JP2024073606A

JP2024073606A - ＦＶＩＩＩ（ａ）の代わりとなることができる非常に効力があるＩＳＶＤ化合物

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Publication number: JP2024073606A
Application number: JP2024043302A
Authority: JP
Inventors: アンドレアス・ヴェッゲ; ダニエル・グラナタ; エヴァ・ヨハンソン; ヤイス・ローズ・ビエルケ; ヤコブ・ルンド; フィリップ・ヨナス・サッセーネ; ピア・ジェイ・グライセン; トマス・イーイビェア; フランティセク・フバレク; シモーネ・フュレ; マティアス・ノーマン; マリー－アンジュ・ビュイセ; エヴリン・デ・タヴェルニエ; ソレン・ステフェンセン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2024-03-19
Publication date: 2024-05-29

Abstract

【課題】本発明が解決しようとする課題は、血液凝固障害の治療について、治療負担の低減、ならびに血友病Ａおよび関連する疾患などの血液凝固障害の治療における使用のためのＦＶＩＩＩ（ａ）の代わりとなることができる改善された化合物を提供することである。
【解決手段】本発明は、非常に効力があり、かつ効果的な皮下投与ならびに経口投与を可能にするのに十分な長い半減期を提供する、凝固第ＩＸ因子（ａ）および第Ｘ因子（ａ）を結合することができるＩＳＶＤポリペプチド誘導体に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、凝固第ＩＸ（ａ）因子および第Ｘ（ａ）因子に結合することができる化合物、ならびに血友病Ａを含む様々な形態の血友病などの血液凝固障害の治療におけるそれらの使用に関する。

配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

血友病Ａ（ＨＡ）およびＢ（ＨＢ）を有するヒトなどの血液凝固障害を有する患者では、凝固カスケードの様々な工程が、例えば、機能的な凝固因子の非存在または存在が不十分であることに起因して、機能不全となる。そのような凝固カスケードの一部の機能不全は、不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血、または関節などの内部器官への損傷をもたらす。

一般的に血友病Ａと呼ばれる凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損症は、世界中の約４２０，０００人に影響を及ぼす先天性出血障害であり、そのうち約１０５，０００人が現在診断されている。血友病Ａは、１％以下（重度）、２～５％（中等度）、および６～３０％（軽度）（［非特許文献１］）、またはＷＦＨの“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ”２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎＨａｅｍｏｐｈｉｌｉａ；Ｅｐｕｂ６ＪＵＬ２０１２に従って、５～＜４０％の第ＦＶＩＩＩ因子血漿レベルによって定義される３つの重症度のグレードを有する。出血は特発的に、または外傷後に現れ得る。血友病Ａを有する患者の約半数が、重度の血友病Ａを有すると分類され、小児期早期から始まる重度の出血を経験し、以後の人生で、特発性出血または過剰出血の頻繁なエピソードを経験する。出血は一般的に関節および筋肉内に起こり、適切な治療を行わなければ、再発性出血は不可逆的な血友病性関節症につながり得る（［非特許文献２］）。

血友病Ａを有する患者は、外因性ＦＶＩＩＩなどの凝固因子補充療法を受け得る。従来の治療は、出血エピソードの予防法または要求治療として提供される、補充療法から成る。最近まで、重度の血友病Ａを有する患者に対する予防処置には、血漿由来ＦＶＩＩＩもしくは組み換えＦＶＩＩＩ、またはその長時間作用型変異体のいずれかを用いた、１週間に最大３回の静脈注射が含まれた。

しかしながら、このような患者は、こうした外因性因子に対する中和抗体、いわゆる阻害物質を発生し、以前に効率的だった療法も無効にするリスクがある。阻害物質を有する血友病Ａ患者は、部分的に先天性であり、部分的に後天性である血液凝固障害の非限定的な例である。ＦＶＩＩＩに対する阻害物質が発生した患者は、従来の補充療法で治療することができない。外因性凝固因子は、静脈内にのみ投与される場合があり、これは患者にとってかなりの不便であり、また不快である。

ＦＶＩＩＩ活性の低減または不在によって引き起こされる不適切なＦＸａ形成およびトロンビン生成の低下は、血友病Ａ患者の出血素因の根底にある理由である。

ＦＸの酵素活性形態ＦＸａへのタンパク質分解変換は、ＦＩＸａおよびその補因子活性型ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）を含む固有のＦＸ活性化複合体によって達成することができる。補因子結合は、ＦＩＸａの酵素活性を約５桁増加させ、［非特許文献３］によって概説されているように複数のメカニズムを通して生じると考えられている。特に、ＦＶＩＩＩａは、ＦＸに対するタンパク質分解活性を増加させたＦＩＸａの構造を安定化させることがわかっている（［非特許文献４］、［非特許文献５］）。

近年、エミシズマブ（ＨＥＭＬＩＢＲＡ（登録商標））（ＡＣＥ９１０としても公知である）は、従来の補充療法の因子に対する阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの皮下予防処置について承認された。エミシズマブは血友病Ａの治療のためにＣｈｕｇａｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＲｏｃｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたヒト化二重特異性抗完全長ＦＩＸ（ａ）／抗ＦＸ（ａ）モノクローナル抗体である。エミシズマブは、ＦＶＩＩＩ補因子機能（［非特許文献６］および［特許文献１］を参照）を模倣するように設計されている。ミリリットル血漿当たり３０～５０μｇのエミシズマブを用いた治療は、デシリットル血漿当たり、少なくとも１０～１５ＩＵの同等の第ＶＩＩＩ因子活性に相当すると推測されている（［非特許文献７］）。しかしながら、一部の患者は、エミシズマブに対する阻害物質（抗薬剤抗体）を発現し、この化合物による治療は無効であった。

エミシズマブに例示されるような阻害物質の生成に加えて、他の抗体特性も、患者に有効な抗体系の治療を達成するために重要である。特に、非特異的結合の高い傾向を伴う抗体が診療所の安全性の問題につながり得ることが示されている。一部の報告では、高いレベルの非特異的結合は、抗体の循環半減期を数倍低減し、患者にとって無効で面倒な投薬レジメンをもたらした（［非特許文献８］、および［非特許文献９］を参照）。

［特許文献２］、［特許文献３］（［特許文献４］）、［特許文献５］、および［特許文献６］は、抗ＦＩＸ（ａ）／抗ＦＸ（ａ）二重特異性完全長抗体、および皮下投与による血友病の治療に使用するための血液凝固促進としてのそれらの使用を開示している。１つのかかる二重特異性抗体は、Ｍｉｍ８と指定される（［非特許文献１０］および［特許文献７］を参照）。

しかしながら、血友病コミュニティ、特に血液凝固障害を有する対象者において、まだ多くの非常に重要な満たされていない医療ニーズがあり、特に、治療負担の低減、ならびに血友病Ａおよび関連する疾患などの血液凝固障害の治療における使用のためのＦＶＩＩＩ（ａ）の代わりとなることができる改善された化合物に対するニーズがある。

国際公開第２０１２／０６７１７６号国際公開第２０１８／１４１８６３号国際公開第２０１９／０６５７９５号米国特許第１０７５９８７０号国際公開第２０２０／０２５６７２号国際公開第２０２１／１５２０６６号国際公開第２０２０／０２５６７２号

Ｗｈｉｔｅｅｔａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：５６０Ｍａｎｃｏ－Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（２００７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５７：５３５－４４Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．（２００８）ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ，６：３１５－３２２ＫｏｌｋｍａｎＪＡ，ＭｅｒｔｅｎｓＫ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：７３９８－７４０５ＺｏｇｇＴ，ＢｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒＨ（２００９）ＢｉｏｌＣｈｅｍ，３９０：３９１－４００Ｓａｍｐｅｉｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ，８，ｅ５７４７９Ｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１６；３７４：２０４４－５３Ｄｏｂｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌｕｍｅ６，ａｒｔ．ｎｏ．：３８６４４（２０１６）Ａｖｅｒｙｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２０１８，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，２４４－２５５ＯｓｔｅｒｇａａｒｄＨｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０２１；１３８：１２５８－６８

本発明は、非常に効力があり、かつ効果的な皮下投与ならびに経口投与を可能にするのに十分な長い半減期を提供する、凝固第ＩＸ因子（ａ）および第Ｘ因子（ａ）を結合することができる、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などの血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体を提供する。したがって、一態様では、本発明は、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性化型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、１つ以上の表面曝露残基に結合した１つ以上の延長部分（ｐｒｏｔｒａｃｔｉｏｎｍｏｉｅｔｙ（ｉｅｓ））と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｓ））と、を含む、血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体に関する。

一態様では、本発明は、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、表面曝露残基に結合された少なくとも１つの延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含む血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体に関し、当該第１のＩＳＶＤは、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、当該第２のＩＳＶＤは、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる。

ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、例えば、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体であり得る。

別の態様の本発明は、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチド誘導体を含む医薬組成物に関する。本発明の別の態様は、皮下および経口投与を含む様々な投与経路による、様々な形態の血友病の治療、ならびに特に血友病Ａの治療、インヒビターが存在する血友病Ａの治療、および後天性血友病Ａの治療のためのかかる化合物を含む、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチド誘導体、および組成物の使用に関する。

さらなる態様では、本発明は、特定の抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨ断片またはその特定の抗ＦＸ（ａ）Ｖ_ＨＨ断片など、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の一部である個々の構成要素（中間体）ＩＳＶＤまたはＶ_ＨＨ断片に関する。

本発明のさらなる態様は、ポリペプチド誘導体の経口バイオアベイラビリティを改善するために、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）を結合することができるかかるＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点を修飾する方法を含む、本明細書に開示される化合物の構成要素（中間体）の製造に関する。

図１ａ～ｈは、抗ＦＸ（ａ）／ＦＩＸ（ａ）ＩＳＶＤポリペプチド誘導体の非限定的な例を示す。Ｅ：延長部、ＰＭ：延長部分、Ｌ_１－２：ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー。破線はジスルフィド結合を示す。図２ａは、延長部分リンカー（Ｌ_Ｐ）によってＣ末端延長部にコンジュゲートされた単一のＣ１８二酸脂肪酸に基づく延長部分を含む抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の非限定的な例を示す、ＩＤ：Ｌ_Ｐ１。破線はジスルフィド結合を示す。図２ｂは、延長部分リンカー（Ｌ_Ｐ）によってＣ末端延長部にコンジュゲートされた単一のテトラゾールに基づく延長部分を含む抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の非限定的な例を示す、ＩＤ：Ｌ_Ｐ２。破線はジスルフィド結合を示す。図３ａ～ｆは、化合物番号２０（ａ）、化合物番号１８（ｂ）、化合物番号１５（ｃ）、化合物番号１３（ｄ）、化合物番号１４（ｅ）、および化合物番号１２（ｆ）の化合物の詳細な比喩的説明を示しており、これらは、延長部分リンカー（Ｌ_Ｐ）、ＩＤＬ_Ｐ１によってＣ末端延長部（Ｅ）にコンジュゲートされた２つのＣ１６二酸脂肪酸に基づく延長部分を含む抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の非限定的な例である。破線はジスルフィド結合を示す。延長部（Ｅ）（配列番号９）を、これらのＶ_ＨＨポリペプチド誘導体に使用した。延長部は、２つのシステイン残基を、それぞれ４位および６位に含み、これは、延長部分（ＰＭ）の結合点としての役割を果たす。ａ）Ｖ_ＨＨ１．２０～Ｌ_１－２～Ｖ_ＨＨ２．２０～Ｅの配列では、ポリペプチドは、配列番号６３４（化合物番号２０）によって表される。ｂ）Ｖ_ＨＨ１．１８～Ｌ_１－２～Ｖ_ＨＨ２．１８～Ｅの配列では、ポリペプチドは、配列番号６３２（化合物番号１８）によって表される。ｃ）Ｖ_ＨＨ１．１５～Ｌ_１－２～Ｖ_ＨＨ２．１５～Ｅの配列では、ポリペプチドは、配列番号６２９（化合物番号１５）によって表される。ｄ）Ｖ_ＨＨ１．１３～Ｌ_１－２～Ｖ_ＨＨ２．１３～Ｅの配列では、ポリペプチドは、配列番号６２７（化合物番号１３）によって表される。ｅ）Ｖ_ＨＨ１．１４～Ｌ_１－２～Ｖ_ＨＨ２．１４～Ｅの配列では、ポリペプチドは、配列番号６２８（化合物番号１４）によって表される。ｆ）Ｖ_ＨＨ１．１２～Ｌ_１－２～Ｖ_ＨＨ２．１２～Ｅの配列では、ポリペプチドは、配列番号６２６（化合物番号１２）によって表される。図４は、化合物番号６、Ｍｉｍ８、およびエミシズマブＳＩＡの滴定曲線（化合物濃度の結果としての活性）の例を示す。図５ａおよび５ｂは、それぞれ抗ＦＩＸ（ａ）および抗ＦＸＩＳＶＤ（Ｖ_ＨＨ断片）配列の配列アライメントを示し、ＣＤＲ配列は、太字および下線で強調表示されている。

配列の簡潔な説明
配列番号１は、ヒト凝固第ＩＸ因子のアミノ酸配列を表す。
配列番号２は、ヒト凝固第Ｘ因子のアミノ酸配列を表す。
配列番号３～１３および６９０は、延長部（Ｅ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１４～２６および６９１は、Ｌ_１－２およびＬ_Ｐリンカーのアミノ酸配列を表す。
配列番号２７～６１４は、Ｖ_ＨＨ断片のアミノ酸配列およびその相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。
配列番号６１５～６９１、７３４、および７３５は、任意のＬ_１－２リンカーおよび／または延長部を含むＶ_ＨＨポリペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号６９２～７３３は、本明細書の実施例４に開示されるペプチド断片の配列を表す。
配列番号７３６～７３９は、潜在的な延長因子（ｐｒｏｔｒａｃｔｏｒｓ）のアミノ酸配列を表す。

本発明は、非常に効力があり、かつ効果的な皮下投与ならびに経口投与を可能にするのに十分な長い半減期を提供する、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）を結合することができるＩＳＶＤポリペプチド誘導体を提供する。したがって、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、皮下および経口投与を含む様々な投与経路による、血友病Ａの治療、インヒビターが存在する血友病Ａの治療、および後天性血友病Ａの治療など、様々な形態の血友病の治療に好適である。

特に、本発明は、凝固第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）の補因子活性を模倣する方法で、凝固ＦＩＸａおよび活性化凝固ＦＸ（ＦＸａ）の形成につながる凝固ＦＸを結合することができる、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体（またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体）と呼ばれる、Ｖ_ＨＨポリペプチドなどの二重特異性延長ＩＳＶＤポリペプチドに関する。本明細書に開示されるＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、非常に高いインビトロ効力を示し、それは、例えば、二重特異性抗体エミシズマブ配列同一類似体（ＳＩＡ）よりも高い大きな規模である。Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体はまた、ラット、イヌ、およびブタなどの動物モデルにおいて、導入した延長因子、例えば、脂肪酸コンジュゲーションおよびアルブミン結合ペプチド融合を介して半減期の延長も示す。非延長Ｖ_ＨＨポリペプチドは、イヌおよびブタにおいて非常に急速なクリアランスを示す。さらに、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体は、表面曝露残基のｐＩ低下アミノ酸置換、ならびに賦形剤であるＮ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）および例えば、ニコチンアミド（ＮＡＭ）を使用した製剤を介した、経口投与後の臨床的に関連するバイオアベイラビリティを可能にするように操作されている。したがって、経口投与時に、製剤化された非常に効力があるＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、ラットおよびイヌ動物モデルにおいて、臨床的に関連するバイオアベイラビリティのレベルを示す。従来、１０ｋＤａを超える分子量を有する、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などのＩＳＶＤポリペプチド誘導体などの治療用ポリペプチドは、経口投与に好適であるとはみなされていない。しかしながら、本明細書に開示されるＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、これらに限定されないが、インヒビターが存在する、または存在しない血友病Ａなどの血液凝固障害の新規経口治療に好適である。

したがって、本発明は、非常に効力があり、かつ効果的な皮下投与ならびに経口投与を可能にするのに十分な長い半減期を提供する、凝固第ＩＸ因子（ａ）および第Ｘ因子（ａ）を結合することができる、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などの血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体を提供する。したがって一態様では、本発明は、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、１つ以上の表面曝露残基に結合した１つ以上の延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含む、血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体に関する。図１ａ～ｆは、抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）ＩＳＶＤポリペプチド誘導体の非限定的な例を示す。

一態様では、本発明は、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、表面曝露残基に結合された少なくとも１つの延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含む血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体に関し、当該第１のＩＳＶＤは、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、当該第２のＩＳＶＤは、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる。

別の態様では、本発明は、血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体に関し、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＶ_ＨＨ（Ｖ_ＨＨ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）に結合することができる第２のＶ_ＨＨ（Ｖ_ＨＨ２）と、
表面曝露残基に結合した少なくとも１つの延長部分と、
任意選択で、Ｖ_ＨＨ１およびＶ_ＨＨ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
Ｖ_ＨＨ１は、
Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）、
Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）、または
Ｖ_ＨＨ－２．２（配列番号３５）の配列を含み、
Ｖ_ＨＨ２は、
Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）、
Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）、
Ｖ_ＨＨ－１．３（配列番号３１）、または
Ｖ_ＨＨ－１．４（配列番号３９）の配列を含む。

かかる一実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．２０の配列（配列番号１６７）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１５の配列（配列番号１２７）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１３の配列（配列番号１１１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１２の配列（配列番号１０３）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．３の配列（配列番号３１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２０の配列（配列番号１７１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．４の配列（配列番号３９）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．１８の配列（配列番号１５５）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．１５の配列（配列番号１３１）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．１３の配列（配列番号１１５）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．１４の配列（配列番号１２３）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．１２の配列（配列番号１０７）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

別のかかる実施形態では、Ｖ_ＨＨ１は、Ｖ_ＨＨ－２．２の配列（配列番号１３５）を含み、Ｖ_ＨＨ２は、Ｖ_ＨＨ－１．１８の配列（配列番号１５１）を含む。

いくつかの実施形態では、延長部分は、以下の構造を含み、
＊は、ＩＳＶＤポリペプチド上の結合点を示した。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチド誘導体を含む医薬組成物に関する。本発明の別の態様は、皮下および経口投与を含むがこれらに限定されない、様々な投与経路による、様々な形態の血友病の治療、ならびに特に血友病Ａの治療、インヒビターが存在する血友病Ａの治療、および後天性血友病Ａの治療のためのかかる化合物を含む、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチド誘導体、および組成物の使用に関する。

定義
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語が以下に定義される。

ギリシャ文字は、それらの記号または対応する名称で表されてもよく、例えば、α＝アルファであり、β＝ベータであり、ε＝イプシロンであり、γ＝ガンマであり、ω＝オメガであるといった具合である。また、μのギリシャ文字は「ｕ」で表されてもよく、例えば、μｌ＝ｕｌ、またはμＭ＝ｕＭである。

化学式中のアスタリスク（＊）は、結合点を示す。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、「１つ以上」を意味することを意図している。工程または要素の列挙に先行する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、さらなる工程または要素の追加が任意選択であり、除外されないことを意味することを意図している。

「約」という用語は、本明細書では、およそ、大まかに、またはその周辺を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、記載された数値を上回るおよび下回る境界を拡張することによってその範囲を修正する。概して、約という用語は、１０パーセント上または下（より高いまたはより低い）で、記載値を上回るおよび下回る数値を修正することができる。

本明細書で使用される場合、「骨格」という用語は、任意のＬ_１－２リンカーおよび延長部を含むＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチドのアミノ酸配列を指すが、延長部分を除外し、かつ骨格に融合されるのに好適な任意の延長部分を除外する疑いの回避のためである。

「結合親和性」という用語は、Ｖ_ＨＨ断片および抗原など、２つの分子間、例えば、ＩＳＶＤ間の非共有相互作用の強度の尺度である。用語は、一価の相互作用を説明するために使用される。一価の相互作用による、Ｖ_ＨＨなど、２つの分子間、例えば、ＩＳＶＤ間の結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定することによって定量化され得る。Ｋ_Ｄは、複合体形成および解離の動態を、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法によって測定することによって決定することができる。一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋ_ａ（またはｋ_ｏｎ）、および解離速度定数ｋ_ｄ（またはｋ_ｏｆｆ）と呼ばれる。Ｋ_Ｄは、式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａを介して、ｋ_ａおよびｋ_ｄと関連する。

上記の定義に従って、所与の抗原に対する異なるＩＳＶＤの結合親和性など、異なる分子相互作用に関連する結合親和性は、個別の抗体／抗原複合体のＫ_Ｄ値の比較によって比較され得る。

解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができる。標的に向かうＩＳＶＤなどのリガンドの結合能力を評価するための標準アッセイは、当該技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析を含む。ＩＳＶＤの結合動態および結合親和性も、ＳＰＲなどの当該技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。

標的とのＶ_ＨＨなどのＩＳＶＤの結合が別のＩＳＶＤなどのその標的の別のリガンドの存在下で標的の結合と比較される、競合結合アッセイを行うことができる。

文脈によって矛盾しない限り、Ｋ_Ｄは、本明細書に記載の表面プラズモン共鳴によって決定されることが好ましい（実施例７を参照）。

好ましくは、ＦＩＸ（ａ）に結合することができるＩＳＶＤのＫ_Ｄ値は、３μＭ以下、例えば１５ｎＭ以下、例えば１１．７ｎＭ以下である。

好ましくは、ＦＸ（ａ）に結合することができるＩＳＶＤのＫ_Ｄ値は、３μＭ以下、例えば３５０ｎＭ以下、例えば３００ｎＭ以下である。

「交差種反応性」ＩＳＶＤ（またはＶ_ＨＨ断片）は、例えば、全ての示される種（例えば、ヒトおよびカニクイザル）からのＦＩＸに、同等の親和性で、特に、例えば、５０の係数の範囲内、２０の係数の範囲内、または１０の係数の範囲内などの１００の係数の範囲内のＫ_Ｄで結合する。定義された係数ＸのＫ_Ｄ範囲内では、特定の列挙された種に対する最も高い親和性は、異なる列挙された種への結合に対して測定された最も低い親和性よりもＸ倍を超えないことを意味する。当業者であれば、親和性を測定するための任意の方法を使用して、異種間反応性ＩＳＶＤが、同じ条件が全ての列挙された種に対するＫ_Ｄ測定に適用される限り、本明細書に記載される所与のＫ_Ｄ係数範囲内の全ての列挙された種由来の標的抗原に結合することを検証することができることを理解されるであろう。好ましくは、Ｋ_Ｄ値は、特に２５℃で、ＳＰＲを使用して測定される。好ましくは、親和性は、Ｖ_ＨＨなどの異種間反応性ＩＳＶＤを使用して測定される。

アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびにしばしば側鎖と呼ばれる１つ以上の追加的な基を任意選択で含有する分子である。

「アミノ酸」という用語には、標準アミノ酸（遺伝的にコードされている）および非天然アミノ酸が含まれる。非天然アミノ酸の非限定的な例は、Ａｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、デアミノヒスチジン（別名３－（イミダゾール－４－イル）プロパン酸、略称Ｉｍｐ（イミダゾプロピオニル）、および標準アミノ酸のｄ－異性体である。光学異性体が記載されていないポリペプチド内の全てのアミノ酸残基は、本明細書では、別段の指定がない限り、ｌ－異性体を意味すると理解されるべきである。

本明細書において「抗体」という用語は、抗原またはその一部分に結合することができる免疫グロブリン配列を含むか、またはそれに由来するタンパク質を指す。

「抗体」は、ジスルフィド結合によって連結される２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）である少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む完全長抗体、ならびにジスルフィド結合によって連結される２つの重鎖（ＨＣ）および１つの軽鎖（ＬＣ）である少なくとも３つのポリペプチド鎖を含む抗体を含むが、これらに限定されない。免疫グロブリンの１つのクラスは、ＩｇＧである。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４へと分割されてもよい。軽鎖は、それらの配列組成物の差異に基づいて、２つのタイプ、カッパ鎖およびラムダ鎖に分けることができる。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖、および各々がジスルフィド結合によって重鎖に付着した２つの軽鎖で構成されている。「抗体」という用語はまた、Ｖ_ＨＨ断片およびＶ－ＮＡＲ断片などの単一ドメイン抗体を包含する。

本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「ＣＤＲ」としても公知である「相補性決定領域」を含む。

「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体またはＩＳＶＤは、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４をＮからＣ末端に含む。重鎖のＣＤＲ３は、典型的には抗原結合に最も寄与する領域である。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能であるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面要素から成り、通常、特定の三次元構造的特性、ならびに特定の荷電特性を有する。構造エピソードおよび非構造エピトープは、後者ではないが前者への結合が、タンパク質の構造を破壊することができる変性剤の存在下で失われるという点で区別される。

例えば、ＩＳＶＤ、Ｖ_ＨＨ断片、およびその標的の間の複合体の空間座標によって定義されるＸ線由来結晶構造の文脈では、本明細書におけるエピトープという用語は、文脈により別段の指定がない限りまたは矛盾しない限り、ＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ／ＦＸａ内の重原子から４Åの距離以内に重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とするＩＳＶＤ残基として特異的に定義される。

所与のＩＳＶＤ／抗原対のエピトープは、実施例に記載されるものなど、日常的な方法によって特定され得る。例えば、ＩＳＶＤおよび抗原は組み合わせられてもよく、ＩＳＶＤ／抗原複合体は結晶化されてもよい。ＩＳＶＤとその抗原との間の相互作用の特異的部位を特定するために、複合体の結晶構造が決定されて、使用されてもよい。

一実施形態では、本明細書に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（配列番号１）のうちの少なくとも１つを含むＦＩＸまたはその活性型上のエピトープに結合することができる第１のＩＳＶＤ、ならびにアミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含むＦＸ（配列番号２）上のエピトープに結合することができる第２のＩＳＶＤを含む。

一実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができる第１のＩＳＶＤ、ならびに
アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含むか、またはアミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９のうちの少なくとも１つを含む第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる第２のＩＳＶＤを含む。

凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、第Ｘ因子、およびプロテインＣとの構造的類似性を有するビタミンＫ依存性凝固因子である。ＦＩＸは、単鎖酵素前駆体（配列番号１）として血漿中を循環する。循環する酵素前駆体型は、Ｎ末端γ－カルボキシグルタミン酸が豊富な（Ｇｌａ）ドメイン、２つのＥＧＦドメイン、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、４つの異なるドメインに分割された４１５個のアミノ酸から成る。ＦＩＸの活性化は、Ａｒｇ１４５およびＡｒｇ１８０での限られたタンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドを放出する（配列番号１の残基１４６～１８０）。したがって、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）は、配列番号１の残基１～１４５（軽鎖）および配列番号１の残基１８１～４１５（重鎖）から構成される。

したがって、循環ＦＩＸ分子は、ＦＩＸ酵素前駆体、および活性型のＦＩＸを含み、これは本明細書では一般に、配列番号１に関してＦＩＸおよびＦＩＸａと呼ばれる。

活性型第ＩＸ因子は、第ＩＸａ因子またはＦＩＸａと呼ばれる。「ＦＩＸ（配列番号１）および／またはその活性型形態（ＦＩＸａ）」という用語は、「ＦＩＸ／ＦＩＸａ」または単に「ＦＩＸ（ａ）」とも呼ばれ得る。

ＦＩＸａは、テナーゼ複合体の一部として、凝固中に適切なトロンビン形成を支持するために必要な第Ｘａ因子のほとんどを生成することにより、止血において重要な役割を果たす、トリプシン様セリンプロテアーゼである。

ＦＩＸは、本明細書では、ヒトＦＩＸのＡｌａ１４８対立遺伝子型に対応する配列番号１によって表される（Ａｎｓｎｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１９８４３：１０５３－１０６０、ＭｃＧｒａｗｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９８５８２：２８４７－２８５１、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８４２：５７３－５８０）。本発明では、ＦＩＸは、Ｔ１４８バリアント（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＰ００７４０）などのＦＩＸの全ての天然バリアントを網羅することを意図している。

ＦＸは、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、ＦＩＸ、およびプロテインＣとの構造的類似性を有するビタミンＫ依存性凝固因子である。ＦＸは、配列番号２の残基１～１３９（軽鎖）および配列番号２の残基１４３～４４８（重鎖）を含む二本鎖酵素前駆体として血漿内を循環する。ヒトＦＸ酵素前駆体は、Ｎ末端ガンマカルボキシグルタミン酸が豊富な（Ｇｌａ）ドメイン（残基１～４５）、２つのＥＧＦドメイン、それぞれＥＧＦ１（残基４６～８２）とＥＧＦ２（残基８５～１２５）、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメイン（残基１９５～４４８）を含む４つの別個のドメインを含む。ＦＸの活性化は、Ａｒｇ１９４での限られたタンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドの放出をもたらす（残基１４３～１９４）。したがって、活性化ＦＸ（ＦＸａ）は、配列番号２の残基１～１３９（軽鎖）および配列番号２の残基１９５～４４８（活性化重鎖）から構成される。したがって、循環第Ｘ因子分子は、ＦＸ酵素前駆体、および活性型形態のＦＸを含み、これは本明細書では、配列番号２に関してそれぞれＦＸおよびＦＸａと呼ばれる。本発明では、ＦＸは、ＦＸの全ての天然バリアントを網羅することを意図している。「ＦＸ（配列番号２）および／またはその活性型形態（ＦＸａ）」という用語は、「ＦＸ／ＦＸａ」または「ＦＸ（ａ）」とも呼ばれ得る。

本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸が、類似の生化学特性を有するアミノ酸へと置換されてもよく、例えば、塩基性アミノ酸は別の塩基性アミノ酸へと（例えば、リジンからアルギニンへと）置換されてもよく、酸性アミノ酸は別の酸性アミノ酸へと（例えば、グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩へと）置換されてもよく、中性アミノ酸は別の中性アミノ酸へと（例えば、スレオニンからセリンへと）置換されてもよく、荷電アミノ酸は別の荷電アミノ酸へと（例えば、グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩へと）置換されてもよく、親水性アミノ酸は別の親水性アミノ酸へと（例えば、アスパラギンからグルタミンへと）置換されてもよく、疎水性アミノ酸は別の疎水性アミノ酸へと（例えば、アラニンからバリンへと）置換されてもよく、極性アミノ酸は別の極性アミノ酸へと（例えば、セリンからスレオニンへと）置換されてもよく、芳香族アミノ酸は別の芳香族アミノ酸へと（例えば、フェニルアラニンからトリプトファンへと）置換されてもよく、脂肪族アミノ酸は別の脂肪族アミノ酸へと（例えば、ロイシンからイソロイシンへと）置換されてもよい場合を指す。

本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。

限定されるものではないが、賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類およびデンプンのタイプ、Ｌ－アルギニン、ニコチンアミド、ＳＮＡＣ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「延長部」（Ｅ）という用語は、ＩＳＶＤポリペプチドに結合するのに好適なペプチドまたはポリペプチドを指す。

延長部は、数個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸であってもよく、それはより長い、１０～３０個のアミノ酸であってもよいか、または非常に長いアミノ酸、３０個を超えるアミノ酸であってもよい。延長部は、好ましくは、ＩＳＶＤポリペプチド、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド、またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体のＮ末端（Ｎ末端延長部）もしくはＣ末端（Ｃ末端延長部）、またはその両方に存在する。あるいは、延長部は、１つ以上のフレームワーク領域またはリンカーＬ_１－２など、ＣＤＲ配列の外側のＩＳＶＤポリペプチドのどこかに結合される。

延長部は、好ましくは、ＩＳＶＤポリペプチドに組み換え融合される。他の実施形態では、延長部は、ＩＳＶＤポリペプチドにコンジュゲートされる。

非限定的な例としては、ＧＱＡＣＰＣ（配列番号９）から構成される６アミノ酸のＣ末端延長部を有する化合物番号２２、ＧＧＧＧＣＳＣＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）から構成される１３アミノ酸のＣ末端延長部を有する化合物番号６、およびＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号７）から構成される１１アミノ酸のＣ末端延長部が挙げられる。

延長部の目的は、延長部分の結合点を提供すること、および／または精製のための手段を提供することである。したがって、延長部という用語は、延長因子および延長部分を包含しない。

例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に組み換え融合された任意の延長因子リンカー（Ｌ_Ｐ）を含む延長因子は、延長部とみなされない。

本明細書で使用される場合、「融合」という用語は、元々別個のタンパク質もしくはペプチドまたはその断片をコードする２つ以上のＤＮＡ配列のインフレーム結合を指す。融合ポリペプチドＤＮＡ配列の翻訳は、元のタンパク質またはペプチドの各々から誘導された機能的特性を有し得る単一のポリペプチド配列をもたらす。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、オーバーラップＰＣＲまたはＤＮＡライゲーションなどの標準的な分子生物学法によって人工的に作製されてもよい。得られた融合ポリペプチドＤＮＡ配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、または哺乳類細胞などの宿主生物における異種融合タンパク質発現を支持する適切な発現ベクターに挿入されてもよい。延長部分は、例えば、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチド骨格のＣ末端またはＮ末端に融合されてもよい。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本明細書に開示されるＩＳＶＤを生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を包含する。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類培養細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、真菌細胞、および昆虫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

当該技術分野で公知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。当該技術分野では、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基の文字列の間の一致の数によって決定されるような、ポリペプチド間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処された隙間調整（もしあれば）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全一致の割合を測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。本発明では、ＥＭＢＯＳＳ－６．６．０からのＮｅｅｄｌｅｍａｎ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３－４５３）を使用し、ギャップ開始およびギャップ伸長についてそれぞれパラメータ１０および０．５を使用して（ｇａｐｏｐｅｎ＝１０、ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５）、類似性および同一性が決定された。

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「ＩＳＶＤ」という用語は、それぞれ、ＶＨドメインおよびＶＬドメインなどの抗原結合ドメインまたは断片を含むための一般用語として使用される。

したがって、ＩＳＶＤは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）、または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）、例えば、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または従来の４鎖抗体に由来する軽鎖可変ドメイン配列であり得る。

特定のタイプのＩＳＶＤは、単一の単量体可変抗体ドメインから成る抗体断片として定義される免疫グロブリンのタイプとして元々特定されたＶ_ＨＨ断片である。Ｖ_ＨＨ断片は、重鎖のみの抗体の抗原結合可変領域を包含する単一ドメイン抗体であり、ラクダ類から得ることができる。Ｖ_ＨＨ断片は、約１５ｋＤａのサイズを有する。それらは、単一ドメインを使用してその同族抗原を結合することができる単一鎖分子を含む。Ｖ_ＨＨ断片の抗原結合表面は、通常、平坦または凹面である従来の抗体の表面よりも、より凸状（または突出）である。Ｖ_ＨＨ断片は、その配列および構造が保存されたものとして定義される４つのフレームワーク領域（またはＦＲ）、および３つの相補性決定領域（またはＣＤＲ）から構成され、抗原結合に関与し、かつ抗原特異性を提供する、配列含量および構造立体配座の両方において高い可変性を示す。

別のタイプのＩＳＶＤは、軟骨魚のＩｇＮＡＲから得ることができ、その単一ドメイン抗体は、「Ｖ－ＮＡＲ断片」と示される。

Ｖ_ＨＨ断片およびＶ－ＮＡＲ断片は、定常ドメインを含まないため、典型的には部分／完全長および／または操作／天然の重鎖のみの抗体の一部であるＦｃ領域を有さない［Ｄｏｏｌｅｙｅｔａｌ．（２００６）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：４３－５６、ＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓＳ．（２０１３）ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ．８２：７７５－９７］。

ラクダＶ_ＨＨ断片ならびにそれらの産生および／または単離および／または使用のための方法の一般的な説明は、特に以下の参考資料国際公開第９４／０４６７８号および国際公開第９７／４９８０５号に見出される。軟骨魚由来の重鎖免疫グロブリンおよびその可変領域、ならびにそれらの生産および／または単離および／または使用のための方法の一般的な説明は、特に国際公開第２００５／１１８６２９号に見出される。

Ｖ_ＨＨ断片中のアミノ酸残基の総数は、典型的には１１０～１４０の範囲内である。しかしながら、Ｖ_ＨＨの一部、断片、または類似体は、かかる一部、断片、または類似体が、本明細書の以下に概説されるさらなる要件を満たし、また好ましくは、本明細書に記載される目的にも好適である場合、その長さおよび／またはサイズに関して特に限定されないことに留意されるべきである。Ｖ_ＨＨ断片の分子量は、典型的には、１２～１５ｋＤａの範囲内である。Ｖ_ＨＨ断片のｐＩは、抗体が概してそうであるように、概して塩基性であり、ｐＩ値が概して７を上回り、しばしば７．５～８．５であることを意味する。Ｖ_ＨＨ断片は、通常、フレームワーク領域１および３に位置付けられた保存されたシステイン対によって典型的には形成される少なくとも１つのジスルフィド架橋を包含する。かかるジスルフィド架橋は、Ｖ_ＨＨ断片の正しい折り畳みおよび安定性を確実にし、例えば、Ｖ_ＨＨポリペプチドにおける導入された非対のシステインを標的とするような方法で側鎖修飾および／またはコンジュゲーションが行われる場合、かかるジスルフィド架橋を保持することが望ましい。

本文書では、Ｖ_ＨＨ断片などのＩＳＶＤのＣＤＲ配列を、Ｋａｂａｔ定義を使用して決定する（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎａｎｄＤｕｂｅｌ，２０１０，Ｅｄｓ．，ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ２，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＢｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ３，ｐｐ．３３－５１）。この方法に従って、可変ドメインのＣＤＲは、３１～３５位（ＣＤＲ１）、５０～６５位（ＣＤＲ２）、および９５～１０２位（ＣＤＲ３）として定義される。しかしながら、別段の定めのない限り、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチドの連続ナンバリングにおけるＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域を含む、本明細書に記載されるポリペプチド化合物における特定のアミノ酸残基位置を指す場合、使用される。

本明細書で使用される場合、「ＩＳＶＤポリペプチド」という用語は、例えば、直接的なドメイン融合として、必要な場合に任意の適切な組成物および長さのリンカー（Ｌ_１－２）によって連結されるか、または任意のリンカーを全く有さない、第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）および第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）などの２つ以上のＩＳＶＤを含むポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、化学実体間で共有結合を形成する少なくとも１つの原子を指す。化学実体がペプチド結合を介してのみ連結される場合、リンカーは、「ペプチドリンカー」と呼ばれ得る。そうでなければ、リンカーは、「化学リンカー」と呼ばれ得る。

ＩＳＶＤポリペプチドの一例は、リンカー（Ｌ_１－２）を介して連結された２つのＩＳＶＤである。

ＩＳＶＤポリペプチドの別の例は、１つ以上の延長部をさらに含むリンカー（Ｌ_１－２）を介して連結された２つのＩＳＶＤである。

ＩＳＶＤポリペプチドの別の例は、リンカー（Ｌ_１－２）なしで、Ｃ末端および／またはＮ末端延長部などであるがこれらに限定されない、１つ以上の延長部をさらに含む、連結された２つのＩＳＶＤである。

リンカー（Ｌ_１－２）は、例えば、アミノ酸配列から構成されてもよく、反復を含まないか、または複数の反復を含む。

例えば、リンカーは、２～５０個のアミノ酸、５～４０個のアミノ酸、または１０～３０個のアミノ酸を含み得る。

リンカーの非限定的な例としては、＊－ＧＧＧＧＳ－＊リンカー、＊－ＧＱＡＰＧＱ－＊リンカー（配列番号２０）、＊－ＱＡＰＧＱＡ－＊リンカー（配列番号１６）、＊－ＧＩ－＊リンカー、＊－ＧＶ－＊リンカー、＊－ＧＴ－＊リンカー、＊－ＧＬ－＊リンカー、または別のアミノ酸複合リンカーが挙げられる。リンカーの２つの例は、ＧＧＧＧＳの２回および６回反復複合であり、それぞれ、１０および３０アミノ酸残基長である。

疑義を避けるために付言すると、Ｌ_１－２の添字_１－２は、連結されているＩＳＶＤの特定の方向、すなわち、Ｌ_１－２は、ＩＳＶＤ１をＩＳＶＤ２に、またはＩＳＶＤ２をＩＳＶＤ１に（Ｎ末端からＣ末端）連結することができることを暗示するものではない。

配列番号１４～２４は、Ｌ_１－２リンカーの非限定的な例を表す。

いくつかの実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチドは、以下の式のうちのいずれかに概説されるように、延長部（Ｅ）を含む。
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ１－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ２
延長部（Ｅ）は、例えば、以下の式（Ｎ末端からＣ末端）のうちのいずれかに概説されるように、ＩＳＶＤポリペプチドに結合され得る。
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ１－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ２

ＩＳＶＤポリペプチドは、延長部分を含むことが好ましい。このような場合、ＩＳＶＤポリペプチドは、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、第１のＩＳＶＤは、１つ以上の延長部分に対する結合点としての役割を果たす。

いくつかの実施形態では、第２のＩＳＶＤは、１つ以上の延長部分に対する結合点としての役割を果たす。

いくつかの実施形態では、Ｌ_１－２リンカーは、１つ以上の延長部分に対する結合点としての役割を果たす。

疑義を避けるために付言すると、延長部分が、ＩＳＶＤ１－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ２への延長部（Ｅ）に結合したリンカー（Ｌ_ｐ）を含む場合、リンカーＬ_Ｐは、「延長部」の一部とはみなされない。

いくつかの態様では、ＩＳＶＤポリペプチドは、非ＩＳＶＤ、例えば、小さな化学的非ポリペプチド分子、炭水化物、脂肪酸、またはオリゴペプチドもしくはポリペプチド、またはタンパク質、例えば、抗体または好ましくは抗体断片と化学的にコンジュゲートされる。

一実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチドは、リンカーを使用することなく、ＩｇＧ抗体からＦｃドメインに連結される。

別の実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチドは、リンカーによって、ＩｇＧ抗体からＦｃドメインまたはその断片に連結される。

好ましい実施形態では、延長部は、ＩＳＶＤポリペプチドに融合され、したがって、化学コンジュゲーションよってＩＳＶＤポリペプチドに連結されない。

いくつかの実施形態では、延長部分は、ＩＳＶＤポリペプチドに融合され、したがって、化学コンジュゲーションよってＩＳＶＤポリペプチドに連結されない。

本明細書で使用される場合、「等電点」または「ｐＩ」という用語は、抗体などのタンパク質の全体的な正味電荷がゼロであるｐＨ値を指す。タンパク質には多くの荷電基があり、等電点では、これら全ての電荷の合計がゼロである。等電点を上回るｐＨでは、タンパク質の全体的な正味電荷は陰性となるが、等電点を下回るｐＨ値では、タンパク質の全体的な正味電荷は陽性となる。

ｐＩは、理論上または実験的に決定された等電点のいずれかであってもよい。

当業者は、タンパク質の等電点を決定する方法を認識している。最も一般的には、タンパク質の等電点は、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算される。タンパク質の等電点の決定を可能にする多数の（オンライン）ツールが入手可能であり、例えば、「ＥｘＰＡＳｙＣｏｍｐｕｔｅｐＩ／Ｍｗ」であり、ＰｒｏｔｅｉｎＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓＴｏｏｌｓｏｎｔｈｅＥｘＰＡＳｙＳｅｒｖｅｒ、ＧａｓｔｅｉｇｅｒＥ．，ＨｏｏｇｌａｎｄＣ．，ＧａｔｔｉｋｅｒＡ．，ＤｕｖａｕｄＳ．，ＷｉｌｋｉｎｓＭ．Ｒ．，ＡｐｐｅｌＲ．Ｄ．，ＢａｉｒｏｃｈＡ．、（Ｉｎ）ＪｏｈｎＭ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：ＴｈｅＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＰｒｏｔｏｃｏｌｓＨａｎｄｂｏｏｋ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２００５），ｐｐ．５７１－６０７を参照されたい。好ましくは、Ｓｋｏｏｇ＆Ｗｉｃｈｍａｎ，１９８６のアルゴリズム。ｐＫａのアミノ酸残基が、ｐＩの計算に使用される。

ｐｌはまた、実験的に決定されてもよく、電荷バリアントは、例えば、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）ゲル電気泳動などの荷電ベース分離技法を使用して分離され得る。

一実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチド中の第１および第２のＩＳＶＤは、Ｖ－ＮＡＲ断片であり、かかる化合物は、「Ｖ－ＮＡＲポリペプチド」と示される。

別の実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチド中の第１および第２のＩＳＶＤは、Ｖ_ＨＨ断片であり、かかる化合物は、「Ｖ_ＨＨポリペプチド」と示される。かかる一実施形態では、第１のＶ_ＨＨ断片は、ＦＩＸ／ＦＩＸａを結合することができ、第２のＶ_ＨＨ断片は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができる。好ましい実施形態では、Ｖ_ＨＨポリペプチドは、二重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチドである。

疑義を避けるために付言すると、多重特異性、三重特異性、または二重特異性という用語は、Ｖ_ＨＨ断片など、ＩＳＶＤによって結合された抗原の数を反映するように意図されており、すなわち、アルブミンなどであるがこれに限定されない、延長部分（存在する場合）によって結合された分子を含まない。

一実施形態では、延長部分を有さないＶ_ＨＨポリペプチドの分子量は、２７～２９ｋＤａの範囲内である。

好ましい実施形態では、１つ以上の延長部分（すなわち、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体）、および任意選択で、１つ以上の延長部を含むＶ_ＨＨポリペプチドの分子量は、２８～３３ｋＤａの範囲内である。

当業者は、上記の実施形態が、Ｖ－ＮＡＲポリペプチドに同様に適用可能であることを理解するであろう。

本明細書で使用される場合、「遊離システイン」という用語は、例えば、化学コンジュゲーションなどの反応に利用可能なポリペプチド鎖中のシステイン残基であり、したがって、天然または操作された内部ジスルフィド架橋の一部ではない。本質的に、遊離システインは、コンジュゲーションに使用され得るが、それは組み換え導入遊離システインを含む遊離システイン残基は、しばしば、宿主細胞におけるポリペプチドの組み換え発現中に、システイン、ホモシステイン、またはグルタチオンなどの小さなチオールで遮断される。これは、１つ以上の遊離システインが導入されているＩＳＶＤポリペプチドの組み換え産生でも観察される。したがって、ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などの適切な還元剤を使用する還元反応を使用して、Ｃ１８二酸ガンマ－Ｇｌｕ２ｘＯＥＧ脂肪酸部分などの延長部分などであるがこれらに限定されない、目的の部分へのコンジュゲーションのための遊離システインを放出および調製することができる。

本明細書に開示されるＶ_ＨＨポリペプチドなどのＩＳＶＤポリペプチドは、二重特異性または三重特異性などを含むがこれらに限定されない、多重特異性であってもよい。

本明細書で使用される場合、「二重特異性ＩＳＶＤポリペプチド」または「二重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド」という用語は、それぞれ、２つの異なる抗原または同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「三重特異性ＩＳＶＤポリペプチド」または「三重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド」という用語は、それぞれ、３つの異なる抗原もしくは同じ抗原上の３つの異なるエピトープまたは２つの異なる抗原上に存在する３つの異なるエピトープに結合することができる、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「多重特異性ＩＳＶＤポリペプチド」または「多重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド」という用語は、それぞれ、２つ以上の異なる抗原または同じ抗原上の２つ以上の異なるエピトープに結合することができる、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチドを指す。多重性ＩＳＶＤポリペプチドまたは多重性Ｖ_ＨＨポリペプチドは、したがって、それぞれ二重特異性ＩＳＶＤポリペプチドおよび三重特異性ＩＳＶＤポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチドを含む。

当業者であれば、上記がポリペプチド誘導体（すなわち、延長部分を含む）にも適用されることを理解するであろう。

本明細書で使用される場合、「経口（ｏｒａｌ）バイオアベイラビリティ」または「経口（ｐｅｒｏｒａｌ）バイオアベイラビリティ」という用語は、当該薬剤の静脈内投与後の全身循環における投与された薬剤の量に対する、経口投与後の全身循環における投与された薬剤の量（投与された薬剤対時間曲線の血漿濃度下面積として推定される）を指す。

したがって、本明細書で使用される場合、「パラトープ」という用語は、抗原が特異的に結合する、すなわち抗原と物理的接触をする、ＩＳＶＤ上の区域または領域を指す。

例えば、ＩＳＶＤ、Ｖ_ＨＨ断片、およびその標的の間の複合体の空間座標によって定義されるＸ線由来結晶構造の文脈では、本明細書におけるパラトープという用語は、文脈により別途の指定がない限りまたは矛盾しない限り、ＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ／ＦＸａ内の重原子から４Åの距離以内に重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とするＩＳＶＤ残基として特異的に定義される。

所与のＩＳＶＤ／抗原対のパラトープ（およびエピトープ）は、実施例に記載されるものなど、日常的な方法によって特定され得る。例えば、ＩＳＶＤおよび抗原は組み合わせられてもよく、ＩＳＶＤ／抗原複合体は結晶化されてもよい。ＩＳＶＤとその抗原との間の相互作用の特異的部位を特定するために、複合体の結晶構造が決定されて、使用されてもよい

「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、概して安全、非毒性であり、かつヒトの医薬品使用に許容可能である賦形剤を含む、医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味する。かかる賦形剤は、例えば、固形、液体、または半固体であり得る。

本明細書で使用される場合、「血漿半減期」という用語は、患者に投与された物質の量の半分が、正常な生物学的プロセスによって患者の血清もしくは血漿から代謝または除去されるのに必要な時間を指す。

本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」という用語は、Ｖ_ＨＨ断片などのＩＳＶＤ上の結合領域が、別の構成要素よりも優先して、またはそれを支持して、１つの構成要素（例えば、活性化ＦＩＸ）に結合することを意味するようにとされるべきである。したがって、「選択的結合」は、他の構成要素の排他的結合または非検出可能な結合を必ずしも必要としない。例えば、抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨ断片などの抗ＦＩＸ（ａ）ＩＳＶＤは、非活性化ＦＩＸと比較して、活性化ＦＩＸに選択的に結合し得る。

「血液凝固促進抗体」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または１つ以上の凝固因子の酵素活性を増加させることによって、血液凝固を増強する抗体を指す。

本明細書で使用される場合、「血液凝固促進活性」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または１つ以上の凝固因子の酵素活性を増加させることによって、血液凝固を増強する抗体などの化合物の能力を指す。したがって、「血液凝固促進活性」という用語は、以下に列挙される活性のうちの１つ以上を包含する（ただし、これらに限定されない）。

ＦＩＸａ媒介性ＦＸ活性化に基づくアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）（発色性または蛍光性）アッセイによって測定される、第ＩＸａ因子媒介性因子Ｘ活性化の増強。アッセイは、ＦＸａ特異的ペプチド基質の切断を通してＦＸａを測定する。基質が産生され、吸光度によって光度測定され得る色が得られる。

活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）などの凝固アッセイによって測定される、凝固時間の短縮は、凝固の固有および共通の経路の活性を測定する。血漿は、接触活性化因子、例えば、エラグ酸またはカオリン、およびリン脂質を含むＡＰＴＴ試薬でプレインキュベートされる。塩化カルシウムは、フィブリン血栓形成を促進するために添加される。可能性のある読み取りは、凝固時間または凝固波形である。

較正された自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）などのトロンビン生成アッセイで測定される、トロンビン生成の増強。トロンボグラムは、凝固血漿中のトロンビンの濃度を記述し、したがって、止血系の機能試験である。アッセイは、経時的なトロンビンによる蛍光性基質ＺＧＲＡＭＣの切断によって生成される蛍光の測定に基づく。本明細書の実施例８で使用される方法も参照されたい。

ＲＯＴＥＭ（回転トロンボエラストメトリー）などのアッセイにより、粘弾性止血法によって、例えば、せん断応力下で全血において測定される、血栓形成のグローバル粘弾性特性の増強。機器内では、ボールベアリングピンが固定カップ内で回転する。試料中のフィブリン鎖は、凝固中のカップの壁とピンとの間に形成され、鎖の強度は、ピンの動きに影響を及ぼし、それは検出される。

血小板活性化後のコラーゲンへのフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）媒介性血小板接着に基づく、血小板機能アナライザーによって測定される全血閉鎖時間（ｗｈｏｌｅｂｌｏｏｄｃｌｏｓｕｒｅｔｉｍｅ）（ＷＢＣＴ）の短縮。高いせん断応力が生じ、これが血小板接着および血小板凝集につながる。血流の開始から終了までの時間が測定される。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、好ましくは、１つ、２つ、３つ、または４つの「延長部分」（ＰＭ）を含む。より好ましくは、１つまたは２つの延長部分。

本明細書で使用される場合、「延長部分」という用語は、半減期延長特性を有し、かつ「延長因子」（Ｐ）および任意選択の「リンカー」（Ｌ_Ｐ）を含む部分を指す。したがって、「延長」という用語は、半減期の延長を指し、したがって、延長因子または延長部分は、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドの半減期の延長の目的に役立つ。

延長部分（ＰＭ）は、延長因子「Ｐ」および任意選択のリンカー（Ｌ_Ｐ）を含む。

各延長部分は、好ましくは、化合物のポリペプチド骨格内の表面曝露リジンまたはシステイン残基と結合する。結合点は、一般にＲ１と呼ばれる（また、Ｒ１≠Ｒ２≠Ｒ３などである、１つを超える延長部分Ｒ２、Ｒ３などの結合の場合）。

当業者は、結合に好適な他の表面曝露残基を特定することができるであろう。

延長部分は、１個の延長因子から成り得る。

延長部分は、１個のリンカー（Ｌ_Ｐ）および１個の延長因子（Ｐ）を含み得る。

延長部分は、１個のリンカーおよび２個以上の延長因子を含み得る。

リンカー（Ｌ_Ｐ）が存在する場合、延長部分は、Ｌ_Ｐを介してＩＳＶＤポリペプチド骨格と結合する。リンカー（Ｌ_Ｐ）が不在である場合、Ｐは、ポリペプチド骨格と結合する。

一実施形態では、第１延長部分および第２の延長部分が存在し、当該第１の延長部分は、以下の構造を含み、
当該第２の延長部分は、以下の構造を含み、
「＊」（Ｒ１）は、第１の延長部分に対するＩＳＶＤポリペプチド上の結合点を表し、
「＊＊」（Ｒ２）は、第２の延長部分に対するＩＳＶＤポリペプチド上の結合点を表し、
「＊」は、配列番号６２９の２５７位のＣｙｓであり、
「＊＊」は、配列番号６２９の２５９位のＣｙｓである。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、単一システイン残基またはリジン残基を含んでもよく、これに対して単一延長部分が結合／コンジュゲートされている。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、２個のリジン残基および２個の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、２個のリジン残基および２個の同一の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、２個のリジン残基および２個の非同一の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、３個のリジン残基および３個の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、３個のリジン残基および３個の同一の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、３個のリジン残基および３個の非同一の延長部分を含み得る（例えば、第１および第２の延長部分は、同一であってもよく、第３の延長部分は、当該第１および第２の部分とは異なる）。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、２個のシステイン残基および２個の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、２個のシステイン残基および２個の同一の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、２個のシステイン残基および２個の非同一の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、３個のシステイン残基および３個の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、３個のシステイン残基および３個の同一の延長部分を含み得る。

本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、３個のシステイン残基および３個の非同一の延長部分を含み得る（例えば、第１および第２の延長部分は、同一であってもよく、第３の延長部分は、当該第１および第２の部分とは異なる）。

ＩＳＶＤポリペプチドが２または３個の延長部分を含む場合、延長部分は、好ましくは、類似しており、より好ましくは、実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。

本明細書に開示される延長部分などの化学部分に関して、類似性および／または同一性は、当該技術分野において公知である任意の好適なコンピュータプログラムおよび／またはアルゴリズムを使用して決定され得る。

延長部分を含む化合物は、「誘導体」と呼ばれ得る。例えば、「ＩＳＶＤポリペプチド誘導体」は、延長部分を含むＩＳＶＤポリペプチド、「Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体」は、延長部分を含むＶ_ＨＨポリペプチド、および「Ｖ－ＮＡＲポリペプチド誘導体」は、延長部分を含むＶ－ＮＡＲポリペプチドであると理解される。

延長部分は、アルブミンと非共有結合することが可能であり得、それによって、血流中のＩＳＶＤポリペプチド誘導体の循環を促進し、その半減期を延長することができる。したがって、一実施形態では、延長部分は、アルブミン結合部分である。

延長因子（Ｐ）は、アシル基を含み得る。アシル基は、分枝または非分枝であり得る。アシル基は、飽和または不飽和であり得る。延長因子は、脂肪アシル基を含み得る。アシル基は、分枝または非分枝であり得る。アシル基は、飽和または不飽和であり得る。

延長因子は、遠位カルボン酸基を含み得る。

延長因子は、脂肪酸基を含み得る。

延長因子は、脂肪酸基およびアミド基を含み得る。

延長因子は、遠位カルボン酸基およびアミド基を含み得る。

延長因子は、アルキル基を含み得る。

延長因子は、アリール基を含み得る。

延長因子は、テトラゾール基を含み得る。

延長因子は、スルホン酸基を含み得る。

延長因子は、フェノキシ基を含み得る。

延長因子は、安息香酸基を含み得る。

延長因子は、８～３０個の炭素原子を含み得る。延長因子は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の炭素原子を含み得る。

延長因子は、６～３０個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。延長因子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続する－ＣＨ_２－基を含む炭素鎖を含み得る。

延長因子は、１２～２６個の炭素原子を含み得る。「延長因子」は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の炭素原子を含み得る。

延長因子は、１０～２６個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。延長因子は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の連続する－ＣＨ_２－基を含む炭素鎖を含み得る。

延長因子は、１６～２２個の炭素原子を含み得る。

延長因子は、１４～２０個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。延長因子は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続する－ＣＨ_２－基を含む炭素鎖を含み得る。

延長因子は、１６～２２個の連続する炭素原子および１４～２０個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。

延長因子は、１６個の連続する炭素原子および１４個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。

延長因子は、１８個の連続する炭素原子および１６個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。

延長因子は、２０個の連続する炭素原子および１８個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。

延長因子は、２２個の連続する炭素原子および２０個の連続する－ＣＨ_２－基を含み得る。

いくつかの実施形態では、延長因子は、以下：
化学式ａ：ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯ－＊（式中、ｎが８～３０の範囲の整数である）によって定義される基を含み、これは、Ｃ（ｎ＋２）二酸、または
化学式ａ１：

延長因子は、オリゴペプチドを含み得る。一実施形態では、延長因子オリゴペプチドは、１０～４０個のアミノ酸、例えば１０～３０個のアミノ酸、例えば１５～２５個のアミノ酸、および好ましくは２０個のアミノ酸である。延長因子オリゴペプチド配列組成物は、例えば、配列番号３および４の融合配列として例示される、ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号７３６）であってもよい［国際公開第０１／４５７４６Ａ２号も参照］。化合物番号７１は、例えば、ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）から構成される５０アミノ酸Ｎ末端延長部分を含み、残基１～２０は、延長因子（Ｐ）であり、残基２１～５０は、リンカー（Ｌ_Ｐ）である。

延長因子は、アミノ酸リンカーＬ_Ｐを介してＩＳＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチドに結合されてもよい。

一実施形態では、Ｌ_Ｐは、ＩＳＶＤポリペプチド骨格中のリジン残基またはシステイン残基の側鎖に、延長因子（Ｐ）を結合し得る。

ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、２つの延長部分を含んでもよく、その各々は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素原子を含む。ＩＳＶＤポリペプチドは、２つの延長部分を含んでもよく、各延長因子（Ｐ）は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続する－ＣＨ_２－基を含む。

ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、２つのＣ１４二酸、２つのＣ１６二酸、または２つのＣ１８二酸を含み得る。

ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、３つの延長部分を含んでもよく、その各々は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素原子を含む延長因子を含む。ＩＳＶＤポリペプチドは、３つの延長部分を含んでもよく、延長因子は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続する－ＣＨ_２－基を含む。

疑義を避けるために付言すると、例えば、アルブミンを結合することができるとしても、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドが二重特異性、三重特異性、または多重特異性であるかを定義するという点では、延長部分はバインダーとはみなされない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチドは、表１に示されるもののうちのいずれか１つから選択される延長因子を含み得る。

表２では、Ｌ_Ｐは、示される延長因子（Ｐ）をＩＳＶＤポリペプチド骨格と接続する任意選択のリンカーを表す。Ｒ１は、ＩＳＶＤポリペプチドにおける結合部位を表す。

一実施形態では、延長因子は、ＩＳＶＤポリペプチド上に直接コンジュゲートされ、すなわち、リンカーＬ_Ｐを使用しない（すなわち、共有結合による）。

他の実施形態では、延長因子は、リンカーＬ_Ｐを使用してＩＳＶＤポリペプチド上に直接コンジュゲートされる。非限定的な例を以下に提供する。

Ｌ_Ｐリンカーは、存在する場合、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、またはＡｅｅｅｐ、スルホンアミド、Ｔｒｘ、ε－Ｌｙｓ、Ａｈｘ、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、および／またはＴｈｒを含み得る。

Ｌ_Ｐリンカーは、
化学式１：＊－ＮＨ－（ＣＨ_２）_２－（Ｏ－（ＣＨ_２））_ｋ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯ－＊
または
（式中、ｋは１～５の範囲の整数であり、ｎは１～５の範囲の整数である）の化学式によって表され得る少なくとも一部分を含み得る。

ｋ＝１およびｎ＝１の場合、リンカー要素は、Ａｄｏ、または８－アミノ－３，６－ジオキサオクタノイルと指定され得、以下の化学式によって表され得る。
化学式３：＊－ＮＨ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＯ－＊
または

ｋ＝１およびｎ＝２の場合、リンカー要素は、Ａｅｅｐと指定され得、以下の化学式によって表され得る。
化学式５：＊－ＮＨ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－＊
または

ｋ＝２およびｎ＝２の場合、リンカー要素は、Ａｅｅｅｐと指定され得、以下の化学式によって表され得る。
化学式７：＊－ＮＨ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－（ＣＨ_２）_２Ｏ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－＊
または

任意のリンカー（Ｌ_Ｐ）は、以下の化学式を有する８－アミノ－３，６－ジオキサ－オクタン酸（ＯＥＧ）基を含み得る。

任意選択のリンカー（Ｌ_Ｐ）は、スルホンアミド－Ｃ４部分を含み得る。スルホンアミド－Ｃ４基は、４－ブタノイル基と結合したスルホンアミド基であり、以下の化学式を有する。
化学式９：＊－ＮＨ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ－＊
または

任意選択のリンカーＬ_Ｐは、Ｔｒｘを含み得る。Ｔｒｘはまた、トラネキサム酸、トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸とも呼ばれ、以下の化学式を有する。
化学式１１：＊－ＮＨ－ＣＨ_２－（Ｃ_６Ｈ_１０）－ＣＯ－＊
または

リンカーＬ_Ｐは、イプシロン－リジン（ε－Ｌｙｓ）を含み得る。

リンカーＬ_Ｐは、リジン（Ｌｙｓ）を含み得る。

リンカーＬ_Ｐは、Ａｈｘを含み得る。Ａｈｘは、アミノカプロン酸、６－アミノヘキサン酸とも呼ばれ、以下によって定義される。
化学物質１３：＊－ＮＨ－（ＣＨ_２）_５－ＣＯ－＊
または

リンカーＬ_Ｐは、
（式中、Ｇｌｕジラジカルは、ｐ回含まれ得、ｐは１～３の範囲の整数である）などのＧｌｕジラジカルを含み得る。

化学式１５はまた、本明細書では別のリジンのイプシロンアミノ基との連結のために使用されるアミノ酸グルタミン酸のガンマカルボキシ基であることから、ガンマ－Ｇｌｕ、または簡潔にγＧｌｕとも呼ばれる場合がある。上記に説明するように、他のリンカー要素は、例えば、別のＧｌｕ残基、またはＡｄｏ分子であってもよい。次にＧｌｕのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基、または存在する場合は、例えば、Ａｄｏ分子のカルボキシ基と、または存在する場合は、例えば、別のＧｌｕのガンマカルボキシ基と、アミド結合を形成する。

あるいは、本明細書に開示されるＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、以下の表２に示されるもののうちのいずれか１つから選択されるリンカー（Ｌ_Ｐ）を含み得る。Ｒ１は、延長部分が結合されるＩＳＶＤポリペプチド中の残基を表し、Ｐは、延長因子を表す。

本明細書の開示に基づいて、当業者は、任意選択で、いくつかの限定された日常的な実験の後に、本明細書に開示される特定のＩＳＶＤポリペプチド誘導体で使用するための最適なＬ_ＰおよびＬ_１－２リンカーを決定することができるであろう。例えば、リンカーは、好ましくは、ＩＳＶＤポリペプチド中のＶ_ＨＨ断片などの各ＩＳＶＤが、その標的に結合することを可能にするようなものである。また、本明細書の開示に基づいて、当業者は、任意選択で、いくつかの限定された日常的な実験の後に、本明細書に開示される特定のＩＳＶＤポリペプチド誘導体で使用するための最適なリンカーを決定することができるであろう。

結合が生じるＩＳＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチド骨格中のアミノ酸残基は、本明細書ではＲ１と示される。１個を超える延長部分が結合している場合、さらなる結合部位は、Ｒ２、Ｒ３などと示され得る。

延長部分は、ＩＳＶＤポリペプチド骨格の第１のＩＳＶＤ部分のシステイン残基またはリジン残基と結合してもよい。

延長部分は、ＩＳＶＤポリペプチド骨格の第２のＩＳＶＤ部分のシステイン残基またはリジン残基と結合してもよい。

延長部分は、ＩＳＶＤポリペプチド骨格の任意選択のリンカー（Ｌ_１－２）部分のシステイン残基またはリジン残基と結合してもよい。

延長部分は、ＩＳＶＤポリペプチド骨格内のリジン残基と共有結合し得る。延長部分は、延長部分におけるカルボン酸基とリジン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して結合され得る。

延長部分は、ＩＳＶＤポリペプチド骨格内のシステイン残基と共有結合し得る。延長部分は、ポリペプチドにおける延長部分とシステイン残基の硫黄原子との間に形成されるチオエーテル結合を介して結合され得る。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物は、１、２、もしくは３個のリジンまたはシステイン残基、１、２、もしくは３個の延長部分を含み得、各延長部分は、単一のリジンまたはシステイン残基の側鎖と結合する。

結合がシステイン残基を介して生じる場合、システインは、好ましくは、遊離システインである。

遊離システインは、いくつかの実施形態では、組み換えＤＮＡ技術によって導入され、１つ以上のＣ１６二酸、Ｃ１７二酸。またはＣ１８二酸ガンマ－Ｇｌｕ２ｘＯＥＧ脂肪酸部分を結合するためのコンジュゲーション部位として機能し得る。

好ましい実施形態では、遊離システインは、任意選択で、組み換えＤＮＡ技術によって導入され、１、２、または３つのＣ１８二酸ガンマ－Ｇｌｕ２ｘＯＥＧ脂肪酸部分を結合するためのコンジュゲーション部位として機能し得る。
（ＩＵＰＡＣ名Ｓ｛ベータ－ＡＡ＃｝－［２－［２－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－４－カルボキシ－４－（１７－カルボキシヘプタデカノイル－アミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］－エチルアミノ］－２－オキソエチル］、ＡＡ＃アミノ酸結合）。

別の実施形態では、遊離システインは、任意選択で、組み換えＤＮＡ技術によって導入され、１、２、または３つのＣ１７二酸ガンマ－Ｇｌｕ２ｘＯＥＧ脂肪酸部分を結合するためのコンジュゲーション部位として機能し得る。
（ＩＵＰＡＣ名Ｓ｛ベータ－ＡＡ＃｝－［２－［２－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－４－カルボキシ－４－（１６－カルボキシヘキサデカノイル－アミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］－エチルアミノ］－２－オキソエチル］、ＡＡ＃アミノ酸結合）。

最も好ましい実施形態では、遊離システインは、組み換えＤＮＡ技術によって導入され、１、２、または３つのＣ１６二酸ガンマ－Ｇｌｕ２ｘＯＥＧ脂肪酸部分を結合するためのコンジュゲーション部位として機能し得る。
（ＩＵＰＡＣ名Ｓ｛ベータ－ＡＡ＃｝－［２－［２－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－４－カルボキシ－４－（１５－カルボキシペンタデカノイル－アミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］－エチルアミノ］－２－オキソエチル］、ＡＡ＃アミノ酸結合）。

本明細書で使用される場合、「標準クロマトグラフィー」という用語は、タンパク質Ａ、陽イオン交換、陰イオン交換、疎水性相互作用、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの標準クロマトグラフィー方法を包含する。

本明細書で使用される場合、「表面曝露アミノ酸残基」という用語は、その側鎖が溶媒分子（概して、ほとんど水分子であり得る）と接触し得るアミノ酸残基を指す。しかしながら、側鎖は、必ずしも溶媒分子と完全に接触している必要はなく、側鎖の一部でさえも溶媒分子と接触しているとき、アミノ酸残基は、「表面上に位置するアミノ酸」として定義される。ポリペプチドの表面上に位置するアミノ酸残基はまた、ＩＳＶＤ表面の近くに位置するアミノ酸残基を含んでもよく、それによって、側鎖が部分的にでも溶媒分子と接触している他のアミノ酸残基からの相互電荷の影響を有してもよい。当業者であれば、例えば、市販または公開されているソフトウェアを使用して相同性モデリングまたは機械学習を行うことによって、ポリペプチドまたは抗体の相同性モデルまたは機械学習に基づく三次元分子モデルを調製することができる。あるいは、三次元分子モデル生成のためのＸ線結晶構造解析などの方法を使用することが可能である。表面上に曝され得るアミノ酸残基は、例えば、ＭＯＥ（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ）またはＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）などのコンピュータプログラムを使用して、抗体の三次元分子モデルからの座標を使用して決定することができる。表面曝露部位は、技術分野で公知のアルゴリズムを使用して決定されてもよい（例えば、ＬｅｅａｎｄＲｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９－４００、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（１９８３）１６：５４８－５５８を参照）。表面曝露可能部位は、タンパク質モデリングおよび抗体から得られた三次元構造情報の分析に好適なソフトウェアを使用して決定することができる。かかる目的で入手可能なソフトウェアには、例えば、ＭＯＥ（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ）またはＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）が含まれる。溶媒にアクセス可能な表面（Å^２中）面積は、プローブ半径１．４Åの水プローブを使用して計算される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用して表面曝露領域および面積を決定する方法は、Ｐａｃｉｏｓ（Ｐａｃｉｏｓ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７－３８６（１９９４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ．１：４６－５３（１９９５））によって記載されている。上述のような情報に基づいて、溶媒と接触する抗体の表面上に位置する適切なアミノ酸残基を選択することができる。

医薬組成物
本明細書に開示されるＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、医薬組成物中で調製されてもよい。いくつかの実施形態では、かかる組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、活性治療成分（ＡＰＩ）以外の任意の構成要素を幅広く指す。賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、充填剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、崩壊剤、流量制御剤、結晶化阻害剤、可溶化剤、安定剤、着色剤、香味剤、界面活性剤、乳化剤、送達剤、ヒドロトロープ、もしくはそれらの組み合わせとして、および／または活性医薬成分の投与および／または吸収を改善するために、様々な目的を果たし得る。

使用される各賦形剤の量は、当該技術分野において慣行である範囲内で変化してもよい。経口剤形を製剤化するために使用され得る技法および賦形剤については、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｈｅｓｋｅｙｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ（２０１７）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＲｅｍｉｎｇｔｏｎａｎｄＡｌｌｅｎ，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ（２０１３）に記載されている。

好ましい実施形態では、Ｖ_ＨＨポリペプチドを含む組成物は、送達剤およびハイドロトロープをさらに含む。

好ましい送達剤は、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸（ＮＡＣ）の塩である。

いくつかの実施形態では、送達剤は、国際公開第２００７／１２１３１８号に記載されるように、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩である。いくつかの実施形態では、送達剤は、８－（サリチロイルアミノ）オクタン酸ナトリウムとしても公知である、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸ナトリウム（本明細書では「ＳＮＡＣ」と呼ばれる）である。

医薬組成物は、好ましくは、１つ以上のハイドロトロープを含む。界面活性剤のように、ハイドロトロープは、親水性部分および疎水性の両方を含み、ミセルを形成し、自己凝集することができるが、ミセル可溶化することなく溶質を可溶化する。一実施形態では、ハイドロトロープは、ＳＮＡＣの溶解度を高めることができる。一実施形態では、ハイドロトロープは、ニコチンアミド（ＮＡＭ）である。

一実施形態では、組成物は、固形組成物である。組成物は、錠剤、小袋、またはカプセルなど、経口投与に好適な形態であってもよい。かかる一実施形態では、組成物は錠剤として製剤化される。本明細書に提供される固形組成物は、溶解促進を可能にし、それによって活性医薬成分の迅速な取り込みを可能にする。

投与および用量
本明細書に開示される化合物、例えばＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、適切な医薬組成物で非経口的に、例えば静脈内、例えば筋肉内、例えば皮下に投与されてもよい。化合物は、非注射経路を介して投与されてもよく、好ましくは、経口（ＰＯ）投与されてもよい。化合物は、予防的に投与されてもよい。化合物は、（要求に応じて）治療的に投与されてもよい。

皮下投与
皮下投与によって送達される化合物の用量は、状態の重症度に応じて、１日当たり約０．０１ｍｇ～１ｍｇの化合物、好ましくは１日当たり約０．０５ｍｇ～５ｍｇ、およびより好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、または週１回であってもよい。また、好適な用量は、特定の化合物について、そのインビボ半減期または平均滞留時間およびその生物活性を含む、その化合物の特性に基づいて調整され得る。

一実施形態では、本発明は当該組成物の内容物を有する注射装置に関する。

経口（ＰＯ）投与
経口で送達される化合物の用量は、状態の重症度に応じて、１日毎、隔日、３日毎に、約１ｍｇ～約３００ｍｇの化合物であり得る。また、好適な用量は、特定の化合物について、そのインビボ半減期または平均滞留時間およびその生物活性を含む、その化合物の特性に基づいて調整され得る。

本明細書に開示される化合物を含有する組成物は、予防的な処置のために、および／または一部の実施形態では治療的な処置のために投与することができる。治療的な用途では、組成物は、上述のような何らかの出血障害などの疾患を患っている対象者に、疾患およびその合併症を治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」として定義される。当業者によって理解されるように、この目的のために有効な量は、疾患または傷害の重度、ならびに対象者の体重および全身状態に依存する。

実施形態
１．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
少なくとも１つの延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含む、血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２．以下の式を有する、実施形態１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ１－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ２
３．以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有する、実施形態１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ２－ＩＳＶＤ１、または
ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－ＩＳＶＤ２、または
Ｅ－ＩＳＶＤ２－ＩＳＶＤ１、または
ＩＳＶＤ１－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ２、または
ＩＳＶＤ２－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ１、または
ＩＳＶＤ１－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ２－Ｅ、または
ＩＳＶＤ２－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ、または
Ｅ－ＩＳＶＤ１－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ２、または
Ｅ－ＩＳＶＤ２－Ｌ１－２－ＩＳＶＤ１
４．少なくとも１つの延長部分が、１つ以上の表面曝露アミノ酸残基に結合している、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５．以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ
式中、１つ以上の延長部分が、１つ以上の表面曝露残基に結合している、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
６．以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ
式中、２つの延長部分が、Ｅ上の１つ以上の表面曝露残基に結合している、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
７．以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ

Ｅにおける第１の表面露出残基および第２の表面露出残基にそれぞれ結合している第１の延長部分および第２の延長部分をさらに含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
８．Ｌ_１－２が、「４０～６０％」対「６０～４０％」の疎水性アミノ酸対親水性アミノ酸の比を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
９．第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができる、実施形態１～８のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１０．第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも４、５、６、７、または８個を含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができる、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１１．第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）を含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１２．第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１３．第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８（連続ナンバリング）を含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１４．第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１５．第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）のうちの少なくとも３、４、５、または６個を含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１６．第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）を含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１７．当該第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、
当該第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１８．当該第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）を含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、
当該第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）を含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１９．第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｆ２９、Ｎ３０、Ｙ３２、Ｔ５４、Ｄ９９、Ｒ１００、Ｓ１０１、Ｆ１０２、Ｌ１０３、Ｆ１０４、Ｑ１０６、Ａ１０７、およびＮ１１３（配列番号３５）を含むパラトープを含み、
第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基
ａ）Ｄ３２、Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｙ３７、Ｌ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ｇ５０、Ｉ５１、Ｍ５２、Ｎ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ｔ６１、Ｋ９７、Ｖ９９、Ｒ１０１、およびＰ１０２（配列番号２７）、または
ｂ）Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｗ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ａ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ａ６１、Ａ９７、Ａ９８、Ｄ９９、Ｇ１０５、Ｌ１０７、およびＹ１０９（配列番号７３４）
（連続ナンバリング）を含むパラトープを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２０．当該第１のＩＳＶＤが、
１）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つまたは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）（Ｋａｂａｔ定義）を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２１．当該第２のＩＳＶＤが、
（Ａ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つまたは２つの置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号１６８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１７０）、または
（Ｂ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）（Ｋａｂａｔ定義）を含む、
実施形態１～９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２２．当該第１のＩＳＶＤが、
１）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）を含むか、または
当該第２のＩＳＶＤが、
（Ａ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号１６８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１７０）、または
（Ｂ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）（Ｋａｂａｔ定義）を含む、
実施形態１～９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２３．当該置換が、保存的置換である、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２４．当該第１のＩＳＶＤの配列が、それぞれ配列番号１０７、１１５、１２３、１３１、１５５、または１７１によって特定される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２５．当該第２のＩＳＶＤの配列が、それぞれ配列番号１０３、１１１、１１９、１２７、１５１、または１６７によって特定される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２６．当該第１のＩＳＶＤの配列が、それぞれ配列番号１０７、１１５、１２３、１３１、１５５、または１７１によって特定される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であり、当該第２のＩＳＶＤの配列が、それぞれ配列番号１０３、１１１、１１９、１２７、１５１、または１６７によって特定される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
２７．当該第１のＩＳＶＤが、以下の配列を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）、または
Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）
２８．当該第２のＩＳＶＤが、以下の配列を含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）、または
Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）
２９．当該第１のＩＳＶＤが、以下の配列を含み、
Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）、または
Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）
当該第２のＩＳＶＤが、以下の配列を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）、または
Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）
３０．当該第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）の配列を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）の配列を含む、実施形態２９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３１．当該第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）の配列を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）の配列を含む、実施形態２９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３２．当該第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）の配列を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）の配列を含む、実施形態２９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３３．当該第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）の配列を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）の配列を含む、実施形態２９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３４．当該第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）の配列を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）の配列を含む、実施形態２９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３５．当該第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）の配列を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）の配列を含む、実施形態２９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３６．延長部分が、以下から成る群から選択される延長因子を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
ａ）Ｃ１６二酸、Ｃ１７二酸、Ｃ１８二酸、Ｃ１９二酸、Ｃ２０二酸、Ｃ２１二酸、またはＣ２２二酸、
ｂ）テトラゾール、
ｃ）ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ（配列番号７３７）などのアルブミンバインダーペプチド、
ｄ）ＱＲＦＣＴＧＨＦＧＧＬＹＰＣＮＧ（配列番号７３８）などのＦｃＲｎバインダーペプチド、および
ｅ）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＮ（配列番号７３９）などのＦｃバインダーペプチド
３７．延長部分が、Ｃ１６二酸、Ｃ１７二酸、Ｃ１８二酸、Ｃ１９二酸、およびＣ２０二酸から成る群から選択される延長因子を含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３８．延長因子が、Ｃ１６二酸延長因子である、実施形態３４に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
３９．延長部分が、ＩＳＶＤ１、Ｌ_１－２、ＩＳＶＤ２、またはＥに延長因子を結合するリンカーＬ_Ｐを含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４０．Ｌ_Ｐが、以下から成る群から選択される、実施形態３９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４１．延長部分が、ＩＳＶＤ２の１３位、および／またはＩＳＶＤ１の１２位、１４位、１５位、４２位、４４位、６３位、および／または８５位（連続番ナンバリング）のうちの１つ以上に結合されている、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４２．ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、Ｃ末端延長部を含み、延長部分が、当該Ｃ末端延長部に結合されている、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４３．ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、第１および第２の延長部分ならびにＣ末端延長部を含み、第１の延長部分および第２の延長部分が、Ｃ末端延長部に結合されている、実施形態１～４２のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４４．Ｃ末端延長部が、ＩＳＶＤ１に結合されている、実施形態４３に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４５．Ｃ末端延長部が、ＩＳＶＤ２に結合されている、実施形態４３に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４６．当該延長部分が、同一である、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４７．１つ以上の延長部分が、表面曝露残基に結合している、実施形態１～４６のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４８．１つ以上の延長部分が、表面曝露残基に結合しており、当該表面曝露残基が、ＣＤＲ領域の残基ではない、実施形態１～４７のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
４９．１つ以上の延長部分が、１つ以上のシステインまたはリジン残基で結合している、実施形態１～４８のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５０．当該ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、配列番号６２９を含み、

当該第１の延長部分が、以下の構造を含み、
当該第２の延長部分が、以下の構造を含み、
「＊」（Ｒ１）が、第１の延長部分に対するＩＳＶＤポリペプチド上の結合点を表し、
「＊＊」（Ｒ２）が、第２の延長部分に対するＩＳＶＤポリペプチド上の結合点を表し、
「＊」が、配列番号６２９の２５７位のＣｙｓであり、
「＊＊」が、配列番号６２９の２５９位のＣｙｓである、実施形態４３に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５１．当該ポリペプチドの等電点が、等電点電気泳動を使用して決定された場合、６．５以下である、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５２．当該ポリペプチド誘導体が、二重特異性または三重特異性ポリペプチド誘導体などの多重特異性ポリペプチド誘導体である、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５３．当該ポリペプチド誘導体が、二重特異性ポリペプチド誘導体である、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５４．当該ポリペプチド誘導体が、１２～５０ｋＤａの範囲内、例えば１２～４８ｋＤａ、例えば１２～４３ｋＤａ、例えば１２～３７ｋＤａ、例えば１２～３５ｋＤａ、例えば１２～３２ｋＤａ、例えば１２～２７ｋＤａ、例えば１２～２２ｋＤａ、例えば１２～１８ｋＤａ、例えば１４～５０ｋＤａ、例えば１４～４８ｋＤａ、例えば１４～４３ｋＤａ、例えば１４～３７ｋＤａ、例えば１４～３５ｋＤａ、１４～３２ｋＤａ、例えば１４～２７ｋＤａ、例えば１４～２２ｋＤａ、例えば１４～１８ｋＤａ、例えば２２～５０ｋＤａ、２２～４８ｋＤａ、例えば２２～４３ｋＤａ、例えば２２～３７ｋＤａ、例えば２２～３５ｋＤａ、例えば２２～３２ｋＤａ、例えば２２～３１ｋＤａ、例えば２２～３０ｋＤａ、例えば２２～２９ｋＤａ、例えば２２～２８ｋＤａ、例えば２２～２７ｋＤａ、例えば２４～５０ｋＤａ，２４～４８ｋＤａ、例えば２４～４３ｋＤａ、例えば２４～３７ｋＤａ、例えば２４～３５、例えば２４～３２ｋＤａ、例えば２４～３１ｋＤａ、２４～３０ｋＤａ、２４～２９ｋＤａ、２４～２８ｋＤａ、例えば２４～２７ｋＤａ、例えば３６～４８ｋＤａ、例えば３６～４３ｋＤａ、例えば３６～３７ｋＤａ、例えば２８～３６ｋＤａ、例えば２９～３３ｋＤａ、例えば２９～３０、例えば約２９、例えば２９、例えば約３０、例えば３０、例えば３０～３２ｋＤａ、または例えば３１ｋＤａの分子量を有する、実施形態１～５３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５５．膜標的化ＩＳＶＤポリペプチド誘導体ではない、実施形態１～５４のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５６．当該延長部分が、ホスファチジルセリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミンなど、アミノリン脂質などの形質膜の構成要素を結合することができない、実施形態１～５５のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５７．当該延長部分が、ＧＰｌｂ－ｌＸ、コラーゲンシャペロンＨＳＰ４７、エフリンＢ１、チオールイソメラーゼタンパク質ＥＲＰ５、５５の造血前駆キナーゼ１－相互作用タンパク質（ＨＩＰ－５５）、糖タンパク質Ｖｌ、血小板糖タンパク質１ｂ、血小板由来増殖因子受容体、血小板内皮凝集受容体Ｉ、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＭＡＲＫＳ、マルチメリン、インテグリンアルファｌＩｂ／ベータ３、骨髄細胞に発現するトリガ受容体（ＴＲＥＭ）様転写産物－１（ＴＬＴ－１）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ジキシン、コラーゲン、Ｐ－セレクチン、第ＸＩＩＩ因子、Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１、インテグリンアルファ６ベータ１、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子、Ｇ６Ｂ、ＣＤ４２ｂ、シンタキシン結合タンパク質２、ホスファチジルエタノールアミン、フィブリノゲン／フィブリン、フィラミン、ストマチン、スフィンゴ脂質、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０９、ＣＤ１５４、ＰＥＣＡＭ－１、および／またはＥＲＰＳなどの血小板表面タンパク質を結合することができない、実施形態１～５６のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５８．当該延長部分が、糖タンパク質、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、β２ＧＰ１、ＴＬＴ－１、セレクチン、凝固因子もしくは凝固因子複合体、および／またはセレクチンなどの膜関連ポリペプチドを結合することができない、実施形態１～５７のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
５９．血液中の平均滞留時間終末相半減期が、当該延長部分を有さないＩＳＶＤポリペプチドと比較して、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３、４、５、または７日間延長される、実施形態１～５８のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
６０．当該第１および／または第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ断片である、実施形態１～５９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
６１．当該第１および／または第２のＩＳＶＤが、Ｖ－ＮＡＲ断片である、実施形態１～５９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
６２．当該ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体である、実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
６３．血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＶ_ＨＨと、
第Ｘ因子（配列番号２）に結合することができる第２のＶ_ＨＨと、
当該第１のＶ_ＨＨおよび当該第２のＶ_ＨＨを連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
Ｃ末端延長部（Ｅ）と、
１つまたは２つの延長部分と、を含み、
以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
「第２のＶ_ＨＨ」－Ｌ_１－２－「第１のＶ_ＨＨ」－Ｅ
Ｉ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＹＡＭＧ（配列番号１６８）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６９）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１７０）を含むか、または
ＩＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１３２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３３）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１３４）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）を含むか、または
（Ｋａｂａｔ定義）を含む、血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
６４．
Ｉ）
当該第１のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）の配列を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）の配列を含み、
ＩＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）の配列を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）の配列を含み、
ＩＩＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）の配列を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）の配列を含み、
ＩＶ）
当該第１のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）の配列を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）の配列を含み、
Ｖ）
当該第１のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）の配列を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）の配列を含み、
ＶＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）の配列を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）の配列を含む、実施形態６３に記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
６５．当該Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体が、二重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体である、実施形態１～６０および６２～６４のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
６６．リンカーＬ_１－２が、アミノ酸残基ＧＱＡＰＧＱ（配列番号２０）を含む、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
６７．延長部（Ｅ）が、アミノ酸残基ＧＱＡＣＰＣ（配列番号９）を含む、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
６８．２つの延長部分が、それぞれ４位および６位（配列番号９）でＥに結合されている、実施形態６３～６７のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
６９．当該２つの延長部分が、同一である、実施形態６３～６８のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
７０．当該２つの延長部分が、以下の構造を含む、実施形態６３～６９のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
７１．第１および第２の延長部分を含み、
前記第１の延長部分が、以下の構造を含み、
当該第２の延長部分が、以下の構造を含み、
「＊」（Ｒ１）が、第１の延長部分に対するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体上の結合点を表し、
「＊＊」（Ｒ２）が、第２の延長部分に対するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体上の結合点を表し、
「＊」が、配列番号６２９の２５７位のＣｙｓであり、
「＊＊」が、配列番号６２９の２５９位のＣｙｓである、実施形態６３～７０のいずれか１つに記載の血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
７２．実施形態１～７１のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体を含む、医薬組成物。
７３．実施形態１～７１のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体を含む、経口投与のための医薬組成物。
７４．ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体である、実施形態７２または７３に記載の医薬組成物。
７５．ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、Ｖ－ＮＡＲポリペプチド誘導体である、実施形態７２または７３に記載の医薬組成物。
７６．当該組成物が、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩を含む、実施形態７２～７５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７７．当該Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩が、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）である、実施形態７６に記載の医薬組成物。
７８．ニコチンアミド（ＮＡＭ）をさらに含む、実施形態７６または７７に記載の医薬組成物。
７９．当該組成物が、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、Ｎ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、およびステアリン酸マグネシウムを含む、実施形態７４～７８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８０．当該組成物が、約７％ｗ／ｗの_ＶＨＨポリペプチド誘導体、約５５％ｗ／ｗのＮ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）、約３６％ｗ／ｗのニコチンアミド（ＮＡＭ）、および約０．５％ｗ／ｗのステアリン酸マグネシウムを含む、実施形態７４～７８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８１．当該組成物が、液体組成物である、実施形態７３～８０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８２．当該組成物が、固形組成物である、実施形態７３～８０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８３．当該組成物が、錠剤、トローチ、またはカプセルである、実施形態８２に記載の医薬組成物。
８４．治療を必要とする患者においてそれを行う方法であって、実施形態１～８３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または医薬組成物を投与することを含む、方法。
８５．患者が、インヒビターが存在する、もしくは存在しない血友病Ａまたは後天性血友病Ａを患う患者である、実施形態８４に記載の治療方法。
８６．治療が、予防処置である、実施形態８４または８５に記載の治療方法。
８７．ＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または医薬組成物が、経口投与される、実施形態８４～８６のいずれか１つに記載の治療方法。
８８．ＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または医薬組成物が、皮下注射によって投与される、実施形態８４～８６のいずれか１つに記載の治療方法。
８９．医薬品において使用するための、実施形態１～８３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または医薬組成物。
９０．インヒビターが存在する、もしくは存在しない血友病Ａなど、または後天性血友病Ａなどの血友病の治療に使用するための、実施形態１～８３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
９１．インヒビターが存在する、もしくは存在しない血友病Ａの治療に使用するための、実施形態１～８３のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
９２．治療が、予防処置である、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の使用のためのＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
９３．当該誘導体または組成物が、経口投与される、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の使用のためのＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
９４．当該誘導体または組成物が、皮下注射によって投与される、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の使用のためのＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
９５．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体を産生する方法であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
１つ以上の延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、

ａ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体のアミノ酸残基をコードする核酸を、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点が低減されるように修飾する工程と、
ｂ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体をコードする核酸を発現するように宿主細胞を培養する工程と、
ｃ．宿主細胞からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を収集する工程と、
ｄ．標準クロマトグラフィーを使用して宿主細胞培養からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を精製する工程と、
ｅ．延長部分を、かかる部分が既に存在していない限り、ＩＳＶＤポリペプチドに結合する工程と、を含む、方法。
９６．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を産生するための方法であって、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結することができるリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
ａ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体のアミノ酸残基をコードする核酸を、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点が６．５以下であるように修飾する工程と、
ｂ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体をコードする核酸を発現するように宿主細胞を培養する工程と、
ｃ．宿主細胞からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を収集する工程と、
ｄ．標準クロマトグラフィーを使用して宿主細胞培養からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を精製する工程と、
ｅ．延長部分を、かかる部分が既に存在していない限り、ＩＳＶＤポリペプチドに結合する工程と、を含む、方法。
９７．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の経口バイオアベイラビリティを増加させるための方法であって、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結することができるリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
ａ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体のアミノ酸残基をコードする核酸を、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点が低減されるように修飾する工程と、
ｂ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体をコードする核酸を発現するように宿主細胞を培養する工程と、
ｃ．宿主細胞からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を収集する工程と、
ｄ．標準クロマトグラフィーを使用して宿主細胞培養からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を精製する工程と、
ｅ．延長部分を、かかる部分が既に存在していない限り、ＩＳＶＤポリペプチドに結合する工程と、を含む、方法。
９８．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の経口バイオアベイラビリティを増加させるための方法であって、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結することができるリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部分（Ｅ）と、を含み、
ａ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体のアミノ酸残基をコードする核酸を、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点が６．５以下であるように修飾する工程と、
ｂ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体をコードする核酸を発現するように宿主細胞を培養する工程と、
ｃ．宿主細胞からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を収集する工程と、
ｄ．標準クロマトグラフィーを使用して宿主細胞培養からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を精製する工程と、
ｅ．延長部分を、かかる部分が既に存在していない限り、ＩＳＶＤポリペプチドに結合する工程と、を含む、方法。
９９．等電点が、少なくとも０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４ｐＨ単位など、少なくとも０．５ｐＨ単位だけ低減される、実施形態９５～９８のいずれかに１つに記載の方法。
１００．工程ｅ）が、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点の増加につながらない、実施形態９５～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．等電点が、等電点電気泳動を使用して決定される、実施形態９５～１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、単一の核酸によってコードされる、実施形態９５～１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０３．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、第１および第２のＩＳＶＤのコンジュゲートであり、当該第１および第２のＩＳＶＤが、別個の核酸によってコードされる、実施形態９５～１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０４．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、Ｖ_ＨＨポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体である、実施形態９５～１０３のいずれか１つに記載の方法。
１０５．実施形態９５～１０３のいずれか１つに記載の方法を使用して産生される、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１０６．実施形態９５～１０３のいずれか１つに記載の方法を使用して得ることが可能である、ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１０７．実施形態９５～１０４のいずれか１つに記載の方法を使用して産生される、Ｖ_ＨＨポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体。
１０８．ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）に結合することができるＶ_ＨＨ断片であって、
ａ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１７２によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１７３によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１７４によって特定されるか、または
ｂ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１５６によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１５７によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１５８によって特定されるか、または
ｃ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１３２によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１３３によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１３４によって特定されるか、または
ｄ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１１６によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１１７によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１１８によって特定されるか、または
ｅ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１２４によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１２５によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１２６によって特定されるか、または
ｆ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１０８によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１０９によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１１０によって特定される（Ｋａｂａｔ定義）、Ｖ_ＨＨ断片。
１０９．ＦＸ（配列番号２）に結合することができるＶ_ＨＨ断片であって、
ａ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１５２によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１５３によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１５４によって特定されるか、または
ｂ．ＣＤＲ１配列が、任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含む配列番号１２８によって特定され、
ＣＤＲ２配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１２９によって特定され、
ＣＤＲ３配列が、任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含む配列番号１３０によって特定される、Ｖ_ＨＨ断片。
１１０．当該置換が、保存的置換である、実施形態１０８または１０９に記載のＶ_ＨＨ断片。
１１１．当該Ｖ_ＨＨ断片が、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）に結合することができ、かつＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＸａ）に結合することができる、Ｖ_ＨＨポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の製造において使用するための中間体である、実施形態１０８～１１０のいずれか１つに記載のＶ_ＨＨ断片。
１１２．当該Ｖ_ＨＨポリペプチドが、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体の製造において使用するための中間体である、実施形態１０８～１１０のいずれか１つに記載のＶ_ＨＨポリペプチド。
１１３．活性が、国際公開第２０１９／０９６８７４号に記載されるような抗ＦＸＩＳＶＤ化合物のうちのいずれかと比較して、ＦＸをＦＩＸａによるタンパク質分解がより起こり易くするという点で改善される、実施形態１０９または１１０に記載のＩＳＶＤまたはＶ_ＨＨ。
１１４．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
少なくとも１つの延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
当該ＩＳＶＤポリペプチドが、配列番号６１５～６９１、７３４、または７３５から成る群から選択される、血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１１５．配列番号２７～６１４のいずれか１つ記載の配列を含む、Ｖ_ＨＨ断片。
１１６．配列番号６１５～６９１または７３４～７３５のうちのいずれかの配列を含む、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
１１７．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
少なくとも１つの延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含む、血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１１８．以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ
式中、１つ以上の延長部分が、１つ以上の表面曝露残基に結合している、実施形態１１７に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１１９．以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ
式中、２つの延長部分が、Ｅ上の１つ以上の表面曝露残基に結合しており、
誘導体の分子量が、２０～３５ｋＤａの範囲内である、実施形態１１８または１１９に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１２０．当該第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）を含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、
第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８（連続ナンバリング）を含む、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型上のエピトープに結合することができる、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１２１．当該第１のＩＳＶＤが、
１）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）、または
２）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１５６）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５７）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１５８）、または
３）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１３２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１３４）、または
４）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１１６）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１７）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１１８）、または
５）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１２４）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２５）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１２６）、または
６）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１０８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１１０）を含み、
当該第２のＩＳＶＤが、
（Ａ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号１６８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１７０）、または
（Ｂ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号１５２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１５４）、または
（Ｃ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）、または
（Ｄ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１１２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１１４）、または
（Ｅ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１２０）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２１）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１２２）、または
（Ｆ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つの置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１０４）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０５）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つの置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１０６）（Ｋａｂａｔ定義）を含む、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１２２．当該置換が、保存的置換である、実施形態１２１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
１２３．当該第１のＩＳＶＤが、以下の配列を含み、
Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）、または
Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）

当該第２のＩＳＶＤが、以下の配列を含む、実施形態１１７～１２２のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）、または
Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）
１２４．血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＶ_ＨＨと、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＶ_ＨＨと、
当該第１のＶ_ＨＨおよび当該第２のＶ_ＨＨを連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
Ｃ末端延長部（Ｅ）と、
１つまたは２つの延長部分と、を含み、
以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
「第２のＶ_ＨＨ」－Ｌ_１－２－「第１のＶ_ＨＨ」－Ｅ

Ｉ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＹＡＭＧ（配列番号１６８）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６９）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１７０）を含むか、または
ＩＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１５６）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５７）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１５８）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＹＡＭＧ（配列番号１５２）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５３）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１５４）を含むか、または
ＩＩＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１３２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３３）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１３４）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）を含むか、または
ＩＶ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１１６）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１７）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１１８）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１１２）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１３）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１１４）を含むか、または
Ｖ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１２４）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２５）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１２６）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１２０）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２１）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１２２）を含むか、または
ＶＩ）
当該第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１０８）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０９）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１１０）を含み、
当該第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１０４）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０５）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１０６）（Ｋａｂａｔ定義）を含む、血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
１２５．実施形態１１７～１２４のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体を含む、医薬組成物。
１２６．前記組成物が、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩を含む、実施形態１２５に記載の医薬組成物。
１２７．当該Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩が、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）である、実施形態１２６に記載の医薬組成物。
１２８．ニコチンアミド（ＮＡＭ）をさらに含む、実施形態１２５～１２７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１２９．当該組成物が、固形組成物である、実施形態１２５～１２８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１３０．インヒビターが存在する、もしくは存在しない血友病Ａなど、または後天性血友病Ａなどの血友病の治療に使用するための、実施形態１１７～１２９のいずれか１つに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
１３１．当該ポリペプチド誘導体または組成物が、経口投与される、実施形態１～１３０のいずれか１つに記載の使用のためのＩＳＶＤポリペプチド誘導体、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、または組成物。
１３２．血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の経口バイオアベイラビリティを増加させるための方法であって、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、延長部分と、任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結することができるリンカー（Ｌ_１－２）と、任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
ａ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体のアミノ酸残基をコードする核酸を、その等電点が低減されるように修飾する工程と、
ｂ．ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体をコードする核酸を発現するように宿主細胞を培養する工程と、
ｃ．宿主細胞からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を収集する工程と、
ｄ．標準クロマトグラフィーを使用して宿主細胞培養からＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を精製する工程と、
ｅ．延長部分を、かかる部分が既に存在していない限り、ＩＳＶＤポリペプチドに結合する工程と、を含む、方法。

好ましい実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、Ｎ末端からＣ末端方向（Ｎ末端からＣ末端）で抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨＩＳＶＤに接続された抗ＦＸＩＳＶＤを含む。

かかる好ましい一実施形態では、ＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、Ｎ末端からＣ末端方向（Ｎ末端からＣ末端）で抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨ断片に接続された抗ＦＸＶ_ＨＨ断片を含み、例えば、図２ａ、２ｂ、および３ａ～ｆを参照されたい。

好ましい実施形態では、ＦＩＸ（ａ）に結合することができるＩＳＶＤまたはＶ_ＨＨ断片は、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）に選択的に結合する。

好ましい実施形態では、ＦＸに結合することができるＩＳＶＤまたはＶ_ＨＨ断片は、ＦＸ酵素前駆体、すなわち、活性化されていないＦＸに選択的に結合する。

一実施形態では、本発明のＩＳＶＤポリペプチド（誘導体）またはＶ_ＨＨポリペプチド（誘導体）は、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる。かかる一実施形態では、当該ＩＳＶＤポリペプチド（誘導体）またはＶ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の刺激特性は、ＦＩＸ（ａ）を結合することができるＩＳＶＤまたはＶ_ＨＨに由来する。

図５ａおよび５ｂは、それぞれ好ましい抗ＦＩＸ（ａ）および抗ＦＸＩＳＶＤ（Ｖ_ＨＨ断片）配列の配列アライメントを示し、ＣＤＲ配列は、太字および下線で強調表示されている。

本発明は、本明細書に開示されるＩＳＶＤまたはＶ_ＨＨ断片の置換バリアントを包含し、それらは、本明細書に開示される個々の配列に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含み得る。いくつかの実施形態では、当該置換および／または欠失および／または挿入は、本明細書に開示されるＣＤＲ配列のうちの１つ以上にある。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列のうちの１つ以上を、アミノ酸置換に供する。いくつかの実施形態では、個々のＣＤＲ配列は、それぞれ０、１、２、または３個のアミノ酸置換を含み得る。例えば、配列番号５５９によるＶ_ＨＨ断片において、ＣＤＲ１は、置換を含まない場合があり、ＣＤＲ２は、３個の置換を含んでもよく、ＣＤＲ３は、１個の置換を含んでもよい。「置換」バリアントは、同数のアミノ酸を有する１つ以上のアミノ酸の置換を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換である。

一実施形態では、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などのＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、ホスファチジルセリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミンなど、アミノリン脂質などの形質膜の構成要素を結合することができない、少なくとも１つの延長部分を含む。

いくつかの実施形態では、延長部分は、以下の構造を含み、
「＊」は、Ｖ_ＨＨポリペプチドへの結合点を表す。

一実施形態では、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などのＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、ＧＰｌｂ－ｌＸ、コラーゲンシャペロンＨＳＰ４７、エフリンＢ１、チオールイソメラーゼタンパク質ＥＲＰ５、５５の造血前駆キナーゼ１－相互作用タンパク質（ＨＩＰ－５５）、糖タンパク質Ｖｌ、血小板糖タンパク質１ｂ、血小板由来増殖因子受容体、血小板内皮凝集受容体Ｉ、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＭＡＲＫＳ、マルチメリン、インテグリンアルファｌＩｂ／ベータ３、骨髄細胞に発現するトリガ受容体（ＴＲＥＭ）様転写産物－１（ＴＬＴ－１）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ジキシン、コラーゲン、Ｐ－セレクチン、第ＸＩＩＩ因子、Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１、インテグリンアルファ６ベータ１、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子、Ｇ６Ｂ、ＣＤ４２ｂ、シンタキシン結合タンパク質２、ホスファチジルエタノールアミン、フィブリノゲン／フィブリン、フィラミン、ストマチン、スフィンゴ脂質、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０９、ＣＤ１５４、ＰＥＣＡＭ－１、および／またはＥＲＰＳなどの血小板表面タンパク質を結合することができない、延長部分を含む。

一実施形態では、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などのＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、糖タンパク質、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、β２ＧＰ１、ＴＬＴ－１、セレクチン、凝固因子もしくは凝固因子複合体、および／またはセレクチンなどの膜関連ポリペプチドを結合することができない、延長部分を含む。

一実施形態では、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体などのＩＳＶＤポリペプチド誘導体は、血友病Ａの治療において臨床的に関連する用量で当該抗体が使用されるとき、血友病Ａを患う患者に投与された組み換えＦＶＩＩＩなどのＦＶＩＩＩの効果に干渉しない。

本発明のある特定の特徴が本明細書に例証および記載されているが、ここで、多くの修正、代用、変更、および均等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのような全ての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。

略語リスト

実施例１：一般的な方法ならびにＶ_ＨＨ断片および他の組み換えタンパク質の調製
一般分子生物学
一般的な分子生物学技法については、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２０１４，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓｅｄｓ．，ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹＵＳＡ）を参照されたい。

免疫化およびライブラリ
ＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＡｂｌｙｎｘＣａｍｅｌｉｄＦａｃｉｌｉｔｙ（ＬＡ１４００５７５）の承認後、２頭のラマおよび２頭のアルパカを、それぞれヒトＦＩＸおよびＦＸ（ＨａｅｍｏｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＶＴＵＳＡ）で免疫化した。

重鎖のみの抗体断片レパートリーのクローニングおよびファージ免疫ライブラリの調製を以下のように実施した。

最終免疫原注射後、血液試料を収集した。これらの血液試料から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳ）の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅを使用して調製した。ＰＢＭＣから全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲの出発材料として使用して、本質的に国際公開第２００５／０４４８５８号に説明されるように、Ｖ_ＨＨ断片コードＤＮＡセグメントを増幅した。要するに、Ｖ_ＨＨ断片コードＤＮＡ断片を、ファージミドベクターｐＡＸ２１２にクローニングし、Ｈｉｓ_６およびＦＬＡＧ_３タグで融合されたＶ_ＨＨ断片を表示するファージ粒子の生成を可能にした。その後、ファージを標準プロトコルに従って調製し、保管した。

合成ライブラリ
合成ライブラリは、免疫化から得られ、かつクローニングされた合成Ｖ_ＨＨ遺伝子断片をファージミドベクターｐＡＸ１９０にクローニングすることによって生成され、これは上述のｐＡＸ２１２と同一の特徴を有するが、複数のクローニング部位において差異を有した。

ＦＸまたはＦＩＸに結合するＶ_ＨＨ断片のライブラリスクリーニング
Ｖ_ＨＨ断片ファージディスプレイの選択は、生成された免疫および合成ライブラリで実施した。ライブラリは、ＦＩＸおよびＦＸへのバインダーを得るためのクローンスクリーニングを富化する固定化ヒトＦＩＸおよびＦＸ（ＨａｅｍｏｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＶＴＵＳＡ）ならびにカニクイザルＦＩＸおよびＦＸ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ自社で生成）の異なる濃度に対して、１～４個の連続した富化ラウンドを受けた。

ＦＩＸおよびＦＸａに対しＦＩＸａおよびＦＸに選択的なＶ_ＨＨ断片を特異的に富化するために、ある特定の実験では、固定化ＦＩＸａおよびＦＸを用いたライブラリのインキュベーション中の競合のために過剰な可溶性ＦＩＸおよびＦＸａを使用した。

他の構造的に関連する凝固因子に対しＦＩＸおよびＦＸに選択的なＶ_ＨＨ断片を特異的に富化するために、ある特定の実験では、固定化ＦＩＸおよびＦＸを用いたライブラリのインキュベーション中の競合のために過剰な可溶性ＦＸおよびＦＩＸをそれぞれ使用した。

選択出力からの約４５００個の個別のクローンを、ヒトおよびカニクイザルＦＸ、ＦＸａ、ＦＩＸ、およびＦＩＸａに対して、ＥＬＩＳＡで結合するためにスクリーニングした（Ｖ_ＨＨ断片を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞からのペリプラズム抽出物を使用した）。ヒトＦＸおよびＦＩＸａ／ＦＩＸへの特異的結合を示した約１５００個のクローンを特定し、その大部分はカニクイザルＦＸおよびＦＩＸへの交差結合を示した。一部のクローンは、ＦＸａに対してＦＸへの、およびＦＩＸに対してＦＩＸａへの選択的結合を示した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列解析は、ＦＩＸａ／ＦＩＸまたはＦＸ／ＦＸａに結合するＶ_ＨＨ断片の約７００個のユニーク配列を特定した。化合物をさらに最適化するために、延長因子の付加、リンカー、および延長部の組み合わせと組み合わせた、激烈なＶ_ＨＨＣＤＲおよびＦＲの変異誘発を、トロンビン生成アッセイを使用した変異スクリーニングを介して、止血効力の増強に焦点を当てて実施し、親和性が変化した化合物のスクリーニングを介して標的介在性の薬剤消失を回避し、ＭＨＣ関連ペプチドプロテオミクスアッセイを使用したリスク部位のスクリーニングを介して免疫原性の低減し、表面曝露残基の置換を低下させるｐＩを介したインビボでの経口バイオアベイラビリティを増強する。

ＦＸまたはＦＩＸに結合するＶ_ＨＨ断片の発現構築物生成
ファージディスプレイ選択出力からのＶ_ＨＨ断片の配列解析を、一般的に公知の手順に従って行った（Ｐａｒｄｏｎｅｔａｌ．（２０１４）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ９：６７４）。

各々が固有の制限部位を担持するフォワードＦＲ１およびリバースＦＲ４プライマーの特定の組み合わせを有するＰＣＲによって得られた、Ｖ_ＨＨ断片含有ＤＮＡ断片を、適切な制限酵素で消化し、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現のためのＨｉｓ_６－および／またはＦＬＡＧ_３タグ付きフォーマットとして、Ｖ_ＨＨポリペプチド発現ベクターの一致するクローニングカセット内にライゲーションした。次いで、ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＴＧ１（６０５０２、Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）またはＴＯＰ１０（Ｃ４０４０５２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に形質転換し、それらは次いで、適切な抗生物質選択圧（カナマイシンまたはゼオシン）下で増殖させた。耐性クローンを、プラスミドＤＮＡのサンガー配列決定（ＬＧＣＧｅｎｏｍｉｃｓ、Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により検証した。

Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＸまたはＦＩＸに結合するＶ_ＨＨ断片の一般的な発現
Ｖ_ＨＨ断片を、ｌａｃプロモータを含有するプラスミド発現ベクターからのＥ．ｃｏｌｉＴＧ１、カナマイシンの耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製元、およびＯｍｐＡシグナルペプチドのコード配列によって先行されるＶ_ＨＨ断片クローニング部位において発現させた。Ｖ_ＨＨポリペプチドコード配列とインフレームで、ベクターはＣ末端ＦＬＡＧ_３およびＨｉｓ_６タグをコードする。シグナルペプチドは、発現されたＶ_ＨＨ断片を細菌宿主のペリプラズム区画に導く。

目的のＶ_ＨＨ断片構築物を含有するＥ．ｃｏｌｉＴＧ－１細胞を、３７℃で２時間、その後、３０℃で２９時間、「５０５２」自動誘発培地（０．５％グリセロール、０．０５％グルコース、０．２％ラクトース＋３ｍＭのＭｇＳＯ_４）を含有するバッフル付き振盪装置フラスコ中で増殖させた。一晩凍結させたＥ．ｃｏｌｉ発現培養物からの細胞ペレットを、次いでＰＢＳ（元の培養物の体積の１／１２．５）中に溶解し、穏やかに撹拌しながら４℃で１時間インキュベーションした。最後に、細胞をもう一度ペレット化し、ペリプラズム空間内に分泌されたタンパク質を含有する上清を保管した。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＶ_ＨＨ断片の一般的な発現
目的のＶ_ＨＨ断片構築物を含有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を、ＢＧＣＭ培地中で２日間（３０℃で、２００ｒｐｍ）増殖させた。３日目に、培地をＢＭＣＭに切り替え、構築物をさらに増殖させて（３０℃、２００ｒｐｍ）、８時間後に０．５％ｖ／ｖメタノールを用いて誘導した。翌日、構築物を、０．５％ｖ／ｖメタノールを用いて、午前中、正午、および夕方に誘導した。５日目に、細胞を遠心分離し、上清（分泌されたＶ_ＨＨ断片を含有する）を収集した。

ＨＥＫ細胞において、ＦＸまたはＦＩＸおよび他の組み換え型タンパク質に結合するＶ_ＨＨおよび抗体の一般的な発現
ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現のための発現プラスミドを、ＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのいずれかから購入した。ＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのプラスミドは、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ｅｔａｌ．，（２００２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ，３０：Ｅ９に記載のｐＴＴベクターに基づくが、一方で、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３４－Ｔｏｐｏベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に基づいていた。Ｈｉｓ_６タグ付きまたは非タグ付きＶ_ＨＨポリペプチド化合物を、Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物を一過性に発現するために、ＨＥＫ２９３懸濁細胞にトランスフェクトした。抗ＧＬＡＦＩＸ抗体および抗ＧＬＡＦＸ抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ社内生成）、エミシズマブ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－ＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）配列同一類似体（ＳＩＡ）、およびＭｉｍ８（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をコードする配列を担持する等価発現構築物も、以下に記載される方法を使用してＨＥＫ２９３で発現された。

ＨＥＫ２９３懸濁細胞の一過性トランスフェクション（Ｅｘｐｉ２９３発現系、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４６３５）は、製造業者の指示に従って本質的に行った。ＨＥＫ２９３細胞は典型的には、１％のＰ／Ｓ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５１４０－１２２）を補充したＥｘｐｉ２９３発現培地（（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１４３５１－０１）で、３～４日毎に継代培養した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して２．５～３ｍｉｌｌ／ｍＬの細胞密度で導入した。ＨＥＫ２９３細胞の各１リットルに対して、合計１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号５１９８５－０２６、希釈物Ａ）へと希釈することによって、および２．７ｍＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（希釈物Ｂ）へと希釈することによって、トランスフェクションを実施した。共トランスフェクション（すなわち、抗体）については、プラスミドを１：１の比率で使用した。希釈ＡおよびＢを混合し、室温で１０～２０分間インキュベートした。この後、トランスフェクション混合物をＨＥＫ２９３細胞に加え、細胞を軌道回転（８５～１４０ｒｐｍ）を備えた加湿インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。導入から１日後、導入された細胞に、５ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクション促進剤１および５０ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクション促進剤２を補充した。細胞培養上清は、遠心分離によって導入から４～５日後に典型的に採取し、その後濾過した。

ＣＨＯ細胞におけるＦＸおよびＦＩＸ（ａ）に結合するＶ_ＨＨ断片および抗体の一般的な発現
抗ＦＩＸおよび抗ＦＸＶ_ＨＨ化合物ならびに抗体は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）選択を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生された。ＣＨＯ細胞を、エレクトロポレーションを使用してＧＳ発現プラスミドでトランスフェクトし、その後、ＣＤ－ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０７４３０２９）中のＭＳＸサプリメントとともに、グルタミン除去を使用して選択に供した。安定したＣＨＯ細胞プールは、典型的には、３週間の培養後に得られ、プールは、その後、３８４ウェルプレートに単一細胞クローニングを行った。３８４ウェルプレートで生じるＣＨＯクローンは、典型的には、９６ウェルプレートに増殖され、生産性についてスクリーニングした。予め定義された専有の細胞培養培地（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ）を使用して、選択された産生クローンを、１－Ｌから１５－Ｌスケールで、バイオリアクター中での培養のためにスケールアップした。培養中、細胞生存率は高く維持され、その後、細胞培養の採取まで段階的減少があった。ここで、細胞上清を、培養スケールに応じて、ＭＤ０ＨＣ２３ＣＬ３およびＭＸ０ＨＣ０１ＦＳ１フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した遠心分離および／またはデプスフィルター濾過により除去した後、クロマトグラフィーベースのタンパク質精製を進めた。

ＦＸまたはＦＩＸに結合するＶ_ＨＨ断片の一般的な精製および特徴付け
Ｈｉｓ６タグ付きまたは非タグ付きＶ_ＨＨ化合物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＰｒｏｔｅｉｎ－Ａ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）または固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、イミダゾール（後者の場合）または酸性溶出（前者の場合）を有するＮｉ－Ｅｘｃｅｌ（Ｃｙｔｉｖａ）樹脂のいずれかで精製し、続いて、脱塩工程（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５樹脂を用いたＰＤカラム、Ｃｙｔｉｖａ）を行い、必要な場合、ＰＢＳまたはＨＢＳ中でゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム、Ｃｙｔｉｖａ）を行った。非Ｈｉｓ６タグ付きＶ_ＨＨ化合物、ならびにそれぞれＦＩＸおよびＦＸのＧＬＡドメイン（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ社内生成）を標的とする抗体、ならびにエミシズマブＳＩＡ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－ＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、酸性溶出を伴うＰｒｏｔｅｉｎ－Ａ樹脂ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ）またはマルチモーダル樹脂（Ｃｙｔｉｖａ社）によって精製し、続いて、脱塩工程（例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５樹脂を含むＰＤカラム、Ｃｙｔｉｖａ）を行い、必要な場合、ＰＢＳまたはＨＢＳ中でゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム、Ｃｙｔｉｖａ）を行った。タンパク質の完全性を、ＢＩＯＳＥＰ（分離生体分子のためのカラム）－ＳＥＣ－５３０００３００×７．８ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号ＯＯＨ－２１４６－Ｋ０）、ならびに２００ｍＭのリン酸ＮａｐＨ６．９、３００ｍＭのＮａＣｌ、および１０％のイソプロパノールで構成されるランニング緩衝液を用いた、ＡｇｉｌｅｎｔＬＣ１１００／１２００システム上のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）法を使用して分析した。精製されたＶ_ＨＨポリペプチドバッチの分子質量は、段階溶出のために、ＭＱ－Ｈ２Ｏ／０．１％のギ酸で構成されたＡ緩衝液、およびアセトニトリル／０．１％のギ酸で構成されたＢ緩衝液中で０．４ｍｌ／分で実行されるＭａｓｓＰＲＥＰＤｅｓａｌｔ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムを有する６２８０Ａｇｉｌｅｎｔシステム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上のエレクトロスプレーイオン化と飛行時間型質量分析（ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）を使用して分析した。最終的なタンパク質濃度を測定するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、理論的に計算された吸光係数を用いて使用した。

実施例２：Ｖ_ＨＨポリペプチドシステイン残基への延長部分のコンジュゲーション
薬物動態特性を改善するためにＶ_ＨＨポリペプチドを延長するために、Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物を、以下にさらに説明されるように、様々な骨格位置、例えば、１つ以上の脂肪酸延長部分とのコンジュゲーションに使用される１つまたは２つの導入されたＣｙｓ残基を有するＮ末端またはＣ末端延長部にシステイン（Ｃｙｓ）置換基を含むように操作した。

延長部分をＶ_ＨＨポリペプチド化合物に結合するために、修飾された延長部分の形態の中間体試薬を使用した。

延長部分を含む中間体試薬を、国際公開第２０１６／１０２５６２号に記載されるように調製し、かかる中間体試薬の非限定的な例を以下の表３に示す。

コンジュゲーション、精製、および分析
コンジュゲーションのため１つ以上の導入されたシステイン残基を有するＶ_ＨＨポリペプチドを含有する水溶液に、キャッピングされたシステイン当たり５当量のＢＳＰＰ（ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物ジカリウム塩）または１．１当量のＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）を添加した。１～２時間の撹拌の後、ｐＨを、ＮａＯＨ水溶液で８．５に調整し、それぞれのＶ_ＨＨポリペプチド中の遊離システイン当たり、例えば、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３（水溶液）中の５当量の中間体試薬Ｃ１を添加した。混合物を暗所で１．５～１６時間穏やかに撹拌した。反応混合物を、Ａｋｔａシステムを使用して、陰イオン交換（ＡＩＥＸ）法によって精製する前に水で希釈した。側鎖コンジュゲーションを含むＶ_ＨＨポリペプチドを、ＡＩＥＸクロマトグラフィー分離法を使用して精製した。したがって、好適なカラムに充填されたＡＩＥＸ樹脂Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑを、ＡｋｔａＡｖａｎｔクロマトグラフィーシステムでセットアップした塩化ナトリウム勾配プログラムと一緒に使用した。使用した緩衝液系は、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）から構成される平衡緩衝液、および２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）から構成される溶出緩衝液であった。反応混合物を、ｐＨ８．５に調整し、ＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏまたは平衡緩衝液を使用して、導電率４ｍＳ／ｃｍ未満に希釈した。試料をカラムに適用し、カラムを５～１０カラム体積の平衡緩衝液で適用後に洗浄した。次いで、３０～５０カラム体積の浅い勾配を使用して分離クロマトグラフィーを行った。使用した勾配は、精製されたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体のｐＩに応じて、０％から最大５０％であった。一般的に、コンジュゲートされていない親Ｖ_ＨＨポリペプチドは、勾配の早期に溶出され、単一コンジュゲーションを含むＶ_ＨＨポリペプチドは、勾配の最中に溶出され、Ｖ_ＨＨポリペプチド分子当たり１つを超える側鎖コンジュゲートを意味する多重コンジュゲーションを含むＶ_ＨＨポリペプチドは、勾配の後期に溶出された。メインピーク上の画分のプーリングをある方法で行ったため、９０～９９％の高い純度の、単一または二重コンジュゲート調製物を含むＶ_ＨＨポリペプチドを得た。純度分析は、ＵＶおよびＦＬＤ検出器を有するＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣシステムでセットアップした、ＨＡＬＯＤｉＰｈｅｎｙｌカラム１０００Å、２．７μｍ、１５０×２．１ｍｍ（ＳｃａｎｔｅｃＮｏｒｄｉｃＵＳＤＰＦ００１３１６）ならびにＡ）水中の０．１％ｖ／ｖＴＦＡおよびＢ）アセトニトリル中の０．０９％ｖ／ｖＴＦＡから構成されるランニング緩衝液に基づく、逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）法を使用して行った。カラム温度を６０℃に設定した。勾配プログラムは、以下であった：１）０．０～８．０分：２０～５０％Ｂ、２）８．０～８．１分：５０～８０％Ｂ、３）８．１～９．０分：８０％Ｂ、４）９．０～９．１分：８０～２０％Ｂ、および５）９．１～１１．０分：２０％Ｂ。コンジュゲートされていない親Ｖ_ＨＨポリペプチドは、４．６～４．８分の間に溶出された。単一コンジュゲーションを含むＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、５．１～５．６分の間に溶出され、約５．３分でメインピークを有した。二重コンジュゲーションを有するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、オフサイトの多重コンジュゲートされたＶ_ＨＨポリペプチドに対して、５．７～５．８以降に溶出された。コンジュゲーションを含むＶ_ＨＨポリペプチドの完全性は、ＡｇｉｌｅｎｔＬＣ１１００／１２００システムと、ＢＩＯＳＥＰ－ＳＥＣ－３０００３００×７．８ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号ＯＯＨ－２１４６－Ｋ０）ならびに２００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、３００ｍＭのＮａＣｌ、および１０％のイソプロパノールで構成されたランニング緩衝液で準備したＳＥ－ＨＰＬＣ方法に基づいて分析した。コンジュゲーションを含むＶ_ＨＨポリペプチドの分子質量は、段階溶出のために、ＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏ／０．１％のギ酸で構成されたＡ緩衝液、およびアセトニトリル／０．１％のギ酸で構成されたＢ緩衝液中で０．４ｍｌ／分で実行されるＭａｓｓＰＲＥＰＤｅｓａｌｔ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムを有する６２８０Ａｇｉｌｅｎｔシステム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上のＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳを使用して分析した。キモトリプシンおよびトリプシンベースの消化物の組み合わせを使用して、配列検証のためのペプチドマッピングを行った。ＬＣ－ＭＳシステムは、ＴｈｅｒｍｏＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎ機器に組み合わせたｗａｔｅｒｓのＡｑｕｉｔｙＵＰＬＣから成っていた。消化物のオンラインＬＣ－ＭＳ分析を、ＣＳＨＣ－１８カラム１．７μｍ、１５０×２．１ｍｍ、およびアセトニトリル／ギ酸勾配を使用して行った。カラム温度は６０Ｃであった。緩衝液Ａ：０，１％ＦＡ水および緩衝液Ｂ：０，１％ＦＡアセトニトリル。勾配プログラムは以下であった：１）０．０～２．０分：１％Ｂ、２）２～５０分：１～３５％Ｂ、３）５０～５１分：１００％Ｂ、および４）５１～６０分：１００～１％Ｂ、１２０μｌ／分の流量。ＧｅｎｅｄａｔａＲｅｆｉｎｅｒペプチドマッピングワークフローを使用してデータを分析した。一次配列の完全なカバレッジが得られた。コンジュゲーションを用いたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体のバッチ調製物のタンパク質濃度を測定するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を理論的に計算された吸光係数を用いて使用した。

図１、２、および３は、ＩＳＶＤ－およびＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の非限定的な例を、増加するレベルの詳細とともに示す。

実施例３：配列表および抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド

実施例４：ＥＬＩＳＡ実験に基づく抗ＦＸＶ_ＨＨポリペプチドのエピトープ
「化合物番号１」と示される抗ＦＸＶ_ＨＨポリペプチドの結合エピトープが、ヒトＦＸ（配列番号２）の活性化ペプチド（ＡＰ）の内側に位置するかどうかを判定するために、ＥＬＩＳＡアッセイをセットアップした。１個のアミノ酸間隔を有する活性化ペプチドの５２残基にわたる４１個の固有の１２－ｍｅｒペプチド断片を、マイクロタイタープレートウェル中で固定化し、続いて、試験されるＶ_ＨＨポリペプチドとともにインキュベーションし、結合したリガンドの検出を、二次ＨＲＰ標識化抗体の添加によって行った。

ペプチドをビオチンにＣ末端結合し、５０μＬの１μｇ／ｍＬペプチド溶液を使用して、１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートの個別ウェル中に固定した。各ウェルを洗浄緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．６０）で洗浄し、続いて、試験される５０μＬの２μｇ／ｍＬのＦＬＡＧタグ付き抗ＦＸＶ_ＨＨポリペプチドまたはＩｇＧ抗体を添加した。１時間後、非結合Ｖ_ＨＨポリペプチドを、洗浄緩衝液を使用して洗浄した。

最初にＨＲＰ標識化二次抗体（ＦＬＡＧタグ付きＶ_ＨＨポリペプチド：抗ＦＬＡＧｍＡｂＭ２－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）を１時間結合し、次いで、１００μＬのＴＭＢ－１ＥＬＩＳＡ基質（Ｋｅｍ－Ｅｎ－ＴｅｃＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加することによって、結合した抗ＦＸ活性化ペプチドリガンドを検出した。

次いで、各ＦＸバインダーによって結合した一組のペプチド（表６）によって被覆された共通配列を特定することにより、ベースラインを上回るシグナルを生じさせる一組のペプチドから最小エピトープを推定した。エピトープの第１の残基を、第１の連続的なＥＬＩＳＡ陽性ペプチドにおける最後のアミノ酸により定義し、一方で、エピトープの最後の残基を、最後の連続的なＥＬＩＳＡ陽性ペプチドの第１の残基として定義した。

したがって、以下の表は、化合物番号１に対応する試験された初期抗ＦＸＶ_ＨＨポリペプチドについて、ＦＸＡＰ全体に及ぶ連続ペプチドからのＥＬＩＳＡシグナルを示す。ＥＬＩＳＡシグナルは、バックグラウンドシグナルに対して正規化されている。

灰色の領域は、配列ＮＰＦＤＬＬＤＦ（配列番号６９２）として特定された最小エピトープを決定するために使用される陽性結合シグナルをマークする。

化合物番号１に対するＦＸ活性化ペプチドの特定されたエピトープ配列を、実施例６に概説されるように、エピトープ：パラトープ相互作用の実験を決定する高分解能構造に使用した。

実施例５：抗ＦＩＸＶ_ＨＨ断片（化合物番号２）の結晶化およびパラトープ／エピトープマッピング
本研究の目的は、化合物番号２と指定されたＶ_ＨＨ断片のパラトープ残基およびエピトープ残基を決定することであった。

結晶化
ヒトＥＧＲ－ＣＭＫ阻害第ＩＸａ因子Ｇｌａドメインレス（野生型）（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＰｒｏｔｅｉｎＷｏｒｋｓから購入、ロット番号ｈＧＤＦＩＸＡＷＴＥＧＲ＿１１）と１：１のモル比で混合したＶ_ＨＨポリペプチドの結晶（化合物番号２）を、１８℃でシッティングドロップ蒸気拡散技法を使用して成長させた。２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２．５ｍＭのＣａＣｌ_２中の１００ｎｌの８．４ｍｇ／ｍｌ複合体のタンパク質溶液を、１００ｎｌの０．２Ｍの硫酸Ｌｉ、０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００（沈殿剤として）と混合して、６０μｌの沈殿剤上でインキュベートした。結晶は２週間以内に現れた。

回折データ収集
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、結晶化ドロップに２０％のエチレングリコールを加えた１μｌの沈殿剤の添加により凍結保護した。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＰｉｌａｔｕｓ２Ｍ画素検出器を使用して、ＳｗｉｓｓＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅビームラインＸ０６ＤＡ（１．００００Å波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合、およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いて実施された（回析データ統計を表７に要約する）。

構造の決定および精緻化
非対称単位は、マシューズ係数分析によって判定された、２つの化合物番号２：ＥＧＲ－ＣＭＫ阻害第ＩＸａ因子Ｇｌａドメインレス複合体を含む。構造は、探索モデルとして所定のＶ_ＨＨ：ＦＩＸａ複合体の構造を使用して、プログラムスイートＰｈｅｎｉｘ内に実装されたＰｈａｓｅｒを使用する分子置換によって決定された。正しいアミノ酸配列はＣＯＯＴを使用してモデル構築され、その後構造はＣＯＯＴでのＰｈｅｎｉｘ精緻化工程および手動再建工程を使用して精緻化された。精緻化統計が表７に示される。

エピトープおよびパラトープの決定
Ｖ_ＨＨポリペプチド内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子（すなわち、非水素原子）を有することによって特徴付けられるＦＩＸ（ａ）残基として定義される化合物番号２のエピトープは、ＦＩＸ配列によるＦＩＸ（ａ）のプロテアーゼドメインからの以下の残基：
Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０を含む（連続ナンバリング）（配列番号１）。

ＦＩＸ（ａ）内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子（すなわち、非水素原子）を有することによって特徴付けられる残基として定義される化合物番号２のパラトープは、化合物番号２からの以下の残基：
Ｆ２９、Ｎ３０、Ｙ３２、Ｔ５４、Ｄ９９、Ｒ１００、Ｓ１０１、Ｆ１０２、Ｌ１０３、Ｆ１０４、Ｑ１０６、Ａ１０７、およびＮ１１３（配列番号３５）（連続番ナンバリング）を含む。

実施例６：結晶化およびパラトープ／エピトープマッピング抗ＦＸＶ_ＨＨ断片（化合物番号１）
本研究の目的は、化合物番号１と指定されたＶ_ＨＨ断片のパラトープ残基およびエピトープ残基を決定することであった。

結晶化
実施例４で特定されたヒトＦＸ（Ｓｃｈａｆｅｒ－ＮＡｐＳから購入）の活性化ペプチド配列ａａ３１～３７に対応する、合成ペプチドＮ－ｔｅｒｍ－ＮＰＦＤＬＬＤ－Ｃ－ｔｅｒｍと１：１４のモル比で混合されたＶ_ＨＨポリペプチド（化合物番号１）の結晶を、１８℃で、シッティングドロップ蒸気拡散技法を使用して成長させた。２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭＮａＣｌ中の１５０ｎｌの４．０ｍｇ／ｍｌ複合体のタンパク質溶液を、５０ｎｌの０．２ＭＮａＣｌ、２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）（沈殿剤として）と混合し、６０μｌの沈殿剤でインキュベートした。結晶は１週間以内に現れた。

回折データ収集
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、結晶化ドロップに２０％のエチレングリコールを加えた１μｌの沈殿剤の添加により凍結保護した。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＰｉｌａｔｕｓ２Ｍ画素検出器を使用して、ＳｗｉｓｓＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅビームラインＸ０６ＤＡ（１．００００Å波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合、およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いて実施された（回析データ統計を表８に要約する）。

構造の決定と精緻化
非対称単位は、１つの化合物番号１：ペプチド複合体を含む。構造は、探索モデルとしてタンパク質構造データバンクＩＤ４Ｂ４１（鎖Ａ）で指定されたＶ_ＨＨポリペプチド構造を使用して、プログラムスイートＰｈｅｎｉｘ内に実装されたＰｈａｓｅｒを使用する分子置換によって決定された。化合物番号１の正しいアミノ酸配列を導入し、合成ペプチドの電子密度の違いを特定し、全てＣＯＯＴを使用して手動でモデル構築した。その後、構造は、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ精緻化および手動再建工程を使用して精緻化された。精緻化統計が表８に示される。

エピトープおよびパラトープの決定
Ｖ_ＨＨポリペプチド（化合物番号１）内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子を有することによって特徴付けられるＦＸ活性化ペプチド残基として定義される合成ペプチドのエピトープは、連続ナンバリングに基づく対応するＦＸ活性化ペプチド配列（配列番号２）による、合成ペプチドＮ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８からの以下の残基を含む。

合成ペプチド内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子（すなわち、非水素原子）を有することによって特徴付けられる化合物番号１の残基として定義されるＶ_ＨＨポリペプチドのパラトープ（化合物番号１）は、化合物番号１からの以下の残基：
Ｄ３２、Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｙ３７、Ｌ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ｇ５０、Ｉ５１、Ｍ５２、Ｎ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ｔ６１、Ｋ９７、Ｖ９９、Ｒ１０１、およびＰ１０２（配列番号２７）（連続ナンバリング）を含む。

合成ペプチドと複合体化されたＶ_ＨＨポリペプチド（化合物番号３）の相同性モデルの構築を行い、その理由は、化合物番号３を合理的な配列ベースおよび構造ベースの最適化のための親Ｖ_ＨＨポリペプチド配列として使用したためである。

上記の実験からの合成ペプチドと複合体化された化合物番号１の結晶構造を、合成ペプチドと複合体化された化合物番号３の相同性モデルの出発モデルとして使用した。化合物番号１および化合物番号３のアミノ酸配列をアライメントし、２つの配列間で異なるアミノ酸残基をＣＯＯＴで変異させて、化合物番号３の出発モデルを作成した。化合物番号３を含むこのモデルは、前処理され、最適化され、ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲからのＭＡＥＳＴＲＯにおける抑制された最小化を通して実行された。

このモデルは、配列がこれらの位置で同一であったため、上記のように同じエピトープ残基およびパラトープ残基を示した。

実施例７：抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチドのＳＰＲ解析
本研究の目的は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析により、ヒト血漿由来ＦＸおよびＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）を有する選択された抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物の結合定数を推定することであった。

精製された抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物のヒト血漿由来ＦＸ（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＵＳＡ）への結合を、ＳＰＲによってプローブした。

簡潔に述べると、上記のように組み換え的に調製された抗ＧＬＡ－ＦＸを、ｐＨ５で標準アミンカップリング化学を使用してＣＭ４センサーチップまたはＸａｎｔｅｃＨＬＣ２００Ｍ上に固定化した。１０ｎＭＦＸ（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を、１０μＬ／分の流量で３０秒間注射した。その後、表９による１０００、１００、１０、１、０．１、および０ｎＭのＶ_ＨＨポリペプチド化合物を、５０μＬ／分の流量で２００秒間注射し、ＦＸへの結合を許容し、続いて、ランニング緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｐｈ７．４）注射を１０分間の流れで行い、ＦＸからの解離を許容した。ランニング緩衝液はまた、抗ＦＸＶ_ＨＨポリペプチド化合物の希釈にも使用された。チップの再生を、ランニング緩衝液中の５０ｍＭＥＤＴＡから成る再生緩衝液、３０秒間の接触時間、および３０μＬ／分の流量を使用して達成した。結合データを２５℃で収集し、製造者（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、ＵｐｐｓａｌａまたはＢｒｕｋｅｒＡｎａｌｙｓｅｒ）により供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１を使用する１：１モデルにより分析した。

全ての場合において、結合センソグラムは、運動分析に基づくＫ_Ｄ決定を除外する運動プロファイルに結合する迅速なオンおよび迅速なオフを示した。したがって、報告されたＫ_Ｄ値を、定常状態分析に基づいて決定する。分析により、以下の表９に報告された結合定数を得た。

精製された抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物のＢｅｎｅｆｉｘ（登録商標）（ＰｆｉｚｅｒＩｎｃ、ＵＳＡ）への結合を、ＳＰＲによりプローブした。簡潔に述べると、上記のように組み換え的に調製された抗ＧＬＡ－ＦＩＸを、ｐＨ５で標準アミンカップリング化学を使用してＣＭ４センサーチップまたはＸａｎｔｅｃＨＬＣ２００Ｍ上に固定化した。ＦＩＸ（１０ｎＭ）を、１０μＬ／分の流量で１分間注射した。その後、１０００、１００、１０、１、０．１、および０ｎＭのＶ_ＨＨポリペプチド化合物を、３０μＬ／分の流量で４分間注射し、ＦＩＸ（Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標））への結合を許容し、続いて、ランニング緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｐｈ７．４）注射を５分間の流れで行い、ＦＩＸからの解離を許容した。ランニング緩衝液はまた、抗ＦＩＸＶ_ＨＨポリペプチド化合物の希釈にも使用された。チップの再生を、ランニング緩衝液中の５０ｍＭＥＤＴＡから成る再生緩衝液、３０秒間の接触時間、および３０μＬ／分の流量を使用して達成した。結合データを２５℃で収集し、製造者（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ）により供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１を使用する１：１モデルにより分析した。

全ての場合において、結合センソグラムは、運動分析に基づくＫ_Ｄ決定を除外する運動プロファイルに結合する迅速なオンおよび迅速なオフを示した。したがって、報告されたＫ_Ｄ値を、定常状態分析に基づいて決定する。

一連の化合物の結合定常分析を表９に報告する。ＦＩＸの結合親和性は、概して、全ての化合物について低ｎＭＫ_Ｄであり、一方で、ある範囲の化合物は、ＦＸの結合について高ｎＭＫ_Ｄを示した。したがって、標的媒介性薬剤配置は、ＦＸ中に不在であると予想され、一方で、ＦＩＸ相互作用は予想されるが、概説される化合物の必要な定常状態血漿濃度に限定される。したがって、列挙された化合物に対して有意な止血カバレッジを得るために期待される必要な血漿濃度は、列挙された化合物に対して高い効力があることを考えると、低いｎＭ濃度であることが予想される。

実施例８：トロンビン生成試験（ＴＧＴ）アッセイにおける抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（Ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチドの活性
抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の血液凝固促進活性は、Ｈｅｍｋｅｒｅｔａｌ．（ＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌＨａｅｍｏｓｔＴｈｒｏｍｂ，２００２；３２：２４９－２５３）によって記載される原理による血液凝固促進合成リン脂質膜の存在下でトロンビン生成を促進するそれらの能力に基づいて決定された。比較のために、エミシズマブ配列同一類似体（ＳＩＡ）を含めた。各Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体を、中和抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体（以下、ＨＡ－ＰＰＰと称する）で補充された正常ヒト血小板欠乏血漿（ＮＨＰ）を使用して、ＴＧＴアッセイで試験した。

ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩポリクローナル抗体（ｐＡｂ、ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、ＶＴ，ＵＳＡ）を補充したＮＨＰ（健康なボランティアからの）におけるＴＧＴを、９６ウェルプレート蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏｓｃａｎＡｓｃｅｎｔＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用した標準的な較正された自動トロンボグラフィーによって実施した。反応混合物は、０．１μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩｐＡｂ、４μｌの試験化合物希釈液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡで希釈）、１０μｌの１ｐＭ組織因子（ＴＦ、ｐｐｐＬｏｗ、ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから）、または１～８．３Ｕ／ｍｌヒト第ＸＩａ因子（ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＮ，ＵＳＡ）のいずれか、および１０μｌのＦｌｕＣａ基質（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とプレインキュベートした３６μｌのＮＨＰを含む。ＴＧＴアッセイを、トロンビンキャリブレーター（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してキャリブレーションし、１０μｌのトロンビンキャリブレーターを、０．１μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩｐＡｂ、４μｌ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ）とプレインキュベートした３６μｌのＮＨＰと混合した。概して、ＴＧＴは、８つの濃度の試験化合物（０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、および３００ｎＭ、最終血漿濃度または類似のもの）または添加緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ）のみ（対照を表す）で行った。ＴＧＴ中の正常な対照レベルは、ＮＨＰ添加緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ）のみを使用して測定した。ＴＧＴを合計６０分間進行させ、ＴＧＴパラメータのピークトロンビン高さ（ｎＭ）をＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ）で分析した。選択された試験Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体、化合物番号６、ならびにコンパレータエミシズマブＳＩＡおよびＭｉｍ８の代表的な滴定曲線については、図４を参照されたい。活性レベルの差の評価は、コンパレータ、例えば、エミシズマブＳＩＡに対するＥＣ_５０の差、またはエミシズマブＳＩＡに対する最大トロンビンピーク高さに対する所与のＶ_ＨＨポリペプチド化合物に対する最大トロンビンピーク高さの差として実施した。後者のアプローチを、より多くのＶ_ＨＨポリペプチド誘導体をスクリーニングするために使用した。

Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の活性をブーストするために、ＣＤＲ変異の最適な組み合わせを最大活性効果を生成するため特定した。実施例５および６に記載されるものなどの結晶構造モデルを使用して、重要なパラトープ残基を特定し、ならびにシステインで置換されるのに適した表面曝露残基をコンジュゲーション部位として特定し、バイオアベイラビリティを増強するためにｐＩ低下置換した。異なるリンカーおよび異なるコンジュゲーションタイプも調査した。以下の表では、これらのパラメータの各々を扱う一連のＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の活性プロファイルが概説され、個別に説明される。

表１０では、活性ブースト変異に対して最適化された、最適化されたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体から得られた効力ＥＣ_５０値を示す。主要な構成要素の計算アルゴリズムおよびランダムフォレストアルゴリズムを、変異の組み合わせに使用して、活性をブーストした。Ｖ_ＨＨポリペプチド（化合物番号２４）は、ブースト変異を有さない初期誘導体であり、このＶ_ＨＨポリペプチド誘導体およびエミシズマブＳＩＡと比較して、それぞれ最大４０倍および最大７６倍の効力が、開発された最良のＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の中で得られた。

表１１では、システインとの置換（リンカーＬ_Ｐ１を介して結合されたＣ１８二酸脂肪酸延長部分Ｐ３とのコンジュゲーションありおよびなし）後に、Ｖ_ＨＨポリペプチドの活性を保持したＶ_ＨＨポリペプチド（ＣＤＲ１－３の外側）上の最適なコンジュゲート部位のスクリーニングが行われた。

合計９５の表面曝露部位を、Ｃｙｓ置換の導入を用いて試験した。化合物番号２３／２４を基準として使用した連続ナンバリング（ＣＤＲにおけるいかなるブースト変異を含まないＶ_ＨＨポリペプチドを表す）に基づいて、最適なコンジュゲーション部位のスクリーニングを実施した。以下の残基置換を試験した：Ｇ２７Ｃ、Ｖ２８Ｃ、Ｖ２９Ｃ、Ｑ３０Ｃ、Ｐ３１Ｃ、Ｇ３２Ｃ、Ｓ３４Ｃ、Ｌ３５Ｃ、Ｒ３６Ｃ、Ｓ３８Ｃ、Ａ４０Ｃ、Ｓ４２Ｃ、Ｒ５５Ｃ、Ｑ５６Ｃ、Ａ５７Ｃ、Ｐ５８Ｃ、Ｇ５９Ｃ、Ｋ６０Ｃ、Ｅ６１Ｃ、Ｒ６２Ｃ、Ｙ７７Ｃ、Ａ７８Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｖ８１Ｃ、Ｋ８２Ｃ、Ｇ８３Ｃ、Ｒ８４Ｃ、Ｆ８５Ｃ、Ｔ８６Ｃ、Ｓ８８Ｃ、Ｄ９０Ｃ、Ｎ９１Ｃ、Ｓ９２Ｃ、Ｋ９３Ｃ、Ｔ９５Ｃ、Ｙ９７Ｃ、Ｑ９９Ｃ、Ｍ１００Ｃ、Ｎ１０１Ｃ、Ｓ１０２Ｃ、Ｌ１０３Ｃ、Ｒ１０４Ｃ、Ｐ１０５Ｃ、Ｅ１０６Ｃ、Ｄ１０７Ｃ、Ｔ１０８Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｖ１５７Ｃ、Ｖ１５８Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｐ１６０Ｃ、Ｇ１６１Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｓ１６３Ｃ、Ｌ１６４Ｃ、Ｒ１６５Ｃ、Ｓ１６７Ｃ、Ａ１６９Ｃ、Ｓ１７１Ｃ、Ｒ１８４Ｃ、Ｑ１８５Ｃ、Ａ１８６Ｃ、Ｐ１８７Ｃ、Ｇ１８８Ｃ、Ｋ１８９Ｃ、Ｅ１９０Ｃ、Ｒ１９１Ｃ、Ｙ２０６Ｃ、Ａ２０７Ｃ、Ｄ２０８Ｃ、Ｓ２０９Ｃ、Ｖ２１０Ｃ、Ｋ２１１Ｃ、Ｇ２１２Ｃ、Ｒ２１３Ｃ、Ｆ２１４Ｃ、Ｔ２１５Ｃ、Ｓ２１７Ｃ、Ｄ２１９Ｃ、Ｎ２２０Ｃ、Ｓ２２１Ｃ、Ｋ２２２Ｃ、Ｔ２２４Ｃ、Ｙ２２６Ｃ、Ｑ２２８Ｃ、Ｍ２２９Ｃ、Ｎ２３０Ｃ、Ｓ２３１Ｃ、Ｌ２３２Ｃ、Ｒ２３３Ｃ、Ｐ２３４Ｃ、Ｅ２３５Ｃ、Ｄ２３６Ｃ、Ｔ２３７Ｃ、およびＣ末端延長部に導入されたＣｙｓ。

これらのうち、以下の４１個のＶ_ＨＨポリペプチドは、ＨＥＫ２９３発現系を使用して発現され、Ｃ１８二酸延長部分を含む試薬Ｃ３と首尾よくコンジュゲートされ得る：Ｑ３０Ｃ，Ｐ３１Ｃ、Ｑ５６Ｃ、Ａ５７Ｃ、Ｋ６０Ｃ、Ｅ６１Ｃ、Ａ７８Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｋ８２Ｃ、Ｎ９１Ｃ、Ｓ９２Ｃ、Ｑ９９Ｃ、Ｒ１０４Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｖ１５８Ｃ、Ｑ１５９Ｃ、Ｐ１６０Ｃ、Ｇ１６１Ｃ、Ｇ１６２Ｃ、Ｓ１６３Ｃ、Ａ１６９Ｃ、Ｓ１７１Ｃ、Ｑ１８５Ｃ、Ａ１８６Ｃ、Ｐ１８７Ｃ、Ｇ１８８Ｃ、Ｋ１８９Ｃ、Ｅ１９０Ｃ、Ａ２０７Ｃ、Ｄ２０８Ｃ、Ｓ２０９Ｃ、Ｖ２１０Ｃ、Ｔ２１５Ｃ、Ｓ２１７Ｃ、Ｄ２１９Ｃ、Ｎ２２０Ｃ、Ｓ２２１Ｃ、Ｋ２２２Ｃ、Ｓ２３１Ｃ、Ｒ２３３Ｃ、Ｃ末端延長部に導入されたＣｙｓ。コンジュゲーションありおよびなしのこれら４１個のＶ_ＨＨポリペプチドを、ＴＧＴアッセイで活性について試験した。コンジュゲーションありおよびなしのＶ_ＨＨポリペプチド（誘導体）のエミシズマブＳＩＡの最大トロンビンピーク高さに対するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の最大トロンビンピーク高さとして表される相対活性レベルは、表１１に示す。したがって、以下の９個の部位を、コンジュゲーションの前後に保持された活性に基づいて、例えば、試薬としてＣ３を使用して、延長部分とのコンジュゲーションのための遊離Ｃｙｓの導入に最適であると特定した：Ｃ末端延長部に導入されたＣｙｓ（化合物番号２３／２４）、Ｑ３０Ｃ（化合物番号２５／２６）、Ｖ１５８Ｃ（化合物番号２７／２８）、Ｐ１６０Ｃ（化合物番号２９／３０）、Ｇ１６１Ｃ（化合物番号３１／３２）、Ｇ１８８Ｃ（化合物番号３３／３４）、Ｅ１９０Ｃ（化合物番号３５／３６）、Ｓ２０９Ｃ（化合物番号３７／３８）、およびＳ２３１Ｃ（化合物番号３９／４０）。

２つの抗ＦＩＸおよび抗ＦＸＶ_ＨＨ断片の間に組み換え的に融合された異なるリンカーＬ_１－２の試験を行って、組成物を最適化した（表１２を参照）。Ｖ_ＨＨポリペプチドのエミシズマブＳＩＡの最大トロンビンピーク高さに対するＶ_ＨＨポリペプチドの最大トロンビンピーク高さとして表される相対活性レベルを、表１２に示す。これらのデータから、疎水性組成物のリンカーを有するＶ_ＨＨポリペプチドは、概して最も高い相対活性を示したが、酸性または親水性組成物のリンカーを有するＶ_ＨＨポリペプチドは、最も低い活性を示した。ＱＡＰＧＱＡ、ＧＱＡＰＧＱ、または類似のものから構成される混合組成物のリンカーを有するＶ_ＨＨポリペプチドは、中級の相対活性を示した。最適なリンカー組成物は、好ましくは、親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸の両方を含有するため、ＱＡＰＧＱＡリンカーを、例えば、等張性緩衝液および中性ｐＨで、３７℃で２週間、加速ストレス条件下で、高い安定性を示すＭＳ分析を使用して、化学的安定性についてさらに調査した。

したがって、「４０～６０％」対「６０～４０％」の疎水性アミノ酸対親水性アミノ酸の比が好ましい。示されるＶ_ＨＨポリペプチドは全て、ＣＤＲ変異をブーストする活性の同じセットを含んでいたが、ＣＤＲの外側のｐＩ低下変異の異なるセットを含んでいた。

実施例９：経口投与に好適な剤形のＳＮＡＣおよびＮＡＭを有する抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（Ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の製剤化
賦形剤として、Ｎ－（８－［２－ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）およびニコチンアミド（ＮＡＭ）を含む液体製剤を使用する経口研究のために調製するために、以下の手順に従った。ＳＮＡＣを計量して２００ｍｇ／ｍｌの濃度が得られ、ＮＡＭを計量して１Ｍの濃さが得られ、ＨＥＰＥＳ緩衝液を計量して５ｍＭの最終濃度が得られた。粉末をガラスバイアルに移し、それに応じてＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏを添加した。溶液を、ＳＮＡＣ、ＮＡＭ、およびステアリン酸マグネシウムが溶解されるまで、マグネチックスターラーで撹拌した。ｐＨを測定し、２ＭＮａＯＨでｐＨ８に調整した。したがって、精製およびコンジュゲートされた２～５ｍｇ／ｍｌのＶ_ＨＨポリペプチド誘導体のバッチは、２００ｍｇ／ｍｌのＳＮＡＣおよび１ＭＮＡＭ最終濃度で製剤化された液体であった。

ＳＮＡＣおよびＮＡＭを有する錠剤を使用した経口研究のために準備するために、以下の手順に従った。脂肪酸延長因子コンジュゲーションありまたはなしの精製されたＶ_ＨＨポリペプチド（誘導体）のバッチを、ＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏに緩衝液交換し、０．１ＭＮａＯＨまたは０．１Ｍギ酸のいずれかを用いて８．０にｐＨを調整した。ＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏ中に溶解されたＶ_ＨＨポリペプチド（誘導体）は、０．５～４ｍｇ／ｍｌの濃度であった。Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の噴霧乾燥を、ＭｉｎｉＳｐｒａｙＤｒｙｅｒＢ２９０（ＢＵＣＨＩ）を使用して、以下で実施した：ポンプ設定５～６、供給流量：２ｍｌ／分、入口温度：８０～８５℃、出口温度：４５～５０℃、ノズル：１．５ｍｍ、および吸引：１００％。

錠剤を調製するために、粉末を混合して所望の組成物を得た。以下の錠剤製剤を調製した。

混合した粉末を計量し、ＫｉｌｉａｎＳｔｙｌｅＯｎｅ（Ｒｏｍａｃｏ）を使用して、パンチ設定で均質な錠剤にパンチして、回転プレスをシミュレートした。

実施例１０：異なるＰＩ変化変異を有する抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体を使用したラットにおける経口および静脈内薬物動態研究
本研究の目的は、経口バイオアベイラビリティなどの薬物動態パラメータに対する、抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体におけるｐＩ変化変異の効果を調査することであった。

抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の液体製剤を、静脈内（ＩＶ）（ＩＶ製剤：２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に投与するか、または実施例９に従って調製し、研究の少なくとも１週間前に社内で順化させ、かつ標準的な食品および水への自由なアクセスを有するグループケージで維持したスプラーグドーリーラットの並行群に経口強制飼養により投与した。経口投与のためのラットを、投与前日の午後２時頃から（合計１８時間）、グリッド底ケージ内で、水への自由なアクセスとともに絶食させた。投与日に、全てのラットを処置室で３０分間順化させた。

血液試料は、投与の直前に、およびその後、投与後のいくつかの異なる時点で収集した。経口（ＰＯ）投与された動物は、投与後４時間までグリッド底ケージ内で絶食を維持した。Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の血漿濃度は、ガンマ－Ｇｌｕに基づく免疫アッセイを使用して測定され、そこで、試験分子の延長部分に対する抗Ｖ_ＨＨ抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および抗ガンマ－Ｇｌｕ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した。ここで、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、４３９４５４）を、２μｇ／ｍｌの抗ガンマ－Ｇｌｕ抗体で被覆し、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）を使用して洗浄および遮断した。洗浄工程後、１％ラットＥＤＴＡ血漿および最小希釈１００倍でのラットＥＤＴＡ血漿試料中の化合物特異的キャリブレーター（０、２．７、８．２、２４．７、７４、２２２、６６７、２０００ｐＭ）をプレート上でインキュベートし、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体をガンマ－Ｇｌｕ延長部分を介して捕捉した。追加の洗浄工程の後、社内ビオチン化Ｖ_ＨＨ特異的抗体をプレートに添加し（０．５ｎＭ）、サンドイッチＥＬＩＳＡを作り出した。最後の洗浄工程の後、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジンをプレートに添加した。Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体に結合したビオチン標識化抗体の量は、発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加した後に検出された。光学密度を、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ））を使用して測定した。応答は、ペルオキシダーゼの濃度に比例し、これは再びＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の濃度に比例した。これらの曝露データに基づいて、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎまたはオープンソースの統計解析ソフトウェアＲ（パッケージ「ＮｏｎＣｏｍｐａｒｔ」）のいずれかを使用して、ノンコンパートメント薬物動態パラメータを計算した。

ＣＤＲの外側の表面曝露残基で導入された以下のｐＩ低下置換Ｔ２８Ｄ、Ｋ４３Ｑ、Ｋ６５Ｑ、Ｎ８４Ｄ、Ｒ１４８Ｑ、Ｎ１５９Ｄ、Ｋ１７２Ｑ、Ｋ１９４Ｑ、およびＮ２１３Ｄ（テンプレートとして化合物番号４を使用した連続ナンバリングに基づく）を、異なる組み合わせで試験し（Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体（化合物番号５９～６４および化合物番号５）につながる）、非ｐＩ調整Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体（化合物番号４）を比較した。

結果は、以下の表１３および１４にＶ_ＨＨ誘導体について示し、経口バイオアベイラビリティに対するｐＩ低下の効果を示す。

ｐＩを約８．３６から５．８５まで低下させることで、バイオアベイラビリティが５～１０倍増加した（表１３を参照）。

半減期に対するｐＩ低下の効果は観察されなかった（表１４を参照）。

実施例１１：ラットにおける静脈内薬物動態研究：異なる延長因子を有する抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）
本研究の目的は、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体上の半減期などの薬物動態パラメータに対する、異なる延長因子の効果を調査することであった。

実施例９に従って調製された抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の液体製剤を、研究の少なくとも１週間前に社内で順化させ、かつ標準的な食品および水への自由なアクセスを有するグループケージで維持したスプラーグドーリーラットの並行群に静脈内（ＩＶ）投与した。経口投与のためのラットを、投与前日の午後２時頃から（合計１８時間）、グリッド底ケージ内で、水への自由なアクセスとともに絶食させた。投与日に、全てのラットを処置室で３０分間順化させた。血液試料は、投与の直前に、およびその後、投与後のいくつかの異なる時点で収集した。Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の血漿濃度は、Ｈｉｓタグまたはガンマ－Ｇｌｕに基づく免疫アッセイを使用して測定し、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体に対する抗Ｖ_ＨＨ抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）を、試験分子に融合されたＨｉｓタグに対する抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ０５０）、または試験分子の延長部分に対する抗ガンマ－Ｇｌｕ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と一緒に使用した。２つの免疫アッセイセットアップは、同様の感受性を有し、後者は、Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物が分子にＨｉｓタグを融合していない場合に使用した。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、４３９４５４）を、Ｈｉｓタグまたは抗ガンマ－Ｇｌｕ抗体で被覆し、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）を使用して洗浄および遮断した。洗浄工程後、１％ラットＥＤＴＡ血漿および最小希釈１００倍でのラットＥＤＴＡ血漿試料中の誘導体特異的キャリブレーター（０、２．７、８．２、２４．７、７４、２２２、６６７、２０００ｐＭ）をプレート上でインキュベートし、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体をそのＨｉｓタグまたはガンマ－Ｇｌｕ延長部分を介して捕捉した。追加の洗浄工程の後、社内ビオチン化Ｖ_ＨＨ特異的抗体をプレートに添加し（０．５ｎＭ）、サンドイッチＥＬＩＳＡを作り出した。最後の洗浄工程の後、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジンをプレートに添加した。Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体に結合したビオチン標識化抗体の量は、発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加した後に検出された。光学密度読み取りを、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ））を使用して測定した。応答は、ペルオキシダーゼの濃度に比例し、これは再びＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の濃度に比例した。これらの曝露データに基づいて、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎまたはオープンソースの統計解析ソフトウェアＲ（パッケージ「ＮｏｎＣｏｍｐａｒｔ」）のいずれかを使用して、ノンコンパートメント薬物動態パラメータを計算した。

異なる延長因子タイプを有するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の結果を、以下の表１５に示す。結果は、平均滞留時間終末相半減期（ＭＲＴＨＬ）に対して異なる脂肪酸およびアルブミン結合ペプチドを延長因子として使用する効果を示す。

Ｃ１８、Ｃ２０、およびテトラゾール脂肪酸側鎖コンジュゲーションを有するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体（化合物番号６６、化合物番号６７、および化合物番号６８：３～４倍増加）について、ならびにアルブミンバインダーペプチドとＶ_ＨＨポリペプチドとの間にＣ末端融合した３０残基長のＧｌｙＳｅｒＬ_Ｐリンカーを使用する最適な効果を伴うアルブミンバインダーペプチド延長因子融合を有するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体（化合物番号７０、化合物番号７１、化合物番号７２、および化合物番号７３：１．９～３．６倍増加）について、非延長ポリペプチドと比較して増加された半減期が観察された。短いＣ１２脂肪酸を有するＶ_ＨＨポリペプチド誘導体（化合物番号６５）は、最も低い半減期を示した。これは、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の最適な延長を得るために、延長された半減期の循環のために、Ｃ１２よりも長い脂肪酸が好ましいことを示す（例えば、Ｃ１６、Ｃ１８、またはＣ２０など）。

実施例１２：イヌにおける経口および静脈内薬物動態研究：ＳＮＡＣおよびＮＡＭで製剤化された抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）
本研究の目的は、半減期に対する脂肪酸延長の増殖の効果と、ｐＩの低下が経口バイオアベイラビリティの増強につながるかどうかを調査することであった。

抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の適切な製剤を、静脈内に投与するか、または錠剤として調製し、それぞれビーグル犬の群に経口投与した。イヌに、一晩の絶食後に朝に投与し、単回投与後３～５時間絶食を維持させた。経口研究のサブセット^§において、イヌに、経口投与の１０分前に約３ｎｍｏｌ／ｋｇのグルカゴンの皮下投与を与えた。血液試料は、投与の直前に、およびその後、投与後のいくつかの異なる時点で収集した。Ｖ_ＨＨポリペプチドの血漿濃度は、Ｈｉｓタグに基づくまたはガンマ－Ｇｌｕ－リンカーに基づく免疫アッセイを使用して測定し、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチドに対する抗Ｖ_ＨＨ抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、試験分子に融合されたＨｉｓタグに対する抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ０５０）、または試験分子の延長部分に対する抗ガンマ－Ｇｌｕ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と一緒に使用した。２つの免疫アッセイセットアップは、同様の感受性を有し、後者は、Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物が分子にＨｉｓタグを融合していない場合に使用した。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、４３９４５４）を、抗体で被覆し、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）を使用して洗浄および遮断した。洗浄工程後、１％イヌＥＤＴＡ血漿および最小希釈１００倍でのイヌＥＤＴＡ血漿試料中の化合物特異的キャリブレーター（０、２．７、８．２、２４．７、７４、２２２、６６７、２０００ｐＭ）をプレート上でインキュベートし、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物をそのＨｉｓタグまたはガンマ－Ｇｌｕリンカーモチーフを介して捕捉した。追加の洗浄工程の後、社内ビオチン化Ｖ_ＨＨ特異的抗体をプレートに添加し（０．５ｎＭ）、サンドイッチＥＬＩＳＡを作り出した。最後の洗浄工程の後、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジンをプレートに添加した。Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物に結合したビオチン標識化抗体の量は、発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加した後に検出された。光学密度読み取りを、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ））を使用して測定した。応答は、ペルオキシダーゼの濃度に比例し、これは再びＶ_ＨＨポリペプチド化合物の濃度に比例した。これらの曝露データに基づいて、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎまたはオープンソースの統計解析ソフトウェアＲ（パッケージ「ＮｏｎＣｏｍｐａｒｔ」）のいずれかを使用して、ノンコンパートメント薬物動態パラメータを計算した。

^§は、イヌに、経口投与の１０分前に約３ｎｍｏｌ／ｋｇのグルカゴンの皮下投与を示す。

結果は、３つのＣ１８二酸コンジュゲートＶ_ＨＨポリペプチド誘導体について以下の表１６および１７に示され、
ａ）半減期に対する脂肪酸延長の効果、および
ｂ）ｐＩの低下が経口バイオアベイラビリティの増強につながることを確認する。

したがって、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体が非延長化合物と比較して示された脂肪酸とコンジュゲートされたときに、イヌにおいて観察された半減期は、３７０～７１０倍増加した。Ｃ末端リンカー中の２つのＣ１６二酸脂肪酸コンジュゲーションを有する化合物（化合物番号６）は、約７．６日の半減期の最も高い増加を示した。

イヌでは、ＳＮＡＣ：ＮＡＭ製剤は、ＳＮＡＣ製剤単独と比較して、経口バイオアベイラビリティを２～８倍増加させた。したがって、ＮＡＭを経口製剤に添加することは、経口バイオアベイラビリティを臨床的に関連するレベル、すなわち約０．１％以上のレベルにすることを可能にする顕著な効果を有した。

全体として、効力、平均滞留時間、および経口バイオアベイラビリティを考慮すると、本明細書に開示されるＶ_ＨＨポリペプチド誘導体は、経口投与されたときに、インヒビターが存在する、もしくは存在しない血友病Ａの治療、および後天性血友病Ａの治療に有用であることが予想されるであろう。

実施例１３：ブタにおける静脈内薬物動態研究：Ｃ１８コンジュゲート抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）
本研究の目的は、Ｃ１８二酸延長因子基を有するかまたは有さないＶ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の薬物動態効果を調査することであった。

抗ＦＸ／ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の適切な製剤を、ミニブタ（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）群にそれぞれ静脈内（ＩＶ）および皮下（ＳＣ）投与した。血液試料は、投与の直前に、およびその後、投与後のいくつかの異なる時点で収集した。Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）の血漿濃度は、Ｈｉｓタグに基づくまたはガンマ－Ｇｌｕに基づく免疫アッセイを使用して測定し、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチド（誘導体）に対する抗Ｖ_ＨＨ抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）を、試験分子に融合されたＨｉｓタグに対する抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ０５０）、または試験分子の延長部分に対する抗ガンマ－Ｇｌｕ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と一緒に使用した。２つの免疫アッセイセットアップは、同様の感受性を有し、後者は、Ｖ_ＨＨポリペプチド化合物が分子にＨｉｓタグを融合していない場合に使用した。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、４３９４５４）を、Ｈｉｓタグまたは抗ガンマ－Ｇｌｕ抗体で被覆し、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）を使用して洗浄および遮断した。洗浄工程後、１％ブタＥＤＴＡ血漿および最小希釈１００倍でのブタＥＤＴＡ血漿試料中の誘導体特異的キャリブレーター（０、２．７、８．２、２４．７、７４、２２２、６６７、２０００ｐＭ）をプレート上でインキュベートし、ここで、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体をそのＨｉｓタグまたはガンマ－Ｇｌｕ延長部分を介して捕捉した。追加の洗浄工程の後、社内ビオチン化Ｖ_ＨＨ特異的抗体をプレートに添加し（０．５ｎＭ）、サンドイッチＥＬＩＳＡを作り出した。最後の洗浄工程の後、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジンをプレートに添加した。Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体に結合したビオチン標識化抗体の量は、発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加した後に検出された。光学密度読み取りを、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ））を使用して測定した。応答は、ペルオキシダーゼの濃度に比例し、これは再びＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の濃度に比例した。オープンソースの統計解析ソフトウェアＲ（パッケージ「ＮｏｎＣｏｍｐａｒｔ」）を使用して、ノンコンパートメント薬物動態パラメータを計算した。実施例１１、１２、および１３で観察されたように、半減期延長について脂肪酸延長因子コンジュゲーションの半減期に対する効果を確認する脂肪酸延長因子を有するおよび有さないＶ_ＨＨポリペプチドについて、結果を以下の表１８に示す。

したがって、Ｖ_ＨＨポリペプチドが非延長Ｖ_ＨＨ化合物と比較して脂肪酸Ｃ１８二酸延長因子とコンジュゲートされたときに、ブタにおいて観察された半減期は、約１５～２０倍増加した。

実施例１４：マウス尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデルにおける最適化された抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）ポリペプチド誘導体の薬力学効果
インビボ有効性を、中等度出血のＨＡマウスモデルで試験した。ＴＶＴモデルでは、ＦＶＩＩＩ投与が野生型マウスで観察されたのと同じレベルに出血を低減することが以前に示されている。化合物の精巣のマウス交差種反応性の欠如を克服するために、ＨＡマウスに、出血実験の前にヒトＦＩＸおよびＦＸを補充した。出血期間の終了時に、総失血を、分光光度ヘモグロビン測定によって決定した。示されたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体およびＦＩＸの血漿レベルは、それぞれ抗Ｖ_ＨＨ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および抗ガンマＧｌｕ－リンカー抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および抗ＦＩＸ抗体（ＬＳ－Ｂ７２２６、ＬＳＢｉｏ、およびＦＩＸ－２Ｆ２４、社内クローン）を使用した発光酸素チャンネリングアッセイによって定量化した。ＦＸレベルを、市販のＦＸＥＬＩＳＡ（ＫＳＰ１３４、ＮｏｒｄｉｃＢｉｏｓｉｔｅ）によって定量化した。示されたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体を用いた用量応答試験から、共有プラトー値（＞０）を有する３パラメータ逆対数（用量）応答方程式にデータを適合させることによって、ＥＣ_５０値を決定した。１％のＲＯＵＴ係数を有する自動外れ値除去を適用し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．０．１）を使用すること（失血）によって、平方和を加重した。

用量応答試験は、表１９に示されるように、それぞれビヒクル群および野生型非血友病群と比較して、試験されたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体について野生型マウスで観察された失血レベルに達する、失血の有意な低減を示した。ＥＣ_５０有効用量範囲の推定値は、表２０に掲示され、試験した３つの化合物全てについて、１ｋｇ用量当たりの低ｎモルで５０％の効果が観察されたため、高い効力を示す。

実施例１５：経口投与後の最適化された抗ＦＸ／抗ＦＩＸ（ａ）Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体のエクスビボ活性の決定
化合物番号６のＰＯ投与を特徴付けるための実施例１２からの野生型イヌにおける薬物動態（ＰＫ）研究に続いて、投与後３０分および９０分で、２つの別個の時点で発色活性を決定した。測定されたＦＶＩＩＩ模倣発色活性を、化合物番号６の血漿曝露と比較し、ＰＯ投与後の血清中の活性Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の割合を決定した。

化合物番号６の発色活性を、市販のＦＶＩＩＩ発色活性アッセイ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＨｙｐｈｅｎＢｉｏｍｅｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して決定し、イヌ血清試料を分析した。較正曲線については、化合物番号６を１０％イヌ血清にスパイク、血清試料を、同じアッセイを使用して１０倍希釈で分析した。最終活性の結果を、１０倍希釈に対して１０倍で補正した。化合物番号６の血漿曝露レベルを、抗Ｖ_ＨＨ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）および抗ガンマＧｌｕ－リンカー抗体（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した発光酸素チャンネリング（ＬＯＣＩ）アッセイによって定量化した。データを表２１に要約する。ＦＶＩＩＩ：Ｃ発色活性は、投与後３０分および９０分で、血清で測定可能であり、発色活性に基づく化合物番号６の定量化は、ＬＯＣＩアッセイを使用した化合物番号６の血漿曝露測定値に基づく推定と類似している。化合物番号６の定量化におけるいかなる不一致も、アッセイ感度の差異によって引き起こされると予測される。データは、ＰＯ投与されたＶ_ＨＨポリペプチド誘導体が、イヌにおける経口取り込み時に完全に活性であることを示し、例えば、血友病Ａを患う患者を治療するための経口的に利用可能なＦＶＩＩＩ模倣薬を作製する概念が可能であることを示す。

実施例１６：抗ＦＸＶＨＨ断片（化合物番号７６）の結晶化およびパラトープ／エピトープマッピング
本研究の目的は、化合物番号７６と指定されたＶ_ＨＨ断片（ＶＨＨ－１．１５）のパラトープ残基およびエピトープ残基を決定することであった。

結晶化
実施例４で特定されたヒトＦＸ（Ａｐｉｇｅｎｅｘから購入）の活性化ペプチド配列ａａ３１～３７に対応する、合成ペプチドＮ末端－ＮＰＦＤＬＬＤ－Ｃ末端と１：４のモル比で混合されたＣＨＯを使用して生産されたＶ_ＨＨ断片（化合物番号７６）の結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散技法を使用して成長させた。２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭＮａＣｌ中の２５０ｎｌの５．７５ｍｇ／ｍｌ複合体のタンパク質溶液を、２５０ｎｌの４％（ｖ／ｖ）Ｔａｃｓｉｍａｔｅ（１．８３０５Ｍマロン酸、０．２５Ｍ三塩基性クエン酸アンモニウム、０．１２Ｍコハク酸、０．３ＭＤＬ－リンゴ酸、０．４Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、０．５Ｍギ酸ナトリウム、および０．１６Ｍ二塩基性酒石酸アンモニウム）（ｐＨ５．０）、１２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３３５０（沈殿剤として）と混合し、８０μｌの沈殿剤でインキュベートした。１８℃で５日間のインキュベーション後、結晶化プレートを５℃に移した。結晶は３か月以内に現れた。

回折データ収集
結晶は、液体窒素中でフラッシュ冷却する前に、２０％のエチレングリコールを加えた沈殿剤中で凍結保護した。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＥｉｇｅｒ２１６Ｍ画素検出器を使用して、ＳｗｉｓｓＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅビームラインＸ１０ＳＡ（１．００００Å波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合、およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いて実施された（回析データ統計を表２２に要約する）。

構造の決定と精緻化
非対称単位は、２つの化合物番号７６：ＦＸＡＰ３１－３７複合体を含む。構造は、探索モデルとして関連するＶ_ＨＨの以前に決定された結晶構造を使用して、プログラムスイートＰｈｅｎｉｘ内に実装されたＰｈａｓｅｒを使用する分子置換によって決定した（実施例６を参照）。化合物番号７６の正しいアミノ酸配列を導入し、ＦＸＡＰ３１－３７は、全てＣＯＯＴを使用して、差分電子密度マップで手動で構築されたモデルであった。Ｐｈｅｎｉｘでの精密化およびＣＯＯＴでの手動再建のラウンド中、スレオニン残基１１７上のＯ－グリコシル化およびチロシン残基１０９の硫酸化が観察され、モデル化された。精緻化統計が表２２に示される。

エピトープおよびパラトープの決定
Ｖ_ＨＨポリペプチド（化合物番号７６）内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子を有することによって特徴付けられるＦＸ活性化ペプチド残基として定義される合成ペプチドのエピトープは、連続ナンバリングに基づく対応するＦＸ活性化ペプチド配列（配列番号２）による、合成ペプチドＮ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９からの以下の残基を含む。

合成ペプチド内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子（すなわち、非水素原子）を有することによって特徴付けられる化合物番号７６の残基として定義されるＶ_ＨＨ断片（化合物番号７６）のパラトープは、化合物番号７６からの以下の残基：Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｗ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ａ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ａ６１、Ａ９７、Ａ９８、Ｄ９９、Ｇ１０５、Ｌ１０７、Ｙ１０９（配列番号７３４）
（連続ナンバリング）を含む。

実施例１７：抗ＦＸＶＨＨ断片（化合物番号７７）の結晶化およびパラトープ／エピトープマッピング
本研究の目的は、化合物番号７７と指定されたＶ_ＨＨ断片（Ｖ_ＨＨ１．１３）のパラトープ残基およびエピトープ残基を決定することであった。

結晶化
ヒトＦＸ（Ａｐｉｇｅｎｅｘによって合成）の活性化ペプチド配列ａａ３１～３７に対応する、合成ペプチドＮ末端－ＮＰＦＤＬＬＤ－Ｃ末端と１：４のモル比で混合されたＣＨＯから生産されたＶ_ＨＨ断片（化合物番号７７）の結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散技法を使用して成長させた。２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭＮａＣｌ中の２５０ｎｌの６．１ｍｇ／ｍｌ複合体のタンパク質溶液を、２５０ｎｌの３％（ｖ／ｖ）Ｔａｃｓｉｍａｔｅ（１．８３０５Ｍマロン酸、０．２５Ｍ三塩基性クエン酸アンモニウム、０．１２Ｍコハク酸、０．３ＭＤＬ－リンゴ酸、０．４Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、０．５Ｍギ酸ナトリウム、および０．１６Ｍ二塩基性酒石酸アンモニウム）（ｐＨ４．０）、１１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０（沈殿剤として）と混合し、８０μｌの沈殿剤でインキュベートした。結晶は、５℃で、４日間のインキュベーションで現れた。

回折データ収集
結晶は、液体窒素中でフラッシュ冷却する前に、２０％のエチレングリコールを加えた沈殿剤中で凍結保護した。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＥｉｇｅｒ２１６Ｍ画素検出器を使用して、ＳｗｉｓｓＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅビームラインＸ１０ＳＡ（１．００００Å波長）で、１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合、およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いて実施された（回析データ統計を表２３に要約する）。

構造の決定と精緻化
非対称単位は、２つの化合物番号７７：ＦＸＡＰ３１－３７複合体を含む。構造は、探索モデルとして実施例１６の化合物番号７６：ＦＸＡＰ３１－３７の結晶構造からの完全非対称単位を使用して、プログラムスイートＰｈｅｎｉｘ内に実装されたＰｈａｓｅｒを使用する分子置換によって決定した。化合物番号７７の正しいアミノ酸配列を導入し、Ｐｈｅｎｉｘでの精緻化およびＣＯＯＴでの手動再建のラウンドを適用した。精緻化統計が表２３に示される。

エピトープおよびパラトープの決定
Ｖ_ＨＨ断片（化合物番号７７）内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子を有することによって特徴付けられるＦＸ活性化ペプチド残基として定義される合成ペプチドのエピトープは、連続ナンバリングに基づく対応するＦＸ活性化ペプチド配列（配列番号２）による、合成ペプチドＮ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９からの以下の残基を含む。

合成ペプチド内の重原子から４．０Å以内の距離に重原子（すなわち、非水素原子）を有することによって特徴付けられる化合物番号７７の残基として定義されるＶ_ＨＨ断片（化合物番号７７）のパラトープは、化合物番号７７からの以下の残基：
Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｗ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ａ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ａ６１、Ａ９７、Ａ９８、Ｄ９９、Ｇ１０５、Ｌ１０７、Ｙ１０９（配列番号７３５）
（連続ナンバリング）を含む。

実施例１８：二重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の定常状態のＦＸＡ生成動態
本研究の目的は、血液凝固促進リン脂質膜の存在下で、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を促進する能力に基づいて、抗ＦＩＸａ／ＦＸ二重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の血液凝固促進活性を決定することであった。試験した化合物を表２４に列挙し、エミシズマブＳＩＡを比較のために含めた。

各化合物の定常状態のＦＸａ生成活性は、所与の化合物濃度でのミカエリス・メンテン動態（ミカエリス定数（Ｋ_Ｍ）および一次速度定数（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ））のパラメータとして報告される。表２４に最終アッセイ濃度が示される化合物は、アッセイ緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ_２、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００（ｐＨ７．３）＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中で、０．１ｎＭヒト血漿由来ＦＩＸａ（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＵＳＡ）および２０μＭ２５：７５のホスファチジルセリン：ホスファチジルコリンリン脂質ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＵＳＡ）とともに５分間プレインキュベーションした。次いで、５００ｎＭで開始するヒト血漿由来ＦＸ（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＵＳＡ）の２倍連続希釈を添加することによって活性化を開始した。室温で７分の活性化の後、反応物（５０μｌ）を２５μｌのクエンチ緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、６０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＰＥＧ８０００（ｐＨ７．３）＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）の添加によりクエンチした。２５μｌの２ｍＭＳ－２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）を添加し、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度測定（ΔＯＤ／分）によって発色基質変換を測定することによって、生成されるＦＸａの量を判定した。同様に、遊離ＦＩＸａによるＦＸ活性化を、１０ｎＭのＦＩＸａ濃度および５～１０分の反応時間で決定した。４０５ｎｍで測定された吸収を対応するＦＸａ濃度に変換するために、０～５ｎＭ（５０μｌ）のＦＸａ標準曲線に、２５μｌのクエンチ緩衝液および２５μｌの２ｍＭＳ－２７６５発色基質を添加した後、４０５ｎｍでの吸収を上記のように記録した。ＦＸａ濃度の関数としてのΔＯＤ／分の線形回帰は、測定されたΔＯＤ／分をＦＸａ生成速度に変換するために使用され得るスロープを生成する。
ＦＸａ生成速度＝（ΔＯＤ／分）／（スロープ_{ＦＸａ標準曲線}＊反応時間）
ミカエリス・メンテン定常状態動態パラメータは、ＦＸａ生成速度をＦＸ（基質）濃度の関数として、以下の式に適合させることによって決定され、
ＦＸａ生成速度＝（ｋ_ｃａｔ＊［ＦＩＸａ］_ｔ＊［ＦＸ］_ｔ）／（Ｋ_Ｍ＋［ＦＸ］_ｔ）
式中、ｋ_ｃａｔは、酵素効率（分^－１）であり、［ＦＩＸａ］_ｔは、総ＦＩＸａ（酵素）濃度（ｎＭ）であり、［ＦＸ］_ｔ、総ＦＸ（基質）濃度（ｎＭ）であり、Ｋ_Ｍは、ミカエリス定数（ｎＭ）である。表２４は、試験された各化合物について決定された定常状態の動態定数ならびに試験された濃度を列挙する。

結論
試験された抗ＦＩＸａ／ＦＸ二重特異性Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体は全て、５ｎＭの最終濃度に補充された場合、Ｋ_Ｍを、遊離ＦＩＸａの２８１．５ｎＭから３．９～９．０ｎＭに減少させ、触媒効率を０．０００１２分^－１ｎＭ^－１から０．１４～０．３３分^－１ｎＭ^－１にさらに増加させる。比較すると、３００ｎＭのエミシズマブ－ＳＩＡは、Ｋ_Ｍを５３．５ｎＭに減少させる。

低減されたＫ_Ｍ値は、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体の有意な効力増加をもたらす、ＦＩＸ（ａ）／ＦＸの改善されたアセンブリ（空間配置）を反映する。全ての化合物を、期待される薬理学的関連濃度で試験する。

Claims

血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
少なくとも１つの延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
前記第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、かつ
前記第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８（連続ナンバリング）のうちの少なくとも１つを含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｅ２２４、Ｔ２２５、Ｇ２２６、Ｖ２５０、Ｉ２５１、Ｒ２５２、Ｉ２５３、Ｐ２５５、Ｈ２５７、およびＮ２６０（連続ナンバリング）を含む、第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型上のエピトープに結合することができ、
前記第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、およびＬ１７８（連続ナンバリング）を含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｎ１７３、Ｐ１７４、Ｆ１７５、Ｌ１７７、Ｌ１７８、およびＤ１７９（連続ナンバリング）を含む、第Ｘ因子（配列番号２）上のエピトープに結合することができる、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記第１のＩＳＶＤが、アミノ酸残基Ｆ２９、Ｎ３０、Ｙ３２、Ｔ５４、Ｄ９９、Ｒ１００、Ｓ１０１、Ｆ１０２、Ｌ１０３、Ｆ１０４、Ｑ１０６、Ａ１０７、およびＮ１１３（配列番号３５）を含むパラトープを含み、かつ
前記第２のＩＳＶＤが、アミノ酸残基
ａ）Ｄ３２、Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｙ３７、Ｌ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ｇ５０、Ｉ５１、Ｍ５２、Ｎ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ｔ６１、Ｋ９７、Ｖ９９、Ｒ１０１、およびＰ１０２（配列番号２７）、または
ｂ）Ａ３３、Ｍ３４、Ｇ３５、Ｗ４７、Ｖ４８、Ａ４９、Ａ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｎ５９、Ｙ６０、Ａ６１、Ａ９７、Ａ９８、Ｄ９９、Ｇ１０５、Ｌ１０７、およびＹ１０９（配列番号７３４）
（連続ナンバリング）を含むパラトープを含む、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記少なくとも１つの延長部分が、表面曝露アミノ酸残基に結合している、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記表面曝露残基が、ＣＤＲ領域における残基ではない、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ
式中、２つの延長部分が、Ｅ上の１つ以上の表面曝露アミノ酸残基に結合しており、
前記ＩＳＶＤポリペプチド誘導体の分子量が、２０～３５ｋＤａの範囲内である、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記第１のＩＳＶＤが、
１）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つまたは２つのアミノ酸置換を含むＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含むＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含むＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）（Ｋａｂａｔ定義）を含み、かつ
前記第２のＩＳＶＤが、
（Ａ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号１５２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１５４）（Ｋａｂａｔ定義）、または
（Ｂ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含むＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）（Ｋａｂａｔ定義）、または
（Ｃ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号３２）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３３）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＹＳＳＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号３４）（Ｋａｂａｔ定義）、または
（Ｄ）
ＣＤＲ１：任意選択で、１つもしくは２つのアミノ酸置換を含むＲＹＡＭＧ（配列番号４０）、
ＣＤＲ２：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４１）、
ＣＤＲ３：任意選択で、１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換を含むＤＤＳＳＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号４２）（Ｋａｂａｔ定義）を含む、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記置換が、保存的置換である、請求項８に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
表面曝露アミノ酸残基に結合した少なくとも１つの延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含み、
前記第１のＩＳＶＤが、
Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）、
Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）、または
Ｖ_ＨＨ－２．２（配列番号３５）の配列を含み、かつ、
前記第２のＩＳＶＤが、
Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）、
Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）、
Ｖ_ＨＨ－１．３（配列番号３１）、または
Ｖ_ＨＨ－１．４（配列番号３９）の配列を含む、血液凝固促進ＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記第１のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－２．１５の配列（配列番号１３１）を含み、かつ前記第２のＩＳＶＤが、Ｖ_ＨＨ－１．１５の配列（配列番号１２７）を含む、請求項１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
ＩＳＶＤ２－Ｌ_１－２－ＩＳＶＤ１－Ｅ
式中、２つの延長部分が、Ｅ上の１つ以上の表面曝露アミノ酸残基に結合しており、
前記ＩＳＶＤポリペプチド誘導体の分子量が、２０～３５ｋＤａの範囲内である、請求項１０または１１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、配列番号６２９を含み、
前記第１の延長部分が、以下の構造を含み、
かつ前記第２の延長部分が、以下の構造を含み、
式中、「＊」が、配列番号６２９の２５７位のＣｙｓであり、
式中、「＊＊」が、配列番号６２９の２５９位のＣｙｓである、請求項１０または１１に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
前記ＩＳＶＤポリペプチド誘導体が、Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体である、請求項１または１０に記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体。
血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体であって、
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＶ_ＨＨと、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＶ_ＨＨと、
前記第１のＶ_ＨＨおよび前記第２のＶ_ＨＨを連結するリンカー（Ｌ_１－２）と、
配列番号９を有するＣ末端延長部（Ｅ）と、を含み、
以下の式（Ｎ末端からＣ末端）を有し、
「第２のＶ_ＨＨ」－Ｌ_１－２－「第１のＶ_ＨＨ」－Ｅ
Ｅに結合した第１および第２の延長部分をさらに含み、
１）
前記第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）（Ｋａｂａｔ定義）を含み、かつ
前記第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＹＡＭＧ（配列番号１５２）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５３）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１５４）（Ｋａｂａｔ定義）を含むか、または
２）
前記第１のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１３２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３３）、
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１３４）（Ｋａｂａｔ定義）を含み、かつ
前記第２のＶ_ＨＨが、
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）（Ｋａｂａｔ定義）を含み、
前記第１の延長部分が、以下の構造を含み、
かつ前記第２の延長部分が、以下の構造を含み、
式中、「＊」が、配列番号６２９の２５７位のＣｙｓ（Ｃ）であり、
式中、「＊＊」が、配列番号６２９の２５９位のＣｙｓ（Ｃ）である、血液凝固促進Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体。
前記Ｖ_ＨＨポリペプチド誘導体が、配列番号６２９を含む、請求項１５に記載のＶ_ＨＨポリペプチド誘導体。
前記ＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体が、二重特異性ＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体である、請求項１、１０および１５のいずれかに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体。
請求項１、１０および１５のいずれかに記載のＩＳＶＤポリペプチド誘導体またはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体と、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。
前記組成物が、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
前記Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩が、Ｎ－（８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）であり、かつ
前記組成物が、ニコチンアミド（ＮＡＭ）をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
インヒビターが存在する、もしくは存在しない血友病Ａの治療、または後天性血友病Ａの治療に使用するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
前記組成物が、経口投与される、請求項２１に記載の医薬組成物。
ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）に結合することができ、かつＦＸ（配列番号２）に結合することができる、Ｖ_ＨＨポリペプチドまたはＶ_ＨＨポリペプチド誘導体の製造において使用される中間体であって、
前記中間体が、以下：
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１７２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７３）、および
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１７４）（Ｋａｂａｔ定義）；
ＣＤＲ１：ＲＹＡＭＧ（配列番号１５２）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５３）、および
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１５４）（Ｋａｂａｔ定義）；
ＣＤＲ１：ＩＹＴＭＳ（配列番号１３２）、
ＣＤＲ２：ＧＬＲＷＴＤＳＳＴＥＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３３）、および
ＣＤＲ３：ＤＲＳＦＬＦＡＱＡＬＧＡＴＫＮＹＥＹ（配列番号１３４）（Ｋａｂａｔ定義）；ならびに
ＣＤＲ１：ＲＬＡＭＧ（配列番号１２８）、
ＣＤＲ２：ＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２９）、および
ＣＤＲ３：ＤＤＳＶＧＤＧＹＬＤＹ（配列番号１３０）（Ｋａｂａｔ定義）から成る群から選択されるＣＤＲを含むＶ_ＨＨ断片；
または
以下：
Ｖ_ＨＨ－１．１８（配列番号１５１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１５（配列番号１２７）、
Ｖ_ＨＨ－１．１３（配列番号１１１）、
Ｖ_ＨＨ－１．１４（配列番号１１９）、
Ｖ_ＨＨ－１．１２（配列番号１０３）、
Ｖ_ＨＨ－１．３（配列番号３１）、
Ｖ_ＨＨ－１．４（配列番号３９）、
Ｖ_ＨＨ－２．２０（配列番号１７１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１８（配列番号１５５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１５（配列番号１３１）、
Ｖ_ＨＨ－２．１３（配列番号１１５）、
Ｖ_ＨＨ－２．１４（配列番号１２３）、
Ｖ_ＨＨ－２．１２（配列番号１０７）、
Ｖ_ＨＨ－２．２（配列番号３５）、および
Ｖ_ＨＨ－１．２０（配列番号１６７）から成る群から選択されるＶ_ＨＨ断片
である、中間体。
第ＩＸ因子（配列番号１）またはその活性型に結合することができる第１のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ１）と、
第Ｘ因子（配列番号２）またはその活性型に結合することができる第２のＩＳＶＤ（ＩＳＶＤ２）と、
延長部分と、
任意選択で、ＩＳＶＤ１およびＩＳＶＤ２を連結することができるリンカー（Ｌ_１－２）と、
任意選択で、１つ以上の延長部（Ｅ）と、を含む血液凝固促進免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の経口バイオアベイラビリティを増加させるための方法であって、
ａ．前記ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体のアミノ酸残基をコードする核酸を、前記ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体の等電点が低減されるように修飾する工程と、
ｂ．前記ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体をコードする前記核酸を発現するように宿主細胞を培養する工程と、
ｃ．前記宿主細胞培養物から前記ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を収集する工程と、
ｄ．標準クロマトグラフィーを使用して前記宿主細胞培養物から前記ＩＳＶＤポリペプチドまたはＩＳＶＤポリペプチド誘導体を精製する工程と、
ｅ．延長部分がまだ存在していない場合は、延長部分を前記ＩＳＶＤポリペプチドに結合する工程と、を含む、方法。