JP2024500974A - 電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、第１のクロマトグラフィー工程として疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、細胞溶解物又は周辺質放出物から、電荷遮蔽されたタンパク質を精製する方法に関する。電荷遮蔽されたタンパク質を含む組成物と、精製された電荷遮蔽されたタンパク質を使用する治療方法ともまた、本明細書において提供される。TIFF2024500974000011.tif58170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２３日に出願された米国出願第６３／１３０，２９５号の優先権を主張し、その内容がその全体で組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：２１０４６２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１２月９日、サイズ：３０，１６０バイト）。
分野
本発明は、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法に関する。
背景
医薬目的の多くのタンパク質、特に特定の酵素及び組換え抗体断片、ホルモン、インターフェロンなどは、急速な（血液）クリアランスを受ける。これは、サイズが約７０ｋＤａの腎濾過の閾値を下回るタンパク質に特に当てはまる（Ｃａｌｉｃｅｔｉ（２００３）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１－１２７７（非特許文献１））。これらの場合、未修飾の医薬タンパク質の血漿半減期は、数時間のオーダーであり得、そのため、ほとんどの治療適用には本質的に役に立たないものになる。持続した薬理作用、及び改善した患者のコンプライアンス－数日又は数週間までにさえ延長する要求された投与間隔－を達成するために、バイオ医薬品開発の目的で、過去にいくつかの戦略が確立された。
バイオ医薬品の血漿半減期を延長するための１つの方法論は、高度に溶媒和された生理学的に不活性な化学ポリマーとのコンジュゲーションであり、したがって、治療用タンパク質の流体力学的半径を約３～５ｎｍの糸球体孔サイズを超えて効果的に拡張する（Ｃａｌｉｃｅｔｉ（２００３）（非特許文献１））。したがって、生物活性ドメインと、生物活性ドメインの生物学的活性に影響を与えることなく融合タンパク質の疎水性半径を増加させる追加のドメインとを含む融合タンパク質が開発されてきている。
しかしながら、かかる融合タンパク質の産生及び精製は、新たな精製方法を必要とする課題を提示する。特に、本発明の前に、生物活性ドメインの流体力学的半径を増加させるためのドメインの融合が電荷遮蔽効果を引き起こし得ることは知られておらず、したがって、従来の精製方法は、かかる融合タンパク質には不適切になる。本発明者らは、電荷遮蔽効果、及び、かかる治療用融合タンパク質を精製するための新規方法を特定した。
Ｃａｌｉｃｅｔｉ（２００３）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１－１２７７
簡単な概要
細胞溶解物又は周辺質放出物から、電荷遮蔽されたタンパク質を精製する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、方法は、第１のクロマトグラフィー工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、方法は、第２のクロマトグラフィー工程として、アニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、方法は、第３のクロマトグラフィー工程として、カチオン交換クロマトグラフィーを含む。
いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物から、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法が本明細書で提供され、電荷遮蔽された融合タンパク質は、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含み、方法は、第１のクロマトグラフィー工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。
いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物から、電荷遮蔽された融合タンパク質を産生するための方法が本明細書において提供され、電荷遮蔽された融合タンパク質は、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含み、方法は、ｉ）電荷遮蔽された融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、ｉｉ）電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することとを含み、電荷遮蔽されたタンパク質は、第１のクロマトグラフィー工程として疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、細胞溶解物又は周辺質放出物から精製される。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１のクロマトグラフィー工程後に少なくとも４５％純粋である。いくつかの実施形態において、方法は、アニオン交換クロマトグラフィーを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、カチオン交換クロマトグラフィーを更に含む。
いくつかの実施形態において、方法は、ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、ｉｉ）アニオン交換クロマトグラフィー、及びｉｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィーを順番に含む一連のクロマトグラフィー工程を含む。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約７．０のｐＨで荷電されており、電荷遮蔽ドメインは、タンパク質の流体力学的半径を増加させ、電荷遮蔽ドメインは、約７．０のｐＨで電荷を有しない。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインの分子量は、電荷遮蔽ドメインの分子量未満である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、１０ｋＤａ～６０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、１０ｋＤａ～２０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインの分子量は、３０ｋＤａ～４０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、電荷遮蔽された融合タンパク質又は電荷遮蔽された融合タンパク質の多量体のインビボ半減期を増加させるのに十分である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合体又は電荷遮蔽されたタンパク質の多量体のインビボ半減期は、電荷遮蔽ドメインを有さず生物活性ドメインを含むタンパク質又は生物活性ドメインを含むタンパク質の多量体の半減期と比較して増加している。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、ランダムコイル又は無秩序構造を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、アラニン、セリン、及びプロリン残基の１つ以上からなるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、プロリン及びアラニン残基からなるポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、方法は、細胞溶解物又は周辺質放出物からＰＡＳ化生物活性融合タンパク質を精製することを含み、ｉ）ＰＡＳ化生物活性タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、ｉｉ）ＰＡＳ化生物活性タンパク質を精製することとを含み、ＰＡＳ化生物活性タンパク質は、第１のクロマトグラフィー工程として疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、細胞溶解物又は周辺質放出物から精製される。
いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物から、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含む電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法が本明細書で提供され、方法は、以下のステップを、ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む負荷溶液を適用するステップ、ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、洗浄溶液を適用するステップ、ｉｉｉ）疎水性相互作用カラムに溶離溶液を適用して、電荷遮蔽されたタンパク質を溶離するステップ、ｉｖ）アニオン交換クロマトグラフィーカラムに、負荷溶液として、ｉｉｉ）における溶離された電荷遮蔽された融合タンパク質を適用するステップ、ｖ）アニオン交換クロマトグラフィーカラムから、電荷遮蔽された融合タンパク質を溶離するステップ、ｖｉ）カチオン交換クロマトグラフィーに、負荷溶液として、ｖｉ）における溶離された電荷遮蔽された融合タンパク質を適用するステップ、ｖｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィーに洗浄溶液を適用するステップ、ｖｉｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィーに溶離溶液を適用して、電荷遮蔽された融合タンパク質を溶離するステップを順番に含む。
いくつかの実施形態において、ステップｉ）における負荷溶液は、２～３ＭのＮａＣｌを含み、６．０～８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ステップｉｉｉ）における溶離溶液は、０．７５～１．７５ＭのＮａＣｌを含み、６．０～７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ステップｉｖ）における負荷溶液は、０．７～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率、並びに７．０及び９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ステップｉｖ）における負荷溶液は、０．７～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率、並びに７．０及び９．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ステップｖｉ）における負荷溶液は、６．０～７．０のｐＨ、及び０．７～２．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ステップｖｉ）における負荷溶液は、５．９～７．０のｐＨ、及び０．７～２．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
いくつかの実施形態において、ステップｖｉｉｉ）における溶離溶液は、６．０～７．０のｐＨ、及び０．７～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ステップｉ）における負荷溶液は、０．２５～３ＭのＮａ２ＳＯ４又は０．２５～０．６ＭのＮＨ４ＳＯ４、及び５．５～６．５のｐＨを含む。２０。いくつかの実施形態において、ステップｉｉｉ）の溶離溶液は、０．３～０．５ＭのＮＨ４ＳＯ４を含み、５．５～６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ＰＯＲＯＳ Ｂｅｎｚｙｌウルトラ樹脂、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ樹脂、及びＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ樹脂からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ樹脂である。いくつかの実施形態において、アニオン交換相互作用クロマトグラフィーは、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂、ＰＯＲＯＳ ＸＱ樹脂、及びＧｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍ樹脂からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アニオン交換相互作用クロマトグラフィーは、Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍ樹脂である。いくつかの実施形態において、カチオン交換相互作用クロマトグラフィーは、強カチオン交換体である。いくつかの実施形態において、カチオン交換相互作用クロマトグラフィーは、混合モード樹脂であり、カチオン交換相互作用クロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂、ＣＭＭ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ｉｍｐｒｅｓ樹脂、Ｆｒａｃｔｏ ｇｅｌ ＳＯ３－樹脂、ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０Ｓ樹脂、及びＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カチオン交換相互作用クロマトグラフィーは、ＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂である。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、アスパラギナーゼサブユニットである。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）アスパラギナーゼ及びＥｒｗｉｎｉａ（エルウィニア属）アスパラギナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼサブユニットは、配列番号１、配列番号５、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、配列番号９又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス属）細胞である。
本明細書において提供される方法によって産生される電荷遮蔽されたタンパク質も本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む組成物が、本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、治療を必要とする個体に、電荷遮蔽されたタンパク質を含む組成物、又は電荷遮蔽されたタンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、治療方法が本明細書において提供される。
ＰＡＳ化アスパラギナーゼを含む組成物も本明細書において提供され、ＰＡＳ化アスパラギナーゼは、少なくとも４５％純粋である。
最初のタンパク質捕捉工程としてのＰＯＲＯＳ ＨＱアニオン交換カラムからの溶離物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。矢印は、ＰＦ７４５に対応するバンドを示す。 最初のタンパク質捕捉工程としてのＰＯＲＯＳ ＸＳカチオン交換カラムからの溶離物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。 代表的なＢｕｔｙｌ－６５０Ｍクロマトグラフィー工程からの画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。純度分析のために、等容量（４μＬ）の負荷、負荷からのフロースルー（ＦＴ）、溶離、及び剥離画分をＳＤＳ－ＣＧＥにロードした。矢印は、ＰＦ７４５に対応するバンドを示す。 ３回の実行からの代表的なＰＯＲＯＳ ＨＱクロマトグラムの重ねた比較を示す。クロマトグラムは、Ｘ軸にｍＬで体積、左側Ｙ軸にｍＡＵで２８０ｎｍの吸光度、右側Ｙ軸にｍＳ／ｃｍで導電率を示す。 ＰＯＲＯＳ ＸＳクロマトグラフィー工程からの画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。純度分析のために、等容量（４μＬ）の負荷、負荷からのフロースルー（ＦＴ）、洗浄、溶離、剥離１及び剥離２の画分をＣＧＥにロードした。矢印は、ＰＦ７４５に対応するバンドを示す。 ＨＩＣ樹脂の高疎水性プレートからのフロースルーのＳＤＳ－ＣＧＥを示す。三重列は、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤで示されるコスモトロープ濃度を加えたウェルからのフロースルーを表す。「Ａ」は、０．２５Ｍ硫酸ナトリウムであり、「Ｂ」は、０．５Ｍ硫酸アンモニウムであり、「Ｃ」は、２ＭのＮａＣｌであり、「Ｄ」は、３ＭのＮａＣｌだった。予想されるターゲットバンド（ＰＦ７４５）のＭＷは、グラフの左側に矢印で示される。 ＨＩＣ樹脂の高疎水性プレートからの溶離物のＳＤＳ－ＣＧＥを示す。三重列は、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤで示されるコスモトロープ濃度を加えたウェルからの溶離を表す。「Ａ」は、０．２５Ｍ硫酸ナトリウムであり、「Ｂ」は、０．５Ｍ硫酸アンモニウムであり、「Ｃ」は、２ＭのＮａＣｌであり、「Ｄ」は、３ＭのＮａＣｌだった。予想されたＰＦ７４５バンドのＭＷは、グラフの左側に矢印で示される。 ＨＩＣ樹脂の低疎水性プレートからのフロースルーのＳＤＳ－ＣＧＥを示す。 ＨＩＣ樹脂の低疎水性プレートからの溶離のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。 Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ及びＢｅｎｚｙｌｕｌｔｒａクロマトグラフィーのＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示し、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍでの画分１Ｂ２～１Ｃ４、及びＢｅｎｚｙｌｕｌｔｒａでの画分２Ａ５～２Ｃ３におけるＰＦ７４５の濃縮を実証している。 アニオン交換樹脂スクリーニングからのＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。標的（ＰＦ７４５）純度は、各レーンのメインバンドの上に表示されている。 ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、及びＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍクロマトグラフィー実行からのフロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ純度を示す。 ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍを使用したＡＥＸの代表的なクロマトグラムを示す。 混合モードカチオン交換樹脂からのフロースルー画分（三重レーンで）のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。上部パネルはｐＨ５．７で実行し、下部パネルはｐＨ６．０で実行した。 各レーンの上に示される様々なｐＨ及び塩濃度でのＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ４００負荷及びフロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。純度％が、各レーンの上に示されている。 各レーンの上に示される様々なｐＨ及び導電率のときに、ＮＨ２－７５０Ｆ負荷及びフロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。純度％が、各レーンの上に示されている。 各セットの上のレーンに示される結合条件で、ＣａＰｕｒｅ－ＨＡ画分：負荷、フロースルー（ＦＴ）、洗浄、及び溶離のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。 各セットの上のレーンに示される結合条件で、ＰＰＧ－６００Ｍ画分：負荷、フロースルー（ＦＴ）、洗浄、及び溶離のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。
詳細な説明
Ｉ．電荷遮蔽されたタンパク質を精製するための方法
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程を用いて、電荷遮蔽されたタンパク質を精製することを含み、いくつかの実施形態において、方法は、第１のクロマトグラフィー工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む。本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、混合物（例えば、細胞溶解物又は周辺質放出物中のタンパク質の混合物）を分離する方法を含む。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーは、細胞溶解物又は周辺質放出物などの混合物を、溶液（例えば、負荷溶液、移動相）中で、固定材料（例えば、樹脂、固定相）上にある媒体を通過させることによって、分離することを含む。クロマトグラフィーシステム内の溶液は、液体（例えば、液体クロマトグラフィー）又は蒸気（例えば、ガスクロマトグラフィー）として構成され得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーは、固定材料上にある媒体を通して溶液中の混合物を分離し、混合物の成分は、それらを互いに分離させる異なる速度で移動する。
特定の負荷溶液の組成物及び／又は樹脂は、混合物の成分が移動する速度を決定し得る。例えば、混合物の特定の成分は、特定の負荷溶液及び／又は樹脂が使用されるとき、樹脂をよりゆっくりと通って移動し得（例えば、より長い保持時間）、一方、同じ混合物の他の成分は、樹脂をより速く通って移動し得る（例えば、より短い保持時間）。
いくつかの実施形態において、混合物のクロマトグラフィー分離は、樹脂（例えば、固定相）、負荷溶液（例えば、緩衝液、移動相）、及びカラムを更に含む。樹脂及び緩衝液の組成は、本明細書に記載される特定のクロマトグラフィー方法に依存し、それに特定的であり得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーカラムは樹脂を含有し、混合物を含む負荷溶液がクロマトグラフィーによって分離されて、通過することを可能にする。いくつかの実施形態において、カラムは、ガラス、ホウケイ酸ガラス、アクリルガラス、又はステンレス鋼クロマトグラフィーカラムである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、細胞溶解物又は周辺質放出物が疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用される、捕捉精製工程に関する。本明細書に使用される「細胞溶解物」は、溶解した細胞の内容物を含む。本明細書で使用される「周辺質放出物」は、外膜の溶解によって産生された周辺質の内容物を含む。いくつかの実施形態において、周辺質放出物は、細胞溶解物の亜画分である。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、細胞内で発現している電荷遮蔽されたタンパク質を含む。溶解した細胞は、細胞膜の完全性を破壊するために、しばしば、ウイルス、酵素、又は浸透メカニズムによって、細胞の膜を分解することによって得ることができる。いくつかの実施形態において、細胞は、超音波処理、機械的技術（例えば、ワーリングブレンダーポリトロン）、液体均質化（例えば、ダンス型ホモジナイザー、Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、又はＦｒｅｎｃｈプレスを使用して）、凍結融解、及びマニュアル粉砕（例えば、乳鉢及び乳棒）を含むが、これらに限定されない物理的な破壊によって溶解される。代替的実施形態において、細胞は、溶液ベースの溶解によって溶解され、この場合、細胞は、細胞を開くように破壊して細胞の内容物を放出させる細胞溶解緩衝液と接触させる。例えば、細胞は、緩衝化塩（例えば、トリス－ＨＣｌ又はＭＥＳ）及びイオン性塩（例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌ）の溶液を使用して溶解され得る。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００又はＳＤＳなどの界面活性剤を含む、追加の成分を細胞溶解緩衝液に添加して、細胞から放出されるタンパク質の分解を防止し得る。いくつかの実施形態において、当該技術分野の任意の既知の技術を使用して、細胞溶解物又は周辺質放出物を産生する。
いくつかの実施形態において、周辺質放出物は、細菌外膜を選択的に破壊することによって産生される。細菌外膜を破壊するための方法は、当該技術分野で既知である。（Ｗｕｒｍ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １７：２１５－２２２（２０１７）を参照されたい）。例えば、グアニジンＨＣｌ及び／又はトリトン、セルニトレート、塩化ベンザルコニウム、グリセロールエーテル、クロロホルム、ＴＲＩＳ、１％グリシン、ポリエチレンイミン、尿素及びＤＴＴ、軽度ヒートショット及びＴＲＩＳ、並びに浸透圧ショックを用いる処理を全て使用することができる。いくつかの実施形態において、外膜は、培養中に破壊される。いくつかの実施形態において、外膜は、採取後に破壊される。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質を含む細胞溶解物又は周辺質放出物の可溶性画分は、細胞又は細胞外膜の溶解の後、かつ第１のクロマトグラフィー捕捉工程の前に、遠心分離を使用して、細胞溶解物又は周辺質放出物の不溶性画分から分離される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物の可溶性画分は、遠心分離によって細胞溶解物又は周辺質放出物の不溶性画分から分離される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、最大、約３，０００×ｇ、約３，５００×ｇ、約４，０００×ｇ、約４，５００×ｇ、約５，０００×ｇ、約５，５００×ｇ、約６，０００×ｇ、約６，５００×ｇ、約７，０００×ｇ、約８，０００×ｇ、約９，０００×ｇ、約１０，０００×ｇ、約１１，０００×ｇ、若しくは約１５，０００×ｇ、又はそれらを超えて遠心分離される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、約８，０００～２０，０００×ｇ、約５，０００～６，０００×ｇ、約８，０００～１５，０００×ｇ、約１８，０００×ｇ、又は約２０，０００×ｇで遠心分離される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、最大、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約２０分、若しくは約３０分間、又はそれらを超えて遠心分離される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、約５～３０分、約５～２０分、約８～１２分、約１０～２０分、又は約１５～３０分間遠心分離される。遠心分離は、最大、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、若しくは約１０℃で、又はそれらを超えて行われ得る。いくつかの実施形態において、遠心分離は、約０～１０℃、又は約２～８℃で行われる。
いくつかの実施形態において、遠心分離後、細胞溶解物又は周辺質放出物は、第１の捕捉クロマトグラフィー工程の前に１つ以上の濾過又は澄明化工程に供される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、限外濾過に供される。いくつかの実施形態において、０．２、０．３、０．４、０．４５、又は０．５μｍのフィルターが使用される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物又は周辺質放出物は、透析に供される。いくつかの実施形態において、緩衝液交換は、細胞溶解物又は周辺質放出物が、第１の疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムへの適用に好適な緩衝液中にあるように行われる。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質を含む、遠心分離によって単離された細胞溶解物又は周辺質放出物の可溶性画分は、捕捉工程に適用される。本明細書で使用される場合、「捕捉工程」は、細胞溶解物から目的のタンパク質（例えば、電荷遮蔽されたタンパク質）に結合する第１のクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程は、非標的宿主細胞タンパク質に加えて、プロテアーゼ及びグリコシダーゼを含むが、これらに限定されない、全細胞溶解物細胞混入物から目的のタンパク質を単離する。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程は、標的タンパク質を濃縮し、標的タンパク質活性を維持する。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程は、細胞混入物（例えば、非標的宿主細胞タンパク質）からの標的タンパク質の精製を最大にするように最適化され得る。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の前に、細胞溶解物中の電荷遮蔽されたタンパク質は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％純粋である。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の前に、細胞溶解物中の電荷遮蔽された融合タンパク質は、約５～１０％、約６～８％、又は約７～９％純粋である。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の前に、細胞溶解物中の電荷遮蔽された融合タンパク質は、約５～３０％、約１０～３０％、又は約１５～２０％純粋である。
いくつかの実施形態において、周辺質放出物の可溶性画分は、捕捉工程に適用される。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー工程は、周辺質放出物から目的のタンパク質（例えば、電荷遮蔽されたタンパク質）に結合する。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程は、標的タンパク質を濃縮し、標的タンパク質活性を維持する。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程は、周辺質放出物中に存在する細胞混入物（例えば、非標的宿主細胞タンパク質）からの標的タンパク質の精製を最大にするように最適化され得る。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の前に、細胞周辺質放出物中の電荷遮蔽されたタンパク質は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、又は約３０％、純粋である。純粋。いくつかの実施形態において、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の前に、周辺質放出物中の電荷遮蔽された融合タンパク質は、約５～３０％、約１０～３０％、又は約１５～２０％純粋である。
本明細書に記載される方法は、クロマトグラフィーを用いて、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することを含み得る（例えば、細胞溶解物又は周辺質放出物から）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、複数のクロマトグラフィー工程を用いて、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することを含み得る。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製するための方法は、１、２、３、４、５、６、又は７つのクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法は、１～７、又は１～３、又は３～５つのクロマトグラフィー工程を含む。クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーを含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＩＣ、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、変位クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、バイオアフィニティクロマトグラフィー、水性順相クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、又は他のクロマトグラフィー方法を含む。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の後に、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％の純度を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の後に、約５０％～８０％、又は約６０％～８０％の純度を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１のクロマトグラフィー捕捉工程の後に、少なくとも４５％の純度を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質の純度は、イオン交換クロマトグラフィー工程を用いた電荷遮蔽されたタンパク質の純度と比較して、第１のＨＩＣクロマトグラフィー工程の後に超えている。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質の純度は、生物活性ドメインの方法に従って精製されたときの電荷遮蔽されたタンパク質の純度を、第１のＨＩＣクロマトグラフィー工程の後に超えている。
電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１のクロマトグラフィー工程を第２のクロマトグラフィー工程と組み合わせた場合、単一のクロマトグラフィー工程と比較して増加した純度を有し得る。電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１のクロマトグラフィー工程を第２及び第３のクロマトグラフィー工程と組み合わせた場合、単一のクロマトグラフィー工程と比較して増加した純度を有し得る。電荷遮蔽された融合タンパク質は、第１及び第２のクロマトグラフィー工程を第３のクロマトグラフィー工程と組み合わせた場合、２つのクロマトグラフィー工程と比較して増加した純度を有し得る。
いくつかの実施形態において、方法は、第１のクロマトグラフィー、又は捕捉工程（例えば、ＨＩＣ）を含む。いくつかの実施形態において、第１のＨＩＣ工程の後に、第２のＨＩＣ工程が続く。いくつかの実施形態において、第１のＨＩＣ工程の後に、ＡＥＸクロマトグラフィー工程が続く。代替的に、第１のＨＩＣ工程の後に、ＣＥＸクロマトグラフィー工程が続き得る。いくつかの実施形態において、第１のＨＩＣ工程の後に、本明細書に記載されるか、さもなければ当業者に既知である任意のクロマトグラフィー技術から構成されるクロマトグラフィー工程が続く。第１のＨＩＣ工程の後に続く第２のクロマトグラフィー工程は、任意選択的に、その後に第３のクロマトグラフィー工程が続く。一態様において、第３のクロマトグラフィー工程は、ＣＥＸクロマトグラフィー工程である。別の態様において、第３のクロマトグラフィー工程は、ＡＥＸクロマトグラフィー工程である。いくつかの実施形態において、ＣＥＸクロマトグラフィー工程は、第１のＨＩＣ工程、及びＡＥＸクロマトグラフィー工程の後に行われる。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程は、第１のＨＩＣ工程、及びＣＥＸクロマトグラフィー工程の後に行われる。代替的な方法において、第３のクロマトグラフィー工程は、本明細書に記載されるか、さもなければ当業者に既知である任意のクロマトグラフィー技術から構成され、第１のＨＩＣ工程、及びＡＥＸ工程の後に行われる。更なる実施形態は、本明細書に記載されるか、さもなければ当業者に既知である任意のクロマトグラフィー技術から構成され、第１のＨＩＣ工程、及びＣＥＸ工程の後に行われる、第３のクロマトグラフィー工程を含む。
各クロマトグラフィー工程間に、１つ以上の任意選択的な限外濾過（ＵＦ）及び／又は透析濾過（ＤＦ）（例えば、ＵＦ／ＤＦ）工程が行われ得る。いくつかの実施形態において、ＵＦ／ＤＦは、クロマトグラフィー工程間で、濃度及び緩衝液交換のために行われる。例えば、ＵＦ／ＤＦは、濾過による分離を含み得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー工程からの溶離物は、加圧力下で膜と接触させる。いくつかの実施形態において、この加圧力は、膜を通る溶離溶液、緩衝塩、及びより小さい非標的溶液成分の移行を駆動する。いくつかの実施形態において、膜は、より大きな分子（例えば、標的タンパク質）を保持する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、第１のクロマトグラフィー工程として、ＨＩＣを使用することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣは、それらの疎水性に基づいて混合物を分離するための方法を含む。ＨＩＣは、親水性及び疎水性領域の両方を含む、緩衝液及びタンパク質を含む混合物を、クロマトグラフィーカラム内のＨＩＣ樹脂に適用することを含み得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ特異的樹脂を使用して、第１のクロマトグラフィー工程として、ＨＩＣを実施する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、高疎水性ＨＩＣ樹脂である。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、低疎水性樹脂である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む組成物の純度は、ＨＩＣ捕捉クロマトグラフィー工程の後に、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、ＨＩＣ捕捉クロマトグラフィー工程の後に、約５０％～８０％、又は約６０％～８０％、又は８０％～９５％の純度を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、ＨＩＣ捕捉クロマトグラフィー工程の後に、少なくとも４５％の純度を有する。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、最大、約５００Å、約５５０Å、約６００Å、約６５０Å、約７００Å、約７５０Å、約８００Å、約８５０Å、約９００Å、約９５０Å、約１，０００Å、約１，５００Å、若しくは約２，０００Å、又はそれらを超える孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、約５００～２，０００Å、約７００～１，０００Å、約７００～８００Å、又は約９００～１，５００Åの孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、最大、最大、又は約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、約１００μｍ、約１０５μｍ、約１１０μｍ、約１１５μｍ、若しくは約１２０μｍ、又はそれらを超える粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、約４０～１２０μｍ、約６０～１００μｍ、約７０～１１０μｍ、及び約４０～５０μｍの粒子サイズを有する。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、マトリックス支持基材から構成され、基材は、親水性炭水化物である。ＨＩＣ樹脂基材は、架橋アガロース又は合成コポリマー材であり得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］基材又はヒドロキシル化メタクリレートポリマー基材から構成される。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、基材に結合したリガンド官能基から更に構成され、リガンド官能基は、疎水性である。ＨＩＣリガンド官能基は、疎水性を示す直鎖アルキルリガンド、又は芳香族及び疎水性相互作用の両方が可能である、混合モード挙動を示すアリールリガンドであり得る。いくつかの実施形態において、リガンド官能基は、芳香族疎水性ベンジルリガンド、フェニルリガンド、又はＣ６（ヘキシル）基である。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、芳香族疎水性ベンジルリガンド官能基と結合した架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］基材から構成される。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、Ｃ６（ヘキシル）基と結合したヒドロキシル化メタクリレートポリマー基材から構成される。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、フェニル官能基と結合したヒドロキシル化メタクリレートポリマー基材から構成される。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、ＰＯＲＯＳ Ｂｅｎｚｙｌウルトラ樹脂、ＰＯＲＯＳ Ｂｅｎｚｙｌ樹脂、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）樹脂、Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ樹脂、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ樹脂、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ樹脂、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ樹脂、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ樹脂、ＰＰＧ－６００Ｍ樹脂、又はＰＯＲＯＳ Ｅｔｈｙｌ樹脂である。
多くの場合、ＨＩＣ樹脂は、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む負荷溶液を適用する前に、平衡緩衝液を使用して平衡化され得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ平衡緩衝液は、緩衝化塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ平衡緩衝液は、トリス、ＥＤＴＡ、及び塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ平衡緩衝液は、約５．０～１０．０、又は最大、約ｐＨ５．０、約ｐＨ６．０、約ｐＨ７．０、約ｐＨ８．０、約ｐＨ９．０、若しくは約ｐＨ１０．０、又はそれらを超えるｐＨに平衡化される。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ平衡緩衝液は、第１のクロマトグラフィー捕捉工程における特定のＨＩＣ樹脂の使用に基づいて選択される。任意選択的に、ＨＩＣ平衡溶液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、混合物中でＨＩＣ樹脂に適用され、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む混合物は、負荷溶液を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む負荷溶液は、ＨＩＣ樹脂に適用される。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ負荷溶液の塩溶液は、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、又はＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ負荷溶液の塩溶液は、約１ＭのＮａＣｌ、約２ＭのＮａＣｌ、約３ＭのＮａＣｌ、約４ＭのＮａＣｌ、又は約５ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約１～５ＭのＮａＣｌ、又は約２～３のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂に添加された電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＨＩＣ負荷溶液は、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、若しくは約９．０、又はそれら以下、若しくはそれらを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ樹脂に添加された電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＨＩＣ負荷溶液は、約５．０～９．０のｐＨ、又は約６．０～８．０のｐＨを有する。任意選択的に、負荷溶液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。
いくつかの実施形態において、負荷溶液は、約０．４～約３．０ＭのＮａ２ＳＯ４、約０．５～約３ＭのＮａ２ＳＯ４、約０．４～約２ＭのＮａ２ＳＯ４又は約０．４～約１．０ＭのＮａ２ＳＯ４などの約０．２５～約３ＭのＮａ２ＳＯ４を含む。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、約０．６ＭのＮａ２ＳＯ４を含む。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、ｐＨ５．５～６．３、ｐＨ５．６～６．３、又はｐＨ５．７～６．２などの５．５～６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、約ｐＨ５．９のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、約０．２５～約０．６ＭのＮＨ４ＳＯ４、約０．３～約０．６ＭのＮＨ４ＳＯ４、又は約０．４～約０．６ＭのＮＨ４ＳＯ４を含む。
電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＨＩＣ負荷溶液をＨＩＣ樹脂に適用した後、１つ以上の洗浄工程が洗浄緩衝液を使用して行われ得る。洗浄緩衝液は、ＨＩＣ負荷溶液及び特定のＨＩＣ樹脂に基づいて選択され、様々な洗浄緩衝液を使用することができることは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、又はＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、トリス及びＥＤＴＡを更に含む。任意選択的に、洗浄緩衝液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ洗浄緩衝液は、ＨＩＣ平衡緩衝液と同じである。代替的に、ＨＩＣ洗浄緩衝液は、ＨＩＣ平衡緩衝液と異なり得る。
いくつかの実施形態において、精製された電荷遮蔽された融合タンパク質は、任意選択的に、１回以上の洗浄後に、ＨＩＣ樹脂から溶離される。ＨＩＣ溶離溶液は、塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ溶離溶液塩溶液は、ＮａＣｌ緩衝液である。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌ緩衝液は、約０．６ＭのＮａＣｌ、約０．６５ＭのＮａＣｌ、約０．７ＭのＮａＣｌ、約０．７５ＭのＮａＣｌ、約０．８ＭのＮａＣｌ、約０．８５ＭのＮａＣｌ、約０．９ＭのＮａＣｌ、約１ＭのＮａＣｌ、約１．２ＭのＮａＣｌ、約１．５ＭのＮａＣｌ、約１．７５ＭのＮａＣｌ、約２ＭのＮａＣｌ、又は約２．５ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌ緩衝液は、約０．６～２．５ＭのＮａＣｌ又は約０．７５～１．７５ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ溶離溶液は、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、又は約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ溶離溶液は、約５．５～７．５のｐＨ、又は約６．０～７．０のｐＨを有する。任意選択的に、溶離溶液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣ溶離溶液は、約０．３～約０．５ＭのＮＨ４ＳＯ４を含み、約５．５～約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ溶離溶液は、約０．３５～約０．４５ＭのＮＨ４ＳＯ４、又は約０．４ＭのＮＨ４ＳＯ４を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ溶離溶液は、約ｐＨ５．６～約６．４、約ｐＨ５．７～約６．２、又は約ｐＨ５．９のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣは、およそ室温で行われる。いくつかの実施形態において、ＨＩＣは、約１５℃～約２８℃、又は約１８℃～約２５℃で行われる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回行われる。いくつかの実施形態において、第１のＨＩＣ捕捉工程は、１～１５回、３～６回、８～１０回、又は９～１５回行われる。任意選択的に、第１のＨＩＣ捕捉工程からの溶離物は、更なる処理の準備が整うまで、０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、又は約１０℃で保存され得る。いくつかの実施形態において、第１のＨＩＣ捕捉工程からの溶離物は、約４℃～約８℃で保存される。いくつかの実施形態において、第１のＨＩＣ捕捉工程からの溶離物は、更なる処理の準備が整うまで、約５～２５℃、約２～８℃、約１０～２０℃、又は約１８℃～２５℃で保存される。いくつかの実施形態において、溶離物は、約２５℃で最大約８時間保存される。いくつかの実施形態において、溶離物は、約４℃～約８℃で２４時間を超えて保存される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程を用いて、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することを含み、いくつかの実施形態において、方法は、ＨＩＣに続くクロマトグラフィー工程として、ＡＥＸクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程は、第１のＨＩＣ工程に続く、第２のクロマトグラフィー工程である。ＡＥＸクロマトグラフィーは、正に荷電した基を含有するＩＥＸ樹脂を使用して、それらの正味の表面電荷に基づいて物質を分離するプロセスである。溶液中では、樹脂は正に荷電した対イオンでコーティングされる。したがって、ＡＥＸ樹脂上の正に荷電した基は、溶液中の負に荷電したタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に使用されるＡＥＸ樹脂は、強アニオン交換樹脂である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるＡＥＸ樹脂は、弱アニオン交換樹脂である。「強」又は「弱」アニオン交換体としてのＡＥＸ樹脂の分類は、樹脂官能基のイオン化状態がｐＨによって変化する程度を指す。例えば、弱ＡＥＸ樹脂は、限られたｐＨ範囲にわたってイオン化される（例えば、官能基は、緩衝液ｐＨの変化に伴ってプロトンを取り込むか、又は失う）が、強ＡＥＸ樹脂は、ｐＨの変化に伴ってイオン交換容量に変化を示さない（例えば、官能基は、変化せず、広いｐＨ範囲にわたって完全に荷電されたままである）。
多くの場合、ＡＥＸ樹脂は、電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＡＥＸ負荷溶液を適用する前に、平衡緩衝液を使用して平衡化され得る。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ平衡緩衝液は、緩衝化塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ平衡緩衝液は、トリス、ＥＤＴＡ、及び塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ平衡緩衝液は、約５．０～１０．０、又は最大、約ｐＨ５．０、約ｐＨ６．０、約ｐＨ７．０、約ｐＨ８．０、約ｐＨ９．０、若しくは約ｐＨ１０．０、又はそれらを超えるｐＨに平衡化される。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ平衡緩衝液は、第２のクロマトグラフィー工程における特定のＡＥＸ樹脂の使用に基づいて選択される。任意選択的に、ＡＥＸ平衡溶液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、最大、約５００Å、約６００Å、約７００Å、約８００Å、約９００Å、約１，０００Å、約２，０００Å、約３，０００Å、約４，０００Å、約５，０００Å、約６，０００Å、約７，０００Å、約８，０００Å、約９，０００Å、若しくは約１０，０００Å、又はそれらを超える孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、約５００～１０，０００Å、約５００～８００Å、約９００～１，２００Å、又は約５，０００～１０，０００Åの孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、最大、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、若しくは約１００μｍ、又はそれらを超える粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、約５０～１００μｍ、約７０～８０μｍ、約５０～９０μｍ、又は約８０～１００μｍの粒子サイズを有する。
いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］又はヒドロキシル化メタクリルポリマー基材から構成される。ＡＥＸ樹脂基材は、低い非特異的結合を確実にするために、追加のポリヒドロキシル表面コーティングで任意選択的にコーティングされ得る。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、基材に結合したリガンド官能基から更に構成され、リガンド官能基は、正荷電又は塩基性である。ＡＥＸリガンド官能基は、弱イオン交換体又は強イオン交換体であり得る。例えば、弱いＡＥＸリガンド官能基は、ジエチルアミノエチル又はジエチルアミノプロピルを含み得る。代替的に、強ＡＥＸリガンド官能基は、四級アンモニウム又はアミン基を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、低い非特異性結合を確実にするために、追加のポリヒドロキシル表面コーティングを有する、剛性で高多孔性の架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］基材から構成され、四級化ポリエチレンイミン官能基と結合される。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、低い非特異性結合を確実にするために、追加のポリヒドロキシル表面コーティングを有する、剛性で高多孔性の架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］基材から構成され、完全な四級化アミンと結合される。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、より多くのアニオン結合部位を提供するように化学修飾され、四級アミン強ＡＥＸ官能基と結合しているヒドロキシル化メタクリルポリマー基材から構成される。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ樹脂は、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂、ＰＯＲＯＳ ＸＱ樹脂、Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍ樹脂、Ｓｕｐｅｒ Ｑ－６５０Ｍ樹脂、又はＮＨ２－７５０Ｆ樹脂である。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、混合物中でＡＥＸ樹脂に適用され、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む混合物は、ＨＩＣ工程からの溶離物から構成される負荷溶液を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む負荷溶液は、ＡＥＸ樹脂に適用される。いくつかの実施形態において、負荷溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ負荷溶液は、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約０．６ｍＳ／ｃｍ、約０．７ｍＳ／ｃｍ、約０．８ｍＳ／ｃｍ、約０．９ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、及び約６．０ｍＳ／ｃｍ、又はそれら以下、若しくはそれらを超える導電率を有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ負荷溶液は、約０．５～６．０ｍＳ／ｃｍの導電率、又は約０．７～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ負荷溶液は、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、若しくは約１０．０、又はそれら以下か、それらを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ負荷溶液は、約６．０～１０．０のｐＨ、又は約７．０～９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ負荷溶液は、７．０～９．１のｐＨを有する。
電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＡＥＸ負荷溶液をＡＥＸ樹脂に適用した後、１つ以上の洗浄工程が洗浄緩衝液を使用して行われ得る。洗浄緩衝液は、ＡＥＸ負荷溶液及び特定のＡＥＸ樹脂に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、又はＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、トリス及びＥＤＴＡを更に含む。任意選択的に、洗浄緩衝液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。いくつかの実施形態において、ＡＥＸ洗浄緩衝液は、ＡＥＸ平衡緩衝液と同じである。代替的に、ＡＥＸ洗浄緩衝液は、ＡＥＸ平衡緩衝液と異なり得る。
いくつかの実施形態において、精製された電荷遮蔽された融合タンパク質がＡＥＸ樹脂に適用され、任意選択的に１つ以上の洗浄に続いて、フロースルーが収集される。いくつかの実施形態において、全てのＡＥＸフロースルー及び全ての洗浄が収集される。後続の下流処理で十分な材料を得るために、任意選択的にＡＥＸを含む、第２のクロマトグラフィー工程が１回以上行われ得る。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回行われる。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程は、１～１５回、３～６回、８～１０回、又は９～１５回行われる。任意選択的に、ＡＥＸクロマトグラフィー工程からのフロースルーは、更なる処理の準備が整うまで、０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、又は約１０℃で保存され得る。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程からの溶離物は、更なる処理の準備が整うまで、約０～１０℃、又は約２～８℃で保存される。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程からの溶離物は、約４℃～約８℃で保存される。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程からの溶離物は、更なる処理の準備が整うまで、約５～２５℃、約２～８℃、約１０～２０℃、又は約１８℃～２５℃で保存される。いくつかの実施形態において、溶離物は、約２５℃で最大約８時間保存される。いくつかの実施形態において、溶離物は、約４℃～約８℃で２４時間を超えて保存される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程を用いて、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することを含み、いくつかの実施形態において、方法は、ＨＩＣに続くクロマトグラフィー工程として、ＣＥＸクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸクロマトグラフィー工程は、第１のＨＩＣ工程に続く、第２のクロマトグラフィー工程である。いくつかの実施形態において、ＣＥＸクロマトグラフィー工程は、第１のＨＩＣ工程及びＡＥＸクロマトグラフィー工程に続く、第３のクロマトグラフィー工程である。ＣＥＸクロマトグラフィーは、負に荷電した基を含むＩＥＸ樹脂を使用して、それらの正味の表面電荷に基づいて物質を分離するプロセスである。溶液中では、樹脂は負に荷電した対イオンでコーティングされる。したがって、ＣＥＸ樹脂上の負に荷電した基は、溶液中の正に荷電したタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるＣＥＸ樹脂は、強カチオン交換樹脂である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるＣＥＸ樹脂は、弱カチオン交換樹脂である。「強」又は「弱」アニオン交換体としてのＣＥＸ樹脂の分類は、樹脂官能基のイオン化状態がｐＨによって変化する程度を指す。例えば、弱ＣＥＸ樹脂は、限られたｐＨ範囲にわたってイオン化される（例えば、官能基は、緩衝液ｐＨの変化に伴ってプロトンを取り込むか、又は失う）が、強ＣＥＸ樹脂は、ｐＨの変化に伴ってイオン交換容量に変化を示さない（例えば、官能基は、変化せず、広いｐＨ範囲にわたって完全に荷電されたままである）。
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、混合モード樹脂である。混合モードクロマトグラフィーは、標的タンパク質の分離を達成するために、固定相と負荷溶液との間の２つ以上の形態の相互作用を利用するクロマトグラフィー方法を含む。ほとんどの混合モード相は、典型的には、イオン交換リガンド官能基と結合されたシリカ又はポリマー逆相ベースの材料である。例えば、混合モードＣＥＸ樹脂は、逆相骨格に共有結合された負に荷電したスルホネート基を含み得る。
多くの場合、ＣＥＸ樹脂は、電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＣＥＸ負荷溶液を適用する前に、平衡緩衝液を使用して平衡化され得る。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ平衡緩衝液は、緩衝化塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ平衡緩衝液は、トリス、ＥＤＴＡ、及び塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ平衡緩衝液は、約５．０～１０．０、又は最大、約ｐＨ５．０、約ｐＨ６．０、約ｐＨ７．０、約ｐＨ８．０、約ｐＨ９．０、若しくは約ｐＨ１０．０、又はそれらを超えるｐＨに平衡化される。いくつかの実施形態において、平衡緩衝液は、第２のクロマトグラフィー工程における特定のＣＥＸ樹脂の使用に基づいて選択される。任意選択的に、平衡溶液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、最大、約５００Å、約６００Å、約７００Å、約８００Å、約９００Å、約１，０００Å、若しくは約２，０００Å、又はそれらを超える孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、約５００～２，０００Å、約８００～１，０００Å、又は約７００～９００Åの孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、最大、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、若しくは約１００μｍ、又はそれらを超える粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、約２０～１００μｍ、約３０～５０μｍ、約５０～８０μｍ、又は約８０～１００μｍの粒子サイズを有する。
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］、メタクリレートポリマー、アガロース、又はセルロース基材から構成される。ＣＥＸ樹脂基材は、低い非特異的結合を確実にするために、追加のポリヒドロキシル表面コーティングでコーティングされ得る。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、基材に結合したリガンド官能基から更に構成され、リガンド官能基は、負荷電又は酸性である。ＣＥＸリガンド官能基は、弱カチオン交換体又は強カチオン交換体であり得る。例えば、弱ＣＥＸリガンド官能基は、カルボキシメチル基を含み得る。代替的に、強ＣＥＸリガンド官能基は、スルホン酸（例えば、メチルスルホネート、スルホニル、スルホイソブチル、スルホプロピル）、カルボン酸（例えば、カルボキシメチル）、又はホスホン酸を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＥＸリガンド官能基は、負に荷電したＣＥＸ基に加えて、一級アミンを含むマルチモーダル（例えば、混合モード）官能基、又は水素結合及び疎水性相互作用部位を提供する基を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、低い非特異的結合を確実にするために、追加のポリヒドロキシル表面コーティングを有する剛性で高多孔性の架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］基材から構成され、高密度の負に荷電したスルホプロピル官能基と結合される。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、カルボン酸基と、水素結合及び疎水性相互作用部位を提供する追加の基とを含有する、マルチモーダル弱ＣＥＸリガンド官能基と結合した、剛性の高流量アガロースベースマトリックスから構成される。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、一級アミン及びカルボキシル基の両方を含有する、リガンドと結合した、剛性のセルロースベースマトリックスから構成され、ＣＥＸ及び疎水性特性を付与する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、負に荷電したスルホネート（ＳＰ）基と結合した高流量アガロースベースマトリックスから構成される。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、直鎖ポリマー鎖を介して、負に荷電したスルホイソブチル官能性イオン交換体基と結合した合成メタクリレートポリマー基材から構成される。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、より多くの数のカチオン性結合部位を提供するように化学修飾されたメタクリレートポリマー基材を含む、高分解能で高容量のＣＥＸ樹脂から構成され、スルホプロピル（Ｓ）強ＣＥＸ官能基と結合される。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂、ＣＭＭ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ｉｍｐｒｅｓ樹脂、Ｆｒａｃｔｏ ｇｅｌ ＳＯ３－樹脂、ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０Ｓ樹脂、ＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂、ＭＸ－ＴＲＰ－６５０Ｍ樹脂、Ｓｕｌｆａｔｅ－６５０Ｆ樹脂、ＮＨ２－７５０Ｆ樹脂、ＣａＰｕｒｅ－ＨＡ樹脂、又はＰＰＧ－６００Ｍ樹脂である。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、混合物中でＣＥＸ樹脂に適用され、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む混合物は、前のクロマトグラフィー工程（例えば、ＡＥＸクロマトグラフィー又はＨＩＣ）からの溶離から構成される負荷溶液を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質を含む負荷溶液は、ＣＥＸ樹脂に添加され、およそ塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ負荷溶液は、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約０．６ｍＳ／ｃｍ、約０．７ｍＳ／ｃｍ、約０．８ｍＳ／ｃｍ、約０．９ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、及び約４．０ｍＳ／ｃｍ、又はそれら以下、若しくはそれらを超える導電率を有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ負荷溶液は、約０．５～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率、又は約０．７～２．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ負荷溶液は、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、若しくは約８．０、又はそれら以下、若しくはそれらを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ負荷溶液は、約５．０～８．０のｐＨ、又は約６．０～７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ負荷溶液は、５．９～７．０のｐＨを有する。
電荷遮蔽された融合タンパク質を含むＣＥＸ負荷溶液をＣＥＸ樹脂に適用した後、１つ以上の洗浄工程が洗浄緩衝液を使用して行われ得る。洗浄緩衝液は、ＣＥＸ負荷溶液及び特定のＣＥＸ樹脂に基づいて選択され、様々な洗浄緩衝液を使用することができることは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、又はＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、トリス又はＭＥＳ及びＥＤＴＡを更に含む。任意選択的に、洗浄緩衝液は、界面活性剤、アルコール、及びカオトロピック塩を含むが、これらに限定されない、添加剤を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ洗浄緩衝液は、ＣＥＸ平衡緩衝液と同じである。代替的に、ＣＥＸ洗浄緩衝液は、ＣＥＸ平衡緩衝液と異なり得る。
いくつかの実施形態において、精製された電荷遮蔽された融合タンパク質は、任意選択的に、１回以上の洗浄後に、ＣＥＸ樹脂から溶離される。ＣＥＸ溶離溶液は、塩溶液を含む。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ溶離溶液は、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約０．６ｍＳ／ｃｍ、約０．７ｍＳ／ｃｍ、約０．８ｍＳ／ｃｍ、約０．９ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、若しくは約５．０ｍＳ／ｃｍ、又はそれら以下、若しくはそれらを超える導電率を有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ溶離溶液は、約０．５～５．０ｍＳ／ｃｍ、約０．７～４．０ｍＳ／ｃｍ、約１．０～２．０ｍＳ／ｃｍ、又は約３．０～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ溶離溶液は、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、又は約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＣＥＸ溶離溶液は、約５．５～７．５のｐＨ、又は約６．０～７．０のｐＨを有する。
後続の下流処理における十分な材料を得るために、任意選択的にＣＥＸを含む、第３のクロマトグラフィー工程が１回以上行われ得る。いくつかの実施形態において、ＣＥＸクロマトグラフィー工程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回行われる。いくつかの実施形態において、ＣＥＸクロマトグラフィー工程は、１～１５回、３～６回、８～１０回、又は９～１５回行われる。任意選択的に、ＣＥＸクロマトグラフィー工程からの溶離物は、更なる処理の準備が整うまで、０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、又は約１０℃で保存され得る。いくつかの実施形態において、ＡＥＸクロマトグラフィー工程からの溶離物は、更なる処理の準備が整うまで、約０～１０℃、又は約２～８℃で保存される。
ＩＩ．電荷遮蔽された融合タンパク質を産生する方法
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、電荷遮蔽されたタンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養して、電荷遮蔽された融合タンパク質を産生することと、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することとを含む。ポリペプチドの発現のための宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、原核細胞、並びに真核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレッセンス）細胞、酵母細胞、無脊椎動物細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ－１サル細胞、Ｂｏｗｅｓ細胞などの黒色腫細胞、マウスＬ－９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ由来の３Ｔ３株、Ｂａｌｂ－ｃ又はＮＩＨマウス、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株を含む。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質をコードする核酸は、宿主細胞染色体に組み込まれる。
好ましくは、当該ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子移入若しくは標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが、標的化細胞集団への本発明のポリヌクレオチド又はベクターの送達ために使用され得る。本発明の核酸分子を含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞に移入することができ、細胞宿主の種類に応じて変化する。
電荷遮蔽された融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術、例えば、電荷遮蔽された融合タンパク質をコードする記載の核酸分子又はベクターを含む細胞を培養することと、培養から当該生物活性タンパク質を単離することとによって産生され得る。電荷遮蔽された融合タンパク質は、原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＢＬ２１、Ｗ３１１０、又はＪＭ８３）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ（枯草菌）、又は真核細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）酵母株Ｘ－３３若しくはＣＨＯ細胞を含む任意の好適な細胞培養システムで産生され得る。当該技術分野で既知の更なる好適な細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような、細胞株デポジトリから入手可能である。「原核生物」という用語は、細菌細胞を含むことが意味され、「真核生物」という用語は、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳類細胞を含むことが意味される。形質転換された宿主を発酵槽で増殖させ、当該技術分野で既知の技術に従って培養して、最適な細胞増殖を達成することができる。更なる実施形態において、本発明は、生物活性タンパク質の発現に好適な条件下で本発明の細胞を培養することと、細胞又は培養培地から生物活性タンパク質を単離することとを含む、上記の生物活性タンパク質の調製のためのプロセスに関する。
方法、ベクター、並びに翻訳及び転写要素、及び本明細書の方法に有用な他の要素の更なる例は、例えば、Ｇｉｌｒｏｙによる米国特許第５，０５５，２９４号、及びＧｉｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，１２８，１３０号、Ｒａｍｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，２８１，５３２号、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，６９５，４５５号及び同第４，８６１，５９５号、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，７５５，４６５号、並びにＷｉｌｃｏｘによる米国特許第５，１６９，７６０号に記載されている。
ＩＩＩ．電荷遮蔽された融合タンパク質
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、融合タンパク質のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、融合タンパク質のＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、生物活性ドメインのＮ末端に位置する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、生物活性ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、電荷遮蔽ドメインと生物活性ドメインとの間にペプチドリンカーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明で提供される融合タンパク質は、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、イオン交換クロマトグラフィー樹脂と生物活性ドメインとの結合を妨げるか又は低下させる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、融合タンパク質の疎水性を増加させる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、生物活性ドメインの荷電領域を覆う。
本明細書で使用される場合、「生物活性ドメイン」は、それ自体で、又は別の分子（タンパク質、脂質、核酸、又は他のモノマーなど）と会合して生物活性を有する、タンパク質又はペプチドである。例えば、「生物活性ドメイン」は、多量体タンパク質複合体のサブユニットを含む。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、非荷電である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、例えば、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、又は約６．９～約７．１などの約７のｐＩを有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、５～９、５～６、５～７、７～８、又は７～９のｐＩを有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、非荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、非極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、プロリン、アラニン、及びセリンからなる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、プロリン及びアラニンからなる。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、１０～１００ｋＤａ、１０～８０ｋＤａ、１０～６０ｋＤａ、又は１０～４０ｋＤａなどの１０～２００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、１０～２０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、多量体タンパク質を形成する、いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質は、二量体、三量体、四量体、六量体、又は八量体を形成する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、四量体を形成する。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された多量体（例えば四量体）タンパク質の分子量は、５０～５００ｋＤａ、７５～３００ｋＤａ、又は１００～２５０ｋＤａである。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量未満である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量の、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、又は２０％未満である。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量超である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量の、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、又は少なくとも２００％である。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量の約２５％～約１５０％である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量の約５０％～約１２５％である。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインの分子量は、生物活性ドメインの分子量の約５０％～約１００％である。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質の総分子量は、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１２０ｋＤａ、又は少なくとも１５０ｋＤａである。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、ランダムコイル立体構造を取り入れる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、水性環境（例えば、水溶液又は水性緩衝液）でランダムコイル構造を取り入れる。ランダムコイル立体構造の存在は、特に円二色性（ＣＤ）分光法などの分光技法によって、当該技術分野で既知の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、無秩序構造を有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、非構造化されている。
別の実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるとき、９０％超のランダムコイル形成、又は約９５％、若しくは約９６％、若しくは約９７％、若しくは約９８％、若しくは約９９％超のランダムコイル形成を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は３％未満のアルファヘリックスを有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は３％未満のベータシートを有する。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるとき、２％未満のアルファヘリックス及び２％未満のベータシートを有する。
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質を提供し、電荷遮蔽ドメインは、アスパラギン及びグルタミン残基の合計が、電荷遮蔽ドメインの全アミノ酸配列の１０％未満であり、メチオニン及びトリプトファン残基の合計が、電荷遮蔽ドメインの全アミノ酸配列の２％未満であり、電荷遮蔽ドメイン配列が、５％未満の正荷電アミノ酸残基を有することを特徴とする。
別の実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、電荷遮蔽ドメイン配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％が、非重複配列モチーフからなることを特徴とし、配列モチーフの各々は、約９～約１４個のアミノ酸残基を有し、任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）から選択される４～６種類のアミノ酸からなる配列モチーフの各々において、２回を超えて発生しない。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、融合タンパク質の流体力学的半径を増加させる。「流体力学的半径」又は「ストークス半径」という用語は、溶液中の分子の有効半径（ｎｍでのＲｈ）であり、それが溶液を通って移動し、溶液の粘度によって抵抗される体であると仮定することによって測定される。本発明の実施形態において、融合タンパク質の流体力学的半径測定は、より直観的な尺度である、「見かけの分子量因子」と相関する。タンパク質の「流体力学的半径」は、水溶液中のその拡散速度、並びに巨大分子のゲル中でのその移動能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量並びに形状及び緻密性を含むその構造によって決定される。流体力学的半径を決定するための方法は、例えば、米国特許第６，４０６，６３２号及び同第７，２９４，５１３号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用によるなど、当該技術分野で周知である。ほとんどのタンパク質は球状構造を有し、タンパク質が最小の流体力学的半径を有することができる最も緻密な三次元構造である。いくつかのタンパク質は、ランダムな、開いた、非構造化、又は「線形」立体構造を取り入れ、結果として、同様の分子量の典型的な球状タンパク質と比較して、はるかに大きな流体力学的半径を有する。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、融合タンパク質の流体力学的半径を、約３～５ｎｍの糸球体細孔サイズ（約７０ｋＤＡの見かけ分子量に対応する）を超えて拡張することができ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ．２００３．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１－１２７７）、循環タンパク質の低下した腎クリアランスをもたらす。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量並びに形状又は緻密性を含むその構造によって決定される。流体力学的半径を決定するための方法は、例えば、米国特許第６，４０６，６３２号及び同第７，２９４，５１３号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用によるなど、当該技術分野で周知である。したがって、特定の実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも約５ｎｍ、又は少なくとも約８ｎｍ、又は少なくとも約１０ｎｍ、又は１２ｎｍ、又は少なくとも約１５ｎｍの流体力学的半径を有する。前述の実施形態において、電荷遮蔽ドメインによって付与される大きな流体力学的半径は、得られた融合タンパク質の低下した腎クリアランスをもたらすことができ、末端半減期の対応する増加、平均滞留時間の増加、及び／又は腎クリアランス速度の低下につながる。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、生物活性ドメインの機能に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、電荷遮蔽ドメインに融合したときに、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の活性を保持する。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、融合タンパク質又は電荷遮蔽された融合タンパク質サブユニットの多量体（すなわち、二量体、三量体、四量体、六量体、又は八量体）のインビボ半減期を増加させる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、電荷遮蔽ドメインを有しない生物活性タンパク質と比較して、インビボ半減期を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％増加させる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、インビボ半減期を、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は３０倍超増加させる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、インビボ半減期を、５～５０倍、５～４０倍、５～３０倍、又は５～２０倍増加させる。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、電荷遮蔽ドメインに連結されていない対応する生物活性ドメインと比較して、動物に投与される融合タンパク質又は融合タンパク質の多量体（すなわち、二量体、三量体、四量体、六量体、又は八量体）における半減期に増加を付与するように選択され、電荷遮蔽ドメインに連結されていない生物活性ドメインと比較して、少なくとも約２倍長い、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも１００倍、又はそれらを超える半減期における増加の相当する用量で投与される。いくつかの実施形態において、本発明は、電荷遮蔽ドメインに結合しておらず、相当する用量で動物に投与される対応する生物活性ドメインと比較して、ＡＵＣにおける少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約１５０％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約５００％、又は少なくとも約１０００％、又は少なくとも約２０００％の増加を示す融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の薬物動態パラメータは、投与、間隔をあけた時点での血液試料の採取、及びＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ラジオアッセイ、又は当該技術分野において既知か若しくは本明細書に記載の他の方法を使用したタンパク質のアッセイ、それに続く半減期及び他のＰＫパラメータを導き出すデータの標準的な計算を含む、標準的な方法によって決定することができる。
加えて、融合タンパク質は、タンパク質約２５μｇ／ｋｇの用量で、少なくとも約５、１０、１２、１５、２４、３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間の半減期を有し得る。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、ＰＡＳドメインである。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、プロリン、アラニン、及び／又はセリン残基からなる。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、１０～１０００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、１００～１０００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、２００～８００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、２００～７００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、２００～６００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、２００～４００個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、生物活性ドメイン及びＰＡＳドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される「ＰＡＳ化」又は「ＰＡＳ化した」は、生物活性ドメインが、ＰＡＳドメインに融合されていることを意味する。
いくつかの実施形態において、ＰＡＳドメインは、１０～１００個以上のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、合計１５～６０個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、合計１５～４５個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、例えば、合計２０～約４０個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基を含む。好ましい態様において、当該アミノ酸配列は、約２０個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる。別の好ましい態様において、当該アミノ酸配列は、約４０個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなる。
プロリン及びアラニンアミノ酸残基のみからなるポリペプチドは、約２００～約４００個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基の長さを有し得る。言い換えれば、ポリペプチドは、約２００～約４００個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基からなり得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、合計約２００（例えば２０１）個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基（すなわち、約２００（例えば２０１）個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基の長さを有する）からなるか、又はポリペプチドは、合計約４００（例えば４０１）個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基（すなわち、約４００（例えば４０１）個のプロリン及びアラニンアミノ酸残基の長さを有する）からなる。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽ドメインは、約２００～約４００個のプロリン及びアラニン残基のランダム配列からなる。
電荷遮蔽ドメインは、複数のアミノ酸反復を含み得、当該反復は、プロリン及びアラニン残基からなり、６個以下の連続したアミノ酸残基が同一である。特に、ポリペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号２）又は環状変更型、又は配列の全体若しくは部分としての配列の多量体を含み得るか、又はそれらからなる。
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡ（配列番号３）
ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号４）
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、ホルモンである。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、酵素である。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、治療用ペプチドである。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、治療用ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、アグーチ関連ペプチド、アミリン、アンギオテンシン、セクロピン、ボンベシン、ガストリン放出ペプチドを含む、ガストリン、ラクトフェリン、マガイニンを含むがこれに限定されない抗菌ペプチド、ウロジラチン、核局在シグナル（ＮＬＳ）、コラーゲンペプチド、サバイビン、ｆ－アミロイドを含む、アミロイドペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ペプチドＹＹ、ニューロペプチドＹを含むがこれに限定されない神経再生ペプチド及び神経ペプチド、ダイノルフィン、エンドモルフィン、エンドセリン、エンカファリン、エキセンジン、フィブロネクチン、ニューロペプチドＷ及びニューロペプチドＳ、ペプチドＴ、メラノコルチン、アミロイド前駆体タンパク質、シートブレーカーペプチド、ＣＡＲＴ１３ ＷＯ２００８／０３０９６８ ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７７６７ペプチド、アミロイド阻害ペプチド、プリオン阻害ペプチド、クロロトキシン、コルチコトロピン放出因子、オキシトシン、バソプレシン、コレシストキニン、セクレチン、チモシン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、パンクレアスタチン、メラノサイト刺激ホルモン、オステオカルシン、ブラジキニン、アドレノメジュリン、ペリネリン、メタスタチン、アプロチニン、ガラニン様ペプチドを含むガラニン、レプチン、ａ－デフェンシン及びｆデフェンシンを含むがこれらに限定されないデフェンシン、サリューシン、及びコノトキシン、デコルシン、クルトキシン、アネノマエ毒、タランチュラ毒を含むがこれに限定されない様々な毒；脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、又はＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド、及びバソナトリンを含むナトリウム利尿ペプチド；ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ；ニューロメジン；ニューロテンシン；オレキシン、膵臓ポリペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、プロラクチン放出ペプチド、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ソマトスタチン、ＴＮＦ－ａ；グレリン（Ｇｒｅｈｌｉｎ）、プロテインＣ（Ｘｉｇｒｉｓ）、ＳＳ１（ｄｓＦｖ）－ＰＥ３８及びｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素タンパク質、アンチトロンビンＩＩＩ及び凝固因子ＶＩＩＡ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子を含む凝固因子、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ベータグルコセレブロシダーゼ及びアルファ－Ｄ－ガラクトシダーゼ、アルファＬ－イズロニダーゼ、アルファ－１，４－グルコシダーゼ、アリルスルファターゼＢ、イズロン酸－２－スルファターゼ、デオキシリブヌクラーゼＩ、ヒト活性化タンパク質、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、黄体形成ホルモン、ソマトロピン、骨形成タンパク質、ネシリチド、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、ケラチノサイト増殖因子、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ヒト顆粒球マクロフェーズコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、ＩＬ－１、ＩＬ－ｉＲａ、ＩＬ－２、１１－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ１１、ＩＬ－１２を含むインターロイキン、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ、Ｂ型肝炎を含む免疫グロブリン、ガンマグロブリン、ベノグロブリン、ヒルジン、アプロチニン、アンチトロンビンＩＩＩ、α－ｉ－プロテイナーゼ阻害剤、フィルグラスチム、及びエタネルセプトのうちの１つ、又はその変異体、断片、若しくは誘導体を含む。
別の実施形態において、生物活性ドメインは、免疫療法、又は他の治療的介入に関連している、抗体又は抗原である。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、インスリンＡペプチド、Ｔ２０ペプチド、インターフェロンアルファ２Ｂペプチド、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、小型ヘテロダイマーパートナーオーファン受容体、アンドロゲン受容体リガンド結合ドメイン、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン、Ｇタンパク質アルファＱ、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸レダクトイソメラーゼペプチド、Ｇタンパク質アルファＳ、アンギオスタチン（Ｋｉ－３）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、カルモジュリン（ＣａｌＭ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インターロイキンＩ受容体アンタゴニスト（ＩＬ－ｉＲａ）、ルシフェラーゼ、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴｇ）、モルヒネ調節神経ペプチド１４ ＷＯ２００８／０３０９６８ ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７７６７（ＭＭＮ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシン－Ｂ、レプチン、ＡＣＴＨ、カルシトニン、アドレノメジュリン（ＡＭ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、デフェンシン、成長ホルモンを含む。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、２００ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約１５０ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、腎臓濾過における閾値である、約７０ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約２０～約１００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約２０～約７０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約３０～約４０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、多量体を形成することができる。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、二量体、三量体、四量体、六量体、又は八量体を形成することができる。いくつかの実施形態において、多量体生物学的活性ドメインの分子量は、約２０ｋＤａ～約３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約２００ｋＤａ、又は約１００ｋＤａ～約２００ｋＤａである。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、中性溶液中で正味電荷を有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、７．０ではないｐＩを有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約３．０～約６．０、約４．０～約６．０、又は約５．０～約６．０のｐＩを有する。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、約８．０～約１０．０、約８．０～約９．０のｐＩを有する。
いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、酵素である。いくつかの実施形態において、生物活性ドメインは、アスパラギナーゼサブユニットである。Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（黒脚病菌）からの組換えＩＩ型アスパラギナーゼ、クリサンタスパーゼは、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）及びＥｒｗｉｎａｚｅ（登録商標）としても知られている。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の組換えアスパラギナーゼは、Ｃｏｌａｓｐａｓｅ（登録商標）、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）、Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）、Ｌｅｕｎａｓｅ（登録商標）、及びＳｐｅｃｔｒｉｌａ（登録商標）という名称によって知られている。Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ（登録商標）は、Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼのペグ化型の名称である。クリサンタスパーゼは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、及び非ホジキンリンパ腫を有する患者に、静脈内、筋肉内、又は皮下注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ型（クリサンタスパーゼ）である。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼは、アミノ酸配列ＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹを含む。（配列番号１）
いくつかの実施形態において、アスパラギンは、組換えＥ．Ｃｏｌｉアスパラギナーゼである。Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｌ－アスパラギナーゼＩ型及びＬ－アスパラギナーゼＩＩ型の２つのアスパラギナーゼを産生する。Ｌ－アスパラギナーゼＩ型は、アスパラギンに対して低い親和性を有し、細胞質に局在される。Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ型は、切断可能な分泌リーダー配列とともに産生されるアスパラギンに対して高い親和性を有する四量体周辺質酵素である。参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願第２０１６／００６０６１３号、「Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ」は、細菌源からの既知のＬ－アスパラギナーゼの共通の構造的特徴を説明する。ＵＳ２０１６／００６０６１３号により、全てが、２つの隣接するモノマーのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間に４つの活性部位を有するホモ四量体であり、全てが、それらの三次及び四次構造において高度な類似性を有し、Ｌ－アスパラギナーゼの触媒部位の配列は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ（軟腐病菌）、及びＥ．ｃｏｌｉのＬ－アスパラギナーゼＩＩの間で高度に保存されている。
実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ Ａ－１－３ Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ型は、アミノ酸配列：ＬＰＮＩＴＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＧＧＤＳＡＴＫＳＮＹＴＡＧＫＶＧＶＥＮＬＶＮＡＶＰＱＬＫＤＩＡＮＶＫＧＥＱＶＶＮＩＧＳＱＤＭＮＤＤＶＷＬＴＬＡＫＫＩＮＴＤＣＤＫＴＤＧＦＶＩＴＨＧＴＤＴＭＥＥＴＡＹＦＬＤＬＴＶＫＣＤＫＰＶＶＭＶＧＡＭＲＰＳＴＳＭＳＡＤＧＰＦＮＬＹＮＡＶＶＴＡＡＤＫＡＳＡＮＲＧＶＬＶＶＭＮＤＴＶＬＤＧＲＤＶＴＫＴＮＴＴＤＶＡＴＦＫＳＶＮＹＧＰＬＧＹＩＨＮＧＫＩＤＹＱＲＴＰＡＲＫＨＴＳＤＴＰＦＤＶＳＫＬＮＥＬＰＫＶＧＩＶＹＮＹＡＮＡＳＤＬＰＡＫＡＬＶＤＡＧＹＤＧＩＶＳＡＧＶＧＮＧＮＬＹＫＴＶＦＤＴＬＡＴＡＡＫＮＧＴＡＶＶＲＳＳＲＶＰＴＧＡＴＴＱＤＡＥＶＤＤＡＫＹＧＦＶＡＳＧＴＬＮＰＱＫＡＲＶＬＬＱＬＡＬＴＱＴＫＤＰＱＱＩＱＱＩＦＮＱＹ（配列番号５）を含む。
いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼは、本発明の方法を使用して産生される。このアスパラギナーゼは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８０７，４３６号、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ＩＩ」に記載されており、配列は、配列番号５として示される。Ｅ．ｃｏｌｉ Ａ－１－３Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ型はまた、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，１９７２，“Ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａ－１－３，”Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１２，２２５１－２２５３によって記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ Ａ－１－３は、高レベルのアスパラギンを産生するＥ．ｃｏｌｉ ＨＡＰ株に由来し、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９６８，“Ｎｅｗ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，９５：６，２１１７－２１２３に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態において、本発明の方法を使用して産生されるＬ－アスパラギナーゼＩＩ型タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ型酵素であり、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１４９１－１４９８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ３４２７７）によって記載されるａｎｓＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有し、両方ともが参照により本明細書に組み込まれる（ＭＥＦＦＫＫＴＡＬＡＡＬＶＭＧＦＳＧＡＡＬＡＬＰＮＩＴＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＧＧＤＳＡＴＫＳＮＹＴＶＧＫＶＧＶＥＮＬＶＮＡＶＰＱＬＫＤＩＡＮＶＫＧＥＱＶＶＮＩＧＳＱＤＭＮＤＮＶＷＬＴＬＡＫＫＩＮＴＤＣＤＫＴＤＧＦＶＩＴＨＧＴＤＴＭＥＥＴＡＹＦＬＤＬＴＶＫＣＤＫＰＶＶＭＶＧＡＭＲＰＳＴＳＭＳＡＤＧＰＦＮＬＹＮＡＶＶＴＡＡＤＫＡＳＡＮＲＧＶＬＶＶＭＮＤＴＶＬＤＧＲＤＶＴＫＴＮＴＴＤＶＡＴＦＫＳＶＮＹＧＰＬＧＹＩＨＮＧＫＩＤＹＱＲＴＰＡＲＫＨＴＳＤＴＰＦＤＶＳＫＬＮＥＬＰＫＶＧＩＶＹＮＹＡＮＡＳＤＬＰＡＫＡＬＶＤＡＧＹＤＧＩＶＳＡＧＶＧＮＧＮＬＹＫＳＶＦＤＴＬＡＴＡＡＫＴＧＴＡＶＶＲＳＳＲＶＰＴＧＡＴＴＱＤＡＥＶＤＤＡＫＹＧＦＶＡＳＧＴＬＮＰＱＫＡＲＶＬＬＱＬＡＬＴＱＴＫＤＰＱＱＩＱＱＩＦＮＱＹ（配列番号６）又はＬＰＮＩＴＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＧＧＤＳＡＴＫＳＮＹＴＶＧＫＶＧＶＥＮＬＶＮＡＶＰＱＬＫＤＩＡＮＶＫＧＥＱＶＶＮＩＧＳＱＤＭＮＤＮＶＷＬＴＬＡＫＫＩＮＴＤＣＤＫＴＤＧＦＶＩＴＨＧＴＤＴＭＥＥＴＡＹＦＬＤＬＴＶＫＣＤＫＰＶＶＭＶＧＡＭＲＰＳＴＳＭＳＡＤＧＰＦＮＬＹＮＡＶＶＴＡＡＤＫＡＳＡＮＲＧＶＬＶＶＭＮＤＴＶＬＤＧＲＤＶＴＫＴＮＴＴＤＶＡＴＦＫＳＶＮＹＧＰＬＧＹＩＨＮＧＫＩＤＹＱＲＴＰＡＲＫＨＴＳＤＴＰＦＤＶＳＫＬＮＥＬＰＫＶＧＩＶＹＮＹＡＮＡＳＤＬＰＡＫＡＬＶＤＡＧＹＤＧＩＶＳＡＧＶＧＮＧＮＬＹＫＳＶＦＤＴＬＡＴＡＡＫＴＧＴＡＶＶＲＳＳＲＶＰＴＧＡＴＴＱＤＡＥＶＤＤＡＫＹＧＦＶＡＳＧＴＬＮＰＱＫＡＲＶＬＬＱＬＡＬＴＱＴＫＤＰＱＱＩＱＱＩＦＮＱＹ（配列番号７）として示されるアミノ酸配列）（リーダー配列を含まない
米国特許第７，８０７，４３６号は、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｅｌｓｐａｒ（登録商標））からのＬ－アスパラギナーゼＩＩ型酵素及びＫｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．からのＬ－アスパラギナーゼＩＩ型酵素と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２酵素サブユニットは、Ａｌａ２７の代わりにＶａｌ２７、Ａｓｐ６４の代わりにＡｓｎ６４、Ｔｈｒ２５２の代わりにＳｅｒ２５２、及びＡｓｎ２６３の代わりにＴｈｒ２６３を有することを報告している。
実施形態において、本発明の方法を使用して産生されたＬ－アスパラギナーゼＩＩ型は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９７４，“Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６（６）：１３５１－４によって示されるアミノ酸配列を有する。
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えＩＩ型アスパラギナーゼは、Ｃｏｌａｓｐａｓｅ（登録商標）、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）、Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）、Ｌｅｕｎａｓｅ（登録商標）、及びＳｐｅｃｔｒｉｌａ（登録商標）という名称によっても知られている。Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ（登録商標）は、Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼのペグ化型の名称である。アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、及び非ホジキンリンパ腫を有する患者に、静脈内、筋肉内、又は皮下注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するアスパラギナーゼサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する配列番号７を含む、アスパラギナーゼサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のアミノ酸挿入又は欠失を有する配列番号７を含む、アスパラギナーゼサブユニットを含む。
置換は、保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖、又は物理化学的特徴（例えば、静電、水素結合、同配体、疎水性特性）を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。アミノ酸は、天然に存在するか、又は非天然であり得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で既知である。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。置換はまた、非保存的変化を含み得る。
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ＮＣＰＰＢ１０６６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ３２８８４、例えば、Ｍｉｎｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ＮＣＰＰＢ １０６６ Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ，”Ｇｅｎｅ ４６（１），２５－３５によって記載され、各々が参照によりその全体が組み込まれる）、シグナルペプチド及び／若しくはリーダー配列を有するか、又は有しない。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｄｉｃｋｅｙａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ（ディケヤ・クリサンテミ）からのアスパラギナーゼを含む。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼは、アミノ酸配列ＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ（配列番号８）を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ（配列番号９）を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、アミノ酸配列ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ（配列番号１０）を含む。
ＩＶ．電荷遮蔽された組換えＥｒｗｉｎｉａ融合タンパク質の産生
いくつかの実施形態において、方法は、電荷遮蔽されたアスパラギナーゼ融合タンパク質を発現させること及び精製することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＩＩ型アスパラギナーゼ融合タンパク質を発現させることを含む。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ Ｌ－アスパラギナーゼＩＩ型（クリサンタスパーゼ）である。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼ融合タンパク質は、原核生物宿主細胞で発現する。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼ融合タンパク質は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞で発現する。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ（シュードモナス目）宿主細胞は、１つ以上のネイティブアスパラギナーゼの発現を欠損している。いくつかの実施形態において、発現が欠損したネイティブアスパラギナーゼは、Ｉ型アスパラギナーゼである。いくつかの実施形態において、発現が欠損したネイティブアスパラギナーゼは、ＩＩ型アスパラギナーゼである。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、１つ以上のプロテアーゼの発現を欠損している。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、１つ以上のフォルディング調節物質を過剰発現する。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、１つ以上のネイティブアスパラギナーゼの発現を欠損している、１つ以上のプロテアーゼの発現を欠損している、かつ／又は１つ以上のフォルディング調節物質を過剰発現する。ＵＳ１０７８７６７１は、組換えＥｒｗｉｎｉａアスパラギナーゼを産生するための方法を提供する。
そのネイティブ宿主であるＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉでは、クリサンタスパーゼは周辺質で産生される。本発明は、宿主細胞の細胞質における高レベルの可溶性及び／又は活性クリサンタスパーゼの産生を可能にする方法を提供する。実施形態において、本明細書で提供される方法は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ（シュードモナス菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞の細胞質中に高レベルの可溶性及び／又は活性クリサンタスパーゼを生じる。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質は、周辺質放出物から精製される。いくつかの実施形態において、電荷遮蔽された融合タンパク質をコードする核酸は、周辺質分泌リーダー配列を含む。
いくつかの実施形態において、浸透圧ショックを使用して、周辺質放出物を生成する。いくつかの実施形態において、細胞をリゾチームとインキュベートして、周辺質放出物を生成する。いくつかの実施形態において、細胞を超音波処理して、周辺質放出物を生成する。いくつかの実施形態において、細胞をリゾチームとインキュベートし、超音波処理して、周辺質放出物を生成する。
いくつかの実施形態において、周辺質から、電荷遮蔽された融合タンパク質を放出させるために、クロロホルム（Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０：１１８１－１１８３）、グアニジン－ＨＣｌ、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｎａｇｌａｋ ａｎｄ Ｗａｎｇ（１９９０）Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１２：６０３－６１１）などの化学薬品が使用されている。しかしながら、これらの化学薬品は不活性ではなく、多くの組換えタンパク質産物又はその後の精製手順に悪影響を及ぼし得る。外膜の増加した透過性をもたらすＥ．ｃｏｌｉ細胞のグリシン処理もまた、周辺質内容物を放出させることが報告されている（Ａｒｉｇａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６８：２４３－２４６）。組換えタンパク質周辺質放出の最も広く使用された方法は、浸透圧ショック（Ｎｏｓａｌ ａｎｄ Ｈｅｐｐｅｌ（１９６６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１：３０５５－３０６２、Ｎｅｕ ａｎｄ Ｈｅｐｐｅｌ（１９６５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４０：３６８５－３６９２）、鶏卵白（ＨＥＷ）リゾチーム／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理（Ｎｅｕ ａｎｄ Ｈｅｐｐｅｌ（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９：３８９３－３９００、Ｗｉｔｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４４３：５３４－５４４、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＩＣｈｅｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｖｅｎｔ，２：９９５－９９７）、及びＨＥＷリゾチーム／浸透圧ショック併用処理（Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，１９：３３２－３３８）である。Ｆｒｅｎｃｈ方法は、画分化緩衝液中の細胞の再懸濁、続いて周辺質画分の回収を伴い、リゾチーム処理の直後に浸透圧ショックが行われる。
典型的には、これらの手順は、浸透圧を安定化させる培地中での初期破壊を伴い、続いて非安定化培地中での選択的放出を伴う。これらの培地（ｐＨ、保護剤）の組成及び使用される破壊方法（クロロホルム、ＨＥＷリゾチーム、ＥＤＴＡ、超音波処理）は、報告された特定の手順に依存する。リゾチーム／ＥＤＴＡ処理でのＥＤＴＡ Ａ変化の代わりに双性イオン界面活性剤を使用するＨＥＷは、Ｓｔａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：３０７－３１４に記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉを破壊する細胞内溶解酵素システムの使用の全般的なレビューについて、Ｄａｂｏｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｎｅｙ（１９９０）ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔｅｒ，ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ），ｐｐ．Ｓｅｅ１１－３０を参照されたい。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたアスパラギナーゼ融合タンパク質は、分泌シグナルを伴わずに、プラスミドなどの発現構築物で発現する。誘導性プロモーター配列を使用して、本明細書における方法に従ってクリサンタスパーゼの発現を調節する。実施形態において、本明細書における方法に有用な誘導性プロモーターには、ｌａｃプロモーター（すなわち、ｌａｃＺプロモーター）に由来するファミリーのもの、特に、ＤｅＢｏｅｒによる米国特許第４，５５１，４３３号に記載されているｔａｃ及びｔｒｃプロモーター、並びにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、及びＴ７ｌａｃプロモーターが含まれる。一実施形態において、プロモーターは、宿主細胞生物に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ生物に由来する。いくつかの実施形態において、ｌａｃプロモーターを使用して、プラスミドからのクリサンタスパーゼの発現を調節する。ｌａｃプロモーター誘導体又はファミリーメンバー、例えば、ｔａｃプロモーターの場合、インデューサは、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれる）である。特定の実施形態において、ＩＰＴＧを培養に添加して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞におけるｌａｃプロモーターからクリサンタスパーゼの発現を誘導する。
本明細書における方法を実施するのに有用な発現構築物には、タンパク質コード配列に加えて、それに操作可能に連結された以下の調節要素：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、並びに翻訳開始及び停止シグナルが含まれる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及び密接に関連する細菌は、一般に、「グラム（－）プロテオバクテリアサブグループ１」又は「グラム陰性好気性桿菌及び球菌」（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ Ａｒｃｈａｅａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２０１５））として定義される群の一部である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株は、上記で引用される、文献、例えば、米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号に記載されている。
「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」にはまた、分類で使用される基準に従ってこの見出しに分類されるプロテオバクテリアが含まれる。見出しにはまた、以前はこのセクションに分類されたが、もはや分類されていないグループが含まれ、例えば、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ（アシドボラクス）属、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ（ブレブンディモナス）属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア）属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ（ハイドロゲノファーガ）属、Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ（オセアニモナス）属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属、及びＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ（ステノトロホモナス）属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（キサントモナス）属に属する再分類した生物によって作成されたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（スフィンゴモナス）属（及びそれに由来するＢｌａｓｔｏｍｏｎａｓ（ブラストモナス）属）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ Ａｒｃｈａｅａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２０１５）で定義されたＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アセトバクター）属に属する生物を再分類することによって作成されたＡｃｉｄｏｍｏｎａｓ（アシドモナス）属が挙げられる。加えて、宿主には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属である、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎａｌｉａ（シュードモナス・エナリア）（ＡＴＣＣ１４３９３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ（シュードモナス・ニグリファシエンシ）（ＡＴＣＣ１９３７５）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（シュードモナス・プトレファシエンス）（ＡＴＣＣ８０７１）からの細胞が含まれ、それぞれＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ（シュードアルテロモナス・ハロプランクティス）、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（シュードアルテロモナス・ニグリファシエンス）、及びＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（アルテロモナス・プトレファシエンス）として再分類されている。同様に、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（シュードモナス・アシドボランス）（ＡＴＣＣ１５６６８）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（シュードモナス・テストステロニ）（ＡＴＣＣ１１９９６）は、それぞれＣｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（コマモナス・アシドボランス）及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（コマモナス・テストステロニ）として以来再分類されており、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（シュードモナス・ニグリファシエンス）（ＡＴＣＣ１９３７５）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（シュードモナス・ピスシシダ）（ＡＴＣＣ１５０５７）は、それぞれＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（シュードアルテロモナス・ニグリファシエンス）及びＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（シュードアルテロモナス・ピスシシダ）として再分類されている。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」にはまた、科：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ（シュードモナス科）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ（アゾトバクター科）（現在、しばしば同義語であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅの「窒素固定菌群」によって呼ばれる）、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ（リゾビウム科）、及びＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ（メチロモナス科）（現在、しばしば同義語である「Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（メチロコッカス科）」によって呼ばれる）のうちのいずれかに属するとして分類されたプロテオバクテリアが含まれる。結果として、これらの属に加えて、本明細書に記載される別の方法では、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」内に入る更なるプロテオバクテリア属には、１）Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ（アゾリゾフィルス）属のＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ（アゾトバクター）群細菌、２）Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ（セルビブリオ）属、Ｏｌｉｇｅｌｌａ（オリゲラ）属、及びＴｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ（テレディニバクター）属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌、３）Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ（ケラトバクター）属、Ｅｎｓｉｆｅｒ（エンシフェル）属、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ（リベリバクター）属（別名「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ（カンキツグリーニング病菌）」とも呼ばれる）、及びＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（シノリゾビウム）属のＲｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科細菌、並びに４）Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ（メチロバクター）属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ（メチロカルダム）属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ（メチロミクロビウム）属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ（メチロサルシナ）属、及びＭｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ（メチロスファエラ）属のＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科細菌が含まれる。
宿主細胞は、いくつかの場合において、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」は、以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（括弧内に示されるＡＴＣＣ又は例示的な株の他の寄託番号を伴う）：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ（シュードモナス・アビエタニフィラ）（ＡＴＣＣ７００６８９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）（ＡＴＣＣ１０１４５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（シュードモナス・アルカリゲネス）（ＡＴＣＣ１４９０９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ（シュードモナス・アンギリセプティカ）（ＡＴＣＣ３３６６０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ（シュードモナス・シトロネロリス）（ＡＴＣＣ１３６７４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ（蛍光菌）（ＡＴＣＣ５１５５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（シュードモナス・メンドシナ）（ＡＴＣＣ２５４１１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ（シュードモナス・ニトロレデュセンス）（ＡＴＣＣ３３６３４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（シュードモナス・オレオボランス）（ＡＴＣＣ８０６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｋａｌｉｇｅｎｅｓ（シュードモナス・シュードアカリゲネス）（ＡＴＣＣ１７４４０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ（シュードモナス・レシノボランス）（ＡＴＣＣ１４２３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ（シュードモナス・ストラミネア）（ＡＴＣＣ３３６３６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ（シュードモナス・アガリシ）（ＡＴＣＣ２５９４１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ（シュードモナス・アルカリフィラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ（シュードモナス・アルギノボラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（シュードモナス・アンデルソニイ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｓｐｌｅｎｉｉ（シュードモナス・アスプレニイ）（ＡＴＣＣ２３８３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｅｌａｉｃａ（シュードモナス・アゼライカ）（ＡＴＣＣ２７１６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ（シュードモナス・ビエリンキ）（ＡＴＣＣ１９３７２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（シュードモナス・ボレアリス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ（シュードモナス・ボレオポリス）（ＡＴＣＣ３３６６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ（シュードモナス・ブラッシカセアルム）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ（シュードモナス・ブタノボラ）（ＡＴＣＣ４３６５５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａ（シュードモナス・セルローサ）（ＡＴＣＣ５５７０３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃａ（シュードモナス・アウランティアカ）（ＡＴＣＣ３３６６３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ（シュードモナス・クロロラフィス）（ＡＴＣＣ９４４６， ＡＴＣＣ １３９８５， ＡＴＣＣ １７４１８， ＡＴＣＣ １７４６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（シュードモナス・フラギ）（ＡＴＣＣ４９７３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ（シュードモナス・ルンデンシス）（ＡＴＣＣ４９９６８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ（シュードモナス・タエトロレンス）（ＡＴＣＣ４６８３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｓｓｉｃｏｌａ（シュードモナス・シシコーラ）（ＡＴＣＣ３３６１６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ（シュードモナス・コロナファシエンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ（シュードモナス・ジテルペニフィラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ（ミクロバルビファー・エロンガータ）（ＡＴＣＣ１０１４４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｅｃｔｅｎｓ（シュードモナス・フレクテンス）（ＡＴＣＣ１２７７５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ（シュードモナス・アゾトフォルマンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ（シュードモナス・ブレンネリ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｅｌｌａ（シュードモナス・セドレラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ（シュードモナス・コルガータ）（ＡＴＣＣ２９７３６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（シュードモナス・イクストレモリエンタリス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ３５８５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ（シュードモナス・ゲッサーディイ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ（シュードモナス・リバネンシス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ（シュードモナス・マンデリイ）（ＡＴＣＣ７００８７１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ（シュードモナス・マルギナリス）（ＡＴＣＣ１０８４４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ（シュードモナス・ミグラエ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ（シュードモナス・ムシドレンス）（ＡＴＣＣ４６８５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（シュードモナス・オリエンタリス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ（シュードモナス・ローデシアエ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ（シュードモナス・シンキサンサ）（ＡＴＣＣ９８９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ（シュードモナス・トラーシイ）（ＡＴＣＣ３３６１８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ（シュードモナス・ベロニイ）（ＡＴＣＣ７００４７４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（シュードモナス・フレデリクスベーゲンシス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ（シュードモナス・ゲニクラタ）（ＡＴＣＣ１９３７４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｅｒｉ（シュードモナス・ジンゲリ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ（シュードモナス・グラミニス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ（シュードモナス・グリモンティイ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（シュードモナス・ハロデニトリフィカンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ（シュードモナス・ハロフィラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ（シュードモナス・ヒビシコーラ）（ＡＴＣＣ１９８６７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ（シュードモナス・フティエンス）（ＡＴＣＣ１４６７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ（シュードモナス・ハイドロゲノボラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ（シュードモナス・ジェッセニイ）（ＡＴＣＣ７００８７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ（シュードモナス・キロネンシス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ（シュードモナス・ランセオラタ）（ＡＴＣＣ１４６６９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｎｉ（シュードモナス・リニ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ（シュードモナス・マリギナータ）（ＡＴＣＣ２５４１７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｐｈｉｔｉｃａ（シュードモナス・メフィチカ）（ＡＴＣＣ３３６６５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（シュードモナス・デニトリフィカンス）（ＡＴＣＣ１９２４４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ（シュードモナス・ペルツシノゲナ）（ＡＴＣＣ１９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｔｏｒｕｍ（シュードモナス・ピクトラム）（ＡＴＣＣ２３３２８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ（シュードモナス・サイクロフィラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｌｖａ（シュードモナス・フィルバ）（ＡＴＣＣ３１４１８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ（シュードモナス・モンテイリイ）（ＡＴＣＣ７００４７６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ（シュードモナス・モッセリイ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ（シュードモナス・オリジハビタンス（ＡＴＣＣ４３２７２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ（シュードモナス・プレコグロシシダ）（ＡＴＣＣ７００３８３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ）（ＡＴＣＣ１２６３３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅａｃｔａｎｓ（シュードモナス・リアクタンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｉｎｏｓａ（シュードモナス・スピノサ）（ＡＴＣＣ１４６０６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ（シュードモナス・バレアリカ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ（シュードモナス・ルテオラ）（ＡＴＣＣ４３２７３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ（シュードモナス・スタッツェリ）（ＡＴＣＣ１７５８８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｇｄａｌｉ（シュードモナス・アミグダリ）（ＡＴＣＣ３３６１４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｌｌａｎａｅ（シュードモナス・アベルラナエ）（ＡＴＣＣ７００３３１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ（シュードモナス・カリカパパヤエ）（ＡＴＣＣ３３６１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ（シュードモナス・シクホリイ）（ＡＴＣＣ１０８５７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ（シュードモナス・フィクセレクタエ）（ＡＴＣＣ３５１０４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ（シュードモナス・フスコバギナエ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｉａｅ（シュードモナス・メリアエ）（ＡＴＣＣ３３０５０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（シュードモナス・シリンガエ）（ＡＴＣＣ１９３１０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ（シュードモナス・ビリディフラバ）（ＡＴＣＣ１３２２３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ（シュードモナス・サーモカルボキシドボランス）（ＡＴＣＣ３５９６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ（シュードモナス・サーモトレランス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ（シュードモナス・チベルバレンシス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ（シュードモナス・バンコウベレンシス）（ＡＴＣＣ７００６８８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ（シュードモナス・ウィスコンシエンシス）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ（シュードモナス・シアメネンシス）のプロテオバクテリアの群として定義される。一実施形態において、クリサンタスパーゼの発現のための宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。
宿主細胞は、いくつかの場合において、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」は、例えば、以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ（シュードモナス・セドリナ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉに属するものを含む「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ（蛍光性シュードモナス）」として当該技術分野で既知のプロテオバクテリアの群として定義される。
実施形態において、本発明の方法で、電荷遮蔽されたクリサンタスパーゼ融合タンパク質を発現するのに有用な宿主株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株、例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓであり、プロテアーゼ欠損若しくは不活性化（例えば、欠失、部分的欠失、又はノックアウトから生じる）を伴い、かつ／又は例えば、プラスミド若しくは細菌染色体からのフォルディング調節物質を過剰発現する。実施形態において、宿主株は、栄養要求性マーカーｐｙｒＦ及びｐｒｏＣを発現し、プロテアーゼ欠損を有し、かつ／又はフォルディング調節因子を過剰発現する。実施形態において、宿主株は、当該技術分野で既知の任意の他の好適な選択マーカーを発現する。上記の実施形態のいずれかにおいて、アスパラギナーゼ、例えば、ネイティブＩ型及び／又はＩＩ型アスパラギナーゼは、宿主株において不活性化される。一実施形態において、本明細書における方法は、目的の株におけるコドン使用のために最適化されている構築物からの電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の発現を含む。実施形態において、株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。細菌宿主における発現を改善するためにコドンを最適化するための方法は、当該技術分野で既知であり、文献に記載されている。
本明細書における方法に有用な増殖条件は、しばしば、約４℃～約４２℃の温度、及び約５．７～約８．８のｐＨを含む。ｌａｃＺプロモーター又はその誘導体を有する発現構築物を使用する場合、発現はしばしば、培養にＩＰＴＧを約０．０１ｍＭ～約１．０ｍＭの最終濃度で添加することによって誘導される。
ＩＩ．電荷遮蔽されたタンパク質
本明細書の他の箇所に記載されるように、誘導性プロモーターがしばしば、電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の発現を制御するために、発現構築物で使用され、例えば、ｌａｃプロモーターである。ｌａｃプロモーター誘導体又はファミリーメンバー、例えばｔａｃプロモーターの場合、エフェクター化合物は、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれる）のような無償性誘導物質などの誘導物質である。実施形態において、ｌａｃプロモーター誘導体が使用され、細胞密度が約２５～約１６０のＯＤ５７５によって特定されるレベルに達したときに、約０．０１ｍＭ～約１．０ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加によって、電荷遮蔽されたクリサンタスパーゼ融合タンパク質の発現が誘導される。
誘導剤を添加した後、培養はしばしば、ある期間、例えば約２４時間増殖され、その間、電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質が発現する。誘導剤を添加した後、培養はしばしば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３６時間、又は約４８時間増殖される。誘導剤を培養に添加した後、培養は、約１～４８時間、約１～２４時間、約１０～２４時間、約１５～２４時間、又は約２０～２４時間増殖される。細胞培養はしばしば、遠心分離によって濃縮され、培養ペレットは、その後の溶解手順に適切な緩衝液又は溶液中に再懸濁される。
実施形態において、細胞は、高圧機械的細胞破壊のための装置（市販されている、例えば、マイクロフルイディックス微細流動装置、定常細胞破壊装置、Ｎｉｒｏ－Ｓｏａｖｉホモジナイザー、又はＡＰＶ－Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー）を使用して破壊される。電荷遮蔽されたクリサンタスパーゼ融合タンパク質を発現する細胞は、しばしば、例えば、超音波処理を使用して破壊される。細胞を溶解するための当該技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して、可溶性画分を放出させる。例えば、実施形態において、細胞壁溶解酵素及びＥＤＴＡなどの化学的及び／又は酵素的細胞溶解試薬が、しばしば使用される。凍結又は以前に保存された培養物の使用も、本明細書における方法に企図される。培養物は、時には、溶解前にＯＤ規準化される。例えば、細胞は、しばしば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０のＯＤ６００に規準化される。
遠心分離が、適切な装置及び方法を使用して行われる。不溶性画分から可溶性画分を分離する目的における、細胞培養若しくは溶解物又は周辺質放出物の遠心分離は、当該技術分野において周知である。例えば、溶解した細胞は、時には、２０，８００×ｇで２０分間（４℃で）遠心分離され、上清はマニュアルで又は自動の液体ハンドリングを使用して除去される。ペレット（不溶性）画分を、緩衝化溶液、例えば、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４、中に再懸濁させる。再懸濁は、しばしば、例えば、オーバーヘッドミキサーに接続されたインペラ、磁気撹拌バー、ロッキングシェーカーなどの装置を使用して実行される。
一実施形態において、発酵が、電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質を産生する方法に使用される。本開示による発現システムは、任意の発酵形式で培養される。例えば、バッチ、供給バッチ、半連続、及び連続発酵モードが本明細書において用いられ得る。実施形態において、発酵培地は、リッチ培地、最小培地、及びミネラル塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最小培地又はミネラル塩培地のいずれかが選択される。特定の実施形態において、ミネラル塩培地が、選択される。
発酵は、任意のスケールで行われ得る。本開示による発現システムは、任意のスケールでの組換えタンパク質発現に有用である。そのため、例えば、マイクロリットルスケール、ミリリットルスケール、センチリットルスケール、及びデシリットルスケールの発酵体積が使用され得、１リットルスケール及びより大きな発酵体積がしばしば使用される。
実施形態において、本明細書における方法は、可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質、例えば、モノマー又は四量体の全細胞タンパク質に対する約１％～約７０％の収率を得るために使用される。特定の実施形態において、可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の収率は、約１％の全細胞タンパク質、約２％の全細胞タンパク質、約３％の全細胞タンパク質、約４％の全細胞タンパク質、約５％の全細胞タンパク質、約８％の全細胞タンパク質、約１０％の全細胞タンパク質、約１５％の全細胞タンパク質、約２０％の全細胞タンパク質、約２５％の全細胞タンパク質、約３０％の全細胞タンパク質、約３５％の全細胞タンパク質、約４０％の全細胞タンパク質、約４１％の全細胞タンパク質、約４２％の全細胞タンパク質、約４３％の全細胞タンパク質、約４４％の全細胞タンパク質、約４５％の全細胞タンパク質、約４６％の全細胞タンパク質、約４７％の全細胞タンパク質、約４８％の全細胞タンパク質、約４９％の全細胞タンパク質、約５０％の全細胞タンパク質、約５１％の全細胞タンパク質、約５２％の全細胞タンパク質、約５３％の全細胞タンパク質、約５４％の全細胞タンパク質、約５５％の全細胞タンパク質、約５６％の全細胞タンパク質、約５７％の全細胞タンパク質、約５８％の全細胞タンパク質、約５９％の全細胞タンパク質、約６０％の全細胞タンパク質、約６５％の全細胞タンパク質、約７０％の全細胞タンパク質、約７５％の全細胞タンパク質、約８０％の全細胞タンパク質、約８５％の全細胞タンパク質、又は約９０％の全細胞タンパク質である。
いくつかの実施形態において、可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の収率は、約１％～約７０％の全細胞タンパク質、約１％～約５０％の全細胞タンパク質、約１％～約２０％の全細胞タンパク質、約１％～約１０％の全細胞タンパク質、約１％～約５％の全細胞タンパク質、約１％～約３％の全細胞タンパク質、約２０％～約５５％の全細胞タンパク質、約２０％～約６０％の全細胞タンパク質、約２０％～約６５％の全細胞タンパク質、約２０％～約７０％の全細胞タンパク質、約２０％～約７５％の全細胞タンパク質、約２０％～約８０％の全細胞タンパク質、約２０％～約８５％の全細胞タンパク質、約２０％～約９０％の全細胞タンパク質、約２５％～約９０％の全細胞タンパク質、約３０％～約９０％の全細胞タンパク質、約３５％～約９０％の全細胞タンパク質、約４０％～約９０％の全細胞タンパク質、約４５％～約９０％の全細胞タンパク質、約５０％～約９０％の全細胞タンパク質、約５５％～約９０％の全細胞タンパク質、約６０％～約９０％の全細胞タンパク質、約６５％～約９０％の全細胞タンパク質、約７０％～約９０％の全細胞タンパク質、約７５％～約９０％の全細胞タンパク質、約８０％～約９０％の全細胞タンパク質、約８５％～約９０％の全細胞タンパク質、約１％～約５％の全細胞タンパク質、約２％～約５％の全細胞タンパク質、約５％～約１０％の全細胞タンパク質、約２０％～約３５％の全細胞タンパク質、約２０％～約３０％の全細胞タンパク質、又は約２０％～約２５％の全細胞タンパク質である。いくつかの実施形態において、可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の収率は、全細胞タンパク質の約２０％～約４０％である。
実施形態において、本明細書における方法は、リットル当たり約１グラム～リットル当たり約５０グラムの可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質、例えば、モノマー又は四量体の収量を得るために使用される。特定の実施形態において、可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の収量は、約０．２５グラム、リットル当たり約０．５グラム、リットル当たり約１グラム、リットル当たり約２グラム、リットル当たり約３グラム、リットル当たり約４グラム、リットル当たり約５グラム、リットル当たり約６グラム、リットル当たり約７グラム、リットル当たり約８グラム、リットル当たり約９グラム、リットル当たり約１０グラム、リットル当たり約１１グラム、リットル当たり約１２グラム、リットル当たり約１３グラム、リットル当たり約１４グラム、リットル当たり約１５グラム、リットル当たり約１６グラム、リットル当たり約１７グラム、リットル当たり約１８グラム、リットル当たり約１９グラム、リットル当たり約２０グラム、リットル当たり約２１グラム、リットル当たり約２２グラム、リットル当たり約２３グラム、リットル当たり約２４グラム、リットル当たり約２５グラム、リットル当たり約２６グラム、リットル当たり約２７グラム、リットル当たり約２８グラム、リットル当たり約３０グラム、リットル当たり約３５グラム、リットル当たり約４０グラム、リットル当たり約４５グラム、リットル当たり約５０グラムである。
いくつかの実施形態において、可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の収量は、リットル当たり約０．１～約６グラム、リットル当たり約０．２５～約４グラム、リットル当たり約０．５～約２グラム、リットル当たり約１グラム～リットル当たり約５グラム、リットル当たり約０．７５グラム～約１０グラム、リットル当たり約０．７５グラム～リットル当たり約３グラム、リットル当たり約０．７５グラム～リットル当たり約２グラム、リットル当たり約０．７５グラム～リットル当たり約１．５グラム、リットル当たり約０．５グラム～リットル当たり約１５グラム、リットル当たり約０．５グラム～リットル当たり約１０グラム、リットル当たり約０．５グラム～リットル当たり約８グラム、リットル当たり約０．５グラム～リットル当たり約６グラム、リットル当たり約０．５グラム～リットル当たり約６グラム、リットル当たり約０．１グラム～リットル当たり約２０グラム、リットル当たり約０．１グラム～リットル当たり約１０グラム、リットル当たり約０．１グラム～リットル当たり約８グラム、リットル当たり約０．１グラム～リットル当たり約５グラム、リットル当たり約０．１グラム～リットル当たり約３グラム、リットル当たり約０．１グラム～リットル当たり約２５グラムまでリットル当たり約２５グラム、又はリットル当たり２４グラム～リットル当たり約２５グラムである。
実施形態において、類似又は実質的に類似の条件下で得られた、周辺質によって産生された可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質に対する、細胞質によって産生された可溶性組換えクリサンタスパーゼの収量比は、約１～約５である。実施形態において、類似又は実質的に類似の条件下で得られた、周辺質によって産生された可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質に対する、細胞質によって産生された可溶性の電荷遮蔽された組換えクリサンタスパーゼ融合タンパク質の収量比は、少なくとも約１である。
Ｖ．電荷遮蔽された組換えＥ．Ｃｏｌｉアスパラギン融合タンパク質の産生
本発明の方法に有用な産生宿主株は、公的に利用可能な宿主細胞、例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＭＢ１０１を使用して、例えば、ｐｙｒＦ遺伝子、及び／若しくはＩ型Ｌ－アスパラギナーゼ遺伝子、及び／若しくはＩＩ型Ｌ－アスパラギナーゼ遺伝子を、当該技術分野において既知であり、文献に記載されている多くの適切な方法のうちのいずれかを使用して不活性化することによって作製することができることは、当業者によって理解されよう。また、プラスミドを復元する原栄養性は、当該技術分野で既知であり、文献に記載されている多くの適切な方法のいずれかを使用して、株ＭＢ２１４からｐｙｒＦ遺伝子を担持する株、例えばプラスミドなどに形質転換することができることも理解されたい。加えて、かかる株において、当該技術分野で周知の方法を使用して、プロテアーゼは不活性化することができ、フォルディング調節物質過剰発現構築物が導入される。
実施形態において、本発明の方法におけるアスパラギナーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼＩＩ型を発現するのに有用な宿主株は、プロテアーゼ欠損若しくは不活性化（例えば、欠失、部分的欠失、又はノックアウトから生じる）を伴い、かつ／又は、例えば、プラスミド若しくは細菌染色体からフォルディング調節物質を過剰発現する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株、例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。任意の実施形態において、宿主株は、栄養要求性マーカーｐｙｒＦ及びｐｒｏＣを発現し、プロテアーゼ欠損を有し、かつ／又はフォルディング調節因子を過剰発現する。実施形態において、宿主株は、当該技術分野で既知の任意の他の好適な選択マーカーを発現する。上記の実施形態のいずれかにおいて、アスパラギナーゼ、例えば、ネイティブＩ型及び／又はＩＩ型アスパラギナーゼは、宿主株において不活性化される。
本明細書の他の箇所に記載されるように、誘導性プロモーターが、しばしば、組換えアスパラギナーゼの発現を制御するために、発現構築物に使用され、例えば、ｌａｃプロモーターである。ｌａｃプロモーター誘導体又はファミリーメンバー、例えばｔａｃプロモーターの場合、エフェクター化合物は、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれる）のような無償性誘導物質などの誘導物質である。実施形態において、ｌａｃプロモーター誘導体が使用され、細胞密度が約２５～約１６０のＯＤ５７５によって特定されるレベルに達したときに、約０．０１ｍＭ～約１．０ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加によって、アスパラギナーゼの発現が誘導される。
実施形態において、細胞は、高圧機械的細胞破壊のための装置（市販されている、例えば、マイクロフルイディックス微細流動装置、定常細胞破壊装置、Ｎｉｒｏ－Ｓｏａｖｉホモジナイザー、又はＡＰＶ－Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー）を使用して破壊される。アスパラギナーゼを発現する細胞は、しばしば、例えば、超音波処理を使用して破壊される。細胞を溶解するための当該技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して、可溶性画分を放出させる。例えば、実施形態において、細胞壁溶解酵素及びＥＤＴＡなどの化学的及び／又は酵素的細胞溶解試薬が、しばしば使用される。凍結又は以前に保存された培養物の使用も、本明細書における方法に企図される。培養物は、時には、溶解前にＯＤ規準化される。例えば、細胞は、しばしば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０のＯＤ６００に規準化される。
ＶＩ．電荷遮蔽されたタンパク質を含む組成物
電荷遮蔽されたタンパク質を含む組成物もまた、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、電荷遮蔽されたタンパク質と、１つ以上の医薬的に許容される担体とを含む。
好適な医薬的担体、賦形剤、及び／又は希釈剤の例は、当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。かかる担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。好適な担体は、本発明の生物活性タンパク質と組み合わせるとき、生物活性タンパク質の生物学的活性を保持する任意の材料を含み得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄを参照されたい）。非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含み得る）。医薬組成物の文脈で用いられる緩衝剤、溶媒、及び／又は賦形剤は、好ましくは、上記で定義されるように「生理学的」である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水溶液、エマルジョン、又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油を含み得る。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養素補充、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などを含み得る。保存剤及び他の添加剤も存在し得、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが含まれる。加えて、本発明の医薬組成物は、例えば、血清アルブミン又は免疫グロブリンのような、好ましくはヒト由来のタンパク質性担体を含み得る。
いくつかの実施形態において、最大、約８０％、約８５％、約９０％、若しくは約９５％、又はそれらを超える純度を有する、第１の疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム後の電荷遮蔽されたタンパク質精製タンパク質を含む組成物が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、電荷遮蔽されたタンパク質を、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の純度で含む組成物が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、組成物は、電荷遮蔽されたタンパク質を、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態において、組成物は、電荷遮蔽されたタンパク質を、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも３００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態において、組成物は、電荷遮蔽されたタンパク質を、１～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
ＶＩ．治療の方法
いくつかの実施形態において、治療を必要とする個体に、電荷遮蔽されたタンパク質を含む組成物を投与することを含む、個体を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、個体は、がん又は新生物疾患を有する。いくつかの実施形態において、個体は、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫を有する。いくつかの実施形態において、個体は、急性リンパ芽球性リンパ腫を有する。いくつかの実施形態において、疾患は、代謝性疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は、ホルモン欠乏関連障害、自己免疫疾患、がん、貧血、新生血管疾患、感染性／炎症性疾患、血栓症、心筋梗塞、又は糖尿病である。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示的な目的のためのものであり、それらの観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆され、それらは本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。
実施例１．捕捉工程としてイオン交換クロマトグラフィーを用いたＰＡＳ化アスパラギナーゼの発現及び精製
この実施例は、周辺質放出物からの電荷遮蔽されたＰＡＳ化アスパラギナーゼ融合タンパク質（例えば、ＰＦ７４５）の発現を示す。
プロリン及びアラニン残基から完全に構成された２００アミノ酸ポリペプチド配列（ＰＡ２００）にそのアミノ末端で遺伝学的に融合した組換えクリサンタスパーゼ（ＲＣ）（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉからのアスパラギナーゼ）が、成功裏に発現された。ＰＡ２００融合パートナーは、ＸＬ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｍｂＨによって、それらの独自技術であるＰＡＳ化（登録商標）を使用して設計され、これは、ＰＥＧ化の生物学的代替物として本質的に無秩序なタンパク質を適用することによってバイオ医薬品の半減期を延長する。ＰＡ２００－ＲＣ融合タンパク質をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓで発現させ、特定の純度及び効力目標を満たす組換えＰＡ２００－ＲＣ融合タンパク質を生成した。
融合タンパク質はＰＦ７４５と名付けられ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおけるＰＡ２００－ＲＣ ＤＮＡ融合のクローニングによって構築が開始された。１，０４０例の発現株の９６ウェルスケールでの最初のスクリーニングは、可溶性ＰＡ２００－ＲＣタンパク質モノマーの発現が成功したことを実証した。株ＳＴＲ５８７５１（周辺質に局在するＰＡ２００－ＲＣタンパク質を発現する）が、複数の発酵誘導条件下での可溶性モノマーの高力価発現、再現可能な低いＮ末切断プロファイル（＜２％）、並びに同一性、活性、及び純度方法からの結果に基づいて、ＰＦ７４５の産生のために選択された。ＰＦ７４５は、株操作中の周辺質発現株の選択によって、発現し、浸透圧抽出によって細胞から放出された。浸透圧抽出は、宿主細胞混入物（例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ））放出を最小限にしながら、細胞からの生成物放出を最大にするように最適化された。
第１のクロマトグラフィー捕捉工程として、周辺質放出物からイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によるＰＦ７４５の捕捉が行われるように努めた。
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）は、ＳＴＲ５８７５１からのＰＦ７４５の浸透圧ショック抽出後に行われた。抽出物をｐＨ９及び０．８ｍＳ／ｃｍの導電率に調整し、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ ＡＥＸカラムにロードし、０．８２ｇペースト／ｍＬ樹脂の負荷比を用いてフロースルーモードで実行した。しかしながら、ＨＣＰのブレークスルーが画分６Ａ１（図１のレーン１４）で観察され、ＡＥＸが最初の精製工程として行われた場合、ＡＥＸは、標的タンパク質（例えば、電荷遮蔽された融合タンパク質、ＰＦ７４５）の十分な濃縮を提供しないことが示された。
ＣＥＸを最初の捕捉／精製工程として用いた、細胞質発現株からＰＦ７４５を捕捉する試みも成功せず、したがって、このアプローチは、ＳＴＲ５８７５１からの浸透圧ショックを使用する試みには供されなかった。第２のカラムとしてのＣＥＸへの結合も許容可能ではなく、捕捉工程としてのその使用は、第２のカラムが接するであろうＨＣＰ混入物よりも更に高いレベルのＨＣＰ混合物の存在下でもまた、標的の濃縮に成功しないであろうことが示された。
ＡＥＸ及びＣＥＸ捕捉工程の両方ともが、捕捉なし、又は極めて低い結合能力を示した。これは、ＰＡ２００部分からの遮蔽が、ＰＦ７４５における電荷を効果的に覆い隠すことを示唆する。
実施例２．サイズ排除クロマトグラフィー、続いてＣＥＸを用いたＰＦ７４５の精製
ＳＴＲ５８７５１からの周辺質抽出物を２Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）用のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ５００樹脂上にロードした。標的分子を含有するフロースルー画分をプールし、１００ｋＤａ濃縮装置を使用して濃縮し、濃縮したプールを０．５ｍＳ／ｃｍ樹脂に調整し、ＰＯＲＯＳ ＸＳカチオン交換樹脂上に結合及び溶離モードでロードした。標的の結合が観察された（図２の画分Ａ６～Ｂ４、レーン６～１６を参照）が、結合能力が低く、標的の大部分がフロースルー画分に観察された（図２のレーン３、ＦＴ）。負荷体積とフロースルー画分とはほとんど同一であり、等体積（１６μＬ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。負荷における標的タンパク質の純度は、密度測定によって決定されたとおり５３．５％であり、フロースルーにおける標的タンパク質の純度は５２．９％であり、ほとんどのＰＦ７４５タンパク質がＣＥＸカラムに結合せず、フロースルー中に滞留したことが示された。
これらの結果は、より高い負荷純度が、電荷遮蔽された融合タンパク質（例えば、ＰＦ７４５）のＣＥＸ捕捉に必要であることを示した。
実施例３．電荷遮蔽された融合タンパク質の発現及び精製
この実施例は、周辺質放出物からの電荷遮蔽された融合タンパク質（例えば、ＰＦ７４５）の精製に成功したことを実証する。特に、この実施例は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、及びカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）の一連の使用が、周辺質放出物からのＰＦ７４５の純度を増加させることを実証する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
６つのＨＩＣ樹脂を試験した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍは、高い結合能力及び許容可能な純度を示し、したがって、例示的なＨＩＣカラムとして使用した。浸透圧抽出物を、最終導電率１７８±１５ｍＳ／ｃｍ、及びｐＨ６．０±０．２で、２．５ＭのＮａＣｌに調整した。調整した周辺質放出物を濾過し、直ちにＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ捕捉カラムに、≦０．１７ｇペースト／ｍＬ樹脂の負荷比でロードした。
十分なタンパク質を得るために、この捕捉カラムを、各実行について８～１０回、合計２６回サイクルさせた。このカラムは、（Ａ２７９によって測定されたとおり）ロードしたグラムペースト当たり８～９ｍｇのＰＦ７４５を一貫して生じ、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣによって測定されたとおり、それぞれ約７５％及び６０％の純度値を有した。Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ樹脂を使用した代表的なＨＩＣ工程からのＳＤＳ－ＣＧＥ画像が図３に示され、この捕捉工程によって得られた精製を実証する。
アニオン交換クロマトグラフィー
ＨＩＣ後の限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）１から回収した濃縮物を、ＡＥＸクロマトグラフィー工程を用いて更に精製し、純度を増加させることができるか決定した。例示的なＡＥＸ樹脂として、ＰＯＲＯＳ ＨＱ樹脂を使用した。潜在的な脱アミド化のリスクを低下させるために、ＵＦ／ＤＦｌ回収濃縮物を、ＰＯＲＯＳ ＨＱカラムにロードする直前に、９．０±０．２のｐＨに調整した。同様に、ＰＯＲＯＳ ＨＱクロマトグラフィー工程が完了した直後に、収集したフロースルー及び洗浄プールも、６．０±０．２のｐＨに調整した。
各ロットを４～６回サイクルして、５ｍｇのＰＦ７４５／ｍＬ樹脂の負荷比を超えることなく全ての材料を処理した。カラムのサイクルにかかわらず、クロマトグラムは、ＡＥＸクロマトグラフィーが一貫しており再現可能であることを示した。更に、全ての実行は、２２～２５％の一貫したＡＥＸ工程の収率をもたらした（図４）。この収率は低いようにみえるが、これは生成物が失われているよりも、不純物が除去されていることを示している。これは、剥離ピークの面積を、フロースルー＋洗浄生成物ピークと比較することによって容易に示される。加えて、不純物除去の更なる証拠は、このＡＥＸ工程後、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣ値に示され、それぞれ９０％及び８０％に増加する。最後には、全てのＡＥＸ溶離物におけるＨＣＰ含有量は１２０ｐｐｍ未満に減少し、次第に純粋になる試料のＨＰＬＣ結果が確証された。
そのため、ＡＥＸ工程は一貫して良好に行われ、ＨＩＣ工程後にかなりの量の不純物を除去した。
カチオン交換クロマトグラフィー
ＵＦ／ＤＦ２工程から回収した濃縮物を、ＣＥＸクロマトグラフィー工程を用いて精製し、純度を更に増加させることができるか試験した。例示的なＣＥＸ樹脂として、ＰＯＲＯＳ ＸＳを使用した。各ロットは、５ｍｇのＰＦ７４５／ｍＬ樹脂の負荷比を超えることなく全ての材料を処理するために、３～６サイクルのＣＥＸ工程を必要とした。カラムをサイクルしたにもかかわらず、クロマトグラムは、ＣＥＸクロマトグラフィーが一貫しており再現可能だったことを示した。
更に、全ての実行は、４８～５４％の一貫したＣＥＸ工程回収をもたらし、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣによるそれぞれ９４％超及び１００％の純度の生成物を有した。これらの純度値は、ＣＧＥ分析によって更に裏付けられ、ＰＦ７４５が負荷材料中に残存する不純物から効果的に分離されたことを示し、非常に純粋な溶離物をもたらした（図５）。最後には、全てのＣＥＸ溶離物のＨＣＰ含有量は３ｐｐｍ未満であり、高純度試料のＨＰＬＣ結果が確証された。
そのため、ＣＥＸ工程は、一貫して良好に行われ、かなりの量の不純物を除去し、目標純度値を超える材料を生成して、ＨＩＣ及びＡＥＸクロマトグラフィー工程後に純度を更に高い程度まで増加させた。
結論
ＨＩＣ、ＡＥＸクロマトグラフィー、及びＣＥＸクロマトグラフィーの一連の工程は、その順序で、周辺質放出物からの、ＰＦ７４５などの電荷遮蔽されたタンパク質の効率的な精製のために信頼して用いることができる。
実施例４．ＰＡＳ化アスパラギナーゼ精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー
この実施例は、周辺質放出物からの電荷遮蔽された融合タンパク質の精製について疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の方法を実証する。特に、この実施例は、ＨＩＣ樹脂スクリーニング及び標的である電荷遮蔽された融合タンパク質の濃縮のためのＨＩＣの使用を実証する。
ＰＦ７４５（ＰＡＳ化アスパラギナーゼ）は、株操作中の周辺質発現株の選択によって、記載されるように、発現し、浸透圧抽出によって細胞から放出された。細胞から材料を放出させて澄明化し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて捕捉を試験した。
樹脂
プレートベースの樹脂スクリーニングを行い、９６ウェルフィルタープレート（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｃａｔ番号２００９５７－１００）、並びにＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ ２００液体ハンドリングシステム及びＢｉｏｎｅｘ ＨｉＧ４自動遠心分離機を含むＢｉｏｓｅｒｏ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、１３種の疎水性相互作用樹脂（表１）が、結合／溶離又はフロースルー精製の回収を有することを実証した。
Figure 2024500974000002
樹脂プレートを調製するために、各樹脂の５０％スラリーの５０μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに、ウェル当たり標的樹脂２５μＬについてＴｅｃａｎでピペッティングした。高疎水性樹脂プレートを、１列当たり１つの樹脂で、最高の疎水性から最低の疎水性までの、以下の順序で調製した：Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、Ｂｅｎｚｙｌ、Ｈｅｘｙｌ－６５０ Ｃ、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ、Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、及びＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ。低疎水性樹脂プレートを、１列当たり１つの樹脂で、最高の疎水性から最低の疎水性までの、以下の順序で調製した：Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、ＰＰＧ－６００Ｍ、Ｅｔｈｙｌ、及びＢｕｔｙｌ－６５０Ｍ。
プレートを遠心分離して、スラリー液体を濾過した。表２は、樹脂を水で剥離することから開始したクロマトグラフィー工程を含む。プレートを、各サイクルのピペッティング後に遠心分離した。次いで、樹脂をそれぞれの平衡緩衝液で平衡化した。浸透圧ショック及び限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）１からのＰＦ７４５中間物を、平衡緩衝液に対応するコスモトロープ濃度にコスモトロープスパイク溶液で調整した。次いで、調整したＰＦ７４５中間物を、対応する平衡緩衝液でｍＬ溶液当たりペースト１６７ｍｇに希釈し、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ ０．４５／０．２μｍフィルターに通して濾過した。１５０μＬ（ｍＬ樹脂当たりペースト１ｇを標的とする）を負荷した後、濾液をフロースルー評価のために収集した。洗浄及び溶離濾液を同様に別個のプレートに収集した。フロースルー及び溶離を、ＳＤＳ－ＣＧＥを介して分析した。
Figure 2024500974000003
図６は、４つの樹脂（Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ、及びＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ）が、ほとんどの条件下で標的に結合したことを示しており、このことはフロースルー中のごくわずかな検出可能なＰＦ７４５バンドによって証明される。全ての樹脂は、０．２５Ｍ硫酸ナトリウムで乏しい結合を実証した。ＰＦ７４５が結合しなかった場合、フロースルーは、負荷に対して有意に改善した純度を示さない。
フロースルーに基づいて最も高い結合を有すると特定された樹脂はまた、最善の溶離回収を実証した－Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ、及びＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（図７）。最善の回収を生じる結合条件は、０．５Ｍ硫酸アンモニウムだった（前記図における「Ｂ」三重列）。有望な回収に加えて、溶離は、ＳＤＳ－ＣＧＥ純度における有意な増加を示し、これは低分子量（ＬＭＷ）バンドの減少によって証明された。
対照的に、低疎水性樹脂は、０．２５Ｍ硫酸ナトリウム及び０．５Ｍ硫酸アンモニウムの両方で少量のＰＦ７４５が結合し、このことはこれらの条件のフロースルーにおけるＰＦ７４５バンドによって証明され（図８）、加えて、不純物からのＰＦ７４５の分離はなかった。ほとんどの条件が、低い回収率を生じた（図９）。ＰＰＧ又はＢｕｔｙｌ－６５０Ｍ樹脂と組み合わせた３ＭのＮａＣｌ負荷のみが、有意な可視バンドを生じた。
Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ、及びＣａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓを、６．１～７．５ｍＬのカラムスケールで、同じ負荷材料及びｍＬ樹脂当たりペースト約６ｇの負荷添加で試験した。Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍでの実行からのＳＤＳ－ＣＧＥ画像は、ＰＦ７４５の、溶離勾配の初期における濃縮（画分１Ａ６～１Ｂ５、図１０）、及び勾配の後期における溶離した不純物（主に１６～６８ｋＤａ）からの分離を実証し、負荷純度は、溶離画分における５０～７５％と比較して、約１％という測定値であった（図１０）。負荷フロースルーは収集されなかったが、低流量及び高流量の洗浄画分は、負荷の終わり近くでほとんどブレークスルーを示さず、負荷されたＰＦ７４５の大部分が結合したことを示唆した。
表３は、溶離収率及び純度を示す。Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍは、最も効率的な捕捉特性を示した。
Figure 2024500974000004
初期のＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ及びＢｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａ動的結合能力（ＤＢＣ）試験では、Ｂｅｎｚｙｌ Ｕｌｔｒａのフロースルーにおいて、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍよりも大きなブレークスルーが早く観察された。Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍは、ｍＬ樹脂当たりペースト約９．７ｇに相当する結合を示した。Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍは、３０％高い結合能力を示した。
例示的なＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ ＨＩＣ樹脂を使用した、ＰＦ７４５のＨＩＣ精製に有効だった条件は、樹脂能力を最大にした０．６０Ｍ硫酸アンモニウム負荷を含んだ。かかる溶離硫酸アンモニウム濃度を０．４０Ｍ硫酸アンモニウム（６０～７５ｍＳ／ｃｍ）で維持して、高い標的回収を提供した。負荷及び溶離ｐＨを５．９±０．１に設定し、ＰＦ７４５材料を一貫して捕捉し、単一のＨＩＣ捕捉工程後に４０～６０％のＳＤＳ－ＣＧＥ純度を提供した。
最終的に、例示的なＨＩＣ捕捉方法は、例示的なＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ樹脂を使用して、いくつかの因子（例えば、（１）ＥＱ、負荷、洗浄、及び溶離のｐＨ、（２）ＥＱ、負荷、洗浄、及び溶離の硫酸アンモニウム濃度、（３）負荷添加、及び（４）溶離の硫酸アンモニウム濃度）に基づいて作成した。例示的なＨＩＣ方法は、表４に簡潔に記載されており、段階、緩衝液／溶液、カラム体積（ＣＶ）、及び低流量（ｃｍ／ｈ）によって定義される。
Figure 2024500974000005
結論
この実施例は、ＨＩＣクロマトグラフィーが、単一のクロマトグラフィー工程（例えば、捕捉工程）後に９０％を超える純度を達成する、周辺質放出物からの、ＰＦ７４５などの電荷遮蔽されたタンパク質を効率的に精製する捕捉工程として使用することができることを示す。
実施例５．ＰＡＳ化アスパラギナーゼ精製のためのアニオン交換クロマトグラフィー
この実施例は、細胞溶解物からの電荷遮蔽された融合タンパク質の精製についてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の方法を実証する。
アニオン交換クロマトグラフィーを、第１のＨＩＣクロマトグラフィー工程後の第２のクロマトグラフィー工程として試験した。５種のＡＥＸ樹脂（表５）を、最初のスクリーニングのために、０．６６ｃｍのＯｍｎｉｆｉｔカラム（ＰＣＥ１２４５－１２４９）に充填した。
Figure 2024500974000006
図１１は、ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、及びＳｕｐｅｒ Ｑ－６５０Ｍのフロースループールが、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ及びＮＨ２－７５０Ｆ（３２．４～４１．０％）のものよりも有意に高いＳＤＳ－ＣＧＥ純度（６５．６～６８．２％）を有したことを示す。５つの実行全てからの剥離には、測定可能なＰＦ７４５が含有されておらず、標的の高い回収及び全ての試験したＡＥＸ樹脂に対して意図しない結合がなかったことを示す。ＰＯＲＯＳ ＨＱ及びＮＨ２－７５０Ｆフロースループールは、他の実行よりも有意に高いＨＣＰレベルを有し、これは低いＳＤＳ－ＣＧＥ純度と整合する（図１１）。Ｓｕｐｅｒ Ｑ－６５０Ｍフロースループールは、ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ及びＰＯＲＯＳ ＸＱからのプールのＨＣＰ含有量の＞５×を有した。ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ及びＰＯＲＯＳ ＸＱは、最も低いＨＣＰで、最も高い純度を生じた。
フロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ積分（図１１）に基づき、ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍフロースルーは、ＰＯＲＯＳ ＸＱ及びＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱよりも高い純度を達成した。後者の２つの樹脂の純度はロードすることで低下したが、純度はＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍではロードにわたって比較的一貫したままだった。フロースループールは、表６に示されるように、同様の純度結果を達成した。したがって、これらの樹脂は全て、第２のＣＥＸクロマトグラフィー工程における使用に好適である。
Figure 2024500974000007
ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣの純度には、実行間で有意差は観察されなかった。ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍは、所与の添加でのＳＤＳ－ＣＧＥ純度、及び最も低い測定されたＨＣＰレベルを維持する能力を実証した。
ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ及びＰＯＲＯＳ ＸＱは、フロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ純度に関して同様の性能を実証した（図１２）。両方の樹脂は、最大５７ｍｇ／ｍＬロードして、負荷に対して高い純度を＜６０％で達成及び維持した。１４～１６ＣＶの間で急速に低下する純度は、負荷が洗浄に移行するにつれて、ＰＦ７４５濃度が低下するためである。ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ樹脂は、ロード全体を通してわずかにＳＤＳ－ＣＧＥ高い純度を維持し、加えて、前の実験におけるより低いＨＣＰレベルをもたらした。
５種のＡＥＸ樹脂を評価するスクリーニング実験は、ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍが高い精製性能を達成したことを実証した。ＡＥＸクロマトグラフィーによるタンパク質精製に有効な条件は、負荷ｐＨ９．０及び１．０ｍＳ／ｃｍを含み、２～６ｍｇ／ｍＬの負荷濃度に対して頑丈だった。更なる実験は、１．０ｍＳ／ｃｍの負荷導電率が、負荷安定性を低下させることなく、高い収率をもたらしたことを実証した。ＡＥＸクロマトグラフィーに好適な条件は、９．０±０．１の負荷ｐＨ、１．０±０．１ｍＳ／ｃｍの負荷導電率、２～６ｍｇ／ｍＬの負荷濃度、６～２５ｍｇ／ｍＬで＜６時間の負荷添加でｐＨ９に保持される負荷、及び６時間以内でｐＨ６．０±０．１に滴定されるフロースルーを含んだ。
精製のためにこれらの条件を用い、一貫した回収が得られ、ＲＰ－ＨＰＬＣによる≧８５％のフロースルー純度、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる≧８０％のフロースルー純度、＜１０００ｎｇ／ｍｇのＨＣＰレベル、及び＜５００ｐｇ／ｍｇのＨＣＤＮＡレベルを有した。例示的なＡＥＸクロマトグラフィー工程の代表的なクロマトグラフを図１３に示す。
Figure 2024500974000008
潜在的な脱アミド化を最小限に抑えるために、ＡＥＸのロード直前にｐＨ９．０への負荷調整を行い、収集後できるだけ早くフロースルーのｐＨ６．０への調整を行うことが推奨される。
結論
最初のＨＩＣ工程後のＡＥＸクロマトグラフィー工程は、電荷遮蔽されたタンパク質ＰＦ７４５の純度を改善した。
実施例６．ＰＡＳ化アスパラギナーゼ精製のためのカチオン交換クロマトグラフィー
この実施例は、細胞溶解物から、電荷遮蔽された融合タンパク質（例えば、ＰＦ７４５）を精製するための第３のクロマトグラフィー工程として、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）の方法を実証する。
カチオン交換クロマトグラフィーを、ＨＩＣ及びＡＥＸクロマトグラフィー工程の両方の後に、ＰＦ７４５の精製のための第３のクロマトグラフィー工程として試験した。
樹脂スクリーニング
第３のクロマトグラフィー工程で使用されるＣＥＸ樹脂を表８に示す。
Figure 2024500974000009
４種の混合モード樹脂（Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ、ＣＭＭ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、Ｓｕｌｆａｔｅ－６５０Ｆ）をスクリーニングして、それらがより高い分解能及び純度のために、より高い導電率（５～１０ｍＳ／ｃｍ）で標的（例えば、ＰＦ７４５）に結合するか調べた。フロースルー精製は、９６ウェルフィルタープレート（Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｃａｔ番号２００９５７－１００）、並びにＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ ２００液体ハンドリングシステム及びＢｉｏｎｅｘ ＨｉＧ４自動遠心分離機を含む、Ｂｉｏｓｅｒｏ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。図１４は、４種の異なる混合モード樹脂に供された、ｐＨ及び導電負荷の８つの組み合わせからのフロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。Ｃａｐｔｏ ＭＭＣにおける８つの負荷条件全てで有意なＰＦ７４５バンドが存在しないことは、良好な結合の証拠である。ＣＭＭ ＨｙｐｅｒＣｅｌは、ｐＨ５．７及び２０ｍＳ／ｃｍでのブレークスルーを除いて、同様の性能を実証した。ＭＸ－ＴＲＰ－６５０Ｍ及びＳｕｌｆａｔｅ－６５０Ｆは、≧５ｍＳ／ｃｍでの有意なＰＦ７４５バンドによって証明されるように、著しく低い結合能力を実証した。
バッチ混合試験において、４種の追加の樹脂を、第３のカラム候補として評価した（Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ４００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＮＨ２－７５０Ｆ、ＣａＰｕｒｅ－ＨＡ、及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ－６００Ｍ）。Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ４００負荷及びフロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像は、いずれの条件においても純度に有意な増加を示さない（図１５）。ＬＭＷ不純物（＜６９ｋＤａ）の不十分な結合が観察された。ＮＨ２－７５０Ｆ負荷及びフロースルー画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像は、試験したいずれの条件においても、純度の有意な増加を示さない（図１６）。ＬＭＷ不純物（＜６９ｋＤａ）の結合は、観察されなかった。
図１７は、バッチ混合からのＣａＰｕｒｅ－ＨＡ画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。フロースルーは有意なＰＦ７４５バンドを示さず、ほぼゼロ濃度で測定され、良好な結合を示す。洗浄、溶離、及び剥離画分にＰＦ７４５バンドが存在しないことは、結合したＰＦ７４５が回収されなかったことを示した。ＵＶによる濃度は、溶離画分において＜１０％の回復及び剥離における無視できる回収を示す。
最後に、図１８は、ＰＰＧ－６００Ｍ画分のＳＤＳ－ＣＧＥ画像を示す。０．７５Ｍ硫酸アンモニウム負荷調整は、ＳＤＳ－ＣＧＥによるバンドの不存在によって証明されるように、ＰＦ７４５を沈殿させた。０．２５Ｍ硫酸アンモニウム負荷条件のＳＤＳ－ＣＧＥ取り込みは、フロースルーでの５５．１％と比較して、４９．６％の負荷純度をもたらし、純度のわずかな増加は、フロースルー画分中の低濃度のアーチファクトである可能性が高く、ＬＭＷバンドが定量の限界を下回る原因となる。０．２５Ｍ硫酸アンモニウム負荷条件のフロースルー画分に、有意な純度改善は観察されなかった。０．５Ｍ硫酸アンモニウム負荷において、負荷と比較してフロースルーにおける低いＰＦ７４５バンド強度は、有意な結合を示した。洗浄画分におけるより強い強度は、０．５Ｍ硫酸アンモニウムが結合を強くは促進せず、洗浄緩衝液への移行がタンパク質を溶離させ得ることを示した。加えて、ＰＦ７４５バンドが剥離に存在し、０．５Ｍ硫酸アンモニウム負荷条件から良好な回収を達成することが困難であることを示す。
３種の樹脂、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、ＣＭＭ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、及びＣａｐｔｏ ＭＭＣを、０．６６ｃｍ直径のカラムにスケーリングした。１５ｍｇ／ｍＬの樹脂添加での動的結合能力（ＤＢＣ）試験は、クロマトグラム又はＳＤＳ－ＣＧＥ結果においてフロースルーに有意なブレークスルーを示さなかった。回収率は高く（８６％）、ＲＰ－ＨＰＬＣ純度は以前の結果（純度９８．９％）と一致していた。これらの結果は、ＣＥＸクロマトグラフィーにおける最大１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質のロードを裏付ける。２０％の安全率を適用して、負荷添加限界を１２ｍｇ／ｍＬに設定した。混合モード及びゲル濾過樹脂スクリーニング実験は、ＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂を使用した効率的な精製を実証した。
溶離前洗浄工程を除くと、回収率が２０～３０％改善される一方、溶離前洗浄を伴う実行に匹敵する生成物品質を維持した。例えばＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂を使用するＣＥＸ工程は、ＲＰ－ＨＰＬＣ純度及びＳＤＳ－ＣＧＥ純度を有意に改善し、ＨＣＰ及びＨＣＤＮＡレベルを低下させた。
ＤＢＣ実行は、負荷添加が、同様の精製結果で、５ｇ／Ｌ～１２ｇ／Ｌに増加できたことを特定した。例示的なカラムとしてＰＯＲＯＳ ＸＳを使用する有効なＣＥＸクロマトグラフィー条件は、１）負荷導電率：１．０±０．１ｍＳ／ｃｍ（ＵＦ／ＤＦ３によって達成される）、２）溶離ＮａＣｌ濃度：８．３５±０．０８ｍＭ、３）負荷添加：≦１２ｇ／Ｌ、及び４）負荷濃度：≦６ｍｇ／ｍＬを含んだ。これらの条件は、回収≧７０％、ＲＰ－ＨＰＬＣ純度≧９７％、及びＳＥ－ＨＰＬＣ純度≧９９％を生じることが期待される。表９は、図２１中のように、ＵＦ／ＤＦ３に続く例示的なＣＥＸクロマトグラフィー方法を示す。
Figure 2024500974000010
結論
ＣＥＸクロマトグラフィー工程は、ＨＩＣ工程及びＡＥＸ工程の後に続いて、電荷遮蔽タンパク質ＰＦ７４５の純度を更に改善した。

Claims (41)

  1. 細胞溶解物又は周辺質放出物から、電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法であって、前記電荷遮蔽された融合タンパク質が、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含み、かつ前記方法が、第１のクロマトグラフィー工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、方法。
  2. 電荷遮蔽された融合タンパク質を細胞溶解物又は周辺質放出物から産生するための方法であって、前記電荷遮蔽された融合タンパク質が、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含み、前記方法が、
    ｉ）前記電荷遮蔽された融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、
    ｉｉ）前記電荷遮蔽された融合タンパク質を精製することであって、第１のクロマトグラフィー工程として疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、前記電荷遮蔽されたタンパク質が前記細胞溶解物又は周辺質放出物から精製される、ことと
    を含む、方法。
  3. 前記電荷遮蔽された融合タンパク質が、前記第１のクロマトグラフィー工程の後に少なくとも４５％純粋である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. アニオン交換クロマトグラフィーを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. カチオン交換クロマトグラフィーを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
    ｉｉ）アニオン交換クロマトグラフィー、及び
    ｉｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィー
    を順番に含む一連のクロマトグラフィー工程を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生物活性ドメインが、約７．０のｐＨで荷電されており、前記電荷遮蔽ドメインが、前記タンパク質の流体力学的半径を増加させ、かつ／又は前記電荷遮蔽ドメインが、約７．０のｐＨで電荷を有しない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記生物活性ドメインの分子量が、前記電荷遮蔽ドメインの分子量未満である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記電荷遮蔽ドメインの前記分子量が、１０ｋＤａ～６０ｋＤａである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記電荷遮蔽ドメインの前記分子量が、１０ｋＤａ～２０ｋＤａである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記生物活性ドメインの前記分子量が、３０ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記電荷遮蔽ドメインの前記分子量が、前記電荷遮蔽された融合タンパク質又は前記電荷遮蔽された融合タンパク質の多量体のインビボ半減期を増加させるのに十分である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記電荷遮蔽された融合タンパク質又は前記電荷遮蔽された融合タンパク質の多量体の前記インビボ半減期が、前記電荷遮蔽ドメインを有さず前記生物活性ドメインを含むタンパク質、又は前記電荷遮蔽ドメインを有さず前記生物活性ドメインを含む多量体タンパク質の半減期と比較して増加している、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記電荷遮蔽ドメインが、ランダムコイル又は無秩序構造を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記電荷遮蔽ドメインが、アラニン、セリン、及びプロリン残基のうちの１つ以上からなるポリペプチドである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記電荷遮蔽ドメインが、プロリン及びアラニン残基からなるポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
  17. ＰＡＳ化生物活性融合タンパク質を細胞溶解物又は周辺質放出物から産生するための方法であって、
    ｉ）前記ＰＡＳ化生物活性タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、
    ｉｉ）前記ＰＡＳ化生物活性タンパク質を精製することと
    を含み、
    第１のクロマトグラフィー工程として疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、前記ＰＡＳ化生物活性タンパク質が前記細胞溶解物又は周辺質放出物から精製される、
    方法。
  18. 細胞溶解物又は周辺質放出物から、生物活性ドメイン及び電荷遮蔽ドメインを含む電荷遮蔽された融合タンパク質を精製するための方法であって、以下のステップを、
    ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、前記電荷遮蔽された融合タンパク質を含む負荷溶液を適用するステップ、
    ｉｉ）前記疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに、洗浄溶液を適用するステップ、
    ｉｉｉ）前記疎水性相互作用カラムに溶離溶液を適用して、前記電荷遮蔽されたタンパク質を溶離するステップ、
    ｉｖ）アニオン交換クロマトグラフィーカラムに、負荷溶液として、ｉｉｉ）における前記溶離された電荷遮蔽された融合タンパク質を適用するステップ、
    ｖ）前記アニオン交換クロマトグラフィーカラムから前記電荷遮蔽された融合タンパク質を溶離するステップ、
    ｖｉ）カチオン交換クロマトグラフィーカラムに、負荷溶液として、ｖｉ）における前記溶離された電荷遮蔽された融合タンパク質を適用するステップ、
    ｖｉｉ）前記カチオン交換クロマトグラフィーカラムに、洗浄溶液を適用するステップ、
    ｖｉｉｉ）前記カチオン交換クロマトグラフィーカラムに溶離溶液を適用して、前記電荷遮蔽された融合タンパク質を溶離するステップ
    を順番に含む、方法。
  19. ステップｉ）における前記負荷溶液が、０．２５～３ＭのＮａ２ＳＯ４又は０．２５～０．６ＭのＮＨ４ＳＯ４、及び５．５～６．５のｐＨを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. ステップｉｉｉ）における前記溶離溶液が、０．３～０．５ＭのＮＨ４ＳＯ４を含み、５．５～６．５のｐＨを有する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. ステップｉｖ）における前記負荷溶液が、０．７～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率及び７．０～９．１のｐＨを有する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ステップｖｉ）における前記負荷溶液が、５．９～７．０のｐＨ及び０．７～２．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ステップｖｉｉｉ）における前記溶離溶液が、６．０～７．０のｐＨ及び０．７～４．０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ＰＯＲＯＳ Ｂｅｎｚｙｌウルトラ樹脂、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ樹脂、及びＰｈｅｎｙｌ－６００Ｍ樹脂からなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、Ｐｈｅｎｙｌ－６００Ｍ樹脂である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記アニオン交換相互作用クロマトグラフィーが、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂、ＰＯＲＯＳ ＸＱ樹脂、及びＧｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍ樹脂からなる群から選択される、請求項５～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記アニオン交換相互作用クロマトグラフィーが、Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍ樹脂である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記カチオン交換相互作用クロマトグラフィーが、強カチオン交換体である、請求項６～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記カチオン交換相互作用クロマトグラフィーが、混合モード樹脂である、請求項６～２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記カチオン交換相互作用クロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂、ＣＭＭ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ｉｍｐｒｅｓ樹脂、Ｆｒａｃｔｏ ｇｅｌ ＳＯ３－樹脂、ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０Ｓ樹脂、及びＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂からなる群から選択される、請求項６～２７のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記カチオン交換相互作用クロマトグラフィーが、ＰＯＲＯＳ ＸＳ樹脂である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記生物活性ドメインが、アスパラギナーゼサブユニットである、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記アスパラギナーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）アスパラギナーゼ及びＥｒｗｉｎｉａ（エルウィニア属）アスパラギナーゼからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記アスパラギナーゼが、配列番号１、配列番号５、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記電荷遮蔽された融合タンパク質が、配列番号９又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記細胞が、細菌細胞である、請求項２又は１７に記載の方法。
  37. 前記細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス属）細胞である、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法によって産生された、電荷遮蔽されたタンパク質。
  39. 請求項３８に記載の電荷遮蔽されたタンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  40. それを必要とする個体に、請求項３８に記載の電荷遮蔽されたタンパク質を含む組成物又は請求項３９に記載の医薬組成物を投与することを含む、治療方法。
  41. ＰＡＳ化アスパラギナーゼを含む組成物であって、前記ＰＡＳ化アスパラギナーゼが、少なくとも４５％純粋である、組成物。
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