JP2024505272A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を直接かつ高感度に検出するための遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅 - Google Patents

Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を直接かつ高感度に検出するための遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅 Download PDF

Info

Publication number
JP2024505272A
JP2024505272A JP2023547029A JP2023547029A JP2024505272A JP 2024505272 A JP2024505272 A JP 2024505272A JP 2023547029 A JP2023547029 A JP 2023547029A JP 2023547029 A JP2023547029 A JP 2023547029A JP 2024505272 A JP2024505272 A JP 2024505272A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
enhancer
dna polymerase
inhibitor
polynucleotide
nanostructure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023547029A
Other languages
English (en)
Inventor
シャオ，フイリン
リアンディプトラ スンダー，ノア
ナタリア，オージニア
リウ，ユー
Original Assignee
ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール filed Critical ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール
Publication of JP2024505272A publication Critical patent/JP2024505272A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/127—Reactions demanding special reaction conditions the enzyme inhibitor or activator used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本発明は、酵素を利用したナノテクノロジーを用いた標的核酸の検出に関する。より具体的には、本発明は、遷移状態のDNA－酵素分子スイッチの形態の分子ナノテクノロジー、および処理を行っていない臨床試料においてウイルスRNA標的の直接かつ高感度な検出が可能な、前記DNA－酵素分子スイッチの使用方法を提供する。一実施形態において、この検出は、少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と、少なくとも１つのエンハンサーと、少なくとも１つのDNAポリメラーゼインヒビターとを含む組成物を提供する工程を含み、このDNAポリメラーゼインヒビターは、その保存領域を介してDNAポリメラーゼ酵素によって認識されてこれに結合し、その可変領域を介して前記エンハンサーの一部に相補的である。別の一実施形態において、前記検出方法は、シグナル伝達ナノ構造体を提供する工程、およびシグナルの発生を検出し、このシグナルの強度の変化から標的核酸の存在が示される工程を含む。別の一実施形態において、前記標的核酸は、SARS-CoV-2のポリヌクレオチドである。

Description

本発明は、酵素を利用したナノテクノロジーを用いた核酸の検出に関する。より具体的には、本発明は、遷移状態のDNA－酵素分子スイッチの形態の分子ナノテクノロジー、および処理を行っていない臨床試料においてウイルスRNA標的の直接かつ高感度な検出が可能な、前記DNA－酵素分子スイッチの使用方法を提供する。
コロナウイルス感染症2019（COVID-19）の急速な世界的蔓延によって、医療資源は限界に達した［Huang H, et al., ACS Nano. 2020, 14: 3747-3754］。無症状または軽症の感染患者を介した人から人への伝播が広く報告された［Bai W, et al., JAMA. 2020, 323(14): 1406-1407; Rothe C et al., N Engl J Med. 2020, 382: 970-871］。COVID-19の原因病原体であるSARS-CoV-2［Gorbalenya AE et al., Nat Microbiol. 2020, 5: 536-544］の精力的な検査は、疾患の蔓延の抑制と安全対策の実施において重要である。現在まで、SARS-CoV-2を検出するための主要なアッセイとして、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）が実施されている［Carter LJ et al., ACS Cent Sci. 2020, 6: 591-605］。RT-qPCRは高感度な性能を有しているものの、この技術は、労力を要する試料調製（例えばRNAの抽出）、精巧なプライマーの設計、専用の設備および訓練された人員が必要とされる［米国疾病予防管理センター（2020）、fdadotgov/media/134922/download］。このような制限事項によって、１回のアッセイに長時間を要したり、大規模実装や急速に発展するパンデミックでの適用が妨げられている。実際に、このような欠点は、特にCOVID-19の重圧下に晒されたときに明白となる。世界的な試薬不足、新たな変異株の出現および偽陰性は、RT-qPCRを利用した検出において極めて大きな障害となる［Bruce EA, et al., bioRxiv. 2020 doi.org/10.1101/2020.03.20.001008; Li Y et al., J Med Virol. 2020, 92: 903-908; Toyoshima Y et al., J Hum Genet. 2020, 65(12): 1075-1082］。利用しやすく正確かつ迅速なSARS-CoV-2用の分子診断検査が世界中で非常に強く求められている［Weissleder R et al., Sci Transl Med. 2020, 12, eabc1931］。
分子ナノテクノロジーは、無比の精度を得ることができるとともに、様々な自己集合性の機能的ナノ構造体を構築するようにプログラムすることができる［Li J et al., Nat Chem. 2017, 9: 1056-1067; Li Y et al., Nat Biotechnol. 2005, 23: 885-889; Jones MR et al., Science. 2005, 347: 1260901; Sundah NR et al., Nat Biomed Eng. 2019, 3: 684-694］。このようなナノ構造体は、外部刺激を認識するだけでなく、これに応答して様々な活性を発揮する汎用の多機能マシンとして設計することができる［Wilner OI et al., Nat Nanotechnol. 2009, 4: 239-254; Song P et al., Nat Commun. 2020, 11: 838］。本発明者らは、核酸の迅速検出用の分子ナノテクノロジープラットホームを過去に開発している［Ho NRY et al., Nat Commun. 2018, 9: 3238］。この技術では、従来の標的増幅方法（従来のRT-qPCRにおけるような標的増幅）に依存するのではなく、標的ハイブリダイゼーションにより検出を行う。さらに、この技術では、酵素とDNAからなるハイブリッドナノ複合体を分子スイッチとして利用している。このナノ複合体は、特異的な核酸に直接結合すると（RNA標的でも結合可能）、解離して強力な酵素活性を活性化させる。重要な点として、この技術は、高度にプログラム可能であり、PCRプライマーの複雑な設計や、専用の蛍光プローブ（例えばTaqmanプローブ）を必要とすることなく、非常に自由に構成可能なナノ複合体を改変することによって、新たなアッセイを容易に構築することができる。このように、ユニークな検知機構を有し、自由にプログラム可能性であることから、この技術を利用することによって、PCR検出で実施される多くの工程（例えば、逆転写やサーマルサイクル）を省き、かつPCR検出における課題を回避しつつ、SARS-CoV-2の直接検出が可能であると想定している。一方で、COVID-19患者の大部分はウイルス量が非常に少ないことが報告されており［Pan Y et al., Lancet Infect Dis. 2020, 20: 411-412］、過去に本発明者らが開発した検出限界が約10amolのアッセイでは、様々な重症度のCOVID-19患者の診断において感度の点で限界があると見られる。
したがって、検出感度に関するこの隔たりを埋める必要がある。
個々のナノ複合体は複数の構成要素からなることから、これらの構成要素を調整することによって、応答性の高い分子スイッチを構築できると推察した。具体的には、ナノ複合体からなる分子スイッチは、Taqポリメラーゼと様々な種類のDNA鎖とを含む複数の分子成分が自己集合したものであり、これらのTaqポリメラーゼと様々な種類のDNA鎖は、動的平衡状態で存在し、分子スイッチ全体としての特性に様々な効果を発揮する。これらの分子成分の比率を調整することによって、準安定状態が最も応答性が高い状態であることが見出された。この準安定状態では、ごく微量の標的核酸であっても、分子スイッチが容易に活性化されて、強力な酵素活性を誘導することができる。この高応答状態（遷移状態と呼ぶ）の分子スイッチを利用して、SARS-CoV-2用の高感度な直接核酸検出アッセイを開発した。遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅（catalytic amplification by transition-state molecular switch；CATCH）と命名したこの技術は、二重触媒による増幅であるという利点がある。すなわち、この遷移状態の分子スイッチは、ごく微量のウイルスRNA標的であっても、このウイルスRNA標的に直接結合することによって、容易に活性化されて、十分な酵素活性を遊離する。この分子スイッチの活性化は、別の酵素カスケードをさらに動員して、強力なシグナル出力に変換される。
CATCHは、その高い応答性を利用して優れた性能を発揮する。CATCHは、複雑な生物学的バックグラウンドに対して、高感度かつ特異的なRNA標的の検出が可能であり、標的１μlあたり約８コピーの検出限界（LOD）で報告が可能である。これは、本発明者らによる過去のプラットホームの10,000倍以上の感度である。さらに、CATCHによる検出は直接的かつ迅速である。CATCHアッセイ全体では室温で１時間以内に完了することができ、様々な種類の試料（例えば、精製したRNAや複雑な臨床試料）に使用することができ、従来のRT-qPCRで使用されるすべての工程（すなわち、RNAの抽出、逆転写およびサーマルサイクル増幅）を省くことができる。重要な点として、CATCHは、汎用アッセイへの実装が可能である。様々な診断ニーズを支援するため、CATCHアッセイは、ハイスループット分析用の96ウェルフォーマットに実装することができ、スマートフォンを利用した携帯型測定用の小型化したマイクロ流体カートリッジとしても実装することができる。CATCHをSARS-CoV-2の臨床検出に適用したところ、抽出したRNA試料でも、不活性化した患者スワブでも、正確かつ高感度な検出が達成された。
本発明の第１の態様において、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドを含む試料を提供する工程；
（ｂ）少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と、少なくとも１つのエンハンサーと、少なくとも１つのDNAポリメラーゼインヒビターとを含む組成物を提供する工程であり、
ｉ）前記エンハンサーが、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドであること；
ii）前記DNAポリメラーゼインヒビターが、保存領域と可変領域を含むポリヌクレオチドであり、前記保存領域が、前記DNAポリメラーゼ酵素によって認識されてこれに結合し、前記可変領域が、前記エンハンサーの一部に相補的であること；
iii）前記インヒビターの可変領域の相補的配列と前記エンハンサーの相補的配列が二本鎖抑制性DNA複合体を形成し、この抑制性DNA複合体によりDNAポリメラーゼ活性が抑制されること；ならびに
iv）前記組成物中の前記抑制性複合体の含有量が、例えば、前記抑制性複合体に対してポリメラーゼ活性をプロットした滴定曲線の一次導関数を用いることによって、かつ／または前記エンハンサーと前記インヒビターの比率を様々に変えた滴定曲線の一次導関数を用いることによって、最も速い応答性および／または最も高いシグナル対ノイズ比を有することが判明している量であること
を特徴とする組成物を提供する工程；
（ｃ）核酸を含む前記試料を工程（ｂ）の組成物と接触させることによって、
（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドが、工程（ｂ）の二本鎖抑制性DNA複合体のエンハンサー配列領域に結合して、該二本鎖抑制性DNA複合体から前記インヒビターを押しのけて前記DNAポリメラーゼ酵素を放出させ、該DNAポリメラーゼ酵素を活性化させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の活性型DNAポリメラーゼ酵素に反応性を示すシグナル伝達ナノ構造体を提供する工程；
（ｅ）工程（ｃ）の活性型DNAポリメラーゼ酵素に前記シグナル伝達ナノ構造体を接触させる工程；ならびに
（ｆ）シグナルの発生を検出し、このシグナルの強度の変化から、工程（ｂ）の組成物を用いた試料中に標的核酸が存在することが示される工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、
ｉ）工程ｄ）のシグナル伝達ナノ構造体は、前記DNAポリメラーゼ酵素に応答性を示すセルフプライミング部分を含み、標識されたオリゴヌクレオチド（dNTP）およびシグナル発生試薬の存在下において、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素により、前記標識されたオリゴヌクレオチドが前記シグナル伝達ナノ構造体に付加され、該シグナル伝達ナノ構造体のセルフプライミング部分に組み込まれた前記標識されたオリゴヌクレオチドに、前記シグナル発生試薬が結合するか；または
ii）工程ｄ）のシグナル伝達ナノ構造体は、前記DNAポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性に応答性を示すダンベル型のセルフプライミングエキソヌクレアーゼナノ構造体を含み、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素により、標識されたdNTPが前記ダンベル型のシグナル伝達ナノ構造体から除去される。
前記シグナル伝達ナノ構造体を用いた前記試料中の標的核酸の検出は、ｉ）シグナル強度の増加によって示されるか、あるいはii）のシグナル伝達ナノ構造体のシグナルの量が、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素の存在下で減少することは理解できるであろう。
いくつかの実施形態において、前記方法は、（ｇ）前記試料中に標的核酸が存在することが検出された場合に、患者が疾患に罹患していると診断する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記DNAポリメラーゼインヒビターの保存配列領域は、配列番号14：5’-CAATGTACAGTATTG-3’で示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記組成物中の前記抑制性複合体の含有量は20nM～60nMの範囲であり、かつ／または前記組成物中のエンハンサーとインヒビターの比率は１未満：１であり、0.3：1～0.6：1の範囲であることが好ましい。
いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、前記インヒビターの二本鎖領域よりも少なくとも１ヌクレオチド長い。
いくつかの実施形態において、前記エンハンサーの長さは約35～45ヌクレオチド長であり、約40ヌクレオチド長であることが好ましい。
いくつかの実施形態において、前記エンハンサーオリゴヌクレオチドの全長の約半分は、前記インヒビターと前記エンハンサーからなる二本鎖を形成し、残りの約半分は突出末端セグメントを形成する。
いくつかの実施形態において、前記シグナル伝達ナノ構造体のセルフプライミング部分は、配列番号5：5’-CGGCGTACGTAGAGCGTTGAGCAGGATGCCAACAGTCGATCAGGACGAGTGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3’で示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記dNTPの標識はビオチンである。
いくつかの実施形態において、前記ダンベル型のシグナル伝達ナノ構造体は、配列番号6：5’-GTGCGTACATAGATCGTTATCTGTCTAACGATCTATGTACGCACTCACTCAGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3’で示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記シグナル発生試薬は、アビジンまたはその誘導体を含む融合タンパク質と；HRP、β－ラクタマーゼ、アミラーゼおよびβ－ガラクトシダーゼを含む群から選択される（ただしこれらに限定されない）酵素と；DAB、TMB、ABTS、ADHP、ニトロセフィン、ルミノール、デンプンおよびヨウ素を含む群から選択される（ただしこれらに限定されない）前記酵素に対応する基質とを含み、前記シグナルは、色の変化、蛍光の変化、ルミネッセンスの変化または電気化学的変化として（ただしこれらに限定されない）測定および定量することができる。
いくつかの実施形態において、前記標的は、非ヒト疾患もしくはヒト疾患、遺伝子バリアント、法医学的証拠、株の同定、環境汚染および／または食品汚染に関連する少なくとも１つの核酸である。
いくつかの実施形態において、前記標的は、少なくとも１つの病原体のポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記標的は、SARS-CoV-2のポリヌクレオチドであり、前記インヒビターを構成するポリヌクレオチドおよび前記エンハンサーを構成するポリヌクレオチドは、表１に記載のものから選択することが好ましい。いくつかの実施形態において、前記インヒビターを構成するポリヌクレオチドおよび前記エンハンサーを構成するポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4を含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明のいずれかの態様による方法は、マルチウェルフォーマット、マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスにおいて行われる。
いくつかの実施形態において、前記方法の各工程は、16℃～40℃の温度範囲、好ましくは室温で行われる。
本発明の第３の態様は、
（ｉ）第１の位置に配置された、少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも１つの抑制性DNA複合体とを含む本発明のいずれかの態様に記載の組成物ｂ）と；
（ii）第２の位置に結合された、活性型DNAポリメラーゼ酵素に応答性を示す本発明のいずれかの態様に記載のセルフプライミング部分を含むシグナル伝達ナノ構造体と；
（iii）前記検出用ナノ構造体と核酸試料を混合して、前記第２の位置に活性型DNAポリメラーゼ酵素を放出するための中間ステージと
を含むデバイスを提供する。
いくつかの実施形態において、前記デバイスは、マルチウェルプレート、マイクロ流体デバイスおよびラテラルフローデバイスを含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、前記デバイスはマイクロ流体デバイスであり、該マイクロ流体デバイスは、
（ｉ）試験用試料、陽性コントロールおよび陰性コントロールを導入するため、かつ本発明のいずれかの態様に記載の、少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と、少なくとも１つのエンハンサーと、少なくとも１つのDNAポリメラーゼインヒビターとを含む凍結乾燥試薬を前記デバイス内で再構成するための第１の位置の入口；
（ii）第１の位置と流体接続しており、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素を収容するための、シグナル伝達ナノ構造体を含む第２の位置の検出室；ならびに
（iii）前記試料と前記試薬の流れを制御するための、第１の位置と第２の位置の間に配置されたバルブ
を含み、
前記デバイスが、組み立て後の使用時に、前記試料の入口から出口まで流体が流れるように構成されていることを特徴とする。
好適なマイクロ流体デバイスの例を図3および図4に示す。
本発明の第４の態様は、核酸検出用キットであって、
（ａ）少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも１つの抑制性DNA複合体とを含む組成物を含み、
（ｂ）活性型DNAポリメラーゼ酵素に反応性を示すシグナル伝達ナノ構造体をさらに含んでいてもよく、
（ｃ）標識されたヌクレオチド（dNTP）およびシグナル発生試薬をさらに含んでいてもよく、
前記抑制性DNA複合体が、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAインヒビターと、エンハンサーポリヌクレオチドとを含むこと、
前記インヒビターが、保存配列領域と可変配列領域を有すること、
前記可変配列領域が、突出末端セグメントを含み、該突出末端セグメントが、前記エンハンサーポリヌクレオチドの一部と少なくとも７ヌクレオチド長にわたって相補的であり、該エンハンサーポリヌクレオチドの一部と二本鎖を形成すること、
前記エンハンサーポリヌクレオチドが、前記インヒビターと前記エンハンサーからなる二本鎖よりも少なくとも１ヌクレオチド長く、標的ポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有し、その数が７ヌクレオチドを超えること；および
前記活性型DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識されたヌクレオチドが前記シグナル伝達ナノ構造体に付加され、該シグナル伝達ナノ構造体のセルフプライミング部分に組み込まれた前記標識されたヌクレオチドに、前記シグナル発生試薬が結合すること
を特徴とするキットを提供する。
いくつかの実施形態において、
ｉ）工程ｂ）のシグナル伝達ナノ構造体は、前記DNAポリメラーゼ酵素に応答性を示すセルフプライミング部分を含み、標識されたオリゴヌクレオチド（dNTP）およびシグナル発生試薬の存在下において、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素により、前記標識されたオリゴヌクレオチドが前記シグナル伝達ナノ構造体に付加され、該シグナル伝達ナノ構造体のセルフプライミング部分に組み込まれた前記標識されたオリゴヌクレオチドに、前記シグナル発生試薬が結合するか、または
ii）工程ｂ）のシグナル伝達ナノ構造体は、前記DNAポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性に応答性を示すダンベル型のセルフプライミングエキソヌクレアーゼナノ構造体を含み、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素により、標識されたdNTPが前記ダンベル型のシグナル伝達ナノ構造体から除去される。
いくつかの実施形態において、前記構成要素（ａ）～（ｃ）は、本発明のいずれかの態様に記載されているとおりである。
いくつかの実施形態において、前記核酸検出用キットは、本発明のいずれかの態様によるデバイスに組み込まれている。
いくつかの実施形態において、前記インヒビターポリヌクレオチドおよび／または前記エンハンサーポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、天然の核酸から構造的および／または化学的に修飾されたものである。
いくつかの実施形態において、前記構造的修飾および／または化学的修飾は、蛍光タグ、放射性タグ、ビオチン、５’テールなどのタグの付加；ホスホロチオエート（PS）結合の付加；２’－Ｏ－メチル修飾；および／または合成過程におけるC3スペーサーホスホロアミダイトの付加を含む群から選択される。
遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅（catalytic amplification by transition-state molecular switch；CATCH）を示す。（ａ）CATCHアッセイの模式図。CATCHアッセイでは、核酸標的（SARS-CoV-2ウイルスRNA）の特異的結合を利用して、分子スイッチを活性化させる。１つの分子スイッチは、Taq DNAポリメラーゼと抑制性DNA複合体からなる。この抑制性DNA複合体は、インヒビター鎖とエンハンサー鎖を含み、ポリメラーゼに結合してこれを不活性化する。ウイルスRNA標的がエンハンサー鎖にハイブリダイズすると、これによって抑制性複合体が不安定化し、活性型ポリメラーゼが放出される（左図）。個々の分子スイッチの分子成分の比率を調節することによって、クローズド、遷移状態、オープンの３つの異なる標的応答状態を有する分子スイッチを調製している（右図）。クローズド状態では、抑制性複合体が過剰に存在することから、分子スイッチは完全に不活性化されており、微量のRNA標的では容易に活性化できない。オープン状態では、初期バックグラウンドが高いことから、すべての分子スイッチが活性化されており、標的に対してほとんど応答性を示さない。遷移状態では、様々な形態の分子スイッチが鋭敏な平衡状態で存在しており、少量のRNA標的によって、この平衡状態が容易にシフトして、さらに活性化された分子スイッチの形成が促される。遷移状態の分子スイッチは、このようにして最大の応答性を示す（すなわち、最も短いタイムスパンで、ポリメラーゼ活性を最も大きく変化させる）。（ｂ）シグナルの生成。シグナルの検出を増強するため、CATCHアッセイでは、別の酵素カスケードを利用して、標的により誘導されたポリメラーゼ活性を蛍光読み取り値に変換し、その増幅を行う（詳細については図8aを参照されたい）。クローズド状態の分子スイッチやオープン状態の分子スイッチを用いる場合と比べて、（遷移状態の分子スイッチを利用した）CATCHアッセイでは、ウイルス量の少ない臨床試料から強力なシグナルが生成される。（ｃ）様々なアッセイフォーマット。CATCHアッセイは、ハイスループットアプリケーション用の96ウェルフォーマットで実施することができ（上段）、スマートフォンを利用した携帯型検出用の小型化したマイクロ流体デバイスでも実施することができる（下段）。
複数の構成要素からなる分子スイッチのポリメラーゼ活性を示す。（ａ）抑制性複合体の模式図。この抑制性複合体は、インヒビター鎖とエンハンサー鎖からなる。エンハンサー鎖の全長の半分（20個のヌクレオチド）のみがインヒビター鎖とハイブリダイズすることができるが、その全長（40個のヌクレオチドすべて）は、標的と相補的になるように設計されていることから、標的とエンハンサーからなる二本鎖の形成が熱力学的に有利になっている。また、抑制性複合体内のエンハンサー鎖の残りの半分は一本鎖のままであり、標的による抑制性複合体からの引き剥しが動態学的に有利になっている。（ｂ）分子スイッチの様々な構成酵素のポリメラーゼ活性に対する抑制効果。インヒビター鎖のみでは、ポリメラーゼ活性を弱く抑制するが、エンハンサー鎖を付加すると、ポリメラーゼ活性を強く抑制することできる。一方で、エンハンサー鎖のみでは適切な抑制効果は示されない。（ｃ）分子スイッチの異なる形態（すなわち、不活性型、中間型および活性型）間の動的平衡の模式図。（ｂ）の測定はすべて三連で行い、データは平均値±s.d.として示している。
マイクロ流体デバイスの分解図を示す。２枚のポリジメチルシロキサン（PDMS）層をガラス基板上に配置し、トルクで駆動する連続フロー制御用のバルブを設けて、マイクロ流体プラットホームを構築した。
マイクロ流体デバイスを用いたCATCHプラットホームの操作を示す。各工程で開放されるバルブの輪郭を強調して表示している。
携帯型のCATCHアッセイを示す。（ａ）スマートフォンを利用した蛍光検出器の写真。（ｂ）LED光源の光学スペクトル、フィルターを通していない蛍光放射の光学スペクトル、およびフィルターを通した蛍光放射の光学スペクトル。（ｃ）スマートフォンを利用した検出器と従来のプレートリーダーの相関性。スマートフォンを利用した検出器と市販のプレートリーダーとの間で良好な相関性が認められた（R2=0.9813）。（ｄ）マイクロ流体チップの形態のCATCHアッセイとプレートの形態のCATCHアッセイの性能。マイクロ流体チップの形態のCATCHアッセイで得られた結果は、プレートの形態のCATCHアッセイで得られた結果と良好な一貫性を示した。すべての測定は三連で行い、（ｃ）および（ｄ）のデータは平均値±s.d.として示している。a.u.は任意単位を示す。
SARS-CoV-2検出用の高応答性分子スイッチを示す。（ａ）SARS-CoV-2ゲノムのマップ。分子スイッチは、スパイク（Ｓ）遺伝子またはヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子を認識するように設計されている。各分子スイッチのエンハンサー鎖を赤色の長方形で示す。縮尺は正確ではない。（ｂ）抑制性複合体に対する分子スイッチの応答性。濃度を一定にしたポリメラーゼに、様々な濃度の抑制性複合体を加え（エンハンサー：インヒビターの比率は１：１で維持した）、得られたポリメラーゼ活性を測定した。挿入図は、抑制性複合体に対する分子スイッチの応答性を可視化した一次導関数プロットを示す。グラフの頂点において、分子スイッチ組成物の応答性が最も高いとみなし、この抑制性複合体濃度の分子スイッチ組成物を選択してさらに最適化を行った。（ｃ）遷移状態の決定。さらに、インヒビター鎖の濃度を一定にし、エンハンサー鎖の濃度を様々に変えて、得られたポリメラーゼ活性を測定した。挿入図は、エンハンサー鎖に対する分子スイッチの応答性を可視化した一次導関数プロットを示す。グラフの頂点において、分子スイッチ組成物が遷移状態にあるとみなした。（ｄ）分子スイッチの性能。クローズド状態、オープン状態または遷移状態の分子スイッチを、オンターゲット配列またはオフターゲット配列とともにインキュベートした。遷移状態の分子スイッチは、低いバックグラウンドを維持しつつ、標的との結合により有意なポリメラーゼの活性化を示した。（ｅ）活性化動態。遷移状態の分子スイッチは、標的であるSARS-CoV-2のＳ遺伝子とインキュベートすると、即座に活性化された。（ｄ）および（ｅ）で使用した様々な状態の分子スイッチは、以下に示す代表的な組成で調製した。オープン状態：1nMのインヒビター鎖と1nMのエンハンサー鎖；遷移状態：36nMのインヒビター鎖と24nMのエンハンサー鎖；クローズド状態：100nMのインヒビター鎖と100nMのエンハンサー鎖。すべての測定は三連で行い、（ｂ）～（ｅ）のデータは平均値±s.d.として示している（****P<0.0001、***P<0.005、n.s.、有意差なし、スチューデントのｔ検定）。
遷移状態の分子スイッチの性能の評価を示す。（ａ）抑制性複合体に対する分子スイッチの応答性を示した抑制曲線の一次導関数プロット。抑制性複合体の濃度を様々に変えて分子スイッチを調製した。得られたポリメラーゼ活性の変化に基づいて、分子スイッチを、オープン、応答性、クローズドの３つの群に分類した。応答性の濃度範囲では、分子スイッチは、抑制性複合体の濃度の変化に応答性を示す。抑制性複合体の濃度が応答性範囲を上回ると、分子スイッチはクローズド状態になり、分子スイッチの大半が不活性化される。抑制性複合体の濃度が応答性範囲を下回ると、分子スイッチはオープン状態になり、分子スイッチの大部分が活性化される。（ｂ）応答性状態、クローズド状態またはオープン状態の分子スイッチの摂動。インヒビターに対するエンハンサーの比率を低下させて、分子スイッチを摂動させた。応答性状態の分子スイッチは、幅広い範囲の摂動に対して反応性を示しただけでなく、ポリメラーゼ活性が大きく変化した場合も応答性を示した。（ｃ）遷移状態の分子スイッチのシグナルの評価。様々な状態の分子スイッチを、標的の存在下または非存在下において室温で30分間インキュベートし、得られたポリメラーゼ活性を測定した。遷移状態の分子スイッチは、応答性状態の分子スイッチよりも向上したシグナルを示したが、クローズド状態の分子スイッチやオープン状態の分子スイッチでは、識別可能なシグナルは生成されなかった。（ｄ）活性化動態。標的であるSARS-CoV-2のＮ遺伝子とともに室温でインキュベートすると、遷移状態の分子スイッチが最も速い活性化動態を示した。（ｅ）シグナル生成動態。標的の濃度を様々に変えて、遷移状態の分子スイッチを活性化させた。標的の濃度が高くなるほど、シグナルの生成速度が速くなった。（ｃ）～（ｅ）で使用した様々な状態の分子スイッチは、以下に示す代表的な組成で調製した。オープン状態：1nMのインヒビター鎖と1nMのエンハンサー鎖；遷移状態：36nMのインヒビター鎖と24nMのエンハンサー鎖；クローズド状態：100nMのインヒビター鎖と100nMのエンハンサー鎖。すべての測定は三連で行い、データは平均値±s.d.として示している（***P<0.005、**P<0.01、n.s.、有意差なし、スチューデントのｔ検定）。
複数の酵素カスケードを介したシグナルの増強を示す。（ａ）ポリメラーゼの伸長活性またはエキソヌクレアーゼ活性を測定するための２種のシグナル伝達オリゴヌクレオチド構造体の模式図。伸長活性に基づく方法では、活性型ポリメラーゼによって、セルフプライミングヘアピンオリゴヌクレオチドの伸長した３’末端にビオチン修飾dNTPが組み込まれる。ストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）と基質を添加した後に、蛍光シグナルを読み取ることができる。エキソヌクレアーゼ活性に基づく方法では、活性型ポリメラーゼが自己ハイブリダイズ鎖の５’末端に到達すると、ビオチン修飾ヌクレオチドを切断して、HRPの組み込み量を減少させることから、得られる蛍光シグナルも減少する。（ｂ）伸長活性に基づくシグナルの増強。等量のポリメラーゼで処理したところ、伸長活性に基づく方法では、エキソヌクレアーゼ活性に基づく方法よりも高いシグナルが示された（左図）。別の酵素カスケード（HRP）を追加することによって、ポリメラーゼのみの活性に基づいた測定と比較してシグナルが有意に増強された（右図）。（ｃ）CATCHアッセイの特異性。遷移状態の分子スイッチを利用したCATCHアッセイは、クローズド状態の分子スイッチを利用したCATCHアッセイと比べて、標的のミスマッチに対して特異性は損なわれなかった。（ｄ）CATCHアッセイの感度。検出限界（点線）は、標的を含まないコントロールの標準偏差の３倍と定義し、全量50μl中の様々な既知濃度の標的を滴定して、それぞれの蛍光シグナルを測定することにより決定した。（ｅ）CATCHアッセイの凍結乾燥。携帯型での使用を容易にするため、アッセイ試薬（分子スイッチとビオチン修飾dNTP）を凍結乾燥した。凍結乾燥を行っても、分子スイッチの性能は保持されていた。すべての測定は三連で行い、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）のデータは平均値±s.d.として示し、（ｃ）のデータは平均値として示している（****P<0.0001、***P<0.005、スチューデントのｔ検定）。
シグナル伝達オリゴヌクレオチドの固定化を示す。まず、様々なセンサ表面をアミン基で官能化した。具体的には、96ウェルプレートは、アミンリッチ足場タンパク質としてのウシ血清アルブミン（BSA）でコーティングし；マイクロ流体デバイスは、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）でコーティングした。次に、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ－SMCC）とともにインキュベートして、１級アミンを活性化させた。これとは別に、チオール修飾シグナル伝達オリゴヌクレオチドのジスルフィド結合を還元して活性化させた。次に、活性化させたシグナル伝達オリゴヌクレオチドを、アミンで官能化した表面に添加して共有結合させた。
CATCHシグナルの増幅および携帯型への組み込みを示す。（ａ）別の酵素の追加による性能の向上。別の酵素カスケード（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP））を追加することによって、ポリメラーゼ活性が低くても、CATCHアッセイにより蛍光シグナルが生成された。（ｂ）少量の標的の存在下でのCATCHの性能。標的なしのコントロールと1,000コピーの標的の間でシグナルの有意な差が観察された。（ｃ）分子スイッチ試薬の凍結乾燥。携帯型での使用を容易にするため、CATCH試薬（すなわち、分子スイッチとビオチン修飾dNTP）を凍結乾燥した。次に、凍結乾燥した試薬を、1分未満、5分、10分または30分かけて再構成してから、標的オリゴヌクレオチドと混合した。凍結乾燥した分子スイッチは、自発的にアセンブリし、その機能性を保持していた。（ｄ）凍結乾燥した分子スイッチの加速劣化。試薬を凍結乾燥し、室温（25℃）または加速劣化条件（80℃）下で３週間放置後にその活性を測定した。すべての測定は三連で行い、データは平均値±s.d.として示している（**P<0.01、スチューデントのｔ検定）。
細胞溶解物中のSARS-CoV-2の検出におけるCATCHの特異性を示す。標的であるSARS-CoV-2のＳ遺伝子およびＮ遺伝子の検出におけるCATCHアッセイの特異性。SARS-CoV-2に密接に関連するその他のヒトコロナウイルス（SARS-CoVとMERS-CoV）の配列および類似した症状の疾患を引き起こすその他のウイルス（デング熱ウイルスとＡ型インフルエンザH1N1亜型ウイルス）の配列に対するアッセイの特異性を評価した。合成した各標的を、（ａ）純粋なバッファーまたは（ｂ～ｃ）細胞溶解物に添加した。（ｂ）様々な温度と時間での加熱インキュベーション、または（ｃ）様々な洗浄剤の組み合わせを用いた化学的溶解により溶解物を調製した。分子スイッチは、すべての溶解条件において、標的であるSARS-CoV-2に対して特異的な検出を維持し、オフターゲットなウイルス配列に対してごくわずかな交差反応性しか示さなかった。すべての測定は三連で行い、データは平均値±s.d.として示している。
ポリメラーゼ活性に対する洗浄剤の影響を示す。様々な濃度の単一の種類の洗浄剤の存在下においてポリメラーゼ活性を評価した。ポリメラーゼ活性は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下で大幅に抑制され、サポニンの濃度上昇に伴って徐々に抑制された。試験したその他の洗浄剤は、それらの添加濃度に関係なく、ポリメラーゼ活性に対してごくわずかな影響しか示さなかった。すべての測定は三連で行い、データは平均値±s.d.として示している。
細胞の溶解効率に対する洗浄剤の影響を示す。（ａ）単一の種類の洗浄剤または複数の種類の洗浄剤の混合物を用いて細胞を溶解した。1%Triton X-100以外の洗浄剤は、5分以内に細胞を効率的に溶解することができた。（ｂ～ｃ）様々な比率で組み合わせたTriton X-100とSDSの存在下において、ポリメラーゼ活性を評価した。1：10の最適な比率のSDSとTriton X-100の混合物は、ポリメラーゼ活性を保持させつつ、5分以内に細胞を溶解することができた。すべての測定は三連で行い、（ａ）のデータは平均値として示し、（ｂ）および（ｃ）のデータは平均値±s.d.として示している。
化学的溶解および熱溶解による内因性のRNA標的の放出と保持を示す。ヒト肺上皮細胞において、内因性のmRNA標的であるGAPDH（ａ）とβ－アクチン（ｂ）を測定した。基準となるRNA試料は、細胞培養物から標準的な抽出方法で調製した。RNAの抽出を行わずに、同じ細胞培養物から化学溶解物と熱溶解物をそれぞれ調製した。すべての測定は、RT-qPCR分析により三連で行った。これらの溶解方法によって内因性のRNA標的を効果的に放出させ保持することができた。データは平均値±s.d.として示す。
COVID-19診断用のCATCHの臨床評価を示す。（ａ）鼻咽頭スワブ試料から抽出したRNA（陽性：n=24；陰性：n=25）および（ｂ）熱不活性化したスワブ溶解物（陽性：n=9；陰性：n=15）のCATCHアッセイを行った。（ｃ）CATCHアッセイと臨床RT-qPCRのCt値の相関性。CATCHアッセイは、臨床結果と良好に一致した（R=0.8261）。（ｄ）CATCHプラットホームの受信者操作特性（ROC）曲線。CATCH分析は、SARS-CoV-2の検出に対して高い正確度を示した（混合試料のAUC=0.9803；抽出された患者由来RNAのAUC=0.9833；熱不活性化スワブ試料のAUC=0.9704）。すべての測定は三連で行い、（ａ）～（ｃ）のデータは平均値±s.d.として示している。a.u.は任意単位を示す。AUCは曲線下面積を示す。
簡便に参照できるように、本明細書に記載の参考文献を一覧にして、実施例の後ろに付記している。この参考文献の一覧に記載の文献はいずれも引用によりその内容全体が本明細書に援用される。先行技術に関する考察は、本発明の技術分野においてその先行技術が技術常識の一部であるということを意味するものではない。
用語の定義
別段の記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において使用されている特定の用語を以下にまとめた。
本明細書および添付の請求項において使用されているように、単数形の「a」、「an」および「the」は、明確な記載がない限り、複数のものを含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの標的配列」に関する言及は、複数の標的配列を含み、「１つの酵素」に関する言及は、１つ以上の酵素および当業者に公知の等価物を指し、その他についても同様である。
本明細書において、「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはこれらの断片；一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、かつセンス鎖であってもよく、アンチセンス鎖であってもよい、ゲノム由来もしくは合成のDNAもしくはRNA；ペプチド核酸（PNA）；またはDNA様物質もしくはRNA様物質を指す。
本明細書において、「抑制性複合体」は、DNAポリメラーゼに結合してこれを不活性化する、インヒビターポリヌクレオチドとエンハンサーポリヌクレオチドからなる二本鎖を指す。
本明細書において、「DNAポリメラーゼインヒビター」または「インヒビター」は、保存領域と可変領域を含むポリヌクレオチドであって、保存領域が、DNAポリメラーゼ酵素によって認識されてこれに結合し、前記可変領域が、エンハンサーポリヌクレオチドの一部に相補的であることを特徴とするポリヌクレオチドを指す。
本明細書において、「エンハンサー」は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドであって、その一部が、DNAポリメラーゼインヒビターの可変領域の相補的配列と二本鎖を形成することができ、別の一部が突出末端を形成することを特徴とするポリヌクレオチドを指す。エンハンサーの長さは、約40ヌクレオチド長であることが好ましく、その全体が標的ポリヌクレオチド配列に相補的であることが好ましく、その40ヌクレオチド長のうち20ヌクレオチド長は、インヒビターと二本鎖を形成し、残りの20ヌクレオチド長は突出末端を形成することが好ましい。したがって、インヒビターとエンハンサーは、DNAポリメラーゼ活性を抑制する二本鎖抑制性DNA複合体を形成し、エンハンサーが標的ポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成すると、二本鎖の抑制性DNA複合体からエンハンサーが外れて、DNAポリメラーゼ活性に対する抑制が解除される。
本明細書において、「遷移状態」は、エンハンサーとインヒビターの比率に関してさらに最適化が行われたインヒビター複合体とDNAポリメラーゼの最適な比率を指す（例えば、図2c、図6および図7を参照されたい）。最適化を行ったところ、遷移状態は、抑制曲線の一次導関数プロットの頂点として定義された（図2c、挿入図）。この同定された遷移状態は、最適化された応答性を示し、ポリメラーゼ活性が最も増加したが、「オープン状態」の分子スイッチや「クローズド状態」の分子スイッチでは、識別可能なシグナルの生成は認められなかった（図7c）。いわゆるクローズド状態では、過剰量の抑制性複合体がポリメラーゼに結合していることから、分子スイッチの大半が完全に不活性化されており、ポリメラーゼ活性をオンにするには、大量のRNA標的が必要となる。オープン状態では、分子スイッチの大半が完全に活性化しており、初期バックグラウンドが高い状態でさらなるポリメラーゼ活性がオンになることから、正味のシグナルは低くなる。遷移状態では、様々な形態（すなわち、不活性型、中間型および活性型）の分子スイッチが鋭敏な動的平衡で存在しており（図2c）、少量の標的分子によって容易に平衡状態がシフトして、さらに活性化された分子スイッチの形成が促進され、その結果、全体的なポリメラーゼ活性が大幅に増加する。
本明細書において、「試料」という用語は、最も広い意味で使用される。例えば、SARS-CoV-2のゲノム配列を含む疑いのある生体試料は、体液；細胞抽出物または細胞から単離された染色体、細胞小器官もしくは細胞膜；細胞；（溶液または固体担体に結合された状態の）ゲノムDNA、RNAまたはcDNA；組織；組織プリントなどを含んでいてもよい。
本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、例えば、本発明の方法の実施中に、ヌクレアーゼを含む可能性のある試料中においてオリゴヌクレオチドの活性を持続させるため、またはキットにおいて保存期間を向上させるために、構造的かつ／または化学的に修飾されていてもよい。したがって、インヒビター、エンハンサーおよび／もしくはシグナル伝達ナノ構造体、または本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドプライマーもしくはオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に修飾されていてもよい。いくつかの実施形態において、構造的修飾および／または化学的修飾として、蛍光タグ、放射性タグ、ビオチン、５’テールなどのタグの付加；ホスホロチオエート（PS）結合の付加；２’－Ｏ－メチル修飾；および／または合成過程におけるC3スペーサーホスホロアミダイトの付加が挙げられる。
例えば、本明細書では、５’チオール基を用いた付加反応によりシグナル伝達オリゴヌクレオチドを修飾した。５’末端にその他の付加修飾を行うこともでき、このような修飾として、アミノ、アクリレート、アジドなどが挙げられる。
本発明の文脈において用いられる「含む」という用語は、本発明の実施に際して、様々な成分、材料または工程を組み合わせて使用することを指す。したがって、「含む」という用語には、この用語よりも限定的な意味の「実質的に～からなる」および「からなる」という用語も包含される。「実質的に～からなる」という用語は、本発明に記載されている特徴が、明示されている特徴を「必須」の構成要素として「実質的に」含むことを意味する。
実施例１
材料と方法
分子スイッチの設計と調製
本実施例で使用したすべてのオリゴヌクレオチド配列を表１に示しており、これらのオリゴヌクレオチド配列は、Integrated DNA Technologies（IDT）社から購入した。SARS-CoV-2のゲノム配列（NC_045512）、SARS-CoVのゲノム配列（FJ882957）、MERSのゲノム配列（NC_019843）、デング熱ウイルスのゲノム配列（NC_001477）およびＡ型インフルエンザH1N1亜型ウイルス（A/California/07/2009（H1N1）株、NC_026431～NC_026438）は、NCBIのRefSeqから取得した。複数の配列のアラインメントは、UGENEツールスイートを用いて行った［Okonechnikov K et al., Bioinformatics. 2012, 28:1166-1167］。分子スイッチを調製するため、50mM NaCl、1.5mM MgCl2および50mM Tris-HClで構成された反応バッファー（pH8.5）中で、インヒビターオリゴヌクレオチドとエンハンサーオリゴヌクレオチド（表１、IDT社）を混合した。得られた混合物を95℃で5分間インキュベートし、反応温度が25℃に達するまで0.1℃/秒でゆっくり冷却して、抑制性複合体を形成させた。次に、Taq DNAポリメラーゼ（プロメガ）を加えて、分子スイッチを完成させた。

Figure 2024505272000002
Figure 2024505272000003
遷移状態の特性評価
分子スイッチの様々な状態を特定するため、まず、インヒビター鎖とエンハンサー鎖の比率を１：１に固定して、その他の構成要素の比率を様々に変え、次に、インヒビター鎖とエンハンサー鎖の比率を様々に変えた。これらの実験により得られたポリメラーゼ活性を、蛍光シグナルプローブの５’エキソヌクレアーゼ分解により測定した。簡潔に述べると、反応バッファー中において、等モル量の蛍光プローブと鋳型とプライマー（IDT社）を、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、サーモサイエンティフィック）と混合した。得られた混合物を95℃で5分間インキュベートし、0.1℃/秒でゆっくり冷却して25℃まで反応温度を下げた。次に、分子スイッチをプローブ含有混合物に加え、25℃でインキュベートしながら、蛍光強度を読み取った。観察されたポリメラーゼ活性の変化から、分子スイッチの様々な状態を定義した。すなわち、オープン状態は、抑制性複合体が存在しない（<20nM）状態であり、クローズド状態は、抑制性複合体が過剰に存在する（>60nM）状態であり、遷移状態は、最も応答性が高い状態である（すなわち、抑制曲線の一次導関数の頂点を示し、この遷移状態では、分子スイッチの組成のわずかな変化によって、ポリメラーゼ活性が大きく変化する）。核酸標的に対する様々な状態の分子スイッチの応答性を評価するため、以下の代表的な組成で分子スイッチを調製し、様々な組成の分子スイッチを標的オリゴヌクレオチドとインキュベートした。各状態の分子スイッチとして、オープン状態は、インヒビター鎖1nMとエンハンサー鎖1nMで調製し；クローズド状態は、インヒビター鎖100nMとエンハンサー鎖100nMで調製し；遷移状態は、インヒビター鎖36nMとエンハンサー鎖24nMで調製した。いずれの実験でも、配列をスクランブルしたオリゴヌクレオチドを用いて、オフターゲットなバックグラウンドシグナルを測定した。
シグナル伝達オリゴヌクレオチドの固定化
図9に示すように、シグナル伝達オリゴヌクレオチドをELISAプレートに固定した。具体的には、ウシ血清アルブミン（BSA、5%w/v、シグマ）を足場タンパク質としてELISAプレート（サーモサイエンティフィック）に吸着させ、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ－SMCC、0.5mg/ml、Pierce）を加え、室温で30分間インキュベートすることにより活性化させた。次に、0.05%v/v Tween-20（シグマ）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（サーモサイエンティフィック）（PBST）でプレートを洗浄した。これとは別に、チオール修飾シグナル伝達オリゴヌクレオチド（表１、IDT社）にTCEP還元ゲル（Pierce）を加え、室温で１時間インキュベートすることによってジスルフィド結合を還元して、シグナル伝達オリゴヌクレオチドを活性化させた。この反応物を濾過し、得られたゲルを数回洗浄して、活性化されたシグナル伝達オリゴヌクレオチドを回収した。次に、先に調製したBSAコーティングプレートに、活性化したシグナル伝達オリゴヌクレオチドを加え、室温で2時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、2%BSAを用いてプレートを室温で１時間ブロックした。次に、PBSTと反応バッファーでプレートを洗浄してから、試料の添加を行った。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）によるポリメラーゼ活性の増幅
２種類の形態のシグナル伝達オリゴヌクレオチドを用いて、異なる種類のポリメラーゼ活性、すなわち、エキソヌクレアーゼに基づく活性と伸長に基づく活性の増幅と変換を評価した。いずれの形態のシグナル伝達オリゴヌクレオチドを用いた方法でも、ポリメラーゼを含んでいないコントロールウェルを同時に測定して、ベースラインシグナルを得た。エキソヌクレアーゼに基づく方法では、ダンベル型のシグナル伝達DNA構造体をプレートに固定し、固定したダンベル型のシグナル伝達DNA構造体から、触媒作用によりビオチン修飾ヌクレオチドを除去することによって、ポリメラーゼ活性（５’エキソヌクレアーゼ活性）を測定した。簡潔に述べると、標的を含む試料を遷移状態の分子スイッチと混合し、dNTP（サーモサイエンティフィック）の存在下で、固定したシグナル伝達オリゴヌクレオチドと室温で30分間インキュベートして直接反応させた。PBSTによる洗浄工程を行い、ストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP、サーモサイエンティフィック）とインキュベートしてから、QuantaRed化学蛍光基質（サーモサイエンティフィック）を添加し、蛍光強度（テカン社）を測定して、ビオチン修飾ヌクレオチドの除去を評価した。
伸長に基づく方法では、プレートに固定したセルフプライミングヘアピンシグナル伝達DNA構造体に、ビオチン修飾ヌクレオチドを組み込んでポリメラーゼ活性を測定した。試料と分子スイッチをシグナル伝達構造体に加え、ビオチン修飾dNTP混合物（TriLink BioTechnologies）の存在下でインキュベートした。室温で30分間インキュベートし、PBSTで洗浄してから、ストレプトアビジン標識HRP（サーモサイエンティフィック）を加えてインキュベートした。洗浄後、QuantaRed化学蛍光基質（サーモサイエンティフィック）を添加し、蛍光強度（テカン社）を測定して、ビオチン修飾ヌクレオチドの付加を評価した。
CATCHアッセイ（プレートフォーマット）
前述した方法で、遷移状態の分子スイッチを調製した。調製した分子スイッチに、標的を含む試料を混合して、最終量を50μlとした。次に、得られた混合物を、ビオチン修飾dNTP混合物の存在下において、プレートに固定したセルフプライミングシグナル伝達DNA構造体に加えた。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。PBSTによる洗浄工程を行い、ストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP、サーモサイエンティフィック）とインキュベートしてから、QuantaRed化学蛍光基質（サーモサイエンティフィック）を添加し、蛍光強度（テカン社）を測定した。各試料に対して、各試料と同じ条件の陽性コントロール（抑制性複合体を含んでいないポリメラーゼ）と陰性コントロール（配列をスクランブルした分子スイッチ）を同時に測定して、データの正規化を行った。
デバイスの製造
プロトタイプのマイクロ流体デバイスを、前述した方法で標準的なソフトリソグラフィを用いて製造した［X. Wu, et al., Sci Adv 6, eaba2556 (2020)］。簡潔に述べると、クリーンルーム用マスクアライナ（SUSS MicroTec）を用いて、シリコンウェハ上にSU-8フォトレジストを塗布し、紫外線（UV）を露光して成形することによって、パターンが転写された50μmの厚さの鋳型を作製した。ポリジメチルシロキサン（PDMS、ダウコーニング）と架橋剤を10：1の比率で混合して、SU-8フォトレジストで成形した鋳型に流し込んだ。最初に75℃で30分間ポリマーを硬化させた。次に、PDMSフィルムで形成された各流路上に、複数のナイロン製ねじと六角ナット（アールエスコンポーネンツ社）を配置してPDMSフィルムに埋没させ、最終硬化工程を行った。
デバイスの調製
上記で製造したマイクロ流体デバイスにシグナル伝達オリゴヌクレオチドを固定するため、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES、2%v/v、シグマ）の95%エタノール溶液でマイクロ流体デバイスのガラス表面を室温で１時間処理した。次に、検出室をエタノールでフラッシュして、過剰なAPTESを除去し、乾燥させた。これとは別に、前述した方法で、チオール修飾シグナル伝達オリゴヌクレオチドを活性化させた。次に、活性化したチオール修飾シグナル伝達オリゴヌクレオチドをマイクロ流体デバイスに流し込み、室温で2時間インキュベートした。PBSTでフラッシュして過剰なシグナル伝達オリゴヌクレオチドを除去した後、2%BSAを用いて検出室を室温で１時間ブロックした。次に、検出室をPBSTと反応バッファーで洗浄した。測定操作を実施するためのマイクロ流体デバイスを調製するため、マイクロ流体デバイス内でアッセイ試薬を凍結乾燥した。インヒビター鎖、エンハンサー鎖、ポリメラーゼおよびビオチン修飾dNTP混合物を含む試薬混合物をマイクロ流体デバイスに流し入れ、一晩凍結乾燥した（Labconco社）。
CATCHアッセイ（マイクロ流体チップフォーマット）
マイクロ流体デバイスの操作工程を図4に示す。典型的なアッセイとして、３つの入口のそれぞれに試料5μlを導入して、試料およびこの試料と同じ条件の陽性コントロールと陰性コントロールの測定を行った（それぞれ流路１、流路２および流路３に導入した）。陽圧をかけて、各試料を各検出室へと流した。各検出室内の各溶液をデバイス内で室温にて30分間インキュベートした。PBSTでフラッシュした後、5μlのストレプトアビジン標識HRPを導入し、室温で5分間インキュベートした。次に、結合しなかったストレプトアビジン標識HRPを除去し、5μlのQuantaRed化学蛍光基質（サーモサイエンティフィック）を加えた。スマートフォンを利用した光学センサを用いて、得られた蛍光強度を各検出室（図3参照）において測定した。
スマートフォンを利用した光学センサ
マイクロ流体デバイスに組み込んだCATCHアッセイをスマートフォンで分析できるようにするため、過去の報告に従って、3D印刷により作製した光学ケージ内にLED光源と、光学フィルタと、拡大レンズを設置したセンサを作製した［X. Wu, et al., Sci Adv 6, eaba2556 (2020)］。光学ケージは、卓上型3Dプリンター（Aureus）を用いて、UV硬化樹脂（HTM 140）で作製した。LED光源（Chaoziran S&T）の中心波長は500nmであり、光学フィルタ（Thorlabs）の中心波長は600nmであった。拡大レンズ（Thorlabs）をスマートフォンのカメラの前に配置して画質を向上させた。構築した光学系の寸法は、45mm（幅）×45mm（長さ）×50mm（高さ）であり、スマートフォン（Apple）を簡単に装着できるように、スライド式スロットを２つ設けた。市販のマイクロプレートリーダー（テカン社）で様々な蛍光色素の強度を測定して、センサの性能を評価した。
データの正規化
Inorm＝（Itarget－Icontrol）／（Ipol－Icontrol）
Inormは、補正された蛍光強度であり、Itargetは、標的に対する分子スイッチとインキュベートした試料の蛍光強度であり、Icontrolは、配列をスクランブルした分子スイッチコントロールとインキュベートしたこと以外は試料と同じ条件の陰性コントロールの蛍光強度であり、Ipolは、活性型ポリメラーゼとインキュベートしたこと以外は試料と同じ条件の陽性コントロールの蛍光強度である。
CATCHの性能の評価
遷移状態の特異性をクローズド状態の特異性と比較して評価するため、分子スイッチによって生成されるシグナルに最も大きな影響を与える位置に様々な数のミスマッチを有する標的と分子スイッチを混合した［Ho NRY et al., Nat Commun. 2018, 9: 3238］（表１）。前述した方法により、プレート上でアッセイを行って、得られたポリメラーゼ活性を測定した。また、CATCHアッセイの感度を評価するため、標的の10倍段階希釈を調製し、段階希釈した標的試料を、様々に異なる状態の分子スイッチと混合して（例えば、遷移状態とクローズド状態の比較）、ポリメラーゼ活性の変化を評価した。また、凍結乾燥した分子スイッチの機能性の回復に必要なインキュベーション時間を調べるため、凍結乾燥した試薬を反応バッファーで再構成し、1分未満、5分間、10分間または30分間インキュベートしてから標的と混合し、官能化したプレートに移してシグナルを発生させた。さらに、凍結乾燥した分子スイッチの性能を評価するため、凍結乾燥した分子スイッチまたは凍結乾燥していない分子スイッチをそれぞれ標的と混合し、得られたポリメラーゼ活性を、前述した方法に従って蛍光シグナルプローブの５’エキソヌクレアーゼ分解により測定した。
細胞培養および細胞溶解
ヒト肺上皮細胞株（PC9）は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手し、10%ウシ胎児血清（FBS、HyClone）および1%ペニシリン－ストレプトマイシン（Gibco）を添加したRPMI-1640培地（HyClone）中で、5%CO2の湿潤インキュベーターにて37℃で増殖させた。細胞株を試験して、マイコプラズマ汚染がないことを確認した（MycoAlertマイコプラズマ検出キット、ロンザ社、LT07-418）。生体試料におけるCATCHアッセイの性能を評価するため、様々なプロトコルを用いて細胞溶解物を調製し、標的の合成オリゴヌクレオチドを添加してから、分子スイッチを試料に添加して試験を行った。RNaseインヒビターをすべての溶解混合物に加えた。具体的には、熱処理または洗浄剤バッファーとのインキュベーションにより細胞ペレットを溶解した。熱処理では、細胞ペレットを反応バッファーに再懸濁し、56℃で30分間、70℃で5分間または90℃で5分間加熱した［Chin AWH, et al., The Lancet Microbe. 2020, 1: e10; Ladha A et al., medRxiv (2020). Doi.org/10.1101/2020.05.07.20055947］。化学的溶解では、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、サポニン、Tween-20、Igepal CA-630、NP-40（シグマ）から選択した様々な量の単一の洗浄剤または複数の種類の洗浄剤の混合物と反応バッファーを混合して溶解バッファーを調製した。化学的溶解組成物とインキュベーション時間を最適化するため、ポリメラーゼ活性を良好に保持しつつ、細胞を急速に溶解することが可能であるかという点について、様々な溶解条件を評価した。細胞溶解効率を評価するため、溶解バッファー中で細胞をインキュベートし、Countess II自動セルカウンター（サーモサイエンティフィック）で、残った細胞数を計数した。ポリメラーゼ活性は、前述と同様に、蛍光シグナルプローブの５’エキソヌクレアーゼ分解により測定した。
RNAの抽出および検出
RNAの抽出は、製造業者のプロトコルに従って、市販のキット（RNeasy Mini、キアゲン）を用いて行った。抽出したRNAは、Nanodrop分光光度計（サーモサイエンティフィック）で定量した。標準的なRT-qPCR分析により特異的なRNA標的を検出するため、抽出したRNAを逆転写して、第１鎖cDNAを作製した（MultiScribe Reverse転写酵素、サーモサイエンティフィック）。PCR分析では、ハウスキーピング遺伝子（すなわち、GAPDHおよびβ－アクチン）を検出するため、製造業者の推奨に従って、Taqman Fast Advanced Master Mix（サーモサイエンティフィック）とプライマーセット（Taqman gene expression assays、サーモサイエンティフィック）を使用した。増幅条件は、95℃で2分を1サイクル、95℃で1秒を45サイクルおよび60℃で20秒とした。サーマルサイクルは、QuantStudio 5リアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズ）において行った。
臨床的測定
本研究では、抽出したRNAと熱不活性化スワブからなる合計48個の臨床試料を評価した。CATCHアッセイの診断性能を判定するため、抽出したRNA試料（陽性：n=20；陰性：n=9）は、CATCHアッセイにそのまま使用し、スワブ溶解物（陽性：n=9；陰性：n=10）は、70℃で30分間加熱してからCATCHアッセイにより測定を行った。SARS-CoV-2の臨床診断は、市販のRT-qPCRアッセイ（Fortitude Kit、MiRXES）により行った。増幅条件は、48℃で15分を1サイクル、95℃で150秒を1サイクル、95℃で10秒を42サイクルおよび59℃で42秒とした。CDCのガイドライン［米国疾病予防管理センター（CDC）2019 - Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel. (2020)、www.fda.gov/media/134922/downloadから入手可能］に従って、Ct値が40未満の場合に、陽性と判定した。臨床試料の測定はすべて匿名化かつ盲検化して実施し、臨床Ct値との比較を行う前に完了させた。
統計分析
特段の記載がない限り、すべての測定は生物学的反復を３回にして実施し、データは平均値±標準偏差として示した。試料間の比較を行うため、複数の試料ペアをそれぞれスチューデントのｔ検定で検定し、多重仮説検定を行うため、ボンフェローニ補正を用いて、得られたP値を調整した。調整P値<0.05を有意差ありと判定した。受信者動作特性（ROC）曲線は、患者のプロファイリングデータを元に作製し、（１－特異度）に対して感度をプロットすることにより構築し、曲線下面積（AUC）値は、台形法を用いて計算した。臨床報告を分類基準（真の陽性および真の陰性）として用いた。検出感度、特異度および正確度は、標準的な計算式を用いて計算した。統計分析は、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン7.0c）を用いて行った。
実施例２
CATCHプラットホーム
CATCHアッセイの動作原理を図1aに示す。SARS-CoV-2ウイルスのRNA標的を含む臨床試料をDNA－酵素分子スイッチと混合して、高感度な直接検出を行った。このハイブリッドスイッチは、インヒビター鎖とエンハンサー鎖を含む抑制性DNA複合体からなり、この抑制性DNA複合体は、Taq DNAポリメラーゼに結合してこれを不活性化する［Dang C et al., J Mol Biol. 1996, 264: 268-278］。様々なSARS-CoV-2 RNA標的に相補的な抑制性DNA複合体を設計した（図6a）。特異的な標的RNAの存在下においてのみ、エンハンサーが標的とハイブリダイズして、インヒビターが押しのけられ、その結果、ポリメラーゼが放出されて活性化される。インヒビター鎖は、保存領域（ループ）と可変領域（ステム）からなるステムループ構造である。興味深いことに、インヒビター鎖のみでもポリメラーゼ活性を弱く抑制することができるが、エンハンサー鎖を同時に加えることによって、ポリメラーゼ活性を強く抑制することができる（図6b）。これは、恐らく、インヒビター鎖のステム部分にエンハンサー鎖がハイブリダイズすることによって、ステムループ構造の安定性が向上し、その結果、インヒビター鎖の抑制効果が増強することによるものだと考えられる［Dang C et al., J Mol Biol. 1996, 264: 268-278; Hasegawa H et al., Molecules. 2016, 21; 421］。本発明者らは、エンハンサー鎖による強力なオン・オフの切り替え効果と複数の構成要素の動的平衡（すなわち、分子スイッチの内部および複数の分子スイッチ間での構成要素の動的平衡）が見出されたことから、個々の分子スイッチの分子成分の比率を調節することによって分子スイッチを調整可能であると推察し、クローズド状態、遷移状態、オープン状態という標的応答性の異なる様々な状態の分子スイッチを得ることができた（図1a、右図）。クローズド状態では、過剰量の抑制性複合体がポリメラーゼに結合していることから、分子スイッチの大半が完全に不活性化されており、ポリメラーゼ活性をオンにするには、大量のRNA標的が必要となる。オープン状態では、分子スイッチの大半が完全に活性化しており、初期バックグラウンドが高い状態でさらなるポリメラーゼ活性がオンになることから、正味のシグナルは低くなる。遷移状態では、様々な形態（すなわち、不活性型、中間型および活性型）の分子スイッチが鋭敏な動的平衡で存在しており（図6c）、少量の標的分子によって容易に平衡状態がシフトして、さらに活性化された分子スイッチの形成が促進され、その結果、全体的なポリメラーゼ活性が大幅に増加する。
分子スイッチの様々な構成要素の比率を調整することによって、遷移状態の分子スイッチがRNA標的に対して高い応答性を示すことが判明したことから、この遷移状態の分子スイッチを利用して、SARS-CoV-2の迅速かつ高感度検出用のCATCHアッセイを開発した。検出シグナルをさらに増強するため、別の酵素による増幅を介してポリメラーゼ活性の変化を測定した（図1b）。具体的には、標的により誘導されるポリメラーゼ活性を利用して、固定されたヘアピンオリゴヌクレオチドにビオチン修飾デオキシヌクレオチド三リン酸（ビオチン－dNTP）を組み込むことによって、ストレプトアビジン標識酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を動員して化学蛍光シグナルを発生させた。クローズド状態の分子スイッチやオープン状態の分子スイッチを用いたアッセイと比べて、（遷移状態の分子スイッチを用いた）CATCHアッセイでは、ウイルス量の少ない弱陽性患者から強力なシグナルが生成される。重要な点として、このCATCHアッセイは、様々な診断ニーズに応えるために、多種多様な実装が可能である（図1c）。例えば、シグナル伝達オリゴヌクレオチドをハイスループットアプリケーション用の96ウェルプレートに固定することができる。このアッセイ構成は、アッセイワークフローと読み取りの点で従来のELISAと非常によく似ており、標準的な設備を備えた臨床検査室に容易に適合させることができる。CATCHアッセイは、小型化したマイクロ流体デバイスに実装することもできる（図3および図4）。さらに、スマートフォンを利用した携帯型の蛍光検出器を利用して、化学蛍光シグナルを容易に検出し、同程度の性能を発揮することができる（図5）。
実施例３
遷移状態の分子スイッチ
SARS-CoV-2の検出用のCATCHアッセイを開発するため、SARS-CoV-2ウイルスRNAに対する特異的プローブとして分子スイッチを設計した。特異的な標的として、SARS-CoV-2ウイルスのスパイク（Ｓ）遺伝子領域［Yan C et al., Clin Microbiol Infect. 2020, 26: 773-779］と、ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子領域［Broughton JP et al., Nat Biotechnol. 2020, 38: 870-874］とを選択し、これらの配列に基づいて種類の異なる分子スイッチを構築した（図6aおよび表１）。分子スイッチの遷移状態を同定するため、まず、Taqポリメラーゼに対する抑制性複合体の効果を評価した。具体的には、一定の濃度にしたポリメラーゼに、徐々に濃度を増加させた抑制性複合体を加えて滴定した（すなわち、エンハンサーとインヒビターの比率を１：１に維持したまま、抑制性複合体の濃度を様々に変化させた）。20nMを上回る濃度の抑制性複合体とインキュベートした場合に、ポリメラーゼ活性が顕著に抑制されることが認められた（図6b）。この抑制曲線の一次導関数をプロットして、分子スイッチを、オープン、応答性、クローズドの３つの群に分類した（図6bの挿入図および図7a）。オープン状態の分子スイッチは、低濃度の抑制性複合体（<20nM）で調製した。応答性範囲の分子スイッチは、中程度の濃度の抑制性複合体で調製したものであり、抑制性複合体の濃度が変化しても応答性を維持した（すなわち、一次導関数において、分子スイッチが最も高い応答性を示す頂点にあり、36nMの抑制性複合体を用いて分子スイッチを調製した）。クローズド状態の分子スイッチは、高濃度の抑制性複合体（>60nM）で調製した。重要な点として、エンハンサー鎖の量を減少させて系を摂動させると（すなわち、インヒビターに対するエンハンサーの比率を減少させると）、応答性状態の分子スイッチでは、ポリメラーゼ活性が大きく変化した（図7b）。
遷移状態を確立するため、インヒビター鎖の量を一定に維持したまま、エンハンサー鎖の量を滴定することによって（すなわち、分子スイッチに標的をハイブリダイズさせて、分子スイッチを活性化させることによって）、応答性状態の分子スイッチの調整をさらに行った（図6c）。この最適化の結果、抑制曲線の一次導関数プロットの頂点として遷移状態を定義した（図6c、挿入図）。この同定された遷移状態では、応答性がさらに向上していることが示され、ポリメラーゼ活性が最も増加したが、オープン状態の分子スイッチおよびクローズド状態の分子スイッチでは、識別可能なシグナルの生成は認められなかった（図7c）。遷移状態の分子スイッチの性能をさらに評価した。分子スイッチの様々な構成要素の比率を調整することによって、オンターゲットな相補的RNA配列とインキュベートした際に有意なポリメラーゼ活性が示されただけでなく、オフターゲットな配列で処理した際に低いバックグラウンド活性が維持された（図6d）。さらに重要な点として、Ｓ遺伝子に対する分子スイッチ（図6e）とＮ遺伝子に対する分子スイッチ（図7d）のいずれにおいても、遷移状態の分子スイッチは、非常に急速な活性化動態を示した。その他の状態に調製した分子スイッチと比較して、遷移状態の分子スイッチは、即座にポリメラーゼを活性化させることができた。また、室温での30分以内のインキュベーションで様々な濃度の標的を区別することができた（図7e）。
実施例４
シグナルの生成および増幅
次に、分子スイッチにより誘導されたポリメラーゼ活性を酵素により増幅して測定を行うために、シグナル伝達機構を開発した。具体的には、異なる種類のポリメラーゼ活性（すなわち、伸長活性またはエキソヌクレアーゼ活性）を利用して、別の酵素カスケード（すなわち、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP））を動員し、シグナルを増幅させるための２種類のシグナル伝達オリゴヌクレオチド構造体を設計した（図8a）。足場タンパク質を介して、シグナル伝達オリゴヌクレオチド構造体を96ウェルELISAプレートに固定した（図9）。伸長活性に基づく方法では、活性型ポリメラーゼによって、セルフプライミングヘアピンオリゴヌクレオチドの伸長鎖（３’末端）にビオチン修飾dNTPが組み込まれる。次に、ストレプトアビジン標識HRPと化学蛍光基質を添加することによって、蛍光シグナルが発生する。エキソヌクレアーゼに基づく方法では、５’末端にビオチン修飾を有するダンベル型のシグナル伝達オリゴヌクレオチドを構築した。活性型ポリメラーゼは、シグナル伝達オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長して、自己ハイブリダイズされた５’末端に到達すると、ビオチン修飾ヌクレオチドを切断する。ストレプトアビジン標識HRPを反応させると、ビオチン基が除去されたことによって、蛍光シグナルの量が減少する。これら２種のシグナル伝達オリゴヌクレオチド構造体を等量の活性型ポリメラーゼで処理して、得られた蛍光シグナルの変化を測定することによって、この２つの方法を評価した。伸長活性に基づく方法では、エキソヌクレアーゼ活性に基づく方法よりも有意に高いシグナルが示された（図8b、左図）。これを踏まえて、CATCHのシグナルを伝達する方法として、伸長活性に基づく方法を取り入れた。ポリメラーゼ活性のみの測定と比較して、追加のHRPを動員することによって、シグナルの出力が増強され（図8b、右図）、検出のダイナミックレンジを広げることができた（図10a）。
このようなシグナル伝達能が見出されたことから、応答性の高い標的認識を行うための遷移状態の分子スイッチと、シグナルを増強させるための伸長活性に基づく複数の酵素カスケードとを利用したCATCHアッセイのワークフローを開発した。具体的には、RNA標的と遷移状態の分子スイッチを混合し、固定したシグナル伝達オリゴヌクレオチドと直接インキュベートして（室温で30分間）反応させて、シグナル伝達とその増強を行った。クローズド状態の分子スイッチを用いた類似のアッセイ（すなわち、完全に不活性化された分子スイッチとHRPを用いたシグナルの増強）と比較して、CATCHアッセイは、分子スイッチの最も感受性の高いセグメントに対してミスマッチを導入した場合でも、標的ミスマッチに対して同程度の特異度を示した（図8cおよび表１）。より重要な点として、遷移状態の分子スイッチは、より優れた性能を示した。標的試料を段階希釈し、様々な状態の分子スイッチとインキュベートした滴定実験では、CATCHアッセイは、クローズド状態の分子スイッチを用いたアッセイと比較して、検出限界が107倍以上向上した（検出限界：標的１μlあたり約８コピー）（図8dおよび図10b）。携帯型での臨床応用を容易にするため、マイクロ流体デバイスの内部でアッセイ試薬（すなわち、分子スイッチとビオチン－dNTP）を凍結乾燥した。凍結乾燥によって、アッセイの性能が保持されるだけでなく、優れた長期安定性を付与することもできた（図8eおよび図10c～d）。
実施例５
細胞溶解物におけるCATCHアッセイの評価
従来のqPCRでは、労力を要する試料調製（すなわちRNA抽出）が必要とされることに対処するため、この必須の制約的な試料調製工程を省くことが可能なCATCHアッセイを開発することができるかどうかを次に検討した。SARS-CoV-2のRNA標的用に設計した特異的な分子スイッチ（すなわち、Ｓ遺伝子に対する分子スイッチとＮ遺伝子に対する分子スイッチ）を作製したところ、これらの分子スイッチは、特異的な検出が可能であり、密接に関連するその他のヒトコロナウイルス（SARS-CoVおよびMERS-CoV）の配列や、類似した症状の疾患を引き起こすその他のウイルス（デング熱ウイルスおよびＡ型インフルエンザH1N1亜型ウイルス）の配列に対してごくわずかな活性しか示さないことが示された（図11a）。これらの特異的な分子スイッチを用いて、様々な細胞溶解物におけるCATCHアッセイの性能を評価した。
具体的には、熱溶解（図11b）と化学的溶解（図11c）の２種類の直接溶解方法を調査し、得られた溶解物を用いてCATCHによる直接検出を行った。熱溶解では、溶解効率に対する様々な温度と加熱時間の影響を調べた。公表されている研究に基づいて、56℃で30分、70℃で5分、90℃で5分の３つの異なる温度条件を選択した［Chin AWH, et al., The Lancet Microbe. 2020, 1: e10; Ladha A et al., medRxiv (2020) Doi.org/10.1101/2020.05.07.20055947］。化学的溶解では、処理条件を最適化するため、まず、単一の種類の洗浄剤の存在下で、ポリメラーゼ活性を評価した（図12）。ポリメラーゼ活性は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下において大幅に抑制され、サポニンの濃度上昇に伴って徐々に抑制されることが見出された。試験したその他の洗浄剤（例えばTriton X-100）では、ポリメラーゼ活性に対する影響はごくわずかであることが示された。この知見に基づいて、次に、ポリメラーゼ活性を良好に維持しつつ（図13b）、迅速に細胞溶解を行うために（図13a）、洗浄剤の組み合わせを最適化した。1：10の最適な比率のSDSとTriton X-100の混合物は、ポリメラーゼ活性を保持させつつ、5分以内に細胞を溶解できることが判明した。
選択した熱溶解プロトコルと化学的溶解プロトコルを用いて、まず、ヒト肺上皮細胞において内因性RNA標的（すなわち、GAPDHおよびβ－アクチン）を放出させ、この内因性RNA標的を保持できるかどうかを検証した。RT-qPCRにより分析した結果、試験した内因性標的のいずれでも、すべての溶解物において、標準的な方法で抽出したRNA試料と同程度のサイクル閾値（Ct）が得られることが示された（図14）。さらに、開発したCATCHアッセイと溶解プロトコルの適合性を評価した。熱溶解物（図11b）または化学的溶解物（図11c）に合成標的を添加して調製した溶解物混合物と分子スイッチをインキュベートして、CATCH検出を行った。すべての溶解条件において、CATCHアッセイは、SARS-CoV-2に対する強力かつ特異的な検出を維持しただけでなく、オフターゲットなウイルスに対してごくわずかな交差反応性しか示さなかった。
実施例６
臨床スワブ試料におけるSARS-CoV-2の検出
SARS-CoV-2検出用のCATCHプラットホームの臨床的有用性を試験するため、患者試料を用いて実用性研究を行った。本研究は、（１）鼻咽頭スワブ試料から抽出したRNAの検出にCATCHアッセイを直接使用することができるかどうか（すなわちRT-qPCRを省くことができるかどうか）、（２）スワブ溶解物の直接検出にCATCHプラットホームを用いることができるかどうか（すなわちRNA抽出を省くことができるかどうか）、および（３）COVID-19の診断におけるCATCHの正確度はどの程度かという疑問を解決することを目的として行った。
最初に、スワブから抽出したRNA試料（n=49）をCATCHアッセイで試験した。市販のカラムに通してRNA試料を抽出し、CATCH混合物と室温で30分間直接インキュベートした。49個の抽出RNA試料のうち、24個の試料は、標準的なRT-qPCRアッセイによりCOVID-19感染症が陽性であると判定され、残りの25個の試料は陰性であると判定された。RT-qPCRの臨床結果に対するCATCHの陽性診断予測の一致率は100%であり、陰性診断予測の一致率は92%であった（図15a）。さらに、RNAの抽出工程を省いて、加熱処理したスワブ試料（n=24）においてCATCHアッセイを試験した。RT-qPCRアッセイで判定したところ、入手できた24個の患者由来スワブ試料のうち9個はCOVID-19感染症が陽性であり、残りの15個はCOVID-19感染症が陰性であった。CATCHアッセイは、9個の陽性試料のうち9個が陽性であると正確に同定でき（100%）、15個の陰性試料のうち14個が陰性であると正確に同定できた（93.34%）（図15b）。
試験したすべての臨床試料に対して臨床成績を評価するため、CATCHアッセイと、これと条件をそろえたRT-qPCRのCt値との相関性を調べた（図15c）。CATCHアッセイは、臨床結果と良好に一致し（R=0.8261）、ウイルス量が少ない試料（Ct>35）を高感度に検出することができた。CATCHプラットフォームは、RT-qPCRによる臨床診断と比べて、SARS-CoV-2の検出に対して高い正確度を示した（図15d；混合試料の曲線下面積（AUC）=0.9803；抽出された患者由来RNAのAUC=0.9833；熱不活性化スワブ試料のAUC=0.9704）。このように、CATCHは、RNA抽出やRT-qPCRを必要とすることなく、COVID-19を診断可能であることから、より迅速、より簡便かつより安価に診断検査を行うことができる。
まとめ
現在のCOVID-19の検査プロトコルのうち、核酸検出法（特にRT-qPCR）は標準基準となっている。しかし、核酸検出法は、労力を要する処理、複雑性の高さおよび訓練された人員の必要性から、大規模な中央臨床検査室でしかほぼ実施されていない。したがって、RT-qPCRに依存していることから、公的医療機関に負荷がかかっており（Huang H, et al., ACS Nano. 2020, 14: 3747-3754; Weissleder R et al., Sci Transl Med. 2020, 12, eabc1931）、深刻な世界的供給不足と診断の遅れが起こっている。迅速な検出と効率的な管理を行うには、正確な迅速診断アッセイが至急に必要とされている［Ong CWM et al., Eur Respir J. 2020, 56: 2001727; Ong CWM et al., Int J Tubc Lung Dis. 2020, 24:547-548］。本発明者らは、現在の標準基準法を補うため、代替となる核酸検出方法としてCATCHアッセイを開発した。具体的には、CATCHアッセイは、そのユニークなアッセイ機構と臨床応用の容易さから、他のアッセイとは異なる際立った利点を示し、COVID-19の診断に関わる様々な問題に対処することができる。
アッセイとしての観点から見れば、CATCHは、高応答性分子スイッチとしてDNAと酵素からなるハイブリッド複合体を利用している。DNA－酵素ハイブリッド複合体の分子組成を調整することによって、複数の構成要素からなる分子スイッチを高応答性状態（すなわち遷移状態）で調製することができ、この高応答性状態では、ごく微量のRNA標的であっても、このRNA標的と直接ハイブリダイズして容易に活性化されて、十分な酵素活性をオンにすることができる。したがって、CATCHは、より増強された強度という点だけでなく、より速い動態という点で増強された応答を示すことができる。しかし、CATCHの重要な利点は、分子スイッチングに関するものである。１）CATCHは、相補的な標的が分子スイッチに結合した場合にのみ、高特異的に活性化する。２）CATCHは、別の酵素カスケード（例えばHRP）を容易に組み込むことができ、それによってシグナルをさらに増強することができる。３）CATCHは、設計がプログラム可能であり、新たなアッセイの迅速な試作が可能である。また、CATCHは、１μlあたり約８RNAコピーという検出限界（本発明者らによる過去のプラットホームの10,000倍以上の感度）を達成しており、室温において１時間未満で完了することができ、様々な種類の試料（例えばスワブ溶解物）に直接適用することができた。CATCHは、このような性能の高さから、ウイルス量が少ない患者試料であっても、SARS-CoV-2を正確に検出することができる。
臨床応用においては、CATCHは、従来の標的増幅（RT-qPCRにおける標的増幅）ではなく、標的ハイブリダイゼーションにより検出を行う。CATCHは、このような技術によって、RT-qPCRにおいて必須の工程（すなわち、RNA抽出、逆転写およびサーマルサイクル増幅）を実質的にすべて省くことができる。重要な点として、CATCHは、汎用アッセイとして実装可能であり、COVID-19の様々な診断ニーズに応えることができる。96ウェルフォーマットのCATCHのアッセイ構成は、アッセイのワークフローおよび読み取りの点において、従来のELISAと非常によく似ており、臨床検査室の既存の設備（例えば、プレートリーダーと訓練された人員）を用いて、容易にハイスループット分析を行うことができる。携帯型フォーマットでは、CATCHは、小型化されたマイクロ流体カートリッジとして実装され、ユーザーフレンドリーな用途およびスマートフォンを利用した検出を目的として、デバイス内でアッセイ試薬を凍結乾燥させておく［Yelleswarapu V et al., Proc Nat Acad Sci U S A. 2019, 116: 4489-4495; Xu H et al., Sci Adv. 2020, 6: eaaz7445; Wu X et al., Sci Adv. 2020, 6: eaba2556］。また、別の臨床応用では、提案された用途に応じてCATCHアッセイの閾値を調節する必要がある。この閾値の設定は、アッセイの感度と特異度の間での妥協点となる。例えば、現行の検出閾値の設定では、予備スクリーニング検査としてCATCHを使用する可能性を考慮に入れて、アッセイ感度を優先させた（100%の感度：偽陰性が最小になり、偽陽性が最大となる）。このアッセイ閾値であっても、偽陽性の発生率は低くなる（<8%）ことが判明し、これは、これまでに報告されている既存のアッセイの偽陽性の発生率（0～16.7%）の範囲内である ［Surkova E et al., Lancet Respir Med. 2020, 8: 1167-1168; Cohen AN et al., medRxiv (2020). doi.org/10.1101/2020.04.26.20080911］。核酸検査での偽陽性の原因は、アッセイに関連するものまたはPCRによる誤った分類によるものであると考えられ、これらはいずれも過去に報告されている［Cohen AN et al., medRxiv (2020). doi.org/10.1101/2020.04.26.20080911; Vogels CBF et al., Nat Microbiol. 2020, 5: 1299-1305］。
CATCH技術はさらに発展させることができる。COVID-19の診断では、急速に発展しているパンデミックを考慮に入れて、SARS-CoV-2の検出範囲を広くするだけでなく、亜型の分化および変異株の識別を可能とするために、SARS-CoV-2の様々な遺伝子座を認識するように設計された複数の種類のCATCHスイッチを組み込むことを想定している［Toyoshima Y et al., J Hum Genet. 2020, 65(12): 1075-1082］。CATCHは、最小限の処理しか行っていない臨床溶解物において堅牢な性能を発揮できることから、採取がより容易なその他の種類の試料（例えば唾液や喀痰）を調査できるように容易に発展させることができると考えられる［Garg N et al., Lab Chip. 2019, 19: 1524-1533; Jeong JH et al., J Med Virol. 2014, 86: 2122-2127］。ユーザーフレンドリーな使いやすさをさらに向上させるため、マイクロ流体デバイスの形態のCATCHプラットホームに、自動液体分注システム（例えば、コンパクト型の液体分注を行うための、コンピュータでプログラムされた流体装置とポンプ）を組み込むことができる［Shaffer SM et al., Lab Chip. 2015, 15: 3170-3182; Yeh EC et al., Sci Adv. 2017, 3: e1501645］。このような試料の種類の拡大およびシステムの自動化によって、反復検査および患者自身による検査に新たな臨床的可能性を見出すことができる。さらに、現在のCOVID-19パンデミック以外にも、新たなバイオマーカーシグネチャーを発見し、これを測定できるようにCATCHをさらに発展させることができる。様々な領域の疾患（例えば、感染症、がんおよび神経変性疾患）にCATCHプラットホームを応用して、核酸標的および複合的なシグネチャーの高感度検出を容易に行うことができると考えられる［Lim CZJ et al., Nat Commun. 2019, 10: 1144］。多重化したマイクロ流体コンパートメント［Duncombe TA et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2015, 16: 554-567; Tokeshi M et al., Anal Chem. 2002, 74: 1565-1571; Shao H et al., Nat Commun. 2015, 6: 6999］などのさらなる技術的向上によって、高度に並列化されたバイオマーカーの検出および大規模臨床評価が可能な、マイクロアレイ型アッセイの実装が可能になると考えられる。
参考文献
1. Y. Bai, L. Yao, T. Wei, F. Tian, D. Y. Jin, L. Chen, M. Wang, Presumed Asymptomatic Carrier Transmission of COVID-19. JAMA 323(14), 1406-1407 (2020).
2. J. P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C. L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, X. Miao, J. A. Streithorst, A. Granados, A. Sotomayor-Gonzalez, K. Zorn, A. Gopez, E. Hsu, W. Gu, S. Miller, C. Y. Pan, H. Guevara, D. A. Wadford, J. S. Chen, C. Y. Chiu, CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol 38, 870-874 (2020).
3. E. A. Bruce, M. L. Huang, G. A. Perchetti, S. Tighe, P. Laaguiby, J. J. Hoffman, D. L. Gerrard, A. K. Nalla, Y. Wei, A. L. Greninger, S. A. Diehl, D. J. Shirley, D. G. B. Leonard, C. D. Huston, B. D. Kirkpatrick, J. A. Dragon, J. W. Crothers, K. R. Jerome, J. W. Botten, Direct RT-qPCR detection of SARS-CoV-2 RNA from patient nasopharyngeal swabs without an RNA extraction step. bioRxiv (2020). doi.org/10.1101/2020.03.20.001008.
4. L. J. Carter, L. V. Garner, J. W. Smoot, Y. Li, Q. Zhou, C. J. Saveson, J. M. Sasso, A. C. Gregg, D. J. Soares, T. R. Beskid, S. R. Jervey, C. Liu, Assay Techniques and Test Development for COVID-19 Diagnosis. ACS Cent Sci 6, 591-605 (2020).
5. Centers for Disease Control and Prevention, CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel. (2020), (www.fda.gov/media/134922/downloadから入手可能).
6. A. W. H. Chin, J. T. S. Chu, M. R. A. Perera, K. P. Y. Hui, H. L. Yen, M. C. W. Chan, M. Peiris, L. L. M. Poon, Stability of SARS-CoV-2 in different environmental conditions. The Lancet Microbe 1, e10 (2020).
7. A. N. Cohen, B. Kessel, M. G. Milgroom, Diagnosing COVID-19 infection: the danger of over-reliance on positive test results. medRxiv (2020). doi.org/10.1101/2020.04.26.20080911.
8. C. Dang, S. D. Jayasena, Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol 264, 268-278 (1996).
9. T. A. Duncombe, A. M. Tentori, A. E. Herr, Microfluidics: reframing biological enquiry. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 554-567 (2015).
10. N. Garg, D. Boyle, A. Randall, A. Teng, J. Pablo, X. Liang, D. Camerini, A. P. Lee, Rapid immunodiagnostics of multiple viral infections in an acoustic microstreaming device with serum and saliva samples. Lab Chip 19, 1524-1533 (2019).
11. A. E. Gorbalenya, S. C. Baker, R. S. Baric, R. J. de Groot, C. Drosten, A. A. Gulyaeva, B. L. Haagmans, C. Lauber, A. M. Leontovich, B. W. Neuman, D. Penzar, S. Perlman, L. L. M. Poon, D. V. Samborskiy, I. A. Sidorov, I. Sola, J. Ziebuhr, Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses, The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol 5, 536-544 (2020).
12. H. Hasegawa, N. Savory, K. Abe, K. Ikebukuro, Methods for Improving Aptamer Binding Affinity. Molecules 21, 421 (2016).
13. H. Huang, C. Fan, M. Li, H.-L. Nie, F.-B. Wang, H. Wang, R. Wang, J. Xia, X. Zheng, X. Zuo, J. Huang, COVID-19: A Call for Physical Scientists and Engineers. ACS Nano 14, 3747-3754 (2020).
14. N. R. Y. Ho, G. S. Lim, N. R. Sundah, D. Lim, T. P. Loh, H. Shao, Visual and modular detection of pathogen nucleic acids with enzyme-DNA molecular complexes. Nat Commun 9, 3238 (2018).
15. J. H. Jeong, K. H. Kim, S. H. Jeong, J. W. Park, S. M. Lee, Y. H. Seo, Comparison of sputum and nasopharyngeal swabs for detection of respiratory viruses. J Med Virol 86, 2122-2127 (2014).
16. M. R. Jones, N. C. Seeman, C. A. Mirkin, Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science 347, 1260901 (2015).
17. A. Ladha, J. Joung, O. Abudayyeh, J. Gootenberg, F. Zhang, A 5-min RNA preparation method for COVID-19 detection with RT-qPCR. medRxiv (2020). Doi.org/10.1101/2020.05.07.20055947.
18. J. Li, A. A. Green, H. Yan, C. Fan, Engineering nucleic acid structures for programmable molecular circuitry and intracellular biocomputation. Nat Chem 9, 1056-1067 (2017).
19. Y. Li, Y. T. Cu, D. Luo, Multiplexed detection of pathogen DNA with DNA-based fluorescence nanobarcodes. Nat Biotechnol 23, 885-889 (2005).
20. Y. Li, L. Yao, J. Li, L. Chen, Y. Song, Z. Cai, C. Yang, Stability issues of RT-PCR testing of SARS-CoV-2 for hospitalized patients clinically diagnosed with COVID-19. J Med Virol 92, 903-908 (2020).
21. C. Z. J. Lim, Y. Zhang, Y. Chen, H. Zhao, M. C. Stephenson, N. R. Y. Ho, Y. Chen, J. Chung, A. Reilhac, T. P. Loh, C. L. H. Chen, H. Shao, Subtyping of circulating exosome-bound amyloid β reflects brain plaque deposition. Nat Commun 10, 1144 (2019).
22. K. Okonechnikov, O. Golosova, M. Fursov, T. UGENE, Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics 28, 1166-1167 (2012).
23. C. W. M. Ong, G. B. Migliori, M. Raviglione, G. MacGregor-Skinner, G. Sotgiu, J. W. Alffenaar, S. Tiberi, C. Adlhoch, T. Alonzi, S. Archuleta, S. Brusin, E. Cambau, M. R. Capobianchi, C. Castilletti, R. Centis, D. M. Cirillo, L. D’Ambrosio, G. Delogu, S. M. R. Esposito, J. Figueroa, J. S. Friedland, B. H. Choon Heng, G. Ippolito, M. Jankovic, H. Y. Kim, S. R. Klintz, C. Kodmon, E. Lalle, Y. S. Leo, C. C. Leung, A. G. Martson, M. Melazzini, S. Najafi Fard, P. Penttinen, L. Petrone, E. Petruccioli, E. Pontali, L. Saderi, M. Santin, A. Spanevello, R. van Crevel, M. J. van der Werf, D. Visca, M. Viveiros, J. P. Zellweger, A. Zumla, D. Goletti, Epidemic and pandemic viral infections: impact on tuberculosis and the lung. A consensus by the World Association for Infectious Diseases and Immunological Disorders (WAidid), Global Tuberculosis Network (GTN) and members# of ESCMID Study Group for Mycobacterial Infections (ESGMYC). Eur Respir J 56, 2001727 (2020).
24. C. W. M. Ong, D. Goletti, Impact of the global COVID-19 outbreak on the management of other communicable diseases. Int J Tuberc Lung Dis 24, 547-548 (2020).
25. Y. Pan, D. Zhang, P. Yang, L. L. M. Poon, Q. Wang, Viral load of SARS-CoV-2 in clinical samples. Lancet Infect Dis 20, 411-412 (2020).
26. C. Rothe, M. Schunk, P. Sothmann, G. Bretzel, G. Froeschl, C. Wallrauch, T. Zimmer, V. Thiel, C. Janke, W. Guggemos, M. Seilmaier, C. Drosten, P. Vollmar, K. Zwirglmaier, S. Zange, R. Wolfel, M. Hoelscher, Transmission of 2019-nCoV Infection from an Asymptomatic Contact in Germany. N Engl J Med 382, 970-971 (2020).
27. S. M. Shaffer, R. P. Joshi, B. S. Chambers, D. Sterken, A. G. Biaesch, D. J. Gabrieli, Y. Li, K. A. Feemster, S. E. Hensley, D. Issadore, A. Raj, Multiplexed detection of viral infections using rapid in situ RNA analysis on a chip. Lab Chip 15, 3170-3182 (2015).
28. H. Shao, J. Chung, K. Lee, L. Balaj, C. Min, B. S. Carter, F. H. Hochberg, X. O. Breakefield, H. Lee, R. Weissleder, Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nat Commun 6, 6999 (2015).
29. P. Song, J. Shen, D. Ye, B. Dong, F. Wang, H. Pei, J. Wang, J. Shi, L. Wang, W. Xue, Y. Huang, G. Huang, X. Zuo, C. Fan, Programming bulk enzyme heterojunctions for biosensor development with tetrahedral DNA framework. Nat Commun 11, 838 (2020).
30. N. R. Sundah, N. R. Y. Ho, G. S. Lim, A. Natalia, X. Ding, Y. Liu, J. E. Seet, C. W. Chan, T. P. Loh, H. Shao, Barcoded DNA nanostructures for the multiplexed profiling of subcellular protein distribution. Nat Biomed Eng 3, 684-694 (2019).
31. E. Surkova, V. Nikolayevskyy, F. Drobniewski, False-positive COVID-19 results: hidden problems and costs. Lancet Respir Med 8, 1167-1168 (2020).
32. M. Tokeshi, T. Minagawa, K. Uchiyama, A. Hibara, K. Sato, H. Hisamoto, T. Kitamori, Continuous-flow chemical processing on a microchip by combining microunit operations and a multiphase flow network. Anal Chem 74, 1565-1571 (2002).
33. Y. Toyoshima, K. Nemoto, S. Matsumoto, Y. Nakamura, K. Kiyotani, SARS-CoV-2 genomic variations associated with mortality rate of COVID-19. J Hum Genet (2020).
34. C. B. F. Vogels, A. F. Brito, A. L. Wyllie, J. R. Fauver, I. M. Ott, C. C. Kalinich, M. E. Petrone, A. Casanovas-Massana, M. Catherine Muenker, A. J. Moore, J. Klein, P. Lu, A. Lu-Culligan, X. Jiang, D. J. Kim, E. Kudo, T. Mao, M. Moriyama, J. E. Oh, A. Park, J. Silva, E. Song, T. Takahashi, M. Taura, M. Tokuyama, A. Venkataraman, O. E. Weizman, P. Wong, Y. Yang, N. R. Cheemarla, E. B. White, S. Lapidus, R. Earnest, B. Geng, P. Vijayakumar, C. Odio, J. Fournier, S. Bermejo, S. Farhadian, C. S. Dela Cruz, A. Iwasaki, A. I. Ko, M. L. Landry, E. F. Foxman, N. D. Grubaugh, Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-CoV-2 RT-qPCR primer-probe sets. Nat Microbiol 5, 1299-1305 (2020).
35. R. Weissleder, H. Lee, J. Ko, M. J. Pittet, COVID-19 diagnostics in context. Sci Transl Med 12, eabc1931 (2020).
36. O. I. Wilner, Y. Weizmann, R. Gill, O. Lioubashevski, R. Freeman, I. Willner, Enzyme cascades activated on topologically programmed DNA scaffolds. Nat Nanotechnol 4, 249-254 (2009).
37. X. Wu, H. Zhao, A. Natalia, C. Z. J. Lim, N. R. Y. Ho, C. J. Ong, M. C. C. Teo, J. B. Y. So, H. Shao, Exosome-templated nanoplasmonics for multiparametric molecular profiling. Sci Adv 6, eaba2556 (2020).
38. H. Xu, A. Xia, D. Wang, Y. Zhang, S. Deng, W. Lu, J. Luo, Q. Zhong, F. Zhang, L. Zhou, W. Zhang, Y. Wang, C. Yang, K. Chang, W. Fu, J. Cui, M. Gan, D. Luo, M. Chen, An ultraportable and versatile point-of-care DNA testing platform. Sci Adv 6, eaaz7445 (2020).
39. C. Yan, J. Cui, L. Huang, B. Du, L. Chen, G. Xue, S. Li, W. Zhang, L. Zhao, Y. Sun, H. Yao, N. Li, H. Zhao, Y. Feng, S. Liu, Q. Zhang, D. Liu, J. Yuan, Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Microbiol Infect 26, 773-779 (2020).
40. E. C. Yeh, C. C. Fu, L. Hu, R. Thakur, J. Feng, L. P. Lee, Self-powered integrated microfluidic point-of-care low-cost enabling (SIMPLE) chip. Sci Adv 3, e1501645 (2017).
41. V. Yelleswarapu, J. R. Buser, M. Haber, J. Baron, E. Inapuri, D. Issadore, Mobile platform for rapid sub-picogram-per-milliliter, multiplexed, digital droplet detection of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 4489-4495 (2019).

Claims (25)

  1. 試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
    （ａ）ポリヌクレオチドを含む試料を提供する工程；
    （ｂ）少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と、少なくとも１つのエンハンサーと、少なくとも１つのDNAポリメラーゼインヒビターとを含む組成物を提供する工程であり、
    ｉ）前記エンハンサーが、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドであること；
    ii）前記DNAポリメラーゼインヒビターが、保存領域と可変領域を含むポリヌクレオチドであり、前記保存領域が、前記DNAポリメラーゼ酵素によって認識されてこれに結合し、前記可変領域が、前記エンハンサーの一部に相補的であること；
    iii）前記インヒビターの可変領域の相補的配列と前記エンハンサーの相補的配列が二本鎖抑制性DNA複合体を形成し、この抑制性DNA複合体によりDNAポリメラーゼ活性が抑制されること；ならびに
    iv）前記組成物中の前記抑制性複合体の含有量が、例えば、前記抑制性複合体に対してポリメラーゼ活性をプロットした滴定曲線の一次導関数を用いることによって、かつ／または前記エンハンサーと前記インヒビターの比率を様々に変えた滴定曲線の一次導関数を用いることによって、最も速い応答性および／または最も高いシグナル対ノイズ比を有することが判明している量であること
    を特徴とする組成物を提供する工程；
    （ｃ）核酸を含む前記試料を工程（ｂ）の組成物と接触させることによって、
    （ｉ）前記標的ポリヌクレオチドが、工程（ｂ）の二本鎖抑制性DNA複合体のエンハンサー配列領域に結合して、該二本鎖抑制性DNA複合体から前記インヒビターを押しのけて前記DNAポリメラーゼ酵素を放出させ、該DNAポリメラーゼ酵素を活性化させる工程；
    （ｄ）工程（ｃ）の活性型DNAポリメラーゼ酵素に反応性を示すシグナル伝達ナノ構造体を提供する工程；
    （ｅ）工程（ｃ）の活性型DNAポリメラーゼ酵素に前記シグナル伝達ナノ構造体を接触させる工程；ならびに
    （ｆ）シグナルの発生を検出し、このシグナルの強度の変化から、工程（ｂ）の組成物を用いた試料中に標的核酸が存在することが示される工程
    を含む方法。
  2. ｉ）工程ｄ）のシグナル伝達ナノ構造体が、前記DNAポリメラーゼ酵素に応答性を示すセルフプライミング部分を含み、標識されたオリゴヌクレオチド（dNTP）およびシグナル発生試薬の存在下において、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素により、前記標識されたオリゴヌクレオチドが前記シグナル伝達ナノ構造体に付加され、該シグナル伝達ナノ構造体のセルフプライミング部分に組み込まれた前記標識されたオリゴヌクレオチドに、前記シグナル発生試薬が結合すること；または
    ii）工程ｄ）のシグナル伝達ナノ構造体が、前記DNAポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性に応答性を示すダンベル型のセルフプライミングエキソヌクレアーゼナノ構造体を含み、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素により、標識されたdNTPが前記ダンベル型のシグナル伝達ナノ構造体から除去されること
    を特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. （ｇ）前記試料中に標的核酸が存在することが検出された場合に、患者が疾患に罹患していると診断する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記DNAポリメラーゼインヒビターの保存配列領域が、配列番号14：5’-CAATGTACAGTATTG-3’で示される核酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記組成物における前記エンハンサーと前記インヒビターの比率が１未満：１である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記エンハンサーが、前記インヒビターの二本鎖領域よりも少なくとも１ヌクレオチド長い、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記エンハンサーの長さが約35～45ヌクレオチド長である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記エンハンサーオリゴヌクレオチドの全長の約半分が、前記インヒビターと前記エンハンサーからなる二本鎖を形成し、残りの約半分が突出末端セグメントを形成する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 工程ｄ）のシグナル伝達ナノ構造体が、
    ｉ）配列番号5：5’-CGGCGTACGTAGAGCGTTGAGCAGGATGCCAACAGTCGATCAGGACGAGTGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3’で示される核酸配列を含むセルフプライミング部分を含むか、または
    ii）配列番号6：5’-GTGCGTACATAGATCGTTATCTGTCTAACGATCTATGTAC GCACTCACTCAGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3’で示される核酸配列を含むダンベル型のセルフプライミングエキソヌクレアーゼナノ構造体を含む、
    請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記dNTPの標識がビオチンである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記シグナル発生試薬が、アビジンまたはその誘導体を含む融合タンパク質と；HRP、β－ラクタマーゼ、アミラーゼおよびβ－ガラクトシダーゼを含む群から選択される（ただしこれらに限定されない）酵素と；DAB、TMB、ABTS、ADHP、ニトロセフィン、ルミノール、デンプンおよびヨウ素を含む群から選択される（ただしこれらに限定されない）前記酵素に対応する基質とを含むこと、ならびに
    前記シグナルが、色の変化、蛍光の変化、ルミネッセンスの変化または電気化学的変化として（ただしこれらに限定されない）測定および定量することができること
    を特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記標的が、非ヒト疾患もしくはヒト疾患、遺伝子バリアント、法医学的証拠、株の同定、環境汚染および／または食品汚染に関連する少なくとも１つの核酸である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記標的が、少なくとも１つの病原体のポリヌクレオチドである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記標的が、SARS-CoV-2のポリヌクレオチドである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記インヒビターを構成するポリヌクレオチドおよび前記エンハンサーを構成するポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. マルチウェルフォーマット、マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスにおいて行われる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 各工程が、16℃～40℃の温度範囲、好ましくは室温で行われる、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. （ｉ）第１の位置に配置された、少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも１つの抑制性DNA複合体とを含む請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物ｂ）と；
    （ii）第２の位置に結合されたシグナル伝達ナノ構造体と；
    （iii）前記検出用ナノ構造体と核酸試料を混合して、前記第２の位置に活性型DNAポリメラーゼ酵素を放出するための中間ステージと
    を含むデバイス。
  19. マルチウェルプレート、マイクロ流体デバイスおよびラテラルフローデバイスを含む群から選択される、請求項１８に記載のデバイス。
  20. 前記デバイスがマイクロ流体デバイスであり、該マイクロ流体デバイスが、
    （ｉ）試験用試料、陽性コントロールおよび陰性コントロールを導入するため、かつ本発明のいずれかの態様に記載の、少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と、少なくとも１つのエンハンサーと、少なくとも１つのDNAポリメラーゼインヒビターとを含む凍結乾燥試薬を前記デバイス内で再構成するための第１の位置の入口；
    （ii）第１の位置と流体接続しており、活性化されたDNAポリメラーゼ酵素を収容するための、シグナル伝達ナノ構造体を含む第２の位置の検出室；ならびに
    （iii）前記試料と前記試薬の流れを制御するための、第１の位置と第２の位置の間に配置されたバルブ
    を含み、
    前記デバイスが、組み立て後の使用時に、前記試料の入口から出口まで流体が流れるように構成されていることを特徴とする、
    請求項１８または１９に記載のデバイス。
  21. 核酸検出用キットであって、
    （ａ）少なくとも１つのDNAポリメラーゼ酵素と少なくとも１つの抑制性DNA複合体とを含む組成物；
    （ｂ）活性型DNAポリメラーゼ酵素に反応性を示すシグナル伝達ナノ構造体；ならびに／または
    （ｃ）標識されたヌクレオチド（dNTP）およびシグナル発生試薬
    を含み、
    前記抑制性DNA複合体が、前記DNAポリメラーゼ酵素に特異的なDNAインヒビターと、エンハンサーポリヌクレオチドとを含むこと、
    前記インヒビターが、保存配列領域と可変配列領域を有すること、
    前記可変配列領域が、突出末端セグメントを含み、該突出末端セグメントが、前記エンハンサーポリヌクレオチドの一部と少なくとも７ヌクレオチド長にわたって相補的であり、該エンハンサーポリヌクレオチドの一部と二本鎖を形成すること、
    前記エンハンサーポリヌクレオチドが、前記インヒビターと前記エンハンサーからなる二本鎖よりも少なくとも１ヌクレオチド長く、標的ポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有し、その数が７ヌクレオチドを超えること；および
    前記活性型DNAポリメラーゼ酵素により、前記標識されたヌクレオチドが前記シグナル伝達ナノ構造体に付加され、該シグナル伝達ナノ構造体のセルフプライミング部分に組み込まれた前記標識されたヌクレオチドに、前記シグナル発生試薬が結合すること
    を特徴とする、核酸検出用キット。
  22. 前記組成物および前記シグナル伝達ナノ構造体が、先行する請求項のいずれか１項に記載されたものである、請求項２１に記載の核酸検出用キット。
  23. 請求項１８～２０のいずれか１項に記載のデバイスに組み込まれた、請求項２１または２２に記載の核酸検出用キット。
  24. 前記インヒビターポリヌクレオチドおよび／または前記エンハンサーポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、天然の核酸から構造的および／または化学的に修飾されたものである、請求項２１に記載の核酸検出用キット。
  25. 前記構造的修飾および／または化学的修飾が、蛍光タグ、放射性タグ、ビオチン、５’テールなどのタグの付加；ホスホロチオエート（PS）結合の付加；２’－Ｏ－メチル修飾；および／または合成過程におけるC3スペーサーホスホロアミダイトの付加を含む群から選択される、請求項２４に記載の核酸検出用キット。
JP2023547029A 2021-02-02 2022-01-24 Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を直接かつ高感度に検出するための遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅 Pending JP2024505272A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG10202101092X 2021-02-02
SG10202101092X 2021-02-02
PCT/SG2022/050031 WO2022169412A1 (en) 2021-02-02 2022-01-24 Catalytic amplification by transition-state molecular switches for direct and sensitive detection of sars-cov-2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024505272A true JP2024505272A (ja) 2024-02-05

Family

ID=82742575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023547029A Pending JP2024505272A (ja) 2021-02-02 2022-01-24 Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を直接かつ高感度に検出するための遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240043945A1 (ja)
EP (1) EP4288560A1 (ja)
JP (1) JP2024505272A (ja)
KR (1) KR20230152012A (ja)
CN (1) CN117120633A (ja)
WO (1) WO2022169412A1 (ja)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101719285B1 (ko) * 2014-11-04 2017-03-23 한국과학기술원 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법
EP3818176A4 (en) * 2018-07-03 2022-04-27 National University of Singapore VISUAL AND MODULAR DETECTION OF NUCLEIC ACIDS USING ENZYME-ASSISTED NANOTECHNOLOGY

Also Published As

Publication number Publication date
EP4288560A1 (en) 2023-12-13
US20240043945A1 (en) 2024-02-08
CN117120633A (zh) 2023-11-24
WO2022169412A1 (en) 2022-08-11
KR20230152012A (ko) 2023-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Afzal Molecular diagnostic technologies for COVID-19: Limitations and challenges
Chaouch Loop‐mediated isothermal amplification (LAMP): An effective molecular point‐of‐care technique for the rapid diagnosis of coronavirus SARS‐CoV‐2
Batule et al. based nucleic acid testing system for simple and early diagnosis of mosquito-borne RNA viruses from human serum
Ambrosi et al. SARS-CoV-2: Comparative analysis of different RNA extraction methods
Mannion et al. Emerging technologies for the rapid detection of enteric viruses in the aquatic environment
He et al. Rapid and highly sensitive one-tube colorimetric RT-LAMP assay for visual detection of SARS-CoV-2 RNA
Zhang et al. A microfluidic device with microbead array for sensitive virus detection and genotyping using quantum dots as fluorescence labels
Egatz-Gomez et al. Future microfluidic and nanofluidic modular platforms for nucleic acid liquid biopsy in precision medicine
US20210130870A1 (en) Visual and modular detection of nucleic acids with enzyme-assisted nanotechnology
Soares et al. Rolling circle amplification in integrated microsystems: An uncut gem toward massively multiplexed pathogen diagnostics and genotyping
Kellner et al. Scalable, rapid and highly sensitive isothermal detection of SARS-CoV-2 for laboratory and home testing
Wei et al. Isothermal nucleic acid amplification technology for rapid detection of virus
Sundah et al. Catalytic amplification by transition-state molecular switches for direct and sensitive detection of SARS-CoV-2
He et al. All-in-one in situ colorimetric RT-LAMP assay for point-of-care testing of SARS-CoV-2
Miao et al. Rapid detection of Nipah virus using the one-pot RPA-CRISPR/Cas13a assay
Lian et al. Capillary electrophoresis based on nucleic acid detection for diagnosing human infectious disease
Corpuz et al. Advances in virus detection methods for wastewater-based epidemiological applications
JP2020533974A (ja) 呼吸器合胞体ウイルス種のニッキング及び伸長増幅反応（ｎｅａｒ）
KR20230004558A (ko) 폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체
Schopf et al. Attomole DNA detection assay via rolling circle amplification and single molecule detection
Powell et al. Digital PCR in the clinical microbiology laboratory: another tool on the molecular horizon
Rastogi et al. Advances in molecular diagnostic approaches for biothreat agents
JP2024505272A (ja) Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２を直接かつ高感度に検出するための遷移状態の分子スイッチによる触媒増幅
Rodrigo et al. Electrochemical microarray for identification pathogens: a review
US20230250496A1 (en) Rapid detection kit for human pathogenic coronaviruses: betacoronavirus group b/c and sars-cov-2

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231005