JP2024500232A - インターロイキン２１変異体およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規インターロイキン２１（ＩＬ－２１）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２１と比較して、改善された特性、例えば、低減されたＩＬ－２１受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するＩＬ－２１変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２１変異タンパク質を含む融合物、および当該ＩＬ－２１変異タンパク質、融合物をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２１変異タンパク質、融合物の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。

Description

本発明は、新規インターロイキン２１（ＩＬ－２１）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２１と比較して、改善された特性、例えば、低減されたＩＬ－２１受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するＩＬ－２１変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２１変異タンパク質を含む融合物、および当該ＩＬ－２１変異タンパク質または融合物をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２１変異タンパク質、融合物の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。

インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）は、先天性免疫細胞および適応性免疫細胞の活性を調節するＴ細胞誘導多面性サイトカインであり、Ｉ型サイトカインおよび共通のサイトカイン受容体γ鎖（ｃｇ鎖）サイトカインファミリーのメンバーである。

ＩＬ－２１は、４ヘリックスバンドル構造を有するとともにモノマーとして存在する。ヒトにおいて、それぞれ前駆体分子に由来するＩＬ－２１の２つの異性体が知られている。第１のＩＬ－２１異性体は１６２個のアミノ酸（ａａ）を含み、ここで、最初の２９個のアミノ酸がシグナルペプチドを構成し、かつ第２のＩＬ－２１異性体は１５３ａａを含み、ここで、第１異性体と同様に、最初の２９個のアミノ酸がシグナルペプチドを構成する。

ＩＬ－２１は、活性化ＣＤ４ Ｔ細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞によって産生される。ＩＬ－２１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現するヘテロ二量体ＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）に結合する。ＩＬ－２１がＩＬ－２１Ｒに結合する場合、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路が活性化されることで、標的遺伝子が活性化される。これらのサイトカイン受容体のそれぞれがいずれも共通のγ鎖（γｃ）を含むため、ＩＬ－２１Ｒの構造はＩＬ－２受容体およびＩＬ－１５受容体と類似する。γｃに加えて、ＩＬ－２１Ｒには、ＩＬ－２１との結合にとって重要なα鎖が含まれる。ＩＬ－２１Ｒは、Ｔリンパ球とＢリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および骨髄細胞を含む造血細胞に広く発現される。

樹状細胞（ＤＣ）において、ＩＬ－２１はＤＣの成熟および活性化を抑制することができ、一般的なＤＣのアポトーシスを誘導することができ、混合培養物でのＴ細胞の活性化を強力に抑制することができ、かつ耐性の誘導に作用を発揮することができる。ＩＬ－２１はＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞の効果的な分裂促進因子および生存因子であるが、必須の成長因子または分化因子ではない。ＩＬ－２１はまた、ＣＤ４（＋）Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞および濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）の分化をサポートすることができ、かつ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化に拮抗することができる。さらに、ＩＬ－２１は、ＣＤ８ Ｔ細胞の生存を強化することができ、かつ活性化が少ないがより持続性のあるＴ細胞表現型を保護し、腫瘍およびウイルスの制御を強化することができる。

ＩＬ－２１は抗腫瘍および抗ウイルスの応答において重要な役割を果たすだけでなく、自己免疫性疾患および炎症性疾患を引き起こす炎症性反応に対して重要な役割を発揮することから、ＩＬ－２１は、複数の療法の魅力的な標的となっている。

ＩＬ－２１の多面的効果により、それを潜在的な治療標的となっている。しかしながら、ＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および骨髄細胞を含むさまざまな細胞で広く発現しているため、当該分子は、Ｔ細胞などの細胞に対する選択性がなく、末梢で多数のＴ細胞を活性化してしまい、その結果分子の毒性が高くなる。したがって、その毒性を慎重に制御する必要がある。

ＩＬ－２１自体の精製は比較的に難しく、野生型分子のワンステップ精製によるＳＥＣ純度はわずか６１％である。また、ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒとの親和性が非常に高く、８．２９×１０^－１０Ｍに達するため、インビボでの半減期が非常に短く、半減期を延長するために効果的な改善も必要である。さらに、野生型ＩＬ－２１はＦｃと融合して発現されるため、その創薬可能性が低い。

当該分野でいくつかのＩＬ－２１分子改変方法が提案されている。例えばＷＯ２０１９０２８３１６Ａ１は、改変によって親和性が弱められたインターロイキン－２１変異タンパク質およびＰＤ－１抗体とのその融合物を提案しており、弱められたＩＬ－２１はマウス体内での半減期が明らかに延長されるが、この特許では分子創薬可能性の改善に言及されていない。

ＩＬ－２１免疫治療および生産と精製に関連する上記の問題を鑑み、当該分野は、依然として、改善された特性を有する新規ＩＬ－２１分子、特に生産、精製に役立つことを示し、改善された薬物動態学的および薬力学的特性を有するＩＬ－２１分子、および抗体と組み合わせたその融合物をさらに開発する必要がある。

本発明は、新規インターロイキン２１（ＩＬ－２１）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２１と比較して、改善された特性、例えば、低減されたＩＬ－２１受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するＩＬ－２１変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２１変異タンパク質を含む融合物、および当該ＩＬ－２１変異タンパク質または融合物をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２１変異タンパク質、融合物の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。

具体的には、本発明は、以下の実施形態に関する。
１．ＩＬ－２１変異タンパク質であって、
ここで、上記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２１（好ましくはヒトＩＬ－２１、より好ましくは配列番号７４の配列を含むＩＬ－２１）と比較して、以下：
（ｉ）ＩＬ－４（好ましくはヒトＩＬ－４）の位置１～１５におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１５におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１５におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１４におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１４におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１４におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１３におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１３におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１３におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１２におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１２におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１２におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１１におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１１におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１０におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１０におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１０におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～９におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～９におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～８におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～８におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～８におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～７におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～７におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～７におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～６におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～６におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～６アミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～５におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～５におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～５におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～４におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～４におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～４におけるアミノ酸の置換；またはＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１１におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換、
（ｉｉ）Ｄ４、Ｒ５、Ｈ６、Ｍ７、Ｄ１５、Ｖ１７、Ｑ１９、Ｋ２１、Ｄ３７、Ｅ３９、Ｒ７６、Ｋ７７、Ｐ７８、Ｐ７９、Ｓ８０、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｈ１２０かつ／またはＨ１２２の位置から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の位置での変異による当該位置でのグリコシル化、
（ｉｉｉ）Ｉ８、Ｋ７２、Ｋ７７、Ｐ７８、かつ／またはＰ７９から選択される１個～５個の位置、例えば１個もしくは２個の位置での置換であって、ここで、上記ＫがＤもしくはＥで置換可能であり、ＰがＥもしくはＡで置換可能であり、またはＩがＱで置換可能である置換、
（ｉｖ）Ｈｅｌｉｘ ＡのＮ末端（例えば位置１～１５）、ＣＤ ｌｏｏｐ（例えば位置８２～９５、もしくは８４～９１）またはＣ ｌｏｏｐ（例えば位置７６～８１）での１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、もしくは９個のアミノ酸の欠失、あるいは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、もしくは９個のアミノ酸を含むセグメントの欠失、
の変異の１つもしくは複数を含み、
ここで、上記アミノ酸位置は、配列番号７４により番号付けられるアミノ酸位置である。

２．実施形態１に記載の変異タンパク質であって、ここで、上記変異（ｉ）における置換のためのＩＬ－４のＮ末端の位置１～１５におけるアミノ酸は、ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮまたはＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮであり、
より好ましくは、上記変異（ｉ）の変異は、
ＩＬ－４の１～５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩ）によるＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～１５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮ）によるＩＬ－２１の１～１５（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤ）の置換、
ＩＬ－４の１～１２＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫ）によるＩＬ－２１の１～１２（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱ）の置換、
ＩＬ－４の１～１１＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩ）によるＩＬ－２１の１～１１（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲ）の置換、または
ＩＬ－４の１～１１＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩ）によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、から選択される。

３．実施形態１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質であって、ここで、上記変異（ｉｉ）における変異は、上記位置におけるアミノ酸をＮ、ＴもしくはＳに置換することであり、
好ましくは、上記変異（ｉｉ）は、
Ｄ４Ｎ、Ｒ５Ｎ、Ｈ６Ｔ、Ｍ７Ｔ、Ｄ１５Ｎ、Ｖ１７Ｔ、Ｑ１９Ｎ、Ｋ２１Ｔ、Ｄ３７Ｎ、Ｅ３９Ｔ、Ｒ７６Ｎ、Ｋ７７Ｎ、Ｐ７８Ｔ／Ｓ、Ｐ７９Ｔ／Ｎ、Ｓ８０Ｎ、Ｎ８２Ｔ、Ｇ８２Ｔ、Ｇ８４Ｔ、Ｈ１２０Ｎかつ／またはＨ１２２Ｔから選択される１個、２個、３個、４個、もしくは５個の置換を含み、
より好ましくは、上記変異（ｉｉ）は、
Ｄ４＆Ｈ６
Ｒ５＆Ｍ７
Ｄ１５＆Ｖ１７
ＩＱ１９＆Ｋ２１
Ｒ７６＆Ｐ７８
Ｋ７７＆Ｐ７８＆Ｐ７９
Ｐ７９
Ｓ８０＆Ｎ８２
Ｇ８４
Ｈ１２０＆Ｈ１２２または
Ｄ３７＆Ｅ３９という位置での置換または置換の組み合わせから選択され、
最も好ましくは、上記変異（ｉｉ）は、
Ｄ４Ｎ＆Ｈ６Ｔ
Ｒ５Ｎ＆Ｍ７Ｔ
Ｄ１５Ｎ＆Ｖ１７Ｔ
ＩＱ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ
Ｒ７６Ｎ＆Ｐ７８Ｔ
Ｋ７７Ｎ＆Ｐ７８Ｓ＆Ｐ７９Ｔ
Ｐ７９Ｎ
Ｓ８０Ｎ＆Ｎ８２Ｔ
Ｇ８４Ｔ
Ｈ１２０Ｎ＆Ｈ１２２Ｔまたは
Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９Ｔでの置換または置換の組み合わせから選択される。

４．実施形態１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質にであって、ここで、上記変異（ｉｉｉ）における変異は、
Ｉ８Ｑ、Ｋ７２Ｅ、Ｋ７７Ｄ、Ｐ７８Ａかつ／またはＰ７９Ｅから選択される１個～５個、例えば１個もしくは２個の置換を含み、
好ましくは、上記変異（ｉｉｉ）における変異は、
Ｋ７２、
Ｉ８＆Ｐ７９、または
Ｋ７７＆Ｐ７８という位置または位置の組み合わせでの置換であり、ここで、ＫがＤもしくはＥで置換可能であり、ＰがＥもしくはＡで置換可能であり、またはＩがＱで置換可能であり、
好ましくは、上記変異（ｉｉｉ）における変異は、
Ｋ７２Ｅ
Ｉ８Ｑ＆Ｐ７９Ｅまたは
Ｋ７７Ｄ＆Ｐ７８Ａから選択される。

５．実施形態１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質にであって、ここで、上記変異（ｉｖ）における変異は、位置１～９、位置７８～７９、位置８５～８７、もしくは位置８４～９１から選択される位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含み、
好ましくは、上記変異（ｉｖ）における変異は、
８５～８７の切断、
７８～７９の切断、
１～９の切断、
８４～９１の切断、または
１～９の切断＆７８～７９の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの欠失であり、
好ましくは、上記変異（ｉｖ）における変異は、
８５～８７（ＲＲＱ）の切断、
７８～７９（ＰＰ）の切断、
１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断、
８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断、または
１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断＆７８～７９（ＰＰ）の切断から選択されるアミノ酸セグメントの欠失である。

６．実施形態１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質であって、ここで、上記変異タンパク質は、
（ｉ）１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断＆Ｑ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ、
（ｉｉ）８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断＆Ｃ４２Ａ＆Ｃ９３Ｔ＆Ｑ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ、
（ｉｉｉ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆７８～７９（ＰＰ）の切断によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
（ｉｖ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｋ１１７Ｎ＆Ｉ１１９ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
（ｖ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
（ｖｉ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｄ１５Ｎ＆Ｖ１７ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、または
（ｖｉｉ）ＩＬ－４の１～５（ＨＫＣＤＩ）＆Ｌ１２３ＣによるＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）の置換、から選択される変異を含む。

７．実施形態１～６のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質であって、ここで、上記野生型ＩＬ－２１は、配列番号７４もしくは配列番号１０６～１０８に示されるアミノ酸配列、あるいは、上記アミノ酸配列と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有するまたは１個～１０個もしくは１個～５個以下のアミノ酸保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。

８．実施形態１～７のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質にであって、ここで、上記変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、以下：
（ｉ）より低いＩＬ－２１Ｒに対する親和性、
（ｉｉ）より高い安定性、
（ｉｉｉ）改善された創薬可能性（例えばより長い半減期かつ／または改善された純度、例えばＳＥＣ純度）、かつ／または
（ｉｖ）抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、という改善された特性の１つもしくは複数を有する。

９．実施形態１～７のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質であって、ここで、上記変異タンパク質は、配列番号７５～１０５から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、配列番号７５～１０５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

１０．実施形態１～８のいずれか１項に記載のＩＬ２変異タンパク質を含むＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質である。

１１．実施形態１０に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、それはＦｃ断片に連結される実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質を含むか、あるいは、抗体またはその抗原結合断片に連結される実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質を含み、ここで、上記連結は、リンカーによるものまたはリンカーによらないものである。

１２．実施形態１１に記載の変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記Ｆｃ断片はヒトのＩｇＧ Ｆｃ、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、もしくはヒトＩｇＧ４ Ｆｃであり、好ましくは、上記Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、例えばＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃであり、より好ましくは、上記Ｆｃ断片は、配列番号７０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９６％、９７％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

１３．実施形態１１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記抗体が対象とする抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である。

１４．実施形態１２に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記抗体が対象とする抗原はＰＤ－１であり、かつ上記抗体またはその抗原結合断片は、
（１）配列番号１１５に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１１６に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または
（２）それぞれアミノ酸配列の配列番号１０９、１１０および１１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号１１２、１１３および１１４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、を含む。

１５．実施形態１４に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、上記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１１５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるＶＨと、配列番号１１６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるＶＬと、を含む。

１６．実施形態１０～１２のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、それは
ＩＬ－２１変異タンパク質がリンカーを介して、またはＦｃ断片のＮ末端に直接連結する鎖Ａを含み、
好ましくは、上記融合タンパク質が２つの同じ鎖Ａを含む。

１７．実施形態１６に記載の変異タンパク質融合タンパク質であって、鎖Ａは配列番号１～３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

１８．実施形態１０、１１、１３～１５のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、それは
抗体の軽鎖である鎖Ａ、
抗体の重鎖のＣ末端に連結するＩＬ－２１変異タンパク質である鎖Ｂ、という構造を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質融合タンパク質は、２つの同じ鎖Ａおよび２つの同じ鎖Ｂを含む。

１９．実施形態１５に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、鎖Ａは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または鎖Ｂは、配列番号３５～５４のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

２０．実施形態１０、１１、１３～１５のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、それは
抗体の軽鎖である鎖Ａ、
抗体の１つの重鎖のＣ末端に連結するＩＬ－２１変異タンパク質である鎖Ｂ１、および
抗体の重鎖である鎖Ｂ２、という構造を含み、
好ましくは、上記融合タンパク質は２つの同じ鎖Ａ、１つの鎖Ｂ１および１つの鎖Ｂ２を含み、好ましくは、鎖Ｂ１はｋｎｏｂ変異、例えばＳ３５４Ｃ＆Ｔ３６６Ｗを含み、鎖Ｂ２はｈｏｌｅ変異、例えばＹ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖを含む。

２１．実施形態２０に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、鎖Ａは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または鎖Ｂ１は、配列番号５５～６７のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、かつ／または鎖Ｂ２は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

２２．実施形態１０～２１のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質であって、ここで、リンカーは、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、ａｎｄ（ＧＧＧＳ）_ｎから選択されるリンカー配列を含み、ここで、ｎは少なくとも１である整数であり、好ましくは、リンカーは（Ｇ４Ｓ）_２もしくは（Ｇ４Ｓ）_３を含む。

２３．実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質または実施形態１０～２２のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質における鎖をコードする、単離したポリヌクレオチド。

２４．実施形態２３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

２５．実施形態２３に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態２４に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、上記宿主細胞は酵母細胞または哺乳動物細胞、特にＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。

２６．実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質または実施形態１０～２２のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質を生産するための方法であって、上記ＩＬ－２１変異タンパク質または融合タンパク質の発現に適する条件で、実施形態２５に記載の宿主細胞を培養することを含む。

２７．実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質または実施形態１０～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、場合による薬用補助材料と、を含む医薬組成物。

２８．癌を予防かつ／または治療するための薬物の調製における、実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質、実施形態１０～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または実施形態２７に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、上記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である。

２９．実施形態２８に記載の使用であって、ここで、上記医薬組成物は第２治療剤をさらに含む。

３０．対象の癌を予防かつ／または治療する方法であって、上記方法は、実施形態１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質、実施形態１０～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または実施形態２７に記載の医薬組成物を上記対象に投与することを含み、好ましくは、上記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である。

３１．実施形態３０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、上記変異タンパク質、上記融合タンパク質または上記医薬組成物は、第２治療剤と併用療法により投与される。

ＰＤＢ：３ＴＧＸに由来するＩＬ－２１結晶構成図（図１Ａ）、ＩＬ－２１とＩＬ－４との構造の比較（図１Ｂ）、およびＩＬ－２１の受容体への結合の結晶模式図（図１Ｃ）を示す。 ＩＬ－２１融合タンパク質の３つの形態（Ｆｏｒｍａｔ １、Ｆｏｒｍａｔ ２およびＦｏｒｍａｔ ３）を示す。 ＰＤ１陰性ＨｕＴ７８細胞およびＰＤ１陽性ＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞におけるＳＴＡＴシグナル伝達経路に対するｒｈＩＬ－２１および各融合タンパク質分子の刺激活性を示す。 ＰＤ１陰性ＨｕＴ７８細胞およびＰＤ１陽性ＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞におけるＳＴＡＴシグナル伝達経路に対するｒｈＩＬ－２１、本発明の融合タンパク質分子０５３および対照分子１０６の刺激活性を示す。

Ｉ．定義
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本発明に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。

本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数の場合が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。

用語「約」は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

本明細書に使用されるように、用語「かつ／または」は、選択可能なオプションのうちのいずれか１つ、または選択可能なオプションの２つまたは複数を指す。

本明細書に使用されるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」ＩＬ－２１変異タンパク質に言及する場合、上記変異または変異の組み合わせのみを有するＩＬ－２１変異タンパク質を包含することも意図される。

本明細書において、野生型「インターロイキン－２１」または「ＩＬ－２１」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートとしての親ＩＬ－２１タンパク質、好ましくは天然に存在するＩＬ－２１タンパク質、例えば、未処理（例えば、シグナルペプチドが除去されていない）の形態および処理済み（例えば、シグナルペプチドが除去された）の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然ＩＬ－２１タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトＩＬ－２１配列（Ｑ９ＨＢＥ４）は配列番号１０６に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号７４に示される。なお、この表現には、天然に存在するＩＬ－２１対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。例えば、可変スプライスによって産生されるＩＬ－２１アイソタイプ（Ｑ９ＨＢＥ４－２）もこの表現に含まれており、ここで、シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトＩＬ－２１配列は配列番号１０８に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号１０７に示される。この表現には天然ＩＬ－２１の変異体がさらに含まれ、例えば、上記変異体は天然ＩＬ－２１と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または１個～１０個もしくは１個～５個以下のアミノ酸変異（例えば、保存的置換）を有してもよく、かつ好ましくは天然ＩＬ－２１タンパク質と基本的に同一のＩＬ－２１Ｒ結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２１配列は、配列番号７４、１０６、１０７もしくは１０８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。

本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸またはアミノ酸配列セグメントの置換、欠失／切断、挿入および付加であってもよい。置換、欠失／切断、挿入および付加の任意の組み合わせを行うことで、所望の特性（例えば、低減されたＩＬ－２１Ｒ結合親和性かつ／または改善された創薬可能性）を有する最終的な変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノ基かつ／またはカルボキシ基末端での欠失／切断および挿入を含むとともに、ポリペプチド配列内での欠失／切断および挿入も含む。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、単一アミノ酸置換もしくは複数のアミノ酸置換の組み合わせまたはアミノ酸配列セグメントの置換などの、アミノ酸置換である。例えば、置換によって、１つもしくは複数のグリコシル化部位を導入し、およびＩＬ－２１タンパク質のグリコシル化を促進することができる。また、ＩＬ－２１Ｒ結合界面アミノ酸との置換によって、低減されたＩＬ－２１Ｒ結合親和性を有する変異タンパク質を得ることができる。さらに、野生型ＩＬ－２１のＮ末端の１つもしくは複数のアミノ酸もしくはアミノ酸配列セグメントを、他のサイトカイン（例えばＩＬ－４）と異なるＮ末端アミノ酸に置換して、他のサイトカインとのキメラを形成することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、欠失変異または切断変異をさらに含む。欠失／切断変異は、ＩＬ－２１野生型のあるドメイン（例えばＣＤループ領域もしくはＮ末端）に１つもしくは複数のアミノ酸もしくはアミノ酸配列セグメントが欠失してＩＬ－２１を得る切断変異体を含む。

本発明において、ＩＬ－２１タンパク質もしくはＩＬ－２１配列セグメントにおけるアミノ酸位置に言及する場合、野生型ヒトＩＬ－２１タンパク質（ＩＬ－２１^ＷＴとも呼ばれる）の配列番号７４のアミノ酸配列を参照することによって決定される。配列番号７４とのアミノ酸配列アラインメントによって、他のＩＬ－２１タンパク質もしくはポリペプチド（スプライス変異体を含む）における対応するアミノ酸位置を同定することができる。したがって、本発明において、特記しない限り、ＩＬ－２１タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号７４に従って番号付けられるアミノ酸位置である。例えば、「Ｄ４Ｎ」に言及する場合、配列番号７４の第４位アスパラギン酸残基ＤがＮに置換され、またはアラインメントによって他のＩＬ－２１ポリペプチド配列の対応する位置におけるアミノ酸残基（当該位置でＤである可能性もあり、Ｄでない可能性もある）がＮに置換されることを意味する。アミノ酸位置決定のために実施される配列アラインメントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。

本明細書において、ＩＬ－２１変異タンパク質に言及する場合、以下のように単一アミノ酸置換を説明する：［元のアミノ酸残基／位置／置換のアミノ酸残基］。例えば、位置４のアスパラギン酸がアスパラギンに置換される場合、Ｄ４Ｎと表すことができる。１つの所定の位置（例えば、Ｄ３７位）に複数の選択可能なアミノ酸置換方式（例えば、Ｎ、Ｔ）があり得る場合、当該アミノ酸置換は、Ｄ３７Ｎ／Ｔと表すことができる。

本明細書において、ＩＬ－２１変異タンパク質に言及する場合、以下のようにアミノ酸配列セグメント取り替え／置換を説明する：［（元のアミノ酸配列セグメント）／（位置）／（置換のアミノ酸配列セグメント）］。例えば、位置１～９の配列セグメント「（ＱＧＱＤＲ）」が「（ＨＫＳＤＩ）」に置換される場合、（ＱＧＱＤＲ）／（１～５）／（ＨＫＣＤＩ）と表すことができる。あるいは、当該取り替え、置換は、「ＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）がＩＬ－４の１～５（ＨＫＣＤＩ）に置換される」と説明される。ＩＬ－４のアミノ酸配列セグメントには置換を含む、例えばＣ３Ｓ置換を含む場合、「ＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）がＩＬ－４の１～５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩ）に置換される」と説明されてもよい。

本明細書において、ＩＬ－２１変異タンパク質に言及する場合、以下のようにアミノ酸配列セグメントの欠失／切断を説明する：［切断位置（切断のアミノ酸配列セグメント）］。例えば、位置８５～８７における配列セグメント「（ＲＲＱ）」の欠失／切断は「８５～８７（ＲＲＱ）の切断」と表す。

アンド記号「＆」もしくは「－」によって各変異を連結して、複数の所定の位置での組み合わせ変異を表すことができる。例えばＤ３７ＮとＥ３９Ｔ位置の組み合わせ変異は、Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９Ｔ、またはＤ３７Ｎ－Ｅ３９Ｔと表すことができる。

注意すべきことは、上記説明の応用の場合、アラインメントによって、他の親ＩＬ－２１ポリペプチド配列の対応する位置におけるアミノ酸は、配列番号７４の対応する位置におけるアミノ酸と異なる場合があるが、依然として示される変異を行うことができる。

本明細書において、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で２つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号７４）の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、当該分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２，１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０，１９９０参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である。本願の目的のため、同一性パーセントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて決定することができる。

本明細書で使用されるように、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当該分野で既知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に置換することを指す。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、当該分野でよく知られているものである。本発明において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表Ｘ、特に表Ｘにおける好ましい保存的アミノ酸置換残基に由来する。

例えば、野生型ＩＬ－２１タンパク質は、配列番号７４および１０６～１０８の１つに対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、かつ１つの好ましい実施形態において、保存的置換は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の残基など、１０個以下のアミノ酸残基を有する。さらに例えば、本発明の変異ＩＬ－２１タンパク質は、本明細書に具体的に示されるＩＬ－２１変異タンパク質配列（例えば配列番号７５～１０５のいずれか１つ）に対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、かつ１つの好ましい実施形態において、保存的置換は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の残基など、１０個以下のアミノ酸残基を有する。

「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって示されてもよく、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋ_ｄｉｓとｋ_ｏｎである）との比率である。結合親和性は当該分野で既知の常用方法で測定されてもよい。親和性を測定するための具体的な方法は、本明細書のＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術またはＢＬＩ測定技術である。

本明細書において、抗原結合分子は、抗原に特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片およびｓｃＦｖ断片である。一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、免疫チェックポイント分子に対して抗原とする結合分子、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体である。一実施形態において、免疫チェックポイント分子はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２である。

本明細書において、抗体Ｆｃ断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域であり、かつ天然配列Ｆｃ断片および変異体Ｆｃ断片を含むことができる。天然配列Ｆｃ断片は、様々なＩｇサブタイプおよびそのアロタイプのＦｃ領域など、天然に存在する様々な免疫グロブリンＦｃ配列を含む（Ｇｅｓｔｕｒ Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，２０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０．）。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ断片は、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０からカルボキシ基末端まで延びる。他の実施形態において、Ｆｃ－断片のＣ－末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。他のいくつかの実施形態において、Ｆｃ断片は変異を含む変異体Ｆｃ断片であり、例えば、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異（ＬＡＬＡ変異）を含む。一実施形態において、Ｆｃ断片はＩｇＧ１に由来する。一実施形態において、本発明で使用されるＦｃは、ＩｇＧ１に由来するとともにＬＡＬＡ変異を有する。一実施形態において、本発明で使用されるＦｃは、配列番号７０に示される配列（ＩｇＧ１に由来し、ＬＡＬＡ変異を有する）を含むか、または配列番号７０に示される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。本明細書に特記しない限り、Ｆｃ断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、ＥＵインデックスとも呼ばれる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１ー３２４２に記載される。いくつかの実施形態において、抗体Ｆｃ断片は、Ｎ末端にＩｇＧ１ヒンジ配列またはＩｇＧ１ヒンジ配列の一部、例えばＥＵ番号付けによる配列Ｅ２１６からＴ２２５または配列Ｄ２２１からＴ２２５を有することができる。上記ヒンジ配列に変異が含まれ得る。
「抗原結合断片」とは、完全な抗体の一部を含むとともに、完全な抗体の結合する抗原と結合する、完全な抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、二価抗体またはその断片、あるいはラクダ科抗体を含むが、これらに限定されない。

用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生または特異性免疫細胞の活性化に関係し、あるいは両方に関係する可能性がある。当業者であれば、ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む大分子は、いずれも抗原として利用できると理解される。また、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載される抗原は腫瘍関連抗原、即ち腫瘍の発生、発展または進行に関連する抗原、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である。

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインで、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ（「超可変ループ」）であり、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号付けられる。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲの精確なアミノ酸配列の境界は、多くの公知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種またはその組み合わせにより決定することができ、上記割り当てシステムは、例えば、抗体の３次元構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３，Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７～９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／にて利用可能）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。

例えば、ＣＤＲの決定方案によって、それぞれのＣＤＲの残基は、以下のとおりである。

ＣＤＲは、参照ＣＤＲの配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することで決定されてもよい。

特に断りのない限り、本発明において、用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」は、上記のいずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列を含む。

特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。

一実施形態において、本発明抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｎｏｒｔｈ番号付け方案に基づいて定義されるＣＤＲ配列である。

本明細書において、「ＩＬ－２１Ｒ」という用語は、ＩＬ－２１に結合する受容体を指す。上記受容体はＩ型サイトカイン受容体に属し、同様にＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５によって共有する受容体サブユニットである共通のγ鎖を持つヘテロダイマー受容体複合体を形成することが示される。当該受容体は、ＩＬ－２１の成長促進シグナルを伝達し、かつＴ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラーＮＫ細胞の増殖および分化に重要な役割を果たす。この受容体とリガンドとの結合は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の活性化など、複数の下流シグナル分子の活性化につながる。本明細書において、「ＩＬ－２１Ｒ結合界面変異」とは、ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒが相互作用するアミノ酸部位における変異を指す。ＩＬ－２１およびその受容体複合体の結晶構造（例えばＰＤＢ：３ＴＧＸ）を分析することにより、これらの相互作用部位を決定することができる。いくつかの実施形態において、上記変異は、特にＩＬ－２１ヘリックスＡ、ヘリックスＣおよびＣＤループの一部、例えばアミノ酸残基８、７２もしくは７７～７９の１つもしくは複数における変異を指す。好ましくは、上記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、上記変異を含むＩＬ－２１タンパク質は、低減または排除されたＩＬ－２１Ｒ結合を有する。

本明細書において、「ＩＬ－２１」グリコシル化は、ＩＬ－２１にＮ－グリコシル化部位を導入することでＩＬ－２１変異タンパク質のグリコシル化レベルを向上させ、さらにＩＬ－２１変異タンパク質の創薬可能性を改善するかつ／またはＩＬ－２１Ｒに低減された結合親和性を備えさせることを意味する。いくつかの実施形態において、グリコシル化部位は、位置４～７、１５、１７、１９、２１、３７、３９、７６～８０、８２、８４、１２０および１２２から選択される１つもしくは複数である。

本明細書で使用される「リンカー」という用語は、融合タンパク質の異なる部分に直接連結可能な任意の分子を指す。融合タンパク質の異なる部分の間で共有結合を確立するリンカーの例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体を含むが、これらに限定されないペプチドリンカーおよび非タンパク質ポリマーが含まれる。本発明による「ペプチドリンカー」という用語は、融合タンパク質の第１部分のアミノ酸配列を融合タンパク質の第２部分に連結するアミノ酸の配列を指す。例えば、ペプチドリンカーは、融合タンパク質のＩＬ－２１部分をＦｃドメインまたはその断片に連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、抗体重鎖のＣ末端をＩＬ－２１に連結するなど、抗体をＩＬ－２１に連結することもできる。好ましくは、上記ペプチドリンカーは、所望の活性を妨害せずに、それらが互いに対してコンフォメーションを維持するように、２つの実体を連結するのに十分な長さを有する。ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒというアミノ酸残基を主に含んでもよいが、主に含まなくてもよい。有用なリンカーには、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＳ）_ｎおよび（ＧＧＧＧＳ）_ｎＧを含むグリシン－セリンポリマーが含まれ、ここで、ｎは少なくとも１（かつ好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０）の整数である。有用なリンカーには、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマーおよび他のフレキシブルリンカーがさらに含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号６９）または（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号７２）である。

「ＩｇＧ形態の抗体」は、抗体の重鎖定常領域の属するＩｇＧ形態を指す。すべての同じタイプの抗体は、その重鎖定常領域がいずれも同じであり、異なるタイプの抗体は、その重鎖定常領域が異なる。例えば、ＩｇＧ４形態の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ４からのものであることを指し、またはＩｇＧ１形式の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ１からのものであることを指す。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ほぼすべての可変ドメインの少なくとも１つ、一般的に２つを含み、ここで、すべてまたはほぼすべてのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体に由来する部分に対応し、かつすべてまたはほぼすべてのＦＲは、ヒト抗体に由来する部分に対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含む。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化が行われた抗体を指す。

「ヒト抗体」または「全ヒト化抗体」または「完全ヒト抗体」は、交換して使用されてもよく、ヒトまたはヒト細胞から生成され、または非ヒト由来のものから由来し、ヒト抗体ライブラリーや他のヒト抗体で配列がコードされた抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体についての当該定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。

本明細書で使用される「融合物」という用語は、２つまたは複数の最初別々のタンパク質／遺伝子／化合物を連結することによって形成される融合物を指す。融合物を構成する実体がタンパク質である場合、融合タンパク質と呼ばれる。融合タンパク質は、本願の融合物の範囲内に含まれる。例えば、ＩＬ－２１をＦｃ二量体に連結してＩＬ－２１融合タンパク質を形成するか、またはＩＬ－２１を完全な抗体もしくは抗体断片に連結してＩＬ－２１融合タンパク質を形成することもできる。融合物を構成する２つの実体の間の連結は、リンカーを介して達成されてもされなくてもよい。

本明細書に記載の「治療剤」という用語は、癌などの腫瘍の治療または予防に有効ないずれの物質も含み、化学療法剤、サイトカイン、血管新生抑制剤、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物、または免疫調節剤（例えば、免疫抑制剤）を含む。
「有効量」という用語は、本発明の抗体もしくは断片または組成物または組み合わせの１回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。「有効量」には、「治療有効量」または「予防有効量」が含まれてもよい。

「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、抗体もしくは抗体断片または組成物または組み合わせのいずれの毒性または有害作用も治療による有益な作用に及ばないという量でもある。未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ（例えば腫瘍体積）を少なくとも約４０％、さらに、好ましくは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは１００％抑制する。「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防目的の用量が対象における疾患の初期段階より前にまたは疾患の初期段階に適用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」と「宿主細胞培養物」は、交換して使用されてもよく、外因性核酸が導入された細胞を指し、この細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の内容において親細胞と全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。

本明細書に使用される用語「標識」は、試薬（例えば、ポリヌクレオチドプローブもしくは抗体）に直接的または間接的に複合または融合され、かつ、その複合または融合の対象試薬による検出を促進する化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であるか、または、酵素触媒によって標識される場合に、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変に触媒作用を及ぼすことができる。当該用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（即ち、物理的連結）することによってプローブもしくは抗体を直接標識すること、および、直接標識されている別の試薬との反応によりプローブもしくは抗体を間接的に標識することを含もうとする。

「個体」または「対象」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類動物（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類動物）、ウサギ、およびげっ歯類動物（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または対象はヒトである。

用語「抗腫瘍作用」は、さまざまな手段により表示できる生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減または腫瘍細胞の生存率の減少を含むが、これらに限定されない。

用語「腫瘍」および「癌」は、本明細書において交換して使用され、固形腫瘍および血液腫瘍を含む。

用語「癌」は、無秩序な細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物の生理学的疾患を指すか、または説明する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体による治療に適する癌は、癌の転移性形態を含む固形腫瘍または血液腫瘍などを含む。

用語「腫瘍」は、悪性か良性かを問わず、すべての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の細胞の成長と増殖、およびすべての前癌（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）と癌性の細胞と組織を含む。用語「癌」、「癌性」および「腫瘍」は、本明細書で言及される時に、互いに排他的ではない。

用語「薬用補助材料」は、活性物質とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、賦形剤、ベクターや安定化剤などを指す。

用語「医薬組成物」は、それに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在するとともに、上記組成物が投与された対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。

用語「医薬組合せ」は、非固定組合せの製品または固定組合せの製品であり、薬物キット、医薬組成物を含むが、これらに限定されない。用語「非固定組合せ」とは、活性成分（例えば、（ｉ）本発明の変異タンパク質または融合物、および（ｉｉ）他の治療剤）が、別個の実体で同時に、特定の時間制限なしに、または同じもしくは異なる時間間隔で、患者に順に投与されるものを指し、ここで、このような投与は、患者の体内において予防的または治療的に有効なレベルの２つ以上の活性剤を提供する。用語「固定組合せ」は、２つ以上の活性剤が単一実体の形態で同時に患者に投与されるものを指す。好ましくは、２種以上の活性剤の用量かつ／または時間間隔を選択することにより、各成分の併用が疾患または病症の治療において、いずれか１つの成分を単独で使用する場合よりもよい効果を達成することができる。各成分はそれぞれ、単独の製剤形態であってもよく、その製剤形態は同じであってもよく、異なってもよい。

用語「組合せ療法」は、２種以上の治療剤または治療形態（例えば、放射線治療や手術）を投与することにより、本明細書に記載の疾患を治療するものを指す。そのような投与は、ほぼ同時に、例えば、一定の割合の活性成分を有する単一のカプセルで、これらの治療剤を共投与することを含む。または、このような投与は、複数または別個の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末と液体）での各有効成分の共投与を含む。粉末かつ／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、このような投与は、各タイプの治療剤を実質的に同じ時間、または異なる時間で順番によって使用することを含む。いずれの場合においても、治療プログラムは、本明細書に記載の病症または病状の治療における医薬組み合わせの有益な効果を提供する。

本明細書に使用される場合、「治療」は、存在している症状、病症、病状または疾患の進行または重症度を軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転することを指す。

本明細書に使用される場合、「予防」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症に係る症状の発生または進行に対する阻害を含む。いくつかの実施形態において、癌家族歴がある対象は、予防プログラムの候補である。一般的に、癌の背景では、用語「予防」は、癌にかかる病徴または症状が生じる前に、特に、癌に罹患するリスクのある対象に癌が生じる前の医薬投与を指す。

用語「ベクター」は、本明細書に使用される場合、それに連結された別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製の核酸構造としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。一部のベクターは、それに操作可能に連結された核酸の発現をガイドすることができる。かかるベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。

「対象／患者／個体試料」は、患者または対象から得た細胞または流体の集まりを指す。組織または細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍されたかつ／または保存された器官や組織試料や生検試料や穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液（羊水）、腹膜液（腹水）や間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意段階に由来する細胞であってもよい。組織試料は、自然界において天然に組織と混ぜ合わせない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などを含んでもよい。

ＩＩ．ＩＬ－２１変異タンパク質およびその融合物
本発明のＩＬ－２１変異タンパク質の有利な生物学的特性
ＩＬ－２１タンパク質は、短鎖サイトカインファミリーのすべてのメンバーによって共有される上－上－下－下のトポロジー構造に配列された４ヘリックスバンドルＡ、Ｂ、ＣおよびＤを形成する。ループ構造は、４つのヘリックスバンドルを連結する。具体的には、ヒトＩＬ－２１（例えば配列番号７４に示すようなもの）のドメインは、以下のとおりである。ここで、ＩＬ－２１のＮ末端であるＨｅｌｉｘは、ＩＬ－２１Ｒに結合する領域であり、同様にＩＬ－２１Ｒに結合する領域は、ＨｅｌｉｘＣ、Ｃｌｏｏｐかつ／またはＣＤ ｌｏｏｐをさらに含むことが知られている。

本発明者らは、以下の分子変異および改変を組み合わせて実施して、ＩＬ－２１の安定性、創薬可能性を同時に改善し、良好な生産性能を達成することができ、また特定のＴ細胞に対する選択的活性化を向上させることができることを長期にわたる研究を通じて見出した。

１、ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異：ＩＬ－４のＮ末端アミノ酸でＩＬ－２１のＮ末端アミノ酸を置換して、より安定したＩＬ－２１のＮ末端コンフォメーションを取得し、ＩＬ－２１またはその融合物の安定性をさらに改善し、創薬可能性をさらに改善する。

２、ＩＬ－２１グリコシル化変異：ＩＬ－２１Ｒとの結合界面にＮ－グリコシル化部位を導入することで、ＩＬ－２１のグリコシル化パターンを変更し、ＩＬ－２１とその受容体ＩＬ－２１Ｒとの結合親和性を低下させることで、ＩＬ－２１またはその融合物の安定性を改善し、その創薬可能性をさらに改善する。

３、ＩＬ－２１界面アミノ酸変異：ＩＬ－２１のＩＬ－２１Ｒに結合する界面に電荷または親水性／疎水性に類似するアミノ酸置換を導入して、ＩＬ－２１変異タンパク質のＩＬ－２１Ｒへの結合性能を変更し、ＩＬ－２１とその受容体ＩＬ－２１Ｒとの結合親和性を低下させることで、ＩＬ－２１またはその融合物の創薬可能性を改善する。

４、ＩＬ－２１切断変異：ＩＬ－２１のＨｅｌｉｘ Ａ、ＣＤ ｌｏｏｐまたはＣ ｌｏｏｐ領域で１つもしくは複数のアミノ酸またはアミノ酸セグメントを切断／欠失して、ＩＬ－２１の局所構造を変更し、その局所構造をより安定させることで、ＩＬ－２１の安定性を改善し、ＩＬ－２１またはその融合物の創薬可能性をさらに改善する。

いくつかの実施形態において、本発明者らは、上記の１つもしくは複数（例えば２つ、３つもしくは４つすべて）の変異をさらに組み合わせて、ＩＬ－２１変異タンパク質のＩＬ－２１Ｒへの結合性能を変更するか、あるいはＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物の安定性を変更することで、本発明の変異タンパク質またはその融合物に良好な創薬可能性を付与することを見出した。

いくつかの実施形態において、本発明の変異タンパク質の創薬可能性の改善は、上記変異タンパク質またはその融合物の半減期の延長、かつ／または生産されたタンパク質の純度の増加を含む。

改善された創薬可能性
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物は、改善された創薬可能性を有する。例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞に発現する時、特に変異タンパク質融合物（例えばＦｃ融合タンパク質または抗体と形成された融合タンパク質）で発現する時、より高いタンパク質の純度に簡単に精製することができる。

いくつかの実施形態において、タンパク質Ａのアフィニティークロマトグラフィーにより精製された後のタンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質融合物または融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２１タンパク質の融合物または融合タンパク質と比較して、より高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、精製後、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物の純度は、６５％、７０％、７５％、８０％もしくは８５％以上、好ましくは８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％以上に達することができる。

他のいくつかの実施形態において、本発明に記載の改善された創薬可能性は、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質または変異タンパク質融合物（例えばＦｃ融合タンパク質または抗体と形成された融合タンパク質）が改善された半減期を有することを意味する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物の半減期は、既知のＩＬ－２１野生型タンパク質またはその融合物、あるいは既知のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物の半減期よりも長くもよい。

低減されたＩＬ－２１受容体への結合親和性
体内でのＩＬ－２１の半減期は非常に短く、主な理由の１つは、それが細胞表面受容体と高い結合親和性を有するため、細胞に容易に取り込まれて分解されることである。したがって、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物は、野生型ＩＬ－２１またはその融合物と比較して変異を導入するため、ＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物が低減または除去された（検出不能）ＩＬ－２１Ｒ受容体結合を有する。

いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２１（例えば配列番号７４に示されるＩＬ－２１）またはその融合物と比較して、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物のＩＬ－２１Ｒ受容体への結合親和性は、少なくとも５倍、少なくとも１０倍もしくは少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍もしくは１００倍以上低減される。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質またはその融合物は、ＩＬ－２１受容体に弱く結合するか、または検出不能な親和性で結合する。ＢＬＩ親和性測定技術によって、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物と、受容体ＩＬ－２１Ｒとの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定して、結合親和性を決定することができる。

増加した抗原陽性細胞に対する選択的活性化
本発明の変異タンパク質は、抗体、例えばモノクローナル抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２など、腫瘍に関連する抗原）と融合して、ＩＬ－２１変異タンパク質－抗体融合物を産生することができ、当該融合物は、野生型ＩＬ－２１変異タンパク質－抗体融合物と比較して、増加した抗原陽性細胞に対する選択的活性化能力を有する。

いくつかの実施形態において、抗体は、ＰＤ－１に対する抗体、例えばＰＤ－１に対するモノクローナル抗体である。野生型ＩＬ－２１と比較して、ＩＬ－２１変異タンパク質とＰＤ－１抗体の融合タンパク質は、ＰＤ－１陰性の細胞における活性が比較的弱いか、または検出できず、ＰＤ－１陽性の細胞における活性が比較的高いか、または非常に高い。

したがって、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはＩＬ－２１変異タンパク質融合物は、野生型ＩＬ－２１タンパク質または融合物と比較して、より広い治療ウィンドウを有し、抗原（例えば腫瘍に関連する抗原）陽性の細胞を選択的に活性化することができ、例えば当該腫瘍に関連する抗原の細胞を発現し、例えば当該腫瘍に関連する抗原のＴ細胞を発現する。

一実施形態において、ＳＴＡＴ３リン酸化測定試験において、Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化シグナルに対するＩＬ－２１変異タンパク質またはその抗体融合タンパク質の活性化を検出することで、Ｔ細胞（例えば、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路）を活性化するＩＬ－２１変異タンパク質またはその抗体融合タンパク質の能力を同定する。例えば、本願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーにより細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化を分析し、半数効果濃度（ＥＣ５０）を決定することで、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその抗体融合タンパク質を活性化する活性を検出する。

本発明の変異タンパク質
ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異
一態様において、本発明は、ＩＬ－４のＮ末端アミノ酸でＩＬ－２１のＮ末端アミノ酸を置換したＩＬ－２１変異タンパク質を提供して、より安定したＩＬ－２１のＮ末端コンフォメーションを取得し、ＩＬ－２１またはその融合物の安定性をさらに改善し、創薬可能性をさらに改善する。

いくつかの実施形態において、ＨｅｌｉｘＡ（Ｎ末端）における上記ＩＬ－２１変異タンパク質の１個～１５個のアミノ酸は、ＩＬ－４のＮ末端アミノ酸に置換されることができる。一実施形態において、上記ＩＬ－２１変異タンパク質は、以下の置換を含む：
Ｎ末端の位置１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５もしくは１～４におけるアミノ酸は、ＩＬ－４のＮ末端のアミノ酸に置換される。

いくつかの実施形態において、置換に使用されるＩＬ－４のＮ末端アミノ酸の位置は、その置換されるＩＬ－２１のアミノ酸の位置と同じである。例えば、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、
ＩＬ－４の位置１～１５におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１５におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１４におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１４におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１３におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１３におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１２におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１２におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１１におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１０におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１０におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～９におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～８におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～８におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～７におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～７におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～６におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～６におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～５におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～５におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～４におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～４におけるアミノ酸の置換、を含む。

いくつかの実施形態において、置換に使用されるＩＬ－４のＮ末端アミノ酸の数は、その置換されるＩＬ－２１のアミノ酸の数と、１個～３個のアミノ酸の差を有する。例えば、ＩＬ－２１変異タンパク質に含まれ得る置換は、ＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換である。

いくつかの実施形態において、置換に使用されるＩＬ－４のＮ末端には、１つもしくは２つの置換が含まれてもよい。例えば、置換に使用されるＩＬ－４のＮ末端には、Ｃ３Ｓが含まれてもよい。

ＩＬ－４に言及される場合、それは野生型ＩＬ－４または天然に存在するＩＬ－４、例えばヒトに由来するＩＬ－４（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０５１１２）であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－４のアミノ酸配列は、配列番号１１７に示される。この表現には、天然に存在するＩＬ－４対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然ＩＬ－４の変異体もさらに含まれ、例えば、上記変異体は、天然ＩＬ－４（配列番号１１７）と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または１個～５個以下のアミノ酸変異（例えば、保存的置換）を有してもよく、かつ好ましくは、天然ＩＬ－４タンパク質と基本的に同一のＩＬ－４Ｒ結合親和性を有する。

いくつかの具体的な実施形態において、本発明のＩＬ－４のＮ末端の位置１～１５におけるアミノ酸は、ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮもしくはＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮに示される。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、
ＩＬ－４の位置１～５におけるアミノ酸もしくはＣ３Ｓを含む位置１～５におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～５におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～９におけるアミノ酸もしくはＣ３Ｓを含む位置１～９におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１５におけるアミノ酸もしくはＣ３Ｓを含む位置１～１５におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１５におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の位置１～１２におけるアミノ酸もしくはＣ３Ｓを含む位置１～１２におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１２におけるアミノ酸の置換、
ＩＬ－４の１～１１におけるアミノ酸もしくはＣ３Ｓを含む位置１～１１におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～１１におけるアミノ酸の置換、または
ＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸もしくはＣ３Ｓを含む位置１～１１におけるアミノ酸によるＩＬ－２１の位置１～９の置換、という取り替え／置換を含む。

いくつかのさらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、
ＩＬ－４の１～５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩ）によるＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～１５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮ）によるＩＬ－２１の１～１５（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤ）の置換、
ＩＬ－４の１～１２＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫ）によるＩＬ－２１の１～１２（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱ）の置換、
ＩＬ－４の１～１１＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩ）によるＩＬ－２１の１～１１（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲ）の置換、または
ＩＬ－４の１～１１＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩ）によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、という取り替え／置換を含む。

ＩＬ－２１－グリコシル化変異
いくつかの態様において、ＩＬ－２１Ｒとの結合界面にＮ－グリコシル化部位を導入することで、ＩＬ－２１のグリコシル化部位変異を変更し、ＩＬ－２１とその受容体ＩＬ－２１Ｒとの結合親和性を低下させることで、ＩＬ－２１またはその融合物の安定性を改善し、その創薬可能性をさらに改善する。

本発明に適するグリコシル化部位変異は、以下から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個もしくは５個の位置で変異されることで、当該位置でグリコシル化される：
Ｄ４、Ｒ５、Ｈ６、Ｍ７、Ｄ１５、Ｖ１７、Ｑ１９、Ｋ２１、Ｄ３７、Ｅ３９、Ｒ７６、Ｋ７７、Ｐ７８、Ｐ７９、Ｓ８０、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｈ１２０かつ／またはＨ１２２である。

いくつかの実施形態において、上記位置におけるアミノ酸は、Ｎ、ＴもしくはＳに変異される。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質は、以下：
Ｄ４Ｎ、Ｒ５Ｎ、Ｈ６Ｔ、Ｍ７Ｔ、Ｄ１５Ｎ、Ｖ１７Ｔ、Ｑ１９Ｎ、Ｋ２１Ｔ、Ｄ３７Ｎ、Ｅ３９Ｔ、Ｒ７６Ｎ、Ｋ７７Ｎ、Ｐ７８Ｔ／Ｓ、Ｐ７９Ｔ／Ｎ、Ｓ８０Ｎ、Ｎ８２Ｔ、Ｇ８２Ｔ、Ｇ８４Ｔ、Ｈ１２０Ｎかつ／またはＨ１２２Ｔから選択される１個、２個、３個、４個、もしくは５個の置換を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質は、以下：
Ｄ４＆Ｈ６
Ｒ５＆Ｍ７
Ｄ１５＆Ｖ１７
ＩＱ１９＆Ｋ２１
Ｒ７６＆Ｐ７８
Ｋ７７＆Ｐ７８＆Ｐ７９
Ｐ７９
Ｓ８０ ＆ Ｎ８２
Ｇ８４
Ｈ１２０＆Ｈ１２２または
Ｄ３７＆Ｅ３９という位置での置換または置換の組み合わせを含む。

いくつかのさらなる好ましい実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質は、以下：
Ｄ４Ｎ＆Ｈ６Ｔ
Ｒ５Ｎ＆Ｍ７Ｔ
Ｄ１５Ｎ＆Ｖ１７Ｔ
ＩＱ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ
Ｒ７６Ｎ＆Ｐ７８Ｔ
Ｋ７７Ｎ＆Ｐ７８Ｓ＆Ｐ７９Ｔ
Ｐ７９Ｎ
Ｓ８０Ｎ＆Ｎ８２Ｔ
Ｇ８４Ｔ
Ｈ１２０Ｎ＆Ｈ１２２Ｔまたは
Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９Ｔから選択される置換または置換の組み合わせを含む。

ＩＬ－２１結合界面アミノ酸変異
ＩＬ－２１のＩＬ－２１Ｒに結合する界面に電荷または親水性／疎水性に類似するアミノ酸置換を導入して、ＩＬ－２１変異タンパク質のＩＬ－２１Ｒへの結合性能を変更し、ＩＬ－２１とその受容体ＩＬ－２１Ｒとの結合親和性を低減させることで、ＩＬ－２１またはその融合物の創薬可能性を改善することができる。

このような変異の例は、ＩＬ－２１結合界面における、特にＨｅｌｉｘ Ａ、Ｈｅｌｉｘ ＣもしくはＣ ｌｏｏｐにおける、特にＩ８、Ｋ７２、Ｋ７７、Ｐ７８、かつ／またはＰ７９から選択される１個～５個の位置、例えば１個もしくは２個の位置での置換を含むが、これらに限定されない。

いくつかの好ましい実施形態において、ＫがＤもしくはＥで置換可能であり、ＰがＥもしくはＡで置換可能であり、またはＩがＱで置換可能である。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質は、Ｉ８Ｑ、Ｋ７２Ｅ、Ｋ７７Ｄ、Ｐ７８Ａかつ／またはＰ７９Ｅから選択される置換の１個～５個、例えば１個もしくは２個を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ２１変異タンパク質は、以下：
Ｋ７２、
Ｉ８＆Ｐ７９、または
Ｋ７７＆Ｐ７８から選択される位置または位置の組み合わせでの置換を含む。

いくつかのさらなる好ましい実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質は、以下：
という置換／置換の組み合わせを含む。
Ｋ７２Ｅ
Ｉ８Ｑ＆Ｐ７９Ｅ
Ｋ７７Ｄ＆Ｐ７８Ａ

ＩＬ－２１切断変異
いくつかの態様において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、ＩＬ－２１のＨｅｌｉｘ Ａ、ＣＤ ｌｏｏｐまたはＣ ｌｏｏｐにおける１つもしくは複数のアミノ酸またはアミノ酸セグメントの欠失／切断を含み、それによりＩＬ－２１の局所構造を変更し、その局所構造をより安定させることで、ＩＬ－２１の安定性を改善し、ＩＬ－２１変異またはその融合物の創薬可能性をさらに改善する。

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、Ｈｅｌｉｘ ＡのＮ末端（例えば位置１～１５）、ＣＤ ｌｏｏｐ（例えば位置８２～９５、好ましくは８４～９１）またはＣ ｌｏｏｐ（例えば位置７６～８１）における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、もしくは９個のアミノ酸の欠失、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、もしくは９個のアミノ酸セグメントの欠失を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、以下：
位置１～９、位置７８～７９、位置８５～８７もしくは位置８４～９１という位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、上記変異タンパク質は、以下：
８５～８７の切断、
７８～７９の切断、
１～９の切断、
８４～９１の切断、または
１～９の切断＆７８～７９の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの切断／欠失を含む。
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、上記変異タンパク質は、以下：
８５～８７（ＲＲＱ）の切断、
７８～７９（ＰＰ）の切断、
１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断、
８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断、または
１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断＆７８～７９（ＰＰ）の切断という切断／欠失を含む。

いくつかの実施形態において、上記変異タンパク質は切断／欠失を含むと同時に、ジスルフィド結合を除去し、Ｌｏｏｐの柔軟性を向上させるために、システインの変異をさらに含む。例えば、上記変異タンパク質は、Ｃ４２Ａかつ／またはＣ９３Ｔをさらに含んでもよい。したがって、上記変異タンパク質は、８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断を含むと同時にＣ４２ＡおよびＣ９３Ｔをさらに含んでもよい。

他の変異
上記の変異に加えて、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、それが本発明のＩＬ－２１変異タンパク質の上記の１つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に１つ以上の変異をさらに有してもよい。例えば、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、ジスルフィド結合を減少させるために、他のアミノ酸による元のシステインの変異、またはシステインによる元のアミノ酸の変異をさらに含んでもよい。例えば、上記変異は、Ｌ１２３Ｃ、Ｃ４２ＡもしくはＣ９３Ｔであってもよい。当業者は、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異をどのように決定するかを知っている。

好ましい例示的な変異の組み合わせ
本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質の改善された特性を有する本明細書に記載の１つもしくは複数の変異タイプの組み合わせ、または本明細書に記載の１つもしくは複数の変異タイプと他の変異（例えば当該分野で知られている他の変異）との組み合わせをさらに含んでもよい。

好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、野生型と比較して、本明細書に記載の変異の少なくとも２つを含み、例えば本明細書に記載の以下の変異の組み合わせ：
（１）ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異とＩＬ－２１グリコシル化変異、
（２）ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異とＩＬ－２１界面アミノ酸変異、
（３）ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異とＩＬ－２１切断変異、
（４）ＩＬ－２１グリコシル化変異とＩＬ－２１界面アミノ酸変異、
（５）ＩＬ－２１グリコシル化変異とＩＬ－２１切断変異、または
（６）ＩＬ－２１界面アミノ酸変異とＩＬ－２１切断変異、を含む。

場合により、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、Ｃ４２ＡおよびＣ９３Ｔなどの他の変異をさらに含み、例えば本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、ＩＬ－２１界面アミノ酸変異、ＩＬ－２１切断変異およびＣ４２ＡとＣ９３Ｔを含んでもよく、またはＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異およびＬ１２３Ｃを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、野生型と比較して、以下：
ＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断＆Ｑ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ、
ＩＬ－２１の８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断＆Ｃ４２Ａ＆Ｃ９３Ｔ＆Ｑ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ、
ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆７８～７９（ＰＰ）の切断によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｋ１１７Ｎ＆Ｉ１１９ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｄ１５Ｎ＆Ｖ１７ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、または
ＩＬ－４の１～５（ＨＫＣＤＩ）＆Ｌ１２３ＣによるＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）の置換、から選択される変異または変異の組み合わせを含む。

ＩＬ－２１変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって表してもよく、または両方の間の異なるアミノ酸の数によって表してもよい。一実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質と野生型タンパク質との間は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有する。他の実施形態において、本発明の上記の４つの変異に加えて、ＩＬ－２１変異タンパク質と野生型タンパク質との間は、１５個以下、例えば１個～１０個、もしくは１個～５個変異、例えば０個、１個、２個、３個、４個の変異をさらに有してもよく、好ましくは、上記他の変異は保存的置換であってもよい。

本発明のＩＬ－２１変異タンパク質
したがって、本発明は、配列番号７５～１０５から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる変異タンパク質を提供する。本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、配列番号７５～１０５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含み、その条件は、これらのアミノ酸配列には本明細書に記載の特定の変異が含まれ、かつ野生型タンパク質と比較して、以下：
（ｉ）より低い親和性、
（ｉｉ）より高い安定性、
（ｉｉｉ）改善された創薬可能性（例えばより長い半減期かつ／または改善された純度、例えばＳＥＣ純度）、かつ／または
（ｉｖ）抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、という改善された特性の１つもしくは複数を有する。

本発明の変異タンパク質融合物
一態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質の融合物、例えば融合タンパク質をさらに提供する。一実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、抗体のＦｃ断片もしくは完全な抗体またはその抗原結合断片に連結して、ＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質を得ることができる。

好ましい一実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えば抗体Ｆｃ断片と融合される。したがって、一実施形態において、本発明は、抗体Ｆｃ断片に連結する本発明のＩＬ－２１変異タンパク質を含むＩＬ－２１変異タンパク質－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。

本発明に使用されるＦｃ断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異を含むことができる。好ましい一実施形態において、Ｆｃ断片は、低減されたＦｃ領域により媒介されるエフェクター機能を有し、例えば低減または排除されたＡＤＣＣまたはＡＤＣＰまたはＣＤＣエフェクター機能を有する。例えば、いくつかの特別な実施形態において、本発明に使用されるＦｃ断片は、Ｆｃγ受容体に対する結合を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有する。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質と融合されるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ ＦｃまたはヒトＩｇＧ４ ＦｃなどのヒトＩｇＧ Ｆｃである。好ましくは、上記Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１ ＦｃなどのヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。一実施形態において、Ｆｃ断片は、配列番号７０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９６％、９７％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質は、Ｆｃに直接融合される。いくつかの実施形態において、リンカー連結を介してＩＬ－２１変異タンパク質とＦｃを連結することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質－Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－２１変異タンパク質がリンカーを介して、または抗体Ｆｃ断片のＮ末端に直接連結する鎖Ａを含み、好ましくは、上記融合タンパク質は２つの同じ鎖Ａを含む。別のいくつかの実施形態において、上記融合タンパク質は、２つの異なる鎖Ａを含むか、または１つの鎖ＡおよびＩＬ－２１変異タンパク質に連結していないＦｃ断片を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質－Ｆｃ融合タンパク質に含まれる鎖Ａが異なるか、または１つの鎖Ａおよび１つのＩＬ－２１変異タンパク質に連結していないＦｃ断片を含む。例えば、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ技術に基づいて、第１鎖ＡのＦｃ断片にＫｎｏｂを導入し、かつ別の鎖ＡのＦｃ断片または別のＦｃ断片にＨｏｌｅ変異を導入し、逆にも同じである。

いくつかの具体的な実施形態において、本発明にかかるＦｃ断片と融合されるＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２１を含む融合タンパク質と比較して、本発明の変異タンパク質の特性、例えば低減されたＦｃ受容体に対する親和性、より高い安定性かつ／または改善された創薬可能性（例えば延長した半減期または増加した生産純度）を有する。

一具体的な実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、図２のＦｏｒｍａｔ１に示される形態を有する。

当業者に理解されるように、本発明に適用される融合タンパク質のＦｃ断片は任意の抗体Ｆｃ断片であってもよい。

いくつかの具体的な実施形態において、本発明にかかるＦｃと融合されるＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質の鎖Ａは、配列番号２～３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

別の好ましい実施形態において、本発明は、ＩＬ－２１変異タンパク質およびそれに連結する抗体またはその抗原結合断片を含むＩＬ－２１変異タンパク質－抗体融合タンパク質をさらに提供する。

本発明のＩＬ－２１変異タンパク質と抗体またはその抗原結合断片とが形成するＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、対応する野生型ＩＬ－２１融合タンパク質と比較して、本発明の変異タンパク質の特性、例えば低減された受容体に対する親和性、より高い安定性、改善された創薬可能性（例えば延長した半減期または増加した生産純度）を有し、かつ／または増加した上記抗体が対象とする抗原陽性の細胞に対する選択的活性化を有する。

いくつかの実施形態において、上記抗体は、腫瘍に関連する抗原に対する抗体、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２である。

本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質は、直接的に、もしくはリンカーを介して抗体またはその抗原結合断片に連結することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片のＣ末端に連結する。

ＩＬ－２１変異タンパク質との連結に適する抗体は、完全な抗体、またはその抗原結合断片であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１形態の抗体、ＩｇＧ２形態の抗体、ＩｇＧ３形態の抗体またはＩｇＧ４形態の抗体であり、好ましくは、ＩｇＧ１形態の抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト化されたものである。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はキメラ抗体である。一実施形態において、本発明の抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または線状抗体という抗体断片から選択される。

本発明の一具体的な実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質は、完全な抗体の１つもしくは２つの重鎖のＣ末端またはＮ末端に連結してＩＬ－２１変異タンパク質－抗体融合タンパク質を形成する。

本発明の一実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質－抗体融合タンパク質は、抗体の２つの重鎖のＣ末端にそれぞれ連結するＩＬ－２１変異タンパク質を含む。本発明の一実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質－抗体融合タンパク質は、抗体の１つの重鎖のＣ末端に連結するＩＬ－２１変異タンパク質、および１つの抗体重鎖を含み、好ましくは、ヘテロ二量体を形成しやすくするために、抗体は、２つの重鎖にｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ構造を導入する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２１変異タンパク質に連結する抗体重鎖にはＫｎｏｂ変異が含まれ、ＩＬ－２１変異タンパク質に連結していない抗体重鎖にはｈｏｌｅ変異が含まれ、逆にも同じである。いくつかの実施形態において、Ｋｎｏｂ変異は、Ｋｎｏｂ：Ｓ３５４Ｃ＆Ｔ３６６Ｗであり、かつ／またはＨｏｌｅ変異は、Ｙ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖである。

本発明の一実施形態において、上記のＰＤ－１に対する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＮ２０１６８００４０４８２．０に開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＣＮ２０１６８００４０４８２．０に開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の１つもしくは複数のＣＤＲ（好ましくは３つのＣＤＲ、即ちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ＨおよびＨＣＤＲ３、またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、より好ましくは６つのＣＤＲ、即ちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含むか、またはＣＮ２０１６８００４０４８２．０に開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＶＨかつ／またはＶＬを含むか、または上記抗体の重鎖かつ／または軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）とを含む。

いくつかの態様において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの態様において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの態様において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖をさらに含む。

いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域ＶＨは、
（ｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、好ましくは、上記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない。

いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域ＶＬは、
（ｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むか、または上記アミノ酸配列からなり、好ましくは、上記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない。

いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号１１５に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、上記３つのＨＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列、から選択される。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲおよびＬＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号１１６に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、上記３つのＬＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列、から選択される。

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、ＨＣＤＲ１は、配列番号１０９のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、ＨＣＤＲ２は、配列番号１１０のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１１のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、ＬＣＤＲ１は、配列番号１１２のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、ＬＣＤＲ２は、配列番号１１３のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１４のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域ＨＣは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、好ましくはＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、例えばＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１の重鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域にｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅの変異を導入する。例えば１つの重鎖定常領域にＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの変異を導入してｋｎｏｂ変異を含む抗体重鎖を取得し、かつ／または別の重鎖定常領域にＹ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖの変異を導入してｈｏｌｅ変異を含む抗体重鎖を取得する。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域は、ｌａｍｂｄａまたはＫａｐｐａ軽鎖定常領域である。

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、
（ｉ）配列番号７１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
（ｉｉ）配列番号７１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号７１から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片のｋｎｏｂ変異を含む重鎖は、
（ｉ）配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
（ｉｉ）配列番号７３から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号７３から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片のｈｏｌｅ変異を含む重鎖は、
（ｉ）配列番号３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
（ｉｉ）配列番号３３から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３３から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、
（ｉ）配列番号３４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなり、
（ｉｉ）配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３４から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１１５に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１１６に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
それぞれアミノ酸配列の配列番号１０９、１１０および１１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号１１２、１１３および１１４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１１５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるＶＨと、配列番号１１６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなるＶＬと、を含む。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号３４に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。

いくつかの好ましい実施形態において上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの同じ重鎖および２つの同じ軽鎖を含む。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号７３に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる、ｋｎｏｂ変異を含む重鎖、
配列番号３３に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる、ｈｏｌｅ変異を含む重鎖、
および、配列番号３４に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列または上記アミノ酸配列からなる軽鎖を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ｈｏｌｅ変異を含む１つの重鎖、ｋｎｏｂ変異を含む１つの重鎖、および２つの同じ上記軽鎖を含む。

本発明の一具体的な実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、
抗体の軽鎖である鎖Ａ、
抗体の重鎖Ｃ末端にリンカーを介して、または直接連結する本発明のＩＬ－２１変異タンパク質である鎖Ｂ、という構造を含む。

一実施形態において、鎖ＢのＩＬ－２１変異タンパク質は、抗体の重鎖Ｃ末端とリンカーを介して連結する。

一実施形態において、本明細書に記載の変異タンパク質融合タンパク質は、２つの同じ鎖Ａおよび２つの同じ鎖Ｂを含む。

一実施形態において、本明細書に記載の変異タンパク質融合タンパク質は、図２のＦｏｒｍａｔ２に示される構造を有する。

本発明の一実施形態において、鎖Ａおよび鎖Ｂが由来する抗体は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２に対する抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Ａおよび鎖Ｂが由来する抗体は、ＣＮ２０１６８００４０４８２．０の抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Ａおよび鎖Ｂが由来する抗体には、ＣＮ２０１６８００４０４８２．０の抗ＰＤ－１抗体の６つのＣＤＲが含まれるか、または上記抗体のＶＨかつ／またはＶＬが含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Ａおよび鎖Ｂが由来する抗体には、ＩｇＧ１重鎖定常領域、例えばＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１が含まれる。

いくつかの実施形態において、鎖Ａには、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２かつ／またはＬＣＤＲ３が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ａには、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ａには、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ａは、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖を含むか、あるいは上記軽鎖である。一実施形態において、鎖Ａは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、鎖Ｂの抗体重鎖には、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２かつ／またはＨＣＤＲ３が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂの抗体重鎖には、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂの抗体重鎖には、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂの抗体重鎖には、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖が含まれる。一実施形態において、鎖Ｂに含まれる抗体重鎖は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、鎖Ｂに含まれるＩＬ－２１変異タンパク質は、配列番号７５～１０５のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなり、かつ本発明に記載の変異を含む。

いくつかの実施形態において、鎖Ｂは、配列番号３５～５４のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

本発明の一具体的な実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、
抗体の軽鎖である鎖Ａ、
抗体の１つの重鎖のＣ末端に連結するＩＬ－２１変異タンパク質である鎖Ｂ１、
抗体の重鎖である鎖Ｂ２、という構造を含む。

一実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、２つの鎖Ａ、１つの鎖Ｂ１および１つの鎖Ｂ２を含む。

一実施形態において、鎖Ｂ１およびＢ２がヘテロ二量体を形成しやすくするために、鎖Ｂ１および鎖Ｂ２にｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ変異を導入する。一実施形態において、鎖Ｂ１にはｋｎｏｂ変異が含まれ、鎖Ｂ２にはｈｏｌｅ変異が含まれる。一実施形態において、ｋｎｏｂ変異はＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの変異であり、かつ／またはｈｏｌｅ変異はＹ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖである。一実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質は、図２のＦｏｒｍａｔ３に示される構造を有する。

本発明の一実施形態において、鎖Ａ、鎖Ｂ１および鎖Ｂ２が由来する抗体は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２に対する抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Ａ、鎖Ｂ１および鎖Ｂ２が由来する抗体は、ＣＮ２０１６８００４０４８２．０の抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Ａ、鎖Ｂ１および鎖Ｂ２が由来する抗体には、ＣＮ２０１６８００４０４８２．０の抗ＰＤ－１抗体の６つのＣＤＲが含まれるか、または上記抗体ＶＨかつ／またはＶＬが含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、鎖Ａおよび鎖Ｂが由来する抗体には、ＩｇＧ１重鎖定常領域、例えばＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１が含まれる。

いくつかの実施形態において、鎖Ａには、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２かつ／またはＬＣＤＲ３が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ａには、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ａには、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ａは、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖を含むか、あるいは上記軽鎖である。一実施形態において、鎖Ａは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、鎖Ｂ１もしくは鎖Ｂ２には、それぞれ上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２かつ／またはＨＣＤＲ３が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂ１もしくは鎖Ｂ２には、それぞれ上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂ１もしくは鎖Ｂ２には、それぞれ上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂ１には、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のｋｎｏｂ変異を含む重鎖が含まれる。いくつかの実施形態において、鎖Ｂ２には鎖Ｂ１には、上記の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のｈｏｌｅ変異を含む重鎖が含まれる。

一実施形態において、鎖Ｂ１に含まれる抗体重鎖は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、鎖Ｂ１に含まれるＩＬ－２１変異タンパク質は、配列番号７５～１０５のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ本発明に記載の変異を含む。

いくつかの実施形態において、鎖Ｂ１は、配列番号５５～６７のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは上記アミノ酸配列からなる。

一実施形態において、鎖Ｂ２は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

当業者には明らかなように、本発明に適用される融合物においてＩＬ－２１変異タンパク質とＦｃ断片もしくは抗体とを連結するリンカーは、当該分野で既知の任意のリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、ａｎｄ（ＧＧＧＳ）_ｎから選択されるリンカー配列を含んでもよく、ここで、ｎは少なくとも１の整数である。好ましくは、リンカーは（Ｇ４Ｓ）_２もしくは（Ｇ４Ｓ）_３を含む。

ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主
本発明は、上記任意のＩＬ－２１変異タンパク質または融合物をコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法により、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ－２１をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって産生することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含んでもよく、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに操作可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。

本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター、例えば、真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターである。

本発明はまた、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。ＩＬ－２１変異タンパク質または融合物の発現を複製および支持するのに適用される宿主細胞は、当該分野で周知である。特定の発現ベクターでこのような細胞をトランスフェクションまたは形質導入することができるとともに、ベクターを含む多くの細胞を大規模な発酵槽に接種するために増殖させることができ、臨床的使用のための十分な量のＩＬ－２１変異体または融合物が得られる。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選択される。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０から形質転換されたサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎系（Ｅｘｐｉ２９３細胞などの２９３もしくは２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞と、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株と、を含む。一実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞であり、好ましくはＨＥＫ２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞またはリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。

ＩＶ．調製方法
さらなる態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質または融合物を調製する方法を提供し、ここで、上記方法は、ＩＬ－２１変異タンパク質または融合物の発現に適した条件で、上記タンパク質または融合物をコードする核酸を含む上記で提供されるような宿主細胞を培養するステップと、場合により上記宿主細胞（または宿主細胞培地）から上記タンパク質または融合物を回収するステップとを含む。

Ｖ．測定法
当該分野で既知の様々な測定方法を利用して、本明細書により提供されるＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性かつ／または生物学的活性の特性評価を行うことができる。

一態様において、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物のＩＬ－２１受容体への結合活性、例えば親和性を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような当該分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示される例示的な方法を利用して、ヒトＩＬ－２１Ｒとの結合を測定することができる。候補として、結合ダイナミクス（例えばＫ_Ｄ値）を含む変異タンパク質と受容体との結合は、ＩＬ－２１－Ｆｃ融合タンパク質もしくはＩＬ－２１と抗体の融合タンパク質を使用して、ＢＬＩ測定法によって測定することができる。

さらなる態様において、受容体結合下流で発生するシグナル伝達かつ／または免疫活性化効果を測定することで、ＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物のＩＬ－２１受容体への結合能力を間接的に測定することができる。

したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異ＩＬ－２１タンパク質またはその融合物を同定するための測定法を提供する。生物学的活性は、例えばＩＬ－２１受容体を有するＴ細胞におけるＩＬ－２１シグナル伝達を誘導する能力を含んでもよい。本発明は、インビボかつ／またはインビトロにこのような生物学的活性を有する変異ＩＬ－２１タンパク質も提供する。

当該分野で既知のさまざまな方法は、ＩＬ－２１またはその融合物の生物学的活性を測定するために使用できる。例えば、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物のＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する能力を測定する。

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、製品の純度などの本発明の変異タンパク質またはその融合物の創薬可能性を特徴付けることができる。製品純度の測定について、得られた生産細胞の培養上清に対してワンステップ精製を実施した後、純度を測定して、変異タンパク質の精製性能を検出することができる。好ましくは、本発明の変異タンパク質は、精製後に野生型タンパク質よりも有意に優れた純度を有し、本発明の変異タンパク質がより良好な精製性能を有することを示している。純度測定法は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を含むが、これに限定されない、当該分野で既知の任意の従来の方法であってもよい。

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、本発明の変異タンパク質またはその融合物の半減期などの薬物動態特性を特徴付けることができる。

ＶＩ．ＩＬ－２１タンパク質の改変方法
さらなる態様において、本発明は、改善された特性を有するＩＬ－２１変異タンパク質を得るための方法およびこの方法により得られたＩＬ－２１変異タンパク質を提供する。

一実施形態において、本発明の方法は、
（ａ）以下の１つもしくは複数の本発明の変異：
１、ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異、
２、ＩＬ－２１グリコシル化変異、
３、ＩＬ－２１界面アミノ酸変異、かつ／または
４、ＩＬ－２１切断変異、によってＩＬ－２１変異タンパク質のアミノ酸配列を取得し、
場合により、上記ＩＬ－２１変異タンパク質を他のタンパク質またはポリペプチド、例えばＦｃ断片、抗体またはその抗原結合断片に連結して、ＩＬ－２１変異タンパク質融合物を取得することをさらに含む、
（ｂ）上記ＩＬ－２１変異タンパク質をコードする核酸分子を合成するか、または上記ＩＬ－２１変異タンパク質融合物をコードする各鎖を含む核酸分子を合成する、
（ｃ）哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３もしくはＣＨＯ細胞）に（ｂ）の核酸分子を導入し、上記ＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物を発現する、というステップを含む。
一実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ａ）～（ｃ）の後、変異タンパク質またはその融合物の特性：（ｉ）精製後のタンパク質純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出によるワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、（ｉｉ）低減された結合、および場合による（ｉｉｉ）延長した半減期を同定するステップをさらに含む。
一実施形態において、上記方法は、ステップ（ａ）～（ｃ）の変異を組み合わせる前、細胞（例えばＴ細胞）に対する変異タンパク質またはその融合物の活性化、例えばＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路への結合、例えばＳＴＡＴ３に対するリン酸化を同定することを含む。

ＶＩＩ．医薬組成物および医薬製剤
本発明は、ＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物を含む組成物（医薬組成物または医薬製剤を含む）、およびＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、当該分野で既知の薬学的に許容可能なベクター、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な賦形剤などの適切な薬用補助材料を必要に応じて含んでもよい。

ＶＩＩＩ．組み合わせ製品
一態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合物、および１つもしくは複数の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。

いくつかの実施形態において、上記組み合わせ製品は癌の予防または治療に用いられる。

ＩＸ．治療方法および使用
一態様において、本発明は、癌などの対象の疾患を予防または治療する方法に関し、上記方法は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２１変異タンパク質、またはその融合物を上記対象に投与することを含む。癌は、早期、中期または末期にある癌または転移性癌であってもよい。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍または血液腫瘍であってもよい。

本発明のＩＬ－２１変異タンパク質またはその融合物（およびそれを含む医薬組成物、場合による他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療に必要な場合、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、投与は、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路によることができる。本明細書において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス注入などの様々な投与スケジュールが含まれる。

疾患を予防または治療するために、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質の適切な用量（単独で投与される場合または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度とその進行、予防目的の投与か治療目的の投与か、過去の治療、患者の臨床病歴および上記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。上記抗体は、単回の治療で、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。

さらなる態様において、本発明はまた、上記方法に使用される（例えば治療に使用される）薬物の調製における、本発明のＩＬ－２１変異タンパク質、組成物および融合物の使用を提供する。

本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。いかなる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。

本発明にかかる上記と他の態様および実施形態は、図面（図面の簡単な説明がその後に続く）と以下の発明の詳細な説明において記載され、以下の実施例に例示されている。上記および本願にわたって説明された特徴のいずれかまたはすべては、本発明の各実施形態において組み合わせることができる。以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。

実施例
実施例１：ＩＬ－２１変異体の設計および構築
インターロイキン２１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２１、ＩＬ－２１）は、体内で主に活性化されたＣＤ４＋Ｔｈ細胞およびＮＫＴ細胞によって分泌される４つのαヘリックス鎖で構成された樽形構造のサイトカイン（図１Ａ）であり、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－１５との相同性が比較的高く、いずれもγｃ受容体ファミリーのサイトカインに属する。ＩＬ－２１受容体は、それぞれＩＬ－２１ＲαとＩＬ－２Ｒγｃである２つの鎖で構成される。ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒαとの結合界面は、ヘリックスＡ、ヘリックスＣおよび一部のＣＤ Ｌｏｏｐ（図１Ｃ）である。ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒαとの結合を弱めるために、ＩＬ－２１と受容体との相互作用残基を減少または減弱させることによって、野生型ＩＬ－２１（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＢＥ４、配列番号７４）に対して、４種類のＩＬ－２１変異体を設計し、３種類の分子形態（Ｆｏｒｍａｔ）によって検証されている。具体的には、設計された変異は、主に以下の変異形態を含む：
１） ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラに関して、ＩＬ－２１とＩＬ－４の構造が相同であるため、ＩＬ－２１とＩＬ－４の一部が二次構造に置換され、即ちＩＬ－２１のＮ末端がＩＬ－４のＮ末端アミノ酸によって置換される、
２） ＩＬ－２１グリコシル化変異体に関して、ＩＬ－２１とその受容体界面にＮ－グリコシル化部位変異を導入する、
３） ＩＬ－２１界面アミノ変異体、
４） ＩＬ－２１切断変異体、
５） 組み合わせ変異体に関して、少なくとも上記４種類のうちの任意の２つ、３つもしくは４つすべてを含む。

ＩＬ－２１の野生型タンパク質および上記の変異タンパク質をＦｃ（ＩｇＧ１に由来し、ＬＡＬＡ変異、配列番号７０）にリンカー（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号６９）を介してそれぞれ連結し、ジスルフィド結合を介して２つの鎖を連結し、Ｆｏｒｍａｔ Ｉの融合タンパク質形態に構築し、ＩＬ－２１の野生型タンパク質および変異タンパク質を抗ＰＤ－１抗体（ＣＮ２０１６８００４０４８２．０に由来し、重鎖ＨＣの配列が配列番号７１に示され、軽鎖ＬＣの配列が配列番号３４に示される）の重鎖Ｃ末端にそれぞれ直接連結し、Ｆｏｒｍａｔ ＩＩの融合タンパク質形態に構築し、またはＩＬ－２１の野生型タンパク質および変異タンパク質をｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅの抗ＰＤ－１抗体（ＣＮ２０１６８００４０４８２．０に由来し、軽鎖ＬＣの配列が配列番号３４に示され、ｋｎｏｂ重鎖（即ちＨＣ－ｋｎｏｂ、ＩｇＧ１形態、ＬＡＬＡ変異を有する）の配列が配列番号７３に示され、Ｈｏｌｅ重鎖（即ちＨＣ－ｈｏｌｅ、ＩｇＧ１形態、ＬＡＬＡ変異を有する）の配列が配列番号３３に示される）のｋｎｏｂ重鎖Ｃ末端にリンカー（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号７２）を介してそれぞれ連結し、Ｆｏｒｍａｔ ＩＩＩの融合タンパク質形態に構築し、ここで、Ｆｏｒｍａｔ Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの融合タンパク質形態は図２を参照する。
上記変異およびＦｏｒｍａｔの詳細な情報は次のとおりである。

ＩＬ－２１／ＩＬ－４キメラ変異の設計
ＩＬ－２１のＮＭＲ構造（ＰＤＢ：２ＯＱＰ）は、そのＮ末端が比較的活性であり、相対的に安定したコンフォメーションを持たないことが示され、構造のアラインメント（図１Ｂ）によってＩＬ－４とＩＬ－２１の構造の類似度が比較的高く、かつそのＮ末端コンフォメーションがより安定していることが分かった。したがって、ＩＬ－４のＮ末端アミノ酸でＩＬ－２１のＮ末端アミノ酸を置換して、より安定したＩＬ－２１のＮ末端コンフォメーションを取得するように設計し、かつ分子の創薬可能性を最適化する。
具体的な設計は、下記の表１に示される：

ＩＬ－２１グリコシル化変異体
ＩＬ－２１は、細胞表面へのＩＬ－２１Ｒの吸着（ｓｉｎｋ効果）により、体内でのその半減期が短くなる。発明者らは、ＩＬ－２１とその受容体との結合界面にグリコシル化部位を導入してグリコシル化を導入することで、ＩＬ－２１とその受容体との間の相互結合を反発させ、さらにＩＬ－２１のその受容体に対する親和性を低減させ、体内でのＩＬ－２１の半減期を延長すると同時に、ＩＬ－２１表面へのグリコシル化を導入することは、分子の凝集状態を改善し、分子の創薬可能性を最適化することができることを見出した。

ＩＬ－２１界面アミノ酸変異体
ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒが結合する界面では、電荷または親水性と疎水性が類似するアミノ酸で対応する位置のアミノ酸を変異させ、さらにＩＬ－２１のその受容体に対する親和性を低減させ、かつ分子の創薬可能性を最適化する。

ＩＬ－２１切断変異体
Ｈｅｌｉｘ Ａ、ＣＤ ｌｏｏｐもしくはＣ ｌｏｏｐを切断することによって、その局所構造をより安定させ、ＩＬ－２１の安定性を増加させることができ、さらにその創薬可能性（例えば、ＳＥＣ純度）を改善する。

組み合わせ変異体：
発明者らは、上記の変異をさらに組み合わせて、より優れた安定性かつ／または比較的低い親和性を有する組み合わせ変異体を取得し、さらにその創薬可能性または活性を改善する。

実施例２：ＩＬ－２１変異体の発現精製
発現プラスミドの構築
融合タンパク質分子００１～０６５の各鎖の配列は、ＧＥＮＥＷＩＺ遺伝子合成に送られ、それぞれｐＣＤＮＡ３．１テンプレートプラスミドに構築され、細胞の一過性発現のために一定量のプラスミドが調製された。

必要なトランスフェクション体積に応じて、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約３×１０^６個の細胞／ｍＬであった。最終体積の１／１０（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）をトランスフェクション緩衝液として、上記で構築した発現プラスミドを加え、均一に混合し、０．２２μｍのフィルターヘッドでろ過して使用に備えた。前のステップのプラスミドに適量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を加え（各プラスミドとＰＥＩの質量比率が１：３）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートし、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＥｘｐｉ２９３細胞に慎重に注入して（Ｆｏｒｍａｔ Ｉ形態の融合タンパク質分子の場合は、鎖を含むｐＣＮＤＡ３．１のプラスミドを細胞にトランスフェクションし、Ｆｏｒｍａｔ ＩＩとＩＩＩ形態の融合タンパク質分子の場合は、重鎖を含むｐＣＮＤＡ３．１プラスミドおよび軽鎖を含むｐＣＮＤＡ３．１プラスミドを細胞に同時トランスフェクションする）、均一に混合し、３７℃、８％のＣＯ_２の条件で２４ｈ培養した後、最終濃度が２ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）Ｆｅｅｄ（１ｇ／ＬのＰｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ＋１ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈｙｔｏｎｅ）になるようにＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ｐ４５４３－１００Ｇ）を補充し、６日間培養を続けた。

タンパク質の精製：遠心分離し、細胞上清を収集した。メーカーの取扱説明書に従って、プレパックカラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ、１１－００３４－９５）で上清液を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集した。溶出液１ｍＬあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２ＭのＴｒｉｓ）を加え、限外ろ過濃縮管（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、製品番号：ＵＦＣ９０１０９６）を用いてＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、製品番号：７００１１－０４４）に交換し、濃度を測定した。１００μｇの精製後のタンパク質を濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで調整し、ゲルろ過クロマトグラフィーカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）でタンパク質の純度を測定した。結果は表１１を参照する。

表１１から分かるように、野生型ＩＬ－２１（０３３対照）は、ワンステップアフィニティー精製後に試料の純度がわずか６１％であったが、本発明のＩＬ－２１変異体の純度はいずれも野生型よりも優れ、０３４～０６５のうちの２１個の分子は純度が８５％以上に達し、それぞれ０３４、０３７、０３９、０４３～０４４、０４６～０５０、０５３～０６０、０６２～０６３および０６５であり、さらに、００１～０３２のすべてまたは一部の分子のＳＥＣ純度を同様に測定しており、これらの分子のＳＥＣ純度がいずれも野生型分子００１より高ったことが示される（データは示さていない）。上記の結果は、本発明の変異体が野生型ＩＬ－２１よりも安定で凝集しにくく、より高い純度を得ることができ、改善された創薬可能性を有することが示される。

実施例３．ＩＬ－２１変異体のその受容体に対する親和性の測定
ヒトＩＬ－２１Ｒ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）に結合する本発明のＩＬ－２１変異体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏｌａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）技術によって測定された。ＢＬＩ法による親和性の測定は、従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ２７０－８）で行われた。
実験開始より半時間前に、試料の数量に応じて、適切な数量のＡＨＣ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８－５０６０）センサをＳＤ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．０５％）に浸漬した。

１００μＬのＳＤ緩衝液、ＩＬ－２１融合タンパク質（分子０３３～０６５、ここで、分子０３３は対照として野生型ＩＬ－２１融合タンパク質である）、ＩＬ－２１Ｒ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、９２４９－Ｒ２－１００）を９６ウェルの黒色ポリスチレンハーフボリュームマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６７５０７６）にそれぞれ加えた。試料の位置に対応するようにプレートを配置し、センサの位置を決定した。次のように機器パラメータを設定した。ステップＢａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ～１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを実行し、試料の結合と解離の速度で各ステップの実行時間を決定し、回転速度は４００ｒｐｍで、温度は３０℃であった。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェアを用いてＫ_Ｄ値を分析した。結果は表１２を参照する。

ＩＬ－２１変異体のその受容体に対する親和性データは表１２に示される。野生型ＩＬ－２１（０３３）のＩＬ－２１Ｒに対する親和性Ｋ_Ｄは８．２９Ｅ－１０Ｍであるが、この研究で得られたＩＬ－２１変異体のＩＬ－２１Ｒに対する一価親和性はいずれも非常に弱く、ここで、分子００２～０３２のＫ_Ｄ値は３．７４Ｅ－１０よりも低いか、または機器の検出範囲よりも低く（結合なし（Ｎ．Ｂ．）に示され、データは示されず）、分子０３４～０６５の分子の一部の分子のＫ_Ｄ値も機器の検出範囲よりも低く、ここで結合なし（Ｎ．Ｂ．）として示される（表１２）。

体内でのＩＬ－２１の半減期は非常に短く、主な理由の１つは、それが細胞表面受容体と高い親和性を有するため、細胞に容易に取り込まれて分解されることである。したがって、受容体への結合能力が弱められたＩＬ－２１変異体は、体内での半減期がより長くなる。

実施例４：インビトロ機能実験
実験方法：
一、ＨｕＴ７８ ＰＤ１陽性細胞の調製
- トランスフェクションの前日、対数増殖期の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を選択し、Ｔ１７５スクエアフラスコ（ＮＵＮＣ、１５９９１０）に接種した。
- トランスフェクションの１ｈ前に培地を捨て、１８ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００２２．０１Ｂ）を加え、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、４１１１）に再度入れた。
- 遠心分離管１に１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５－０７０）および１０５μＬのＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、１１５－１００）を加え、軽く均一に混合し、室温で５ｍｉｎインキュベートした。遠心分離管２に１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、２０μｇのレンチウイルスプラスミド（ｈＰＤ１－ｋｏｚａｋａ－ｃｄｓ、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ）（ＧＥＮＥＷＩＺ Ｉｎｃ、蘇州）、１０μｇのｐＳＰＡＸ２（ＧＥＮＥＷＩＺ Ｉｎｃ、蘇州）および５μｇのｐＭＧ２．Ｇ（ＧＥＮＥＷＩＺ Ｉｎｃ、蘇州）を加え、軽く均一に混合し、室温で５ｍｉｎインキュベートした。
- ２つの遠心分離管の混合物を一緒に混合し、軽く均一に混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートした。
- 混合したトランスフェクション混合物を培養フラスコに加え、培養フラスコを軽く振とうして均一にし、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに入れて培養した。
- ４～６ｈトランスフェクション後に培養フラスコ内の培地を吸引し、１０％の血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）および１％の二重抗体（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）を含むＤＭＥＭ培地２５ｍＬを加え、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに入れて培養した。
- ４８ｈトランスフェクション後に細胞上清液を収集して４℃の冷蔵庫に保存し、元のフラスコに１０％の血清および１％の二重抗体を含むＤＭＥＭ培地２５ｍＬを加え、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに入れて培養した。
- ７２ｈトランスフェクション後に細胞上清液を再度収集し、４８ｈに収集した細胞上清液と混合した。
- 冷凍遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＡ４０Ｒ）を使用し、４℃、２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、細胞破片を除去した。
- 遠心分離後、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルター膜（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ｓｔｅｄｉｍ、１６５４１－ｋ）で上清液をろ過した。
- 上清液の１／３体積の濃縮試薬（Ｔａｋａｒａ、６３１２３２）を加え、軽く均一に混合し、４℃の冷蔵庫で一晩静置した。
- ４℃、１５００ｇで４５ｍｉｎ遠心分離し、慎重に上清を捨て、ウイルス粒子沈殿物を捨てないように注意し、レンチウイルス粒子沈殿物を取得した。
- １ｍＬの標的感染細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０８０９．０１）、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）、および１％のＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２））で前のステップで得られたレンチウイルス粒子沈殿物を再懸濁し、沈殿物を吹き飛ばさずに軽く懸濁し、４℃で４ｈ静置してウイルスを溶解し、レンチウイルス溶液を取得し、１００μＬ／管に分注した後に－８０℃で凍結保存した。
- 感染の前日に、対数増殖期のＨｕＴ７８細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１６１）を選択し、３×１０５／ウェル、各ウェル３ｍＬで６ウェルプレート（ＮＥＳＴ、７０３００１）に接種した。
- 各ウェルに凍結融解したレンチウイルス溶液１００μＬを加え、軽く均一に混合し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに入れて３日培養し、ＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１として命名されたＰＤ－１－ＧＦＰ陽性細胞を取得した。
- ＨｕＴ７８とＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞３００ｇを取って、室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- フローサイトメトリー（ＢＤ、ＦＡＣＳ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ）によってＧＦＰとＰＤ１の陽性率を検出した。

二、ＨｕＴ７８とＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞におけるＩＬ－２１変異体のＳＴＡＴ３検出
- ＨｕＴ７８とＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞の濃度をそれぞれ５×１０６／ｍＬに調整し、ＨｕＴ７８：ＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１＝３：７に従って混合し、３００ｇで室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- 上記の上清を除去した細胞に等体積のＤＣＭ希釈液（Ｌ３４９６３）を加え、室温で暗所で１０ｍｉｎインキュベートした。
- ３倍体積のＦＡＣＳ緩衝液（５００ｍＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、００２０００００３４）、５０ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬのＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加え、３００ｇで室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、等体積の培地（ＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０８０９．０１）、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０４０６．０５）、および１％のＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２））を加えて再懸濁し、細胞混合液を取得した。
- 各ウェルに前のステップで調製した細胞混合液１００μＬ、ｒｈＩＬ－２１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、８８７９－ＩＬ－０５０）１００μＬまたは本発明の０３３～０６５分子を加え、均一に混合し、３７℃で２０ｍｉｎ水浴した。
- 各ウェルにＰＢＳで１０％に希釈した固定液（Ｐｉｅｒｃｅ（商標） １６％のＦｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ｗ／ｖ）、Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｆｒｅｅ、２８９０６）５０μＬをさらに加え、３７℃で１０ｍｉｎ水浴した。
- ６００ｇで室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- 上清が除去された各ウェルにＰＢＳで０．０５％に希釈したＴｒｉｔｏｎ５０μＬを加え、氷上でウェルを通して５ｍｉｎインキュベートした。
- 各ウェルに２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、６００ｇで室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、５００ｇで室温で４ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに２００μＬのメタノール（国薬集団化学試剤有限公司、１００１４１１８）を加えて均一に混合し、－２０℃で一晩放置した。
- ６００ｇで室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルに２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、６００ｇで室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。
- 各ウェルを５０μＬのＳＴＡＴ３染色液（ＦＡＣＳ緩衝液＋ＰＥ結合のｐＳＴＡＴ３抗体）で再懸濁し、室温で暗所で６０ｍｉｎインキュベートした。

実験結果：
ＩＬ－２１がＴ細胞表面のＩＬ－２１受容体に結合すると、Ｔリンパ球のＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化し、ＳＴＡＴ３がリン酸化されるため、リン酸化されたＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）のレベルで当該シグナル伝達経路の活性化の程度を評価した。

以下の結果が得られた（表１３）：ｒｈＩＬ－２１および０３３のＩＬ２１は野生型ＩＬ－２１であり、ＰＤ１陰性のＨｕＴ７８細胞に対してシグナル伝達経路を活性化する活性が非常に高く、ＥＣ５０はそれぞれ～１．６１Ｅ－００９ｎＭおよび０．０４６ｎＭであり、この研究の変異体のＥＣ５０値はいずれも野生型ＩＬ－２１よりも大きく、即ちＰＤ１陰性細胞を活性化する活性がより低く示された。例えば、０４１、０４９、０５３～０５５、０５９、０６１および０６３～０６４は１００ｎＭの場合、活性化する活性が極めて弱く、または活性が検出できないと示された。図３Ａに示されるとおりである。

逆に、ＰＤ１陽性のＨｕＴ７８細胞（ＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１）に対して、ｒｈＩＬ－２１の活性ＥＣ５０は～１．５９Ｅ－００９ｎＭ、０３３は６．３Ｅ－０５ｎＭであり、この研究の変異体融合タンパク質分子０５３、０５４、０５５、０６１および０６３を活性化する活性ＥＣ５０はそれぞれ、０．０３４、０．０４３、０．０９２、０．８３１および０．８２１７ｎＭであるため、ＰＤ１陽性のＴ細胞における本発明のＩＬ－２１変異体の活性はｒｈＩＬ－２１より低いが、ＰＤ－１陰性細胞におけるその活性よりも大幅に向上したことが示された。図３Ｂに示されるとおりである。

上記の結果から分かるように、ＰＤ１陰性のＨｕＴ７８細胞における本発明の変異体の活性が非常に低いが、ＰＤ１陽性のＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞における活性が非常に高く、その活性ＥＣ５０はほとんど０．１ｎＭより低く、最大で５．５ｎＭより低いため、この研究で得られたＩＬ－２１変異体は２種類の細胞において非常に広い治療ウィンドウを有し、ＰＤ１陽性のＴ細胞を選択的に活性化できることが示された。

図４を参照し、発明者らは、本発明の融合タンパク質分子０５３と対照分子（本願では１０６としてコード化され、ここで、ＩＬ－２１変異タンパク質改変情報は、特許出願ＵＳ２０１９００４６６１１Ａ１に開示された配列番号２４１のＩＬ－２１変異タンパク質に由来し、本発明の抗ＰＤ１抗体－融合タンパク質であり、ここで、抗ＰＤ１抗体の配列は、重鎖－Ｋｎｏｂ：配列番号６８、重鎖－Ｈｏｌｅ：配列番号３３、軽鎖：配列番号０３４であり、実施例２に記載のように調製された）のシグナル伝達経路を活性化する活性をさらに比較した。結果から、ＰＤ１陰性のＨｕＴ７８細胞における本発明の融合タンパク質分子０５３の活性（図４Ａ）は分子１０６より明らかに弱いが、ＰＤ１陽性のＨｕＴ７８－ＧＦＰ－ＰＤ１細胞における分子０５３と分子１０６の活性がほぼ同等であることが示され（図４Ｂ）、既知の変異体と比較して、本発明で得られたＩＬ－２１変異体はＰＤ－１の陰性と陽性の細胞との間でより大きい活性ウィンドウを有することがさらに示された。

Claims (31)

1. ＩＬ－２１変異タンパク質であって、
   前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２１（好ましくはヒトＩＬ－２１、より好ましくは配列番号７４の配列を含むＩＬ－２１）と比較して、以下：
   （ｉ）ＩＬ－４（好ましくはヒトＩＬ－４）の位置１～１５におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１５におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１５におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１４におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１４におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１４におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１３におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１３におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１３におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１２におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１２におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１２におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１１におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１１におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～１０におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１０におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～１０におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～９におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～９におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～８におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～８におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～８におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～７におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～７におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～７におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～６におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～６におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～６アミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～５におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～５におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～５におけるアミノ酸の置換；ＩＬ－４の位置１～４におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～４におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～４におけるアミノ酸の置換；またはＩＬ－４の位置１～１１におけるアミノ酸もしくはＣＳ３を含む位置１～１１におけるアミノ酸による、ＩＬ－２１の位置１～９におけるアミノ酸の置換、
   （ｉｉ）Ｄ４、Ｒ５、Ｈ６、Ｍ７、Ｄ１５、Ｖ１７、Ｑ１９、Ｋ２１、Ｄ３７、Ｅ３９、Ｒ７６、Ｋ７７、Ｐ７８、Ｐ７９、Ｓ８０、Ｎ８２、Ｇ８４、Ｈ１２０かつ／またはＨ１２２の位置から選択される少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の位置での変異による当該位置でのグリコシル化、
   （ｉｉｉ）Ｉ８、Ｋ７２、Ｋ７７、Ｐ７８、かつ／またはＰ７９から選択される１個～５個の位置、例えば１個もしくは２個の位置での置換であって、ここで、前記ＫがＤもしくはＥで置換可能であり、ＰがＥもしくはＡで置換可能であり、またはＩがＱで置換可能である置換、
   （ｉｖ）Ｈｅｌｉｘ ＡのＮ末端（例えば位置１～１５）、ＣＤ ｌｏｏｐ（例えば位置８２～９５、もしくは８４～９１）またはＣ ｌｏｏｐ（例えば位置７６～８１）での１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、もしくは９個のアミノ酸の欠失、あるいは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、もしくは９個のアミノ酸を含むセグメントの欠失、
   の変異の１つもしくは複数を含み、
   ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７４により番号付けられるアミノ酸位置である、
   ＩＬ－２１変異タンパク質。
2. 前記変異（ｉ）における置換のためのＩＬ－４のＮ末端の位置１～１５におけるアミノ酸は、ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮまたはＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮであり、
   より好ましくは、前記変異（ｉ）の変異は、
   ＩＬ－４の１～５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩ）によるＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）の置換、
   ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
   ＩＬ－４の１～１５＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮ）によるＩＬ－２１の１～１５（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤ）の置換、
   ＩＬ－４の１～１２＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩＫ）によるＩＬ－２１の１～１２（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱ）の置換、
   ＩＬ－４の１～１１＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩ）によるＩＬ－２１の１～１１（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲ）の置換、または
   ＩＬ－４の１～１１＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥＩＩ）によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、から選択される、
   請求項１に記載の変異タンパク質。
3. 前記変異（ｉｉ）における変異は、前記位置におけるアミノ酸をＮ、ＴもしくはＳに置換することであり、
   好ましくは、前記変異（ｉｉ）は、
   Ｄ４Ｎ、Ｒ５Ｎ、Ｈ６Ｔ、Ｍ７Ｔ、Ｄ１５Ｎ、Ｖ１７Ｔ、Ｑ１９Ｎ、Ｋ２１Ｔ、Ｄ３７Ｎ、Ｅ３９Ｔ、Ｒ７６Ｎ、Ｋ７７Ｎ、Ｐ７８Ｔ／Ｓ、Ｐ７９Ｔ／Ｎ、Ｓ８０Ｎ、Ｎ８２Ｔ、Ｇ８２Ｔ、Ｇ８４Ｔ、Ｈ１２０Ｎかつ／またはＨ１２２Ｔから選択される１個、２個、３個、４個、もしくは５個の置換を含み、
   より好ましくは、前記変異（ｉｉ）は、
   Ｄ４＆Ｈ６
   Ｒ５＆Ｍ７
   Ｄ１５＆Ｖ１７
   ＩＱ１９＆Ｋ２１
   Ｒ７６＆Ｐ７８
   Ｋ７７＆Ｐ７８＆Ｐ７９
   Ｐ７９
   Ｓ８０＆Ｎ８２
   Ｇ８４
   Ｈ１２０＆Ｈ１２２または
   Ｄ３７＆Ｅ３９という位置での置換または置換の組み合わせから選択され、
   最も好ましくは、前記変異（ｉｉ）は、
   Ｄ４Ｎ＆Ｈ６Ｔ
   Ｒ５Ｎ＆Ｍ７Ｔ
   Ｄ１５Ｎ＆Ｖ１７Ｔ
   ＩＱ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ
   Ｒ７６Ｎ＆Ｐ７８Ｔ
   Ｋ７７Ｎ＆Ｐ７８Ｓ＆Ｐ７９Ｔ
   Ｐ７９Ｎ
   Ｓ８０Ｎ＆Ｎ８２Ｔ
   Ｇ８４Ｔ
   Ｈ１２０Ｎ＆Ｈ１２２Ｔまたは
   Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９Ｔでの置換または置換の組み合わせから選択される、
   請求項１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
4. 前記変異（ｉｉｉ）における変異は、
   Ｉ８Ｑ、Ｋ７２Ｅ、Ｋ７７Ｄ、Ｐ７８Ａかつ／またはＰ７９Ｅから選択される１個～５個、例えば１個もしくは２個の置換を含み、
   好ましくは、前記変異（ｉｉｉ）における変異は、
   Ｋ７２、
   Ｉ８＆Ｐ７９、または
   Ｋ７７＆Ｐ７８という位置または位置の組み合わせでの置換であり、ここで、ＫがＤもしくはＥで置換可能であり、ＰがＥもしくはＡで置換可能であり、またはＩがＱで置換可能であり、
   好ましくは、前記変異（ｉｉｉ）における変異は、
   Ｋ７２Ｅ
   Ｉ８Ｑ＆Ｐ７９Ｅまたは
   Ｋ７７Ｄ＆Ｐ７８Ａから選択される、
   請求項１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
5. 前記変異（ｉｖ）における変異は、位置１～９、位置７８～７９、位置８５～８７、もしくは位置８４～９１から選択される位置におけるアミノ酸セグメントの欠失を含み、
   好ましくは、前記変異（ｉｖ）における変異は、
   ８５～８７の切断、
   ７８～７９の切断、
   １～９の切断、
   ８４～９１の切断、または
   １～９の切断＆７８～７９の切断という位置または位置の組み合わせでのアミノ酸セグメントの欠失であり、
   好ましくは、前記変異（ｉｖ）における変異は、
   ８５～８７（ＲＲＱ）の切断、
   ７８～７９（ＰＰ）の切断、
   １～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断、
   ８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断、または
   １～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断＆７８～７９（ＰＰ）の切断から選択されるアミノ酸セグメントの欠失である、
   請求項１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
6. 前記変異タンパク質は、
   （ｉ）１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の切断＆Ｑ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ、
   （ｉｉ）８４～９１（ＧＲＲＱＫＨＲＬ）の切断＆Ｃ４２Ａ＆Ｃ９３Ｔ＆Ｑ１９Ｎ＆Ｋ２１Ｔ、
   （ｉｉｉ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆７８～７９（ＰＰ）の切断によるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
   （ｉｖ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｋ１１７Ｎ＆Ｉ１１９ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
   （ｖ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｄ３７Ｎ＆Ｅ３９ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、
   （ｖｉ）ＩＬ－４の１～９＆Ｃ３Ｓ（ＨＫＳＤＩＴＬＱＥ）＆Ｄ１５Ｎ＆Ｖ１７ＴによるＩＬ－２１の１～９（ＱＧＱＤＲＨＭＩＲ）の置換、または
   （ｖｉｉ）ＩＬ－４の１～５（ＨＫＣＤＩ）＆Ｌ１２３ＣによるＩＬ－２１の１～５（ＱＧＱＤＲ）の置換、から選択される変異を含む、
   請求項１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
7. 前記野生型ＩＬ－２１は、配列番号７４もしくは配列番号１０６～１０８に示されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有するまたは１個～１０個もしくは１個～５個以下のアミノ酸保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、
   請求項１～６のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
8. 前記変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、以下：
   （ｉ）より低いＩＬ－２１Ｒに対する親和性、
   （ｉｉ）より高い安定性、
   （ｉｉｉ）改善された創薬可能性（例えばより長い半減期かつ／または改善された純度、例えばＳＥＣ純度）、かつ／または
   （ｉｖ）抗原に対する抗体またはその抗原結合断片と融合タンパク質を形成した後、その当該抗原の陽性細胞に対する選択的活性化の増加、
   という改善された特性の１つもしくは複数を有する、
   請求項１～７のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
9. 前記変異タンパク質は、配列番号７５～１０５から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、配列番号７５～１０５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
   請求項１～７のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質。
10. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ２変異タンパク質を含む、
    ＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
11. Ｆｃ断片に連結される請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質を含むか、あるいは、抗体またはその抗原結合断片に連結される請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質を含み、
    ここで、前記連結は、リンカーによるものまたはリンカーによらないものである、
    請求項１０に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
12. 前記Ｆｃ断片はヒトのＩｇＧ Ｆｃ、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、もしくはヒトＩｇＧ４ Ｆｃであり、好ましくは、前記Ｆｃ断片はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、例えばＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃであり、より好ましくは、前記Ｆｃ断片は、配列番号７０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９６％、９７％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
    請求項１１に記載の変異タンパク質融合タンパク質。
13. 前記抗体が対象とする抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、
    請求項１１に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
14. 前記抗体が対象とする抗原はＰＤ－１であり、かつ前記抗体またはその抗原結合断片は、
    （１）配列番号１１５に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１１６に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または
    （２）それぞれアミノ酸配列の配列番号１０９、１１０および１１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号１１２、１１３および１１４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、を含む、
    請求項１２に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
15. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
    配列番号１１５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＶＨと、配列番号１１６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＶＬと、を含む、
    請求項１４に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
16. ＩＬ－２１変異タンパク質がリンカーを介して、またはＦｃ断片のＮ末端に直接連結する鎖Ａを含み、
    好ましくは、前記融合タンパク質が２つの同じ鎖Ａを含む、
    請求項１０～１２のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
17. 鎖Ａは配列番号１～３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
    請求項１６に記載の変異タンパク質融合タンパク質。
18. 抗体の軽鎖である鎖Ａ、
    抗体の重鎖のＣ末端に連結するＩＬ－２１変異タンパク質である鎖Ｂ、という構造を含み、
    好ましくは、前記変異タンパク質融合タンパク質は、２つの同じ鎖Ａおよび２つの同じ鎖Ｂを含む、
    請求項１０、１１、１３～１５のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
19. 鎖Ａは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または鎖Ｂは、配列番号３５～５４のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１５に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
20. 抗体の軽鎖である鎖Ａ、
    抗体の１つの重鎖のＣ末端に連結するＩＬ－２１変異タンパク質である鎖Ｂ１、および
    抗体の重鎖である鎖Ｂ２、という構造を含み、
    好ましくは、前記融合タンパク質は２つの同じ鎖Ａ、１つの鎖Ｂ１および１つの鎖Ｂ２を含み、好ましくは、鎖Ｂ１はｋｎｏｂ変異、例えばＳ３５４Ｃ＆Ｔ３６６Ｗを含み、鎖Ｂ２はｈｏｌｅ変異、例えばＹ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖを含む、
    請求項１０、１１、１３～１５のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
21. 鎖Ａは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または鎖Ｂ１は、配列番号５５～６７のいずれか１項に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなり、かつ／または鎖Ｂ２は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項２０に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
22. リンカーは、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、ａｎｄ（ＧＧＧＳ）_ｎから選択されるリンカー配列を含み、ここで、ｎは少なくとも１である整数であり、好ましくは、リンカーは（Ｇ４Ｓ）_２もしくは（Ｇ４Ｓ）_３を含む、
    請求項１０～２１のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質。
23. 単離したポリヌクレオチドであって、
    請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質または請求項１０～２２のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質における鎖をコードする、
    ポリヌクレオチド。
24. 請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、
    発現ベクター。
25. 請求項２３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞であって、
    好ましくは、酵母細胞または哺乳動物細胞、特にＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、
    宿主細胞。
26. 請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質または請求項１０～２２のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質融合タンパク質を生産するための方法であって、
    前記ＩＬ－２１変異タンパク質または融合タンパク質の発現に適する条件で、請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、
    方法。
27. 請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質または請求項１０～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、場合により薬用補助材料と、を含む、
    医薬組成物。
28. 癌を予防かつ／または治療するための薬物の調製における、請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質、請求項１０～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項２７に記載の医薬組成物の使用であって、
    好ましくは、前記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である、
    使用。
29. 前記医薬組成物は第２治療剤をさらに含む、請求項２８に記載の使用。
30. 対象の癌を予防かつ／または治療する方法であって、
    前記方法は、請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２１変異タンパク質、請求項１０～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項２７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記癌は固形腫瘍または血液腫瘍である、
    方法。
31. 前記変異タンパク質、前記融合タンパク質または前記医薬組成物は、第２治療剤と併用療法により投与される、
    請求項３０に記載の方法。