の方法のいずれかを提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象が急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）もしくは敗血症に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある、上記の方法のいずれかを提供する。

別の実施形態では、本発明は、上記の方法のいずれかを提供し、対象が、急性または慢性のウイルス疾患または感染症、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、もしくはＥ型肝炎、またはコロナウイルス感染症、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ、に罹患しており、及び／あるいは、急性または慢性の細菌性疾患または感染症、例えば、インフルエンザまたは肺炎球菌感染症、任意に、対象を急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または敗血症または線維症を発症するリスクにさらすもの、に罹患している。

別の実施形態では、本発明は、対象が組織または臓器の炎症、例えば、心膜炎、に罹患している、上記の方法のいずれかを提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象が、ワクチン、任意に、ｍＲＮＡワクチンにより引き起こされる組織もしくは臓器の炎症に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある、上記の方法のいずれかを提供する。

Ａは、異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ｈｕＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞、ｈｕＰＳＣ：ヒト周産期間質細胞の誘発図を示す。Ｂは、周産期間質細胞のフローサイトメトリー特性を示すヒストグラムを示す。ＡＰＳＣ：羊膜周産期間質細胞、ＰＰＳＣ：胎盤固有間質細胞、ＷＰＳＣ：ホウォートンゼリー周産期間質細胞。Ｃは、組織培養された単離細胞を示す。スケールバー＝４００μｍ。

Ａは、４０日目のマウス試料由来のヒト特異的ＣＤ３＋細胞のフローサイトメトリーの結果を示す棒グラフである。Ｂは、実験条件毎の毎日の重量変化率（％）を示すグラフである。Ｃは、総体重の曲線下面積を示す棒グラフである。Ｄは、全体の平均身体変化率（％）を示す棒グラフである。ｎｓ＝Ｐ＞０．０５、＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．０１、＊＊＊＝Ｐ≦０．００１。ＰＢＭＣ及びシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、それぞれ陽性（ＧｖＨＤ）及び陰性（減弱ＧｖＨＤ）対照である。

Ａは、体重変化がベースライン（変化ゼロ）に戻るまでの時間を示すグラフである。Ｂは、ＧｖＨＤスコアのＡＵＣを示すグラフである。＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．０１、＊＊＊＝Ｐ≦０．００１。ＰＢＭＣ及びシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、それぞれ陽性（ＧｖＨＤ）及び陰性（減弱ＧｖＨＤ）対照である。

Ａは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ陰性対照）、胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、ホウォートン周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）に対するヒト特異的ｈＣＤ４５＋細胞について染色されたマウス肺組織の組織学的試料を示す。上段スケール＝１ｍｍ及び下段スケール＝２００μｍ。Ｂは、肺組織におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．００１。

Ａは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ陰性対照）、胎盤周産期間質細胞（ＰＰＳＣ）、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、ホウォートン周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）に対するヒト特異的ＣＤ４５＋細胞について染色されたマウス肝臓組織の組織学的試料を示す。上段スケール＝１ｍｍ及び下段スケール＝２００μｍ。Ｂは、肝臓組織におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．００１。

Ａは、マッソントリクロームで染色されたマウス肺組織の組織学的試料を示す。上段スケール＝１ｍｍ及び下段スケール＝２００μｍ。Ｂは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ陰性対照）、胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、ホウォートン周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）に対する線維化病理学的スコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ）を示すグラフである。Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５。

Ａは、マッソントリクロームで染色されたマウス肝臓組織の組織学的試料を示す。上段スケール＝１ｍｍ及び下段スケール＝２００μｍ。Ｂは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ陰性対照）、胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、ホウォートン周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）に対する線維化病理学的スコア（Ｉｓｈａｋ）を示すグラフである。Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．００１。

Ａは、重度の体重減少（＞３０％）のある動物を含む、研究期間中（５５日間）の生存率を示す曲線である。Ｂは、体重減少が１５％未満の動物を含む、研究期間中（５５日間）の生存率を示す曲線である。ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ陰性対照）、胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、ホウォートン周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）。Ｎ＝１０。＊Ｐ＜０．０５。

生理食塩水、同種異系脂肪（ＡＳＣ）、全臍帯、またはホウォートンゼリー（ＷＪ）由来の間葉系幹細胞を投与されたブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性肺損傷に罹患するマウスの生存率を示す曲線である。

Ａは、生理食塩水（対照）を投与され、マッソントリクロームで染色されたマウスの肺組織の組織片である。Ｂは、マッソントリクロームで染色されたＢＬＭ処置マウスの肺組織の組織片である。Ｃは、マッソントリクロームで染色されたＡＳＣを注入したマウスの肺組織の組織片である。Ｄは、マッソントリクロームで染色されたＣＳＣを注入したマウスの肺組織の組織片である。Ｅは、マッソントリクロームで染色されたＣＶＣを注入したマウスの肺組織の組織片である。Ｆは、マッソントリクロームで染色されたＷＪを注入したマウスの肺組織の組織片である。Ｇは、半定量的Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアで測定される、組織切片上の肺線維症の程度を示すグラフである。図１０Ｈは、ヒドロキシプロリンアッセイで測定される、肺コラーゲン含有量に対する気管内ＢＬＭ注入の効果を示すグラフである。データは、平均値±平均値の標準誤差としてグラフ化されている（生理食塩水 ｎ＝３、他の全て ｎ＝７～１１／群）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。

対象の肺組織内のリン酸化ＡＫＴ対ＡＫＴタンパク質発現の比（２１日目の死亡時にウェスタン分析で定量）を示す。データは、平均値±平均値の標準誤差としてグラフ化されている（ｎ＝４～９／群）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。 ＢＬＭまたはＢＬＭ＋ＡＳＣまたはＢＬＭ＋ＣＳＣ、ＢＬＭ＋ＣＶＣ、ＢＬＭ＋ＷＪ処置マウスの肺組織からのタンパク質抽出物に対して実施されたザイモグラフィーで評価された活性型ＭＭＰ－２を示す。データは、平均値±平均値の標準誤差としてグラフ化されている（ｎ＝５～７／群）^＊Ｐ＜０．０５。 ウェスタン分析で決定されたＣａｖ－１タンパク質発現を示す。データは、平均値±平均値の標準誤差としてグラフ化されている（ｎ＝３～５／群）。^＊Ｐ＜０．０５。

Ａは、絨毛間質細胞によるマーカーＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７３、ＣＤ２１０、ＣＤ１７８、ＣＤ１１９、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡＤＲ、及びＣＤ４５の発現を示す棒グラフである。Ｂは、ＣＤ１６３、ＣＤ１１ｂ、ＰａｎＣＫ、及びＰＤＬ１マーカーの発現を示す絨毛膜絨毛組織の組織切片を示す。

Ａは、絨毛間質細胞の存在下での成熟ｍｏＤＣ ＣＤ１ａ＋細胞の数の変化を示す棒グラフである。Ｂは、絨毛間質細胞の存在下での成熟ｍｏＤＣ ＣＤ８３＋細胞の数の変化を示す棒グラフである。Ｃは、絨毛間質細胞の存在下での未熟ｍｏＤＣ ＣＤ８５ｄ＋細胞の数の変化を示す棒グラフである。Ｄは、絨毛間質細胞の存在下での未熟ｍｏＤＣ ＣＤ１４＋細胞の数の変化を示す棒グラフである。

Ａは、ＰＢＭＣ及び絨毛間質細胞の共培養後のＣＤ４＋細胞数の変化を示す棒グラフである。Ｂは、ＰＢＭＣ及び絨毛間質細胞の共培養後のＣＤ２５＋細胞数の変化を示す棒グラフである。Ｃは、ＰＢＭＣ及び絨毛間質細胞の共培養後のＣＤ８＋細胞数の変化を示す棒グラフである。Ｄは、ＰＢＭＣ及び絨毛間質細胞の共培養後のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の数の変化を示す棒グラフである。Ｅは、ＰＢＭＣ及び絨毛間質細胞の共培養後のＣＤ３＋細胞数の変化を示す棒グラフである。

ＩＬ１０由来及び絨毛由来ｍｏＤＣ細胞と共培養したＴ細胞の増殖を示す棒グラフである。

Ａは、実験条件毎の毎日の重量変化パーセントを示すグラフである。Ｂは、ＧｖＨＤスコアのＡＵＣを示すグラフである。＊＝Ｐ≦０．０５。ＰＢＭＣ及びシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、それぞれ陽性（ＧｖＨＤ）及び陰性（減弱ＧｖＨＤ）対照である。

Ａは、マッソントリクロームで染色されたマウス肺組織の組織学的試料を示す。Ｂは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）及び絨毛間質細胞に関する線維化病理学的スコア（Ａｓｈｃｒｏｆｔ）を示すグラフである（＊Ｐ＜０．０５）。Ｃは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）及び絨毛間質細胞のヒト特異的ｈＣＤ４５＋細胞について染色されたマウス肺組織の組織学的試料を示す。Ｄは、肺組織のヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．００１。

Ａは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）及び絨毛間質細胞のヒト特異的ｈＣＤ４５＋細胞について染色されたマウス肝臓組織の組織学的試料を示す。Ｂは、肝臓組織のヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．００１。Ｃは、マッソントリクロームで染色されたマウス肝臓組織の組織学的試料を示す。Ｄは、ＧｖＨＤ（ＰＢＭＣ陽性対照）及び絨毛間質細胞に関する線維化病理学的スコア（Ｉｓｈａｋ）を示すグラフである（＊Ｐ＜０．０５）。

Ａは、マッソントリクロームで染色されたマウス心臓組織切片の組織学的試料を示す。Ｂは、疾患スコア（平均値±ＳＤ）＊、Ｐ値を示すグラフである。

Ａは、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の出現頻度を示す。Ｂは、ＩＬ－１７産生Ｔ細胞の出現頻度を示す。（平均値±ＳＤ）＊、Ｐ値。

マッソントリクロームで染色されたマウス肺組織の組織学的試料を示す。

Ａは、処置後のマウスで測定された線維症スコアを示す。Ｂは、線維症指数を決定するために使用されたコラーゲンの量を示す。Ｃは、処置後のインテグリンの発現のｍＲＮＡレベルを示す。ブレオマイシン（ＢＬＭ）、絨毛膜間質細胞（絨毛膜）、絨毛間質細胞（絨毛）、及びヒト脂肪間質細胞（ｈＡＳＣ）。各点は、個々のマウスを表す。＊ｐ、＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１（ＢＬＭ処置マウスと比較）。

本発明は、羊膜、胎盤、ホウォートンゼリー、絨毛膜、絨毛膜絨毛、及び臍帯組織から単離された周産期間質組織細胞が、移植片対宿主病の処置及び／または予防用に、特に、組織線維症、例えば、特発性肺線維症及び多臓器線維症の処置及び／または予防、に有用であるという独創的な発見に基づいている。

本発明の組成物及び方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、及び実験条件に限定されず、そのような組成物、方法、及び条件は変動し得ることが理解される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図されないことも理解される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「方法」への言及には、本開示などを読めば、当業者らには明らかとなる本明細書に記載される種類の１つ以上の方法及び／またはステップが含まれる。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されるのと同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、修正及び変更は、本開示の精神及び範囲内に含まれることが理解されるであろう。ここで、好ましい方法及び材料を記載する。

一実施形態では、本発明は、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、ホウォートンゼリー周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）、全絨毛膜由来間質細胞（ＣＳＣ）、または絨毛膜絨毛由来間質細胞（ＣＶＣ）、及び薬学的に許容される担体を含む周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「周産期間質細胞」または「ＰＳＣ」は、胎盤、好ましくは、ヒト胎盤、から単離された細胞を指す。ヒトの胎盤には、絨毛、羊膜、及び「胎盤本体」が含まれ、これには、絨毛膜または絨毛膜板、絨毛、絨毛間腔、基底板、及び子葉が含まれる。胎盤の各部分は、単離することができ、周産期間質細胞の部分集団を得るために使用することができる。

羊膜は、絨毛膜から機械的に分離することができ、これにより、羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）の誘導体がもたらされる。臍帯を縦方向に切断すると、臍動脈及び静脈を含有するホウォートンゼリーが露出する。血管を除去した後、ホウォートンゼリー周産期間質細胞（ＷＰＳＣ、ＷＪＰＳＣ、またはＭＪ－ＭＳＣ）は臍帯に由来し得る。羊膜及び臍帯が除去される時、胎盤の残部（胎盤本体と呼ぶことができる）は、胎盤本体間質細胞（ＰＰＳＣ）を調製するために直接使用することができるか、または、分離することもできる。例えば、絨毛膜は、絨毛膜由来間質細胞（ＣＳＣ）全体を単離するために分離することができ、中間及び終末絨毛は、絨毛膜絨毛間質細胞（ＣＶＣ）を単離するために露出させることができる。

ホウォートンゼリー（ＷＪ）は、これらのＰＳＣが脂肪組織などの他の供給源からのＳＣよりも幹様特性を維持しているので、臨床用途で使用されるＰＳＣを取得するための理想的なリザーバーである。これらの非胚性ＭＳＣの使用には倫理的な問題は生じない。加齢に伴う肺修復機序の悪化がＩＰＦの発症機序の根拠である可能性が高いので、この若いＭＳＣ源は、高齢マウスのＢＬＭ誘発性ＩＰＦの処置においてＡＳＣよりも特定の利点をもたらし得る。さらに、供給源が容易に入手でき、通常は廃棄物として生成されるので、臍帯由来細胞は採取が容易である。

実験モデルでは、ＷＪ由来ＭＳＣは、抗線維化効果を示す。腎線維症の片側虚血再灌流損傷ラットモデルでは、主張される機序は、上皮から間葉への移行及び腎線維症の救済の遅延を含む。ＷＪ－ＭＳＣは、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ誘発性肝線維症の処置としても研究されている。ＷＪ－ＭＳＣを移植すると、ＷＪ－ＭＳＣは、ヒト肝細胞に特異的なマーカーを発現する肝細胞様細胞に分化したことを報告した。さらに、肝線維症は、肝線維症に関連するマーカーであるコラーゲンＩ、α平滑筋アクチン、及びＩＬ－１３の下方制御と同時に退行した。ヒトケロイド線維芽細胞の線維化促進プロファイルは、ＷＪ－ＭＳＣ馴化培地との共培養により増強された。対照的に、ＷＪ－ＭＳＣ馴化培地は、正常な皮膚線維芽細胞の遊走及び創傷閉鎖を促進した。

「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、または賦形剤が製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））は、当該技術分野で周知である。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度ではレシピエントに対して無毒であり、これには、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及びメチオニンを含む）；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール）；アルキルパラベン（例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量の（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、システイン、またはリジン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））；パルミチン酸レチニル、セレン、メチオニン、クエン酸、硫酸ナトリウム、及びパラベンが含まれ得る。希釈剤の例としては、水、アルコール、食塩水、グリコール、鉱油、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。

医薬組成物は、他の治療薬も含有してもよく、医薬製剤の分野で既知の手法に従い、例えば、従来のビヒクルまたは希釈剤、及び所望の投与様式に適切なタイプの医薬添加剤（例えば、賦形剤、保存剤など）を用いることにより製剤化され得る。

医薬組成物は、さらに、該医薬組成物を投与する内科医により有益であると評価される追加の医薬または治療薬を含んでもよい。

一態様では、ＡＰＳＣ、ＰＰＳＣ、ＷＰＳＣ、またはＣＶＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７３、ＣＤ２１０、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される分子マーカーを発現する。別の態様では、ＡＰＳＣ、ＰＰＳＣ、ＷＰＳＣ、またはＣＶＣは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ１１９、ＣＤ８５ｂ、ＣＤ１７８、ＣＤ４０、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される分子マーカーを発現しない。

本明細書で使用される場合、「分子マーカー」は、評価することができ、組織または細胞に関する有用な情報を提供する、組織または細胞の特徴を指す。分子マーカーの非限定例としては、遺伝子、タンパク質、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、酵素などの発現または活性が挙げられるが、これらに限定されない。膜関連タンパク質の発現は、分子マーカーであり得；タンパク質の発現または欠如は、細胞型の同定に有用であり得る。酵素の活性は、分子マーカーであり得；酵素の活性またはその欠如は、細胞内の経路の活性化または抑制を同定するのに有用であり得る。遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの発現は、分子マーカーであり得；遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡの発現または欠如は、細胞内の経路の活性化または抑制を同定するのに有用であり得る。

別の実施形態では、本発明は、本発明の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の慢性炎症及びそれに伴う組織線維症を低減する方法を提供する。

線維症は、修復または反応プロセスにおける臓器または組織への過剰な線維性結合組織の形成である。生理学的には、線維症は、結合組織を堆積させるように作用し、これは、その下にある臓器または組織の正常な構造及び機能を妨げるか、または完全に阻害し得る。線維症は、線維組織の過剰な沈着の病理学的状態、及び治癒における結合組織の沈着のプロセスについて記載するために使用することができる。線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の病理学的蓄積で定義することができ、正常な臓器機能を妨げる罹患組織の瘢痕化及び肥厚が生じる。線維症は、実質的に体内のあらゆる組織で、炎症または組織への損傷の結果として生じ得る。線維症に罹患し得る組織の非限定例としては、肺、肝臓、脳、腎臓、動脈、腸、関節（膝、肩）、皮膚、手、指、軟部組織、陰茎、及び心臓が挙げられる。

一態様では、組織は、肺、肝臓、心臓、膵臓、血管、大腸、小腸、腎臓、皮膚、間質、または瘢痕組織である。

本明細書で使用される場合、「対象における組織線維症を軽減すること」は、組織内で発生する線維化プロセスを治癒し、減速させ、その症状を軽減し、及び／またはその進行を停止する任意の介入を指し得る。

本明細書で使用される「対象」という用語は、本方法が実施される任意の個体または患者を指す。一般に、対象は、ヒトであるが、当業者らには理解されるように、対象は、動物であってもよい。従って、脊椎動物、例えば、齧歯動物（マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリなどを含む）、ならびに霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、及びゴリラを含む）を含む他の動物が対象の定義に含まれる。

「の投与」及び／または「投与すること」という用語は、処置を必要とする対象に治療有効量の医薬組成物を提供することを意味すると理解されるべきである。投与経路は、経腸、局所、または非経口であり得る。そのため、投与経路には、皮内、皮下、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経皮、経気管、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内、経口、舌下、口内、経直腸、膣内、経鼻、眼内投与、さらに、注入、吸入、及び噴霧が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味する。

「治療的有効量」、「有効用量」、「治療有効用量」、「有効量」などの用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が調査する組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する主題の化合物の量を指す。一般に、応答は、患者の症状の改善、または所望の生物学的結果（例えば、組織線維症の低減、組織炎症の低減、免疫調節の増加）のいずれかである。

いくつかの態様では、組織内のコラーゲン含有量及び／またはコラーゲン沈着は、ＰＳＣ組成物の投与前の該組織内のコラーゲン含有量またはコラーゲン沈着と比較して減少している。

線維症は、様々な組織の過剰成長、硬化、及び／または瘢痕化で定義され、コラーゲンを含む細胞外マトリックス成分の過剰な沈着に起因する。それ故、組織のコラーゲン含有量及び／または組織内のコラーゲンの沈着の任意の変化を評価することは、線維症を評価及び監視するのに有用な手法である。組織学で使用される３色染色プロトコールであるマッソントリクローム染色は、ケラチン及び筋線維を赤で、コラーゲン及び骨を青または緑で、細胞質を淡い赤またはピンクで、細胞核を暗褐色～黒で染色することにより、細胞を周囲の結合組織から区別することを可能にする。組織内のコラーゲンの検出及び定量化を可能にする他の方法が当該技術分野に存在しており、その趣旨で、任意の好適な方法を使用することができる。

他の態様では、組織内の線維化スコアは、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内の該線維化スコアと比較して減少している。

本明細書で使用される場合、「線維化スコア」は、組織内の線維症の量を容易且つ再現的に評価するために使用することができる検証された任意のスコアリング法を指す。組織及び／または組織に罹患する疾患に応じて、異なるスコアリング法を適用することができる。

多くの態様では、線維化スコアは、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア及びＩｓｈａｋスコアからなる群より選択される。

Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアは、肺標本における線維症の程度と、他の肺変数、例えば、肺機能検査またはミネラル負荷、との相関関係のために作成された連続的な数値スケールである。グレードは、顕微鏡視野スコアの平均を使用して、０～８のスケールでスコア化される。この系は、線維症が小さな組織試料（１ｃｍ）で測定可能にし、これは、肺の変化の詳細な説明を提供し得、現在では、ほとんどの既存の方法では不可能である。

肝線維症の評価のための、いくつかのスコアリングシステム（ＩＡＳＬ、Ｂａｔｔｓ－Ｌｕｄｗｉｇ、Ｍｅｔａｖｉｒ、及びＩｓｈａｋスコアを含む）が存在する。Ｉｓｈａｋは、慢性Ｃ型肝炎の処置における線維症及び壊死性炎症の評価に最も広く受け入れられているスコアリングシステムの１つである。

一態様では、線維症の分子マーカーは、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内の該分子マーカーと比較して、組織内で減少している。

スコアリングシステムは、通常は、組織学的組織試料を研究することにより、組織の全体的な評価が可能になる。線維症の分子マーカーは、線維症を制御可能な分子経路に関与するタンパク質、酵素、またはｍｉＲＮＡの発現レベルを評価するために使用することもできる。分子マーカーは、線維化を進行させ得、それにより、その発現／活性の増加は、線維症の増加を示し得るか、または、分子マーカーは、抗線維性である得、それにより、その発現／活性の増加は、線維症の減少を示し得る。例えば、α_ｖ－インテグリン発現、活性型ＭＭＰ－２、ｐＡＫＴ／ＡＫＴ比、及びｍｉＲ１９９発現は、線維症のマーカーであることが当該技術分野で既知である。カベオリン－１は、抗線維化マーカーであることが当該技術分野で既知である。

様々な態様では、線維症の分子マーカーは、α_ｖ－インテグリン発現、活性型ＭＭＰ－２、ｐＡＫＴ／ＡＫＴ発現比、ｍｉＲ１９９発現、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の態様では、抗線維化分子マーカーは、ＰＳＣ組成物の投与前の該組織内の該分子マーカーと比較して組織内で増加している。様々な態様では、抗線維化分子マーカーは、カベオリン－１発現である。

さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、本発明の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む、対象の組織炎症を低減する方法を提供する。

「炎症反応」または「炎症」は、組織が損傷された時に、細菌、外傷、毒素、熱、または他の任意の原因を生じる。損傷した細胞は、ヒスタミン、ブラジキニン、及びプロスタグランジンを含む化学物質を放出し、腫脹を引き起こす。化学物質は、食細胞などの白血球も引き付けて、細菌及び死んだ細胞または損傷した細胞を除去する。組織の損傷及び炎症は、自然免疫系及び適応免疫系の様々な異なる細胞型の動員及び活性化を誘導することにより、再生及び線維症の重要な引き金である。

一態様では、組織内の炎症の分子マーカーは、ＰＳＣ組成物の投与前の組織内の該分子マーカーと比較して減少している。

いくつかの態様では、炎症の分子マーカーは、ＴＮＦα発現、ＩＮＦγ発現、ＩＬ－１７発現、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、細胞死を引き起こし得るサイトカインのスーパーファミリーを指す。全てのＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、特定の受容体に認識されるホモ三量体（またはＬＴ－アルファ／ベータの場合のヘテロ三量体）複合体を形成する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの例としては、ＴＮＦα、ＴＮＦ－β、リンホトキシンアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、及びＴＲＡＩＬが挙げられる。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、いくつかの病原体、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、及びさらには腫瘍細胞、の存在に応答して宿主細胞により生成及び放出されるシグナル伝達タンパク質の群である。典型的なシナリオでは、ウイルスに感染した細胞が、インターフェロンを放出し、これにより、近くの細胞に抗ウイルス防御を増強させる。ＩＦＮは、病原体の根絶を助ける免疫系の防御防衛を引き起こすために細胞間の情報伝達に使用される分子であるサイトカインとして既知のタンパク質の大きなクラスに属する。ＩＦＮの例としては、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、及びＩＦＮ－γが挙げられる。

インターロイキン１７Ａ（ＩＬ－１７またはＩＬ－１７Ａ）は、ＩＬ－２３による刺激に応答して、Ｔヘルパー１７細胞として既知のヘルパーＴ細胞の群により産生される炎症誘発性サイトカインである。

組織へのＴリンパ球の浸潤は、線維症患者及び線維症の動物モデルで一般的である。細胞は、細胞外マトリックス、特に、コラーゲンの蓄積を調節する役割を果たしていると考えられている。線維化促進性Ｔリンパ球及び抗線維化性Ｔリンパ球の両方は、線維化に関与することが確認され得る。線維化促進性浸潤性Ｔリンパ球の除去は、線維症患者の転帰を改善するためにアプローチすることができる。

他の態様では、組織内のＣＤ４５＋Ｔ細胞浸潤は、ＰＳＣ組成物の投与前と比較して減少している。

さらなる実施形態では、本発明は、対象の免疫寛容を誘導する方法を提供し、方法は、本発明の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。

「免疫応答」は、抗原に対する統合された身体応答を指し、好ましくは、細胞性免疫応答または細胞性及び体液性免疫応答、を指す。免疫応答は、防御的／予防的／防止的及び／または治療的または病理学的であり得る。免疫系は、疾患を防ぐ生体内の生物学的構造及びプロセスの系である。この系は、相互作用する細胞、細胞産物、及び細胞形成組織の拡散した複雑なネットワークであり、これは、病原体及び他の外来物質から身体を保護し、感染細胞及び悪性細胞を破壊し、細胞残骸を除去する。この系には、胸腺、脾臓、リンパ節及びリンパ組織、幹細胞、白血球、抗体、ならびにリンホカインが含まれる。Ｂ細胞またはＢリンパ球は、獲得免疫系の体液性免疫におけるリンパ球の一種であり、免疫監視にとって重要である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。Ｔ細胞には、キラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞という２つの主要なサブタイプがある。さらに、免疫応答を調節する役割を有するサプレッサーＴ細胞がある。キラーＴ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原のみを認識するが、ヘルパーＴ細胞は、クラスＩ ＩＭＨＣ分子に結合した抗原のみを認識する。これら２つの抗原提示の機序は、２種類のＴ細胞の異なる役割を反映する。３番目のマイナーのサブタイプは、ＭＨＣ受容体に結合していないインタクト抗原を認識するγδＴ細胞である。対照的に、Ｂ細胞抗原特異的受容体は、Ｂ細胞表面の抗体分子であり、いかなる抗原プロセシングも必要とせずに病原体全体を認識する。Ｂ細胞の各系統は、異なる抗体を発現するので、Ｂ細胞抗原受容体の完全なセットは、身体が製造することができる全ての抗体を表す。

「細胞性免疫応答」、「細胞性応答」、「抗原に対する細胞性応答」、または同様の用語は、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣを有する抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞性応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして機能するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関連する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は、免疫応答を調節することにより中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも呼ばれる）は、がん細胞などの罹患細胞を殺傷し、これにより、より多くの罹患細胞の生成が予防される。好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上の腫瘍発現抗原を発現し、好ましくは、そのような腫瘍発現抗原をクラスＩ ＭＨＣで提示する腫瘍細胞、に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を含む。

本発明の文脈における「免疫反応性細胞」「免疫細胞」、または「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原、または、抗原もしくは抗原由来の抗原ペプチドの提示を特徴とする細胞に結合し、及び免疫応答を媒介することが可能である。例えば、そのような細胞は、サイトカイン及び／またはケモカインを分泌し、抗体を分泌し、がん性細胞を認識し、任意に、そのような細胞を除去する。例えば、免疫反応性細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。

「免疫調節」または「免疫寛容」は、免疫応答が適切であることを保証するための基本である。本明細書で使用される場合、「免疫寛容の誘導」は、バランスの取れた好適な免疫応答の維持に関与している調節細胞の誘導を指す。免疫制御細胞には、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ、ならびに骨髄由来サプレッサー細胞、樹状細胞、及び間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を含む。これらの細胞は、エフェクター細胞を阻害し、他の調節細胞を誘導することにより免疫応答を調節し得る。

一態様では、炎症誘発性成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の増殖が阻害され、寛容原性未熟ｍｏＤＣの増殖が誘導され、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（二重陽性）、及び／またはＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖が阻害され、及び／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋Ｔ細胞の増殖が阻害される。

単球は、マクロファージ前駆体として機能し、樹状細胞（ＤＣ）に分化する能力を有し、それ故、自然免疫及び適応免疫の両方で重要な役割を果たす。成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）は、成熟マーカー、例えば、ＣＤ１ａ及びＣＤ８３を発現し、炎症誘発能を有する。未成熟ｍｏＤＣ、または寛容原性ＤＣは、未成熟マーカー、例えば、ＣＤ８５ｄ及びＣＤ１４を発現し、免疫抑制特性を有している。

いくつかの態様では、単球集団における成熟マーカーＣＤ１ａ及びＣＤ８３の発現の減少は、成熟ｍｏＤＣ増殖の阻害を示し；他の態様では、単球集団における未成熟マーカーＣＤ８５ｄ及びＣＤ１４の発現増加は、未成熟ｍｏＤＣ増殖の増加を示す。

多くの態様では、対象は、単一もしくは多臓器線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患している。

いくつかの態様では、対象は、強皮症に罹患している。本明細書で使用される場合、「強皮症」は、皮膚、血管、筋肉、及び内臓に変化をもたらし得る一群の自己免疫疾患を指す。特に、コラーゲンの合成の増加（硬化症を引き起こす）、小血管の損傷、Ｔリンパ球の活性化、及び結合組織の変化の発生により、強皮症は、皮膚、血管、筋肉、及び内臓の肥厚、硬直、及び線維化を引き起こす。

本明細書で使用される場合、「単一臓器線維症」という用語は、線維症（すなわち、肺線維症、肝臓線維症、心臓線維症、腎臓線維症など）（本明細書に記載の組成物を使用して、それぞれ個別に処置することができる）により別々に影響を受ける個々の臓器の処置を指すことを意味するが、「多臓器線維症」という用語は、同時に同じ対象において線維症の影響を受けた複数の臓器を処置することを指す。実に、いくつかの場合では、線維症は、複数の臓器（１つの臓器に限定されない）に広がり得る。

特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、進行性肺瘢痕化及び通常の間質性肺炎の組織像を特徴とする原因不明の慢性進行性線維化性間質性肺疾患（ＩＬＤ）である。ＩＬＤカテゴリーに属する障害は、炎症、浮腫、及び／または線維症を含む様々な機序を通じて肺間質に損傷を引き起こす。最新の推計によると、肺線維症に罹患するアメリカ人は２０万人を超えている。ＩＰＦは、主に、６０歳以上の男性に現れる。予測不可能で過酷な臨床経過に直面すると、患者に、有効性が限られ、重大な罹患率を伴う非標的療法の使用を含む管理が提供される。歴史的に、ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性肺線維症の動物モデルの特徴は、線維性肺疾患の研究に使用されており、これにより、結果をヒトＩＰＦ（ＩＰＦ患者に対する第Ｉ相安全性試験を含む）に直接変換している（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ０２０１３７００）。不可逆的で機能障害性の線維性肺疾患の臨床的負担を認識することにより、より効果的な治療法の開発が推進される。

拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、若年成人における心不全（ＨＦ）及び心臓移植の主な原因であるが；この疾患が、出現頻度の高い、且つ壊滅的なものであるにもかかわらず、この状態を予防または回復する効果的な処置はまだない。ＤＣＭは、重大な健康管理の懸念材料であり、米国で５８０万の症例の心不全（ＨＦ）及び全世界で２，３００万を超える症例の心不全の約１０％を占める。ＤＣＭの病因は、不均一であり、これには、遺伝的原因、非遺伝的原因、及び炎症性原因を含む。ＤＣＭ症例（ＤＣＭｉ）の少なくとも３０～４０％で炎症が観察され、従って、心筋炎が、その病因の重要な原因であると考えられている。心筋炎は、男性に多く見られ、最大２０％の若者の突然死の重要な原因である。それは、潜行性の発症のため、広く診断されていない。心筋炎処置試験は、症状のある患者の１年死亡率が２０％、４年死亡率が５０％を超えることを示した。巨細胞性心筋炎の生存期間中央値は、疾患発症から約５ヶ月である。心筋炎及びＤＣＭｉの現在の処置は、主に、対症療法であり、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、ニトログリセリン、利尿薬、及び重度の心不全の場合の強心薬による心不全の臨床症状の処置を目的としていた。免疫抑制療法は、根底にある病因が炎症性及び自己免疫性である場合であっても、ＤＣＭｉの予防または逆転には効果がない。根本的な理由は、ほとんど理解されていない。慢性心筋炎及びＤＣＭｉへの進行の自己免疫機序は、心筋炎患者の心臓組織に対する自己抗体及び動物モデルでの心臓自己抗原を使用した実験的自己免疫性心筋炎（ＥＡＭ）の誘発でサポートされる。心筋炎からＤＣＭｉへの進行は、この疾患の壊滅的な合併症であり、多くの場合、致命的な結果をもたらす。炎症は、心筋炎からＤＣＭｉへの進行に重要な役割を果たしていると考えられている。未知の原因で、免疫抑制性グルココルチコイド（ＧＣ）薬を使用する処置は、効果がなく、ＤＣＭｉの進行が阻止される。従って、ＤＣＭｉを予防または回復するための新規の処置が緊急に必要とされている。

移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、骨髄移植で生じるような幹細胞移植と一般に関連するが、固形臓器移植などの他の形態の移植組織にも当てはまる。提供された組織（移植片）内に残るドナーの免疫系の白血球は、レシピエント（宿主）を異物（非自己）として認識する。次に、移植された組織内に存在する白血球は、レシピエントの身体の細胞に対して反応し、これは、ＧｖＨＤを引き起こす。これは、移植レシピエントの免疫系が移植組織を拒絶する時に生じる移植拒絶反応と混同すべきではなく、ＧｖＨＤは、ドナーの免疫系の白血球がレシピエントを拒絶する時に生じる。

さらに別の実施形態では、本発明は、対象の単一もしくは多臓器線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法を提供し、方法は、本発明の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。

「処置すること」という用語は、「処置」または「処置方法」を指すために使用され、１）診断された病的状態または障害を治癒し、減速させ、その症状を軽減し、及び／またはその進行を停止させる治療的処置または手段と、２）防止／予防手段の両方を指す。処置が必要な者らには、既に特定の内科的疾患に罹患している個体、ならびに、最終的に疾患を患う可能性のある個体（すなわち、予防手段が必要な個体）も含まれ得る。

多くの態様では、ＰＳＣ組成物には、絨毛膜絨毛由来間質細胞（ＣＶＣ）及び薬学的に許容される担体を含む。

議論された用途のために企図される周産期間質細胞組成物を議論する例が、以下に提示される。本発明の実施形態をさらに説明するために、以下の実施例は、提供されるが、本発明の範囲を限定することが意図されるものではない。これらは、使用され得るものに特有であるが、当業者らに既知の他の手順、方法論、または手法が代わりに使用され得る。

実施例１
周産期間質細胞の単離及び特性評価
周産期間質細胞（ＰＳＣ）を、ヒト胎盤から単離し、そこから、羊膜由来細胞、臍帯由来細胞、及び絨毛膜由来細胞を、母親の同意後に、アラバマ大学の協力的ヒト組織ネットワークの倫理委員会のガイドラインに従って、選択的帝王切開により収集された健常な妊娠末期胎盤から単離した。ヒト胎盤組織は、次の通り、滅菌層流フード内で収集後２４時間以内に処理された。

羊膜を絨毛膜から機械的に分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄した。次に、それを小片に切り刻み、シェーカーインキュベーター（Ｉ２４ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｈａｋｅｒシリーズ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニュージャージー州エジソン）内で５ｍＬ／ｇ組織のＴｒｙｐｌｅ（Ｇｉｂｃｏ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で３０分間消化し、３７℃、１５０ｒｐｍで羊膜上皮細胞を除去した。次に、未消化の羊膜を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、さらに、１２５Ｕ／ｍｇのコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、米国ニュージャージー州レイクウッド）を用いて、３７℃、１５０ｒｐｍで１．５時間消化して、羊膜間葉細胞（ＡＰＳＣ）を単離した。消化物中で移動した細胞を、１００μｍのセルストレーナー（ＶＷＲ、米国ペンシルベニア州ラドノール）に通し、５００ｘｇで８分間遠心分離することにより収集した。

ホウォートンゼリー（ＷＰＳＣ）を、以下のように臍帯から抽出し：臍帯を長さ約１．５ｃｍの小片に切断し、次に、縦方向に切開してホウォートンゼリーを露出させた。動脈及び静脈を除去し、残りの組織を小片に切り刻み、１２５Ｕ／ｍｇのコラゲナーゼＩを用いて、３７℃、１５０ｒｐｍで２．５時間または全ての組織が消化されるまで消化した。消化物を１００μｍのセルストレーナーに通し、５００ｘｇで８分間遠心分離した。

胎盤本体を、ＰＢＳで十分に洗浄し、小片に切り刻み、１２５Ｕ／ｍｇのコラゲナーゼＩを用いて、３７℃、１５０ｒｐｍで１．５時間消化して、胎盤本体間質細胞（ＰＰＳＣ）を単離した。消化物を１００μｍのセルストレーナーに通し、５００ｘｇで１０分間遠心分離して、ＰＰＳＣを収集した。

新たに単離された周産期間質細胞（ＰＳＣ）を、１％のＡｎｔｉ－Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ）及び５％の熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＭＥＭ－アルファ（Ｇｉｂｃｏ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）中、標準的な組織培養条件（加湿、３７℃、及び５％のＣＯ_２）で培養した。細胞培地を、１日おきに交換し、細胞が７０～８０％のコンフルエンシーに達した時に、それを継代培養した。図１Ｃに示されるように、全ての周産期間質細胞由来の単離細胞は、培養された時に、スピンドル様モルホロジーを呈した。

ＰＳＣを、フローサイトメトリーで特性評価して、間葉系間質細胞関連マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡＤＲ、及びＣＤ４５）ならびに他の免疫関連マーカー（ＣＤ２７３、ＣＤ２１０、ＣＤ１７８、ＣＤ１１９、ＣＤ８５ｄ、及びＣＤ４０）の発現を評価した。

ＰＳＣをランニング緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ ＢｉｏｔｅｃＩｎｃ．、米国カリフォルニア州オーバーン）で洗浄し、３５０ｘｇで５分間遠心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、米国ニューヨーク州ウェストベリー）。細胞を、ブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋａｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ、米国テキサス州オースティン）中、４℃で１５分間インキュベートした。ＰＳＣ試料（１×１０^５細胞／１００μｌ）を、以下の抗体と共にインキュベートした：ＣＤ８５ｄ－ＩＬＴ４－ＰＥ、ＨＬＡ－ＤＲ－ＴＵ３６－ＰＥ、ＣＤ４５－ＨＩ３０－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＤ７３－ＡＤ２－ＰＥ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ・ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）、ＣＤ９０－５Ｅ１０－ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）、ＣＤ１０５－４３Ａ３－ＰＥ、ＣＤ２７３－Ｂ７ＤＣ－ＰＥ、ＣＤ１１９－ＩＦＮｇＲａ－ＰＥ、ＣＤ４０－５Ｃ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ１１ｂ－Ｍ１／７０－ＦＩＴＣ、及びＣＤ１７８－ＮＯＫ－１－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、ＨＬＡＧ９－ＭＥＭ－Ｇ／１１－ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国テキサス州オースティン）。インキュベーションの完了時、細胞をランニング緩衝液で２回洗浄し、３５０×ｇで遠心分離し、次に、３００μＭのＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有するランニング緩衝液１００μｌに再懸濁させ、暗所、４℃で、１５分間インキュベートした。製造者の使用説明書に従い、全血試料を遠心分離で処理し、赤血球（ＲＢＣ）をＡＣＫ緩衝液で溶解した。製造者の使用説明書に従って、最終的な単一細胞懸濁液を、染色緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、２．５％のＦＢＳ、０．０９％のＮａＮ３）中、２ｘ１０^７細胞／ｍＬで調製し、９６ウェルプレートに添加し、１００μＬの再構成Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、４℃で３０分間染色した。１５０μＬの染色緩衝液で２回洗浄した後、免疫染色の前に、容量１００μＬのＴｒｕＳｔａｉｎ Ｆｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、Ｆｃ受容体を氷上で５～１０分間ブロックした。抗体を用いる、細胞を４℃で３０分間染色し、次に、１５０μＬの染色緩衝液で２回洗浄し、分析のために１００μＬの染色緩衝液に再懸濁した。必要と思われる場合に、アイソタイプ対照抗体を、陰性染色対照として使用した。全てのデータを、ＦｏｒｔｅｓｓａＬＳＲ（ＢＤ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で分析した。細胞集団を、プロトコールに従って定義し、ゲーティング方策を、シングレットでの最初のゲーティング（ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣＡ）により決定し、次に、生細胞を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ生存率染色に基づいて決定した。ヒトＣＤ３＋（ＣＤ３ ＰＥ ＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）細胞の割合を、親細胞ゲーティングに従って決定した。Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国テキサス州アービング）を使用して、分析を実施した。図１Ｂに示されるように、ＰＳＣは、そのような細胞を同定するために使用される他の示唆された免疫関連マーカーに加えて、通常、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）で見出される表面マーカーを有する。

本明細書で単離された周産期間質細胞（ＰＳＣ）は、ＩＳＣＴ基準に基づく間葉系間質細胞（ＭＳＣ）と同様の特徴を有しており、これは、標準的な培養条件下で可塑性接着性、ＣＤ１０５＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１１ｂ－、及びＣＤ４５－ＨＬＡＤＲの発現である。しかし、ＰＳＣの効果がそれらの分化能力（幹細胞性）に基づいていることが推測されないので、ＰＳＣが三系統（軟骨細胞、骨細胞、及び脂肪細胞）に分化する能力を評価しなかった。従って、ＰＳＣは、ＭＳＣとは呼ばれなかった。さらに、そのような細胞をさらに同定するために、他のいくつかの免疫関連マーカーを試験した。全てのＰＳＣは、ＣＤ２７３＋（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２１０＋（ＩＬ－１０受容体）については陽性（＞７０％）であり、ＣＤ１７８－（ＦａｓＬ）、ＣＤ１１９－（ＩＦＮｇ受容体）、ＣＤ８５ｄ－（ＩＬＴ４）、及びＣＤ４０については陰性（＜５％）であった。これらの追加の免疫調節マーカーは、そのような細胞を同定する特性評価パネルを拡張するために使用することができる。

実施例２
移植片対宿主病に対する周産期間質細胞注入の効果の評価
移植片対宿主病に対する周産期間質細胞注入の効果を、ＧＶＨＤの異種マウスモデルで評価した。

非肥満糖尿病／重度複合免疫不全ＩＬ－２受容体ガンマヌル（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＮＳＧ（登録商標））マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メイン州バーハーバー）から購入した。マウスを、チャールズリバー動物管理施設に収容し、病原体が存在しない条件下で餌及び水が利用できるようにした。マウスを、制御された室温及び湿度で、１２：１２時間の明暗サイクルにさらした。チャールズリバー施設内動物管理使用委員会の承認を得て、全ての動物実験を実施した。

異種ＧＶＨＤ ＮＳＧを雌ＮＳＧマウスで作製し、尾静脈注射により３×１０^７個のヒトＰＢＭＣを静脈内（ＩＶ）移植し、それぞれ、１０匹ずつの５群に分けた。陽性対照（ＰＢＭＣ）群は、ＧｖＨＤの発症を可能にする処置は受けなかった。陰性対照（ＣｓＡ）群を、ＧｖＨＤの症状を抑制するために、１日目から研究終了まで（ｑｄから終了まで）シクロスポリンＡを１５ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内（ＩＰ）投与した。５日目に、３つの処置マウス群に、尾静脈内注射で送達される３５０，０００個の細胞の単回用量としてＰＳＣ注入を行った（図１Ａ）。細胞を凍結保存から回収し、注射前に４８時間インキュベーター（加湿、３７℃及び５％のＣＯ２）内で回復させた。使用された全ての細胞は、Ｐ２及びＰ３間にあった。処置群を、以下のように指定した：羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、ホウォートンゼリー周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）、及び胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）。

動物の生存を毎日監視し、体重及びＧｖＨＤスコアリングを週に３回評価した。臨床ＧＶＨＤ指数を、５つのパラメーター：体重減少、活動性、姿勢、毛皮の質感、及び皮膚の完全性に基づいてスコア化した（の０～２のスケールで、２が最も重篤である）（表１）。動物を安楽死させ、次に、体重が３０％を超える体重減少、または２５％を超える２回連続した体重減少に達した。各群の５匹の動物を４０日目に全血中のヒトＣＤ３＋の発現について分析した（下顎血から０．１ｍＬを収集した）。実験を５５日目まで実施した。

図２Ａに示されるように、ヒトＰＢＭＣを、ＮＳＧマウスにうまく移植し、これを、４０日目のマウス血液試料由来のヒト特異的ＣＤ３＋細胞のフローサイトメトリーによる検出で確認した。陰性対照（シクロスポリンＡ）条件は、陽性対照（ＰＢＭＣ）及び実験条件と比較して、ｈＣＤ３＋が有意に減少した唯一の試料であり；ＰＢＭＣ及び実験条件間に差異は観察されなかった。図２Ｂに示されるように、ＧｖＨＤは、移植マウスで発生し、これを、疾患の進行に特徴的な体重減少で検出した。ＰＢＭＣと比較して、陰性対照及びＰＰＳＣのみが、体重変化率（％）及び総体重の曲線下面積（ＡＵＣ）の両方において有意差を示した（図２Ｃ～Ｄ）。

ベースラインへの戻り（日数）は、ＧｖＨＤの進行速度を計算するために、体重が変化率０（％）（０日目の体重）に戻った日として、群毎の個々の動物に注釈を付け、グラフ化した。このベースライン数値への戻り（図３Ａ）に加えて、表１に記載のスコアリングシステムを使用して、ＧｖＨＤの進行を記録し、動物毎のＡＵＣをグラフ化した（図３Ｂ）。ＧｖＨＤの進行及び進行速度は、シクロスポリンＡ及びＰＰＳＣ群でのみ有意に遅延した。

確立された組織病理学である、肺（Ａｓｈｃｒｏｆｔ）及び肝臓（Ｉｓｈａｋ）の線維化を定量的に記録するマッソントリクローム染色スライドを使用して、ＧＶＨＤの発症も評価した。終点に達した時に、肝臓及び肺（膨張）試料を、各群の動物から収集した。全ての臓器を、ホルマリンで２４時間保存し、７０％のエタノールに移し、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロック、Ｈ＆Ｅ染色スライド、及び特殊な染色（マッソントリクローム及びヒトＣＤ４５＋染色）に処理するために、Ｈｉｓｔｏｗｉｚ（米国ニューヨーク州ブルックリン）に室温で発送した。Ｈｉｓｔｏｗｉｚと契約した認定病理学者（盲検）は、肝臓（Ｉｓｈａｋ）及び肺（Ａｓｈｃｒｏｆｔ）の線維症の組織病理学スコアを提供し、ヒトＣＤ４５＋染色細胞をデジタルで定量した。

ヒトＣＤ４５＋細胞浸潤を、肺（図４）及び肝臓（図５）組織の組織学的試料で検出した。画像解析を使用して、ヒトＣＤ４５＋染色細胞の定量化（割合）を計算した。ヒトＣＤ４５＋細胞の大部分は、血管内腔表面の周囲に位置しており、これは、血管系からの浸潤細胞で通常見られるパターンである。ＰＢＭＣと比較して、ＰＰＳＣ及び陰性対照（ＣｓＡ）のみは、組織への浸潤ヒトＣＤ４５＋細胞の有意な減少を示し、これは、上記の観察（ＧｖＨＤスコア及び体重減少）をサポートする。

マッソントリクロームで染色されたマウスの肺（図６）及び肝臓（図７）の組織切片（コラーゲン沈着が青色に染色）は、ＰＰＳＣが、ＰＢＭＣ群と比較して肺及び肝臓組織の両方の線維症スコアを有意に低減させた唯一の処置群であったことが判明した。これは、肺及び肝臓の病理学的線維症スコアである、それぞれ、Ａｓｈｃｒｏｆｔ及びＩｓｈａｋをサポートする。

５５日間実施した生存分析は、陰性対照（シクロスポリンＡ）及びＰＰＳＣのみがＰＢＭＣと比較して有意に異なることを示した（図８）。動物のほとんどは、重度の体重減少（＞３０％）で死亡した。異なる処置群の中で、ＷＰＳＣは、群内で最も高い体重変動を示した群であった（データは示されず）。

ヒト化モデルを使用して、ＧｖＨＤにおける細胞治療の効果を評価すると、従来の客観的な測定値（体重減少、ＧＶＨＤスコアリング、線維症スコアリングなど）が提供された。さらに、マウス組織で簡単に検出することができるヒト浸潤細胞を簡単に定量する機会も提供され、これは、将来的にはより優れた機序の慢性拒絶反応研究を提供し得る。ＰＰＳＣによる処置は、肺及び肝臓への浸潤ヒトＣＤ４５＋細胞が大幅に減少したことが示されたが、循環ヒトＣＤ３＋の割合（図２Ａ）は、他の処置群と異ならなかった。これは、ＰＰＳＣがヒトＣＤ４５＋細胞の遊走活性または走化性活性を変化させることが可能であることを示唆する。あるいは、ＰＰＳＣが内皮細胞に影響を及ぼし、活性化されたヒトＣＤ４５＋細胞の遊走を妨げる能力を有し得る可能性もある。

ＰＰＳＣの生存率は、ＰＢＭＣ及び他の実験群と比較して大きく異なったが、シクロスポリンＡと比較して４５日目に体重が減少したので、ＧＶＨＤに対する恒久的な解決策をもたらさなかった。これは、１回の注射の制限された効果によるものであり得、おそらく、疾患の経過中に、複数回注射を投与した場合に、治療効果を維持することができる。興味深いことに、シクロスポリンＡ群は、薬剤に応答せず、ＧＶＨＤで死亡した１匹の動物を有する。

全ての処置は、忍容性が良好であったが、全てのＰＳＣに、同じ治療効果があるとは限らなかった。ＰＰＳＣ細胞療法は、ＧＶＨＤスコア、体重減少、臓器線維化、及びヒトＣＤ４５＋浸潤のような様々な結果測定に基づいて、ＧＶＨＤに対する有効性の可能性を示した。

実施例３
ＰＳＣの分離及び特性評価
ホウォートンゼリー（ＷＪ）ＭＳＣは、男児を出産した母親に由来し、予想どおりＹ染色体検査で陽性であった。３３歳の男性の男性由来脂肪由来ＭＳＣ（ＡＳＣ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、メリーランド州ウォーカーズビル）から購入した。製造者の注意書きに従い、細胞をＬｏｎｚａ培地で増殖させ、対照として使用した。

ＷＪ細胞を臍帯から単離し、次に、小片に切断した。試験片を、付着を可能にする最小限の培地を含むいくつかのＴ－１７５フラスコに入れた。フラスコを、５％のＣＯ_２を含む３７℃のインキュベーターに入れた。培地は、α－ＭＥＭ中の１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンで構成されていた。最初のプレーティングから３日後、少量の培地を、フラスコに添加して、ＷＪピースがしっかりと取り付けられていることを確認した。続いて、フラスコが９０％のコンフルエンシーに達するまで、３～４日毎に、細胞に新鮮な培地を補充した。コンフルエントになった時点で、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回すすぎ、次に、トリプシンと共に３７℃で７分間インキュベートした。トリプシンを培地で中和し、細胞層を、２００ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞を計数し、１×１０^６個の細胞を、各Ｔ－１７５フラスコに播種した。新しいフラスコ中の細胞を、継代１として表記した。プロセスを繰り返して、継代３に達した。継代３の細胞がコンフルエントに達した時、細胞を回収し、１．２５×１０^６細胞／ｍＬの凍結保存培地で凍結保存した。凍結保存培地は、Ｈｅｓｐａｎ中の５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む１０％のＦＢＳで構成されていた。

絨毛膜（ＣＳＣ）及び絨毛膜絨毛（ＣＶＣ）由来のＭＳＣを、母親の同意後に、アラバマ大学の協力的ヒト組織ネットワークの倫理委員会のガイドライン（ＩＲＢプロトコール＃９４０８３１０１６）に従って、選択的帝王切開により収集された健康な健常な妊娠末期胎盤から単離した。ヒト胎盤組織を、次のように、収集後２４時間以内に滅菌層流フード内で処理した。絨毛膜を羊膜から機械的に分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄した。次に、絨毛膜を、小片に切り刻み、シェーカーインキュベーター（Ｉ２４ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｈａｋｅｒシリーズ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニュージャージー州エジソン）内で、１２５Ｕ／ｍｇのコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、米国ニュージャージー州レイクウッド）を用いて、１５０ｒｐｍ、３７℃で１．５時間消化し、絨毛膜間質細胞（ＣＳＣ）を単離した。消化物中で移動した細胞を、１００μｍのセルストレーナー（ＶＷＲ、米国ペンシルベニア州ラドノール）に通し、５００ｘｇで８分間遠心分離することにより収集した。最後に、胎盤固有の組織を慎重に除去して、中間絨毛及び終末絨毛を露出させ、中間絨毛の基部で切開し、ＰＢＳで完全に洗浄し、小片に切り刻み、１２５Ｕ／ｍｇのコラゲナーゼＩを用いて、１５０ｒｐｍ、３７℃で、１．５時間消化して、絨毛膜絨毛間質細胞（ＶＳＣ）を分離した。消化物を、１００μｍのセルストレーナーに通し、５００×ｇで８分間遠心分離して、移動した周産期間質細胞（ＰＳＣ）を収集した。

男性新生児の誕生後に単離されたＷＪ由来のＭＳＣの胎児起源を確認するために、Ｘ／Ｙ染色体分析を実施した。継代２で、細胞を分析した。ＰＣＲ媒介増幅及び後続のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）のサイズ分析で、全臍帯ＭＳＣをアッセイして、細胞または組織の母体及び／または胎児の細胞組成を決定した。ゲノムＤＮＡを、培養細胞または組織から抽出した。Ｘ染色体及びＹ染色体の偽常染色体領域上の合計１５個の常染色体ＳＴＲ及びアメロゲニンを標的とする多重ＰＣＲ媒介増幅反応に、このＤＮＡを使用した。ＰＣＲ増幅後、蛍光標識されたＰＣＲ産物を、ＡＢＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒのキャピラリー電気泳動で分離した。ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェア（ＡＢＩ）を使用して、各ＳＴＲ遺伝子座のリピート数及び各リピートの相対存在量を計算した。次に、このデータを使用して、母体ＳＴＲプロファイル（ＴＤ１９－６６）を使用して、試料中の母体細胞の有無を判定した。このアッセイでは、胎児細胞または母体細胞のわずか２％しか検出することができなかった。

全ての供給源由来のＭＳＣを、蛍光標識抗体：パシフィックブルー抗ＣＤ９０．２、パシフィックブルー抗ＣＤ１０５、ＦＩＴＣ抗ＣＤ２９、ＰＥ、ＦＩＴＣ抗ＣＤ７９α、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ４５、ＰＥ抗－ＣＤ１４、またはＰＥ抗ＣＤ１１、のうちの１つと共にインキュベートした。細胞を、フローアシストセルソーティング（ＦＡＣＳ）Ｃａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カルフォルニア州サンノゼ）で分析した。アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。ＦＡＣＳ分析により、単離ＭＳＣは、ＣＤ９０．２^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２９^＋、Ｓｃａ－１^＋の陽性発現、及びＣＤ７９α^－、ＣＤ４５^－、ＣＤ１４^－の欠如、及びＣＤ１１の発現を含む、間葉系マーカーのよく特徴付けられた発現パターンを示した（表２）。

実施例４
線維症の発症に対する周産期間質細胞注入の安全性及び有効性の評価
線維症の進行に対するＷＪ及び全臍帯ＭＳＣの効果を試験するために、ブレオマイシン注入後１日目に、細胞の尾静脈注射を実施した。

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）から入手した。２２月齢の雄マウスを、全ての実験に使用した（ｎ＝６～１０／群）。４月齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６を、ＡＳＣの単離に使用した。動物を、病原体不含の条件下、餌及び水を自由にして収容した。全ての実験及び手順は、米国実験動物管理認定協会により認定された施設であるマイアミ大学ミラー医学部（フロリダ州マイアミ）の施設内動物管理使用委員会に承認された。

ケタミンを用いる麻酔導入後に、５０μｌの滅菌生理食塩水に溶解した硫酸ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ；ミズーリ州セントルイス）を直接気管内点滴注入（２．０Ｕ／ｋｇ）により投与し、ＢＬＭ誘発肺損傷を生じさせた。対照マウスは、５０μｌの滅菌生理食塩水を気管内投与した。開始時、ＢＬＭ後の７日目、及び死亡時に、マウスを計量した。ＢＬＭまたは生理食塩水の投与から２１日後に、マウスを死亡させた。ＡＳＣ及び他の全ての供給源由来のＭＳＣ（継代２または３）を、３７℃の水浴で解凍し、注射前に、ＰＢＳで洗浄して、細胞凍結溶液を除去した。次に、細胞を、７０μｍのセルストレーナーに通して、細胞塊を除去した。細胞を計数し、注射の直前に、ＰＢＳに再懸濁した。ＢＬＭ損傷の１日後または１０日後に、２００μｌのＰＢＳ中の５×１０^５細胞を、マウスに１分間かけて尾静脈注射により投与した。対照マウスは、尾静脈注射により２００μｌのＰＢＳを受けた。

図９に示されるように、且つ、以前に報告されるように、ＢＬＭによる処置後に、生存率は、減少した。ＢＬＭ群のマウスの５０％は、ＢＬＭ投与の１４日後以降生存した。しかし、ＡＳＣ群のマウスの８０％、またはＷＪ群のマウスの７５％が、ＢＬＭ投与後２１日間生存した。全臍帯注射を受けたマウスは、ＢＬＭ後２１日目の生存率が約５０％であった。

ＢＬＭ注入後１０日目に確立された線維症からの回復に対する細胞の尾静脈注射の効果を評価するために、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアリング及びコラーゲン含有量を測定した。

２０倍の倍率のマッソントリクローム染色スライドで半定量的Ａｓｈｃｒｏｆｔ法を使用して、実験群を知らない肺病理学者が、肺線維症を評価した。３２正方形のグリッド上を体系的に移動することにより、個々のフィールドを評価し；各フィールドを線維症の重症度について評価し、スコアをスケール０（正常な肺）～８（領域の全線維症）に割当て、平均を各スライドについて得た。ヒドロキシプロリン含有量を評価することにより、コラーゲン含有量を評価し、これを、製造者の使用説明書に従って決定した（ヒドロキシプロリンアッセイキット；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）。要約すると、２ｍｇの肺フラグメントを計量し、１００μｌの蒸留水中でホモジナイズした。等量の１０ＮのＨＣｌを試料に添加後、４９℃で３時間乾燥させた。５０μｌの試料をプレートにロードし、３７℃で一晩インキュベートした。ヒドロキシプロリン標準曲線を、標準溶液（０～１μｇ／ウェル）に従って作製した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ；カリフォルニア州サニーベール）を使用して、ヒドロキシプロリン含有量を５５７ｎｍで読み取った。

非特異的である咳及び呼吸困難などの臨床症状により、ほとんどの肺線維症患者は、診断の遅延を経験し、重大な線維症が発生した後の疾患の後期段階で診断される。この設定では、１０日目に、線維症が確立され、ＭＳＣの尾静脈注射の効果を評価することができることが判明した。図１０Ａ～Ｈに示されるように、全てのＭＳＣは、Ａｓｈｃｒｏｆｔ（図１０Ｇ）及びヒドロキシプロリン測定値（図１０Ｈ）を低減させることが判明した。

実施例５
線維症及び炎症に対する周産期間質細胞注入の効果の評価
線維症及び炎症の分子マーカーに対する細胞注入の効果を評価するために、α_ｖ－インテグリン及びＴＮＦαの発現レベルをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）で測定した。ＲＮＡを、肺組織から抽出した。ＴａｑＭａｎ ｒＲＮＡコントロール試薬キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、内因性コントロールである１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し、試料を１８Ｓ転写物含有量に対して正規化した。マイクロＲＮＡ分析のために、製造者の使用説明書に従って、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）マイクロＤＮＡ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して、ｃＤＮＡを生成した。リアルタイムＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ増幅キット（ＱｕａｎｔａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を使用する特異的プライマー（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）を使用して、マイクロＲＮＡ－１９９－３ｐの増幅を実施した。Ｕ６発現をマイクロＲＮＡ解析の対照として使用し、比較Ｃ（Ｔ）法を使用して、相対発現を計算した。

表２に示されるように、ＡＳＣ及びＷＪは、線維症及び炎症の確立された分子マーカーのｍＲＮＡ発現を減少させた。処置の投与（ＢＬＭ後１０日目）により、ＢＬＭ誘発性肺損傷と関連するマーカーが有意に減少した。組織線維症を調節する膜貫通細胞接着分子であるα_ｖインテグリンｍＲＮＡの発現は、ＡＳＣ、ＣＶＣ、及びＷＪ由来細胞と比較して、ＢＬＭ処置マウスで増加していることが判明した（表３）。炎症のマーカーであるＴＮＦ－αも、ＣＳＣを除く全ての処置と比較して、ＢＬＭ処置マウスで増加した（表３）。

さらに、ウェスタンブロットによりＡＫＴ活性化を、ザイモグラフィーにより活性型ＭＭＰ－２を評価することで、ＢＬＭ投与により活性化される線維化経路に対する細胞注入の効果を測定した。

ウェスタン分析を、均質化された肺組織に対して実施した。ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２７１５）、ＡＫＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｃ－１６１９）、カベオリン１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３２６７Ｓ）、及びβ－アクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ５４４１）の場合。５～２５μｇのタンパク質溶解物を、１０％のポリアクリルアミドゲル上で分画し、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロースブロットを化学発光溶液（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．、ニュージャージー州メトゥチェン）に曝露させ、続いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国バッキンガムシャー）に曝露させることにより、免疫反応性バンドを決定した。タンパク質の相対量を決定するために、Ｉｍａｇｅ Ｊバージョン１．４８ｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；メリーランド州ベセスダ）を使用して、濃度測定を評価した。β－アクチン分析を対照として使用した。対象の肺組織内のリン酸化ＡＫＴ対ＡＫＴタンパク質発現の比（２１日目の死亡時にウェスタン分析で定量）を示す。気管内ＢＬＭで処置された高齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ＢＬＭ投与の１０日後に、同種異系ＡＳＣまたはＷＪの尾静脈注射で処置されたマウスの肺と比較して、ｐＡＫＴ／ＡＫＴタンパク質発現の増加を示した。挿入図は、代表的なウェスタンブロット及びβ－アクチンローディング対照を示す。

活性型マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ－２）を肺組織で測定した。要約すると、試料及び標準（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、１０％のザイモグラムゲル（Ｎｏｖｅｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードした。電気泳動後、ゲルを、ゼラチナーゼ溶液中、３７℃で２４時間インキュベートして、関連組織阻害薬による干渉なしのＭＭＰ－２タンパク質分解活性の決定を可能にした。Ｉｍａｇｅ Ｊバージョンｖ１．４８（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ）を使用するデンシトメトリーで、相対的な活性型ＭＭＰ－２を測定した。高齢のＣ５６Ｂｌ／６マウスの肺における活性型ＭＭＰ－２の発現は、ブレオマイシン（ＢＬＭ）肺損傷に応答して２１日目の死亡時に増加した。ＢＬＭ注入後１０日目に、同種異系ＡＳＣまたはＷＪで処置すると、ＢＬＭのみの対照マウスと比較して、活性型ＭＭＰ－２が一貫して減少した。挿入図は、代表的なザイモグラムである。

図１１Ａ～Ｃに示されるように、ＡＳＣ及びＷＪは、ＡＫＴ活性化（図１１Ａ）及び活性型ＭＭＰ－２（図１１Ｂ）を一貫して抑制した。抗線維化として記載されるＣａｖ１タンパク質は、ＡＳＣ処置でのみ増加した。これは、抗線維化効果を示す（図１１Ｃ）。

肺関連線維化経路において重要であることが示されたｍｉＲ－２９及びｍｉＲ－１９９に対する細胞注入の効果を評価した。表４に示されるように、ＢＬＭ処置マウスで、ｍｉＲ－１９９発現が増加し、ＡＳＣの尾静脈注射によってのみ減少したことが判明した。これらのデータは、ＡＳＣのみによるＣａｖ－１の制御をサポートしていた。

実施例６
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト絨毛膜絨毛細胞の免疫調節効果の評価
ヒト胎盤から絨毛膜絨毛細胞が単離され、３つの異なるが、相補的な動物モデルを使用して、線維症を引き起こす慢性炎症を代表するモデルで治療的な細胞として使用した。

図１２Ａ～Ｂに示されるように、ヒト間質細胞を、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１１ｂ－、ＰａｎＣＫ＋、ＰＤＬ１＋絨毛膜絨毛組織から単離し（図１２Ｂ）、線維芽細胞様モルホロジーを有し、可塑性接着性であり、ＣＤ１０５＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ２７３＋、ＣＤ２１０＋、ＣＤ１７８－、ＣＤ１１９－、ＣＤ８５ｄ－、ＣＤ４０－、ＣＤ１１ｂ－、ＨＬＡＤＲ－、ＣＤ４５－の表現型を有していた（図１２Ａ）。

成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）は、Ｔ細胞を活性化することで「炎症」を刺激することができる抗原提示能力を有する自然免疫系の細胞（抗原提示細胞）である。成熟ｍｏＤＣは、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３などの成熟マーカーの上方制御で測定することができる。対照的に、未成熟ｍｏＤＣは、Ｔ細胞の増殖を無効にすることにより「炎症」を阻害する寛容原性樹状細胞の特性を有し、未成熟ｍｏＤＣは、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３などの成熟マーカーの下方制御と、ＣＤ８５ｄ及びＣＤ１４など寛容原性マーカーの同時の上方制御により測定することができる。

絨毛間質細胞の免疫調節能力を評価するために、成熟マーカーＣＤ１ａ及びＣＤ８３、ＣＤ８５ｄ、ならびにＣＤ１４の発現を測定した。図１３Ａ～Ｄに示されるように、ｍｏＤＣの成熟マーカーは、絨毛間質細胞の存在下で有意に下方制御され（図１３Ａ及び１３Ｂ）、ｍｏＤＣの寛容原性マーカーは、絨毛間質細胞の存在下で有意に上方制御された（図１３Ｃ及び１３Ｄ）ことが判明した。絨毛間質細胞は、免疫系全体の主要な区画の両方を代表する適応免疫細胞及び自然免疫細胞の両方を免疫調節することが可能であった。

さらに、絨毛間質細胞の免疫抑制効果を、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２で同種刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の様々な細胞集団で評価した。図１４に示されるように、絨毛間質細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋、ならびにＣＤ３＋増殖に対して顕著な免疫抑制効果を有することが判明した。

ヒトの免疫寛容に対する絨毛間質細胞の影響も、様々なｍｏＤＣと共培養した時、Ｔ細胞の増殖の変化を測定することにより評価した。ＩＬ１０由来ｍｏＤＣは、ＩＬ１０の存在下で同種異系単球に由来する樹状細胞であり、これは、寛容原性樹状細胞の陽性対照として決定されている。絨毛由来ｍｏＤＣ細胞は、絨毛細胞の存在下で同種単球由来の樹状細胞であり；ウェルインサートを使用して細胞を別々の区画で培養し、それ故、絨毛細胞のパラクリン効果を観察した。図１５に示されるように、寛容原性ＩＬ１０－ｍｏＤＣは、（同種抗原ＣＤ３／ＣＤ２／ＣＤ２８を使用して得られるＴ細胞の最大増殖と比較して）完全なＴ細胞増殖／刺激を促進することができなかった（それらを本質的に寛容原性と定義する）。絨毛細胞は、ヒトＴ細胞に対して寛容特性を示した寛容原性樹状細胞を促進することにより、ヒトの免疫寛容の有意な促進を誘導することが判明した。

実施例６
ｉｎ ｖｉｖｏヒト化移植片対宿主病モデルにおけるヒト絨毛膜絨毛細胞の効果の評価
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト絨毛性絨毛間質細胞の効果を評価するために、ヒト化移植片対宿主病モデル、異種間ＧＶＨＤ ＮＳＧ（非肥満糖尿病／重篤な複合免疫不全ＩＬ－２受容体ガンマヌル（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ、ＮＳＧ（登録商標））のマウスに、細胞を投与した。３×１０^７個のヒトＰＢＭＣを尾静脈注射により静脈内（ＩＶ）移植された雌のＮＳＧマウスにおいて、ＧＶＨＤを生成した。陽性対照（ＰＢＭＣ）群は、ＧｖＨＤの発症を可能にする処置は受けなかった。陰性対照（ＣｓＡ）群を、ＧｖＨＤの症状を抑制するために、１日目から研究終了まで（ｑｄから終了まで）シクロスポリンＡを１５ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内（ＩＰ）投与した。５日目に、マウスは、尾静脈内注射により送達された３５０，０００個の細胞を単回用量として、ＭＳＣ細胞注入（絨毛）を受けた。

動物の生存状況を毎日監視し、体重及びＧｖＨＤスコアリングを、週に３回評価した。体重減少、活動性、姿勢、毛皮の質感、及び皮膚の完全性の５つのパラメーターに基づいて、０～２のスケール（２が最も重篤である）で、臨床ＧＶＨＤ指数をスコア化した。動物を安楽死させ、次に、体重が３０％を超える体重減少、または２５％を超える２回連続した体重減少に達した。各群の５匹の動物を４０日目に全血中のヒトＣＤ３＋の発現について分析した（下顎血から０．１ｍＬを収集した）。実験を５５日目まで実施した。図１６に示されるように、ＧｖＨＤ疾患の進行を代表する体重減少は、絨毛間質細胞の投与により有意に減少し、疾患進行のスコア（ＡＵＣ）にも陽性の影響があった。

図１７及び１８に示されるように、炎症性傷害の原因となる臓器へのヒト免疫（ＣＤ４５＋）細胞の浸潤の大幅な減少に加えて、組織学的評価は、肺線維症及び肝臓線維症で、それぞれＡｓｈｃｒｏｆｔ及びＩｓｈａｋの減少を示した。

実施例６
拡張型心筋症のＩＮ ＶＩＶＯモデルにおけるヒト絨毛膜絨毛細胞の効果の評価
絨毛間質細胞が心臓線維症を低減する能力を評価するために、拡張型心筋症（ＤＣＭ）の自己免疫マウスモデルのマウスに、ヒト絨毛膜絨毛細胞を投与した。実験的自己免疫性心筋炎（ＥＡＭ）は、広く受け入れられている心筋炎の動物モデルであり、ミオシン抗原による感受性マウス株の能動免疫化、またはミオシン反応性Ｔリンパ球の養子移入により誘発することができる。疾患は、免疫後２～３週間でピークに達し、多くの場合、雄マウスではより重篤になり、心筋へのＴ細胞及びＡＰＣの広範な浸潤を特徴とする。ミオシン反応性Ｔｈ１７細胞により産生されたＩＬ－１７の重要な役割が記載されている。重要なことに、ＥＡＭを有するほとんどのマウスは、免疫後約６～８週間までにＤＣＭｉ（心臓線維症及び心筋リモデリングを特徴とする）に進行し、それにより、ヒトＤＣＭｉの典型的な特徴を複製する。

マウスにおけるＥＡＭからＤＣＭｉへの進行が、絨毛間質細胞による処置で改善または予防することができるかどうかを評価するために、絨毛間質細胞は、ＥＡＭのマウスモデルに投与されている。ＥＡＭ及びＤＣＭｉは、心臓ミオシンペプチド（ＭｙＨＣα_{６１４－６２９}）を用いる免疫化によりＷｔＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導された。免疫後１１日目に、マウスを絨毛間質細胞調製物で処置した。マッソントリクローム染色により決定されたコラーゲン沈着（線維症）を評価することにより、ＤＣＭｉを４２日目にスコア化した。４２日目に、脾臓を取り出し、サイトカインＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、単一細胞懸濁液を調製した。ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の出現頻度及びＩＬ－１７産生Ｔ細胞の頻度を評価した。

図１９に示されるように、ＥＡＭによるマウスの絨毛間質細胞処置は、ＤＣＭｉへの進行の予防に非常に効果的であり、線維症を軽減することができることが判明した。さらに、図２０に示されるように、絨毛間質細胞処理により、ＥＡＭマウスにおけるＴ細胞由来の病原性サイトカインの産生が有意に減少した。絨毛ＭＳＣが、心臓の線維化スコアを低減可能であり、ＩＮＦｇ及びＩＬ１７などの炎症誘発性サイトカインを下方制御するので、ＤＣＭｉの新規処置法であり得、現在の処置パラダイムを変え得ると、結果は示唆している。

実施例７
誘発性肺線維症のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるヒト絨毛膜絨毛細胞の効果の評価
絨毛間質細胞が肺線維症を低減する能力を評価するために、マウスの肺線維症の化学誘発モデルに、絨毛間質細胞を投与した。このモデルでは、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、直接気管内点滴注入により硫酸ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処理し、ＢＬＭの２１日後に死亡させた。

図２１及び図２２に示されるように、絨毛間質細胞の注入により、コラーゲンの沈着が大幅に減少し、従って、線維症スコアが大幅に低減した。さらに、絨毛間質細胞は、炎症を減少し、線維症を媒介するインテグリンを下方制御した。

本発明を上記の例を参照して記載されているが、修正及び変形が本発明の精神及び範囲内に包含されると理解されるであろう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (38)

1. 以下の細胞型：（ｉ）羊膜周産期間質細胞（ＡＰＳＣ）、（ｉｉ）胎盤固有間質細胞（ＰＰＳＣ）、（ｉｉｉ）ホウォートンゼリー周産期間質細胞（ＷＰＳＣ）、（ｉｖ）全絨毛膜由来間質細胞（ＣＳＣ）、及び（ｖ）絨毛膜絨毛由来間質細胞（ＣＶＣ）、のうちの少なくとも１つと、薬学的に許容される担体と、を含む、周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物。
2. 前記以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの少なくとも２つを含む、請求項１に記載のＰＳＣ組成物。
3. 前記以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの少なくとも３つを含む、請求項１に記載のＰＳＣ組成物。
4. 前記以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの少なくとも４つを含む、請求項１に記載のＰＳＣ組成物。
5. 前記以下の細胞型：（ｉ）ＡＰＳＣ、（ｉｉ）ＰＰＳＣ、（ｉｉｉ）ＷＰＳＣ、（ｉｖ）ＣＳＣ、及び（ｖ）ＣＶＣ、のうちの５つ全てを含む、請求項１に記載のＰＳＣ組成物。
6. 前記ＡＰＳＣ、ＰＰＳＣ、ＷＰＳＣ、またはＣＶＣのうちの少なくとも１つが、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７３、ＣＤ２１０、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される分子マーカーを発現する、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
7. 前記ＡＰＳＣ、ＰＰＳＣ、ＷＰＳＣ、またはＣＶＣのうちの少なくとも１つが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ１１９、ＣＤ８５ｂ、ＣＤ１７８、ＣＤ４０、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される分子マーカーを発現しない、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
8. 前記細胞が複数のドナーに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
9. 前記細胞が、同じ血液型の複数のドナーに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
10. 前記細胞が、互いに組織適合性があると判定されている複数のドナーに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
11. 前記細胞が、同じものを含むか、または類似のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を含むと判定されている複数のドナーに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
12. 前記細胞が、１人以上のドナーに由来し、それのＤＮＡが、分析されて、前記細胞が、限定されないが、がん、常染色体優性疾患、例えば、家族性高コレステロール血症、Ｉ型神経線維腫症、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ハンチントン病、常染色体劣性疾患、例えば、鎌状赤血球性貧血、嚢胞性線維症、テイ・サックス病、フェニルケトン尿症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、ムコ多糖症、リソソーム酸リパーゼ欠損症、糖原病、例えば、ガラクトース血症、Ｘ連鎖性疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、及び血友病を含む遺伝性疾患に関連するものを含む遺伝子変異を含まないことが確認されている、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
13. 前記細胞が、任意の病原性ウイルスまたは他の微生物病原体を含まないと判定されている１人以上のドナーに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載のＰＳＣ組成物。
14. 対象の慢性炎症及びそれに伴う組織線維症を低減する方法であって、それを必要とする前記対象に、先行請求項のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む、前記方法。
15. それを必要とする対象の線維症を処置または予防する方法であって、それを必要とする前記対象に、先行請求項のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む、前記方法。
16. 前記対象が、例えば、感染症、化学療法、がん、ＣＯＰＤ、環境損傷、例えば、アスベスト、石炭粉塵などにより引き起こされる肺もしくは肺線維症、または疾患、例えば、がんもしくは嚢胞性線維症；例えば、アルコール依存症、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、Ｂ型肝炎、もしくはＣ型肝炎により引き起こされる肝線維症；例えば、疾患、感染症、心臓発作、もしくは脳卒中により引き起こされる心臓線維症；リンパ節の石灰化線維症を特徴とする縦隔線維症；後腹膜腔の線維症；骨髄線維症；皮膚の線維化：または強皮症もしくは全身性硬化症のうちの１つ以上を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 線維化組織が、肺、肝臓、心臓、膵臓、血管、大腸、小腸、腎臓、皮膚、間質、または瘢痕組織を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記組織内のコラーゲン含有量及び／またはコラーゲン沈着が、前記ＰＳＣ組成物の前記投与前の前記組織内の前記コラーゲン含有量またはコラーゲン沈着と比較して減少している、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記組織内の線維化スコアが、前記ＰＳＣ組成物の前記投与前の前記組織内の前記線維化スコアと比較して減少している、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記線維化スコアが、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア及びＩｓｈａｋスコアからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 線維症の分子マーカーが、前記ＰＳＣ組成物の前記投与前の前記組織内の前記分子マーカーと比較して、前記組織内で減少している、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 線維症の前記分子マーカーが、α_ｖインテグリン発現、活性型ＭＭＰ－２、ｐＡＫＴ／ＡＫＴ発現比、ｍｉＲ１９９発現、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 抗線維化分子マーカーが、前記ＰＳＣ組成物の前記投与前の前記組織内の前記分子マーカーと比較して、前記組織内で増加している、請求項１４～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記抗線維化分子マーカーが、カベオリン－１発現である、請求項２３に記載の方法。
25. それを必要とする対象の組織または臓器の炎症を低減または予防する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１～１３のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む、前記方法。
26. 組織内の炎症の分子マーカーが、前記ＰＳＣ組成物の前記投与前の前記組織内の前記分子マーカーと比較して減少している、請求項１４～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 炎症の前記分子マーカーが、ＴＮＦα発現、ＩＮＦγ発現、ＩＬ－１７発現、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 組織内のＣＤ４５＋Ｔ細胞浸潤が、前記ＰＳＣ組成物の前記投与前と比較して減少している、請求項１４～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 対象における免疫寛容を誘導する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１～１３のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む、前記方法。
30. 炎症誘発性成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の増殖が阻害され、寛容原性未熟ｍｏＤＣの増殖が誘導され、炎症誘発性ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（二重陽性）、及び／またはＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖が阻害され、及び／またはＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋Ｔ細胞の増殖が阻害される、請求項２９に記載の方法。
31. 単球集団における成熟マーカーＣＤ１ａ及びＣＤ８３の発現の減少が、成熟ｍｏＤＣ増殖の阻害を示し、単球集団における未成熟マーカーＣＤ８５ｄ及びＣＤ１４の発現の増加が、未成熟ｍｏＤＣ増殖の増加を示す、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 前記対象が、単一もしくは多臓器線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する、請求項１４～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 対象の単一もしくは多臓器線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する方法であって、それ必要とする前記対象に、請求項１～１３のいずれか１項に記載の周産期間質細胞（ＰＳＣ）組成物を投与することを含む、前記方法。
34. 前記ＰＳＣ組成物が、絨毛膜絨毛由来間質細胞（ＣＶＣ）及び薬学的に許容される担体を含む、請求項１４～３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記対象が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）もしくは敗血症に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある、請求項１４～３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記対象が、急性または慢性のウイルス疾患または感染症、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、もしくはＥ型肝炎、インフルエンザ、ヘルペス、ＨＩＶ、脳炎、デング熱、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、関節炎原性アルファウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、またはコロナウイルス感染症、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳに罹患しており、及び／あるいは、急性または慢性の細菌性疾患または感染症、例えば、インフルエンザまたは肺炎球菌感染症、任意に、前記対象を急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または敗血症または線維症を発症するリスクにさらすもの、に罹患している、請求項１４～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記対象が、組織または臓器の炎症、例えば、心膜炎、に罹患している、請求項１４～３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記組織または臓器の炎症が、ワクチン、任意に、ｍＲＮＡワクチンにより、または移植された組織もしくは臓器もしくは細胞療法に対する拒絶応答により引き起こされる、請求項３７に記載の方法。

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