JP2024506713A - 多糖およびそのポリペプチドコンジュゲートの精製方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、免疫原性組成物における使用に適した高分子量の細菌多糖(例えば、細胞壁多糖)およびそのポリペプチド-多糖コンジュゲートを精製するための方法を提供する。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2021年2月17日出願の米国仮出願番号第63/150,516号；2021年12月10日出願の米国仮出願番号第63/288,387号に対する優先権を主張するものであって、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2021年2月17日出願の米国仮出願番号第63/150,516号；2021年12月10日出願の米国仮出願番号第63/288,387号に対する優先権を主張するものであって、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(政府の助成金に関する説明)
本発明は、CARB-Xパススルー・エンティティの下、米国保健福祉省の事前準備・対応担当次官補局(HHS/ASPR)が授与する助成金番号93.360；サブアワード4500003905として米国政府の支援を受けて行われたものである。政府は、本発明について一定の権利を有している。
本発明は、CARB-Xパススルー・エンティティの下、米国保健福祉省の事前準備・対応担当次官補局(HHS/ASPR)が授与する助成金番号93.360；サブアワード4500003905として米国政府の支援を受けて行われたものである。政府は、本発明について一定の権利を有している。
(電子的に提出されたテキストファイルの説明)
本出願に関連する配列表は、紙のコピーに代えてテキスト形式で提供され、参照により本明細書中に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、STRO_015_02WO_ST25.txtである。このテキストファイルは、363 kbであり、2022年2月14日に作成され、EFS-Webを介して提出されたものである。
本出願に関連する配列表は、紙のコピーに代えてテキスト形式で提供され、参照により本明細書中に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、STRO_015_02WO_ST25.txtである。このテキストファイルは、363 kbであり、2022年2月14日に作成され、EFS-Webを介して提出されたものである。
(本発明の分野)
本発明は、一般に、細菌多糖、その精製、ポリペプチドとのコンジュゲーションおよびそのような多糖-ポリペプチドコンジュゲートを含む免疫原性組成物の分野に関する。
本発明は、一般に、細菌多糖、その精製、ポリペプチドとのコンジュゲーションおよびそのような多糖-ポリペプチドコンジュゲートを含む免疫原性組成物の分野に関する。
(背景)
細菌の細胞壁および細胞膜は、糖コンジュゲートおよび多糖類(PS)を含む多くの高分子分子と結合しており、これらは、細菌において様々な構造的および機能的役割を果たしている。グラム陰性菌では、外膜の大部分はリポ多糖(LPS)で構成されている。グラム陽性菌は外膜を持たないが、特殊な多糖類を含む厚いペプチドグリカン層を持つ。グラム陰性菌、グラム陽性細菌ともに、菌株によっては、さらに病原性を助長させるペプチドグリカン結合型の莢膜多糖類を含んでいる。
細菌の細胞壁および細胞膜は、糖コンジュゲートおよび多糖類(PS)を含む多くの高分子分子と結合しており、これらは、細菌において様々な構造的および機能的役割を果たしている。グラム陰性菌では、外膜の大部分はリポ多糖(LPS)で構成されている。グラム陽性菌は外膜を持たないが、特殊な多糖類を含む厚いペプチドグリカン層を持つ。グラム陰性菌、グラム陽性細菌ともに、菌株によっては、さらに病原性を助長させるペプチドグリカン結合型の莢膜多糖類を含んでいる。
多くのPS、例えば、髄膜炎菌、HiBおよび肺炎球菌などの細菌のPSに対する免疫を誘導することで、疾病に対する保護が得られ、多くの効果的なワクチンが開発されている。しかし、大規模なワクチン製造には、その他の細胞成分を含まない純粋で均質な多糖類を、大規模かつコスト効率良く供給する必要がある。多糖類を精製するいくつかの従来法は、過酷な条件(例えば、濃フッ化水素酸)に依存しており、安全性に関して問題があり、製造のスケールアップにも限界がある。さらに、多くの精製法は、標的多糖をある程度分解して収量を低下させるか、あるいは免疫原性が制限または低下された低分子量の多糖をもたらす。従って、より安全で、収率が高く、効率的な多糖生産方法が必要とされている。
A群溶血性レンサ球菌(GAS)は、世界中で年間7億例の咽頭炎(「溶連菌性咽頭炎」)を引き起こし、重篤な侵襲性感染症、敗血症、壊死性筋膜炎、中耳炎および中毒性ショック症候群の症例を増加させている、傑出したヒト病原体である。GASはまた、発展途上国における主要な死亡原因である、感染後の免疫介在性リウマチ性心疾患(RHD)の原因でもある。現在、約3,000万人がRHDに罹患しており、年間30万人以上が死亡し(60％が70歳未満)、1,150万人の障害調整生存年が失われている。世界的に高い需要があるにもかかわらず、安全で有効な治療薬はない。さらに、免疫優性表面アンカー型のGAS Mタンパク質は、非常に多型であり(200を超えるemm型)、その二量体コイルドコイル構造の領域は、RHDの心臓組織に対する自己免疫反応を引き起こす場合がある。従って、GAS感染を予防または治療できる免疫原性組成物が必要とされている。前記組成物は、タンパク質-抗原コンジュゲートを活用することができ、従って十分な免疫原性を有するコンジュゲートが必要とされている。
(発明の要約)
本明細書において開示される内容は、(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド；ならびに(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲートである。
本明細書において開示される内容は、(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド；ならびに(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲートである。
A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原、GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原ならびにポリペプチド-多糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物が、本明細書に記載される。ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、後記のものを含み得る： (i)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む化膿レンサ球菌接着/分裂(Streptococcus pyogenes Adhesion and Division)(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(ここで、前記少なくとも1つのnnAAが、クリックケミストリー反応基を含む)；および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント。GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol%～約20mol%は、リンカーによって誘導体化されていてもよい。ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDa～約700kDaまたは約190kDa～約700kDaの間である。
また、本明細書には、細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための方法も開示されており、この方法は：(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解して、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および(b)多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素(muralytic enzyme)と共にインキュベートして遊離多糖溶液を形成させる工程を含む。
(発明の詳細な説明)
本明細書には、細菌細胞から高分子量多糖PS(本明細書では長鎖多糖と呼ぶ)を精製する方法が記載されている。これらのPSは、当該分野で公知の方法を用いて単離されたものよりも高い平均分子量を有しているため、免疫原性および／または安定性が高いワクチン、即ち免疫原性組成物などの製造において使用され得る。このような免疫原性組成物を、本明細書に記載する。PSサイズの増大に加えて、本明細書に記載される方法は、従来の精製方法よりも高い収率をもたらし得る。結果として、これらの方法により、より効率的な精製PSの製造が可能となる。
本明細書には、細菌細胞から高分子量多糖PS(本明細書では長鎖多糖と呼ぶ)を精製する方法が記載されている。これらのPSは、当該分野で公知の方法を用いて単離されたものよりも高い平均分子量を有しているため、免疫原性および／または安定性が高いワクチン、即ち免疫原性組成物などの製造において使用され得る。このような免疫原性組成物を、本明細書に記載する。PSサイズの増大に加えて、本明細書に記載される方法は、従来の精製方法よりも高い収率をもたらし得る。結果として、これらの方法により、より効率的な精製PSの製造が可能となる。
多糖の精製
本明細書に記載の方法は、細菌細胞から多糖類を精製するのに有用である。細菌細胞は、例えば、当該分野で公知の標準的な技術を用いて培養物からペレットとして単離され得る。ある実施形態において、本開示は、、細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための方法、例えば、細菌細胞のペレットを精製するための方法を提供する。
本明細書に記載の方法は、細菌細胞から多糖類を精製するのに有用である。細菌細胞は、例えば、当該分野で公知の標準的な技術を用いて培養物からペレットとして単離され得る。ある実施形態において、本開示は、、細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための方法、例えば、細菌細胞のペレットを精製するための方法を提供する。
「精製」とは、本明細書で使用される場合、細菌細胞に存在する非多糖成分から多糖を除去または部分的に除去することを指す。精製は、不純物および／または副生成物の少なくとも約85％を除去することを意味し得る。ある実施形態において、「精製された」多糖溶液または調製物は、約15％未満、約14％未満、約13％未満、約12％未満、約11％未満、約10％未満、約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.9%未満、約0.8%未満、約0.7%未満、約0.6%未満、約0.5%未満、約0.4%未満、約0.3%未満、約0.2%未満、約0.1%未満、約0.09%未満、約0.08%未満、約0.07%未満、約0.06%未満、約0.05%未満、約0.04%未満、約0.03%未満、約0.02%未満または約0.01%未満の不純物および/または副生成物を含む。
本明細書で用いられる「細胞壁多糖」とは、細菌の細胞壁に存在するあらゆるPSを指し、例えば、細菌の莢膜に存在するものとは異なる。細胞壁多糖は、ペプチドグリカンを介して細胞に結合し得る。細胞壁多糖は、グラム陽性またはグラム陰性の細菌細胞に由来し得る。例示的な細胞壁多糖は、A群レンサ球菌(GAS)PSである。
「ペプチドグリカン結合型莢膜多糖」は、本明細書で使用される場合、ペプチドグリカンを介して細胞に結合し、本明細書に記載される方法の条件下で分解されにくい細菌莢膜由来の任意のPSを指す。これらには、グルコース、ラムノース、ガラクトース、マンノース、リボース、グルクロン酸、ガラクツロン酸および2-アセトアミド-4-アミノ-2,4,6-トリデオキシガラクトース(AATGal)などの単糖のある組み合わせを含有する特定のPSが含まれる。ペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、グラム陽性またはグラム陰性細菌細胞に由来し得る。記載された方法による精製に適したペプチドグリカン結合型莢膜多糖はまた、O-アセチル化が殆どないか、または全くないか、あるいはホスホジエステル結合が殆どないか、または全くないことを特徴とする。
一般に、本明細書に記載される細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための方法は、塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解する工程；ならびに多糖を含有する組成物を壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解して、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および(b)多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程を包含する。ある実施形態において、細菌細胞から、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を製造するための方法は、(a)細菌細胞を壁分解性酵素と共にインキュベートして、切断された多糖の溶液を形成させる工程；および(b)切断された多糖溶液を塩基と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程を包含する。
ある実施形態において、本明細書に記載の方法は、O-アセチル基を欠失している多糖の精製に適している。精製方法は、N-アセチル化グルコース、ラムノース、マンノース、リボースまたはガラクトースモノマーを有するPSに使用され得る。本明細書に記載される方法のある実施形態において、細菌細胞は、シュードモナス属(Pseudomonas)細菌細胞、レンサ球菌属(Streptococcus)細菌細胞、ブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌細胞、ナイセリア属(Neisseria)細菌細胞、ヘモフィルス属(Haemophilus)細菌細胞、リステリア属(Listeria)細菌細胞、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌細胞またはクロストリジウム属(Clostridium)細菌細胞である。ある実施形態において、細菌細胞は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、ミュータンスレンサ球菌(Streptococcus mutans)および化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)からなる群より選択される。
ある実施形態において、細菌細胞は、A群レンサ球菌(GAS)としても知られる化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)である。GASは、グラム陽性である鎖状のβ溶血性球菌である。これは、ヒトの様々な疾患の原因となる。これらの疾患には、溶連菌性咽頭炎(急性咽頭炎)、中耳炎、皮膚および軟部組織の感染症(例えば膿痂疹または蜂窩織炎など)が挙げられる。また、これら疾患は、まれに壊死性筋膜炎(肉食性疾患)や毒性ショック症候群(TSS)のような侵襲性(重篤な)疾患を引き起こす場合もある。いくつかの病原性因子は、GASの病因(例えば、Mタンパク質、ヘモリシンおよび細胞外酵素)に関与している。ある実施形態において、化膿レンサ球菌は、以下の血清型から選択されるものである：M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M41、M43、M44、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89およびM92、M94、M110または前記のいずれかのバリアント。本明細書に記載した方法のある実施形態において、Mタンパク質(例えば、M1)は、単離された長鎖多糖の良好な収量を維持しながら精製中に効率的に除かれる。
ある実施形態において、化膿レンサ球菌細菌細胞は、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GLcNAc)側鎖を欠失している多糖またはそのバリアントを産生するように遺伝子操作され得る(例えば、国際PCT公開第WO 2013/020090号、米国特許第10,780,155号、国際PCT公開第WO 2021/167996号およびGao, N.J. et al. Infectious Microbes and Diseases, doi: 10.1097/IM9.000000000044)。
ある実施形態において、本明細書に記載の方法は、細菌細胞からペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するのに適切であり得る。
本開示の方法において、塩基による細菌細胞の処理は、その他の細胞成分(例えば、細胞壁など)から多糖を解離させる役割を果たし得る。酸処理を利用するPS精製の公知方法とは異なり、本明細書に記載の使用される塩基は、ネイティブな多糖に含まれるグリコシド結合の加水分解を避けることが可能である。具体的には、細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製する方法は、塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解し、多糖を含有する分解溶液を形成することを含む。開示される方法に好適な塩基の非限定的な例は、アルカリ金属水酸化物(例えば、NaOH、KOH、LiOHなど)、炭酸塩(例えば、Na2CO3、K2CO3など)、有機アミン(例えば、Et3N、NH3など)およびアルコキシド(例えば、NaOMe、NaOEtおよびKOtBuなど)である。ある実施形態では、塩基は、NaOH、KOHまたはLiOHである。特定の実施形態では、塩基は、NaOHである。特定の実施形態では、塩基は、KOHである。特定の実施形態では、塩基は、LiOHである。
ある実施形態では、塩基の濃度は、約2M～約8Mの間である。特定の実施形態では、塩基の濃度は、約2M～約6Mの間である。特定の実施形態において、塩基の濃度は、約2M～約4Mの間である。特定の実施形態において、塩基の濃度は、約4M～約8Mの間である。特定の実施形態において、塩基の濃度は、約4M～約6Mの間である。特定の実施形態において、塩基の濃度は、約6M～約8Mの間である。本開示のある実施形態において、塩基および還元剤を含有する溶液は、約pH7より大きい。特定の実施形態において、塩基および還元剤を含有する溶液は、約pH8、約pH9、約pH10、約pH11、約pH12、約pH13または約pH14である。
PSは、高いpHの下では「脱離反応」と呼ばれる過程を経て劣化することがあり、この過程を防ぐために還元剤を添加する場合がある。脱離反応に対抗するために、任意の適切な還元剤を選択することができる。ある実施形態において、還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールから選択される。特定の実施形態において、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムである。還元剤の濃度は、約1mM～約500mMであり得る。ある実施形態では、還元剤の濃度は、約1mM～約500mMである。特定の実施形態において、還元剤の濃度は、約1mM～約400mM、約1mM～約300mM、約1mM～約200mM、約1mM～約100mM、約1mM～約50mM、約1mM～約10mM、約10mM～約100mM、約100mM～約400mM、約100mM～約300mM、約100mM～約200mM、約200mM～約400mM、約200mM～約300mMならびに約300mM～約400mMである。
塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解して、多糖を含有する分解溶液を形成する場合、より高分子量のPSおよびより高い収率を達成するために、温度を上昇させることができる。ある実施形態において、加水分解工程は、溶液を約30℃～約100℃の間でインキュベートすることをさらに含む。特定の実施形態において、加水分解工程は、以下の温度の間で溶液をインキュベートすることをさらに含む：約30℃～約100℃；約30℃～約90℃；約30℃～約80℃；約30℃～約70℃；約30℃～約60℃；約30℃～約50℃；約30℃～約40℃；約40℃～約100℃；約40℃～約90℃；約40℃～約80℃；約40℃～約70℃；約40℃～約60℃；約40℃～約50℃；約50℃～約100℃；約50℃～約90℃；約50℃～約80℃；約50℃～約70℃；約50℃～約60℃；約60℃～約100℃；約60℃～約90℃；約60℃～約80℃；約60℃～約70℃；約70℃～約100℃；約70℃～約90℃；約70℃～約80℃；約80℃～約100℃；約80℃～約90℃；または約90℃～約100℃。
多糖を含有する分解溶液を形成するための塩基および還元剤を含有する溶液は、反応の完了に十分な時間インキュベートされ得る。例えば、ある実施形態において、加水分解工程は、約0.5時間～約20時間の間で溶液をインキュベートすることをさらに含む。特定の実施形態において、加水分解工程は、約0.5時間～約1時間；約1時間～約5時間；約5時間～約20時間；約5時間～約15時間；約5時間～約10時間；約10時間～約20時間；約10時間～約15時間；または約15時間～約20時間の間で溶液をインキュベートすることをさらに含む。加水分解の完了は、例えば、適切な分析法によって多糖の収量を決定することによってモニタリングできる。
多糖を含有する分解溶液を形成するために塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解することによって、除去されるべき非PS副生成物が形成されるため、本方法は、それらの副生成物の除去を補助するための1つ以上のpH調整工程を含み得る。一実施形態において、1つ以上のpH調整工程は、以下から独立して選択される：(i)多糖を含有する分解溶液のpHを上昇させるか、または(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを低下させる。
ある実施形態において、この方法は、多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～約7の間に低下させることを含む。特定の実施形態において、当該方法は、多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～約6の間；約3～約5の間；約3～約4の間；約4～約7の間；約4～約6の間；約4～約5の間；約5～約7の間；または約5～約6の間に低下させることを含む。ある実施形態において、当該方法は、多糖を含有する分解溶液のpHを、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5または約7に低下させることを含む。ある実施形態において、当該方法は、以下の工程：(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～約7.0の間に低下させる工程；(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3に低下させる工程；および(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～約7.0の間に上昇させる工程を包含する。特定の実施形態において、当該方法は、(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5まで低下させる工程；(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3まで低下させる工程；および(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5まで上昇させる工程を包含する。
本明細書に開示される方法において、多糖を含有する分解溶液は、1つ以上のpH調整工程の後、室温でインキュベートされ得る。「室温」とは、実験室環境における周囲温度として定義され、典型的には約20℃～約25℃の間である。ある実施形態において、多糖を含有する分解溶液は、1つ以上のpH調整工程の後、約4℃～約30℃の間でインキュベートされる。特定の実施形態において、多糖を含有する分解溶液は、1つ以上のpH調整工程の後、以下の温度でインキュベートされる：約4℃～約30℃；約4℃～約25℃；約4℃～約20℃；約4℃～約15℃；約4℃～約10℃；約10℃～約30℃；約10℃～約25℃；約10℃～約20℃；約10℃～約15℃；約15℃～約30℃；約15℃～約25℃；約15℃～約20℃；約20℃～約30℃；約20℃～約25℃；または約25℃～約30℃。
加水分解の工程中に形成された固体の副生成物を除去することは有益であり得る。従って、ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程をさらに含み得る。ある実施形態において、多糖を含有する分解溶液から固体を除去することには、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせが含まれる。ある実施形態において、濾過は、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、膜濾過またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、固体は、遠心分離によって多糖を含有する分解溶液から除去される。固体を除去する種々の方法は、組み合わせて、また任意の順序により用いることができる。ある実施形態において、濾過は、デプス濾過の後にTFFを行うことを含む。
本開示の方法において、細菌細胞または多糖を含む分解溶液を、壁分解性酵素を用いて処理することにより、ペプチドグリカン内のグリコシド結合が切断され、PSをアミノ酸骨格から解離させるのに役立つ。壁分解性酵素は、例えば、N-アセチルムラミン酸(NAM)とN-アセチルグルコサミン(NAG)の結合を切断する。具体的には、加水分解後、酵素切断工程は、多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させることを含み得る。ある実施形態において、壁分解性酵素は、ムタノリシン、リゾチームまたはバクテリオファージ加水分解酵素である。精製をさらに補助するために、ある実施形態では、遊離多糖溶液を形成するために、多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートする工程には、プロテアーゼと共にインキュベートする工程をさらに含む。ある実施形態において、プロテアーゼとは、プロテイナーゼKである。特定の実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、ペプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパイン、サブチリシン、クロストリパイン、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カテプシンC、アシルアミノ酸放出酵素またはピログルタメートである。
本明細書中に開示される方法のある実施形態において、遊離多糖溶液を形成させるために、多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートする工程は、多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共に約30℃～約65℃の間に加温する工程をさらに含む。ある実施形態において、壁分解性酵素と共に多糖を含有する分解溶液は、約30℃～約60℃；約30℃～約55℃；約30℃～約50℃；約30℃～約45℃；約30℃～約40℃；約30℃～約35℃；約40℃～約60℃；約40℃～約55℃；約40℃～約50℃；約40℃～約60℃；約40℃～約55℃；約40℃～約50℃；約45℃～約60℃；約45℃～約55℃；約45℃～約50℃；約50℃～約60℃；または約55℃～約60℃の間に加温される。
ある実施形態において、多糖を含有する分解溶液はプロテアーゼと共に加温される。ある実施形態において、多糖を含有する分解溶液をプロテアーゼと共に、約45℃～約55℃の間；約45℃～約50℃の間；または約50℃～約55℃の間に加温される。
PSを含む分解溶液と壁分解性の酸の両方あるいはPSを含む分解溶液とプロテアーゼ両方の場合、分解溶液は、少なくとも2時間加温することができる。ある実施形態では、分解物は、以下の時間加温される：約6時間～約20時間；約6時間～約18時間；約6時間～約16時間；約6時間～約14時間；約6時間～約12時間；約6時間～約10時間；約6時間～約8時間；約8時間～約20時間；約8時間～約18時間；約8時間～約16時間；約8時間～約14時間；約8時間～約12時間；約8時間～約10時間；約10時間～約20時間；約10時間～約18時間；約10時間～約16時間；約10時間～約14時間；約10時間～約12時間；約12時間～約20時間；約12時間～約18時間；約12時間～約16時間；約12時間～約14時間；約14時間～約20時間；約14時間～約18時間；約14時間～約16時間；約16時間～約20時間；約16時間～約18時間；または約18時間～約20時間。
副生成物からPSの分離をさらに補助するために、多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートする工程中に生じた遊離多糖溶液をさらに精製する。ある実施形態において、遊離多糖溶液は、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させるためにさらに精製される。特定の実施形態において、遊離多糖溶液は、沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによってさらに精製される。
ある実施形態において、遊離多糖溶液は、沈殿によって更に精製される。この沈殿は、多数の化学的または物理的手段によって誘導することができる。ある実施形態において、遊離多糖溶液は、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させるためにさらなる精製により処理される。ある実施形態では、遊離多糖溶液は、界面活性剤で処理される。ある実施形態において、界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)である。特定の実施形態において、遊離多糖溶液中のCTABの濃度は、約0.1％～約10％である。ある実施形態では、遊離多糖溶液中のCTABの濃度は、約0.1%～約0.5%；約0.5%～約3%；約0.5%～約2%；約0.5%～約1%；約1%～約10%；約1%～約9%；約1%～約8%；約1%～約7%；約1%～約6%；約1%～約5%；約1%～約4%；約1%～約3%；約1%～約2%；約2%～約10%；約2%～約9%；約2%～約8%；約2%～約7%；約2%～約6%；約2%～約5%；約2%～約4%；約2%～約3%；約3%～約10%；約3%～約9%；約3%～約8%；約3%～約7%；約3%～約6%；約3%～約5%；約3%～約4%；約4%～約10%；約4%～約9%；約4%～約8%；約4%～約7%；約4%～約6%；約4%～約5%；約5%～約10%；約5%～約9%；約5%～約8%；約5%～約7%；約5%～約6%；約6%～約10%；約6%～約9%；約6%～約8%；約6%～約7%；約7%～約10%；約7%～約9%；約7%～約8%；約8%～約10%；約8%～約9%；または約9%～約10%である。
溶液から過剰量のCTABを除去するために、ヨウ化カリウム(KI)またはその他の適切な塩を利用することができる。ある実施形態において、遊離多糖溶液は、カリウムKIで処理される。ある実施形態において、遊離多糖溶液中のKIの濃度は、約20mM～約400mMである。特定の実施形態において、KIの濃度は、約20mM～約300mM；約20mM～約200mM；約20mM～約100mM；約20mM～約50mM；約50mM～約300mM；約50mM～約200mM；約50mM～約100mM；約100mM～約300mM；約100mM～約200mM；または約200mM～約300mMの間である。
細菌細胞から精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を生成するための方法中に生じた遊離多糖溶液は、任意の時点で、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたは前記の組み合わせによって、さらに精製され得る。ある実施形態では、濾過が使用される。特定の実施形態において、濾過は、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過または前述の組み合わせを含む。ある実施形態において、クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を含む。
ポリペプチド-多糖コンジュゲート
前述したように、本明細書に記載の方法によって得られる高分子多糖は、ワクチンなどに使用するためのポリペプチド-多糖コンジュゲートの形成に適している。
前述したように、本明細書に記載の方法によって得られる高分子多糖は、ワクチンなどに使用するためのポリペプチド-多糖コンジュゲートの形成に適している。
本開示の高分子量の多糖は、「長鎖多糖」とも呼ばれる場合がある。
従って、本明細書で開示するポリペプチド-多糖コンジュゲートは、(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むポリペプチド抗原(例えば、GASポリペプチド抗原)または非GASキャリアポリペプチド；および(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を含む。本明細書でより詳細に説明するように、nnAAは、ポリペプチド抗原とPSとの間のコンジュゲーションを促進するためのクリックケミストリー反応基を含む。
ある実施形態において、コンジュゲートに使用される多糖は、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖である。
前述のように、GASは、ヒトの健康にとって重要な細菌であり、多くの疾患の原因となっている。ある実施形態において、精製された細胞壁多糖はGAS多糖である。GAS多糖の1つであるA群炭水化物(GAC)は、免疫優性のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を有するポリラムノース骨格を含んでおり、M型に関係なくすべてのGAS血清型の株表面に存在しており、GASワクチン候補として検討されてきた。親和性精製抗GAC抗体は、試験した3つのGAS血清型のオプソニン化に成功し(Salvadori et al., 1995. J. Infect. Dis. 171:593-600.)、GACで免疫化されたマウスは、腹腔内および鼻腔内のGASチャレンジに対して保護された。しかし、抗GAC抗体と、宿主心臓弁タンパク質(Goldstein et al., 1967. Nature 213:44-47)およびアクチン、ケラチン、ミオシンおよびビメンチンなどの細胞骨格タンパク質との間の免疫学的交差反応性により、GASワクチン構成成分としてのGACの使用に関して安全面での重大な懸念が引き起こされる。従って、ある実施形態では、精製された細胞壁多糖は、免疫優性GlcNAc側鎖を欠失しているGACのバリアントである(例えば、国際PCT公開第WO 2013/020090号、米国特許第10,780,155号およびGao, N. J. et al., Infectious Microbes and Diseases, 2021, 3(2), 87-100を参照)。
ある実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、約10kDa～約45kDa；約10kDa～約40kDa；約10kDa～約35kDa；約10kDa～約30kDa；約10kDa～約25kDa；約10kDa～約20kDa；約10kDa～約15kDa；15kDa～約40kDa；約15kDa～約35kDa；約15kDa～約30kDa；約15kDa～約25kDa；約15kDa～約20kDa；20kDa～約40kDa；約20kDa～約35kDa；約20kDa～約30kDa；約20kDa～約25kDa；25kDa～約40kDa；約25kDa～約35kDa；約25kDa～約30kDa；約30kDa～約40kDa；約30kDa～約35kDa；または約35kDa～約40kDaの平均分子量を有する。ある実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、約10kDa、約15kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDa、約35kDa、約40kDaまたは約45kDaの平均分子量を有する。
ある実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、コンジュゲートタンパク質へのコンジュゲーションを容易にするために、クリックケミストリー反応基で修飾される。クリックケミストリー反応基の例は、例えば、国際PCT公開第WO2018／126229号および国際PCT公開第WO2021／167996号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ある実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、DBCOまたはDBCO-PEG(例えば、DBCO-PEG-NH2)で修飾される。ある実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、DBCO-(PEG)4-NH2で修飾される。
精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖が、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーで修飾される程度は、多糖反復単位(PSRU)が、幾つ修飾されたか、または何％(例えば、mol％)修飾されたかによって定義され得る。従って、本明細書に記載の精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖のある実施形態では、約8mol％～20mol％の多糖反復単位が、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーによって誘導体化される。ある実施形態において、多糖のPS反復単位の約8mol%～約20mol%、約8mol%～約19mol%、約8mol%～約18mol%、約8mol%～約17mol%、約8mol%～約16mol%、約8mol%～約15mol%、約8mol%～約14mol%、約8mol%～約13mol%、約8mol%～約12mol%、約8mol%～約11mol%、8mol%～約10mol%、約8mol%～約9mol%、約9mol%～約20mol%、約9mol%～約19mol%、約9mol%～約18mol%、約9mol%～約17mol%、約9mol%～約16mol%、約9mol%～約15mol%、約9mol%～約14mol%、9mol%～約13mol%、約9mol%～約12mol%、約9mol%～約11mol%、9mol%～約10mol%、約10mol%～約20mol%、約10mol%～約19mol%、約10mol%～約18mol%、約10mol%～約17mol%、約10mol%～約16mol%、約10mol%～約15mol%、約10mol%～約14mol%、10mol%～約13mol%、約10mol%～約12mol%、約10mol%～約11mol%、約11mol%～約20mol%、約11mol%～約19mol%、約11mol%～約18mol%、約11mol%～約17mol%、約11mol%～約16mol%、約11mol%～約15mol%、約11mol%～約14mol%、約11mol%～約13mol%、約11mol%～約12mol%、約12mol%～約20mol%、約12mol%～約19mol%、約12mol%～約18mol%、約12mol%～約17mol%、約12mol%～約16mol%、約12mol%～約15mol%、約12mol%～約14mol%、12mol%～約13mol%、約13mol%～約20mol%、約13mol%～約19mol%、約13mol%～約18mol%、約13mol%～約17mol%、約13mol%～約16mol%、約13mol%～約15mol%、約13mol%～約14mol%、約14mol%～約20mol%、約14mol%～約19mol%、約14mol%～約18mol%、約14mol%～約17mol%、約14mol%～約16mol%、約14mol%～約15mol%、約15mol%～約20mol%、約15mol%～約19mol%、約15mol%～約18mol%、約15mol%～約17mol%、約15mol%～約16mol%、約16mol%～約20mol%、約16mol%～約19mol%、約16mol%～約18mol%、約16mol%～約17mol%、約17mol%～約20mol%、約17mol%～約19mol%、約17mol%～約18mol%、約18mol%～約20mol%、約18mol%～約19mol%または約19mol%～約20mol%は、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーによって誘導体化される。ある実施形態において、多糖の反復単位は、GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位である。本明細書に記載の精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖のある実施形態では、多糖反復単位の約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20mol％が、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーによって誘導体化される。ある実施形態において、GAS多糖またはそのバリアントは、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している。
一般に、多糖の多糖反復単位へのリンカー導入量(mol％)を増加させると、分子量が増加したポリペプチド-多糖コンジュゲートを製造できる。本明細書でさらに議論されるように、リンカーの導入量が多い多糖類を用いて形成されたポリペプチド-多糖コンジュゲートは、リンカー導入のモル百分率が低いものよりも高い免疫原性を示す可能性がある。さらに、本明細書でさらに議論されるように、リンカー導入量が増加した多糖は、コンジュゲーション後に存在する遊離多糖の量も少なくなり得る。
本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物に関して、「遊離多糖」とは、ポリペプチドにコンジュゲートされていない多糖、リンカーおよび／またはクリックケミストリー反応基で誘導体化された多糖または多糖のフラグメントを指す。例えば、誘導体化された多糖とポリペプチドとの間のコンジュゲーション反応を行った後、ポリペプチド-多糖コンジュゲートの混合物中に遊離の多糖が存在する場合がある。多糖の濃度は、例えば、実施例6に記載した方法で測定することができる。
本明細書に記載されるコンジュゲートに使用されるポリペプチド抗原は、GASまたは非GASポリペプチド抗原であり得る。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む、全長GASポリペプチド抗原または全長GASポリペプチド抗原のフラグメントである。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、C5aペプチダーゼ(UniProt P15926)、ストレプトリジンO(SLO, UniProt P0C0I3)、レンサ球菌免疫グロブリン結合タンパク質35[Sib35, UniProt (Q1XG74)]およびフィブロネクチン結合タンパク質F1(Sfb1, UniProt Q48VN7)ならびに接着/分裂ポリペプチド(SpyAD, UniProt Q9A1H3)から選択される。
本明細書に記載されるコンジュゲートに使用される非GASキャリアポリペプチドは、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む、全長非GASキャリアポリペプチドまたは全長非GASキャリアポリペプチドのフラグメントに基づくことができる。ある実施形態において、非GASキャリアポリペプチドは、アルギニンデイミナーゼ(ADI, UniProt P0C0B3)、CRM197(1272033-67-6)、フェリチン(UniProt P02792)およびプロテインD(UniProt R4R7Q5)から選択される。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原または非GASキャリアタンパク質は、野生型アミノ酸配列において1つ以上のアミノ酸変異を含む。例えば、ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSpyADであり、前記SpyADポリペプチドは1つ以上のアミノ酸変異を含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原はADIであり、前記ADIポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸変異を含む。ある実施形態において、アミノ酸変異は、D277A(例えば、配列番号：36)である。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原または非GASキャリアタンパク質は、少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む。ある実施形態において、少なくとも1つのnnAAは、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドにおいてリジン、ロイシン、アルギニンまたはイソロイシンに置換される。ある実施形態において、1つ以上のnnAAは、クリックケミストリー反応基を含む。ここで、「クリックケミストリー反応基」とは、第2のクリックケミストリー反応基とクリックケミストリー反応を起こすことができる、アジドまたはアルキンなどの部位を指す。ある実施形態では、1つのクリックケミストリー反応基が第2のクリックケミストリー反応基と反応して置換トリアゾールを形成する。このタイプのクリック反応の例は、例えば、国際PCT公開第WO2018／126229号に見出すことができる。生物医学用途で使用される金属を含まないクリック反応の一般的な例は、例えば、Kim, et al., Chemical Science, 2019, 10, 7835-7851に見出すことができる。クリック化学反応性基を含むnnAAsの例としては、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸が挙げられる。ある実施形態において、コンジュゲートポリペプチドは、1つ以上のnnAAを含み、各nnAAは、pAMFである。
本明細書に記載されるポリペプチド-多糖コンジュゲートは、任意の合理的な特性評価方法(例えば、SEC-MALS)によって規定される分子量(例えば、平均分子量)によって特徴付けられ得る。ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、例えば、約185kDa以上または190kDa以上の分子量または平均分子量を有し得る。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、約185kDa～約700kDa、約185kDa～約600kDa、約185kDa～約500kDa、約185kDa～約400kDa、約185kDa～約300kDaおよび約185kDa～約200kDaの分子量または平均分子量を有する。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、約185kDa～約700kDa、約185kDa～約650kDa、約185kDa～約600kDa、約185kDa～約550kDa、約185kDa～約500kDa、約185kDa～約450kDa、約185kDa～約400kDa、約185kDa～約350kDa、約185kDa～約300kDa、約185kDa～約250kDa、約185kDa～約200kDa、約190kDa～約700kDa、約190kDa～約650kDa、約190kDa～約600kDa、約190kDa～約550kDa、約190kDa～約500kDa、約190kDa～約450kDa、約190kDa～約400kDa、約190kDa～約350kDa、約190kDa～約300kDa、約190kDa～約250kDa、約190kDa～約200kDa、約200kDa～約700kDa、約200kDa～約650kDa、約200kDa～約600kDa、約200kDa～約550kDa、約200kDa～約500kDa、約200kDa～約450kDa、約200kDa～約400kDa、約200kDa～約350kDa、約200kDa～約300kDa、約200kDa～約250kDa、約250kDa～約700kDa、約250kDa～約650kDa、約250kDa～約600kDa、約250kDa～約550kDa、約250kDa～約500kDa、約250kDa～約450kDa、約250kDa～約400kDa、約250kDa～約350kDa、約250kDa～約300kDa、約300kDa～約700kDa、約300kDa～約650kDa、約300kDa～約600kDa、約300kDa～約550kDa、約300kDa～約500kDa、約300kDa～約450kDa、約300kDa～約400kDa、約300kDa～約350kDa、約350kDa～約700kDa、約350kDa～約650kDa、約350kDa～約600kDa、約350kDa～約550kDa、約350kDa～約500kDa、約350kDa～約450kDa、約350kDa～約400kDa、約400kDa～約700kDa、約400kDa～約650kDa、約400kDa～約600kDa、約400kDa～約550kDa、約400kDa～約500kDa、約400kDa～約450kDa、約450kDa～約700kDa、約450kDa～約650kDa、約450kDa～約600kDa、約450kDa～約550kDa、約450kDa～約500kDa、約500kDa～約700kDa、約500kDa～約650kDa、約500kDa～約600kDa、約500kDa～約550kDa、約550kDa～約700kDa、約550kDa～約650kDa、約550kDa～約600kDa、約600kDa～約700kDa、約600kDa～約650kDaまたは約650kDa～約700kDaの間の分子量または平均分子量を有し得る。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、約185、約190、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650または約700kDaの分子量または平均分子量を有し得る。
ある実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートは、その分子量によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートは、リンカーによって誘導体化されたGAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位のmol％によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートは、その分子量、ならびにリンカーによって誘導体化されたGAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位のmol％によって特徴付けられ得る。
ある実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートは、(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド(前記nnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を含む。
ある実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートは、後記を含む：(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド(前記nnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および (b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖；ここで、前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約18mol％は、リンカーによって誘導体化されている。
表1は、選択されたポリペプチド抗原および非GASキャリアタンパク質の例示的配列を示しており、これには、ネイティブ、バリアント、切断型およびnnAA含有バージョンが含まれる。
表1Aは、nnAAsを含有する選択されたポリペプチド抗原の例示的配列を示す。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSLOである。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SLO(ΔC101)であり、配列番号：53のK98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407およびK464から選択される位置で置換された3つまたは4つのnnAAを含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SLO(ΔC101)であり、位置K98、R151 、K272およびK357；位置K112、K189、K323およびK375；位置R151、K272、K357およびK407；位置R151、K272、K375およびK464；位置K112、K272、K357およびK464；位置K98、K189およびK357；位置K112、K189およびK323；位置K98、R151およびK272；位置K112、K272およびK375；または位置K112、K323およびK407で置換されたnnAAを含むか、またはそれらからなる。ある実施形態において、3つまたは4つのnnAAsは、各々pAMFである。ポリペプチド抗原は、SLOポリペプチドであり、配列番号：55、56、57、58、59、60、61、62、63または64のいずれか1つのアミノ酸配列と、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、コンジュゲートポリペプチドはSLOポリペプチドであり、配列番号：55、56、57、58、59、60、61、62、63または64のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSLOポリペプチドである。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SLO(ΔC101)であり、配列番号：53のK98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407およびK464から選択される位置で置換された5、6、7、または8つのnnAAを含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SLO(ΔC101)であり、位置K98、R151、K272、K357およびK407；位置K112、K189、K323、K375およびK464；位置K112、R151、K272、K357およびK407；位置K98、R151、K272、K357、K407およびK464；位置K112、R151、K189、K323、K375およびK464；位置K98、K112、K189、K323、K375およびK464；位置K112、R151、K189、K272、K357、K407およびK464；位置K98、R151、K189、K323、K375、K407およびK464；位置K112、K189、K272、K357、K375、K407およびK464；位置K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357およびK375；位置K98、R151、K189、K272、K323、K357、K407およびK464；または位置K112、K189、K272、K323、K357、K375、K407およびK464で置換されたnnAAを含むか、またはそれらからなる。ある実施形態において、5、6、7または8つのnnAAは、各々pAMFである。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SLOポリペプチドであり、配列番号：65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75または76のいずれか1つと少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SLOポリペプチドであり、配列番号：65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75または76のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSpyADであり、配列番号：9の位置K64、K287、K396およびK657で置換された4つのnnAAを含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSpyADであり、配列番号：33の位置K64、K287、K396およびK657で置換された4つのnnAAを含む。ある実施形態において、4つのnnAAは、各々pAMFである。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SpyADであり、配列番号：11または配列番号：12と少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、4つのnnAAは、各々pAMFである。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SpyADであり、配列番号：34と少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SpyADであり、配列番号：11または配列番号：12のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SpyADであり、配列番号：34のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SpyADであり、配列番号：11、配列番号：12または配列番号：80と少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原は、SpyADであり、配列番号：11、配列番号：12または配列番号：80のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。
ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSpyADであり、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83と少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチド抗原はSpyADであり、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83を含むか、またはその配列からなる。
ある実施形態において、非GASキャリアポリペプチドは、eCRM197を含むか、またはその配列からなる。特定の実施形態において、eCRM197は、配列番号：25の配列を有する。
ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、表1に列挙されたポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、配列番号：1～76のいずれか1つと少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、表1または1Aに列挙されたポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、配列番号：1～80のいずれか1つと少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、表1に列挙されたポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、配列番号：1～76のいずれか1つと少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、表1Aに列挙されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、配列番号：77～80のいずれか1つと少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
免疫原性組成物
前述のように、本明細書に記載の方法によって得られる長鎖多糖および前記長鎖多糖を用いて作成される多糖-ポリペプチドコンジュゲートは、免疫原性組成物(例えば、疾病を治療または予防するためのワクチン)に使用するために適している。例えば、ある実施形態において、免疫原性組成物は、対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導し得る。ある実施形態において、本明細書で提供されるのは、対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導するための医薬品の製造における、本明細書に記載の免疫原性組成物の使用である。
前述のように、本明細書に記載の方法によって得られる長鎖多糖および前記長鎖多糖を用いて作成される多糖-ポリペプチドコンジュゲートは、免疫原性組成物(例えば、疾病を治療または予防するためのワクチン)に使用するために適している。例えば、ある実施形態において、免疫原性組成物は、対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導し得る。ある実施形態において、本明細書で提供されるのは、対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導するための医薬品の製造における、本明細書に記載の免疫原性組成物の使用である。
本明細書において、用語「対象」は、哺乳動物を指す。ある実施形態において、対象は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ヒツジ、非ヒト霊長類またはヒトである。ある実施形態では、対象はヒトである。ある実施形態において、ヒト対象は18歳以上である。ある実施形態において、ヒト対象は18歳未満である。
ある実施形態において、ヒト対象は、生後6ヶ月から17歳の間である。ある実施形態において、ヒト対象は、生後6ヶ月～9歳の間、生後6ヶ月～8歳の間、生後6ヶ月～7歳の間、生後6ヶ月～6歳の間、生後6ヶ月～5歳の間、生後6ヶ月～4歳の間、生後6ヶ月～3歳の間、生後6ヶ月～2歳の間または生後6ヶ月～1歳の間である。ある実施形態において、ヒト対象は、5歳以上17歳未満、7歳以上17歳未満、9歳以上17歳未満、11歳以上17歳未満、13歳以上17歳未満または15歳以上17歳未満である。ある実施形態において、ヒト対象は、6ヶ月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年または18歳である。
本明細書において、用語「防御免疫応答」は、対象において抗GAS抗体応答を誘発することを包含する。本明細書に記載される免疫原性組成物の投与後に生じた抗体力価は、当該分野で公知の手段、例えば、免疫化された対象由来の血清サンプルのELISAアッセイによって決定され得る。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、複数の(即ち、2つ以上の)GAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載される免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35またはそれ以上のGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、ヒトタンパク質または組織に対する抗体応答を惹起しない。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89およびM92から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載される免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89およびM92から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75およびM89から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M6、M11、M12、M22、M28、M75およびM89から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72およびM74から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M3、M5、M9、M12、M18、M22、M25、M28、M71、M72およびM74から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77およびM81から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M4、M6、M11、M12、M22、M44、M75、M77、M77およびM81から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89およびM92から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M6、M9、M12、M18、M22、M75、M77、M89およびM92から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62およびM89から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M28、M62およびM89から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89およびM92から選択される少なくとも1つのGAS血清型に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置された対象において抗体応答を誘発し、ここで前記の生成抗体は、M1、M2、M3、M4、M6、M12、M22、M28、M49、M53、M68、M77、M80、M83、M87、M89およびM92から選択される2つ以上のGAS血清型に結合する。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置対象において1つ以上の赤痢菌(Shigella)血清型に結合する抗体応答を誘発する。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、処置対象において1つ以上のGAS血清型に結合し、かつ1つ以上の赤痢菌血清型にも結合する抗体応答を誘発する。ある実施形態において、赤痢菌血清型は、ポリラムノース骨格を含んでいる多糖を含む。このような多糖を含む例示的な赤痢菌血清型には、S. flexneri、例えば、S. flexneri 2Aおよび3AならびにS. flexneri 6が挙げられる。
このような免疫原性組成物は、一般に、(a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；および(c)ポリペプチド-多糖コンジュゲートを含み得る。
ある実施形態において、A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原は、全長ネイティブC5aペプチダーゼポリペプチドまたはそのフラグメントであり得る。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原は、配列番号：30のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：29または配列番号：30と、少なくとも95％、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：29または配列番号：30と少なくとも95％、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を有する。
同様に、本明細書に記載の免疫原性組成物は、GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原、またはそのフラグメントを含み得る。ある実施形態において、SLOポリペプチド抗原、またはそのフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる：配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53。ある実施形態において、SLOポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる：配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53。特定の実施態様において、SLO抗原は、配列番号：53のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。本明細書に記載のある実施形態において、SLO抗原またはそのフラグメントは、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。本明細書に記載のある実施形態において、SLO抗原またはそのフラグメントは、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。本明細書に記載のある実施形態において、SLO抗原またはそのフラグメントは、配列番号：53と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、SLO抗原またはそのフラグメントは、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、SLO抗原またはそのフラグメントは、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、SLO抗原またはそのフラグメントは、配列番号：53のアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載の免疫原性組成物は、ポリペプチド-多糖コンジュゲートを含み得る。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、以下を含む：(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含み、前記少なくとも1つのnnAAがクリックケミストリー反応基を含んでいる、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント；および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント。
上述のように、免疫原性組成物のSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントは、クリックケミストリー反応基を含む少なくとも1つのnnAAを含み、GAS多糖またはそのバリアントへのコンジュゲーションを可能にする。ある実施形態において、少なくとも1つのnnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択され得る。ある実施形態において、少なくとも1つのnnAAは、pAMFである。
SpyADコンジュゲートポリペプチドは、ネイティブもしくは全長のSpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントであり得る。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントは、配列番号：33と少なくとも95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチドは、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチドは、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を有する。
ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントは、配列番号：33(注：本明細書における番号付けは、全長のネイティブ配列に基づく)の位置K64、K287、K386およびK657にpAMF置換を含む。従って、ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる：配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントは、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントは、配列番号：34と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントは、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチド、またはそのフラグメントは、配列番号：34のアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載の免疫原性組成物のある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む；SLOポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号：34と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：30のアミノ酸配列を含む；SLOポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：53のアミノ酸配列を含む；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号：34のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、C5aペプチダーゼポリペプチド抗原またはそのフラグメントは、配列番号：30のアミノ酸配列を有する；SLOポリペプチド抗原、またはそのフラグメントは、配列番号：53のアミノ酸配列を有する；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号：34のアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかのある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートのGAS多糖またはそのバリアント中の多糖反復単位の約8mol％～20mol％は、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーによって誘導体化されている。ある実施形態において、約8mol%～約20mol%、約8mol%～約19mol%、約8mol%～約18mol%、約8mol%～約17mol%、約8mol%～約16mol%、約8mol%～約15mol%、約8mol%～約14mol%、約8mol%～約13mol%、約8mol%～約12mol%、約8mol%～約11mol%、8mol%～約10mol%、約8mol%～約9mol%、約9mol%～約20mol%、約9mol%～約19mol%、約9mol%～約18mol%、約9mol%～約17mol%、約9mol%～約16mol%、約9mol%～約15mol%、約9mol%～約14mol%、9mol%～約13mol%、約9mol%～約12mol%、約9mol%～約11mol%、9mol%～約10mol%、約10mol%～約20mol%、約10mol%～約19mol%、約10mol%～約18mol%、約10mol%～約17mol%、約10mol%～約16mol%、約10mol%～約15mol%、約10mol%～約14mol%、10mol%～約13mol%、約10mol%～約12mol%、約10mol%～約11mol%、約11mol%～約20mol%、約11mol%～約19mol%、約11mol%～約18mol%、約11mol%～約17mol%、約11mol%～約16mol%、約11mol%～約15mol%、約11mol%～約14mol%、11mol%～約13mol%、約11mol%～約12mol%、約12mol%～約20mol%、約12mol%～約19mol%、約12mol%～約18mol%、約12mol%～約17mol%、約12mol%～約16mol%、約12mol%～約15mol%、約12mol%～約14mol%、12mol%～約13mol%、約13mol%～約20mol%、約13mol%～約19mol%、約13mol%～約18mol%、約13mol%～約17mol%、約13mol%～約16mol%、約13mol%～約15mol%、約13mol%～約14mol%、約14mol%～約20mol%、約14mol%～約19mol%、約14mol%～約18mol%、約14mol%～約17mol%、約14mol%～約16mol%、約14mol%～約15mol%、約15mol%～約20mol%、約15mol%～約19mol%、約15mol%～約18mol%、約15mol%～約17mol%、約15mol%～約16mol%、約16mol%～約20mol%、約16mol%～約19mol%、約16mol%～約18mol%、約16mol%～約17mol%、約17mol%～約20mol%、約17mol%～約19mol%、約17mol%～約18mol%、約18mol%～約20mol%、約18mol%～約19mol%または約19mol%～約20mol%の多糖のPS反復単位は、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーによって誘導体化される。ある実施形態において、多糖の反復単位は、GAS多糖の多糖反復単位またはそのバリアントである。本明細書に記載の免疫原性組成物のある実施形態では、ポリペプチド-多糖コンジュゲートのGAS多糖またはそのバリアント中の多糖反復単位の約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20mol％の間が、クリックケミストリー反応基またはクリックケミストリー反応基を含むリンカーによって誘導体化される。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートのGAS多糖またはそのバリアントは、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している。
本発明の免疫原性組成物のある実施形態において、nnAAのクリックケミストリー反応基との反応前のリンカーは、式I：
(式中、Xは、少なくとも1つの多糖の多糖反復単位であり、nは、少なくとも1である)
の構造を含む。ある実施形態では、多糖は、GAS多糖またはそのバリアントである。ある実施形態では、nは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5である。ある実施形態では、nは、1、2、3、4または5である。Xが、GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位に結合されるとして、この箇所または別の箇所で説明される場合、その結合は、多糖反復単位内の任意の適切な官能基への、または官能基を介した化学的結合(例えば、還元的アミノ化を介した、ビシナルジオールの酸化から生じ得るアルデヒドと反応したもの)を、意味することができる。ある実施形態において、式IのXおよび-NH-は、イソウレア部分の一部である。
(式中、Xは、少なくとも1つの多糖の多糖反復単位であり、nは、少なくとも1である)
の構造を含む。ある実施形態では、多糖は、GAS多糖またはそのバリアントである。ある実施形態では、nは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5である。ある実施形態では、nは、1、2、3、4または5である。Xが、GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位に結合されるとして、この箇所または別の箇所で説明される場合、その結合は、多糖反復単位内の任意の適切な官能基への、または官能基を介した化学的結合(例えば、還元的アミノ化を介した、ビシナルジオールの酸化から生じ得るアルデヒドと反応したもの)を、意味することができる。ある実施形態において、式IのXおよび-NH-は、イソウレア部分の一部である。
ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチドは、式II：
(式中、R1は、H、ホルミルまたはSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントの少なくとも1つのアミノ酸であり；R2は、OHまたはSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントの少なくとも1つのアミノ酸であり；Wは、CHまたはNであり；yは、少なくとも1であり；nは、少なくとも1であり；および、Xは、GAS多糖またはそのバリアントの少なくとも1つの多糖反復単位である)に従って、GAS多糖またはそのバリアントに結合される。ある実施形態において、R1およびR2は両方とも、SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸である。ある実施形態において、yは、少なくとも1、少なくとも2、または少なくとも3である。ある実施形態において、yは、1、2または3である。ある実施形態において、Wの両方はCHである。ある実施形態において、Wの両方はNである。ある実施形態において、1つのWはNであり、もう一方のWはCHである。ある実施形態において、nは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5である。特定の実施形態において、nは、1、2、3、4または5である。ある実施形態において、式IのXおよび-NH-は、イソウレア部分の一部である。
(式中、R1は、H、ホルミルまたはSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントの少なくとも1つのアミノ酸であり；R2は、OHまたはSpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントの少なくとも1つのアミノ酸であり；Wは、CHまたはNであり；yは、少なくとも1であり；nは、少なくとも1であり；および、Xは、GAS多糖またはそのバリアントの少なくとも1つの多糖反復単位である)に従って、GAS多糖またはそのバリアントに結合される。ある実施形態において、R1およびR2は両方とも、SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸である。ある実施形態において、yは、少なくとも1、少なくとも2、または少なくとも3である。ある実施形態において、yは、1、2または3である。ある実施形態において、Wの両方はCHである。ある実施形態において、Wの両方はNである。ある実施形態において、1つのWはNであり、もう一方のWはCHである。ある実施形態において、nは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5である。特定の実施形態において、nは、1、2、3、4または5である。ある実施形態において、式IのXおよび-NH-は、イソウレア部分の一部である。
本明細書に記載の免疫原性組成物のある実施形態において、GAS多糖またはそのバリアントは、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する。特定の実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカンが結合した莢膜多糖は、約10kDa～約40kDa；約10kDa～約35kDa；約10kDa～約30kDa；約10kDa～約25kDa；約10kDa～約20kDa；約10kDa～約15kDa；約15kDa～約40kDa；約15kDa～約35kDa；約15kDa～約30kDa；約15kDa～約25kDa；約15kDa～約20kDa；約20kDa～約40kDa；約20kDa～約35kDa；約20kDa～約30kDa；約20kDa～約25kDa；約25kDa～約40kDa；約25kDa～約35kDa；約25kDa～約30kDa；約30kDa～約40kDa；約30kDa～約35kDa；または約35kDa～約40kDaの平均分子量である。ある実施形態において、精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖は、約10kDa、約15kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDa、約35kDaまたは約40kDaの平均分子量を有する。ある実施形態において、GAS多糖またはそのバリアントは、免疫優性のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している。
より長い多糖を有することに加えて、本明細書に記載される免疫原性組成物のポリペプチド-多糖コンジュゲートは、増加した平均分子量を有し得る。本明細書に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲートのいずれかのある実施形態では、平均分子量は、約185kDaまたは190kDaより大きい。ある実施形態において、平均分子量は、約185kDa～約700kDa、約185kDa～約600kDa、約185kDa～約500kDa、約185kDa～約400kDa、約185kDa～約300kDa、約185kDa～約200kDaである。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、約185kDa～約700kDa、約185kDa～約650kDa、約185kDa～約600kDa、約185kDa～約550kDa、約185kDa～約500kDa、約185kDa～約450kDa、約185kDa～約400kDa、約185kDa～約350kDa、約185kDa～約300kDa、約185kDa～約250kDa、約185kDa～約200kDa、約200kDa～約700kDa、約200kDa～約650kDa、約200kDa～約600kDa、約200kDa～約550kDa、約200kDa～約500kDa、約200kDa～約450kDa、約200kDa～約400kDa、約200kDa～約350kDa、約200kDa～約300kDa、約200kDa～約250kDa、約250kDa～約700kDa、約250kDa～約650kDa、約250kDa～約600kDa、約250kDa～約550kDa、約250kDa～約500kDa、約250kDa～約450kDa、約250kDa～約400kDa、約250kDa～約350kDa、約250kDa～約300kDa、約300kDa～約700kDa、約300kDa～約650kDa、約300kDa～約600kDa、約300kDa～約550kDa、約300kDa～約500kDa、約300kDa～約450kDa、約300kDa～約400kDa、約300kDa～約350kDa、約350kDa～約700kDa、約350kDa～約650kDa、約350kDa～約600kDa、約350kDa～約550kDa、約350kDa～約500kDa、約350kDa～約450kDa、約350kDa～約400kDa、約400kDa～約700kDa、約400kDa～約650kDa、約400kDa～約600kDa、約400kDa～約550kDa、約400kDa～約500kDa、約400kDa～約450kDa、約450kDa～約700kDa、約450kDa～約650kDa、約450kDa～約600kDa、約450kDa～約550kDa、約450kDa～約500kDa、約500kDa～約700kDa、約500kDa～約650kDa、約500kDa～約600kDa、約500kDa～約550kDa、約550kDa～約700kDa、約550kDa～約650kDa、約550kDa～約600kDa、約600kDa～約700kDa、約600kDa～約650kDaまたは約650kDa～約700kDaの分子量または平均分子量を有し得る。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートは、約185、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650または700kDaの分子量または平均分子量を有し得る。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートのGAS多糖またはそのバリアントは、免疫優性のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している。
本明細書に記載の長鎖多糖類を使用することにより、遊離GAS多糖類またはそのバリアントの量を低下させた免疫原性組成物を製造することができる。例えば、免疫原性組成物は、約60％未満、55％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満または5％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含み得る。ある実施形態において、免疫原性組成物は、約60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％または5％の遊離GAS多糖、またはそのバリアントをさらに含む。
本明細書に記載される免疫原性組成物は、本明細書に記載される免疫原性組成物のいずれかを投与すること特徴とし、対象においてA群レンサ球菌(GAS)細菌に対する防御免疫応答を誘導するのに好適であり得る。ある実施形態において、免疫原性組成物は、A群レンサ球菌(GAS)細菌に対する抗体応答を対象において誘導し得るが、ヒト組織に対する抗体応答を対象において誘導しない。ある実施形態において、本開示は、対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導するための医薬品の製造における、本明細書に記載の免疫原性組成物の使用を提供する。また、対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導するための、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかの使用も提供する。ある実施形態において、対象は、18歳以上である。ある実施形態において、対象は18歳以上である。ある実施形態において、対象は18歳未満である。ある実施形態において、対象は、5歳以上17歳未満、6カ月以上9歳未満または5歳以上9歳未満である。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、以下のものを含む：(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む、レンサ球菌接着分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントであって、前記少なくとも1つのnnAAがクリックケミストリー反応基を含んでいる；および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している、GAS多糖またはそのバリアント。ある実施形態では、GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％がリンカーによって誘導体化されている。さらに、ある実施形態では、ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDa～約700kDaの間である。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDaより大きい。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約190kDaより大きい。
ある実施形態において、免疫原性組成物は、以下のものを含み得る：(a)配列番号：30またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなるA群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；(b)配列番号：53のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなるGASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに(c)(i)配列番号：34のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなる化膿レンサ球菌接着分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチド、および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアントを含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲート。ある実施形態では、GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されている。ある実施形態では、ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDa～約700kDaの間である。ある実施形態において、ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約200kDa～約700kDaの間である。特定の実施形態において、平均分子量は、約300kDa～約600kDaの間である。特定の実施形態において、平均分子量は、約400kDa～約500kDaとの間である。ある実施形態において、GAS多糖またはそのバリアントは、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する。ある実施形態において、SpyADコンジュゲートポリペプチドは、配列番号：34のアミノ酸配列のフラグメントであって、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83の配列を含むか、またはその配列からなる。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、以下のものを含む：(a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに(c)ポリペプチド-多糖コンジュゲート：これは、(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む、化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(前記少なくとも1つのnnAAは、クリックケミストリー反応基を含んでいる)および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント(前記ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDa～約700kDaである)を含む。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、以下のものを含む：(a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに(c)ポリペプチド-多糖コンジュゲート：これは、(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む化膿レンサ球菌接着分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(前記少なくとも1つのnnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント(前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されている)を含む。
ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、以下のものを含む：(a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに(c)ポリペプチド-多糖コンジュゲート：これは、(i)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(前記少なくとも1つのnnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)および(ii)免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント(前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されており、前記ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約185kDa～約700kDaである)を含む。
(実施形態の列挙)
実施形態I-1. 細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製する方法であって、以下の工程を含む：
(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解し、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および
(b)多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程。
実施形態I-2. 細菌細胞が、シュードモナス属(Pseudomonas)細菌細胞、レンサ球菌属(Streptococcus)細菌細胞、ブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌細胞、ナイセリア属(Neisseria)細菌細胞、ヘモフィルス属(Haemophilus)細菌細胞、リステリア属(Listeria)細菌細胞、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌細胞またはクロストリジウム属(Clostridium)細菌細胞である、実施形態I-1に記載の方法。
実施形態I-3. 細菌細胞が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)または化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)などから選択される、実施形態I-1またはI-2に記載の方法。
実施形態I-4．化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89またはM92から選択される血清型である、実施形態I-3に記載の方法。
実施形態I-5. 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している多糖またはそのバリアントを産生する、実施形態I-3に記載の方法。
実施形態I-6. 細菌細胞からペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための、実施形態I-1に記載の方法。
実施形態I-7. 工程(a)の塩基が、NaOH、KOHまたはLiOHである、実施形態I-1からI-6のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-8. 工程(a)の塩基が、NaOHである、実施形態I-1～I-7のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-9. 塩基の濃度が、約2M～約8Mである、実施形態I-1～I-8のいずれか1項記載の方法。
実施形態I-10. 塩基および還元剤を含有する溶液が、約pH14である、実施形態I-1～I-9のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-11. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである、実施形態I-1～I-10のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-12. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムである、実施形態I-1～I-11のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-13. 還元剤の濃度が、約1mM～500mMである、実施形態I-1～I-12のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-14. 工程(a)が、溶液を約30℃～約100℃の間でインキュベートする工程をさらに含む、実施形態I-1～I-13のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-15. 工程(a)が、溶液を約0.5～約20時間インキュベートする工程をさらに含む、実施形態I-1～I-14のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-16. 工程(a)が、1つ以上のpH調整工程をさらに含む、実施形態I-1～I-15のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-17. 1つ以上のpH調整工程が、以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを上昇させる工程；または
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを低下させる工程、
から独立して選択される、実施形態I-16に記載の方法。
実施形態I-18. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～7.0に低下させる工程を含む、実施形態I-17に記載の方法。
実施形態I-19. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5に低下させる工程を含む、実施形態I-17またはI-18に記載の方法。
実施形態I-20. 多糖を含有する分解溶液のpHを約3～約4に低下させる工程を含む、実施形態I-17またはI-18に記載の方法。
実施形態I-21. 以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に低下させる工程；
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3に低下させる工程；
(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に上昇させる工程、
を含む、実施形態I-16またはI-17に記載の方法。
実施形態I-22. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後に、約室温(r.t.)でインキュベートされる、実施形態I-16～I-21のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-23. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後、約4℃～約30℃でインキュベートされる、実施形態I-17～I-20のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-24. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程をさらに含む、実施形態I-1～I-23のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-25. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程が、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせを含む、実施形態I-24に記載の方法。
実施形態I-26. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態I-25に記載の方法。
実施形態I-27. 濾過が、デプス濾過に続いてTFFを行うことを含む、実施形態I-25またはI-26に記載の方法。
実施形態I-28. 固体が、遠心分離によって、多糖を含有する分解溶液から除去される、実施形態I-24またはI-25に記載の方法。
実施形態I-29. 工程(b)の壁分解性酵素が、ムタノリシン、リゾチームまたはバクテリオファージヒドロラーゼである、実施形態I-1～I-28のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-30. 工程(b)が、プロテアーゼと共にインキュベートする工程をさらに含む、実施形態I-1～I-29のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-31. プロテアーゼが、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、ペプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパイン、スブチリシン、クロストリパイン、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カテプシンC、アシルアミノ酸放出酵素またはピログルタメートである、実施形態I-30に記載の方法。
実施形態I-32. 工程(b)が、多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共に、約30℃～約65℃に加温する工程をさらに含む、実施形態I-1～I-31のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-33. プロテアーゼと共に多糖を含有する分解溶液が、約45℃～約55℃に加温される、実施形態I-30～I-32のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-34. 分解溶液が、約6～約20時間加温される、実施形態I-32またはI-33に記載の方法。
実施形態I-35. 工程(b)の遊離多糖溶液を更に精製して、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させる、実施形態I-1～I-34のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-36. 工程(b)の遊離多糖溶液が、沈殿によって更に精製される、実施形態I-1～I-35のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-37. 工程(b)の遊離多糖溶液が、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)で処理される、実施形態I-1～I-36のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-38. 遊離多糖溶液中のCTAB濃度が、約0.1％～約10％である、実施形態I-37に記載の方法。
実施形態I-39. CTABの濃度が、約0.5％～約3％である、実施形態I-37または38に記載の方法。
実施形態I-40. 工程(b)の遊離多糖溶液が、ヨウ化カリウム(KI)で処理される、実施形態I-37～I-39のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-41. 遊離多糖溶液中のKI濃度が、約20mM～約400mMである、実施形態I-32のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-42. 遊離多糖溶液が、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによってさらに精製される、実施形態I-1～I-41のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-43. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態I-42に記載の方法。
実施形態I-44. クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を含む、実施形態I-42に記載の方法。
実施形態I-45.
(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド；および
(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖、
を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-46. 精製された細胞壁多糖が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している、実施形態I-45に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-47． ポリペプチド抗原が、全長GASポリペプチド抗原または全長GASポリペプチド抗原のフラグメントである、実施形態I-45～I-46に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-48． 少なくとも1つのnnAAが、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドにおいてリジン、ロイシン、イソロイシンまたはアルギニンに置換されている、実施形態I-45～I-47のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-49. nnAAが、クリックケミストリー反応基を含む、実施形態I-45～I-48のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-50. nnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、実施形態I-45～I-49のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-51. nnAAがpAMFである、実施形態I-45～I-50のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-52. ポリペプチド抗原が、C5aペプチダーゼ、ストレプトリジンO(SLO)、SpyAD、Sib35およびSfb1から選択される、実施形態I-45～I-51のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-53． ポリペプチド抗原がSLOである、実施形態I-45～I-52のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-54. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態I-53に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-55. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95％同一である、実施形態I-53に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-56. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される位置に3または4つのpAMF置換を含む、実施形態I-53～I-55のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-57. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を含む、実施形態I-53～I-56のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-58. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を有する、実施形態I-53～I-56のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-59. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される位置において5、6、7または8つのpAMF置換を含む、実施形態I-53～I-55のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-60. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を含む、実施形態I-53～I-55または59のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-61. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を有する、実施形態I-53～I-55または59～60のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-62. ポリペプチド抗原がSpyADポリペプチドである、実施形態I-45からI-52のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-63. SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態I-62に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-64．SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95％同一である、実施形態I-62に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-65. SpyADポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657においてpAMF置換を含む、実施形態I-62～I-64のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-66．SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、実施形態I-62からI-65のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-67．SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、実施形態I-62からI-65のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-68．非GASキャリアポリペプチドが、ADI、フェリチン、プロテインDおよびeCRM197から選択される、実施形態I-45～I-45または48～51のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-69. 非GASキャリアポリペプチドが、eCRM197である、実施形態I-68に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-70．eCRM197が、配列番号：25の配列を有する、実施形態I-69に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-71. GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1に列挙されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、実施形態I-45～I-50のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-1.
(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド(前記nnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および
(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖、
を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-2. 精製された細胞壁多糖が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している、実施形態II-1に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-3. GASポリペプチド抗原が、全長GASポリペプチド抗原または全長GASポリペプチド抗原のフラグメントである、実施形態II-1～II-2に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-4．細胞壁多糖が、GAS多糖またはそのバリアントである、実施形態II-1～II-3のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-5. GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-4に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-6. GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-4～II-5に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-7. GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約18mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-4～II-6に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-8. 平均分子量が約185kDa～約700である、実施形態II-1～II-6のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-9. 平均分子量が約200kDa～約700kDaである、実施形態II-1～II-7のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-10. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600kDaである、実施形態II-1～II-9のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-11．ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約400kDa～約500kDaである、実施形態II-1～II-10のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-12． 少なくとも1つのnnAAが、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドにおいてリジン、ロイシン、イソロイシンまたはアルギニンに置換されている、実施形態II-1～II-11のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-13. 少なくとも1つのnnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、実施形態II-1～II-12のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-14. nnAAがpAMFである、実施形態II-1～II-13のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15. GASポリペプチド抗原が、C5aペプチダーゼ、ストレプトリジンO(SLO)、SpyAD、Sib35およびSfb1から選択される、実施形態II-1～II-14のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15a. GASポリペプチド抗原がSLOである、実施形態II-1～II-15のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15b. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-15aに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15c. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95%同一である、実施形態II-15bに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15d. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される位置に3または4つのpAMF置換を含む、実施形態I-15a～II-15cのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15e. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を含む、実施形態II-15a～15dのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15f. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を有する、実施形態II-15a～15dのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15g. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される5、6、7または8つのpAMF置換を含む、実施形態II-15a～15cのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15h. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を含む、実施形態II-15a～II-15cまたはII-22のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15i. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を有する、実施形態II-15a～15cまたはII-15g～II-15fのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-16. GASポリペプチド抗原が、SpyADポリペプチドまたはそのフラグメントである、実施形態II-1～II-15またはII-15a～II-15iのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-17. SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-16に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-18. SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95%同一である、実施形態II-16に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-19. SpyADポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657にpAMFを含む、実施形態II-16～II-18のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-20. SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-21. SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-22. SpyADポリペプチドが、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含む、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-23. SpyADポリペプチドが、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を有する、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-24. 非GASキャリアポリペプチドが、ADI、フェリチン、プロテインDおよびeCRM197から選択される、実施形態II-1～II-2またはII-4～II-14のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-25． 非GASキャリアポリペプチドがeCRM197である、実施形態II-24に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-26．eCRM197が、配列番号：25の配列を有する、実施形態II-25に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-27. GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1に列挙されたポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列から成る、実施形態II-1～II-13のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-28．GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1Aに列挙されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、実施形態II-1～II-13のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-29.
(a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；
(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに
(c)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(前記少なくとも1つのnnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアントを含むポリペプチド-多糖コンジュゲート、
を含む免疫原性組成物であって、前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されており、前記ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDa～約700kDaである、免疫原性組成物。
実施形態II-30．C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-31. C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29またはII-30に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-32．C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を有する、実施形態II-29～II-31のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-33．SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29からII-32のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-34．SLO抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-33に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-35．SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸を有する、実施形態II-29～II-34に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-36. 少なくとも1つのnnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、実施形態II-29～II-35に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-37. 少なくとも1つのnnAAがpAMFである、実施形態II-29～II-36のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-38. SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号：33と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-37のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-39. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-38のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-40. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を有する、実施形態II-29～II-38のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-41. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657にpAMF置換を含む、実施形態II-29～II-40のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-42. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-41のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-43. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-42のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-44. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸を有する、実施形態II-29～II-43のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-45. C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-44のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-46． C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30のアミノ酸配列を含み；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53のアミノ酸配列を含み；SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-45のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-47． C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30のアミノ酸配列を有し；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53のアミノ酸配列を有し；ならびにSpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、実施形態II-29～II-46のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-48．GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約15mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-29～II-47のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-49．nnAAのクリックケミストリー反応基と反応する前のリンカーが、式I：
(式中、Xは、GAS多糖またはそのバリアントの少なくとも1つの多糖反復単位であり、ｎは少なくとも1である)
の構造を含む、実施形態II-29～II-48のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-50．SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントが、式II：
(式中、
R1は、H、ホルミル、またはSpyADコンジュゲートポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸であり；
R2は、OH、またはSpyADコンジュゲートポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸であり；
Wは、CHまたはNであり;
yは、少なくとも1であり;
nは、少なくとも1であり；および
Xは、GAS多糖またはそのバリアントの少なくとも1つの多糖反復単位である)
に従ってGAS多糖に結合される、実施形態II-29～II-49のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-51．GAS多糖またはそのバリアントが、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する、実施形態II-29～II-50のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-52. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約185kDa～約700である、実施形態II-29～II-51のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-53. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約200kDa～約700である、実施形態II-29～II-52のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-54. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約700である、実施形態II-29～II-53のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-55. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600である、実施形態II-29～II-53のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-56．約60％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-55のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-57. 約50％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-56のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-58. 約25％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-57のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-59. 約15％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-58のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-60. 約10％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-59のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-61. 実施形態II-29からII-60のいずれか1つに記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象においてA群レンサ球菌(GAS)細菌に対する防御免疫応答を誘発する方法。
実施形態II-62. 免疫原性組成物が、A群レンサ球菌(GAS)細菌に対する抗体応答を対象において誘発し、ヒト組織に対する抗体応答を対象においては誘発しない、実施形態II-61に記載の方法。
実施形態II-63. 対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘発するための医薬品の製造における、実施形態II-29～II-60のいずれか1つに記載の免疫原性組成物の使用。
実施形態II-64. 対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘発するための、実施形態II-29～II-60のいずれか1つに記載の免疫原性組成物の使用。
実施形態II-65. 細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を細菌細胞から精製するための方法であって、以下の工程：
(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解し、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および
(b)多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程、
を含む方法。
実施形態II-66. 細菌細胞が、シュードモナス属(Pseudomonas)細菌細胞、レンサ球菌属(Streptococcus)細菌細胞、ブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌細胞、ナイセリア属(Neisseria)細菌細胞、ヘモフィルス属(Haemophilus)細菌細胞、リステリア属(Listeria)細菌細胞、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌細胞またはクロストリジウム属(Clostridium)細菌細胞である、実施形態II-65に記載の方法。
実施形態II-67. 細菌細胞が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)または化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)から選択される、実施形態II-65またはII-66に記載の方法。
実施形態II-68. 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89またはM92から選択される血清型である、実施形態II-67に記載の方法。
実施形態II-69. 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している多糖またはそのバリアントを産生する、実施形態II-68に記載の方法。
実施形態II-70. 細菌細胞からペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための、実施形態II-65に記載の方法。
実施形態II-71. 工程(a)の塩基が、NaOH、KOHまたはLiOHである、実施形態II-65～II-70のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-72. 工程(a)の塩基が、NaOHである、実施形態II-65～II-71のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-73. 塩基の濃度が、約2M～約8Mである、実施形態II-65～II-72のいずれか1項記載の方法。
実施形態II-74. 塩基および還元剤を含有する溶液が、約pH14である、実施形態II-65～II-73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-75. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである、実施形態II-65～II-72のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-76. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムである、実施形態II-65～II-73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-77. 還元剤の濃度が、約1mM～500mMである、実施形態II-65～II-76のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-78. 工程(a)が、溶液を約30℃～約100℃でインキュベートする工程をさらに含む、実施形態II-65～II-75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-79. 工程(a)が、溶液を約0.5～約20時間インキュベートする工程をさらに含む、実施形態II-65～II-78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-80. 工程(a)が、1つ以上のpH調整工程をさらに含む、実施形態II-65～II-79のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-81. 1つ以上のpH調整工程が、以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを上昇させる工程；または
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを低下させる工程、
から独立して選択される、実施形態II-80に記載の方法。
実施形態II-82. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～7.0に低下させる工程を含む、実施形態II-81に記載の方法。
実施形態II-83. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5に低下させる工程を含む、実施形態II-81またはII-82に記載の方法。
実施形態II-84. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～約4に低下させる工程を含む、実施形態II-81またはII-82に記載の方法。
実施形態II-85. 以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に低下させる工程；
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3に低下させる工程；
(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に上昇させる工程、
を含む、実施形態II-80またはII-81に記載の工程。
実施形態II-86. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後に、約室温(r.t.)でインキュベートされる、実施形態II-80～II-85のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-87. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後、約4℃～約30℃でインキュベートされる、実施形態II-81～II-84のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-88. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程をさらに含む、実施形態II-65～II-87のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-89. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程が、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせを含む、実施形態II-88に記載の方法。
実施形態II-90. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態II-89に記載の方法。
実施形態II-91. 濾過が、デプス濾過の後にTFFを行うことを含む、実施形態II-89またはII-90に記載の方法。
実施形態II-92. 固体が、遠心分離によって、多糖を含有する分解溶液から除去される、実施形態II-88またはII-89に記載の方法。
実施形態II-93. 工程(b)の壁分解性酵素が、ムタノリシン、リゾチームまたはバクテリオファージヒドロラーゼである、実施形態II-65～II-92のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-94. 工程(b)が、プロテアーゼと共にインキュベートする工程をさらに含む、実施形態II-65～II-93のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-95. プロテアーゼが、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、ペプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパイン、スブチリシン、クロストリパイン、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カテプシンC、アシルアミノ酸放出酵素またはピログルタメートである、実施形態II-94に記載の方法。
実施形態II-96. 工程(b)が、多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共に、約30℃～約65℃に加温する工程をさらに含む、実施形態II-65～II-95のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-97. 多糖を含有する分解溶液を、プロテアーゼと共に、約45℃～約55℃に加温される、実施形態II-94～II-96のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-98. 分解溶液が、約6～約20時間加温される、実施形態II-96またはII-97に記載の方法。
実施形態II-99. 工程(b)の遊離多糖溶液を更に精製して、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させる、実施II-65～II-98のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-100. 工程(b)の遊離多糖溶液が、沈殿によって更に精製される、実施形態II-65～II-99のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-101. 工程(b)の遊離多糖溶液が、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)で処理される、実施形態II-65～II-100のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-102. 遊離多糖溶液中のCTAB濃度が、約0.1％～約10％である、実施形態II-101に記載の方法。
実施形態II-103. CTABの濃度が、約0.5％～約3％である、実施形態II-101またはII-102に記載の方法。
実施形態II-104. 工程(b)の遊離多糖溶液が、ヨウ化カリウム(KI)で処理される、実施形態II-101～II-103のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-105. 遊離多糖溶液中のKI濃度が、約20mM～約400mMである、実施形態II-104のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-106. 遊離多糖溶液が、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによってさらに精製される、実施形態II-65～II-105のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-107. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過またはこれらの組み合わせを含む、実施形態II-106に記載の方法。
実施形態II-108. クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を含む、実施形態II-106に記載の方法。
実施形態II-109. 下記のものを含む免疫原性組成物：
(a)配列番号：30のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなるA群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；
(b)配列番号：53のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなるGASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに
(c)配列番号：34のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなる化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチド；および免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント(前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されている)を含む、ポリペプチド多糖コンジュゲート。
実施形態II-110. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約185kDa～約700kDaの間である、実施形態II-109の免疫原性組成物。
実施形態II-111. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約200kDa～約700kDaの間である、実施形態II-109またはII-110の免疫原性組成物。
実施形態II-112. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約700kDaの間である、実施形態II-109またはII-111のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-113. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600kDaの間である、実施形態II-109またはII-112のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-114. GAS多糖またはそのバリアントが、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する、実施形態II-109またはII-113のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-115. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸のフラグメントであり、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、実施形態II-109またはII-114のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-1. 細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製する方法であって、以下の工程を含む：
(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解し、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および
(b)多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程。
実施形態I-2. 細菌細胞が、シュードモナス属(Pseudomonas)細菌細胞、レンサ球菌属(Streptococcus)細菌細胞、ブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌細胞、ナイセリア属(Neisseria)細菌細胞、ヘモフィルス属(Haemophilus)細菌細胞、リステリア属(Listeria)細菌細胞、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌細胞またはクロストリジウム属(Clostridium)細菌細胞である、実施形態I-1に記載の方法。
実施形態I-3. 細菌細胞が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)または化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)などから選択される、実施形態I-1またはI-2に記載の方法。
実施形態I-4．化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89またはM92から選択される血清型である、実施形態I-3に記載の方法。
実施形態I-5. 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している多糖またはそのバリアントを産生する、実施形態I-3に記載の方法。
実施形態I-6. 細菌細胞からペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための、実施形態I-1に記載の方法。
実施形態I-7. 工程(a)の塩基が、NaOH、KOHまたはLiOHである、実施形態I-1からI-6のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-8. 工程(a)の塩基が、NaOHである、実施形態I-1～I-7のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-9. 塩基の濃度が、約2M～約8Mである、実施形態I-1～I-8のいずれか1項記載の方法。
実施形態I-10. 塩基および還元剤を含有する溶液が、約pH14である、実施形態I-1～I-9のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-11. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである、実施形態I-1～I-10のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-12. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムである、実施形態I-1～I-11のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-13. 還元剤の濃度が、約1mM～500mMである、実施形態I-1～I-12のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-14. 工程(a)が、溶液を約30℃～約100℃の間でインキュベートする工程をさらに含む、実施形態I-1～I-13のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-15. 工程(a)が、溶液を約0.5～約20時間インキュベートする工程をさらに含む、実施形態I-1～I-14のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-16. 工程(a)が、1つ以上のpH調整工程をさらに含む、実施形態I-1～I-15のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-17. 1つ以上のpH調整工程が、以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを上昇させる工程；または
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを低下させる工程、
から独立して選択される、実施形態I-16に記載の方法。
実施形態I-18. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～7.0に低下させる工程を含む、実施形態I-17に記載の方法。
実施形態I-19. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5に低下させる工程を含む、実施形態I-17またはI-18に記載の方法。
実施形態I-20. 多糖を含有する分解溶液のpHを約3～約4に低下させる工程を含む、実施形態I-17またはI-18に記載の方法。
実施形態I-21. 以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に低下させる工程；
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3に低下させる工程；
(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に上昇させる工程、
を含む、実施形態I-16またはI-17に記載の方法。
実施形態I-22. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後に、約室温(r.t.)でインキュベートされる、実施形態I-16～I-21のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-23. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後、約4℃～約30℃でインキュベートされる、実施形態I-17～I-20のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-24. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程をさらに含む、実施形態I-1～I-23のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-25. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程が、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせを含む、実施形態I-24に記載の方法。
実施形態I-26. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態I-25に記載の方法。
実施形態I-27. 濾過が、デプス濾過に続いてTFFを行うことを含む、実施形態I-25またはI-26に記載の方法。
実施形態I-28. 固体が、遠心分離によって、多糖を含有する分解溶液から除去される、実施形態I-24またはI-25に記載の方法。
実施形態I-29. 工程(b)の壁分解性酵素が、ムタノリシン、リゾチームまたはバクテリオファージヒドロラーゼである、実施形態I-1～I-28のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-30. 工程(b)が、プロテアーゼと共にインキュベートする工程をさらに含む、実施形態I-1～I-29のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-31. プロテアーゼが、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、ペプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパイン、スブチリシン、クロストリパイン、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カテプシンC、アシルアミノ酸放出酵素またはピログルタメートである、実施形態I-30に記載の方法。
実施形態I-32. 工程(b)が、多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共に、約30℃～約65℃に加温する工程をさらに含む、実施形態I-1～I-31のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-33. プロテアーゼと共に多糖を含有する分解溶液が、約45℃～約55℃に加温される、実施形態I-30～I-32のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-34. 分解溶液が、約6～約20時間加温される、実施形態I-32またはI-33に記載の方法。
実施形態I-35. 工程(b)の遊離多糖溶液を更に精製して、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させる、実施形態I-1～I-34のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-36. 工程(b)の遊離多糖溶液が、沈殿によって更に精製される、実施形態I-1～I-35のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-37. 工程(b)の遊離多糖溶液が、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)で処理される、実施形態I-1～I-36のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-38. 遊離多糖溶液中のCTAB濃度が、約0.1％～約10％である、実施形態I-37に記載の方法。
実施形態I-39. CTABの濃度が、約0.5％～約3％である、実施形態I-37または38に記載の方法。
実施形態I-40. 工程(b)の遊離多糖溶液が、ヨウ化カリウム(KI)で処理される、実施形態I-37～I-39のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-41. 遊離多糖溶液中のKI濃度が、約20mM～約400mMである、実施形態I-32のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-42. 遊離多糖溶液が、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによってさらに精製される、実施形態I-1～I-41のいずれか1つに記載の方法。
実施形態I-43. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態I-42に記載の方法。
実施形態I-44. クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を含む、実施形態I-42に記載の方法。
実施形態I-45.
(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド；および
(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖、
を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-46. 精製された細胞壁多糖が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している、実施形態I-45に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-47． ポリペプチド抗原が、全長GASポリペプチド抗原または全長GASポリペプチド抗原のフラグメントである、実施形態I-45～I-46に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-48． 少なくとも1つのnnAAが、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドにおいてリジン、ロイシン、イソロイシンまたはアルギニンに置換されている、実施形態I-45～I-47のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-49. nnAAが、クリックケミストリー反応基を含む、実施形態I-45～I-48のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-50. nnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、実施形態I-45～I-49のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-51. nnAAがpAMFである、実施形態I-45～I-50のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-52. ポリペプチド抗原が、C5aペプチダーゼ、ストレプトリジンO(SLO)、SpyAD、Sib35およびSfb1から選択される、実施形態I-45～I-51のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-53． ポリペプチド抗原がSLOである、実施形態I-45～I-52のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-54. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態I-53に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-55. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95％同一である、実施形態I-53に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-56. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される位置に3または4つのpAMF置換を含む、実施形態I-53～I-55のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-57. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を含む、実施形態I-53～I-56のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-58. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を有する、実施形態I-53～I-56のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-59. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される位置において5、6、7または8つのpAMF置換を含む、実施形態I-53～I-55のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-60. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を含む、実施形態I-53～I-55または59のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-61. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を有する、実施形態I-53～I-55または59～60のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-62. ポリペプチド抗原がSpyADポリペプチドである、実施形態I-45からI-52のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-63. SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態I-62に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-64．SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95％同一である、実施形態I-62に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-65. SpyADポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657においてpAMF置換を含む、実施形態I-62～I-64のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-66．SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、実施形態I-62からI-65のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-67．SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、実施形態I-62からI-65のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-68．非GASキャリアポリペプチドが、ADI、フェリチン、プロテインDおよびeCRM197から選択される、実施形態I-45～I-45または48～51のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-69. 非GASキャリアポリペプチドが、eCRM197である、実施形態I-68に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-70．eCRM197が、配列番号：25の配列を有する、実施形態I-69に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態I-71. GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1に列挙されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、実施形態I-45～I-50のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-1.
(a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド(前記nnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および
(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖、
を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-2. 精製された細胞壁多糖が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している、実施形態II-1に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-3. GASポリペプチド抗原が、全長GASポリペプチド抗原または全長GASポリペプチド抗原のフラグメントである、実施形態II-1～II-2に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-4．細胞壁多糖が、GAS多糖またはそのバリアントである、実施形態II-1～II-3のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-5. GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-4に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-6. GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-4～II-5に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-7. GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約18mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-4～II-6に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-8. 平均分子量が約185kDa～約700である、実施形態II-1～II-6のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-9. 平均分子量が約200kDa～約700kDaである、実施形態II-1～II-7のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-10. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600kDaである、実施形態II-1～II-9のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-11．ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約400kDa～約500kDaである、実施形態II-1～II-10のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-12． 少なくとも1つのnnAAが、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドにおいてリジン、ロイシン、イソロイシンまたはアルギニンに置換されている、実施形態II-1～II-11のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-13. 少なくとも1つのnnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、実施形態II-1～II-12のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-14. nnAAがpAMFである、実施形態II-1～II-13のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15. GASポリペプチド抗原が、C5aペプチダーゼ、ストレプトリジンO(SLO)、SpyAD、Sib35およびSfb1から選択される、実施形態II-1～II-14のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15a. GASポリペプチド抗原がSLOである、実施形態II-1～II-15のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15b. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-15aに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15c. SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32または配列番号：53と少なくとも95%同一である、実施形態II-15bに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15d. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される位置に3または4つのpAMF置換を含む、実施形態I-15a～II-15cのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15e. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を含む、実施形態II-15a～15dのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15f. SLOポリペプチドが、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63または配列番号：64のアミノ酸配列を有する、実施形態II-15a～15dのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15g. SLOポリペプチドが、K98、K112、R151、K189、K272、K323、K357、K375、K407またはK464から選択される5、6、7または8つのpAMF置換を含む、実施形態II-15a～15cのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15h. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を含む、実施形態II-15a～II-15cまたはII-22のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-15i. SLOポリペプチドが、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75または配列番号：76のアミノ酸配列を有する、実施形態II-15a～15cまたはII-15g～II-15fのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-16. GASポリペプチド抗原が、SpyADポリペプチドまたはそのフラグメントである、実施形態II-1～II-15またはII-15a～II-15iのいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-17. SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-16に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-18. SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95%同一である、実施形態II-16に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-19. SpyADポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657にpAMFを含む、実施形態II-16～II-18のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-20. SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-21. SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-22. SpyADポリペプチドが、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含む、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-23. SpyADポリペプチドが、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を有する、実施形態II-16～II-19のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-24. 非GASキャリアポリペプチドが、ADI、フェリチン、プロテインDおよびeCRM197から選択される、実施形態II-1～II-2またはII-4～II-14のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-25． 非GASキャリアポリペプチドがeCRM197である、実施形態II-24に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-26．eCRM197が、配列番号：25の配列を有する、実施形態II-25に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-27. GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1に列挙されたポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列から成る、実施形態II-1～II-13のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-28．GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1Aに列挙されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、実施形態II-1～II-13のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-29.
(a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；
(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに
(c)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(前記少なくとも1つのnnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアントを含むポリペプチド-多糖コンジュゲート、
を含む免疫原性組成物であって、前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されており、前記ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は、約185kDa～約700kDaである、免疫原性組成物。
実施形態II-30．C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-31. C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29またはII-30に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-32．C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を有する、実施形態II-29～II-31のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-33．SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29からII-32のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-34．SLO抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-33に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-35．SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸を有する、実施形態II-29～II-34に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-36. 少なくとも1つのnnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、実施形態II-29～II-35に記載の免疫原性組成物。
実施形態II-37. 少なくとも1つのnnAAがpAMFである、実施形態II-29～II-36のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-38. SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号：33と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-37のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-39. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-38のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-40. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を有する、実施形態II-29～II-38のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-41. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657にpAMF置換を含む、実施形態II-29～II-40のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-42. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-41のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-43. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-42のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-44. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸を有する、実施形態II-29～II-43のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-45. C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-44のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-46． C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30のアミノ酸配列を含み；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53のアミノ酸配列を含み；SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、実施形態II-29～II-45のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-47． C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30のアミノ酸配列を有し；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53のアミノ酸配列を有し；ならびにSpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、実施形態II-29～II-46のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-48．GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約15mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、実施形態II-29～II-47のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-49．nnAAのクリックケミストリー反応基と反応する前のリンカーが、式I：
の構造を含む、実施形態II-29～II-48のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-50．SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントが、式II：
(式中、
R1は、H、ホルミル、またはSpyADコンジュゲートポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸であり；
R2は、OH、またはSpyADコンジュゲートポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸であり；
Wは、CHまたはNであり;
yは、少なくとも1であり;
nは、少なくとも1であり；および
Xは、GAS多糖またはそのバリアントの少なくとも1つの多糖反復単位である)
に従ってGAS多糖に結合される、実施形態II-29～II-49のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-51．GAS多糖またはそのバリアントが、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する、実施形態II-29～II-50のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-52. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約185kDa～約700である、実施形態II-29～II-51のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-53. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約200kDa～約700である、実施形態II-29～II-52のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-54. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約700である、実施形態II-29～II-53のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-55. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600である、実施形態II-29～II-53のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-56．約60％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-55のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-57. 約50％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-56のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-58. 約25％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-57のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-59. 約15％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-58のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-60. 約10％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、実施形態II-29～II-59のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-61. 実施形態II-29からII-60のいずれか1つに記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象においてA群レンサ球菌(GAS)細菌に対する防御免疫応答を誘発する方法。
実施形態II-62. 免疫原性組成物が、A群レンサ球菌(GAS)細菌に対する抗体応答を対象において誘発し、ヒト組織に対する抗体応答を対象においては誘発しない、実施形態II-61に記載の方法。
実施形態II-63. 対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘発するための医薬品の製造における、実施形態II-29～II-60のいずれか1つに記載の免疫原性組成物の使用。
実施形態II-64. 対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘発するための、実施形態II-29～II-60のいずれか1つに記載の免疫原性組成物の使用。
実施形態II-65. 細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を細菌細胞から精製するための方法であって、以下の工程：
(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解し、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および
(b)多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程、
を含む方法。
実施形態II-66. 細菌細胞が、シュードモナス属(Pseudomonas)細菌細胞、レンサ球菌属(Streptococcus)細菌細胞、ブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌細胞、ナイセリア属(Neisseria)細菌細胞、ヘモフィルス属(Haemophilus)細菌細胞、リステリア属(Listeria)細菌細胞、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌細胞またはクロストリジウム属(Clostridium)細菌細胞である、実施形態II-65に記載の方法。
実施形態II-67. 細菌細胞が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)または化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)から選択される、実施形態II-65またはII-66に記載の方法。
実施形態II-68. 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89またはM92から選択される血清型である、実施形態II-67に記載の方法。
実施形態II-69. 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している多糖またはそのバリアントを産生する、実施形態II-68に記載の方法。
実施形態II-70. 細菌細胞からペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための、実施形態II-65に記載の方法。
実施形態II-71. 工程(a)の塩基が、NaOH、KOHまたはLiOHである、実施形態II-65～II-70のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-72. 工程(a)の塩基が、NaOHである、実施形態II-65～II-71のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-73. 塩基の濃度が、約2M～約8Mである、実施形態II-65～II-72のいずれか1項記載の方法。
実施形態II-74. 塩基および還元剤を含有する溶液が、約pH14である、実施形態II-65～II-73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-75. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである、実施形態II-65～II-72のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-76. 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムである、実施形態II-65～II-73のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-77. 還元剤の濃度が、約1mM～500mMである、実施形態II-65～II-76のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-78. 工程(a)が、溶液を約30℃～約100℃でインキュベートする工程をさらに含む、実施形態II-65～II-75のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-79. 工程(a)が、溶液を約0.5～約20時間インキュベートする工程をさらに含む、実施形態II-65～II-78のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-80. 工程(a)が、1つ以上のpH調整工程をさらに含む、実施形態II-65～II-79のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-81. 1つ以上のpH調整工程が、以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを上昇させる工程；または
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを低下させる工程、
から独立して選択される、実施形態II-80に記載の方法。
実施形態II-82. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～7.0に低下させる工程を含む、実施形態II-81に記載の方法。
実施形態II-83. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5に低下させる工程を含む、実施形態II-81またはII-82に記載の方法。
実施形態II-84. 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～約4に低下させる工程を含む、実施形態II-81またはII-82に記載の方法。
実施形態II-85. 以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に低下させる工程；
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3に低下させる工程；
(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に上昇させる工程、
を含む、実施形態II-80またはII-81に記載の工程。
実施形態II-86. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後に、約室温(r.t.)でインキュベートされる、実施形態II-80～II-85のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-87. 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後、約4℃～約30℃でインキュベートされる、実施形態II-81～II-84のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-88. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程をさらに含む、実施形態II-65～II-87のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-89. 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程が、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせを含む、実施形態II-88に記載の方法。
実施形態II-90. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態II-89に記載の方法。
実施形態II-91. 濾過が、デプス濾過の後にTFFを行うことを含む、実施形態II-89またはII-90に記載の方法。
実施形態II-92. 固体が、遠心分離によって、多糖を含有する分解溶液から除去される、実施形態II-88またはII-89に記載の方法。
実施形態II-93. 工程(b)の壁分解性酵素が、ムタノリシン、リゾチームまたはバクテリオファージヒドロラーゼである、実施形態II-65～II-92のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-94. 工程(b)が、プロテアーゼと共にインキュベートする工程をさらに含む、実施形態II-65～II-93のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-95. プロテアーゼが、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、ペプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパイン、スブチリシン、クロストリパイン、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カテプシンC、アシルアミノ酸放出酵素またはピログルタメートである、実施形態II-94に記載の方法。
実施形態II-96. 工程(b)が、多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共に、約30℃～約65℃に加温する工程をさらに含む、実施形態II-65～II-95のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-97. 多糖を含有する分解溶液を、プロテアーゼと共に、約45℃～約55℃に加温される、実施形態II-94～II-96のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-98. 分解溶液が、約6～約20時間加温される、実施形態II-96またはII-97に記載の方法。
実施形態II-99. 工程(b)の遊離多糖溶液を更に精製して、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させる、実施II-65～II-98のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-100. 工程(b)の遊離多糖溶液が、沈殿によって更に精製される、実施形態II-65～II-99のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-101. 工程(b)の遊離多糖溶液が、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)で処理される、実施形態II-65～II-100のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-102. 遊離多糖溶液中のCTAB濃度が、約0.1％～約10％である、実施形態II-101に記載の方法。
実施形態II-103. CTABの濃度が、約0.5％～約3％である、実施形態II-101またはII-102に記載の方法。
実施形態II-104. 工程(b)の遊離多糖溶液が、ヨウ化カリウム(KI)で処理される、実施形態II-101～II-103のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-105. 遊離多糖溶液中のKI濃度が、約20mM～約400mMである、実施形態II-104のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-106. 遊離多糖溶液が、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによってさらに精製される、実施形態II-65～II-105のいずれか1つに記載の方法。
実施形態II-107. 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過またはこれらの組み合わせを含む、実施形態II-106に記載の方法。
実施形態II-108. クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を含む、実施形態II-106に記載の方法。
実施形態II-109. 下記のものを含む免疫原性組成物：
(a)配列番号：30のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなるA群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；
(b)配列番号：53のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなるGASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに
(c)配列番号：34のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、または前記配列またはフラグメントからなる化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチド；および免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアント(前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％は、リンカーによって誘導体化されている)を含む、ポリペプチド多糖コンジュゲート。
実施形態II-110. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約185kDa～約700kDaの間である、実施形態II-109の免疫原性組成物。
実施形態II-111. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約200kDa～約700kDaの間である、実施形態II-109またはII-110の免疫原性組成物。
実施形態II-112. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約700kDaの間である、実施形態II-109またはII-111のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
実施形態II-113. ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600kDaの間である、実施形態II-109またはII-112のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-114. GAS多糖またはそのバリアントが、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する、実施形態II-109またはII-113のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
実施形態II-115. SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸のフラグメントであり、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、実施形態II-109またはII-114のいずれか1つに記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
合成実施例1：高分子量(長鎖)多糖の精製
GAS細菌培養物からGAS多糖類を抽出および精製するために実験を行った。図1は、本明細書に記載されているサンプル精製の簡略化したフローチャートを示す。
GAS細菌培養物からGAS多糖類を抽出および精製するために実験を行った。図1は、本明細書に記載されているサンプル精製の簡略化したフローチャートを示す。
塩基加水分解：準備したGAS細胞ペレットを、50mM NaCl溶液に再懸濁した。セロロジカルピペットを用いて50mLのNaClを加えて、再懸濁されるまでボルテックスに供した。10N 水酸化ナトリウムおよび1M 水素化ホウ素ナトリウムを加え、最終濃度が4N NaOHおよび25mM NaBH4になるようにした。再懸濁したペレットを、1Lの発酵容量あたり160mLを最終目標容量として、遠心分離用容器に分配した。溶液を分配する際に、均質性を確保するために一定のスワリングを行った。ボトルを、65℃のプレインキュベーター内で2時間シェーカー上においた。インキュベーション後、加水分解溶液を、25℃、14,000xgで30分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化し、遠心分離の前に加水分解サンプルを室温に低下していることを確認する。遠心分離が停止した後、ペレットを壊さないように上清を回収し、上清をpH6.5±0.3に中和した。中和する際に、ボトルを4℃の氷浴に置き、37％HClを用いてpHを調整し、必要に応じて1M NaOHを用いてさらに調整した。その後、サンプルを、4℃で一晩インキュベートする。
濾過：インキュベーション後、白色沈殿が形成する。この溶液を、10,000xgで30分間遠心した。宿主細胞タンパク質(HCP)を含む大きな白色ペレットが形成される。透明な上清を回収した。37% HClを用いて、pHを3.0に調整し、この溶液をRTで1時間インキュベートした。Clarisolve Filter μPod -40MSを用いて、サンプルを濾過した。例えば、23mL/minのポンプ流量で、準備が出来るまでフィルターに水を流し、バルブを開けて120mLの容量を流し、15mM NaClを用いて120mLの容量で平衡化した。抽出液を同じポンプ流量23mL/分でフィルターに流し、フィルターから出てくる透明な濾液を回収した。フィルターを60mLの15mM NaClで洗い、チューブとフィルター内容物を洗い流した。フィルターは、廃棄した。サンプルpHを、6.5±0.3に再調整した。その後、タンジェンシャルフロー濾過(TFF-10k)を行って塩類を除去し、濃縮(限外濾過)した後、10mM NaClで緩衝液を交換した(ダイアフィルトレーション)。
ムタノリシン処理：ムタノリシン処理用の溶液を、最終濃度が1mM MgCl2になるように1M MgCl2を加えて、最終濃度が20mM リン酸ナトリウムになるように200mM リン酸ナトリウム(pH6.8)(10倍)を加えて調製した。ムタノリシン溶液(5000 IU/mL)を、120 IU/mLになるようにした。サンプルを、37℃で振盪しながら一晩培養した。
プロテイナーゼ-K処理：サンプルを、その後最終濃度が40 IU/mLとなるようにプロテイナーゼ-K溶液を加えて(プロテイナーゼ-Kは45u/mg)、プロテイナーゼ-Kで処理した。混合物を50℃で一晩、穏やかに混合しながらインキュベートした。
沈殿および濾過：サンプル中の酵素、核酸およびHCPを沈殿させるために、CTAB/20mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)を加えて、30℃で1時間振盪した。使用した溶液を全て事前に温めた：PSサンプル、5% CTABストック溶液、200mM リン酸ナトリウム(pH6.8)。PS溶液は、加熱しながら攪拌して(マグネチックスターバー)、加熱攪拌プレートには温度計を取り付けて、溶液の温度を常にモニターできるようにした。200mM リン酸ナトリウム(pH6.8)溶液をPS溶液に加えて、最終濃度が20mM リン酸ナトリウムになるようにした。5%CTABをPS溶液に加えて、CTAB濃度が1%になるようにした。溶液を1時間混合した。40MSフィルターを用いて、沈殿溶液をデプス濾過した。例えば、ポンプ流量23mL/minにて200mLのMilliQ H20を用いてこの系を流し、サンプルを23mL/分で濾過し、20mMリン酸ナトリウム(pH6.8)および15mM NaClの溶液の60mLを用いて20mL/分で流した。気泡が溶出されるまで濾液を回収した。フィルターは廃棄した。
PS溶液および274mM KIを、30℃に加温した。最終濃度が27.4mM KIとなるように、十分量の274mM KIを、混合PS溶液に加えた。混合溶液を、30℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後の溶液を、30℃で10,000xgにて30分間遠心分離を行った。上清を回収し、ペレットを廃棄した。ペレットは、砕けやすい為に注意されたい。その後、上清を0.45μmのフィルターで真空濾過した。
サンプルを、先ずTFF-10kで濃縮して、その後350mM NaClで9DV、最後にMilliQ水で2DVの透析濾過を行った。例えば、TFFシステムの容量は、約35mLであり、ポンプの流量は200mL/minに設定し、ダイアフィルトレーションは、9DV(50mL)の緩衝液TMP：7～8psiで行う。
次いで、3M 塩化ナトリウムおよび50mM リン酸ナトリウム(pH6.8)で、予め平衡化したHiPrep(登録商標)Butyl Fast Flow 16/10を用いて、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより多糖溶液を精製した。3M 塩化ナトリウムおよび50mM リン酸カリウム(pH6.8)となるように塩化ナトリウムおよびリン酸緩衝液を多糖溶液に添加した。多糖溶液を、HIC樹脂を通過させて、フロースルーモードで操作した。樹脂を、同じ平衡化緩衝液で洗浄し、フロースルーおよび洗浄溶液の両方を、次の処理のために回収した。
9DVの15mMのNaClまたはWFIのダイアフィルトレーションによって、PSサンプル中の高濃度NaClを除去するために、最終のTFF 10kDa/3kDaを行った。精製されたPS溶液を、0.22μmフィルターで濾過した。
図2A、図2Bおよび図2Cは、GlcNAcを欠失しているPSを発現するGAS細菌株(PCT/US2012/049604を参照)に由来する、合成実施例1により調製した精製された多糖のNMR分析を示す。NMRにより、ポリラムノースの存在およびGlcNAcの非存在が確認された。サンプル調製のために、精製された多糖溶液を凍結乾燥して、内部標準としてTSPを加えてD2Oに交換した。プロトンNMRスペクトルを、400MHzの装置にて50℃で40スキャンにわたるシグナルを平均して得た。0.2Hzの線幅拡大を適用した。図3のウエスタンブロットから実証されるように、この精製プロトコールにより、M-タンパク質を含まない精製多糖も得ることができた。図4Aおよび4Bは、別の例示的多糖精製法の概要を示すフローチャートを示す。
合成実施例2：高分子多糖の誘導体化のための一般的プロトコール
精製した多糖類、例えば、実施例1の方法で調製した多糖類を、DBCO-PEGリンカーを用いて官能化することができる。
精製した多糖類、例えば、実施例1の方法で調製した多糖類を、DBCO-PEGリンカーを用いて官能化することができる。
一般に、多糖の水溶液(全ての試薬を添加した後の最終濃度5.5mM)に、ホウ酸塩の最終濃度が最終容量で100mMとなるように、ホウ酸緩衝液(1M, pH8.5)を添加した。その後、追加の水を加えて、反応容積を満たした。2.5当量(多糖の反復単位に対して)の1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP；アセトニトリル中の100 mg/mL溶液の)を、激しく攪拌しながら加えた。CDAPは、-20℃で保存されるので、溶液は使用直前に調製する必要がある。CDAPの添加から5分後に(このタイミングが重要であり、5分以上経過するとDBCO-PEG-アミンの取り込み量は減少する)、0.5モル当量のジベンゾシクロオクチン-アミンリンカー(DMSOストック溶液から、DMSOの最終濃度は5％v/v)を添加した。DBCO-PEG4-アミンリンカーは-20℃で保存されるため、使用直前に調製する必要がある。さらに1時間反応させた後、グリシン(2M, pH8.35)を、体積比で1:10加えて、最終濃度を200mMとし、未反応のシアネートエステルをクエンチした。1時間のクエンチ後、誘導体化した多糖を、Zebaスピンカラムで精製した。2～3mLの溶液を、各10mLのZebaカラムに加えた。精製された多糖を、Bound/Free DBCO HPLC法で分析し、残留するDBCO-PEG4-アミンリンカーとDMAPが、カラム精製によって完全に除去されたかどうかを判定した。必要に応じて、その物質をさらに精製することも可能である。多糖濃度は、アントロンアッセイを用いて測定し、ジベンゾシクロオクチンの濃度を、309nmの吸光度を用いて測定した。この2つの値を合わせて、ジベンゾシクロオクチン官能基で誘導体化された多糖の割合を推定した。DBCOの割合は、CDAP反応では5～10%でなければならない。
GAS多糖のDBCO-PEG4誘導体化：100mM ホウ酸緩衝液(pH8.5)中のGAS多糖の6mM 溶液に、反応性水酸基でのシアニル化を促進するために、激しく攪拌しながら3当量(多糖反復単位に対して)の1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP；アセトニトリル中の100mg/mL溶液から)を加えた。CDAP添加の5分後、2モル当量のジベンゾシクロオクチルアミンリンカーストック/DMSOを、最終DMSO濃度が5%(v/v)となるように添加した。DBCO誘導体化後、未反応のシアネートエステルをクエンチするために200mMのグリシンを、この反応に添加した。DBCO誘導体化された多糖はzebaスピン脱塩カラムで精製され、回収物の純度を逆相で評価した。HPLCで309nmの吸光度をモニターしたところ、単一のピークが確認され、過剰量のDBCOリンカーとその他の反応副生成物は、完全に除去されていることが確認された。最後に、アントロンアッセイ(下記参照)を用いて多糖濃度を測定し、309nmの吸光度を用いてジベンゾシクロオクチン濃度を測定した。これら2つの値を合わせて、ジベンゾシクロオクチン官能基で誘導体化された多糖の割合を推定した。コンジュゲーションのために、GAS多糖のDBCO誘導体化率は5～10%に保たれた。
総多糖濃度のアントロンアッセイ：アントロン試薬(Sigma-Aldrich, CAS#90-44-8)の2 mg/mlのストックを、冷硫酸にて調製し、2xラムノースを含む多糖反復単位(PSRU)の1mMのストックを、標準物として水で調製した。3連のウェルに、100μlのPSRUストック(参照標準に連続希釈)または未知サンプル(1：3に希釈)をプレーティングし(96ウェルプレート)、次いで200μl/ウェルのアントロン試薬ストックを添加した。全ての反応溶液を十分に混合し、プレートカバーで密閉して95℃で10分間インキュベートした。プレートを氷上に置き、室温まで冷却した後、UV/VISプレートリーダーを用いて620 nmの吸光度を測定した。未知サンプルの濃度を測定するために、PSRU標準濃度および吸光度を用いて最小二乗回帰分析を行った。
合成実施例3：pAMF改変コンジュゲートポリペプチドの発現および精製
本実験は、細胞不含タンパク質合成抽出液からpAMF改変コンジュゲートポリペプチドを発現させて、精製するために行った。
アンバーストップコドンにnnAAを挿入するための直交性tRNAを産生するように遺伝子操作された大腸菌由来の抽出物(XtractCF+)を用いて、nnAAを含むポリペプチド(例えば、pAMF)を無細胞タンパク質合成(CFPS)反応で発現させる。これらの改変コンジュゲートポリペプチドのクローニング、発現および精製に使用されるサンプルプロトコールは、例えば、Kapoor et al., Biochemistry, 2018, 57(5), 516-519に見出すことができる。
本実験は、細胞不含タンパク質合成抽出液からpAMF改変コンジュゲートポリペプチドを発現させて、精製するために行った。
アンバーストップコドンにnnAAを挿入するための直交性tRNAを産生するように遺伝子操作された大腸菌由来の抽出物(XtractCF+)を用いて、nnAAを含むポリペプチド(例えば、pAMF)を無細胞タンパク質合成(CFPS)反応で発現させる。これらの改変コンジュゲートポリペプチドのクローニング、発現および精製に使用されるサンプルプロトコールは、例えば、Kapoor et al., Biochemistry, 2018, 57(5), 516-519に見出すことができる。
合成実施例4：ポリペプチド-多糖コンジュゲートを形成するための、高分子量多糖とポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドとのコンジュゲーションのための一般的なプロトコル
一般に、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドに組み込まれたnnAA側鎖のアジド基と、DBCO基のシクロオクチン基を反応させることにより、実施例2の精製されたDBCO誘導体化多糖にコンジュゲートされる。DBCO基とアジド基との間のコンジュゲーション反応のサンプルプロトコールは、例えば、Zimmerman et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25(2), 351-361およびKapoor et al., Biochemistry, 018, 57(5), 516-519に見出すことができる。
一般に、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドは、ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドに組み込まれたnnAA側鎖のアジド基と、DBCO基のシクロオクチン基を反応させることにより、実施例2の精製されたDBCO誘導体化多糖にコンジュゲートされる。DBCO基とアジド基との間のコンジュゲーション反応のサンプルプロトコールは、例えば、Zimmerman et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25(2), 351-361およびKapoor et al., Biochemistry, 018, 57(5), 516-519に見出すことができる。
pAMFで誘導体化したGAS多糖とSpyADのコンジュゲーション：
SpyAD[4pAMF](配列番号：34)を、DBCO誘導体化GAS多糖と共に1:1の割合で混合し[各々0.5 mg/ml]、クリックケミストリーによるコンジュゲーションを容易にした。コンジュゲーション後に、反応混合物を、50kDaカットオフ膜に対して透析し、過剰量の未反応遊離多糖を除去した。回収したコンジュゲートを、SEC(多角度光散乱)MALSにより分析し、アントロンアッセイを用いて濃度を推定した。図5は、DBCO-(PEG)4-NH2を用いたGAS多糖の誘導体化の後に、pAMF誘導体化SpyADへのコンジュゲーションを概説するスキームを示す。図6は、SpyAD[4pAMF](配列番号：34)ポリペプチド-多糖コンジュゲートに関する3.5時間のコンジュゲーション反応後および透析後のSEC MALS分析を示す。3.5時間後に、1MDa以上のコンジュゲートが観察された。透析後、単離されたコンジュゲートのサイズ分布は、約186kDaにピークを示した。図7は、本実施例と同じSpyADポリペプチドを用いたポリペプチド-多糖コンジュゲートのSEC-MALS分析を示すが、フッ化水素酸ベースのPS精製を利用した(例えば、van Sorge, N.M. et al. 2014, Cell Host Microbe. 15(6): 729-740を参照)。旧来の方法で精製したPSを用いた場合、分子量のピークは153kDaであったのに対し、ここで報告した精製多糖では～186kDaであった。
SpyAD[4pAMF](配列番号：34)を、DBCO誘導体化GAS多糖と共に1:1の割合で混合し[各々0.5 mg/ml]、クリックケミストリーによるコンジュゲーションを容易にした。コンジュゲーション後に、反応混合物を、50kDaカットオフ膜に対して透析し、過剰量の未反応遊離多糖を除去した。回収したコンジュゲートを、SEC(多角度光散乱)MALSにより分析し、アントロンアッセイを用いて濃度を推定した。図5は、DBCO-(PEG)4-NH2を用いたGAS多糖の誘導体化の後に、pAMF誘導体化SpyADへのコンジュゲーションを概説するスキームを示す。図6は、SpyAD[4pAMF](配列番号：34)ポリペプチド-多糖コンジュゲートに関する3.5時間のコンジュゲーション反応後および透析後のSEC MALS分析を示す。3.5時間後に、1MDa以上のコンジュゲートが観察された。透析後、単離されたコンジュゲートのサイズ分布は、約186kDaにピークを示した。図7は、本実施例と同じSpyADポリペプチドを用いたポリペプチド-多糖コンジュゲートのSEC-MALS分析を示すが、フッ化水素酸ベースのPS精製を利用した(例えば、van Sorge, N.M. et al. 2014, Cell Host Microbe. 15(6): 729-740を参照)。旧来の方法で精製したPSを用いた場合、分子量のピークは153kDaであったのに対し、ここで報告した精製多糖では～186kDaであった。
SEC MALS-UV-RIは、Agilent HPLC 1100脱気装置、温度制御オートサンプラー(4℃)、カラムコンパートメント(25℃)およびUV-VISダイオードアレイ検出器(Agilent, Santa Clara, CA)と、DAWN-HELEOS多角度レーザー光散乱検出器およびOptilab T-rEX示差屈折干渉計(Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)を、3本のTOSOHカラムに直列に接続して実施した：TSKgel Guard PWXL内径6.0mm×長さ4.0cm, 粒子径12μm；TOSOH TSKgel 6000 PWXL内径7.8mm×長さ30cm, 粒子径13μm；およびTSKgel 3000 PWXL内径 7.8mm×長さ30cm, 粒子径7μm。0.2 μmで濾過した5% (v/v)アセトニトリルを含む1xPBSからなる移動相を0.5 mL/minの流速で使用して、サンプル(50～100μg)を注入して分析した。HPLCの制御には、Agilent Open Labソフトウェアを使用し、データ収集および分子量分析にはWyatt Astra 7のソフトウェアを使用した。
合成実施例5：3、4、5、6、7または8つのnnAAを有する切断型SLO(ΔC101)ポリペプチドの発現、精製およびコンジュゲート
nnAAを含む切断型SLO(ΔC101)バリアントは、例えば、上記の方法に従って発現される(例えば、合成実施例3を参照のこと)。このバリアントは、3、4、5、6、7または8つのpAMF残基を含んでおり、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75および配列番号：76に対応する。図8Aは、22のSLO(ΔC101)バリアント(var1～var22)およびそれらのpAMF導入部位の概略図である。図8Bは、総タンパク質濃度および可溶性タンパク質濃度の両方におけるこれら22のpAMFバリアント(3pAMF～8pAMF)の発現レベルを示す。図8Cは、発現に対応するゲルを示す(配列番号：65～76は、var11-var22に対応する)。8Dは、DBCO-TAMRA標識(var1、5、6、10、11、12、14および15)によって確認される通り、精製されたバリアントのサブセットにおいてpAMF導入が成功したことを明らかにしたゲルを示す。要するに、精製のためには、CFPSを採取し、スピンダウンさせて、濾過した後、事前に平衡化したhisTRAP excel 1mlカラムに0.75ml/minでロードし、最終容量6mlの250mMイミダゾールの単一工程にて溶出した。各工程の画分(5μl)を、SDS-PAGEセーフブルー染色で分析した。その後、溶出液を3倍に希釈し、最終精製のためにCaptoQカラムにロードし、セーフブルー染色とDBCO TAMRA標識で分析した。FTフラクションを濃縮し、200μlアリコートを-80℃で保存した。SEC-MALS分析により、精製したバリアントのサブセットの分子量が推定された(図8E)。この分析から、5-pAMF(var11)および6-pAMF(var14)のバリアントは、溶液中で高次のオリゴマー状態を示した。
nnAAを含む切断型SLO(ΔC101)バリアントは、例えば、上記の方法に従って発現される(例えば、合成実施例3を参照のこと)。このバリアントは、3、4、5、6、7または8つのpAMF残基を含んでおり、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75および配列番号：76に対応する。図8Aは、22のSLO(ΔC101)バリアント(var1～var22)およびそれらのpAMF導入部位の概略図である。図8Bは、総タンパク質濃度および可溶性タンパク質濃度の両方におけるこれら22のpAMFバリアント(3pAMF～8pAMF)の発現レベルを示す。図8Cは、発現に対応するゲルを示す(配列番号：65～76は、var11-var22に対応する)。8Dは、DBCO-TAMRA標識(var1、5、6、10、11、12、14および15)によって確認される通り、精製されたバリアントのサブセットにおいてpAMF導入が成功したことを明らかにしたゲルを示す。要するに、精製のためには、CFPSを採取し、スピンダウンさせて、濾過した後、事前に平衡化したhisTRAP excel 1mlカラムに0.75ml/minでロードし、最終容量6mlの250mMイミダゾールの単一工程にて溶出した。各工程の画分(5μl)を、SDS-PAGEセーフブルー染色で分析した。その後、溶出液を3倍に希釈し、最終精製のためにCaptoQカラムにロードし、セーフブルー染色とDBCO TAMRA標識で分析した。FTフラクションを濃縮し、200μlアリコートを-80℃で保存した。SEC-MALS分析により、精製したバリアントのサブセットの分子量が推定された(図8E)。この分析から、5-pAMF(var11)および6-pAMF(var14)のバリアントは、溶液中で高次のオリゴマー状態を示した。
5、6、7または8つのnnAAを含むSLO(ΔC101)ポリペプチドのコンジュゲーション：
5、6、7または8つのnnAAを含有するポリペプチドは、合成実施例4を含めた上述の方法を用いてGAS多糖にコンジュゲートされる。このようにして、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：68および配列番号：69のpAMFを含有するSLO(ΔC101)バリアントは、長鎖DBCO誘導体化GACにコンジュゲートされた(合成実施例l)。図9Aに示すように、コンジュゲーション反応を、SDS-PAGEで分析した。各バリアントの最初のレーンは、タンパク質のコンジュゲーション前を示す。最終的なコンジュゲートサイズを、SEC-MALSにより決定し、その結果を図10に示す。
5、6、7または8つのnnAAを含有するポリペプチドは、合成実施例4を含めた上述の方法を用いてGAS多糖にコンジュゲートされる。このようにして、配列番号：65、配列番号：66、配列番号：68および配列番号：69のpAMFを含有するSLO(ΔC101)バリアントは、長鎖DBCO誘導体化GACにコンジュゲートされた(合成実施例l)。図9Aに示すように、コンジュゲーション反応を、SDS-PAGEで分析した。各バリアントの最初のレーンは、タンパク質のコンジュゲーション前を示す。最終的なコンジュゲートサイズを、SEC-MALSにより決定し、その結果を図10に示す。
キャリアタンパク質として3-および5-pAMF SLOバリアントを用いて作成したコンジュゲートの生物物理学的特性評価および免疫原性評価
精製されたSLO(ΔC101)バリアントを用いてコンジュゲートを作成するために、3つのpAMF(var1とvar5)および4つのpAMF(var6とvar10)含有SLO(ΔC101)バリアントを、膜アンカー型GAS炭水化物(GACPR)を規定する種のDBCO誘導体化ポリラムノースリッチコア(すなわち、GACPR-DBCO)との銅不含クリックケミストリー反応において用いた。各タンパク質を、DBCO-GACPRと共に室温で4時間撹拌しながら混合した。その後、反応生成物を回収し、緩衝液で透析して過剰量の遊離PSを除去した。その後、精製したコンジュゲートについてSEC-MALS分析を行うと、3つのpAMFを含むSLO(ΔC101)バリアントを用いて作成したコンジュゲートの平均モル質量は、97または116kDaであり(図9B)、4つのpAMFを含むSLO(ΔC101)バリアントを用いて作成したコンジュゲートの平均モル質量は、68または74kDaであった(図9C)。最後に、精製したコンジュゲートのSDS-PAGE分析、その後にSafeBlueTM染色を行うと、結果からも実証されるが、クリックケミストリー反応後の各コンジュゲートの作製のためにキャリアタンパク質が完全に消費されたことが確認された(図9B～9C)。
精製されたSLO(ΔC101)バリアントを用いてコンジュゲートを作成するために、3つのpAMF(var1とvar5)および4つのpAMF(var6とvar10)含有SLO(ΔC101)バリアントを、膜アンカー型GAS炭水化物(GACPR)を規定する種のDBCO誘導体化ポリラムノースリッチコア(すなわち、GACPR-DBCO)との銅不含クリックケミストリー反応において用いた。各タンパク質を、DBCO-GACPRと共に室温で4時間撹拌しながら混合した。その後、反応生成物を回収し、緩衝液で透析して過剰量の遊離PSを除去した。その後、精製したコンジュゲートについてSEC-MALS分析を行うと、3つのpAMFを含むSLO(ΔC101)バリアントを用いて作成したコンジュゲートの平均モル質量は、97または116kDaであり(図9B)、4つのpAMFを含むSLO(ΔC101)バリアントを用いて作成したコンジュゲートの平均モル質量は、68または74kDaであった(図9C)。最後に、精製したコンジュゲートのSDS-PAGE分析、その後にSafeBlueTM染色を行うと、結果からも実証されるが、クリックケミストリー反応後の各コンジュゲートの作製のためにキャリアタンパク質が完全に消費されたことが確認された(図9B～9C)。
合成実施例6：多糖反復単位へのリンカー導入の最適化
上記のように、精製された多糖(例えば、GAS多糖)、例えば、実施例1の方法によって調製されたものは、リンカー(例えば、DBCO-PEG)によって誘導体化され得る。DBCO-PEG4-アミンによって誘導体化されたGAS多糖の多糖反復単位(PSRU)のmol％は、いくつかの関連方法において定義され得る(例えば、PSRU1 mol当たりのリンカーのmolによって測定されたDBCO-PEG4-アミンの導入％；リンカーによって誘導体化されたPSRUのmol％)。
上記のように、精製された多糖(例えば、GAS多糖)、例えば、実施例1の方法によって調製されたものは、リンカー(例えば、DBCO-PEG)によって誘導体化され得る。DBCO-PEG4-アミンによって誘導体化されたGAS多糖の多糖反復単位(PSRU)のmol％は、いくつかの関連方法において定義され得る(例えば、PSRU1 mol当たりのリンカーのmolによって測定されたDBCO-PEG4-アミンの導入％；リンカーによって誘導体化されたPSRUのmol％)。
免疫優性のN-アセチルグルコサミン側鎖を欠失しているA群炭水化物(GAC)多糖、ホウ酸ナトリウム(pH8.8)およびジメチルスルホキシドを含有する水溶液に、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP, GAC多糖反復単位に対して0.5～4モル当量)/アセトニトリルを加えた。5分後、のDBCO-PEG4-アミン(0.5～2モル当量)/ジメチルスルホキシドの溶液を加えた。反応成分の最終濃度は、以下の通りであった：GAC, 4mg/mL；ホウ酸ナトリウム, 0.1M；ジメチルスルホキシド, 10%v/v。1時間後、グリシンを、最終濃度0.2Mとなるように加えた。2時間後、反応混合物を、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーション用緩衝液として生理食塩水と水を用いるタンジェンシャルフロー濾過により精製した。活性化GAC(APS, 活性化多糖類とも呼ばれる)を、多糖濃度およびDBCO-PEG4-アミン導入率について分析した。
反応条件を変更することにより、上記のプロトコールを用いてDBCO-PEG4-アミンを、6～15％(PSRUに対するmol％)導入されたGAS多糖を製造した。表2には、記載した導入％に至った実施例を示す。
合成実施例7：長鎖多糖およびSpyADに対するコンジュゲーション条件の最適化
本明細書に記載した長鎖多糖のコンジュゲーション効率は、リンカーのmol％導入量(例えば、合成実施例6を参照)、ポリペプチドの反応濃度、ポリペプチドに対する活性化多糖の量に依存する。
本明細書に記載した長鎖多糖のコンジュゲーション効率は、リンカーのmol％導入量(例えば、合成実施例6を参照)、ポリペプチドの反応濃度、ポリペプチドに対する活性化多糖の量に依存する。
サンプルのコンジュゲーションプロトコル：活性化多糖(合成実施例6参照)およびリン酸緩衝生理食塩水を含む水溶液に、SpyAD-4pAMF(配列番号：34)を加えた。反応成分の最終濃度は以下の通りであった：DBCOリンカーを含む活性化PS、0.075～1.35mg/mL；SpyAD-4pAMF、0.5～3.7mg/mL。16～20時間後、アジ化ナトリウム(多糖の反復単位に対して4当量)を加えた。2時間後、反応混合物を、ダイアフィルトレーション緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水を用いた透析またはタンジェンシャルフロー濾過により精製した。コンジュゲートを、0.22ミクロンの定格フィルター(Pall KM2EKVS)で濾過し、多糖濃度、タンパク質濃度、遊離糖％および分子量を分析した。作成したコンジュゲートの実施例を表3に示す。
以下の生物学的実施例でさらに議論されるように、本開示の長鎖多糖を用いて作製されたコンジュゲートのうち、高分子量のSpyAD-GACコンジュゲート(例えば、合成実施例7の方法により作製されたもの)は、低分子量のコンジュゲートよりもSpyADおよびGACに対して強い力価をもたらした。高分子量コンジュゲートの製造にはいくつかの要因が重要である。第一に、活性化多糖へのDBCO-PEG4-アミンの導入％(例えば、合成実施例4)は、コンジュゲートのサイズに影響を及ぼす。6～15％の範囲において、DBCO導入率(mol％)が高いほど、一般的に、より大きなコンジュゲートが得られる。第二に、GAC：SpyADの質量比が高いほど、一般的に、より小さなコンジュゲートが得られ、一方で質量比が低いほど、コンジュゲートされていないSpyADポリペプチドが得られる。0.10～0.15の質量比では、一般的に、コンジュゲートされていないSpyADと活性化多糖の量が制限され、より大きなコンジュゲートが得られる。最後に、所定のGAC：SpyAD比においては、両反応生成物の濃度が高いほど、一般に大きなコンジュゲートが得られる。
活性化多糖中に導入されたDBCO-PEG4-アミン％は、モル比(全DBCO-PEG4-アミン)*(結合DBCO-PEG4-アミン％)/(PSRU濃度)として報告された。これらの値を以下のように得た：全DBCO-PEG4-アミンについては、APSサンプルの吸光度を、307nmで測定した。サンプル中の全DBCO-PEG4-アミン濃度は、DBCO-PEG4-アミンのために決定された消衰係数を用いて決定された。結合したDBCO-PEG4-アミン％は、HPLC分析によって測定した。サンプルを、Sepax Zenix-C SEC-300カラムに注入し、50mM塩化カリウム、15% v/vアセトニトリルおよび0.1% v/vトリフルオロ酢酸を含有する移動相で溶出した。結合したDBCO-PEG4-アミン％は、310nmにおける(APS)/(APS＋遊離DBCO-PEG4-アミン)のピーク面積比として決定した。
多糖濃度を、前述のようにアントロンアッセイを用いて測定した。Pierce Modified Lowry assay kitを用いて、製造業者のプロトコールに従って、サンプルのタンパク質濃度を測定した。遊離糖を測定するために、デオキシコール酸ナトリウム溶液(水中で1% w/v)を調製し、塩酸を用いてpHを6.8に調整した。コンジュゲートの溶液に、0.1容量のデオキシコール酸塩ストック溶液および0.05容量のHCl(1M)を加えた。サンプルを回転させて、上清を回収し、この操作をもう一度繰り返した。上清の多糖含量をアントロンアッセイにより測定し(前述の通り)、コンジュゲートの遊離糖含量を、デオキシコール酸塩上清の多糖濃度とコンジュゲートの多糖濃度の比として決定した。コンジュゲートの分子量は、前述したようにSEC-MALSにより決定した。
例示として、SpyADコンジュゲートCNJ-AE、CNJ-AFおよびCNJ-AGを、上記のパラメーターを変更して作成した。注目すべきことに、コンジュゲートCNJ-AGの平均分子量(SEC-MALSによって決定)は、CNJ-AEおよびCNJ-AFの両方が、およそ170kDaであったのに対して、およそ469kDaであった(図13を参照されたい)。これは、活性化多糖におけるDBCO導入の程度が高いこと(15％ vs 6％)、反応混合物中のSpyADポリペプチドの濃度が高いこと、および活性化多糖とポリペプチドの投入量比がより低いことに起因すると考えられる。さらに、CNJ-AGは、遊離多糖の量が少ない状態で作成されたため、精製手順が簡略化され、本明細書に記載の免疫原性組成物に使用するための活性医薬成分がより安定したものとなった。これは、生産がより効率的で、コスト効率がよく、試薬を節約できることも意味する。
合成実施例8：SpyADフラグメントの発現
配列番号：34のSpyADポリペプチドフラグメント(配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79および配列番号：81)を、合成実施例3の方法に従って発現させた。各フラグメントの発現には、2x6-histagリーダー配列(例えば、配列番号：80)を有するポリペプチドをコードするコンストラクトを用い、配列番号：77、78、79および81は、リーダータグの精製および切断後の配列に対応している。
配列番号：34のSpyADポリペプチドフラグメント(配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79および配列番号：81)を、合成実施例3の方法に従って発現させた。各フラグメントの発現には、2x6-histagリーダー配列(例えば、配列番号：80)を有するポリペプチドをコードするコンストラクトを用い、配列番号：77、78、79および81は、リーダータグの精製および切断後の配列に対応している。
SpyADのフラグメントは、ネイティブまたは全長のSpyAD配列と比較して、発現、精製および／または免疫原性を改善するのに有用であり得る。所望のポリペプチドフラグメントの産生をモニタリングするために、14C-ロイシン(GE Life Sciences, Piscataway, NJ)を、配列番号:77、78、79および81を合成するためにCFPS反応に添加し、翻訳ポリペプチドに組み込んだ。23℃で10時間振盪した後、4,500rpmで10分間回転させて、上清を回収した。全タンパク質および可溶性タンパク質の発現力価は、14Cカウントによって推定した。合計4 μlの上清を、非還元4～12% SDS-PAGEゲルにロードした。タンパク質ゲルを、80℃で2時間脱水した後、ネイティブSpyAD(配列番号：33)、SpyAD(4pAMF)(配列番号：34)およびフラグメント(配列番号：77、78、79および81)を、Storm 820 PhosphoImagerを用いたオートラジオグラフィーで解析した。
図14は、ネイティブSpyAD、SpyAD(4pAMF)および4つのフラグメントの発現についてのオートラジオグラフィーの結果、ならびに各サンプルにおける全タンパク質および可溶性タンパク質の発現力価を示す。注目すべきは、ネイティブSpyADおよびSpyAD(4pAMF)の発現混合物には、50～75kDaの間に6本の夾雑物フラグメントのバンドがあるのに対し、配列番号：77～79および81のSpyADフラグメントは、同じ領域内でより少ないバンドしか示さないことである。CFPS反応におけるタンパク質発現レベルの向上は、より高い回収率をもたらす。これにより、ポリペプチドの精製手順が簡略化され、誘導体化された多糖へのコンジュゲーションにより、より高純度の材料が得られる。
生物学的実施例1：多糖または多糖コンジュゲートによるマウスの能動免疫化
マウスは、皮下注射およびIP注射によってチャレンジされる前に能動免疫化される。
マウスは、皮下注射およびIP注射によってチャレンジされる前に能動免疫化される。
1回目、2回目および3回目の免疫化-皮下およびIPチャレンジ：
抗原／アジュバント混合物は、10μgの抗原または5μgのコンジュゲートをアルム(alm)(Alhydrogel)(50μL)に加えて、抗原がアルムに吸着するようにしっかりと混合することにより調製する。各抗原/アジュバント混合物を、26 1/2ゲージの針を付けた1mLのシリンジに入れる。各マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、調製したワクチン100μLを後脚の筋肉に注射する。
抗原／アジュバント混合物は、10μgの抗原または5μgのコンジュゲートをアルム(alm)(Alhydrogel)(50μL)に加えて、抗原がアルムに吸着するようにしっかりと混合することにより調製する。各抗原/アジュバント混合物を、26 1/2ゲージの針を付けた1mLのシリンジに入れる。各マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、調製したワクチン100μLを後脚の筋肉に注射する。
チャレンジ用マウスの調製-皮下チャレンジ：
マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚を傷つけないように注意しながら、マウスの背中を電気カミソリで剃毛する。剃毛した背中に脱毛クリームを塗布し、数分間放置した後、湿らせたペーパータオルで十分に拭き取る。マウスを乾かし、イソフルラン処理から回復させる。
マウスをイソフルランで麻酔した。皮膚を傷つけないように注意しながら、マウスの背中を電気カミソリで剃毛する。剃毛した背中に脱毛クリームを塗布し、数分間放置した後、湿らせたペーパータオルで十分に拭き取る。マウスを乾かし、イソフルラン処理から回復させる。
チャレンジのための材料の準備－皮下およびIPチャレンジ：GAS培養物を対数期中期まで増殖させる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水で細胞濃度を調整し、連続希釈して寒天培地にプレーティングし、菌量を確認する。皮下チャレンジの場合、10μL/マウス1匹の目標CFUは、1x10６であり、細菌を、26 1/2ゲージの針を付けた500μLのハミルトン注射器にて採取した。35日目のIPチャレンジでは、100μL/マウス1匹の目標CFUは1x107であり、細菌を、26 1/2ゲージの針を付けた1mLのシリンジで採取した。マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、200μLのM1 89155菌を腹腔内に注射した。マウスを、通常の空気中で麻酔から回復させる。マウスの生存を1週間にわたって追跡し、1日に複数回確認する。
皮下チャレンジおよび病変採取：35日目の皮下チャレンジでは、マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、ハミルトンシリンジ用リピートディスペンサーを用いて剃毛した背中に10μLのGAS菌を注射する。病変の大きさは、イソフルラン麻酔をかけたマウスを定規と並べて撮影することにより、3日間にわたり、毎日追跡する。3日目に病変を採取する前に、各皮膚病変用に1.0mmシリカビーズと1mLのPBSを入れた2 mLの滅菌済スクリューキャップチューブを準備した。各チューブの重量を記録した。病変が完全に成育した3日目に、マウスをCO2および頚椎脱臼で安楽死させる。清潔な手術器具を用いて各皮膚病変を切り取り、事前に秤量したチューブに入れる。チューブの重量は、組織量の計算のために記録する。チューブを、MagnaLyserのビーズビーターに置き、6000rpmで60秒間回転させる。サンプルを連続希釈して、溶菌溶液を寒天培地に置き、細菌量を定量する。
2つのパラレル試験が行われ、一方の群ではワクチン接種後の抗原特異的抗体力価を調べるため、実験期間中、マウスの血を採取した。もう一方の群では、マウスを実験期間中採血しない。両群の動物は、病変サイズおよびCFU/mg分析を実施するために、最終的に同じ様にチャレンジされる。
生物学的実施例2：ポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド、およびそれらのポリペプチド-多糖類コンジュゲートをマウスモデルにおける免疫原性を評価する
合成実施例2および3のポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド、およびそれらの多糖コンジュゲートを、生物学的実施例1において上述した方法によりマウスモデルで評価した。マウスを、0、7および14日目に免疫し、次いで21日目の屠殺後に最終採血を行った。
合成実施例2および3のポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド、およびそれらの多糖コンジュゲートを、生物学的実施例1において上述した方法によりマウスモデルで評価した。マウスを、0、7および14日目に免疫し、次いで21日目の屠殺後に最終採血を行った。
各5μgの多糖コンジュゲートを用いてマウスを免疫する。ポリペプチドおよび多糖に対する抗体力価を最終採血後に測定した。実施例1の方法に従って調製された長鎖多糖は、これらの免疫原性実験のELISA分析においてコーティング抗原として使用することができる。図11Aは、pAMF置換SLO(ΔC101)-var1、SLO(ΔC101)-var5、SLO(ΔC101)-var6およびSLO(ΔC101)-var10(配列番号：55、59、60および64に対応する)の多糖コンジュゲートの各5μgを、マウスに免疫するために使用した後のELISAを示す。これらのポリペプチド-多糖コンジュゲートは、短鎖多糖を用いたが、図11Aの最初のプロットは、ELISAがコーティング抗原として長鎖多糖(実施例1の方法によって調製された)を利用した最終採血後に測定した抗体力価を示している。図11Aの2番目のプロットは、ポリペプチドコーティング抗原を利用したELISAにおける抗体力価を示す。
上記の実験をマウスの異なるコホートで繰り返し、図11Bに示した通り、SLOに対する抗体力価(＞106)を、タンパク質単独またはコンジュゲート群からの抗血清を分析した時に記録した。この分析から、部位選択的コンジュゲーションのためのpAMF導入残基の慎重な選択は、キャリアタンパク質としてのSLOの重要な免疫原性エピトープを破壊しないことが確認された。最終的に、GACPRに対しても強固な抗体応答(＞106)が記録された(図11B)。全体として、これは、CFPSが、nnAAを含む病原体特異的タンパク質抗原を発現および精製するための有効なプラットフォームを提供し、これを利用して免疫原性コンジュゲートを上手く作成できることを示している。
生物学的実施例3：多糖およびポリペプチド-多糖コンジュゲートの安定性
実施例1の多糖およびそのコンジュゲートの安定性を測定するために実験を行った。多糖またはポリペプチド-多糖コンジュゲートを、-20℃、5℃および25℃で少なくとも6ヶ月間保持する。6ヵ月、12ヵ月、24ヵ月後にサンプルを採取し、各々サンプルを、pHおよび分子量について分析して安定性を決定する。
実施例1の多糖およびそのコンジュゲートの安定性を測定するために実験を行った。多糖またはポリペプチド-多糖コンジュゲートを、-20℃、5℃および25℃で少なくとも6ヶ月間保持する。6ヵ月、12ヵ月、24ヵ月後にサンプルを採取し、各々サンプルを、pHおよび分子量について分析して安定性を決定する。
生物学的実施例4：M1 GASチャレンジにおける、SLOバリアントコンジュゲートならびにSLOバリアントコンジュゲートおよびeCRM197-多糖類コンジュゲートの併用投与に関する比較
マウス(各群N=10)に、モック、SLO(ΔC101)var1-GACPRコンジュゲートまたは混合ワクチン[SLO(ΔC101)var1 + eCRM-GACPR]を免疫した。野生型雌性CD-1マウス(Charles River)に、5週齢から14日毎に計3回免疫した。筋肉内免疫は、製造者の指示書に従って調製した50μlのAlhydrogel；2%水酸化アルミニウムアジュバント(Invivogen)を含み、1回の投与につき100μl/マウスの全容量で行った。最終免疫の14日後、マウスに1x107CFU M1 89155GASを、i.p.注射により感染させ、生存について追跡した。Kaplan-Meier生存曲線の統計は、log-rank Mantel-Cox検定を用いて計算した。図12に示すように、混合ワクチン群とは異なり、SLO(ΔC101)var1-GACPR単独での免疫化は、モック群と比較して有意に高い防御率(p=0.012)が得られた。この事は、関連しないキャリアタンパク質を用いてコンジュゲートを作製する従来法とは異なり、GACPRのCFPSで生成したGAS特異的タンパク質抗原への部位特異的なコンジュゲーションにより、in vivoでより優れた防御が得られることを示している。
マウス(各群N=10)に、モック、SLO(ΔC101)var1-GACPRコンジュゲートまたは混合ワクチン[SLO(ΔC101)var1 + eCRM-GACPR]を免疫した。野生型雌性CD-1マウス(Charles River)に、5週齢から14日毎に計3回免疫した。筋肉内免疫は、製造者の指示書に従って調製した50μlのAlhydrogel；2%水酸化アルミニウムアジュバント(Invivogen)を含み、1回の投与につき100μl/マウスの全容量で行った。最終免疫の14日後、マウスに1x107CFU M1 89155GASを、i.p.注射により感染させ、生存について追跡した。Kaplan-Meier生存曲線の統計は、log-rank Mantel-Cox検定を用いて計算した。図12に示すように、混合ワクチン群とは異なり、SLO(ΔC101)var1-GACPR単独での免疫化は、モック群と比較して有意に高い防御率(p=0.012)が得られた。この事は、関連しないキャリアタンパク質を用いてコンジュゲートを作製する従来法とは異なり、GACPRのCFPSで生成したGAS特異的タンパク質抗原への部位特異的なコンジュゲーションにより、in vivoでより優れた防御が得られることを示している。
生物学的実施例5：NZWウサギにおける免疫原性組成物を用いたSpyAD-PSコンジュゲートの免疫原性の評価
等量のポリペプチド抗原C5a(配列番号：30)およびSLO(配列番号：50)と組み合わせた様々な量のSpyAD-PSコンジュゲートを含有する試験物質(表5に示す)を製造した。コンジュゲートCNJ-AE、CNJ-AFおよびCNJ-AG(合成実施例6および7を参照)を試験した。
等量のポリペプチド抗原C5a(配列番号：30)およびSLO(配列番号：50)と組み合わせた様々な量のSpyAD-PSコンジュゲートを含有する試験物質(表5に示す)を製造した。コンジュゲートCNJ-AE、CNJ-AFおよびCNJ-AG(合成実施例6および7を参照)を試験した。
全ての試験物質は、5mMのコハク酸ナトリウム(pH5.8)、150mMの塩化ナトリウムおよび0.02%のポリソルベート80を含む緩衝液に含まれる。各投与量には31.2μgのリン酸アルミニウムを含む。コンジュゲートは、雌のニュージーランド白ウサギに0.25 mL/両側(0.125 mL/両肢)で筋肉内投与した。投与は、0、21、42日目に行い、-1、14、35および56日目に採血した。10匹のウサギに、アームあたりに投与した。各抗原に対する力価は、SLO、C5A、SpyAD、SpyAD-GACおよびeCRM-GACをコーティング抗原として用いるELISA法で測定した)。
各ELISA実験のために、目的の抗原を含むコーティング液を、滅菌濾過済のPBS(pH7.4±0.2)で希釈し(合計100μL)、各ウェルに0.5μg/mLずつ添加した。このプレートを密閉容器に入れて、2℃～8℃で16～24時間保持した。その後、プレートを、プレート洗浄緩衝液(350μL/ウェル)で3回洗浄した。その後、200μLのPBS＋3％ウシ血清アルブミン(BSA)を加えてプレートをブロッキングし、室温で60～65分間インキュベートした。プレートをプレート洗浄緩衝液で3回洗浄した後、試験物質を投与した動物の血清サンプル(50μL)の5倍連続希釈液を、1:10濃度から調製し、所定のウェルに添加した。コントロール(サンプル希釈液、1XPBS + 3% BSA；市販の正常血清[Jackson ImmunoResearch]の陰性コントロール；および3倍または5倍希釈で連続希釈した陽性コントロール)もまた指定したウェルに添加した。試験物質の血清サンプルは2枚ずつ、コントロールは1枚ずつ、好ましくは1枚のプレートにセットし、35℃～39℃で60～65分間インキュベートした。プレートを、プレート洗浄緩衝液で6回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギIgG(H+L)を加えて、プレートを室温で60～65分間インキュベートした後、再度6回洗浄した。ABTS基質を加えて、プレートを室温で30分間インキュベートした。プレートを、415nmと570nmで読み取った。
図15、16、17、18および19に示す各ELISAの結果(各々C5a、SLO、SpyAD、SpyAD-GACおよびeCRM-GACコーティング抗原)は、高分子量のSpyAD-GACコンジュゲート(CNJ-AG)が低分子量のコンジュゲート(CNJ-AEおよびCNJ-AF)よりも、SpyADおよびGACの両方に対して、より強い力価を誘起することを示している。場合によっては、高分子量コンジュゲートは、低分子量コンジュゲート(CNJ-AE)よりも35日目に同じ用量で、3～30倍高い力価を誘起する(例えば、0.062μgおよび0.25μg；6群 vs 2群)。
コンジュゲートの安定性は、様々な緩衝液中で測定され、25℃で保存した場合あるいは凍結融解サイクルを複数回繰り返した場合の、質量回収率、コンジュゲート分子量および粒子形成における変化を評価する。このような緩衝液としては、(i)20mMリン酸カリウムpH7.4、10％ソルビトール；(ii)20mMリン酸カリウムpH7.4、10％ソルビトール、10mM塩化ナトリウム；(iii)20mMリン酸カリウムpH7.4、10％ソルビトール、10mM塩化ナトリウム、0.02％ポリソルベート80；および(iv)20mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンpH8.0、10％ソルビトール、50mM塩化ナトリウムである。
インビボの免疫原性試験もまた、上記のように、分子量の異なるコンジュゲートを用いて、1回または2回の投与で、加速安定性条件(例えば、製造されたワクチン製品に使用される可能性のある温度よりも高い温度)または凍結／融解サイクルに供される前後に実施される。例えば、コンジュゲートは、250kDa以下、250～400kDaの間および／または400kDa以上である。これらの実験では、収率および免疫原性に影響を及ぼす結合条件の効果をさらに評価し、ここに記載したコンジュゲートを凍結融解サイクルに付すると免疫原性にどのような変化が生じるかを評価し、1つまたは複数の用量レベルでこれらの変数の両方を評価する。
生物学的実施例6：ヒト第I相および第IIA相の臨床試験デザイン
最初の第I相臨床試験は、18～29歳の健康な成人(N=96)を対象とした無作為化、プラセボ対照、昇順用量試験とする(表3)。この最初の臨床試験の目的は、安全性、用量反応性、免疫原性(IgG抗体)に関するものである。この年齢層では多くの人がGASに対する既存の曝露および免疫を持っているため、既存の免疫がワクチン反応に与える影響を理解するために、ベースラインの免疫を十分に評価する。各ワクチン成分に対するIgG反応およびM血清型の異なる現代のGAS分離株の多様なパネルに対するOPK抗体力価を評価した。
最初の第I相臨床試験は、18～29歳の健康な成人(N=96)を対象とした無作為化、プラセボ対照、昇順用量試験とする(表3)。この最初の臨床試験の目的は、安全性、用量反応性、免疫原性(IgG抗体)に関するものである。この年齢層では多くの人がGASに対する既存の曝露および免疫を持っているため、既存の免疫がワクチン反応に与える影響を理解するために、ベースラインの免疫を十分に評価する。各ワクチン成分に対するIgG反応およびM血清型の異なる現代のGAS分離株の多様なパネルに対するOPK抗体力価を評価した。
第2A相臨床試験は、無作為化プラセボ対照多施設共同試験で、10歳から17歳、次いで5歳から9歳の小児(N=96)の連続コホートでワクチンを評価する(表4)。この試験の目的は、安全性、免疫原性(血清のIgG抗体反応およびオプソノファゴサイト活性)および予備的有効性(GAS咽頭炎の発生率)の評価である。各患者を12ヵ月間モニタリングし、治療群における溶連菌性咽頭炎の発症率を決定した。
Claims (108)
- (a)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むGASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチド(前記nnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)；および
(b)少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する精製された細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖、
を含む、ポリペプチド-多糖コンジュゲート。 - 精製された細胞壁多糖が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している、請求項1に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GASポリペプチド抗原が、全長GASポリペプチド抗原または全長GASポリペプチド抗原のフラグメントである、請求項1または2に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 細胞壁多糖が、GAS多糖またはそのバリアントである、請求項1～3のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、請求項4に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、請求項4～5のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約10mol％～約18mol％が、リンカーによって誘導体化されている、請求項4～6のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 平均分子量が約185kDa～約700kDaである、請求項1～6のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 平均分子量が約200kDa～約700kDaである、請求項1～7のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600kDaである、請求項1～9のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約400kDa～約500kDaである、請求項1～10のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 少なくとも1つのnnAAが、GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドにおいてリジン、ロイシン、イソロイシンまたはアルギニンに置換されている、請求項1～11のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 少なくとも1つのnnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、請求項1～12のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 少なくとも1つのnnAAがpAMFである、請求項1～13のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GASポリペプチド抗原が、C5aペプチダーゼ、ストレプトリジンO(SLO)、SpyAD、Sib35およびSfb1から選択される、請求項1～14のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GASポリペプチド抗原が、SpyADポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項1～15のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項16に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：33と少なくとも95%同一である、請求項16に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657にpAMFを含む、請求項16～18のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、請求項16～19のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸を有する、請求項16～19のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含む、請求項16～19のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- SpyADポリペプチドが、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸を有する、請求項16～19のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 非GASキャリアポリペプチドが、ADI、フェリチン、プロテインDおよびeCRM197から選択される、請求項1～2または4～14のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- 非GASキャリアポリペプチドがeCRM197である、請求項24に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- eCRM197が、配列番号：25の配列を有する、請求項25に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1に列挙されたポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1～13のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- GASポリペプチド抗原または非GASキャリアポリペプチドが、表1Aに列挙されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項1～13のいずれか1項に記載のポリペプチド-多糖コンジュゲート。
- (a)A群レンサ球菌(GAS)C5aペプチダーゼポリペプチド抗原；
(b)GASストレプトリジンO(SLO)ポリペプチド抗原；ならびに
(c)少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む化膿レンサ球菌接着/分裂(SpyAD)コンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメント(前記少なくとも1つのnnAAは、クリックケミストリー反応基を含む)および免疫優性のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失しているGAS多糖またはそのバリアントを含むポリペプチド-多糖コンジュゲート、
を含む免疫原性組成物であって、ここで前記GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約8mol％～約20mol％はリンカーによって誘導体化されており、前記ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量は約185kDa～約700kDaである、免疫原性組成物。 - C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の免疫原性組成物。
- C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項29または30に記載の免疫原性組成物。
- C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：29または配列番号：30のアミノ酸配列を有する、請求項29～31のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸配列を含む、請求項29～32のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SLO抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項29～33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SLOポリペプチド抗原が、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52または配列番号：53のアミノ酸を有する、請求項29～34のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 少なくとも1つのnnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-4-アジドブタン酸、2-アジド-3-フェニルプロピオン酸、2-アミノ-3-アジドプロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、請求項29～35のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 少なくとも1つのnnAAがpAMFである、請求項29～36のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントが、配列番号：33と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項29～37のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を含む、請求項29～38のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33のフラグメントであるアミノ酸配列を有する、請求項29～38のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：33の位置K64、K287、K386およびK657にpAMF置換を含む、請求項29～40のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸配列を含む、請求項29～41のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項29～42のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：82または配列番号：83のアミノ酸を有する、請求項29～43のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含み；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含み；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項29～44のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30のアミノ酸配列を含み；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53のアミノ酸配列を含み；SpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を含む、請求項29～45のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- C5aペプチダーゼポリペプチド抗原が、配列番号：30のアミノ酸配列を有し；SLOポリペプチド抗原が、配列番号：53のアミノ酸配列を有し；およびSpyADコンジュゲートポリペプチドが、配列番号：34のアミノ酸配列を有する、請求項29～46のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- GAS多糖またはそのバリアントの多糖反復単位の約15mol％～約20mol％が、リンカーによって誘導体化されている、請求項29～47のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- nnAAのクリックケミストリー反応基と反応する前のリンカーが、式I：
の構造を含む、請求項29～48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。 - SpyADコンジュゲートポリペプチドまたはそのフラグメントが、式II：
R1は、H、ホルミルであるか、またはSpyADコンジュゲートポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸であり；
R2は、OHまたはSpyADコンジュゲートポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸であり；
Wは、CHまたはNであり；
yは、少なくとも1であり；
nは、少なくとも1であり；および
Xは、GAS多糖またはそのバリアントの少なくとも1つの多糖反復単位である)
に従ってGAS多糖に結合される、請求項29～49のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。 - GAS多糖またはそのバリアントが、少なくとも約10kDa～少なくとも約40kDaの分子量を有する、請求項29～50のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約185kDa～約700kDaである、請求項29～51のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約200kDa～約700kDaである、請求項29～52のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約700kDaである、請求項29～53のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ポリペプチド-多糖コンジュゲートの平均分子量が、約300kDa～約600kDaである、請求項29～54のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 約60％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、請求項29～55のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 約50％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、請求項29～56のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 約25％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、請求項29～57のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 約15％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、請求項29～58のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 約10％未満の遊離GAS多糖またはそのバリアントをさらに含む、請求項29～59のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 請求項29～60のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象においてA群レンサ球菌(GAS)細菌に対する防御免疫応答を誘導する方法。
- 免疫原性組成物が、対象においてA群レンサ球菌(GAS)細菌に対する抗体応答を誘導し、対象においてヒト組織に対する抗体応答を誘導しない、請求項61に記載の方法。
- 対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導するための医薬品の製造における、請求項29～60のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の使用。
- 対象においてGAS細菌に対する防御免疫応答を誘導するための、請求項29～60のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の使用。
- 細菌細胞から細胞壁多糖またはペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製する方法であって、以下の工程を含む方法：
(a)塩基および還元剤を含有する溶液中で細菌細胞を加水分解し、多糖を含有する分解溶液を形成させる工程；および
(b)多糖を含有する分解溶液を壁分解性酵素と共にインキュベートして、遊離多糖溶液を形成させる工程。 - 細菌細胞が、シュードモナス属(Pseudomonas)細菌細胞、レンサ球菌属(Streptococcus)細菌細胞、ブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌細胞、ナイセリア属(Neisseria)細菌細胞、ヘモフィルス属(Haemophilus)細菌細胞、リステリア属(Listeria)細菌細胞、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌細胞またはクロストリジウム属(Clostridium)細菌細胞である、請求項65に記載の方法。
- 細菌細胞が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)または化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)から選択される、請求項65または66に記載の方法。
- 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)が、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M9、M11、M12、M13、M18、M22、M25、M28、M62、M71、M72、M74、M75、M77、M80、M81、M83、M87、M89またはM92から選択される血清型である、請求項67に記載の方法。
- 化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)細菌細胞が、免疫優性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)側鎖を欠失している多糖またはそのバリアントを産生する、請求項68に記載の方法。
- 細菌細胞からペプチドグリカン結合型莢膜多糖を精製するための、請求項65に記載の方法。
- 工程(a)の塩基が、NaOH、KOHまたはLiOHである、請求項65～70のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)の塩基が、NaOHである、請求項65～71のいずれか1項に記載の方法。
- 塩基の濃度が、約2M～約8Mである、請求項65～72のいずれか1項記載の方法。
- 塩基および還元剤を含有する溶液が、約pH14である、請求項65～73のいずれか1項に記載の方法。
- 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである、請求項65～72のいずれか1項に記載の方法。
- 還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムである、請求項65～73のいずれか1項に記載の方法。
- 還元剤の濃度が、約1mM～500mMである、請求項65～76のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)が、溶液を約30℃～約100℃の間でインキュベートする工程をさらに含む、請求項65～75のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)が、溶液を約0.5～約20時間インキュベートする工程をさらに含む、請求項65～78のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)が、1つ以上のpH調整工程をさらに含む、請求項65～79のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上のpH調整工程が、以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを上昇させる工程；または
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを低下させる工程、
から独立して選択される、請求項80に記載の方法。 - 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～7.0に低下させる工程を含む、請求項81に記載の方法。
- 多糖を含有する分解溶液のpHを、約6.5に低下させる工程を含む、請求項81または82に記載の方法。
- 多糖を含有する分解溶液のpHを、約3～約4に低下させる工程を含む、請求項81または82に記載の方法。
- 以下の工程：
(i)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に低下させる工程；
(ii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約3に低下させる工程；および
(iii)多糖を含有する分解溶液のpHを、約5.5～7.0に上昇させる工程、
を含む、請求項80または81に記載の工程。 - 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後に、約室温(r.t.)でインキュベートされる、請求項80～85のいずれか1項に記載の方法。
- 多糖を含有する分解溶液が、1つ以上のpH調整工程の後に、約4℃～約30℃でインキュベートされる、請求項81～84のいずれか1項に記載の方法。
- 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程をさらに含む、請求項65～87のいずれか1項に記載の方法。
- 多糖を含有する分解溶液から固体を除去する工程が、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせを含む、請求項88に記載の方法。
- 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過またはこれらの組み合わせを含む、請求項89に記載の方法。
- 濾過が、デプス濾過に続いてTFFを行うことを含む、請求項89または90に記載の方法。
- 固体が、遠心分離によって多糖を含有する分解溶液から除去される、請求項88または89に記載の方法。
- 工程(b)の壁分解性酵素が、ムタノリシン、リゾチームまたはバクテリオファージヒドロラーゼである、請求項65～92のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、プロテアーゼと共にインキュベートする工程をさらに含む、請求項65～93のいずれか1項に記載の方法。
- プロテアーゼが、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、ペプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパイン、スブチリシン、クロストリパイン、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カテプシンC、アシルアミノ酸放出酵素またはピログルタメートである、請求項94に記載の方法。
- 工程(b)が、多糖を含有する分解溶液を、壁分解性酵素と共に、約30℃～約65℃に加温する工程をさらに含む、請求項65～95のいずれか1項に記載の方法。
- 多糖を含有する分解溶液を、プロテアーゼと共に、約45℃～約55℃に加温する、請求項94～96のいずれか1項に記載の方法。
- 分解溶液が、約6～約20時間加温される、請求項96または97に記載の方法。
- 工程(b)の遊離多糖溶液を、更に精製して、核酸、酵素、宿主細胞タンパク質(HCP)またはこれらの組み合わせの濃度を低下させる、請求項65～98のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)の遊離多糖溶液が、沈殿によって更に精製される、請求項65～99のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)の遊離多糖溶液が、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)で処理される、請求項65～100のいずれか1項に記載の方法。
- 遊離多糖溶液中のCTAB濃度が、約0.1％～約10％である、請求項101に記載の方法。
- CTABの濃度が、約0.5％～約3％である、請求項101または102に記載の方法。
- 工程(b)の遊離多糖溶液が、ヨウ化カリウム(KI)で処理される、請求項101～103のいずれか1項に記載の方法。
- 遊離多糖溶液中のKI濃度が、約20mM～約400mMである、請求項104のいずれか1項に記載の方法。
- 遊離多糖溶液が、濾過、遠心分離、クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによって更に精製される、請求項65～105のいずれか1項に記載の方法。
- 濾過が、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、無菌濾過またはこれらの組み合わせを含む、請求項106に記載の方法。
- クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)、セラミックヒドロキシアパタイト型クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を含む、請求項106に記載の方法。
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