CN116916966A - 纯化电荷屏蔽融合蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤从细胞裂解物或周质释放物中纯化出电荷屏蔽蛋白的方法。本文还提供了包括电荷屏蔽蛋白的组合物以及使用纯化的电荷屏蔽蛋白的治疗方法。

Description

纯化电荷屏蔽融合蛋白的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月23日提交的美国申请第63/130,295号的优先权，该案的内容整体并入。
以ASCII文本文件提交的序列表
以下以ASCII文本文件提交的内容以全文引用的方式并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：210462000140SEQLIST.TXT，记录日期：2021年12月9日，大小：30,160字节)。
技术领域
本发明涉及纯化电荷屏蔽融合蛋白的方法。
背景技术
许多有药用价值的蛋白质，特别是某些酶和重组抗体片段、激素、干扰素等都存在着快速(血液)清除的问题。对于大小低于约70kDa的肾过滤阈值的蛋白质来说，情况尤其如此(Caliceti(2003)《先进药物递送评述(Adv Drug Deliv Rev)》55：1261-1277)。在这些情况下，未修饰过的药用蛋白质的血浆半衰期可能只有数小时，由此使其在大多数治疗应用中是基本上无用的。为了实现持续的药理学作用并提高患者的依从性，即，将所需给药间隔延长至数天，或甚至是数周，先前制定了若干策略来达到生物制药药物开发的目的。
一种用于延长生物药物的血浆半衰期的方法联合高度溶剂化并在生理上具有惰性的化学聚合物，由此有效地扩大治疗性蛋白质的流体动力半径，使其超过约3-5nm的肾小球孔径(Caliceti(2003))。因此，开发出了融合蛋白，所述融合蛋白包括生物活性结构域以及增加该融合蛋白的疏水半径而不影响生物活性结构域的生物活性的额外结构域。
然而，此类融合蛋白的制造和纯化提出了难题，需要新的纯化方法。具体点说，在本发明之前，并不知道融合增加生物活性结构域的流体动力半径的结构域会引起电荷屏蔽效应，由此使常规纯化方法不适合此类融合蛋白。本发明的发明人鉴别出了电荷屏蔽效应以及纯化此类治疗性融合蛋白的新颖方法。
发明内容
本文提供了从细胞裂解物或周质释放物中纯化出电荷屏蔽蛋白的方法。在一些实施例中，所述方法包括疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤。在一些实施例中，所述方法包括阴离子交换色谱作为第二个色谱步骤。在一些实施例中，所述方法包括阳离子交换色谱作为第三个色谱步骤。
在一些实施例中，本文提供了一种从细胞裂解物或周质释放物中纯化出电荷屏蔽融合蛋白的方法，其中所述电荷屏蔽融合蛋白包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域，并且其中所述方法包括疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤。
在一些实施例中，本文提供了一种用于由细胞裂解物或周质释放物产生电荷屏蔽融合蛋白的方法，其中所述电荷屏蔽融合蛋白包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域，其中所述方法包括：i)培养细胞，所述细胞包括编码所述电荷屏蔽融合蛋白的核酸；并且ii)纯化所述电荷屏蔽融合蛋白，其中所述电荷屏蔽蛋白是使用疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤从所述细胞裂解物或周质释放物纯化的。
在一些实施例中，在第一个色谱步骤之后，所述电荷屏蔽融合蛋白是至少45％纯的。在一些实施例中，所述方法另外包括阴离子交换色谱。在一些实施例中，所述方法另外包括阳离子交换色谱。
在一些实施例中，所述方法包括一系列色谱步骤，所述色谱步骤依序包括i)疏水相互作用色谱；ii)阴离子交换色谱；及iii)阳离子交换色谱。
在一些实施例中，所述生物活性结构域在约pH 7.0下带电，并且其中所述电荷屏蔽结构域增加蛋白质的流体动力半径，并且其中所述电荷屏蔽结构域在约pH 7.0下不带电。在一些实施例中，所述生物活性结构域的分子量小于所述电荷屏蔽结构域的分子量。在一些实施例中，所述电荷屏蔽结构域的分子量在10kDa与60kDa之间。在一些实施例中，所述电荷屏蔽结构域的分子量在10kDa与20kDa之间。在一些实施例中，所述生物活性结构域的分子量在30kDa与40kDa之间。在一些实施例中，所述电荷屏蔽结构域的分子量足以增加所述电荷屏蔽融合蛋白或所述电荷屏蔽融合蛋白的多聚体的体内半衰期。在一些实施例中，电荷屏蔽融合物或电荷屏蔽蛋白的多聚体的体内半衰期相较于包括生物活性结构域的蛋白质或包括生物活性结构域但不包括电荷屏蔽结构域的蛋白质的多聚体的半衰期有所增加。
在一些实施例中，所述电荷屏蔽结构域具有无规卷曲或无序结构。在一些实施例中，所述电荷屏蔽结构域是由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基中的一者或多者组成的多肽。在一些实施例中，所述电荷屏蔽结构域是由脯氨酸和丙氨酸残基组成的多肽。
在一些实施例中，所述方法包括从细胞裂解物或周质释放物中纯化出PAS化生物活性融合蛋白，包括：i)培养细胞，所述细胞包括编码所述PAS化生物活性蛋白质的核酸；并且ii)纯化所述PAS化生物活性蛋白质，其中所述PAS化生物活性蛋白质是使用疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤从所述细胞裂解物或周质释放物纯化的。
在一些实施例中，本文提供了一种用于从细胞裂解物或周质释放物中纯化出包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域的电荷屏蔽融合蛋白的方法，所述方法依序包括以下步骤：i)将包括所述电荷屏蔽融合蛋白的上样溶液(load solution)施加至疏水相互作用色谱柱上；ii)将洗涤溶液施加至疏水相互作用色谱柱上；iii)将洗脱溶液施加至疏水性相互作用柱上以洗脱所述电荷屏蔽蛋白；iv)将iii)中洗脱的电荷屏蔽融合蛋白作为上样溶液施加至阴离子交换色谱柱上；v)从所述阴离子交换色谱柱洗脱所述电荷屏蔽融合蛋白；vi)将vi)中洗脱的电荷屏蔽融合蛋白作为上样溶液施加至阳离子交换色谱柱上；vii)将洗涤溶液施加至阳离子交换色谱柱上；viii)将洗脱溶液施加至阳离子交换色谱柱上以洗脱所述电荷屏蔽融合蛋白。
在一些实施例中，步骤i)中的上样溶液包括2至3M的NaCl并具有6.0至8.0的pH值。在一些实施例中，步骤iii)中的洗脱溶液包括0.75-1.75M的NaCl并具有6.0至7.0的pH值。在一些实施例中，步骤iv)中的上样溶液具有0.7-4.0mS/cm的电导率以及7.0和9.0的pH值。在一些实施例中，步骤iv)中的上样溶液具有0.7-4.0mS/cm的电导率以及7.0和9.1的pH值。在一些实施例中，步骤vi)中的上样溶液具有6.0至7.0的pH值以及0.7至2.5mS/cm的电导率。在一些实施例中，步骤vi)中的上样溶液具有5.9至7.0的pH值以及0.7至2.5mS/cm的电导率。
在一些实施例中，步骤viii)中的洗脱溶液具有6.0至7.0的pH值以及0.7至4.0mS/cm的电导率。在一些实施例中，步骤i)中的上样溶液包括0.25-3M的Na2SO4或0.25-0.6MNH4SO4以及5.5至6.5的pH值。20。在一些实施例中，步骤iii)中的洗脱溶液包括0.3-0.5M的NH4SO4并具有5.5至6.5的pH值。
在一些实施例中，所述疏水相互作用色谱选自由以下组成的组：POROS Benzylultra树脂、Hexyl-650C树脂和Phenyl-600M树脂。在一些实施例中，疏水相互作用色谱是Phenyl-600M树脂。在一些实施例中，阴离子交换相互作用色谱选自由以下组成的组：POROS50HQ树脂、POROS XQ树脂和Gigacap Q-650M树脂。在一些实施例中，阴离子交换相互作用色谱是Gigacap Q-650M树脂。在一些实施例中，阳离子交换相互作用色谱是强阳离子交换剂。在一些实施例中，阳离子交换相互作用色谱是混合模式树脂，其中所述阳离子交换相互作用色谱选自由以下组成的组：Capto MMC树脂、CMM Hypercel树脂、Capto SP impres树脂、Fracto gel SO3-树脂、GigaCap S-650S树脂和POROS XS树脂。在一些实施例中，阳离子交换相互作用色谱是POROS XS树脂。
在一些实施例中，生物活性结构域是天冬酰胺酶亚基。在一些实施例中，所述天冬酰胺酶选自由大肠杆菌(E.coli)天冬酰胺酶和欧文氏菌(Erwinia)天冬酰胺酶组成的组。在一些实施例中，所述天冬酰胺酶亚基包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白包括SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述细胞是细菌细胞。在一些实施例中，所述细胞是大肠杆菌细胞或假单胞菌(Pseudomonas)细胞。
本文还提供了由本文所提供的方法产生的电荷屏蔽蛋白。
在一些实施例中，本文提供了一种组合物，所述组合物包括电荷屏蔽蛋白和药学上可接受的载体。
在一些实施例中，本文提供了一种治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用包括电荷屏蔽蛋白的组合物或包括电荷屏蔽蛋白的药物组合物。
本文还提供了一种组合物，所述组合物包括PAS化天冬酰胺酶，其中所述PAS化天冬酰胺酶是至少45％纯的。
附图说明
图1显示由作为初始蛋白质捕获步骤的POROS HQ阴离子交换柱得到的洗出液的SDS-PAGE。箭头指示对应于PF745的谱带。
图2显示由作为初始蛋白质捕获步骤的POROS XS阳离子交换柱得到的洗出液的SDS-PAGE。
图3显示来自代表性Butyl-650M色谱步骤的部分的SDS-CGE图像。将相等体积(4μL)的上样部分、来自上样部分的流出物(flowthrough，FT)、洗脱部分和剥离部分上样至SDS-CGE上进行纯度分析。箭头指示对应于PF745的谱带。
图4显示由三次操作得到的代表性POROS HQ色谱图的叠置比较。色谱图在X轴上展示以mL为单位的体积，在左侧Y轴上展示以mAU为单位的在280nm的吸光度并且在右侧Y轴上展示以mS/cm为单位的电导率。
图5显示由POROS XS色谱步骤得到的部分的SDS-CGE图像。将相等体积(4μL)的上样部分、来自上样部分的流出物(FT)、洗涤部分、洗脱部分、剥离部分1和剥离部分2上样至CGE上进行纯度分析。箭头指示对应于PF745的谱带。
图6显示来自含HIC树脂的高疏水性板的流出物的SDS-CGE。三个重复柱表示来自上样有以A、B、C或D表示的稳液剂(kosmotrope)浓度的孔的流出物。“A”是0.25M的硫酸钠，“B”是0.5M的硫酸铵，“C”是2M的NaCl，并且“D”是3M的NaCl。预期目标谱带(PF745)的MW以图左侧上的箭头表示。
图7显示来自含HIC树脂的高疏水性板的流出物的SDS-CGE。三个重复柱表示来自上样有以A、B、C或D表示的稳液剂浓度的孔的洗脱液。“A”是0.25M的硫酸钠，“B”是0.5M的硫酸铵，“C”是2M的NaCl，并且“D”是3M的NaCl。预期的PF745谱带的MW以图左侧上的箭头表示。
图8显示来自含HIC树脂的低疏水性板的流出物的SDS-CGE图像。
图9显示来自含HIC树脂的低疏水性板的洗脱液的SDS-CGE图像。
图10显示Phenyl-600M和Benzylultra色谱的SDS-CGE图像，展示来自Phenyl-600M的部分1B2-1C4和来自Benzylultra的部分2A5-2C3中PF745的富集。
图11显示由阴离子交换树脂筛选得到的SDS-CGE图像。目标(PF745)纯度展示于每个泳道中主要谱带的上方。
图12显示由POROS 50 HQ、POROS XQ和GigaCap Q-650M色谱操作得到的流出物部分的SDS-CGE纯度。
图13显示使用GigaCap Q-650M得到的AEX的代表性色谱图。
图14显示由混合模式阳离子交换树脂得到的流出物部分(在一式三份泳道中)的SDS-CGE图像。上图在pH 5.7下操作并且下图在pH 6.0下操作。
图15显示在每一泳道的上方所指示的各种pH值和盐浓度下Capto Core 400上样部分和流出物部分的SDS-CGE图像。纯度％显示于每一泳道上方。
图16显示在每一泳道上方所指示的各种pH值和电导率下NH2-750F上样部分和流出物部分的SDS-CGE图像。纯度％显示于每一泳道的上方。
图17显示在每组泳道上方所指示的结合条件下CaPure-HA部分的SDS-CGE图像：上样部分、流出物(FT)部分、洗涤部分和洗脱部分。
图18显示在每组泳道上方所指示的结合条件下PPG-600M部分的SDS-CGE图像：上样部分、流出物(FT)部分、洗涤部分和洗脱部分。
具体实施方式
I.用于纯化电荷屏蔽蛋白的方法
在一些实施例中，本文所提供的方法包括使用一个或多个色谱步骤纯化电荷屏蔽蛋白；在一些实施例中，所述方法包括疏水相互作用色谱(HIC)作为第一个色谱步骤。如本文所使用，术语“色谱”包括分离混合物(例如细胞裂解物或周质释放物内的蛋白质混合物)的方法。在一些实施例中，色谱包括通过使溶液(例如上样溶液、流动相)中的混合物，例如细胞裂解物或周质释放物穿过在固定材料(例如树脂、固定相)上的介质来分离该混合物。色谱系统内的溶液可包括液体(例如液相色谱)或蒸气(例如气相色谱)。在一些实施例中，色谱通过在固定材料上的介质分离溶液中的混合物，其中该混合物的组分以不同速率移动，由此使其彼此分离。
特定上样溶液和/或树脂的组成可决定混合物的组分行进的速率。例如，当使用特定上样溶液和/或树脂时，混合物的某些组分可较慢地行进穿过树脂(例如较长的滞留时间)，而该混合物的其它组分可较快地行进穿过树脂(例如较短的滞留时间)。
在一些实施例中，混合物的色谱分离还包括树脂(例如固定相)、上样溶液(例如缓冲液、流动相)和柱。树脂和缓冲液的组成可取决于如本文所描述的特定色谱方法并且是如本文所描述的特定色谱方法专用的。在一些实施例中，色谱柱含有树脂，允许包括打算通过色谱分离的混合物的上样溶液穿过。在一些实施例中，柱是玻璃色谱柱、硼硅酸盐玻璃色谱柱、丙烯酸玻璃色谱柱或不锈钢色谱柱。
在一些实施例中，本文所提供的方法涉及捕获纯化步骤，其中将细胞裂解物或周质释放物施加至疏水相互作用色谱柱上。如本文所使用，“细胞裂解物”包括裂解的细胞的内含物。如本文所使用，“周质释放物”包括由外膜裂解产生的周质的内含物。在一些实施例中，周质释放物是细胞裂解物的子部分。在一些实施例中，细胞裂解物或周质释放物包括在细胞内表达的电荷屏蔽蛋白。裂解的细胞可通过分解细胞膜，通常通过用病毒、酶或渗透机制破坏细胞膜的完整性来获得。在一些实施例中，细胞是通过物理破坏裂解的，所述物理破坏包含但不限于声波处理、机械技术(例如瓦林氏掺和机(waring blender)，polytron)、液体均质化(例如使用杜恩斯匀浆器(dounce homogenizer)、波-伊匀浆器(Potter-Elvehjemhomogenizer)、微流化床或法式压机(French press))、冷冻解冻以及人工研磨(例如研钵和研杵)。在替代性实施例中，细胞是通过基于溶液的裂解方法裂解的，其中使该细胞与细胞裂解缓冲液接触，由此打开细胞并释放出细胞内的内含物。例如，细胞可使用缓冲盐(例如Tris-HCl或MES)和离子盐(例如NaCl或KCl)的溶液裂解。在一些实施例中，可将额外组分添加至细胞裂解缓冲液中以防止从细胞释放的蛋白质降解，所述额外组分包含蛋白酶抑制剂和清洁剂，例如Triton X-100或SDS。在一些实施例中，使用了本领域中的任何已知技术来制造细胞裂解物或周质释放物。
在一些实施例中，周质释放物是通过选择性破坏细菌外膜产生的。用于破坏细菌外膜的方法是本领域中已知的。(参见Wurm等人，《生命科学工程(Engineering in LifeSciences)》17：215-222(2017))。例如，可以使用盐酸胍和/或triton、硝酸铯(cernitrate)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、甘油醚、氯仿、TRIS、1％甘氨酸、聚乙烯亚胺、尿素和DTT、温和热射(mild heat shot)和TRIS以及渗透冲击。在一些实施例中，在培养期间破坏外膜。在一些实施例中，在收集后破坏外膜。
在一些实施例中，在细胞或细胞外膜裂解之后并且在第一个色谱捕获步骤之前，使用离心将包括电荷屏蔽蛋白的细胞裂解物或周质释放物的可溶性部分与细胞裂解物或周质释放物的不溶性部分分离。在一些实施例中，通过离心将细胞裂解物或周质释放物的可溶性部分与细胞裂解物或周质释放物的不溶性部分分离。在一些实施例中，将细胞裂解物或周质释放物以至多、超过或约3,000×g、约3,500×g、约4,000×g、约4,500×g、约5,000×g、约5,500×g、约6,000×g、约6,500×g、约7,000×g、约8,000×g、约9,000×g、约10,000×g、约11,000×g或约15,000×g离心。在一些实施例中，将细胞裂解物或周质释放物以约8,000-20,000×g、约5,000-6,000×g、约8,000-15,000×g、约18,000×g或约20,000×g离心。在一些实施例中，将细胞裂解物或周质释放物离心至多、超过或约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约20分钟或约30分钟。在一些实施例中，将细胞裂解物或周质释放物离心约5-30分钟、约5-20分钟、约8-12分钟、约10-20分钟或约15-30分钟。离心可以在至多、超过或约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃进行。在一些实施例中，离心是在约0-10℃或约2-8℃进行的。
在一些实施例中，在离心之后，并在第一个捕获色谱步骤之前，细胞裂解物或周质释放物经历一个或多个过滤或澄清步骤。在一些实施例中，细胞裂解物或周质释放物经历超过滤。在一些实施例中，使用0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.45μm或0.5μm过滤器。在一些实施例中，细胞裂解物或周质释放物经历透析。在一些实施例中，执行缓冲液交换以使得细胞裂解物或周质释放物处于适于施加至第一疏水相互作用色谱柱的缓冲液中。
在一些实施例中，将通过离心分离的包括电荷屏蔽蛋白的细胞裂解物或周质释放物的可溶性部分应用于捕获步骤。如本文所使用，“捕获步骤”包括结合细胞裂解物中的感兴趣蛋白质(例如电荷屏蔽蛋白)的第一个色谱步骤。在一些实施例中，第一个色谱捕获步骤将感兴趣蛋白质与全细胞裂解物细胞污染物分离，所述细胞污染物除包含非靶标宿主细胞蛋白外，还包含但不限于蛋白酶和糖苷酶。在一些实施例中，第一个色谱捕获步骤浓缩靶标蛋白并保持靶标蛋白活性。在一些实施例中，第一个色谱捕获步骤可被优化成从细胞污染物(例如非靶标宿主细胞蛋白)最大限度纯化出靶标蛋白。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之前，细胞裂解物中的电荷屏蔽蛋白是约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％纯的。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之前，细胞裂解物中的电荷屏蔽融合蛋白是约5-10％、约6-8％或约7-9％纯的。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之前，细胞裂解物中的电荷屏蔽融合蛋白是约5-30％、约10-30％或约15-20％纯的。
在一些实施例中，将周质释放物的可溶性部分应用于捕获步骤。在一些实施例中，结合周质释放物中的感兴趣蛋白质(例如电荷屏蔽蛋白)的色谱步骤。在一些实施例中，第一个色谱捕获步骤浓缩靶标蛋白并保持靶标蛋白活性。在一些实施例中，第一个色谱捕获步骤可被优化成从周质释放物中存在的细胞污染物(例如非靶标宿主细胞蛋白)最大限度纯化靶标蛋白。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之前，细胞周质释放物中的电荷屏蔽蛋白是约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约15％、约18％、约20％、约25％或约30％纯的。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之前，周质释放物中的电荷屏蔽融合蛋白是约5-30％、约10-30％或约15-20％纯的。
本文所描述的方法可包括使用色谱法纯化电荷屏蔽融合蛋白(例如从细胞裂解物或周质释放物中纯化)。在一些实施例中，本文所描述的方法可包括使用多个色谱步骤纯化电荷屏蔽融合蛋白。在一些实施例中，用于纯化电荷屏蔽融合蛋白的方法包括一个、二个、三个、四个、五个、六个或七个色谱步骤。在一些实施例中，用于纯化电荷屏蔽融合蛋白的方法包括1-7个，或1-3个，或3-5个色谱步骤。色谱可包括液相色谱或气相色谱。在一些实施例中，所述方法包括HIC、阴离子交换(AEX)色谱、阳离子交换(CEX)色谱、离子交换(IEX)色谱、分配色谱、正相色谱、置换色谱、反相色谱(RPC)、生物亲和色谱、水性正相色谱、高效液相色谱、快速色谱或其它色谱方法。
在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之后，电荷屏蔽融合蛋白具有约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％或约95％纯度。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之后，电荷屏蔽融合蛋白具有约50％-80％或约60％-80％纯度。在一些实施例中，在第一个色谱捕获步骤之后，电荷屏蔽融合蛋白具有至少45％纯度。在一些实施例中，与使用离子交换色谱步骤得到的电荷屏蔽蛋白的纯度相比较，在第一个HIC色谱步骤之后，电荷屏蔽蛋白的纯度较高。在一些实施例中，在第一个HIC色谱步骤之后，电荷屏蔽蛋白的纯度高于根据生物活性结构域的方法纯化时电荷屏蔽蛋白的纯度。
当将第一个色谱步骤与第二个色谱步骤组合时，电荷屏蔽融合蛋白可具有相较于单一色谱步骤增加的纯度。当将第一个色谱步骤与第二个和第三个色谱步骤组合时，电荷屏蔽融合蛋白可具有相较于单一色谱步骤增加的纯度。当将第一个和第二个色谱步骤与和第三个色谱步骤组合时，电荷屏蔽融合蛋白可具有相较于两个色谱步骤增加的纯度。
在一些实施例中，所述方法包括第一个色谱或捕获步骤(例如HIC)。在一些实施例中，第一个HIC步骤之后是第二个HIC步骤。在一些实施例中，第一个HIC步骤之后是AEX色谱步骤。或者，第一个HIC步骤之后可以是CEX色谱步骤。在一些实施例中，第一个HIC步骤之后是包括本文所描述的任何色谱技术或本领域普通技术人员已知的其它技术的色谱步骤。在第一个HIC步骤之后，第二个色谱步骤任选地后接第三个色谱步骤。在一方面，第三个色谱步骤是CEX色谱步骤。在另一方面，第三个色谱步骤是AEX色谱步骤。在一些实施例中，CEX色谱步骤是在第一个HIC步骤和AEX色谱步骤之后执行。在一些实施例中，AEX色谱步骤是在第一个HIC步骤和CEX色谱步骤之后执行。在替代性方法中，第三个色谱步骤包括本文所描述的任何色谱技术，或本领域普通技术人员已知的其它技术，并且在第一个HIC步骤和AEX步骤之后执行。其它实施例包含在第一个HIC步骤和CEX步骤之后执行的第三个色谱步骤，该第三个色谱步骤包括本文所描述的任何色谱技术，或本领域普通技术人员已知的其它技术。
在每个色谱步骤之间可以执行一个或多个任选使用的超过滤(UF)和/或透滤(DF)(例如UF/DF)步骤。在一些实施例中，在各色谱步骤之间执行UF/DF进行浓缩和缓冲液交换。例如，UF/DF可包括通过过滤进行分离。在一些实施例中，来自色谱步骤的洗出液与膜在施加的压力下接触。在一些实施例中，这一施加的压力驱动洗脱溶液、缓冲盐和较小的非靶标溶液组分迁移穿过膜。在一些实施例中，膜保留较大分子(例如靶标蛋白)。
在一些实施例中，本文所提供的方法包括使用HIC作为第一个色谱步骤。在一些实施例中，HIC包括基于疏水性分离混合物的方法。HIC可包括将包括缓冲液和蛋白质，即包括亲水区和疏水区的混合物施加至色谱柱内的HIC树脂上。在一些实施例中，使用了HIC特异性树脂执行HIC作为第一个色谱步骤。在一些实施例中，HIC树脂是高疏水性HIC树脂。在一些实施例中，HIC树脂是低疏水性树脂。在一些实施例中，在HIC捕获色谱步骤之后，包括电荷屏蔽融合蛋白的组合物的纯度是约40％、约50％、约60％、约70％、80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，在HIC捕获色谱步骤之后，电荷屏蔽融合蛋白具有约50％-80％或约60％-80％或80％-95％纯度。在一些实施例中，在HIC捕获色谱步骤之后，电荷屏蔽融合蛋白具有至少45％纯度。
在一些实施例中，HIC树脂具有至多、超过或约约/>约/>约/> 约/>约/>约/>约/>约/>约/>约/>约/> 或约的孔径。在一些实施例中，HIC树脂具有在约/>之间、约/>之间、约/>之间或约/>之间的孔径。在一些实施例中，HIC树脂具有至多、超过或约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm、约100μm、约105μm、约110μm、约115μm或约120μm的粒度。在一些实施例中，HIC树脂具有在约40-120μm之间、约60-100μm之间、约70-110μm之间及约40-50μm之间的粒度。
在一些实施例中，HIC树脂包括基质支撑基底材料，其中所述基底材料是亲水性碳水化合物。HIC树脂基底材料可以是交联琼脂糖或合成共聚物材料。在一些实施例中，HIC树脂包括交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]基底材料或羟基化甲基丙烯酸酯聚合物基底材料。在一些实施例中，HIC树脂还包括与基底材料结合的配体官能团，其中所述配体官能团是疏水性的。HIC配体官能团可以是展示疏水性的直链烷基配体，或展示混合模式行为的芳基配体，其中芳香族和疏水性相互作用是可能的。在一些实施例中，配体官能团是芳香族疏水性苯甲基配体、苯基配体或C6(己基)基团。在一些实施例中，HIC树脂包括与芳香族疏水性苯甲基配体官能团键结的交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]基底材料。在一些实施例中，HIC树脂包括与C6(己基)基团键结的羟基化甲基丙烯酸酯聚合物基底材料。在一些实施例中，HIC树脂包括与苯基官能团键结的羟基化甲基丙烯酸酯聚合物基底材料。在一些实施例中，HIC树脂是POROS Benzyl ultra树脂、POROS Benzyl树脂、Capto Phenyl(高取代)树脂、Butyl-650M树脂、Hexyl-650C树脂、Phenyl-600M树脂、Capto Phenyl ImpRes树脂、PhenylSepharose HP树脂、Octyl Sepharose 4 FF树脂、Capto Octyl树脂、PPG-600M树脂或POROSEthyl树脂。
通常，HIC树脂可在施加包括电荷屏蔽融合蛋白的上样溶液之前使用平衡缓冲液平衡。在一些实施例中，HIC平衡缓冲液包括缓冲盐溶液。在一些实施例中，HIC平衡缓冲液包括Tris、EDTA和盐(例如NaCl)。在一些实施例中，HIC平衡缓冲液被平衡至约pH 5.0-10.0，或者至多、超过或约pH 5.0、约pH 6.0、约pH 7.0、约pH 8.0、约pH 9.0或约pH 10.0。在一些实施例中，HIC平衡缓冲液是基于第一个色谱捕获步骤中特定HIC树脂的使用而选择。任选地，HIC平衡溶液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。
在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白是以混合物施加至HIC树脂上，其中包括电荷屏蔽融合蛋白的混合物包括上样溶液。在一些实施例中，将包括电荷屏蔽融合蛋白的上样溶液施加至HIC树脂上。在一些实施例中，上样溶液包括盐溶液。在一些实施例中，HIC上样溶液的盐溶液包括NaCl、(NH4)2SO4、Na2SO4、KCl或CH3COONH4。在一些实施例中，HIC上样溶液的盐溶液包括约1M NaCl、约2M NaCl、约3M NaCl、约4M NaCl或约5M NaCl。在一些实施例中，盐溶液包括约1-5M之间的NaCl或约2-3之间的NaCl。在一些实施例中，添加至HIC树脂的包括电荷屏蔽融合蛋白的HIC上样溶液具有不超过、超过或约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0的pH值。在一些实施例中，添加至HIC树脂的包括电荷屏蔽融合蛋白的HIC上样溶液具有约5.0-9.0的pH值或约6.0-8.0的pH值。任选地，上样溶液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。
在一些实施例中，上样溶液包括约0.25至约3M Na2SO4，例如约0.4至约3.0MNa2SO4、约0.5至约3M Na2SO4、约0.4至约2M Na2SO4或约0.4至约1.0M Na2SO4。在一些实施例中，上样溶液包括约0.6M Na2SO4。在一些实施例中，上样溶液具有5.5至6.5的pH值，例如pH5.5至6.3、pH 5.6至6.3或pH 5.7至6.2。在一些实施例中，上样溶液具有约pH 5.9的pH值。在一些实施例中，上样溶液包括约0.25至约0.6M NH4SO4、约0.3至约0.6M NH4SO4或约0.4至约0.6M NH4SO4。
在将包括电荷屏蔽融合蛋白的HIC上样溶液施加至HIC树脂之后，可使用洗涤缓冲液执行一个或多个洗涤步骤。洗涤缓冲液是基于HIC上样溶液和特定HIC树脂选择的，并且本领域的技术人员将显而易见的是，各种洗涤缓冲液均可使用。在一些实施例中，洗涤缓冲液包括盐溶液。在一些实施例中，洗涤缓冲液包括NaCl、(NH4)2SO4、Na2SO4、KCl或CH3COONH4。在一些实施例中，洗涤缓冲液还包括Tris和EDTA。任选地，洗涤缓冲液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。在一些实施例中，HIC洗涤缓冲液与HIC平衡缓冲液相同。或者，HIC洗涤缓冲液可与HIC平衡缓冲液不同。
在一些实施例中，任选地在一次或多次洗涤之后，从HIC树脂洗脱纯化的电荷屏蔽融合蛋白。HIC洗脱溶液包括盐溶液。在一些实施例中，HIC洗脱溶液盐溶液是NaCl缓冲液。在一些实施例中，NaCl缓冲液包括约0.6M NaCl、约0.65M NaCl、约0.7M NaCl、约0.75MNaCl、约0.8M NaCl、约0.85M NaCl、约0.9M NaCl、约1M NaCl、约1.2M NaCl、约1.5M NaCl、约1.75M NaCl、约2M NaCl或约2.5M NaCl。在一些实施例中，NaCl缓冲液包括约0.6-2.5MNaCl或约0.75-1.75M NaCl。在一些实施例中，HIC洗脱溶液具有约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或约7.5的pH值。在一些实施例中，HIC洗脱溶液具有约5.5-7.5的pH值或约6.0-7.0的pH值。任选地，洗脱溶液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。
在一些实施例中，HIC洗脱溶液包括约0.3至约0.5M NH4SO4并具有约5.5至约6.5的pH值。在一些实施例中，HIC洗脱溶液包括约0.35至约0.45M NH4SO4或约0.4M NH4SO4。在一些实施例中，HIC洗脱溶液具有约pH 5.6至约6.4、约pH 5.7至约6.2或约pH 5.9的pH值。
在一些实施例中，HIC是在约室温下执行的。在一些实施例中，HIC是在约15℃至约28℃或约18℃至约25℃下执行的。
在一些实施例中，HIC执行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次。在一些实施例中，第一个HIC捕获步骤执行1-15次、3-6次、8-10次或9-15次。任选地，来自第一个HIC捕获步骤的洗出液可在0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃储存，直至准备好进行进一步加工。在一些实施例中，将来自第一个HIC捕获步骤的洗出液在约4℃至约8℃储存。在一些实施例中，将来自第一个HIC捕获步骤的洗出液在约5-25℃、约2-8℃、约10-20℃或约18℃-25℃储存，直至准备好进行进一步加工。在一些实施例中，将洗出液在约25℃储存约至多8小时。在一些实施例中，将洗出液在约4℃至约8℃储存超过24小时。
在一些实施例中，本文所提供的方法包括使用一个或多个色谱步骤纯化电荷屏蔽融合蛋白；并且在一些实施例中，所述方法在HIC之后包括AEX色谱作为色谱步骤。在一些实施例中，AEX色谱步骤是继第一个HIC步骤之后的第二个色谱步骤。AEX色谱是一种使用含有带正电基团的IEX树脂，基于净表面电荷分离物质的方法。在溶液中，树脂被涂布带正电的抗衡离子。因此，AEX树脂上的带正电基团将结合溶液中带负电的蛋白质。在一些实施例中，本文所描述的方法中使用的AEX树脂是强阴离子交换树脂。在一些实施例中，本文所描述的方法中使用的AEX树脂是弱阴离子交换树脂。AEX树脂分类为“强”或“弱”阴离子交换剂是指树脂官能团的离子化状态随pH值变化的程度。例如，弱AEX树脂在有限pH值范围内离子化(例如官能团随缓冲液pH值的变化而接受或失去质子)，而强AEX树脂随pH值变化显示离子交换能力无变化(例如官能团在宽pH值范围内没有变化且保持完全带电)。
通常，AEX树脂可在施加包括电荷屏蔽融合蛋白的AEX上样溶液之前使用平衡缓冲液平衡。在一些实施例中，AEX平衡缓冲液包括缓冲盐溶液。在一些实施例中，AEX平衡缓冲液包括Tris、EDTA和盐(例如NaCl)。在一些实施例中，AEX平衡缓冲液被平衡至约pH 5.0-10.0，或者至多、超过或约pH 5.0、约pH 6.0、约pH 7.0、约pH 8.0、约pH 9.0或约pH 10.0。在一些实施例中，AEX平衡缓冲液是基于第二个色谱捕获步骤中特定AEX树脂的使用而选择。任选地，AEX平衡溶液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。
在一些实施例中，AEX树脂具有至多、超过或约约/>约/>约约/>约/>约/>约/>约/>约/>约/> 约约/>约/>或约/>的孔径。在一些实施例中，AEX树脂具有约约/>约/>或约/>的孔径。在一些实施例中，AEX树脂具有至多、超过或约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm或约100μm的粒度。在一些实施例中，AEX树脂具有约50-100μm、约70-80μm、约50-90μm或约80-100μm的粒度。
在一些实施例中，AEX树脂包括聚[苯乙烯-二乙烯基苯]或羟基化甲基丙烯酸聚合物基底材料。AEX树脂基底材料可任选地涂布有另外的多羟基表面涂层，以确保低非特异性结合。在一些实施例中，AEX树脂还包括与基底材料结合的配体官能团，其中所述配体官能团是带正电的或碱性的。AEX配体官能团可以是弱或强阴离子交换剂。例如，弱AEX配体官能团可包括二乙基氨基乙基或二乙基氨基丙基。或者，强AEX配体官能团可包括季铵或胺基团。在一些实施例中，AEX树脂包括与季铵化聚乙烯亚胺官能团键结的刚性、高度多孔的交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]基底材料，具有另外的多羟基表面涂层以确保低非特异性结合。在一些实施例中，AEX树脂包括与完全季铵化的季胺键结的刚性、高度多孔的交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]基底材料，具有另外的多羟基表面涂层以确保低非特异性结合。在一些实施例中，AEX树脂包括羟基化甲基丙烯酸聚合物基底材料，该基底材料经过化学改性以提供较多数量的阴离子结合位点，并与季胺强AEX官能团键结。在一些实施例中，AEX树脂是POROS 50HQ树脂、POROS XQ树脂、Gigacap Q-650M树脂、Super Q-650M树脂或NH2-750F树脂。
在一些实施例中，将电荷屏蔽融合蛋白以混合物施加至AEX树脂，其中包括电荷屏蔽融合蛋白的混合物包括上样溶液，该上样溶液包括来自HIC步骤的洗出液。在一些实施例中，将包括电荷屏蔽融合蛋白的上样溶液施加至AEX树脂上。在一些实施例中，上样溶液包括盐。在一些实施例中，AEX上样溶液具有不超过、超过或约0.5mS/cm、约0.6mS/cm、约0.7mS/cm、约0.8mS/cm、约0.9mS/cm、约1.0mS/cm、约2.0mS/cm、约3.0mS/cm、约4.0mS/cm、约5.0mS/cm和约6.0mS/cm的电导率。在一些实施例中，AEX上样溶液具有约0.5-6.0mS/cm的电导率或约0.7-4.0mS/cm的电导率。在一些实施例中，AEX上样溶液具有不超过、超过或约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0的pH值。在一些实施例中，AEX上样溶液具有约6.0-10.0的pH值或约7.0-9.0的pH值。在一些实施例中，AEX上样溶液具有7.0至9.1的pH值。
在将包括电荷屏蔽融合蛋白的AEX上样溶液施加至AEX树脂之后，可使用洗涤缓冲液执行一个或多个洗涤步骤。洗涤缓冲液是基于AEX上样溶液和特定AEX树脂选择的。在一些实施例中，洗涤缓冲液包括盐溶液。在一些实施例中，洗涤缓冲液包括NaCl、(NH4)2SO4、Na2SO4、KCl或CH3COONH4。在一些实施例中，洗涤缓冲液还包括Tris和EDTA。任选地，洗涤缓冲液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。在一些实施例中，AEX洗涤缓冲液与AEX平衡缓冲液相同。或者，AEX洗涤缓冲液可与AEX平衡缓冲液不同。
在一些实施例中，将纯化的电荷屏蔽融合蛋白施加至AEX树脂上并任选地在一次或多次洗涤之后，收集流出物。在一些实施例中，将所有AEX流出物和所有洗涤液收集起来。为了获得足够的材料用于后续下游加工，第二个色谱步骤可以执行一次或多次，该步骤任选地包括AEX。在一些实施例中，将AEX色谱步骤执行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次或15次。在一些实施例中，将AEX色谱步骤执行1-15次、3-6次、8-10次或9-15次。任选地，来自AEX色谱步骤的流出物可在0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃储存，直至准备好进行进一步加工。在一些实施例中，将来自AEX色谱步骤的洗出液在约0-10℃或约2-8℃储存，直至准备好进行进一步加工。在一些实施例中，将来自AEX色谱步骤的洗出液在约4℃至约8℃储存。在一些实施例中，将来自AEX色谱步骤的洗出液在约5-25℃、约2-8℃、约10-20℃或约18℃-25℃储存，直至准备好进行进一步加工。在一些实施例中，将洗出液在约25℃储存约至多8小时。在一些实施例中，将洗出液在约4℃至约8℃储存超过24小时。
在一些实施例中，本文所提供的方法包括使用一个或多个色谱步骤纯化电荷屏蔽融合蛋白；并且在一些实施例中，所述方法在HIC之后包括CEX色谱作为色谱步骤。在一些实施例中，CEX色谱步骤是继第一个HIC步骤之后的第二个色谱步骤。在一些实施例中，CEX色谱步骤是继第一个HIC步骤和AEX色谱步骤之后的第三个色谱步骤。CEX色谱是一种使用含有带负电基团的IEX树脂，基于净表面电荷分离物质的方法。在溶液中，树脂涂布带负电的抗衡离子。因此，CEX树脂上的带负电基团将结合溶液中带正电的蛋白质。在一些实施例中，本文所描述的方法中使用的CEX树脂是强阳离子交换树脂。在一些实施例中，本文所描述的方法中使用的CEX树脂是弱阳离子交换树脂。CEX树脂分类为“强”或“弱”阴离子交换剂是指树脂官能团的离子化状态随pH值变化的程度。例如，弱CEX树脂在有限pH值范围内离子化(例如官能团随缓冲液pH值的变化而接受或失去质子)，而强CEX树脂随pH值变化显示离子交换能力无变化(例如官能团在宽pH值范围内没有变化且保持完全带电)。
在一些实施例中，CEX树脂是混合模式树脂。混合模式色谱包括利用固定相与上样溶液之间的多种形式相互作用来实现靶标蛋白的分离的色谱方法。大多数的混合模式相典型地键结与离子交换配体官能团键结的基于二氧化硅或聚合反相的材料。例如，混合模式CEX树脂可包括与反相主链共价键结的带负电磺酸根。
通常，CEX树脂可在施加包括电荷屏蔽融合蛋白的CEX上样溶液之前使用平衡缓冲液平衡。在一些实施例中，CEX平衡缓冲液包括缓冲盐溶液。在一些实施例中，CEX平衡缓冲液包括Tris、EDTA和盐(例如NaCl)。在一些实施例中，CEX平衡缓冲液被平衡至约pH 5.0-10.0，或者至多、超过或约pH 5.0、约pH 6.0、约pH 7.0、约pH 8.0、约pH 9.0或约pH 10.0。在一些实施例中，平衡缓冲液是基于第二个色谱步骤中特定CEX树脂的使用而选择。任选地，平衡溶液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。
在一些实施例中，CEX树脂具有至多、超过或约约/>约/>约约/>约/>或约/>的孔径。在一些实施例中，CEX树脂具有约约/>或约/>的孔径。在一些实施例中，CEX树脂具有至多、超过或约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm或约100μm的粒度。在一些实施例中，CEX树脂具有约20-100μm、约30-50μm、约50-80μm或约80-100μm的粒度。
在一些实施例中，CEX树脂包括聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、甲基丙烯酸酯聚合物、琼脂糖或纤维素基底材料。CEX树脂基底材料可涂布有另外的多羟基表面涂层，以确保低非特异性结合。在一些实施例中，CEX树脂还包括与基底材料结合的配体官能团，其中所述配体官能团是带负电的或酸性的。CEX配体官能团可以是弱或强阳离子交换剂。例如，弱CEX配体官能团可包括羧甲基。或者，强CEX配体官能团可包括磺酸(例如磺酸甲酯、磺酰基、磺基异丁基、磺基丙基)、羧酸(例如羧甲基)或膦酸。在一些实施例中，除带负电的CEX基团外，CEX配体官能团还可包括多峰(例如混合模式)官能团，包含伯胺或提供氢键结和疏水相互作用位点的基团。
在一些实施例中，CEX树脂包括与高密度带负电磺基丙基官能团键结的刚性、高度多孔的交联聚[苯乙烯-二乙烯基苯]基底材料，具有另外的多羟基表面涂层以确保低非特异性结合。在一些实施例中，CEX树脂包括与多峰弱CEX配体官能团键结的刚性高流量琼脂糖基质，含有羧酸基团以及提供氢键结和疏水相互作用位点的另外的基团。在一些实施例中，CEX树脂包括与赋予CEX和疏水特性的配体键结的刚性纤维素基质，含有伯胺和羧基。在一些实施例中，CEX树脂包括与带负电磺酸根(SP)键结的高流量琼脂糖基质。在一些实施例中，CEX树脂包括通过线性聚合物链与带负电磺基异丁基官能性离子交换剂基团键结的合成甲基丙烯酸酯聚合物基底材料。在一些实施例中，CEX树脂包括高分辨率、高载量CEX树脂，该树脂包括与磺丙基(S)强CEX官能团键结的甲基丙烯酸酯聚合物基底材料，该基底材料被化学改性用于提供较多数量的阳离子结合位点。在一些实施例中，CEX树脂是CaptoMMC树脂、CMM Hypercel树脂、Capto SP impres树脂、Fracto gel SO3-树脂、GigaCap S-650S树脂、POROS XS树脂、MX-TRP-650M树脂、Sulfate-650F树脂、NH2-750F树脂、CaPure-HA树脂或PPG-600M树脂。
在一些实施例中，将电荷屏蔽融合蛋白以混合物施加至CEX树脂上，其中包括电荷屏蔽融合蛋白的混合物包括上样溶液，该上样溶液包括来自前一色谱步骤(例如AEX色谱或HIC)的洗脱液。在一些实施例中，将包括电荷屏蔽融合蛋白的上样溶液添加至CEX树脂，并包括约盐溶液。在一些实施例中，CEX上样溶液具有不超过、超过或约0.5mS/cm、约0.6mS/cm、约0.7mS/cm、约0.8mS/cm、约0.9mS/cm、约1.0mS/cm、约2.0mS/cm、约2.5mS/cm、约3.0mS/cm、约3.5mS/cm和约4.0mS/cm的电导率。在一些实施例中，CEX上样溶液具有约0.5-4.0mS/cm的电导率或约0.7-2.5mS/cm的电导率。在一些实施例中，CEX上样溶液具有不超过、超过或约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0的pH值。在一些实施例中，CEX上样溶液具有约5.0-8.0的pH值或约6.0-7.0的pH值。在一些实施例中，CEX上样溶液具有5.9至7.0的pH值。
在将包括电荷屏蔽融合蛋白的CEX上样溶液施加至CEX树脂之后，可使用洗涤缓冲液执行一个或多个洗涤步骤。洗涤缓冲液是基于CEX上样溶液和特定CEX树脂选择的，并且本领域的技术人员将显而易见的是，各种洗涤缓冲液均可使用。在一些实施例中，洗涤缓冲液包括盐溶液。在一些实施例中，洗涤缓冲液包括NaCl、(NH4)2SO4、Na2SO4、KCl或CH3COONH4。在一些实施例中，洗涤缓冲液还包括Tris或MES和EDTA。任选地，洗涤缓冲液包括添加剂，包含但不限于清洁剂、醇和离液盐。在一些实施例中，CEX洗涤缓冲液与CEX平衡缓冲液相同。或者，CEX洗涤缓冲液可与CEX平衡缓冲液不同。
在一些实施例中，任选地在一次或多次洗涤之后，从CEX树脂洗脱纯化的电荷屏蔽融合蛋白。CEX洗脱溶液包括盐溶液。在一些实施例中，CEX洗脱溶液具有不超过、超过或约0.5mS/cm、约0.6mS/cm、约0.7mS/cm、约0.8mS/cm、约0.9mS/cm、约1.0mS/cm、约2.0mS/cm、约2.5mS/cm、约3.0mS/cm、约3mS/cm、约4.0mS/cm或约5.0mS/cm的电导率。在一些实施例中，CEX洗脱溶液具有约0.5-5.0mS/cm、约0.7-4.0mS/cm、约1.0-2.0mS/cm或约3.0-4.0mS/cm的电导率。在一些实施例中，CEX洗脱溶液具有约5.5、约6.0、约6.5、约7.0或约7.5的pH值。在一些实施例中，CEX洗脱溶液具有约5.5-7.5的pH值或约6.0-7.0的pH值。
为了获得足够的材料用于后续下游加工，第三个色谱步骤可以执行一次或多次，该步骤任选地包括CEX。在一些实施例中，将CEX色谱步骤执行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次或15次。在一些实施例中，将CEX色谱步骤执行1-15次、3-6次、8-10次或9-15次。任选地，来自CEX色谱步骤的洗出液可在0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃储存，直至准备好进行进一步加工。在一些实施例中，将来自AEX色谱步骤的洗出液在约0-10℃或约2-8℃储存，直至准备好进行进一步加工。
II.产生电荷屏蔽融合蛋白的方法
在一些实施例中，本文所提供的方法包括培养包括编码电荷屏蔽蛋白的核酸的细胞以产生电荷屏蔽融合蛋白，并纯化该电荷屏蔽融合蛋白。用于表达多肽的宿主细胞是本领域中众所周知的并且包括原核细胞以及真核细胞，例如大肠杆菌细胞；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)细胞；酵母细胞；无脊椎动物细胞；CHO细胞；CHO-K1细胞；Hela细胞；COS-1猴细胞；黑色素瘤细胞，如Bowes细胞；小鼠L-929细胞；来源于Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3细胞系；BHK或HaK仓鼠细胞系。
在一些实施例中，编码电荷屏蔽蛋白的核酸是在载体中。在一些实施例中，编码电荷屏蔽蛋白的核酸被整合至宿主细胞染色体中。
优选地，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。来源于病毒，例如来源于逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可以用于将本发明的多核苷酸或载体递送至靶标细胞群中。含有本发明的核酸分子的载体可以通过众所周知的方法转移至宿主细胞中，所述方法取决于细胞宿主的类型而变化。
电荷屏蔽融合蛋白可以通过重组DNA技术，例如通过培养包括所描述的编码电荷屏蔽融合蛋白的核酸分子或载体的细胞并从培养物中分离所述生物活性蛋白质来产生。电荷屏蔽融合蛋白可以在任何适合的细胞培养系统中产生，所述细胞培养系统包含原核细胞，例如大肠杆菌(例如BL21、W3110或JM83)、荧光假单胞菌或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilus)细胞；或者真核细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母菌株X-33或CHO细胞。本领域中已知的其它适合细胞系可从细胞系保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。术语“原核细胞”意图包含细菌细胞，而术语“真核细胞”意欲包含酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。转化后的宿主可在发酵罐中生长并根据本领域中已知的技术培养以实现最佳的细胞生长。在另一实施例中，本发明涉及一种用于制备以上描述的生物活性蛋白质的方法，该方法包括在适于表达生物活性蛋白质的条件下，培养本发明的细胞，并从细胞或培养基中分离出生物活性蛋白质。
可用于本文的方法中的方法、载体与翻译和转录元件以及其它元件的其它实例描述于例如以下专利中：颁予Gilroy的美国专利第5,055,294号和颁予Gilroy等人的美国专利第5,128,130号；颁予Rammler等人的美国专利第5,281,532号；颁予Barnes等人的美国专利第4,695,455号和第4,861,595号；颁予Gray等人的美国专利第4,755,465号；以及颁予Wilcox的美国专利第5,169,760号。
III.电荷屏蔽融合蛋白
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域位于融合蛋白的N末端。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域位于融合蛋白的C末端。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域位于生物活性结构域的N末端。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域位于生物活性结构域的C末端。在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白在电荷屏蔽结构域与生物活性结构域之间包括肽接头。
在一些实施例中，本文所提供的融合蛋白包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域防止或减少生物活性结构域与离子交换色谱树脂的结合。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域增加融合蛋白的疏水性。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域覆盖生物活性结构域的带电区域。
如本文所使用，“生物活性结构域”是本身具有或与另一分子(例如蛋白质、脂质、核酸或其它单体)缔合而具有生物活性的蛋白质或肽。例如，“生物活性结构域”包含多聚蛋白质复合物的亚基。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域不带电。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有约7，例如约6.5至约7.5、约6.6至约7.4、约6.7至约7.3、约6.8至约7.2或约6.9至约7.1的pI。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有5至9、5至6、5至7、7至8或7至9的pI。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域包括不带电氨基酸。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域包括极性氨基酸。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域包括非极性氨基酸。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域由脯氨酸和丙氨酸组成。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有10至200kDa，例如10至100kDa、10至80kDa、10至60kDa或10至40kDa的分子量。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有10至20kDa的分子量。
在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白形成多聚蛋白质。在一些实施例中，电荷屏蔽蛋白形成二聚体、三聚体、四聚体、六聚体或八聚体。在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白形成四聚体。
在一些实施例中，多聚(例如四聚)电荷屏蔽蛋白的分子量在50至500kDa之间、75至300kDa之间或100至250kDa之间。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量小于生物活性结构域的分子量。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量是生物活性结构域的分子量的不到80％、不到70％、不到60％、不到50％、不到40％、不到30％或不到20％。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量大于生物活性结构域的分子量。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量是生物活性结构域的分子量的至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％或至少200％。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量是生物活性结构域的分子量的约25％至约150％。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量是生物活性结构域的分子量的约50％至约125％。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的分子量是生物活性结构域的分子量的约50％至约100％。
在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白的总分子量是至少50kDa、至少100kDa、至少120kDa或至少150kDa。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域呈现无规卷曲构形。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域在水性环境(例如水溶液或水性缓冲液)中呈现无规卷曲构形。无规卷曲构形的存在可使用本领域中已知的方法，特别是借助于光谱技术，例如圆二色性(CD)光谱法确定。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有无序结构。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域是非结构化的。
在另一实施例中，电荷屏蔽结构域的特征在于，经GOR算法确定，它具有超过90％的无规卷曲构成，或约95％，或约96％，或约97％，或约98％，或约99％无规卷曲构成。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少于3％的α螺旋。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域具有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少于3％的β折叠。在一些实施例中，经Chou-Fasman算法确定，电荷屏蔽结构域具有少于2％的α螺旋和少于2％的β折叠。
在另一实施例中，本发明提供融合蛋白，其中电荷屏蔽结构域的特征在于，天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总和是电荷屏蔽结构域的总氨基酸序列的不到10％，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和是电荷屏蔽结构域的总氨基酸序列的不到2％，电荷屏蔽结构域序列具有不到5％的带正电氨基酸残基。
在另一实施例中，电荷屏蔽结构域的特征在于，至少约80％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的电荷屏蔽结构域序列由非重叠序列基元组成，其中所述序列基元各自具有约9至约14个氨基酸残基，并且其中任何两个邻接氨基酸残基的序列在各序列基元中未出现超过两次，所述序列基元由四至六种类型的氨基酸组成，所述氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域增加融合蛋白的流体动力半径。术语“流体动力半径”或“斯托克斯半径(Stokes radius)”是通过假定一个分子是移动穿过溶液并受到溶液粘度的抵抗的主体所测量的溶液中该分子的有效半径(Rh，以nm为单位)。在本发明的实施例中，融合蛋白的流体动力半径测量值与‘表观分子量因子’相关，表观分子量因子是更直观的度量。蛋白质的“流体动力半径”影响它在水溶液中的扩散速率以及它在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力半径是通过其分子量以及其结构确定，包含形状及紧密度。用于确定流体动力半径的方法是本领域中众所周知的，例如通过使用尺寸排阻色谱(SEC)确定，如美国专利第6,406,632号和第7,294,513号中所描述。大多数蛋白质具有球状结构，这是蛋白质所能具有的最紧凑的三维结构，具有最小的流体动力半径。一些蛋白质呈现无规并且开放式的、非结构化或‘线性’构形，并因此具有比具有类似分子量的典型球状蛋白质大得多的流体动力半径。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域能够增大融合蛋白的流体动力半径，使其超过约3-5nm的肾小球孔径(对应于约70kDA的表观分子量)(Caliceti.2003.聚(乙二醇)-蛋白质缀合物的药物动力学和生物分布特性(Pharmacokinetic and biodistributionproperties of poly(thylene glycol)-protein conjugates.)，《先进药物递送评述》，55：1261-1277)，由此使循环蛋白质的肾清除率减小。蛋白质的流体动力半径是通过其分子量以及其结构确定，包含形状或紧密度。用于确定流体动力半径的方法是本领域中众所周知的，例如通过使用尺寸排阻色谱(SEC)确定，如美国专利第6,406,632号和第7,294,513号中所描述。因此，在某些实施例中，融合蛋白具有至少约5nm，或至少约8nm，或至少约10nm或12nm，或至少约15nm的流体动力半径。在前述实施例中，电荷屏蔽结构域所赋予的较大流体动力半径可使所得到的融合蛋白的肾清除率减小，引起终末半衰期的相应增加、平均滞留时间增加和/或肾清除速率降低。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域不影响生物活性结构域的功能。在一些实施例中，生物活性结构域当与电荷屏蔽结构域融合时，保持至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的活性。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域使融合蛋白或电荷屏蔽融合蛋白亚基的多聚体(即，二聚体、三聚体、四聚体、六聚体或八聚体)的体内半衰期增加。在一些实施例中，相较于无电荷屏蔽结构域的生物活性蛋白质，电荷屏蔽结构域使体内半衰期增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％或至少200％。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域使体内半衰期增加至少5倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍或超过30倍。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域使体内半衰期增加5至50倍、5至40倍、5至30倍或5至20倍。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域的选择将使施用给动物的融合蛋白或融合蛋白多聚体(即二聚体、三聚体、四聚体、六聚体或八聚体)的半衰期相较于未连接至电荷屏蔽结构域并以相当剂量施用的相应生物活性结构域增加，使得半衰期相较于未连接至电荷屏蔽结构域的生物活性结构域增加至少约两倍，或至少约三倍，或至少约四倍，或至少约五倍，或至少约六倍，或至少约七倍，或至少约八倍，或至少约九倍，或至少约十倍，或至少约15倍，或至少20倍，或至少40倍，或至少80倍，或至少100倍或更大倍数。在一些实施例中，本发明提供了一种融合蛋白，与未连接至电荷屏蔽结构域并以相当的剂量施用给动物的相应生物活性结构域相比较，该融合蛋白使AUC增加至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约100％，或至少约150％，或至少约200％，或至少约300％，或至少约500％，或至少约1000％，或增加至少约2000％。融合蛋白的药物动力学参数可通过标准方法确定，所述标准方法涉及给药，以一定时间间隔获取血液样本，并使用ELISA、HPLC、放射测定或者本领域中已知或如本文所描述的其它方法测定所述蛋白质，随后对数据进行标准计算以得出半衰期和其它PK参数。
此外，融合蛋白在约25μg蛋白质/kg剂量下可具有至少约5、10、12、15、24、36、48、60、72、84或96小时的半衰期。
在一些实施例中，电荷屏蔽结构域是PAS结构域。在一些实施例中，PAS结构域由脯氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一些实施例中，PAS结构域包括10至1000个氨基酸。在一些实施例中，PAS结构域包括100至1000个氨基酸。在一些实施例中，PAS结构域包括200至800个氨基酸。在一些实施例中，PAS结构域包括200至700个氨基酸。在一些实施例中，PAS结构域包括200至600个氨基酸。在一些实施例中，PAS结构域包括200至400个氨基酸。
在一些实施例中，电荷屏蔽融合蛋白包括生物活性结构域和PAS结构域。在一些实施例中，如本文所使用，“PAS化(PASylation)”或“PAS化的(PASylated)”意思指，生物活性结构域与PAS结构域融合。
在一些实施例中，PAS结构域包括10至100个或更多脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基、总计15至60个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基、总计15至45个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基，例如总计20至约40个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基，例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个或45个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基。在一个优选方面，所述氨基酸序列由约20个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成。在另一个优选方面，所述氨基酸序列由约40个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成。
仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的多肽可具有约200至约400个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基的长度。换句话说，所述多肽可由约200至约400个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成。在一个优选方面，所述多肽由总计约200(例如201)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成(即，具有约200(例如201)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基的长度)，或所述多肽由总计约400(例如401)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成(即，具有约400(例如401)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基的长度)。在一些实施例中，电荷屏蔽结构域由含约200至约400个脯氨酸和丙氨酸残基的随机序列组成。
电荷屏蔽结构域可包括多个氨基酸重复序列，其中所述重复序列由脯氨酸和丙氨酸残基组成，并且其中不超过6个连续氨基酸残基是相同的。具体点说，所述多肽可包括以下或由以下组成：氨基酸序列AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(SEQ ID NO：2)或者序列整体或部分序列的环形排列形式或(a)多聚体。
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在一些实施例中，生物活性结构域是激素。在一些实施例中，生物活性结构域是酶。在一些实施例中，生物活性结构域是免疫球蛋白。在一些实施例中，生物活性结构域是治疗性肽。在一些实施例中，生物活性结构域是治疗性多肽。
在一些实施例中，生物活性结构域包括以下中的一者或者其变体、片段或衍生物：刺鼠相关肽；淀粉素(amylin)；血管紧张素；天蚕素(cecropin)；铃蟾素(bombesin)；胃泌素(gastrin)，包含胃泌素释放肽；乳铁素(lactoferin)；抗微生物肽，包含但不限于爪蟾抗菌肽(magainin)；尿舒张肽(urodilatin)；核定位信号(NLS)；胶原蛋白肽；存活素(survivin)；淀粉样肽，包含f-淀粉样蛋白；利钠肽(natiuretic peptides)；肽YY；神经再生性肽和神经肽，包含但不限于神经肽Y、强啡肽(dynorphin)、内吗啡肽(endomorphin)、内皮素(endothelin)、脑啡肽(enkaphalin)、艾生丁(exendin)、纤维结合蛋白(fibronectin)、神经肽W和神经肽S；肽T；黑皮质素(melanocortin)；淀粉样前体蛋白；片层阻断肽(sheet breaker peptide)；CART 13 WO 2008/030968 PCT/US2007/077767肽；淀粉样抑制肽；朊病毒抑制肽；氯毒素(chlorotoxin)；促皮质素释放因子；催产素(oxytocin)；血管加压素(vasopressin)；胆囊收缩素(cholecystokinin)；肠泌素(secretin)；胸腺素(thymosin)；表皮生长因子(EGF)；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；血小板源性生长因子(PDGF)；类胰岛素生长因子(IGF)；成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)；胰抑制素(pancreastatin)；黑色素细胞刺激激素；骨钙蛋白(osteocalcin)；缓激肽(bradykinin)；肾上腺髓质素(adrenomedullin)；海蚕抗菌肽(perinerin)；转移抑制素(metastatin)；抑肽酶(aprotinin)；甘丙胺素(galanins)，包含甘丙胺素样肽；瘦素(leptin)；防御素(defensins)，包含但不限于a-防御素和f防御素；心血管调节肽(salusin)和各种毒液，包含按不限于芋螺毒素(conotoxin)、抗栓肽(decorsin)、蝎子毒素(kurtoxin)、海葵毒液(anenomae venom)、塔兰托毒蛛毒液(tarantula venom)；利钠肽，包含脑利钠肽(B型利钠肽或BNP)、心房利钠肽和血管钠肽(vasonatrin)；神经激肽A、神经激肽B；神经介素(neuromedin)；神经调压素(neurotensin)；食欲素(orexin)、胰腺多肽、垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)、催乳素释放肽、蛋白脂质蛋白质(proteolipid protein，PLP)、生长抑素(somatostatin)、TNF-a；饥饿素(Grehlin)、蛋白质C(Xigris)、SS1(dsFv)-PE38和假单胞菌外毒素蛋白；凝血因子，包含抗凝血酶III和凝血因子VTTA、因子VIII、因子IX；链激酶(streptokinase)；组织纤维蛋白溶酶原活化剂；尿激酶；β葡糖脑苷脂酶和α-D-半乳糖苷酶；αL-艾杜糖醛酸酶；α-1，4-葡糖苷酶；芳基硫酸酯酶B；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；脱氧核糖核酸酶I(deoxyribunuclase I)；人活化蛋白；促卵泡激素；绒膜促性腺激素；促黄体激素；索马托品(somatropin)；骨形态发生蛋白；奈西立肽(nesiritide)；甲状旁腺激素；促红细胞生成素；角质细胞生长因子；人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；α干扰素；β干扰素；γ干扰素；白细胞介素，包含IL-1、IL-iRa、IL-2、11-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL 11、IL-12；糖蛋白IIB/IIIA；免疫球蛋白，包含B型肝炎、γ球蛋白、venoglobulin；水蛭素(hirudin)；抑肽酶(aprotinin)；抗凝血酶III；αt-i-蛋白酶抑制剂；非格司亭(filgrastim)；以及依那西普(etanercept)。
在另一实施例中，生物活性结构域是与免疫疗法或其它治疗性干预相关的抗体或抗原。
在一些实施例中，生物活性结构域包括胰岛素A肽、T20肽、干扰素α2B肽、烟草蚀刻病毒蛋白酶、小异二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质素受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白αQ、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸酯还原异构酶肽、G蛋白αS、血管生长抑素(Ki-3)、蓝色荧光蛋白(BFP)、钙调蛋白(CalM)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、白细胞介素I受体拮抗剂(IL-iRa)、荧光素酶、组织型谷氨酰胺转氨酶(tTg)、吗啡碱调节神经肽14WO 2008/030968 PCT/US2007/077767(MMN)、神经肽Y(NPY)、食欲素-B、瘦素、ACTH、降血钙素、肾上腺髓质素(AM)、甲状旁腺激素(PTH)、防御素以及生长激素。
在一些实施例中，生物活性结构域具有小于200kDa的分子量。在一些实施例中，生物活性结构域具有小于约150kDa的分子量。在一些实施例中，生物活性结构域具有小于约100kDa的分子量。在一些实施例中，生物活性结构域具有小于约70kDa的分子量，70kDa是肾过滤的阈值。在一些实施例中，生物活性结构域具有小于约50kDa的分子量。
在一些实施例中，生物活性结构域具有约20至约100kDa的分子量。在一些实施例中，生物活性结构域具有约20至约70kDa的分子量。在一些实施例中，生物活性结构域具有约30至约40kDa的分子量。
在一些实施例中，生物活性结构域可形成多聚体。在一些实施例中，生物活性结构域可形成二聚体、三聚体、四聚体、六聚体或八聚体。在一些实施例中，多聚生物活性结构域的分子量是约20kDa至约300kDa、约50kDa至约200kDa或约100kDa至约200kDa。
在一些实施例中，生物活性结构域在中性溶液中具有净电荷。在一些实施例中，生物活性结构域具有的pI不是7.0。在一些实施例中，生物活性结构域具有约3.0至约6.0、约4.0至约6.0或约5.0至约6.0的pI。在一些实施例中，生物活性结构域具有约8.0至约10.0、约8.0至约9.0的pI。
在一些实施例中，生物活性结构域是酶。在一些实施例中，生物活性结构域是天冬酰胺酶亚基。来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的重组II型天冬酰胺酶克立他酶(crisantaspase)又称为和/>来源于大肠杆菌的重组天冬酰胺酶以名称/>和/>为人所知。/>是大肠杆菌天冬酰胺酶聚乙二醇化形式的名称。克立他酶通过静脉内、肌肉内或皮下注射施用给患有急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病和非霍奇金淋巴瘤的患者。
在一些实施例中，天冬酰胺酶是菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶II型(克立他酶)。在一些实施例中，天冬酰胺酶包括以下氨基酸序列：
在一些实施例中，天冬酰胺是重组大肠杆菌天冬酰胺酶。大肠杆菌产生两种天冬酰胺酶，即I型L-天冬酰胺酶和II型L-天冬酰胺酶。I型L-天冬酰胺酶对天冬酰胺具有低亲和力，位于细胞质中。II型L-天冬酰胺酶是对天冬酰胺具有高亲和力的四聚体周质酶，该酶产生具有可断裂的分泌前导序列。以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请第US2016/0060613号“聚乙二醇化L-天冬酰胺酶”描述了来自细菌来源的已知L-天冬酰胺酶的共同结构特征。根据US 2016/0060613，所有L-天冬酰胺酶都是在两个相邻单体的N末端与C末端结构域之间具有四个活性位点的同四聚体，全部在其三级和四级结构中具有高度相似性，并且L-天冬酰胺酶的催化位点序列在菊欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)与大肠杆菌L-天冬酰胺酶II之间具有高度保守性。
在实施例中，大肠杆菌A-1-3的L-天冬酰胺酶II型包括以下氨基酸序列：
在一些实施例中，天冬酰胺酶是使用本发明的方法产生的。这一天冬酰胺酶描述于例如以全文引用的方式并入本文中的美国专利第7,807,436号“用于产生L-天冬酰胺酶II的重组宿主”中，其中序列如SEQ ID NO：5所示。大肠杆菌A-1-3的L-天冬酰胺酶II型在以引用的方式并入本文中的Nakamura，N.等人，1972，“来自大肠杆菌A-1-3的L-天冬酰胺酶的生产率和特性(On the Productivity and Properties of L-Asparaginase fromEscherichia coli A-1-3)”，《农业与生物化学(Agricultural and BiologicalChemistry)》，36：12，2251-2253中也有描述。大肠杆菌A-1-3来源于大肠杆菌HAP菌株，该菌株产生高水平天冬酰胺酶，在以引用的方式并入本文中的Roberts，J.等人，1968，“用于从大肠杆菌中以高产率纯化出L-天冬酰胺酶的新颖程序(New Procedures forPurification of L-Asparaginase with High Yield from Escherichia coli)”，《细菌学杂志(Journal of Bacteriology)))，95：6，2117-2123中有描述。
在实施例中，使用本发明的方法产生的L-天冬酰胺酶II型蛋白质是大肠杆菌K-12的L-天冬酰胺酶II型酶，该酶具有Jennings等人，1990，《细菌学杂志》，172：1491-1498所描述的ansB基因(GenBank编号M34277)编码的氨基酸序列，两者以引用的方式并入本文中(氨基酸序列如下所示：
或
/>
(不包含前导序列
美国专利第7,807,436号报导，相对于来自Merck公司的L-天冬酰胺酶II型酶和来自Kyowa Hakko Kogyo有限公司的L-天冬酰胺酶II型酶，大肠杆菌K12酶亚基具有Val27替代Ala27，Asn64替代Asp64，Ser252替代Thr252以及Thr263替代Asn263。
在实施例中，使用本发明的方法产生的L-天冬酰胺酶II型具有以引用的方式并入本文中的Maita，T.等人，1974年12月，“来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的氨基酸序列(Aminoacid sequence of L-asparaginase from Escherichia coli)”，《生物化学杂志(J.Biochem.)》76(6)：1351-4中所示的氨基酸序列。
来自大肠杆菌的重组II型天冬酰胺酶又以名称 和/>为人所知。/>是大肠杆菌天冬酰胺酶聚乙二醇化形式的名称。天冬酰胺酶通过静脉内、肌肉内或皮下注射施用给患有急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病和非霍奇金淋巴瘤的患者。
在一些实施例中，融合蛋白包括与SEQ ID NO：7具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性的天冬酰胺酶亚基。在一些实施例中，融合蛋白包括含SEQ ID NO：7并具有一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代的天冬酰胺酶亚基。在一些实施例中，氨基酸取代是保守取代。在一些实施例中，融合蛋白包括含SEQ ID NO：7并具有一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸插入或缺失的天冬酰胺酶亚基。
取代包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链或物理化学特征(例如静电、氢键结、等排、疏水特征)的氨基酸残基置换。氨基酸可以是天然存在的或非天然的。具有类似侧链的氨基酸残基家族是本领域中已知的。这些家族包含具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。取代还可包含非保守变化。
菊欧文氏菌NCPPB 1066(Genbank寄存编号CAA32884，描述于例如Minton等人，1986，“菊欧文氏菌NCPPB 1066L-天冬酰胺酶基因的核苷酸序列(Nucleotide sequence ofthe Erwinia chrysanthemi NCPPB 1066 L-asparaginase gene)”，《基因(Gene)》46(1)，25-35中，各自以全文引用的方式并入本文中)带有或不带信号肽和/或前导序列。
在一些实施例中，融合蛋白包括来自菊迪卡氏菌(Dickeya chrysanthemi)的天冬酰胺酶。在一些实施例中，天冬酰胺酶包括以下氨基酸序列：
在一些实施例中，融合蛋白包括以下氨基酸序列：
在一些实施例中，融合蛋白包括以下氨基酸序列：
IV.电荷屏蔽重组欧文氏菌融合蛋白的产生
在一些实施例中，所述方法包括表达并纯化电荷屏蔽天冬酰胺酶融合蛋白。在一些实施例中，所述方法包括表达II型天冬酰胺酶融合蛋白。在一些实施例中，天冬酰胺酶是菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶II型(克立他酶)。在一些实施例中，天冬酰胺酶融合蛋白是在原核宿主细胞中表达的。在一些实施例中，天冬酰胺酶融合蛋白是在荧光假单胞菌宿主细胞中表达的。在一些实施例中，假单胞菌目(Pseudomonadales)宿主细胞在一种或多种天然天冬酰胺酶的表达方面存在缺陷。在一些实施例中，缺陷性表达的天然天冬酰胺酶的是I型天冬酰胺酶。在一些实施例中，缺陷性表达的天然天冬酰胺酶是II型天冬酰胺酶。在一些实施例中，假单胞菌目宿主细胞在一种或多种蛋白酶的表达方面存在缺陷。在一些实施例中，假单胞菌目宿主细胞过度表达一种或多种折叠调节剂。在一些实施例中，假单胞菌目宿主细胞在一种或多种天然天冬酰胺酶的表达方面存在缺陷，在一种或多种蛋白酶的表达方面存在缺陷和/或过度表达一种或多种折叠调节剂。US10787671提供了用于产生重组欧文氏菌天冬酰胺酶的方法。
在天然宿主菊欧文氏菌中，克立他酶是在周质中产生的。本发明提供了允许在宿主细胞的细胞质中高水平产生可溶性和/或活性克立他酶的方法。在实施例中，本文所提供的方法在假单胞菌目、假单胞菌属(Pseudomonad)、假单胞菌或荧光假单胞菌宿主细胞的细胞质中高水平产率可溶性和/或活性克立他酶。
在一些实施例中，从周质释放物中纯化出电荷屏蔽融合蛋白。在一些实施例中，编码电荷屏蔽融合蛋白的核酸包括周质分泌前导序列。
在一些实施例中，使用了渗透冲击来产生周质释放物。在一些实施例中，将细胞与溶菌酶一起培育以产生周质释放物。在一些实施例中，对细胞进行声波处理以产生周质释放物。在一些实施例中，将细胞与溶菌酶一起培育并进行声波处理以产生周质释放物。
在一些实施例中，为了从周质释放电荷屏蔽融合蛋白，使用了化学试剂，例如氯仿(Ames等人(1984)《细菌学杂志》，160：1181-1183)、盐酸胍和Triton X-100(Naglak和Wang(1990)《包含酶与微生物技术的方法(Processes including Enzyme Microb.Technol.)》，12：603-611)。然而，这些化学试剂并非惰性的并且可能不利地影响许多重组蛋白产物或后续纯化程序。另外，据报导，甘氨酸处理大肠杆菌细胞，引起外膜渗透性的增加，由此可释放出周质内含物(Ariga等人(1989)，《发酵与生物工程杂志(J.Ferm.Bioeng.)》，68：243-246)。最广泛使用的重组蛋白周质释放方法是渗透冲击(Nosal和Heppel(1966)《生物化学杂志》，241：3055-3062；Neu和Heppel(1965)《生物化学杂志》，240：3685-3692)、鸡蛋白(heneggwhite，HEW)溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)处理(Neu和Heppel(1964)《生物化学杂志》，239：3893-3900；Witholt等人(1976)《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》，443：534-544；Pierce等人(1995)《ICheme研究事件(IChemeResearch.Event)》，2：995-997)以及HEW溶菌酶/渗透冲击组合处理(French等人(1996)《酶与微生物技术(Enzyme and Microb.Tech.)》，19：332-338)。法式方法涉及使细胞再悬浮于分级分离缓冲液中，随后回收周质部分，并在溶菌酶处理之后立即执行渗透冲击。
典型地，这些程序涉及最初在使渗透压稳定的介质中进行破坏，随后在非稳定化介质中进行选择性释放。这些介质(pH值、保护剂)的组成和所使用的破坏方法(氯仿、HEW溶菌酶、EDTA、声波处理)取决于所报导的具体程序。HEW使用两性离子型表面活性剂代替EDTA，即针对溶菌酶/EDTA处理的变化，描述于Statel等人(1994)《兽医微生物学(Veterinary Microbiol.)》，38：307-314中。有关使用细胞内裂解酶系统破坏大肠杆菌的一般评述，参见Dabora和Cooney(1990)，《生化工程/生物技术进展(Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology)》，第43卷，A.Fiechter编(Springer-Verlag：Berlin)，参见第11-30页。
在一些实施例中，电荷屏蔽天冬酰胺酶融合蛋白是以表达构建体，例如质粒表达，不含分泌信号。使用了诱导型启动子序列，根据本文中的方法调节克立他酶的表达。在实施例中，可用于本文中的方法中的诱导型启动子包含来源于lac启动子(即，lacZ启动子)的家族的诱导型启动子，尤其是颁予DeBoer的美国专利第4,551,433号中所描述的tac和trc启动子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5，和T7lac启动子。在一个实施例中，启动子并非来源于宿主细胞生物体。在某些实施例中，启动子来源于大肠杆菌生物体。在一些实施例中，使用了lac启动子来调节由质粒进行的克立他酶表达。在lac启动子衍生物或家族成员，例如tac启动子的情况下，诱导剂是IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷，又称为“异丙基硫代半乳糖苷”)。在某些实施例中，将IPTG添加至培养物中以诱导在假单胞菌宿主细胞中从lac启动子表达克立他酶。
可用于实践本文中的方法的表达构建体除蛋白质编码序列外，还包含与该蛋白质编码序列可操作地连接的调控元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子以及翻译起始信号和终止信号。
假单胞菌和密切相关的细菌一般是定义为“革兰氏(-)变形菌亚群1”或“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”(《伯杰氏系统古细菌和细菌手册(Bergey′s Manual of Systematicsof Archaea and Bacteria)》(在线公开，2015))的群组的一部分。假单胞菌宿主菌株描述于以上引用的文献中，例如美国专利申请公开第2006/0040352号中。
“革兰氏阴性变形菌亚群1”还包含变形菌，所述细菌在此标题中根据分类中使用的标准进行分类。根据《伯杰氏系统古细菌和细菌手册》(在线公开，2015)中所定义，标题还包含先前在这一节中分类但不再分类的群组，例如食酸菌属(Acidovorax)、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、大洋单胞菌属(Oceanimonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(以及由其衍生的芽单胞菌属(Blastomonas))，该细菌属是通过对属于黄单胞菌属(Xanthomonas)(以及先前称为其菌种)的生物体重分组而产生；酸单胞菌属(Acidomonas)，该细菌属是通过对属于醋杆菌属(Acetobacter)的生物体重分组而产生。此外，宿主还包含来自假单胞菌属(Pseudomonas)海洋假单胞菌(Pseudomonas enalia)(ATCC 14393)、产黑假单胞菌(Pseudomonasnigrifaciensi)(ATCC 19375)和腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)的细胞，这些假单胞菌分别重分类为游海交替单胞菌(Alteromonas haloplanktis)、产黑交替单胞菌(Alteromonas nigrifaciens)和腐败交替单胞菌(Alteromonasputrefaciens)。类似地，例如，食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)自此分别重分类为食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；并且产黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和杀鱼假单胞菌(Pseudomonaspiscicida)(ATCC 15057)分别重分类为产黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)和杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)。“革兰氏阴性变形菌亚群1”还包含分类为属于以下任一科的变形菌：假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、固氮菌科(Azotobacteraceae)(现通常以同义词假单胞菌科的“固氮菌群”称呼)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)和甲基单胞菌科(Methylomonadaceae)(现通常以同义词“甲基球菌科(Methylococcaceae)”称呼)。因此，除本文另外所描述的菌属外，属于“革兰氏阴性变形菌亚群1”的其它变形菌包含：1)嗜氮根瘤菌属(Azorhizophilus)固氮菌群细菌；2)纤维弧菌属(Cellvibrio)、寡养杆菌属(Oligella)和船蛆杆菌属(Teredinibacter)的假单胞菌科细菌；3)螯合杆菌属(Chelatobacter)、剑菌属(Ensifer)、韧皮杆菌属(Liberibacter)(又称为“柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter)”)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的根瘤菌科细菌；及4)甲基杆菌属(Methylobacter)、喜热嗜甲基菌属(Methylocaldum)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)和甲烷球形菌属(Methylosphaera)的甲基球菌科(Methylococcaceae)细菌。
在一些情况下，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群16”。“革兰氏阴性变形菌亚群16”定义为以下假单胞菌属的变形菌群(例示性菌株的ATCC或其它保藏号显示于括号中)：冷杉假单胞菌(Pseudomonas abietaniphila)(ATCC 700689)；铜绿假单胞菌(ATCC10145)；产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)(ATCC 33660)；香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronellolis)(ATCC 13674)；荧光假单胞菌(ATCC 51555)；门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411)；硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)(ATCC 33634)；食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)(ATCC 8062)；假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoakaligenes)(ATCC 17440)；食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)(ATCC 14235)；稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)(ATCC 33636)；伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941)；嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)；褐藻胶假单胞菌(Pseudomonas alginovora)；安氏假单胞菌(Pseudomonas andersonii)；无脾假单胞菌(Pseudomonas asplenii)(ATCC 23835)；壬二酸假单胞菌(Pseudomonas azelaica)(ATCC 27162)；拜氏假单胞菌(Pseudomonasbeyerinckii)(ATCC 19372)；北方假单胞菌(Pseudomonas borealis)(ATCC 33662)；油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)；食丁酸假单胞菌(Pseudomonas butanovora)(ATCC 43655)；纤维素假单胞菌(Pseudomonas cellulosa)(ATCC 55703)；桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446、ATCC 13985、ATCC 17418、ATCC 17461)；脆弱假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)；隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683)；青紫葛假单胞菌(Pseudomonas cissicola)(ATCC 33616)；晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)；二萜降解性假单胞菌(Pseudomonas diterpeniphila)；伸长假单胞菌(Pseudomonas elongata)(ATCC 10144)；弯曲假单胞菌(Pseudomonas flectens)(ATCC 12775)；产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)；布氏假单胞菌(Pseudomonas brenneri)；雪松假单胞菌(Pseudomonascedrella)；起皱假单胞菌(Pseudomonas corrugata)(ATCC 29736)；远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)；荧光假单胞菌(ATCC 35858)；盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)；黎巴嫩假单胞菌(Pseudomonas libanensis)；孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)(ATCC 700871)；边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)(ATCC10844)；米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)；霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)(ATCC 4685)；东方假单胞菌(Pseudomonas orientalis)；霍氏假单胞菌(Pseudomonasrhodesiae)；类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)(ATCC 9890)；托拉假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618)；维氏假单胞菌(Pseudomonas veronii)(ATCC700474)；弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)；弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374)；姜黄色假单胞菌(Pseudomonas gingeri)；草假单胞菌(Pseudomonas graminis)；格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)；盐脱氮假单胞菌(Pseudomonas halodenitrificans)；嗜盐假单胞菌(Pseudomonas halophila)；栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)(ATCC 19867)；哈特假单胞菌(Pseudomonashuttiensis)(ATCC 14670)；噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)；杰氏假单胞菌(Pseudomonas jessenii)(ATCC 700870)；基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)；柳叶刀假单胞菌(Pseudomonas lanceolata)(ATCC 14669)；亚麻假单胞菌(Pseudomonaslini)；划界假单胞菌(Pseudomonas marginata)(ATCC 25417)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas mephitica)(ATCC 33665)；脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(ATCC 19244)；穿孔素假单胞菌(Pseudomonaspertucinogena)(ATCC 190)；形象假单胞菌(Pseudomonaspictorum)(ATCC 23328)；嗜冷假单胞菌(Pseudomonaspsychrophila)；黄褐色假单胞菌(Pseudomonas filva)(ATCC 31418)；蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)(ATCC 700476)；摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)；稻皮假单胞菌(Pseudomonasoryzihabitans)(ATCC 43272)；杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)(ATCC700383)；恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(ATCC 12633)；反应假单胞菌(Pseudomonasreactans)；多刺假单胞菌(Pseudomonas spinosa)(ATCC 14606)；巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)；浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)(ATCC 43273)；施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；杏仁核假单胞菌(Pseudomonas amygdali)(ATCC 33614)；丁香假单胞菌(Pseudomonas avellanae)(ATCC 700331)；番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapayae)(ATCC 33615)；菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857)；天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)(ATCC 35104)；褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)；苦楝假单胞菌(Pseudomonas meliae)(ATCC 33050)；丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310)；浅绿黄假单胞菌(Pseudomonasviridiflava)(ATCC 13223)；好热嗜一氧化碳假单胞菌(Pseudomonasthermocarboxydovorans)(ATCC 35961)；耐热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)；赛维瓦尔假单胞菌(Pseudomonas thivervalensis)；温哥华假单胞菌(Pseudomonasvancouverensis)(ATCC 700688)；威斯康辛假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)；及厦门假单胞菌(Pseudomonas xiamenensis)。在一个实施例中，用于表达克立他酶的宿主细胞是荧光假单胞菌。
在一些情况下，宿主细胞选自“革兰氏阴性变形菌亚群17”。“革兰氏阴性变形菌亚群17”定义为本领域中已知为“荧光假单胞菌”的变形菌群，包含例如属于以下假单胞菌属菌种的那些：产氮假单胞菌；布氏假单胞菌；雪松假单胞菌；松柏假单胞菌(Pseudomonascedrina)；起皱假单胞菌；远东假单胞菌；荧光假单胞菌；盖氏假单胞菌；黎巴嫩假单胞菌；孟氏假单胞菌；边缘假单胞菌；米氏假单胞菌；霉味假单胞菌；东方假单胞菌；霍氏假单胞菌；类黄假单胞菌；托拉假单胞菌；及维氏假单胞菌。
在实施例中，在本发明的方法中，可用于表达电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的宿主菌株是具有蛋白酶缺陷或失活(由例如缺失、部分缺失或基因剔除引起)和/或过度表达折叠调节剂(例如由质粒或细菌染色体引起)的假单胞菌宿主菌株，例如荧光假单胞菌。在实施例中，宿主菌株表达营养缺陷型标志物pyrF和proC，并且具有蛋白酶缺陷和/或过度表达折叠调节剂。在实施例中，宿主菌株表达本领域中已知的任何其它适合的选择标志物。在上述实施例中的任一个中，天冬酰胺酶，例如天然I型和/或II型天冬酰胺酶，在宿主菌株中失活。在一个实施例中，本文中的方法包括由构建体表达重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白，所述构建体已在感兴趣菌株中针对密码子使用优化。在实施例中，菌株是假单胞菌宿主细胞，例如荧光假单胞菌。用于优化密码子以改善细菌宿主中的表达的方法是本领域中已知的并且在文献中有描述。
可用于本文中的方法中的培养条件通常包括约4℃至约42℃的温度和约5.7至约8.8的pH值。当使用具有lacZ启动子或其衍生物的表达构建体时，通常通过将IPTG添加至培养物中达到约0.01mM至约1.0mM的最终浓度来诱导表达。II.电荷屏蔽蛋白
如本文中别处所描述，通常在表达构建体中使用诱导型启动子以控制重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的表达，例如lac启动子。在lac启动子衍生物或家族成员，例如tac启动子的情况下，效应化合物是诱导剂，例如安慰性诱导剂，如IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷，又称为“异丙基硫代半乳糖苷”)。在实施例中，使用lac启动子衍生物，并且当细胞密度达到了利用OD575鉴别为约25至约160的水平时，通过添加IPTG达到约0.01mM至约1.0mM最终浓度来诱导电荷屏蔽克立他酶融合蛋白表达。
在添加诱导剂之后，通常使培养物生长一段时间，例如约24小时，在此期间，表达重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白。在添加诱导剂之后，通常使培养物生长约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时或约48小时。在将诱导剂添加至培养物中之后，使培养物生长约1至48小时、约1至24小时、约10至24小时、约15至24小时或约20至24小时。通常通过离心对细胞培养物进行浓缩，并将培养物沉淀再悬浮于适合后续裂解程序的缓冲液或溶液中。
在实施例中，使用进行高压机械细胞破坏的设备(该设备是可商购的，例如Microfluidics Microfluidizer、Constant Cell Disruptor、Niro-Soavi匀浆机或APV-Gaulin匀浆机)破坏细胞。通常，使用例如声波处理来破坏表达电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的细胞。通常使用本领域中已知用于裂解细胞的任何适当方法释放可溶部分。例如，在实施例中，通常使用化学和/或酶促细胞裂解试剂，例如细胞壁裂解酶和EDTA。使用冷冻或先前储存的培养物也涵盖在本文中的方法中。在裂解之前，有时会对培养物进行OD归一化。例如，通常针对约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20的OD600将细胞归一化。
使用任何适当的设备和方法执行离心。对细胞培养物或裂解物或周质释放物进行离心以将可溶性部分与不溶性部分分离是本领域中众所周知的。例如，有时将裂解的细胞以20,800×g离心20分钟(4℃)，并使用人工或自动液体处理来去除上清液。将沉淀(不溶性)部分再悬浮于缓冲溶液，例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通常，使用例如连接至顶置式混合器的叶轮、磁性搅拌棒、摇摆振荡器等设备进行再悬浮。
在一个实施例中，将发酵用于产生重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的方法中。将根据本公开的表达系统以任何发酵型式培养。例如，在本文中可采用分批、分批补料、半连续和连续发酵模式。在实施例中，发酵培养基可选自完全培养基、基本培养基和矿物盐培养基。在其它实施例中，选择基本培养基或矿物盐培养基。在某些实施例中，选择矿物盐培养基。
发酵可以按任何规模执行。根据本公开的表达系统可用于以任何规模进行的重组蛋白表达。因此，例如，可使用微升规模、毫升规模、厘升规模和分升规模的发酵体积，并且通常使用1升和更大规模的发酵体积。
在实施例中，使用本文中的方法获得约1％至约70％总细胞蛋白质的可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白，例如单体或四聚体的产率。在某些实施例中，可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产率是约1％总细胞蛋白质、约2％总细胞蛋白质、约3％总细胞蛋白质、约4％总细胞蛋白质、约5％总细胞蛋白质、约8％总细胞蛋白质、约10％总细胞蛋白质、约15％总细胞蛋白质、约20％总细胞蛋白质、约25％总细胞蛋白质、约30％总细胞蛋白质、约35％总细胞蛋白质、约40％总细胞蛋白质、约41％总细胞蛋白质、约42％总细胞蛋白质、约43％总细胞蛋白质、约44％总细胞蛋白质、约45％总细胞蛋白质、约46％总细胞蛋白质、约47％总细胞蛋白质、约48％总细胞蛋白质、约49％总细胞蛋白质、约50％总细胞蛋白质、约51％总细胞蛋白质、约52％总细胞蛋白质、约53％总细胞蛋白质、约54％总细胞蛋白质、约55％总细胞蛋白质、约56％总细胞蛋白质、约57％总细胞蛋白质、约58％总细胞蛋白质、约59％总细胞蛋白质、约60％总细胞蛋白质、约65％总细胞蛋白质、约70％总细胞蛋白质、约75％总细胞蛋白质、约80％总细胞蛋白质、约85％总细胞蛋白质或约90％总细胞蛋白质。
在一些实施例中，可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产率是约1％至约70％总细胞蛋白质、约1％至约50％总细胞蛋白质、约1％至约20％总细胞蛋白质、约1％至约10％总细胞蛋白质、约1％至约5％总细胞蛋白质、约1％至约3％总细胞蛋白质、约20％至约55％总细胞蛋白质、约20％至约60％总细胞蛋白质、约20％至约65％总细胞蛋白质、约20％至约70％总细胞蛋白质、约20％至约75％总细胞蛋白质、约20％至约80％总细胞蛋白质、约20％至约85％总细胞蛋白质、约20％至约90％总细胞蛋白质、约25％至约90％总细胞蛋白质、约30％至约90％总细胞蛋白质、约35％至约90％总细胞蛋白质、约40％至约90％总细胞蛋白质、约45％至约90％总细胞蛋白质、约50％至约90％总细胞蛋白质、约55％至约90％总细胞蛋白质、约60％至约90％总细胞蛋白质、约65％至约90％总细胞蛋白质、约70％至约90％总细胞蛋白质、约75％至约90％总细胞蛋白质、约80％至约90％总细胞蛋白质、约85％至约90％总细胞蛋白质、约1％至约5％总细胞蛋白质、约2％至约5％总细胞蛋白质、约5％至约10％总细胞蛋白质、约20％至约35％总细胞蛋白质、约20％至约30％总细胞蛋白质或约20％至约25％总细胞蛋白质。在一些实施例中，可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产率是约20％至约40％总细胞蛋白质。
在实施例中，使用本文中的方法获得约1克/升至约50克/升的可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白，例如单体或四聚体产量。在某些实施例中，可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产量是约0.25克/升、约0.5克/升、约1克/升、约2克/升、约3克/升、约4克/升、约5克/升、约6克/升、约7克/升、约8克/升、约9克/升、约10克/升、约11克/升、约12克/升、约13克/升、约14克/升、约15克/升、约16克/升、约17克/升、约18克/升、约19克/升、约20克/升、约21克/升、约22克/升、约23克/升、约24克/升、约25克/升、约26克/升、约27克/升、约28克/升、约30克/升、约35克/升、约40克/升、约45克/升、约50克/升。
在一些实施例中，可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产量是约0.1至约6克/升、约0.25至约4克/升、约0.5至约2克/升、约1克/升至约5克/升、约0.75克/升至约10克/升、约0.75克/升至约3克/升、约0.75克/升至约2克/升、约0.75克/升至约1.5克/升、约0.5克/升至约15克/升、约0.5克/升至约10克/升、约0.5克/升至约8克/升、约0.5克/升至约6克/升、约0.5克/升至约6克/升、约0.1克/升至约20克/升、约0.1克/升至约10克/升、约0.1克/升至约8克/升、约0.1克/升至约5克/升、约0.1克/升至约3克/升、约0.1克/升至约25克/升至约25克/升或约24克/升至约25克/升。
在实施例中，在类似或大体上类似的条件下获得的胞质产生的可溶性重组克立他酶与周质产生的可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产量比是约1至约5。在实施例中，在类似或大体上类似的条件下获得的胞质产生的可溶性重组克立他酶融合蛋白与周质产生的可溶性重组电荷屏蔽克立他酶融合蛋白的产量比是至少约1。
V.电荷屏蔽重组大肠杆菌天冬酰胺融合蛋白的产生
本领域的技术人员应理解，可用于本发明的方法中的生产宿主菌株可使用本领域中已知以及在文献中描述的许多适当方法中的任一种，使用可公开获得的宿主细胞，例如荧光假单胞菌MB101，例如通过使pyrF基因和/或I型L-天冬酰胺酶基因和/或II型L-天冬酰胺酶基因失活来产生。还应理解，可使用本领域中已知以及文献中描述的许多适当方法中的任一种，将原养恢复质粒转化至菌株中，例如携带来自菌株MB214的pyrF基因的质粒。此外，在此类菌株中，可使用本领域中众所周知的方法使蛋白酶失活并引入折叠调节剂过度表达构建体。
在实施例中，在本发明的方法中，可用于表达天冬酰胺酶，例如大肠杆菌II型天冬酰胺酶的宿主菌株是具有蛋白酶缺陷或失活(由例如缺失、部分缺失或基因剔除引起)和/或过度表达折叠调节剂(例如由质粒或细菌染色体引起)的假单胞菌宿主菌株，例如荧光假单胞菌。在任何实施例中，宿主菌株表达营养缺陷型标志物pyrF和proC，并且具有蛋白酶缺陷和/或过度表达折叠调节剂。在实施例中，宿主菌株表达本领域中已知的任何其它适合的选择标志物。在上述实施例中的任一个中，天冬酰胺酶，例如天然I型和/或II型天冬酰胺酶，在宿主菌株中失活。
如本文中别处所描述，通常使用诱导型启动子表达构建体中以控制重组天冬酰胺酶的表达，例如lac启动子。在lac启动子衍生物或家族成员，例如tac启动子的情况下，效应化合物是诱导剂，例如安慰性诱导剂，如IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷，又称为“异丙基硫代半乳糖苷”)。在实施例中，使用lac启动子衍生物，并且当细胞密度达到了利用OD575鉴别为约25至约160的水平时，通过添加IPTG达到约0.01mM至约1.0mM最终浓度来诱导天冬酰胺酶表达。
在实施例中，使用进行高压机械细胞破坏的设备(该设备是可商购的，例如Microfluidics Microfluidizer、Constant Cell Disruptor、Niro-Soavi匀浆机或APV-Gaulin匀浆机)破坏细胞。通常，使用例如声波处理来破坏表达天冬酰胺酶的细胞。通常使用本领域中已知用于裂解细胞的任何适当方法释放可溶部分。例如，在实施例中，通常使用化学和/或酶促细胞裂解试剂，例如细胞壁裂解酶和EDTA。使用冷冻或先前储存的培养物也涵盖在本文中的方法中。在裂解之前，有时会对培养物进行OD归一化。例如，通常针对约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20的OD600将细胞归一化。
VI.包括电荷屏蔽蛋白的组合物
本文还提供了包括电荷屏蔽蛋白的组合物。在一些实施例中，所述组合物是药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包括电荷屏蔽蛋白和一种或多种药学上可接受的载体。
适合的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的实例是本领域中众所周知的，并且包含磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括此类载体的组合物可以通过众所周知的常规方法配制。适合的载体可包括当与本发明的生物活性蛋白质组合时保留生物活性蛋白质的生物活性的任何材料(参见《雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》(1980)第16版，Osol，A.编)。供肠胃外施用的制剂可包含无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。在药物组合物的情形中采用的缓冲液、溶剂和/或赋形剂优选地是如上文所定义的“生理上”的。非水性溶剂的实例是丙二醇；聚乙二醇；植物油，如橄榄油；以及可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包含水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包含盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂可包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer′s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或非挥发性油。静脉内媒剂可包含流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，包含例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。另外，本发明的药物组合物可以包含蛋白质载体，如例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人类来源的。
在一些实施例中，本文提供了一种组合物，该组合物包括电荷屏蔽蛋白，在第一疏水相互作用色谱柱之后纯化的蛋白质具有至多、超过或约80％、约85％、约90％或约95％的纯度。
在一些实施例中，本文提供一种组合物，该组合物包括至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯度的电荷屏蔽蛋白。
在一些实施例中，所述组合物包括至少1mg/mL浓度的电荷屏蔽蛋白。在一些实施例中，所述组合物包括至少5mg/mL、至少10mg/mL、至少20mg/mL、至少50mg/mL、至少100mg/mL或至少300mg/mL浓度的电荷屏蔽蛋白。在一些实施例中，所述组合物包括1至50mg/mL浓度的电荷屏蔽蛋白。
VI.治疗方法
在一些实施例中，本文提供了治疗个体的方法，所述方法包括向有需要的个体施用包括电荷屏蔽蛋白的组合物。在一些实施例中，个体患有癌症或赘生性疾病。在一些实施例中，个体患有白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施例中，个体患有急性成淋巴细胞性淋巴瘤。在一些实施例中，疾病是代谢疾病。在一些实施例中，疾病是激素缺乏相关病症、自身免疫疾病、癌症、贫血、新生血管疾病、感染性/炎症性疾病、血栓形成、心肌梗塞或糖尿病。
实例
通过参考以下实例，将更全面地理解本发明。然而，以下实例不应被解释为限制本发明的范围。应理解，本文所描述的实例和实施例仅出于说明目的，并且本领域的技术人员据此将想到各种修改或变化并且这些修改或变化都包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。
实例1.使用离子交换色谱作为捕获步骤进行的PAS化天冬酰胺酶的表达和纯化
本实例展示由周质释放物进行的电荷屏蔽PAS化天冬酰胺酶融合蛋白(例如PF745)的表达。
已成功地表达重组克立他酶(RC)(来自菊欧文氏菌的天冬酰胺酶)，该RC在其氨基末端以基因方式与完全由脯氨酸和丙氨酸残基构成的200个氨基酸的多肽序列(PA200)融合。PA200融合搭配物是由XL-Protein GmbH使用其专有技术设计，该技术通过应用固有无序蛋白作为聚乙二醇化的生物替代物来延长生物药物的半衰期。在荧光假单胞菌中表达PA200-RC融合蛋白以产生符合指定纯度和效力目标的重组PA200-RC融合蛋白。
所述融合蛋白命名为PF745，并通过在荧光假单胞菌中克隆PA200-RC DNA融合物来起始构建。以96孔规模初始筛选1,040个表达菌株展示出，可溶性PA200-RC蛋白质单体得到成功表达。根据在多种发酵诱导条件下可溶性单体的高效价表达、可再现的低N末端截短型式(＜2％)以及由同一性、活性和纯度方法得到的结果，选择菌株STR58751(表达位于周质中的PA200-RC蛋白质)来产生PF745。由于在菌株工程改造期间周质表达菌株的选择，表达PF745并通过渗透提取使其从细胞释放。对渗透提取进行优化以使细胞中产物的释放达到最大，同时使宿主细胞污染物(例如宿主细胞蛋白(HCP))释放减到最少。
作为第一个色谱捕获步骤，努力通过离子交换色谱(IEX)从周质释放物中捕获PF745。
在通过渗透冲击从STR58751提取出PF745之后，执行阴离子交换色谱(AEX)。将提取物调至pH 9和0.8mS/cm的电导率，并将其以0.82g糊料/mL树脂的上样比率上样至POROS50 HQ AEX柱上，以流过模式操作。然而，在部分6A1(图1的泳道14)中观察到HCP的穿透，表明当作为初始纯化步骤执行时，AEX不能充分富集靶标蛋白(例如电荷屏蔽融合蛋白，PF745)。
使用CEX作为主要捕获/纯化步骤从胞质表达菌株中捕获PF745的尝试也不成功，并且因此，不尝试使用渗透冲击由STR58751进行这一方法。与作为第二柱的CEX结合也是不可接受的，这表明将其用作捕获步骤，在甚至比第二柱更高水平的HCP污染物存在下，也无法成功富集靶标。
AEX和CEX捕获步骤均显示无捕获或显示出极低的结合载量。这表明，屏蔽PA200部分将有效地掩蔽PF745上的电荷。
实例2.依序使用尺寸排阻色谱和CEX纯化PF745
将由STR58751得到的周质提取物调至2M硫酸铵，并上样至SephacrylS500树脂上进行尺寸排阻色谱(SEC)。将含有靶标分子的流过部分汇集起来，并使用100kDa浓缩器装置浓缩，将浓缩的池调至0.5mS/cm树脂并以结合和洗脱模式上样至POROS XS阳离子变化树脂上。观察到靶标的结合(参见部分A6-B4，图2的泳道6-16)，但结合载量较低，并且在流过部分(泳道3，图2的FT)中观察到大部分靶标。上样部分和流过部分的体积大致相同，并取相等体积(16μL)上样至SDS-PAGE凝胶上。经光密度测定法确定，上样部分中的靶标蛋白的纯度是53.5％，而流过部分中的靶标蛋白的纯度是52.9％，表明大部分PF745蛋白质不与CEX柱结合并保留在流过部分中。
这些结果表明，CEX捕获电荷屏蔽融合蛋白(例如PF745)需要较高的上样部分纯度。
实例3.电荷屏蔽融合蛋白的表达和纯化
本实例展示周质释放物中电荷屏蔽融合蛋白(例如PF745)的成功纯化。具体点说，本实例展示依序使用疏水相互作用色谱(HIC)、阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)增加来自周质释放物的PF745的纯度。
疏水相互作用色谱
测试六种HIC树脂。Toyopearl Butyl-650M展示高结合载量和可接受的纯度，并因此用作例示性HIC柱。将渗透提取物调至2.5M NaCl，其最终电导率是178±15mS/cm，并且pH值是6.0±0.2。将调整后的周质释放物过滤并以≤0.17g糊料/mL树脂的上样比率立即上样至Toyopearl Butyl-650M捕获柱上。
为了获得足够蛋白质，这一捕获柱在每一操作中循环8-10次，总计26次。该柱一致地产生8-9mg PF745/g上样糊料(利用A279测量)，经RP-HPLC和SE-HPLC测量，其纯度值分别为约75％和60％。由使用Butyl-650M树脂的代表性HIC步骤得到的SDS-CGE图像示于图3中，展示了由这一捕获步骤提供的纯化。
阴离子交换色谱
使用AEX色谱步骤进一步纯化在HIC之后由超过滤/透滤(UF/DF)1回收的浓缩物以确定是否能增加纯度。使用POROS HQ树脂作为例示性AEX树脂。为了降低潜在脱酰胺的风险，在即将上样于POROS HQ柱上之前，将UF/DF 1回收的浓缩物调至9.0±0.2的pH值。类似地，在完成POROS HQ色谱步骤后，也立即将收集的流出物和洗涤液池调至6.0±0.2的pH值。
将各批料循环4到6次以加工所有材料，但上样比率不超过5mg PF745/mL树脂。尽管进行了柱循环，但色谱图指示，AEX色谱是一致且可再现的。此外，所有操作都产生22-25％的一致AEX步骤产率(图4)。尽管这一产率看起来很低，但这更能表明杂质被去除，而非产物损失。通过将剥离部分峰的面积与流出物+洗涤产物峰的面积相比较，将很容易地见到这一点。此外，在这一AEX步骤之后，根据分别增加至90％和80％的RP-HPLC和SE-HPLC值，观察到杂质去除的进一步证据。最后，所有AEX洗出液的HCP含量减少至低于120ppm，由此确证样本愈来愈纯的HPLC结果。
因此，在HIC步骤之后，AEX步骤一致地良好执行并去除大量杂质。
阳离子交换色谱
使用CEX色谱步骤纯化从UF/DF 2步骤回收的浓缩物以测试是否能进一步增加纯度。使用POROS XS作为例示性CEX树脂。各批料需要CEX步骤循环3到6次以加工所有材料，但上样比率不超过5mg PF745/mL树脂。尽管进行了柱循环，但色谱图指示，CEX色谱是一致且可再现的。
此外，所有操作均产生48-54％的一致CEX步骤回收率，并且经RP-HPLC和SE-HPLC确定，产物纯度分别超过94％和100％。CGE分析进一步证实这些纯度值，由此显示PF745有效地与上样材料中剩余的杂质分离，产生高纯度洗出液(图5)。最后，所有CEX洗出液的HCP含量都低于3ppm，由此确证高度纯样本的HPLC结果。
因此，在HIC和AEX色谱步骤之后，CEX步骤一致地良好执行并去除大量的杂质，产生超出目标纯度值的材料，使得纯度增加至甚至更大的程度。
结论
依序进行HIC、AEX色谱和CEX色谱步骤能够可靠地用于从周质释放物中高效纯化出电荷屏蔽蛋白，例如PF745。
实例4.用于PAS化天冬酰胺酶纯化的疏水相互作用色谱
本实例展示用于从周质释放物中纯化出电荷屏蔽融合蛋白的疏水相互作用色谱(HIC)方法。具体点说，本实例展示HIC树脂筛选以及使用HIC富集靶标电荷屏蔽融合蛋白。
如所描述的，由于在菌株工程改造期间选出周质表达菌株，表达PF745(一种PAS化天冬酰胺酶)并通过渗透提取使其从细胞释放。在从细胞释放材料并澄清之后，使用疏水相互作用色谱(HIC)测试捕获物。
树脂
执行基于板的树脂筛选以展示十三种疏水相互作用树脂(表1)使用96孔滤板(Agilent，目录号200957-100)和Biosero自动化系统实现了结合/洗脱或流出物纯化的回收，该Biosero自动系统包含Tecan Freedom Evo 200液体处理系统和Bionex HiG4自动离心机。
表1.可以用于第一个色谱步骤的疏水相互作用色谱树脂
树脂 制造商 目录号
POROS Benzyl Ultra Thermo Scientific A32569
POROS Benzyl Thermo Scientific A32563
Hexyl-650C Tosoh Bioscience 0019026
Capto Phenyl(高取代) GE Healthcare 17-5451-02
Butyl-650M Tosoh Bioscience 0019802
Phenyl-600M Tosoh Bioscience 0021888
Capto Phenyl ImpRes GE Healthcare 17-5484-03
Phenyl Sepharose HP GE Healthcare 17-1082-01
Octyl Sepharose 4FF GE Healthcare 17-0946-02
Capto Octyl GE Healthcare 17-5465-02
PPG-600M Tosoh Bioscience 0021301
POROS Ethyl Thermo Scientific A32557
为了制备树脂板，用Tecan将50uL的各树脂的50％浆液移液至96孔板各孔中，达到每孔目标25μL树脂。制备高疏水树脂板，其中每行一种树脂，从最高至最低疏水性，遵循以下次序：Benzyl Ultra、Benzyl、Hexyl-650C、Capto Phenyl、Butyl-650M、Phenyl-600M、Capto Phenyl ImpRes和Phenyl Sepharose HP。制备低疏水性树脂板，其中每行一种树脂，从最高至最低疏水性，遵循以下次序：Octyl Sepharose 4 FF、Capto Octyl、PPG-600M、Ethyl和Butyl-650M。
对所述板离心以使浆液液体滤过。表2包含色谱步骤，所述步骤以用水剥离树脂开始。在每个移液循环之后，对所述板离心。接着，将树脂用对应的平衡缓冲液平衡。用掺加稳液剂的溶液将由渗透冲击和超过滤/透滤(UF/DF)1得到的PF745中间物调至与平衡缓冲液对应的稳液剂浓度。接着，用相应的平衡缓冲液将经过调整的PF745中间物稀释至相当于每毫升溶液167mg糊料，并通过Sartobran P 0.45/0.2μm过滤器过滤。上样150μL(以1g糊料/mL树脂为目标)之后，收集滤液用于流出物评估。以类似方式将洗涤和洗脱滤液收集于单独板中。通过SDS-CGE分析流出物和洗脱物。
表2.用于树脂筛选的色谱步骤
图6显示，根据流出物中存在极少可检测的PF745谱带所证实，四种树脂(BenzylUltra、Hexyl-650C、Phenyl-600M和Capto Phenyl ImpRes)在大多数条件下结合靶标。所有树脂均展示与0.25M硫酸钠结合不良。在PF745不结合的情况下，流出物未展示出相对于上样部分明显改善的纯度。
基于流出物鉴别为具有最高结合的树脂也展示出最佳的洗脱回收率：BenzylUltra、Hexyl-650C、Phenyl-600M和Capto Phenyl ImpRes(图7)。产生最佳回收率的结合条件是0.5M硫酸铵(一式三份，图中的“B”柱)。除期望的回收率外，洗脱液还显示SDS-CGE纯度明显增加，这是由低分子量(LMW)谱带减小证实的。
相比之下，低疏水性树脂在0.25M硫酸钠和0.5M硫酸铵中均结合少量PF745，这是根据在这些条件下流出物中的PF745谱带证实的(图8)；此外，PF745与杂质未分离。大多数条件产生低回收率(图9)。仅3M NaCl上样部分与PPG或Butyl-650M树脂的组合产生明显可见的谱带。
利用相同上样材料和每毫升树脂约6g糊料的上样要求(challenge)，以6.1-7.5mL柱规模测试Benzyl Ultra、Hexyl-650C、Phenyl-600M和Capto Phenyl ImpRes。通过在Phenyl-600M上操作得到的SDS-CGE图像展示，PF745在洗脱梯度早期富集(部分1A6-1B5，图10)，并与在该梯度后期洗脱的杂质(主要在16至68kDa之间)分离；测得上样部分纯度为约1％，与洗脱部分中50-75％的纯度形成比较(图10)。不收集上样部分流出物，但低流量和高流量洗涤部分指示在上样快结束时有极少穿透物(breakthrough)，表明上样的大部分PF745已结合。
表3示出洗脱产量和纯度。Phenyl-600M显示出最高效的捕获特性。
表3.可以用于第一个色谱步骤的HIC捕获树脂的洗脱产量和纯度
在初始Phenyl-600M和Benzyl Ultra动态结合载量(DBC)试验中，相较于Phenyl-600M，在Benzyl Ultra流出物中较早观察到明显穿透。Phenyl-600M展示的结合相当于每毫升树脂约9.7g糊料。Phenyl-600M显示高出30％的结合载量。
对于使用例示性Phenyl-600M HIC树脂进行PF745的HIC纯化有效的条件包含0.60M硫酸铵上样最大化树脂载量。此类洗脱硫酸铵浓度维持在0.40M硫酸铵(60-75mS/cm)以提供高靶标回收率。上样和洗脱pH值设置为5.9±0.1，并一致地捕获PF745材料，并在单一HIC捕获步骤之后提供40-60％的SDS-CGE纯度。
最后，基于若干因素(例如1)EQ、上样、洗涤和洗脱的pH值；2)EQ、上样、洗涤和洗脱的硫酸铵浓度；3)上样要求；及4)洗脱的硫酸铵浓度)，使用例示性Phenyl-600M树脂建立例示性HIC捕获方法。例示性HIC方法在表4中有简单描述，并且通过阶段、缓冲液/溶液、柱体积(CV)和低流动速率(cm/h)定义。
表4.使用Phenyl-600M的例示性HIC方法
结论
本实例显示，HIC色谱可以用作捕获步骤以从周质释放物中高效纯化电荷屏蔽蛋白，例如PF745，由此在单一色谱步骤(例如捕获步骤)之后获得超过90％纯度。
实例5.用于PAS化天冬酰胺酶纯化的阴离子交换色谱
本实例展示用于从细胞裂解物中纯化出电荷屏蔽融合蛋白的阴离子交换色谱(AEX)方法。
在第一个HIC色谱步骤之后，测试作为第二个色谱步骤的阴离子交换色谱。将五种AEX树脂(表5)填充于0.66Omnifit柱中进行初始筛选(PCE1245-1249)。
表5.可以用于第二个色谱步骤的阴离子交换色谱树脂
树脂 制造商 目录号
GigaCap Q 650M Tosoh Bioscience 0021855
Super Q-650M Tosoh Bioscience 0043205
NH2-750F Tosoh Bioscience 0023438
POROS 50 HQ Thermo Scientific 82078
POROS XQ Thermo Scientific 82074
图11显示，相较于POROS 50 HQ和NH2-750F的纯度(32.4-41.0％)，GigaCap Q-650M、POROS XQ和Super Q-650M流出物池具有明显较高的SDS-CGE纯度(65.6-68.2％)。来自全部五个操作的胶条(strip)不含任何可测量的PF745，表明靶标具有高回收率以及所有测试AEX树脂无非预期结合。相较于其它操作，POROS HQ和NH2-750F流出物池具有明显较高的HCP水平，这与较低的SDS-CGE纯度相符(图11)。Super Q-650M流出物池的HCP含量是来自GigaCap Q-650M和POROS XQ的池的＞5倍。GigaCap Q-650M和POROS XQ产生最高纯度和最低HCP。
基于流出物部分的SDS CGE积分(图11)，GigaCap Q-650M流出物实现比POROS XQ和POROS 50 HQ要高的纯度。后两种树脂的纯度通过上样而下降，而对于GigaCap Q-650M，纯度在上样时保持相对一致。流出物池实现类似的纯度结果，如表6中所示。因此，所有这些树脂均适用于第二个CEX色谱步骤中。
表6.来自可以用于第二个色谱步骤的树脂的流出物产物质量
在各操作之间未观察到RP-HPLC和SE-HPLC纯度的显著差异。GigaCap Q-650M展示在给定要求下维持SDS-CGE纯度和最低HCP测量水平的能力。
GigaCap Q-650M和POROS XQ在流出物部分的SDS-CGE纯度方面展示出类似的性能(图12)。相对于在＜60％下至多57mg/mL上样量的上样部分，两种树脂实现并维持高纯度。在上样转变为洗涤时，在14-16CV之间迅速下降的纯度是由较低的PF745浓度引起。GigaCapQ-650M树脂在整个上样过程中维持略微较高的SDS-CGE纯度，并且另外在先前实验中引起较低的HCP水平。
评估五种AEX树脂的筛选实验展示，GigaCap Q-650M实现高纯化性能。在通过AEX色谱进行的蛋白质纯化中有效的条件包含上样部分pH 9.0和1.0mS/cm，并且针对在2mg/mL与6mg/mL之间的上样部分浓度是稳健的。另外的实验展示，1.0mS/cm的上样部分电导率引起高产率，同时不会降低上样部分稳定性。适于AEX色谱的条件包含9.0±0.1的上样部分pH值、1.0±0.1mS/cm的上样部分电导率、2-6mg/mL的上样部分浓度、在pH 9下上样保持＜6小时的在6-25mg/mL之间的上样部分要求以及在6小时内滴定至pH 6.0±0.1的流出物。
使用这些条件纯化产生一致的回收率，并且流出物纯度经RP-HPLC测量为≥85％，经SEC-HPLC测量为≥80％，HCP水平＜1000ng/mg并且HCDNA水平＜500pg/mg。例示性AEX色谱步骤的代表性色谱绘示于图13中。
表7.使用GigaCap Q-650M的例示性AEX方法
为了最大限度地减少可能的脱酰胺，建议在即将上样进行AEX之前，将上样部分调至pH 9.0，并且在收集之后尽快将流出物调至pH 6.0。
结论
在初始HIC步骤之后，AEX色谱步骤提高电荷屏蔽蛋白PF745的纯度。
实例6.用于PAS化天冬酰胺酶纯化的阳离子交换色谱
本实例展示了作为第三个色谱步骤从细胞裂解物中纯化出电荷屏蔽融合蛋白(例如PF745)的阳离子交换色谱(CEX)方法。
在HIC和AEX色谱步骤之后，测试作为第三个色谱步骤用于PF745纯化的阳离子交换色谱。
树脂筛选
第三个色谱步骤中使用的CEX树脂示于表8中。
表8.可以用于第三个色谱步骤的阳离子交换色谱树脂
对四种混合模式树脂(Capto MMC、MX-Trp-650M、CMM HyperCel、Sulfate-650F)进行筛选以观察这些树脂在较高电导率(5-10mS/cm)下是否结合靶标(例如PF745)以获得较高分辨率和纯度。使用96孔滤板(Agilent，目录号200957-100)和Biosero自动系统执行流出物纯化，该Biosero自动系统包含Tecan Freedom Evo 200液体处理系统和Bionex HiG4自动离心机。图14显示经历四种不同混合模式树脂，由上样部分pH值和电导率的八种组合得到的流出物部分的SDS-CGE图像。Capto MMC在全部八种上样部分条件下不存在显著PF745谱带证实良好结合。CMM HyperCel展示类似性能，但在pH 5.7和20mS/cm下发生穿透。根据在≥5mS/cm下存在显著PF745谱带所证实，MX-TRP-650M和Sulfate-650F展示明显较低的结合载量。
在分批混合研究中评价作为第三柱候选物的四种另外的树脂(Capto Core 400、TOYOPEARL NH2-750F、CaPure-HA和TOYOPEARL PPG-600M)。Capto Core 400上样部分和流出物部分的SDS-CGE图像展示在任何条件下纯度均无明显增加(图15)。观察到LMW杂质(＜69kDa)的不充分结合。NH2-750F上样部分和流出物部分的SDS-CGE图像展示在任何测试条件下纯度均无明显增加(图16)。未观察到LMW杂质(＜69kDa)的结合。
图17显示通过分批混合得到的CaPure-HA部分的SDS-CGE图像。流出物未显示明显PF745谱带并且测量接近零浓度，指示良好结合。洗涤部分、洗脱部分和剥离部分中不存在PF745谱带表明，未回收到结合的PF745。利用UV确定浓度显示，洗脱部分中的回收率＜10％并且剥离部分中的回收率可忽略。
最后，图18显示PPG-600M部分的SDS-CGE图像。通过SDS CGE确定不存在谱带所证实，0.75M硫酸铵上样部分调整使PF745沉淀。0.25M硫酸铵上样部分条件的SDS-CGE积分产生49.6％的上样部分纯度，与流出物的55.1％形成比较；纯度的小幅增加可能是流出物部分中低浓度的假象，使得LMW谱带降到定量限以下。在0.25M硫酸铵上样条件的流出物部分中未观察到明显纯度提高。在0.5M硫酸铵上样下，流出物中低于上样部分的PF745谱带强度表明显著结合。洗涤部分中较强的强度表明，0.5M硫酸铵可能不会明显促进结合，并且转变到洗涤缓冲液以洗脱蛋白质。此外，PF745谱带存在于剥离部分中，表明利用0.5M硫酸铵上样部分条件很难实现良好回收率。
将三种树脂，即POROS XS、CMM HyperCel和Capto MMC填至0.66cm直径的柱中。在15mg/mL树脂要求下进行的动态结合载量(DBC)测试显示在色谱图或SDS-CGE结果中流出物无显著穿透。回收率很高(86％)并且RP-HPLC纯度与先前的结果一致(98.9％纯度)。这些结果支持上样至多15mg/mL蛋白质进行CEX色谱。应用20％的安全系数将上样要求限值设置在12mg/mL。混合模式和凝胶过滤树脂筛选实验展示使用POROS XS树脂的高效纯化。
当去除洗脱前洗涤步骤时，回收率提高20-30％，同时维持与利用洗脱前洗涤的操作相当的产物质量。CEX步骤，例如使用POROS XS树脂进行的CEX步骤明显提高RP-HPLC纯度和SDS-CGE纯度并降低HCP和HCDNA水平。
DBC操作鉴别出，上样部分要求可从5g/L增加至12g/L，并得到类似的纯化结果。使用POROS XS作为例示性柱的有效CEX色谱条件包含：1)上样部分电导率：1.0±0.1mS/cm(可通过UF/DF 3实现)；2)洗脱部分NaCl浓度：8.35±0.08mM；3)上样部分要求：≤12g/L；及4)上样部分浓度：≤6mg/mL。预期这些条件会产生≥70％的回收率、≥97％的RP-HPLC纯度和≥99％的SE-HPLC纯度。表9显示在UF/DF 3之后的例示性CEX色谱方法，如图21中所示。
表9.使用POROX XS的例示性CEX色谱方法
结论
在HIC步骤和AEX步骤之后进行CEX色谱步骤进一步提高电荷屏蔽蛋白PF745的纯度。
序列表
<110> 爵士制药爱尔兰有限公司（JAZZ PHARMACEUTICALS IRELAND LTD）
普芬克斯公司（Pfenex, Inc.）
<120> 纯化电荷屏蔽融合蛋白的方法
<130> 21046-20001.40
<140> 尚未转让
<141> 在此同时
<150> US 63/130,295
<151> 2020-12-23
<160> 10
<170> 适用于Window 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 327
<212> PRT
<213> 菊欧文氏菌
<400> 1
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
<210> 3
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
195 200
<210> 4
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
385 390 395 400
<210> 5
<211> 326
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 5
Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Ala Gly Lys Val Gly Val
20 25 30
Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn Val
35 40 45
Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Asp
50 55 60
Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys Thr
65 70 75 80
Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met Val
100 105 110
Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp Val
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn Tyr
165 170 175
Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Gln Arg Thr
180 185 190
Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys Leu
195 200 205
Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala Ser
210 215 220
Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Thr Val Phe Asp Thr
245 250 255
Leu Ala Thr Ala Ala Lys Asn Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser Arg
260 265 270
Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala Lys
275 280 285
Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg Val
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile Gln
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325
<210> 6
<211> 348
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 6
Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
50 55 60
Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn
85 90 95
Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp
100 105 110
Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser
130 135 140
Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr
180 185 190
Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro
210 215 220
Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
245 250 255
Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
260 265 270
Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
290 295 300
Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
305 310 315 320
Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
340 345
<210> 7
<211> 326
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 7
Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Val Gly Lys Val Gly Val
20 25 30
Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn Val
35 40 45
Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp Asn
50 55 60
Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys Thr
65 70 75 80
Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met Val
100 105 110
Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn Arg
130 135 140
Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp Val
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn Tyr
165 170 175
Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Ile Asp Tyr Gln Arg Thr
180 185 190
Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys Leu
195 200 205
Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala Ser
210 215 220
Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile Val
225 230 235 240
Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Ser Val Phe Asp Thr
245 250 255
Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser Arg
260 265 270
Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala Lys
275 280 285
Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg Val
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile Gln
305 310 315 320
Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325
<210> 8
<211> 327
<212> PRT
<213> 菊迪卡氏菌
<400> 8
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 9
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile
195 200 205
Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu
225 230 235 240
Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu
245 250 255
Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu
260 265 270
Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp
275 280 285
Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr
290 295 300
Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala
305 310 315 320
Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu
325 330 335
Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly
340 345 350
Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly
370 375 380
Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile
385 390 395 400
Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr
405 410 415
Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu
420 425 430
Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr
435 440 445
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met
450 455 460
Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr
465 470 475 480
Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser
485 490 495
Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu
500 505 510
Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
515 520 525
<210> 10
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
405 410 415
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
420 425 430
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys
435 440 445
Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu
450 455 460
Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu
465 470 475 480
Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
485 490 495
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
500 505 510
Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile
515 520 525
Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly
530 535 540
Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg
545 550 555 560
Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp
565 570 575
Thr Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn
580 585 590
Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
595 600 605
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
610 615 620
Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
625 630 635 640
His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val
645 650 655
Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val
660 665 670
Val Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
675 680 685
Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
690 695 700
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
705 710 715 720
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
725

Claims (41)

1.一种从细胞裂解物或周质释放物中纯化出电荷屏蔽融合蛋白的方法，其中所述电荷屏蔽融合蛋白包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域，并且其中所述方法包括疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤。
2.一种用于由细胞裂解物或周质释放物产生电荷屏蔽融合蛋白的方法，其中所述电荷屏蔽融合蛋白包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域，其中所述方法包括
i)培养细胞，所述细胞包括编码所述电荷屏蔽融合蛋白的核酸；并且
ii)纯化所述电荷屏蔽融合蛋白，其中所述电荷屏蔽蛋白是使用疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤从所述细胞裂解物或周质释放物中纯化的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述第一个色谱步骤之后，所述电荷屏蔽融合蛋白是至少45％纯的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括阴离子交换色谱。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括阳离子交换色谱。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法包括一系列色谱步骤，所述步骤依序包括：
i)疏水相互作用色谱；
ii)阴离子交换色谱；以及
iii)阳离子交换色谱。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述生物活性结构域在约pH 7.0下带电，其中所述电荷屏蔽结构域增加所述蛋白质的流体动力半径，和/或其中所述电荷屏蔽结构域在约pH 7.0下不带电。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物活性结构域的分子量小于所述电荷屏蔽结构域的分子量。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述电荷屏蔽结构域的分子量在10kDa与60kDa之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述电荷屏蔽结构域的分子量在10kDa与20kDa之间。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述生物活性结构域的分子量在30kDa与40kDa之间。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述电荷屏蔽结构域的分子量足以增加所述电荷屏蔽融合蛋白或所述电荷屏蔽融合蛋白的多聚体的体内半衰期。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述电荷屏蔽融合蛋白或所述电荷屏蔽融合蛋白的多聚体的体内半衰期相较于包括所述生物活性结构域但不包括所述电荷屏蔽结构域的蛋白质或者包括所述生物活性结构域但不包括所述电荷屏蔽结构域的多聚蛋白质的半衰期有所增加。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述电荷屏蔽结构域具有无规卷曲或无序结构。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述电荷屏蔽结构域是由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基中的一者或多者组成的多肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述电荷屏蔽结构域是由脯氨酸和丙氨酸残基组成的多肽。
17.一种用于由细胞裂解物或周质释放物产生PAS化生物活性融合蛋白的方法，所述方法包括
i)培养细胞，所述细胞包括编码所述PAS化生物活性蛋白质的核酸；并且
ii)纯化所述PAS化生物活性蛋白质，
其中所述PAS化生物活性蛋白质是使用疏水相互作用色谱作为第一个色谱步骤从所述细胞裂解物或周质释放物纯化的。
18.一种用于从细胞裂解物或周质释放物纯化出包括生物活性结构域和电荷屏蔽结构域的电荷屏蔽融合蛋白的方法，所述方法依序包括以下步骤
i)将包括所述电荷屏蔽融合蛋白的上样溶液施加至疏水相互作用色谱柱上；
ii)将洗涤溶液施加至所述疏水相互作用色谱柱上；
iii)将洗脱溶液施加至所述疏水性相互作用柱上以洗脱所述电荷屏蔽蛋白；
iv)将iii)中洗脱的电荷屏蔽融合蛋白作为上样溶液施加至阴离子交换色谱柱上；
v)从所述阴离子交换色谱柱洗脱所述电荷屏蔽融合蛋白；
vi)将vi)中洗脱的电荷屏蔽融合蛋白作为上样溶液施加至阳离子交换色谱柱上；
vii)将洗涤溶液施加至所述阳离子交换色谱柱上；
viii)将洗脱溶液施加至所述阳离子交换色谱柱上以洗脱所述电荷屏蔽融合蛋白。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤i)中的所述上样溶液包括0.25-3M的Na2SO4或0.25-0.6M的NH4SO4以及5.5至6.5的pH值。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中步骤iii)中的所述洗脱溶液包括0.3-0.5M的NH4SO4并具有5.5至6.5的pH值。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中步骤iv)中的所述上样溶液具有0.7-4.0mS/cm的电导率以及7.0至9.1的pH值。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中步骤vi)中的所述上样溶液具有5.9至7.0的pH值以及0.7至2.5mS/cm的电导率。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中步骤viii)中的所述洗脱溶液具有6.0至7.0的pH值以及0.7至4.0mS/cm的电导率。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱选自由以下组成的组：POROS Benzyl ultra树脂、Hexyl-650C树脂和Phenyl-600M树脂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱是Phenyl-600M树脂。
26.根据权利要求5至25中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换相互作用色谱选自由以下组成的组：POROS 50HQ树脂、POROS XQ树脂和Gigacap Q-650M树脂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述阴离子交换相互作用色谱是Gigacap Q-650M树脂。
28.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换相互作用色谱是强阳离子交换剂。
29.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换相互作用色谱是混合模式树脂。
30.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换相互作用色谱选自由以下组成的组：Capto MMC树脂、CMM Hypercel树脂、Capto SP impres树脂、Fracto gelSO3-树脂、GigaCap S-650S树脂和POROS XS树脂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述阳离子交换相互作用色谱是POROS XS树脂。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述生物活性结构域是天冬酰胺酶亚基。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述天冬酰胺酶选自由大肠杆菌天冬酰胺酶和欧文氏菌天冬酰胺酶组成的组。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述天冬酰胺酶包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述电荷屏蔽融合蛋白包括SEQ ID NO：9或SEQID NO：10中所示的氨基酸序列。
36.根据权利要求2或权利要求17所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞或假单胞菌细胞。
38.一种电荷屏蔽蛋白，所述电荷屏蔽蛋白是由根据权利要求1至37中任一项所述的方法产生的。
39.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求38所述的电荷屏蔽蛋白和药学上可接受的载体。
40.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用包括权利要求38所述的电荷屏蔽蛋白的组合物或权利要求39所述的药物组合物。
41.一种组合物，所述组合物包括PAS化天冬酰胺酶，其中所述PAS化天冬酰胺酶是至少45％纯的。
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