JP2024508416A - 非定型ｐｋｃ活性化剤を含有する糖調節用組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、小腸で代謝されるグルコースの量を調節する糖調節用組成物に関し、本発明によると、小腸でグルコースの代謝を改善させ、血中グルコースが糞便に排出されることを促進することにより、血中グルコース濃度を低下させ、代謝性疾患を効果的に予防、改善または治療することができる。

Description

本発明は、小腸で代謝されるグルコースの量を調節する糖調節用組成物に関し、さらに詳しくは、非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する糖調節用組成物及び非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または治療用薬学組成物に関する。
糖尿病とは、様々な誘発因子から由来し、血糖値の高い状態が長時間持続すること(高血糖症)を特徴とする慢性的な代謝疾患である。血中のグルコースが細胞で利用されるためにはインスリンが必要であり、インスリンは膵臓のランゲルハンス島から分泌され、食後の血糖値を低下させる効果を有する。インスリンは膵臓のβ細胞から分泌され、炭水化物と脂肪代謝を調節するホルモンとして、標的細胞(肝臓、筋肉及び脂肪細胞など)を刺激し、血流からグルコースを流入及び貯蔵する役割をする。正常人の場合、体内の血糖をエネルギーに変換して降下させる作用をするのに対し、糖尿病患者の場合、インスリンの分泌が正常に行われなかったり、インスリンが正常に分泌されても受容体に問題が生じ、血糖コントロール能力を失って血糖値が高くなる場合がある。このように糖尿は大きく二つの類型に分けられる。1型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病(IDDM)では、患者はグルコース利用を調節するホルモンであるインスリンをほとんどまたは全く生成できない。自己免疫機序により膵臓のβ細胞が破壊され、これに伴うインスリン欠乏により発生する。従って、血中のグルコースが細胞内に吸収されず、糖尿病につながる。一方、2型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)では、インスリンは依然として体内で生産される。これは後天性糖尿病であり、糖尿病全体の80％以上の割合を占めている。膵臓のβ細胞で十分な量のインスリンを分泌しているにもかかわらず、それを細胞で受け入れられず、結果として高血糖状態になるのである。2型糖尿病患者は、筋肉、肝臓及び脂肪組織である主要なインスリン感受性組織において、グルコース及び脂質代謝を刺激するインスリンの効果に対する抵抗性を有する。このようなインスリンに対する反応性不足は、筋肉でのグルコースの吸収、酸化及び貯蔵の不十分なインスリン媒介活性化及び脂肪組織での脂肪分解及び肝臓でのグルコースの生産及び分泌の不適当なインスリン媒介抑制を引き起こす。
世界的に糖尿病は1億5千万人以上が患っており、最近、糖尿病患者数が急速に増加しており、WHOが調査した資料の数値によると、2030年には約3億6千万人以上の糖尿患者が発生すると予想している。それだけでなく、韓国でも生活様式が変わり、肉類中心の食習慣や運動不足の現象が増加し、糖尿患者の発生率が急激に高まっており、発病年齢も低くなっている。糖尿病と診断された後は、血糖調節のために自由な食事が制限され、生活の質が低下し、様々な合併症のリスクが生じるため、血糖値を正常範囲に調節するための技術開発が続けられている。例えば、韓国登録特許第10-1983982号には、desPro36エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2及びグリタゾンを用いた糖尿治療技術を開示しており、韓国公開特許第10-2006-0020548号には、シロキクラゲ(Tremellafuciformis)粗多糖体抽出物を用いた糖尿治療技術を開示しているが、従来の関連技術は、すでに血中に高濃度で存在する糖を体内の他の部位に移動させるだけで、体外に糖を排出することはできないという問題があった。
そこで、本発明では、小腸でのグルコースの吸収率増加を誘導する薬物を選別しようと鋭意努力した結果、PKC活性化剤であるプロストラチン(prostratin)とインゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)を糖調節能を有する化合物として選別し、前記プロストラチン(prostratin)を投与した糖尿病モデルマウスの小腸でのグルコースの吸収率が増加し、糞便へのグルコースの排出率が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
発明の要約
本発明の目的は、小腸でのグルコースの吸収率増加を誘導する糖調節用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、糖調節用化合物を有効成分として含む代謝性疾患の予防または治療用組成物を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、糖調節用化合物を有効成分として含む代謝性疾患の予防または改善用機能性食品組成物を提供することである。
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、前記で言及した課題に限定されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
前記目的を達成するために、本発明は、非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する糖調節用組成物を提供する。
本発明は、また、非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
本発明は、また、非定型PKC活性化剤を投与する段階を含む代謝性疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明は、また、代謝性疾患の予防または治療のための非定型PKC活性化剤の用途を提供する。
本発明は、また、代謝性疾患の予防または治療用薬剤の製造のための非定型PKC活性化剤の使用を提供する。
本発明は、また、非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または改善用機能性食品組成物を提供する。
PKCサブタイプの分類を示し、PKCは大きくClassicalグループ、新規グループ及び非定型(atypical)グループに分けられ、それぞれの遺伝子、タンパク質名とドメイン及びそれぞれのリガンドを示す。 IEC-6及びIEC-18細胞にプロストラチンとインゲノール3－アンゲラートを処理した後、細胞溶解物のタンパク質変化をウエスタンブロットで確認した結果を示す。 IEC-6及びIEC-18細胞にプロストラチンとインゲノール3－アンゲラート処理による2-DG吸収率を確認した結果を示す。 IEC-18細胞にプロストラチンとインゲノール3－アンゲラート処理によるPKC zetaとGLUT1の活性増加を確認した結果を示す。 Aは、PKC zeta形質感染IEC-6細胞及びIEC-18細胞でPKC zeta及びp-GLUT1及びGLUT1の発現を確認した結果であり、Bは、PKC zeta形質感染HEK293細胞でPKC zeta及びp-GLUT1及びGLUT1の発現を確認した結果であり、Cは、PKC zeta形質感染IEC-18細胞で2-DG吸収率を確認した結果を示す。 プロストラチンとインゲノールが処理されたEC-6細胞及びIEC-18細胞にPKC zeta阻害剤(ZIP)を処理した後、グルコース吸収率を測定した結果を示す。 PKCα、PKCδ、PKCζ及び、PKCιのそれぞれに対するsiRNAをIEC-6細胞株に形質感染させた後、各細胞株にプロストラチンを処理した後、p-GLUT1及びGLUT1の発現変化をウエスタンブロットで確認した結果を示す。 PKCα、PKCδ、PKCζ及び、PKCιのそれぞれに対するsiRNAをIEC-6細胞株に形質感染させた後、各細胞株にプロストラチンとインゲノールを処理した後、2-DG吸収率の変化を確認した結果を示す。 Aは、C57BL6マウスにインゲノールまたはプロストラチンを単回皮下注射し、マウスkg当たりグルコース2g(2g/kg glucose)を腹腔内投与した後、IP glucotolerance testを行った結果を示し、Bは、C57BL6マウスにプロストラチンを2週間投与し、マウスkg当たりグルコース2g(2g/kg glucose)を腹腔内投与した後、IP glucotolerance testを行った結果を示す。 糖尿病モデルマウスに40日間毎日プロストラチン(0.5mg/kg)及びインゲノール(1μg/kg)をそれぞれ腹腔内注射した後、体重(左側)及び腹腔内グルコース耐性検査(右側)を行った結果を示す。 Aは、糖尿病モデルマウスに1ヶ月間プロストラチンを投与した後、腸を摘出し、18FDGに対する放射線撮影を行った結果を示し、Bは、摘出した牛の糞便サンプルでの18FDG量を測定した結果を示し、Cは、小腸の十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)及び回腸(ileum)の18FDGアップテイク量をガンマカウンターで測定した結果を示す。 糖尿病モデルマウスに1ヶ月間プロストラチンを投与した後、小腸を摘出し、十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)及び回腸(ileum)をPKC zetaに対する抗体で免疫組織化学染色を行った結果である。左側は光学顕微鏡での100倍撮影結果であり、右側は400倍撮影結果である。 糖尿病モデルマウスに1ヶ月間プロストラチンを投与した後、摘出した小腸の空腸(jejunum)でルーメン(lumen)の頂端膜(apical membrane)部分を電子顕微鏡で撮影した写真である。
発明の詳細な説明及び望ましい実施態様
他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家により通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、通常使用されるものである。
本発明では、小腸内のグルコースの吸収率増加を誘導するEGFRリガンドであるHb-EGFと類似またはより優れた効果を示す薬物を選別するためにAIベースの薬物スクリーニングを行い、候補薬物としてプロストラチンとインゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate、以下、「インゲノール」という)を選別した。プロストラチンとインゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)はすべてPKC(proetein kinase C)の活性化剤として作用する。
本発明の一実施態様では、プロストラチンとインゲノールを処理した腸上皮細胞株(IEC-6及びIEC-18)で、細胞膜でグルコース吸収に関与するタンパク質であるp-GLUT1とGLUT1の発現が増加することを確認し、グルコース類似体である2-DGのアップテイクも増加することを確認した。
本発明の他の実施態様では、糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)にプロストラチンを投与した場合、腹腔内のグルコース耐性が増加し、糖代謝が改善されることを確認し、プロストラチン投与群マウスの体重が有意に減少することを確認した。
従って、本発明は一つの観点から、非定型PKC活性化剤(Atypical PKC activator)を有効成分として含有する糖調節用組成物に関する。
本発明において、前記非定型PKCは、PKC zeta(PKC ζ)またはPKC iota(PKCι)であることを特徴とすることができる。
PKCサブファミリーは、Classicalグループ(PKCα、PKCβ及びPKCγ)、Novelグループ(PKCδ、PKCε、PKCη及びPKCθ)及び非定型(Atypical)グループ(PKCζ及びPKCλ/ι)に分類され、それぞれのサブタイプPKCを活性化するリガンドはサブファミリーグループによって異なる。ClassicalグループはCa2+、DAG、PIP2によって活性化され、novelグループはDAG、lipidによって活性化される。非定型(atypical) PKCの場合、C2とC1ドメインがなく、Ca2+とDAGに活性化されない特性を有する。また、Phox and Bem 1(PB1)ドメインを含んでおり、polarity regulator(PAR6)のようなタンパク質と相互作用することが知られている(図1)。
本発明の一実施態様では、convention PKC(PKCα)、novel PKC(PKCδ)及び非定型PKC(PKCζ及びPKCι)それぞれに対するsiRNAをIEC-6細胞株に形質感染し、48時間後、プロストラチン(1μM)を処理し、総タンパク質を溶出し、ウエスタンブロットを行い、その結果、陰性対照群(siNeg)でプロストラチンによって増加したGLUT1(p-GLUT1)の発現が非定型PKCであるPKCζとPKCιのsiRNAを処理した細胞群では、プロストラチンを処理しても増加しないことが確認された(図7)。従って、プロストラチンによるGLUT1(p-GLUT1)の活性増加メカニズムでは、PKCζ、PKCιが重要な役割をすることが確認された。
本発明において、糖調節は、小腸での糖の吸収または糖の排出を調節することを特徴とすることができる。
本発明の一実施態様では、糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)に1ヶ月間プロストラチン(0.5mg/kg)を投与した後、腸を摘出した後の放射線撮影結果から、プロストラチンを処理したdb/dbマウスの小腸でグルコース吸収が対照群(vehicle群)よりも顕著に高いことを確認した。さらに、プロストラチンを投与したマウスの糞便洗浄物からグルコースがより多く排出されることを確認した(図11)。
本発明において、前記非定型PKC活性化剤は、プロストラチン(prostratin)またはその塩及びプロストラチン誘導体またはその塩、インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)またはその塩及びインゲノール3－アンゲラート誘導体またはその塩で構成される群から選択されることを特徴とすることができる。
前記「プロストラチン(prostratin)」は、化学式1の構造を有する化合物であって、タンパク質キナーゼCの調節剤として、癌及びアルツハイマー病のような他の疾患に対して有望な治療可能性を示すことが知られており、経口投与されたプロストラチンがヒト膵臓腫瘍を抑制することが発表されている(Wang, Man-Tzu et al., Cell. 16: 1237, 2015)。
本発明で使用される前記「インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)」は、化学式2の構造を有し、「インゲノールメブテート(ingenol mebutate)」と知られており、「Picato」というブランド名で販売されている。Euphorbia peplus植物の樹液から発見された物質であり、細胞死を誘導すると知られており、薬物のゲル剤形は光線角化症の局所治療用として、米国食品医薬品局(FDA)及び欧州のEMAから承認されている。
本発明において、前記糖調節用組成物は、小腸、望ましくは小腸の十二指腸、空腸、回腸内で血中グルコースの小腸細胞への吸収及び糞便への排出を誘導することができる。
本発明で「回腸(ileum)」は小腸の末端部位であり、空腸と大腸の接続部位に位置する。小腸は胃と大腸との間に位置する消化器官であり、解剖学的に十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)、回腸(ileum)の3部位で構成されている。通常5歳以上のヒトの小腸はおよそ7mほどで、大腸より4～5倍長いが、太さは平均7.6cmの大腸に比べて2.5～3cmとはるかに細い。十二指腸は約25～30cmであり、空腸は小腸の中間部分で約2.5mである。回腸は約3.6mで、回盲弁で結腸と連結される。回盲弁は内容物が大腸に流入するようにし、小腸への逆流を防止する。消化作用で栄養分は小腸内部の突出した隆起を通じて血液内部に拡散、伝達される。小腸内の粘膜には多数のしわがあり、その表面に絨毛というものがあり、通常胃から入ってきた糜汁は小腸の最初部分と中間部分に当たる十二指腸と空腸でほとんどが消化吸収される。これに対し、回腸部分での消化吸収は相対的に少ないと知られている(Diabetes Management Interactive Case Study, 2016)。本発明の組成物は、前記十二指腸、空腸及び回腸部分でのグルコース吸収を増加させる効果がある。
また、本発明の前記糖調節用組成物は、血中グルコースが糞便に排出されることを促進するだけでなく、グルコースの代謝を改善する効果があり、代謝性疾患を効果的に予防、改善または治療するために使用することができる。
従って、本発明は、別の観点から、非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または治療用組成物に関する。
本発明において、前記非定型PKCは、PKC zeta(PKCζ)またはPKC iota(PKCι)であることを特徴とすることができる。
本発明において、糖調節は、小腸での糖の吸収または糖の排出を調節することを特徴とすることができる。
本発明において、前記非定型PKC活性化剤は、プロストラチン(prostratin)またはその塩及びプロストラチン誘導体またはその塩、インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)またはその塩及びインゲノール3－アンゲラート誘導体またはその塩で構成される群から選択されることを特徴とすることができる。
本発明において、前記「代謝性疾患」とは、エネルギー過剰摂取またはホルモン不均衡など様々な原因で体内のエネルギー代謝が異常に起こり、脂肪が過剰に合成されたり蓄積されて発生する疾患を意味する。前記代謝性疾患は、具体的には、肥満、糖尿病性疾患、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール血症、脂肪肝または動脈硬化症であってもよい。
本発明において、前記「糖尿病性疾患」とは、糖尿病と急性高血糖による合併症として、糖尿病性ケトアシドーシス(diabetic ketoacidosis)、糖尿病性アシドーシス(diabetic acidosis)、糖尿病性黄色腫(diabetic xanthoma)、糖尿病性筋萎縮(diabetic amyotrophy)、糖尿病性ケトーシス(diabetic ketosis)、糖尿病性昏睡(diabetic coma)、糖尿病性胃腸障害(diabetic gastric disorder)、糖尿病性壊疽(diabetic gangrene)、糖尿病性潰瘍(diabetic ulcer)、糖尿病性合併症、糖尿病性下痢症(diabetic diarrhea)、糖尿病性細小血管症(diabetic microangiopathy)、糖尿病性子宮体硬化症(diabetic uterine body sclerosis)、糖尿病性心筋症(diabetic cardiomyopathy)、糖尿病性神経障害(diabetic neuropathy)、糖尿病性腎不全(diabetic nephropathy)、糖尿病性水疱(bullosis diabeticorum)、糖尿病性白内障(diabetic cataract)、糖尿病性皮膚疾患(diabetic dermopathy)、糖尿病性浮腫性硬化症(diabetic scleredema)、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、糖尿病性リポイド類壊死症(necrobiosis lipoidica diabeticorum)、または糖尿病性血液循環障害(diabetic blood circulation disorder)などを含むが、これらに限定されない。
本発明において、前記「糖尿」または「糖尿病」は、血中グルコース濃度を増加させて発生する疾患であり、このような糖尿病は、有病期間が長くなるほど、慢性合併症による失明、末期腎不全症、神経疾患、下肢切断及び感染疾患などが急増する。特に、糖尿病合併症として脳血管疾患及び心血管系疾患が最も多い部分を占めているが、疾患死亡者の約3/4は糖尿病合併症による死亡者であり、心血管系合併症による死亡リスクも糖尿病有病期間が10年増加するたびに24％ずつ増加することが報告された。糖尿病患者は正常人に比べて冠状動脈疾患の有病率が2倍も高く、末梢血管疾患の有病率は約3倍以上と報告されており、糖尿病においてこのようなアテローム性動脈硬化を引き起こす原因としては、高血糖、脂質代謝の異常、高インスリン血症、高血圧、血液凝固機序の変化など多様に知られている。糖尿病の95％以上を占める2型(インスリン非依存型)糖尿病の病因は、二つの原因、すなわちインスリン分泌障害及びインスリン抵抗性の複合障害と知られている。つまり、糖尿病はこの複合的な障害により慢性的な高血糖症状を示す疾患である。
本発明において、前記「糖尿病性ケトアシドーシス」は、糖尿病患者に発生する最も重要な急性代謝性合併症であって、身体に必要なエネルギーを糖より脂肪を使用することによって引き起こされる過度な血流中の酸代謝物の蓄積と、水分と糖の損失によって発生する疾患である。糖尿病性ケトアシドーシスは、インスリンに対する抵抗やインスリン不在によって発生する。インスリンが少ないと、グルコースが細胞内に入ることができず、血中に蓄積される。その結果、細胞はグルコースを供給されず、エネルギー源として脂肪を使うようになる。脂肪代謝は脂肪酸とグリセロールを作るが、グリセロールは細胞に若干のエネルギーを供給するが、脂肪酸はケト酸に代謝され、結果として酸毒症を引き起こす。酸毒症は細胞内で血管内へのカリウム移動を増加させることになり、利尿作用によって過カリウム尿症をもたらし、全身のカリウム枯渇状態をもたらす。
本発明において、前記「肥満」は、エネルギー不均衡によって過剰な体脂肪を有する状態(condition)または疾患(disease)を意味することができ、様々な原因で体内のエネルギー代謝が円滑に行われず、脂肪が過剰に合成または蓄積される疾患を意味する。
別の観点から、本発明は、非定型PKC活性化剤を投与する段階を含む代謝性疾患の予防または治療方法に関する。
別の観点から、本発明は、代謝性疾患の予防または治療のための非定型PKC活性化剤の用途に関する。
別の観点から、本発明は、代謝性疾患の予防または治療用薬剤の製造のための非定型PKC活性化剤の使用に関する。
別の観点から、本発明は、非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または改善用機能性食品組成物に関する。
本発明において、前記非定型PKCは、PKC zeta(PKCζ)またはPKC iota(PKCι)であることを特徴とすることができる。
本発明において、糖調節は、小腸での糖の吸収または糖の排出を調節することを特徴とすることができる。
本発明において、前記非定型PKC活性化剤は、プロストラチン(prostratin)またはその塩及びプロストラチン誘導体またはその塩、インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)またはその塩及びインゲノール3－アンゲラート誘導体またはその塩で構成される群から選択されることを特徴とすることができる。
本発明の一実施態様で「予防」とは、本発明の前記組成物を用いて代謝性疾患によって引き起こされる症状を遮断したり、その症状を抑制または遅延させることができる全ての行為であれば、制限なく含むことができる。
本発明の一実施態様で「改善」とは、本発明の前記組成物を用いて代謝性疾患によって引き起こされる症状が好転するようにしたり、有益になるようにする全ての行為であれば、制限なく含むことができる。
本発明の一実施態様で「治療」とは、目的とする疾患の緩和及び／又は改善のために行われる一連の活動を意味する。本発明の目的上、治療は腸内吸収されるグルコースの量を著しく増加させ、グルコース代謝を改善させる活動を含む。
本発明の一実施態様で「薬学組成物」とは、特定の目的のために投与される組成物を意味する。本発明の目的上、本発明の薬学組成物は、糖尿または糖尿による合併症を予防または治療することであり、これに関与する化合物及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。
また、本発明による薬学組成物は、組成物の総重量に対して本発明の有効成分を0.1～50重量％で含有する。本発明の組成物に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施態様で「投与」とは、ある適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。
経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、腸内投与、腔内投与、硬膜内投与を行うことができるが、これらに限定されない。本発明で有効量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれる有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物をはじめ様々な要因によって調節することができる。また、本発明の薬学組成物は、目的とする代謝性疾患の治療のために単独または当業界に公知の他の治療法、例えば、化学療法剤及び手術と一緒に投与することができる。また、本発明の薬学組成物は、血糖降下を促進するために考案された他の治療、例えば、当業界に周知されたものと混合して投与することができる。バイオリスティック(biolistic)伝達または生体外(ex vivo)処理のように他の標準伝達方法を使用することもできる。
本発明の一実施態様で「食品組成物」とは、本発明で目的とする代謝性疾患の予防または改善のために多様に利用されるものであり、本発明の組成物を有効成分として含む食品組成物は、各種食品類、例えば、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、菓子、餅、パンなどの形態で製造されてもよい。本発明の食品組成物は、毒性及び副作用がほとんどない既存の食品用摂取物から改良されて構成されたものであるため、予防目的で長期間服用する際にも安心して使用することができる。本発明の組成物が食品組成物に含まれる場合、その量は総重量の0.1～100％の割合で添加することができる。ここで、前記食品組成物が飲料形態で製造される場合、指示された割合で前記食品組成物を含有すること以外に特別な制限点はなく、通常の飲料と同様に様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。すなわち、天然炭水化物として、グルコースなどのモノサッカライド、フルクトースなどのジサッカライド、シュクロースなどのポリサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールなどを含んでもよい。前記香味剤としては、天然香味剤(タウマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウジオシドA、グリチルリチン等)及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテーム等)等が挙げられる。その他、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有してもよい。これらの成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。これらの添加剤の割合は、通常本発明の組成物100重量部当たり0.1～100重量部の範囲で選択されることが一般的であるが、これに限定されない。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、あくまでも本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例1：小腸の回腸(Ileum)内のグルコース吸収率を増加させる薬物の選別
回腸内のグルコース吸収率の増加を誘導するEGFRリガンドであるHb-EGFと類似またはより優れた効果を示す薬物を選別するために、Arontier社のA.I.ベースの薬物スクリーニング(Arontier社、韓国)を実施した。
アロンティア社が開発したREMEDY platform (Lamb et al., Science, 313:1929~1935, 2006; Subramanian et al., Cell, 171:1437~1452, 2017)を用いてHb-EGFと類似した候補化合物を選別した。
その結果、非定型PKC活性化剤(atypical PKC activator)として作用するプロストラチン(protsratin)とインゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)を選別した。
実施例2：小腸細胞株でプロストラチン及びインゲノール(Ingenol 3-angelate)処理によるグルコース輸送体(GLUT transporter)の発現量の確認
腸上皮細胞であるIEC-6細胞(ATCC CRL-1592)とIEC-18細胞(ATCC CRL-1589)の培養のために、10％ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン－ストレプトマイシンを添加したDulbecco's modified Eagle培地(DMEM)を使用して、10％CO2と90％空気を含む加湿雰囲気で37℃に維持しながら培養し、保存培養は3～4日ごとに継代培養した。実験のために、IEC-6細胞及びIEC-18細胞を2 x 105細胞/皿の密度で6－ウェルプレートに接種した。細胞密度が1.5 x 105細胞/cm2の時、塗抹6日後の培養液を使用した。プロストラチンはSigma-Aldrich(Cat.No. P0077)から購入して使用した。インゲノールはSigma-Aldrich(Cat.No. SML1318)から購入して使用した。
IEC-6細胞及びIEC-18細胞にプロストラチンとインゲノールをそれぞれ30nM、100nM及び300nMで30分処理した後、細胞溶解物を得て、ウエスタンブロットを通じてタンパク質の発現量を確認した。
ウエスタンブロットを次のように行った。
全体の細胞タンパク質溶解物を製造し、標準手続に従ってウエスタンブロット分析を行った。簡単に言うと、細胞を氷上で冷却し、氷冷したリン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル及び1xプロテアーゼ阻害剤(Sigma-Aldrich)を含む緩衝液で溶解した。タンパク質濃度はBradford分析キット(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)で測定した。細胞溶解物に同量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、1次抗体でそれぞれ抗PKCα(Cell signalin Tecnology、米国)、抗PKCδ(Cell signalin Tecnology、米国)、抗PKCζ(Cell signalin Tecnology、米国)、抗p-GLUT1(abcam、英国)、抗GLUT1(abcam、英国)及び抗GLUT2(Novus Biological、米国)と共に4℃で一晩反応させた膜に移した。
ブロットをTBST(0.05% Tween 20を含むトリス緩衝食塩水)で3回洗浄した後、25℃で1時間ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)－コンジュゲートした2次抗体で反応させた。2次抗体はロバ抗-ウサギIgG-HRP抗体(1:5000, Santa Cruz)、ロバ抗－マウスIgG-HRP抗体(1:5000, Santa Cruz)を使用した。免疫反応性はSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)で検出した。
その結果、図2に示すように、IEC-6及びIEC-18細胞は、Ingenol 3-angelateとprostratinによってはすべての濃度(30, 100, 300 nM)でGLUT1リン酸化が促進されることを確認した。タンパク質定量マーカーであるNa/K ATPaseに対して、プロストラチンとインゲノール3－アンゲラートによって糖輸送体であるp-GLUT1とGLUT1の発現が増加することを確認した。
実施例3：小腸細胞株でプロストラチン及びインゲノール(Ingenol 3-angelate)処理による細胞内グルコース吸収率の確認
IEC-6細胞及びIEC-18細胞にプロストラチンとインゲノール(100nM)を10分間処理した後に得られた細胞溶解物で2-DG(2-deoxy-D-glucose)吸収率を確認した。
グルコース濃度を測定し、プロストラチンとインゲノール処理によるグルコース吸収率(2-DG uptake)の変化を確認した。
グルコースの量は、低濃度グルコース培地と無血清DMEMで24時間プロストラチンとインゲノールを処理した後に測定した。IEC-6, IEC-18細胞グルコースレベルは、メーカーの指針に従ってGlucose Assay Kit(Cayman Chemical)を使用して検出した。吸光度信号はGen 5発光分光器(BioTek, Winooski, VT, USA)で測定した。
その結果、図3に示すように、プロストラチンとインゲノール処理によって細胞内グルコース(2-DG)吸収率が増加することを確認した。
実施例4：小腸細胞株でプロストラチン及びインゲノール(Ingenol 3-angelate)によるPKCとGLUT1の活性化の確認
IEC-18細胞にプロストラチン(2μM)とインゲノール(0.1μM)をそれぞれ0分、15分及び60分処理後、PKCとGLUT1のタンパク質発現をウエスタンブロットで確認した。
その結果、図4に示すように、プロストラチンとインゲノールがPKC zetaとGLUT1の活性を増加させることを確認した。また、プロストラチンはインゲノールに比べてより早くPKCとGLUT1を細胞膜に移動(translocation)させることを確認した。
実施例5：小腸細胞株でPKC zetaがGLUT1媒介のグルコース吸収を誘導することを確認
形質感染を通じてPKC zetaを一時的にIEC-6細胞、IEC-18細胞及びHEK293(ATCC CRL-1573)細胞で過発現するように形質感染細胞株を作製した。
ラットPKC zetaを発現するプラスミド(韓国遺伝子銀行)をpCDNA3.1(Addgene、米国)にサブクローニングした。IEC-6細胞及びIEC-18細胞は、形質感染1日前に6－ウェル当たり0.5 x 106の密度で塗抹した。細胞はメーカーの指示に従ってPolyjet形質感染試薬(SignaGen)を使用して発現プラスミドで形質感染した。形質感染した細胞は、溶菌前に37℃で48時間培養し、インゲノール(0.1μM)を処理した。対照群としてempty vector感染群細胞群、PKC zeta形質感染細胞グループ及び野生型細胞にインゲノール処理群、形質感染細胞にインゲノール処理群に対して、細胞溶解物を得て、ウエスタンブロットを行った。
ウエスタンブロットでNa/K ATPaseを膜におけるloading controlとして使用した。
その結果、図5A及び図5Bに示すように、empty vectorを処理した陰性対照群に比べ、インゲノールを処理した群で細胞膜にPKC zetaが活性化されて移動し、GLUT1の膜移動(translocation)を確認することができた。PKC zetaが過発現した細胞株では、インゲノールを処理しなかった群でもp-GLUT1、GLUT1が陰性対照群より多く発現した。
また、PKC zetaを過発現させた形質感染IEC-18細胞株で2-DG吸収率を測定した。その結果、図5Cに示すように、対照群に比べてPKC zetaを過発現させたIEC-18細胞株で2-DG吸収率が有意に増加することを確認した。
従って、非定型PKC発現が多い細胞株で2-DG吸収率が顕著に増加することを確認した。
実施例6：PKC zeta阻害剤処理によるプロストラチン及びインゲノールのグルコース吸収効果阻害の確認
プロストラチン(100nM)とインゲノール(100nM)処理によって非定型PKC(atypical PKC)が活性化されたIEC-6細胞及びIEC-18細胞にPKC zetaを特異的に阻害するZIP(pseudosubstrate-derived PKCζ-inhibitory peptide, R&D system, USA)を1μM濃度で処理した後、グルコース吸収率を測定した。
その結果、図6に示すように、IEC-6、IEC-18細胞にプロストラチン(100nM)とインゲノール(100nM)処理時に、細胞内グルコース－6－リン酸が増加したが、PKC zeta阻害剤であるZIPの併用処理時に、細胞内グルコース－6－リン酸の吸収率が陰性対照群(NT)程度まで減少することを確認した。
実施例7：プロストラチン媒介GLUT1活性化で非定型PKC(zeta +iota)の役割確認
プロストラチンとインゲノールによるGLUT1活性化がどのような種類のPKC subtypeを通じて誘導されるかを確認するために、convention PKC(PKCα)、novel PKC(PKCδ)及び非定型PKC(PKCζ及びPKCι)それぞれに対するsiRNAをIEC-6細胞株に50nM濃度でRNAiMax(Invitrogen)を用いて形質感染し、48時間後、プロストラチン(1μM)を処理し、総タンパク質を溶出し、ウエスタンブロットを行った。
使用したsiRNA配列を以下に示す。
PKCα siRNA: GGGAUGUCAGAGAGCAUGCCUUCUU (配列番号1)
PKCδ siRNA: CUCACAGUACUUCCUCUGU (配列番号2)
PKCζ siRNA: GCUGAGAUCUGUAUCGCUCUCAACU (配列番号3)
PKCι siRNA: GGACAAUGUACUGCUAGACUCUGAA (配列番号4)
その結果、図7に示すように、陰性対照群(siNeg)でプロストラチンによって増加したGLUT1(p-GLUT1)の発現が、非定型PKCであるPKCζとPKCιのsiRNAを処理した細胞群では、プロストラチンを処理しても増加しないことが確認された。
従って、プロストラチンによるGLUT1(p-GLUT1)の活性増加メカニズムでは、PKCζ、PKCιが重要な役割をすることが確認された。
実施例8：プロストラチン及びインゲノールによるグルコースの吸収率増加における非定型PKC(zeta +iota)の役割確認
IEC細胞でプロストラチンとインゲノールの処理によって増加したグルコース吸収率(2DG uptake)がどのsubtypeのPKCを通じて誘導されるのかを確認するために、実施例7と同様に、convention PKC(PKCα)、novel PKC(PKCδ)及び非定型PKC(PKCζ及びPKCι)それぞれに対するsiRNAをIEC-6細胞株に形質感染させ、48時間後、プロストラチン(1μM)またはインゲノール(100nM)を処理し、2DGアップテイクを確認した。
その結果、図8に示すように、陰性対照群(siNeg)でプロストラチンとインゲノール処理によって2DG吸収が増加したが、非定型PKC(PKCζ及びPKCι)をノックダウンさせた群では、プロストラチンとインゲノールを処理しても2DG吸収が増加しなかった。
従って、プロストラチンとインゲノール処理によって誘導されるグルコース吸収において、PKCζ及びPKCιがすべて重要に作用することを確認した。
実施例9：マウス動物モデルでプロストラチンとインゲノールの投与によるグルコース代謝向上効果の確認
9-1：単回投与によるグルコース代謝改善の確認
C57BL6マウス12匹を12時間絶食させた後、腹腔グルコース検査を行い、空腹時血糖を測定した。その後、インゲノール投与群(4匹)とプロストラチン4匹投与群にそれぞれインゲノール(4ug/kg)及びプロストラチン(1mg/kg)を単回皮下注射し、マウスkg当たりグルコース2g(2g/kg glucose)を生理食塩水で希釈して腹腔内投与した。その後、15分、30分、60分、90分及び120分にそれぞれIP glucotolerance testを行った。
その結果、図9Aに示すように、プロストラチン投与群では30分及び60分に陰性対照群(Vehicle)に比べて顕著にグルコース代謝が改善されることを確認し、インゲノール投与群でも陰性対照群よりグルコース代謝が改善されることを確認した。
9-2：2週間投与後、グルコース代謝改善確認
C57BL6マウスにプロストラチンを0mg/kg、0.5mg/kg及び1mg/kgの濃度で浸透圧ポンプを利用して2週間投与し、12時間絶食させた後、マウスkg当たりグルコース2g(2g/kg glucose)を生理食塩水に希釈して腹腔内投与した。その後、15分、30分、60分、90分及び120分にそれぞれIP glucotolerance testを行った。
その結果、図9Bに示すように、2時間の間の血糖変化及びグルコース変化曲線下面積値がいずれも好転されることを確認した。
実施例10：糖尿病モデルマウスでプロストラチンとインゲノールの投与による体重及びグルコース代謝向上効果の確認
レプチン受容体が欠乏した代表的な糖尿病モデルとして知られているdb/dbマウス(Jackson laboratory)に40日間毎日プロストラチン(0.5mg/kg)及びインゲノール(1μg/kg)をそれぞれ腹腔内注射した後、体重を測定した。
その結果、図10に示すように、インゲノールは投与28日目に2μg/kgに濃度を上げてから30日目に体重減少が統計的有意性を示した。プロストラチン0.5mg/kg投与群は投与11日目から体重減少が対照群(vehicle群)と比較して統計的有意性を示した。
薬物投与後17日目に腹腔内グルコース耐性検査(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)を行った。IPGTT進行前12時間絶食後、プロストラチンとインゲノール注射後、15分後に2g/kg IPGTTを行った結果を図10に示した。インゲノール1μg/kg投与群では、グルコース投与後240分で糖改善効果を示した。プロストラチン(0.5mg/kg)投与群では、30～240分間、全時間にわたって対照群(vehicle群)よりも糖改善が優れていることを確認した。
実施例11：糖尿病モデルマウスでプロストラチン投与によるグルコース吸収及び排出向上効果の確認
db/dbマウス(Jackson laboratory)に1ヶ月間プロストラチン0.5mg/kgを投与したマウスの腸を摘出し、18FDG(Fluorodeoxyglucose、DuChemBio)に対する放射線を撮影した。18FDGはDuChemBioから購入し、1匹当たり200μCiを尾静脈により注射した。
また、摘出した小腸を5mLのPBSで洗浄して得られた糞便サンプル(Fecal sample)での18FDGを測定し、小腸の十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)及び回腸(ileum)の18FDGのアップテイク量をガンマカウンターで測定した。
その結果、図11Aに示すように、放射線撮影結果から、プロストラチンを処理したdb/dbマウスの小腸でグルコース吸収が対照群(vehicle群)よりはるかに高いことを確認した。
また、図11Bに示すように、糞便サンプルのグルコース排出量を確認したとき、プロストラチンを投与したマウスの糞便洗浄物からグルコースがより多く排出された。さらに、図11Cに示すように、小腸の十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)及び回腸(ileum)で全て2倍以上にグルコース吸収が増加した。
実施例12：糖尿病モデルマウスの空腸と回腸でプロストラチン投与による非定型PKCの膜移動効果の確認
db/dbマウスに1ヶ月間プロストラチン(0.5mg/kg)またはvehicleを投与した後、小腸を摘出し、十二指腸、空腸及び回腸をホルマリンで固定した後、PKC zetaに対する抗体(abcam, USA)で免疫組織化学染色を行い、光学顕微鏡で100倍、400倍に拡大して撮影した。
その結果、図12に示すように、十二指腸ではプロストラチン投与群と対照群(vehicle)間に大きな差がなく、空腸と回腸はプロストラチン投与群でPKC zetaの位置が細胞質からルーメン(lumen)の膜頂点(apical membrane)に集中する傾向を確認することができた。
実施例13：プロストラチンを投与した糖尿病モデルマウスの空腸(jejunum)のルーメンの電子顕微鏡的観察
db/dbマウスに1ヶ月間プロストラチン(0.5mg/kg)またはvehicleを投与した後、小腸を摘出し、空腸(jejunum)でルーメン(lumen)の膜頂点(apical membrane)部分を電子顕微鏡で観察した。
その結果、図13に示すように、対照群(vehicle)に比べ、プロストラチン投与群の空腸の微絨毛(microvilli)の近くの糖質皮質(glycocalyx)が多く分泌されていることを確認し、プロストラチン投与群の小腸細胞内でミトコンドリア数が増加しており、細胞内代謝が活発に行われていることが分かった。
本発明によると、小腸でグルコースの代謝を改善させ、血中グルコースが糞便に排出されることを促進することにより、血中グルコース濃度を低下させ、代謝性疾患を効果的に予防、改善または治療することができる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界において通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は単なる望ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されない点は明らかであろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。

Claims (14)

  1. 非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する糖調節用組成物。
  2. 前記非定型PKCは、PKC zeta(PKCζ)またはPKC iota(PKCι)であることを特徴とする、請求項1に記載の糖調節用組成物。
  3. 糖調節は、小腸での糖の吸収または糖の排出を調節することを特徴とする、請求項1に記載の糖調節用組成物。
  4. 前記非定型PKC活性化剤は、プロストラチン(prostratin)またはその塩及びプロストラチン誘導体またはその塩、インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)またはその塩及びインゲノール3－アンゲラート誘導体またはその塩で構成された群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の糖調節用組成物。
  5. 非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または治療用組成物。
  6. 前記非定型PKCは、PKC zeta(PKC ζ)またはPKC iota(PKCι)であることを特徴とする、請求項5に記載の代謝性疾患の予防または治療用組成物。
  7. 小腸での糖の吸収を調節することを特徴とする、請求項5に記載の代謝性疾患の予防または治療用組成物。
  8. 前記非定型PKC活性化剤は、プロストラチン(prostratin)またはその塩及びプロストラチン誘導体またはその塩、インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)またはその塩及びインゲノール3－アンゲラート誘導体またはその塩で構成された群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載の代謝性疾患の予防または治療用組成物。
  9. 小腸での糖の吸収または糖の排出を調節することを特徴とする、請求項5に記載の代謝性疾患の予防または治療用組成物。
  10. 前記代謝性疾患は、糖尿病性疾患、肥満、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール血症、動脈硬化症または脂肪肝疾患である、請求項5に記載の代謝性疾患の予防または治療用薬学組成物。
  11. 前記糖尿病性疾患は、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性アシドーシス、糖尿病性黄色腫、糖尿病性筋萎縮、糖尿病性ケトーシス、糖尿病性昏睡、糖尿病性胃腸障害、糖尿病性壊疽、糖尿病性潰瘍、糖尿病性合併症、糖尿病性下痢症、糖尿病性細小血管症、糖尿病性子宮体硬化症、糖尿病性心筋症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎不全、糖尿病性水疱、糖尿病性白内障、糖尿病性皮膚疾患、糖尿病性浮腫性硬化症、糖尿病性網膜症、糖尿病性リポイド類壊死症及び糖尿病性血液循環障害で構成された群から選択されることを特徴とする、請求項10に記載の代謝性疾患の予防または治療用薬学組成物。
  12. 非定型PKC活性化剤を有効成分として含有する代謝性疾患の予防または改善用機能性食品組成物。
  13. 小腸での糖の吸収または糖の排出を調節することを特徴とする、請求項1に記載の代謝性疾患の予防または改善用機能性食品組成物。
  14. 前記非定型PKC活性化剤は、プロストラチン(prostratin)またはその塩及びプロストラチン誘導体またはその塩、インゲノール3－アンゲラート(Ingenol 3-angelate)またはその塩及びインゲノール3－アンゲラート誘導体またはその塩で構成された群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の代謝性疾患の予防または改善用機能性食品組成物。
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