JP2024506914A - がんの処置のための多重免疫療法とがんワクチンとを組み合わせた治療用組成物及び方法 - Google Patents

がんの処置のための多重免疫療法とがんワクチンとを組み合わせた治療用組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】がんの処置のための多重免疫療法とがんワクチンとを組み合わせた治療用組成物及び方法を提供する。【解決手段】本発明は、ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとを含む治療用組成物に関する。本発明はまた、患者における腫瘍又はがんを処置する方法であって、治療用組成物を、腫瘍又は癌を処置するのに有効な量で、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０２１年２月１２日に出願された米国仮出願第６３／１４８，９２２号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、がんの処置のための免疫学的及び化学療法的方法とがんワクチンとを組み合わせた治療用組成物に関する。
がんは米国で２番目に多い死因であり、毎年５８０，０００人の米国人、毎日１，５００人を上回る人々の命が奪われている。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）は、がん医療の年間総費用が２２７０億ドルを上回ると推定しており（２００７年）；これには直接的な医療費８９０億ドルが含まれる。がん処置の総医療費の多くは、放射線及び従来の化学療法の有害な副作用の管理に由来する。
転移性固形がんに対しては、がんの部位及び組織型（例えば、扁平上皮がん、尿路上皮がん、腺がん、肉腫、リンパ腫、黒色腫など）に応じて異なる、化学療法、免疫療法、手術、外照射療法、近距離照射療法、凍結手術などの操作療法、及びホルモン療法（特定のがんに対して）を含む複数の療法が使用されている。これらの療法の多くは延命効果をもたらすものの、この集団における重大な有害事象の発生率と考え合わせて検討する必要がある。
例えば、免疫学的がん処置は、腫瘍学的治療薬の展望を完全に変える態勢にある。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１などのチェックポイント阻害剤は、既に転移性黒色腫及び非小細胞肺がんの処置に大きな影響を与えている。これらの薬物は現在、それらの有効性の向上を目指して併用されている。これらの薬物の送達は一般的に静脈内に行われ、このことは、がん細胞及び正常細胞の両方を死滅させることで処置レジメン及び患者転帰に悪影響を及ぼし得るこれらの殺細胞剤の体内での非特異的な分布の結果として、重篤で時には致死的な全身毒性を及ぼす怖れがある。
操作は、細胞、臓器、又は異常成長物（がんなど）を選択的に損傷させるか又は破壊するために使用される外科的手法である。凍結外科的凍結は、患者の抗原提示細胞及び樹状細胞に対する特有な一連の腫瘍関連抗原の提示を介して、患者における免疫応答を誘発することが知られている。しかし、この「凍結免疫学的効果」にはばらつきがあり、場合によっては有害でさえあることが知られている。
ＷＯ ２０１７／１２３９８１は、少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤及び少なくとも１種のサイトカインを含む医薬組成物、並びにそれと操作工程との組合せに関する。サイトカインは、いくつかの刺激に応答して免疫系の細胞又は非免疫細胞（例えば、上皮細胞）によって分泌される天然に存在するタンパク質であり、免疫エフェクター細胞の発生を調節するのを助ける。サイトカインは、標的細胞における遺伝子発現を最終的に変化させる機構を介して作用する免疫調節剤である。２種の免疫チェックポイント阻害剤とサイトカインとの組合せは、排他的な免疫学的薬剤を使用することによる免疫療法レジメンの範囲内にある。
今日までのがん免疫療法の多くの取り組みは、薬物の作用機序に焦点を当てており、がん抗原の放出及び提示のプロセス及び機序についてはあまり考慮されていない。がんワクチンは多くの場合、１種の抗原のみに対する攻撃によってもたらされる脅威に対してがんが適応する可能性を考慮せずに、単一の抗原に焦点を当てる。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のペイロード全体ががん細胞から放出されると、近傍の未熟な樹状細胞が活性化され、同じ抗原を発現する体内の他の場所にある無傷の他のがん細胞を同定するプロセスを開始し、続いてがんを取り囲んで破壊する細胞傷害性Ｔ細胞を動員することができる。
適応免疫系は、腫瘍拒絶の主要なメディエーターである一方で、ヒトがんの成長においても防御的な働きをする。その結果、免疫療法抗体を使用してＴReg細胞を不活性化し、この不活性化を延長させることによってこの応答を抑えるか又は鈍らせて、がん細胞の最大限の免疫破壊を可能にする取り組みが行われてきた。これは、細胞傷害性Ｔ細胞によるがん細胞破壊が早期に自己停止しないことを確実にする。しかし、これらの治療方法は、がん抗原のうちの１種のみに焦点を当てている。
がんの後期に診断された対象に加えて、限局性がんの一次療法に失敗した対象は進行する可能性があり、一部の場合には転移状態に達する。例えば、転移性前立腺がんの場合、アンドロゲン除去療法が標準的な処置であり、血清ＰＳＡレベル及びＸ線評価に基づいて、大多数の対象において一時的なコントロール又は退縮が達成される。しかし、転移性前立腺がんを有する多くの対象は、この療法を受けている間に最終的に疾患進行を来し、それによって転移性アンドロゲン非依存性前立腺がんの状態に達する。
いくつかの治療用がんワクチンが利用可能であるか、又は臨床試験で評価されており、これには、前立腺酸性ホスファターゼによるパルス刺激を受けた自己樹状細胞（Harzstark et al., “Immunotherapy for prostate cancer using antigen-loaded antigen-presenting cells: APC8015 (Provenge),” Expert Opin Biol Ther. 7(8):1275-1280 (2007)を参照）；ＧＭ－ＣＳＦを分泌するようにトランスフェクトされた全同種異系細胞株（Small et al., “Granulocyte macrophage colony-stimulating factor--secreting allogeneic cellular immunotherapy for hormone-refractory prostate cancer,” Clin Cancer Res. 13(13):3883-3891 (2007)を参照）；並びに前立腺特異抗原並びに３種の免疫共刺激分子、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７．１、及びリンパ球機能関連抗原－３を発現するように操作された組換え弱毒化ワクシニアウイルス（Doehn et al., “Drug evaluation: Therion's rV-PSA-TRICOM + rF-PSA-TRICOM prime-boost prostate cancer vaccine,” Curr Opin Mol Ther. 9(2):183-189 (2007)を参照）が含まれる。いくつかの治療用ワクチンのアプローチが考察されている（Sonpavde et al., “Vaccine therapy for prostate cancer. Urol Oncol. 25(6):451-459 (2007); Slovin, “Emerging role of immunotherapy in the management of prostate cancer,” Oncology (Williston Park) 21(3):326-333; discussion 334, 338, 346-348 (2004); Karnes et al., “Immunotherapy for prostate cancer,” Curr Pharm Des. 2(7):807-817 (2006); Ragde et al., “Dendritic cell based vaccines: progress in immunotherapy studies for prostate cancer,” J Urol. 172(6 Pt 2):2532-2538 (2004)を参照）。例えば、前立腺がんについて、シプロイセルＴ臨床試験では、投与前に成熟表現型を誘導するために、組換え抗原－それぞれＰＡＰ及びＰＳＭＡ－をロードした細胞性アジュバントとして樹状細胞を使用した。これら及び他の樹状細胞免疫療法試験からの結果、特異的免疫応答が得られ、平均４か月間の寿命延長がもたらされた（例えば、シプロイセルＴについて）。しかし、これらの療法は、典型的には１００，０００ドルを超える費用がかかり、患者は依然としてその後間もなくして死亡する可能性がある。これらの知見は、現在の免疫療法処置が、患者の大部分にとっては限られた価値しかないことを示す。
がんワクチンには、抗原認識及びＴ細胞活性化を強化するために、アジュバント又は他のモダリティが添加されており、これらは以下のうちの１種又は複数を含み得る：１）細胞ベースのワクチンの遺伝的又は化学的改変；２）樹状細胞を関与させることによる腫瘍関連抗原のＴ細胞への交差プライミング；３）Ｔ細胞養子療法；４）非特異的免疫調節剤、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、サイトカイン、ケモカイン又はホルモンによる細胞傷害性炎症の刺激；５）抗体、小分子を使用した免疫抑制の低減及び／又は抗腫瘍エフェクター細胞の刺激；並びに６）化学療法を含む様々な細胞増殖抑制性又は細胞減少性モダリティ。しかし、がんワクチンをこれらのモダリティと組み合わせる現在の技術は、その完全な臨床的可能性に達しておらず、その理由は少なくとも一部には、その毒性、並びに腫瘍微小環境において免疫認識を能動的にオフにし、及び／又はエフェクターＴ細胞を無効にする既存の寛容機構のために、対象において顕著な抗がん応答を開始させることが困難であることによる。
したがって、従来の全身性がん処置に伴う毒性を減少させるだけでなく、がんの処置の向上のために最適ながん免疫応答をももたらす改善された方法を開発する必要性が、当技術分野には依然として存在する。本開示はこの需要に応える。
本発明の一態様は、ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとを含む治療用組成物に関する。治療用組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
本発明の別の態様は、腫瘍又はがんを処置する方法であって、ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとを含む治療用組成物を、腫瘍又はがんを処置するのに有効な量で、対象に投与することを含む方法に関する。
本発明の更なる態様、利点及び特徴は、本明細書に記載されており、一部は、以下の検討によって当業者に明らかになるか、又は本発明の実施によって学ぶことができると考えられる。本出願に開示される発明は、態様、利点及び特徴のいかなる特定のセット又は組合せにも限定されない。記載される態様、利点及び特徴の様々な組合せが、本出願に開示される発明を構成すると想定される。
本開示は、少なくとも一部には、腫瘍指向性の免疫学的がん処置と、操作手法などのエクスビボ処置によって調製されたがんワクチンとの組合せによって、がん免疫応答を誘発するための新たな組成物及び方法の開発に基づく。
本発明者らは、エクスビボで作出された（例えば、ＵＶ照射及び／又は他の操作を介して）がんワクチン（例えば、自己由来）を、複数のチェックポイント阻害剤及びサイトカイン又は低用量化学療法薬と組み合わせることで、拮抗的相互作用及び有害事象を最小限に抑えながら、全身がん死滅の相加的又は相乗的機構を利用するアプローチを発見した。本発明に記載される治療用組成物及び処置方法は、細胞破壊の必要性と抗原の構造的保存及び放出の必要性とのバランスをとるために、壊死及びネクロトーシスの誘導を注意深く制御しながら無数の抗原を放出させることによって、特定の患者のがん全体に存在するがん抗原の１種だけではなくすべてを利用することができる（個別化されたがん処置）。
「エクスビボ」という用語は、がん標本の処置（例えば、照射も含んでよい１種又は複数の操作による）が、「天然の」環境を変化させることを代償にして、インビボ処置（患者における）で可能であるよりも制御された条件下で、患者の体外で行われることを意味する。エクスビボ組織又は細胞を使用することの主な利点は、そうでなければ生きている対象において複雑で危険（例えば、重要構造物の損傷及び脊髄又は全身麻酔への曝露）と考えられる処置（例えば、操作／照射）又は試験を行うことができることである。組織又は細胞は、部分的に、全臓器として、又はより大きな臓器系としてのものを含む、多くの方法で取り出すことができる。
組織標本から得られたがんのエクスビボ処置、及びエクスビボで作出されたそのようながんワクチンのその後の投与は、抗がん薬の従来の全身送達を上回る有意な利点を有し得る。本明細書に開示される治療用組成物及び処置方法は、従来の用量よりも少ない用量を対象に投与すること（例えば、治療用組成物が皮膚に直接投与される実施形態において）、腫瘍抗原に対する免疫系の刺激、並びに薬物及び腫瘍抗原を免疫炎症過程に近接して配置することによる改善された結果を可能にすることができる。エクスビボ処置は、処置中の全身性（全身）麻酔の必要性を回避することができ、患者と接触して使用される凍結手術用又は他の操作用機器などの処置機器の必要性を回避することができ（それによって、操作により誘発されるリスクを低下させる）、各処置に必要とされる時間の長さを減少させることができる。
これに比較して、マイクロ波及びＨＩＦＵ（高密度焦点式超音波）などの熱を使用する細胞破壊の他の多くの方法は、抗原性タンパク質を変性させ、抗原をその天然の状態から変化させて、それらが他のがん細胞上のがん抗原標的に対する正確なシグナルとして作用することができないようにする。
本明細書に記載される治療用組成物及び処置方法によって提供される抗原の取扱いにおけるこの差異は、抗原が変性することなく十分に曝露されて保存されることを確実にすることができ、転移部位で同定し得る患者特異的及びがん特異的抗原による未熟樹状細胞の標的化及び活性化を可能にする。
本発明者らは、驚いたことに、免疫チェックポイント阻害剤、サイトカイン又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、及びエクスビボ処置されたがん（組織標本、例えば、生検、切除、吸引などから得られる）に由来するがんワクチンの組合せを使用することによって、処置方法が、少なくとも以下を含む利点を提供することを発見した：（１）エクスビボ処置と組み合わせた多重併用免疫療法の軟部組織注射は、低用量（従来の用量よりも低い）免疫療法を可能にする；（２）低用量免疫療法の副作用プロファイルは、従来の投薬よりも好ましく、患者が曝されるリスクもより少ない；（３）熱破壊を全く又は最小限にしか使用しない（例えば、熱操作を全く又は最小限にしか使用しない）ことによってがんネオ抗原が保たれる；並びに（４）従来のインビボ処置（例えば、インビボ操作ではなくエクスビボ操作）よりも低い合併症及びリスク。
更に、本明細書に記載されるアプローチは、以下を可能にする点で有益である。
・患者特異的及びがん特異的抗原の全範囲、又は少なくともより広い範囲が免疫系に曝露されることを確実にすることができる。これは、患者のがんによって発現される場合とされない場合がある単一の所定のがん抗原を認識する現在のがんワクチン（例えば、前立腺がんに対するプロベンジ）とは異なる。
・これらのタンパク質を著しく変性させることなく壊死及びネクロトーシスを誘導する特殊な方法を使用することによって（変性した場合、それらは同様には機能しないため）、曝露される腫瘍抗原の量及び質を最大化するか、又は少なくとも増加させることができ、免疫系樹状細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の出入りを可能にする血管構造を保つことができる；
・炎症環境と組み合わせて、壊死又はネクロトーシスによって誘導されるがん溶解物中の天然範囲の共刺激物質を利用することができる；
・がん溶解物及び薬物を皮内又は腫瘍内に注射することによって、腫瘍抗原及び炎症性免疫プロセスの近接性を作出することができる；
・１つ又は少数の予め選択された抗原に焦点を当てるのではなく、がん細胞を破壊して、がん特異的抗原の全レパートリー又は少なくとも多数を放出させることによって、標的化された個別化ワクチンを可能にすることができる。
一態様では、本開示は、ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、がん細胞を死滅させる（例えば、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出する）エクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとの組合せを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、腫瘍又はがんの処置のための治療用組成物を提供する。治療組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞及び一部のがん細胞などのいくつかのタイプの免疫系細胞によって作られる特定のタンパク質を遮断する薬物の一種である。これらのタンパク質は、免疫応答を抑制するのに役立ち、Ｔ細胞ががん細胞を死滅させないように保つことができる。これらのタンパク質が遮断されると、免疫系の「ブレーキ」が解除され、Ｔ細胞はがん細胞をより存分に死滅させることができるようになる。したがって、チェックポイント阻害剤は、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃するように作用し、免疫系をダウンレギュレートすることに関与する免疫応答タンパク質を阻害する。そのようなチェックポイント阻害剤には、小分子阻害剤が含まれることもあれば、又は免疫チェックポイント受容体に結合して遮断若しくは阻害する抗体若しくはその抗原結合断片、又は免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断若しくは阻害する抗体が含まれることもある。
例えば、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４は、独立した分子機構を介してＴ細胞活性を減衰させる。Das et al., "Early B cell changes predict autoimmunity following combination immune checkpoint blockade." J Clin Invest. 128(2):715-720 (2018); Das et al., "Combination therapy with anti-CTLA-4 and anti-PD-1 leads to distinct immunologic changes in vivo." J Immunol. 194(3):950-959 (2015)を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。チェックポイント阻害剤併用下での遮断の利益の強化は、各単剤療法の細胞機構及び分子機構の相加的な関与よりも、構成要素である単剤療法とは異なる複数の機構によって媒介される可能性が高い。Wei et al., "Fundamental Mechanisms of Immune Checkpoint Blockade Therapy. Cancer Discov." 8(9):1069-1086 (2018)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。生理的レベルを超える遮断による正の共刺激は、標準的なＴ細胞集団によっては示されない強化された細胞溶解能力又は新規な特性の獲得を促進し、有効性の強化をもたらすことが可能である。ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４遮断のいくつかの既知の分子機構のそれぞれについて、治療有効性に対する相対的な寄与はほとんど知られていない。併用チェックポイント阻害剤遮断療法は、前臨床試験及び臨床試験のいずれにおいても、単剤療法と比較して治療効果を改善することができる。Curran et al., “PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors.” Proc Natl Acad Sci U S A. 107(9):4275-4280 (2010); Postow et al., “Immunologic correlates of the abscopal effect in a patient with melanoma.” New England Journal of Medicine. 366(10):925-931 (2012); Wolchok et al., “Ipilimumab monotherapy in patients with pretreated advanced melanoma: a randomised, double-blind, multicentre, phase 2, dose-ranging study.” Lancet Oncol. 11(2):155-164 (2010)を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４遮断による併用療法によって処置された転移性黒色腫の患者は、３６％の奏効、一部の事例では５０％を上回る奏効を達成することができ、５７％の３年全生存率を達成する可能性がある。Larkin et al., “Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma.” N Engl J Med. 373(1):23-34 (2015)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。併用療法はまた、標準治療と比較した場合、転移性腎細胞がんにおいて全生存期間の利点を生じさせる可能性もある。Motzer et al., “Nivolumab plus Ipilimumab versus Sunitinib in Advanced Renal-Cell Carcinoma.” N Engl J Med. 378(14):1277-1290 (2018)を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
チェックポイント阻害剤は、阻害剤、例えば、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）；ＣＤ１３４；ＰＤ－１；ＫＩＲ；ＬＡＧ－３；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤＬ２；ＣＴＬＡ－４；Ｂ７ファミリーリガンド、例えば、Ｂ７．１（又はＣＤ８０）又はＢ７．２（又はＣＤ８６）、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３（又はＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６及びＢ７－Ｈ７；ＢＴＬＡ（又はＣＤ２７２）；ＬＩＧＨＴ；ＨＶＥＭ；ＧＡＬ９；ＴＩＭ－３；ＴＩＧＨＴ；ＶＩＳＴＡ；２Ｂ４；ＣＧＥＮ－１５０４９；ＣＨＫ１；ＣＨＫ２；Ａ２ａＲ；ＴＧＦ－β；ＰＩ３Ｋγ；ＧＩＴＲ；ＩＣＯＳ；ＩＤＯ；ＴＬＲ；ＩＬ－２Ｒ；ＩＬ－１０；ＰＶＲＩＧ（Ｂ７／ＣＤ２８）；ＣＣＲＹ；ＯＸ－４０；ＣＤ１６０；ＣＤ２０；ＣＤ５２；ＣＤ４７；ＣＤ７３；ＣＤ２７－ＣＤ７０；及びＣＤ４０の阻害剤を含む。
好適なＣＤ１３７（４－１ＢＢ）阻害剤としては、ウトミルマブ、ウレルマブ、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＤ１３４阻害剤又はＯＸ４０阻害剤としては、ＯＸ４０－免疫グロブリン（ＯＸ４０－Ｉｇ）、ＧＳＫ３１７４９９８（抗ＯＸ４０抗体）、９Ｂ１２、ＭＯＸＲ ０９１６、ＰＦ－０４５１８６００（ＰＦ－８６００）、ＭＥＤＩ６３８３、ＭＥＤＩ０５６２、ＩＮＣＡＧＮ０１９４９、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＫＩＲ阻害剤としては、ＩＰＨ４１０２、１－７Ｆ９（ＫＩＲ２ＤＬ１／２Ｌ３に結合するヒトモノクローナル抗体）、リリルマブ、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。好適なＬＡＧ－３阻害剤としては、レラトリマブ、ＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｎｔｅｐ（登録商標））、ＧＳＫ２８３１７８１（ＬＡＧ３に対するアゴニスト抗体）、ＢＭＳ－９８６０１６、ＬＡＧ５２５、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＴＬＡ－４阻害剤としては、イピリムマブ、トレメリムマブ、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＰＤ－１阻害剤としては、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＭＫ－３４７５、ＭＥＤ １４７３６（モノクローナル抗体）、ＣＴ－０１１、スパルタリズマブ、又はそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。好適なＰＤ－Ｌ１阻害剤又はＰＤ－Ｌ２阻害剤としては、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＡＭＰ２２４、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＢ７．１（又はＣＤ８０）阻害剤又はＢ７．２（又はＣＤ８６）阻害剤としては、ルデックス、アバタセプト、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＢ７－Ｈ３阻害剤としては、エノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）、ＭＧＤ００９、８Ｈ９（Ｂ７－Ｈ３に対するモノクローナル抗体）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＤ２０阻害剤としては、リツキシマブ、オファツムマブ、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＤ５２阻害剤としては、アレムツズマブが挙げられるが、これに限定されない。好適なＣＤ４７阻害剤としては、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、ＴＴＩ－６２１（ＳＩＲＰαＦｃ）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＤ７３阻害剤としては、ＭＥＤＩ９４４７が挙げられるが、これに限定されない。好適なＣＤ２７－ＣＤ７０阻害剤としては、ＡＲＧＸ－１１０、ＢＭＳ－９３６５６１（ＭＤＸ－１２０３）、バルリルマブ（ｖａｒｉｌｕｍａｂ）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＤ４０阻害剤としては、ＣＰ－８７０８９３、ＡＰＸ００５Ｍ、ＡＤＣ－１０１３、ＪＮＪ－６４４５７１０７、ＳＥＡ－ＣＤ４０、ＲＯ７００９７８９、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
好適なＢＴＬＡ（又はＣＤ２７２）阻害剤としては、４０Ｅ４；４０Ｅ４ ｍＩｇＧ１；Ｄ２６５Ａ、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＬＩＧＨＴ（又はＣＤ２７２）阻害剤としては、Ｔ５－３９；１７－２５８９－４２（ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）モノクローナル抗体）、ＴＮＦＳＦ１４、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＨＶＥＭ阻害剤としては、抗ＣＤ２７０が挙げられるが、これに限定されない。好適なＴＩＭ－３阻害剤としては、ＭＢＧ４５３、ＭＥＤＩ９４４７、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＴＩＧＨＴ阻害剤としては、ＯＭＰ－３１Ｍ３２が挙げられるが、これに限定されない。好適なＶＩＳＴＡ阻害剤としては、ＪＮＪ－６１６１０５８８、ＣＡ－１７０、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＣＧＥＮ－１５０４９阻害剤としては、抗ＣＧＥＮ－１５０４９が挙げられるが、これに限定されない。好適なＡ２ａＲ阻害剤としては、ＣＰＩ－４４４が挙げられるが、これらに限定されない。好適なＴＧＦ－β阻害剤としては、トラベデルセン（ＡＰ１２００９）、Ｍ７８２４、ガルニセルチブ（ｇａｌｕｓｅｒｔｉｎｉｂ）（ＬＹ２１５７２９９）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＰＩ３Ｋγ阻害剤としては、ＩＰＩ－５４９が挙げられるが、これに限定されない。好適なＧＩＴＲ阻害剤としては、ＴＲＸ－５１８、ＢＭＳ－９８６１５６、ＡＭＧ ２２８、ＭＥＤＩ１８７３、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＫ－４１６６、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＧＷＮ３２３、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＩＣＯＳ阻害剤としては、ＪＴＸ－２０１１、ＧＳＫ３３５９６０９、ＭＥＤＩ－５７０、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＩＤＯ阻害剤としては、ＢＭＳ－９８６２０５、インドキシモド、エパカドスタット、又はこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＴＬＲ阻害剤としては、ＭＥＤＩ９１９７、ＰＧ５４５（ピキサチモド、ｐＩＮＮ）、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸ポリリジン、カルボキシメチルセルロース（ポリ－ＩＣＬＣ）、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好適なＩＬ－２Ｒ阻害剤としては、ＮＫＴＲ－２１４が挙げられるが、これに限定されない。好適なＩＬ－１０阻害剤としては、ＡＭ００１０が挙げられるが、これに限定されない。好適なＰＶＲＩＧ（Ｂ７／ＣＤ２８）阻害剤としては、ＣＯＭ７０１が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用するために好適な更なるチェックポイント阻害剤には、Marin-Acevedo et al., “Next generation of immune checkpoint therapy in cancer: new developments and challenges,” Journal of Hematology & Oncology 11:39 (2018)に記載されているものも含まれ、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
治療用組成物は、２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤の任意の組合せを含むことができる。それらは同じタイプのチェックポイント阻害剤でもよく、又は異なるチェックポイント阻害剤であってもよい。一部の実施形態では、少なくとも２種のチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤及びＰＤ－１阻害剤を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種のチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤はイピリムマブであり、ＰＤ－１阻害剤はペムブロリズマブである。
熟練の専門家は、チェックポイント阻害剤の多くの他の組合せも治療用組成物に好適であることを理解するであろう。組合せの非限定的なリストには、ＣＤ１３７阻害剤及びＣＤ１３４阻害剤；ＰＤ－１阻害剤及びＫＩＲ阻害剤；ＬＡＤ－３阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤；ＣＴＬＡ－４阻害剤及びＣＤ４０阻害剤；ＣＤ１３４阻害剤及びＰＤ－１阻害剤；ＫＩＲ阻害剤及びＬＡＧ－３阻害剤；ＰＤ－Ｌ１阻害剤及びＣＴＬＡ－４阻害剤；ＣＤ４０阻害剤及びＣＤ１３７阻害剤；ＣＴＬＡ－４阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤；ＰＤ－１阻害剤及びＣＤ４０阻害剤；又は当技術分野で公知のチェックポイント阻害剤のうちの２種又はそれ以上の任意の他の組合せが含まれる。
治療用組成物はまた、サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物も含むことができる。
薬物は、サイトカイン薬であり得る。「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達を媒介し、免疫、炎症及び造血を調節する免疫系の特定の細胞によって分泌され得る、細胞タンパク質構成成分又は薬物の大きなグループを指す。
好適なサイトカインとしては、エリスロポエチン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ、インターフェロン、例えば、ＩＮＦ－α－２ａ、ＩＮＦ－α－２ｂ、ＩＮＦ－β、及びＩＮＦ－γ、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、サイトカインはＧＭ－ＣＳＦである。
或いは、薬物は、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬でもあり得る。「細胞傷害性」又は「細胞増殖抑制性」という用語は、がん細胞の成長及び増殖の阻害を引き起こすか、又はがん細胞を死滅させることができる細胞構成成分又は薬物を指す。
好適な細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬としては、アクチノマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、カルメット・ゲラン桿菌ワクチン（ＢＣＧ）、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボツリヌス毒素（ボトックス）、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、酢酸セトロレリクス、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムフェニコール、塩酸クロルメチン、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、シクロスポリン、シドフォビル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クロラムブシル、コルヒチン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダナゾール、ダサチニブ、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキン、ジエンエストロール（ｄｉｅｎｏｓｔｒｏｌ）、ジエチルスチルベストロール、ジノプロストン、ジトラノール含有生成物、ドセタキセル、ドキソルビシン、デュタステリド、エピルビシン、エルゴメトリン／メチルエルゴメトリン、エストラジオール、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エストロゲン－プロゲスチン配合物、結合型エストロゲン、エステル化エストロゲン、エストロン、エストロピペート、エトポシド、エキセメスタン、フィナステリド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルベストラント、ガンシクロビル、ガニレリクス酢酸塩、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガミシン、ゴナドトロピン（ｇｏｎｄａｏｔｒｏｐｈｉｎ）、絨毛性ゴセレリン（ゾラデックス）、ヒドロキシカルバミド、イブリツモマブ・チウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシル酸塩、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロン含有生成物、イリノテカンＨＣｌ、レフルノミド、レトロゾール、酢酸リュープロレリン、ロムスチン、リンフォグロブリン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メノトロピン、メルカプトプリン、メスナ（ｍｅｓｅｎａ）、メトトレキサート、メチルテストステロン、ミフェプリストン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロンＨＣｌ、ミコフェノレート、モフェチル、ナファレリン、ナタリズマブ、ニルタミド、エストロゲン含有生成物、オキサリプラチン、オキシトシン（シントシノン及びシントメトリンを含む）、パクリタキセル、パラアルデヒド、ペグアスパルガーゼ、ペメトレキセド二ナトリウム、ペンタミジンイセチオン酸塩、ペントスタチン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピリトレキシムイセチオン酸塩、プリカマイシン、ポドフリロックス、ポドフィリン、ポドフィルム樹脂、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲステロン含有生成物、プロゲスチン、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、リバビリン、リツキシマブ、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリマス、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、サイモグロブリン、チオグアニン、トポテカン、トレミフェンクエン酸塩、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレオスルファン、トレチノイン、トリフルリジン、トリメトレキサートグルクロン酸塩（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ ｇｌｕｃｏｒｏｎａｔｅ）、トリプトレリン、ウラムスチン、ワクチン（生）、バルガンシクロビル、バルルビシン、ビダラビン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン酒石酸塩、ジドブジン、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬には、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、シクロホスファミド、ＢＣＧ、クロラムフェニコール、コルヒチン、シクロスポリン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカルバジン、リツキシマブ、テモゾロミド、チオテパ（ｔｈｉｔｅｐａ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ジドブジン、及びそれらの組合せがある。一実施形態では、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬は、シクロホスファミドである。
２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤とサイトカインとの組合せは、２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤と化学療法剤（細胞増殖抑制性又は細胞傷害性）、例えば、シクロホスファミドとの組合せとは異なる。２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤と化学療法剤（細胞増殖抑制性又は細胞傷害性）との組合せは、２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤と別の免疫療法剤、例えば、サイトカインとの組合せとは異なる。基本的に、後者の組合せの多剤併用における薬物クラス及び作用機序は、前者の組合せのものとは異なる。特に、化学療法剤は通常、代謝拮抗物質であり、タンパク薬物ではなく合成薬物であるのに対して、サイトカインは天然に存在するタンパクであり、生物製剤と考えられる。これらの薬剤の両方のクラスは、免疫系に対して多面的な作用を及ぼすが、作用のレパートリー及びこれらの作用を誘導する作用の機序は、これらの２種の異なるクラスの薬剤について著しく異なる。更に、サイトカインの抑制（サイトカインシグナル伝達タンパク質のサプレッサー）の機構は、化学療法薬のものとは異なる。
サイトカインは、いくつかの刺激に応答して免疫系の細胞又は非免疫細胞（例えば、上皮細胞）によって通常分泌される低分子量の調節タンパク質又は糖タンパク質であり、免疫エフェクター細胞の発生の調節を助ける。サイトカインは、標的細胞の膜上の特異的受容体に結合し、標的細胞における遺伝子発現を最終的に変化させるシグナル伝達経路を誘発する。サイトカインの作用は、広範囲にわたる生物プロセスに関与している。
一方、化学療法剤は、免疫原性細胞死を直接的又は間接的に誘導することによってがん免疫を促進することができる。化学療法の直接的な作用には、ネクロトーシス又はオートファジーの誘導が含まれる。間接的な作用には、細胞シグナル伝達経路を変化させること、免疫調節を回避するためにがんが使用する取り組みを妨害すること（Emens et al., “Chemotherapy: friend or foe to cancer vaccines?” Curr Opin Mol Ther. 3(1):77-84 (2001)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）；がんネオ抗原及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出及び提示強化、例えば、ＣＸＣＬ８によるケモカインシグナル伝達が、カルレティキュリンを細胞表面に露出させることによって、樹状細胞の同定及び損傷したがん細胞の消費を刺激する場合（Sukkurwala et al., “Immunogenic calreticulin exposure occurs through a phylogenetically conserved stress pathway involving the chemokine CXCL8.” Cell Death Differ. 21(1):59-68 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）；ＭＨＣクラス１発現、Ｂ７－１などの共刺激分子、若しくはがんネオ抗原自体をアップレギュレートすること；又はＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１若しくはＢ７－Ｈ４などの共抑制分子をダウンレギュレートすることによるエフェクターＴ細胞活性の強化（Chen et al., “Chemoimmunotherapy: reengineering tumor immunity.” Cancer Immunol Immunother. 62:203-216 (2013)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。化学免疫療法により誘導されるＴ細胞媒介性のがん死滅は、ｆａｓ依存性、パーフォリン依存性、及びグランザイムＢ依存性の機構を含み得る。Chen et al., “Chemoimmunotherapy: reengineering tumor immunity.” Cancer Immunol Immunother. 62:203-216 (2013)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
細胞増殖抑制性及び細胞傷害性化学療法剤は単独で、免疫系に対して用量依存的な効果を示している。Emens, "Chemoimmunotherapy." Cancer J 16:295-303 (2010); Chen et al., "Chemoimmunotherapy: reengineering tumor immunity." Cancer Immunol Immunother 62:203-216 (2013)を参照されたく、これらはその全体が参照により組み込まれる。
化学療法剤は、直接的な細胞死滅のために必要とされるもより高い用量に伴う毒性を回避しながら、がん免疫を調節するために使用されてきた。この調節は、シクロホスファミド、パクリタキセル、シスプラチン、及びテモゾロミドなどのいくつかの化学療法剤で実証されている。例えば、シクロホスファミドは、例えば、Ｔｒｅｇを枯渇させることを含む、多面的な免疫調節特性を示している。Machiels et al., “Cyclophosphamide, doxorubicin, and paclitaxel enhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerized mice.” Cancer Res. 61(9):3689-3697 (2001)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。パクリタキセルなどのタキサンはまた、Ｔｒｅｇを枯渇させ、樹状細胞の成熟を促進し、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー表現型を２型から１型にシフトさせ、その結果、炎症誘発性サイトカインの分泌、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミング及び溶解活性の強化をもたらす。ドキソルビシンは腫瘍増殖を遅延させ、ワクチン活性を増強する可能性があるが、この免疫調節の機序は不明である。シクロホスファミドとドキソルビシンとの組合せも好ましい効果を示しており、Ｔｒｅｇの選択的な枯渇によって一部のがんマウスを治癒させ、高アビディティのがん特異的Ｔ細胞の動員を可能にする。ＨＥＲ２ｐ、ＧＭ－ＣＳＦを分泌する乳がんワクチンと、免疫調節用量のシクロホスファミド及びドキソルビシンとの組合せは、エフェクターＴ細胞に比してＣＤ４＋ Ｔｒｅｇを選択的に枯渇させて、エフェクターＴ細胞を活性化することができる。“Immediate versus deferred treatment for advanced prostatic cancer: initial results of the Medical Research Council Trial. The Medical Research Council Prostate Cancer Working Party Investigators Group.” Br J Urol. 79(2):235-246 (1997)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ゲムシタビンなどの他の化学療法剤もまた、アポトーシスの誘導、樹状細胞がん抗原提示の促進、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の交差プライミングの促進を含む、免疫系に対する効果を示している。Nowak et al., "Induction of tumor cell apoptosis in vivo increases tumor antigen cross-presentation, cross-priming rather than cross-tolerizing host tumor-specific CD8 T cells." J Immunol. 170(10):4905-4913 (2003)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤とサイトカイン又は化学療法剤（細胞増殖抑制性又は細胞傷害性）との組合せは、がん免疫ライフサイクルの他の非重複的な側面、例えば、新規分子、作用の組織部位、免疫細胞集団、及び生物学的プロセスを標的とすることによる利益を得る可能性がある。例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）由来の分子であるＶＩＳＴＡは、転移性前立腺がんを有する患者においてイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）処置後にＭ２マクロファージ上で主に発現される。Gao et al., “VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased after ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nat Med. 2017;23(5):551-555を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＶＩＳＴＡ及びＰＤ－１は、Ｔ細胞に対して非重複的な阻害作用を有する。Liu et al., “Immune-checkpoint proteins VISTA and PD-1 nonredundantly regulate murine T-cell responses." Proc Natl Acad Sci U S A. 112(21):6682-6687 (2015)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。別の例として、ゲムシタビンは、マウス膵臓がんモデルにおいて、Ｔ細胞輸送を増加させ、腫瘍細胞をＴ細胞媒介性溶解に対して感作させることによって、樹状細胞ベースのワクチンの有効性を強化することができる。Bauer et al., “Concomitant gemcitabine therapy negatively affects DC vaccine-induced CD8(+) T-cell and B-cell responses but improves clinical efficacy in a murine pancreatic carcinoma model.” Cancer Immunol Immunother. 63(4):321-333 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。転移性腎細胞がんの患者の第ＩＩ相臨床試験において、更なる例は、シクロホスファミド及びマルチペプチドワクチンＩＭＡ９０１の使用であり、これはマルチペプチド免疫応答を生じた患者において生存を改善することができ、このことは複数の抗原によって生じる多様な腫瘍特異的免疫応答を示唆する。Walter et al., “Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival.” Nat Med. 18(8):1254-1261 (2012)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
非小細胞肺がん及び黒色腫を有する患者における特定の試験で、化学療法とイピリムマブとの組合せが安全であり得ることが示されている（Weber et al. “Randomized phase I pharmacokinetic study of ipilimumab with or without one of two different chemotherapy regimens in patients with untreated advanced melanoma,” Cancer Immunology 13:7 (2013)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかし、高トランスアミナーゼ血症などの特定の有害作用の増加の報告もあり、これはおそらく静脈内投与による（Robert et al., “Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. New England Journal of Medicine 11;364(26):2517-26 (2011)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
用量、処置スケジュール、投与経路などの因子は、毒性を最小化することに寄与し得る。しかし、免疫チェックポイント遮断をサイトカイン又は低用量化学療法剤と組み合わせることの有効性に関するデータは非常に限られている。２種又はそれ以上のチェックポイント阻害剤とサイトカイン又は低用量化学療法剤（細胞傷害性又は細胞増殖抑制性）との組合せは、拮抗的相互作用及び有害事象を最小化しながら、全身性がん死滅の相加的又は相乗的機構を利用することができる。
一部の実施形態では、治療用組成物中の薬物は、サイトカインと細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬との組合せを含み得る。
一部の実施形態では、治療用組成物中の薬物は、サイトカイン薬を含み、治療用組成物は、第２のサイトカインを更に含み得る。第２のサイトカイン薬は、第１のサイトカイン薬と同じでもよく、又は異なってもよい。
一部の実施形態では、治療用組成物中の薬物は、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を含み、治療用組成物は、第２の細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を更に含み得る。第２の細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬は、第1の細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬と同じでもよく、又は異なってもよい。
免疫チェックポイント阻害剤は、治療組成物中に治療有効量で存在する。例えば、各免疫チェックポイント阻害剤の濃度は、約０．１～約５００ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．１～約３００ｍｇ／ｍｌ、約０．１～約２００ｍｇ／ｍｌ、約０．１～約１００ｍｇ／ｍｌ、約０．５～約１００ｍｇ／ｍｌ、約０．５～約５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５～約３０ｍｇ／ｍｌ、約０．５～約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５～約１０ｍｇ／ｍｌ、約１～約１０ｍｇ／ｍｌ、約１～約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１～約２ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。
サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法剤も、存在する場合には、治療組成物中に治療有効量で存在する。
例えば、各サイトカイン薬の濃度は、約１μｇ／ｍｌ～約１０００ｍｇ／ｍｌ、約１～約１０００ｍｇ／ｍｌ、約１～約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０～約５００ｍｇ／ｍｌ、約５０～約５００ｍｇ／ｍｌ、約１００～約５００ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌ、約１～約５００μｇ／ｍｌ、約１～約５００μｇ／ｍｌ、約１～約３００μｇ／ｍｌ、約１～約２００μｇ／ｍｌ、約１～約１００μｇ／ｍｌ、約１～約５０μｇ／ｍｌ、約１～約３０μｇ／ｍｌ、約１～約２０μｇ／ｍｌ、約５～約５０μｇ／ｍｌ、約５～約３０μｇ／ｍｌ、約５～約２０μｇ／ｍｌ、又は約５～約１０μｇ／ｍｌの範囲であり得る。一部の事例では、サイトカイン薬はＧＭ－ＣＳＦであり、組成物中のその濃度は約１００～約５００ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。
各細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬の濃度は、約１μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌ、約１～約５００μｇ／ｍｌ、約１～約５００μｇ／ｍｌ、約１～約３００μｇ／ｍｌ、約１～約２００μｇ／ｍｌ、約１～約１００μｇ／ｍｌ、約１～約５０μｇ／ｍｌ、約１～約３０μｇ／ｍｌ、約１～約２０μｇ／ｍｌ、約５～約５０μｇ／ｍｌ、約５～約３０μｇ／ｍｌ、約５～約２０μｇ／ｍｌ、又は約５～約１０μｇ／ｍｌの範囲であり得る。一部の事例では、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬はシクロホスファミドであり、組成物中のその濃度は、約１０～約５００μｇ／ｍｌの範囲であり得る。
一部の事例では、治療用組成物は、約０．５～１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ－４阻害剤、約０．５～２０ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＤ－１阻害剤、及びおよそ１～１０００ｍｇ／ｍｌ（例えば、１００～５００ｍｇ／ｍｌ）の濃度のサイトカイン薬又はおよそ１～１０００μｇ／ｍｌ（例えば、１０～５００μｇ／ｍｌ）の濃度の細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬のいずれかとを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。一部の事例では、組成物は、約１～２ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ－４阻害剤と、約１～１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＤ－１阻害剤と、約１０～約５００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２５０ｍｇ／ｍｌ）の濃度のサイトカイン薬又は約１０～約５００μｇ／ｍｌ（例えば、約２５０μｇ／ｍｌ）の濃度の細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬のいずれかとを含む。例えば、組成物は、約３．３ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ－４阻害剤と、約６．６ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＤ－１阻害剤と、約２５０ｍｇ／ｍｌの濃度のサイトカイン薬又は約１６．６μｇ／ｍｌの濃度の細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬のいずれかとを含み得る。一部の事例では、組成物は、約０．５～１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ－４阻害剤と、約０．５～２０ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＤ－１阻害剤と、約１００～約５００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２５０ｍｇ／ｍｌ）の濃度のＧＭ－ＣＳＦ又は約１０～約５００μｇ／ｍｌ（例えば、約２５０μｇ／ｍｌ）の濃度のシクロホスファミドのいずれかとを含む。一部の事例では、組成物は、少なくとも又はおよそ１５ｍｌの容量である。一部の事例では、組成物は、少なくとも又はおよそ１０ｍｌの容量である。一部の事例では、組成物は、およそ１．０ｍｌ未満の容量である。
少なくとも２種のチェックポイント阻害剤とサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬との組合せは、これらの免疫刺激性薬物が腫瘍内制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させる能力に対する相加作用又は相乗作用のために、少なくとも２種のチェックポイント阻害剤の組合せ（ただし、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法剤を含まない）よりも優れている。更に、効率的な全身適応性抗がん免疫応答の生成を、Ｔｒｅｇ枯渇と免疫原性腫瘍細胞死及び樹状細胞の活性化とを組み合わせた軟部組織（例えば、皮内、筋肉内など）免疫処置戦略によって達成することができる。従来より、チェックポイント阻害剤は静脈内投与されるが、これは、これらの殺細胞剤の体内での非特異的な分布の結果として、重篤で時には致死的な全身毒性を引き起こす可能性がある。これらの薬剤の非特異的な分布は、がん細胞及び正常細胞の両方を死滅させ、処置レジメン及び患者の転帰に悪影響を及ぼし得る。軟部組織注射方法は、軟部組織の微小環境に薬物を隔離し、正常な細胞及び組織を薬物の毒性から免れさせることによって、全身毒性を減少させ、副作用をより少なくすることができる（Marabelle et al., “Intratumoral Immunization: A New Paradigm for Cancer Therapy” Clin. Cancer Res. 20(7): 1747-56 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
複数の共刺激受容体及び共抑制（ｃｏｈｉｂｉｔｏｒｙ）受容体は、Ｔ細胞活性化の制御、増殖、及びＣＴＬＡ－４を含むエフェクター機能の獲得又は喪失に影響を及ぼす。ＣＴＬＡ４は、Ｂ７－１及びＢ７－２リガンドに結合し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化すること及び同時にＣＤ４＋ Ｔｒｅｇを枯渇させることによって抗がん活性を促進する。Selby et al., “Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells” Cancer Immunol Res 1:32-42; 2013を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの結果は、抗ＣＴＬＡ－４の局所低用量送達を用いたマウスモデルにおいて生じた全身性抗がん免疫応答を説明し得る。成立したマウス結腸がんの周囲に注射された低用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、がん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の直接的な強化によって、局所腫瘍を根絶し、注射されていない遠隔部位でのがんの発生を予防することができた（アブスコパル効果）。Fransen et al., “Controlled local deliver of CTLA-4 blocking antibody induces CD8+ T-cell-dependent tumor eradication and decreases risk of toxic side effects” Clin Cancer Res 19: 5381-9; 2013を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
更に、がん細胞及び免疫系の両方を標的とする手法を組み合わせることによって、本治療用組成物は、がんを阻害するだけでなく、有効な抗腫瘍免疫応答を誘発する上でもより有効となり得る。続いて、この抗腫瘍免疫応答は、転移部位を標的として、対象全体のがんを排除し得る。
本治療用組成物は、がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、がん細胞を死滅させる（例えば、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出する）エクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンを更に含む。
がんワクチンは、典型的には、ある種のがんに特異的な免疫応答を誘導して、そのがんの発症を処置又は予防するワクチンである。それらは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ベースのワクチンと樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンに分類することができる。腫瘍関連抗原ベースのワクチンは、免疫細胞を活性化するための腫瘍特異抗原を含有する。樹状細胞ベースのワクチンは、樹状細胞による抗原提示を促進して抗腫瘍応答を誘導することを目的とする。がんワクチンの非限定的な例には、腫瘍細胞ワクチン、抗原ワクチン、樹状細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、及びベクターベースのワクチンが含まれる。
がんワクチンは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は抗原性エピトープを提供することによって細胞性免疫応答のプライミングを行う。ＭＨＣ特異的な合成又はがん精製ペプチド、全タンパク質又は部分的タンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡプラスミド、組換えウイルス及び細菌ベクター、樹状細胞の直接的標的化又はエクスビボパルス刺激、並びにがん由来の全細胞溶解物、断片、アポトーシス小体、又はエキソソームの注射を含む、種々のワクチン送達プラットフォームが存在する。Patel et al., “Next generation approaches for tumor vaccination.” Chin Clin Oncol 6:19 (2017); Gonzalez et al., “Tumor cell lysates as immunogenic sources for cancer vaccine design. Hum Vaccin Immunother 10:3261 (2014)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。多くには、それらの臨床的有用性を妨げる限界がある。例えば、がんの根絶及び再発の予防には、広範囲のＴＡＡを標的とすることが必要であり、これは予め選択されたペプチド若しくはタンパク質、プラスミド、又は組換えベクターを使用する戦略の主な欠点である。樹状細胞ワクチン接種には、臨床グレードの樹状細胞のエクスビボ作製、及びその後のがん関連抗原又はがん細胞全体のローディングが必要であるが、これは、このアプローチの幅広い臨床適用を妨げてきた、費用及び時間がかかり、骨の折れるプロセスである。
抗原は、がんワクチンの免疫標的を構成する。がんを制御するために、ワクチンは、宿主免疫系を刺激して、臨床的に意味のあるがんの大きな沈着物を根絶する（又は阻止する）。ヒト対象に導入される抗原性物質は、アジュバントを含むか又は含まない「裸の」タンパク質若しくはペプチド、ウイルスベクターによって発現されてウイルス粒子として導入されるタンパク質、可能性のある広範囲の抗原を発現するがん全細胞若しくは溶解物、又は樹状細胞などの抗原提示細胞にローディングされた組換え若しくは自己タンパク質の形態をとり得る。
したがって、がんワクチンは、がん全細胞、細胞断片、組織断片、溶解物、アポトーシスブレブ若しくはエキソソームなどの細胞成分誘導体、又はそれらの組合せを使用して作製することができ、それらは新鮮なもの、照射されたもの、固定されたもの（例えば、ホルマリンで固定された、エタノールで固定された、又はグルタルアルデヒドで固定された）で、溶解物を作製するために操作されたものであり得る。
壊死性腫瘍細胞は、アジュバントを必要とせずにＤＣにおいて部分的成熟を誘導することが示されており、これはおそらく、処置後に死細胞から放出される大量の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０及び９０に起因する（Sauter et al., “Consequences of cell death: exposure to necrotic tumor cells, but not primary tissue cells or apoptotic cells, induces the maturation of immunostimulatory dendritic cells,” J Exp Med. 191(3):423-34 (2000); Somersan et al, “Primary tumor tissue lysates are enriched in heat shock proteins and induce the maturation of human dendritic cells,” J Immunol. 167(9):4844-52 (2001)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＨＳＰは、ＤＣ上に発現されるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）によって認識され、細胞内抗原のプロセシング及び提示を可能にする（Asea et al. “HSP70 stimulates cytokine production through a CD14-dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine,” Nat Med. 6(4):435-42 (2000)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。炎症誘発性因子の高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）もまた、壊死性細胞死の間に放出され、ＤＣ上のＴＬＲ４と相互作用し、抗原のプロセシング及び提示を刺激する（Scaffidi et al., “Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation,” Nature 418(6894):191-95 (2002); Apetoh et al., “Molecular interactions between dying tumor cells and the innate immune system determine the efficacy of conventional anticancer therapies,” Cancer Res. 68(11):4026-30 (2008)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４を連結することによってファゴソームとリソソームとの融合を遮断し、そうすることで抗原の分解を妨げ、抗原提示細胞へのそれらの輸送を助ける。ＨＭＧＢ１の中和又はノックダウン又はＴＬＲ４のノックアウトは、インビトロ及びインビボの両方で抗腫瘍応答を誘導する死滅しつつある腫瘍細胞の能力を消失させる。内因性の危険シグナルである尿酸は、損傷細胞又は死滅しつつある細胞におけるプリン分解後に蓄積し、ＤＣ成熟をも誘導し、それによってワクチン接種を強化する（Shi et al., “Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells,” Nature 425(6957):516-21 (2003)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
プログラム細胞死の複数の機構のうちの１つであるネクロトーシスは、混合系列キナーゼ様タンパク質（ＭＬＫＬ）を介した急速な膜透過化及びＲＩＰＫ１／ＲＩＰＫ３ネクロソーム複合体経路の活性化によって特徴付けられる。アポトーシスとは異なり、ネクロトーシスは、損傷関連膜タンパク質（ＤＡＭＰ）などの細胞内内容物の放出、炎症性ケモカイン及びサイトカインの産生、並びにＡＰＣによる抗原ローディングのＲＩＰＫ３促進に起因して、免疫応答を強く刺激する。マウスにおけるネクロトーシス細胞の腫瘍内注射は、ＣＤ８＋白血球依存性抗腫瘍免疫をもたらすことができる。
一実施形態では、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体は、新鮮な全細胞である。
腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体は、がんワクチンを調製する場合に、エクスビボで処置することができる。処置又は操作としては、がんの最大限の純度を確実にするための物理的若しくは化学的方法による非がん組織の除去；アポトーシス、ネクロトーシス、若しくは壊死の機構によって腫瘍関連抗原を放出及び曝露させて、注射されたワクチンが生存がん細胞を含有しないことを確実にするための操作若しくは細胞改変（例えば、照射、凍結外科的凍結、温熱療法、高周波操作など）；並びに／又はサイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）などの好ましい薬剤の産生を可能にするための遺伝子トランスフェクション（新鮮な試料においてのみ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体は、解離又は切離、固定、遠心分離、再懸濁、濃縮、他の操作、及びそれらの組合せなどの１つ又は複数の処置によって調製されたがん細胞溶解物である。
がんワクチンは、対象から取り出された実際のがん細胞から作製することができる。ひとたび取り出されると、がん細胞は、実験室において、例えば、壊死性がん細胞及びネクロトーシス性がん細胞を作出するためのエクスビボ処置によって改変することができ、その結果、それらはより多くの腫瘍を形成できなくなる。例えば、がん細胞は、化学物質又は新たな遺伝子を添加することによって改変することができ、これにより、細胞が免疫系によって異物として認められる可能性が高くなる。続いて、エクスビボ処置された細胞を対象に注射する。免疫系は、これらの細胞上の抗原を認識することができ、自然な生理的プロセスを介して、意図された抗原を発現する細胞を探し出し、攻撃して／死滅させる。
対象から取り出された生検又は吸引試料は、典型的には、がん細胞を高収率で確実に得るために切離及び濃縮され、続いて、ネクロトーシス性又は壊死性にされる。この方法により、破壊された膜の細胞断片、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラ、並びに細胞ＲＮＡ及びＤＮＡの粗混合物を含有する細胞材料が生じる。
一実施形態では、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体は、例えば、ホルマリン、エタノール、又はグルタルアルデヒドによって固定されたがん細胞溶解物である。更なる固定方法は、Wang, et al., “Protective antitumor immunity induced by tumor cell lysates conjugated with diphtheria toxin and adjuvant epitope in mouse breast tumor models” Chin J Cancer 31:295-305 (2012); Baogang et al., “Fixed-tumor vaccine: A practical formulation with cytokine-microspheres for protective and therapeutic antitumor immunity” Chinese-German Journal of Clinical Oncology 2:196-202 (2003)に見出すことができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、がんワクチンには、がん全細胞又は溶解物を使用する。がん全細胞又は溶解物の使用は、（１）すべての潜在的な腫瘍関連抗原を供給及び標的化すること；（２）抗原喪失を回避すること；（３）好ましい抗原の事前同定の必要性がなくなること；（４）ＨＬＡ型にかかわらず処置に適格なすべての対象を標的化すること；（５）細胞内及び／又は細胞膜上に発現される抗原エピトープは可溶性非結合形態にある同じペプチドよりも高い免疫原性を誘導するためにＭＨＣ依存性免疫刺激を生じる可能性がより高いことを含めて、免疫原性を改善すること；（６）抗原的に多様な細胞を含有する組織学的に同一な腫瘍由来の抗原を確実に含められること；並びに（７）免疫細胞上のＬＯＸ－１、ＣＤ３６、及びＭＡＲＣＯなどの多くのタイプのスカベンジャー受容体、並びにおそらくはＴｏｌｌ様受容体に同時に関与して活性化することができる、タンパク質、脂質、及び糖タンパク質を含む抗原及び生体分子を豊富に提供することを含む、複数の利点を提供する。Chiang et al., “Whole Tumor Antigen Vaccines: Where Are We? Vaccines” (Basel) 3:344 (2015); Seledtsov et al., “Clinically feasible approaches to potentiating cancer cell-based immunotherapies.” Hum Vaccin Immunother 11:851 (2015)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
がんワクチンは、自己由来又は同種異系であり得る。
一実施形態では、がんワクチンは同種異系であり、すなわち、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体は、患者と同じ種の別のメンバーに由来する材料から作出される。換言すれば、がん細胞を対象から採取し、改変し、続いて第２の異なる対象に注入して戻す。一般的に使用される同種異系材料には、特定の腫瘍タイプのＴＡＡを発現することが知られている、樹立された実験室で増殖させたがん細胞株の使用が含まれる。
一実施形態では、がんワクチンは自己由来であり、すなわち、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体は、患者の腫瘍又はがんに由来する材料から作出される。換言すれば、がん細胞を対象から採取して、改変し、続いて同じ対象に注射して戻す。
自己由来ワクチンは、同種異系ワクチンと比較した場合に優れた生存性を提供し得る（Dillman et al., “Randomized phase II trial of autologous dendritic cell vaccines versus autologous tumor cell vaccines in metastatic melanoma: 5-year follow up and additional analyses.” J Immunother Cancer 6:19 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。自己由来細胞の使用により、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をプライミングするための多数の抗原エピトープを含有する多価患者特異的ワクチン処置を効果的に送達し、それにより、個人用のがんワクチンを作出することができる。例えば、卵巣がんの臨床試験では、樹状細胞にローディングするための抗原供給源としてがん溶解物全体を首尾良く利用しており、ワクチンは安全で実施可能であり、細胞性及び体液性免疫応答の両方を生じさせることが示されている。ヒトの黒色腫、神経膠腫、腎細胞がん、前立腺がん、及び膵臓がんにおける他の試験では、照射及び／又は凍結操作された同種異系又は自己由来腫瘍細胞をアジュバントタンパク質と組み合わせて使用し、顕著な毒性を伴わない中程度の奏効がもたらされた。Furukawa et al., “A practical approach to pancreatic cancer immunotherapy using resected tumor lysate vaccines processed to express alpha-gal epitopes” PLoS One 12: e0184901 (2017); Plautz et al., “T cell adoptive immunotherapy of newly diagnosed gliomas” Clin Cancer Res 6:2209-2218 (2000); Mehrotra et al., “Vaccination with poly(IC:LC) and peptide-pulsed autologous dendritic cells in patients with pancreatic cancer” J Hematol Oncol 10:82 (2017); Simons et al., “Induction of immunity to prostate cancer antigens: results of a clinical trial of vaccination with irradiated autologous prostate tumor cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor using ex vivo gene transfer” Cancer Res 59:5160-68 (1999); Jocham et al., “Adjuvant autologous renal tumour cell vaccine and risk of tumour progression in patients with renal-cell carcinoma after radical nephrectomy: phase III, randomised controlled trial. Lancet 363:594-99 (2004)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
胸水から採取された進行性非小細胞肺がん細胞から作製された自己由来ワクチンは、皮内投与して、顕著な免疫毒性を伴わずにＴＡＡに対する特異的抗体応答を生じさせることができる（Sanborn et al., “A pilot study of an autologous tumor-derived autophagosome vaccine with docetaxel in patients with stage IV non-small cell lung cancer” J Immunother Cancer 5:103 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ユーイング肉腫に対する自己由来皮内がんワクチンは、低い許容可能な有害事象レベル（グレード３を超える毒性なし）で生存上の利益を提供することができる（Ghisoli et al., “Three-year Follow up of GMCSF/bi-shRNA(furin) DNA-transfected Autologous Tumor Immunotherapy (Vigil) in Metastatic Advanced Ewing's Sarcoma” Mol Ther 24:1478-83 (2016)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、がんワクチンは自己由来であり、ホルマリン固定などの固定によって調製される。
自己由来ホルマリン固定腫瘍ワクチン（ＡＦＴＶ）は、患者自身の外科的に摘出されたパラフィン包埋がん組織から受注生産され、皮内注射されて、個別化された腫瘍関連抗原の好都合な供給源となる。Ishikawa et al., “Prospect of Immunotherapy for Glioblastoma: Tumor Vaccine, Immune Checkpoint Inhibitors and Combination Therapy” Neurol Med Chir (Tokyo) 57: 321-330; 2017を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ホルマリン固定は、がん細胞の抗原性を保ち、保存された外科的組織を使用して抗腫瘍免疫応答を生じさせることを可能にする。がん特異的な自己由来細胞傷害性Ｔ細胞は、培養細胞によって誘導されるものに匹敵する活性及び特異性を有するホルマリン固定切片の注射によって作製することができる。Liu et al., “Induction of human autologous cytotoxic T lymphocytes on formalin-fixed and paraffin-embedded tumour sections” Nat Med 1995;1: 267-271, 1995を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＦＴＶは、自己由来がんが多様な未同定の患者特異的抗原の供給源として機能するという点で、ペプチドなどの所定の分子標的剤から作製されるワクチンとは異なる。したがって、ＡＦＴＶで誘導された細胞傷害性Ｔ細胞及び樹状細胞は、本質的にポリクローナル性であり、ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）（例えば、肝細胞がんにおいて高い頻度で発現されるタンパク質であるグリピカン－３）に対する特異的な細胞性免疫応答をもたらす。Kawashima et al., “Suppression of postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma treated with autologous formalin-fixed tumor vaccine, with special reference to glypican-3” Clin Case Rep 3: 444-447, 2015を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＦＴＶは、白血球及びリンパ球、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の数、ＣＤ４＋ Ｔ細胞中のＴｈ１の割合、並びにＴｈ１と制御性Ｔ細胞との比を高めることができる。Kuranishi et al., “Rate of Clinical Complete Response for 1 Year or More in Bone-Metastatic Breast Cancer after Comprehensive Treatments including Autologous Formalin-Fixed Tumor Vaccine” Int J Breast Cancer 4879406, 2018を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＦＴＶはまた、他のワクチンよりも調製及び取扱いが容易で安価であり、外来診療所ベースの処置を容易にする。ＡＦＴＶの有効性は、げっ歯類の脳腫瘍及びマウスの肝臓がんにおいて前臨床で実証されており、乳がん、多形性膠芽腫、肝細胞がん、悪性線維性組織球腫、再発腹膜漿液性がん、子宮頸部小細胞がん、上部尿路上皮がん、胆管細胞がん及び結腸がんの患者において臨床的に確認されている。
しかし、ＡＦＴＶ免疫療法は、生検などの組織供給源が少量のがん組織を含有する場合に限定されてきた。また、不均一ながん又は豊富な良性細胞の混合物が存在する場合には、最小限の量のがん抗原が各ワクチンに確実に含まれるようにするための改変が必要である。
本発明の一部の実施形態では、がんワクチンに自己由来ホルマリン固定腫瘍ワクチンを使用する場合、ＡＦＴＶ供給源は、悪性細胞のみではないとしてもそれを大部分として含み、可能な限り標的がん全体を代表するものであるべきである。
がんワクチンには、抗原認識及びＴ細胞活性化を強化するために、他のアジュバント又はモダリティがしばしば添加され、これには以下が含まれる：１）細胞ベースのワクチンの遺伝的又は化学的改変；２）樹状細胞を関与させることによる腫瘍関連抗原のＴ細胞への交差プライミング；３）Ｔ細胞養子療法；４）非特異的免疫調節剤、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、サイトカイン、ケモカイン又はホルモンによる細胞傷害性炎症の刺激；５）抗体、小分子を使用した免疫抑制の低減及び／又は抗腫瘍エフェクター細胞の刺激；並びに６）化学療法を含む様々な細胞増殖抑制性又は細胞減少性モダリティ。Patel et al., “Next generation approaches for tumor vaccination.” Chin Clin Oncol 6:19 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ワクチンを免疫調節剤と組み合わせることで結果は改善されるが、それらの完全な臨床的可能性は達成されておらず、これはおそらく、腫瘍微小環境において免疫認識を能動的にオフにし、及び／又はエフェクターＴ細胞を無効にする既存の寛容機構のために、対象において顕著な抗がん応答を開始することが困難であるためである。Chiang et al., “Whole Tumor Antigen Vaccines: Where Are We? Vaccines” (Basel) 3:344 (2015); Seledtsov et al., “Clinically feasible approaches to potentiating cancer cell-based immunotherapies.” Hum Vaccin Immunother 11:851 (2015); Godoy-Calderon et al., “Autologous tumor cells/bacillus Calmette-Guerin/formalin-based novel breast cancer vaccine induces an immune antitumor response” Oncotarget 9: 20222-38 (2018)を参照されたく、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、がん溶解物は、元の出発組織から作出することができ、約１００万～約１０億個のがん細胞の全細胞又はそれらの誘導体を含む。溶解物は、約０．１～約１０ｍｌ、又は約０．２５～約５ｍｌの累積容量で送達することができる。溶解物は、同時に複数の部位に送達することができる。
一部の事例では、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれらの誘導体を調製するためのエクスビボ処置は、エクスビボ照射及び／又は操作のうちの１種又は複数の工程を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。
本明細書で使用される「操作」又は「操作すること」という用語は、細胞を損傷させるか又は破壊するための低侵襲外科的方法を指し、「アブレーション」又は「アブレーションをすること」という用語と互換的であり得る。
本明細書で使用される「凍結外科的凍結」という用語は、凍結温度を使用してがん細胞又は組織を破壊するプロセスを指し、「冷凍アブレーション」又は「冷凍アブレーションをすること」という用語と互換的であり得る。
エクスビボ照射及び／又は操作は、当技術分野で公知の様々な照射及び／若しくは操作方法又はそれらの組合せを使用することによって行うことができる。
好適な操作方法には、凍結外科的凍結などの低温操作；高周波（ＲＦ）操作、マイクロ波操作、レーザー、光、若しくはプラズマ操作、超音波操作、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）操作、若しくはスチーム操作などの熱的操作；可逆的エレクトロポレーション（ＲＥ）、非可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）、高周波電気的膜破壊（ＲＦ－ＥＭＢ）、ＲＦ－ＥＭＢ型操作、超短電気パルスによる操作などの電気的操作；光線力学的療法を使用する操作；非熱的衝撃波、キャビテーション、若しくは細胞破壊をもたらす他の機械的物理的手段を使用する操作などの機械的若しくは物理的操作；化学物質、例えば、アルコール、高張食塩水、酢酸などの注射による操作などの化学的操作；腫瘍溶解性ウイルスなどの生物製剤による操作；又はそれらの任意の組合せが含まれる。
好適な照射又は放射方法としては、レーザー放射（例えば、紫外線又は近赤外線レーザー放射）、Ｘ線放射、又はガンマ線放射が挙げられるが、これらに限定されない。好適な放射は、固体及び液体の両方を含む。例えば、放射線源は、固体線源としてのＩ－１２５、Ｉ－１３１、Ｙｂ－１６９、Ｉｒ－１９２、固体線源としてのＩ－１２５、又は光子、ベータ粒子、ガンマ線照射、若しくは他の治療用照射線を放出する他の放射性核種などの放射性核種であり得る。放射性物質はまた、放射性核種の任意の溶液、例えば、Ｉ－１２５若しくはＩ－１３１の溶液から作製された流体であり得るか、又は放射性流体は、Ａｕ－１９８、Ｙ－９０などの固体放射性核種の小粒子を含有する好適な流体のスラリーを使用して作製することができる。更に、放射性核種は、ゲル又は放射性マイクロスフェアに組み込むことができる。
少なくとも２種のチェックポイント阻害剤とサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬とを含有する医薬組成物を、エクスビボで処置された（例えば、操作された）がんワクチン組成物の方法と組み合わせることにより、全身的な、永続的な、及び再現可能ながん免疫を提供することができる。凍結療法及び放射線療法などの操作手法は、単独で使用される場合、制御性Ｔ細胞の阻害、エフェクターＴ細胞及びＢ細胞の活性化、並びにがん関連抗原の放出をもたらし（Maia et al., “A comprehensive review of immunotherapies in prostate cancer.” Crit Rev Oncol Hematol. 113:292-303 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激するアジュバント効果を効果的に作出する。例えば、凍結－解凍によって壊死性になった細胞は、同時注射された抗原に対するＴ細胞応答を強化するため、インビボで注射された場合に免疫刺激活性を有する。Shi et al., “Cell injury releases endogenous adjuvants that stimulate cytotoxic T cell responses.” Proc Natl Acad Sci U S A. 97(26):14590-14595 (2000)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
免疫療法薬とエクスビボで操作されたがん組成物との組合せの注射は、免疫応答を増強することができ、これはおそらく異なる作用機序の利益を利用することによる。
本明細書に記載されるエクスビボ操作は、操作された腫瘍に対する免疫応答に影響を及ぼすことが知られている少なくとも２種の因子に影響を及ぼす。１つはタンパク質構造、すなわち腫瘍タンパク質の抗原性に対する操作プロセスの影響である。第２の因子は、操作モダリティに関連する細胞死の機構である。
壊死（即時的な細胞死）は、特定の条件下で、細胞膜を破裂させ、細胞膜断片及び様々な細胞内容物を失活細胞から細胞外環境に流出させ、それが樹状細胞の共刺激を引き起こし、Ｔ細胞の増殖及び活性化をもたらす。これに対して、アポトーシス（プログラム細胞死）は、別の形態の不可逆的な損傷であり、この場合には細胞が時間の経過と共に（通常は数日以内に）しぼんで死滅する。アポトーシスは細胞を無傷のままにし、細胞内容物を閉じ込めて、共刺激を妨げる。このように細胞内容物の露出及び共刺激がないことにより、Ｔ細胞の活性化及び増殖を防ぐことによって免疫学的な影響が抑制される。したがって、壊死は免疫原性刺激を大きく誘導するが、アポトーシスは通常、免疫応答をほとんど又は全く誘導しない。
がん細胞のエクスビボ操作及びその後の軟部組織への投与は、それを除去しようとする身体の防御及び治癒の機構を誘導する。これは、身体の免疫防御機構を利用して、死滅した腫瘍を認識し、潜在的ながんネオ抗原に対して（すなわち、患者自身のがんに対して）患者が本質的に自己免疫処置を受ける機会を作出する（Veenstra et al., “In situ immunization via non-surgical manipulation to prevent local and distant tumor recurrence” Oncoimmunology 4(3): e989762 (2015)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。更に、がん細胞抗原に対する免疫系を刺激することによって、本明細書に開示される治療アプローチは、（ｉ）原発性腫瘍を処置すること；（ｉｉ）がん細胞抗原に対する免疫応答を活性化すること；及び（ｉｉｉ）転移性病変の免疫系標的化を誘導することができる。
異なる型の操作方法は、タンパク構造及び細胞死の機構に対して異なる結果をもたらす可能性がある。例えば、熱的操作は、タンパク質を変性させることに起因して構造を破壊し、これはまた、組織の下層にあるコラーゲンマトリックスも破壊する。このタンパク質及び組織の破壊は、強固な免疫応答を起こりにくくする。低温操作、例えば、凍結外科的凍結は、タンパク質を変性させ、タンパク質及び組織構造の両方を破壊する可能性がある。非可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）及び非熱的操作モダリティ、例えば、ＲＦ－ＥＭＢは、構造を温存するため、膵臓、肝臓中心部、及び頭頸部などの他の領域のがんの処置に使用することができる。ＩＲＥは、細胞に電場を印加して細胞の膜の透過性を高める手法である。ＩＲＥの高電圧は標的細胞を破壊するが、隣接する細胞は影響を受けない。高周波電気的膜破壊（ＲＦ－ＥＭＢ）は、細胞膜を電気的に完全に破壊することによって壊死を生じさせる別の非熱的方法である（ＷＯ ２０１５／０８５１６２を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特定の条件下では、ＲＦ－ＥＭＢを使用してＤＮＡプラスミドを送達することもできる。可逆的エレクトロポレーション（ＲＥ）を使用してＤＮＡプラスミドを送達することもできる。ＲＥはＩＲＥと類似しているが、標的細胞に適用される電気は標的細胞の電場閾値未満である。したがって、細胞は電場が除去されると回復し、細胞膜を再構築し、細胞機能を継続することができる。ＲＥは、可逆的要素が核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド）の生細胞への進入を可能にするため、遺伝子療法のツールとして使用することができる。例示的なエクスビボ操作処置方法及びそれらの機構の簡単な説明を表１にまとめる。
Figure 2024506914000001

がんワクチンを作出するためのがん細胞のエクスビボ処置のために、本明細書に記載される任意の操作方法を、単独で、又は１種若しくは複数の他の操作方法と組み合わせて使用することができる。２種又はそれ以上の操作方法を、連続的又は同時に適用することができる。一部の場合には、操作方法の組合せは、組織に対して相乗効果を有し得る。組合せの非限定的なリストには、例えば、熱的操作及びＲＦ－ＥＭＢ、凍結外科的凍結及びＲＦ－ＥＭＢ、ＩＲＥ及びＲＦ－ＥＭＢ、ＲＥ及びＲＦ－ＥＭＢ、ＩＲＥ及び凍結外科的凍結、熱的操作及び凍結外科的凍結、熱的操作及びＩＲＥ、ＲＥ及びＩＲＥ、熱的操作とＲＥ、並びに２種又はそれ以上の方法が使用される任意の組合せが含まれる。
一部の場合には、本明細書に記載されるエクスビボ操作方法は、ＲＦ－ＥＭＢと凍結外科的凍結手法との組合せを使用してＲＦ－ＥＭＢ型の病変を生じさせる。この操作方法の組合せは、組織に対して相乗効果を生じさせることができる。相乗効果は、他の手段よりも必要とされるエネルギー入力が少ないＲＦ－ＥＭＢ型病変が作出されることであり得る。その結果、例えば肝臓組織では、無菌非炎症性凝固壊死に隣接する領域では、胆管細管の拡張を含む肝臓構造の変化、並びにミトコンドリアクリステの歪み及び小胞体の空胞化を含む細胞質オルガネラの特有のびまん性変化がある。
当業者は、本明細書に記載される操作方法を、エクスビボ適用及びがんの個々の側面、例えば、がん標本のサイズ、混合される非がん組織の量などに従って適合化し得ることを理解するであろう。当業者は、様々な操作方法のそれぞれの変数が、当技術分野において公知であり、記載されていることを理解するであろう（例えば、Percutaneous Prostate Cryoablation (Edited by Onik, Rubinsky, Watson, and Ablin. Quality Medical Publishing, St Louis, MO, 1995)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
操作パラメーターの変動性及び多様性の例として、凍結外科的凍結のプロセスには、操作の結果、例えば、がん標本のサイズ及び病変に対する免疫応答に影響を及ぼすために、凍結－解凍サイクルの数、凍結の速度、サイクルの解凍部分などの調整可能な変数が含まれる。同様に、ＲＦ－ＥＭＢのプロセスには、電界の強度、頻度、極性、形状、持続時間、数、及び間隔などの調整可能な変数が含まれ、これらは同様に操作の結果に影響を及ぼし得る。腫瘍細胞の電気パルスへの近接性は、任意の特定の細胞に対するＲＦ－ＥＭＢの強度及び結果を決定付ける。例えば、電場強度が投与箇所（例えば、プローブ）から減少するにつれて、投与箇所から最も離れた細胞は、より低い強度の電場で処置され、そのため、操作されずに、そうではなくて可逆的にエレクトロポレーションされる可能性がある。
一部の事例では、腫瘍細胞又はそれらの誘導体の第１の部分又は全部が、第１の操作／照射方法を使用してエクスビボで操作／照射され、腫瘍細胞又はそれらの誘導体の第２の部分又は全部が、第２の操作／照射方法を使用してエクスビボで操作／照射される。第1及び第2の操作／照射方法は同じであってもよく、又は異なってもよい。腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体の第１及び第２の部分は、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体の同じ部分であってもよく、又は異なる部分であってもよい。
一部の実施形態では、エクスビボ操作は、ＲＦ－ＥＭＢ及び凍結外科的凍結の両方を使用して行われる。
一部の事例では、エクスビボ操作／照射の工程は、少なくとも一部には、凍結外科的凍結を使用して行われる。上記に考察したように、凍結外科的凍結は、低温を使用して組織を破壊し、脱水及び氷形成によって壊死を生じさせるプロセスである。凍結外科的凍結は、ネクロトーシス性及び壊死性のがん細胞死を引き起こし、抗腫瘍免疫の誘導に必要な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の全セットを放出する。しかし、「凍結免疫学的効果」は様々である。
本明細書で使用される凍結外科的凍結は、従来の凍結外科的凍結とは大きく異なる：典型的な凍結外科手術は、がんの完全で即時的な破壊（凝固壊死）及び陰性の外科的辺縁を作出するために使用されるが、一方、本明細書の凍結外科的凍結は、アブスコパル効果（ネクロトーシス及び壊死の両方）を誘導するために免疫系への無傷のがん抗原の提示を確実にするために使用される。更に、本発明の１つの目的は、凍結外科的凍結の細胞死の３種の機構（細胞膜及び核膜並びに細胞質オルガネラの破裂）のうちの１つを利用し、他の２種の機構（タンパク質の変性及び局所微小血管系の破壊）を最小限に抑えることである。これは、凍結温度を－４０℃（温度制限）に設定し、新鮮ながん性組織又は細胞のエクスビボ凍結外科的凍結を使用することによって達成することができる。この併用療法は、従来の全身性がん処置に伴う全身毒性を低減し、免疫系の抗原特異的刺激を提供して、個別化された腫瘍標的免疫応答をもたらし得る。
凍結外科的凍結の手法は、典型的には、中空針（凍結プローブ）を組織に挿入し、続いて凍結剤を凍結プローブの先端に供給することを伴う。凍結外科的凍結は、２つ以上の凍結プローブを使用して実施することができる。凍結外科的凍結はまた、本明細書に記載される多目的プローブのいずれかを使用して行うこともできる。
組織温度は、完全な凝固壊死と相関する温度まで低下させる。一般的な凍結外科凍結手法は、高圧（例えば、約８０ｐｓｉ）液体窒素システム又は高圧（例えば、３０００～４５００ｐｓｉ）アルゴンガスシステムの使用を伴う。通常、組織の凍結に続いてその解凍（通常、ヘリウムガス又は抵抗加熱を使用する）が行われ、これは細胞膜の破壊をもたらし、細胞破壊を誘導する。細胞破壊は、凍結－解凍サイクルの反復により更に加速される。一部の事例では、エクスビボ凍結外科的凍結は、少なくとも１つの凍結－解凍サイクルを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。例えば、凍結外科的凍結は、１～４回の凍結－解凍サイクルを含むことができる。凍結－解凍サイクルの凍結部分は、例えば、少なくとも又は約３０秒間の長さであり得る。凍結－解凍サイクルの凍結部分は、約３０秒間～約１５分間、約３０秒間～約１２分間、約３０秒間～約１０分間、又は３０秒間～約５分間の範囲であり得る。解凍時間は、少なくとも又は約３０秒間の長さであり得る。例えば、解凍時間は、約３０秒間～約１５分間、約３０秒間～約１２分間、約３０秒間～約１０分間、又は３０秒間～約５分間の範囲であり得る。一部の実施形態では、凍結外科的凍結の工程全体は、３０分間以下、２５分間以下、２０分間以下、１５分間以下、１０分間以下、５分間以下、又は１分間以下にわたり継続される。
上記に考察したように、本明細書で提供される治療用組成物及び処置方法の１つの利点は、エクスビボ操作による免疫刺激性壊死の誘導である。一部の実施形態では、エクスビボ操作は、単一のプローブ（例えば、凍結外科用針プローブ）の挿入によって実施され；操作処置の工程は、所望の温度及び効果を達成するために５分間以下にわたり継続される。
凍結－解凍サイクルの凍結部分は、例えば、約－３０℃～約－１９６℃、例えば、約－３０～約－８０℃、約－３５～約－４５℃、約－３５～約－４０℃、約－４０～約－５０℃、約－４０～約－４５℃、又は約－４０℃の温度で行うことができる。
上記で考察したように、本明細書で提供される治療用組成物及び処置方法の１つの利点は、最小限の熱的操作を使用することによってがんネオ抗原が保たれることである。がんネオ抗原は、細胞膜の内部及び外部表面に存在する特有の外来タンパク質である。これらのネオ抗原は、免疫決定基であり、抗原特異的Ｔ細胞による早期がん認識及び破壊のための免疫療法処置に影響を及ぼし得る。Desrichard et al., “Cancer neoantigens and applications for immunotherapy” Clin. Cancer Res. 22: 807-12 (2016)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ネオ抗原が保たれることは、免疫活性化のために必要である。免疫系は、がんネオ抗原特異的樹状細胞及び細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成及び活性化することによって、がんの発生を制御し、その退縮を媒介することができる。これにより、免疫細胞は、リンパ節及び骨などの転移部位でがん細胞上のネオ抗原を認識して、標的とすることができる。
ほとんどのがん操作方法は壊死を誘導するが、がんネオ抗原の３次元タンパク質構造を保つことができないことが多い（Onik et al., “Electrical membrane breakdown (EMB): Preliminary findings of a new method of non-thermal tissue ablation” J. Clin. Exp. Pathol. 7:5-11 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これは、免疫細胞によるネオ抗原の同定を妨げるため、望ましくない可能性がある。
したがって、一部の実施形態では、通常の－８０℃ではなく約－４０℃という比較的低い温度でエクスビボ凍結外科的凍結を使用して、ネオ抗原の３次元構造を保つ。約－４０℃での凍結外科的凍結は、細胞死の閾値を超えることによって免疫刺激性壊死を引き起こす一方で、タンパク質ネオ抗原破壊の熱破壊を回避するか又は最小限にする。Larson et al., “In vivo interstitial temperature mapping of the human prostate during cryosurgery with correlation to histopathologic outcomes” Urology 55:547-52 (2000)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の事例では、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれらの誘導体のエクスビボ処置は、一連の電気パルスを投与することを更に含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一部の事例では、電気パルスの投与は、操作と同時に行われる。一部の事例では、電気パルスの投与は、操作の前に行われる。一部の事例では、電気パルスの投与は、操作の後に行われる。電気パルスは、凍結プローブを介して投与することができる。一部の事例では、一連の電気パルスは、およそ１～１０００個のパルスを含み、及び／又は１００～５００ｋＨｚの周波数を含む。一部の事例では、一連の電気パルスは、およそ１～４０００個のパルスを含み、及び／又は１００～５００ｋＨｚの周波数を含む。一部の事例では、一連の電気パルスは、およそ１～４０００個のパルスを含む。一部の事例では、一連の電気パルスは、１００～５００ｋＨｚの周波数を含む。電気パルスは、例えば、双極性であってもよく、及び／又は瞬間的な電荷反転を有してもよい。
腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体の少なくとも一部分のエクスビボ操作は、ＲＦ－ＥＭＢを使用して、例えば、プローブを使用して行うことができる。プローブは本明細書で開示されるいずれのプローブであってもよい。一部の事例では、プローブは一連の電気パルスを投与し、それによって操作を生じさせる。一部の事例では、一連の電気パルスは、およそ１～１０００個のパルスを含む。一部の事例では、一連の電気パルスは、およそ１～４０００個のパルスを含む。一部の事例では、電気パルスは、１００～５００ｋＨｚの間の周波数を含む。電気パルスは、双極性であり得る。電気パルスはまた、瞬間的な電荷反転を有してもよい。
一部の事例では、特定のエクスビボ操作方法は、多くの熱的操作（例えば、凍結外科的凍結）及びＲＦ－ＥＭＢを含む、細胞膜の破壊によって特徴付けられる特有の組織壊死を生じさせることができる。細胞膜が破壊されると、細胞内構成成分及び細胞膜の構成部分が細胞外空間に分散し、それによって免疫学的同定及び応答が強化される。これは、組織アポトーシスを生じさせる他の型の操作方法（例えば、ＩＲＥ）とは異なる。
本明細書で使用される場合、「ＲＦ－ＥＭＢ型操作」という用語は、実行されたときにＲＦ－ＥＭＢ操作と本質的に同じ結果をもたらす任意の操作手法又は技法の組合せを指す。
そのようなエクスビボ操作は、以下の利点のうちの少なくとも１種をもたらす：細胞の細胞内構成成分及び膜抗原が操作によって変性されないか若しくは最小限にしか変性されない；細胞の曝露された細胞内構成成分及び膜抗原の量が免疫系を刺激するのに十分である；及び／又は細胞の曝露された細胞内構成成分及び膜抗原の量が免疫寛容を生じないか若しくは最小限にしか生じない。一実施形態では、エクスビボ操作は、抗原が免疫系を刺激するように、がんネオ抗原の構造を保つ。
ある特定の実施形態では、がんワクチンは、照射及び操作（凍結外科的凍結など）のうちの１種又は複数を含むエクスビボ処置によって調製され、少なくとも１種の薬物（サイトカイン、細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、又はそれらの組合せ）に曝露される。
一部の事例では、がんワクチンは、ＵＶ照射及び凍結外科的凍結を含むエクスビボ処置によって調製され、低用量の少なくとも１種のサイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性の化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）に曝露される。一実施形態では、凍結外科的凍結は、約－３５～約－１００℃の範囲の温度、例えば、約－４０℃で実施される。一実施形態では、凍結外科的凍結は、単一のプローブを使用して、１０分間以下の総操作時間で実施することができる。一実施形態では、がんワクチンは、ＧＭ－ＣＳＦ（例えば、２５０ｍｇの投与量で）又はシクロホスファミド（例えば、２００～３００ｍｇ／ｍ2の投与量で）の低用量溶液中に懸濁化される。
治療用組成物は、必要とする対象に単回投与で投与されてもよく、又はそうでなくてもよい。治療用組成物の様々な構成成分は、対象に同時に又は逐次的に投与することができる。例えば、チェックポイント阻害剤、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、及びエクスビボで処置されたがんワクチンを、対象に同時に投与することができる。或いは、チェックポイント阻害剤のそれぞれの投与を、例えば、サイトカイン薬若しくは細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、及び／又はエクスビボで処置されたがんワクチンのそれぞれの投与の前、同時、及び／又は後に行うことができる。サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬のそれぞれの投与を、例えば、チェックポイント阻害剤及び／又はエクスビボ処置されたがんワクチンのそれぞれの投与の前、同時、及び／又は後に行うことができる。エクスビボ処置されたがんワクチンの投与を、例えば、各チェックポイント阻害剤及び／又はサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬のそれぞれの投与の前、同時、及び／又は後に行うことができる。
一実施形態では、サイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）は、がんワクチン接種時に投与される。これは、例えば、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬の懸濁液中にがんワクチンを調製することによって達成することができる。
一実施形態では、サイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）は、がんワクチン接種の後に投与することができる（例えば、皮下又は経口で）。
一実施形態では、サイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）は、がんワクチン接種時に投与され、同じ若しくは異なるサイトカイン薬（例えば、皮下）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、経口）の追加の投与が、がんワクチン接種の後に行われる。
制御性Ｔリンパ球（ＴReg）集団は、臨床用量以下の用量の化学療法剤シクロホスファミドに対して感受性である。低用量のシクロホスファミドでは、動物モデルにおける循環性ＴRegは減少し、他の白血球集団にはほとんど影響を及ぼさない。細胞毒性用量以下の用量のシクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦは、免疫強化の結果をもたらさないことが示されている。シクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦは、進行がんの活性特異的免疫療法（例えば、がんワクチン）試験のいくつかの臨床試験において免疫増強剤として使用されてきたが、低用量（典型的には２５０～３００ｍｇ／ｍ2）のシクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦが、典型的にはワクチンレジメンの３～４日前に投与される。ここで、がんワクチン接種時にシクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦを投与することで、ワクチン接種時にＴ細胞及び他の免疫刺激細胞の動員を促進することができる；ワクチン療法の後、その間、又はその後に追加の投与を行うことで、初期免疫応答を無効にする可能性のあるＴRegの何らかの「リバウンド」に対処するために、ワクチン療法後に継続的ではあるが限定的なレジメンを導入することができる。
ある特定の実施形態では、がんワクチンは、がん組織試料のエクスビボＵＶ照射、低用量シクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦへの曝露、及び温度制限凍結外科的凍結によって調製され、壊死性及びネクロトーシス性細胞並びに無傷の腫瘍関連抗原の個別化されたワクチン溶解物を作出し、これは、注射されると（例えば、皮内又は腫瘍内）、がん細胞を標的とするように免疫系をプライミングすることができる。一実施形態では、そのようながんワクチン溶解物の注射後に、２種の免疫療法薬（例えば、ＰＤ－１阻害性モノクローナル抗体であるニボルマブ（又はペムブロリズマブ）及び抗ＣＴ ＬＡ－４モノクローナル抗体であるイピリムマブ）を、直ちに、好ましくは同じ部位に（例えば、皮内又は腫瘍内に）逐次的に注射する。更に、免疫応答を延長させるために、低用量ＧＭ－ＣＳＦをその後一定期間（例えば、６週間）投与してもよく；免疫応答を延長させるために、経口低用量シクロホスファミドをその後一定期間（例えば、６週間）投与してもよい。
転移性固形がんを処置するための１つの例示的な治療用組成物及び処置方法は、以下の３種の治療用構成成分及び処置レジメンを必要とする：
（ａ）以下を行うための、ＵＶ照射、低用量シクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦ、及び温度制限凍結外科的凍結による生検又は針吸引からの新鮮ながん細胞のエクスビボ処置、
ａ．がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及びネクローシス性がん細胞の個別化されたワクチン溶解物を作製し、それによって良好な免疫応答を確実にすること；
ｂ．がん細胞から放出される腫瘍関連抗原及び関連サイトカイン及び他の免疫刺激剤の全セットを提供すること、並びに
ｃ．制御性Ｔ細胞からの抑制シグナルを抑制するプロセスを開始すること；
これに続いて、
（ｂ）がん溶解物ワクチン（自己由来）と、異なる経路を標的とする補完的な役割を有する２種のチェックポイント阻害剤とを、逐次的に皮内又は腫瘍内注射して、相乗的な又は増強された抗がん効果をもたらすこと、これには例えば以下がある：
ａ．制御性Ｔ細胞からの抑制シグナルを抑制して、抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞応答を延長させるためのＣＴＬＡ－４阻害剤、及び
ｂ．がんネオ抗原を「アンマスキング」し、それによって樹状細胞及び細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞にがん細胞抗原を曝露させる一方で、細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍活性を促進することによって、Ｔ細胞消耗を好転させ、抗腫瘍活性を強化するためのＰＤ－１阻害剤；
これに続いて、
（ｃ）免疫細胞動員を延長させるための低用量シクロホスファミド（例えば、経口）又はＧＭ－ＣＳＦ（例えば、皮下）のその後の投与。
理論に縛られることはないが、がん溶解物ワクチンに含有されるがんネオ抗原及び免疫刺激剤、例えば、サイトカインは、未熟な樹状細胞及び他の免疫細胞の豊富な供給源である皮膚注射部位の真皮、又は腫瘍内で利用可能であり得る。続いて、注射部位に常在する未熟な抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）、Ｔ細胞、及び他の免疫細胞がネオ抗原を取り込み、活性化されて、がん特異的な抗原タンパク質を認識するようになる。活性化された樹状細胞は、近傍リンパ節に排出され、がん特異的なネオ抗原を標的とするＴ細胞を活性化し、他の細胞傷害性Ｔリンパ球を動員して、正確な抗原エピトープを保有する全身のがん細胞を破壊し、それによってアブスコパル（バイスタンダー）効果を刺激する。このようにして、樹状細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と組み合わせて、細胞媒介性全身抗腫瘍免疫応答を開始させることができる。細胞媒介性抗原特異的免疫応答を鈍らせるか又は停止させることに関与する制御性Ｔリンパ球は、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体及び低用量のシクロホスファミド又はＧＭ－ＣＳＦによって選択的に枯渇させることができる。薬物の皮内又は腫瘍内注射は、全身療法よりも誘発される副作用が少ない。
治療用組成物は、がんを処置するのに有効であることが当技術分野で公知である治療用及び／若しくは生物学的薬剤、すなわち、抗がん剤、又は免疫系を刺激するのに有効であることが当技術分野で公知である薬剤、すなわち、免疫刺激剤若しくは免疫調節剤のうちの１種又は複数の治療有効量を更に含むことができる。そのような治療用組成物は、本明細書に記載されるがんを処置するために使用することができる。
治療用組成物はまた、１種又は複数の治療有効量の核酸医薬も含むことができる。核酸医薬は、例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ｎＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｖＲＮＡなどであり得る。例えば、核酸医薬は、ＤＮＡプラスミドであり得る。一部の事例では、ＤＮＡプラスミドは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＴＮＦ、ＩＦＮｙ、ＩＦＮａ、及び／又はそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなることができる。核酸医薬は、例えば、細胞の治療効果を強化すること、又は患者に治療剤を提供することにおいて臨床的有用性を有し得る。別の事例では、核酸医薬は、マーカー又は耐性遺伝子として機能し得る。ヌクレオチド配列は、細胞から分泌可能であるか、又は細胞から分泌されることがあり得ない遺伝子をコードすることができる。核酸医薬は、遺伝子の発現を増加させるための遺伝子及びプロモーター配列をコードすることができる。
治療用組成物はまた、１種又は複数の治療有効量のｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を含むことができる。ｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、ＴＬＲ１３、及び／又はそれらの組合せからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体はＴＬＲ３であり得る。一部の実施形態では、治療用組成物は、第１のＴＬＲ及び第２のＴＬＲを含むことができる。一部の事例では、第１及び第２のＴＬＲは同一である；他の事例では、それらは異なる。ＴＬＲは、約０．０１～約５ｍｇ／ｍ2の濃度で送達され得る。
当業者は、治療用組成物が、がん及び／又は対象の個々の側面、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍の位置、対象、薬物応答の臨床的エビデンスなどに従って適合化され得ることを理解するであろう。
治療用組成物は、送達用薬剤又は薬学的に許容される担体若しくは賦形剤を含むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体又は賦形剤」という用語は、医薬投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。これらの担体又は賦形剤は、その薬理学的活性を損なわせず、治療量の組成物を送達するのに十分な用量で投与された場合に非毒性である。補助的な活性化合物もまた、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片を含有する治療用組成物のための製剤に組み入れることができる。
治療用組成物は、経口若しくは非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、眼窩内、関節包内、腹腔内、直腸内、嚢内、血管内、皮内（例えば、皮膚若しくは軟部組織を介する）；例えば、それぞれ皮膚パッチ若しくは経皮イオントフォレシスを使用する皮膚を介した受動的若しくは促進的吸収によるもの；病的状態の部位に、例えば、腫瘍に供給する血管に静脈内若しくは動脈内投与されることによるもの；又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない様々な投与経路のために製剤化することができる。
好適な治療用／医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Troy, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2006); Willig, “Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs” (M. Dekker, 1975)を参照されたく、これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、非経口、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の構成成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩、及び張性調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨ値は、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基によって調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアルに封入することができる。
一部の実施形態では、治療用組成物及びその構成成分を、皮内又は皮下投与用に製剤化して、皮内又は皮下に注射することができる。例えば、治療用組成物の構成成分を、皮膚又は軟部組織投与などの皮内投与用に製剤化して、皮膚又は軟部組織を介して皮内に注射することができる。
治療用組成物又は治療用組成物の様々な構成成分（例えば、チェックポイント阻害剤、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、がんワクチン、核酸医薬、及び／又はそれらの組合せ）を、軟部組織送達用に製剤化することができる。例えば、治療用組成物又は治療用組成物の種々の構成成分を、注射用デバイスを介して皮内に送達することができる。注射用デバイスは、プローブの一部であってもよい。本明細書に記載されるプローブは、様々な操作方法のために構成することができる。更に、プローブを、本明細書に記載される方法を組み合わせるように構成することもでき、例えば、冷凍プローブを、電気パルス、凍結剤、化学的若しくは生物学的操作剤、及び／又は薬物の組成物を投与するように構成することができる。
良性又はがん性軟部組織に投与される少なくとも２種のチェックポイント阻害剤とサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法剤との組合せは、静脈内投与される２種のチェックポイント阻害剤の組合せ（サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬を含まない）よりも、生じる有害な副作用及び／又は免疫関連の有害事象が少ない。良性又はがん性軟部組織に送達されるこれらの３種又はそれ以上の免疫刺激性薬物の組合せは、マウスの中枢神経系を含む遠隔転移腫瘍部位を根絶することができる全身性のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を誘発するのに十分であり得る。この局所併用戦略はまた、抗体の全身送達とは対照的に後期腫瘍再発を予防するため、より良好なＣＤ８＋メモリー抗腫瘍免疫応答を生じさせることができる。
皮膚は、抗がんワクチンの送達のための好ましい入口であり、静脈内注射又は外科的な腫瘍内操作及び薬物操作の必要性並びにそれによって生じるリスクをなくして、がん細胞溶解物及びアジュバントが安全に投与されることを可能にする好都合な注射部位として役立つ。Patel et al., “Next generation approaches for tumor vaccination.” Chin Clin Oncol 6:19 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。皮内薬物注射は、薬物を皮膚微小環境に隔離させることによって、全身毒性を低減し、副作用をより少なくすることができる（Marabelle et al., “Intratumoral Immunization: A New Paradigm for Cancer Therapy” Clin. Cancer Res. 20(7): 1747-56 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。皮内注射は、抗原提示樹状細胞及びエフェクターＴ細胞を含む免疫細胞の高密度で多様な集団を含有する解剖学的部位であり、所与の量の抗原の筋肉内注射よりも免疫原性の可能性が高い皮膚に、抗原を直接送達する（Kenney et al., “Dose Sparing with Intradermal Injection of Influenza Vaccine” N Eng J Med 351, 2295-301 (2004); Patel et al., “Next generation approaches for tumor vaccination.” Chin Clin Oncol 6:19 (2017)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、カルメット・ゲラン杆菌ワクチンは、日常的に皮内注射される。
がん溶解物産物の皮内投与は、リンパ節遊走皮膚樹状細胞（ＤＣ）の５種のサブセット（ランゲルハンス細胞、ランゲリン、ＣＤ１０３－、ＣＤ１０３＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｂ－）による摂取を増強する（Vardam et al., “Langerhans Cells Orchestrate TFH-Dependent Humoral Immunity” J Invest Dermatol 137:1826-1828 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。動員及び活性化の後、これらのＤＣは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を処理して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞については主要組織適合遺伝子複合体１（ＭＨＣ－１）に結合し、又はＣＤ４＋ Ｔ細胞についてはＭＨＣ－ＩＩに結合するペプチドにし、続いて皮膚から排出リンパ節に遊走して、ＴＡＡをそれらのコグネイトＴ細胞に交差提示し、エフェクターＴ細胞のプライミング及び拡大、並びに濾胞中心Ｔ細胞の分化の誘導を刺激する。Ruben et al., “In situ loading of skin dendritic cells with apoptotic bleb-derived antigens for the induction of tumor-directed immunity” Oncoimmunol 3; 7: e946360 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このため、リンパ節における免疫応答は、抗原認識（ＤＣによるＭＨＣ分子及びＴリンパ球のＴ細胞受容体との関連におけるＴＡＡの提示）と免疫活性化（細胞傷害性Ｔリンパ球を生成する１型ヘルパーＴ細胞応答の生成、並びに細胞媒介性細胞死を誘導するための抗原特異的抗体の産生をもたらす２型ヘルパーＴ細胞応答）との組合せによって誘発される（Dillman et al., “Randomized phase II trial of autologous dendritic cell vaccines versus autologous tumor cell vaccines in metastatic melanoma: 5-year follow up and additional analyses.” J Immunother Cancer 6:19 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。続いて、活性化された抗原特異的Ｔ細胞は、おそらくケモカイン勾配及び他の炎症の手がかりによって導かれてがん部位に遊走し、そこでがん細胞上のＭＨＣ分子の存在下で、Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体と抗原との間の相互作用を介して腫瘍細胞を認識する。細胞傷害性Ｔ細胞はパーフォリン及びグランザイムＢなどの酵素を放出して細胞壊死をもたらし、腫瘍細胞に対するこの溶解作用は正のフィードバックループを誘発して、より多くの抗原を放出させる「がん－免疫サイクル」を再び開始させる。他の抗原の放出もまた、「抗原拡散」と称される拡大された応答を引き起こす。Patel et al., “Next generation approaches for tumor vaccination.” Chin Clin Oncol 6:19 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
樹状細胞活性化との組合せにより、皮内がんワクチン投与はまた、外来抗原（病原体、ＴＡＡなど）に対する持続的な防御性適応免疫及び自然免疫を付与する長寿命のメモリーＣＤ８Ｃ Ｔ細胞の２種のサブセットを含む、正常ヒト皮膚に存在する１００万個／ｃｍ2のＴ細胞の多くも刺激する：（１）ＣＤ６９及びＣＤ１０３を恒常的発現する多数の非リンパ系組織（皮膚、胃腸管、脳、及び肺を含む）で見張りをする常在性メモリー細胞（Ｔｒｍ）；及び（２）血液と非リンパ組織の間を循環し、組織ホーミング受容体を発現するエフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）。メモリーＣＤ８Ｃ Ｔ細胞の第３のサブセットであるセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）は、血液とリンパ組織の間を循環し、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７を発現する。抗原の再チャレンジの際に、これらのＴ細胞はすべて活性化されて増殖するが、Ｔｒｍ細胞は最初で最も強力な局所的な防壁となり、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、Ｂ細胞、及び他の免疫細胞の標的化された関与をもたらすエフェクターサイトカイン及びケモカイン（例えば、ＩＦＮ－ｇ、グランザイムＢ）を豊富に分泌する。ワクチン接種の皮内経路は、局所的及びワクチン接種されていない皮膚に蓄積する抗原特異性Ｔｒｍ細胞の産生を刺激することができる。Galvez-Cancino et al., “Vaccination-induced skin-resident memory CD8(+) T cells mediate strong protection against cutaneous melanoma” Oncoimmunology 7:e1442163 (2018)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
免疫刺激性薬物の皮膚注射は、それらが血中に高濃度で即時循環することを防止することによって、全身毒性を低下させ、副作用をより少なくすることができる。この送達経路はまた、全身注入の場合よりも微小環境内ではるかに高い濃度の免疫刺激性産物を生じさせ、それにより、より良好な効力を増強する。一方、この送達経路はまた、治療が有効であるために必要な投与される組成物の量を減少させることができる。例えば、皮膚に適用されたがん溶解物ワクチンは、抗原の用量が５分の１～１０分の１の少なさにもかかわらず、筋肉内注射などの針による他のワクチン接種と同等であるか又はより優れた強力な免疫療法応答を生じる。Depelsenaire et al., “Colocalization of cell death with antigen deposition in skin enhances vaccine immunogenicity” J Invest Dermatol 134:2361-2370 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
がんワクチンの前臨床皮内（ＩＤ）送達は、多数の多様ながんにおいて安全で有効であることが証明されている。Ｃｈｅｎらは、ＧＭ－ＣＳＦと組み合わせた全細胞がん溶解物ワクチンを注射されたマウスが、皮内ＤＣを刺激して活性化し、その結果、がん貪食作用、がん特異的腫瘍抗原の提示、ＤＣの遊走、及び他の免疫細胞の刺激をもたらすことを見出した。Chen et al., “Leveraging Engineering of Cells for Drug Delivery” Acc Chem Res 51:668-77 (2018)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。あるマウスモデルでは、抗原特異的Ｔｒｍ細胞刺激性ワクチンのＩＤ投与は浸潤及び黒色腫増殖の抑制をもたらし、これは循環性ＣＤ８３ Ｔ細胞とは独立していた。Galvez-Cancino et al., “Vaccination-induced skin-resident memory CD8(+) T cells mediate strong protection against cutaneous melanoma” Oncoimmunology 7: e1442163 (2018)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。熱ショックタンパク質断片及びジフテリア毒素と組み合わせた乳がん細胞溶解物のマウス注射は、良好な体液性及び細胞性免疫応答並びに防御的な抗腫瘍免疫をもたらした。Wang, et al., “Protective antitumor immunity induced by tumor cell lysates conjugated with diphtheria toxin and adjuvant epitope in mouse breast tumor models” Chin J Cancer 31:295-305 (2012)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。あるマウスモデルにおいてすべての結腸がんの半数は、バキュロウイルス、ＣＴ２６結腸がん溶解物、及び細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチドからなるがんワクチンによるＩＤ免疫処置によって根絶された；その抗腫瘍効果は、ＣＤ８Ｃ Ｔ細胞の腫瘍抗原特異的応答と相関した。Kawahara, et al. “A tumor lysate is an effective vaccine antigen for the stimulation of CD4(+) T-cell function and subsequent induction of antitumor immunity mediated by CD8(+) T cells” Cancer Biol Ther 16:1616-25 (2015)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２及びＧＭ－ＣＳＦと組み合わせた自己由来Ｂ細胞リンパ腫細胞膜断片のイヌへのＩＤ注射は、特異的な細胞媒介性免疫及び遅延型過敏反応を生じさせ、顕著な毒性は伴わなかった。Henson et al., “Immunotherapy with autologous tumour antigen-coated microbeads (large multivalent immunogen), IL-2 and GM-CSF in dogs with spontaneous B-cell lymphoma” Vet Comp Oncol 9:95-105 (2011)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。照射されたＧＭ－ＣＳＦ産生がん細胞によるワクチン接種は、脳に移植された腫瘍を有するマウスの生存性を改善した。Sampson et al., “Immunotherapy for Brain Tumors” J Clin Oncol 356:2450-56 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１８及びＧＭＣＳＦを産生するようにトランスフェクトされた、照射されたルイス肺がん細胞株によるワクチン接種は、マウスモデルにおいて、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖及び生存期間の延長を含む抗がん応答を生じさせた。Tian et al., “Cellular immunotherapy using irradiated lung cancer cell vaccine co-expressing GM-CSF and IL-18 can induce significant antitumor effects” BMC Cancer 14:48 (2014)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
前臨床での所見と同様に、患者におけるＩＤがんワクチン接種による処置もまた、複数のがんにおいて安全で、忍容性が良好であり、有効であることが証明されている。Ｍｅｈｒｏｔｒａらは、Ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣとＨＬＡ－Ａ２拘束ペプチドｈＴＥＲＴ、ＣＥＡ、及びサバイビンによるパルス刺激を行った自己由来ＤＣワクチンとの組合せを、膵臓がんを有する８人の患者に皮内送達した。Mehrotra et al., “Vaccination with poly(IC:LC) and peptide-pulsed autologous dendritic cells in patients with pancreatic cancer” J Hematol Oncol 10:82 (2017)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。処置の忍容性は良好であり、一般的な症状は疲労及び／又は自然治癒性のインフルエンザ様症状であった。４人の患者は病勢安定であったが、４人の患者では進行した；全生存期間の中央値は７．７か月であった。ワクチン接種前後のＭＨＣクラスＩ四量体分析により、病勢安定であった３人の患者における抗原特異的Ｔ細胞の効果的な生成が明らかになった。自己由来がん細胞溶解物をローディングした樹状細胞の皮内注射による、種々の部位に転移性がんを有する患者の処置は、忍容性が良好であり、注射部位での発熱、無力症、及び疼痛などのグレード１及び２の有害事象に限定された。Alfaro et al., “Pilot clinical trial of type 1 dendritic cells loaded with autologous tumor lysates combined with GM-CSF, pegylated IFN, and cyclophosphamide for metastatic cancer patients” J Immunol 187:6130-42 (2011)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＢＣＧと組み合わせた複数の黒色腫細胞株由来の照射された全細胞による皮内多価ワクチン接種による処置は、高ステージ患者において１９か月間で２６％の奏効をもたらし、有害事象は最小限であった。Vilella et al., “Treatment of patients with progressive unresectable metastatic melanoma with a heterologous polyvalent melanoma whole cell vaccine” Int J Cancer 106:626-31 (2003)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。自己由来ハプテン改変黒色腫ワクチンの使用は、肺転移の退縮をもたらした。Berd et al., “Induction of cell-mediated immunity to autologous melanoma cells and regression of metastases after treatment with a melanoma cell vaccine preceded by cyclophosphamide” Cancer Res 46: 2572-77 (1986)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。高ステージ黒色腫における多価ワクチンによる処置は、ワクチン療法の前に（多くの場合、複数の部位への）転移を完全に切除した他の処置と比較して、５年生存率を改善した。Vilella et al., “Treatment of patients with progressive unresectable metastatic melanoma with a heterologous polyvalent melanoma whole cell vaccine” Int J Cancer 106:626-31 (2003)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、治療用組成物は、腫瘍内投与のために製剤化され、腫瘍内に注射することができる。
ヒトにおける免疫刺激性薬物の腫瘍内注射は、静脈内注射と比較した場合、全身免疫療法の有害事象発生率を有意に低下させることができる。ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１（例えば、キイトルーダ、オプジーボ）及び抗ＣＴＬＡ－４（例えば、ヤーボイ）などの免疫療法薬の組合せの全身投与は、高い有害事象発生率を有する。腫瘍内注射により、多くの有害事象を回避して、異なる作用機序を有する薬物の組合せを用いることが可能になる。
動物モデルにおける試験では、アゴニスト抗体を使用する局所共刺激により、全身的な抗腫瘍効果が得られ、全身処置から予想されるよりも低い毒性で、Ｔ細胞依存性の抗腫瘍免疫記憶が誘導されることが示されている。腫瘍内又は腫瘍近傍への注射は、全身的な腫瘍効果を生じさせるのに役立つ。例えば、腫瘍内又は腫瘍近傍への注射は、全身投与と比較して、腫瘍排出リンパ節における蓄積を増加させ、Ｃｍａｘ（最高血清中濃度）を低下させる。
注射のために好適な治療用組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を挙げることができる。静脈投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、滅菌精製水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。組成物は、無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度まで流体であることが望ましい。治療用組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アルコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、治療用組成物に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムを含めることが望ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを治療用組成物に含めることによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙した成分の１種又は組合せと共に適切な溶媒中に組み入れて、その後に濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、望ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分に任意の追加の所望の成分を加えた粉末が、その予め濾過滅菌された溶液から得られる。一部の実施形態では、治療用組成物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの、身体からの急速な排出に対して活性化合物を保護する担体を用いて調製することができる。
治療用組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、カートリッジ、又はディスペンサー中に含めることができる。
方法に関する「投与する」又は「投与」という用語は、医療専門家からの処方及び／又は指示の行為だけでなく、処方及び／又は指示を受ける患者の行為、並びに患者が組成物又は処置工程を実際に受ける行為も含む。
本発明の別の態様は、必要とする対象において腫瘍又はがんを処置する方法を提供する。本方法は、それぞれが腫瘍又はがんを処置するための治療有効量で組成物中に存在する、ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法剤、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、並びにｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとを含む治療用組成物を、必要とする対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。組成物は、薬学的に許容される担体を含有してもよい。例えば、投与される組成物は、本明細書に記載の治療用組成物であってもよい。
好適な免疫チェックポイント阻害剤、好適なサイトカイン薬又は好適な細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、がんワクチン及び好適なエクスビボ処置法によるその調製、任意に、好適な薬学的に許容される担体、腫瘍又はがんを処置するためのそれらの有効量、並びに様々な投与経路用の治療用組成物の製剤を含む、治療用組成物の態様に関する上記のすべての実施形態は、対象における腫瘍又はがんを処置する方法のこの態様において適用可能である。
一部の実施形態では、本方法は、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体からのエクスビボ処置によってがんワクチンを作出することを更に含む。がんワクチンの調製のための腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体のエクスビボ処置は、治療用組成物の態様において本明細書に記載されており、腫瘍又はがんを処置する方法のこの態様に適用可能である。
一実施形態では、本方法は、操作などの更なる操作の前に、機械的方法、酵素的方法、又は当業者に公知の他の方法を使用して、細胞又は細胞構成成分をエクスビボで腫瘍又はがん標本から解離させる段階、及び細胞を遠心分離して、緩衝食塩水などの滅菌流体中に再懸濁させることを更に含む。
一部の事例では、本方法は、治療用組成物を患者に皮内、腫瘍内投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一部の事例では、本方法は、治療用組成物を患者の皮膚又は軟部組織に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。投与は、注射用デバイスを使用することによって実施することができる。
一部の実施形態では、本方法は、ｉ）それぞれがＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＰＤ－１、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ １、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、ＴＧＦ－β、ＰＩ３Ｋγ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＴＬＲ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１０、ＰＶＲＩＧ、ＣＣＲＹ、ＯＸ－４０、ＣＤ１６０、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ２７－ＣＤ７０、及びＣＤ４０からなる群から選択される免疫チェックポイント阻害剤である、少なくとも２種の異なる免疫チェックポイント阻害剤と、ｉｉ）少なくとも１種のサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬と、ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとを含む組成物を、腫瘍又はがんを処置するのに有効な量で、患者に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一部の実施形態では、少なくとも２種のチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種のチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。
一部の実施形態では、本方法は、ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と；ｉｉ）エリスロポエチン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ、インターフェロン、例えば、ＩＮＦ－α－２ａ、ＩＮＦ－α－２ｂ、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカイン；又はアスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、シクロホスファミド、ＢＣＧ、クロラムフェニコール、コルヒチン、シクロスポリン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカルバジン、リツキシマブ、テモゾロミド、チオテパ（ｔｈｉｔｅｐａ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ジドブジン、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬と；ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンとを含む組成物を、腫瘍又はがんを処置するのに有効な量で、患者に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一実施形態では、組成物は、少なくとも１種のサイトカインを含み、サイトカインの少なくとも１種はＧＭ－ＣＳＦである。一実施形態では、組成物は、少なくとも１種の細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を含み、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬の少なくとも１種はシクロホスファミドである。
上記に考察したように、治療用組成物は、必要とする対象に単回投与で投与されてもよく、そうでなくてもよい。治療用組成物及び／又は治療用組成物の様々な構成成分の投与方法は、治療用組成物の態様において本明細書に記載されており、腫瘍又はがんを処置する方法のこの態様に適用可能である。
一実施形態では、本方法は、チェックポイント阻害剤、サイトカイン又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、及びエクスビボで処置されたがんワクチンを対象に同時に投与することを含む。
一実施形態では、本方法は、
ｉ）チェックポイント阻害剤のそれぞれを投与すること、
ｉｉ）ｉ）の前、それと同時、及び／又はその後に、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬のそれぞれを投与すること、
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）の前に、それと同時に、及び／又はその後に、エクスビボ処置されたがんワクチンを投与すること、
を含む。
一実施形態では、本方法は、がんワクチン接種時に、サイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）を投与することを含む。これは、例えば、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬の懸濁液中でがんワクチンを調製することによって達成することができる。
一実施形態では、本方法は、がんワクチン接種後に、細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、シクロホスファミド、経口）を投与すること、又はサイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）を投与することを含む。
一実施形態では、本方法は、がんワクチン接種時にサイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）を投与すること、及びがんワクチン接種後に同じ又は異なるサイトカイン薬を投与すること（例えば、皮内に）を含む。
一実施形態では、本方法は、がんワクチン接種時に細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬（例えばシクロホスファミド）を投与すること、及びがんワクチン接種後に同じ又は異なる細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を投与することを含む。
一部の事例では、本方法は、核酸医薬の治療有効量を腫瘍又はがんに投与することを更に含む。
一部の事例では、本方法は、治療用組成物の投与後に、サイトカイン薬（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）を対象に投与することを更に含む。サイトカイン薬物又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬は、皮下投与することができる。
ある特定の実施形態では、本方法は、１）がん組織試料のエクスビボＵＶ照射、低用量ＧＭ－ＣＳＦ又はシクロホスファミドへの曝露、及び温度制限凍結外科的凍結によってがんワクチンを調製すること、２）がんワクチン溶解物を対象に注射すること（例えば、皮内に）、３）２種の免疫療法薬（例えば、ＰＤ－１阻害剤モノクローナル抗体であるペンブロリズマブ（又はニボルマブ）及び抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体であるイピリムマブ）を対象に、好ましくは同じ部位に注射すること（例えば、皮内に又は腫瘍内に）、並びに４）低用量ＧＭ－ＣＳＦ（例えば、皮下に）又は低用量シクロホスファミド（例えば、経口で）を対象に一定期間（例えば、６週間）投与することを含む。
上記で考察したように、治療用組成物又はその構成成分の投与は、経口又は非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、眼窩内、関節包内、腹腔内、直腸内、嚢内、血管内、皮内での投与；例えば、それぞれ皮膚パッチ、経皮イオントフォレシス、又はコーティングされたマイクロニードルを使用する、皮膚を介した受動的又は促進的吸収によって投与すること；病的状態の部位に、例えば、腫瘍を供給する血管に静脈内又は動脈内投与すること；又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない様々な経路を介して実施することができる。
治療用組成物又はその構成成分は、所望の結果を達成するのに必要な有効量で、投与量で、及び期間にわたって投与することができる。有効量は、１回又は複数回の投与、適用又は投与量で投与することができる。治療用組成物の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、選択される治療用組成物に依存する。組成物は、隔日に１回を含めて、１日当たり１回又はそれ以上から１週間当たり１回又はそれ以上までで投与することができる。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の処置、対象の全体的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を有効に処置するために必要とされる投与量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。更に、本明細書に記載される治療組成物の治療有効量による対象の処置は、単回処置又は一連の処置を含むことができる。
一部の事例では、治療用組成物は、注射用デバイスを使用して患者に投与される。注射用デバイスは、複数の尖叉又は単一の尖叉を含み得る。組成物は、本明細書に記載されるようなプローブ（様々な目的を果たす）を使用して投与することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物は、１回又は複数回の投与で投与することができる。これらの１回又は複数回の投与は、本明細書に記載されるものと同じ又は異なる投与方法、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、又はそれらの任意の組合せのものであり得る。
一部の実施形態では、第１の組成物（又はその構成成分）は腫瘍内投与され、第２の組成物（又はその構成成分）は皮下投与される。一部の実施形態では、第１及び第２の組成物は、同時に、順番に、又は一連の処置で投与される。一部の実施形態では、第１及び第２の組成物は、同じであるか、異なるか、又は部分的に同じである。一部の実施形態では、処置方法は、２回又はそれ以上の投与を含む。
一部の実施形態では、第１の投与は、少なくとも２種のチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１阻害剤及びＣＴＬＡ－４阻害剤）、少なくとも１種のサイトカイン又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、及びエクスビボ操作後のがん細胞ワクチンの皮内投与である。
投薬レジメンは、所望の治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少させることができる。当業者は、本明細書に開示される新たなモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を対象に投与するために好適な投与量及び投薬レジメンを認識しているであろう。例えば、Physicians' Desk Reference 2008 (62nd Ed., Thomson Reuters, 2008)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、治療用化合物の投与量、毒性、及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、そのような化合物を患部組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を策定する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。処置方法に使用される任意の化合物について、治療有効用量を、細胞培養アッセイからまず推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて策定することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
組成物は、単回用量で投与することができ、又は２回より多い用量で投与することもできる。免疫チェックポイント阻害剤、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬、及びがんワクチンの投与量の範囲は、治療用組成物の態様において本明細書で論じられており、対象における腫瘍又はがんを処置する方法のこの態様において適用可能である。
一部の実施形態では、組成物は、約１．０ｍｌ未満の容量で投与される。一部の実施形態では、組成物は、約１５ｍｌの容量で投与される。
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の投与量は、対象の体重に基づいて測定される場合、約０．０１～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５～約１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
一部の実施形態では、サイトカイン薬の投与量は、対象の体重に基づいて測定される場合、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約２～約５００ｍｇ／ｋｇ、約２～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約２～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
一部の実施形態では、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬の投与量は、対象の体重に基づいて測定される場合、約１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約２～約５００μｇ／ｋｇ、約２～約１００μｇ／ｋｇ、約２～約５０μｇ／ｋｇ、又は約２～約１０μｇ／ｋｇの範囲であり得る。
一部の場合には、治療用組成物中に含有されるサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬は、約０．１～約１０００ｍｇ／ｍ2、例えば約１０～約６００ｍｇ／ｍ2の範囲の投与量で投与することができる。一実施形態では、治療用組成物中に含有されるサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬は、低用量で、例えば約５００ｍｇ／ｍ2未満、約４００ｍｇ／ｍ2未満、又は約３００ｍｇ／ｍ2未満で投与される。
一実施形態では、各投与において治療用組成物中に含有されるサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬の用量は、従来の投薬レジメン後のその最大耐量の約０．２５％～約７５％である。例えば、治療用組成物中に含有されるサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬は、１回の投与当たりの用量が最大耐量の約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、又は約７５％である低用量で投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物の軟部組織投与は、同じ組成物の従来のＩＶ投与と比較した場合、生じる有害な副作用及び／又は免疫関連有害事象がより少ない。従来のＩＶ投与の有害な副作用及び免疫関連有害事象には、胃腸、呼吸器、神経、内分泌、皮膚、疲労、腎臓、及び肝臓への影響が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物の投与は、少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤及びサイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬を含むが、エクスビボで処置されたがんワクチンを含まない同じ治療用組成物の投与と比較した場合、又は少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤及びエクスビボで処置されたがんワクチンを含むが、サイトカイン薬又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬を含まない同じ治療用組成物の投与と比較した場合、インビボで生じる有害な副作用及び／又は免疫関連有害事象がより少ない。
一部の事例では、本方法は、組成物を投与する前に、軟部組織投与のためのプローブの位置を検査する工程を更に含む。プローブの位置の検査は、プローブを介して試験注射物を投与すること、及び試験注射物の投与中に軟部組織圧を測定することを含み得る。一部の事例では、本方法は、試験注射中に周囲の腫瘍組織の圧と比較して軟組織圧の増加又は減少が検出された場合に、プローブの位置を再配置することを含む。例えば、圧力の増加は、プローブが瘢痕組織内にあることを示す可能性があり、圧力の減少は、プローブが血管内にあることを示す可能性がある。
処置中に、熟練の専門家は、システム、例えば、コンピュータシステム、計算ユニット、ソフトウェア及び／又はアルゴリズムを使用して、処置プロトコールを計画し、標的化し、位置決めし、送達し、モニターし、調整し、画像化し、及び／又は試験することができる。熟練の専門家は、各注射方法が、調整し得るいくつかのパラメーター及び変数を含み、アルゴリズムを使用して注射を制御及び設計し得ることを理解するであろう。当技術分野で公知の任意のアルゴリズムを、本明細書に記載される方法に使用することができる。操作手法に使用するためのコンピュータシステム、計算ユニット、ソフトウェア及び／又はアルゴリズムの例は、当技術分野で公知である。
エクスビボ操作／照射の工程は、使用される操作／照射方法に応じて、当技術分野で公知の操作／照射手法及びシステムによって実施することができる。以下の考察は、様々な操作方法及びデバイスの非限定的な例を提供する。
例えば、凍結外科的凍結は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２００４／０８６９３６号及び第ＷＯ ２００８／１４２６８６号；米国特許第６，０７４，４１２号；同第６，５７９，２８７号；同第６，６４８，８８０号；同第６，８７５，２０９号；同第７，２２０，２５７号；及び同第７，００１，３７８号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なデバイスとしては、Ｅｎｄｏｃａｒｅ（商標）ＣｒｙｏＣａｒｅ（登録商標）シリーズ、例えば、ＣｒｙｏＣａｒｅ（商標）及びＣｒｙｏＣａｒｅ ＣＮ２（ＨｅａｌｔｈＴｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；ＣｒｙｏＣｏｒ（商標）Ｃａｒｄｉａｃ Ｃｒｙｏａｂｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｒｙｏＣｏｒ Ｉｎｃ．）；Ａｒｃｔｉｃ Ｆｒｏｎｔ（登録商標）Ｃａｒｄｉａｃ ＣｒｙｏＡｂｌａｔｉｏｎ Ｃａｔｈｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））；Ｃｒｙｏ Ｐａｉｎｂｌｏｃｋｅｒ（商標）（Ｅｐｉ－Ｍｅｄ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）が挙げられる。
高周波（ＲＦ）操作は、米国特許第５，２４６，４３８号；同第５，５４０，６８１号；同第５，５７３，５３３号；同第５，６９３，０７８号；同第６，９３２，８１４号；及び同第８，１５２，８０１号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
マイクロ波操作は、米国特許第６，３２５，７９６号、同第６，４７１，６９６号、同第７，１６０，２９２号、同第７，２２６，４４６号、及び同第７，３０１，１３１号、並びに米国特許出願公開第２００３／００６５３１７号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
レーザー、光、又はプラズマ操作は、米国特許第４，７８５，８０６号；同第５，２３１，０４７号；同第５，４８７，７４０号；同第６，１３２，４２４号；同第８，０８８，１２６号；同第９，２０４，９１８号；及び同第１０，０２３，８５８号；並びに米国特許出願公開第２００７／０１２９７１２号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
超音波操作は、米国特許第５，３４２，２９２号；同第６，８２１，２７４号；同第７，６７０，３３５号；及び同第８，９７４，４４６号；並びに米国特許出願公開第２００６／００５２７０６号及び同第２００９／００１８４号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）操作は、米国特許第６，４８８，６３９号；同第６，９３６，０４６号；同第７，３１１，７０１号；及び同第７，７０６，８８２号；並びに米国特許出願公開第２００８／００３９７４６号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
蒸気操作は、米国特許第６，８１３，５２０号及び同第９，３４５，５３２号、並びに米国特許出願公開第２０１３／０１７８９１０号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
可逆的エレクトロポレーション（ＲＥ）操作は、米国特許出願公開第２０１０／００２３００４号及び同第２０１２／０１０９１２２号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）操作は、米国特許第７，６５５，００４号及び同第８，０４８，０６７号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１２０７１５２６号；並びに米国特許出願公開第２０１２／０１０９１２２号及び同第２０１３／０２５３４１５号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
高周波電気的膜破壊操作は、米国特許出願第２０１５／０１５０６１８号、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１５／０８５１６２号、同第ＷＯ ２０１６／１２３６０８号、同第ＷＯ ２０１６／１２７１６２号、同第ＷＯ ２０１６／１２６９０５号、同第ＷＯ ２０１６／１２６７７８号、及び同第ＷＯ ２０１６／１２６８１１号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
超短電気パルスによる操作方法は、米国特許第８，９２６，６０６号；並びに米国特許出願公開第２００６／００５６４８０号、同第２０１０／０２６１９９４号、及び同第２０１８／０１５４１４号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なデバイスには、Ｎａｎｏ－Ｐｕｌｓｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（商標）デバイス（Ｐｕｌｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）が含まれる。
光線力学療法を使用する操作方法は、米国特許第６，８１１，５６２号；同第７，９９６，０７８号；及び同第８，０５７，４１８号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
非熱的衝撃波を使用する操作方法は、米国特許第５，５２４，６２０号及び同第８，５５６，８１３号；米国特許出願公開第２０１６／０００８０１６号；並びに日本特許出願特開２００９０６１０８３号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
化学的操作及び／又は生物製剤による操作は、米国特許第６，４２８，９６８号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２００４／０３５１１０号；同第ＷＯ ２００６／０９５３３０号、同第ＷＯ ２００７／０９３０３６号、及び同第ＷＯ ２０１４／０７０８２０号；並びに米国出願公開第２００４／０００２６４７号、同第２００５／０２５５０３９号、同第２００９／０１９２５０５号、同第２０１０／０１７８６８４号、同第２０１０／０１４５３０４号、同第２０１２／０２５３１９２号；同第２０１２／００４６６５６号、同第２０１６／０３１０２００号、及び同第２０１６／００７４６２６号に記載されている方法及びデバイスによって実施することができ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、上記の操作手法及びデバイスの任意のパラメーターをエクスビボでの使用のために必要に応じて改変し、所望の操作を達成するために組み合わせることができることを理解するであろう。例えば、凍結外科的凍結とＲＦ－ＥＭＢ操作とを組み合わせることが望ましい場合、方法及びデバイスを改変すること又は組み合わせることができる。
凍結外科的凍結、エレクトロポレーション、及び／又はＲＦ－ＥＭＢを組み合わせることができる様々なデバイスに関する更なる説明は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１７／１２３９８１号に詳細に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。凍結プローブ及び／又は電極として多目的プローブを使用することに関するより詳細な説明もまた、第ＷＯ ２０１７／１２３９８１号に記載されている。
上記に考察したように、レーザー照射（例えば、紫外線又は近赤外線レーザー照射）、Ｘ線照射、又はガンマ線照射に関して、エクスビボ照射又は照射を実施するための手法又はシステムは、当技術分野で周知である。
本明細書で使用される場合、「核酸医薬」又は「治療用核酸」という用語は、所望の治療効果を達成するために使用されるヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。例示的な核酸医薬としては、例えば、ＤＮＡ、ｎＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｖＲＮＡなどが挙げられる。例えば、核酸医薬は、ＤＮＡプラスミドであり得る。
「対象」という用語は、本明細書全体を通して、本発明の方法による処置が提供される動物、ヒト又は非ヒトを記載するために使用される。獣医学的用途は、本発明によって明らかに予期される。この用語は、鳥類、爬虫類、両生類、及び哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、マウス及びラットなどの齧歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びヤギを含むが、これらに限定されない。好ましい対象は、ヒト、家畜、並びにネコ及びイヌなどの家庭内ペットである。「処置する（処置）」という用語は、本明細書において、状態、例えば、がんの発症を遅延させること、阻害すること、その影響を軽減すること、又はそれに罹患した患者の寿命を延長することを表すために使用される。
「有効量」は、有益な又は所望の結果を生じさせるのに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療効果を達成するか、又は所望の生理的応答を促進する量である。本発明で使用するための本明細書に記載される組成物の有効量には、例えば、腫瘍及び／又は腫瘍細胞に対する免疫応答を強化して、がんに罹患しているか又はがんのリスクがある患者の転帰を改善し、他のがん処置の転帰を改善する量が含まれる。臨床的な奏効を示すがん患者の場合、有効量は、疾患を軽減するか、改善するか、安定化するか、好転させるか若しくはその進行を遅延させるのに十分であり、又は疾患の病的な帰結を軽減する他の量である。有効量は、１回又は複数回の投与、適用又は投与量で投与することができる。治療用組成物の治療有効量（すなわち、有効量）は、選択される治療用組成物に依存する。治療用組成物の治療有効量は、選択される投与方法に依存する。
一部の場合には、組成物の腫瘍内投与は、静脈内投与（例えば、従来のＩＶ投与）と比較して、組成物の治療有効量を減少させる。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の処置、対象の全体的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を有効に処置するために必要とされる投与量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを認識するであろう。更に、本明細書に記載される治療組成物の治療有効量による対象の処置は、単回処置又は一連の処置を含むことができる。
「細胞株」又は「細胞培養物」は、インビトロで維持された培養物又は高等真核細胞を指す。子孫は、親細胞と同一であり得ること（又は形態学的に、遺伝子型で、若しくは表現型で）が理解されるべきである。
単数形又は複数形で使用される「腫瘍細胞」又は「がん性細胞」という用語は、宿主生物の病的細胞であるような悪性形質転換を指す。十分に確立された手法、特に組織化学的検査によって得られ、非がん性細胞と容易に区別される原発性がん細胞（すなわち、得られた悪性形質転換部位の付近の細胞）。本明細書で定義されるがんには、原発性がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先に由来する任意の細胞も含まれる。これには、がん細胞並びにインビトロ培養物及び細胞株に由来する転移性がん細胞が含まれる。
本明細書に記載される処置方法は、単独で、又は患者におけるがんを処置するための他の方法と組み合わせて使用することができる。したがって、一部の事例では、本明細書に記載される方法は、手術（例えば、腫瘍の一部を除去するため）、化学療法、免疫療法、遺伝子療法、及び／又は照射療法を使用して患者を処置することを更に含み得る。本明細書に記載される組成物及び方法は、任意の時点、例えば、手術、化学療法、免疫治療、遺伝子療法、及び／又は放射線治療の前、その間、及び／又は後に、患者に投与することができる。
本明細書に記載される治療用組成物及び処置方法は、対象におけるがんを処置するために特に有用である。「がん」という用語は、自律的に成長する能力を有する細胞を指す。そのような細胞の例には、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状況又は状態を有する細胞が含まれる。この用語は、組織病理学的な型又は侵襲性のステージにかかわらず、がん性増殖、例えば、腫瘍；転移組織、及び悪性形質転換細胞、組織、又は臓器を含むことを意味する。また、呼吸器系、心血管系、腎臓系、生殖系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系、及び内分泌系などの様々な臓器系の悪性腫瘍；並びに多くの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、小腸のがん、及び食道のがんなどの悪性腫瘍を含む腺がんも含まれる。
本明細書に記載される治療用組成物及び処置方法は、対象において天然に生じるがんを処置するために使用することができる。「天然に生じる」がんは、対象へのがん細胞の移植によって実験的に誘導されたのではない任意のがんを含み、例えば、自然発生的に生じるがん、患者の発がん物質への曝露によって引き起こされるがん、トランスジェニックがん遺伝子の挿入又は腫瘍抑制遺伝子のノックアウトから生じるがん、及び感染、例えば、ウイルス感染によって引き起こされるがんを含む。
本明細書に記載される治療用組成物及び処置方法によって処置されるがんには、がん腫、腺がん、肉腫、及び血液がんも含まれる。「がん腫」という用語は、当技術分野で認識されており、上皮組織又は内分泌組織の悪性病変を指す。この用語はがん肉腫も含み、これには、がん腫組織及び肉腫組織で構成される悪性腫瘍が含まれる。「腺がん」は、腺組織に由来するがん、又は腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがんを指す。「肉腫」という用語は、当技術分野で認識されており、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。「リンパ腫」という用語は、血液系由来の悪性腫瘍を指す。
本明細書に記載される処置方法及び治療用組成物を使用して処置することができるがん又は腫瘍には、例えば、特に、胃、結腸、直腸、口／咽頭、食道、喉頭、肝臓、膵臓、肺、乳房、子宮頸部、子宮体部、卵巣、前立腺、精巣、膀胱、皮膚、骨、腎臓、脳／中枢神経系、頭部、頸部、甲状腺、咽喉、及び血液のがん又は腫瘍；肉腫、絨毛がん、及びリンパ腫が含まれる。処置される例示的な腫瘍又はがんは、前立腺、膵臓、皮膚、結腸、肺、及び膀胱のがん又は腫瘍である。
転移性腫瘍又は転移がん（ステージＩＶ）を、本明細書に記載される処置方法及び医薬組成物を使用して処置することができる。例えば、対象の体内の１つの部位に位置する腫瘍又はがん（例えば、原発性腫瘍）に対して本明細書に記載される処置方法を行うことにより、腫瘍又はがんに対する対象の免疫防御を刺激して、対象の体内の別の部位における同じタイプ又は更に異なるタイプの腫瘍又はがん（例えば、転移性腫瘍）に対する免疫攻撃を引き起こすことができる。転移性腫瘍又は転移がんは、脳、前立腺、結腸、肺、乳房、骨、腹膜、副腎、筋肉、及び肝臓起源のものを含むがこれらに限定されない、多数の原発性腫瘍又は原発性がんのタイプから生じ得る。転移は、例えば、原発性腫瘍から脱落した腫瘍細胞が血管内皮に付着し、周囲の組織に浸透し、増殖して、原発性腫瘍とは別の部位に独立した腫瘍を形成する場合に発生する。
熟練の専門家は、本明細書に記載される処置方法及び治療用組成物を使用して、他のステージのがん又は腫瘍、例えば、上皮内がん（ステージ０）、限局性早期がん（ステージＩ）、及びより大きな腫瘍又はがん（ステージＩＩ及びステージＩＩＩ）を処置することもできることを理解するであろう。
熟練の専門家は、本明細書に記載される治療用組成物及び処置方法を使用して、非がん性増殖物、例えば、非がん性腫瘍を処置することもできることを理解するであろう。例示的な非がん性増殖物としては、例えば、良性腫瘍、腺腫、乳腺腺筋上皮腫、管又は小葉過形成、線維腺腫、線維腫、線維症及び単純嚢胞、腺腫瘍、血腫、過誤腫、管内乳頭腫、乳頭腫、顆粒細胞腫、血管腫、脂肪腫、髄膜腫、筋腫、母斑、骨軟骨腫、葉状腫瘍、神経腫（例えば、聴神経腫、神経線維腫、及び化膿性肉芽腫）、又は疣贅（例えば、足底疣贅、性器疣贅、扁平疣贅、爪周囲疣贅、及び糸状疣贅）が挙げられる。
熟練の専門家は、対象が、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、患者の病歴を評価すること、診断検査を行うこと、及び／又は画像化手法を使用することによって、本明細書に記載される状態、例えば、がんに罹患しているか、又はそのリスクがあると、医師（又は診断される対象によっては獣医）によって診断され得ることを理解するであろう。
本明細書に記載されるように、患者における腫瘍を処置する１つの例示的な方法は、（ｉ）生検又は外科的切除によって、患者の体内の腫瘍又はがんの代表的な試料を得る工程；（ｉｉ）腫瘍又はがんの少なくとも一部分のエクスビボ操作／照射の工程；（ｉｉｉ）本明細書に記載される治療用組成物（例えば、少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤及び少なくとも１種のサイトカイン又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬を、エクスビボで操作された自己がん組成物と組み合わせて含む治療用組成物）の、腫瘍又はがんへの軟部組織投与の工程；並びに（ｉｖ）任意に、核酸医薬の治療有効量を腫瘍に投与する工程を含む。
また、本明細書に記載される治療用組成物のうちの１種又は複数を含むキットも提供される。キットは、一般に、以下の主要な構成要素を含む：パッケージング、上記のような結合組成物を含む試薬、任意に対照、及び使用説明書。パッケージングは、前記の結合組成物を含有する１つのバイアル（又は複数のバイアル）、対照を含む１つのバイアル（又は複数のバイアル）、及び／又は本明細書に記載される方法に使用するための使用説明書を保持するための箱様構造であり得る。一部の場合には、パッケージングは、系統的な指示に従ってデジタルデバイスによって制御することができるカートリッジを含有する。当業者は、個々の必要性に適合するようにパッケージングを容易に改変することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、本明細書に記載される組成物のうちの少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、又はより多く）を含有する少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、又はより多く）の組成物、及びがんを処置するのに有効であることが当技術分野で公知である治療剤又は生物学的薬剤を含有する別個のバイアル中にある少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、又はより多く）の他の組成物を含むことができる。
本明細書で提供される組成物及びキットは、上記の方法（例えば、処置方法）のいずれかに従って使用することができる。例えば、組成物及びキットを、がん又は腫瘍を処置するために使用することができる。当業者は、本明細書で提供される組成物及びキットの他の好適な使用を認識しており、そのような使用のために組成物及びキットを用いることができると考えられる。
以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲を何ら限定することを意図したものではない。
（実施例１）
処置レジメン
サイトカイン薬を用いる処置レジメン
サイトカイン薬を伴う各処置サイクルは、以下の例示的な処置を含む：
自己由来がんワクチン：２５０ｍｇ／ｍ2の濃度でＧＭ－ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）中に希釈された最低１００万個の溶解されたがん細胞を含有するＵＶ照射自己由来がん溶解物ワクチンの皮内（上腕）又は腫瘍内注射、合計１．０ｍｌ。
ＰＤ－１阻害抗体であるペンブロリズマブ（キイトルーダ）：同じ部位への皮内又は腫瘍内注射、０．５ｍｌ。
抗ＣＴＬＡ－４抗体であるイピリムマブ（ヤーボイ）：同じ部位への皮内又は腫瘍内注射、０．５ｍｌ。
ＧＭ－ＣＳＦ：皮下投与、１日２５０ｍｇを合計約６週間。
必要に応じて、１回又は２回の追加の処置サイクルを行うことができる。
細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を用いる処置レジメン
細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を含む各処置サイクルは、以下の例示的な処置を含む：
自己由来がんワクチン：２５０ｍｇ／ｍ2の濃度でシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）中に希釈された最低１００万個の溶解されたがん細胞を含有するＵＶ照射自己由来がん溶解物ワクチンの皮内（上腕）又は腫瘍内注射、合計１．０ｍｌ。
ＰＤ－１阻害抗体であるニボルマブ（オプジーボ）：同じ部位への皮内又は腫瘍内注射、０．５ｍｌ。
抗ＣＴＬＡ－４抗体であるイピリムマブ（ヤーボイ）：同じ部位への皮内又は腫瘍内注射、０．５ｍｌ。
シクロホスファミド：経口投与、２５ｍｇを１日２回又は５０ｍｇを１日１回（２週間投与、２週間休薬、続いて２週間再投与、処置後１日目に開始して合計約６週間）。
必要に応じて、１回又は２回の追加の処置サイクルを行うことができる。
（実施例２）
自己由来がん溶解物ワクチンの調製
代表的な腫瘍組織標本（例えば、生検）及び細針細胞吸引物は、慣行に従って地元の処置医によって得られ、生理食塩水に浸漬され、滅菌容器に密封される。
がん溶解物ワクチンのすべての作製手順は、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）に従って実施される。慣行的な取扱い方法を、各患者試料に対して使用する（例えば、標準的な操作手順が、検査室標本の搬送、受領、及び識別、処理要求要件、危険性廃棄物の取扱いなどに適用される）。
無菌製剤室で、以下の処理工程を行う：
組織標本から流体をデカントで除いて、がんの存在及び程度を決定するための検査を行う。続いて、組織を滅菌メスで切離してがんの量が最大になるようにして（切離によって非がん組織の多くを除去することによって）、がん細胞及び非がん細胞の相対的割合を推定して記録する。続いて組織を細かく刻み、少量を試験管に入れて、３０秒間ボルテックス処理する。これらの工程を繰り返して、標本全体を範囲に含める。続いて、組織を１０ｍｇずつのアリコート（およその重量）に分けて試験管に入れて、それぞれに少なくとも１００万個のがん細胞が確実に存在するようにする。
微細針吸引物は、光学顕微鏡によって迅速に検査し、がん性細胞及び非がん性細胞の相対的割合を推定して記録する。続いて、吸引物を１０００ｒｐｍで１分間穏やかに遠心分離して、無傷細胞のペレットを作製し、上清をデカントして、ペレットを１０ｍｇずつのアリコート（およその重量）に分けて試験管に入れて、少なくとも１００万個のがん細胞が確実に存在するようにする。
実施例１の処置レジメンに応じて、処置レジメンがサイトカイン薬を伴う場合には、アリコートのそれぞれをＧＭ－ＣＳＦ（０．９％滅菌塩化ナトリウム中）で希釈し、処置レジメンが細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を伴う場合には、シクロホスファミド（２％の濃度（２０ｍｇ／ｍｌ）に再構成）で希釈する。
続いて、この希釈したアリコートを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ １８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した３００ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射で処置してネクロトーシス（免疫原性細胞死）を誘導し、５％ Ｃ０2中、３７℃で１時間インキュベートして、ネクロトーシスを進行させる。続いて、凍結（－４０℃のドライアイス／エタノール浴）及び解凍（３７℃の水浴）のサイクルを２サイクル反復することによって壊死を誘導する。第３のサイクルでは、アリコートをドライアイスで凍結させたままで処置医に送り返し、そこで、免疫療法剤と組み合わせて患者に注射する直前に最終的な解凍（室温への）を行う。
（実施例３）
ワクチン及び薬物送達
腫瘍内注射
操作者は、バイアル内容物（注射直前に予め解凍され、室温にされた自己由来がんワクチン；合計１．０ｍｌ）を、１８ゲージ、１．５インチの吸上げ針を取り付けた滅菌シリンジの中に吸い上げる。操作者は続いて、シリンジに１８ゲージ、２０ｃｍのＣｈｉｂａ（登録商標）生検針（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａ）を取り付ける。
操作者は、針の先端が所定の位置に到達するまで、画像ガイド下で針を腫瘍に挿入し、続いてワクチンを沈着させる。
針をその位置に残したままで、操作者は、空になったシリンジを外し、それを１．０ｍｌの第１の免疫療法薬（抗ＰＤ－１抗体）を含有する第２のシリンジと交換し、第１の注射の投与と同一の様式で、周囲組織を含むように豊富なオーバーフローを伴って、以前の注射の領域全体にわたってこの薬物を沈着させる。
操作者は続いて、１．０ｍｌの第２の免疫療法薬（抗ＣＴＬＡ－４抗体）を含有する第３のシリンジについてもこの手順を繰り返し、第３の薬物を沈着させる。
皮内注射
がんワクチン、抗ＰＤ－１抗体、又は抗ＣＴＬＡ－４抗体の皮内注射物の調製のために、操作者は、バイアル内容物（注射の直前に予め解凍され、室温にされた自己由来がんワクチン；合計０．５ｍｌ）を、１８ゲージ、１．５インチの吸上げ針を取り付けた滅菌シリンジの中に吸い上げる。次に、操作者は、長さ１／４～１／２インチで、２６又は２７ゲージ厚の針をシリンジに取り付ける。或いは、操作者は、シリンジをＦＤＡ認可済みのマイクロニードル（例えば、Ｍｉｃｒｏｎｊｅｔ ６００、Ｎａｎｏ Ｐａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅｈｏｖａｔ、Ｉｓｒａｅｌ）に取り付けてもよい。
がんワクチンの投与のために、操作者は、針又はマイクロニードルを皮膚に挿入する。通常サイズの針ではマントー手順を採用し、針を５～１５度の投与角度に位置決めして、シリンジ内容物をゆっくりとすべて注射する。がんワクチンシリンジに装着したマイクロニードルを皮膚に直接留置する。注射の方法は、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体についても同じである。
抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与のためには、操作者は、針又はマイクロニードルを第１の膨疹の辺縁で皮膚に挿入して、この流体と以前に投与されたがんワクチン及び抗体の流体との皮内での接触を可能にする。注射の方法は、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体についても同じである。
低用量ＧＭ－ＣＳＦの皮下投与
実施例１に記載されたサイトカイン薬を伴う処置レジメンについて、１日２５０ｍｇのＧＭ－ＣＳＦ（Ｃｙ）の皮下レジメンを、ワクチン処置のために３０日間継続する。
低用量シクロホスファミドの経口メトロノミック投与
実施例１に記載された細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬を伴う処置レジメンのためには、２５ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．（１日２回）又は５０ｍｇ ｑ．ｄ．（１日１回）でのシクロホスファミド（Ｃｙ）の経口レジメンを、各処置の直後に１４日間継続し、その後１４日間は薬物を投与せず、その後で更に１４日間の経口投与を繰り返す。

Claims (48)

  1. 腫瘍又はがんの処置のための治療用組成物であって、
    ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、
    ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、
    ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンと、
    任意に、薬学的に許容される担体と
    を含む治療用組成物。
  2. 免疫チェックポイント阻害剤が異なり、それぞれＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＰＤ－１、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ １、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、ＴＧＦ－β、ＰＩ３Ｋγ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＴＬＲ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１０、ＰＶＲＩＧ、ＣＣＲＹ、ＯＸ－４０、ＣＤ１６０、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ２７－ＣＤ７０、及びＣＤ４０からなる群から選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である、請求項１に記載の治療用組成物。
  3. 少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤が、ｉ）ＣＴＬＡ－４阻害剤、及びｉｉ）ＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む、請求項２に記載の治療用組成物。
  4. 薬物が、エリスロポエチン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカイン薬である、請求項１に記載の治療用組成物。
  5. サイトカイン薬がＧＭ－ＣＳＦである、請求項４に記載の治療用組成物。
  6. 薬物が、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、シクロホスファミド、ＢＣＧ、クロラムフェニコール、コルヒチン、シクロスポリン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカルバジン、リツキシマブ、テモゾロミド、チオテパ（ｔｈｉｔｅｐａ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ジドブジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬である、請求項１に記載の治療用組成物。
  7. 細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬がシクロホスファミドである、請求項６に記載の治療用組成物。
  8. ＣＴＬＡ－４阻害剤の濃度が約０．５～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、ＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤の濃度が約０．５～約２０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、少なくとも１種の薬物の濃度が、サイトカイン薬については約１～約１０００ｍｇ／ｍｌの範囲であり、又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬については約１０～約５００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項３に記載の治療用組成物。
  9. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、全細胞、細胞断片、組織断片、溶解物、細胞成分誘導体、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の治療用組成物。
  10. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、新鮮な全細胞である、請求項９に記載の治療用組成物。
  11. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、解離又は切離、固定、遠心分離、再懸濁、濃縮、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の処置によって調製されたがん細胞溶解物である、請求項９に記載の治療用組成物。
  12. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、ホルマリン、エタノール、又はグルタルアルデヒドによって固定されたがん細胞溶解物である、請求項１１に記載の治療用組成物。
  13. エクスビボ処置が、エクスビボ照射及び／又は操作のうちの１種又は複数の工程を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
  14. エクスビボ照射及び／又は操作が、凍結外科的凍結；高周波（ＲＦ）操作；マイクロ波操作；レーザー、光、若しくはプラズマ操作；超音波操作；高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）操作；蒸気操作；可逆的エレクトロポレーション（ＲＥ）；不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）；高周波電気的膜破壊（ＲＦ－ＥＭＢ）；ＲＦ－ＥＭＢ型操作；超短電気パルスによる操作；光線力学療法を使用する操作；非熱的衝撃波を使用する操作；キャビテーション；化学的操作；生物製剤による操作；照射；又はそれらの組合せを含む、請求項１３に記載の治療用組成物。
  15. がんワクチンが、照射及び凍結外科的凍結のうちの１種又は複数を含むエクスビボ処置によって調製され、サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物に曝露される、請求項１３に記載の治療用組成物。
  16. がんワクチンが、ＵＶ照射及び凍結外科的凍結を含むエクスビボ処置によって調製され、ＧＭ－ＣＳＦ又はシクロホスファミドの低用量溶液中に懸濁化される、請求項１５に記載の治療用組成物。
  17. エクスビボ処置が、単一のプローブを使用して、１０分間以下の総操作時間で実施される凍結外科的凍結を含む、請求項１３に記載の治療用組成物。
  18. エクスビボ処置が、約－３５～約－１００℃の温度で実施される凍結外科的凍結を含む、請求項１３に記載の治療用組成物。
  19. がんワクチンが自己由来である、請求項１に記載の治療用組成物。
  20. がんワクチンが同種異系である、請求項１に記載の治療用組成物。
  21. 皮膚又は軟組織への投与用に製剤化される、請求項１に記載の治療用組成物。
  22. ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、ＴＬＲ１３、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数のｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を更に含む、請求項１に記載の治療用組成物。
  23. 必要とする対象における腫瘍又はがんを処置する方法であって、
    ｉ）少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤と、
    ｉｉ）サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物と、
    ｉｉｉ）がん抗原の破壊を最小限に抑えながら、壊死性及び／又はネクロトーシス性がん細胞を作出するエクスビボ処置によって調製された腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体から調製されたがんワクチンと
    を含む治療用組成物を、腫瘍又はがんを処置するのに有効な量で、対象に投与することを含む方法。
  24. 治療用組成物が、対象に皮内、腫瘍内、リンパ節内、筋肉内又は皮下投与される、請求項２３に記載の方法。
  25. 治療用組成物が、注射用デバイスを使用して対象の皮膚又は軟部組織に投与される、請求項２３に記載の方法。
  26. 免疫チェックポイント阻害剤が異なり、それぞれＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＰＤ－１、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、ＴＧＦ－β、ＰＩ３Ｋγ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＴＬＲ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１０、ＰＶＲＩＧ、ＣＣＲＹ、ＯＸ－４０、ＣＤ１６０、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ２７－ＣＤ７０、及びＣＤ４０からなる群から選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である、請求項２３に記載の方法。
  27. 少なくとも２種の免疫チェックポイント阻害剤が、ｉ）ＣＴＬＡ－４阻害剤、及びｉｉ）ＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 薬物が、エリスロポエチン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ、ＩＮＦ－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカイン薬である、請求項２３に記載の方法。
  29. サイトカイン薬がＧＭ－ＣＳＦである、請求項２８に記載の方法。
  30. 薬物が、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、シクロホスファミド、ＢＣＧ、クロラムフェニコール、コルヒチン、シクロスポリン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカルバジン、リツキシマブ、テモゾロミド、チオテパ（ｔｈｉｔｅｐａ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ジドブジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬である、請求項２３に記載の方法。
  31. 細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬がシクロホスファミドである、請求項３０に記載の方法。
  32. ＣＴＬＡ－４阻害剤の濃度が約０．５～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、ＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤の濃度が約０．５～約２０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、薬物の濃度が、サイトカイン薬については約１～約１０００ｍｇ／ｍｌの範囲であり、又は細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬については約１０～約５００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項２７に記載の方法。
  33. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、全細胞、細胞断片、組織断片、溶解物、細胞成分誘導体、又はそれらの組合せである、請求項２３に記載の方法。
  34. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、新鮮な全細胞である、請求項３３に記載の方法。
  35. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、解離又は切離、固定、遠心分離、再懸濁、濃縮、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の処置によって調製されたがん細胞溶解物である、請求項３３に記載の方法。
  36. 腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、ホルマリン、エタノール、又はグルタルアルデヒドによって固定されたがん細胞溶解物である、請求項３５に記載の方法。
  37. エクスビボ処置が、エクスビボ照射及び／又は操作のうちの１種又は複数の工程を含む、請求項２３に記載の方法。
  38. エクスビボ照射及び／又は操作が、凍結外科的凍結；高周波（ＲＦ）操作；マイクロ波操作；レーザー、光、若しくはプラズマ操作；超音波操作；高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）操作；蒸気操作；可逆的エレクトロポレーション（ＲＥ）；不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）；高周波電気的膜破壊（ＲＦ－ＥＭＢ）；ＲＦ－ＥＭＢ型操作；超短電気パルスによる操作；光線力学療法を使用する操作；非熱的衝撃波を使用する操作；キャビテーション；化学的操作；生物製剤による操作；照射；又はそれらの組合せを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. がんワクチンが、照射及び凍結外科的凍結のうちの１種又は複数を含むエクスビボ処置によって調製され、サイトカイン、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１種の薬物に曝露される、請求項３７に記載の方法。
  40. がんワクチンが、ＵＶ照射及び凍結外科的凍結を含むエクスビボ処置によって調製され、ＧＭ－ＣＳＦ又はシクロホスファミドの低用量溶液中に懸濁化される、請求項３９に記載の方法。
  41. エクスビボ処置が、単一のプローブを使用して、１０分間以下の総操作時間で実施される凍結外科的凍結を含む、請求項３９に記載の方法。
  42. エクスビボ処置が、約－３５～約－１００℃の温度で実施される凍結外科的凍結を含む、請求項３９に記載の方法。
  43. がんワクチンが自己由来であり、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体が、処置される対象に由来する、請求項２３に記載の方法。
  44. がんワクチンが同種異系であり、腫瘍細胞若しくはがん細胞、又はそれらの誘導体ががん細胞株に由来する、請求項２３に記載の方法。
  45. 治療用組成物の投与後に、
    サイトカイン薬、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性化学療法薬、及びそれらの組合せから選択される薬物ｉｉ）を対象に毎日投与すること
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
  46. 薬物ｉｉ）が、ＧＭ－ＣＳＦ又はシクロホスファミドである、請求項４５に記載の方法。
  47. 薬物ｉｉ）が、皮下投与されるサイトカイン薬、又は経口投与される細胞傷害性若しくは細胞増殖抑制性化学療法薬である、請求項４５に記載の方法。
  48. 治療用組成物が、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、ＴＬＲ１３、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数のｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を更に含む、請求項２３に記載の方法。
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