JP2024500232A - インターロイキン21変異体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規インターロイキン21(IL-21)変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型IL-21と比較して、改善された特性、例えば、低減されたIL-21受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するIL-21変異タンパク質に関する。本発明は、当該IL-21変異タンパク質を含む融合物、および当該IL-21変異タンパク質、融合物をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該IL-21変異タンパク質、融合物の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。
Description
本発明は、新規インターロイキン21(IL-21)変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型IL-21と比較して、改善された特性、例えば、低減されたIL-21受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するIL-21変異タンパク質に関する。本発明は、当該IL-21変異タンパク質を含む融合物、および当該IL-21変異タンパク質または融合物をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該IL-21変異タンパク質、融合物の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。
インターロイキン-21(IL-21)は、先天性免疫細胞および適応性免疫細胞の活性を調節するT細胞誘導多面性サイトカインであり、I型サイトカインおよび共通のサイトカイン受容体γ鎖(cg鎖)サイトカインファミリーのメンバーである。
IL-21は、4ヘリックスバンドル構造を有するとともにモノマーとして存在する。ヒトにおいて、それぞれ前駆体分子に由来するIL-21の2つの異性体が知られている。第1のIL-21異性体は162個のアミノ酸(aa)を含み、ここで、最初の29個のアミノ酸がシグナルペプチドを構成し、かつ第2のIL-21異性体は153aaを含み、ここで、第1異性体と同様に、最初の29個のアミノ酸がシグナルペプチドを構成する。
IL-21は、活性化CD4 T細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞によって産生される。IL-21は、T細胞、B細胞およびNK細胞の表面に発現するヘテロ二量体IL-21受容体(IL-21R)に結合する。IL-21がIL-21Rに結合する場合、Jak/STATシグナル伝達経路が活性化されることで、標的遺伝子が活性化される。これらのサイトカイン受容体のそれぞれがいずれも共通のγ鎖(γc)を含むため、IL-21Rの構造はIL-2受容体およびIL-15受容体と類似する。γcに加えて、IL-21Rには、IL-21との結合にとって重要なα鎖が含まれる。IL-21Rは、Tリンパ球とBリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞および骨髄細胞を含む造血細胞に広く発現される。
樹状細胞(DC)において、IL-21はDCの成熟および活性化を抑制することができ、一般的なDCのアポトーシスを誘導することができ、混合培養物でのT細胞の活性化を強力に抑制することができ、かつ耐性の誘導に作用を発揮することができる。IL-21はNK細胞および活性化T細胞の効果的な分裂促進因子および生存因子であるが、必須の成長因子または分化因子ではない。IL-21はまた、CD4(+)Tヘルパー17(Th17)細胞および濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)の分化をサポートすることができ、かつ制御性T細胞(Treg)の分化に拮抗することができる。さらに、IL-21は、CD8 T細胞の生存を強化することができ、かつ活性化が少ないがより持続性のあるT細胞表現型を保護し、腫瘍およびウイルスの制御を強化することができる。
IL-21は抗腫瘍および抗ウイルスの応答において重要な役割を果たすだけでなく、自己免疫性疾患および炎症性疾患を引き起こす炎症性反応に対して重要な役割を発揮することから、IL-21は、複数の療法の魅力的な標的となっている。
IL-21の多面的効果により、それを潜在的な治療標的となっている。しかしながら、IL-21受容体(IL-21R)はT細胞、B細胞、NK細胞および骨髄細胞を含むさまざまな細胞で広く発現しているため、当該分子は、T細胞などの細胞に対する選択性がなく、末梢で多数のT細胞を活性化してしまい、その結果分子の毒性が高くなる。したがって、その毒性を慎重に制御する必要がある。
IL-21自体の精製は比較的に難しく、野生型分子のワンステップ精製によるSEC純度はわずか61%である。また、IL-21とIL-21Rとの親和性が非常に高く、8.29×10-10Mに達するため、インビボでの半減期が非常に短く、半減期を延長するために効果的な改善も必要である。さらに、野生型IL-21はFcと融合して発現されるため、その創薬可能性が低い。
当該分野でいくつかのIL-21分子改変方法が提案されている。例えばWO2019028316A1は、改変によって親和性が弱められたインターロイキン-21変異タンパク質およびPD-1抗体とのその融合物を提案しており、弱められたIL-21はマウス体内での半減期が明らかに延長されるが、この特許では分子創薬可能性の改善に言及されていない。
IL-21免疫治療および生産と精製に関連する上記の問題を鑑み、当該分野は、依然として、改善された特性を有する新規IL-21分子、特に生産、精製に役立つことを示し、改善された薬物動態学的および薬力学的特性を有するIL-21分子、および抗体と組み合わせたその融合物をさらに開発する必要がある。
本発明は、新規インターロイキン21(IL-21)変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型IL-21と比較して、改善された特性、例えば、低減されたIL-21受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するIL-21変異タンパク質に関する。本発明は、当該IL-21変異タンパク質を含む融合物、および当該IL-21変異タンパク質または融合物をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該IL-21変異タンパク質、融合物の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。
具体的には、本発明は、以下の実施形態に関する。
1.IL-21変異タンパク質であって、
ここで、上記変異タンパク質は、野生型IL-21(好ましくはヒトIL-21、より好ましくは配列番号74の配列を含むIL-21)と比較して、以下:
(i)IL-4(好ましくはヒトIL-4)の位置1~15におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~15におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~14におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~14におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~14におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~13におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~13におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~13におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~12におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~12におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~11におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~10におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~10におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~10におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~9におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~9におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~8におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~8におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~8におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~7におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~7におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~7におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~6におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~6におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~6アミノ酸の置換;IL-4の位置1~5におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~5におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~4におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~4におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~4におけるアミノ酸の置換;またはIL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~11におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
(ii)D4、R5、H6、M7、D15、V17、Q19、K21、D37、E39、R76、K77、P78、P79、S80、N82、G84、H120かつ/またはH122の位置から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個または5個の位置での変異による当該位置でのグリコシル化、
(iii)I8、K72、K77、P78、かつ/またはP79から選択される1個~5個の位置、例えば1個もしくは2個の位置での置換であって、ここで、上記KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能である置換、
(iv)Helix AのN末端(例えば位置1~15)、CD loop(例えば位置82~95、もしくは84~91)またはC loop(例えば位置76~81)での1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸の欠失、あるいは1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸を含むセグメントの欠失、
の変異の1つもしくは複数を含み、
ここで、上記アミノ酸位置は、配列番号74により番号付けられるアミノ酸位置である。
1.IL-21変異タンパク質であって、
ここで、上記変異タンパク質は、野生型IL-21(好ましくはヒトIL-21、より好ましくは配列番号74の配列を含むIL-21)と比較して、以下:
(i)IL-4(好ましくはヒトIL-4)の位置1~15におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~15におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~14におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~14におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~14におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~13におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~13におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~13におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~12におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~12におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~11におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~10におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~10におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~10におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~9におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~9におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~8におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~8におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~8におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~7におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~7におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~7におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~6におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~6におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~6アミノ酸の置換;IL-4の位置1~5におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~5におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~4におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~4におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~4におけるアミノ酸の置換;またはIL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~11におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
(ii)D4、R5、H6、M7、D15、V17、Q19、K21、D37、E39、R76、K77、P78、P79、S80、N82、G84、H120かつ/またはH122の位置から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個または5個の位置での変異による当該位置でのグリコシル化、
(iii)I8、K72、K77、P78、かつ/またはP79から選択される1個~5個の位置、例えば1個もしくは2個の位置での置換であって、ここで、上記KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能である置換、
(iv)Helix AのN末端(例えば位置1~15)、CD loop(例えば位置82~95、もしくは84~91)またはC loop(例えば位置76~81)での1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸の欠失、あるいは1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸を含むセグメントの欠失、
の変異の1つもしくは複数を含み、
ここで、上記アミノ酸位置は、配列番号74により番号付けられるアミノ酸位置である。
2.実施形態1に記載の変異タンパク質であって、ここで、上記変異(i)における置換のためのIL-4のN末端の位置1~15におけるアミノ酸は、HKSDITLQEIIKTLNまたはHKCDITLQEIIKTLNであり、
より好ましくは、上記変異(i)の変異は、
IL-4の1~5&C3S(HKSDI)によるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~15&C3S(HKSDITLQEIIKTLN)によるIL-21の1~15(QGQDRHMIRMRQLID)の置換、
IL-4の1~12&C3S(HKSDITLQEIIK)によるIL-21の1~12(QGQDRHMIRMRQ)の置換、
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~11(QGQDRHMIRMR)の置換、または
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、から選択される。
より好ましくは、上記変異(i)の変異は、
IL-4の1~5&C3S(HKSDI)によるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~15&C3S(HKSDITLQEIIKTLN)によるIL-21の1~15(QGQDRHMIRMRQLID)の置換、
IL-4の1~12&C3S(HKSDITLQEIIK)によるIL-21の1~12(QGQDRHMIRMRQ)の置換、
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~11(QGQDRHMIRMR)の置換、または
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、から選択される。
3.実施形態1に記載のIL-21変異タンパク質であって、ここで、上記変異(ii)における変異は、上記位置におけるアミノ酸をN、TもしくはSに置換することであり、
好ましくは、上記変異(ii)は、
D4N、R5N、H6T、M7T、D15N、V17T、Q19N、K21T、D37N、E39T、R76N、K77N、P78T/S、P79T/N、S80N、N82T、G82T、G84T、H120Nかつ/またはH122Tから選択される1個、2個、3個、4個、もしくは5個の置換を含み、
より好ましくは、上記変異(ii)は、
D4&H6
R5&M7
D15&V17
IQ19&K21
R76&P78
K77&P78&P79
P79
S80&N82
G84
H120&H122または
D37&E39という位置での置換または置換の組み合わせから選択され、
最も好ましくは、上記変異(ii)は、
D4N&H6T
R5N&M7T
D15N&V17T
IQ19N&K21T
R76N&P78T
K77N&P78S&P79T
P79N
S80N&N82T
G84T
H120N&H122Tまたは
D37N&E39Tでの置換または置換の組み合わせから選択される。
好ましくは、上記変異(ii)は、
D4N、R5N、H6T、M7T、D15N、V17T、Q19N、K21T、D37N、E39T、R76N、K77N、P78T/S、P79T/N、S80N、N82T、G82T、G84T、H120Nかつ/またはH122Tから選択される1個、2個、3個、4個、もしくは5個の置換を含み、
より好ましくは、上記変異(ii)は、
D4&H6
R5&M7
D15&V17
IQ19&K21
R76&P78
K77&P78&P79
P79
S80&N82
G84
H120&H122または
D37&E39という位置での置換または置換の組み合わせから選択され、
最も好ましくは、上記変異(ii)は、
D4N&H6T
R5N&M7T
D15N&V17T
IQ19N&K21T
R76N&P78T
K77N&P78S&P79T
P79N
S80N&N82T
G84T
H120N&H122Tまたは
D37N&E39Tでの置換または置換の組み合わせから選択される。
4.実施形態1に記載のIL-21変異タンパク質にであって、ここで、上記変異(iii)における変異は、
I8Q、K72E、K77D、P78Aかつ/またはP79Eから選択される1個~5個、例えば1個もしくは2個の置換を含み、
好ましくは、上記変異(iii)における変異は、
K72、
I8&P79、または
K77&P78という位置または位置の組み合わせでの置換であり、ここで、KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能であり、
好ましくは、上記変異(iii)における変異は、
K72E
I8Q&P79Eまたは
K77D&P78Aから選択される。
I8Q、K72E、K77D、P78Aかつ/またはP79Eから選択される1個~5個、例えば1個もしくは2個の置換を含み、
好ましくは、上記変異(iii)における変異は、
K72、
I8&P79、または
K77&P78という位置または位置の組み合わせでの置換であり、ここで、KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能であり、
好ましくは、上記変異(iii)における変異は、
K72E
I8Q&P79Eまたは
K77D&P78Aから選択される。
5.実施形態1に記載のIL-21変異タンパク質にであって、ここで、上記変異(iv)における変異は、位置1~9、位置78~79、位置85~87、もしくは位置84~91から選択される位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含み、
好ましくは、上記変異(iv)における変異は、
85~87の切断、
78~79の切断、
1~9の切断、
84~91の切断、または
1~9の切断&78~79の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの欠失であり、
好ましくは、上記変異(iv)における変異は、
85~87(RRQ)の切断、
78~79(PP)の切断、
1~9(QGQDRHMIR)の切断、
84~91(GRRQKHRL)の切断、または
1~9(QGQDRHMIR)の切断&78~79(PP)の切断から選択されるアミノ酸セグメントの欠失である。
好ましくは、上記変異(iv)における変異は、
85~87の切断、
78~79の切断、
1~9の切断、
84~91の切断、または
1~9の切断&78~79の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの欠失であり、
好ましくは、上記変異(iv)における変異は、
85~87(RRQ)の切断、
78~79(PP)の切断、
1~9(QGQDRHMIR)の切断、
84~91(GRRQKHRL)の切断、または
1~9(QGQDRHMIR)の切断&78~79(PP)の切断から選択されるアミノ酸セグメントの欠失である。
6.実施形態1に記載のIL-21変異タンパク質であって、ここで、上記変異タンパク質は、
(i)1~9(QGQDRHMIR)の切断&Q19N&K21T、
(ii)84~91(GRRQKHRL)の切断&C42A&C93T&Q19N&K21T、
(iii)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&78~79(PP)の切断によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(iv)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&K117N&I119TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(v)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D37N&E39TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(vi)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D15N&V17TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、または
(vii)IL-4の1~5(HKCDI)&L123CによるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、から選択される変異を含む。
(i)1~9(QGQDRHMIR)の切断&Q19N&K21T、
(ii)84~91(GRRQKHRL)の切断&C42A&C93T&Q19N&K21T、
(iii)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&78~79(PP)の切断によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(iv)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&K117N&I119TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(v)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D37N&E39TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(vi)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D15N&V17TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、または
(vii)IL-4の1~5(HKCDI)&L123CによるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、から選択される変異を含む。
7.実施形態1~6のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質であって、ここで、上記野生型IL-21は、配列番号74もしくは配列番号106~108に示されるアミノ酸配列、あるいは、上記アミノ酸配列と少なくとも95%~99%もしくはそれ以上の同一性を有するまたは1個~10個もしくは1個~5個以下のアミノ酸保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。
8.実施形態1~7のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質にであって、ここで、上記変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、以下:
(i)より低いIL-21Rに対する親和性、
(ii)より高い安定性、
(iii)改善された創薬可能性(例えばより長い半減期かつ/または改善された純度、例えばSEC純度)、かつ/または
(iv)抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、という改善された特性の1つもしくは複数を有する。
(i)より低いIL-21Rに対する親和性、
(ii)より高い安定性、
(iii)改善された創薬可能性(例えばより長い半減期かつ/または改善された純度、例えばSEC純度)、かつ/または
(iv)抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、という改善された特性の1つもしくは複数を有する。
9.実施形態1~7のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質であって、ここで、上記変異タンパク質は、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、86%、87%、88%もしくは89%の同一性、好ましくは90%以上の同一性、好ましくは95%、好ましくは97%以下、より好ましくは96%以下の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
10.実施形態1~8のいずれか1項に記載のIL2変異タンパク質を含むIL-21変異タンパク質融合タンパク質である。
11.実施形態10に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、それはFc断片に連結される実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質を含むか、あるいは、抗体またはその抗原結合断片に連結される実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質を含み、ここで、上記連結は、リンカーによるものまたはリンカーによらないものである。
12.実施形態11に記載の変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記Fc断片はヒトのIgG Fc、例えば、ヒトIgG1 Fc、ヒトIgG2 Fc、もしくはヒトIgG4 Fcであり、好ましくは、上記Fc断片はヒトIgG1 Fc、例えばL234A/L235A変異を含むヒトIgG1 Fcであり、より好ましくは、上記Fc断片は、配列番号70のアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%の同一性、例えば95%、96%、97%、99%もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
13.実施形態11に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記抗体が対象とする抗原は、PD-1、PD-L1またはPD-L2である。
14.実施形態12に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記抗体が対象とする抗原はPD-1であり、かつ上記抗体またはその抗原結合断片は、
(1)配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2およびLCDR3、または
(2)それぞれアミノ酸配列の配列番号109、110および111に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号112、113および114に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3、を含む。
(1)配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2およびLCDR3、または
(2)それぞれアミノ酸配列の配列番号109、110および111に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号112、113および114に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3、を含む。
15.実施形態14に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号115に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVHと、配列番号116に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVLと、を含む。
配列番号115に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVHと、配列番号116に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVLと、を含む。
16.実施形態10~12のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、それは
IL-21変異タンパク質がリンカーを介して、またはFc断片のN末端に直接連結する鎖Aを含み、
好ましくは、上記融合タンパク質が2つの同じ鎖Aを含む。
IL-21変異タンパク質がリンカーを介して、またはFc断片のN末端に直接連結する鎖Aを含み、
好ましくは、上記融合タンパク質が2つの同じ鎖Aを含む。
17.実施形態16に記載の変異タンパク質融合タンパク質であって、鎖Aは配列番号1~32のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
18.実施形態10、11、13~15のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、それは
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B、という構造を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質融合タンパク質は、2つの同じ鎖Aおよび2つの同じ鎖Bを含む。
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B、という構造を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質融合タンパク質は、2つの同じ鎖Aおよび2つの同じ鎖Bを含む。
19.実施形態15に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、鎖Aは、配列番号34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または鎖Bは、配列番号35~54のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
20.実施形態10、11、13~15のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、それは
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の1つの重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B1、および
抗体の重鎖である鎖B2、という構造を含み、
好ましくは、上記融合タンパク質は2つの同じ鎖A、1つの鎖B1および1つの鎖B2を含み、好ましくは、鎖B1はknob変異、例えばS354C&T366Wを含み、鎖B2はhole変異、例えばY349C&T366S&L368A&Y407Vを含む。
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の1つの重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B1、および
抗体の重鎖である鎖B2、という構造を含み、
好ましくは、上記融合タンパク質は2つの同じ鎖A、1つの鎖B1および1つの鎖B2を含み、好ましくは、鎖B1はknob変異、例えばS354C&T366Wを含み、鎖B2はhole変異、例えばY349C&T366S&L368A&Y407Vを含む。
21.実施形態20に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、鎖Aは、配列番号34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または鎖B1は、配列番号55~67のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、かつ/または鎖B2は、配列番号33に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
22.実施形態10~21のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、and(GGGS)nから選択されるリンカー配列を含み、ここで、nは少なくとも1である整数であり、好ましくは、リンカーは(G4S)2もしくは(G4S)3を含む。
23.実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質または実施形態10~22のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質における鎖をコードする、単離したポリヌクレオチド。
24.実施形態23に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
25.実施形態23に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態24に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、上記宿主細胞は酵母細胞または哺乳動物細胞、特にHEK293細胞またはCHO細胞である。
26.実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質または実施形態10~22のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質を生産するための方法であって、上記IL-21変異タンパク質または融合タンパク質の発現に適する条件で、実施形態25に記載の宿主細胞を培養することを含む。
27.実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質または実施形態10~12のいずれか1項に記載の融合タンパク質と、場合による薬用補助材料と、を含む医薬組成物。
28.癌を予防かつ/または治療するための薬物の調製における、実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質、実施形態10~21のいずれか1項に記載の融合タンパク質または実施形態27に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、上記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である。
29.実施形態28に記載の使用であって、ここで、上記医薬組成物は第2治療剤をさらに含む。
30.対象の癌を予防かつ/または治療する方法であって、上記方法は、実施形態1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質、実施形態10~21のいずれか1項に記載の融合タンパク質または実施形態27に記載の医薬組成物を上記対象に投与することを含み、好ましくは、上記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である。
31.実施形態30のいずれか1項に記載の方法であって、ここで、上記変異タンパク質、上記融合タンパク質または上記医薬組成物は、第2治療剤と併用療法により投与される。
I.定義
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本発明に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本発明に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。
本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数の場合が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。
用語「約」は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より5%小さく、上限として指定された数字または数値より5%大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。
本明細書に使用されるように、用語「かつ/または」は、選択可能なオプションのうちのいずれか1つ、または選択可能なオプションの2つまたは複数を指す。
本明細書に使用されるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」IL-21変異タンパク質に言及する場合、上記変異または変異の組み合わせのみを有するIL-21変異タンパク質を包含することも意図される。
本明細書において、野生型「インターロイキン-21」または「IL-21」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートとしての親IL-21タンパク質、好ましくは天然に存在するIL-21タンパク質、例えば、未処理(例えば、シグナルペプチドが除去されていない)の形態および処理済み(例えば、シグナルペプチドが除去された)の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然IL-21タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトIL-21配列(Q9HBE4)は配列番号106に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号74に示される。なお、この表現には、天然に存在するIL-21対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。例えば、可変スプライスによって産生されるIL-21アイソタイプ(Q9HBE4-2)もこの表現に含まれており、ここで、シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトIL-21配列は配列番号108に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号107に示される。この表現には天然IL-21の変異体がさらに含まれ、例えば、上記変異体は天然IL-21と少なくとも95%~99%もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または1個~10個もしくは1個~5個以下のアミノ酸変異(例えば、保存的置換)を有してもよく、かつ好ましくは天然IL-21タンパク質と基本的に同一のIL-21R結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、野生型IL-21配列は、配列番号74、106、107もしくは108のアミノ酸配列と少なくとも85%、95%、さらには少なくとも96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。
本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸またはアミノ酸配列セグメントの置換、欠失/切断、挿入および付加であってもよい。置換、欠失/切断、挿入および付加の任意の組み合わせを行うことで、所望の特性(例えば、低減されたIL-21R結合親和性かつ/または改善された創薬可能性)を有する最終的な変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノ基かつ/またはカルボキシ基末端での欠失/切断および挿入を含むとともに、ポリペプチド配列内での欠失/切断および挿入も含む。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、単一アミノ酸置換もしくは複数のアミノ酸置換の組み合わせまたはアミノ酸配列セグメントの置換などの、アミノ酸置換である。例えば、置換によって、1つもしくは複数のグリコシル化部位を導入し、およびIL-21タンパク質のグリコシル化を促進することができる。また、IL-21R結合界面アミノ酸との置換によって、低減されたIL-21R結合親和性を有する変異タンパク質を得ることができる。さらに、野生型IL-21のN末端の1つもしくは複数のアミノ酸もしくはアミノ酸配列セグメントを、他のサイトカイン(例えばIL-4)と異なるN末端アミノ酸に置換して、他のサイトカインとのキメラを形成することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、欠失変異または切断変異をさらに含む。欠失/切断変異は、IL-21野生型のあるドメイン(例えばCDループ領域もしくはN末端)に1つもしくは複数のアミノ酸もしくはアミノ酸配列セグメントが欠失してIL-21を得る切断変異体を含む。
本発明において、IL-21タンパク質もしくはIL-21配列セグメントにおけるアミノ酸位置に言及する場合、野生型ヒトIL-21タンパク質(IL-21WTとも呼ばれる)の配列番号74のアミノ酸配列を参照することによって決定される。配列番号74とのアミノ酸配列アラインメントによって、他のIL-21タンパク質もしくはポリペプチド(スプライス変異体を含む)における対応するアミノ酸位置を同定することができる。したがって、本発明において、特記しない限り、IL-21タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号74に従って番号付けられるアミノ酸位置である。例えば、「D4N」に言及する場合、配列番号74の第4位アスパラギン酸残基DがNに置換され、またはアラインメントによって他のIL-21ポリペプチド配列の対応する位置におけるアミノ酸残基(当該位置でDである可能性もあり、Dでない可能性もある)がNに置換されることを意味する。アミノ酸位置決定のために実施される配列アラインメントは、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiから得ることができるBasic Local Alignment Search Toolを使用して、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。
本明細書において、IL-21変異タンパク質に言及する場合、以下のように単一アミノ酸置換を説明する:[元のアミノ酸残基/位置/置換のアミノ酸残基]。例えば、位置4のアスパラギン酸がアスパラギンに置換される場合、D4Nと表すことができる。1つの所定の位置(例えば、D37位)に複数の選択可能なアミノ酸置換方式(例えば、N、T)があり得る場合、当該アミノ酸置換は、D37N/Tと表すことができる。
本明細書において、IL-21変異タンパク質に言及する場合、以下のようにアミノ酸配列セグメント取り替え/置換を説明する:[(元のアミノ酸配列セグメント)/(位置)/(置換のアミノ酸配列セグメント)]。例えば、位置1~9の配列セグメント「(QGQDR)」が「(HKSDI)」に置換される場合、(QGQDR)/(1~5)/(HKCDI)と表すことができる。あるいは、当該取り替え、置換は、「IL-21の1~5(QGQDR)がIL-4の1~5(HKCDI)に置換される」と説明される。IL-4のアミノ酸配列セグメントには置換を含む、例えばC3S置換を含む場合、「IL-21の1~5(QGQDR)がIL-4の1~5&C3S(HKSDI)に置換される」と説明されてもよい。
本明細書において、IL-21変異タンパク質に言及する場合、以下のようにアミノ酸配列セグメントの欠失/切断を説明する:[切断位置(切断のアミノ酸配列セグメント)]。例えば、位置85~87における配列セグメント「(RRQ)」の欠失/切断は「85~87(RRQ)の切断」と表す。
アンド記号「&」もしくは「-」によって各変異を連結して、複数の所定の位置での組み合わせ変異を表すことができる。例えばD37NとE39T位置の組み合わせ変異は、D37N&E39T、またはD37N-E39Tと表すことができる。
注意すべきことは、上記説明の応用の場合、アラインメントによって、他の親IL-21ポリペプチド配列の対応する位置におけるアミノ酸は、配列番号74の対応する位置におけるアミノ酸と異なる場合があるが、依然として示される変異を行うことができる。
本明細書において、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で2つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列(例えば、配列番号74)の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、当該分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、例えば、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムを含む(Altschul et al.,Nuc. Acids Res.25:3389-402,1977およびAltschul et al. J.Mol. Biol. 215:403-10,1990参照)。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)から公的に入手可能である。本願の目的のため、同一性パーセントは、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiから得ることができるBasic Local Alignment Search Toolを使用して、デフォルトパラメータを用いて決定することができる。
本明細書で使用されるように、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質/ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発などの当該分野で既知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を、類似の化学的特性(例えば、電荷または疎水性)を有する別のアミノ酸に置換することを指す。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、当該分野でよく知られているものである。本発明において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表X、特に表Xにおける好ましい保存的アミノ酸置換残基に由来する。
例えば、野生型IL-21タンパク質は、配列番号74および106~108の1つに対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、かつ1つの好ましい実施形態において、保存的置換は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個もしくは10個の残基など、10個以下のアミノ酸残基を有する。さらに例えば、本発明の変異IL-21タンパク質は、本明細書に具体的に示されるIL-21変異タンパク質配列(例えば配列番号75~105のいずれか1つ)に対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、かつ1つの好ましい実施形態において、保存的置換は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個もしくは10個の残基など、10個以下のアミノ酸残基を有する。
「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Xのその結合パートナーYに対する親和性は、平衡解離定数(KD)によって示されてもよく、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数(それぞれkdisとkonである)との比率である。結合親和性は当該分野で既知の常用方法で測定されてもよい。親和性を測定するための具体的な方法は、本明細書のForteBio親和性測定技術またはBLI測定技術である。
本明細書において、抗原結合分子は、抗原に特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばFab断片およびscFv断片である。一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、免疫チェックポイント分子に対して抗原とする結合分子、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体である。一実施形態において、免疫チェックポイント分子はPD-1、PD-L1もしくはPD-L2である。
本明細書において、抗体Fc断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC-末端領域であり、かつ天然配列Fc断片および変異体Fc断片を含むことができる。天然配列Fc断片は、様々なIgサブタイプおよびそのアロタイプのFc領域など、天然に存在する様々な免疫グロブリンFc配列を含む(Gestur Vidarsson et al,IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions,20 October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520.)。一実施形態において、ヒトIgG重鎖Fc断片は、重鎖のCys226から、またはPro230からカルボキシ基末端まで延びる。他の実施形態において、Fc-断片のC-末端リジン(Lys447)が存在してもよく、存在しなくてもよい。他のいくつかの実施形態において、Fc断片は変異を含む変異体Fc断片であり、例えば、L234A-L235A変異(LALA変異)を含む。一実施形態において、Fc断片はIgG1に由来する。一実施形態において、本発明で使用されるFcは、IgG1に由来するとともにLALA変異を有する。一実施形態において、本発明で使用されるFcは、配列番号70に示される配列(IgG1に由来し、LALA変異を有する)を含むか、または配列番号70に示される配列と少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有する配列を含む。本明細書に特記しない限り、Fc断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、EU番号付けシステムによるものであり、EUインデックスとも呼ばれる。例えば、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th editon,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91ー3242に記載される。いくつかの実施形態において、抗体Fc断片は、N末端にIgG1ヒンジ配列またはIgG1ヒンジ配列の一部、例えばEU番号付けによる配列E216からT225または配列D221からT225を有することができる。上記ヒンジ配列に変異が含まれ得る。
「抗原結合断片」とは、完全な抗体の一部を含むとともに、完全な抗体の結合する抗原と結合する、完全な抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例は、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、dAb(domain antibody)、線状抗体、単鎖抗体(例えば、scFv)、単一ドメイン抗体(例えば、VHH)、二価抗体またはその断片、あるいはラクダ科抗体を含むが、これらに限定されない。
「抗原結合断片」とは、完全な抗体の一部を含むとともに、完全な抗体の結合する抗原と結合する、完全な抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例は、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、dAb(domain antibody)、線状抗体、単鎖抗体(例えば、scFv)、単一ドメイン抗体(例えば、VHH)、二価抗体またはその断片、あるいはラクダ科抗体を含むが、これらに限定されない。
用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生または特異性免疫細胞の活性化に関係し、あるいは両方に関係する可能性がある。当業者であれば、ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む大分子は、いずれも抗原として利用できると理解される。また、抗原は、組換えDNAまたはゲノムDNAから誘導されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載される抗原は腫瘍関連抗原、即ち腫瘍の発生、発展または進行に関連する抗原、例えばPD-1、PD-L1またはPD-L2である。
「相補性決定領域」または「CDR領域」または「CDR」は、抗体可変ドメインで、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ(「超可変ループ」)であり、かつ/または抗原接触残基(「抗原接触点」)を含む領域である。CDRは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖と軽鎖のCDRは通常、CDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれ、N末端から順に番号付けられる。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するCDRはHCDR1、HCDR2およびHCDR3と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するCDRはLCDR1、LCDR2およびLCDR3と呼ばれる。1つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各CDRの精確なアミノ酸配列の境界は、多くの公知の抗体CDR割り当てシステムのいずれか1種またはその組み合わせにより決定することができ、上記割り当てシステムは、例えば、抗体の3次元構造とCDRループのトポロジーに基づくChothia(Chothia et al.(1989)Nature 342:877~883,Al-Lazikani et al.,「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,273,927~948(1997))、抗体配列の可変性に基づくKabat(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th edition,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987))、AbM(University of Bath)、Contact(University College London)、国際ImMunoGeneTics database(IMGT)(www.imgt.cines.fr/にて利用可能)、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング(affinity propagation clustering)に基づくNorth CDR定義を含む。
CDRは、参照CDRの配列(例えば、本発明の例示的なCDRのいずれか1つ)と同じKabat番号付け位置を有することで決定されてもよい。
特に断りのない限り、本発明において、用語「CDR」または「CDR配列」は、上記のいずれか1つの方法で決定されるCDR配列を含む。
特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置(重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む)に言及する場合、Kabat番号付けシステム(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))に基づく番号付け位置を指す。
一実施形態において、本発明抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域CDRは、North番号付け方案に基づいて定義されるCDR配列である。
本明細書において、「IL-21R」という用語は、IL-21に結合する受容体を指す。上記受容体はI型サイトカイン受容体に属し、同様にIL-2、IL-7およびIL-15によって共有する受容体サブユニットである共通のγ鎖を持つヘテロダイマー受容体複合体を形成することが示される。当該受容体は、IL-21の成長促進シグナルを伝達し、かつT細胞、B細胞およびナチュラルキラーNK細胞の増殖および分化に重要な役割を果たす。この受容体とリガンドとの結合は、JAK1、JAK3、STAT1およびSTAT3の活性化など、複数の下流シグナル分子の活性化につながる。本明細書において、「IL-21R結合界面変異」とは、IL-21とIL-21Rが相互作用するアミノ酸部位における変異を指す。IL-21およびその受容体複合体の結晶構造(例えばPDB:3TGX)を分析することにより、これらの相互作用部位を決定することができる。いくつかの実施形態において、上記変異は、特にIL-21ヘリックスA、ヘリックスCおよびCDループの一部、例えばアミノ酸残基8、72もしくは77~79の1つもしくは複数における変異を指す。好ましくは、上記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、上記変異を含むIL-21タンパク質は、低減または排除されたIL-21R結合を有する。
本明細書において、「IL-21」グリコシル化は、IL-21にN-グリコシル化部位を導入することでIL-21変異タンパク質のグリコシル化レベルを向上させ、さらにIL-21変異タンパク質の創薬可能性を改善するかつ/またはIL-21Rに低減された結合親和性を備えさせることを意味する。いくつかの実施形態において、グリコシル化部位は、位置4~7、15、17、19、21、37、39、76~80、82、84、120および122から選択される1つもしくは複数である。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、融合タンパク質の異なる部分に直接連結可能な任意の分子を指す。融合タンパク質の異なる部分の間で共有結合を確立するリンカーの例には、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体を含むが、これらに限定されないペプチドリンカーおよび非タンパク質ポリマーが含まれる。本発明による「ペプチドリンカー」という用語は、融合タンパク質の第1部分のアミノ酸配列を融合タンパク質の第2部分に連結するアミノ酸の配列を指す。例えば、ペプチドリンカーは、融合タンパク質のIL-21部分をFcドメインまたはその断片に連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、抗体重鎖のC末端をIL-21に連結するなど、抗体をIL-21に連結することもできる。好ましくは、上記ペプチドリンカーは、所望の活性を妨害せずに、それらが互いに対してコンフォメーションを維持するように、2つの実体を連結するのに十分な長さを有する。ペプチドリンカーは、Gly、Ser、AlaもしくはThrというアミノ酸残基を主に含んでもよいが、主に含まなくてもよい。有用なリンカーには、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)nおよび(GGGGS)nGを含むグリシン-セリンポリマーが含まれ、ここで、nは少なくとも1(かつ好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)の整数である。有用なリンカーには、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマーおよび他のフレキシブルリンカーがさらに含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーは、(GGGGS)2(配列番号69)または(GGGGS)3(配列番号72)である。
「IgG形態の抗体」は、抗体の重鎖定常領域の属するIgG形態を指す。すべての同じタイプの抗体は、その重鎖定常領域がいずれも同じであり、異なるタイプの抗体は、その重鎖定常領域が異なる。例えば、IgG4形態の抗体は、その重鎖定常領域がIgG4からのものであることを指し、またはIgG1形式の抗体は、その重鎖定常領域がIgG1からのものであることを指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ほぼすべての可変ドメインの少なくとも1つ、一般的に2つを含み、ここで、すべてまたはほぼすべてのCDR(例えば、CDR)は、非ヒト抗体に由来する部分に対応し、かつすべてまたはほぼすべてのFRは、ヒト抗体に由来する部分に対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含む。抗体(例えば、非ヒト抗体)の「ヒト化形態」は、ヒト化が行われた抗体を指す。
「ヒト抗体」または「全ヒト化抗体」または「完全ヒト抗体」は、交換して使用されてもよく、ヒトまたはヒト細胞から生成され、または非ヒト由来のものから由来し、ヒト抗体ライブラリーや他のヒト抗体で配列がコードされた抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体についての当該定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。
本明細書で使用される「融合物」という用語は、2つまたは複数の最初別々のタンパク質/遺伝子/化合物を連結することによって形成される融合物を指す。融合物を構成する実体がタンパク質である場合、融合タンパク質と呼ばれる。融合タンパク質は、本願の融合物の範囲内に含まれる。例えば、IL-21をFc二量体に連結してIL-21融合タンパク質を形成するか、またはIL-21を完全な抗体もしくは抗体断片に連結してIL-21融合タンパク質を形成することもできる。融合物を構成する2つの実体の間の連結は、リンカーを介して達成されてもされなくてもよい。
本明細書に記載の「治療剤」という用語は、癌などの腫瘍の治療または予防に有効ないずれの物質も含み、化学療法剤、サイトカイン、血管新生抑制剤、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物、または免疫調節剤(例えば、免疫抑制剤)を含む。
「有効量」という用語は、本発明の抗体もしくは断片または組成物または組み合わせの1回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。「有効量」には、「治療有効量」または「予防有効量」が含まれてもよい。
「有効量」という用語は、本発明の抗体もしくは断片または組成物または組み合わせの1回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。「有効量」には、「治療有効量」または「予防有効量」が含まれてもよい。
「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、抗体もしくは抗体断片または組成物または組み合わせのいずれの毒性または有害作用も治療による有益な作用に及ばないという量でもある。未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ(例えば腫瘍体積)を少なくとも約40%、さらに、好ましくは少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%もしくは100%抑制する。「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防目的の用量が対象における疾患の初期段階より前にまたは疾患の初期段階に適用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」と「宿主細胞培養物」は、交換して使用されてもよく、外因性核酸が導入された細胞を指し、この細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の内容において親細胞と全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。
本明細書に使用される用語「標識」は、試薬(例えば、ポリヌクレオチドプローブもしくは抗体)に直接的または間接的に複合または融合され、かつ、その複合または融合の対象試薬による検出を促進する化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能(例えば、放射性同位体標識または蛍光標識)であるか、または、酵素触媒によって標識される場合に、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変に触媒作用を及ぼすことができる。当該用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング(即ち、物理的連結)することによってプローブもしくは抗体を直接標識すること、および、直接標識されている別の試薬との反応によりプローブもしくは抗体を間接的に標識することを含もうとする。
「個体」または「対象」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、家畜(例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ)、霊長類動物(例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類動物)、ウサギ、およびげっ歯類動物(例えば、マウスとラット)を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または対象はヒトである。
用語「抗腫瘍作用」は、さまざまな手段により表示できる生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減または腫瘍細胞の生存率の減少を含むが、これらに限定されない。
用語「腫瘍」および「癌」は、本明細書において交換して使用され、固形腫瘍および血液腫瘍を含む。
用語「癌」は、無秩序な細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物の生理学的疾患を指すか、または説明する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体による治療に適する癌は、癌の転移性形態を含む固形腫瘍または血液腫瘍などを含む。
用語「腫瘍」は、悪性か良性かを問わず、すべての腫瘍性(neoplastic)の細胞の成長と増殖、およびすべての前癌(pre-cancerous)と癌性の細胞と組織を含む。用語「癌」、「癌性」および「腫瘍」は、本明細書で言及される時に、互いに排他的ではない。
用語「薬用補助材料」は、活性物質とともに投与される希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全もしくは不完全))、賦形剤、ベクターや安定化剤などを指す。
用語「医薬組成物」は、それに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在するとともに、上記組成物が投与された対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。
用語「医薬組合せ」は、非固定組合せの製品または固定組合せの製品であり、薬物キット、医薬組成物を含むが、これらに限定されない。用語「非固定組合せ」とは、活性成分(例えば、(i)本発明の変異タンパク質または融合物、および(ii)他の治療剤)が、別個の実体で同時に、特定の時間制限なしに、または同じもしくは異なる時間間隔で、患者に順に投与されるものを指し、ここで、このような投与は、患者の体内において予防的または治療的に有効なレベルの2つ以上の活性剤を提供する。用語「固定組合せ」は、2つ以上の活性剤が単一実体の形態で同時に患者に投与されるものを指す。好ましくは、2種以上の活性剤の用量かつ/または時間間隔を選択することにより、各成分の併用が疾患または病症の治療において、いずれか1つの成分を単独で使用する場合よりもよい効果を達成することができる。各成分はそれぞれ、単独の製剤形態であってもよく、その製剤形態は同じであってもよく、異なってもよい。
用語「組合せ療法」は、2種以上の治療剤または治療形態(例えば、放射線治療や手術)を投与することにより、本明細書に記載の疾患を治療するものを指す。そのような投与は、ほぼ同時に、例えば、一定の割合の活性成分を有する単一のカプセルで、これらの治療剤を共投与することを含む。または、このような投与は、複数または別個の容器(例えば、錠剤、カプセル、粉末と液体)での各有効成分の共投与を含む。粉末かつ/または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、このような投与は、各タイプの治療剤を実質的に同じ時間、または異なる時間で順番によって使用することを含む。いずれの場合においても、治療プログラムは、本明細書に記載の病症または病状の治療における医薬組み合わせの有益な効果を提供する。
本明細書に使用される場合、「治療」は、存在している症状、病症、病状または疾患の進行または重症度を軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転することを指す。
本明細書に使用される場合、「予防」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症に係る症状の発生または進行に対する阻害を含む。いくつかの実施形態において、癌家族歴がある対象は、予防プログラムの候補である。一般的に、癌の背景では、用語「予防」は、癌にかかる病徴または症状が生じる前に、特に、癌に罹患するリスクのある対象に癌が生じる前の医薬投与を指す。
用語「ベクター」は、本明細書に使用される場合、それに連結された別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製の核酸構造としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。一部のベクターは、それに操作可能に連結された核酸の発現をガイドすることができる。かかるベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
「対象/患者/個体試料」は、患者または対象から得た細胞または流体の集まりを指す。組織または細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍されたかつ/または保存された器官や組織試料や生検試料や穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)や間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意段階に由来する細胞であってもよい。組織試料は、自然界において天然に組織と混ぜ合わせない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などを含んでもよい。
II.IL-21変異タンパク質およびその融合物
本発明のIL-21変異タンパク質の有利な生物学的特性
IL-21タンパク質は、短鎖サイトカインファミリーのすべてのメンバーによって共有される上-上-下-下のトポロジー構造に配列された4ヘリックスバンドルA、B、CおよびDを形成する。ループ構造は、4つのヘリックスバンドルを連結する。具体的には、ヒトIL-21(例えば配列番号74に示すようなもの)のドメインは、以下のとおりである。ここで、IL-21のN末端であるHelixは、IL-21Rに結合する領域であり、同様にIL-21Rに結合する領域は、HelixC、Cloopかつ/またはCD loopをさらに含むことが知られている。
本発明のIL-21変異タンパク質の有利な生物学的特性
IL-21タンパク質は、短鎖サイトカインファミリーのすべてのメンバーによって共有される上-上-下-下のトポロジー構造に配列された4ヘリックスバンドルA、B、CおよびDを形成する。ループ構造は、4つのヘリックスバンドルを連結する。具体的には、ヒトIL-21(例えば配列番号74に示すようなもの)のドメインは、以下のとおりである。ここで、IL-21のN末端であるHelixは、IL-21Rに結合する領域であり、同様にIL-21Rに結合する領域は、HelixC、Cloopかつ/またはCD loopをさらに含むことが知られている。
本発明者らは、以下の分子変異および改変を組み合わせて実施して、IL-21の安定性、創薬可能性を同時に改善し、良好な生産性能を達成することができ、また特定のT細胞に対する選択的活性化を向上させることができることを長期にわたる研究を通じて見出した。
1、IL-21/IL-4キメラ変異:IL-4のN末端アミノ酸でIL-21のN末端アミノ酸を置換して、より安定したIL-21のN末端コンフォメーションを取得し、IL-21またはその融合物の安定性をさらに改善し、創薬可能性をさらに改善する。
2、IL-21グリコシル化変異:IL-21Rとの結合界面にN-グリコシル化部位を導入することで、IL-21のグリコシル化パターンを変更し、IL-21とその受容体IL-21Rとの結合親和性を低下させることで、IL-21またはその融合物の安定性を改善し、その創薬可能性をさらに改善する。
3、IL-21界面アミノ酸変異:IL-21のIL-21Rに結合する界面に電荷または親水性/疎水性に類似するアミノ酸置換を導入して、IL-21変異タンパク質のIL-21Rへの結合性能を変更し、IL-21とその受容体IL-21Rとの結合親和性を低下させることで、IL-21またはその融合物の創薬可能性を改善する。
4、IL-21切断変異:IL-21のHelix A、CD loopまたはC loop領域で1つもしくは複数のアミノ酸またはアミノ酸セグメントを切断/欠失して、IL-21の局所構造を変更し、その局所構造をより安定させることで、IL-21の安定性を改善し、IL-21またはその融合物の創薬可能性をさらに改善する。
いくつかの実施形態において、本発明者らは、上記の1つもしくは複数(例えば2つ、3つもしくは4つすべて)の変異をさらに組み合わせて、IL-21変異タンパク質のIL-21Rへの結合性能を変更するか、あるいはIL-21変異タンパク質またはその融合物の安定性を変更することで、本発明の変異タンパク質またはその融合物に良好な創薬可能性を付与することを見出した。
いくつかの実施形態において、本発明の変異タンパク質の創薬可能性の改善は、上記変異タンパク質またはその融合物の半減期の延長、かつ/または生産されたタンパク質の純度の増加を含む。
改善された創薬可能性
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物は、改善された創薬可能性を有する。例えば、HEK293またはCHO細胞などの哺乳動物細胞に発現する時、特に変異タンパク質融合物(例えばFc融合タンパク質または抗体と形成された融合タンパク質)で発現する時、より高いタンパク質の純度に簡単に精製することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物は、改善された創薬可能性を有する。例えば、HEK293またはCHO細胞などの哺乳動物細胞に発現する時、特に変異タンパク質融合物(例えばFc融合タンパク質または抗体と形成された融合タンパク質)で発現する時、より高いタンパク質の純度に簡単に精製することができる。
いくつかの実施形態において、タンパク質Aのアフィニティークロマトグラフィーにより精製された後のタンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のIL-21変異タンパク質融合物または融合タンパク質は、野生型IL-21タンパク質の融合物または融合タンパク質と比較して、より高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、SEC-HPLC技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、精製後、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物の純度は、65%、70%、75%、80%もしくは85%以上、好ましくは85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、98%もしくは99%以上に達することができる。
他のいくつかの実施形態において、本発明に記載の改善された創薬可能性は、本発明のIL-21変異タンパク質または変異タンパク質融合物(例えばFc融合タンパク質または抗体と形成された融合タンパク質)が改善された半減期を有することを意味する。いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物の半減期は、既知のIL-21野生型タンパク質またはその融合物、あるいは既知のIL-21変異タンパク質またはその融合物の半減期よりも長くもよい。
低減されたIL-21受容体への結合親和性
体内でのIL-21の半減期は非常に短く、主な理由の1つは、それが細胞表面受容体と高い結合親和性を有するため、細胞に容易に取り込まれて分解されることである。したがって、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物は、野生型IL-21またはその融合物と比較して変異を導入するため、IL-21変異タンパク質またはその融合物が低減または除去された(検出不能)IL-21R受容体結合を有する。
体内でのIL-21の半減期は非常に短く、主な理由の1つは、それが細胞表面受容体と高い結合親和性を有するため、細胞に容易に取り込まれて分解されることである。したがって、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物は、野生型IL-21またはその融合物と比較して変異を導入するため、IL-21変異タンパク質またはその融合物が低減または除去された(検出不能)IL-21R受容体結合を有する。
いくつかの実施形態において、野生型IL-21(例えば配列番号74に示されるIL-21)またはその融合物と比較して、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物のIL-21R受容体への結合親和性は、少なくとも5倍、少なくとも10倍もしくは少なくとも25倍、特に少なくとも30倍、50倍もしくは100倍以上低減される。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質またはその融合物は、IL-21受容体に弱く結合するか、または検出不能な親和性で結合する。BLI親和性測定技術によって、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物と、受容体IL-21Rとの平衡解離定数(KD)を測定して、結合親和性を決定することができる。
増加した抗原陽性細胞に対する選択的活性化
本発明の変異タンパク質は、抗体、例えばモノクローナル抗体(例えば、PD-1、PD-L1もしくはPD-L2など、腫瘍に関連する抗原)と融合して、IL-21変異タンパク質-抗体融合物を産生することができ、当該融合物は、野生型IL-21変異タンパク質-抗体融合物と比較して、増加した抗原陽性細胞に対する選択的活性化能力を有する。
本発明の変異タンパク質は、抗体、例えばモノクローナル抗体(例えば、PD-1、PD-L1もしくはPD-L2など、腫瘍に関連する抗原)と融合して、IL-21変異タンパク質-抗体融合物を産生することができ、当該融合物は、野生型IL-21変異タンパク質-抗体融合物と比較して、増加した抗原陽性細胞に対する選択的活性化能力を有する。
いくつかの実施形態において、抗体は、PD-1に対する抗体、例えばPD-1に対するモノクローナル抗体である。野生型IL-21と比較して、IL-21変異タンパク質とPD-1抗体の融合タンパク質は、PD-1陰性の細胞における活性が比較的弱いか、または検出できず、PD-1陽性の細胞における活性が比較的高いか、または非常に高い。
したがって、本発明のIL-21変異タンパク質またはIL-21変異タンパク質融合物は、野生型IL-21タンパク質または融合物と比較して、より広い治療ウィンドウを有し、抗原(例えば腫瘍に関連する抗原)陽性の細胞を選択的に活性化することができ、例えば当該腫瘍に関連する抗原の細胞を発現し、例えば当該腫瘍に関連する抗原のT細胞を発現する。
一実施形態において、STAT3リン酸化測定試験において、T細胞におけるSTAT3リン酸化シグナルに対するIL-21変異タンパク質またはその抗体融合タンパク質の活性化を検出することで、T細胞(例えば、JAK-STATシグナル伝達経路)を活性化するIL-21変異タンパク質またはその抗体融合タンパク質の能力を同定する。例えば、本願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーにより細胞におけるSTAT3リン酸化を分析し、半数効果濃度(EC50)を決定することで、本発明のIL-21変異タンパク質またはその抗体融合タンパク質を活性化する活性を検出する。
本発明の変異タンパク質
IL-21/IL-4キメラ変異
一態様において、本発明は、IL-4のN末端アミノ酸でIL-21のN末端アミノ酸を置換したIL-21変異タンパク質を提供して、より安定したIL-21のN末端コンフォメーションを取得し、IL-21またはその融合物の安定性をさらに改善し、創薬可能性をさらに改善する。
IL-21/IL-4キメラ変異
一態様において、本発明は、IL-4のN末端アミノ酸でIL-21のN末端アミノ酸を置換したIL-21変異タンパク質を提供して、より安定したIL-21のN末端コンフォメーションを取得し、IL-21またはその融合物の安定性をさらに改善し、創薬可能性をさらに改善する。
いくつかの実施形態において、HelixA(N末端)における上記IL-21変異タンパク質の1個~15個のアミノ酸は、IL-4のN末端アミノ酸に置換されることができる。一実施形態において、上記IL-21変異タンパク質は、以下の置換を含む:
N末端の位置1~15、1~14、1~13、1~12、1~11、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5もしくは1~4におけるアミノ酸は、IL-4のN末端のアミノ酸に置換される。
N末端の位置1~15、1~14、1~13、1~12、1~11、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5もしくは1~4におけるアミノ酸は、IL-4のN末端のアミノ酸に置換される。
いくつかの実施形態において、置換に使用されるIL-4のN末端アミノ酸の位置は、その置換されるIL-21のアミノ酸の位置と同じである。例えば、本発明のIL-21変異タンパク質は、
IL-4の位置1~15におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~14におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~14におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~13におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~13におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~12におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~10におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~10におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~9におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~8におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~8におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~7におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~7におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~6におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~6におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~5におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~4におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~4におけるアミノ酸の置換、を含む。
IL-4の位置1~15におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~14におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~14におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~13におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~13におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~12におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~10におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~10におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~9におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~8におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~8におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~7におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~7におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~6におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~6におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~5におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~4におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~4におけるアミノ酸の置換、を含む。
いくつかの実施形態において、置換に使用されるIL-4のN末端アミノ酸の数は、その置換されるIL-21のアミノ酸の数と、1個~3個のアミノ酸の差を有する。例えば、IL-21変異タンパク質に含まれ得る置換は、IL-4の位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換である。
いくつかの実施形態において、置換に使用されるIL-4のN末端には、1つもしくは2つの置換が含まれてもよい。例えば、置換に使用されるIL-4のN末端には、C3Sが含まれてもよい。
IL-4に言及される場合、それは野生型IL-4または天然に存在するIL-4、例えばヒトに由来するIL-4(uniprot:P05112)であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明のIL-4のアミノ酸配列は、配列番号117に示される。この表現には、天然に存在するIL-4対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然IL-4の変異体もさらに含まれ、例えば、上記変異体は、天然IL-4(配列番号117)と少なくとも95%~99%もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または1個~5個以下のアミノ酸変異(例えば、保存的置換)を有してもよく、かつ好ましくは、天然IL-4タンパク質と基本的に同一のIL-4R結合親和性を有する。
いくつかの具体的な実施形態において、本発明のIL-4のN末端の位置1~15におけるアミノ酸は、HKSDITLQEIIKTLNもしくはHKCDITLQEIIKTLNに示される。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、
IL-4の位置1~5におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~5におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~9におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~9におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~15におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~15におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~12におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~12におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換、
IL-4の1~11におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換、または
IL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9の置換、という取り替え/置換を含む。
IL-4の位置1~5におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~5におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~9におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~9におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~15におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~15におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換、
IL-4の位置1~12におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~12におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換、
IL-4の1~11におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換、または
IL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはC3Sを含む位置1~11におけるアミノ酸によるIL-21の位置1~9の置換、という取り替え/置換を含む。
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、
IL-4の1~5&C3S(HKSDI)によるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~15&C3S(HKSDITLQEIIKTLN)によるIL-21の1~15(QGQDRHMIRMRQLID)の置換、
IL-4の1~12&C3S(HKSDITLQEIIK)によるIL-21の1~12(QGQDRHMIRMRQ)の置換、
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~11(QGQDRHMIRMR)の置換、または
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、という取り替え/置換を含む。
IL-4の1~5&C3S(HKSDI)によるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~15&C3S(HKSDITLQEIIKTLN)によるIL-21の1~15(QGQDRHMIRMRQLID)の置換、
IL-4の1~12&C3S(HKSDITLQEIIK)によるIL-21の1~12(QGQDRHMIRMRQ)の置換、
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~11(QGQDRHMIRMR)の置換、または
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、という取り替え/置換を含む。
IL-21-グリコシル化変異
いくつかの態様において、IL-21Rとの結合界面にN-グリコシル化部位を導入することで、IL-21のグリコシル化部位変異を変更し、IL-21とその受容体IL-21Rとの結合親和性を低下させることで、IL-21またはその融合物の安定性を改善し、その創薬可能性をさらに改善する。
いくつかの態様において、IL-21Rとの結合界面にN-グリコシル化部位を導入することで、IL-21のグリコシル化部位変異を変更し、IL-21とその受容体IL-21Rとの結合親和性を低下させることで、IL-21またはその融合物の安定性を改善し、その創薬可能性をさらに改善する。
本発明に適するグリコシル化部位変異は、以下から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個もしくは5個の位置で変異されることで、当該位置でグリコシル化される:
D4、R5、H6、M7、D15、V17、Q19、K21、D37、E39、R76、K77、P78、P79、S80、N82、G84、H120かつ/またはH122である。
D4、R5、H6、M7、D15、V17、Q19、K21、D37、E39、R76、K77、P78、P79、S80、N82、G84、H120かつ/またはH122である。
いくつかの実施形態において、上記位置におけるアミノ酸は、N、TもしくはSに変異される。
いくつかの実施形態において、IL-21変異タンパク質は、以下:
D4N、R5N、H6T、M7T、D15N、V17T、Q19N、K21T、D37N、E39T、R76N、K77N、P78T/S、P79T/N、S80N、N82T、G82T、G84T、H120Nかつ/またはH122Tから選択される1個、2個、3個、4個、もしくは5個の置換を含む。
D4N、R5N、H6T、M7T、D15N、V17T、Q19N、K21T、D37N、E39T、R76N、K77N、P78T/S、P79T/N、S80N、N82T、G82T、G84T、H120Nかつ/またはH122Tから選択される1個、2個、3個、4個、もしくは5個の置換を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、IL-21変異タンパク質は、以下:
D4&H6
R5&M7
D15&V17
IQ19&K21
R76&P78
K77&P78&P79
P79
S80 & N82
G84
H120&H122または
D37&E39という位置での置換または置換の組み合わせを含む。
D4&H6
R5&M7
D15&V17
IQ19&K21
R76&P78
K77&P78&P79
P79
S80 & N82
G84
H120&H122または
D37&E39という位置での置換または置換の組み合わせを含む。
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、IL-21変異タンパク質は、以下:
D4N&H6T
R5N&M7T
D15N&V17T
IQ19N&K21T
R76N&P78T
K77N&P78S&P79T
P79N
S80N&N82T
G84T
H120N&H122Tまたは
D37N&E39Tから選択される置換または置換の組み合わせを含む。
D4N&H6T
R5N&M7T
D15N&V17T
IQ19N&K21T
R76N&P78T
K77N&P78S&P79T
P79N
S80N&N82T
G84T
H120N&H122Tまたは
D37N&E39Tから選択される置換または置換の組み合わせを含む。
IL-21結合界面アミノ酸変異
IL-21のIL-21Rに結合する界面に電荷または親水性/疎水性に類似するアミノ酸置換を導入して、IL-21変異タンパク質のIL-21Rへの結合性能を変更し、IL-21とその受容体IL-21Rとの結合親和性を低減させることで、IL-21またはその融合物の創薬可能性を改善することができる。
IL-21のIL-21Rに結合する界面に電荷または親水性/疎水性に類似するアミノ酸置換を導入して、IL-21変異タンパク質のIL-21Rへの結合性能を変更し、IL-21とその受容体IL-21Rとの結合親和性を低減させることで、IL-21またはその融合物の創薬可能性を改善することができる。
このような変異の例は、IL-21結合界面における、特にHelix A、Helix CもしくはC loopにおける、特にI8、K72、K77、P78、かつ/またはP79から選択される1個~5個の位置、例えば1個もしくは2個の位置での置換を含むが、これらに限定されない。
いくつかの好ましい実施形態において、KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能である。
いくつかの実施形態において、IL-21変異タンパク質は、I8Q、K72E、K77D、P78Aかつ/またはP79Eから選択される置換の1個~5個、例えば1個もしくは2個を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、IL21変異タンパク質は、以下:
K72、
I8&P79、または
K77&P78から選択される位置または位置の組み合わせでの置換を含む。
K72、
I8&P79、または
K77&P78から選択される位置または位置の組み合わせでの置換を含む。
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、IL-21変異タンパク質は、以下:
という置換/置換の組み合わせを含む。
K72E
I8Q&P79E
K77D&P78A
という置換/置換の組み合わせを含む。
K72E
I8Q&P79E
K77D&P78A
IL-21切断変異
いくつかの態様において、本発明のIL-21変異タンパク質は、IL-21のHelix A、CD loopまたはC loopにおける1つもしくは複数のアミノ酸またはアミノ酸セグメントの欠失/切断を含み、それによりIL-21の局所構造を変更し、その局所構造をより安定させることで、IL-21の安定性を改善し、IL-21変異またはその融合物の創薬可能性をさらに改善する。
いくつかの態様において、本発明のIL-21変異タンパク質は、IL-21のHelix A、CD loopまたはC loopにおける1つもしくは複数のアミノ酸またはアミノ酸セグメントの欠失/切断を含み、それによりIL-21の局所構造を変更し、その局所構造をより安定させることで、IL-21の安定性を改善し、IL-21変異またはその融合物の創薬可能性をさらに改善する。
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、Helix AのN末端(例えば位置1~15)、CD loop(例えば位置82~95、好ましくは84~91)またはC loop(例えば位置76~81)における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸の欠失、または1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸セグメントの欠失を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、以下:
位置1~9、位置78~79、位置85~87もしくは位置84~91という位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含む。
位置1~9、位置78~79、位置85~87もしくは位置84~91という位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、上記変異タンパク質は、以下:
85~87の切断、
78~79の切断、
1~9の切断、
84~91の切断、または
1~9の切断&78~79の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの切断/欠失を含む。
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、上記変異タンパク質は、以下:
85~87(RRQ)の切断、
78~79(PP)の切断、
1~9(QGQDRHMIR)の切断、
84~91(GRRQKHRL)の切断、または
1~9(QGQDRHMIR)の切断&78~79(PP)の切断という切断/欠失を含む。
85~87の切断、
78~79の切断、
1~9の切断、
84~91の切断、または
1~9の切断&78~79の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの切断/欠失を含む。
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、上記変異タンパク質は、以下:
85~87(RRQ)の切断、
78~79(PP)の切断、
1~9(QGQDRHMIR)の切断、
84~91(GRRQKHRL)の切断、または
1~9(QGQDRHMIR)の切断&78~79(PP)の切断という切断/欠失を含む。
いくつかの実施形態において、上記変異タンパク質は切断/欠失を含むと同時に、ジスルフィド結合を除去し、Loopの柔軟性を向上させるために、システインの変異をさらに含む。例えば、上記変異タンパク質は、C42Aかつ/またはC93Tをさらに含んでもよい。したがって、上記変異タンパク質は、84~91(GRRQKHRL)の切断を含むと同時にC42AおよびC93Tをさらに含んでもよい。
他の変異
上記の変異に加えて、本発明のIL-21変異タンパク質は、それが本発明のIL-21変異タンパク質の上記の1つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に1つ以上の変異をさらに有してもよい。例えば、本発明のIL-21変異タンパク質は、ジスルフィド結合を減少させるために、他のアミノ酸による元のシステインの変異、またはシステインによる元のアミノ酸の変異をさらに含んでもよい。例えば、上記変異は、L123C、C42AもしくはC93Tであってもよい。当業者は、本発明のIL-21変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異をどのように決定するかを知っている。
上記の変異に加えて、本発明のIL-21変異タンパク質は、それが本発明のIL-21変異タンパク質の上記の1つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に1つ以上の変異をさらに有してもよい。例えば、本発明のIL-21変異タンパク質は、ジスルフィド結合を減少させるために、他のアミノ酸による元のシステインの変異、またはシステインによる元のアミノ酸の変異をさらに含んでもよい。例えば、上記変異は、L123C、C42AもしくはC93Tであってもよい。当業者は、本発明のIL-21変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異をどのように決定するかを知っている。
好ましい例示的な変異の組み合わせ
本発明のIL-21変異タンパク質は、本発明のIL-21変異タンパク質の改善された特性を有する本明細書に記載の1つもしくは複数の変異タイプの組み合わせ、または本明細書に記載の1つもしくは複数の変異タイプと他の変異(例えば当該分野で知られている他の変異)との組み合わせをさらに含んでもよい。
本発明のIL-21変異タンパク質は、本発明のIL-21変異タンパク質の改善された特性を有する本明細書に記載の1つもしくは複数の変異タイプの組み合わせ、または本明細書に記載の1つもしくは複数の変異タイプと他の変異(例えば当該分野で知られている他の変異)との組み合わせをさらに含んでもよい。
好ましい実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、野生型と比較して、本明細書に記載の変異の少なくとも2つを含み、例えば本明細書に記載の以下の変異の組み合わせ:
(1)IL-21/IL-4キメラ変異とIL-21グリコシル化変異、
(2)IL-21/IL-4キメラ変異とIL-21界面アミノ酸変異、
(3)IL-21/IL-4キメラ変異とIL-21切断変異、
(4)IL-21グリコシル化変異とIL-21界面アミノ酸変異、
(5)IL-21グリコシル化変異とIL-21切断変異、または
(6)IL-21界面アミノ酸変異とIL-21切断変異、を含む。
(1)IL-21/IL-4キメラ変異とIL-21グリコシル化変異、
(2)IL-21/IL-4キメラ変異とIL-21界面アミノ酸変異、
(3)IL-21/IL-4キメラ変異とIL-21切断変異、
(4)IL-21グリコシル化変異とIL-21界面アミノ酸変異、
(5)IL-21グリコシル化変異とIL-21切断変異、または
(6)IL-21界面アミノ酸変異とIL-21切断変異、を含む。
場合により、本発明のIL-21変異タンパク質は、C42AおよびC93Tなどの他の変異をさらに含み、例えば本発明のIL-21変異タンパク質は、IL-21界面アミノ酸変異、IL-21切断変異およびC42AとC93Tを含んでもよく、またはIL-21/IL-4キメラ変異およびL123Cを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、野生型と比較して、以下:
IL-21の1~9(QGQDRHMIR)の切断&Q19N&K21T、
IL-21の84~91(GRRQKHRL)の切断&C42A&C93T&Q19N&K21T、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&78~79(PP)の切断によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&K117N&I119TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D37N&E39TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D15N&V17TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、または
IL-4の1~5(HKCDI)&L123CによるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、から選択される変異または変異の組み合わせを含む。
IL-21の1~9(QGQDRHMIR)の切断&Q19N&K21T、
IL-21の84~91(GRRQKHRL)の切断&C42A&C93T&Q19N&K21T、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&78~79(PP)の切断によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&K117N&I119TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D37N&E39TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D15N&V17TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、または
IL-4の1~5(HKCDI)&L123CによるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、から選択される変異または変異の組み合わせを含む。
IL-21変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって表してもよく、または両方の間の異なるアミノ酸の数によって表してもよい。一実施形態において、IL-21変異タンパク質と野生型タンパク質との間は、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%の同一性、好ましくは90%以上の同一性、好ましくは95%、好ましくは97%以下、より好ましくは96%以下の同一性を有する。他の実施形態において、本発明の上記の4つの変異に加えて、IL-21変異タンパク質と野生型タンパク質との間は、15個以下、例えば1個~10個、もしくは1個~5個変異、例えば0個、1個、2個、3個、4個の変異をさらに有してもよく、好ましくは、上記他の変異は保存的置換であってもよい。
本発明のIL-21変異タンパク質
したがって、本発明は、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる変異タンパク質を提供する。本発明のIL-21変異タンパク質は、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、86%、87%、88%もしくは89%の同一性、好ましくは90%以上の同一性、好ましくは95%、好ましくは97%以下、より好ましくは96%以下の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含み、その条件は、これらのアミノ酸配列には本明細書に記載の特定の変異が含まれ、かつ野生型タンパク質と比較して、以下:
(i)より低い親和性、
(ii)より高い安定性、
(iii)改善された創薬可能性(例えばより長い半減期かつ/または改善された純度、例えばSEC純度)、かつ/または
(iv)抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、という改善された特性の1つもしくは複数を有する。
したがって、本発明は、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる変異タンパク質を提供する。本発明のIL-21変異タンパク質は、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、86%、87%、88%もしくは89%の同一性、好ましくは90%以上の同一性、好ましくは95%、好ましくは97%以下、より好ましくは96%以下の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含み、その条件は、これらのアミノ酸配列には本明細書に記載の特定の変異が含まれ、かつ野生型タンパク質と比較して、以下:
(i)より低い親和性、
(ii)より高い安定性、
(iii)改善された創薬可能性(例えばより長い半減期かつ/または改善された純度、例えばSEC純度)、かつ/または
(iv)抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、という改善された特性の1つもしくは複数を有する。
本発明の変異タンパク質融合物
一態様において、本発明は、本発明のIL-21変異タンパク質の融合物、例えば融合タンパク質をさらに提供する。一実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、抗体のFc断片もしくは完全な抗体またはその抗原結合断片に連結して、IL-21変異タンパク質融合タンパク質を得ることができる。
一態様において、本発明は、本発明のIL-21変異タンパク質の融合物、例えば融合タンパク質をさらに提供する。一実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、抗体のFc断片もしくは完全な抗体またはその抗原結合断片に連結して、IL-21変異タンパク質融合タンパク質を得ることができる。
好ましい一実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えば抗体Fc断片と融合される。したがって、一実施形態において、本発明は、抗体Fc断片に連結する本発明のIL-21変異タンパク質を含むIL-21変異タンパク質-Fc融合タンパク質を提供する。
本発明に使用されるFc断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異を含むことができる。好ましい一実施形態において、Fc断片は、低減されたFc領域により媒介されるエフェクター機能を有し、例えば低減または排除されたADCCまたはADCPまたはCDCエフェクター機能を有する。例えば、いくつかの特別な実施形態において、本発明に使用されるFc断片は、Fcγ受容体に対する結合を低減するL234A/L235A変異を有する。
いくつかの実施形態において、IL-21変異タンパク質と融合されるFc断片は、ヒトIgG1 Fc、ヒトIgG2 FcまたはヒトIgG4 FcなどのヒトIgG Fcである。好ましくは、上記Fc断片は、L234A/L235A変異を含むヒトIgG1 FcなどのヒトIgG1 Fcである。一実施形態において、Fc断片は、配列番号70のアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%の同一性、例えば95%、96%、97%、99%もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態において、IL-21変異タンパク質は、Fcに直接融合される。いくつかの実施形態において、リンカー連結を介してIL-21変異タンパク質とFcを連結することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質-Fc融合タンパク質は、IL-21変異タンパク質がリンカーを介して、または抗体Fc断片のN末端に直接連結する鎖Aを含み、好ましくは、上記融合タンパク質は2つの同じ鎖Aを含む。別のいくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、2つの異なる鎖Aを含むか、または1つの鎖AおよびIL-21変異タンパク質に連結していないFc断片を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質-Fc融合タンパク質に含まれる鎖Aが異なるか、または1つの鎖Aおよび1つのIL-21変異タンパク質に連結していないFc断片を含む。例えば、Knob-in-Hole技術に基づいて、第1鎖AのFc断片にKnobを導入し、かつ別の鎖AのFc断片または別のFc断片にHole変異を導入し、逆にも同じである。
いくつかの具体的な実施形態において、本発明にかかるFc断片と融合されるIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、野生型IL-21を含む融合タンパク質と比較して、本発明の変異タンパク質の特性、例えば低減されたFc受容体に対する親和性、より高い安定性かつ/または改善された創薬可能性(例えば延長した半減期または増加した生産純度)を有する。
一具体的な実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、図2のFormat1に示される形態を有する。
当業者に理解されるように、本発明に適用される融合タンパク質のFc断片は任意の抗体Fc断片であってもよい。
いくつかの具体的な実施形態において、本発明にかかるFcと融合されるIL-21変異タンパク質融合タンパク質の鎖Aは、配列番号2~32のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
別の好ましい実施形態において、本発明は、IL-21変異タンパク質およびそれに連結する抗体またはその抗原結合断片を含むIL-21変異タンパク質-抗体融合タンパク質をさらに提供する。
本発明のIL-21変異タンパク質と抗体またはその抗原結合断片とが形成するIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、対応する野生型IL-21融合タンパク質と比較して、本発明の変異タンパク質の特性、例えば低減された受容体に対する親和性、より高い安定性、改善された創薬可能性(例えば延長した半減期または増加した生産純度)を有し、かつ/または増加した上記抗体が対象とする抗原陽性の細胞に対する選択的活性化を有する。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、腫瘍に関連する抗原に対する抗体、例えばPD-1、PD-L1もしくはPD-L2である。
本明細書に記載のIL-21変異タンパク質は、直接的に、もしくはリンカーを介して抗体またはその抗原結合断片に連結することができる。いくつかの実施形態において、本発明のIL-21変異タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片のC末端に連結する。
IL-21変異タンパク質との連結に適する抗体は、完全な抗体、またはその抗原結合断片であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、IgG1形態の抗体、IgG2形態の抗体、IgG3形態の抗体またはIgG4形態の抗体であり、好ましくは、IgG1形態の抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト化されたものである。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はキメラ抗体である。一実施形態において、本発明の抗体の抗原結合断片は、Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、単鎖抗体(例えばscFv)、(Fab’)2、単一ドメイン抗体(例えばVHH)、dAb(domain antibody)または線状抗体という抗体断片から選択される。
本発明の一具体的な実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質は、完全な抗体の1つもしくは2つの重鎖のC末端またはN末端に連結してIL-21変異タンパク質-抗体融合タンパク質を形成する。
本発明の一実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質-抗体融合タンパク質は、抗体の2つの重鎖のC末端にそれぞれ連結するIL-21変異タンパク質を含む。本発明の一実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質-抗体融合タンパク質は、抗体の1つの重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質、および1つの抗体重鎖を含み、好ましくは、ヘテロ二量体を形成しやすくするために、抗体は、2つの重鎖にknob-into-hole構造を導入する。いくつかの実施形態において、IL-21変異タンパク質に連結する抗体重鎖にはKnob変異が含まれ、IL-21変異タンパク質に連結していない抗体重鎖にはhole変異が含まれ、逆にも同じである。いくつかの実施形態において、Knob変異は、Knob:S354C&T366Wであり、かつ/またはHole変異は、Y349C&T366S&L368A&Y407Vである。
本発明の一実施形態において、上記のPD-1に対する抗体またはその抗原結合断片は、CN201680040482.0に開示される抗PD-1抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、CN201680040482.0に開示される抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の1つもしくは複数のCDR(好ましくは3つのCDR、即ちHCDR1、HCDR2HおよびHCDR3、またはLCDR1、LCDR2およびLCDR3、より好ましくは6つのCDR、即ちHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含むか、またはCN201680040482.0に開示される抗PD-1抗体またはその抗原結合断片のVHかつ/またはVLを含むか、または上記抗体の重鎖かつ/または軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(HCDR)であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む。いくつかの実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(LCDR)であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。いくつかの実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(HCDR)と、軽鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(LCDR)とを含む。
いくつかの態様において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域(VH)を含む。いくつかの態様において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域(VH)を含む。いくつかの態様において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域は、重鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(CDR)であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(CDR)であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖をさらに含む。
いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域VHは、
(i)配列番号115のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(ii)配列番号115のアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号115のアミノ酸配列と比較して、1つもしくは複数(好ましくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、好ましくは、上記アミノ酸変異はCDR領域に生じない。
(i)配列番号115のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(ii)配列番号115のアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号115のアミノ酸配列と比較して、1つもしくは複数(好ましくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、好ましくは、上記アミノ酸変異はCDR領域に生じない。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域VLは、
(i)配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(ii)配列番号116のアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号116のアミノ酸配列と比較して、1つもしくは複数(好ましくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、好ましくは、上記アミノ酸変異はCDR領域に生じない。
(i)配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(ii)配列番号116のアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号116のアミノ酸配列と比較して、1つもしくは複数(好ましくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、好ましくは、上記アミノ酸変異はCDR領域に生じない。
いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(HCDR)であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3は、
(i)配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、あるいは
(ii)(i)の配列に対して、上記3つのHCDR領域に合計で少なくとも1個であり、かつ5個、4個、3個、2個もしくは1個以下のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)が含まれる配列、から選択される。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(LCDR)であるLCDR1、LCDRおよびLCDR3は、
(i)配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3、あるいは
(ii)(i)の配列に対して、上記3つのLCDR領域に合計で少なくとも1個であり、かつ5個、4個、3個、2個もしくは1個以下のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)が含まれる配列、から選択される。
(i)配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域であるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、あるいは
(ii)(i)の配列に対して、上記3つのHCDR領域に合計で少なくとも1個であり、かつ5個、4個、3個、2個もしくは1個以下のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)が含まれる配列、から選択される。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域からの3つの相補性決定領域(LCDR)であるLCDR1、LCDRおよびLCDR3は、
(i)配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域であるLCDR1、LCDR2およびLCDR3、あるいは
(ii)(i)の配列に対して、上記3つのLCDR領域に合計で少なくとも1個であり、かつ5個、4個、3個、2個もしくは1個以下のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)が含まれる配列、から選択される。
いくつかの実施形態において、HCDR1は、配列番号109のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、HCDR1は、配列番号109のアミノ酸配列と比較して1個、2個もしくは3個の変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、HCDR2は、配列番号110のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、HCDR2は、配列番号110のアミノ酸配列と比較して1個、2個もしくは3個の変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、HCDR3は、配列番号111のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、HCDR3は、配列番号111のアミノ酸配列と比較して1個、2個もしくは3個の変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、LCDR1は、配列番号112のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、LCDR1は、配列番号112のアミノ酸配列と比較して1個、2個もしくは3個の変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、LCDR2は、配列番号113のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、LCDR2は、配列番号113のアミノ酸配列と比較して1個、2個もしくは3個の変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、LCDR3は、配列番号114のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、LCDR3は、配列番号114のアミノ酸配列と比較して1個、2個もしくは3個の変異(好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域HCは、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4の重鎖定常領域、好ましくはIgG1の重鎖定常領域であり、例えばLALA変異を有するIgG1の重鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域にknob-into-holeの変異を導入する。例えば1つの重鎖定常領域にS354CおよびT366Wの変異を導入してknob変異を含む抗体重鎖を取得し、かつ/または別の重鎖定常領域にY349C&T366S&L368A&Y407Vの変異を導入してhole変異を含む抗体重鎖を取得する。いくつかの実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域は、lambdaまたはKappa軽鎖定常領域である。
いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、
(i)配列番号71から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号71から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号71から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
(i)配列番号71から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号71から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号71から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片のknob変異を含む重鎖は、
(i)配列番号73から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号73から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号73から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
(i)配列番号73から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号73から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号73から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片のhole変異を含む重鎖は、
(i)配列番号33から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号33から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号33から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
(i)配列番号33から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号33から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号33から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、
(i)配列番号34から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号34から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号34から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
(i)配列番号34から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
(ii)配列番号34から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
(iii)配列番号34から選択されるアミノ酸配列と比較して1つもしくは複数(好ましくは20個もしくは10個以下、より好ましくは5個、4個、3個、2個、1個以下)のアミノ酸変異(好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換)を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、
それぞれアミノ酸配列の配列番号109、110および111に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号112、113および114に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
それぞれアミノ酸配列の配列番号109、110および111に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号112、113および114に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号115に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVHと、配列番号116に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVLと、を含む。
配列番号115に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVHと、配列番号116に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるVLと、を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号71に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号34に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
配列番号71に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号34に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
いくつかの好ましい実施形態において上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、2つの同じ重鎖および2つの同じ軽鎖を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号73に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる、knob変異を含む重鎖、
配列番号33に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる、hole変異を含む重鎖、
および、配列番号34に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
配列番号73に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる、knob変異を含む重鎖、
配列番号33に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる、hole変異を含む重鎖、
および、配列番号34に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、上記抗PD-1抗体またはその抗原結合断片は、hole変異を含む1つの重鎖、knob変異を含む1つの重鎖、および2つの同じ上記軽鎖を含む。
本発明の一具体的な実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の重鎖C末端にリンカーを介して、または直接連結する本発明のIL-21変異タンパク質である鎖B、という構造を含む。
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の重鎖C末端にリンカーを介して、または直接連結する本発明のIL-21変異タンパク質である鎖B、という構造を含む。
一実施形態において、鎖BのIL-21変異タンパク質は、抗体の重鎖C末端とリンカーを介して連結する。
一実施形態において、本明細書に記載の変異タンパク質融合タンパク質は、2つの同じ鎖Aおよび2つの同じ鎖Bを含む。
一実施形態において、本明細書に記載の変異タンパク質融合タンパク質は、図2のFormat2に示される構造を有する。
本発明の一実施形態において、鎖Aおよび鎖Bが由来する抗体は、PD-1、PD-L1もしくはPD-L2に対する抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Aおよび鎖Bが由来する抗体は、CN201680040482.0の抗PD-L1抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Aおよび鎖Bが由来する抗体には、CN201680040482.0の抗PD-1抗体の6つのCDRが含まれるか、または上記抗体のVHかつ/またはVLが含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Aおよび鎖Bが由来する抗体には、IgG1重鎖定常領域、例えばLALA変異を有するIgG1が含まれる。
いくつかの実施形態において、鎖Aには、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2かつ/またはLCDR3が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Aには、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Aには、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Aは、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖を含むか、あるいは上記軽鎖である。一実施形態において、鎖Aは、配列番号34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、鎖Bの抗体重鎖には、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2かつ/またはHCDR3が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Bの抗体重鎖には、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Bの抗体重鎖には、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Bの抗体重鎖には、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖が含まれる。一実施形態において、鎖Bに含まれる抗体重鎖は、配列番号71に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、鎖Bに含まれるIL-21変異タンパク質は、配列番号75~105のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、かつ本発明に記載の変異を含む。
いくつかの実施形態において、鎖Bは、配列番号35~54のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
本発明の一具体的な実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の1つの重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B1、
抗体の重鎖である鎖B2、という構造を含む。
抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の1つの重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B1、
抗体の重鎖である鎖B2、という構造を含む。
一実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、2つの鎖A、1つの鎖B1および1つの鎖B2を含む。
一実施形態において、鎖B1およびB2がヘテロ二量体を形成しやすくするために、鎖B1および鎖B2にknob-into-hole変異を導入する。一実施形態において、鎖B1にはknob変異が含まれ、鎖B2にはhole変異が含まれる。一実施形態において、knob変異はS354CおよびT366Wの変異であり、かつ/またはhole変異はY349C&T366S&L368A&Y407Vである。一実施形態において、本明細書に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質は、図2のFormat3に示される構造を有する。
本発明の一実施形態において、鎖A、鎖B1および鎖B2が由来する抗体は、PD-1、PD-L1もしくはPD-L2に対する抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖A、鎖B1および鎖B2が由来する抗体は、CN201680040482.0の抗PD-L1抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖A、鎖B1および鎖B2が由来する抗体には、CN201680040482.0の抗PD-1抗体の6つのCDRが含まれるか、または上記抗体VHかつ/またはVLが含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Aおよび鎖Bが由来する抗体には、IgG1重鎖定常領域、例えばLALA変異を有するIgG1が含まれる。
いくつかの実施形態において、鎖Aには、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2かつ/またはLCDR3が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Aには、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Aには、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Aは、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の軽鎖を含むか、あるいは上記軽鎖である。一実施形態において、鎖Aは、配列番号34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、鎖B1もしくは鎖B2には、それぞれ上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域HCDR1、HCDR2かつ/またはHCDR3が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖B1もしくは鎖B2には、それぞれ上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖B1もしくは鎖B2には、それぞれ上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖B1には、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片のknob変異を含む重鎖が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖B2には鎖B1には、上記の抗PD-1抗体またはその抗原結合断片のhole変異を含む重鎖が含まれる。
一実施形態において、鎖B1に含まれる抗体重鎖は、配列番号73に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、鎖B1に含まれるIL-21変異タンパク質は、配列番号75~105のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ本発明に記載の変異を含む。
いくつかの実施形態において、鎖B1は、配列番号55~67のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。
一実施形態において、鎖B2は、配列番号33に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
当業者には明らかなように、本発明に適用される融合物においてIL-21変異タンパク質とFc断片もしくは抗体とを連結するリンカーは、当該分野で既知の任意のリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、and(GGGS)nから選択されるリンカー配列を含んでもよく、ここで、nは少なくとも1の整数である。好ましくは、リンカーは(G4S)2もしくは(G4S)3を含む。
III.ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主
本発明は、上記任意のIL-21変異タンパク質または融合物をコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法により、新規固相DNA合成、または野生型IL-21をコードする既存の配列のPCR変異誘発によって産生することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含んでもよく、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに操作可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
本発明は、上記任意のIL-21変異タンパク質または融合物をコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法により、新規固相DNA合成、または野生型IL-21をコードする既存の配列のPCR変異誘発によって産生することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含んでもよく、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに操作可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター、例えば、真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体(YAC)を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはpcDNA3.1発現ベクターである。
本発明はまた、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。IL-21変異タンパク質または融合物の発現を複製および支持するのに適用される宿主細胞は、当該分野で周知である。特定の発現ベクターでこのような細胞をトランスフェクションまたは形質導入することができるとともに、ベクターを含む多くの細胞を大規模な発酵槽に接種するために増殖させることができ、臨床的使用のための十分な量のIL-21変異体または融合物が得られる。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞(例えばCHO細胞もしくは293細胞)から選択される。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40から形質転換されたサル腎CV1系(COS-7)、ヒト胎児腎系(Expi293細胞などの293もしくは293T細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、マウスセルトリ(sertoli)細胞(TM4細胞)、サル腎細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎細胞(MDCK)、buffaloラット肝細胞(BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(HepG2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT060562)、TRI細胞、MRC5細胞およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、dhfr-CHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞と、YO、NS0、P3X63およびSp2/0などの骨髄腫細胞株と、を含む。一実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞であり、好ましくはHEK293細胞(Expi293)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎(HEK)細胞またはリンパ球(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)などの哺乳動物細胞である。
IV.調製方法
さらなる態様において、本発明は、本発明のIL-21変異タンパク質または融合物を調製する方法を提供し、ここで、上記方法は、IL-21変異タンパク質または融合物の発現に適した条件で、上記タンパク質または融合物をコードする核酸を含む上記で提供されるような宿主細胞を培養するステップと、場合により上記宿主細胞(または宿主細胞培地)から上記タンパク質または融合物を回収するステップとを含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明のIL-21変異タンパク質または融合物を調製する方法を提供し、ここで、上記方法は、IL-21変異タンパク質または融合物の発現に適した条件で、上記タンパク質または融合物をコードする核酸を含む上記で提供されるような宿主細胞を培養するステップと、場合により上記宿主細胞(または宿主細胞培地)から上記タンパク質または融合物を回収するステップとを含む。
V.測定法
当該分野で既知の様々な測定方法を利用して、本明細書により提供されるIL-21変異タンパク質またはその融合物に対して同定、スクリーニング、またはその物理的/化学的特性かつ/または生物学的活性の特性評価を行うことができる。
当該分野で既知の様々な測定方法を利用して、本明細書により提供されるIL-21変異タンパク質またはその融合物に対して同定、スクリーニング、またはその物理的/化学的特性かつ/または生物学的活性の特性評価を行うことができる。
一態様において、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物のIL-21受容体への結合活性、例えば親和性を測定することができる。例えば、ELISA、Westernブロットなどのような当該分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示される例示的な方法を利用して、ヒトIL-21Rとの結合を測定することができる。候補として、結合ダイナミクス(例えばKD値)を含む変異タンパク質と受容体との結合は、IL-21-Fc融合タンパク質もしくはIL-21と抗体の融合タンパク質を使用して、BLI測定法によって測定することができる。
さらなる態様において、受容体結合下流で発生するシグナル伝達かつ/または免疫活性化効果を測定することで、IL-21変異タンパク質またはその融合物のIL-21受容体への結合能力を間接的に測定することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異IL-21タンパク質またはその融合物を同定するための測定法を提供する。生物学的活性は、例えばIL-21受容体を有するT細胞におけるIL-21シグナル伝達を誘導する能力を含んでもよい。本発明は、インビボかつ/またはインビトロにこのような生物学的活性を有する変異IL-21タンパク質も提供する。
当該分野で既知のさまざまな方法は、IL-21またはその融合物の生物学的活性を測定するために使用できる。例えば、本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物のSTAT3リン酸化を誘導する能力を測定する。
さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、製品の純度などの本発明の変異タンパク質またはその融合物の創薬可能性を特徴付けることができる。製品純度の測定について、得られた生産細胞の培養上清に対してワンステップ精製を実施した後、純度を測定して、変異タンパク質の精製性能を検出することができる。好ましくは、本発明の変異タンパク質は、精製後に野生型タンパク質よりも有意に優れた純度を有し、本発明の変異タンパク質がより良好な精製性能を有することを示している。純度測定法は、SEC-HPLC法を含むが、これに限定されない、当該分野で既知の任意の従来の方法であってもよい。
さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、本発明の変異タンパク質またはその融合物の半減期などの薬物動態特性を特徴付けることができる。
VI.IL-21タンパク質の改変方法
さらなる態様において、本発明は、改善された特性を有するIL-21変異タンパク質を得るための方法およびこの方法により得られたIL-21変異タンパク質を提供する。
さらなる態様において、本発明は、改善された特性を有するIL-21変異タンパク質を得るための方法およびこの方法により得られたIL-21変異タンパク質を提供する。
一実施形態において、本発明の方法は、
(a)以下の1つもしくは複数の本発明の変異:
1、IL-21/IL-4キメラ変異、
2、IL-21グリコシル化変異、
3、IL-21界面アミノ酸変異、かつ/または
4、IL-21切断変異、によってIL-21変異タンパク質のアミノ酸配列を取得し、
場合により、上記IL-21変異タンパク質を他のタンパク質またはポリペプチド、例えばFc断片、抗体またはその抗原結合断片に連結して、IL-21変異タンパク質融合物を取得することをさらに含む、
(b)上記IL-21変異タンパク質をコードする核酸分子を合成するか、または上記IL-21変異タンパク質融合物をコードする各鎖を含む核酸分子を合成する、
(c)哺乳動物細胞(例えばHEK293もしくはCHO細胞)に(b)の核酸分子を導入し、上記IL-21変異タンパク質またはその融合物を発現する、というステップを含む。
一実施形態において、本発明の方法は、ステップ(a)~(c)の後、変異タンパク質またはその融合物の特性:(i)精製後のタンパク質純度(例えば、SEC-HPLC検出によるワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度)、(ii)低減された結合、および場合による(iii)延長した半減期を同定するステップをさらに含む。
一実施形態において、上記方法は、ステップ(a)~(c)の変異を組み合わせる前、細胞(例えばT細胞)に対する変異タンパク質またはその融合物の活性化、例えばJAK-STATシグナル伝達経路への結合、例えばSTAT3に対するリン酸化を同定することを含む。
(a)以下の1つもしくは複数の本発明の変異:
1、IL-21/IL-4キメラ変異、
2、IL-21グリコシル化変異、
3、IL-21界面アミノ酸変異、かつ/または
4、IL-21切断変異、によってIL-21変異タンパク質のアミノ酸配列を取得し、
場合により、上記IL-21変異タンパク質を他のタンパク質またはポリペプチド、例えばFc断片、抗体またはその抗原結合断片に連結して、IL-21変異タンパク質融合物を取得することをさらに含む、
(b)上記IL-21変異タンパク質をコードする核酸分子を合成するか、または上記IL-21変異タンパク質融合物をコードする各鎖を含む核酸分子を合成する、
(c)哺乳動物細胞(例えばHEK293もしくはCHO細胞)に(b)の核酸分子を導入し、上記IL-21変異タンパク質またはその融合物を発現する、というステップを含む。
一実施形態において、本発明の方法は、ステップ(a)~(c)の後、変異タンパク質またはその融合物の特性:(i)精製後のタンパク質純度(例えば、SEC-HPLC検出によるワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度)、(ii)低減された結合、および場合による(iii)延長した半減期を同定するステップをさらに含む。
一実施形態において、上記方法は、ステップ(a)~(c)の変異を組み合わせる前、細胞(例えばT細胞)に対する変異タンパク質またはその融合物の活性化、例えばJAK-STATシグナル伝達経路への結合、例えばSTAT3に対するリン酸化を同定することを含む。
VII.医薬組成物および医薬製剤
本発明は、IL-21変異タンパク質またはその融合物を含む組成物(医薬組成物または医薬製剤を含む)、およびIL-21変異タンパク質またはその融合物をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、当該分野で既知の薬学的に許容可能なベクター、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な賦形剤などの適切な薬用補助材料を必要に応じて含んでもよい。
本発明は、IL-21変異タンパク質またはその融合物を含む組成物(医薬組成物または医薬製剤を含む)、およびIL-21変異タンパク質またはその融合物をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、当該分野で既知の薬学的に許容可能なベクター、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な賦形剤などの適切な薬用補助材料を必要に応じて含んでもよい。
VIII.組み合わせ製品
一態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合物、および1つもしくは複数の他の治療剤(例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など)を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
一態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合物、および1つもしくは複数の他の治療剤(例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など)を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
いくつかの実施形態において、上記組み合わせ製品は癌の予防または治療に用いられる。
IX.治療方法および使用
一態様において、本発明は、癌などの対象の疾患を予防または治療する方法に関し、上記方法は、有効量の本明細書に記載の任意のIL-21変異タンパク質、またはその融合物を上記対象に投与することを含む。癌は、早期、中期または末期にある癌または転移性癌であってもよい。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍または血液腫瘍であってもよい。
一態様において、本発明は、癌などの対象の疾患を予防または治療する方法に関し、上記方法は、有効量の本明細書に記載の任意のIL-21変異タンパク質、またはその融合物を上記対象に投与することを含む。癌は、早期、中期または末期にある癌または転移性癌であってもよい。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍または血液腫瘍であってもよい。
本発明のIL-21変異タンパク質またはその融合物(およびそれを含む医薬組成物、場合による他の治療剤)は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療に必要な場合、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、投与は、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路によることができる。本明細書において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス注入などの様々な投与スケジュールが含まれる。
疾患を予防または治療するために、本発明のIL-21変異タンパク質の適切な用量(単独で投与される場合または1つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与される場合)が、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度とその進行、予防目的の投与か治療目的の投与か、過去の治療、患者の臨床病歴および上記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。上記抗体は、単回の治療で、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
さらなる態様において、本発明はまた、上記方法に使用される(例えば治療に使用される)薬物の調製における、本発明のIL-21変異タンパク質、組成物および融合物の使用を提供する。
本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。いかなる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。
本発明にかかる上記と他の態様および実施形態は、図面(図面の簡単な説明がその後に続く)と以下の発明の詳細な説明において記載され、以下の実施例に例示されている。上記および本願にわたって説明された特徴のいずれかまたはすべては、本発明の各実施形態において組み合わせることができる。以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。
実施例
実施例1:IL-21変異体の設計および構築
インターロイキン21(Interleukin 21、IL-21)は、体内で主に活性化されたCD4+Th細胞およびNKT細胞によって分泌される4つのαヘリックス鎖で構成された樽形構造のサイトカイン(図1A)であり、IL-2、IL-4およびIL-15との相同性が比較的高く、いずれもγc受容体ファミリーのサイトカインに属する。IL-21受容体は、それぞれIL-21RαとIL-2Rγcである2つの鎖で構成される。IL-21とIL-21Rαとの結合界面は、ヘリックスA、ヘリックスCおよび一部のCD Loop(図1C)である。IL-21とIL-21Rαとの結合を弱めるために、IL-21と受容体との相互作用残基を減少または減弱させることによって、野生型IL-21(uniprot:Q9HBE4、配列番号74)に対して、4種類のIL-21変異体を設計し、3種類の分子形態(Format)によって検証されている。具体的には、設計された変異は、主に以下の変異形態を含む:
1) IL-21/IL-4キメラに関して、IL-21とIL-4の構造が相同であるため、IL-21とIL-4の一部が二次構造に置換され、即ちIL-21のN末端がIL-4のN末端アミノ酸によって置換される、
2) IL-21グリコシル化変異体に関して、IL-21とその受容体界面にN-グリコシル化部位変異を導入する、
3) IL-21界面アミノ変異体、
4) IL-21切断変異体、
5) 組み合わせ変異体に関して、少なくとも上記4種類のうちの任意の2つ、3つもしくは4つすべてを含む。
実施例1:IL-21変異体の設計および構築
インターロイキン21(Interleukin 21、IL-21)は、体内で主に活性化されたCD4+Th細胞およびNKT細胞によって分泌される4つのαヘリックス鎖で構成された樽形構造のサイトカイン(図1A)であり、IL-2、IL-4およびIL-15との相同性が比較的高く、いずれもγc受容体ファミリーのサイトカインに属する。IL-21受容体は、それぞれIL-21RαとIL-2Rγcである2つの鎖で構成される。IL-21とIL-21Rαとの結合界面は、ヘリックスA、ヘリックスCおよび一部のCD Loop(図1C)である。IL-21とIL-21Rαとの結合を弱めるために、IL-21と受容体との相互作用残基を減少または減弱させることによって、野生型IL-21(uniprot:Q9HBE4、配列番号74)に対して、4種類のIL-21変異体を設計し、3種類の分子形態(Format)によって検証されている。具体的には、設計された変異は、主に以下の変異形態を含む:
1) IL-21/IL-4キメラに関して、IL-21とIL-4の構造が相同であるため、IL-21とIL-4の一部が二次構造に置換され、即ちIL-21のN末端がIL-4のN末端アミノ酸によって置換される、
2) IL-21グリコシル化変異体に関して、IL-21とその受容体界面にN-グリコシル化部位変異を導入する、
3) IL-21界面アミノ変異体、
4) IL-21切断変異体、
5) 組み合わせ変異体に関して、少なくとも上記4種類のうちの任意の2つ、3つもしくは4つすべてを含む。
IL-21の野生型タンパク質および上記の変異タンパク質をFc(IgG1に由来し、LALA変異、配列番号70)にリンカー(G4S)2(配列番号69)を介してそれぞれ連結し、ジスルフィド結合を介して2つの鎖を連結し、Format Iの融合タンパク質形態に構築し、IL-21の野生型タンパク質および変異タンパク質を抗PD-1抗体(CN201680040482.0に由来し、重鎖HCの配列が配列番号71に示され、軽鎖LCの配列が配列番号34に示される)の重鎖C末端にそれぞれ直接連結し、Format IIの融合タンパク質形態に構築し、またはIL-21の野生型タンパク質および変異タンパク質をknob-into-holeの抗PD-1抗体(CN201680040482.0に由来し、軽鎖LCの配列が配列番号34に示され、knob重鎖(即ちHC-knob、IgG1形態、LALA変異を有する)の配列が配列番号73に示され、Hole重鎖(即ちHC-hole、IgG1形態、LALA変異を有する)の配列が配列番号33に示される)のknob重鎖C末端にリンカー(G4S)3(配列番号72)を介してそれぞれ連結し、Format IIIの融合タンパク質形態に構築し、ここで、Format I、IIおよびIIIの融合タンパク質形態は図2を参照する。
上記変異およびFormatの詳細な情報は次のとおりである。
上記変異およびFormatの詳細な情報は次のとおりである。
IL-21/IL-4キメラ変異の設計
IL-21のNMR構造(PDB:2OQP)は、そのN末端が比較的活性であり、相対的に安定したコンフォメーションを持たないことが示され、構造のアラインメント(図1B)によってIL-4とIL-21の構造の類似度が比較的高く、かつそのN末端コンフォメーションがより安定していることが分かった。したがって、IL-4のN末端アミノ酸でIL-21のN末端アミノ酸を置換して、より安定したIL-21のN末端コンフォメーションを取得するように設計し、かつ分子の創薬可能性を最適化する。
具体的な設計は、下記の表1に示される:
IL-21のNMR構造(PDB:2OQP)は、そのN末端が比較的活性であり、相対的に安定したコンフォメーションを持たないことが示され、構造のアラインメント(図1B)によってIL-4とIL-21の構造の類似度が比較的高く、かつそのN末端コンフォメーションがより安定していることが分かった。したがって、IL-4のN末端アミノ酸でIL-21のN末端アミノ酸を置換して、より安定したIL-21のN末端コンフォメーションを取得するように設計し、かつ分子の創薬可能性を最適化する。
具体的な設計は、下記の表1に示される:
IL-21グリコシル化変異体
IL-21は、細胞表面へのIL-21Rの吸着(sink効果)により、体内でのその半減期が短くなる。発明者らは、IL-21とその受容体との結合界面にグリコシル化部位を導入してグリコシル化を導入することで、IL-21とその受容体との間の相互結合を反発させ、さらにIL-21のその受容体に対する親和性を低減させ、体内でのIL-21の半減期を延長すると同時に、IL-21表面へのグリコシル化を導入することは、分子の凝集状態を改善し、分子の創薬可能性を最適化することができることを見出した。
IL-21は、細胞表面へのIL-21Rの吸着(sink効果)により、体内でのその半減期が短くなる。発明者らは、IL-21とその受容体との結合界面にグリコシル化部位を導入してグリコシル化を導入することで、IL-21とその受容体との間の相互結合を反発させ、さらにIL-21のその受容体に対する親和性を低減させ、体内でのIL-21の半減期を延長すると同時に、IL-21表面へのグリコシル化を導入することは、分子の凝集状態を改善し、分子の創薬可能性を最適化することができることを見出した。
IL-21界面アミノ酸変異体
IL-21とIL-21Rが結合する界面では、電荷または親水性と疎水性が類似するアミノ酸で対応する位置のアミノ酸を変異させ、さらにIL-21のその受容体に対する親和性を低減させ、かつ分子の創薬可能性を最適化する。
IL-21とIL-21Rが結合する界面では、電荷または親水性と疎水性が類似するアミノ酸で対応する位置のアミノ酸を変異させ、さらにIL-21のその受容体に対する親和性を低減させ、かつ分子の創薬可能性を最適化する。
IL-21切断変異体
Helix A、CD loopもしくはC loopを切断することによって、その局所構造をより安定させ、IL-21の安定性を増加させることができ、さらにその創薬可能性(例えば、SEC純度)を改善する。
Helix A、CD loopもしくはC loopを切断することによって、その局所構造をより安定させ、IL-21の安定性を増加させることができ、さらにその創薬可能性(例えば、SEC純度)を改善する。
実施例2:IL-21変異体の発現精製
発現プラスミドの構築
融合タンパク質分子001~065の各鎖の配列は、GENEWIZ遺伝子合成に送られ、それぞれpCDNA3.1テンプレートプラスミドに構築され、細胞の一過性発現のために一定量のプラスミドが調製された。
発現プラスミドの構築
融合タンパク質分子001~065の各鎖の配列は、GENEWIZ遺伝子合成に送られ、それぞれpCDNA3.1テンプレートプラスミドに構築され、細胞の一過性発現のために一定量のプラスミドが調製された。
必要なトランスフェクション体積に応じて、Expi293細胞(Thermo)を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を1.5×106個の細胞/mLに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約3×106個の細胞/mLであった。最終体積の1/10(v/v)のOpti-MEM培地(Gibco製品番号:31985-070)をトランスフェクション緩衝液として、上記で構築した発現プラスミドを加え、均一に混合し、0.22μmのフィルターヘッドでろ過して使用に備えた。前のステップのプラスミドに適量のポリエチレンイミン(PEI)(Polysciences、23966)を加え(各プラスミドとPEIの質量比率が1:3)、均一に混合してから室温で10minインキュベートし、DNA/PEI混合物を得た。DNA/PEI混合物をExpi293細胞に慎重に注入して(Format I形態の融合タンパク質分子の場合は、鎖を含むpCNDA3.1のプラスミドを細胞にトランスフェクションし、Format IIとIII形態の融合タンパク質分子の場合は、重鎖を含むpCNDA3.1プラスミドおよび軽鎖を含むpCNDA3.1プラスミドを細胞に同時トランスフェクションする)、均一に混合し、37℃、8%のCO2の条件で24h培養した後、最終濃度が2mMおよび2%(v/v)Feed(1g/LのPhytone Peptone+1g/LのDifco Select Phytone)になるようにVPA(Sigma、製品番号:P4543-100G)を補充し、6日間培養を続けた。
タンパク質の精製:遠心分離し、細胞上清を収集した。メーカーの取扱説明書に従って、プレパックカラムHitrap Mabselect Sure(GE、11-0034-95)で上清液を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に5倍カラム体積の平衡液(20mMのTris、150mMのNaCl、pH7.2)で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに10倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、5倍カラム体積の溶出緩衝液(100mMのsodium citrate、pH3.5)で充填剤をすすぎ、溶出液を収集した。溶出液1mLあたり80μLのTris(2MのTris)を加え、限外ろ過濃縮管(MILLIPORE、製品番号:UFC901096)を用いてPBS緩衝液(Gibco、製品番号:70011-044)に交換し、濃度を測定した。100μgの精製後のタンパク質を濃度が1mg/mLになるまで調整し、ゲルろ過クロマトグラフィーカラムSW3000(TOSOH製品番号:18675)でタンパク質の純度を測定した。結果は表11を参照する。
表11から分かるように、野生型IL-21(033対照)は、ワンステップアフィニティー精製後に試料の純度がわずか61%であったが、本発明のIL-21変異体の純度はいずれも野生型よりも優れ、034~065のうちの21個の分子は純度が85%以上に達し、それぞれ034、037、039、043~044、046~050、053~060、062~063および065であり、さらに、001~032のすべてまたは一部の分子のSEC純度を同様に測定しており、これらの分子のSEC純度がいずれも野生型分子001より高ったことが示される(データは示さていない)。上記の結果は、本発明の変異体が野生型IL-21よりも安定で凝集しにくく、より高い純度を得ることができ、改善された創薬可能性を有することが示される。
実施例3.IL-21変異体のその受容体に対する親和性の測定
ヒトIL-21R(R&D systems)に結合する本発明のIL-21変異体の平衡解離定数(KD)は、バイオレイヤー干渉(BiolayerInterferometry、BLI)技術によって測定された。BLI法による親和性の測定は、従来の方法(Estep,P et al.,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p270-8)で行われた。
実験開始より半時間前に、試料の数量に応じて、適切な数量のAHC(ForteBio、18-5060)センサをSD buffer(PBS 1×、BSA 0.1%、Tween(登録商標)-20 0.05%)に浸漬した。
ヒトIL-21R(R&D systems)に結合する本発明のIL-21変異体の平衡解離定数(KD)は、バイオレイヤー干渉(BiolayerInterferometry、BLI)技術によって測定された。BLI法による親和性の測定は、従来の方法(Estep,P et al.,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p270-8)で行われた。
実験開始より半時間前に、試料の数量に応じて、適切な数量のAHC(ForteBio、18-5060)センサをSD buffer(PBS 1×、BSA 0.1%、Tween(登録商標)-20 0.05%)に浸漬した。
100μLのSD緩衝液、IL-21融合タンパク質(分子033~065、ここで、分子033は対照として野生型IL-21融合タンパク質である)、IL-21R(R&D systems、9249-R2-100)を96ウェルの黒色ポリスチレンハーフボリュームマイクロプレート(Greiner、675076)にそれぞれ加えた。試料の位置に対応するようにプレートを配置し、センサの位置を決定した。次のように機器パラメータを設定した。ステップBaseline、Loading~1nm、Baseline、AssociationおよびDissociationを実行し、試料の結合と解離の速度で各ステップの実行時間を決定し、回転速度は400rpmで、温度は30℃であった。ForteBio分析ソフトウェアを用いてKD値を分析した。結果は表12を参照する。
IL-21変異体のその受容体に対する親和性データは表12に示される。野生型IL-21(033)のIL-21Rに対する親和性KDは8.29E-10Mであるが、この研究で得られたIL-21変異体のIL-21Rに対する一価親和性はいずれも非常に弱く、ここで、分子002~032のKD値は3.74E-10よりも低いか、または機器の検出範囲よりも低く(結合なし(N.B.)に示され、データは示されず)、分子034~065の分子の一部の分子のKD値も機器の検出範囲よりも低く、ここで結合なし(N.B.)として示される(表12)。
体内でのIL-21の半減期は非常に短く、主な理由の1つは、それが細胞表面受容体と高い親和性を有するため、細胞に容易に取り込まれて分解されることである。したがって、受容体への結合能力が弱められたIL-21変異体は、体内での半減期がより長くなる。
実施例4:インビトロ機能実験
実験方法:
一、HuT78 PD1陽性細胞の調製
- トランスフェクションの前日、対数増殖期の293T細胞(ATCC、CRL-3216)を選択し、T175スクエアフラスコ(NUNC、159910)に接種した。
- トランスフェクションの1h前に培地を捨て、18mLの無血清DMEM培地(HyClone、SH30022.01B)を加え、37℃、5% CO2のインキュベーター(Thermo、4111)に再度入れた。
- 遠心分離管1に1mLのOpti-MEM(Gibco、31985-070)および105μLのPEIpro(Polyplus、115-100)を加え、軽く均一に混合し、室温で5minインキュベートした。遠心分離管2に1mLのOpti-MEM、20μgのレンチウイルスプラスミド(hPD1-kozaka-cds、pLVX-IRES-EGFP)(GENEWIZ Inc、蘇州)、10μgのpSPAX2(GENEWIZ Inc、蘇州)および5μgのpMG2.G(GENEWIZ Inc、蘇州)を加え、軽く均一に混合し、室温で5minインキュベートした。
- 2つの遠心分離管の混合物を一緒に混合し、軽く均一に混合し、室温で20minインキュベートした。
- 混合したトランスフェクション混合物を培養フラスコに加え、培養フラスコを軽く振とうして均一にし、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて培養した。
- 4~6hトランスフェクション後に培養フラスコ内の培地を吸引し、10%の血清(HyClone、SH30406.05)および1%の二重抗体(Gibco、15140-122)を含むDMEM培地25mLを加え、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて培養した。
- 48hトランスフェクション後に細胞上清液を収集して4℃の冷蔵庫に保存し、元のフラスコに10%の血清および1%の二重抗体を含むDMEM培地25mLを加え、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて培養した。
- 72hトランスフェクション後に細胞上清液を再度収集し、48hに収集した細胞上清液と混合した。
- 冷凍遠心分離機(Thermo Scientific、SA40R)を使用し、4℃、2000gで10min遠心分離し、細胞破片を除去した。
- 遠心分離後、0.22μmの低タンパク質結合フィルター膜(sartorius、stedim、16541-k)で上清液をろ過した。
- 上清液の1/3体積の濃縮試薬(Takara、631232)を加え、軽く均一に混合し、4℃の冷蔵庫で一晩静置した。
- 4℃、1500gで45min遠心分離し、慎重に上清を捨て、ウイルス粒子沈殿物を捨てないように注意し、レンチウイルス粒子沈殿物を取得した。
- 1mLの標的感染細胞培地(RPMI1640(Hyclone、SH30809.01)、10%のFBS(HyClone、SH30406.05)、および1%のPen Strep(Gibco、15140-122))で前のステップで得られたレンチウイルス粒子沈殿物を再懸濁し、沈殿物を吹き飛ばさずに軽く懸濁し、4℃で4h静置してウイルスを溶解し、レンチウイルス溶液を取得し、100μL/管に分注した後に-80℃で凍結保存した。
- 感染の前日に、対数増殖期のHuT78細胞(ATCC、TIB-161)を選択し、3×105/ウェル、各ウェル3mLで6ウェルプレート(NEST、703001)に接種した。
- 各ウェルに凍結融解したレンチウイルス溶液100μLを加え、軽く均一に混合し、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて3日培養し、HuT78-GFP-PD1として命名されたPD-1-GFP陽性細胞を取得した。
- HuT78とHuT78-GFP-PD1細胞300gを取って、室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- フローサイトメトリー(BD、FACS Symphony)によってGFPとPD1の陽性率を検出した。
実験方法:
一、HuT78 PD1陽性細胞の調製
- トランスフェクションの前日、対数増殖期の293T細胞(ATCC、CRL-3216)を選択し、T175スクエアフラスコ(NUNC、159910)に接種した。
- トランスフェクションの1h前に培地を捨て、18mLの無血清DMEM培地(HyClone、SH30022.01B)を加え、37℃、5% CO2のインキュベーター(Thermo、4111)に再度入れた。
- 遠心分離管1に1mLのOpti-MEM(Gibco、31985-070)および105μLのPEIpro(Polyplus、115-100)を加え、軽く均一に混合し、室温で5minインキュベートした。遠心分離管2に1mLのOpti-MEM、20μgのレンチウイルスプラスミド(hPD1-kozaka-cds、pLVX-IRES-EGFP)(GENEWIZ Inc、蘇州)、10μgのpSPAX2(GENEWIZ Inc、蘇州)および5μgのpMG2.G(GENEWIZ Inc、蘇州)を加え、軽く均一に混合し、室温で5minインキュベートした。
- 2つの遠心分離管の混合物を一緒に混合し、軽く均一に混合し、室温で20minインキュベートした。
- 混合したトランスフェクション混合物を培養フラスコに加え、培養フラスコを軽く振とうして均一にし、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて培養した。
- 4~6hトランスフェクション後に培養フラスコ内の培地を吸引し、10%の血清(HyClone、SH30406.05)および1%の二重抗体(Gibco、15140-122)を含むDMEM培地25mLを加え、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて培養した。
- 48hトランスフェクション後に細胞上清液を収集して4℃の冷蔵庫に保存し、元のフラスコに10%の血清および1%の二重抗体を含むDMEM培地25mLを加え、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて培養した。
- 72hトランスフェクション後に細胞上清液を再度収集し、48hに収集した細胞上清液と混合した。
- 冷凍遠心分離機(Thermo Scientific、SA40R)を使用し、4℃、2000gで10min遠心分離し、細胞破片を除去した。
- 遠心分離後、0.22μmの低タンパク質結合フィルター膜(sartorius、stedim、16541-k)で上清液をろ過した。
- 上清液の1/3体積の濃縮試薬(Takara、631232)を加え、軽く均一に混合し、4℃の冷蔵庫で一晩静置した。
- 4℃、1500gで45min遠心分離し、慎重に上清を捨て、ウイルス粒子沈殿物を捨てないように注意し、レンチウイルス粒子沈殿物を取得した。
- 1mLの標的感染細胞培地(RPMI1640(Hyclone、SH30809.01)、10%のFBS(HyClone、SH30406.05)、および1%のPen Strep(Gibco、15140-122))で前のステップで得られたレンチウイルス粒子沈殿物を再懸濁し、沈殿物を吹き飛ばさずに軽く懸濁し、4℃で4h静置してウイルスを溶解し、レンチウイルス溶液を取得し、100μL/管に分注した後に-80℃で凍結保存した。
- 感染の前日に、対数増殖期のHuT78細胞(ATCC、TIB-161)を選択し、3×105/ウェル、各ウェル3mLで6ウェルプレート(NEST、703001)に接種した。
- 各ウェルに凍結融解したレンチウイルス溶液100μLを加え、軽く均一に混合し、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて3日培養し、HuT78-GFP-PD1として命名されたPD-1-GFP陽性細胞を取得した。
- HuT78とHuT78-GFP-PD1細胞300gを取って、室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- フローサイトメトリー(BD、FACS Symphony)によってGFPとPD1の陽性率を検出した。
二、HuT78とHuT78-GFP-PD1細胞におけるIL-21変異体のSTAT3検出
- HuT78とHuT78-GFP-PD1細胞の濃度をそれぞれ5×106/mLに調整し、HuT78:HuT78-GFP-PD1=3:7に従って混合し、300gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 上記の上清を除去した細胞に等体積のDCM希釈液(L34963)を加え、室温で暗所で10minインキュベートした。
- 3倍体積のFACS緩衝液(500mLのPBS(Gibco、0020000034)、50mLのFBS、5mLのEDTA(invitrogen))を加え、300gで室温で5min遠心分離し、上清を除去し、等体積の培地(RPMI1640(Hyclone、SH30809.01)、10%のFBS(HyClone、SH30406.05)、および1%のPen Strep(Gibco、15140-122))を加えて再懸濁し、細胞混合液を取得した。
- 各ウェルに前のステップで調製した細胞混合液100μL、rhIL-21(R&D systems、8879-IL-050)100μLまたは本発明の033~065分子を加え、均一に混合し、37℃で20min水浴した。
- 各ウェルにPBSで10%に希釈した固定液(Pierce(商標) 16%のFormaldehyde(w/v)、Methanol-free、28906)50μLをさらに加え、37℃で10min水浴した。
- 600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 上清が除去された各ウェルにPBSで0.05%に希釈したTriton50μLを加え、氷上でウェルを通して5minインキュベートした。
- 各ウェルに200μLのFACS緩衝液を加え、600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに200μLのFACS緩衝液を加え、500gで室温で4min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに200μLのメタノール(国薬集団化学試剤有限公司、10014118)を加えて均一に混合し、-20℃で一晩放置した。
- 600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに200μLのFACS緩衝液を加え、600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルを50μLのSTAT3染色液(FACS緩衝液+PE結合のpSTAT3抗体)で再懸濁し、室温で暗所で60minインキュベートした。
- HuT78とHuT78-GFP-PD1細胞の濃度をそれぞれ5×106/mLに調整し、HuT78:HuT78-GFP-PD1=3:7に従って混合し、300gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 上記の上清を除去した細胞に等体積のDCM希釈液(L34963)を加え、室温で暗所で10minインキュベートした。
- 3倍体積のFACS緩衝液(500mLのPBS(Gibco、0020000034)、50mLのFBS、5mLのEDTA(invitrogen))を加え、300gで室温で5min遠心分離し、上清を除去し、等体積の培地(RPMI1640(Hyclone、SH30809.01)、10%のFBS(HyClone、SH30406.05)、および1%のPen Strep(Gibco、15140-122))を加えて再懸濁し、細胞混合液を取得した。
- 各ウェルに前のステップで調製した細胞混合液100μL、rhIL-21(R&D systems、8879-IL-050)100μLまたは本発明の033~065分子を加え、均一に混合し、37℃で20min水浴した。
- 各ウェルにPBSで10%に希釈した固定液(Pierce(商標) 16%のFormaldehyde(w/v)、Methanol-free、28906)50μLをさらに加え、37℃で10min水浴した。
- 600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 上清が除去された各ウェルにPBSで0.05%に希釈したTriton50μLを加え、氷上でウェルを通して5minインキュベートした。
- 各ウェルに200μLのFACS緩衝液を加え、600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに200μLのFACS緩衝液を加え、500gで室温で4min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに200μLのメタノール(国薬集団化学試剤有限公司、10014118)を加えて均一に混合し、-20℃で一晩放置した。
- 600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに200μLのFACS緩衝液を加え、600gで室温で5min遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルを50μLのSTAT3染色液(FACS緩衝液+PE結合のpSTAT3抗体)で再懸濁し、室温で暗所で60minインキュベートした。
実験結果:
IL-21がT細胞表面のIL-21受容体に結合すると、Tリンパ球のJAK-STATシグナル伝達経路を活性化し、STAT3がリン酸化されるため、リン酸化されたSTAT3(pSTAT3)のレベルで当該シグナル伝達経路の活性化の程度を評価した。
IL-21がT細胞表面のIL-21受容体に結合すると、Tリンパ球のJAK-STATシグナル伝達経路を活性化し、STAT3がリン酸化されるため、リン酸化されたSTAT3(pSTAT3)のレベルで当該シグナル伝達経路の活性化の程度を評価した。
以下の結果が得られた(表13):rhIL-21および033のIL21は野生型IL-21であり、PD1陰性のHuT78細胞に対してシグナル伝達経路を活性化する活性が非常に高く、EC50はそれぞれ~1.61E-009nMおよび0.046nMであり、この研究の変異体のEC50値はいずれも野生型IL-21よりも大きく、即ちPD1陰性細胞を活性化する活性がより低く示された。例えば、041、049、053~055、059、061および063~064は100nMの場合、活性化する活性が極めて弱く、または活性が検出できないと示された。図3Aに示されるとおりである。
逆に、PD1陽性のHuT78細胞(HuT78-GFP-PD1)に対して、rhIL-21の活性EC50は~1.59E-009nM、033は6.3E-05nMであり、この研究の変異体融合タンパク質分子053、054、055、061および063を活性化する活性EC50はそれぞれ、0.034、0.043、0.092、0.831および0.8217nMであるため、PD1陽性のT細胞における本発明のIL-21変異体の活性はrhIL-21より低いが、PD-1陰性細胞におけるその活性よりも大幅に向上したことが示された。図3Bに示されるとおりである。
上記の結果から分かるように、PD1陰性のHuT78細胞における本発明の変異体の活性が非常に低いが、PD1陽性のHuT78-GFP-PD1細胞における活性が非常に高く、その活性EC50はほとんど0.1nMより低く、最大で5.5nMより低いため、この研究で得られたIL-21変異体は2種類の細胞において非常に広い治療ウィンドウを有し、PD1陽性のT細胞を選択的に活性化できることが示された。
図4を参照し、発明者らは、本発明の融合タンパク質分子053と対照分子(本願では106としてコード化され、ここで、IL-21変異タンパク質改変情報は、特許出願US20190046611A1に開示された配列番号241のIL-21変異タンパク質に由来し、本発明の抗PD1抗体-融合タンパク質であり、ここで、抗PD1抗体の配列は、重鎖-Knob:配列番号68、重鎖-Hole:配列番号33、軽鎖:配列番号034であり、実施例2に記載のように調製された)のシグナル伝達経路を活性化する活性をさらに比較した。結果から、PD1陰性のHuT78細胞における本発明の融合タンパク質分子053の活性(図4A)は分子106より明らかに弱いが、PD1陽性のHuT78-GFP-PD1細胞における分子053と分子106の活性がほぼ同等であることが示され(図4B)、既知の変異体と比較して、本発明で得られたIL-21変異体はPD-1の陰性と陽性の細胞との間でより大きい活性ウィンドウを有することがさらに示された。
Claims (31)
- IL-21変異タンパク質であって、
前記変異タンパク質は、野生型IL-21(好ましくはヒトIL-21、より好ましくは配列番号74の配列を含むIL-21)と比較して、以下:
(i)IL-4(好ましくはヒトIL-4)の位置1~15におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~15におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~15におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~14におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~14におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~14におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~13におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~13におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~13におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~12におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~12におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~12におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~11におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~11におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~10におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~10におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~10におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~9におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~9におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~8におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~8におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~8におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~7におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~7におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~7におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~6におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~6におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~6アミノ酸の置換;IL-4の位置1~5におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~5におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~5におけるアミノ酸の置換;IL-4の位置1~4におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~4におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~4におけるアミノ酸の置換;またはIL-4の位置1~11におけるアミノ酸もしくはCS3を含む位置1~11におけるアミノ酸による、IL-21の位置1~9におけるアミノ酸の置換、
(ii)D4、R5、H6、M7、D15、V17、Q19、K21、D37、E39、R76、K77、P78、P79、S80、N82、G84、H120かつ/またはH122の位置から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個または5個の位置での変異による当該位置でのグリコシル化、
(iii)I8、K72、K77、P78、かつ/またはP79から選択される1個~5個の位置、例えば1個もしくは2個の位置での置換であって、ここで、前記KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能である置換、
(iv)Helix AのN末端(例えば位置1~15)、CD loop(例えば位置82~95、もしくは84~91)またはC loop(例えば位置76~81)での1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸の欠失、あるいは1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のアミノ酸を含むセグメントの欠失、
の変異の1つもしくは複数を含み、
ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号74により番号付けられるアミノ酸位置である、
IL-21変異タンパク質。 - 前記変異(i)における置換のためのIL-4のN末端の位置1~15におけるアミノ酸は、HKSDITLQEIIKTLNまたはHKCDITLQEIIKTLNであり、
より好ましくは、前記変異(i)の変異は、
IL-4の1~5&C3S(HKSDI)によるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、
IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
IL-4の1~15&C3S(HKSDITLQEIIKTLN)によるIL-21の1~15(QGQDRHMIRMRQLID)の置換、
IL-4の1~12&C3S(HKSDITLQEIIK)によるIL-21の1~12(QGQDRHMIRMRQ)の置換、
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~11(QGQDRHMIRMR)の置換、または
IL-4の1~11&C3S(HKSDITLQEII)によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、から選択される、
請求項1に記載の変異タンパク質。 - 前記変異(ii)における変異は、前記位置におけるアミノ酸をN、TもしくはSに置換することであり、
好ましくは、前記変異(ii)は、
D4N、R5N、H6T、M7T、D15N、V17T、Q19N、K21T、D37N、E39T、R76N、K77N、P78T/S、P79T/N、S80N、N82T、G82T、G84T、H120Nかつ/またはH122Tから選択される1個、2個、3個、4個、もしくは5個の置換を含み、
より好ましくは、前記変異(ii)は、
D4&H6
R5&M7
D15&V17
IQ19&K21
R76&P78
K77&P78&P79
P79
S80&N82
G84
H120&H122または
D37&E39という位置での置換または置換の組み合わせから選択され、
最も好ましくは、前記変異(ii)は、
D4N&H6T
R5N&M7T
D15N&V17T
IQ19N&K21T
R76N&P78T
K77N&P78S&P79T
P79N
S80N&N82T
G84T
H120N&H122Tまたは
D37N&E39Tでの置換または置換の組み合わせから選択される、
請求項1に記載のIL-21変異タンパク質。 - 前記変異(iii)における変異は、
I8Q、K72E、K77D、P78Aかつ/またはP79Eから選択される1個~5個、例えば1個もしくは2個の置換を含み、
好ましくは、前記変異(iii)における変異は、
K72、
I8&P79、または
K77&P78という位置または位置の組み合わせでの置換であり、ここで、KがDもしくはEで置換可能であり、PがEもしくはAで置換可能であり、またはIがQで置換可能であり、
好ましくは、前記変異(iii)における変異は、
K72E
I8Q&P79Eまたは
K77D&P78Aから選択される、
請求項1に記載のIL-21変異タンパク質。 - 前記変異(iv)における変異は、位置1~9、位置78~79、位置85~87、もしくは位置84~91から選択される位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含み、
好ましくは、前記変異(iv)における変異は、
85~87の切断、
78~79の切断、
1~9の切断、
84~91の切断、または
1~9の切断&78~79の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの欠失であり、
好ましくは、前記変異(iv)における変異は、
85~87(RRQ)の切断、
78~79(PP)の切断、
1~9(QGQDRHMIR)の切断、
84~91(GRRQKHRL)の切断、または
1~9(QGQDRHMIR)の切断&78~79(PP)の切断から選択されるアミノ酸セグメントの欠失である、
請求項1に記載のIL-21変異タンパク質。 - 前記変異タンパク質は、
(i)1~9(QGQDRHMIR)の切断&Q19N&K21T、
(ii)84~91(GRRQKHRL)の切断&C42A&C93T&Q19N&K21T、
(iii)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&78~79(PP)の切断によるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(iv)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&K117N&I119TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(v)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D37N&E39TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、
(vi)IL-4の1~9&C3S(HKSDITLQE)&D15N&V17TによるIL-21の1~9(QGQDRHMIR)の置換、または
(vii)IL-4の1~5(HKCDI)&L123CによるIL-21の1~5(QGQDR)の置換、から選択される変異を含む、
請求項1に記載のIL-21変異タンパク質。 - 前記野生型IL-21は、配列番号74もしくは配列番号106~108に示されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列と少なくとも95%~99%もしくはそれ以上の同一性を有するまたは1個~10個もしくは1個~5個以下のアミノ酸保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1~6のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質。 - 前記変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、以下:
(i)より低いIL-21Rに対する親和性、
(ii)より高い安定性、
(iii)改善された創薬可能性(例えばより長い半減期かつ/または改善された純度、例えばSEC純度)、かつ/または
(iv)抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、
という改善された特性の1つもしくは複数を有する、
請求項1~7のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質。 - 前記変異タンパク質は、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、配列番号75~105から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、86%、87%、88%もしくは89%の同一性、好ましくは90%以上の同一性、好ましくは95%、好ましくは97%以下、より好ましくは96%以下の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1~7のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質。 - 請求項1~8のいずれか1項に記載のIL2変異タンパク質を含む、
IL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - Fc断片に連結される請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質を含むか、あるいは、抗体またはその抗原結合断片に連結される請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質を含み、
ここで、前記連結は、リンカーによるものまたはリンカーによらないものである、
請求項10に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 前記Fc断片はヒトのIgG Fc、例えば、ヒトIgG1 Fc、ヒトIgG2 Fc、もしくはヒトIgG4 Fcであり、好ましくは、前記Fc断片はヒトIgG1 Fc、例えばL234A/L235A変異を含むヒトIgG1 Fcであり、より好ましくは、前記Fc断片は、配列番号70のアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%の同一性、例えば95%、96%、97%、99%もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
請求項11に記載の変異タンパク質融合タンパク質。 - 前記抗体が対象とする抗原は、PD-1、PD-L1またはPD-L2である、
請求項11に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 前記抗体が対象とする抗原はPD-1であり、かつ前記抗体またはその抗原結合断片は、
(1)配列番号115に示されるVHに含まれる3つの相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに配列番号116に示されるVLに含まれる3つの相補性決定領域LCDR1、LCDR2およびLCDR3、または
(2)それぞれアミノ酸配列の配列番号109、110および111に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号112、113および114に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3、を含む、
請求項12に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 前記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号115に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるVHと、配列番号116に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるVLと、を含む、
請求項14に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - IL-21変異タンパク質がリンカーを介して、またはFc断片のN末端に直接連結する鎖Aを含み、
好ましくは、前記融合タンパク質が2つの同じ鎖Aを含む、
請求項10~12のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 鎖Aは配列番号1~32のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
請求項16に記載の変異タンパク質融合タンパク質。 - 抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B、という構造を含み、
好ましくは、前記変異タンパク質融合タンパク質は、2つの同じ鎖Aおよび2つの同じ鎖Bを含む、
請求項10、11、13~15のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 鎖Aは、配列番号34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または鎖Bは、配列番号35~54のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項15に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 抗体の軽鎖である鎖A、
抗体の1つの重鎖のC末端に連結するIL-21変異タンパク質である鎖B1、および
抗体の重鎖である鎖B2、という構造を含み、
好ましくは、前記融合タンパク質は2つの同じ鎖A、1つの鎖B1および1つの鎖B2を含み、好ましくは、鎖B1はknob変異、例えばS354C&T366Wを含み、鎖B2はhole変異、例えばY349C&T366S&L368A&Y407Vを含む、
請求項10、11、13~15のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 鎖Aは、配列番号34に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ/または鎖B1は、配列番号55~67のいずれか1項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなり、かつ/または鎖B2は、配列番号33に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項20に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、and(GGGS)nから選択されるリンカー配列を含み、ここで、nは少なくとも1である整数であり、好ましくは、リンカーは(G4S)2もしくは(G4S)3を含む、
請求項10~21のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質。 - 単離したポリヌクレオチドであって、
請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質または請求項10~22のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質における鎖をコードする、
ポリヌクレオチド。 - 請求項23に記載のポリヌクレオチドを含む、
発現ベクター。 - 請求項23に記載のポリヌクレオチドまたは請求項24に記載のベクターを含む宿主細胞であって、
好ましくは、酵母細胞または哺乳動物細胞、特にHEK293細胞またはCHO細胞である、
宿主細胞。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質または請求項10~22のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質融合タンパク質を生産するための方法であって、
前記IL-21変異タンパク質または融合タンパク質の発現に適する条件で、請求項25に記載の宿主細胞を培養することを含む、
方法。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質または請求項10~12のいずれか1項に記載の融合タンパク質と、場合により薬用補助材料と、を含む、
医薬組成物。 - 癌を予防かつ/または治療するための薬物の調製における、請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質、請求項10~21のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項27に記載の医薬組成物の使用であって、
好ましくは、前記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である、
使用。 - 前記医薬組成物は第2治療剤をさらに含む、請求項28に記載の使用。
- 対象の癌を予防かつ/または治療する方法であって、
前記方法は、請求項1~9のいずれか1項に記載のIL-21変異タンパク質、請求項10~21のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項27に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である、
方法。 - 前記変異タンパク質、前記融合タンパク質または前記医薬組成物は、第2治療剤と併用療法により投与される、
請求項30に記載の方法。
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