JP2024503515A - 改変抗原提示細胞 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、様々な改変抗原提示細胞、それらの作製方法およびそれらの使用方法を提供する。【選択図】 図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２０日に出願の米国仮出願第６３／１３９６８０号、名称「改変抗原提示細胞（ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＡＮＴＩＧＥＮ ＰＲＥＳＥＮＴＩＮＧ ＣＥＬＬＳ）」の優先権を主張し、その全体は、参照することで本明細書に組み入れられる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２２年１月７日に作成され、サイズが１５,７０８バイトの「ＮＴＢＶ．０１５ＷＯ．ｘｍｌ」と題するファイルとして提供される。電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
本開示は基本的に、改変細胞の集団と、Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法の両方に関する。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）はアクセサリー細胞とも言われ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質が結合した抗原をその表面に提示することができる細胞である。ＡＰＣは、タンパク質抗原を処理してペプチドへと分解し、それをＭＨＣタンパク質と共に細胞表面に提示する場合もあれば、抗原（ペプチドなど）がＭＨＣタンパク質に結合する場所である細胞表面に、負荷された抗原を提示することもできる。
ＡＰＣは、自然免疫応答と獲得免疫応答の両方に関与し、そして多くの組織型で見られる。古典的なＡＰＣには、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞およびＢ細胞が含まれる。細胞傷害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞両方の機能がＡＰＣに依存しているため、ＡＰＣは免疫応答において重要な役割を果たしている。
本明細書では、Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法を開示する。いくつかの態様において方法は、（ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること、（ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること、および（ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること、を含む。いくつかの態様では、細胞は初代ヒトＢ細胞を含み、必要に応じて、ここで初代ヒトＢ細胞はＴ細胞に関して、またはＴ細胞によって提示されるＴＣＲに関して自己である。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する。いくつかの態様においてヒトの組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は前駆細胞の分化によって得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞（以降、「ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞」とする）とすることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子は、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい。いくつかの態様において遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫（ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。いくつかの態様において細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様において少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
本明細書ではまた、改変細胞も開示する。いくつかの態様において細胞は、（ａ）インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；（ｂ）少なくとも１つの抗原化合物とインキュベートされている、および（ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有する。いくつかの態様において、細胞をインビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様において、細胞をインビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において細胞は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。いくつかの態様では、細胞の生存は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、各ポリペプチド少なくとも８のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
本明細書ではまた、改変細胞も開示する。いくつかの態様において改変細胞は、（ａ）生存因子を発現させるためのヌクレオチド配列、（ｂ）抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を発現させるためのヌクレオチド配列、および（ｃ）ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列、を含む。いくつかの態様では、生存因子はＢＣＬ－６および／またはＢＣＬ－ＸＬを含む。いくつかの態様では、抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子は１から４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列は、ＣＤ４０Ｌを安定して発現させる遺伝子を含む。
本明細書ではまた、Ｔ細胞へ抗原を提示する初代ヒトＢ細胞も開示する。いくつかの態様において細胞は、（ａ）ＢＣＬ－６およびＢＣＬ－ＸＬを安定して発現させるヌクレオチド配列、（ｂ）１から４０のポリペプチドを安定して発現させるヌクレオチド配列であって、ここで各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸をコードしており、かつ、各ポリペプチドが抗原であるヌクレオチド配列、および（ｃ）ＣＤ４０Ｌを安定して発現させるヌクレオチド配列、を含む。
本明細書ではまた、抗原提示の方法も開示する。いくつかの態様において方法は、細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること、細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること、および細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること、を含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様において方法は、細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、またはＣＤ４０Ｌ遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。いくつかの態様では、細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
本明細書ではまた、培養用混合物も開示する。いくつかの態様において培養用混合物は、本明細書で開示の態様のいずれか一つの改変細胞と培地とを含む。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様では、発現は有効レベルにある。いくつかの態様において抗原は、１回導入され、その後、細胞を増やすことができ、そして、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために複数回使用される。
いくつかの態様はＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１はＢＣＬ－ｘＬである。
本明細書ではまた、抗原を提示させるために細胞を改変する方法も開示する。いくつかの態様において方法は、（ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること、（ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と、抗原を提示させるのに十分な期間、細胞の表面でインキュベートすること、および（ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること、を含む。いくつかの態様では、細胞は初代ヒトＢ細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する。いくつかの態様においてヒトの組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は前駆細胞の分化によって得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様において方法は、細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子は、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい。いくつかの態様において遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。いくつかの態様では、細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞にエレクトロポレーションで導入される。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、抗原化合物は８アミノ酸長から２５アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドは２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、抗原はＴ細胞へと提示される。
本明細書ではまた、改変細胞も開示する。いくつかの態様において細胞は、（ａ）インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている、（ｂ）少なくとも１つの抗原化合物がエレクトロポレーションによって導入されているか、または少なくとも１つの抗原化合物が発現するように改変されている、および（ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有する。いくつかの態様において、細胞をインビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様において、細胞をインビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において細胞は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。いくつかの態様では、細胞の生存は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様において、少なくとも１つの抗原化合物が発現するように改変されている細胞は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を含み、ここでポリペプチドは少なくとも１つの抗原化合物に対応している。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。いくつかの態様では、細胞にエレクトロポレーションによって導入されている少なくとも１つの抗原化合物は、少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいるポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドは８アミノ酸長から２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、改変細胞は初代ヒトＢ細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する。いくつかの態様においてヒトの組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は前駆細胞の分化によって得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。
本明細書ではまた、培養用混合物も開示する。いくつかの態様において培養用混合物は、本明細書で開示の態様のいずれか一つの改変細胞と培地とを含む。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、一過的に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、誘導性に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、一過的に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、誘導性に発現する。いくつかの態様では、発現は有効レベルにある。いくつかの態様では、抗原は１回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも１回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも２回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも３回導入される。いくつかの態様では、細胞はその後増やされる。いくつかの態様では、Ｔ細胞を評価するために細胞を用いることができる。いくつかの態様では、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために細胞を用いることができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞を評価するために細胞を複数回用いることができる。いくつかの態様では、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために細胞を複数回用いることができる。いくつかの態様はＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１はＢＣＬ－ｘＬである。いくつかの態様はＢＣＬ２様１を伴い、ＢＣＬ２様１はＢＣＬ－ｘＬである。いくつかの態様では、抗原化合物はＴＣＲ抗原化合物である。
Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法のフローチャートである。 改変細胞のいくつかの態様が含み得る特徴を示す。 Ｔ細胞へ抗原を提示する初代ヒトＢ細胞が有し得るいくつかの要素を示す。 抗原提示の方法に含まれ得るいくつかのステップのフローチャートである。 ＰＢＭＣからＢ細胞を効率的に単離できたことを示す、ＣＤ３とＣＤ１９、またはＣＤ１９とＣＤ２０のフローサイトメトリーデータのプロットを図示する。 未導入（ＵＴＤ）と形質導入後の細胞数（ＧＦＰを発現している細胞、従ってＢＣＬ６／ｘＬ）の比較を図示している。左図は未導入細胞がＧＦＰを発現していないこと（従って、ＢＣＬ６／ｘＬを発現している）を、右図は形質導入細胞の多くがＧＦＰを発現していることを示している。 ＢＣＬ６／ｘＬ未導入（ＵＴＤ）とＢＣＬ６／ｘＬ形質導入後のＣＤ１９＋細胞におけるＢＣＬ６／ｘＬの割合の経時変化の比較を図示している。 ＢＣＬ６／ｘＬ未導入（ＵＴＤ）とＢＣＬ６／ｘＬ形質導入後の細胞数の経時変化を表す図である。 ＥＢＶ ＬＣＬにおける細胞数の経時変化を表す図である。３人の提供者（ＢＣ１３、ＢＣ１４、ＢＣ１５）由来の細胞をＥＢＶ感染で不死化した。 ＰＢＭＣからＢ細胞を効率的に単離できたことを示す、ＣＤ３とＣＤ１９、またはＣＤ１９とＣＤ２０のフローサイトメトリーデータのプロットを図示する。 未導入（ＵＴＤ）と形質導入後の細胞数（ＧＦＰを発現している細胞、従ってＳｔａｔ５ｂ）の比較を図示している。左図は未導入細胞がＧＦＰを発現していないこと（従って、Ｓｔａｔ５ｂを発現している）を、右図は形質導入細胞の多くがＧＦＰを発現していることを示している。 Ｓｔａｔ５ｂ未導入（ＵＴＤ）とＳｔａｔ５ｂ形質導入後のＣＤ１９＋細胞におけるＳｔａｔ５ｂ発現の経時変化の比較を図示している。 Ｓｔａｔ５ｂ未導入（ＵＴＤ）とＳｔａｔ５ｂ形質導入後の細胞数の経時変化を表す図である。 ＣＤ３とＣＤ２０の濃縮前後のプロットを図示している。 ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入した細胞におけるＢＣＬ６／ＢＣＬ－ＸＬ対ＣＤ４０Ｌのプロットを図示している。 ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌを組み合わせて形質導入した細胞におけるＢＣＬ６／ＢＣＬ－ＸＬ対ＣＤ４０Ｌのプロットを図示している。 ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入した細胞に関する、形質導入後の生細胞の割合（％）をＢＣＬ６／ｘＬ＋細胞の画分とした場合の経時変化；ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入し、Ｌ細胞と培養した細胞；および、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせを形質導入した細胞。 ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入した細胞に関する、形質導入後の生細胞の数のグラフを図示する；ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入し、Ｌ細胞と培養した細胞；および、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせを形質導入した細胞。 未導入（ＵＴＤ）または形質導入後の細胞にＣＤ４０Ｌを共発現させた場合と共発現させなかった場合のＢＣＬ６／ｘＬ Ｂ細胞におけるＴＭＧの発現を示すグラフである。 提供者（Ｐｔ１、Ｐｔ３）に関する、ピューロマイシン選抜前後での生細胞におけるＬｙ６Ｇ＋細胞の割合（％）を図示する。 提供者（Ｐｔ５）に関する、ピューロマイシン選抜前後での生細胞におけるＬｙ６Ｇ＋細胞の割合（％）を図示する。 生細胞におけるＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。図９Ａは、ＢＣＬ６／ｘＬ形質導入Ｂ細胞から、ＴＭＧを含み抗原を発現しているＢＣＬ６／ｘＬ形質導入Ｂ細胞から、ＴＭＧを含み抗原を発現しているＢＣＬ６／ｘＬ＋ＣＤ４０Ｌ形質導入Ｂ細胞から、またはペプチド抗原を負荷したＢＣＬ６／ｘＬ形質導入Ｂ細胞から、抗原を提示させた場合のＴ細胞活性化の比較を示す。 生細胞におけるＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。図９Ｂは、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞から、ＴＭＧを含み抗原を発現しているＥＢＶ不死化Ｂ細胞から、またはペプチド抗原を負荷したＥＢＶ不死化Ｂ細胞から、抗原を提示させた場合のＴ細胞活性化の比較を示す。 ＴＣＲｂ＋細胞におけるＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。図９Ｃ（ＭＨＣ－Ｉ）は、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせ、およびＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まない抗原を形質導入した細胞から抗原を提示させた場合のＴ細胞活性化の比較を示す。 ＴＣＲｂ＋細胞におけるＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。図９Ｄ（ＭＨＣ－ＩＩ）は、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせ、およびＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まない抗原を形質導入した細胞から抗原を提示させた場合のＴ細胞活性化の比較を示す。 ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に、異なる大きさのペプチドを負荷した場合のＣＤ６９＋細胞の割合（％）とペプチド濃度を示すグラフである。図１０Ａは、短鎖および長鎖ＣＤＫ４－１７ペプチドの結果を示す。 ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に、異なる大きさのペプチドを負荷した場合のＣＤ６９＋細胞の割合（％）とペプチド濃度を示すグラフである。図１０Ｂは、短鎖および長鎖ＣＭＶ－１の結果を示す。 ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に、異なる大きさのペプチドを負荷した場合のＣＤ６９＋細胞の割合（％）とペプチド濃度を示すグラフである。図１０Ｃは、短鎖および長鎖ＧＣＮ１Ｌ１の結果を示す。 種々のＴＭＧ３ペプチドを２５ｍｅｒのペプチドとしてＴＭＧ発現抗原と共に負荷した場合、および他の対照のＣＤ６９＋細胞の割合（％）を示す棒グラフである。 ＴＭＧおよびミニ遺伝子提示抗原のＣＤ６９＋細胞の割合（％）を示す棒グラフである。 一連の棒グラフはＣＤ６９＋細胞の割合（％）を図示しており、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌ発現の有りまたは無しの組み合わせと、ＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まない抗原とを形質導入した細胞から抗原を提示させた場合のＴ細胞活性化の比較を示している。図１１Ａは、提供者１に１Ｇ４ ＴＣＲ（クラスＩ拘束性）を用いた場合の結果を示す。 一連の棒グラフはＣＤ６９＋細胞の割合（％）を図示しており、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌ発現の有りまたは無しの組み合わせと、ＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まない抗原とを形質導入した細胞から抗原を提示させた場合のＴ細胞活性化の比較を示している。図１１Ｂは、提供者２に１Ｇ４ ＴＣＲ（クラスＩ拘束性）を用いた場合の結果を示す。 一連の棒グラフはＣＤ６９＋細胞の割合（％）を図示しており、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌ発現の有りまたは無しの組み合わせと、ＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まない抗原とを形質導入した細胞から抗原を提示させた場合のＴ細胞活性の比較を示している。図１１Ｃは、提供者１に５Ｂ８ ＴＣＲ（クラスＩＩ拘束性）を用いた場合の結果を示す。 一連の棒グラフはＣＤ６９＋細胞の割合（％）を図示しており、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌ発現の有りまたは無しの組み合わせと、ＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まない抗原とを形質導入した細胞から抗原を提示させた場合のＴ細胞活性の比較を示している。図１１Ｄは、提供者２に５Ｂ８ ＴＣＲ（クラスＩＩ拘束性）を用いた場合の結果を示す。 急速増殖後のＴＩＬ材料におけるＣＤ４とＣＤ８のプロットである。 ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞の純度を示す、ＣＤ８と生死判定（Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）、またはＣＤ１９とＣＤ２０のプロットである。 ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞におけるＢＣＬ６／ｘＬとＣＤ４０Ｌの発現を示すプロットである。 ＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞と共培養したＴＩＬにおけるＩＦＮ－γを示す棒グラフである。 この一連のフローサイトメトリーのプロットでは、ＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞と共培養したＴＩＬにおけるＳＳＣ－ＨとＩＦＮ－γを示している。 種々のＴＭＧ形式の模式図である。 この一連のフローヒストグラムプロットは未導入対形質導入後におけるＴＭＧの発現を表すもので、ＢＣＬ／ＢＣＬ－ＸＬまたはＢＣＬ／ＢＣＬ－ＸＬとＣＤ４０Ｌを比較している。 この一連の棒グラフはＣＤ６９の割合（％）に関するもので、ＴＭＧ由来抗原に応答したＴ細胞活性化に及ぼすＣＤ４０Ｌの有無の影響を比較している。 この一連の棒グラフはＣＤ６９の割合（％）に関するもので、ＴＭＧ由来抗原に応答したＴ細胞活性化に及ぼすＣＤ４０Ｌの有無の影響を比較している。 種々のＴＭＧ形式の模式図である。 未導入（ＵＴＤ）、ＴＭＧ１形質導入後（Ｔｄ）、およびＴＭＧ２形質導入後（Ｔｄ）の間のＴＭＧ発現の比較を示すプロットである。 クラスＩ拘束性ＴＣＲ（ＣＤＫ４－１７、ＣＭＶ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ１Ｇ４）とクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ（ＮＹ－ＥＳＯ５Ｂ８、ＴＰ５３、およびＭＡＧＥ－Ａ３＿Ｒ１２Ｃ９）の両方で、２種類のＴＭＧ形式で提示した抗原に応答した細胞中のＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。 本明細書で提供するいくつかの態様の行程表である。 ＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。図１５では、短鎖または長鎖ＧＣＮ１Ｌ１ペプチドをエレクトロポレーションで導入した細胞から抗原を提示させた場合、ＴＭＧからペプチドを発現させた場合、および適した対照のＴ細胞活性化の比較を示している。 図１６Ａは、種々の濃度の長鎖ＧＣＮ１Ｌ１ペプチドをエレクトロポレーションで導入し、その後様々な時間静置した場合のＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。 図１６Ｂは、種々の濃度の長鎖ＧＣＮ１Ｌ１ペプチドを様々な時間負荷した場合のＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。 図１６Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂに適した対照の結果である。 図１７Ａは、種々の濃度の長鎖ＣＭＶ１ペプチドをエレクトロポレーションで導入し、その後様々な時間静置した場合のＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。 図１７Ｂは、種々の濃度の長鎖ＣＭＶ１ペプチドを様々な時間負荷した場合のＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。 図１７Ｃは、図１７Ａおよび図１７Ｂに適した対照の結果である。 ＧＣＮ１Ｌ１をエレクトロポレーションで導入した後の静止時間を様々に変えた場合のＣＤ６９活性の割合（％）を示すペプチド濃度の反応曲線である。 ＣＭＶ１をエレクトロポレーションで導入した後の静止時間を様々に変えた場合のＣＤ６９活性の割合（％）を示すペプチド濃度の反応曲線である。 ＭＡＧＥ－Ａ３をエレクトロポレーションで導入した後の静止時間を様々に変えた場合のＣＤ６９活性の割合（％）を示すペプチド濃度の反応曲線である。 異なるＴ細胞提供者におけるペプチド濃度反応を、ＣＤ６９活性化の割合（％）として表している。図１９Ａでは、ペプチドとしてＧＣＮ１Ｌ１を用いた場合を示す。 異なるＴ細胞提供者におけるペプチド濃度反応を、ＣＤ６９活性化の割合（％）として表している。図１９Ｂでは、ペプチドとしてＣＭＶ１を用いた場合を示す。 異なるＴ細胞提供者におけるペプチド濃度反応を、ＣＤ６９活性化の割合（％）として表している。図２０では、ペプチドとしてＭＡＧＥ－Ａ３を用いた場合を示す。 この一連の棒グラフでは、ＣＤ６９の割合（％）を示している。図２１Ａは、同定したＴＣＲにおいてＴＭＧが反応を誘発することを示している。 この一連の棒グラフでは、ＣＤ６９の割合（％）を示している。図２１Ｂは、ＴＭＧによって発現されたそれぞれのペプチドによって活性化が誘発されること、およびＴＣＲが単一のペプチドによって選択的に活性化されたことを示している。 この一連の棒グラフでは、ＣＤ６９の割合（％）を示している。図２２Ａは、同定したＴＣＲを発現しているＴ細胞において、ＴＭＧが反応を誘発することを示している。 この一連の棒グラフでは、ＣＤ６９の割合（％）を示している。図２２Ｂは、ＴＭＧによってコードされている各ペプチドによって活性化が誘発されたこと、およびＴＣＲを発現しているＴ細胞が単一のペプチドによって選択的に活性化されたことを示している。 ＣＤ６９の割合（％）を示す棒グラフである。図２３は一連のＴＣＲに関して、野生型の長鎖ペプチドではなく、変異型の長鎖ペプチドだけがエレクトロポレーションを行なった際に認識されることを示している。
発明を実施するための形態、および後述する特許請求の範囲において、本発明の特定の特徴に言及した。本明細書における本発明の開示は、そのような特定の特徴のすべての可能な組み合わせを含むと理解される。例えば、特定の特徴が本発明の特定の側面もしくは態様、または特定の請求項の文脈において開示される場合、その特徴はまた、可能な範囲で、本発明の他の特定の側面および態様と組み合わせて、および／または本発明一般において使用することが可能である。
Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージなどの初代抗原提示細胞は研究に用いられることが多い。抗原の送達様式や細胞の特定の表現型に依存するが、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ両方の経路を介した抗原提示が、これら全ての細胞型で起こり得る。しかしながら、初代ＡＰＣをインビトロで無限に増殖させることはできず、また、十分量のヒト生体試料（例えば大量の血液や摘出されたリンパ節）が入手できない限り、大量に得ることも難しい。これらの課題を克服するためには、Ｂ細胞などの特定の型の初代ＡＰＣを不死化することができる。
加えて、改変された細胞株（例えばＣＯＳ－７、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３）をＴＣＲの探索に用いる研究もある。細胞株を使用すれば大量の細胞を得ることができる。このようなシステムは一般的に、限られた数のＨＬＡアレルおよび／または抗原を伴うＴＣＲの探索に用いられる。しかしながら完全に個別化した（つまり、ＨＬＡアレルのレパトアの数が多く、かつ、変化に富んでいる）ＴＣＲの探索には改変細胞株はあまり適していない。なぜならＭＨＣ遺伝子はヒトにおいて最も多型の多い遺伝子座であるため、集団内の個々の多型の大部分をカバーするＨＬＡ対立遺伝子を発現するＨＬＡ改変細胞株を、多大な労力をかけて作製する必要があるからである。
本明細書では、細胞株に関する種々の選択肢、ならびに細胞株の作製方法および使用方法を提供し、これらは例えば、ＴＣＲの探索、特徴分析および操作に応用することができる。この文脈においてＡＰＣは、ＴＣＲ配列の供給源となった患者の自己であってもまたは同種異系であってもよい。
いくつかの態様では、Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；およびｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること、を含み得る。従っていくつかの態様では、抗原はＴ細胞に付随する。
いくつかの態様において改変細胞は、ａ）生存因子を発現させるためのヌクレオチド配列；ｂ）抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を発現させるためのヌクレオチド配列；およびｃ）ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列、を含む。
いくつかの態様では、本明細書で提供する様々な態様により、より少ない数のＢ細胞を、例えば、１００，０００未満、例えば、９０，０００未満、８０，０００未満、７０，０００未満、６０，０００未満、５０，０００未満、またはそれ以下の細胞を出発材料とすることができる。このことは、本明細書で提供するＢＣＬ６／ｘＬの組み合わせにも適用することができる。いくつかの態様では、例えば、ＥＢＶ－ＬＣＬについて、その細胞数は１×１０ｅ８未満、例えば、１×１０ｅ７未満、２×１０ｅ６未満、１．５×１０ｅ６未満、またはそれ以下であってよい。
本明細書ではさらに、抗原を、核酸の形ではなくタンパク質の形で細胞に加えることができる態様を提供する。従っていくつかの態様において改変細胞株とは、抗原性の、外因性の、タンパク質／ペプチドが、例えばエレクトロポレーションによって付加された細胞株を意味し得る。
本明細書ではさらに、Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法を提供する。いくつかの態様においてこの方法は、（ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること、（ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること、および（ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること、のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全ての構成要素を含む。いくつかの態様では、細胞は哺乳類細胞または哺乳類由来の細胞である。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞またはヒト由来の細胞である。いくつかの態様では、細胞は初代ヒトＢ細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞はＴ細胞に関して、またはＴ細胞によって提示されるＴＣＲに関して自己である。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様において初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有するヒト組織に由来する。いくつかの態様においてヒト組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は前駆細胞の分化によって得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの１つ以上は、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様において方法は、細胞を、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てと共培養することをさらに含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子および／またはＢＣＬ２様１遺伝子の少なくとも１つを発現させることを含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞内で、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、および／またはＣＤ４０Ｌ遺伝子の少なくとも１つを発現させることを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、および／またはＣＤ４０Ｌ遺伝子は、同じ発現構築物上にある。いくつかの態様では、少なくとも１つのＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、および／またはＣＤ４０Ｌ遺伝子は、それぞれ別個の発現構築物上にある。遺伝子は、当該分野で知られているいずれの従来法によっても細胞に導入できると理解される。非限定的な例としては、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫（ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。いくつかの態様では、細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で、少なくともおよそ１ヶ月間、少なくともおよそ２ヶ月間、少なくともおよそ３ヶ月間、少なくともおよそ５ヶ月間、少なくともおよそ６ヶ月間、および／または少なくともおよそ１年間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ５つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ２０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ３０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、最大でおよそ４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で誘導を介して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で継続して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でゲノムの転写によって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でプラスミドによって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
本明細書ではまた、改変細胞も開示する。いくつかの態様においてこの細胞は、（ａ）インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；（ｂ）少なくとも１つの抗原化合物とインキュベートされている、および（ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために機能する少なくとも１つの遺伝子改変を有する；のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全ての状態にある。いくつかの態様において細胞は、ＢＣＬ－６遺伝子および／またはＢＣＬ２様１遺伝子のうちの少なくとも１つを細胞内で発現させることによって、インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整される。いくつかの態様において細胞は、細胞にＥＢＶを感染させることによって、インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整される。いくつかの態様において細胞は、発現しているＣＤ４０Ｌ遺伝子をさらに含む。遺伝子は、当該分野で知られているいずれの従来法によっても細胞に導入できると理解される。非限定的な例としては、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。いくつかの態様では、細胞の生存延長はインビトロでの細胞培養で、少なくともおよそ１ヶ月間、少なくともおよそ２ヶ月間、少なくともおよそ３ヶ月間、少なくともおよそ５ヶ月間、少なくともおよそ６ヶ月間、および／または少なくともおよそ１年間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ５つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ２０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ３０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、最大でおよそ４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で誘導を介して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で継続して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でゲノムの転写によって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でプラスミドによって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
本明細書ではまた、改変細胞も開示する。いくつかの態様においてこの改変細胞は、（ａ）生存因子を発現させるためのヌクレオチド配列、（ｂ）抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を発現させるためのヌクレオチド配列、および／または（ｃ）ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てを含む。いくつかの態様において生存因子は、ＢＣＬ－６および／またはＢＣＬ－ＸＬのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子は１から４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ５つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ２０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ３０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、最大でおよそ４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列は、ＣＤ４０Ｌを安定して発現させる遺伝子を含む。いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列は、ＣＤ４０Ｌの発現および／または安定性を高めるまたは改善する遺伝子を含む。
本明細書ではまた、Ｔ細胞へ抗原を提示する初代ヒトＢ細胞も開示する。いくつかの態様においてこの細胞は、（ａ）ＢＣＬ－６および／またはＢＣＬ－ＸＬを安定して発現させるヌクレオチド配列、（ｂ）１から４０のポリペプチドを安定して発現させるヌクレオチド配列であって、ここで各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸をコードしており、かつ、各ポリペプチドが抗原であるヌクレオチド配列、および／または（ｃ）ＣＤ４０Ｌを安定して発現させるヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てを含む。
本明細書ではまた、抗原提示の方法も開示する。いくつかの態様においてこの方法は、細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること、この細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること、および／またはこの細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞を支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様において方法は、細胞を、ＩＬ－２、ＩＬ－４および／またはＩＬ－２１のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てと共培養することをさらに含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ－６遺伝子および／またはＢＣＬ２様１遺伝子のうちの少なくとも１つを細胞内で発現させることを含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、および／またはＣＤ４０Ｌ遺伝子のうちの少なくとも１つは、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。いくつかの態様では、細胞の生存延長はインビトロでの細胞培養で、少なくともおよそ１ヶ月間、少なくともおよそ２ヶ月間、少なくともおよそ３ヶ月間、少なくともおよそ５ヶ月間、少なくともおよそ６ヶ月間、および／または少なくともおよそ１年間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ５つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ２０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ３０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、最大でおよそ４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で誘導を介して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で継続して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でゲノムの転写によって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でプラスミドによって発現する。
本明細書ではまた、培養用混合物も開示する。いくつかの態様においてこの培養用混合物は、本明細書で開示の態様のいずれか一つの改変細胞と培地とを含む。培地とは、細胞の成長、保存、および／または維持に好適な溶液のいずれであってもよいと理解される。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、一過的に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、誘導性に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、一過的に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、誘導性に発現する。いくつかの態様では、発現は有効レベルにある。いくつかの態様では、抗原は１回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも１回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも２回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも３回導入される。いくつかの態様では、細胞はその後増やされる。いくつかの態様では、Ｔ細胞を評価するために細胞を用いることができる。いくつかの態様では、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために細胞を用いることができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞を評価するために、細胞を複数回用いることができる。いくつかの態様では、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために細胞を複数回用いることができる。
本明細書で開示するＢＣＬ２様１を伴ういずれの態様においても、ＢＣＬ２様１はＢＣＬ－ｘＬであってよい。
本明細書ではまた、抗原を提示させるために細胞を改変する方法も開示する。いくつかの態様において方法は、（ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導すること、促進すること、および／または維持することのうちの少なくとも１つ；（ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と、抗原を提示させるのに十分な期間、細胞の表面でインキュベートすること；および／または（ｃ）細胞による抗原提示を誘導すること、促進すること、維持すること、および／または改変することのうちの少なくとも１つを達成するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てを含む。いくつかの態様では、細胞は哺乳類の細胞または哺乳類由来の細胞である。いくつかの態様では、細胞はヒトの細胞またはヒト由来の細胞である。いくつかの態様では、細胞はＢ細胞またはＢ細胞由来の細胞である。いくつかの態様では、細胞は初代ヒトＢ細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する。いくつかの態様では、ヒト組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および／または骨髄のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は前駆細胞の分化によって得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞を支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様において方法は、細胞を、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てと共培養することをさらに含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ－６遺伝子および／またはＢＣＬ２様１遺伝子のうちの少なくとも１つを細胞内で発現させることを含む。いくつかの態様では、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することのうちの少なくとも１つは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様において方法は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内で、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てを発現させることを含む。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全ては、同じ発現構築物上にある。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てはそれぞれ、別個の発現構築物上にある。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全てはそれぞれ、少なくとも２つの発現構築物の組み合わせ上にある。遺伝子は、当該分野で知られているいずれの従来法によっても細胞に導入できると理解される。非限定的な例としては、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。いくつかの態様では、細胞の生存延長はインビトロでの細胞培養で、少なくともおよそ１ヶ月間、少なくともおよそ２ヶ月間、少なくともおよそ３ヶ月間、少なくともおよそ５ヶ月間、少なくともおよそ６ヶ月間、および／または少なくともおよそ１年間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ５つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ２０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ３０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、最大でおよそ４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で誘導を介して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で継続して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でゲノムの転写によって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でプラスミドによって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞にエレクトロポレーションで導入される。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、抗原化合物は８アミノ酸長から２５アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの態様では、抗原化合物は８アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ８アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ１０アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ１５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ２０アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは最長でおよそ２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、抗原はＴ細胞へと提示される。
本明細書ではまた、改変細胞も開示する。いくつかの態様においてこの細胞は、（ａ）インビトロでのその生存を誘導すること、促進すること、および／または維持することのうちの少なくとも１つを達成するように調整されている、（ｂ）少なくとも１つの抗原化合物がエレクトロポレーションで導入されているか、および／または少なくとも１つの抗原化合物が発現するように改変されている、および／または（ｃ）細胞による抗原提示を誘導すること、促進すること、維持すること、または改変することのうちの少なくとも１つを達成するための少なくとも１つの遺伝子改変を有している；のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つ全ての状態にある。いくつかの態様において細胞は、ＢＣＬ－６遺伝子および／またはＢＣＬ２様１遺伝子のうちの少なくとも１つを細胞内で発現させることを含む過程を介して、インビトロでのその生存を誘導すること、促進すること、および／または維持することのうちの少なくとも１つを達成するように調整される。いくつかの態様において細胞は、細胞にＥＢＶを感染させることを含む過程を介して、インビトロでのその生存を誘導すること、促進すること、および／または維持することのうちの少なくとも１つを達成するように調整される。いくつかの態様において細胞は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。遺伝子は、当該分野で知られているいずれの従来法によっても細胞に導入できると理解される。非限定的な例としては、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。いくつかの態様では、細胞の生存延長はインビトロでの細胞培養で、少なくともおよそ１ヶ月間、少なくともおよそ２ヶ月間、少なくともおよそ３ヶ月間、少なくともおよそ５ヶ月間、少なくともおよそ６ヶ月間、および／または少なくともおよそ１年間である。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ５つのポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ１０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ２０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、少なくともおよそ３０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子は、最大でおよそ４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で誘導を介して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で継続して発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でゲノムの転写によって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内でプラスミドによって発現する。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞にエレクトロポレーションで導入される。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいるポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドは８アミノ酸長から２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは８アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ８アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ１０アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ１５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは少なくともおよそ２０アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは最長でおよそ２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、ポリペプチドは２５アミノ酸長である。いくつかの態様では、改変細胞は哺乳類の細胞かまたは哺乳類由来の細胞である。いくつかの態様では、改変細胞はヒトの細胞かまたはヒト由来の細胞である。いくつかの態様では、改変細胞はＢ細胞であるかまたはＢ細胞由来の細胞である。いくつかの態様では、改変細胞は初代ヒトＢ細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する。いくつかの態様においてヒト組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および／または骨髄のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は前駆細胞の分化によって得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの態様では、初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。
本明細書ではまた、培養用混合物も開示する。いくつかの態様においてこの培養用混合物は、本明細書で開示の態様のいずれか一つの改変細胞と培地とを含む。培地は、細胞の成長、保存、および／または維持に好適な溶液のいずれであってもよいと理解される。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、一過的に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから、誘導性に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、継続して発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、一過的に発現する。いくつかの態様において抗原化合物は、プラスミドを介して細胞に組み込まれたポリヌクレオチドから、誘導性に発現する。いくつかの態様では、発現は有効レベルにある。いくつかの態様では、抗原は１回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも１回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも２回導入される。いくつかの態様では、抗原は少なくとも３回導入される。いくつかの態様では、細胞はその後増やされる。いくつかの態様では、Ｔ細胞を評価するために細胞を用いることができる。いくつかの態様では、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために細胞を用いることができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞を評価するために細胞を複数回用いることができる。いくつかの態様では、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために細胞を複数回用いることができる。いくつかの態様において抗原は、１回導入され、その後前記細胞を増やすことができ、そして、抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために複数回使用される。ＢＣＬ２様１を伴ういくつかの態様では、ＢＣＬ２様１はＢＣＬ－ｘＬである。いくつかの態様では、抗原化合物はＴＣＲ抗原化合物である。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）
抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル（またはアマチュア）抗原提示細胞の２つのカテゴリーに分類することができる。プロフェッショナルＡＰＣには樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞が含まれ、ほんの僅かな期間だけ抗原提示において機能する非プロフェッショナルＡＰＣには胸腺上皮細胞と血管内皮細胞が含まれる。
Ｔ細胞は通常、分裂できるようになる前に活性化され、その機能を発揮する。このことは、そのＴ細胞受容体によって認識される抗原を提示するプロフェッショナルＡＰＣとの相互作用によっても達成される場合がある。Ｔ細胞は、「遊離している」すなわち可溶性の抗原は認識することが（そのため、それらに反応することが）できない。Ｔ細胞は、処理（プロセッシング）され、ＭＨＣ分子などの担体を介して細胞から提示された抗原だけしか認識し、反応することができない。
ＡＰＣはまた、ＭＨＣクラスＩファミリーと似た構造をもつＣＤ１ファミリータンパク質を使って、非自己および自己の脂質をＴ細胞とＮＫ細胞へ提示することもできる。
プロフェッショナルＡＰＣの主たる機能は、抗原をＴ細胞へ提示することである。プロフェッショナルＡＰＣは効率的に、食作用または受容体依存性エンドサイトーシスのいずれかによって抗原を取り込み、抗原をペプチド断片へと処理し、その後、（ＭＨＣ分子に結合した）それらペプチドを細胞膜上に提示できる。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上にあるペプチド－ＭＨＣ複合体を認識し、相互作用する。その後、抗原提示細胞によって別の共刺激信号が生成され、Ｔ細胞が活性化される。
プロフェッショナル抗原提示細胞としては主に、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞がある。Ｂ細胞は、そのＢ細胞受容体に結合する抗原を取り込み、それをペプチド－ＭＨＣ複合体としてＢ細胞表面に提示することができる。Ｔ細胞とは違ってＢ細胞は、そのＢ細胞受容体がそれに対して特異性をもつものであれば、可溶性抗原も認識することができる。Ｂ細胞はその後可溶性抗原を処理し、ペプチドをペプチド－ＭＨＣ複合体として提示することができる。
定義
本明細書全体を通じて「含む」という用語、または「含まれる」もしくは「含んでいる」などの変形は、言及している要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味し、他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外しないものと理解される。
以下の用語および方法の説明は、本開示をより良く説明するため、および当業者が本開示を実施する際の指針とするために提供される。単数形の「１つ」、「１種」、および「この」は、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、１つまたは２つ以上を指す。例えば、「核酸分子を含んでいる」という用語は、単一のまたは複数の核酸分子を含むもので、「少なくとも１つの核酸分子を含んでいる」という句と同等であるとみなされる。「または」という用語は、文脈からそうではないことが明らかでない限り、記載された代替要素の単一の要素または２つ以上の要素の組合せを指す。本明細書で使用する場合、「含む」は「包含する」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含んでいる」とは、追加の要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを包含する」ことを意味する。特段の指定のない限り、本定義が他に存在し得る定義と異なる可能性がある場合には、本明細書で提供される定義が優先される。
特段の記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全てのヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ））の識別子（ＩＤ）は、その全体が参照により組み込まれる。本開示の実施または試験には、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等のものを使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図していない。
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、その細胞表面に抗原を提示する細胞である。抗原は、細胞表面上で主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と結合したペプチド（合わせてペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体）の場合も、またはＡＰＣの細胞表面に固定された、付着した、結合したまたは付随した細胞表面タンパク質または任意のペプチド配列の場合もある。ＭＨＣクラスＩ複合体またはＭＨＣクラスＩＩ複合体に関連したペプチドの発現過程が抗原提示として知られている。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してｐＭＨＣを認識する場合も、または好適な受容体分子の発現に応じてその他の抗原を認識する場合もある。好適な受容体分子としては、これらには限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、単鎖ＴＣＲ、単一可変ドメインＴＣＲおよびＴＣＲ様抗体が挙げられる。ＡＰＣは抗原を細胞内で処理し、それらをＴ細胞に提示する場合も、または細胞外抗原が負荷されるもしくは細胞外抗原に結合する場合もある。ほぼ全ての型の細胞が何らかの方法によって抗原を提示することができ、そしてその抗原提示能は、これには限定されないが遺伝子操作などの方法によって、改変することができる。ＡＰＣは様々な組織型で見られ、前駆細胞から誘導することができ、または細胞株に基づくものである。マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞は、Ｔ細胞免疫応答を誘導する一環として、外から獲得した非自己抗原を様々な型のＴ細胞へ提示することができ、一方、ウイルスが感染した細胞（またはがん細胞）はその細胞内部に由来する抗原を提示することができ、それによってＴ細胞が検出できるようになる。ＭＨＣファミリータンパク質に加えて、抗原提示は、ＡＰＣとＴ細胞両方の細胞表面にある特殊なシグナル伝達分子に依存している。
「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、Ｔ細胞すなわちＴリンパ球の表面に存在し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子にペプチドとして結合した抗原を認識する分子を意味する。ＴＣＲは２種類のタンパク質鎖から構成されている（つまり、ヘテロ二量体である）。ヒトの場合、９５％のＴ細胞においてＴＣＲはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖（それぞれＴＲＡとＴＲＢによってコードされている）から構成されているが、５％のＴ細胞ではＴＣＲはガンマとデルタ（γ／δ）鎖（それぞれＴＲＧとＴＲＤによってコードされている）から構成されている。この比率は、個体発生の時期や疾患状態（白血病など）において変化し、また、生物種によっても異なる。それぞれのＴＣＲ鎖は２つの細胞外ドメイン、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域、から構成されている。定常領域は細胞膜に近接していて、膜貫通領域と短い細胞質尾部が続くもので、一方、可変領域はペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方の可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる、３つの超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。いくつかの態様では、ＣＤＲ３が主な抗原認識領域である。いくつかの態様では、ＣＤＲ２が主なＭＨＣ認識領域だと考えられる。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖遺伝子はＶおよびＪを含み、ＴＣＲβ鎖遺伝子は、ＴＣＲの多様性に寄与するＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成して２本の鎖の間のリンクを形成している短い連結配列から構成される。特に代替のＴＣＲ形式としては、これらに制限されるものではないが、単鎖ＴＣＲ、単一可変ドメインＴＣＲ、ＴＣＲ様抗体が挙げられる。このような代替ＴＣＲは、ＭＨＣまたは他の抗原形式によって提示された抗原を認識する場合があり、そのシグナル伝達能は他のＴＣＲとは異なる場合がある。
「治療用ＴＣＲ遺伝子」という用語は、所望の機能、例えば、宿主の免疫系が病気と闘うことを促進できることなどの機能を仲介する、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の特定の組合せを指す場合がある。治療用ＴＣＲ遺伝子は、ファージ、酵母、またはＴ細胞提示系によって組換えＴＣＲライブラリーとして発現されるインビトロの変異型ＴＣＲ鎖から選択することが、あるいは、ヒトや動物材料から得ることができる。治療用ＴＣＲ遺伝子は、自己由来であっても同種異系であってもよい。
「がん（癌）」という用語は、分化能の消失を伴う特徴的な退形成、速い増殖速度、周辺組織への浸潤、および転移能を示す悪性新生物を意味する。「がん（癌）」という用語は、対象における細胞の制御不能な増殖を特徴とする疾患を含むものとする。いくつかの態様において、「がん（癌）」および「腫瘍」という用語は、同じ意味で用いられる。いくつかの態様において、「腫瘍」という用語は、良性すなわち非悪性の増殖を指す。
本明細書で使用する場合、「新生抗原」という用語は、腫瘍特異的なゲノム変異に由来する抗原を指す。例えば新生抗原は、腫瘍試料中で非同義一塩基変異に起因する変異型タンパク質の発現から、変異誘発性のフレームシフトに起因する別の読み取り枠の発現から、またはゲノムの再編成事象から生じる場合がある。このため、新生抗原は病的状態に関連し得る。いくつかの態様において、「変異型タンパク質」は、正規のアミノ酸配列の同じ位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸を少なくとも１つ含むタンパク質を指す。いくつかの態様において、変異型タンパク質は、正規のアミノ酸配列に対して、挿入、欠失、置換、読み取り枠シフトによって生じるアミノ酸の包含、ゲノムの再編成事象に起因する複数の異なるタンパク質の融合、またはそれらの任意の組合せを含む。
「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、骨髄系およびリンパ系と呼ばれる、異なる種類の血液細胞を生じる幹細胞である。リンパ系細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および自然リンパ球系細胞などが含まれる。造血組織には、長期および短期の再生能をもち、多分化能性前駆細胞、少能性前駆細胞および単能性前駆細胞に関わる細胞が存在する。造血幹細胞は成人の骨髄、特に骨盤、大腿骨、および胸骨で見られる。造血幹細胞は、臍帯血でも見られ、また、末梢血にも少量存在する。幹細胞と前駆細胞は、針とシリンジを使って骨盤の腸骨稜から採取することができる。細胞は液体として（細胞の形態を見るためのスメアを実施するため）採取することも、またはコア生検によって（細胞同士および細胞と骨の構造や関わりを維持するため）採取することもできる。造血幹細胞を純粋な集団として単離することはできないが、複数種の細胞表面マーカー（特にＣＤ３４）を組み合わせて使うことで造血幹細胞を周辺の血液細胞から分離するフローサイトメトリーによって、同定または単離することができる。
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」とは、体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは無限に増殖し、そして体内のあらゆる型の細胞を生み出すことができる。ｉＰＳＣは成人の組織から直接樹立することができるため、患者に適合した様式によって作製することができ、このことは、各個人がその人ごとの多能性幹細胞系をもち得ることを意味している。このような無限に供給される自己細胞を使えば、免疫拒絶のリスクのない移植片を生成することができる。ｉＰＳＣは通常、所与の細胞型に、特定の多能性関連遺伝子セットの産物、すなわち「初期化因子」を導入することによって生成される。初期化因子が導入されると細胞は多能性幹細胞に似たコロニーを形成し始める。これを、形態、成長を選抜するための条件、または表面マーカーもしくはレポーター遺伝子の発現を通じて単離することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、細菌や古細菌のような原核生物のゲノム中で見られるＤＮＡ配列のファミリーである。これらの配列はそれまでに原核生物に感染したバクテリオファージのＤＮＡ断片に由来し、以降の感染時に同様のバクテリオファージに由来するＤＮＡを検出して破壊するために用いられる。従ってこれらの配列は、原核生物の抗ウイルス性（つまり、抗ファージ性）生体防御機構において重要な役割を果たすものである。Ｃａｓ９（すなわち「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」）は、ＣＲＩＳＰＲ配列を案内役として使って、ＣＲＩＳＰＲ配列に相補的な特定のＤＮＡストランドを認識し、開裂する酵素である。Ｃａｓ９酵素はＣＲＩＳＰＲ配列と共に、生体内の遺伝子を編集するために用いることができ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９として知られる技術の基礎をなしている。この編集過程は、生物学の基礎研究、生命工学製品の開発、および病気の治療などに、幅広く応用することができる。
「転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥＮ）」は、特定のＤＮＡ配列を切断するように操作することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメイン（ＤＮＡストランドを切断するヌクレアーゼ）に融合させることによって作製される。転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実質的に所望のＤＮＡ配列のいずれにも結合するように操作可能であるため、ヌクレアーゼと組み合わせることでＤＮＡを特定の位置で切断することができる。この制限酵素は細胞に導入して、遺伝子編集や、改変ヌクレアーゼを用いるゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）として知られる、生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのゲノム編集技術に用いることができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼやＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と並んで、ＴＡＬＥＮもゲノム編集の分野における優れた手段である。
「ミニ遺伝子」とは、エクソンと、その遺伝子が野生型の遺伝子断片と同じように発現するのに必要な制御領域とを含む、最小限の遺伝子断片である。複数のエクソンとイントロンを含有しているより複雑なミニ遺伝子を構築することもできる。スプライシングパターンをインビボおよびインビトロ両方における生化学的評価実験で評価している研究者にとって、ミニ遺伝子は有効な手段となる。具体に的には、ミニ遺伝子はスプライスレポーターベクター（エクソントラッピングベクターとも呼ばれる）として用いられ、そして、どの因子がスプライシングの結果において重要であるかを決定する探索子（プローブ）として機能する。ミニ遺伝子は、シス制御エレメント（ＲＮＡが関わる）およびトランス制御エレメント（タンパク質／スプライシング因子に関係する）の両方が遺伝子発現にどのように影響を及ぼすかを調べるために構築することもできる。ミニ遺伝子は、ＡＰＣに任意の短いペプチド配列を発現させ、抗原提示を可能にするための導入遺伝子として用いることもできる。いくつかの態様においてミニ遺伝子は、クラスＩおよびクラスＩＩの効率的な抗原提示が行えるように、さらに操作される場合がある。
本明細書で使用する場合、遺伝子の名称やタンパク質の命名法は、斜体であるか否かによって確認されるのではなく、文脈に依存する。従って「ＢＣＬ６」は、その語がどのように用いられているかの文脈に応じて、タンパク質および／または遺伝子の両方を指し得る（例えば、「タンパク質をコードしている」は遺伝子を、「ＢＣＬ６は～に用いられる」は遺伝子および／またはタンパク質の両方を、「１０ｎｇのＢＣＬ６を細胞にエレクトロポレーションで導入する」はタンパク質を指す可能性がある）。この略称は、同じアイデアを様々な形式で言い直すのを避けるために用いられる。
本明細書で使用される「ＢＣＬ２様１」は一般的な属を表す。好ましい態様では長いアイソフォーム、ＢＣＬ２Ｌ１アイソフォームＢＣＬ－ｘＬが用いられる。本明細書において「ＢＣＬ－ｘＬ」が使用される場合、ＢＣＬ２様１の亜属も同様に適切に用いる／想定することができ、また、「ＢＣＬ－ＸＬ」、「ＢＣＬＸＬ」、「Ｂｃｌ－ｘＬ」、「Ｂｃｌ－ＸＬ」、「ｂｃｌ－ｘｌ」およびその他の同様の意味をもつ用語も、ＢＣＬ－ｘＬと実質的に同じ機能を維持しているという条件で、本発明の文脈において同じ意味で用いてもよいことを当業者であれば理解できるだろう。ＢＣＬ－６とＢＣＬ－ｘＬの組み合わせは、「ＢＣＬ６／ＸＬ」もしくは「ＢＣＬ６／ｘＬ」または同様の構造として言及され得る。従って本明細書では、ＢＣＬ２様１属に含まれる選択肢としての属および個別の種（ＢＣＬ－ｘＬおよび／またはＢＣＬ－ｘＳ）の両方を企図する。いくつかの態様ではＢＣＬ－ｘＬが好ましい。本明細書でＢＣＬ２様１を用いる場合にはＢＣＬ－ｘＬを用いることができ、そして本発明の文脈では有望な種としてＢＣＬ－ｘＬを特に想定していることを、当業者であれば理解できるだろう。
いくつかの態様では、ヒトの遺伝子またはタンパク質が用いられる。当業者であれば、他の種由来の相同体などを含むがこれらには限定されない任意の変種配列を、これらが実質的に同じ機能を有するという条件で、本発明の文脈において用いてもよいことを理解するだろう。
本明細書に記載のいくつかの態様は、Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法に関する。図１に、Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法のいくつかの態様の模式図を示す。方法は、ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；およびｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；のうちの１つ以上のステップを含み得る。
いくつかの態様では、細胞は自己初代ヒトＢ細胞を含む。Ｂリンパ球としても知られるＢ細胞は、白血球細胞のうちのリンパ球サブタイプである。Ｂ細胞は、抗体を分泌することによって、獲得免疫系の液性免疫反応において機能する。加えて、Ｂ細胞は抗原を提示し（これらもプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に分類される）、かつ、サイトカインを分泌する。いくつかの態様では、自己初代ヒトＢ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、自己初代ヒトＢ細胞はＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する。いくつかの態様においてヒトの組織は、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む。いくつかの態様では、自己初代ヒトＢ細胞は、この方法で使用されるＴ細胞にとって自己である。いくつかの態様では、自己初代ヒトＢ細胞は、この方法で使用されるＴＣＲにとって自己である。いくつかの態様では、細胞は非自己の初代ヒトＢ細胞を含む。
いくつかの態様では、自己初代ヒトＢ細胞は、前駆細胞の分化によって得られる細胞であるか、または前駆細胞の分化によって得られる細胞と同様の細胞である。いくつかの態様では、前駆細胞は造血幹細胞を含む（ＨＳＣ）。ここで、前駆細胞は未熟Ｂ細胞を指す。Ｂ細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する。ＨＳＣは、まず多能性前駆（ＭＰＰ）細胞に、そして次にリンパ球系共通前駆（ＣＬＰ）細胞へと分化する。ここからＢ細胞への分化はいくつかの段階を経て進行し、それぞれの段階は、様々な遺伝子の発現パターンや、免疫グロブリンＨ鎖とＬ鎖の遺伝子座配置を特徴とする。骨髄で分化している間、その分化が正確に進行するようにＢ細胞は２種類のセレクション（ポジティブセレクションとネガティブセレクション）を受け、どちらのセレクションにも細胞表面のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が関与する。分化を完了させるために、未熟Ｂ細胞は移行期Ｂ細胞として、Ｔ１およびＴ２という２つの移行段階を経ながら、骨髄から脾臓に移動する。脾臓への移動中および脾臓に移動したばかりのＢ細胞はＴ１ Ｂ細胞だと考えられ、Ｔ１ Ｂ細胞は脾臓内でＴ２ Ｂ細胞に移行する。Ｔ２ Ｂ細胞は、ＢＣＲや他の受容体を介して受け取ったシグナルに応じて、濾胞（ＦＯ）Ｂ細胞か辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞のいずれかに分化する。分化した後のＢ細胞は、今度は成熟Ｂ細胞、すなわちナイーブＢ細胞とみなされる。前述した、成熟Ｂ細胞になる前の細胞はいずれも前駆細胞であり、これらは、分化因子の導入または供給によって、成熟Ｂ細胞へと分化させることができる。
いくつかの態様では、自己初代ヒトＢ細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる。ｉＰＳＣは、体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは無限に増殖することができ、また、分化因子の導入によってＢ細胞を生じさせることも可能である。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ１５４とも呼ばれるＣＤ４０Ｌは、主に活性化Ｔ細胞で発現するタンパク質であり、かつ、ＴＮＦスーパーファミリー分子のメンバーである。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＣＤ４０（タンパク質）に結合する。この結合によって、標的細胞型に依存して多くの作用が引き起こされる。ＣＤ４０Ｌには、ＣＤ４０、α５β１インテグリンおよびαＩＩｂβ３の合計３つの結合パートナーが存在する。ＣＤ４０Ｌは共刺激分子として作用し、特に、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ細胞）と呼ばれるＴ細胞のサブセットにとって重要である。ＴＦＨ細胞でＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０をＢ細胞表面に固定することによってＢ細胞の成熟と機能を促し、それによって細胞間連絡が促進される。いくつかの態様では、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ間相互作用はＢ細胞の増殖を誘導するだけでなく、それらの抗原提示能を高める。いくつかの態様では、ｈＣＤ４０Ｌ導入遺伝子のアミノ酸配列は、例えば、ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ＊（配列番号９）であり得る。
いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌを、発現性細胞との共培養またはＢ細胞から直接発現させることによって提供する。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬも同様に導入遺伝子である。いくつかの態様では、ｒｈ－ＩＬ－２はおよそ１００ＩＵ／ｍＬで、ｒｈ－ＩＬ－４（またはより一般的にはＢＣＬ２様１）はおよそ５０ｎｇ／ｍＬで、およびｒｈ－ＩＬ－２１はおよそ５０ｎｇ／ｍＬで使用することができる。いくつかの態様では、ＩＬ－２／ＩＬ－４を最初に用い、その後、細胞をＩＬ－２１で培養する。いくつかの態様では、ＩＬ－２／ＩＬ－４を用いた長期間培養によってＴ細胞の成長が誘導され、Ｂ細胞の単離／濃縮後にＴ細胞が残留する場合がある。いくつかの態様では、本明細書に記載の量および時点で（例えば、実施例１０のように）、これら全て（ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－４、ＩＬ－２およびＩＬ－２１）が一緒に供給される。
いくつかの態様では、ＣＤ４０ＬをＢ細胞に直接導入することによって、支持細胞を使う必要をなくすことができる。このことは、応用の観点から好ましい場合があり、また、これによってその抗原提示能が高まる。従っていくつかの態様では、本明細書で提供する態様のいずれかは、支持細胞の使用を（完全に、または支持細胞が、その従来の利点を実際に提供するレベルで）除外した過程であり得る。
いくつかの態様は、細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む。インターロイキン２（ＩＬ－２）とはインターロイキンであり、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種である。ＩＬ－２は１５．５～１６ｋＤａのタンパク質で、免疫を担う白血球細胞（白血球、多くはリンパ球）の活性を制御する。ＩＬ－２は、リンパ球によって発現されるＩＬ－２受容体に結合することによって、その作用を媒介する。ＩＬ－２は主に、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する。インターロイキン４（ＩＬ４、ＩＬ－４）は、活性化Ｂ細胞や活性化Ｔ細胞の増殖、およびＢ細胞の形質細胞への分化を刺激するなど、多くの生物学的役割を有するサイトカインであり、液性免疫と獲得免疫における重要な制御因子である。インターロイキン２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫系の細胞に対して強い制御作用をもつサイトカインである。ＩＬ－２１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現するＩＬ－２１受容体と結合することによって、その作用を媒介する。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－ｘＬ（または、より一般的にはＢＣＬ２様１）、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１の典型的なヒトタンパク質変種が、ヒトＢ細胞を操作するのに最も適している。しかしながら、ヒトタンパク質の変種だけでなく、他の種に由来する配列も同様に適している可能性がある。いくつかの態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌのような変種を（例えば、Ｂ細胞の成長を補助するために）用いることができる。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１存在下でＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様では、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１の組み合わせによって、Ｔ細胞の成長が引き起こされ得る。いくつかの態様では、Ｂ細胞を活性化するためにＩＬ－２を単独で使用し、その４８時間後にこれら３種のサイトカインの組み合わせを２４時間使用し、その後、Ｂ細胞をＩＬ－２１だけと培養することができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞が成長し始める短期間の生存に、ｈＣＤ４０Ｌ支持細胞とＩＬ－２／ＩＬ－４／ＩＬ－２１を使用する。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様においてこれらの過程は、少なくとも１ヶ月間またはそれ以上、例えば、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、もしくは１３週間またはそれ以上、あるいは３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間またはそれ以上の期間になり得る。いくつかの態様では、ＢＣＬ２様遺伝子１の長いアイソフォーム（ＢＣＬ－ＸＬ）を使用する。本明細書では、簡略表記として「ＢＣＬ－ＸＬ」という用語を使用する。いくつかの態様は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。ＢＣＬ－６遺伝子によってコードされているタンパク質は、リンパ腫において臨床的意義をもつ。ＢＣＬ－６タンパク質は主要転写因子で、ナイーブヘルパーＴ細胞の濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ細胞）への分化を引き起こす。ＢＣＬ－６タンパク質は、健康なおよび腫瘍性両方の胚中心のＢ細胞だけに存在する。ＢＣＬ－ＸＬ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ－ｅｘｔｒａ ｌａｒｇｅ）は、ＢＣＬ２様１遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＢＣＬ－ＸＬはミトコンドリアにある膜貫通分子であり、アポトーシスにおいて機能する。このような参照および態様の全てが、任意のＢＣＬ様遺伝子１の使用をも企図していると理解される。
ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬはＢ細胞を不死化する。このような不死化Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌによって一定の頻度で刺激されることを必要とする。本明細書で提供するように、そのような刺激は、ＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞によって、またはＣＤ４０ＬをＢ細胞に導入することのいずれかによって与えることができる（例えば実施例１０を参照のこと）。いくつかの態様では、ＣＤ４０ＬをＢ細胞に導入すると、それによって、Ｂ細胞の抗原提示能も向上する（種々の実施例を参照）。いくつかの態様では、ＥＢＶ感染が、感染したＢ細胞の不死化を引き起こす。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）はヘルペスウイルスである。ＥＢＶは免疫系のＢ細胞と上皮細胞に感染する。ＥＢＶをインビトロでＢ細胞に感染させると、最終的に、無制限に成長することが可能なリンパ芽球様細胞株に至る。これらの細胞株で見られるこの成長転換は、ウイルスタンパク質が発現した結果である。いくつかの態様は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性細胞と共培養することを含む。Ｂ細胞の生存延長は、有効なＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ間相互作用の結果である。いくつかの態様では、少なくとも０．５ヶ月間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間またはそれより長い期間、（その生存を誘導、促進、および／または維持するために）細胞を維持することができる。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子は、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい。いくつかの態様において一つまたは複数の遺伝子の発現または安定性は、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡによって制御され得る。いくつかの態様において一つまたは複数の遺伝子は、外因性プロモーターの制御下で発現し得る。いくつかの態様において一つまたは複数の遺伝子は、内在性プロモーターの制御下で発現し得る。
いくつかの態様において遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。導入遺伝子は、他のウイルスを介した（例えばレンチウイルスを介した）遺伝子送達システムなどの、導入遺伝子の安定した組み込みを誘導する他の方法によって送達することもできる。
いくつかの態様では、細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様では、細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で０．５ヶ月間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、もしくは２４ヶ月間またはそれ以上の期間である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様では、導入遺伝子は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００のポリペプチドをコードし、ここでこれらのポリペプチドは同じであってもまたは異なっていてもよい。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、各ポリペプチドは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれより多いアミノ酸を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子におけるポリペプチドの順序は、各抗原が処理され、提示されるように選択される。いくつかの態様においてそのようなポリペプチドの順序は、コンピューター上のアルゴリズムによって推測される。いくつかの態様では、ポリペプチドの順序は実験によって決定される。いくつかの態様では、ポリペプチド抗原提示に及ぼす位置効果を回避するために、同じまたは異なる導入遺伝子内で、複数の順序のポリペプチドが使用される。いくつかの態様において導入遺伝子は、より長いタンパク質部分または完全長タンパク質配列をコードする。いくつかの態様において導入遺伝子は、腫瘍内に認められる一つまたは複数の変異型タンパク質配列をコードし得る。いくつかの態様において導入遺伝子は、別の読み取り枠をコードし得る。いくつかの態様において導入遺伝子は、ゲノムの融合側をコードし得る。いくつかの態様において導入遺伝子は、同じポリペプチドのバリアントを含み得る。いくつかの態様において導入遺伝子は、ヒトエクソームの一部またはヒトゲノム遺伝子座の一部をコードする。いくつかの態様において導入遺伝子は、がん関連ウイルスに由来する一つまたは複数の抗原をコードする。いくつかの態様において導入遺伝子は、がんの治療用のまたはその他のヒト疾患用のＴＣＲを同定または分析するために用いられる抗原をコードする。いくつかの態様において導入遺伝子は、抗原をＭＨＣクラスＩＩ提示経路に標的化するために、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達配列、膜貫通型配列、および切断型の細胞質配列を含む。いくつかの態様において導入遺伝子は、抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示経路への標的化を、例えば細胞膜または細胞内小胞への輸送を誘導することによって、効率的に達成することが可能な他の配列を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドをコードしている種々の領域は、ウイルスの２Ａ配列やプロテアーゼ開裂部位を含むがこれらには限定されないスペーサー配列または開裂部位によって隔てられている。いくつかの態様では、コードされているポリペプチドの安定性を高めるために、導入遺伝子に他の配列を付加する。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに関連する抗原提示の効率を高めるために、導入遺伝子に他の配列を含める。いくつかの態様では、導入遺伝子は外因性プロモーターの制御下で発現する。いくつかの態様では、導入遺伝子は内在性プロモーターの制御下で発現する。いくつかの態様において導入遺伝子の発現は、２シストロン性または多シストロン性の導入遺伝子カセットに含まれている小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡによって制御される。
抗原は、様々な形式でＡＰＣへと送達することができる。第一に、ＡＰＣを様々な長さのポリペプチドと共インキュベーションすると、ＡＰＣによる抗原提示が誘導されることが挙げられる。ペプチドの長さに依存して、ＭＨＣクラスＩ（およそ９～１１アミノ酸）提示経路またはＭＨＣクラスＩＩ（およそ１４～２５アミノ酸）提示経路による提示が起こることが望ましい。より短い（９～１１アミノ酸）ペプチドは通常ＭＨＣクラスＩＩの分子には結合せず、また、より長いペプチド（１４以上のアミノ酸）が必ずしもＭＨＣクラスＩ提示経路によって正確に処理され、提示されるとは限らない点に注意が必要である。従って、決まった長さのペプチドと共インキュベーションすることは、より長いペプチドをエレクトロポレーションで導入しない限り、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ経路の両方ではなく、そのいずれかによる抗原提示を評価するためだけに適している。
第二に、抗原として完全長組み換えタンパク質を用いた研究があることが挙げられる。組み換えタンパク質が、（例えば、ＡＰＣ上のエンドサイトーシス受容体を標的とすることで）ＡＰＣによって効率的に取り込まれることを前提とすれば、これにより、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ両方の抗原提示が起こる。しかし産生過程の複雑さを考慮すると、完全長組み換えタンパク質は多数の異なる抗原を扱う研究、例えば、腫瘍に含まれ、腫瘍ごとにそれぞれ異なる可能性がある変異型タンパク質に対するＴＣＲ探索などの研究には適していない。
第三に、ＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡのいずれかによって、抗原をＡＰＣ内で一過的に発現させられることが挙げられる。簡単に利用できることから、核酸による抗原送達は多種多様な抗原の研究に特に適している。この方法の主な欠点としては、ＡＰＣにトランスフェクションした後の抗原の発現が一過的で変わりやすいため、ＡＰＣの集団が不均一になることが挙げられる。利用可能な解決策としては、抗原を安定的に形質導入することが考えられるが、高効率で、細胞生存率の有害な損失なくこれを達成することは、不死化させていない多くの初代細胞型には難しい場合がある。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。導入遺伝子をコードしている抗原は、安定的に導入遺伝子を組み込む任意の方法によって送達することができ、このような方法には、ウイルスを介した（レトロウイルスまたはレンチウイルスを介した）遺伝子送達システムだけでなく、部位特異的組み込み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、およびトランスポゾンに基づくベクターなどの非ウイルス性遺伝子送達法もある。いくつかの態様において過程には、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮが含まれ得る。抗原が安定して発現することにより、抗原の処理および提示を評価することが可能になる。さらに、飽和量の抗原が安定して発現することで、（ＴＣＲ探索の感度に悪影響を及ぼす）ＡＰＣ集団における抗原発現の不均一さが最小限に抑えられる。加えて、安定した発現によってＡＰＣを数多く生成することも容易になる。いくつかの態様では、導入遺伝子は外因性プロモーターの制御下で安定して発現する。いくつかの態様では、導入遺伝子は内在性プロモーターの制御下で安定して発現する。いくつかの態様では、発現レベルを制御できるように、安定した発現用のプロモーターを選択する。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。いくつかの態様では、混合物は少なくとも１つの細胞と、少なくとも１つの抗原をコードしている少なくとも１つの外因性核酸配列とを含む。いくつかの態様では、混合物は少なくとも１つの細胞と、少なくとも１つの抗原をコードしている少なくとも１つのポリペプチド配列とを含む。いくつかの態様では、細胞を培地中で培養する。細胞内での一過的な発現は、ＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡのいずれかを用いることで達成することができる。多種の抗原について研究する場合には、核酸を一過的に発現させることによって抗原を送達することが特に適している。この方法の主な欠点としては、ＡＰＣにトランスフェクションした後の抗原の発現が一過的で変わりやすいため、ＡＰＣの集団が不均一になることが挙げられる。いくつかの態様では、ＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡは、抗原化合物を発現している細胞の検出および選抜を可能にするために、抗原と共にマーカーをコードするものである。
図２では改変細胞に関するいくつかの態様を示す。いくつかの態様では、細胞は、ａ）インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；ｂ）少なくとも１つの抗原化合物とインキュベートされている；およびｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有する；の特徴の内の１つ以上を含む。細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、またはマクロファージのような初代抗原提示細胞の場合がある。細胞は、腫瘍細胞の場合がある。細胞は、病原体感染細胞の場合がある。細胞はまた、細胞株、ＣＯＳ－７、Ｋ５６２、またはＨＥＫ２９３の場合もある。
いくつかの態様では、過程をインビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様では、過程をインビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。いくつかの態様においてＣＤ４０Ｌの発現は、インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持することに役立つ。
いくつかの態様において遺伝子は、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して細胞に導入される。導入遺伝子は、他のウイルスを介した（例えばレンチウイルスを介した）遺伝子送達システムなどの、安定的に導入遺伝子を組み込むための他の方法によって送達することもできる。
いくつかの態様では、細胞の生存は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様では、細胞の生存延長はインビトロでの細胞培養で、０．５ヶ月間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、または２４ヶ月間である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様において導入遺伝子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のポリペプチドをコードし、ここでこれらのポリペプチドは同じであってもまたは異なっていてもよい。いくつかの態様では、各ポリペプチドは少なくとも８のアミノ酸を含む。いくつかの態様において各ポリペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。導入遺伝子をコードしている抗原は、安定的に導入遺伝子を組み込む任意の方法によって送達することができ、このような方法には、ウイルスを介した（レトロウイルスまたはレンチウイルスを介した）遺伝子送達システムだけでなく、部位特異的組み込み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、およびトランスポゾンに基づくベクターなどの非ウイルス性遺伝子送達法もある。いくつかの態様において過程には、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮが含まれ得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
いくつかの態様において改変細胞は、ａ）生存因子を発現させるためのヌクレオチド配列；ｂ）抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を発現させるためのヌクレオチド配列；およびｃ）ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列；を含む。いくつかの態様では、生存因子はＢＣＬ－６および／またはＢＣＬ－ＸＬを含む。いくつかの態様では、抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子は、１から４０のポリペプチドをコードしている。いくつかの態様において導入遺伝子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のポリペプチドをコードし、ここでこれらのポリペプチドは同じであってもまたは異なっていてもよい。いくつかの態様では、各ポリペプチドは８または９のアミノ酸を含む。いくつかの態様において各ポリペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列は、ＣＤ４０Ｌを安定して発現させる遺伝子を含む。
いくつかの態様は、図３に示すように、Ｔ細胞へ抗原を提示する初代ヒトＢ細胞に関し、この細胞は、ａ）ＢＣＬ－６およびＢＣＬ－ＸＬを安定して発現させるヌクレオチド配列（例えば、配列番号１）；ｂ）１から４０のポリペプチドを安定して発現させるヌクレオチド配列であって、ここで各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸をコードしており、かつ、各ポリペプチドが抗原であるヌクレオチド配列；および、ｃ）ＣＤ４０Ｌを安定して発現させるヌクレオチド配列；を含んでいる。いくつかの態様においてヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のポリペプチドをコードし、ここでこれらのポリペプチドは同じであってもまたは異なっていてもよい。いくつかの態様において各ポリペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のアミノ酸を含む。
ＢＣＬ６－Ｔ２Ａ－ＢＣＬ－ｘＬ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ導入遺伝子のアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号１）。
ＭＡＳＰＡＤＳＣＩＱＦＴＲＨＡＳＤＶＬＬＮＬＮＲＬＲＳＲＤＩＬＴＤＶＶＩＶＶＳＲＥＱＦＲＡＨＫＴＶＬＭＡＣＳＧＬＦＹＳＩＦＴＤＱＬＫＣＮＬＳＶＩＮＬＤＰＥＩＮＰＥＧＦＣＩＬＬＤＦＭＹＴＳＲＬＮＬＲＥＧＮＩＭＡＶＭＡＴＡＭＹＬＱＭＥＨＶＶＤＴＣＲＫＦＩＫＡＳＥＡＥＭＶＳＡＩＫＰＰＲＥＥＦＬＮＳＲＭＬＭＰＱＤＩＭＡＹＲＧＲＥＶＶＥＮＮＬＰＬＲＳＡＰＧＣＥＳＲＡＦＡＰＳＬＹＳＧＬＳＴＰＰＡＳＹＳＭＹＳＨＬＰＶＳＳＬＬＦＳＤＥＥＦＲＤＶＲＭＰＶＡＮＰＦＰＫＥＲＡＬＰＣＤＳＡＲＰＶＰＧＥＹＳＲＰＴＬＥＶＳＰＮＶＣＨＳＮＩＹＳＰＫＥＴＩＰＥＥＡＲＳＤＭＨＹＳＶＡＥＧＬＫＰＡＡＰＳＡＲＮＡＰＹＦＰＣＤＫＡＳＫＥＥＥＲＰＳＳＥＤＥＩＡＬＨＦＥＰＰＮＡＰＬＮＲＫＧＬＶＳＰＱＳＰＱＫＳＤＣＱＰＮＳＰＴＥＳＣＳＳＫＮＡＣＩＬＱＡＳＧＳＰＰＡＫＳＰＴＤＰＫＡＣＮＷＫＫＹＫＦＩＶＬＮＳＬＮＱＮＡＫＰＥＧＰＥＱＡＥＬＧＲＬＳＰＲＡＹＴＡＰＰＡＣＱＰＰＭＥＰＥＮＬＤＬＱＳＰＴＫＬＳＡＳＧＥＤＳＴＩＰＱＡＳＲＬＮＮＩＶＮＲＳＭＴＧＳＰＲＳＳＳＥＳＨＳＰＬＹＭＨＰＰＫＣＴＳＣＧＳＱＳＰＱＨＡＥＭＣＬＨＴＡＧＰＴＦＰＥＥＭＧＥＴＱＳＥＹＳＤＳＳＣＥＮＧＡＦＦＣＮＥＣＤＣＲＦＳＥＥＡＳＬＫＲＨＴＬＱＴＨＳＤＫＰＹＫＣＤＲＣＱＡＳＦＲＹＫＧＮＬＡＳＨＫＴＶＨＴＧＥＫＰＹＲＣＮＩＣＧＡＱＦＮＲＰＡＮＬＫＴＨＴＲＩＨＳＧＥＫＰＹＫＣＥＴＣＧＡＲＦＶＱＶＡＨＬＲＡＨＶＬＩＨＴＧＥＫＰＹＰＣＥＩＣＧＴＲＦＲＨＬＱＴＬＫＳＨＬＲＩＨＴＧＥＫＰＹＨＣＥＫＣＮＬＨＦＲＨＫＳＱＬＲＬＨＬＲＱＫＨＧＡＩＴＮＴＫＶＱＹＲＶＳＡＴＤＬＰＰＥＬＰＫＡＣＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＳＱＳＮＲＥＬＶＶＤＦＬＳＹＫＬＳＱＫＧＹＳＷＳＱＦＳＤＶＥＥＮＲＴＥＡＰＥＧＴＥＳＥＭＥＴＰＳＡＩＮＧＮＰＳＷＨＬＡＤＳＰＡＶＮＧＡＴＧＨＳＳＳＬＤＡＲＥＶＩＰＭＡＡＶＫＱＡＬＲＥＡＧＤＥＦＥＬＲＹＲＲＡＦＳＤＬＴＳＱＬＨＩＴＰＧＴＡＹＱＳＦＥＱＶＶＮＥＬＦＲＤＧＶＮＷＧＲＩＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬＣＶＥＳＶＤＫＥＭＱＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩＱＥＮＧＧＷＤＴＦＶＥＬＹＧＮＮＡＡＡＥＳＲＫＧＱＥＲＦＮＲＷＦＬＴＧＭＴＶＡＧＶＶＬＬＧＳＬＦＳＲＫＥＦＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ＊。
いくつかの態様は、本明細書に記載の改変細胞と培地とを含み得る。
さらなる態様
数千から数百万のＴ細胞／ＴＣＲをスクリーニングするのに用いられる様々な技術にはいくつかの欠点がある。ＴＣＲ探索に関する複数の研究は、組み換えＭＨＣ－多量体を使った試薬を利用することに基づいており（ツジ（Ｔｓｕｊｉ）ら、癌免疫学研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ）、２０１８；ペン（Ｐｅｎｇ）ら、セル・レポート（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２０１９；スピンドラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０２０）、その探索過程ではＡＰＣを全く使用しない。このような試薬は特定のＨＬＡアレルにのみ利用可能で、細胞による抗原の処理および提示に関する決定的な証拠とはならない。また、このような方法では、ＴＣＲの生物物理学的な特性をスクリーニングすることはできるが、Ｔ細胞活性化のような機能特性に基づくスクリーニングはできない。この他に、ペプチド、ｍＲＮＡまたはプラスミドの形で送達された抗原を一過的に発現している初代ヒトＡＰＣを用いた研究もある（トラン（Ｔｒａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１４；トランら、サイエンス、２０１５；グロス（Ｇｒｏｓ）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）、２０１６）。このような送達方法はＡＰＣの抗原レベルを不均一にするもので、ＡＰＣによる長時間にわたる抗原の発現／提示（つまり、負荷した数時間または数日後にＡＰＣがまだ抗原を提示しているか否か）をどのように追跡するかの解決策とはならない。さらに、抗原を負荷したＡＰＣを多量に生成するためには、多量の抗原、例えばｍＲＮＡが必要となる可能性がある。従ってこれらの方法は、抗原の発現レベルが均一で持続的なＡＰＣが大量に必要とされる場合には適していない。さらに、最近の研究では改変されたＡＰＣが使われている（クラ（Ｋｕｌａ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１９）。ここでは、目的の抗原ライブラリーと、Ｔ細胞によって認識される抗原を提示するＡＰＣを標識するためのレポーターシステムとがＡＰＣに導入された。抗原が安定して発現し、かつ、大量のＡＰＣが得られるにも関わらず、このシステムでは個々人について目的のＨＬＡアレルを改変ＡＰＣに導入する必要があるため、完全に個別化されたＴＣＲの探索には適していない。同様に、一つ以上の規定のＨＬＡアレルを発現し、抗原を提示できるように改変された細胞株を使う方法（バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、イムノロジカル・レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ）、２０１４）も適していない。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＡＰＣは以下の３つの利点の内の少なくとも１つを有する可能性がある。第一にこのＡＰＣは、細胞培養中で細胞数が多くなるまで容易に増殖させることができ、そして長期間維持することができる。第二にこのＡＰＣは、目的の抗原を安定して発現し、細胞集団の不均一さを抑えながら、高くかつ持続的な抗原提示を達成できる。第三にこのＡＰＣは、特に目的とする側面（ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ経路、特定のＨＬＡアレルおよび活性化の閾値）に関わるＴＣＲの探索に重点的に取り組むための、推定Ｔ細胞エピトープを提示することができる。いくつかの態様においてＡＰＣは、より効率的な抗原提示を可能にするための１つ以上の遺伝子改変を含み得る。いくつかの態様では、ＡＰＣはＬＡＭＰ１標的化配列を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のＡＰＣは以下に挙げる利点の内の１つを有する可能性がある。第一に、ＡＰＣは抗原を提示し、細胞集団の不均一さを抑えながら、高くかつ持続的な抗原提示を達成し、そしてＡＰＣによるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩを高めるために、ＡＰＣはＣＤ４０Ｌを発現する。いくつかの態様では、抗原は直列型ミニ遺伝子である。いくつかの態様では、抗原は安定して発現する。いくつかの態様では、直列型ミニ遺伝子は腫瘍で見られる１つ以上の変異型タンパク質配列をコードする。いくつかの態様では、ＡＰＣを利用して、がんの治療を含むヒトの治療に関わるＴＣＲを同定および／または分析する。
本明細書で記載のＡＰＣのいくつかの態様は、個人ごとに、完全に個別化された条件で実施される、または多種多様なＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩアレル（またはＨＬＡアレル）を伴う、治療用ＴＣＲ探索の取り組みに適している。このような治療用ＴＣＲ探索の取り組みにおいては：
（１）自己細胞由来のＡＰＣを使用することで、ＴＣＲ探索は個人のクラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡアレルの全てに対して実施され、所与の個人の１つまたは全てのＨＬＡアレルが対象となる。従ってＴＣＲ探索は、個人のＨＬＡアレルには依存しない。
（２）自己細胞による処理および提示が可能な抗原に特異的なＴＣＲだけがスクリーニングによって同定される。従ってＴＣＲは、細胞によって確実に処理され、提示される抗原を認識するはずであり、そしてＴＣＲ探索の過程において候補抗原の処理および提示を評価することができる。および、
（３）レポーターＴ細胞（患者由来のＴ細胞ではなく）並びにＡＰＣ集団（均一でレベルが安定していることが好ましい）を機能的遺伝子スクリーニングに使用して、スクリーニング感度に悪影響を与える可能性のある、Ｔ細胞やＡＰＣの機能的表現型の不均一さを低減するかまたは排除する。いくつかの態様では、同じＴＭＧを発現しているＡＰＣは、ほぼ同じレベルの抗原を発現する。
いくつかの態様は、抗原提示の方法に関する。図４に示すように、方法は、ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；ｂ）細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；および、ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；のうちの１つ以上のステップを含み得る。さらなるステップを追加しても、介在させてもよい。いくつかの態様では、前述した任意のステップのうちの１つ以上を繰り返すこともできる。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞をＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞と共培養することを含む。いくつかの態様は、細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４および／またはＩＬ－２１と共培養することをさらに含む。いくつかの態様では、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１の組み合わせによって、Ｔ細胞の成長が引き起こされ得る。いくつかの態様では、Ｂ細胞を活性化するためにＩＬ－２を単独で使用し、そのおよそ１～３日後、例えば４８時間後に、これら３種のサイトカインの組み合わせを２４時間使用し、その後、Ｂ細胞を、この３種類の成分のうちのＩＬ－２１だけと培養することができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞が成長し始める短期間の生存に、ｈＣＤ４０Ｌ支持細胞とＩＬ－２／ＩＬ－４／ＩＬ－２１を使用する。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む。いくつかの態様は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。
いくつかの態様において、細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することは、細胞にＥＢＶを感染させることを含む。いくつかの態様は、細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む。
いくつかの態様では、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、またはＣＤ４０Ｌ遺伝子は、当業者に知られた任意の方法によって細胞に導入され、このような方法には、例えば、レトロウイルス性形質導入、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮがある。いくつかの態様では、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して、遺伝子を導入することができる。
いくつかの態様において細胞の生存延長は、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である。いくつかの態様では、細胞の生存延長はインビトロでの細胞培養で、０．５ヶ月間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、または２４ヶ月間である。
いくつかの態様において少なくとも１つの抗原化合物は、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている。いくつかの態様において導入遺伝子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のポリペプチドをコードし、ここでこれらのポリペプチドは同じであってもまたは異なっていてもよい。いくつかの態様では、各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる。いくつかの態様において各ポリペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で安定して発現する。導入遺伝子をコードしている抗原は、安定的に導入遺伝子を組み込む任意の方法によって送達することができ、このような方法には、ウイルスを介した（レトロウイルスまたはレンチウイルスを介した）遺伝子送達システムだけでなく、部位特異的組み込み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、およびトランスポゾンに基づくベクターなどの非ウイルス性遺伝子送達法もある。いくつかの態様では、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮ介して、導入遺伝子を付加することができる。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原化合物は細胞内で一過的に発現する。
ＡＰＣによる抗原提示は、様々な戦略によって増強することができる。第一に、トール（Ｔｏｌｌ）様受容体（ＴＬＲ）リガンド、サイトカインおよび可溶性の受容体リガンド（例えば三量体化ＣＤ４０Ｌ）などの免疫賦活剤と共インキュベーションすることで、ＡＰＣによる抗原提示が高まることが示されている。第二に、遺伝子操作を利用することで、ＡＰＣ内の特定の抗原提示経路を活性化または不活性化することができる。例えば、クラスＩＩ転写活性化因子（ＣＩＩＴＡ）を調節することで、ＡＰＣにおけるＭＨＣクラスＩＩ提示を制御することができる一方、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）または抗原提示関連トランスポーター（ＴＡＰ）遺伝子をノックアウトすることで、ＭＨＣクラスＩ抗原提示が消失する。いくつかの態様において遺伝子操作には、細胞によってＣＤ４０Ｌを発現させることが含まれる。いくつかの態様においてＣＤ４０Ｌは、抗原提示を増強し、ＡＰＣの生存延長を誘導、促進および維持する。いくつかの態様において操作には、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６を含むがこれらには限定されない共刺激分子を発現させることが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、ＰＤ－Ｌ１を含むがこれには限定されない１つ以上の抑制性受容体分子の遺伝的ノックアウトが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、ＩＬ－２を含むがこれらには限定されないサイトカインやケモカインなどの可溶性因子を発現させることが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、抗原提示機構の構成要素を発現または消失するように細胞を改変することが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、抗原提示機構の構成要素であって、抗原提示におけるその機能を高めるために改変されている構成要素を発現するように細胞を改変することが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示を増強する、ＣＤ４０Ｌ以外の因子を発現するように細胞を改変することが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、ＴＭＧによってコードされているポリペプチドの、細胞膜および／または細胞内小胞への輸送が高まるように細胞を改変することが含まれる。いくつかの態様において遺伝子操作には、無作為な遺伝子発現を、例えばＡＩＲＥの発現による無作為な遺伝子発現を誘導するように、細胞を改変することが含まれる。第三に、ＡＰＣによる抗原提示は、最適な配合の抗原化合物を送達することによって増強することができる。いくつかの態様において抗原化合物は、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達配列および膜貫通配列を含むがこれらには限定されない特定の配列を含めることで、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示経路の両方を標的とするように設計された、直列型ミニ遺伝子から安定して発現する。いくつかの態様において導入遺伝子は、例えば細胞膜または細胞内小胞への輸送を誘導することによって、抗原をＭＨＣクラスＩＩ提示経路へと効率的に標的化することが可能な他の配列を含む。いくつかの態様では、ミニ遺伝子をコードしている種々の領域はスペーサー配列によって隔てられている。いくつかの態様では、コードされているポリペプチドの安定性を高めるために、導入遺伝子に他の配列を付加する。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに関連する抗原提示の効率を高めるために、導入遺伝子に他の配列を含める。いくつかの態様において直列型ミニ遺伝子は、高レベルで均一な抗原を確保するために、ＴＭＧを発現しているＡＰＣを検出し、濃縮する少なくとも１つのマーカーを含む。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含むがこれらには限定されない小分子、抗体または核酸とインキュベートすることで、ＡＰＣによる抗原提示が高まる。
いくつかの態様では、抗原化合物はポリペプチドであってＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示経路の両方を標的とするように、少なくとも１２のアミノ酸を含むポリペプチドがＡＰＣにエレクトロポレーションで導入される。いくつかの態様においてポリペプチドは、１つ以上の天然のものではないアミノ酸を含む。いくつかの態様においてポリペプチドは、安定性、プロテアーゼ感受性およびＭＨＣ分子との結合を含むがこれらには限定されないその特性が変化するように、化学的に修飾される。いくつかの態様では、エレクトロポレーションを、ポリペプチドが細胞膜を通過することを可能にする代替方法で置き換える。いくつかの態様では、抗原量と関連する抗原提示を最適化するために、滴定量のポリペプチドをＡＰＣにエレクトロポレーションで導入する。このことによって、ＴＣＲの特徴分析研究に関して抗原提示を最適化することができる。いくつかの態様では、ポリペプチドのプールをエレクトロポレーションで導入することが、ＴＣＲライブラリーのスクリーニングを含むがこれらには限定されないＴＣＲの探索にとって有用である。いくつかの態様では、クラスＩまたはクラスＩＩ抗原機構の処理および／または提示を増強する薬剤を、ポリペプチドと共に送達する。
いくつかの態様において抗原化合物は、ＡＰＣにエレクトロポレーションで導入される少なくとも８のアミノ酸を含むポリペプチドである。いくつかの態様において抗原化合物は、ＡＰＣにエレクトロポレーションで導入される８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸のポリペプチドである。当業者であれば、本発明のいくつかの態様では、ＴＣＲ、抗原、またはペプチド－ＭＨＣ複合体の様々な特徴または特性を決定する（例えば最小エピトープを同定する）ために、異なる長さのポリペプチドを利用または比較できることが認識できる。いくつかの態様では、細胞と共にインキュベートされた抗原化合物は、抗原を提示する前に、細胞によって処理される。
本明細書で記載するように、抗原化合物とは通常、免疫学的タンパク質（例えばＴＣＲ）によって認識される分子またはその分子に特有の側面（例えば、ペプチド－ＭＨＣ複合体中の結合ペプチド）を指す。当業者であれば、いくつかの文脈では、免疫学的タンパク質が認識し、結合する分子が、前駆体から改変され、処理され、または複合体化された分子（例えばポリペプチド）であったとしても、前駆分子（例えば２５ｍｅｒのポリペプチド）も抗原化合物と呼ばれ得ることを理解できる。当業者はまた、いくつかの文脈においては、免疫学的タンパク質が認識し、結合する分子またはその分子に特有の側面が、ポリヌクレオチドによってコードされているまたはポリヌクレオチドによって発現される分子（例えばポリペプチド）であったとしても、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも抗原化合物と呼ばれ得ることを理解できる。このような場合、抗原化合物はポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドであって、ポリヌクレオチド自体ではないと理解される。当業者はまた、免疫学的タンパク質が、ポリヌクレオチドまたは小分子を抗原として結合し得ることも認識する。このような場合、抗原化合物がポリペプチドである必要はない。この略称は、同じアイデアを様々な形式で言い直すのを避けるために用いられる。本明細書で使用する場合、抗原化合物の細胞培地への添加、抗原化合物の細胞へのエレクトロポレーションによる導入、または外因性遺伝子改変による抗原化合物の発現を含むがこれらには限定されない任意の方法によって、抗原化合物が外部から導入されるかまたは細胞に提示される時に、抗原化合物は細胞（例えばＡＰＣ）と「インキュベート」される。「ＴＣＲ抗原化合物」は具体的には、ＭＨＣ（もしくはＭＨＣ様分子）が結合するペプチドもしくは他の分子、またはＭＨＣ（もしくはＭＨＣ様分子）が結合するペプチドの前駆ペプチドを指すが、ペプチド－ＭＨＣ複合体全体を指すものではない。
前述した態様では、ＴＣＲ探索用ＡＰＣを作製するための複数の要素を組み合わせることができる。
いくつかの態様では、所与の個人の全ＨＬＡアレルに対するＴＣＲ探索の実施を可能にするために、自己初代ヒトＢ細胞を用いる。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を感染させるか、またはＢＣＬ－６とＢＣＬ－ＸＬを安定定期に形質導入するかのいずれかによってＢ細胞を不死化させることで、多数の細胞を得ることができる。ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化法は、Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌ導入支持細胞と共培養するよりも、Ｂ細胞にＣＤ４０Ｌ分子とを直接形質導入することで、Ｂ細胞のＣＤ４０受容体を刺激すること－インビトロで初代ヒトＢ細胞を維持するのに有効な刺激－が可能であることを実証することによって、改良される。この改変によって細胞培養における不死化Ｂ細胞の維持が容易になることで、産業上の応用が大幅に改善される。いくつかの態様では、ＴＣＲ探索用の自己初代ヒトＢ細胞を少量のヒト血液から生成することができる。いくつかの態様では、使用されるヒト血液の量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｍｌのヒト血液を含む。いくつかの態様では、ＴＣＲ探索用の自己初代ヒトＢ細胞は、腫瘍生検およびリンパ節生検を含むがこれらには限定されない他のヒト組織から得られる。いくつかの態様では、ＴＣＲ探索用の自己初代ヒトＢ細胞を、細胞数が１千万、２千万、３千万、４千万、５千万、６千万、７千万、８千万、９千万、１億、１．５億、２億、２．５億、５億および７．５億または１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億および１００億になるまで、増殖させる。
第二に、いくつかの態様では、抗原は不死化Ｂ細胞の安定した形質導入によって送達される。いくつかの態様において安定した形質導入は、細胞ゲノム中に核酸配列を組み込むことによって達成される。いくつかの態様では、安定した形質導入によって、抗原が継続して発現するようになる。この送達様式によって、抗原の処理および提示が評価できる。さらに、飽和量の抗原が継続して発現することで、（ＴＣＲ探索の感度に悪影響を及ぼし得る）ＡＰＣ集団における抗原発現の不均一さが最小限に抑えられる。加えて、安定した発現によって、多数のＡＰＣを生成することが容易になる。いくつかの態様では、ＴＣＲの単離やＴＣＲの特徴分析に関わる研究を含むがこれらには限定されない特定の使用目的においては、抗原を一過的な形式で送達することが好ましい場合もある。
第三に、いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることによって、Ｂ細胞のＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの抗原提示を調節する。ＣＤ４０Ｌ改変Ｂ細胞の存在下では、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞のＴ細胞活性化が増強し、これによりＴＣＲ探索の感度が向上する。
本明細書に記載の態様は、腫瘍学の他にも様々な治療分野で、例えば自己免疫や感染症におけるＴＣＲ探索に適用できる。いくつかの態様は、治療、例えばがんの、に用いる規定された機能特性（例えば特定の抗原を認識する）を有するＴＣＲ配列を、ＴＣＲバリアントの膨大なコレクションから同定することに関する。いくつかの態様は、治療、例えばがんの、に用いるＴＣＲ配列の特徴分析を行うこと（例えばＴＣＲ特異性の確認、ＨＬＡ拘束性のマッピングまたはＴＣＲ感受性の評価）に関する。
さらに本発明は、患者由来の抗原特異的Ｔ細胞を治療用に増殖させることに有用であり得る。例としては、例えばＡＰＣを樹状細胞で置き換えるために、新生抗原を提示しているＢ細胞との共培養によって腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させること、または新生抗原を提示しているＢ細胞との共培養によって血液由来Ｔ細胞を増殖させることがあげられる。これらの手法は、Ｔ細胞を活性化してそれらが増殖可能になるように、自己抗原を提示している細胞を使用することに基づいている。
いくつかの態様において初代ヒトＢ細胞は、末梢血に加えて、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血および骨髄を含むがこれらには限定されないＢ細胞を含有する他のヒト組織に由来するものであってよい。
いくつかの態様において初代ヒトＢ細胞は、造血幹細胞を含むがこれには限定されない前駆細胞の分化によって得られるものであってよい。
いくつかの態様においてヒトＢ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られるものであってよい。
これまでに、ＥＢＶ（トラジアイ（Ｔｒａｇｇｉａｉ）ら、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）、２０１２）およびＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ（クワッケンボス（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）、２００８）によるＢ細胞の不死化が報告されている。本明細書で提供する種々の態様は、ＣＤ４０Ｌを同時に形質導入することが、Ｂ細胞のＣＤ４０受容体に刺激を与えるための実現可能な戦略であり、そして、ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞との共培養（クワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２００８）および／または三量体化ＣＤ４０Ｌ組み換えタンパク質による刺激（ラポワンツ（Ｌａｐｏｉｎｔｅ）ら、米国癌学会誌（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）、２００３）にとって変わる可能性があることを初めて実証するものである。ここで示した解決策は、他のいかなる外因性ＣＤ４０Ｌ刺激（例えばＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞による刺激）をも補う必要がなく、さらにはＢ細胞によるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ提示を高めるものであることから、産業上の応用に好ましい。
レトロウイルスを介した形質導入によって達成される抗原の安定した発現にはいくつかの利点がある。長期に渡る安定した抗原発現を基盤とすることで、最初に少数のＢ細胞を改変し、その後、その細胞集団を細胞が十分な数になるまで増殖させることが可能になるため、多数のＡＰＣに抗原を負荷する必要がない。後者の手法は、技術的により取り扱いが難しく（つまり、より多くの細胞に負荷しなければならないため、より多くの抗原が必要とされる）、産業上の応用への障害となる。さらに重要なことに、この方法ではＡＰＣ集団における抗原の発現レベルが不均一になり、それがＴＣＲ探索の感度に悪影響を与える恐れもある。さらに、抗原をコードしている導入遺伝子を安定して発現させることにより、他の抗原化合物を使うことでは不可能（ペプチドおよびタンパク質）または困難（ｍＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド）な、抗原を発現しているＢ細胞の検出および選抜が容易になることも注目に値する。
いくつかの態様では、ＴＣＲの探索により、腫瘍細胞内で提示される変異型タンパク質に対する特異性をもつＴ細胞受容体遺伝子を同定することができる。新生抗原の大部分は、タンパク質配列内での一アミノ酸変異を引き起こす非同義点変異によって形成される。変異型タンパク質配列は２５アミノ酸長のポリペプチド（変異したアミノ酸残基の上流および下流に１２ずつのアミノ酸を含む）としてミニ遺伝子にコードされ、１２のミニ遺伝子を組み合わせて直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）構築物とする。いくつかの態様では、ＴＭＧ形式の抗原を送達することができる。当業者であれば、ＴＭＧ形式においては、１２以外の数のミニ遺伝子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４０より多い数のミニ遺伝子が使用可能であることが認識できる。いくつかの態様では、ＴＣＲの探索は、別の読み取り枠または患者間で共通している新生抗原（例えばＫＲＡＳ、ｐ５３、ＰＩ３Ｋの変異や他のドライバー変異）を含むがこれらには限定されない、特定の型の新生抗原について重点的に取り組まれ得る。いくつかの態様では、ＴＣＲの探索は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、メルケル細胞およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を含むがこれらには限定されない、がんで生じるウイルス性抗原について重点的に取り組まれ得る。いくつかの態様では、ＴＣＲの探索はヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）について重点的に取り組まれ得る。いくつかの態様では、ＴＣＲの探索は共通腫瘍抗原について重点的に取り組まれ得る。いくつかの態様では、本明細書で提供する過程において発見されたＴ細胞またはＴＣＲは、細胞治療に用いられる。いくつかの態様では、細胞治療は自己患者ドナー細胞を使用するものである。いくつかの態様では、細胞治療は同種異系ドナー細胞を使用するものである。いくつかの態様において同種異系ドナー細胞は、健常ヒト提供者に由来する。いくつかの態様において同種異系ドナー細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、人工幹細胞またはその他の幹細胞に由来する。いくつかの態様では、遺伝子操作により、同種異系ドナー細胞の持続性または機能を改善する。いくつかの態様では、細胞治療とはＴＣＲ改変細胞治療である。
いくつかの態様では、抗原の安定した発現は、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞においても達成され得る。
ＴＭＧの代わりに、Ｂ細胞内での発現が操作可能になるように設計された他の任意の読み取り枠もまた用いることができる。例としては、単一のミニ遺伝子（前述したような）、任意の長さのポリペプチドおよび完全長タンパク質などがあげられる。
導入遺伝子をコードしている抗原は、安定的に導入遺伝子を組み込む他の方法によって送達することができ、このような方法には、ウイルスを介した（レトロウイルスを介した）遺伝子送達システムだけでなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、およびトランスポゾンに基づくベクターなどの非ウイルス性遺伝子送達法もある。いくつかの態様では、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して、導入遺伝子を付加することができる。
抗原は内在性の遺伝子座に部位特異的に組み込まれ、内在性プロモーターの制御下で規定の抗原発現レベルを達成する場合もある。
抗原は、抗原の発現レベルを制御するために、誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン調節プロモーター）の制御下で発現する場合もある。
以下に記載するのは、ＴＭＧ構築物の初代ヒトＢ細胞への安定的な形質導入を実証する初の報告であり、また、抗原のＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞への安定的な形質導入を示す初の報告である。いくつかの態様においてＴＭＧは、エレクトロポレーション、ウイルスを介した形質導入、トランスポゾン、ヌクレアーゼ介在性ＤＮＡ組み込みまたはＡＰＣへのプラスミドＤＮＡもしくは直鎖状ＤＮＡのトランスフェクションのいずれでもなく、他の何らかの過程によって送達される。いくつかの態様においてＴＭＧは、ＡＰＣへのプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって送達される。いくつかの態様では、ＴＭＧは内在性プロモーターの制御下で発現する。
いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を使ってＣＤ４０Ｌを発現させることができる。いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子発現の域を超えた別の態様を提供する。これらには、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＡＰの遺伝的ノックアウトを利用することで、改変Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩ抗原提示が抑制できること；ＣＩＩＴＡおよび／またはＣＤ７４（ＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖）の遺伝的ノックアウトを利用することで、改変Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ抗原提示が抑制できること；特異的なＨＬＡアレルの遺伝的ノックアウトを利用することで、ＴＣＲ探索を特定のＨＬＡアレルに方向付けられること；およびＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＰＤ－Ｌ１を含むがこれらには限定されない共刺激分子をノックアウトするか、または過剰発現させるかのいずれかによって、Ｂ細胞によるＴ細胞活性化の閾値を制御できること；が含まれる。
前段で概略したような所望の遺伝的ノックアウトはいずれも、Ｂ細胞を改変するのに用いられる任意の導入遺伝子（ＢＣＬ－６；ＢＣＬ－ＸＬ；抗原；ＣＤ４０Ｌ）を標的遺伝子座に部位特異的に組み込むことによって達成することができる。ただし、選択した標的遺伝子座の両アレル編集が非常に効率的であることを条件とする。
ペプチドの構成
いくつかの態様では、細胞に核酸が送達されるのではなく、ペプチドがその代わりに（またはそれに加えて）送達され得る。本明細書のいくつかの態様では、Ｔ細胞エピトープのポリペプチドをエレクトロポレーションで導入することを介した、不死化Ｂ細胞による効率的なＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原提示のための方法を提供する。いくつかの態様では、核酸を細胞に付加することで抗原を付加する代わりに、エレクトロポレーションを介してポリペプチドの形で抗原を付加することができる。ペプチドは、Ｔ細胞エピトープの一部であり得る。
いくつかの態様では、エレクトロポレーションにロンザ（Ｌｏｎｚａ）社のヌクレオファクター（Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ）４Ｄエレクトロポレーション装置を利用する。いくつかの態様では、この装置を使用する際にＤＮ１００プログラムを選択する。
いくつかの態様において本本法は、不死化Ｂ細胞に送達され、それぞれがＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される、最小ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープまたはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの一部として、均一な長さ（例えば２５ｍｅｒ）の長い（例えば、１４～２５）ポリペプチドを伴う。いくつかの態様では、細胞上のＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子による提示は、抗原特異的Ｔ細胞を使って細胞を探索することで測定することができる。抗原特異的Ｔ細胞を活性化するのに十分な量の目的のＴ細胞エピトープが細胞によって提示された場合、Ｔ細胞活性化マーカーを評価することができ、マーカーは対照条件と比較して上昇する。いくつかの態様においてＴ細胞活性化マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ１７およびＧＭ－ＣＳＦを含むがこれらには限定されない。いくつかの態様では、細胞上のＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子による提示は、質量分析によって測定することができる。いくつかの態様において抗原の大きさは、適切に処理された後に、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方に結合するのに十分な長さである。クラスＩペプチドは通常９～１１ｍｅｒであり；クラスＩＩペプチドは１４～２５ｍｅｒである。いくつかの態様においてこれらのペプチドは１２ｍｅｒより長くてもよく、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍｅｒ以上の長さであってよい。いくつかの態様では、クラスＩペプチドは従来９～１１であり、クラスＩＩは１４～２５である。本明細書で提供するように、本システムでは、より長い配列（例えば１２またはそれ以上）が用いられる。
いくつかの態様では、Ｔ細胞エピトープおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の探索および特徴分析に関する研究（以降、ＴＣＲ探索とする）において利用する目的で、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの抗原提示経路を介して効率的に提示させるために、推定Ｔ細胞エピトープをコードしているポリペプチドを不死化Ｂ細胞へ送達するための方法を提供する。
いくつかの態様においてこの技術は、個別の患者ごとの、生育不能な腫瘍生検に由来する、新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子の同定に利用できる。患者の腫瘍生検に由来するＤＮＡおよびＲＮＡを使ってターゲットゲノムシーケンシングを行い、バルクＴＣＲとミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）配列情報の両方を得ることができる。いくつかの態様には、腫瘍組織から単離したＤＮＡまたはＲＮＡのバルクＴＣＲ鎖シーケンシングによって同定された腫瘍由来ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のコンビナトリアルアセンブリーにより、ＴＣＲライブラリーを生成することが含まれる。ＴＣＲαとβの対は、およそ１．８ｋｂの導入遺伝子としてコードされ、レポーターＴ細胞に導入される。並行して、患者から少量（例えば１０ｍＬ）の末梢血試料を採取し、不死化Ｂ細胞を生成する。腫瘍ミュータノーム配列情報を使って新生抗原遺伝子のライブラリーを合成し、これを不死化Ｂ細胞に導入することによって、個別化された新生抗原提示Ｂ細胞を生成する。抗原を発現している細胞で刺激することによって、ＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌを含むがこれらには限定されないＴ細胞活性化マーカーの発現に基づく遺伝子バリアントライブラリーのスクリーニングで、抗原応答性ＴＣＲαβの組み合わせを発現しているレポーターＴ細胞を選抜することができる。コンビナトリアルアセンブリーであることを考慮すると、ＴＣＲαとＴＣＲβ両方の可変配列を決定することによってのみ、各ＴＣＲバリアントを明確に同定することができる。従って、遺伝子スクリーニングの過程で単離したレポーター細胞内にコードされている導入遺伝子を、およそ１．５ｋｂのＰＣＲ増幅産物として回収し、オックスフォード・ナノポア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）シーケンシング（または他の何らかの適したシーケンシング手段）を使ってその全長配列を決定し、そして生物情報学（バイオインフォマティクス）を使って分析する。この過程から新生抗原に特異的なＴＣＲのリードが同定され、これをさらに、がん治療での使用可能性について評価することができる。いくつかの態様では、本明細書で示すＡＰＣを使って、非コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングを行うことができる。
いくつかの態様においてさらなる評価には、安全性を確保し、治療効果を最適化するために、ＴＣＲおよび抗原の特徴分析を行う過程が伴われ得る。実験室において、同定した新生抗原特異的ＴＣＲのリードを発現するよう改変したＴ細胞と、自己不死化Ｂ細胞を発現している抗原との共培養を伴う免疫測定を行い、必要に応じて、以下にあげる事柄の１つ以上に関する情報を得る。１）変異特異性－変異型抗原の特異的認識によって示される、２）ＨＬＡ拘束性－ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ拘束性を決定する、３）ＴＣＲ感受性－ペプチド滴定および／または抗原を規定のレベルで発現している標的細胞の認識によって評価される、４）オフターゲット活性がないこと－自己Ｂ細胞および野生型（非変異型）抗原を発現するよう改変された自己Ｂ細胞に対して反応しないことによって示される。
完全に個別化された新生抗原特異的ＴＣＲ療法の設定でＴＣＲおよび抗原の特徴分析を行うために、多種多様な抗原形式および様々な型の抗原送達システムを用いることができる。ポリペプチドがハイスループットの様式で産生可能なことと、ポリペプチドが産業への応用に適していることから、抗原をポリペプチドの形でＡＰＣに送達することが有効である。ＡＰＣを様々な長さのポリペプチドと共インキュベートすると、ＡＰＣによる抗原提示が起こる。ペプチドの長さに依存して、好ましくは、ＭＨＣクラスＩ（およそ９～１１アミノ酸）提示経路またはＭＨＣクラスＩＩ（およそ１４～２５アミノ酸）提示経路による提示が起こる。より短い（９～１１アミノ酸）ペプチドは通常ＭＨＣクラスＩＩの分子には結合せず、また、より長いペプチド（１４以上のアミノ酸）が必ずしもＭＨＣクラスＩ提示経路によって正確に処理され、提示されるとは限らない点に注意が必要である。従って、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲとＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの両方による抗原認識を評価する目的でＡＰＣを均一な長さ（例えば２５ｍｅｒ）のポリペプチドと共インキュベートすることは、従来、信頼性の高い方法ではなかった。
いくつかの態様では、ＫＲＡＳ、ｐ５３およびＰＩ３Ｋを含むがこれらには限定されない腫瘍抑制因子およびがん遺伝子の変異型タンパク質に特異的なＴＣＲの活性化、増殖および／または特徴分析を行うために、本明細書で提供する態様を用いることができる。一般的な一アミノ酸変異を含有するポリペプチドをエレクトロポレーションによってＡＰＣに導入し、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ経路の両方を介して抗原を発現させる。抗原を発現しているＡＰＣを使用して、変異特異的Ｔ細胞またはＴＣＲの活性化、増殖および／または特徴分析を行う。いくつかの態様では、Ｔ細胞は腫瘍病変に由来する。いくつかの態様では、Ｔ細胞は末梢血に由来する。いくつかの態様では、ＴＣＲを発現しているＴ細胞はＴＣＲライブラリーから得られる。いくつかの態様ではこの技術を使って、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ拘束性ＴＣＲまたは両方に拘束されたＴＣＲ混合物いずれかの活性化、増殖および／または特徴分析を行うことができる。いくつかの態様において方法は、均一な長さのポリペプチドを利用した、ＡＰＣへの抗原送達方法である。この方法によって、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ経路を介した推定Ｔ細胞ペプチドエピトープの効率的な処理と提示がもたらされるため、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ両方の特徴分析が可能になる。このことは、ＴＣＲライブラリーの機能的遺伝子スクリーニングで同定された新生抗原特異的ＴＣＲの特徴分析にも用いることができる。いくつかの態様では、ペプチドの長さは１０ｍｅｒより長くても、１０～１４、１４～２５、または２５ｍｅｒを超える長さであってもよい。
本開示以前には、（ｉ）より長いペプチドがエレクトロポレーション後に正確に処理され、ＭＨＣクラスＩに提示されること、および（ｉｉ）より長いペプチドがエレクトロポレーション後にＭＨＣクラスＩＩに提示されることは確立されていなかった（通常それらは外から負荷され、細胞内で発現させる場合には特定の標的配列（ＴＭＧで使用するＬＡＭＰ－１配列を参照）が必要となる）。
いくつかの態様では、利用するペプチドの量は、２０μｇ／ｍＬ～１ｐｇ／ｍＬなど、または例えば１００μＭ～１ｎＭなどの、いかなる機能量であってもよい。いくつかの態様においてこの量は、ＭＨＣクラスＩに対しては０．２５ｎｇ／ｍＬ以上であり得る。いくつかの態様においてこの量は、ＭＨＣＩＩに対しては１０ｎｇ／ｍＬであっても、例えば、５０、１００、１５０、１６０、２００、ｎｇ／ｍＬ以上のペプチドであってもよい。
これまでの手法では、正確な拘束要素が分かっていない場合、一連の短いペプチド（クラスＩ用；正確な９～１１ｍｅｒが分からない場合があるため、一連の重複したペプチドを作製する）とより長いペプチド（クラスＩＩ用）の両方について試験を行わなければならなかった。しかしながら、本明細書で示すいくつかの態様を用いれば、単一の２５ｍｅｒを使用し、クラスＩおよびクラスＩＩの両方を対象とすることが可能である。従っていくつかの態様では、単一の抗原配列を用いることができる。このことは、本明細書で提供する態様のいずれにも適用可能である。
いくつかの態様では、フレームシフト変異がある場合（例えば、１３～３００アミノ酸）、２５ｍｅｒは、２５より長くなってもまたは２５より短くなってもよい。いくつかの態様では、Ｔ細胞へ抗原を提示するために最適化した細胞を提供する。最適化には、それ自体が推定Ｔ細胞抗原であるかまたは推定Ｔ細胞抗原を含む均一な長さのポリペプチドを、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの抗原処理および提示経路を介してポリペプチド由来の推定Ｔ細胞ペプチドエピトープを効率的に処理および提示することを可能にするエレクトロポレーションを介して、送達することが含まれ得る。いくつかの態様では（例えばフレームシフト変異の態様では）、抗原を決定するために、複数の、重複した均一な長さ（例えば２５アミノ酸）のペプチドをエレクトロポレーションに用いることができる。
いくつかの態様では、均一な長さのポリペプチドを不死化初代ヒトＢ細胞へ送達する方法を提供する。ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原処理および提示経路を介してポリペプチド由来の推定Ｔ細胞ペプチドエピトープを効率的に処理および提示することを可能にし、それによってＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの特徴分析を可能にするエレクトロポレーションを介して、送達することができる。いくつかの態様では、均一な長さのポリペプチドを、樹状細胞、単球およびマクロファージを含むがこれらには限定されない他のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞に送達する方法を提供する。いくつかの態様では、均一な長さのポリペプチドを腫瘍細胞または細胞株に送達する方法を提供する。
いくつかの態様では、腫瘍生検から新生抗原ＴＣＲを単離する過程の一環で同定された新生抗原特異的ＴＣＲの特徴分析に、この過程を用いることができる。このことには例えば、治療への応用において、固形癌を治療するための完全に個別化された新生抗原特異的改変ＴＣＲ療法を開発することが含まれ得る。このことは、個別の患者ごとに、腫瘍生検から新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を同定することを可能にする、腫瘍由来ＴＣＲライブラリーの機能的遺伝子スクリーニングを利用する過程において実施され得る。それらを同定した後、新生抗原特異的ＴＣＲのリードをがん治療での使用可能性についてさらに評価することができる。
いくつかの態様において評価には、安全性を確保し、治療効果を最適化するために、ＴＣＲおよび抗原の特徴分析を行う過程が伴われる。実験室において、同定した新生抗原特異的ＴＣＲのリードを発現するよう操作したＴ細胞と、自己不死化Ｂ細胞を発現している抗原との共培養を伴う免疫測定を行い、以下にあげる事柄の１つ以上に関する情報を得ることができる。１）変異特異性－変異型抗原の特異的認識によって示される、２）ＨＬＡ拘束性－ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ拘束性を決定する、３）ＴＣＲ感受性－ペプチド滴定および／または抗原を規定のレベルで発現している標的細胞の認識によって評価される、４）オフターゲット活性がないこと－自己Ｂ細胞および野生型（非変異型）抗原を発現するよう改変された自己Ｂ細胞に対して反応しないことによって示される。
いくつかの態様では、抗原を不死化Ｂ細胞（例えば、レトロウイルス性遺伝子導入を介したＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬの過剰発現によって、細胞を不死化させる）へ送達する。いくつかの態様では、均一な長さ（例えば２５ｍｅｒ）のポリペプチドの存在下で不死化Ｂ細胞にエレクトロポレーションを行うことで、ポリペプチドによってコードされている推定Ｔ細胞ペプチドエピトープが、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの抗原処理および提示経路を介して効率的に処理および提示される。このことによって、その後の、同定した新生抗原特異的ＴＣＲのリードを発現するよう操作したＴ細胞と、エレクトロポレーションによってポリペプチド抗原を導入した自己不死化Ｂ細胞との共培養を伴う免疫測定において、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲリードとＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲリード両方の特徴分析を行うことが可能になる。
いくつかの態様では、末梢血から単離したＴＣＲの特徴分析にこの過程を用いることができる。このことには例えば、治療への応用において、固形癌を治療するための完全に個別化された新生抗原特異的改変ＴＣＲ療法を開発することが含まれ得る。このことは、個別の患者ごとに、患者の血液から新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を同定することを可能にする、血液由来ＴＣＲライブラリーの機能的遺伝子スクリーニングを利用する過程において実施され得る。それらを同定した後、新生抗原特異的ＴＣＲのリードをがん治療での使用可能性についてさらに評価することができる。
いくつかの態様では、合成ＴＣＲライブラリーから単離したＴＣＲの特徴分析にこの過程を用いることができる。このことには例えば、ＴＣＲライブラリーを合成すること、および所望の抗原特異性を有するＴＣＲについてこのライブラリーをスクリーニングすることが含まれ得る。いくつかの態様では、所望のＴＣＲは腫瘍新生抗原に特異的である。いくつかの態様では、所望のＴＣＲはウイルス性抗原に特異的である。いくつかの態様では、所望のＴＣＲは共通腫瘍抗原に特異的である。それらを同定した後、ＴＣＲのリードをがん治療での使用可能性についてさらに評価することができる。
いくつかの態様では、抗原を均一な長さのポリペプチドの形で、エレクトロポレーションによって導入することには１つ以上の利点がある。第一に、ポリペプチドはハイスループットの様式で迅速に産生可能であり、産業への応用にも適していることが挙げられる。第二に、ＡＰＣへのポリペプチド抗原の送達手段としての共インキュベートとは対照的に、エレクトロポレーションでは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲとＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの両方による抗原認識を評価するために、均一な長さ（例えば２５ｍｅｒ）のポリペプチドを使うことが可能である。第三に、様々な濃度の均一な長さのポリペプチドをエレクトロポレーションによってＡＰＣに導入することで達成される、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの経路を介した推定Ｔ細胞エピトープの効率的な処理および提示では、先に免疫測定でクラス拘束性と最小Ｔ細胞エピトープを決定する必要なしに、ＴＣＲリードの感受性を評価することができるため、ＴＣＲ療法の個別化された性質によく適しており、また、ＴＣＲや抗原の特徴分析過程を完了するための工程が短く済む場合が多い。第四に、エレクトロポレーションによって達成される、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ経路を介した推定Ｔ細胞エピトープの効率的な処理および提示によって、多数のペプチドを迅速に評価することが可能になる。いくつかの態様では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００および１００００のペプチドを評価する。いくつかの態様では、新生抗原セットの全てを評価する。いくつかの態様では、抗原セットの１００％以下を、例えば、全新生抗原セットの９９．９、９９、９８、９７、９６、９５、９０、８０、７０、６０、５０％またはそれ以下を評価する。
いくつかの態様では、均一な長さのポリペプチドをエレクトロポレーションで導入することによる、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩを介した推定Ｔ細胞エピトープの効率的な処理および提示は、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞においても達成することができる。
いくつかの態様では、ＡＰＣとしてＢ細胞の代わりに、他の型のＡＰＣ、例えば、樹状細胞、マクロファージ、または人工ＡＰＣ（例えば、関連したＨＬＡアレルを発現するように改変したＫ５６２細胞）を用いることができる。
いくつかの態様では、ＡＰＣへのエレクトロポレーションに未精製のペプチドを用いることには、以下に挙げる利点のうちの１つ以上がある。１）費用を抑えられる可能性がある；２）未精製のペプチドは精製されていないので、必然的に、様々な長さのペプチドを含むことになる。例えば、２５ｍｅｒを合成すると、９、１０、１１ｍｅｒまたはそれ以上の長さのペプチドが混在する。このようなより短いペプチドが正しいＴ細胞エピトープを含み、いかなる処理も必要とせずに直接ＭＨＣに結合する可能性があるため、このことによって提示が増強される。いくつかの態様では、非均一な長さのポリペプチド（例えば未精製のペプチド抽出物）をエレクトロポレーションによって導入することを介した、ＡＰＣ（例えば不死化Ｂ細胞やＤＣ）による推定Ｔ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ上での効率的な処理および提示を用いることができる。
いくつかの態様において過程には、ＡＰＣ（例えば、初代ヒト不死化Ｂ細胞）に均一な長さのポリペプチドをエレクトロポレーションによって送達することが伴われ、ここでこの送達は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの抗原処理および提示経路を介して、ポリペプチドによってコードされている推定Ｔ細胞ペプチドエピトープの高効率での処理および提示を達成するための手段として用いられる。
いくつかの態様では、この過程によって、単一の抗原形式とＡＰＣへの抗原送達方法を用いて、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲとＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ両方の特徴分析を行うことが可能になる。
いくつかの態様において過程には、ＡＰＣ（例えば初代ヒト不死化Ｂ細胞）に均一な長さのポリペプチドをエレクトロポレーションによって送達することが含まれ、ここでこの送達は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの抗原処理および提示経路を介した、ポリペプチドによってコードされる推定Ｔ細胞ペプチドエピトープの高効率での処理および提示を達成する手段として用いられる。ＴＣＲの特徴分析の文脈において適用される場合、この手段はいくつかの態様において以下に挙げる利点のうちの１つ以上をもたらす。１）この方法では、均一な長さ（例えば２５ｍｅｒ）のポリペプチドを使って、ＴＣＲのクラス拘束性に関する知見がない状態でＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲのうちの片方または両方による抗原認識を評価することが可能になる。いくつかの態様では、例えば、同じ抗原に対して特異的なＴＣＲのセットを試験した時に一部がクラスＩで一部がクラスＩＩである場合などの、どちらが適用されるか分からない場合には両方を適用する。２）この方法では、様々な濃度の均一な長さのポリペプチドをエレクトロポレーションによってＡＰＣに導入することで達成される、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの経路を介した推定Ｔ細胞エピトープの効率的な処理および提示により、先に免疫測定で最小Ｔ細胞エピトープを決定する必要なしに、ＴＣＲリードの感受性を評価することが可能になる。いくつかの態様において様々な濃度は、滴定用の１０段階希釈で、１μＭから１００ｐＭであってよい。いくつかの態様では、１０ｎＭ（クラスＩ）または１００ｎＭ（クラスＩＩ）からシグナルが認められる。いくつかの態様では、このことはＢｃｌ－６／ｘＬＢ細胞においてさらに顕著である。３）ポリペプチドはハイスループットの様式で迅速に産生可能であり、産業への応用にも適している。
いくつかの態様において過程は、様々なプラットフォームを使った、個別の患者ごとのハイスループットなＴＣＲ探索の一環であり得る。ＴＣＲのリードを同定した後、それらをさらに、安全性を確保し、治療効果を最適化するためにＴＣＲおよび抗原の特徴分析を行う過程において評価する。実験室において、同定した新生抗原特異的ＴＣＲのリードを発現するよう操作したＴ細胞と、自己不死化Ｂ細胞を発現している抗原との共培養を伴う免疫測定を行い、以下にあげる事柄の１つ以上に関する情報を得ることができる。１）変異特異性－変異型抗原の特異的認識によって示される、２）ＨＬＡ拘束性－ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ拘束性を決定する、３）ＴＣＲ感受性－ペプチド滴定および／または抗原を規定のレベルで発現している標的細胞の認識によって評価される、４）オフターゲット活性がないこと－自己Ｂ細胞および野生型（非変異型）抗原を発現するよう改変された自己Ｂ細胞に対して反応しないことによって示される。
いくつかの態様では、この過程により、単一の抗原形式、均一な長さ（例えば２５ｍｅｒ）のポリペプチド、を、単一の抗原送達手段（エレクトロポレーション）と組み合わせて、完全に個別化されたＴＣＲ療法プラットフォーム用に安全で効果的なＴＣＲを選抜するのに必要な全てのＴＣＲと抗原の特徴分析アッセイに使用可能な、抗原を発現している自己Ｂ細胞を生成することができる。いくつかの態様においてこのことは、ＴＣＲ療法の個別化された性質や、ＴＣＲおよび抗原の特徴分析過程を完了するために必要な短い工程に特によく適している。
一方、現在Ｔ細胞／ＴＣＲの特徴分析に用いられている抗原形式と抗原送達技術の組み合わせでは、完全に個別化されたＴＣＲ療法用に安全で効果的なＴＣＲを選抜するために特徴分析が必要とされる全てのＴＣＲ／抗原を、抗原形式と抗原送達システムの単一の組み合わせによって送達することができないため、より時間がかかる可能性がある。いくつかの態様では、本明細書で提供するペプチドの態様に関して、過程には１日の共培養と１日の読み出しが含まれ得る。いくつかの態様では、本明細書で提供するＤＮＡ構築物に関して、過程には１週間のトランスフェクションと形質導入と４日間の選抜と細胞の増殖と１日の共培養と１日の読み出しが含まれ得る。
いくつかの態様において過程には、治療（例えばがんの）に用いられるＴＣＲ配列の特徴分析を行うこと（例えばＴＣＲ特異性の確認、ＨＬＡ拘束性のマッピングまたはＴＣＲ感受性の評価）が伴われる。いくつかの態様において過程には、治療（例えばがんの）に用いられる規定された機能特性（例えば特定の抗原を認識する）を有するＴＣＲ配列を、ＴＣＲバリアントの膨大なコレクションから同定することが伴われる。いくつかの態様において過程は、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの両方を用いることを目的とした、完全に個別化されたＴＣＲの探索に特に適している。単一の抗原形式と抗原送達システムによって、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ両方に関するＴＣＲ／抗原の特徴分析が可能だとすれば、個別化された／専用のＴＣＲ療法に特によく適していると言える。いくつかの態様では、ＴＣＲおよび抗原の特徴分析過程を完了させるために工程を特に短縮することが可能である。例えば、形質導入と抗原を発現しているＡＰＣの選抜におよそ１０日間かけていたところを、この過程では９０％短縮し、最短１日で完了させることができる。ＴＣＲ／抗原の特徴分析過程はＴＣＲ探索過程の中でも重要なステップであるため、合理化された迅速なＴＣＲ／抗原の特徴分析過程はＴＣＲの探索と特徴分析にとって有用であり得る。
いくつかの態様では過程を、全ての治療分野での、腫瘍学の他にも例えば自己免疫や感染症の分野でのＴＣＲ探索に適用できる。いくつかの態様において過程は、患者由来の抗原特異的Ｔ細胞を治療用に増殖させることに有用であり得る。例としては、新生抗原を提示しているＡＰＣ、例えば樹状細胞との共培養によって腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増殖させること、または新生抗原を提示しているＡＰＣとの共培養によって血液由来Ｔ細胞を増殖させることがあげられる。これらの手法は、Ｔ細胞を活性化してそれらが増殖可能になるように、目的の抗原を発現するよう改変した自己抗原を提示している細胞を使用することに基づいている。
いくつかの態様では、本明細書で開示のＡＰＣまたはＡＰＣを伴う方法、あるいは他の関連した態様はいずれも、２０２１年２月１１日に公開の米国特許出願公開第２０２１／００４０５５８号で提供されている任意の方法または組成物の対応するＡＰＣ関連組成物もしくは方法または抗原スクリーニングなどに適用することが可能である。すなわち、米国特許出願公開第２０２１／００４０５５８号に記載のＡＰＣに関する１つ以上の側面では、本明細書で提供する任意の態様を利用することができる。２０２１年２月１１日に公開の米国特許出願公開第２０２１／００４０５５８号は、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられ、さらに、ＡＰＣや抗原提示を伴う態様を含むものである。
本明細書で使用する場合、Ｂ細胞上のＣＤ４０受容体を刺激することはＣＤ４０Ｌに基づく刺激を含む場合があり、このような刺激はＣＤ４０Ｌ刺激と呼ばれ得る。
アレンジメント
いくつかの態様では、以下に記載するアレンジメントまたはその下位区分はいずれも、本明細書で提供する態様の一部とすることもまたは本明細書で提供する態様と組み合わせることもできる。アレンジメントには以下の通り、１～１０７の番号が付与されている。
１．Ｔ細胞へ抗原を提示するために細胞を改変する方法であって、
細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；
該細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；および
該細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、該細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；を含む、方法。
２．該細胞が初代ヒトＢ細胞を含み、必要に応じて該初代ヒトＢ細胞が、該Ｔ細胞に関して、または該Ｔ細胞によって提示されるＴＣＲに関して自己である、アレンジメント１に記載の方法。
３．該初代ヒトＢ細胞が末梢血に由来する、アレンジメント２に記載の方法。
４．該初代ヒトＢ細胞が、Ｂ細胞を含有しているヒト組織に由来する、アレンジメント２に記載の方法。
５．該ヒト組織が、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む、アレンジメント４に記載の方法。
６．該初代ヒトＢ細胞が、前駆細胞の分化によって得られる、アレンジメント２に記載の方法。
７．該前駆細胞が造血幹細胞を含む、アレンジメント６に記載の方法。
８．該初代ヒトＢ細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる、アレンジメント２に記載の方法。
９．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞と共培養することを含む、アレンジメント１に記載の方法。
１０．該細胞を、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む、アレンジメント９に記載の方法。
１１．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント１または１０に記載の方法。
１２．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞にＥＢＶを感染させることを含む、アレンジメント１に記載の方法。
１３．該細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、アレンジメント１０、１１、または１２に記載の方法。
１４．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント１に記載の方法。
１５．該ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子が、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい、アレンジメント１４に記載の方法。
１６．該遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫（ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して該細胞に導入される、アレンジメント１１、１３または１４に記載の方法。
１７．該細胞の生存延長が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、アレンジメント１に記載の方法。
１８．該少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている、アレンジメント１に記載の方法。
１９．各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント１８に記載の方法。
２０．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で発現する、アレンジメント１に記載の方法。
２１．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞で一過的に発現する、アレンジメント１に記載の方法。
２２．改変細胞であって、
インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；
少なくとも１つの抗原化合物とインキュベートされている；および
細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有している；改変細胞。
２３．インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、該細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント２２に記載の改変細胞。
２４．インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、該細胞にＥＢＶを感染させることを含む、アレンジメント２２に記載の改変細胞。
２５．該細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、アレンジメント２３または２４に記載の改変細胞。
２６．該遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して該細胞に導入される、アレンジメント２３または２５に記載の改変細胞。
２７．該細胞の生存が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、アレンジメント２２に記載の改変細胞。
２８．該少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている、アレンジメント２２に記載の改変細胞。
２９．各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント２８に記載の改変細胞。
３０．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で安定して発現する、アレンジメント２２に記載の改変細胞。
３１．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で一過的に発現する、アレンジメント２２に記載の改変細胞。
３２．改変細胞であって、
生存因子を発現させるためのヌクレオチド配列；
抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を発現させるためのヌクレオチド配列；および
ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列；を含む、改変細胞。
３３．該生存因子がＢＣＬ－６および／またはＢＣＬ－ＸＬを含む、アレンジメント３２に記載の改変細胞。
３４．抗原をコードしている該少なくとも１つの導入遺伝子が、１から４０のポリペプチドをコードしている、アレンジメント３２に記載の改変細胞。
３５．各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント３４に記載の改変細胞。
３６．ＣＤ４０Ｌを発現させるための該ヌクレオチド配列が、ＣＤ４０Ｌを安定して発現させる遺伝子を含む、アレンジメント３２に記載の改変細胞
３７．Ｔ細胞へ抗原を提示する初代ヒトＢ細胞であって、
ＢＣＬ－６およびＢＣＬ－ＸＬを安定して発現させるヌクレオチド配列；
１から４０のポリペプチドを安定して発現させるヌクレオチド配列であって、ここで各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸をコードしており、かつ、各ポリペプチドが抗原であるヌクレオチド配列；および
ＣＤ４０Ｌを安定して発現させるヌクレオチド配列；を含む、初代ヒトＢ細胞。
３８．抗原提示の方法であって、
細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；
該細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；および
該細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、該細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；を含む、方法。
３９．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞と共培養することを含む、アレンジメント３８に記載の方法。
４０．該細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む、アレンジメント３９に記載の方法。
４１．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント３８に記載の方法。
４２．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞にＥＢＶを感染させることを含む、アレンジメント３８に記載の方法。
４３．該細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、アレンジメント４１または４２の方法。
４４．ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、またはＣＤ４０Ｌ遺伝子を、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫（ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して該細胞に導入する、アレンジメント４３に記載の方法。
４５．該細胞の生存延長が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、アレンジメント３８に記載の方法。
４６．該少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている、アレンジメント３８に記載の方法。
４７．各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント４６に記載の方法。
４８．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で安定して発現する、アレンジメント３８に記載の方法。
４９．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で一過的に発現する、アレンジメント３８に記載の方法。
５０．アレンジメント２２から３７のいずれか１項に記載の改変細胞と培地とを含む、培養用混合物。
５１．該抗原化合物が、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから継続して発現する、アレンジメント２０に記載の方法。
５２．発現が有効レベルにある、アレンジメント２０に記載の方法。
５３．該抗原が、１回導入され、その後該細胞を増やすことができ、そして、該抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために複数回使用される、アレンジメント２０に記載の方法。
５４．ＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１がＢＣＬ－ｘＬである、アレンジメント１から２１、３８から４９、５１から５３のいずれか１項に記載の方法。
５５．抗原を提示させるために細胞を改変する方法であって、
細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；
該細胞を少なくとも１つの抗原化合物と、該細胞の表面に抗原を提示させるのに十分な期間インキュベートすること；および
該細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、該細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；を含む、方法。
５６．該細胞が初代ヒトＢ細胞を含む、アレンジメント５５に記載の方法。
５７．該初代ヒトＢ細胞が末梢血に由来する、アレンジメント５６に記載の方法。
５８．該初代ヒトＢ細胞がＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する、アレンジメント５６に記載の方法。
５９．該ヒト組織が、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む、アレンジメント５８に記載の方法。
６０．該初代ヒトＢ細胞が、前駆細胞の分化によって得られる、アレンジメント５６に記載の方法。
６１．該前駆細胞が造血幹細胞を含む、アレンジメント６０に記載の方法。
６２．該初代ヒトＢ細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる、アレンジメント５６に記載の方法。
６３．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞と共培養することを含む、アレンジメント５５から６２のいずれか１項に記載の方法。
６４．該細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む、アレンジメント６３に記載の方法。
６５．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント５５から６２もしくは６４または１０のいずれか１項に記載の方法。
６６．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞にＥＢＶを感染させることを含む、アレンジメント５５から６２のいずれか１項に記載の方法。
６７．該細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、アレンジメント６４、６５、または６６に記載の方法。
６８．該細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、該細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント５５から６２のいずれか１項に記載の方法。
６９．該ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子が、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい、アレンジメント６８に記載の方法。
７０．該遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して該細胞に導入される、アレンジメント６５、６７、または６８に記載の方法。
７１．該細胞の生存延長が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、アレンジメント５５から７０のいずれか１項に記載の方法。
７２．該少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている、アレンジメント５５から７１のいずれか１項に記載の方法。
７３．各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント７２に記載の方法。
７４．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で安定して発現する、アレンジメント５５から７３のいずれか１項に記載の方法。
７５．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で一過的に発現する、アレンジメント５５から７３のいずれか１項に記載の方法。
７６．該少なくとも１つの抗原化合物が、該細胞にエレクトロポレーションによって導入される、アレンジメント５５から７１のいずれか１項に記載の方法。
７７．各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント７６に記載の方法。
７８．該抗原化合物が８アミノ酸長から２５アミノ酸長のポリペプチドである、アレンジメント７７に記載の方法。
７９．該ポリペプチドが２５アミノ酸長である、アレンジメント７８に記載の方法。
８０．該抗原がＴ細胞へ提示される、アレンジメント５５から７９のいずれか１項に記載の方法。
８１．改変細胞であって、
インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；
少なくとも１つの抗原化合物がエレクトロポレーションによって導入されているか、または少なくとも１つの抗原化合物が発現するように改変されている；および
細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有している；改変細胞。
８２．インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、該細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、アレンジメント８１に記載の改変細胞。
８３．インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、該細胞にＥＢＶを感染させることを含む、アレンジメント８１に記載の改変細胞。
８４．該細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、アレンジメント８２または８３に記載の改変細胞。
８５．該遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して該細胞に導入される、アレンジメント８２または８４に記載の改変細胞。
８６．該細胞の生存が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、アレンジメント８１から８５のいずれか１項に記載の改変細胞。
８７．少なくとも１つの抗原化合物を発現するように改変されていることが、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を含み、ここで該ポリペプチドが該少なくとも１つの抗原化合物に対応している、アレンジメント８１から８６のいずれか１項に記載の改変細胞。
８８．各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、アレンジメント８７に記載の改変細胞。
８９．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で安定して発現する、アレンジメント８７に記載の改変細胞。
９０．該少なくとも１つの抗原化合物が該細胞内で一過的に発現する、アレンジメント８１に記載の改変細胞。
９１．該細胞にエレクトロポレーションによって導入されている該少なくとも１つの抗原化合物が、少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいるポリペプチドである、アレンジメント８１から９０のいずれか１項に記載の改変細胞。
９２．該ポリペプチドが８アミノ酸長から２５アミノ酸長である、アレンジメント９１に記載の改変細胞。
９３．該ポリペプチドが２５アミノ酸長である、アレンジメント９３に記載の改変細胞。
９４．該改変細胞が初代ヒトＢ細胞を含む、アレンジメント３２から３６または８１から９３のいずれか１項に記載の改変細胞。
９５．該初代ヒトＢ細胞が末梢血に由来する、アレンジメント９４に記載の改変細胞。
９６．該初代ヒトＢ細胞がＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する、アレンジメント９４に記載の改変細胞。
９７．該ヒト組織が、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む、アレンジメント９６に記載の改変細胞。
９８．該初代ヒトＢ細胞が、前駆細胞の分化によって得られる、アレンジメント９４に記載の改変細胞。
９９．該前駆細胞が造血幹細胞を含む、アレンジメント９８に記載の改変細胞。
１００．該初代ヒトＢ細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる、アレンジメント９４に記載の改変細胞。
１０１．アレンジメント８１から１００のいずれか１項に記載の改変細胞と培地とを含む、培養用混合物。
１０２．該抗原化合物が、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから継続して発現する、アレンジメント７４に記載の方法。
１０３．発現が有効レベルにある、アレンジメント７４、７５、または１０２に記載の方法。
１０４．該抗原が、１回導入され、その後該細胞を増やすことができ、そして、該抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために複数回使用される、アレンジメント７４、１０２、または１０３に記載の方法。
１０５．ＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１がＢＣＬ－ｘＬである、アレンジメント５５から８０または１０２から１０４のいずれか１項に記載の方法。
１０６．ＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１がＢＣＬ－ｘＬである、アレンジメント２２から３６または８１から１００のいずれか１項に記載の改変細胞。
１０７．抗原化合物がＴＣＲ抗原化合物である、アレンジメント１から３６、３８から４９、５１から１００、１０２から１０６のいずれか１項に記載の方法または改変細胞。
実施例１：初代ヒトＢ細胞をＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬまたはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって効率的に不死化させ、細胞数が多くなるまで急速に増殖させることができることの証明
実施例１では、様々な不死化方法を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）材料から単離した初代ヒトＢ細胞を不死化させ、そしてその後、短期間のうちにそのような不死化Ｂ細胞の数が多くなるまで増殖可能なことを示す。ＴＣＲの探索および特徴分析研究において抗原提示細胞として初代ヒトＢ細胞を用いることにはいくつかの利点があり得る。第一に、実施例１に記載するように、初代ヒトＢ細胞は細胞数が多くなるまで効率的に増殖させることができる。第二に、Ｂ細胞はＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ両方の抗原提示経路を介して抗原を処理する能力を有しており、本明細書の開示は、そのような抗原提示を達成し、改善するためのさらなる方法を説明するものである。第三に、自己の設定では、Ｂ細胞を用いることで対象の全てのヒト白血球アレル（ＨＬＡ）に対するＴ細胞とＴＣＲを効率的に探索することができる。
本実施例では、初代ヒトＢ細胞にＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬを安定的に形質導入すること、または初代ヒトＢ細胞にエプスタイン・バーウイルスを感染させることによる、効率的な不死化と増殖について説明する。実験についてのさらなる詳細は実施例１０でも提供する。
凍結保存しておいた健常提供者のＰＢＭＣから、当業者に知られている利用可能な磁気ビーズ細胞分離技術のうちの１つを用いてＢ細胞を単離する。本実施例では、モジョソート（ＭｏｊｏＳｏｒｔ）ヒト汎（Ｐａｎ）Ｂ細胞単離キット（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））を用い、製造業者の説明に従ってＢ細胞を単離する。簡単に説明すると、ＰＭＢＣをビオチンで標識したＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５に対する抗体とインキュベートする。インキュベートした後、ストレプトアビジンで標識した磁気ナノビーズを加える。２回目のインキュベーションの後、細胞の入ったチューブを磁石の中に入れると磁気標識された画分はチューブ側面に保持され、何とも結合していないＢ細胞が液体中に残り、これをその後の使用のためにチューブから吸い出すことができる（図５Ａ）。当業者であれば、初代ヒトＢ細胞を、例えばフローサイトメトリーソーティングのような別の単離方法、並びに陽性選抜のためにＢ細胞から直接発現させるマーカーなどの他の表現型マーカーのいずれかによっても単離可能であることを理解する。ただしこのような陽性選抜が、ＥＢＶ感染もしくはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬなどの不死化因子の導入を干渉することを含むがこれらには限定されない、単離したＢ細胞のその後の処理に影響しないことを前提とする。
ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子は胚中心Ｂ細胞で発現し、これらが分化せずに増殖することを可能にしている。クワッケンボスらは、これら２つの遺伝子を初代Ｂ細胞に導入することでＢ細胞を不死化させ、その後、これらの細胞をＩＬ－２１およびＣＤ４０Ｌの存在下で培養して細胞を刺激し、長期間増殖させる方法を報告している（クワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２０１０）。ＴＣ処理したプレートにヒトＣＤ４０Ｌ（ｈＣＤ４０Ｌ）発現性Ｌ細胞を少なくとも４時間播種することで単離したＢ細胞を活性化し、その後、Ｂ細胞を加える。マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ）にＣＤ４０Ｌ導入遺伝子をレトロウイルスを介して形質導入することによって、ＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞を生成する。フェニックス－エコ（Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ）産生細胞のトランスフェクションによってレトロウイルスを生成し、そしてこのウイルスをＬ細胞の形質導入に用いる。その後、ＦＡＣＳを使ったソーティングによってＣＤ４０Ｌ形質導入細胞を選別し、５０Ｇｙの放射線を照射する。通常、２０，０００から２００，０００個の単離したＢ細胞を放射線照射済みのｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上で、１：１～１：５の比率で培養する。Ｂ細胞を完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、５０ｎＭの２－メルカプトエタノール）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中、ｒｈ－ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下、密度０．１～０．２５ｅ６Ｂ細胞／ｍＬで培養する。
４８時間後に培地を、ｒｈ－ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）、ｒｈ－ＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した新しい完全Ｂ細胞培地に交換する。２４時間後、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬの安定的な形質導入により、活性化Ｂ細胞を不死化させる。初代Ｂ細胞へのレトロウイルスを介した形質導入に関する手順は文献（例えばクワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２０１０）や実施例１０に記載されており、また、当業者に公知である。レトロウイルスを介して形質導入したＢ細胞を、放射線照射済みのヒトＣＤ４０Ｌ形質導入支持細胞上で、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）存在下、２００，０００～２５０，０００細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で培養する。インビトロで初代ヒトＢ細胞を維持するためには、Ｂ細胞のＣＤ４０受容体を刺激することが必須である。ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ構築物は、不死化した自己Ｂ細胞でのＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬの発現を経時的にモニタリングする（図５Ｂ；図５Ｃ；図５Ｄ）のに使われるＧＦＰマーカーを含む。
知られている別の不死化方法（代替法として）にはＢ細胞へのＥＢＶ感染に基づく方法があり、この方法は文献、例えばトラジアイら、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、２０１２による文献に記載されている。前述したようにＢ細胞を単離し、２ｘＣｐＧ－ＯＤＮ２００６（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ）を添加した完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で培養し、トール様受容体を活性化する。１ｍＬのＥＢＶウイルス上清（ＡＴＣＣ）を使ってＥＢＶ感染を行い、細胞を３７℃で４時間インキュベートする。細胞を洗浄し、２ｘＣｐＧ－ＯＤＮ２００６（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ）と１％のＥＢＶウイルス上清を添加した完全Ｂ細胞培地に再懸濁する。およそ３日目と８日目に、細胞代謝に起因してｐＨが低くなり培地が黄色くなったら、細胞を洗浄し、ＣｐＧを含まない完全Ｂ細胞培地に再懸濁する。Ｂ細胞の凝集塊が現れて増殖が可視化できるようになったら細胞を洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび１％（ｖ／ｖ）Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。２または３日ごとに細胞を１：２の比率で分割し、４週間増殖させる（図５Ｅ）。このデータは、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬまたはＥＢＶによって初代ヒトＢ細胞を効率的に不死化し、その後細胞数が多くなるまで増殖させることができ、そして培地中で長期間維持できることを示している。
図５Ａ～５Ｅで提供する結果は、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬまたはＥＢＶによって初代ヒトＢ細胞を効率的に不死化させることが可能であることを示すもので、Ｂ細胞の単離、不死化および増殖ならびに成長動態に関する説明も含んでいる。この結果は、以下のように要約することができる。図５Ａは、ＰＢＭＣ材料からのＢ細胞の単離を示している。モジョソートの磁気ビーズに基づく細胞分離法を使って、健常提供者のＰＢＭＣからＢ細胞を単離した。汎Ｂ細胞ネガティブキットを使い、製造業者の手順に従って、何とも結合していないＢ細胞を単離した。ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２０に対する抗体を使って、単離したＢ細胞の純度を測定した。図５Ｂは、ＢＣＬ－６およびＢＣＬ－ＸＬの安定的な形質導入によるＢ細胞の不死化を表している。ウイルスを産生するために、これもＧＦＰ構築物をコードしているＢＣＬ－６-ＢＣＬ－ｘＬをフェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス上清を使って、５人の健常提供者に由来する活性化Ｂ細胞へのレトロウイルス性形質導入を行なった。ＧＦＰシグナルによってＢＣＬ－６－ＢＣＬ－ＸＬの発現を測定した。図５Ｃは、不死化Ｂ細胞の増殖を表している。５Ｂの細胞を、放射線照射済みｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上、ＩＬ－２１存在下（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）で培養し、１週間に２回、０．２ｅ６細胞／ｍＬの濃度で分割することによって増殖させた。フローサイトメーターを使い、ＧＦＰシグナルによってＢｃｌ－６－Ｂｃｌ－ｘＬの発現を測定した。図５Ｄは、不死化Ｂ細胞の増殖を表している。５Ｂの細胞を、放射線照射済みｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上、ＩＬ－２１存在下（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）で培養し、１週間に２回、０．２ｅ６細胞／ｍＬの濃度で分割することによって増殖させた。細胞を分割する過程で測定した細胞数に基づいて、累計細胞数を算出した。図５Ｅは、ＥＢＶ感染によるＢ細胞の不死化と増殖を表している。バイオレジェンドのモジョソートの磁気ビーズに基づく細胞分離法を使って、健常提供者ＰＢＭＣから何とも結合していないＢ細胞を単離した。ＥＢＶ感染によって単離したＢ細胞を不死化させ、この細胞を２または３日おきに分割しながら４週間培養した。細胞を分割する過程で測定した細胞数に基づいて、累計細胞数を算出した。
実施例２：初代ヒトＢ細胞にＳＴＡＴ５を導入するとＢ細胞の増殖が低下することの証明
実施例２では、Ｂ細胞をシグナル伝達および転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）で不死化すると、Ｂ細胞の増殖が、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞よりも低下することを示す。ＳＴＡＴ５が、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬの形質導入と同様にＢ細胞の分化を阻害し、その生存期間を延ばすことが報告されているが（例えばシーレン（Ｓｃｈｅｅｒｅｎ）ら、プロスワン（Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ）、２０１１）、本発明のデータがＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬおよびＥＢＶによる不死化と比較するとＳＴＡＴ５は好ましくないことを示しているため、本発見は重要である。
Ｂ細胞を、本明細書で記載した（実施例１０）、モジョソート ヒト汎Ｂ細胞単離キットを使って凍結保存しておいた健常提供者ＰＢＭＣから単離する。
同じ健常提供者から、実施例１に記載したように単離し、活性化したＢ細胞（図６Ａ）にマウス由来の構成的活性型ＳＴＡＴ５導入遺伝子を形質導入する。初代Ｂ細胞へのレトロウイルス性形質導入に関する手順は文献（例えばクワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２０１０）や本発明（実施例１０）に記載がある。レトロウイルスを介して形質導入したＢ細胞を、放射線照射済みヒトＣＤ４０Ｌ形質導入支持細胞上、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で培養する。インビトロで初代ヒトＢ細胞を維持するためには、Ｂ細胞上でＣＤ４０受容体を刺激することが必須である（実施例７も参照のこと）。ＳＴＡＴ５レトロウイルス性構築物は、不死化した自己Ｂ細胞でのＳＴＡＴ５の発現を経時的にモニタリングする（図６Ｂ-Ｄ）のに使われるＧＦＰマーカーを含む。このデータは、他のＢ細胞不死化法（図５）と比較すると、ＳＴＡＴ５を発現しているＢ細胞の総数が、不死化後３０日以内の培養では有意に増加しないことを示している。
図６Ａ～６Ｄに示すようにこの結果は、ＳＴＡＴ５を導入した場合にはＢ細胞が大幅には増えなかったことを示している。ＰＢＭＣ材料からのＢ細胞の単離を図示している図６Ａに示すように、モジョソートの磁気ビーズに基づく細胞分離法を使って健常提供者のＰＢＭＣからＢ細胞を単離した。汎Ｂ細胞ネガティブキットを使い、製造業者の手順に従って、何とも結合していないＢ細胞を単離した。ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２０に対する抗体を使って、単離したＢ細胞の純度を測定した。ＳＴＡＴ５の安定的な形質導入によるＢ細胞の不死化に関する結果を図示している図６Ｂに示すように、ウイルスを産生するために、ＳＴＡＴ５構築物をフェニックス細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス上清を使って、５人の健常提供者に由来する活性化Ｂ細胞へのレトロウイルス性形質導入を行なった。ＧＦＰの発現によってＳＴＡＴ５の発現を測定した。不死化Ｂ細胞について増殖とＳＴＡＴ５の発現を図示している図６Ｃに示すように、６Ｂの細胞を、放射線照射済みｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上、ＩＬ－２１存在下（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）で培養し、１週間に２回、０．２ｅ６細胞／ｍＬの濃度で分割することによって増殖させた。ＧＦＰの発現によってＳＴＡＴ５の発現を測定した。不死化Ｂ細胞の増殖を図示している図６Ｄに示すように、６Ｂの細胞を、放射線照射済みｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上、ＩＬ－２１存在下（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）で培養し、１週間に２回、０．２ｅ６細胞／ｍＬの濃度で分割することによって増殖させた。細胞を分割する過程で測定した細胞数に基づいて、累計細胞数を算出した。
実施例３：ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞の代わりに、Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることを増殖に使用できることの証明
実施例３では、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入したＢ細胞にＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を導入することによる、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化法の改善について実証する。このデータは、Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌ形質導入支持細胞と共培養するよりも、Ｂ細胞にＣＤ４０Ｌ分子を直接形質導入することによって、インビトロで初代ヒトＢ細胞を維持するのに必要な、Ｂ細胞のＣＤ４０受容体が刺激が起こることを示している。この改変によって細胞培養における不死化Ｂ細胞の維持が容易になり、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ形質導入Ｂ細胞による抗原提示がさらに向上する（実施例７および９）ことで、産業への応用が有意に改善される。
Ｂ細胞のＣＤ４０受容体を刺激することによって、初代ヒトＢ細胞はインビトロで維持される。通常、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞のＣＤ４０Ｌの刺激は、典型的には、例えば実施例１０で記載したように生成したＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞（Ｌ細胞）によって起こる。不死化Ｂ細胞の細胞培養での維持を容易にするために、ＣＤ４０Ｌを発現させ、パラクリンおよび／またはオートクリンのＣＤ４０受容体刺激が可能になるようにしたＢ細胞の改変を評価する。このことによって、Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上で培養する必要がなくなることが重要である。
凍結保存しておいた健常提供者のＰＢＭＣから、本発明に記載したように（実施例１０）ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の抗ＣＤ２０ミクロビーズとオートマックス（ａｕｔｏＭＡＣＳ）装置（ミルテニー）を使用して、Ｂ細胞を単離した。
単離し、活性化したＢ細胞（図７Ａ）にＢＣＬ ６／ＢＣＬ－ｘＬまたはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせを、文献（例えばクワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２０１０）や本発明（実施例１０）に記載がある初代Ｂ細胞へのレトロウイルスを介した形質導入に関する手順に基づいて、安定的に形質導入した。
７２時間後にＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ改変Ｂ細胞を回収して分割し、Ｌ細胞の非存在下で、あるいはｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上のいずれかで培養した。ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌを形質導入したＢ細胞は、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を添加した完全Ｂ細胞培地中、Ｌ細胞の非存在下で培養する。ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ構築物は、不死化自己Ｂ細胞でのＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬの発現を経時的に測定し、その増殖をモニタリングするのに使われるＧＦＰマーカーを含む（図７Ｂ；図７Ｄ；図７Ｅ）。フローサイトメーターを使い、ＣＤ１５４に対する抗体によって、Ｂ細胞でのＣＤ４０Ｌの発現を測定する（図７Ｃ）。
安定的な形質導入により、抗原を直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形で送達することによって、不死化Ｂ細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使えるようになる。ＴＭＧ導入遺伝子を不死化Ｂ細胞に導入することの可能性を証明するために、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬまたはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせのいずれかを形質導入したＢ細胞にＴＭＧ構築物を、本発明（実施例１０）で説明した方法により、レトロウイルスを介して形質導入した。レトロウイルス性構築物中でＴＭＧは、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達ドメインと膜貫通型の切断型細胞質ドメインに隣接しており、かつ、細胞表面に発現するＬｙ６Ｇマーカーとピューロマイシン耐性遺伝子に２Ａエレメントを介して結合している。従って、ｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）とピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を添加した完全Ｂ細胞培地中で細胞を３～４日間培養し、その後、Ｌｙ６Ｇ特異的抗体を使ってＴＭＧ導入遺伝子の発現を測定することにより、ＴＭＧを発現している細胞を選抜することが可能である（図７Ｆ）。このデータは、ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞の代わりに、Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることを増殖に使用できること、およびＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ形質導入Ｂ細胞とＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ／ＣＤ４０Ｌ形質導入Ｂ細胞の両方にＴＭＧ導入遺伝子を効率的に導入できることを示している。
図７Ａ～７Ｆでは、ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞の代わりに、Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることを増殖に使用できることを実証している。図７Ａは、ＰＢＭＣ材料からのＢ細胞の単離を示している。ミルテニーの磁気ビーズに基づく細胞分離法を使って、健常提供者のＰＢＭＣからＢ細胞を単離した。製造業者の手順に従って、抗ＣＤ２０ミクロビーズを使用し、その後のオートマックスを使った細胞分離を行うことでＣＤ２０＋Ｂ細胞を単離した。ＣＤ３およびＣＤ２０に対する抗体を使ったＦＡＣＳにより、単離したＢ細胞の純度を測定した。図７Ｂは、ＢＣＬ－６とＢＣＬ－ＸＬの安定的な形質導入によるＢ細胞の不死化を示している。ウイルスを産生するために、ＢＣＬ－６-ＢＣＬ－ｘＬ－ＧＦＰ構築物を２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス上清を使って、健常提供者に由来する活性化Ｂ細胞へのレトロウイルス性形質導入を行なった。ＦＡＣＳを使い、ＧＦＰの発現により、ＢＣＬ６／ＢＣＬ－ｘＬの発現を測定した。図７Ｃは、ＢＣＬ６とＢＣＬ－ＸＬおよびＣＤ４０Ｌの安定的な共形質導入によるＢ細胞の不死化を示している。ウイルスを産生するために、ＢＣＬ６／ＢＣＬ－ｘＬ構築物とＣＤ４０Ｌ構築物を２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス上清を使って、健常提供者に由来する活性化Ｂ細胞へのレトロウイルス性共形質導入を行なった。ＦＡＣＳ分析により、ＢＣＬ６／ＢＣＬ－ｘＬの発現をＧＦＰの発現によって測定し、そしてＣＤ４０Ｌの発現をＣＤ１５４に対する抗体を使って測定した。図７Ｄは、ＣＤ４０Ｌの存在下または非存在下における不死化Ｂ細胞の増殖を示している。７Ｂおよび７Ｃで得られた細胞を、放射線照射済みｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上、ＩＬ－２１存在下（５０ｎｇ／ｍＬ最終濃度）で３日間培養することにより、増殖させた。７２時間後、Ｂ細胞を回収し、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ細胞の半量をｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上で培養し、残りの半量とＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ｈＣＤ４０－Ｌ細胞はＬ細胞上では培養しなかった。細胞を１週間に２回、０．２ｅ６細胞／ｍＬの濃度で分割し、細胞生存率を分析した。図７Ｅは、ＣＤ４０Ｌの存在下または非存在下における不死化Ｂ細胞の増殖を示している。７Ｂおよび７Ｃで得られた細胞を、放射線照射済みｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上、ＩＬ－２１存在下（５０ｎｇ／ｍＬ最終濃度）で３日間培養することにより、増殖させた。７２時間後、Ｂ細胞を回収し、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ細胞の一部をＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上で培養し、残りのＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ細胞並びにＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ｈＣＤ４０Ｌ細胞はＬ細胞上では培養しなかった。細胞は１週間に２回、０．２ｅ６細胞／ｍＬの濃度で分割した。細胞を分割する過程で測定した細胞数に基づいて、累計細胞数を算出した。図７Ｆは、当業者に知られており、かつ、実施例１０にも記載の方法であるピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）選抜した後のＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞およびＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞への、ＴＭＧの安定的な形質導入を示している。ウイルスを産生するために、ＴＭＧ構築物構築物を２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス上清を使って、７Ｂで得られた不死化Ｂ細胞へのレトロウイルス性形質導入を行なった。Ｌｙ６Ｇに対する抗体を使ったＦＡＣＳにより、ＴＭＧの発現を測定した。ゲーティング戦略：リンパ球＞生細胞＞ＣＤ２０＋細胞＞ＧＦＰ＋細胞＞Ｌｙ６Ｇ。
ｈＣＤ４０Ｌ導入遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１０）：ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ＊
実施例４：抗原をコードしている導入遺伝子の安定的な形質導入と抗原をコードしている導入遺伝子を発現している不死化ヒトＢ細胞の選抜
実施例４では、抗原をコードしている導入遺伝子を不死化Ｂ細胞に安定的に形質導入できること、および多シストロン性ベクターに表面マーカーまたは抗生物質選抜マーカーを含めることで、これら抗原を発現しているＢ細胞を効率的に検出および濃縮できることを示す。抗原が安定して発現すると大量の抗原提示Ｂ細胞を産生することが容易になるため、抗原の安定した発現は有益である。外因性ペプチドを負荷することや抗原性化合物（例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質）のエレクトロポレーションなどの別の抗原送達方法では、少量のＢ細胞を安定的に改変した後に増殖させるよりも、実質的に多くの工程が必要となる。さらに、抗原の安定した発現により、抗原の高く継続した発現が確保されるため、Ｂ細胞集団での抗原発現レベルの不均一さが低減する可能性がある。
抗原を発現している不死化Ｂ細胞（以降、「抗原発現性不死化Ｂ細胞」とする）の形質導入と選抜は、我々のＴＣＲ単離プラットフォームにおいてこれらの細胞をＡＰＣとして用いるため、新生抗原応答性ＴＣＲの検出に必要である。
患者に特異的な変異をコードしている導入遺伝子を、直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形式で作製する。これらの構築物は、２５ｍｅｒの連鎖状ポリペプチドのミニ遺伝子として最大で１２までの腫瘍特異的変異を含み、さらに、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインを含む。
本実施例では、複数の不死化技術と、患者に特異的な変異をコードしている導入遺伝子を直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形式で安定的に形質導入することによる、抗原発現性不死化Ｂ細胞の生成について示す。ＴＭＧをコードしているベクターはさらにＬｙ６Ｇタンパク質とピューロマイシン耐性遺伝子の両方を含み、抗生物質選抜によってＴＭＧ改変Ｂ細胞を選抜すること、およびＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＭＧの発現を検出することが可能である。
ミスマッチ修復正常型大腸癌（ＭＭＲｐ－ＣＲＣ）由来のＥＢＶ不死化Ｂ細胞を、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％（ｖ．ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、０．３～０．６ｅ６細胞／ｍＬの密度で培養する。
レトロウイルスを介して直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）形式の導入遺伝子をＢ細胞に形質導入するためには、当業者に知られており、本発明（実施例１０）にも記載した手順を用いた。ＴＭＧは２５ｍｅｒの連鎖状ポリペプチドのミニ遺伝子としてコードされ、最大で１２までの腫瘍特異的変異を含み、さらに、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメイン、並びにＴＭＧを発現しているＢ細胞（以降、「ＴＭＧ発現性Ｂ細胞」とする）の効率的な選抜と検出を可能にするピューロマイシン耐性遺伝子とＬｙ６Ｇマーカーを含む。
形質導入の４日後に、蛍光色素で標識したＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーにより、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞の発現頻度を測定する。その後細胞を、５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有している培地中で４日間培養する。蛍光色素で標識したＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーにより、ピューロマイシンで選抜した後のＴＭＧ発現性Ｂ細胞の発現頻度を決定する（図８Ａ）。
加えて、基底細胞癌患者のＰＢＭＣからネガティブ選抜によってＢ細胞を単離し、次いで、本出願（実施例３および１０）に記載したように、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬとＣＤ４０Ｌで不死化する。その後、ＴＭＧ導入遺伝子をコードしている導入遺伝子の不死化Ｂ細胞への形質導入を、当業者に知られていて、本発明（実施例１０）にも記載の方法によって実施する。形質導入の４日後に、蛍光色素で標識したＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーにより、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞の発現頻度を測定する。その後細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有している培地中で４日間培養し、次いで純度をフローサイトメトリーで測定する。蛍光色素で標識したＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーにより、ピューロマイシンで選抜した後のＴＭＧ発現性Ｂ細胞の発現頻度を決定する（図８Ｂ）。本実施例のデータは、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞とＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞の両方に、腫瘍特異的変異をコードしている導入遺伝子を直列型ミニ遺伝子の形式で安定的に形質導入できること、および抗生物質選抜を利用することでＴＭＧ発現性Ｂ細胞が非常に富む集団を得られることを示している（図８Ａおよび図８Ｂ）。
本実験並びに図８Ａと図８Ｂに示した結果のさらなる詳細については、これらが不死化ヒトＢ細胞の安定的な形質導入と選抜について実証するものであることに留意されたい。図８Ａでは、ＴＭＧをコードしている構築物を用いたＥＢＶ不死化Ｂ細胞の形質導入と選抜を示す。ＥＢＶ不死化Ｂ細胞への形質導入は、スピンを使い、ウイルスを介して行った。形質導入の４日後に、細胞におけるＬｙ６Ｇの発現をフローサイトメトリーを使って分析した。次いで、培地に抗生物質であるピューロマイシンを添加し、Ｌｙ６Ｇの発現を再度分析することによって、細胞を選抜した。図８Ｂでは、ＴＭＧをコードしている構築物を用いたＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞の形質導入と選抜を示す。初代Ｂ細胞をＰＢＭＣから単離し、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬとＣＤ４０Ｌを導入することによって不死化させた。不死化させた後に、患者特異的なＴＭＧ構築物をウイルスを介してＢ細胞に形質導入した。形質導入の４日後にＬｙ６Ｇの発現をフローサイトメトリーを使って分析することで、効率を測定した。その後、細胞にピューロマイシンを添加することによって形質導入された細胞を選抜することができ、そして細胞におけるＬｙ６Ｇの発現を再度分析した。
実施例５：ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含めること、および不死化Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌを発現させることによって、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープの抗原提示が高まることの証明
実施例５では、ＴＭＧ導入遺伝子配列にＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含めることで、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞および／またはＢＣＬ－６／ＢＣＬＸＬ不死化Ｂ細胞の両方によるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープの提示が高まることを示す。
このことは、現行の最先端技術にとって、少なくとも、通常異なる抗原形式を用いてＭＨＣクラスＩとクラスＩＩそれぞれの経路における最適な抗原提示を達成する技術にとって有益である。両経路における抗原提示の最適化は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞受容体を検出することを目的としたＴＣＲ探索の取り組みに役立つ。本実施例では、ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含むかまたは含まない、様々な数の２５ｍｅｒエピトープ（１、３、１２または４０のエピトープ）をコードしている種々の設計のＴＭＧを提供する。ＴＭＧをコードしている導入遺伝子はさらにピューロマイシン耐性遺伝子とＧＦＰを含むため、抗生物質への耐性に基づくＴＭＧ発現性Ｂ細胞の迅速な検出と濃縮が可能である。本実施例では、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの抗原提示に及ぼすＣＤ４０Ｌ発現の影響について評価する。
Ｂ細胞を、磁気ビーズを使った濃縮により、当業者に知られている手順に基づいて健常提供者のＰＢＭＣから単離し、その後、当業者に知られており、本明細書（実施例１０）にも記載した方法を用い、ＥＢＶ感染またはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬの形質導入のいずれかによって不死化する。非ＥＢＶ不死化Ｂ細胞にも、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ単独またはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌの組み合わせのいずれかを形質導入する。Ｂ細胞の形質導入に用いたレトロウイルス性上清は、当業者に知られており、本発明（実施例１０）にも記載した方法によって産生する。Ｂ細胞に、種々のＴＭＧ構築物をレトロウイルスを介して形質導入する。本実施例では、ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含むかまたは含まない、様々な数の２５ｍｅｒエピトープ（１、３、１２または４０のエピトープ）をコードしている種々の設計のＴＭＧを提供する。形質導入の９６時間後に、本分野および本発明（実施例１０）に記載のある手順により、ピューロマイシン耐性に基づいてＴＭＧ発現性Ｂ細胞を濃縮する。簡単に説明すると、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞を、ｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）とピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有する完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中、２００，０００～２５０，０００細胞／ｍｌの密度で９６時間培養する。培地にピューロマイシンを添加した後の４８時間以内に細胞死が認められなかった一部の例では、培養に１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加える。ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を、５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する培地（２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で９６時間培養する。培地にピューロマイシンを添加した後の４８時間以内に細胞死が認められなかった一部の例では、培養に５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加える。
これと並行して、様々なＴ細胞受容体遺伝子を当業者に知られている手順により、ジャーカットＴ細胞に形質導入する。簡単に説明すると、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、フュージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）トランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順により、フェニックス－アンフォ（Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ａｍｐｈｏ）ウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションする。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞への形質導入を行う。ジャーカットレポーターＴ細胞に当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変される。
配列番号２：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＤＫＰＳＬＳＡＲＹＶＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＲＰＲＬＷＬＬＬＡＡＱＬＴＶＬＨＧＮＳＶＬＱＱＴＰＡＹＩＫＶＱＴＮＫＭＶＭＬＳＣＥＡＫＩＳＬＳＮＭＲＩＹＷＬＲＱＲＱＡＰＳＳＤＳＨＨＥＦＬＡＬＷＤＳＡＫＧＴＩＨＧＥＥＶＥＱＥＫＩＡＶＦＲＤＡＳＲＦＩＬＮＬＴＳＶＫＰＥＤＳＧＩＹＦＣＭＩＶＧＳＰＥＬＴＦＧＫＧＴＱＬＳＶＶＤＦＬＰＴＴＡＱＰＴＫＫＳＴＬＫＫＲＶＣＲＬＰＲＰＥＴＱＫＧＰＬＣＳＰＩＴＬＧＬＬＶＡＧＶＬＶＬＬＶＳＬＧＶＡＩＨＬＣＣＲＲＲＲＡＲＬＲＦＭＫＱＦＹＫ
マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。ＴＣＲ改変を、これらの細胞との共培養を行う前に、選別してこの集団を濃縮する（図９Ａ；図９Ｂ）か、または一部の例ではこれらの細胞の選別を行わないため、ＴＣＲ陽性の割合は２５～８０％と多様になる（図９Ｃおよび図９Ｄ）。本実施例では、以下のＴ細胞エピトープに対する特異性を有するＴＣＲ配列を用いる：ＭＡＧＥ－Ａ３（Ｒ１２Ｃ９エピトープ；ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（５Ｂ８エピトープ；ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（１Ｇ４エピトープ；ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープ）、およびＧＣＮ１Ｌ１（ＧＣＮ１Ｌ１エピトープ；ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープ）。
不死化Ｂ細胞との共培養を開始する４８時間前に、ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞を、培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）に、低密度（１ｅ５／ｍＬ）で播種する。Ｂ細胞による抗原提示を評価するために、Ｂ細胞とＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞を、１：１のＥ：Ｔ比（９６ウェルのマイクロタイタープレートの１ウェルにつき２００μｌの培地と２００，０００の細胞を加える）で２０時間培養する。陽性対照としては、Ｂ細胞に、１０μｇ／ｍＬのペプチドとインキュベートすることによって９ｍｅｒペプチド（ＭＨＣクラスＩエピトープ）を、または２０μｇ／ｍＬのペプチドと３７℃で一晩インキュベートすることにより２５ｍｅｒペプチド（ＭＨＣクラスＩＩエピトープ）を負荷する。２５ｍｅｒペプチドを使用する場合、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞には密度が０．５ｅ６細胞／ｍＬの細胞にペプチドを負荷し、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞には密度が０．７５ｅ６細胞／ｍＬ細胞にペプチドを負荷する。１０ｍｅｒペプチドを使用する場合、密度が１ｅ６細胞／ｍＬのＥＢＶ不死化Ｂ細胞およびＢＣＬ－６／ｘＬ不死化Ｂ細胞にペプチドを負荷する。ペプチドを負荷したＢ細胞は、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞との共培養を行う前に洗浄する。２０時間後に、ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞によるＣＤ６９の発現を、フローサイトメトリーで測定する。このデータは、不死化Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌを発現させるとＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原提示が高まる可能性があること（図９Ａおよび図９Ｂ）、およびＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含めることで、抗原を、例えばＴＭＧ導入遺伝子として安定的に発現しているＢ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原提示が改善されること（図９Ｃおよび図９Ｄ）を実証するものである。このデータはさらに、単一のＴＭＧ導入遺伝子の中に１２を超える２５ｍｅｒポリペプチドがコードされている場合には、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原提示が低下する可能性があること（図９Ｄ）を示している。
抗原発現性Ｂ細胞が、ＣＤ４０ＬおよびＬＡＭＰ１の付加を伴って、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲを形質導入したＴ細胞とクラスＩＩ拘束性ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の両方を刺激できることを実証するために、図９Ａ～Ｄに示す結果のさらなる詳細を提供する。ＴＭＧを形質導入した、ＣＤ４０Ｌを含むかまたは含まないＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対するＴ細胞応答性を評価した図９Ａでは、不死化Ｂ細胞にＣＤ４０Ｌを共導入し、その後、１２のエピトープとＬＡＭＰ１配列をコードしているＴＭＧを形質導入した。次いで、このエピトープに対するＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞をＢ細胞と共培養し、活性化マーカーであるＣＤ６９で測定した応答性をフローサイトメトリーで評価した。ＴＭＧを形質導入したＥＢＶ不死化Ｂ細胞、またはＴＭＧを形質導入しなかったＥＢＶ不死化Ｂ細胞に対するＴ細胞応答性を評価した図９Ｂでは、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に１２のエピトープとＬＡＭＰ１配列をコードしているＴＭＧを形質導入した。次いで、ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞をＢ細胞と共培養し、活性化マーカーであるＣＤ６９で測定した応答性をフローサイトメトリーで評価した。ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含む、またはこれを含まないＴＭＧを発現しているＢＣＬ ６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対するクラスＩ拘束性Ｔ細胞の応答性を示している図９Ｃでは、二人の健常提供者に由来する不死化Ｂ細胞に、様々な数のエピトープをコードし、ＬＡＭＰ１を含むかまたは含まないＴＭＧ構築物を形質導入した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞をＢ細胞と一晩共培養し、その後、ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで分析した。ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含むかまたは含まないＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対するクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞の応答性を示している図９Ｄでは、二人の健常提供者に由来する不死化Ｂ細胞に、様々な数のエピトープをコードし、ＬＡＭＰ１を含むかまたは含まないＴＭＧ構築物を形質導入した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞をＢ細胞と一晩共培養し、その後、ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで分析した。
実施例６：不死化Ｂ細胞に２５ｍｅｒポリペプチドを外的に負荷することは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲのＴＣＲ探索には不向きであることの証明
ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞とＴＣＲ遺伝子の発見は、がんの治療を含む様々な治療応用の観点から興味をもたれている。本明細書で提供するように、Ｔ細胞抗原を安定して発現し、それによってＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ両方の提示経路を介して抗原を効率的に提示するＢ細胞が存在し得る。その想定される代替として、Ｂ細胞に２５ｍｅｒペプチドを外的に負荷することが挙げられる。そのようなＢ細胞は、細胞のプロテアーゼによってＭＨＣクラスＩ分子への結合に適した長さ（およそ９～１１ｍｅｒの長さ）に処理されれば、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＭＨＣクラスＩ分子に結合し得る。
本実施例では、関連するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープをコードしているより短い（９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒの）ポリペプチドのペプチド負荷とは異なり、Ｂ細胞に滴定量の２５ｍｅｒポリペプチドを外的に負荷することによっては、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープに関する効率的な抗原提示が達成されないことを実証する。したがって、ＴＣＲ探索にヒトＢ細胞を抗原提示細胞として用いる場合には、２５ｍｅｒのポリペプチドを外的に負荷することは、適した解決策とはならない。
ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に、０．５ｅ６細胞／ｍＬの密度の細胞に（ｉ）滴定量の２５ｍｅｒペプチド（配列を付加する必要がある）を一晩３７℃で、または１ｅ６細胞／ｍＬの密度の細胞に（ｉｉ）２５ｍｅｒペプチド（配列を付加する）に由来する９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのペプチドを９０分、３７℃で、ペプチドを負荷する。ペプチドを外的に負荷した後、ＡＰＣをしっかりと洗浄し、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞と共培養する。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を生成するには、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順により、フェニックス－アンフォウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションする。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞株への形質導入を行う。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラ（Ｍｅｚｚａｄｒａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β－Ｔ２Ａ－ＣＤ４導入遺伝子を形質導入して、ヒトＣＤ４、ＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変されている。マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。アッセイを行う４８時間前に、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞（ＴＣＲ陽性の割合が４７～６７％）を低密度で培養する。ＡＰＣとＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を、１：１の比（９６ウェルのマイクロタイタープレートの１ウェルにつき２００μｌの培地と２００，０００の細胞を加える）で３７℃で一晩、共培養する。その後、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞によるＣＤ６９の発現を分析する。このデータは、ＣＭＶｐｐ６５、変異型ＣＤＫ４および変異型ＧＣＮ１Ｌ１に特異的な３つのＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲ遺伝子では、２５ｍｅｒのポリペプチドを外的に負荷することは、高濃度の場合にのみ、ジャーカットＴ細胞を活性化することを示している（図１０Ａ～Ｃ）。
さらなるアッセイにおいて、単一のＴＭＧ導入遺伝子（ＴＭＧ３）にコードされている、３３種類の２５ｍｅｒポリペプチドを合成し、前述したように、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に外的に負荷する。ペプチドを負荷したＢ細胞を、ＴＭＧにコードされたポリペプチド９１に対する特異性を有するＴＣＲを発現しているジャーカットＴ細胞と、前述したように共培養する。ＴＭＧ３を発現しているＢ細胞とポリペプチド９１（ＭＧ９１）をコードしている導入遺伝子はさらなる対照として用いられ、また、実施例１０で記載するように、レトロウイルスを介した形質導入とその後の抗生物質への耐性に基づく濃縮によって生成される。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞はＴＭＧ３を発現しているＢ細胞とＭＧ９１を発現しているＢ細胞によって活性化されるが、関連する２５ｍｅｒのポリペプチドを外的に負荷したＢ細胞はフローサイトメトリーによって測定される、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞によるＣＤ６９の発現上昇はもたらさない（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）ことに注意されたい。従ってこのデータは、２５ｍｅｒのポリペプチドを外的に負荷することは、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞とＴＣＲの正確な同定と特徴分析には適していないことをさらに示唆している。
不死化Ｂ細胞に２５ｍｅｒのポリペプチドを外的に負荷することがＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲのＴＣＲ探索には適していないことの実証に関する図１０Ａ～Ｄのさらなる詳細を以下に提供する。図１０Ａでは、ペプチドを外的に負荷したＥＢＶ不死化Ｂ細胞に対するＣＤＫ４－１７ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性を示す。不死化Ｂ細胞に、滴定量の、同族抗原をコードしている様々な長さのペプチドを負荷し、次いで、ＴＣＲを形質導入したＴ細胞と共に培養した。ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで評価した。図１０Ｂでは、ペプチドを外的に負荷したＥＢＶ不死化Ｂ細胞に対するＣＭＶ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性を示す。不死化Ｂ細胞に、滴定量の、同族抗原をコードしている様々な長さのペプチドを負荷し、次いで、ＴＣＲを形質導入したＴ細胞と共に培養した。ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで評価した。図１０Ｃでは、ペプチドを外的に負荷したＥＢＶ不死化Ｂ細胞に対するＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性を示す。不死化Ｂ細胞に、滴定量の、同族抗原をコードしている様々な長さのペプチドを負荷し、次いで、ＴＣＲを形質導入したＴ細胞と共に培養した。ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで評価した。図１０Ｄは、ＴＭＧ中に存在する単一の変異をコードしているペプチドに対して行ったＴＣＲの検証結果を表している。ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に、ＴＭＧ構築物中に存在する単一の変異をコードしている２５ｍｅｒのペプチドを負荷した。ＴＣＲを形質導入したＴ細胞だけの集団と共インキュベートした後には、どのペプチドに対しても応答性は認められない。図１０Ｅは、ＴＭＧ中に存在する単一の変異をコードしているミニ遺伝子構築物に対して行ったＴＣＲの検証結果を表している。ＥＢＶ不死化Ｂ細胞に、ＴＭＧ構築物中に存在する単一の変異をコードしている構築物をレトロウイルスを介して形質導入した。ＴＣＲを形質導入したＴ細胞だけの集団と共インキュベートでは、１つのエピトープに対する応答性が認められる。
実施例７：ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子の発現によって、不死化Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ両方の抗原提示が高まる可能性があることの証明
実施例７では、ＢＣＬ－６／ＢＣＬＸＬ不死化Ｂ細胞にＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を導入することによって、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ両方の提示経路を介した抗原提示が高まる可能性があることの証拠を提供する。この発見は、ＴＣＲの探索および特徴分析研究にＢ細胞を用いる場合に関連する。
本実施例では、抗原発現性不死化Ｂ細胞によるＴＣＲを形質導入したＴ細胞の活性化について説明する。
Ｂ細胞を二人の健常提供者から単離し、本発明の実施例５および実施例１０に記載したように、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入することで不死化した。本実施例では、Ｂ細胞にＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ単独またはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌ導入遺伝子との組み合わせのいずれかを形質導入する。不死化させた後、Ｂ細胞に様々な数の（１、３、１２または４０の）２５ｍｅｒポリペプチドをコードしており、かつ、ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列を含む種々のＴＭＧ構築物を形質導入する。形質導入の９６時間後に、実施例５および実施例１０に記載したように、抗生物質への耐性に基づく選抜によりＴＭＧ発現性Ｂ細胞を濃縮する。Ｂ細胞を前述したように、０．２～０．２５ｅ６細胞／ｍＬの密度で、ｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）存在下にて培養する。
２つのＮＹ－ＥＳＯ－１に由来するＴ細胞エピトープ（５Ｂ８エピトープＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ；配列番号３；ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープおよび１Ｇ４エピトープＳＬＬＭＷＩＴＱＣ；配列番号４；ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープ）に特異的なＴＣＲを発現しているジャーカットＴ細胞を、実施例５および実施例１０に記載したように生成する。不死化Ｂ細胞との共培養を開始する４８時間前に、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を低密度（１ｅ５／ｍＬ）で播種する。次いで、Ｂ細胞とＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞を、１：１のＥ：Ｔ比（９６ウェルのマイクロタイタープレートの１ウェルにつき２００μｌの培地と２００，０００の細胞を加える）で２０時間培養する。陽性対照としては、Ｂ細胞に、１０μｇ／ｍＬのペプチドとインキュベートすることにより９ｍｅｒペプチド（ＭＨＣクラスＩエピトープ）を、または２０μｇ／ｍＬのペプチドと３７℃で一晩インキュベートすることにより２５ｍｅｒペプチド（ＭＨＣクラスＩＩエピトープ）を、負荷する。ペプチドを負荷したＢ細胞は、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞との共培養を行う前に洗浄する。共培養の後、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞によるＣＤ６９の発現を、フローサイトメトリーで測定する。このデータは、Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることで、ＭＨＣクラスＩの抗原提示（図１１Ａ、Ｂ）が高まり、同様に、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞ではＭＨＣクラスＩＩの抗原提示（図１１Ｃ、Ｄ）が高まる可能性があることを示している。このデータはさらに、単一のＴＭＧ導入遺伝子の中に１２を超える２５ｍｅｒポリペプチドがコードされている場合には、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原提示が低下する可能性があること（図１１Ｃ、Ｄ）を示している。
ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を含めることで、ＨＬＡクラスＩアレルおよびＨＬＡクラスＩＩアレルにおいて、ＴＣＲを形質導入したＴ細胞による抗原発現性Ｂ細胞の認識が高まることの実証である図１１Ａ～１１Ｄで示す結果のさらなる詳細を以下に提供する。図１１Ａは、ＴＭＧを形質導入したＣＤ４０Ｌを含むかまたは含まないＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対する、提供者１：ＮＹ－ＥＳＯ １Ｇ４ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性を示している。ＣＤ４０Ｌを共導入したかまたは共導入しなかった不死化Ｂ細胞に、その後、１、３、１２または４０のエピトープをコードしており、かつ、隣接したＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まないＴＭＧ構築物のパネルを形質導入した。次いで、クラスＩ上に提示されるエピトープのうちの１つを認識するＮＹ－ＥＳＯ １Ｇ４ ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞をＢ細胞と共培養し、Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現上昇に焦点を当てたフローサイトメトリーによって応答性を評価した。図１１Ｂは、ＴＭＧを形質導入したＣＤ４０Ｌを含むかまたは含まないＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対する、提供者２：ＮＹ－ＥＳＯ １Ｇ４ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性の結果である。ＣＤ４０Ｌを共導入したかまたは共導入しなかった不死化Ｂ細胞に、その後、１、３、１２または４０のエピトープをコードしており、かつ、隣接したＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まないＴＭＧ構築物のパネルを形質導入した。次いで、クラスＩ上に提示されるエピトープのうちの１つを認識するＮＹ－ＥＳＯ １Ｇ４ ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞をＢ細胞と共培養し、Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現上昇に焦点を当てたフローサイトメトリーによって応答性を評価した。図１１Ｃは、ＴＭＧを形質導入したＣＤ４０Ｌを含むかまたは含まないＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対する、提供者１：ＮＹ－ＥＳＯ ５Ｂ８ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性の結果である。ＣＤ４０Ｌを共導入したかまたは共導入しなかった不死化Ｂ細胞に、その後、１、３、１２または４０のエピトープをコードしており、かつ、隣接したＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まないＴＭＧ構築物のパネルを形質導入した。次いで、クラスＩＩ上に提示されるエピトープのうちの１つを認識するＮＹ－ＥＳＯ ５Ｂ８ ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞をＢ細胞と共培養し、Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現上昇に焦点を当てたフローサイトメトリーによって応答性を評価した。図１１Ｄは、ＴＭＧを形質導入したＣＤ４０Ｌを含むかまたは含まないＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に対する、提供者２：ＮＹ－ＥＳＯ ５Ｂ８ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の応答性の結果である。ＣＤ４０Ｌを共導入したかまたは共導入しなかった不死化Ｂ細胞に、その後、１、３、１２または４０のエピトープをコードしており、かつ、隣接したＬＡＭＰ１配列を含むかまたは含まないＴＭＧ構築物のパネルを形質導入した。次いで、クラスＩＩ上に提示されるエピトープのうちの１つを認識するＮＹ－ＥＳＯ ５Ｂ８ ＴＣＲを形質導入したジャーカット細胞をＢ細胞と共培養し、Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現上昇に焦点を当てたフローサイトメトリーによって応答性を評価した。
実施例８：ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞を、わずかな量の患者由来Ｂ細胞から生成することができ、腎細胞癌患者の自己ＴＩＬに含まれるＴ細胞特異的新生抗原の検出に利用可能であることの証明
実施例８では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に含まれる抗原特異的Ｔ細胞応答を見つけるためには、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子とＴＭＧ導入遺伝子とを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞が適していることを示す。
樹状細胞やＢ細胞を含む抗原提示細胞を使って、ＴＩＬに含まれる抗原特異的Ｔ細胞を検出することについてはすでに報告がある（例えば、ロビンズ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら、ネイチャー・メディシン、２０１３、およびリンネマン（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ）ら、ネイチャー・メディシン、２０１４）。しかしながら、ＴＩＬに含まれる抗原特異的Ｔ細胞の量は非常に少ないことが多い。本実施例では、本明細書に記載の改変不死化Ｂ細胞を少数の患者由来Ｂ細胞から生成できること、およびこの生成したＢ細胞を使って、ＴＩＬに含まれる少量の抗原特異的Ｔ細胞を検出できることを示す。
この観察結果は、Ｔ細胞とＴＣＲの特異性を調べるためには、本開示に記載の抗原提示細胞が適していることをさらに強調するものである。
腎細胞癌患者から得たＴＩＬに新生抗原特異的Ｔ細胞が含まれているかを分析するために、ＴＩＬを、文献（ジン（Ｊｉｎ）ら、免疫治療学雑誌（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）２０２１２）に記載があり、また当業者に知られている急速培養法（ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＲＥＰ）によって増殖させた。簡単に説明すると、ＴＩＬを、６０００ＩＵ／ｍｌのｒｈ－ＩＬ－２を添加した適した培地（１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清（ＨＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＸ－ＶＩＶＯ培地）中で、放射線照射済みのＰＢＭＣと共に、ＴＩＬ：支持細胞の比を１：２００として培養する。４日目と８日目に、培地の半量をｒｈ－ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加した新しい培地と交換する。ＲＥＰ開始から１１日後に、細胞産物のＣＤ４／ＣＤ８の組成をフローサイトメトリーでモニタリングする（図１２Ａ）。
同時に、本発明（実施例１）で記載したように、ＰＢＭＣからネガティブ選抜によって自己Ｂ細胞を単離する。本実施例では、３．１ｅ６のＰＢＭＣから１ｅ５のＢ細胞が得られ、これを、実施例１０に記載の、かつ、当業者に知られている方法により、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬとＣＤ４０Ｌを形質導入することで不死化させた。形質導入の９６時間後に、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ（ＧＦＰの発現で測定する）およびＣＤ４０Ｌの発現を生存率によって、ＣＤ８－、ＣＤ１９＋／ＣＤ２０＋Ｂ細胞をフローサイトメトリーで測定する（図１２Ｂ、Ｃ）。
その後Ｂ細胞を培養し、本明細書（実施例１０）に記載の方法で用いるのに十分な量になるまで増殖させる。腫瘍遺伝子変異を、全エクソーム解析（ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と当業者に知られている方法を用いて同定する。次いでＢ細胞に７つのＴＭＧ構築物を形質導入する。この７つのＴＭＧ構築物はそれぞれ、ＬＡＭＰ１シグナル伝達配列と膜貫通配列に隣接しており、かつ、ピューロマイシン耐性遺伝子とＬｙ６Ｇマーカーに連結された１２種類の患者特異的新生抗原をコードしている。ＴＭＧ発現性Ｂ細胞をレトロウイルス性形質導入によって生成し、実施例１０に記載したような５日間の抗生物質選抜により濃縮する。
ＴＭＧ発現性Ｂ細胞との共培養を開始する１日前にＴＩＬを解凍し、３７℃で一晩静置する。その後ＴＩＬを、自己のＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ発現性Ｂ細胞と１：１のＥ：Ｔ比（９６ウェルのマイクロタイタープレートの１ウェルにつき２００μｌの培地と２００，０００の細胞を加える）で、３７℃で２０時間インキュベートする。共インキュベーションしたあと、培養上清を回収し、ＩＦＮγの有無をサイトメトリックビーズアレイ（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ）を使い、製造業者（ＢＤ）の説明に従って分析する。２種類のＴＭＧ構築物（ＴＭＧ４およびＴＭＧ７）に特異的なＴ細胞応答が検出される（図１２Ｄ）。次いで、検出されたＴ細胞応答を、細胞内サイトカインの染色によって確認する。ＴＩＬとＴＭＧ発現性Ｂ細胞を共培養した後、当業者に知られている手順によって、ＴＩＬの細胞内ＩＦＮγを染色する。これにより、ＴＩＬに含まれるＴＭＧ特異的Ｔ細胞の有無を確認する（図１２Ｅ）。
僅かな量の血液由来Ｂ細胞からＢＣＬ ６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞を生成することができ、そしてこれを使って、腎細胞癌患者の自己ＴＩＬに含まれる新生抗原特異的Ｔ細胞を検出できることを示した図１２のさらなる詳細を以下に提供する。図１２Ａでは、急速培養した後のＴＩＬ材料の分析結果を図示している。腫瘍浸潤リンパ球を採取し、凍結保存した。その後、ＲＥＰを行ってこれらの細胞を増殖させた。フローサイトメトリーの分析から、この培養にＣＤ４ Ｔ細胞が高い割合で含まれていることが分かる。図１２Ｂでは、自己ＰＢＭＣからのＢ細胞の選抜について示している。Ｂ細胞を磁気ビーズを使ったネガティブ選抜によって単離した。選抜した後Ｂ細胞を不死化し、その培養の純度を、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０に対する抗体を利用したフローサイトメトリーによって分析した。近赤外蛍光色素を使い、死細胞を除外した。図１２Ｃでは、選抜したＢ細胞への不死化構築物とＣＤ４０Ｌ導入遺伝子の形質導入について示している。選抜したＢ細胞に、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ ＧＦＰ構築物とＣＤ４０Ｌ導入遺伝子をレトロウイルスを介して形質導入した。形質導入効率を、Ｂ細胞でのＧＦＰとＣＤ１５４の発現を観測するフローサイトメトリーによって評価した（図１２Ｂ）。図１２Ｄでは、ＩＦＮγサイトカインによって測定した２種類のＴＭＧ構築物に対するＴＩＬの応答を示している。ＴＭＧを形質導入した不死化Ｂ細胞を自己ＴＩＬと共培養し、その培養中のＩＦＮγ産生をサイトメトリックビーズアレイで分析した。２種類のＴＭＧ構築物に対して、特異的なＴ細胞応答が認められた。図１２Ｅは、ＴＩＬの応答が細胞レベルでも検出可能であることを示している。図１２Ｄで得られた細胞をＩＦＮγ抗体の染色によって分析し、１細胞あたりの応答を決定した。列ごとに、同じ条件の複数のプロットを示している。
実施例９：ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることで、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原提示が高まる可能性があること、およびＴＭＧの形式がＭＨＣクラスＩＩ抗原提示の有効性に影響を及ぼす可能性があることの証明
実施例９では、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞が、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ両方の提示経路を介して、高い抗原発現を示すことを示す。本実施例はさらに、選択された一部の例では、Ｔ細胞エピトープの位置および／または隣接するＴ細胞エピトープの性質がＭＨＣクラスＩＩの抗原提示に影響を及ぼす可能性があることも示す。本実施例は、ＴＭＧ設計の付加的な改善を調べることに対するさらなる根拠を提供し、このような改善としては、より少ない数のＴ細胞エピトープをコードしているＴＭＧ設計や、２種類のＴＭＧ設計（様々な位置および隣接配列）の中に、同じセットのＴ細胞エピトープをコードしている２シストロン性のＴＭＧ設計に関して、その使用可能性を評価することが挙げられるがこれらには限定されない。
Ｂ細胞を健常提供者から単離し、その後、前述したように（実施例１０）、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを単独で、またはＣＤ４０Ｌ導入遺伝子と組み合わせて形質導入することで不死化する。簡単に説明すると、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬおよびＣＤ４０Ｌ構築物を別々に２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ（バイオベックファーマ、ＢｉｏＶｅｃ Ｐｈａｒｍａ）またはフェニックス－アンフォ（ＡＴＣＣ）ウイルス産生細胞に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションする。得られたレトロウイルス粒子を用いて、健常提供者（ＨＣ８５８）から単離した不死化Ｂ細胞にＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬを単独で、またはＣＤ４０Ｌと組み合わせて形質導入する。この提供者は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＤＰＢ１＊０４：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１およびＤＱＢ１＊０６：０２のＨＬＡアレルを発現している。
１２種類の２５ｍｅｒポリペプチド、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達ドメイン、および膜貫通ドメインを含んでいる様々な形式の直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）を設計する（図１３Ａ）。それぞれのＴＭＧは、ＴＭＧ構築物中で様々な位置に配置されており、ＣＤＫ４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＰ５３、およびＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６と呼ばれている４つの既知のエピトープを含む。その他の位置には、選択した関係のないのヒト腫瘍中で検出される一アミノ酸変異から導出した無関係の付加的な２５ｍｅｒのポリペプチド配列を配置した。それぞれのＴＭＧ間で、個々の２５ｍｅｒポリペプチド配列の位置は異なっているが隣接配列は一定に保たれており（図１３Ａ）、それによって、隣接配列とは無関係に、特定のエピトープの位置がＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲによる認識に影響を及ぼし得るかを評価できる。これとは別に、さらに２つの形式の直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）を設計した。この２つのＴＭＧ構築物では９種類の既知のエピトープを異なる位置に配置したが、ＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６エピトープだけは両方のＴＭＧ設計で６番目の位置に配置した（図１３Ｅ）。既知のエピトープは、ＣＤＫ４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＰ５３、ＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６、ＧＣＮ１Ｌ１、ＡＫＡＰ８Ｌ、ＩＴＰＲ３、ＣＭＶ、およびＨＳＰＡ９である。ＴＭＧが合計１２のポリペプチドをコードするように、２５ｍｅｒポリペプチドにさらに３つの配列を付加する。
ＴＭＧ発現性Ｂ細胞を生成するために、ＴＭＧをコードしている構築物を２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞（バイオベックファーマ）に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションした。得られたレトロウイルス粒子を用いて、不死化Ｂ細胞への形質導入を行なった。本明細書（実施例１０）で記載するように、ＴＭＧにコードされているＬｙ６Ｇマーカーとピューロマイシン耐性遺伝子を使って、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞を検出および濃縮することができる。遺伝子改変細胞の抗生物質選抜は当業者に知られており、また、本明細書（実施例１０）にも記載がある。ＴＭＧ導入遺伝子の発現を、Ｌｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーで検出する（図１３Ｂ、Ｆ）。
ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞のエピトープ（ＣＤＫ４－１７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＭＶ－１）またはＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞のエピトープ（ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６およびＴＰ５３）のいずれかを認識するＴＣＲを発現しているジャーカットＴ細胞を使って、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞によるＴ細胞エピトープの提示を評価することができる。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を生成するために、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞（バイオベックファーマ）またはフェニックス－アンフォウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ）に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションする。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞株への形質導入を行う。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変される。マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。ＴＣＲ改変Ｔ細胞の大部分が選別され、純度は９５％を超える。当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）が形質導入され、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するようにだけ改変され、選別されなかったジャーカットＴ細胞株にＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを形質導入する。ＴＰ５３－ＴＣＲ構築物を、選抜マーカーとして使用可能なブラストサイジン導入遺伝子に連結させる。ＴＰ５３－ＴＣＲ改変Ｔ細胞を０．２５ｅ６細胞／ｍＬの密度で９６時間、６μｇ／ｍＬのブラストサイジンで選抜する。培地を洗浄し、細胞を０．２５ｅ６細胞／ｍＬの細胞密度、ブラストサイジン非存在下でさらに７２時間培養して選抜を完了させる。アッセイ当日、７０％を超える細胞がＴＣＲ＋であることが示される。
その後、様々な形式のＴＭＧを提示するように改変されたＡＰＣで、ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を刺激する。共培養を開始する４８時間前に、ジャーカットレポーターＴ細胞を低密度（１ｍｌあたり０．１×１０６細胞）で播種した。Ｂ細胞は前述したように、０．２～０．２５ｅ６細胞／ｍＬの密度で、ｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養する。ＴＭＧ発現性Ｂ細胞とＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞とを、１：１のＥ：Ｔ比（ＴＣ処理した丸底の９６ウェルプレートの１ウェルにつき、２００μｌの培地と合計２００，０００の細胞を加える）で共培養する。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心し、３７℃で２０～２２時間インキュベートする。２０時間後、細胞をＣＤ６２Ｌ（データは示さない）とＣＤ６９に対する抗体で染色し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識を、フローサイトメーターを使い、ＣＤ６９の発現上昇として測定する（図１３Ｃ；図１３Ｄ；図１３Ｇ；ＣＤ６２Ｌに関するデータは示していない）。ここで示したデータから、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌを発現させることで、Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩ拘束性抗原提示とＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原提示の両方が向上し得ることが分かる。いくつかの例から、Ｔ細胞エピトープの位置および／または隣接するＴ細胞エピトープの性質が、ＭＨＣクラスＩＩの抗原提示に影響を及ぼし得ることが分かる。その他に可能な解釈としては、ＴＭＧ／ポリペプチドの全体的な安定性および／またはＴＭＧの細胞への標的化が向上した可能性が考えられる。総合すると、これらの結果から、ＴＭＧ導入遺伝子カセットの設計、およびＴＭＧのＢ細胞への送達にはさらに改良を加えられることが示唆される。
図１３Ａ～１３Ｇに示す結果のさらなる詳細を以下に提供する。図１３Ａでは、様々な形式のＴＭＧの模式図を示している。それぞれのＴＭＧは、ＴＭＧ構築物中で様々な位置に配置されており、ＣＤＫ４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＰ５３、およびＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６と呼ばれている４つの既知のエピトープを含む。その他の位置には、ヒト腫瘍中で検出される、無作為に選択した一アミノ酸変異から導出した付加的な２５ｍｅｒのポリペプチド配列を配置した。それぞれのＴＭＧ間で、個々の２５ｍｅｒポリペプチド配列の位置は異なっているが、隣接配列は一定に保たれている。図１３Ｂでは、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞およびＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に、ＴＭＧを安定的に形質導入した結果を示している。ウイルスを産生するために、ｂｃｌ－６-ｂｃｌ－ｘＬ構築物を２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス性上清を用いて、不死化Ｂ細胞へのレトロウイルスを介した形質導入を行なった。ＴＭＧの発現を、Ｌｙ６Ｇに対する抗体を使ったＦＡＣＳで測定した。ゲーティング戦略：リンパ球＞生細胞＞ＣＤ２０＋細胞＞ＧＦＰ＋細胞＞Ｌｙ６Ｇ。図１３Ｃは、様々な形式のＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞とＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に対する、クラスＩ拘束性Ｔ細胞の応答を示している。１３Ａで得られた様々なＴＭＧ構築物をそれぞれ別々に、健常提供者由来の不死化Ｂ細胞に形質導入した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞をＴＭＧ発現性Ｂ細胞と一晩共培養し、その後、ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで分析した。図１３Ｄは、様々な形式のＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞とＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に対する、クラスＩＩ拘束性Ｔ細胞の応答を示している。図１３Ａの様々なＴＭＧ構築物を、健常提供者由来の不死化Ｂ細胞に形質導入した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞をＴＭＧ発現性Ｂ細胞と一晩共培養し、その後、ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで分析した。図１３Ｅは、２種類の付加的な形式のＴＭＧの模式図である。この２つのＴＭＧ構築物では９種類の既知のエピトープを異なる位置に配置したが、ＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６エピトープだけは両方のＴＭＧ設計で６番目の位置に配置した。既知のエピトープは、ＣＤＫ４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＰ５３、ＭＡＧＥ－Ａ３／Ａ６、ＧＣＮ１Ｌ１、ＡＫＡＰ８Ｌ、ＩＴＰＲ３、ＣＭＶ、およびＨＳＰＡ９である。ＴＭＧが合計１２のポリペプチドをコードするように、２５ｍｅｒポリペプチドにさらに３つの配列を付加する。図１３Ｆでは、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞にＴＭＧを安定的に形質導入した結果を示している。ウイルスを産生するために、ＴＭＧ構築物を２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ細胞にトランスフェクションし、得られたウイルス性上清を用いて、不死化Ｂ細胞へのレトロウイルスを介した形質導入を行なった。ＴＭＧの発現を、Ｌｙ６Ｇに対する抗体を使ったＦＡＣＳで測定した。ゲーティング戦略：リンパ球＞単一細胞＞生細胞。図１３Ｇでは、２種類の形式のＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に対するクラスＩ拘束性Ｔ細胞とクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞の応答を示している。図１３Ｅで得られた様々なＴＭＧ構築物を、健常提供者に由来する不死化Ｂ細胞に形質導入した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞をＴＭＧ発現性Ｂ細胞と一晩共培養し、その後、ＣＤ６９の発現上昇をフローサイトメトリーで分析した。
実施例１０：Ｂ細胞の不死化、Ｂ細胞への形質導入およびＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞の生成に関する詳細な説明
Ｂ細胞の単離
Ｂ細胞を、凍結保存しておいた健常提供者または患者のＰＢＭＣから、当業者に知られている利用可能な磁気ビーズ細胞分離技術のうちの１つを用いて単離する。本発明で使用した磁気ビーズを使った細胞分離技術には、以下のものがある。（ｉ）ネガティブ選抜によるＢ細胞の単離。例えば、モジョソートヒト汎Ｂ細胞単離キット（バイオレジェンド）を使い、製造業者の説明に従ってＢ細胞を単離する。簡単に説明すると、ＰＭＢＣをビオチンで標識したＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５に対する抗体とインキュベートする。インキュベートした後、ストレプトアビジンで標識した磁気ナノビーズを加える。２回目のインキュベーションの後、細胞の入ったチューブを磁石の中に入れると磁気標識された画分はチューブ側面に保持され、何とも結合していないＢ細胞が液体中に残り、これをその後の使用のためにチューブから吸い出すことができる（図７Ａ）。（ｉｉ）ポジティブ選抜によるＢ細胞の単離。例えば、ミルテニーの抗ＣＤ２０ミクロビーズとミルテニーのオートマックス装置を使い、製造業者の説明に従って、Ｂ細胞を単離する。簡単に説明すると、ＰＢＭＣの生存率に応じて、死細胞除去キット（ミルテニー）を使い、Ｂ細胞の単離を継続する前に試料から死細胞を除去することができる。死細胞を除去することで、ミクロビーズの死細胞への非特異的な結合を減らせるため、細胞分離を改善することができる。通常、生存率が８５％未満の場合には生存率が低いと考えられ、細胞分離を行う前に死細胞を除去することが望ましい。死細胞を除去した後のＰＢＭＣから、あるいは解凍したＰＢＭＣから直接、ＰＢＭＣと抗ＣＤ２０ミクロビーズをインキュベートすることによってＢ細胞を単離する。インキュベーションステップの１５分後に試料をオートマックス（ミルテニー）にかけ、例えばポッセル（Ｐｏｓｓｅｌ）またはポッセル感受性（ＰｏｓｓｅｌＳ）などのポジティブ選抜法を装置で実行することができる。陽性画分はＣＤ２０陽性Ｂ細胞を含み、これをＢ細胞の不死化などのその後の処理に用いることができる。陰性画分は、Ｔ細胞などのその他全ての細胞を含む。ミルテニー汎Ｔ細胞単離キットを使って、この画分から、特定のサブタイプのＴ細胞、例えば抗原を経験したＴ細胞を単離することもできる。Ｂ細胞とＴ細胞両方の細胞サブセットをその後の処理、例えばＴ細胞応答を評価すること、または自己Ｂ細胞を抗原提示細胞として利用して、試料からＴＣＲ遺伝子を単離することに用いる場合には、ＰＭＢＣからＢ細胞とＴ細胞の両方を同時に単離することにも興味がもたれる。
当業者であれば、初代ヒトＢ細胞を、例えばフローサイトメトリーソーティングのような別の単離方法によって単離してもよいこと、そして、いかなるＢ細胞単離法も、ＥＢＶ感染またはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ導入遺伝子のレトロウイルスを介した形質導入に干渉すること含むがこれらには限定されない、単離したＢ細胞のその後の処理に干渉すべきでないことを理解する。
ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬによるＢ細胞の不死化
ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子は胚中心Ｂ細胞で発現し、これらが分化せずに増殖することを可能にしている。Ｂ細胞のＣＤ４０受容体を刺激することは、インビトロで初代ヒトＢ細胞を維持するために有用である。クワッケンボスらは、初代Ｂ細胞にＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ導入遺伝子を導入することでＢ細胞を不死化し、これらの細胞をＩＬ－２１およびＣＤ４０Ｌの存在下で培養して細胞を刺激し、これらを長期間増殖させる方法を報告している（クワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２０１０）。ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ導入遺伝子の導入に基づく初代ヒトＢ細胞不死化の一般的な工程を図１４に示す。
本発明においてＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ不死化Ｂ細胞を生成するために、Ｂ細胞を加える前に、ｈＣＤ４０Ｌ－発現性Ｌ細胞をＴＣ処理したプレートに少なくとも４時間播種することで、単離したＢ細胞を活性化する。ＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞は、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子をレトロウイルスを介してマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ）に形質導入することによって生成する。レトロウイルスは、フェニックス－エコウイルス産生細胞のトランスフェクションによって生成し、このウイルスをＬ細胞への形質導入に用いる。その後、ＣＤ４０Ｌを形質導入した細胞をＦＡＣＳを使ったソーティングによって選別し、６０Ｇｙの放射線を照射する。
通常、２０，０００から２００，０００個の単離したＢ細胞を放射線照射済みのｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上で、１：１～１：５の比率で培養する。典型的には、単離したＢ細胞の収量により、ＴＣ処理した２４ウェル培養プレート（１ｅ５Ｌ細胞および１～５ｅ５Ｂ細胞）またはＴＣ処理した６ウェル培養プレート（１ｅ６Ｌ細胞および１～５ｅ６Ｂ細胞）を使用する。Ｂ細胞を、完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中、ｒｈ－ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で培養する。
４８時間後に培地を、ｒｈ－ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）、ｒｈ－ＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した新しい完全Ｂ細胞培地と交換する。２４時間後、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬレトロウイルス性構築物を単独で、あるいはＣＤ４０Ｌ導入遺伝子と組み合わせて安定的に形質導入することで、活性化Ｂ細胞を不死化させる。初代Ｂ細胞へのレトロウイルスを介した形質導入に関する手順は文献（例えばクワッケンボスら、ネイチャー・メディシン、２０１０）に記載されており、また、当業者に公知である。簡単に説明すると、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬおよびＣＤ４０ＬをコードしているプラスミドＤＮＡを、フェニックス－アンフォまたは２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞に、フュージーン６トランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションする。４８時間後にウイルス上清を回収し、これを用いて、当業者に知られているスピンを利用した形質導入によるＢ細胞への形質導入を行う。
形質導入した後、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬを形質導入したＢ細胞をｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した完全Ｂ細胞培地中で培養する。ｒｈ－ＩＬ－２とＩＬ－４を含有する培地でＢ細胞を長期間培養すると、望ましくない残留Ｔ細胞の成長が起こる場合がある。２４時間後に、ｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞をプレート底部に接着させておいたＴＣ処理済み培養プレートに細胞を移し、細胞を完全Ｂ細胞培地中、ｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で培養する。Ｂ細胞を２００，０００～２５０，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、ＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞と１：１～１：５の比で共培養する。通常、Ｂ細胞を１週間に２回、２００，０００～２５０，０００細胞／ｍＬの密度で分割し、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した完全Ｂ細胞培地中でｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上に１：１～１：５の比でプレーティングする。
７２時間後に、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌを形質導入したＢ細胞をｈＣＤ４０Ｌ発現性Ｌ細胞上から除去して新しいＴＣ処理済み組織培養プレートまたは組織培養フラスコに移し、そしてｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む完全Ｂ細胞培地中で、２００，０００～２５０，０００細胞／ｍＬの密度で培養する。細胞密度を維持するために、細胞を１週間に２回分割し、新しいｒｈ－ＩＬ－２１を添加する。
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を感染させることによるＢ細胞の不死化
別の不死化法にはＢ細胞にＥＢＶを感染させることに基づく方法があり、例えばトラジアイら、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、２０２１．Ｔによって報告されている。前述したようにＢ細胞を単離し、２ｘＣｐＧ－ＯＤＮ２００６（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ）を含む完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で培養して、トール様受容体を活性化させる。その後、１ｍＬのＥＢＶウイルス上清（ＡＴＣＣ）を使ってＥＢＶを感染させ、そして細胞を３７℃で４時間インキュベートする。細胞を洗浄し、２ｘＣｐＧ－ＯＤＮ２００６（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ）と１％のＥＢＶウイルス上清を含む完全Ｂ細胞培地に再懸濁する。培地が黄色くなった３日目と８日目に細胞を洗浄し、ＣｐＧを含まない完全Ｂ細胞培地に再懸濁する。Ｂ細胞の凝集塊が現れて増殖が可視化できるようになったら細胞を洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳと１％（ｖ／ｖ）Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ培地中で培養する。２または３日ごとに細胞を１：２の比率で分割する。
直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）導入遺伝子のＢ細胞への形質導入
様々な不死化技術と、患者特異的な変異を直列型ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形式でコードしている導入遺伝子の安定的な形質導入によって抗原発現性不死化Ｂ細胞を生成することは、ＴＣＲ探索の観点から興味がもたれる場合がある。ＴＭＧ導入遺伝子は様々な形式で設計することができる。例えば、異なる数の推定Ｔ細胞エピトープに加えて、ＴＭＧをコードしている遺伝子カセットにはさらに、Ｌｙ６Ｇタンパク質とピューロマイシン耐性遺伝子の両方を含めることができる。このことにより、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞を抗生物質選抜によって選抜でき、また、ＴＭＧの発現をＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによって検出できるようになる。
ＴＭＧ導入遺伝子をＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞にレトロウイルスを介して形質導入するために、ＴＭＧをコードしているプラスミドＤＮＡをフェニックス－アンフォまたは２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞に、フュージーン６トランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションする。４８時間後にウイルス上清を回収し、これを用いて、当業者に知られているスピンを利用した形質導入による不死化Ｂ細胞への形質導入を行う。翌日、細胞を新しいＴＣ処理済み培養プレートに細胞を移し、ｒｈ－ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む新しい完全Ｂ細胞培地を、細胞に１：１の量比で加える。
７２時間後に培地の半量を除去し、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）とピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を含む新しい完全Ｂ細胞培地を、細胞に１：１の量比で加える。抗生物質選抜を４日間継続し（別段の指示がない限り）、その後、ピューロマイシンを用いた選抜後のＴＭＧ発現性Ｂ細胞の発現頻度を、蛍光色素で標識したＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーで測定する。
ＥＢＶ不死化Ｂ細胞にも同様にＴＭＧ導入遺伝子を形質導入できることに注意が必要である。ＴＭＧをコードしているプラスミドＤＮＡを、フェニックス－アンフォまたは２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞に、フュージーン６トランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションする。４８時間後にウイルス上清を回収し、これを用いて、当業者に知られているスピンを利用した形質導入による不死化Ｂ細胞への形質導入を行う。翌日、新しい培地（ＲＰＭＩ１６４０、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシン）を細胞に１：１の量比で加える。
７２時間後に培地の半量を除去し、ピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）を含む新しい培地を細胞に１：１の量比で加える。抗生物質選抜を４日間継続し（別段の指示がない限り）、その後、ピューロマイシンを用いた選抜後のＴＭＧ発現性Ｂ細胞の発現頻度を、蛍光色素で標識したＬｙ６Ｇ特異的抗体を使ったフローサイトメトリーで測定する。
ＴＣＲ遺伝子のジャーカットＴ細胞への形質導入
ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープのいずれかを認識するＴＣＲを発現しているジャーカットＴ細胞を使うことで、ＴＭＧ発現性Ｂ細胞によるＴ細胞エピトープの提示を評価することができる。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を生成するために、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、フェニックス－アンフォ（ＡＴＣＣ）または２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖ（バイオベックファーマ）ウイルス産生細胞に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションする。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞株への形質導入を行う。当業者であれば、多様なジャーカットレポーターＴ細胞株から選択することができる。（ｉ）ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変される。（ｉｉ）ジャーカットレポーターＴ細胞株は、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変される。（ｉｉｉ）ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β－Ｔ２Ａ－ＣＤ４導入遺伝子を形質導入すると、ヒトＣＤ４、ＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変される。最後の（ｉｉｉ）は内在性ＴＣＲの発現を欠いており、かつ、ＭＨＣＩ拘束性ＴＣＲとＭＨＣＩＩ拘束性ＴＣＲの両方を発現させることができるＣＤ４とＣＤ８のその細胞表面での発現が最大であることから、この細胞株が好ましい。マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。ＴＣＲ構築物に（ｉ）ピューロマイシン選抜マーカー導入遺伝子または（ｉｉ）ブラストサイジン選抜マーカー導入遺伝子が連結されている場合、フローサイトメトリーを使ったソーティングまたは抗生物質選抜によってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を濃縮することができる。（ｉ）簡単に説明すると、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を０．５ｅ６細胞／ｍＬの密度、６μｇ／ｍＬのブラストサイジン存在下で９６時間培養する。培地を洗浄し、細胞を０．５ｅ６細胞／ｍＬの密度、ブラストサイジン非存在下でさらに７２時間培養して選抜を完了させる。場合によっては、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を０．２５ｅ６細胞／ｍＬの密度、６μｇ／ｍＬのブラストサイジン存在下で９６時間培養する。培地を洗浄し、細胞を０．２５ｅ６細胞／ｍＬの密度、ブラストサイジン非存在下でさらに７２時間培養して選抜を完了させる。（ｉｉ）簡単に説明すると、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を０．５ｅ６細胞／ｍＬの密度、２５０ｎｇ／ｍＬのピューロマイシン存在下で９６時間培養する。ジャーカットＴ細胞を、培地（２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中、０．１～１ｅ６細胞／ｍＬの密度で培養する。
実施例１１：長いペプチドをエレクトロポレーションで導入することによる、ＭＨＣクラスＩ複合体におけるＴ細胞エピトープの効率的な提示
均一な長さ（２５ｍｅｒ）のポリペプチドをエレクトロポレーションによって導入された不死化初代ヒトＢ細胞は、ポリペプチドにコードされているＴ細胞エピトープを、ＭＨＣクラスＩ経路を介して効率的に処理および提示し、そして、ポリペプチドにコードされているＴ細胞エピトープに特異的なＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲを発現しているＴ細胞を活性化する。健常提供者由来のＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に、短い（１０ｍｅｒ）ペプチド（ＡＬＬＥＴＰＳＬＬＬ、配列番号５）、またはＧＣＮ１Ｌ１変異型ペプチドをコードしている長い（２５ｍｅｒ）ペプチド（ＦＳＷＮＶＫＡＡＬＬＥＴＰＳＬＬＬＡＫＶＧＩＡＬＫ、配列番号６）、またはＣＭＶ変異型の長いペプチド（ＷＱＡＧＩＬＡＲＮＬＶＰＭＶＡＴＶＱＧＱＮＬＫＹＱ、配列番号７）を、当業者に知られている方法によりエレクトロポレーションで導入した。簡単に説明すると、各試料につき０．２ｅ６のＢ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを完全に除去した後、乾燥させたペレットを、２５ｅ６細胞／ｍＬの濃度でエレクトロポレーション緩衝液（ＳＦ－バッファー、ロンザ（Ｌｏｎｚａ））に再懸濁した。この混合液を１試料あたり２０μＬずつ、適量のペプチドを含む９６ウェル組織培養プレートに加え、表示のペプチド濃度とした。細胞を１６ウェルエレクトロポレーションストリップ（ロンザ）に移し、その後、ＤＮ１００プログラム（ロンザ・アマクサ（Ａｍａｘａ））を使ってエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、細胞を３７℃で１０分間静置し、９６ウェルの丸底組織培養プレートに移し、完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）と合わせて最終的な量が２００μＬとなるようにし、そして３７℃で０、２、４、５、６、１０または２４時間インキュベートした。ペプチドをエレクトロポレーションで導入した後に一定の時間静置することにより、対応する実験条件において、標的細胞にペプチドを外的に負荷することが可能になる。インキュベーションの後、細胞を回収し、１ウェルあたり１ｅ５の細胞をプレーティングした。その後、細胞をしっかりと洗浄し、残留しているペプチドを完全に除去した。本実験では陽性対照として、ＧＣＮ１Ｌ１、ＣＭＶおよびＭＡＧＥ－Ａ３の変異型エピトープ（ＴＭＧ１２Ｌ１、ＭＡＧＥ－Ａ３に関連する結果を実施例１２に示す）をコードしているＴＭＧを発現しているＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞を含めた。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を生成するために、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、フェニックス－アンフォウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ）に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションした。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞株への形質導入を行なった。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β－Ｔ２Ａ－ＣＤ４導入遺伝子を形質導入して、ヒトＣＤ４、ＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変した。マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。実験の前に、ＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲまたはＣＭＶ１ ＴＣＲを発現しているエフェクターＴＣＲ－ＫＯジャーカットＴ細胞を１ｅ５細胞／ｍＬの密度で２日間播種し、活性化マーカーのバックグラウンドをできるだけ低減した。ペプチドをエレクトロポレーションで導入したＴＭＧ発現性Ｂ細胞とＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を１：１のＥ：Ｔ比（ＴＣ処理済み丸底９６ウェルプレートの１ウェルにつき２００μｌに溶解した合計２００，０００の細胞を加える）で共培養した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心し、３７℃で２０～２２時間インキュベートする。２０時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識を、フローサイトメーターを使い、ＣＤ６９の発現上昇として測定した。
図１５では、ペプチドをエレクトロポレーションで導入した後、短いペプチドと長いペプチドの両方からＧＣＮ１Ｌ１抗原が効率的に提示されたことを示している。エピトープをコードしているＴＭＧ１２Ｌ１構築物を発現しているＢ細胞（「ＴＭＧ１２Ｌ１」）、親ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞（「未負荷」）、Ｂ細胞を含まない培地（「Ｔｃのみ」）、または５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと１μＭのイオノマイシンを含む培地（「ＰＭＡ／Ｉｏｎ」）を、抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した。ＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞との（共）培養を行なった後、Ｔ細胞の活性化を生細胞におけるＣＤ６９＋細胞の割合として測定した。
ペプチドをエレクトロポレーションで導入するかまたは負荷した後の様々な時点における、クラスＩ拘束性ＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲを介したＴ細胞の活性化
ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に、変異型ＧＣＮ１Ｌ１エピトープをエレクトロポレーションで導入するかまたは負荷した。エレクトロポレーションの後、６、１０または２４時間静置した後に（図１６Ａ）、またはペプチドを負荷してから同様の時点で（図１６Ｂ）、Ｔ細胞の活性化を様々なペプチド濃度について測定した。ＴＭＧ１２Ｌ１エピトープをコードしているＴＭＧ１２Ｌ１構築物を発現しているＢ細胞（「ＴＭＧ１２Ｌ１」）、親ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞（「未負荷」）、Ｂ細胞を含まない培地（「ＴＣのみ」）または５０ｎｇ／μＬのＰＭＡと１μＭのイオノマイシンを含む培地（「ＰＭＡ／Ｉｏｎ」）を、抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した（図１６Ｃ）。ＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞との（共）培養を行なった後、Ｔ細胞の活性化を生細胞におけるＣＤ６９＋細胞の発現の割合として測定した。
ペプチドをエレクトロポレーションで導入するかまたは負荷した後の様々な時点における、クラスＩ拘束性ＣＭＶ ＴＣＲを介したＴ細胞の活性化
ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に、ＣＭＶエピトープをエレクトロポレーションで導入するかまたは負荷した。エレクトロポレーションの後、６、１０または２４時間静置した後に（図１７Ａ）、またはペプチドを負荷してから同様の時点で（図１７Ｂ）、Ｔ細胞の活性化を様々なペプチド濃度について測定した。ＴＭＧ１２Ｌ１エピトープをコードしているＴＭＧ１２Ｌ１構築物を発現しているＢ細胞（「ＴＭＧ１２Ｌ１」）、親ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ｘＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞（「未負荷」）、Ｂ細胞を含まない培地（「ＴＣのみ」）または５０ｎｇ／μＬのＰＭＡと１μＭのイオノマイシンを含む培地（「ＰＭＡ／Ｉｏｎ」）を、抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した（図１７Ｃ）。ＣＭＶ ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞との（共）培養を行なった後、Ｔ細胞の活性化を生細胞におけるＣＤ６９＋細胞の発現の割合として測定した。
ここに示したデータは、ペプチドのエレクトロポレーションによって導入された長いペプチドと短いペプチドはいずれも、ＭＨＣクラスＩ分子で効率的に処理され、提示されること、およびＴＣＲを形質導入したＴ細胞によるこれら標的細胞の認識がＴＭＧ発現性標的Ｂ細胞と同等であることを表している（図１５～１７）。このデータはまた、エレクトロポレーション後に６時間処理した場合に、エレクトロポレーションでペプチドを導入したＢ細胞による認識が、ペプチドを負荷した場合を上回っていたことを示している（図１６および図１７）。
実施例１２：ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方で長い２５ｍｅｒペプチドはうまく処理され提示され得る
不死化初代ヒトＢ細胞に均一な長さ（２５ｍｅｒ）のポリペプチドをエレクトロポレーションによって導入すると、このポリペプチドにコードされているＴ細胞エピトープがＭＨＣクラスＩＩ経路を介して効率的に処理および提示され、そしてこのポリペプチドにコードされているＴ細胞エピトープに特異的なＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲを発現しているＴ細胞が活性化される。
実施例１１と同様に実施した実験において（ただしペプチドの濃度とエレクトロポレーション後の静置時間は図１８Ａ～１８Ｃに示した通りである）、ＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲおよびＣＭＶ ＴＣＲ、並びにＭＡＧＥＡ３ ＴＣＲおよび対応する変異型の長いペプチド（ＧＣＮ１Ｌ１-配列番号６）（ＣＭＶ-配列番号７）（ＭＡＧＥＡ３－ＩＬＧＤＰＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰ、配列番号８）を使用した。データを図１８Ａ～１８Ｃに示す。エレクトロポレーション後の静置時間を２時間以上にした場合に、全てのペプチド（ＭＨＣクラスＩ拘束性のＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲとＣＭＶ ＴＣＲの両方、およびクラスＩＩ拘束性ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲを含む）が応答を誘発することができた。
実施例１１と合わせて、これらの実施例から、ペプチドのエレクトロポレーションによって導入された長い２５ｍｅｒのペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方で効率的に処理され、提示されることが分かる。
実施例１３：試験したＴＣＲに関する一定の濃度範囲のペプチドに対する感受性
不死化初代ヒトＢ細胞に、Ｔ細胞エピトープをコードしている均一な長さ（２５ｍｅｒ）のポリペプチドを、段階的に濃度を変えて、エレクトロポレーションによって導入し、これを、これらの抗原発現性不死化Ｂ細胞と規定のＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲを発現するように改変したＴ細胞との共培養を伴う免疫測定に使用して、ＴＣＲの感受性を評価する。次いで、感受性に関するアッセイを行う。
エレクトロポレーションアッセイでの長いペプチドの例示的な濃度は、二人の健常提供者に由来する不死化Ｂ細胞と、このペプチドに対応するＴＣＲを形質導入した自己ＰＢＭＣとを使ったペプチドの滴定試験により決定した（図１９Ａ～１９Ｂ）。健常提供者（ＨＣ８３６およびＨＣ８５８）に由来するＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞に、０μＭから１００μＭの範囲の変異型ＧＣＮ１Ｌ１またはウイルス性ＣＭＶをコードしている滴定量のペプチドを、前述したようにエレクトロポレーションによって導入した。エレクトロポレーションの後、Ｂ細胞を３７℃で４時間静置する（最終濃度が０μＭから１０μＭの範囲になる）。ＧＣＮ１Ｌ１ ＴＣＲまたはＣＭＶ ＴＣＲを形質導入した自己ＰＢＭＣを、エフェクターと標的細胞の比が１：１になるように加えた。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心し、３７℃で２０～２２時間インキュベートした。２０時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識を、フローサイトメーターを使い、ＣＤ６９の発現上昇として測定した。
ここに示したデータは、試験したＴＣＲについて、一定の濃度範囲のペプチドに対する感受性を表している（図１９Ａ～１９Ｂ）。このデータはさらに、ペプチドのＴ細胞応答を誘発する能力はドナーには無関係であることも示している。
実施例１４：クラスＩ拘束性ＴＣＲとクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの両方に関するペプチド滴定アッセイ
不死化初代ヒトＢ細胞に、Ｔ細胞エピトープをコードしている均一な長さ（２５ｍｅｒ）のポリペプチドを、段階的に濃度を変えて、エレクトロポレーションによって導入し、これを、これらの抗原発現性不死化Ｂ細胞と規定のＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲを発現するように改変したＴ細胞との共培養を伴う免疫測定に使用して、ＴＣＲの感受性を評価することができる。
実施例１３と同様に実施した実験において、ＭＡＧＥＡ３ ＴＣＲと対応する変異型ペプチドを使用した。データを図２０に示す。
実施例１３と合わせて、このデータは、２５ｍｅｒペプチドを使ったペプチドのエレクトロポレーション実験を利用して、クラスＩ拘束性ＴＣＲとクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ両方のペプチドの滴定アッセイを実施することができることを示している。
実施例１５：長いペプチドの提示
それぞれが異なる推定新生抗原をコードしている均一な長さ（２５ｍｅｒ）のポリペプチドのセットをエレクトロポレーションによって導入した不死化初代ヒトＢ細胞を使って、変異型新生抗原に、ＴＣＲ探索プラットフォームにより同定したＴＣＲリードの特異性を付与する。
本実施例では、ＢＣＬ６／ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞へのペプチドのエレクトロポレーションを使った長いペプチドの効率的な提示、および抗原スクリーニングにおけるこれらＡＰＣの利用について説明する。
実施例１５Ａ：ＢＣＬ６ＸＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞
我々のＴＣＲ探索プラットフォームを使った基底細胞癌（ＢＣＣ）患者のスクリーニングで、１２のミニ遺伝子をコードしているＴＭＧを認識するＴＣＲを同定した。それぞれが、これら５つのＴＣＲリードのうちの１つを発現しているジャーカットレポーターＴ細胞株を、単一のＴＭＧ構築物を単一の複製物として発現している自己のＢＣＬ６／ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞と共培養した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を生成するために、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞（バイオベック）に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションした。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞株への形質導入を行なった。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子を形質導入して、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変した。マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。実験の２日前に、レポーターＴＣＲを形質導入したＴ細胞を１ｅ５細胞／ｍＬの密度で播種した。９６ウェルの１ウェルにつき１ｅ５の細胞を加え、エフェクター細胞と標的細胞の比を１：１として共培養を行なった。１６～１８時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、図２１Ａに示すように、同定したＴＣＲのリードについて、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識をフローサイトメーターを使いＣＤ６９の発現上昇として測定した。形質導入していないＢ細胞（「Ｂ細胞」）、Ｂ細胞を含まない培地（「Ｔｃのみ」）、または５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと１μＭのイオノマイシンを含む培地（「ＰＭＡ／Ｉｏｎ」）を、抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した。ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞との（共）培養を行なった後、Ｔ細胞の活性化を、ＴＣＲを形質導入したＣＤ８＋細胞におけるＣＤ６９＋細胞の発現の割合として測定した。
その後、５つのＴＣＲリードによって認識される新生抗原を決定するために、単一の２５ｍｅｒペプチドをコードしているＴＭＧをエレクトロポレーションで導入した自己ＢＣＬ６／ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞を使い、ＴＣＲの特異性を決定した（図２１Ｂ）。前述したように、細胞にエレクトロポレーションを行なった。簡単に説明すると、１種類のペプチドにつき、濃度１ｍＭの単一の長いペプチドを含有している２０μＬのエレクトロポレーション緩衝液に０．５ｅ６のＢ細胞を溶解し、エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーションの後、細胞を４時間、２００μＬの完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で静置し、ペプチドの最終濃度を１００μＭとした。静置期間の後にＢ細胞をしっかりと洗浄し、回収して、そして複数のウェルに１ウェルあたり１ｅ５の細胞を配分した。同定したＴＣＲを発現するように、内在性ＴＣＲの発現を欠いているレポータージャーカットＴ細胞を改変し、アッセイを行う前に２日間、低密度（１００，０００細胞／ｍＬ）で播種した。９６ウェルの１ウェルにつき１ｅ５の細胞を加え、エフェクター細胞と標的細胞の比を１：１として共培養を行なった。１６～１８時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識をフローサイトメーターを使いＣＤ６９の発現上昇として測定した。形質導入していないＴ細胞（「未導入」）、エレクトロポレーションを行なっていないＢ細胞（「非導入」）、および１２全てのエピトープをコードしているＴＭＧ（「ＴＭＧ３５形質導入」）を抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した。これらのデータは、５つ全てのＴＣＲのリードが、親和性はそれぞれ異なるものの、ペプチド７を認識することを示している（図２１Ｂ）。
実施例１５Ｂ：ＥＢＶ不死化Ｂ細胞
我々のＴＣＲ探索プラットフォームを使った大腸癌（ＣＲＣ）患者のスクリーニングで、９つのミニ遺伝子をコードしているＴＭＧを認識するＴＣＲを同定した。それぞれが、これら２つのＴＣＲリードのうちの１つを発現しているジャーカットレポーターＴ細胞株を、単一のＴＭＧ構築物を単一の複製物として発現しているＥＢＶ不死化Ｂ細胞と共培養した。ＴＣＲを形質導入したジャーカットＴ細胞を生成するために、ＴＣＲをコードしているプラスミドを、２９３Ｖｅｃ－Ｂａｅｖウイルス産生細胞（バイオベック）に、フュージーントランスフェクション試薬を使い、当業者に知られている手順によってトランスフェクションした。得られたレトロウイルス粒子を用いて、ジャーカットレポーターＴ細胞株への形質導入を行なった。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内在性ＴＣＲの発現を欠いており（このような遺伝的ノックアウトの生成については、例えばメッザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法によってＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子を形質導入して、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように改変した。マウスのＴＣＲ定常ドメイン配列をＴＣＲ導入遺伝子に組み込むことで、マウスＴＣＲβ定常ドメイン特異的抗体を使ったフローサイトメトリーによってＴＣＲ改変ジャーカットＴ細胞を検出することができる。実験の２日前に、レポーターＴＣＲを形質導入したＴ細胞を１ｅ５細胞／ｍＬの密度で播種した。９６ウェルの１ウェルにつき１ｅ５の細胞を加え、エフェクター細胞と標的細胞の比を１：１として共培養を行なった。１６～１８時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、図２２Ａに示すように、同定したＴＣＲのリードについて、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識をフローサイトメーターを使いＣＤ６９の発現上昇として測定した。形質導入していないＢ細胞（「Ｂ細胞」）、Ｂ細胞を含まない培地（「Ｔｃのみ」）、または５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと１ｍＭのイオノマイシンを含む培地（「ＰＭＡ／Ｉｏｎ」）を、抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した。ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞との（共）培養を行なった後、Ｔ細胞の活性化を、ＴＣＲを形質導入したＣＤ８＋細胞におけるＣＤ６９＋細胞の発現の割合として測定した。
その後、２つのＴＣＲリードによって認識される新生抗原を決定するために、単一の２５ｍｅｒペプチドをコードしているＴＭＧをエレクトロポレーションで導入した自己ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使い、ＴＣＲの特異性を決定した（図２２Ｂ）。本実施例では、ミニ遺伝子のうちの１つがフレームシフト変異から生じたもので、本実験では最終的に、重なり合っている５つの２５ｍｅｒペプチドを使用した。前述したように、細胞にエレクトロポレーションを行なった。簡単に説明すると、１種類のペプチドにつき、濃度１ｍＭの単一の長いペプチドを含有している２０μＬのエレクトロポレーション緩衝液に０．５ｅ６のＢ細胞を溶解し、エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーションの後、細胞を４時間、２００μＬの完全Ｂ細胞培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）グルタマックス、５０ｎＭの２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で静置し、ペプチドの最終濃度を１００μＭとした。静置期間の後にＢ細胞をしっかりと洗浄し、回収して、そして複数のウェルに１ウェルあたり１ｅ５の細胞を配分した。同定したＴＣＲを発現するように、内在性ＴＣＲの発現を欠いているレポータージャーカットＴ細胞を改変し、アッセイを行う前に２日間、低密度（１００，０００細胞／ｍＬ）で播種した。９６ウェルの１ウェルにつき１ｅ５の細胞を加え、エフェクター細胞と標的細胞の比を１：１として共培養を行なった。１６～１８時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識をフローサイトメーターを使いＣＤ６９の発現上昇として測定した。形質導入していないＴ細胞（「未導入」）、エレクトロポレーションを行なっていないＢ細胞（「非導入」）、および１３全てのエピトープをコードしているＴＭＧ（「ＴＭＧ３形質導入」）を抗原提示および／またはＴ細胞活性化に対する対照として共培養に使用した。これらのデータは、片方のＴＣＲがペプチド２を認識し、もう一方がペプチド１２を認識することを示している（図２２Ｂ）。
実施例１６：ＢＣＬ６／ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞へのペプチドのエレクトロポレーションを使った長いペプチドの提示
不死化初代ヒトＢ細胞に、新生抗原の野生型（非変異型）対応物をコードしている均一な長さ（２５ｍｅｒ）のポリペプチドをエレクトロポレーションによって導入し、これを使って、ＴＣＲ探索プラットフォームを利用して同定したＴＣＲリードの安全性を評価することができる。
本実施例では、ＢＣＬ６ＸＬ／ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞へのペプチドのエレクトロポレーションを使った長いペプチドの効率的な提示、および野生型抗原と新生抗原とを区別するＴＣＲの能力決定におけるこれらＡＰＣの利用について説明する。
ＴＣＲの変異特異性を決定するために、実施例１５Ａに記載したように、高濃度（１００μＭ、静置した後の最終濃度は１０μＭとなった）の野生型または変異型ペプチドをＢＣＬ６／ｘＬ－ＣＤ４０Ｌ不死化Ｂ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。野生型抗原は、一アミノ酸置換によって新生抗原とは異なっていた。実施例１５に記載したのと同様に（同定したさらなるＴＣＲリードを使って）、共培養を行なった。簡単に説明すると、エレクトロポレーションにかけた１ｅ５のＢ細胞を、対応するＴＣＲを形質導入した１ｅ５のＴＣＲ－ＫＯジャーカットＴ細胞と、エフェクター細胞と標的細胞の比を１：１として培養した。１６～１８時間後、細胞をＣＤ８とＣＤ６９に対する抗体で染色し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による特異的な認識をフローサイトメーターを使いＣＤ６９の発現上昇として測定した。これらのデータは、全てのＴＣＲが変異特異的で、野生型ペプチドを認識しないことを示している（図２３）。
実施例１７：生育不能な腫瘍生検から新生抗原特異的なＴ細胞受容体遺伝子を同定するためのＡＰＣの利用
本実施例では、個別の患者ごとに、生育不能な腫瘍生検から新生抗原特異的なＴ細胞受容体遺伝子を同定することにおける、本明細書に記載の抗原を発現している細胞の利用について説明する。
腫瘍由来のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖から、コンビナトリアルアセンブリーによってＴＣＲライブラリを生成する過程が開発されている。これらのＴＣＲ鎖を、腫瘍組織から単離したＤＮＡまたはＲＮＡのバルクＴＣＲ鎖シーケンシングによって同定する。ＴＣＲαとβの対をおよそ１．８ｋｂの導入遺伝子としてコードし、レポーター細胞に導入する。本明細書に記載の抗原を発現している細胞で刺激することで、遺伝子バリアントライブラリーのスクリーニングから抗原応答性ＴＣＲαβの組み合わせを発現しているレポーター細胞を選抜することができる。コンビナトリアルアセンブリーであることを考慮すると、ＴＣＲαとＴＣＲβ両方の可変配列を決定することによってのみ、各ＴＣＲバリアントを明確に同定することができる。従って、遺伝子スクリーニングの過程で単離したレポーター細胞内にコードされている導入遺伝子を、およそ１．５ｋｂのＰＣＲ増幅産物として回収し、オックスフォード・ナノポアシーケンシングを使ってその全長配列を決定し、そして、専用の生物情報学的分析パイプラインで分析する。この過程から新生抗原に特異的なＴＣＲのリードが同定され、これをさらに、がん治療での使用可能性について評価することができる。
実施例１８：ＡＰＣ細胞型
抗原提示細胞として使用する細胞型
原理上は、いずれの細胞もＴＣＲ探索用のＡＰＣになるように改変することができる。本発明では、２つの理由により初代ヒトＢ細胞を使用する。第一に、各個人由来する自己細胞を用いることで、全ての自己ＨＬＡアレルに対するＴＣＲの探索が可能になり、完全に個別化されたＴＣＲ探索が容易になる。
ＥＢＶ感染またはＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬの形質導入のいずれかによって、初代ヒトＢ細胞を不死化させることができる。それにより、末梢血から単離したＢ細胞のサブセットに形質導入を行うことによって、大量の初代ヒトＢ細胞をインビトロで得ることができる（下記参照）。大量のＡＰＣは、ＴＣＲ探索の過程を十分な感度で実施するのに有用である。ＴＣＲライブラリーを機能的遺伝子スクリーニングの過程でスクリーニングする。今日まで、一般的なＴＣＲライブラリーには１０，０００のＴＣＲバリアントが含まれている。１：１０，０００の頻度で存在するＴＣＲの検出を可能にするためには、過程が完了するまでの全体を通じて、それぞれのＴＣＲバリアントを平均して８００倍表させなければならない。このようなライブラリーのスクリーニングを行うには、それぞれが８千万のＡＰＣと８千万レポーターＴ細胞を含む共培養を４回実施するため、少なくとも３億２千万のＡＰＣが必要になる。
細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、または維持すること
単離したＢ細胞にＢＣＬ－６およびＢＣＬ－ＸＬをレトロウイルスを介して形質導入することによって、初代ヒトＢ細胞の生存延長が達成される。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、磁気ビーズを使ったネガティブ選抜によって初代ヒト汎Ｂ細胞のサブセットを単離し、これをその後、ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞とＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１存在下で共培養することで活性化させる。活性化の７２時間後、Ｂ細胞にＢＣＬ－６、ＢＣＬ－ＸＬとＣＤ４０Ｌをレトロウイルスを介して形質導入する。このデータは、この過程が（１）安定していて、最小限の数の（長期間）凍結保存しておいたＢ細胞を使っても上手く実施できること（現在までに、２５年以上凍結保存されていたＰＢＭＣ材料から単離した１×１０５という少量のＢ細胞から始めている）、および（２）大量の細胞増加につながること（２８日の内に少なくとも３０倍に増殖する）を表している。
形質導入した後のＢ細胞は、培養中で少なくとも３ヶ月間維持することができる。ＣＤ４０Ｌを直接Ｂ細胞に導入することによって、改変したＢ細胞は、サイトカインを添加した培地のみに基づく細胞培養中で維持することができる。これまでに報告されている方法では、ＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞を含む培地を、およそ３日ごとに継続的に補充する必要がある。この新しい改良により、培養中で長期間Ｂ細胞を維持すること、並びに培養過程の自動化と拡大が容易になる。
本実施例の代替例
フローサイトメトリーによるソーティングなどの、細胞集団からＢ細胞を単離するのに一般的に用いられる他の全ての方法を使用することができる。
汎Ｂ細胞を濃縮する代わりに、ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、プレＢ細胞、プロＢ細胞、および未熟Ｂ細胞を含むがこれらには限定されない、特定のＢ細胞サブセットを濃縮してもよい。
初代ヒトＢ細胞は、ＥＢＶ感染によっても不死化させることができる。
導入遺伝子は、導入遺伝子を安定的に組み込むことができる他の方法によっても送達することができ、そのような送達方法には、他のウイルス（レンチウイルス）性遺伝子送達システムだけでなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮおよびトランスポゾンに基づくベクターなどの非ウイルス性遺伝子送達法もある。一部の代替例では、例えばトランスフェクション／非組み込み型のウイルスからの非安定的な発現を介して、導入遺伝子を付加することができる。
導入遺伝子は、個別の導入遺伝子として送達しても、または多シストロン性の発現カセット中に組み合わせて送達してもよい。一部の代替例では、Ｂ細胞に様々なサイトカイン補助物質（サポート）を加えることができる。
細胞を少なくとも１つの抗原化合物とインキュベートすること
抗原をレトロウイルスを介した形質導入によってＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ改変Ｂ細胞に送達する。簡単に説明すると、ＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞に、１つ以上の抗原をレトロウイルスを介して形質導入する。形質導入を行なった後には、抗原に融合させた細胞表面マーカーの染色を伴うフローサイトメトリー、および抗原と共にＢ細胞に導入したピューロマイシン耐性遺伝子を用いた選抜により、抗原を発現しているＢ細胞を検出することができる。
この細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること
このデータは、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることによって、生成したＢ細胞によるＭＨＣクラスＩＩの抗原提示が改善されることを示している。ＣＤ４０Ｌを最初に導入することによって、細胞培養中でＢＣＬ－６／ＢＣＬ－ＸＬ不死化Ｂ細胞を維持するためにＣＤ４０Ｌ発現性支持細胞を用いる必要がなくなった。
改変Ｂ細胞による抗原提示を特異的に変更するさらなる改良についても評価することができる。Ｂ細胞の操作を、例えば、ＭＨＣクラスＩ提示経路またはＭＨＣクラスＩＩ提示経路いずれかの抗原提示に焦点を当てること（必須経路分子の遺伝的ノックアウトによって）、およびＴ細胞活性化の閾値を調整すること（関連する共刺激分子の遺伝的ノックアウトまたは過剰発現のいずれかによって）によって、ＴＣＲの探索を方向付けることに用いる。これらの戦略により、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子発現の域を越える別の態様を提供することができる。そのような代替案は以下の通りである。
Ｂ２Ｍおよび／またはＴＡＰの遺伝的ノックアウトを利用して、改変Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩの抗原提示を抑制してもよい。
ＣＩＩＴＡおよび／またはＣＤ７４（ＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖）の遺伝的ノックアウトを利用して、改変Ｂ細胞によるＭＨＣクラスＩＩの抗原提示を抑制してもよい。
特異的なＨＬＡアレルの遺伝的ノックアウトを利用して、ＴＣＲの探索を特定のＨＬＡアレルに方向付けてもよい。
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＰＤ－Ｌ１を含むがこれらには限定されない共刺激分子をノックアウトするか、または過剰発現させるかのいずれかによって、Ｂ細胞によるＴ細胞活性化の閾値を制御してもよい。
ここまでに概略したような所望の遺伝的ノックアウトはいずれも、Ｂ細胞を改変するのに用いられる任意の導入遺伝子（ＢＣＬ－６；ＢＣＬ－ＸＬ；抗原；ＣＤ４０Ｌ）を標的遺伝子座に部位特異的に組み込むことによって達成することができる。ただし、選択した標的遺伝子座の両アレル編集が非常に効率的であることを条件とする。
本実施例は、Ｂ細胞でＣＤ４０Ｌ導入遺伝子を発現させることによって、ＭＨＣクラスＩＩの抗原提示が高まり、かつ、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞が強く活性化されることを初めて報告するものである。通常、ＣＤ４０ＬはＴ細胞で発現しており、ＣＤ４０受容体を刺激する効果を調べることを目的とした研究では、一般的に、Ｔ細胞または三量体化ＣＤ４０Ｌ組み換えタンパク質いずれかとの共培養が用いられる。

Claims (107)

  1. Ｔ細胞へ抗原を提示させるために細胞を改変する方法であって、
    ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；
    ｂ）前記細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；および
    ｃ）前記細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、前記細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；を含む、方法。
  2. 前記細胞が初代ヒトＢ細胞を含み、必要に応じて前記初代ヒトＢ細胞が、前記Ｔ細胞に対して、または前記Ｔ細胞によって提示されるＴＣＲに対して自己である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記初代ヒトＢ細胞が末梢血に由来する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記初代ヒトＢ細胞が、Ｂ細胞を含有しているヒト組織に由来する、請求項２に記載の方法。
  5. 前記ヒト組織が、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記初代ヒトＢ細胞が、前駆細胞の分化によって得られる、請求項２に記載の方法。
  7. 前記前駆細胞が造血幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記初代ヒトＢ細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる、請求項２に記載の方法。
  9. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞と共培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記細胞を、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、請求項１または１０に記載の方法。
  12. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞にＥＢＶを感染させることを含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項１０、１１、または１２に記載の方法。
  14. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子が、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して前記細胞に導入される、請求項１１、１３または１４に記載の方法。
  17. 前記細胞の生存延長が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている、請求項１に記載の方法。
  19. 各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で発現する、請求項１に記載の方法。
  21. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞で一過的に発現する、請求項１に記載の方法。
  22. 改変細胞であって、
    ａ）インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；
    ｂ）少なくとも１つの抗原化合物とインキュベートされている；および
    ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有している；改変細胞。
  23. インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、前記細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、請求項２２に記載の改変細胞。
  24. インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、前記細胞にＥＢＶを感染させることを含む、請求項２２に記載の改変細胞。
  25. 前記細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項２３または２４に記載の改変細胞。
  26. 前記遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して前記細胞に導入される、請求項２３または２５に記載の改変細胞。
  27. 前記細胞の生存が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、請求項２２に記載の改変細胞。
  28. 前記少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子によってコードされている、請求項２２に記載の改変細胞。
  29. 各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、請求項２８に記載の改変細胞。
  30. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で安定して発現する、請求項２２に記載の改変細胞。
  31. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で一過的に発現する、請求項２２に記載の改変細胞。
  32. 改変細胞であって、
    ａ）生存因子を発現させるためのヌクレオチド配列；
    ｂ）抗原をコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を発現させるためのヌクレオチド配列；および
    ｃ）ＣＤ４０Ｌを発現させるためのヌクレオチド配列；を含む、改変細胞。
  33. 前記生存因子がＢＣＬ－６および／またはＢＣＬ－ＸＬを含む、請求項３２に記載の改変細胞。
  34. 抗原をコードしている前記少なくとも１つの導入遺伝子が、１から４０のポリペプチドをコードしている、請求項３２に記載の改変細胞。
  35. 各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、請求項３４に記載の改変細胞。
  36. ＣＤ４０Ｌを発現させるための前記ヌクレオチド配列が、ＣＤ４０Ｌを安定して発現させる遺伝子を含む、請求項３２に記載の改変細胞。
  37. Ｔ細胞へ抗原を提示する初代ヒトＢ細胞であって、
    ａ）ＢＣＬ－６およびＢＣＬ－ＸＬを安定して発現させるヌクレオチド配列；
    ｂ）１から４０のポリペプチドを安定して発現させるヌクレオチド配列であって、ここで各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸をコードしており、かつ、各ポリペプチドが抗原であるヌクレオチド配列；および
    ｃ）ＣＤ４０Ｌを安定して発現させるヌクレオチド配列；を含む、初代ヒトＢ細胞。
  38. 抗原提示の方法であって、
    細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；
    前記細胞を少なくとも１つの抗原化合物と継続的にインキュベートすること；および
    前記細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、前記細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；を含む、方法。
  39. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞と共培養することを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞にＥＢＶを感染させることを含む、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、またはＣＤ４０Ｌ遺伝子を、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して前記細胞に導入する、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記細胞の生存延長が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、請求項３８に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている、請求項３８に記載の方法。
  47. 各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で安定して発現する、請求項３８に記載の方法。
  49. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で一過的に発現する、請求項３８に記載の方法。
  50. 請求項２２から３７のいずれか１項に記載の改変細胞と培地とを含む、培養用混合物。
  51. 前記抗原化合物が、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから継続して発現する、請求項２０に記載の方法。
  52. 発現が有効レベルにある、請求項２０に記載の方法。
  53. 前記抗原が、１回導入され、その後前記細胞を増やすことができ、そして、前記抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために複数回使用される、請求項２０に記載の方法。
  54. ＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１がＢＣＬ－ｘＬである、請求項１から２１、３８から４９、５１から５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 抗原を提示させるために細胞を改変する方法であって、
    ａ）細胞のインビトロでの生存延長を誘導する、促進する、および／または維持すること；
    ｂ）前記細胞を少なくとも１つの抗原化合物と、前記細胞の表面に抗原を提示させるのに十分な期間インキュベートすること；および
    ｃ）前記細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するおよび／または改変するために、前記細胞に少なくとも１つの遺伝子改変を導入すること；を含む、方法。
  56. 前記細胞が初代ヒトＢ細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記初代ヒトＢ細胞が末梢血に由来する、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記初代ヒトＢ細胞がＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記ヒト組織が、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記初代ヒトＢ細胞が、前駆細胞の分化によって得られる、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記前駆細胞が造血幹細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記初代ヒトＢ細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる、請求項５６に記載の方法。
  63. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞をＣＤ４０Ｌを発現している支持細胞と共培養することを含む、請求項５５から６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記細胞をＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－２１と共培養することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、請求項５５から６２もしくは６４または１０のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞にＥＢＶを感染させることを含む、請求項５５から６２のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項６４、６５、または６６に記載の方法。
  68. 前記細胞の生存延長を誘導する、促進する、および／または維持することが、前記細胞内でＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることを含む、請求項５５から６２のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記ＢＣＬ－６、ＢＣＬ２様１、およびＣＤ４０Ｌ遺伝子が、同じ発現構築物上にあっても、または異なる発現構築物上にあってもよい、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して前記細胞に導入される、請求項６５、６７、または６８に記載の方法。
  71. 前記細胞の生存延長が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、請求項５５から７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記少なくとも１つの抗原化合物が、１から４０のポリペプチドをコードしている１つの導入遺伝子によってコードされている、請求項５５から７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で安定して発現する、請求項５５から７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で一過的に発現する、請求項５５から７３のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記少なくとも１つの抗原化合物が、前記細胞にエレクトロポレーションによって導入される、請求項５５から７１のいずれか１項に記載の方法。
  77. 各ポリペプチドが少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいる、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記抗原化合物が８アミノ酸長から２５アミノ酸長のポリペプチドである、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ポリペプチドが２５アミノ酸長である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記抗原がＴ細胞へ提示される、請求項５５から７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 改変細胞であって、
    ａ）インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整されている；
    ｂ）少なくとも１つの抗原化合物がエレクトロポレーションによって導入されているか、または少なくとも１つの抗原化合物が発現するように改変されている；および
    ｃ）細胞による抗原提示を誘導する、促進する、維持するまたは改変するための少なくとも１つの遺伝子改変を有している；改変細胞。
  82. インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、前記細胞内でＢＣＬ－６遺伝子とＢＣＬ２様１遺伝子を発現させることを含む、請求項８１に記載の改変細胞。
  83. インビトロでのその生存を誘導する、促進するおよび／または維持するように調整することが、前記細胞にＥＢＶを感染させることを含む、請求項８１に記載の改変細胞。
  84. 前記細胞内でＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現させることをさらに含む、請求項８２または８３に記載の改変細胞。
  85. 前記遺伝子が、ウイルスを介した形質導入、エレクトロポレーション、圧迫、トランスフェクション、部位特異的組み込み、トランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを介して前記細胞に導入される、請求項８２または８４に記載の改変細胞。
  86. 前記細胞の生存が、インビトロでの細胞培養で少なくとも３ヶ月間である、請求項８１から８５のいずれか１項に記載の改変細胞。
  87. 少なくとも１つの抗原化合物を発現するように改変されていることが、１から４０のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの導入遺伝子を含み、ここで前記ポリペプチドが前記少なくとも１つの抗原化合物に対応している、請求項８１から８６のいずれか１項に記載の改変細胞。
  88. 各ポリペプチドが少なくとも８のアミノ酸を含んでいる、請求項８７に記載の改変細胞。
  89. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で安定して発現する、請求項８７に記載の改変細胞。
  90. 前記少なくとも１つの抗原化合物が前記細胞内で一過的に発現する、請求項８１に記載の改変細胞。
  91. 前記細胞にエレクトロポレーションによって導入されている前記少なくとも１つの抗原化合物が、少なくとも８または９のアミノ酸を含んでいるポリペプチドである、請求項８１から９０のいずれか１項に記載の改変細胞。
  92. 前記ポリペプチドが８アミノ酸長から２５アミノ酸長である、請求項９１に記載の改変細胞。
  93. 前記ポリペプチドが２５アミノ酸長である、請求項９３に記載の改変細胞。
  94. 前記改変細胞が初代ヒトＢ細胞を含む、請求項３２から３６または８１から９３のいずれか１項に記載の改変細胞。
  95. 前記初代ヒトＢ細胞が末梢血に由来する、請求項９４に記載の改変細胞。
  96. 前記初代ヒトＢ細胞がＢ細胞を含有しているヒト組織に由来する、請求項９４に記載の改変細胞。
  97. 前記ヒト組織が、腫瘍組織、リンパ節、脾臓、臍帯血、体液、および骨髄を含む、請求項９６に記載の改変細胞。
  98. 前記初代ヒトＢ細胞が、前駆細胞の分化によって得られる、請求項９４に記載の改変細胞。
  99. 前記前駆細胞が造血幹細胞を含む、請求項９８に記載の改変細胞。
  100. 前記初代ヒトＢ細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化によって得られる、請求項９４に記載の改変細胞。
  101. 請求項８１から１００のいずれか１項に記載の改変細胞と培地とを含む、培養用混合物。
  102. 前記抗原化合物が、細胞ゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドから継続して発現する、請求項７４に記載の方法。
  103. 発現が有効レベルにある、請求項７４、７５、または１０２に記載の方法。
  104. 前記抗原が、１回導入され、その後前記細胞を増やすことができ、そして、前記抗原の２回目の送達を必要とすることなく、Ｔ細胞を評価するために複数回使用される、請求項７４、１０２、または１０３に記載の方法。
  105. ＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１がＢＣＬ－ｘＬである、請求項５５から８０または１０２から１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. ＢＣＬ２様１を伴い、ここでＢＣＬ２様１がＢＣＬ－ｘＬである、請求項２２から３６または８１から１００のいずれか１項に記載の改変細胞。
  107. 抗原化合物がＴＣＲ抗原化合物である、請求項１から３６、３８から４９、５１から１００、１０２から１０６のいずれか１項に記載の方法または改変細胞。
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