JP2024045297A - 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造 - Google Patents

低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造 Download PDF

Info

Publication number
JP2024045297A
JP2024045297A JP2024008489A JP2024008489A JP2024045297A JP 2024045297 A JP2024045297 A JP 2024045297A JP 2024008489 A JP2024008489 A JP 2024008489A JP 2024008489 A JP2024008489 A JP 2024008489A JP 2024045297 A JP2024045297 A JP 2024045297A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
seq
aunp
antibody
certain embodiments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2024008489A
Other languages
English (en)
Inventor
アデール，ジェニファー・イー
E Adair Jennifer
シャフバジ，レザ
SHAHBAZI Reza
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fred Hutchinson Cancer Center
Original Assignee
Fred Hutchinson Cancer Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fred Hutchinson Cancer Research Center filed Critical Fred Hutchinson Cancer Research Center
Publication of JP2024045297A publication Critical patent/JP2024045297A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】低操作又は最小操作にかけられた生物学的試料中の造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）集団を遺伝子改変する方法提供する。【解決手段】金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を、生物学的試料へと添加するステップを含む、生物学的試料中の造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）集団を遺伝子改変する方法であり、ＨＳＰＣ集団が、電気穿孔、ＨＤＴをコードするウイルスベクター又は磁気による細胞分離工程へと曝露されておらず、方法が、３０％以下のＨＳＰＣ細胞毒性を結果としてもたらし、ＨＳＰＣ集団内において、少なくとも１０％の遺伝子編集効率をもたらす、方法である。【選択図】なし

Description

本出願は、本明細書において、完全に明示された場合と同様に、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月５日に出願された、米国特許仮出願第６２／７７５，７２１号に対する優先権を主張する。
配列表に関する言明
本出願と関連する配列表は、紙のコピーの代わりに、テキストフォーマットにおいて提示され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、Ｆ０５３－００９１ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、２９６ＫＢであり、２０１９年１２月５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して、電子提出されている。
本開示の分野
本開示は、低操作（ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）又は最小操作（ｍｉｎｉｍａｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）を経た、選択された細胞型を遺伝子改変するナノ粒子を提示する。ナノ粒子は、正確なゲノム操作に要求される全ての構成要素を送達し、細胞を、治療目的で遺伝子操作する、現行の臨床的実践と関連する、多数の欠点を克服する。
患者特異的遺伝子治療は、遺伝子疾患、感染性疾患及び悪性疾患を処置する、大きな可能性を有する。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）への、レトロウイルス媒介型遺伝子付加は、最近１０年間にわたり、遺伝性免疫不全症（例えば、Ｘ連鎖アデノシンデアミナーゼ欠損性重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ））、異常ヘモグロビン症、ウィスコット－アルドリッチ症候群及び異染性白質ジストロフィーを含む、いくつかの遺伝子疾患について、治癒的転帰を示している。加えて、この処置法はまた、神経膠芽腫など、予後不良の診断に対する転帰も改善している。ドナーに由来する細胞とは異なり、遺伝子補正された、自家細胞又は「自己」細胞の使用により、移植片－宿主間の免疫反応の危険性を消失させる免疫抑制薬に対する必要性がなくなる。
臨床医学において使用されている、現行のシステムは、遺伝子編集構成要素を、ＨＳＣ及びＨＳＰＣ並びに他の血液細胞型へと送達するのに、最適の方法を欠く。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラットフォームは、ＨＳＰＣ内の遺伝子編集のために、臨床の背景において追求されつつある１つの手法である。目標が、遺伝子破壊である場合、遺伝子編集構成要素を送達するのに、電気穿孔だけが要求される。しかし、電気穿孔は、多くの細胞型に対して毒性であり、この毒性は、とりわけ、出発細胞数が少ない場合、ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを使用する治療にとって問題となる。
目標が、新たな遺伝子素材を挿入することである場合、相同性指向修復のためのＤＮＡ鋳型を組み入れなければならない。新たな遺伝子素材が、小型である場合、これは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型の電気穿孔により達せられうるが、大型の鋳型の場合、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の使用が、臨床実践における、現行の標準法である。電気穿孔が単独において使用されるのであれ、ＡＡＶと組み合わせて使用されるのであれ、送達される、個別の遺伝子編集構成要素の全てが、同じ細胞へと送達される保証は存在しない。さらに、電気穿孔は、細胞膜の機械的破壊及び透過化に依拠するため、細胞の生存を損ない、細胞は、治療的使用に理想的でなくなる。さらに、ウイルスベースの方法と同様に、電気穿孔も、遺伝子を、異質性のプールの中から、特異的な細胞型へと、選択的に送達するわけではないので、細胞選択工程及び精製工程を先行させなければならない。細胞選択工程及び精製工程は、過酷な工程であり、所望されない低度に高度な毒性レベルをもたらす。最後に、ＡＡＶ処置は、細胞が再注入される場合、免疫原性の可能性をもたらす。
遺伝子編集構成要素を送達する、任意の改善された方法であって、要求されるステップを簡略化することが可能であり、全ての構成要素が、意図された細胞型へと送達されることを確保しうる方法であれば、臨床医学の分野に対して、著明な改善となる。ポリプレックス及びリポプレックスなどのナノ粒子が提起されているが、これらは、毒性であり、遺伝子編集構成要素送達の限定的効率を示し、ＨＳＣ及びＨＳＰＣにおける遺伝子編集効能が限定的であることが示されている。
（発明の要旨）
本開示は、低／最小操作を経た、選択された細胞型の選択的遺伝子改変を可能とするナノ粒子（ＮＰ）を提示する。低操作とは、電気穿孔及びＡＡＶなどのウイルスベクターの使用が要求されないことを意味する。最小操作とは、電気穿孔、ウイルスベクター、並びに細胞選択工程及び精製工程の使用が要求されないことを意味する。さらに、本開示はまた、ゲノム編集に要求される全ての構成要素を送達するように、特異的に操作されたＮＰも提示する。ＮＰは、機能喪失突然変異が必要とされる治療に使用されうるが、重要なことは、また、遺伝子の付加又は特異的な突然変異の補正に必要とされる全ての構成要素ももたらしうることである。記載された手法は、安全であり（すなわち、オフターゲットの毒性をもたらさない）、信頼でき、スケーラブルであり、製造が容易であり、合成でき、プラグアンドプレイである（すなわち、同じ基本的プラットフォームが、異なる治療用核酸を送達するのに使用されうる）。
本明細書に提示された図面の多くは、カラーの場合に、よりよく理解される。本出願者は、カラー版を、元来の提出の一部と考え、図面の、本カラー画像に対する権利を、後続の手順においても保持する。
現行の、エクスビボにおける遺伝子編集のために臨床使用されている系が、ＨＳＣ、ＨＳＰＣ及び他の血液細胞に最適の送達方法を欠くことを示す図である。図１Ａに示されている通り、現行の、臨床使用されているプロトコールは、８つのステップ：（１）動員及びアフェレーシス；（２）標的細胞型（例えば、図１Ａにおける、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ）の免疫磁気分離；（３）培養培地中の、分離された細胞の、組換え増殖因子（ｒｈＧＦ）による刺激；（４）遺伝子編集構成要素（例えば、図１Ａにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質）を送達する、細胞の電気穿孔；（５）電気穿孔後の培養培地／ｒｈＧＦ中における、細胞のインキュベーション；（６）遺伝子編集用ドナー鋳型を保有するウイルスベクター（例えば、図１Ａにおける、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ））による形質導入；（７）培養培地／ｒｈＧＦ中における、細胞のさらなるインキュベーション；及び（８）前処置された患者への再注入のための、細胞の採取を含む。臨床薬の目標は、低／最小操作による製造である。 低操作による製造は、電気穿孔又はウイルスベクターの送達を要求しないが、なおも、標的細胞の精製工程を利用しうることを示す図である。図１Ｂに示されている通り、本明細書において開示されたＮＰを使用して、図１Ａのステップ３～６への依拠を低減することができる。 最小操作による、エクスビボにおける製造が、選択された細胞型の分離、電気穿孔又はウイルスに媒介された遺伝子編集構成要素の送達を要求せず、このため、エクスビボにおける細胞製造の効率を、大幅に改善することを示す図である。ターゲティングリガンドを伴う、本明細書において開示されたＮＰは、図１Ａのステップ２～７への依拠を、さらに低減し、細胞選択工程及び精製工程の使用を要求しない。 （先行技術）ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋細胞が、血液再増殖の一因となることを示す図である。非ヒト霊長動物ＣＤ３４＋細胞を、フロー分取により、画分ｉ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋）、ｉｉ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０－）及びｉｉｉ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９０－）へと分離し、次いで、これらの細胞へと、緑色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＣｅｒｕｌｅａｎをコードするＬＶを形質導入し、これらの細胞を、骨髄破壊された自家レシピエントへと移植した。全ての場合において、血液細胞の生着は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋（画分ｉ）細胞だけに対応した。 （先行技術）体重ｋｇ当たりの、移植ＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋細胞個数の、好中球及び血小板の生着（スピアマンのランク相関係数であるＲ２：０．０～０．１９＝極めて弱い、０．２０～０．３９＝弱い、０．４～０．５９＝中程度、０．６～０．７９＝強い、０．８～１．０＝極めて強い）との、対数による相関を示す図である。線形回帰及び９５％の信頼区間を、それぞれ、実線及び点線により指し示す。 ＡｕＮＰのサイズが、ヒトへと投与された場合における、目的組織／消失経路を決定することを示す図である。 ＮＰの合成及び構造を表す概略図である。（図５Ａ）インビボにおける適合性が確立された、スケーラブルな合成送達土台である、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）のための、初期作製スキームの概略を示す図である。 ＮＰの合成及び構造を表す概略図である。（図５Ｂ）例示的な遺伝子編集構成要素を伴うＡｕＮＰを創出し、ロードするための合成工程についての概略表示である。描示された、１つのＡｕＮＰは、ＡｕＮＰ表面へと接合されたｃｒＲＮＡを示す。次いで、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及びｓｓＤＮＡを、ｃｒＲＮＡへと接合させる。描示された、別のＡｕＮＰは、１９ｎｍのＡｕＮＰコアの表面へと接合された、チオール修飾を伴う、１８エチレングリコールスペーサーへと連結されたｃｒＲＮＡを示す。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ｃＲＮＡへと接合させて、ＲＮＰを形成する。ＡｕＮＰを、低分子量（ＭＷ（例えば、２０００））のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりコーティングする。ｓｓＤＮＡを、ＰＥＩによりコーティングされた表面上に積層させる。 ＮＰの合成及び構造を表す概略図である。（図５Ｃ）Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰのアセンブリー工程についての概略表示である。１）ＡｕＮＰコアを、合成及び精製する。２）スペーサーアーム及びチオール基を伴うｃｒＲＮＡを、金（Ａｕ）コアの表面へとコンジュゲートする。３）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの、ｃｒＲＮＡとの相互作用により、ＲＮＰ複合体を、表面上に形成する。４）ＲＮＰ複合体を、２ＫＭＷのＰＥＩによりコーティングする。５）ＰＥＩとの静電相互作用により、ｓｓＤＮＡ鋳型を、表面上に捕捉させる。 ＮＰの合成及び構造を表す概略図である。（図５Ｄ）本明細書において記載されるＡｕＮＰについて描示する、さらなる概略図である。 選択された細胞をターゲティングするリガンドを伴う、例示的なＡｕＮＰを示す図である。（図６Ａ）遺伝子の付加及び細胞のターゲティングのための、全ての構成要素を伴って構成された、例示的なＡｕＮＰについての描示を示す図である。描示された構成要素は、治療用核酸配列（例えば、遺伝子又はこの補正部分）をもたらす、ｃｒＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。ターゲティングリガンドは、アプタマーを含む。 選択された細胞をターゲティングするリガンドを伴う、例示的なＡｕＮＰを示す図である。（図６Ｂ）相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）、治療用ＤＮＡ配列及び他の潜在的エレメントを含むドナー鋳型など、大型のオリゴヌクレオチドを送達するのに使用されうる、代替的な、製剤化された「層状」ＡｕＮＰについての概略図である。ドナー鋳型は、描示されたリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）より、ＡｕＮＰ表面から離れて配置される。アプタマーによるターゲティングリガンドもまた、描示される。 選択された細胞をターゲティングするリガンドを伴う、例示的なＡｕＮＰを示す図である。（図６Ｃ）図５Ｄに表されたデザインであって、アプタマーによるターゲティングリガンドが、直接的なアミノ酸連結を介して、ヌクレアーゼへと接合されたデザインを示す図である。 選択された細胞をターゲティングするリガンドを伴う、例示的なＡｕＮＰを示す図である。（図６Ｄ）図５Ｄに表されたデザインであって、アプタマーによるターゲティングリガンドが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）テザーを介して、ヌクレアーゼへと接合されたデザインを示す図である。 選択された細胞をターゲティングするリガンドを伴う、例示的なＡｕＮＰを示す図である。（図６Ｅ）図５Ｄに表されたデザインであって、抗体によるターゲティングリガンドが、アミン－スルフヒドリル間架橋剤又は直接的なアミノ酸連結を介して、ヌクレアーゼへと接合されたデザインを示す図である。ＰＥＧテザーを介して接合された、抗体によるターゲティングリガンド、もまた提示される。 ＣＣＲ５遺伝子上の標的遺伝子座を示す図である。（図７Ａ）標的遺伝子座が、中央部において、２０ｂｐのガイドセグメント（配列番号１）を伴う、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の両方のためのＰＡＭ部位を有することを示す図である。 ＣＣＲ５遺伝子上の標的遺伝子座を示す図である。（図７Ｂ）ＨＤＴを、８ｂｐのＮｏｔＩ認識配列インサート及び４０ｂｐの長さの、対称性の相同性アーム（配列番号２）を伴う切断部位の近傍にデザインしたことを示す図である。 γ－グロビン遺伝子プロモーター内の標的遺伝子座を示す図である。（図８Ａ）標的遺伝子座が、中央部において、２１ｂｐのガイドセグメント（配列番号３）を伴う、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の両方のためのＰＡＭ部位を有することを示す図である。 γ－グロビン遺伝子プロモーター内の標的遺伝子座を示す図である。（図８Ｂ）ＨＤＴを、１３ｂｐのＨＰＦＨ欠失及び３０ｂｐの長さの、対称性の相同性アーム（配列番号４）を伴う切断部位の近傍にデザインしたことを示す図である。 完全ロードＡｕＮＰが、単分散性であり、良好なゼータ電位を提示することを示す図である。 合成されたＡｕＮＰの特徴的特性及び最適のローディング濃度を示す、グラフ及びデジタル画像である。（図１０Ａ）合成されたＡｕＮＰの局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）ピークを示す図である。 合成されたＡｕＮＰの特徴的特性及び最適のローディング濃度を示す、グラフ及びデジタル画像である。（図１０Ｂ）ＡｕＮＰ及びＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰのＬＳＰＲピークを示す図である。 合成されたＡｕＮＰの特徴的特性及び最適のローディング濃度を示す、グラフ及びデジタル画像である。（図１０Ｃ）ＡｕＮＰ／ｓｓＤＮＡの、最適のｗ／ｗローディング比を示すゲル電気泳動を示す図である。 合成されたＡｕＮＰの特徴的特性及び最適のローディング濃度を示す、グラフ及びデジタル画像である。（図１０Ｄ）Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰのローディング濃度を示す図である。 最適のローディング濃度を示す図である。（図１１Ａ）５０ｎｍのＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ（比：６）；１５ｎｍのＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ（比：１）及び１５ｎｍのＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ／Ｃｐｆ１／ＰＥＩ／ＤＮＡ（比：０．５）を示す図である。 最適のローディング濃度を示す図である。（図１１Ａ）５０ｎｍのＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ（比：６）；１５ｎｍのＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ（比：１）及び１５ｎｍのＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ／Ｃｐｆ１／ＰＥＩ／ＤＮＡ（比：０．５）を示す図である。 最適のローディング濃度を示す図である。（図１１Ｂ）出発試薬量が同じであっても、小型のＡｕＮＰは、接触可能な表面積を３倍にすることを示す図である。サイズを減少させることにより、ＮＰの表面積及びコンジュゲーション比は増大する。 ＣＲＩＳＰＲ構成要素の、ＡｕＮＰへの、層ごとのコンジュゲーションを示す図である。 各積層ステップの後における、動的光散乱による、ＡｕＮＰの特徴付けを示す図である。各層を添加した後における、鋭い単一のピーク及びサイズのシフトは、表面への正確な接合を裏付ける。 ＡｕＮＰ各積層ステップの後における、平均サイズ（Ｚ平均；右軸上にプロットされた棒グラフ）及び多分散性指数（ＰＤＩ；左軸上にプロットされたドット）を示す図である。＜０．２のＰＤＩ値は、凝集を伴わない、高度の単分散性を示す。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 各構成要素を添加した後のＡｕＮＰについてのＬＳＰＲにおける赤方シフトが、カーゴのローディングを確認することを示す図である。 各層を添加した後における、ゼータ電位の測定値が、ＡｕＮＰについての－２６ｍＶから、最終的なＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰについての＋２７ｍＶに変化したことを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 Ｃｐｆ１及びｓｓＤＮＡの最適量についての特徴付けを示す図である。（図１３Ａ）ＡｕＮＰ／Ｃｐｆ１のｗ／ｗ比が異なる場合における、ＮＰについてのサイズ解析を示す図である。測定は、三連において行った。 Ｃｐｆ１及びｓｓＤＮＡの最適量についての特徴付けを示す図である。（図１３Ｂ）ＡｕＮＰ／Ｃｐｆ１のｗ／ｗ比が異なる場合における、Ｚ平均及びＰＤＩ値を示す図である。ＡｕＮＰ／Ｃｐｆ１のｗ／ｗ比０．６が、サイズ及びＰＤＩに関して、最適であることが見出された。測定は、三連において行った。 Ｃｐｆ１及びｓｓＤＮＡの最適量についての特徴付けを示す図である。（図１３Ｃ）ＡｕＮＰ／ｓｓＤＮＡのｗ／ｗ比が異なる場合における、ＮＰについてのサイズ解析を示す図である。測定は、三連において行った。 Ｃｐｆ１及びｓｓＤＮＡの最適量についての特徴付けを示す図である。（図１３Ｄ）ＡｕＮＰ／ｓｓＤＮＡのｗ／ｗ比が異なる場合における、Ｚ平均及びＰＤＩ値を示す図である。ＡｕＮＰ／ｓｓＤＮＡのｗ／ｗ比１が、サイズ及びＰＤＩに関して、最適であることが見出された。測定は、三連において行った。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ構成要素を、ＨＳＰＣの核へと送達しうることを示す図である。（図１４Ａ）ＨＳＰＣが、インビトロにおいて、完全ロードＡｕＮＰを取り込むことを示す図である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ構成要素を、ＨＳＰＣの核へと送達しうることを示す図である。（図１４Ｂ）Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰの、培養物への添加後における、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣの核（青、Ｈｏｅｃｈｓｔ）を示す図である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ構成要素を、ＨＳＰＣの核へと送達しうることを示す図である。（図１４Ｃ）フルオロフォアでタグづけされたｃｒＲＮＡ（緑、Ａｌｅｘａ４８８）を使用して、細胞の細胞質内及び核内の生体内分布を追跡したことを示す図である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ構成要素を、ＨＳＰＣの核へと送達しうることを示す図である。（図１４Ｄ）フルオロフォアでタグづけされたｓｓＤＮＡ（赤、Ａｌｅｘａ６６０）もまた、細胞質内及び核内のいずれにも存在したことを示す図である。画像の最左側における、目視可能な小型の小胞は、エンドサイトーシスによる受動的取込みを示唆する。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ構成要素を、ＨＳＰＣの核へと送達しうることを示す図である。（図１４Ｅ）３つの染色全ての重合せが、ｃｒＲＮＡとｓｓＤＮＡとの共局在を示した図である。画像は、Ｚ－Ｓｔａｃｋモード及び６０倍の倍率の共焦点顕微鏡により収集した。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣに対して、非毒性であることを示す図である。（図１５Ａ、１５Ｂ）２４時間後（上パネル）４８時間後（下パネル）における、生存－死滅生存率アッセイの結果を示す図である。細胞生存率は、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ処置群について、７０％を上回り、モック処置群と同様であった。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣに対して、非毒性であることを示す図である。（図１５Ａ、１５Ｂ）２４時間後（上パネル）４８時間後（下パネル）における、生存－死滅生存率アッセイの結果を示す図である。細胞生存率は、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ処置群について、７０％を上回り、モック処置群と同様であった。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣに対して、非毒性であることを示す図である。（図１５Ｃ）トリパンブルー染料除外アッセイによる細胞生存率を示す図である。アッセイ結果は、生存－死滅アッセイ結果と緊密に相関した。 Ｋ５６２細胞内及びＣＤ３４＋細胞内の、遺伝子切断効率を示すグラフを示す図である。（図１６Ａ）ＡｕＮＰ方法及び電気穿孔方法による送達の後における生存率パーセントを示す図である。 Ｋ５６２細胞内及びＣＤ３４＋細胞内の、遺伝子切断効率を示すグラフを示す図である。（図１６Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ構成要素の投与用量を示す図である。 Ｋ５６２細胞内及びＣＤ３４＋細胞内の、遺伝子切断効率を示すグラフを示す図である。（図１６Ｃ、１６Ｄ）Ｋ５６２細胞内及びＣＤ３４＋細胞内の切断効率パーセントを示す、ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）アッセイの結果を示す図である。 Ｋ５６２細胞内及びＣＤ３４＋細胞内の、遺伝子切断効率を示すグラフを示す図である。（図１６Ｃ、１６Ｄ）Ｋ５６２細胞内及びＣＤ３４＋細胞内の切断効率パーセントを示す、ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）アッセイの結果を示す図である。 最大において、１０％の遺伝子編集及びＨＤＲが、Ｇ－ＣＳＦにより動員された、健常成人ドナーから得られた、インビトロにおける初代ＣＤ３４＋細胞内において観察されたことを示す図である。急速融解方法を使用して、ＣＤ３４＋細胞を融解させ、１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中において、終夜培養した。翌朝、ＡｕＮＰを播種し、以下の通りにアセンブルした：播種する；ＰＥＧスペーサーを伴うｃｒＲＮＡを添加して、静電斥力を防止する；Ｃｐｆ１タンパク質を添加し、ＲＮＰが形成されることを可能とする；２Ｋの分枝状ＰＥＩ及び一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）によりコーティングする。この例において、接合のために、ＡｕＮＰ表面との共有結合を促進する、末端のチオール付加以外に、ｃｒＲＮＡの化学修飾はなされなかった。この例において、ＣＣＲ５標的遺伝子座に対する相同性（対称性）を有する、４０ｎｔにより挟まれたＮｏｔＩ部位を使用する８ｂｐのインサートであるｓｓＯＤＮを、ＨＤＴとして使用した。製剤化されたＡｕＮＰを、細胞へと添加し、プレートを、静かに混合しながら、４８時間にわたりインキュベートした。４８時間後、細胞を採取し、洗浄し、ＰＣＲ増幅及び解析のために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。 最大において、１０％の遺伝子編集及びＨＤＲが、Ｇ－ＣＳＦにより動員された、健常成人ドナーから得られた、インビトロにおける初代ＣＤ３４＋細胞内において観察されたことを示す図である。急速融解方法を使用して、ＣＤ３４＋細胞を融解させ、１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中において、終夜培養した。翌朝、ＡｕＮＰを播種し、以下の通りにアセンブルした：播種する；ＰＥＧスペーサーを伴うｃｒＲＮＡを添加して、静電斥力を防止する；Ｃｐｆ１タンパク質を添加し、ＲＮＰが形成されることを可能とする；２Ｋの分枝状ＰＥＩ及び一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）によりコーティングする。この例において、接合のために、ＡｕＮＰ表面との共有結合を促進する、末端のチオール付加以外に、ｃｒＲＮＡの化学修飾はなされなかった。この例において、ＣＣＲ５標的遺伝子座に対する相同性（対称性）を有する、４０ｎｔにより挟まれたＮｏｔＩ部位を使用する８ｂｐのインサートであるｓｓＯＤＮを、ＨＤＴとして使用した。製剤化されたＡｕＮＰを、細胞へと添加し、プレートを、静かに混合しながら、４８時間にわたりインキュベートした。４８時間後、細胞を採取し、洗浄し、ＰＣＲ増幅及び解析のために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。 ＣＤ３４＋細胞内の、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ（１５ｎｍ、５０ｎｍ及び１００ｎｍ）による編集の後におけるインデルを示すＴＩＤＥアッセイの結果を示す図である。 ＣＤ３４＋細胞内の、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ（１５ｎｍ、５０ｎｍ及び１００ｎｍ）による編集の後におけるインデルを示すＴＩＤＥアッセイの結果を示す図である。 ＣＤ３４＋細胞内の、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ（１５ｎｍ、５０ｎｍ及び１００ｎｍ）による編集の後におけるインデルを示すＴＩＤＥアッセイの結果を示す図である。 ＮＳＧマウスへと移植された細胞についてのインビトロ解析を示す図である。（図１９Ａ）移植時の、ヒトＣＤ３４＋細胞内の、標的遺伝子座において、１０％ＨＤＲが、ＴＩＤＥにより、著明なインデルを伴わずに観察されたことを示す図である。 ＮＳＧマウスへと移植された細胞についてのインビトロ解析を示す図である。（図１９Ｂ）Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）及びＮｏｔＩの両方による制限消化物が、完全ロードＡｕＮＰを施された細胞内だけにおいて観察されたことを示す図である。 ＮＳＧマウスへと移植された細胞についてのインビトロ解析を示す図である。（図１９Ｃ）興味深いことに、このドナーについての、コロニー形成能の増大が、細胞を、ＡｕＮＰにより処置した場合に限り認められたことを示す図である。各条件にわたり形成されたコロニーの種類に、有意差は、観察されなかった。 移植後早期の解析が、遺伝子編集された細胞の生着を示唆することを示す図である。移植の６週間後に、ｇＤＮＡ解析のために、末梢血を回収した。完全ロードＡｕＮＰにより処置された、全てのマウスを通して、１０匹中７匹が、ＴＩＤＥにより検出可能な、０．５～６％の範囲の編集を提示した。１匹のマウス（全編集に対する５％）において、ＴＩＤＥ解析により、１．７％のＨＤＲを観察した。 ＨＤＲ条件の最適化及び最適の編集投与量を示す図である。（図２１Ａ）非標的鎖のためにデザインされたＨＤＴが、高レベルのＮｏｔＩ挿入を提示することを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 ＨＤＲ条件の最適化及び最適の編集投与量を示す図である。（図２１Ｂ）関連する消化バンドを示す、Ｔ７ＥＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素消化を示す図である。 ＨＤＲ条件の最適化及び最適の編集投与量を示す図である。（図２１Ｃ）異なるＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ濃度の、初代ヒトＨＳＰＣ内のＨＤＲに対する効果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 ＨＤＲ条件の最適化及び最適の編集投与量を示す図である。（図２１Ｄ）２０μｇ／ｍＬを超える濃度が、ＣＤ３４＋細胞に対して、毒性作用を及ぼしたことを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 異なる血清条件及びトランスフェクション構成要素の、遺伝子編集に対する効果を示す図である。（図２２Ａ）異なる条件下の処置の４８時間後における細胞生存率を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 異なる血清条件及びトランスフェクション構成要素の、遺伝子編集に対する効果を示す図である。（図２２Ｂ）ＴＩＤＥアッセイによる、全編集レベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 異なる血清条件及びトランスフェクション構成要素の、遺伝子編集に対する効果を示す図である。（図２２Ｃ）ＴＩＤＥアッセイによる、ＨＤＲレベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 Ｃｐｆ１を保有するＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＨＤＲに関して、Ｃａｓ９より高性能であることを示す図である。（図２３Ａ）ＴＩＤＥアッセイによる全編集結果を示す図である。Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰは、ＣＣＲ５遺伝子座において、Ｃａｓ９による切断効率を改善した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 Ｃｐｆ１を保有するＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＨＤＲに関して、Ｃａｓ９より高性能であることを示す図である。（図２３Ｂ）ＴＩＤＥアッセイによるＨＤＲ結果が、Ｃｐｆ１を使用したところ、Ｃａｓ９と比較して、高レベルのＮｏｔＩ挿入を示した図である。Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰにより送達されたＣｐｆ１及びＣａｓ９のいずれについて観察されたＨＤＲのレベルも、電気穿孔より高レベルであった。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 Ｃｐｆ１を保有するＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＨＤＲに関して、Ｃａｓ９より高性能であることを示す図である。（図２３Ｃ）Ｍｉｓｅｑ解析が、ＴＩＤＥアッセイにより観察された傾向を確認したことを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 Ｃｐｆ１を保有するＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＨＤＲに関して、Ｃａｓ９より高性能であることを示す図である。（図２３Ｄ）Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ方法及び電気穿孔方法を使用する、ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９による処置の後における、ＣＤ３４＋細胞の細胞生存率を示す図である。細胞生存率は、全ての研究群について、７０％を上回った。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。統計学的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを行うことにより決定した。 Ｃｐｆ１を保有するＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＨＤＲに関して、Ｃａｓ９より高性能であることを示す図である。（図２３Ｅ）全コロニー数を示す、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 Ｃｐｆ１を保有するＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、ＨＤＲに関して、Ｃａｓ９より高性能であることを示す図である。（図２３Ｆ）異なるコロニーの百分率を示す、ＣＦＣアッセイの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 長期にわたる、前駆細胞のコロニー形成可能性に対する、処置の効果を示す、再播種ＣＦＣアッセイを示す図である。（図２４Ａ）全コロニー数を示す、ＣＦＣアッセイの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 長期にわたる、前駆細胞のコロニー形成可能性に対する、処置の効果を示す、再播種ＣＦＣアッセイを示す図である。（図２４Ｂ）異なるコロニーの百分率を示す、ＣＦＣアッセイの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 Ｍｉｓｅｑ解析による、γ－グロビン遺伝子プロモーター内の標的遺伝子座のＨＤＲ結果が、Ｃｐｆ１について、Ｃａｓ９と比較して、高レベルの１３ｂｐ欠失プロファイルを示した図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 ＡｕＮＰ処置ＣＤ３４＋細胞が、インビボにおいて生着することを示す図である。ＣＤ３４＋細胞が、まず、異なるヒトドナーから得られたことを除き、図１７に関して記載された手順と同じ手順を使用した。４８時間後、細胞を採取し、洗浄し、致死線量未満において照射された、成体（８～１２週齢）ＮＳＧマウスへと注入した。予備細胞を使用して、プレートコロニーアッセイを評価し、ＰＣＲ増幅及び解析のために、ｇＤＮＡを単離した。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ａ、２７Ｂ）ＮＳＧレシピエントの末梢血中の、ヒトＣＤ４５発現細胞の百分率により測定された生着を示す図である。ＡｕＮＰ処置細胞及びＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ処置細胞は、モック処置細胞より良好に生着した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック、ｎ＝４：非注射）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ａ、２７Ｂ）ＮＳＧレシピエントの末梢血中の、ヒトＣＤ４５発現細胞の百分率により測定された生着を示す図である。ＡｕＮＰ処置細胞及びＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ処置細胞は、モック処置細胞より良好に生着した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック、ｎ＝４：非注射）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ｃ）末梢血中の、ヒトＣＤ２０＋Ｂ細胞生着の動態を示す図である。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ｄ）末梢血中の、ヒトＣＤ１４＋単球生着の動態を示す図である。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ｅ）末梢血中の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞生着の動態を示す図である。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ｆ）骨髄試料について、全コロニー数を示す、ＣＦＣアッセイを示す図である。ＣＦＣ結果は、生着結果と緊密に相関した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 ＡｕＮＰ処置が、ＮＳＧマウスにおける、ＨＳＰＣの生着を増強したことを示す図である。（図２７Ｇ）異なる形状の頻度を示す、ＣＦＣアッセイの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 マウスの体重が、研究の経過にわたり、安定であったことを示す図である。マウスの体重の、異なるコホートについての追跡である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック、ｎ＝４：非注射）である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置後における、剖検試料中の、細胞集団の生着レベルを示す図である。（図２９Ａ）骨髄中の生着レベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック）である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置後における、剖検試料中の、細胞集団の生着レベルを示す図である。（図２９Ｂ）脾臓内の生着レベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック）である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置後における、剖検試料中の、細胞集団の生着レベルを示す図である。（図２９Ｃ）胸腺内の生着レベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック）である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置後における、剖検試料中の、細胞集団の生着レベルを示す図である。（図２９Ｄ）末梢血内の生着レベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０：Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ、ｎ＝１０：ＡｕＮＰ、ｎ＝５：モック）である。 生着前における、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ処置細胞のコロニー形成可能性を示す図である。生着前における、全コロニー数を示すＣＦＣアッセイである。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。統計学的有意性は、２標本ｔ検定により決定した。 異なるコロニーの百分率を示す、ＣＦＣアッセイの結果を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝３）である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置の後における、代表的なコロニー形状を示す図である。赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）、顆粒球／単球（ＧＭ）である。 生着後における、編集レベルの持続を示す図である。（図３２Ａ）生着前における、全編集レベル及びＨＤＲレベルについての、ＴＩＤＥアッセイの結果を示す図である。 生着後における、編集レベルの持続を示す図である。（図３２Ｂ）全編集レベルの追跡を示す図である。移植の４週間後から、末梢血試料を、隔週において回収した。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０）である。 生着後における、編集レベルの持続を示す図である。（図３２Ｃ）生着後におけるＨＤＲレベルの追跡を示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０）である。 生着後における、編集レベルの持続を示す図である。（３２Ｄ）剖検時における、末梢血中、骨髄中及び脾臓中の、全編集レベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０）である。 生着後における、編集レベルの持続を示す図である。（３２Ｅ）剖検時における、末梢血中、骨髄中及び脾臓中の、ＨＤＲレベルを示す図である。データは、平均値±標準誤差（ｎ＝１０）である。 Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置の後における、ＮｏｔＩ及びＴ７ＥＩによる制限酵素消化を示す図である。 ｃｒＲＮＡ、ＨＤＴ及びプライマーの配列（配列番号５～１９）を示す図である。 Ｃｐｆ１及びＣａｓ９についての、ＣＣＲ５標的部位上及びγ－グロビン標的部位上の、潜在的なオフターゲット切断部位（配列番号２０～２７）を示す図である。 遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）のための、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１によるガイド並びにＨＤＲ鋳型（配列番号２８～５２及び２１４～２２４）を示す図である。各ガイド配列は、特異的な突然変異にわたる。ｃｒＲＮＡ合成のために使用されうる、標的ＤＮＡ配列が提示される。 遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）のための、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１によるガイド並びにＨＤＲ鋳型（配列番号２８～５２及び２１４～２２４）を示す図である。各ガイド配列は、特異的な突然変異にわたる。ｃｒＲＮＡ合成のために使用されうる、標的ＤＮＡ配列が提示される。 遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）のための、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１によるガイド並びにＨＤＲ鋳型（配列番号２８～５２及び２１４～２２４）を示す図である。各ガイド配列は、特異的な突然変異にわたる。ｃｒＲＮＡ合成のために使用されうる、標的ＤＮＡ配列が提示される。 遺伝子操作のためのＤＮＡ標的部位（配列番号２０～２２、２４～２６、２８～３２、４２、４３、８４～９７及び２１４～２２４）から転写されたＲＮＡ配列（配列番号２２５～２６２）を示す図である。 遺伝子操作のためのＤＮＡ標的部位（配列番号２０～２２、２４～２６、２８～３２、４２、４３、８４～９７及び２１４～２２４）から転写されたＲＮＡ配列（配列番号２２５～２６２）を示す図である。 ＤＮＡ標的部位、ｃＲＮＡ配列及びＨＤＴの相補性のセットを提示する表である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。 本開示を裏書きする、さらなる配列（配列番号１１２～１３８）を示す図である。
遺伝子治療は、遺伝子疾患、感染性疾患及び悪性疾患を処置する、大きな可能性を有する。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）への、レトロウイルス媒介型遺伝子付加は、最近１０年間にわたり、遺伝性免疫不全症（例えば、Ｘ連鎖アデノシンデアミナーゼ欠損性重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ））、異常ヘモグロビン症、ウィスコット－アルドリッチ症候群及び異染性白質ジストロフィーを含む、いくつかの遺伝子疾患について、治癒的転帰を示している。加えて、この処置法はまた、神経膠芽腫など、予後不良の診断に対する転帰も改善している。ドナーに由来する細胞ではない、遺伝子補正された、自家細胞又は「自己」細胞の使用により、移植片－宿主間の免疫反応危険性を含む、細胞ベースの遺伝子治療の多くの危険性を消失させる、免疫抑制薬に対する必要性がなくなる。
現在のところ、臨床システムは、遺伝子編集構成要素を、多くの細胞型へと送達するのに、最適の方法を欠く。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）のために、最新技術は、骨髄吸引物又は動員末梢血を介する、患者からの細胞の除去、表面マーカーであるＣＤ３４を発現する細胞の免疫選択による、このバルク集団の、自家ＨＳＰＣについての分取、次いで、サイトカインの存在下における、これらの細胞の培養を含む。目標が、既存の、問題となる遺伝子の破壊である場合、遺伝子編集構成要素を、細胞へと送達するのに、電気穿孔が使用される。電気穿孔とは、一般に、細胞膜の透過性を増大させて、細胞へと導入される分子の通過を可能とするように、電界を、細胞へと印加することを指す。電気穿孔は、多くの細胞型に対して毒性であり、この毒性は、とりわけ、出発細胞数が少ない場合、ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを使用する治療にとって問題となる。
目標が、細胞へと、新たな遺伝子素材を挿入することである場合、相同性指向修復のためのＤＮＡ鋳型もまた、組み入れなければならない。新たな遺伝子素材が、小型である場合、これは、電気穿孔単独により達せられうるが、大型形態の遺伝子素材のために、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）のさらなる使用が、臨床実践における、現行の標準法である。遺伝子導入のための、ウイルスベクターの使用と関連する、公知の遺伝毒性の危険性及び他の限界が、依然として存在する。例えば、遺伝毒性の危険性は、ＨＳＰＣ遺伝子治療により処置された患者における、挿入による突然変異誘発に起因する悪性腫瘍の発症により証拠立てられている。この有害副作用は、宿主細胞ゲノムへの、レトロウイルス媒介型トランス遺伝子送達の、半ランダム性から生じる。挿入されたトランス遺伝子配列による、近傍遺伝子の調節異常は、一部の遺伝子治療患者において観察された、クローン拡大及び悪性形質転換の分子的基礎となっているが、挿入されたトランス遺伝子と、周囲のゲノムコンテキストとの相互作用はまた、トランス遺伝子の減弱又はサイレンシングも引き起こし、治療効果を減少させる場合もある。特定のウイルスベクターの使用と関連する、他の限界は、免疫反応の誘導、時間経過にわたる、分裂細胞内の、効能の低下（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）、インビボにおいて、選択された細胞型を、十分にターゲティングできないこと（例えば、レトロウイルスベクター）及び、指し示された通り、挿入部位及び挿入の数を制御できないこと（例えば、レンチウイルスベクター）を含む。
最近の数年間は、特異的なＤＮＡ配列をターゲティングし、ターゲティングされた配列において、予測可能に、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を作出する、操作ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼの開発により可能とされた、レトロウイルス媒介型遺伝子導入に対する、より安全な代替法としての、遺伝子編集において、爆発的発展を見た。今日、問題となる遺伝子（すなわち、機能喪失突然変異を発生させる遺伝子）の、除去又はサイレンシングが必要とされる場合、これらのプログラム化可能な複合体は、有望な治療をもたらすのに、最も効果的となっている。これは、ＤＳＢが、ＤＳＢ部位において、オリゴヌクレオチドの挿入及び欠失（インデル）を結果としてもたらす、エラープローン型非相同末端接合（ＮＨＥＪ）により、最も一般に修復されるためである。
遺伝子の付加又は特異的な突然変異の補正のために、それほど一般的でない、ＤＳＢの相同性指向修復（ＨＤＲ）が要求される。この状況において、操作ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ並びに相同性指向修復鋳型を含む、さらなる複合体のペイロードが、共送達されなければならない。この手法についての概念実証は、ＨＳＰＣ内において裏付けられているが、また、一部の遺伝子編集構成要素の、タンデム電気穿孔に続く、非組込型ウイルスベクター、特に、ＤＮＡ鋳型を送達する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターによる形質導入又は指定された細胞濃度における、化学修飾された、一本鎖オリゴヌクレオチド鋳型を伴う、規定された濃度の、操作されたヌクレアーゼ構成要素の同時的な電気穿孔も要求される。さらに、各操作ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ及び相同性指向修復鋳型は、指定された各遺伝子的標的について、固有に操作されなければならず、細胞系及びＨＳＰＣにおける、送達、活性及び特異性についての、個別の査定を要求する。
電気穿孔が単独において使用されるのであれ、ＡＡＶと組み合わせて使用されるのであれ、遺伝子編集に要求される個別の構成要素の全てが、同じ細胞へと送達される保証は存在しない。さらに、電気穿孔及び多くのウイルスベクターは、遺伝子を、異質性のプールの中から、特異的な細胞型へと、選択的に送達するわけではないので、これらの処置に、細胞選択工程及び／又は精製工程を先行させなければならない。細胞選択工程及び精製工程は、細胞毒性又は適応度の喪失をもたらしうる操作である。この例は、操作されると、分化を開始し、分化の進んだ血液細胞は、長期にわたる血液産生を支援しうるので、生着可能性の喪失をもたらす、血液幹細胞である。
したがって、遺伝子治療を、ゲノム内の、特異的な部位において実施する能力において、多くの、刺激的なブレークスルーがなされている一方、安全であり、強力である送達媒体の、持続的な欠如が、特に、ＨＳＣ／ＨＳＰＣを伴う遺伝子編集系の臨床への移行を妨げている。
遺伝子編集構成要素を、細胞へと送達する、任意の改善された方法であって、低毒性であり、全ての遺伝子編集構成要素が、細胞へと送達されることを確保するのに要求されるステップを簡略化しうる方法であれば、臨床医学に対して、著明な改善となる。搬送的観点から、また、自家細胞生成物の操作に要求される複雑な設備も踏まえると、現地に近く、合理的な製造工程を有することは、ある特定の疾患の文脈において、重要でありうる、血管から血管への時間を短縮する。ポリプレックス及びリポプレックスなどのナノ粒子が提起されているが、これらは、細胞に対する毒性が過度であることが示されており、例えば、ＨＳＰＣに対する、遺伝子編集構成要素送達の限定的効率を示している。
本開示は、低／最小操作を経た、選択された細胞型の選択的遺伝子改変を可能とするナノ粒子（ＮＰ）を提示する。低操作とは、電気穿孔及びＡＡＶなどのウイルスベクターの使用が要求されないことを意味する。特定の実施形態において、低操作とは、電気穿孔及びＡＡＶなどのウイルスベクターが使用されないことを意味する。最小操作とは、電気穿孔、ウイルスベクター、並びに細胞選択工程及び精製工程の使用が要求されないことを意味する。特定の実施形態において、最小操作とは、電気穿孔、ウイルスベクター、並びに細胞選択工程及び精製工程が使用されないことを意味する。特定の実施形態において、最小操作とは、選択された血液細胞型を含有する試料が、本明細書において開示されたＮＰへと曝露される前に、血小板を取り出すのに洗浄されただけであることを意味する。本明細書の別の箇所において、より詳細に記載される通り、ＮＰが、低操作工程又は最小操作工程において使用されるのかどうかは、細胞ターゲティングリガンドが、ＮＰと会合しているのかどうかに依存する。
ターゲティングリガンドは、例えば、抗体、アプタマー、リガンド又はＮＰの、目的の細胞型との相互作用を指定する他の分子を含む。選択された細胞をターゲティングするリガンドは、ＮＰを、選択された細胞に、選択的に結合し、細胞への取込みを誘発する、表面にアンカリングされたターゲティングリガンドを含みうる。特定の実施形態において、細胞への取込みは、受容体誘導性エンドサイトーシスにより媒介されうる。本明細書の別の箇所において、より詳細に開示されている通り、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、抗体、ｓｃＦｖタンパク質、ＤＡＲＴ分子、ペプチド及び／又はアプタマーを含みうる。特定の実施形態は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）又はＣＤ４６を認識する抗体、抗体の結合性断片又はアプタマーを利用して、ＨＳＣをターゲティングする。特定の実施形態は、ターゲティングリガンドとして、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ４抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体、抗ヒトＣＤ９０抗体、抗ヒトＣＤ１３３抗体、抗ヒトＣＤ１６４抗体、抗ヒトＣＤ１３３アプタマー、ヒト黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＬＨＲＨ受容体に対するリガンドである、ｈＣＧ）、デガレリクス酢酸塩（ＬＨＲＨ受容体のアンタゴニスト）又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １（ＡＨＲに対するリガンド）のうちの１つ以上を含む。
開示されたＮＰが、細胞の異種混合物（例えば、エクスビボ血液生成物）へと添加されると、操作されたＮＰは、選択された細胞集団に結合し、標的細胞へと内部化される。この工程は、ＮＰが保有する遺伝子操作構成要素を侵入させ、結果として、選択された細胞は、遺伝子改変される。遺伝子操作に要求される全ての構成要素を、単一の粒子に与えることは、粒子を取り込む細胞が、それらのサブセットではなく、全ての必要な構成要素を受け取ることを確保する。ＮＰを、所望の細胞集団へとターゲティングすることにより、細胞選択（免疫磁気選択又は他の選択）は、もはや、必要でなくなる。
本明細書において開示されたＮＰの使用は、エクスビボにおける治療用細胞の製造を円滑化し、加工及び遺伝子操作時における、細胞損傷の減少を結果としてもたらす。特定の実施形態において、この方法はまた、患者細胞の採取から、遺伝子改変された血液細胞生成物の再注入までの所要時間も短縮する。
特定の実施形態において、本明細書において開示されたＮＰは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）である。ＡｕＮＰは、特に、哺乳動物の非分裂細胞及び分裂細胞のいずれに対しても非毒性であることが示されており、臨床試験において、ＲＮＡ治療剤の、インビボ送達に適用されている。さらに、それらの固有の表面化学反応のために、ＡｕＮＰに、遺伝子編集に要求される全ての構成要素がロードされうる。本明細書において、より詳細に記載された通り、遺伝子編集構成要素は、例えば、サイズ、多分散性指数及び遺伝子編集効率に関して、ＮＰの機能性及び特徴付けを最適化する、特異的にデザインされた層状立体配置において、ＮＰへと接合されうる。
特定の実施形態は、ターゲティングされた機能喪失突然変異をもたらす構成要素を伴うＮＰを含む。これらの実施形態は、ＮＰの表面と会合した、ターゲティングエレメント（例えば、ガイドＲＮＡ）及び切断エレメント（例えば、ヌクレアーゼ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングエレメントは、チオールリンカーを介して、ＮＰの表面へとコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ターゲティングエレメント及び／又は切断エレメントは、チオールリンカーを介して、ＮＰの表面へとコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ターゲティングエレメントは、チオールリンカーを介して、ＮＰの表面へとコンジュゲートされ、切断エレメントは、ターゲティングエレメントへと連結されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ターゲティングエレメントは、切断エレメントを、切断及びＮＨＥＪ修復のための特異的部位へとターゲティングする。
特定の実施形態は、ターゲティングされた機能獲得突然変異（例えば、遺伝子の付加又は補正）をもたらす構成要素を伴うＮＰを含む。特定の実施形態において、これらの実施形態は、ターゲティングエレメント、切断エレメント、相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）及び治療用ＤＮＡ配列と会合した金属ＮＰ（例えば、ＡｕＮＰ）を含む。ターゲティングエレメントは、切断エレメントを、切断のための特異的部位へとターゲティングし、相同性指向修復鋳型は、ＨＤＲ修復をもたらすが、この場合、ＨＤＲ修復の後に、治療用ＤＮＡ配列は、標的部位内に挿入されている。本明細書において、相同性指向修復鋳型及び治療用ＤＮＡ配列は、併せて、ドナー鋳型と称されうる。特定の実施形態において、ターゲティングエレメントは、チオールリンカーを介して、ＮＰの表面へとコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ターゲティングエレメント及び／又は切断エレメントは、チオールリンカーを介して、ＮＰの表面へとコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ターゲティングエレメントは、チオールリンカーを介して、ＮＰの表面へとコンジュゲートされ、切断エレメントは、ターゲティングエレメントへと連結されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。これらの実施形態において、ＲＮＰ複合体は、ドナー鋳型素材より、ＮＰの表面に近接する。この構成は、例えば、ターゲティングエレメント及び／又は切断エレメントが、細菌由来である場合に、有益である。これは、本明細書において記載されたＮＰを施されうる、多くの個体が、細菌由来の遺伝子編集構成要素など、細菌由来の構成要素に対する、既存の免疫を有しうるためである。完全に製剤化されたＮＰの内層への、細菌由来の遺伝子編集構成要素の組入れは、非細菌由来の構成要素（例えば、ドナー鋳型）が、細菌由来の構成要素（例えば、ターゲティングエレメント及び／又は切断エレメント）を、患者の免疫系から遮蔽することを可能とする。これは、細菌由来の構成要素を、攻撃から保護し、また、投与後における、ＮＰに対する、望ましくない炎症性応答も、回避又は低減する。加えて、これは、宿主の免疫応答による不活化を伴わずに、インビボにおけるＮＰの反復投与を可能としうる。
特定の実施形態は、少なくとも４つの層と会合しており、第１の層が、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、第２の層が、ヌクレアーゼを含み、第３の層が、ｓｓＤＮＡを含み、第４の層が、ターゲティングリガンドを含み、第１の層が、ＮＰコアの表面に対する最近接層であり、第２の層が、ＮＰコアの表面に対する、第２の最近接層であり、第３の層が、ナノ粒子コアに対する、第３の最近接層であり、第４の層が、ＮＰコアから最も離れている、ＡｕＮＰを利用しうる。特定の実施形態において、層とは、選択された細胞集団の遺伝子改変において使用された構成要素であって、ｃｒＲＮＡ、ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、ターゲティングリガンド及び／又はリンカー及びポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ））を含む層を創出するのに使用された構成要素を含む構成要素を含む、ＮＰと会合している層を指す。
特定の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集を利用する。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１（また、Ｃａｓ１２ａとも称された）又はＣａｓ９）により生じうる。
特定の実施形態は、ＨＤＲの効率及び／又は精度を増大させる特徴を採用する。例えば、Ｃｐｆ１は、短い単一のｃｒＲＮＡを有し、標的ＤＮＡを、粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）と呼ばれる、５’側の２～４ヌクレオチド（ｎｔ）の突出を伴う、粘着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）形態に切断する。粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）は、ＨＤＲに好適である（Ｋｉｍら（２０１６）、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３４（８）：８６３～８）。さらに、ドナー鋳型は、ＨＤＲを促進するように、ＲＮＰによるゲノム切断が生じる前に、ＮＰから放出されるものとする。したがって、特定の実施形態において、本明細書において開示されたドナー鋳型は、ターゲティングエレメント及び切断エレメントより、ＮＰの表面から離れて見出される。本開示はまた、予測外に、ＡｕＮＰ上の遺伝子編集構成要素の送達が、ＨＤＲの効率及び／又は精度を増大させることも見出した。したがって、特定の実施形態は、ＡｕＮＰを利用して、遺伝子編集構成要素を送達する。
遺伝子操作のための、特異的なカーゴは、所望の処置転帰に基づき、個別の患者に照らして微調整される。ターゲティングリガンドが、ＮＰの構成要素として組み入れられない場合、ＮＰは、電気穿孔及びウイルスベクターの送達を利用する必要をなくす、低操作による製造をもたらす。ターゲティングリガンドの組入れは、細胞選択工程及び精製工程を実施する必要をなくす、最小操作による製造を可能とする。
低操作又は最小操作を経た血液細胞生成物へのＮＰの添加の後、インキュベーション時間が与えられる。この後、任意選択的に、過剰なＮＰを取り出すように、細胞生成物が洗浄され、患者へと再投与されうる。特定の実施形態において、細胞は保管されうる。保管は、再注入のための患者の準備に要求される時間の長さに応じて、室温条件、冷蔵（２～８℃）条件又は低温保存（液体窒素中又は蒸気相中の保管を含む、≦－２０℃の）条件を含みうる。生物学的試料は、患者への再注入の前の、ＮＰへの曝露の前及び／又は後に低温保存されうる。
ここで、本開示の態様が、以下：（Ｉ）遺伝子編集系及び構成要素；（ＩＩ）ナノ粒子及びこれらの遺伝子編集構成要素とのコンジュゲーション；（ＩＩＩ）遺伝子編集効率；（ＩＶ）選択された細胞及び選択された細胞をターゲティングするリガンド；（Ｖ）細胞集団の供給源及び加工；（ＶＩ）細胞の製剤及び低温保存；（ＶＩＩ）ナノ粒子製剤；（ＶＩＩＩ）キット；（ＩＸ）例示的な使用方法；（Ｘ）例示的な製造実施形態及び比較；（ＸＩ）ナノ粒子の性能を評価するアッセイ；（ＸＩＩ）例示的実施形態；（ＸＩＩＩ）実験例及び（ＸＩＶ）結語の通りに、さらなる詳細及び選択肢において記載される。
（Ｉ）遺伝子編集系及び構成要素
本開示の教示の中において、正確な配列のターゲティング及び修飾が可能な、任意の遺伝子編集系が使用されうる。これらの系は、典型的に、正確なターゲティングのためのターゲティングエレメント及びターゲティングされた遺伝子部位を切断するための切断エレメントを含む。ガイドＲＮＡが、ターゲティングエレメントの１つの例であるのに対し、多様なヌクレアーゼは、切断エレメントの例を提示する。ターゲティングエレメントと切断エレメントとは、別個の分子の場合もあり、例えば、ナノ粒子により連結される場合もある。代替的に、ターゲティングエレメント及び切断エレメントは、１つの二重目的分子へと、一体に連結されうる。治療用核酸配列の挿入が意図される場合、系はまた、治療用核酸配列と会合した、ＨＤＲ鋳型（相同性アームを含みうる）も含む。しかし、下記において、さらに詳述される通り、異なる遺伝子編集系は、選択されたゲノム部位を、正確にターゲティングし、切断し、修飾する能力を維持しながら、異なる構成要素及び構成を採用しうる。
特定の実施形態において、遺伝子操作のための部位は、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集系を使用してターゲティングされうる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系とは、プラスミド及びファージなど、外来の遺伝子エレメントに対する耐性を付与する、原核生物免疫系であり、獲得免疫の形態をもたらす。ＣＲＩＳＰＲは、塩基配列の短い反復を含有する、ＤＮＡ遺伝子座である。原核生物免疫系の文脈では、各反復に、原核生物が曝露された、外来の遺伝子エレメントに属する、スペーサーＤＮＡの短いセグメントが後続する。このＣＲＩＳＰＲによる、スペーサーを介在させた、一連のリピートは、ＲＮＡへと転写されうる。ＲＮＡは、成熟形態へとプロセシングされ、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ会合）ヌクレアーゼと会合する。次いで、外来の遺伝子エレメントとハイブリダイズしうる配列を有するＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ゲノム内の、これらの外因性遺伝子エレメントを認識し、切断しうる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、特異的な配列をターゲティングするのに、専用のタンパク質の作出を要求せず、単一のＣａｓ酵素が、短いガイドＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）により、特異的なＤＮＡ標的を認識するようにプログラムされうる。細菌及び古細菌の獲得免疫によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構築の、極度の多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系遺伝子座は、５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密なユニバーサル遺伝子は見られないことから、遺伝子座構築の急速な進化及び極度の多様性を指し示す。これまでのところ、多面的手法を採用して、９３のＣａｓタンパク質についての、３９５のプロファイルに対して、包括的なＣａｓ遺伝子の同定がなされている。分類は、シグネチャー遺伝子のプロファイルに加えた、遺伝子座構築についてのシグネチャーを含む。これらの系が、クラス１を、マルチサブユニットのエフェクター複合体とし、クラス２を、Ｃａｓ９タンパク質により例示された、単一サブユニットのエフェクターモジュールとする、２つのクラスへと大きく分けられた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の分類が提起されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｍＲＮＡ及びＨＤＲのためのドナー鋳型としての、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の電気穿孔を使用する、ヒトＣＤ３４＋細胞における、効率的な遺伝子編集が裏付けられている（Ｄｅ Ｒａｖｉｎら Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１７；９（３７２）：ｅａａｈ３４８０）。クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と会合した、新規のエフェクタータンパク質は、強力なゲノム操作ツールとして開発される可能性があり、新規の推定エフェクタータンパク質の予測並びにそれらの操作及び最適化は、重要である。クラス及びクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に加えて、より近年において、推定のクラス２である、Ｃｐｆ１により例示された、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓクラスが同定されている（Ｚｅｔｓｃｈｅら（２０１５）、Ｃｅｌｌ、１６３（３）：７５９～７７１）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及びこの構成要素に関する、さらなる情報について、ＵＳ８６９７３５９、ＵＳ８７７１９４５、ＵＳ８７９５９６５、ＵＳ８８６５４０６、ＵＳ８８７１４４５、ＵＳ８８８９３５６、ＵＳ８８８９４１８、ＵＳ８８９５３０８、ＵＳ８９０６６１６、ＵＳ８９３２８１４、ＵＳ８９４５８３９、ＵＳ８９９３２３３及びＵＳ８９９９６４１並びにこれらと関連する出願；並びにＷＯ２０１４／０１８４２３、ＷＯ２０１４／０９３５９５、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９３６３５、ＷＯ２０１４／０９３６５５、ＷＯ２０１４／０９３６６１、ＷＯ２０１４／０９３６９４、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１４／０９３７０９、ＷＯ２０１４／０９３７１２、ＷＯ２０１４／０９３７１８、ＷＯ２０１４／１４５５９９、ＷＯ２０１４／２０４７２３、ＷＯ２０１４／２０４７２４、ＷＯ２０１４／２０４７２５、ＷＯ２０１４／２０４７２６、ＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／２０４７２８、ＷＯ２０１４／２０４７２９、ＷＯ２０１５／０６５９６４、ＷＯ２０１５／０８９３５１、ＷＯ２０１５／０８９３５４、ＷＯ２０１５／０８９３６４、ＷＯ２０１５／０８９４１９、ＷＯ２０１５／０８９４２７、ＷＯ２０１５／０８９４６２、ＷＯ２０１５／０８９４６５、ＷＯ２０１５／０８９４７３、ＷＯ２０１５／０８９４８６、ＷＯ２０１６０５７１１、ＷＯ２０１７／１０６６５７、ＷＯ２０１７／１２７８０７並びにこれらと関連する出願において記載されている。
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、特に、可撓性プロトスペーサー隣接モチーフ又はＰＡＭとして公知の、短い、３つの塩基対（ＴＴＮ）による認識配列により、標的部位の選択において、柔軟性を付け加えうる。Ｃｐｆ１の切断部位は、ＰＡＭ配列から、少なくとも１８ｂｐ離れているので、酵素は、インデル（挿入及び欠失）形成の後において、指定された遺伝子座を、繰り返し切断することが可能であり、ＨＤＲの効率を、潜在的に増大させる。ＨＤＲの成功は、さらなる切断が生じないように、ＰＡＭ配列の突然変異を結果としてもたらす。さらに、粘着末端を伴う粘着末端化ＤＳＢは、非分裂細胞において有利である、配向性特異的なドナー鋳型の挿入を可能とする。
既に指し示された通り、特定の実施形態は、ＨＤＲの効率及び／又は精度を増大させる特徴を採用する。例えば、Ｃｐｆ１は、短い単一のｃｒＲＮＡを有し、標的ＤＮＡを、粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）と呼ばれる、５’側の２～４ヌクレオチド（ｎｔ）の突出を伴う、粘着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）形態に切断する。粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）は、ＨＤＲに好適である（Ｋｉｍら（２０１６）、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３４（８）：８６３～８）。さらに、ドナー鋳型は、ＨＤＲを促進するように、ＲＮＰによるゲノム切断が生じる前に、ＮＰから放出されるものとする。したがって、特定の実施形態において、本明細書において開示されたドナー鋳型は、ターゲティングエレメント及び切断エレメントより、ＮＰの表面から離れて見出される。本開示はまた、予測外に、ＡｕＮＰ上の遺伝子編集構成要素の送達が、ＨＤＲの効率及び／又は精度を増大させることも見出した。したがって、特定の実施形態は、ＡｕＮＰを利用して、遺伝子編集構成要素を送達する。
特定の実施形態は、操作された変異体Ｃｐｆ１を利用しうる。例えば、ＵＳ２０１８／００３０４２５は、標的特異性が、変更及び改善された、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）菌ＮＤ２００６及びアシドアミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種ＢＶ３Ｌ６に由来する、操作Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて記載している。特定の変異体は、以下の位置：Ｓ２０３、Ｎ２７４、Ｎ２７８、Ｋ２９０、Ｋ３６７、Ｋ５３２、Ｋ６０９、Ｋ９１５、Ｑ９６２、Ｋ９６３、Ｋ９６６、Ｋ１００２及び／又はＳ１００３のうちの１つ以上において、突然変異（すなわち、天然のアミノ酸の、異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン又はセリンによる置きかえ）を伴う、ラクノスピラ科菌ＮＤ２００６を含む。特定のＣｐｆ１変異体はまた、以下の位置：Ｎ１７８、Ｓ１８６、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｒ３０１、Ｔ３１５、Ｓ３７６、Ｎ５１５、Ｋ５２３、Ｋ５２４、Ｋ６０３、Ｋ９６５、Ｑ１０１３、Ｑ１０１４及び／又はＫ１０５４のうちの１つ以上において、突然変異（すなわち、天然のアミノ酸の、異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン又はセリンによる置きかえ（天然のアミノ酸がセリンである場合を除く））を伴う、アシドアミノコッカス属種ＢＶ３Ｌ６のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）も含みうる。特定の実施形態において、操作された変異体Ｃｐｆ１は、ｅＣｆｐ１を含む。他のＣｐｆ１変異体について、ＵＳ２０１６／０２０８２４３及びＷＯ／２０１７／１８４７６８において記載されている。
特定の実施形態は、遺伝子編集剤として、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用する。ＺＦＮは、特異的な位置において、ＤＮＡに結合し、これを切断するように操作された、部位特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＺＦＮは、ＤＮＡ配列内の特異的な部位において、二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するのに使用されるが、これは、ＺＦＮが、様々な異なる細胞におけるゲノム内の、固有の配列をターゲティングすることを可能とする。さらに、二本鎖切断に後続して、ＤＳＢを修復する、ＨＤＲ又はＮＨＥＪが生じ、これにより、ゲノム編集を可能とする。
ＺＦＮは、亜鉛フィンガーのＤＮＡ結合性ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインへと融合することにより合成される。ＤＮＡ結合性ドメインは、転写因子である、３つ～６つの亜鉛フィンガータンパク質を含む。ＤＮＡ切断ドメインは、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒姓ドメインを含む。ＦｏｋＩドメインは、標的配列上の部位に対する、固有のＤＮＡ結合性ドメインを伴う、２つの構築物を要求する、二量体として機能する。ＦｏｋＩ切断ドメインは、２つの逆位ハーフサイトを隔てる、５又は６塩基対のスペーサー配列内において切断する。
ＺＦＮに関する、さらなる情報について、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、９３、１１５６～１１６０（１９９６）；Ｗｏｌｆｅら、Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２９、１８３～２１２（２０００）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００、７６４（２００３）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６１、１１６９～１１７５（２００２）；Ｍｉｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ、４、１６０９～１６１４（１９８５）及びＭｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５、７７８～７８５（２００７）を参照されたい。
特定の実施形態は、遺伝子編集剤として、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用しうる。ＴＡＬＥＮとは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合性タンパク質及びＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ内に、細胞内の修復機構を誘導する、ＤＳＢを誘導することにより、遺伝子及びゲノムを編集するのに使用される。一般に、２つのＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断ドメインが、二量体化し、ＤＳＢを誘導するように、標的ＤＮＡ部位の各側に結合し、これらを挟まなければならない。外因性の二本鎖ドナーＤＮＡ断片が存在する場合、ＤＳＢは、細胞内において、ＮＨＥＪ又はＨＤＲにより修復される。
指し示された通り、ＴＡＬＥＮは、例えば、内因性ゲノムの標的配列に結合し、標的配列の位置において、ＤＮＡを切断するように操作されている。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥは、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）菌により分泌された、ＤＮＡ結合性タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合性ドメインは、各リピートの１２番目及び１３番目の位置において、多様な残基を伴う、高度に保存的な、３３又は３４アミノ酸のリピートを含む。ＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）と称された、これらの２つ位置は、特異的なヌクレオチド認識との、強い相関を示す。したがって、ターゲティング特異性は、ＲＶＤ内のアミノ酸を変化させ、非従来型のＲＶＤアミノ酸を組み込むことにより改善されうる。
ＴＡＬＥＮ融合体において使用されうる、ＤＮＡ切断ドメインの例は、野生型及び変異体のＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮに関する、さらなる情報について、Ｂｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６、１５０９～１５１２（２００９）；Ｍｏｓｃｏｕ及びＢｏｇｄａｎｏｖｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６、１５０１（２００９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８６、７５７～７６１（２０１０）及びＭｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９、１４３～１４８（２０１１）を参照されたい。
特定の実施形態は、ＭｅｇａＴＡＬを、遺伝子編集剤として利用する。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥが、メガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合された単鎖希少切断型ヌクレアーゼ構造を有する。ホーミングエンドヌクレアーゼとしてもまた公知のメガヌクレアーゼは、同じドメイン内に、ＤＮＡ認識機能及びヌクレアーゼ機能の両方を有する、単一のペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ＭｅｇａＴＡＬは、機能的な活性のために、単一のペプチド鎖の送達だけを要求する。
対象とする遺伝子操作標的のための、例示的なｃｒＲＮＡは、
Figure 2024045297000001
 を含む。
遺伝子操作のための、対象とする標的部位は、
Figure 2024045297000002
 を含む（ＰＡＭ部位を斜字体とした）。これらの標的部位は、ＨＳＰＣ内の、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）を反映する。特定の実施形態において、これらのＧＳＨ部位は、上記において反映された、配列番号２１及び８４～９７（第１１染色体－ｇｓｈ－標的１～１５）であるが、集団にわたる、典型的な遺伝子変異の原因となる、１つ、２つ、３つ又は４つのヌクレオチド置換を伴う。
本開示はまた、異常ヘモグロビン症及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）など、他の障害の処置においても有用な遺伝子座についての標的部位及びターゲティング配列も提示する（例えば、図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、３４及び３５Ａ～３５Ｄを参照されたい）。
特定の実施形態において、ＮＰは、目的である、所望のＤＮＡ修復経路を促進する因子を送達しうる。二本鎖ＤＮＡ切断を修復するための、任意の経路における、第１のステップは、切断部位における、ＤＮＡの遊離末端の安定性である。この特異的ＤＮＡ修復経路を促進するように、目的の修復経路に特異的な、ＤＮＡ安定化タンパク質が組み込まれうる。ＮＨＥＪのために、ＤＮＡの安定化遊離末端において、２つのタンパク質：Ｋｕ７０及びＫｕ８０が関与する。ＨＤＲのために、ＭＲＮとして公知である、ＭＲＥ１１、Ｎｂｓ１及びＲＡＤ５０からなる、３つのタンパク質による複合体が要求される。これらの分子は、遺伝子編集機構を施される細胞にこれらの因子も存在することを確保するように、関与する因子のうちのいずれのオリゴ（ｍＲＮＡ）又はタンパク質も含みうる。代替的に、又は組合せにおいて、ＮＨＥＪ経路の発現を低減する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）もまた、組み入れられうる。
ＨＤＲのための鋳型は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１６；３４（３）：３３９～４４により記載されている通り、対称性の相同性アームの場合もあり、非対称性の相同性アームの場合もある。各ドナー鋳型は、臨床使用において、治療用ＤＮＡ配列の発現を駆動する、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの上流において、クローントラッキングのための、２０ｂｐの、ランダムのＤＮＡバーコードエレメントを挟む、相同性アーム（ＨＤＲ鋳型）を含みうる。ヒト化Ｃｐｆ１タンパク質は、市販品の製造元（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）による合成が可能であり、２つの修飾を伴うガイドＲＮＡ、原子オリゴエチレングリコールスペーサー及び３’末端のチオールもまた、市販品の供給源（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から得られうる。一本鎖相同性鋳型ＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）もまた、市販品の製造元（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成されうる。このような配列の例について、図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、３４、３５Ｂ及び３５Ｄを参照されたい。
指し示された通り、特定の実施形態において、遺伝子治療をもたらす遺伝子編集系は、ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼを含む。特定の実施形態において、ドナー鋳型は、とりわけ、機能獲得療法又は正確な機能喪失療法を実施する場合に使用されうる。特定の実施形態において、遺伝子編集系は、ＨＤＲ鋳型及び治療用核酸配列を含む。
遺伝子編集系の、全ての核酸ベースの構成要素は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、一本鎖領域と、二本鎖領域とのミックスの場合もある。例えば、ガイドＲＮＡ又はドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡの場合もあり、一本鎖ＲＮＡの場合もあり、二本鎖ＤＮＡの場合もあり、二本鎖ＲＮＡの場合もある。特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰを利用して、ＮＰ表面から最も離れた核酸の末端は、当業者に公知の方法により保護されうる（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端へと付加されうる、及び／又は自己相補性オリゴヌクレオチドが、一方又は両方の末端へとライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４：４９５９～４９６３；Ｎｅｈｌｓら（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２：８８６～８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを、分解から保護するための、さらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加及び、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート及びＯ－メチルリボース残基又はデオキシリボース残基など、ヌクレオチド間連結の修飾の使用を含む。化学修飾されたｍＲＮＡが、細胞内の安定性を増大させるのに使用されうるのに対し、非対称性相同性アーム及びホスホロチオエート修飾は、ＨＤＲ効率を改善するように、ｓｓＯＤＮへと組み込まれうる。特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰを利用して、核酸は、例えば、電荷遮蔽スペーサーの付加により、静電（電荷ベースの）斥力から保護されうる。特定の実施形態において、電荷遮蔽スペーサーは、一方又は両方の末端へと添加された、原子１８個のオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）スペーサーを含みうる。特定の実施形態において、電荷遮蔽スペーサーは、一方又は両方の末端へと添加された、原子１０～２６個のオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）スペーサーを含みうる。
ドナー鋳型は、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上など、任意の長さのドナー鋳型でありうる。
特定の実施形態において、ＨＤＲ鋳型（ＨＤＴ）は、遺伝子編集系の酵素（例えば、ヌクレアーゼ）により、ニック処理又は切断された標的配列内又は標的配列近傍の相同組換えにおける鋳型として用いられるようにデザインされる。ＨＤＲの鋳型ポリヌクレオチドは、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００ヌクレオチド以上など、任意の適切な長さのポリヌクレオチドでありうる。特定の実施形態において、ＨＤＲの鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの部分に対して、相補性である。最適にアライメントされた場合、ＨＤＲの鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の、１つ以上のヌクレオチド（例えば、１つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のヌクレオチド）と重複する。
特定の実施形態において、ＨＤＲ鋳型は、切断部位において、ゲノム配列に対して、ＨＤＲ鋳型と、それが相同性を保有するゲノム配列との間のＨＤＲを支援するのに十分な相同性、例えば、切断部位から５０塩基以内において、例えば、３０塩基以内において、１５塩基以内において、１０塩基以内において、５塩基以内において、切断部位を挟むヌクレオチド配列、又は切断部位を、直に挟むヌクレオチド配列との、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の相同性を含みうる。ＨＤＲ鋳型と、標的ゲノム配列との間の、２５、５０、１００又は２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドを超える（又は１０～２００ヌクレオチド以上の間の、任意の整数値の）配列相同性は、ＨＤＲを支援しうる。相同性アーム又はフランキング配列は、一般に、ゲノム配列、例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じるゲノム領域と同一である。しかし、絶対的な同一性は、要求されない。
特定の実施形態において、ドナー鋳型は、標的ＤＮＡ領域と、２つのフランキング配列との間のＨＤＲが、異種の治療用核酸配列の、標的領域における挿入を結果としてもたらすように、２つの相同性領域により挟まれた、異種の治療用核酸配列を含む。一部の例において、ＨＤＲ鋳型の相同性アーム又はフランキング配列は、非対称性である。
指し示された通り、特定の実施形態において、ドナー鋳型は、治療用核酸配列を含む。治療用核酸配列は、補正遺伝子配列；完全遺伝子配列及び／又は遺伝子の発現と関連する、１つ以上の調節エレメントを含みうる。補正遺伝子配列は、補正を要求する遺伝子の部分の場合もあり、遺伝子の、完全な置きかえコピーの場合もある。補正遺伝子配列は、必ずしも、既存の不全遺伝子の置きかえを伴わずに、遺伝子の完全なコピーをもたらしうる。当業者は、補正コピーをもたらす場合に、不全遺伝子の除去が要求される場合もあり、要求されない場合もあることを認識する。遺伝子を、遺伝子セーフハーバー内に挿入する場合、治療用核酸配列は、コード領域及びこれらの発現に要求される全ての調節エレメントを含むものとする。
治療用遺伝子及び遺伝子産物の例は、骨格タンパク質４．１、グリコフォリン、ｐ５５、Ｄｕｆｆｙの対立遺伝子、グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質の遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；Ｃ９ＯＲＦ７２、α２β１；αｖβ３；αｖβ５；αｖβ６３；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ－３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼＮ；ＨＨＶ－７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ－１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；α－ジストログリカン；ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ－１、ＢＤＮＦ、ベータ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ－ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ－１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ－１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ－１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ－４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ及びＦａｎｃＷ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ１、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ－１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ＩＬ－１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ－１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ－１、ＬＵＣＡ－２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ－３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭＡ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ－ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ－１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、Ｆ８、Ｆ９、ＨＢＢ、ＣＹＢ５Ｒ３、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ並びにＳＬＣ４６Ａ１を含む。
特定の実施形態において、治療用遺伝子は、治療様発現産物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ）のコード配列及び遺伝子産物の発現を結果としてもたらすための、全ての関連する調節エレメント（例えば、プロモーターなど）を含む。
特定の実施形態において、治療的遺伝子操作は、遺伝子部位を破壊して、結合を防止する。例えば、図８Ａ、８Ｂを参照されたい。特定の実施形態において、遺伝子操作は、１１番染色体上のγグロビン遺伝子座内のＢＣＬ１１ａ結合性部位と重複する、一塩基多型（ＳＮＰ）若しくは１３ヌクレオチドの欠失又は２番染色体上のＢＣＬ１１ａ遺伝子の第２イントロンにおける、赤血球特異的エンハンサーエレメント内のＳＮＰをターゲティングする、Ｃｐｆ１及びガイドＲＮＡを含む、遺伝子編集構成要素に基づく。特定の実施形態において、遺伝子操作は、１１番染色体上のγグロビン遺伝子座の、５ｂｐのＢＣＬ１１ａ結合性部位内に配置された突然変異又は２番染色体上、ｒｓ１４２７４０７及びｒｓ７５６９９４６から選択される赤血球特異的エンハンサー領域内のＢＣＬ１１ａ遺伝子内に配置された、２つのＳＮＰ突然変異のうちの１つをターゲティングする、Ｃｐｆ１及びガイドＲＮＡを含む遺伝子編集構成要素に基づく。また、図８Ａ、８Ｂ、３４及び３５Ａ～３５Ｄも参照されたい。
特定の実施形態において、治療用核酸配列（例えば、遺伝子）は、遺伝子改変細胞のインビボ選択をもたらすように、遺伝子部位への組込みについて選択されうる。例えば、細胞増殖スイッチを使用するインビボ選択は、遺伝子改変細胞の小集団が、誘導可能に増幅されることを可能とする。インビボ選択を達成する戦略は、Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡ－メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）など、化学療法耐性をもたらすトランス遺伝子を共発現させながら、薬物選択を利用することであった。代替的手法は、ホメオボックス転写因子である、ＨＯＸＢ４の送達を介して、遺伝子改変ＨＳＣに対して、増殖能の増強を付与することである。特定の実施形態において、例えば、自殺遺伝子を活性化する薬物の投与により、このような細胞集団が、消失させられうるように、自殺遺伝子が、遺伝子改変細胞へと組み込まれうる。例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１２年８月、１９（８）：５２３～９；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１３、８（３）：ｅ５９５９４；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ（２０１６）３、１６０１１を参照されたい。
特定の実施形態は、血液細胞を、ドナー鋳型を、標的部位に挿入することが可能な遺伝子編集系と接触させることを含む。特定の実施形態において、遺伝子編集系は、標的配列とハイブリダイズすることが可能なｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１又はＣａｓ９などのヌクレアーゼ酵素をコードする核酸を含む。
特定の実施形態は、血液細胞を、ドナー鋳型を、標的部位に挿入することが可能な遺伝子編集系と接触させることを含む。特定の実施形態において、遺伝子編集系は、標的配列とハイブリダイズすることが可能なｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１又はＣａｓ９などのヌクレアーゼ酵素をコードする核酸を含む。特定の実施形態において、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１のコード配列は、配列番号１１２～１２４を含みうる。特定の実施形態において、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１のアミノ酸配列は、配列番号１２５～１３８を含みうる。
（ＩＩ）ナノ粒子及びこれらの遺伝子編集構成要素とのコンジュゲーション
指し示された通り、電気穿孔、ウイルスベクター及び／又は細胞選択工程若しくは細胞精製工程に依拠しない、遺伝子編集系の送達方法が必要とされている。
本開示は、電気穿孔又はウイルスベクターによる遺伝子編集構成要素の送達に依拠する必要を伴わずに、遺伝子編集構成要素の送達を可能とする、操作ＮＰを提示する。治療的使用が、問題となる遺伝子を脱活性化することだけを必要とする場合、ＮＰは、ターゲティングエレメント及び切断エレメントと会合していることだけを必要とする（特定の目的に必要又は有用な、他の構成要素も組み入れられうるが）。治療的使用が、遺伝子を付加又は補正する場合、ＮＰは、ターゲティングエレメント、切断エレメント及びドナー鋳型と会合している。細胞選択工程又は細胞精製工程を、さらに回避するために、ターゲティングリガンドは、異質性の細胞プール内の、選択された細胞集団への、ＮＰの選択的送達を結果としてもたらすように、ＮＰへと接合されうる。
特定の実施形態は、コロイド金属ＮＰを利用する。コロイド金属は、液体である水中に分散させられた、任意の水不溶性金属粒子又は金属化合物を含む。コロイド金属は、金属粒子の、水溶液中懸濁液でありうる。コロイド形態とされうる、任意の金属であって、Ａｕ、銀、銅、ニッケル、アルミニウム、亜鉛、カルシウム、白金、パラジウム及び鉄を含む金属が使用されうる。特定の実施形態において、例えば、ＨＡｕＣｌ４から調製されたＡｕＮＰが使用される。特定の実施形態において、ＮＰは、ＡｕコーティングＮＰを作るように、Ａｕによりコーティングされた、非ＡｕＮＰである。
ＨＡｕＣｌ４から、ＡｕコロイドＮＰを含む、コロイド金属ＮＰを作る方法は、当業者に公知である。例えば、本明細書において記載された方法並びに他の箇所（例えば、ＵＳ２００１／００５５８１；２００３／０１１８６５７及び２００３／００５３９８３）に記載された方法は、ＮＰを作るのに使用されうる。
特定の例示的な実施形態において、ＡｕＮＰコアを、最適化されたＴｕｒｋｅｖｉｃｈ方法及び播種増殖方法（Ｓｈａｈｂａｚｉら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）、２０１７、１２（１６）：１９６１～１９７３頁；Ｓｈａｈｂａｚｉら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１７、２８（２）：０２５～１０３頁；Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈら、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９５１、１１（０）：５５～７５頁；Ｐｅｒｒａｕｌｔ及びＣｈａｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００９、１３１（４７）：１７０４２～１７０４３頁）により、３つの異なるサイズ範囲（１５、５０、１００ｎｍ）において合成した。第１のステップにおいて、０．２５ｍＭの塩化Ａｕ（ＩＩＩ）三水和物溶液１００ｍＬを、沸点へと至らせ、３．３３％の無水クエン酸三ナトリウム溶液１ｍＬを添加することにより、１５ｎｍのシードＡｕＮＰを合成した。ＮＰの合成は、高撹拌速度において、１０分間にわたり実行した。調製されたＮＰを、４℃へと冷却し、後続の増殖ステップにおいて使用した。
５０ｎｍ～１００ｎｍのサイズ範囲にあるＡｕＮＰを調製するために、２つの異なる、０．２５ｍＭの塩化Ａｕ（ＩＩＩ）三水和物溶液１００ｍＬずつを調製し、低速の撹拌条件下において、それぞれ、５０ｎｍ及び１００ｎｍのＡｕＮＰを合成するように、２４４０μＬ及び３０４μＬのシードＡｕＮＰを、個別に添加した。これらの溶液へと、１５ｍＭの無水クエン酸三ナトリウム溶液１ｍＬを添加し、混合物を、高撹拌速度下に置いた。次いで、２５ｍＭのヒドロキノン溶液１ｍＬを添加し、５０ｎｍのＡｕＮＰのために、３０分間にわたり合成を持続させ、１００ｎｍのＡｕＮＰのために、５時間にわたり合成を持続させた。最後に、５０００×ｇにおいて遠心分離し、超純水中に分散させることにより、合成されたＮＰを精製した。特定の実施形態において、ＮＰコアは、＞１００ｎｍ；＞９０ｎｍ；＞８０ｎｍ；＞７０ｎｍ；＞６０ｎｍ；＞５０ｎｍ；＞４０ｎｍ；＞３０ｎｍ又は２０ｎｍである。
ＡｕＮＰについて、特に記載されているが、本開示に包含されるＮＰは、異なる形態において、例えば、固体ＮＰ（例えば、金属など、銀、Ａｕ、鉄、チタン）、非金属の、脂質ベースの固体、ポリマー、ＮＰの懸濁液又はこれらの組合せとしても提供されうる。金属、誘電体及び半導体のＮＰ並びにハイブリッド構造のＮＰ（例えば、コア－シェル型ＮＰ）も調製されうる。半導体素材から作られたＮＰはまた、電子エネルギーレベルの量子化が生じる程度に、十分に小型（典型的に、１０ｎｍ未満）である場合、量子ドットによっても標識付けされうる。このようなナノスケール粒子は、薬物担体又はイメージング剤として、生物医学的応用において使用される場合があり、本開示においても、同様の目的のために適合させられうる。
指し示された通り、ターゲティングされた遺伝子編集のために、様々な活性の構成要素が、本明細書において開示されたＮＰへと、コンジュゲートされうる。例えば、遺伝子編集系構成要素である核酸は、ＮＰの表面へと、直接的にコンジュゲートされる場合もあり、間接的にコンジュゲートされる場合もあり、共有結合的にコンジュゲートされる場合もあり、非共有結合的にコンジュゲートされる場合もある。例えば、核酸は、核酸の１つの末端において、ＮＰの表面へと、共有結合的に結合されうる。
ＮＰへとコンジュゲートされた核酸は、１０ヌクレオチド（ｎｔ）～１０００ｎｔ、例えば、１ｎｔ～２５ｎｔ、２５ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～１００ｎｔ、１００ｎｔ～２５０ｎｔ、２５０ｎｔ～５００ｎｔ、５００ｎｔ～１０００ｎｔ又は１０００ｎｔを超える長さを有しうる。特定の実施形態において、リンカーへのコンジュゲーションにより修飾された核酸は、５０ｎｔ又は４０ｎｔの長さを超えない。
例えば、介在リンカーを介して、間接的にコンジュゲートされた場合、任意の種類の分子が、リンカーとして使用されうる。例えば、リンカーは、少なくとも２個の炭素原子（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個以上の炭素原子）を含む、脂肪族鎖であることが可能であり、ケトン、エーテル、エステル、アミド、アルコール、アミン、尿素、チオ尿素、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド及び／又はジスルフィドを含む、１つ以上の官能基により置換されうる。
特定の実施形態において、リンカーは、ＮＰ表面をカップリングさせる、遊離末端（例えば、ガイドＲＮＡへとコンジュゲートされていない末端）において、ジスルフィドを含む。特定の実施形態において、ジスルフィドは、Ｃ２～Ｃ１０のジスルフィドである、すなわち、ジスルフィドは、より長い脂肪族鎖が使用されうることも想定されるが、ジスルフィドを終端とする脂肪族鎖であって、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の炭素原子を含む脂肪族鎖でありうる。特定の実施形態において、ジスルフィドは、炭素３個のジスルフィド（Ｃ３ Ｓ－Ｓ）である。リンカーは、スルフヒドリル群（ＳＨ）を有する場合もあり、ジスルフィド基（Ｓ－Ｓ）を有する場合もあり、異なる数の硫黄原子を有する場合もある。特定の実施形態において、リンカーを使用せずに、チオール修飾が導入されうる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ酵素は、このガイドＲＮＡ（リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体）とあらかじめコンジュゲートされたタンパク質として送達される。この製剤中において、ガイドＲＮＡ分子は、ＮＰへと結合されるが、デフォルトにより、ヌクレアーゼ酵素もまた結合されうる（例えば、図５Ｂを参照されたい）。
本明細書において開示された、１つの前進は、ＮＰへの連結のために、ＣＲＩＳＰＲ構成要素を修飾する能力である。これは、ＣＲＩＳＰＲ構成要素における修飾の大半が、切断効率を損ないうるためである。例えば、Ｌｉら（「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」、２０１７、１：００６６頁）は、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの５’末端は、そのような修飾が、ｃｒＲＮＡの、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼへの結合を結果として妨げるため、修飾に安全でないことを指し示した。本明細書において、切断効率を損なわない、ｃｒＲＮＡの３’末端への修飾が開示される。特定の実施形態において、ＮＰへのコンジュゲーションの、第１のステップにおいてｃｒＲＮＡの３’末端は、ｃｒＲＮＡを、ＡｕＮＰの表面へと接合させるように、原子１８個のヘキサエチレングリコールスペーサー（１８スペーサー）及び炭素３個のジスルフィド（Ｃ３ Ｓ－Ｓ）により修飾される。
前出に基づき、特定の実施形態において、例えば、ＮＰが、Ａｕを含む場合、リンカーは、任意のチオール含有分子でありうる。チオール基の、Ａｕとの反応は、共有結合的スルフィド（－Ｓ－）結合を結果としてもたらす。ＡｕＮＰは、チオール（－ＳＨ）基及びジチオール（Ｓ－Ｓ）基に対して、高アフィニティーを有し、ＡｕＮＰの表面と、硫黄基との間に、半共有結合が生じる（Ｈａｋｋｉｎｅｎ、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ、２０１２、４（６）：４４３～４５５頁）。特定の実施形態において、チオール基は、ＡｕＮＰの表面への接合を容易とするように、核酸へと付加されうる。この手法は、核酸の取込み及び安定性を改善しうる（例えば、Ｍｉｒｋｉｎら、Ａ Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８２（６５９２）：６０７～６０９頁を参照されたい）。
最適化された２ステップの播種増殖方法を使用して、高度に単分散性のＡｕＮＰを、３つの異なるサイズ範囲（１５ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ）において合成し、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼとコンジュゲートした（図５Ｂ及び１１Ｂ）。負帯電表面と、負帯電ｃｒＲＮＡとの、強い静電斥力のために、例えば、チオール修飾を伴わずに、ｃｒＲＮＡを、ＡｕＮＰの表面へと接合させることは困難である。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡコンジュゲートＡｕＮＰの精製の後の、第２のステップにおいて、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを添加し、ｃｒＲＮＡコンジュゲートＡｕＮＰと共にインキュベートして、ｃｒＲＮＡの５’側ハンドルへのその結合を容易とした（Ｄｏｎｇ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１６．５３２（７６００）：５２２～５２６頁）。デザインされたＮＰの、ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの両方を含有する、稠密な構造は、全体的な中性電荷（すなわち、ゼータ電位）のために、分解薬剤に対する安定性を増大させ、細胞による、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰの取込みを容易とするコンフォメーションを結果としてもたらす。開示されたＮＰを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１のための最適化を特に対象としが、同じ概念は、他のＣＲＩＳＰＲクラスにも適用されうる。また、相同性指向修復（ＨＤＲ）において使用されることを目的として、新規のＮＰを得るように、ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼと並んで、１８スペーサーチオールにより修飾された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）も、ＡｕＮＰの表面へと接合されうる。
特定の実施形態において、スペーサー－チオールリンカーは、Ｎ末端又はＣ末端におけるシステイン残基の付加により、Ｃｐｆ１タンパク質又はＣａｓ９タンパク質自体へと付加される場合もあり、前出の（例えば、下記で記載される）操作変異体へと付加される場合もある。次いで、ヌクレアーゼタンパク質が、ＡｕＮＰコアの表面上の、第１の層として付加されうる。このスペーサー－チオールリンカーは、タンパク質の安定性を増大させることが可能であり、切断効率を増大させうる。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡと、ヌクレアーゼとの間において、ＲＮＡ複合体が形成され、次いで、スペーサー－チオールリンカーを介して、ＡｕＮＰコアの表面へと接合される。
既に指し示された通り、細菌由来の、遺伝子編集構成要素の、第１のローディングステップとしての付加は、構成要素に対する、既存の免疫を伴う対象への投与の後における、これらの構成要素の有益な遮蔽をもたらしうる。遮蔽は、他の遺伝子編集構成要素（例えば、ドナー鋳型）に起因することが可能であり、保護用のポリマーシェルに依拠する必要がない。特定の実施形態において、ポリマーシェルは、除外される。特定の実施形態において、遮蔽は、一連のインビボ投与を可能としうる。
特定の実施形態において、異なるＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡのｗ／ｗ比（０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６）において、ｃｒＲＮＡを、ＡｕＮＰへと添加し、混合することができる。ｐＨを３とするクエン酸緩衝液を、１０ｍＭの濃度において、混合物へと添加して、負帯電ｃｒＲＮＡとＡｕＮＰとの、負の斥力についてスクリーニングすることができる。５分間にわたり撹拌した後に、ＮＰを遠心分離し、非結合のｃｒＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動により可視化することができる。最適のコンジュゲーション濃度を決定した後に、６３μＭのＣｐｆ１ヌクレアーゼ１μＬを、ＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡ溶液へと添加し、２０分間にわたりインキュベートすることができる。
重要なことは、クエン酸緩衝液の使用が、製造において、著明な利点をもたらすことである。既存の方法は、負帯電のＮＰ表面についてスクリーニングし、同様に負帯電のＤＮＡの斥力を低減するのに、ＮａＣｌの使用に依拠してきた。しかし、ＮａＣｌは、ＡｕＮＰの不可逆的凝集を引き起こしうるので、時間経過にわたり、濃度を漸増させながら、徐々に添加されなければならない。一般に、ＮａＣｌは、凝集を回避するように、４８時間にわたり添加されなければならない。ｐＨを３として、クエン酸緩衝液が使用される場合、この結合は、３分間未満において、高効率により生じ、ＧＭＰ製造施設における、物資及び時間の費用を軽減する（Ｚｈａｎｇら（２０１２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１３４（１７）：７２６６～７２６９）。
調製されたＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰのサイズ及び形状は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）下のイメージングにより特徴付けられうる。ＡｕＮＰ（４μＬ）を、銅グリッドへと添加し、終夜乾燥させる。イメージングは、１２０ｋＶにおいて実行される。
遺伝子編集構成要素によるコーティングは、負染色電子顕微鏡により可視化することができる。例えば、ＮＰは、それぞれ、０．７％のギ酸ウラニル及び２％の酢酸ウラニルにより染色することができる。染色された試料（４μＬ）は、炭素コーティング銅グリッドへと添加さし、１分間にわたりインキュベートし、１枚の濾紙によりブロッティングすることができる。２０μｌの染色液による、３回にわたる洗浄サイクルの後、４μｌの染色液を、グリッドへと添加し、ブロッティングし、通気乾燥させることができる。
ＮＰはまた、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ－可視光分光光度計遺伝子編集構成要素とのコンジュゲーションの前後における、ＮＰの、局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）ピークのシフトを解析することによってもまた、特徴付けることができる。
特定の実施形態において、ＮＰは、表面積を増大させ、ターゲティングリガンド及び／又は大型のドナー鋳型など、大型のｓｓＤＮＡ又は他の分子、をコンジュゲートするために、ＰＥＩ又は他の正帯電ポリマーを組み入れるための合成時などにおいて、層状化させられる（例えば、図６Ｂを参照されたい）。このＮＰは、層ごとの形態において調製される場合があり、遺伝子編集構成要素及び他の構成要素（抗体の結合性ドメインなど）を接合させるように、ＡｕＮＰ又は遺伝子編集構成要素によりコーティングされたＡｕＮＰの負帯電表面をコーティングするのに、正帯電ポリマー（異なる分子量及び分子形態にあるＰＥＩなど）が使用されうる。層状化は、本質的に、他のタンパク質を伴う、又はこれを伴わない、大型のオリゴヌクレオチドなどの分子をコンジュゲートするために利用可能な、ＮＰの表面積を増大させる。
特定の実施形態は、分子量が、１，０００～３，０００ダルトン（例えば、１，０００；１，２００；１，４００；１，６００；１，８００；２，０００；２，２００；２，４００；２，６００；２，８００又は３，０００ダルトン）の間である、正帯電ポリマーを利用する。正帯電ポリマーの例は、ポリアミン；ポリ有機アミン（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミンセルロース）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）；ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン）；多糖（例えば、セルロース、デキストラン、ＤＥＡＥデキストラン、デンプン）；スペルミン、スペルミジン、ポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）、ポリ（４－ビニル－Ｎ－アルキル－ピリジニウム）、ポリ（アクリロイル－トリアルキルアンモニウム）及びＴａｔタンパク質を含む。
任意の濃度及び任意の比におけるポリマー（及び、任意選択的に、脂質）のブレンドもまた、使用されうる。多様なグレードを使用する、異なる種類のポリマーの、異なる比におけるブレンドは、寄与ポリマーの各々から取り入れる特徴を結果としてもたらす。多様な末端基化学反応もまた、採用されうる。
特定の実施形態において、正帯電ポリマー（例えば、ＰＥＩ）は、既に形成されたＮＰ部分に対するコーティングとして付加することができ、ｓｓＤＮＡは、共時的に、又はこの後において付加することができる。代替的に、層としてのｓｓＤＮＡを添加した後における、後続層としての正帯電ポリマーの付加により、コンジュゲーションステップを変化させることもできる。特定の実施形態において、この層は、リンカーへとカップリングされたＲＮＰ複合体のために取っておくことができるので、正帯電ポリマー及びｓｓＤＮＡは、第１の層として組み入れない。
特定の実施形態において、本開示の多層型ＮＰは、２５～７０ｎｍの平均サイズを有し、高度に単分散性である。ＡｕＮＰについての、透過電子顕微鏡画像（ＴＥＭ）及びＬＳＰＲは、凝集を伴わずに、一様な表面コーティングを示した（図１０Ａ、１０Ｂ）。全送達系の合成的性格を踏まえると、全ての構成要素は、例えば、電荷スクリーニングとしての、ＮａＣｌの使用のために、数日間を要求した、既存の手法と対比して、数時間以内にアセンブルすることができる。
図１０Ａに示される通り、合成されたＮＰは、高度に単分散性であり、凝集を伴わずに、４ｎｍのコーティングを達成することに成功したが、これは、５０ｎｍのＡｕＮＰについて、コーティングの後において、ＮＰのサイズを、５４ｎｍへと増大させた。また、ＡｕＮＰについてのＬＳＰＲの、強度及び赤色シフトの減少も、凝集を伴わない、遺伝子編集構成要素とのコンジュゲーションの成功を示した（図１０Ａ）。各層は、異なる最適のローディング比を有する。第１の層は、ＲＮＡからなったが、この層をローディングするための、最適の比について調べるために、一本鎖ＤＮＡの試験ヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）を使用した。この試験オリゴヌクレオチドを、ｃｒＲＮＡを修飾するのに使用された、同じ１８スペーサーである、Ｃ３ Ｓ－Ｓにより修飾した。ローディング研究において、異なるＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡのｗ／ｗ比は、粒子コア：ｓｓＤＮＡ（及び、推定により、粒子コア：ｃｒＲＮＡ）の６の比が、コンジュゲーションを実行するのに最適であることを示した（図１０Ｃ）。この最適のローディング比を使用して、ｃｒＲＮＡを、ＡｕＮＰの表面に、３０μｇ／ｍＬの濃度においてロードした（図１０Ｄ）。これらのデータは、遺伝子編集研究のための、正確な適用投与量を計算する一助となる。
当業者により理解される通り、各層が添加されるのに応じて、最適のローディングのための比は、わずかずつ異なるため、提示された比は、反復による比である。添加された全ての層並びに最後の層としてのＮＰの特徴、及び添加される新たな層の特性は全て、比に影響を及ぼす。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ（第１の層）のために、６：１の比が、最適である。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質のために、０．６の比が、ＮＰコア＋ｃｒＲＮＡ層へのローディングに最適であり、最後のＨＤＴ層は、最適のローディング比１を有する。Ｃｐｆ１タンパク質に対する修飾又はＨＤＴの長さ若しくは化学修飾に対する変化は、これらの比に影響しうる。
粒子コアの、遺伝子編集構成要素に対する、特に有用な比は、０．５、０．６又は０．７の、粒子コア：Ｃｐｆ１の重量／重量（ｗ／ｗ）比及び０．９、１．０又は１．１の粒子コア：ＨＤＴのｗ／ｗ比を含む。
記載された手法は、電気穿孔又はウイルスベクターの送達を必要とせずに、新たなＤＮＡの挿入のための、合成の、非化学修飾リボ核タンパク質及びｓｓＤＮＡ相同性鋳型の両方を送達することが可能な、高度に強力な、ロードされた、遺伝子編集ＮＰを結果としてもたらした。特定の実施形態において、完全ロードＡｕＮＰの流体力学サイズは、１５０～１９０ｎｍ、１６０～１８５ｎｍ、１７０～１８０ｎｍ又は１７６ｎｍである。
さらなる粒子デザインは、ＮＰコアの表面の近位から、遠位へと、以下の順序：チオール化ＰＥＩ、リンカー、ターゲティングエレメント及び切断エレメントにおいて伸長する、以下の構成要素を含む。特定の実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコールリンカーである。特定の実施形態において、切断エレメントを、ターゲティングリガンドと連結するのに、ＮＨＳエステル及びマレイミド反応基を、中程度の長さのシクロヘキサンスペーサーアームの反対側の末端に含有する、水溶性のアミン－スルフヒドリル間架橋剤が使用されうる。特定の実施形態において、アミン－スルフヒドリル間架橋剤は、スルホスクシンイミジル４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボン酸（スルホ－ＳＭＣＣ、図６Ｅ）を含む。特定の実施形態において、ｓｓＤＮＡは、リンカーの層と共に共伸長する、ＮＰのコアを取り囲む層内にある。この構成は、例えば、図５Ｄ及び６Ｃ～６Ｅに描示されている。
リンカーは、ポリマーリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーは、可撓性及び、リンカーにより接続された、２つの領域、ドメイン、モチーフ、カセット又はモジュールの間のコンフォメーション運動のための余地をもたらしうる、１～５００アミノ酸を有するアミノ酸配列でありうる。特定の実施形態において、リンカーは、リンカーにより接合された構成要素の、所望の機能又は構造に応じて、可撓性の場合もあり、非可撓性の場合もあり、半可撓性の場合もある。特定の実施形態において、リンカーは、２つの分子、領域、ドメイン、モチーフ、カセット又はモジュールを接続する場合、直接的リンカーでありうる。特定の実施形態において、リンカーは、２つの分子、領域、ドメイン、モチーフ、カセット又はモジュールが、単一のリンカーにより、直接接続されず、両側からのリンカーにより、さらに、第３のリンカー又はドメインへと接続される場合、間接的でありうる。例示的なリンカー配列は、ＧｌｙｘＳｅｒｙ［配列中、ｘ及びｙは、いずれも０でないことを条件として、独立に、０～１０の整数である］の、１～１０回の反復を有するリンカー配列（例えば、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）（配列番号１００）など、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号９８）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（配列番号９９）、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ又はこれらの組合せ）を含む。
非可撓性リンカー又は半可撓性リンカーの例は、プロリンリッチリンカーを含む。特定の実施形態において、プロリンリッチリンカーとは、偶然だけに基づき予測されるより、多くのプロリン残基を有するペプチド配列である。特定の実施形態において、プロリンリッチリンカーは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４８％、少なくとも５０％又は少なくとも５１％のプロリン残基を有するリンカーである。プロリンリッチリンカーの特定の例は、プロリンリッチ唾液タンパク質（ＰＲＰ）の断片を含む。
（ＩＩＩ）遺伝子編集効率
ｃｒＲＮＡ、ｈＡｓＣｐｆ１ＲＮＡ及びｓｓＯＤＮの、電気穿孔のための最適濃度を、Ｋ５６２細胞において決定した。最適濃度は、最高の生存率及びＧＦＰの発現を提示する。Ｋ５６２細胞を、２４ウェルプレート内、ウェル１つ当たりの細胞１×１０５個の濃度において培養した。１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎＳｔｒｅｐを伴う、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を使用して、細胞を培養した。ＣＤ３４＋細胞を、２４ウェルプレート内、ウェル１つ当たりの細胞５×１０５個の濃度において培養した。ＣＤ３４＋細胞のための培養条件は、Ｋ５６２細胞の場合と同じであったが、要求される増殖因子を伴った。Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰを、２５ｎＭの濃度において、ウェルへと添加し、インキュベーションの４８時間後において、編集効率を査定した。特定の実施形態において、ＡｕＮＰ／ＣＲＩＳＰＲは、細胞集団と共に、１～４８時間、１～３６時間、１～２４時間又は１～１２時間にわたりインキュベートされうる。特定の実施形態において、ＡｕＮＰ／ＣＲＩＳＰＲは、細胞集団と共に、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間以上にわたりインキュベートされうる。１ｍｍのキュベット内、２５０Ｖ及び５ミリ秒間のパルス持続時間における、ＢＴＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＵＳＡ）を使用する、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＥＣＭ ８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにより、細胞の電気穿孔を実施した。ギャップ幅を２ｍｍとする、１ｍｍのＢＴＸキュベットを使用して、２５０Ｖにおいて、５ミリ秒間にわたり、Ｋ５６２細胞１００万～３００万個に電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞を、培養培地中に再懸濁させ、解析した。臨床における搬送又は疾患の文脈にある、最小操作による実施形態の文脈において、１～２４、１～４８又は１～７２時間が好ましい。ある特定の場合において、再注入のために、がん患者を前処置するのに、２日間を要しうるが、遺伝子疾患の背景において、患者は、前処置されない場合があり、体外操作の時間を制限することが好ましい。
第１１染色体：６７８１２３４９～６７８１２３７５位をターゲティングするＡｕＮＰ／ＣＲＩＳＰＲは、同じ切断効率を達成するのに、高量（１２６ｎＭ）のｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１が使用された（図１６Ｃ）、電気穿孔方法と比較して、極めて低度のｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ濃度（２５ｎＭ）において、標的部位の切断に成功することが可能であった。この部位についての切断効率は、ＰＡＭ部位の１５ｂｐ後における、Ａ＞Ｔ突然変異に起因して、低度であった。次の試験において、初代ＣＤ３４＋細胞内の、同じ位置をターゲティングしたところ、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰは、極めて低度のｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ濃度において、毒性作用を惹起せずに、極めて良好な切断効率により、この部位をターゲティングすることが可能であることが示された（図１６Ａ、１６Ｄ及び１８）。残念ながら、初代ＣＤ３４＋細胞の電気穿孔は、細胞の生存率に有害な影響を及ぼし、電気穿孔された細胞についても、切断が見られなかった。ＡｕＮＰ／ＣＲＩＳＰＲについて計算された濃度は、電気穿孔方法に要求される濃度の５分の１未満であった（図１６Ｂ）。Ｋｉｍら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１６、３４（８）：８６３～８頁）により既に言及されている通り、ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１遺伝子編集系による欠失率は、挿入率に対して高率であった（図１８）。
図２３Ａ～２３Ｃにおいて示される通り、ＡｕＮＰ媒介型遺伝子送達は、Ｃａｓ９の性能を改善するが、ＨＤＲについて、Ｃｐｆ１が、より良好である。ＡｕＮＰ処置細胞は、電気穿孔細胞と比較した高生存率を裏付けた。Ｃａｓ９について、ＡｕＮＰ媒介型送達は、全編集及びＨＤＲを、電気穿孔と比べて改善した。相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）を伴わずに送達されたＣｐｆ１について、電気穿孔は、高全遺伝子編集（挿入及び欠失：インデル）を結果としてもたらした。これは、電気穿孔は、それ自体が、使用される修復経路又は標的部位におけるＣｐｆ１切断の頻度に影響しうることを示唆する。ＨＤＴの、Ｃｐｆ１製剤への付加は、全編集を改善し、最高のＨＤＲ率を結果としてもたらした。まとめると、これらのデータは、ＡｕＮＰ＋Ｃｐｆ１／ｃｒＲＮＡ＋ＨＤＴの完全ロード製剤が、インデル形成を最小としながら、最高のＨＤＲ率を結果としてもたらすことを示唆する。これは、いくつかの標的遺伝子座について、遺伝子編集のために理想的である。
特定の実施形態において、当技術分野で公知のいくつかのアッセイは、遺伝子編集及び／又は遺伝子編集レベル（パーセント）若しくは遺伝子編集率を検出するのに使用されうる。特定の実施形態において、遺伝子編集の結果としての、欠失又は酵素制限部位の導入は、遺伝子編集標的部位を挟む、増幅されたゲノムＤＮＡの、制限酵素による消化及び消化産物の、ゲル電気泳動による視覚化により評価されうる。特定の実施形態において、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイが使用されうる。Ｔ７ＥＩアッセイにおいて、遺伝子改変のためにターゲティングされた細胞に由来するゲノムＤＮＡを単離し、遺伝子編集標的部位を挟むゲノム領域を、ＰＣＲ増幅することができる。増幅産物を、アニーリングし、Ｔ７ＥＩにより消化することができる。Ｔ７ＥＩは、マッチが不完全なＤＮＡを認識し、切断するので、任意の遺伝子編集は、アニーリングされたヘテロ二重鎖内のミスマッチとして検出することができ、次いで、これが、Ｔ７ＥＩにより切断される。Ｔ７ＥＩアッセイにおける遺伝子改変パーセントは、以下：遺伝子改変パーセント＝１００×（１－（１－切断率）１／２）の通りに計算することができる。Ｔ７ＥＩアッセイキットは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡから得られうる。
特定の実施形態において、遺伝子編集又は遺伝子編集レベル（パーセント）は、ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）アッセイにより検出されうる。遺伝子編集標的部位を挟むゲノム領域をＰＣＲ増幅し、増幅産物を精製することができる。精製産物に対するサンガーシーケンシングは、蛍光標識付けジデオキシヌクレオシド三リン酸末端（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから市販されているシーケンシングキット）により実行されうる。サイクルシーケンシングの後、得られた配列を、ＴＩＤＥソフトウェアにかけることができる。結果は、遺伝子改変パーセントとして報告されうる（Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２（２２）：ｅ１６８～ｅ１６８（２０１４））。
特定の実施形態において、遺伝子編集又は遺伝子編集レベル（パーセント）は、シーケンシングにより検出されうる。遺伝子編集標的部位を挟むゲノム領域をＰＣＲ増幅し、増幅産物を精製することができる。二次ＰＣＲを実施して、所与のシーケンシングプラットフォームに必要とされる、アダプター及び／又は他の配列を付加することができる。合成によるシーケンシング、ピロシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ローリングサークル増幅シーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、放出プロトンの検出に基づくシーケンシング及びナノ小孔シーケンシングを含む、任意のシーケンシング法が利用されうる。
特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰを含む治療用製剤の使用は、標的細胞内の、５％～１００％、５％～９０％、５％～８０％、５％～７０％、５％～６０％、５％～５０％、５％～４０％、５％～３０％又は５％～２０％の平均値全遺伝子編集をもたらしうる。特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰを含む治療用製剤の使用は、標的細胞内の、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上の平均値全遺伝子編集をもたらしうる。
共焦点顕微鏡は、開示されたＮＰが、リソソームにトラップされることを回避し、健常ドナーに由来する、ＣＤ３４＋初代造血細胞の核への局在化に成功することを裏付けた。相同性アーム長を、±４０ヌクレオチドとする、ＮｏｔＩ制限酵素鋳型を使用して、細胞毒性を伴わずに、最大において１０％の、ＣＣＲ５遺伝子座へのノックイン頻度が裏付けられた。非標的ＤＮＡ鎖に対する鋳型のデザインは、高度の相同性指向修復（ＨＤＲ）効率をもたらし（図１７）、ＮｏｔＩ酵素及びＴ７ＥＩ酵素による消化の後において、４４７ｂｐ及び３１６ｂｐの切断バンドを除去した（図１９Ｂ）。同じＣＣＲ５標的部位における、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９のヌクレアーゼ活性の直接的な比較は、インデルを優先的に発生させるＣａｓ９を上回る、Ｃｐｆ１の、ＨＤＲ及び鋳型ノックインに対するバイアスを裏付けた。ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１ ＮＰにより処置されたヒトＣＤ３４＋細胞の、免疫不全マウスへの異種移植が、非処置細胞と比較して、早期における生着の増大傾向を裏付けたことは、ＮＰ処置ＨＳＰＣの未知の利益を示唆する。ＣＣＲ５遺伝子改変細胞の生着頻度は、培養物中において観察された頻度と同じであり、ヒト細胞のうちの１０％が、インビボにおいて、ＮｏｔＩ鋳型の付加を提示した。
特定の実施形態において、最小操作血液細胞生成物１ｍＬ当たり、１、２、３、４、５、８、１０、１２、１５又は２０μｇ／ｍＬのＮＰを、インキュベーション時間にわたり添加する。インキュベーション時間は、例えば、４０分間～４８時間の長さ（特定の実施形態において、１時間）でありうる。特定の実施形態において、インキュベーション時間は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間及び、４８時間までの、全ての整数時間である。インキュベーションは、２～８摂氏度（冷蔵）において行う場合もあり、２３～２８摂氏度（室温）において行う場合もあり、３７摂氏度（体内温度）において行う場合もある。生成物の、軽微な揺動又は回転動は、任意の温度のインキュベーション時において行いうる。
（ＩＶ）選択された細胞及び選択された細胞をターゲティングするリガンド
遺伝子改変のためにターゲティングすべき細胞集団（すなわち、細胞型）は、ＨＳＣ、ＨＳＰＣ、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞を含む。選択された細胞集団とは、本開示のＮＰによる遺伝子改変のために、ターゲティングされる細胞集団又はターゲティングされている細胞集団を指す場合がある。
ＨＳＣは、多能性であり、全ての種類の最終分化血液細胞を、最終的にもたらす。ＨＳＣは、自己再生する場合もあり、より関与の進んだ前駆細胞であって、少数の血液細胞型だけの祖先細胞であることが不可逆的に決定された前駆細胞へと分化する場合もある。例えば、ＨＳＣは、（ｉ）最終的に、単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞をもたらす、骨髄系前駆細胞又は（ｉｉ）最終的に、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞をもたらす、リンパ系前駆細胞へと分化しうる。幹細胞が、骨髄系前駆細胞へと分化したら、その後代は、リンパ系統の細胞をもたらすことができず、同様に、リンパ系前駆細胞は、骨髄系統の細胞をもたらすことができない。造血及び造血幹細胞の分化についての一般的議論について、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ａｌｂｅｒｔｓら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」、２版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１７章；「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」の２章、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、２００６年８月及び「Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」の５章、２００９、「Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照されたい。
特定のＨＳＣ集団は、ＨＳＣ１（Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋）及びＨＳＣ２（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０－ＣＤ４９ｆ＋）を含む。例えば、特定の実施形態において、ヒトＨＳＣ１は、以下のプロファイル：ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋又はＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋により同定される場合があり、マウスＬＴ－ＨＳＣは、Ｌｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－Ｆｌｔ３－ＣＤ３４－（ここで、Ｌｉｎは、ＣＤ３、Ｃｄ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＮＫ１．１、Ｇｒ１及びＴＥＲ１１９を含む、成熟細胞についての任意のマーカーの発現の非存在を表す）により同定されうる。したがって、ＨＳＣ１は、マーカープロファイル：ＬＨＲ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋を含みうる。ＬＨＲの発現に加えて、特定の実施形態において、ＨＳＣ１は、以下のプロファイル：Ｌｉｎ－／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋により同定されうる。したがって、ＨＳＣ１は、マーカープロファイル：ＬＨＲ＋／Ｌｉｎ－／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋を含みうる。ＬＨＲの発現に加えて、特定の実施形態において、ＨＳＣ２は、以下のプロファイル：ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０－／ＣＤ４９ｆ＋により同定されうる。したがって、ＨＳＣ２は、マーカープロファイル：ＬＨＲ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０－／ＣＤ４９ｆ＋を含みうる。前出プロファイルに基づき、ＬＨＲの発現は、ＨＳＣ１細胞集団及び／又はＨＳＣ２細胞集団を同定するための、以下の１つ以上のマーカー：Ｌｉｎ／ＣＤ３４／ＣＤ３８／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ９０／ＣＤ４９ｆ並びにＣＤ１３３の存在又は非存在と組み合わされうる。マーカーの組合せが、ＨＳＣ１又はＨＳＣ２を、信頼できる形で同定する限りにおいて、他の多様な組合せもまた使用されうる。特定の実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ１３３＋プロファイルにより同定される。特定の実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋プロファイルにより同定される。特定の実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ１６４＋プロファイルにより同定される。特定の実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ１６４＋プロファイルにより同定される。
ＨＳＰＣとは、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を指す。ＨＳＰＣは、ＨＳＣについて、上記において記載した通り、自己再生する場合もあり、骨髄系前駆細胞又はリンパ系前駆細胞へと分化する場合もある。ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣ上において、他の造血細胞型と比べて高レベルにおいて発現された、特異的なマーカーについて陽性でありうる。例えば、このようなマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ又はこれらの組合せを含む。ＨＳＰＣはまた、発現されたマーカーについて、他の造血細胞型と比べて陰性の場合もある。例えば、このようなマーカーは、Ｌｉｎ、ＣＤ３８又はこれらの組合せを含む。好ましくは、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋細胞である。
特定の実施形態において、「ＨＳＣ／ＨＳＰＣ」とは、ＨＳＣ、ＨＳＰＣ又はこれらの両方を指す場合がある。
リンパ球は、Ｔ細胞及びＢ細胞を含む。Ｔ細胞は、免疫系の鍵となる部分であり、免疫応答を制御するほか、ウイルス感染細胞及びがん細胞などの細胞を死滅させる一助となる。ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含む、いくつかのＴ細胞型が存在する。Ｂ細胞は、細菌、ウイルス及び他の生物などの侵入者に対する、抗体を含む獲得免疫系に参与する。
各々が、顕著に異なる機能を伴う、Ｔ細胞の、いくつかの異なるサブセットが発見されている。特定の実施形態において、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して、特定のリンパ球集団に対する、選択的方向付けを達成する。例えば、Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立の、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子及びＴ細胞受容体ベータ遺伝子（ＴＣＲα遺伝子及びＴＣＲβ遺伝子）から産生され、α－ＴＣＲ鎖及びβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる、２つの別個のペプチド鎖から構成される。
γδ Ｔ細胞は、それらの表面上に、顕著に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を所有する、Ｔ細胞の小型のサブセットを表す。γδ Ｔ細胞において、ＴＣＲは、１つのγ鎖及び１つのδ鎖から作られる。この群のＴ細胞は、αβＴ細胞より、はるかにまれ（全Ｔ細胞のうちの２％）である。
ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞上において発現される。したがって、本明細書において開示された、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、核酸の、全ての成熟Ｔ細胞への選択的送達を達成するように、ＣＤ３に結合しうる。活性化Ｔ細胞は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ６９及びＣＤ２５を発現する。したがって、本明細書において開示された、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、核酸の、活性化Ｔ細胞への選択的送達を達成するように、４－１ＢＢ、ＣＤ６９又はＣＤ２５に結合しうる。ＣＤ５及びトランスフェリン受容体もまた、Ｔ細胞上において発現される。
Ｔ細胞は、ヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び細胞溶解性Ｔ細胞を含む、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）へとさらに分類されうる。ヘルパーＴ細胞は、他の機能の中でも、Ｂ細胞の、形質細胞への成熟並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫過程にある、他の白血球を支援する。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現された、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原と共に提示されると、活性化する。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節又は支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、体内のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩと会合した抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。
本明細書において使用された、「セントラルメモリー」Ｔ細胞（又は「ＴＣＭ」）とは、その表面上において、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯを発現し、ＣＤ４５ＲＡを発現しない、又はこれらの発現が減少している抗原経験ＣＴＬを指す。特定の実施形態において、セントラルメモリー細胞はナイーブ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ９５の発現について陽性であり、ＣＤ４５ＲＡの発現が減少している。
本明細書において使用された、「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（又は「ＴＥＭ」）とは、その表面上において、セントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌを発現しない、又はこれらの発現を減少させ、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現しない、又はこれらの発現が減少している、抗原経験Ｔ細胞を指す。特定の実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の発現について、ナイーブ細胞又はセントラルメモリー細胞と比較して、陰性であり、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡの発現を変動させる。エフェクターＴ細胞は、グランザイムＢ及びパーフォリンについて、メモリーＴ細胞又はナイーブＴ細胞と比較して、陽性である。
調節性Ｔ細胞（「ＴＲＥＧ」）とは、免疫系をモジュレートし、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を消滅させる、Ｔ細胞の亜集団である。ＴＲＥＧは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及びＬＡＰを発現する。
本明細書において使用された、「ナイーブ」Ｔ細胞とは、セントラル細胞又はエフェクターメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡを発現し、ＣＤ４５ＲＯを発現しない、非抗原経験Ｔ細胞を指す。特定の実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡを含む、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現により特徴付けられる。
Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の存在により、他のリンパ球から識別されうる。Ｂ細胞の主要な機能は、抗体を作ることである。Ｂ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５２及びＣＤ８０を発現する。本明細書において開示された、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、核酸の、Ｂ細胞への選択的送達を達成するように、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５２及び／又はＣＤ８０に結合しうる。Ｂ細胞受容体のアイソタイプ定常領域をターゲティングする抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）もまた、Ｂ細胞亜型をターゲティングするのに使用されうる。
ナチュラルキラー細胞（また、ＮＫ細胞、Ｋ細胞及びキラー細胞としても公知である）は、インターフェロン又はマクロファージ由来のサイトカインに応答して活性化される。ＮＫ細胞は、細胞膜を破壊する顆粒を放出することにより、アポトーシス又は細胞の溶解を誘導することが可能であり、他の免疫細胞を動員するサイトカインを分泌しうる。ＮＫ細胞は、獲得免疫応答が、感染を除去しうる、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を発生させつつある間、ウイルス感染を食い止めるのに役立つ。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ及び天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）ファミリーのいくつかのメンバーを発現する。ＮＣＲの例は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０及びＤＮＡＭ－１を含む。
マクロファージ（及びそれらの前駆細胞、単球）は、体内のあらゆる組織内に常在（ある特定の場合に、ミクログリア、クッパー細胞及び破骨細胞として）し、ここで、アポトーシス細胞、病原体及び他の非自己構成要素を貪食する。マクロファージ（及びそれらの前駆細胞、単球）の表面上において発現されたタンパク質の例は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１１９、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、Ｆ４／８０、ＩＦＧＲ２、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）１～９、ＩＬ－４Ｒα及びＭＡＲＣＯを含む。
本明細書において開示されたＮＰへと接合されうる、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、異質性の細胞集団内の、目的の細胞に選択的に結合する。異質性の細胞混合物中の、選択された細胞型への「選択的送達」とは、標的マーカーを発現しない集団内の細胞と比べ、投与されたＮＰのうちの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％が標的細胞内に比例的に取り込まれることを意味する。特定の実施形態において、試料中の、選択された細胞集団のうちの５０％以上が、ＮＰを取り込み、いずれか１つの非標的細胞集団のうちの２０％未満が、ＮＰを取り込む。
特定の実施形態において、選択された細胞をターゲティングするリガンドの結合性ドメインは、細胞マーカーリガンド、受容体リガンド、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸、核酸アプタマー、シュピーゲルマー又はこれらの組合せを含む。選択された細胞をターゲティングするリガンドの文脈の中では、結合性ドメインは、別の物質に結合して、エンドサイトーシスを媒介することが可能な複合体を形成する、任意の物質を含む。
「抗体」とは、ターゲティングリガンドの１つの例であり、全抗体又は抗体の結合性断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及び単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又は免疫グロブリンの、任意の、生物学的に効果的な断片であって、選択された細胞型により発現されたモチーフに特異的に結合する断片を含む。抗体又は抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、ミニボディー及び直鎖状抗体の全部又は一部を含む。
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とは、短いリンカーペプチドにより接続された、免疫グロブリンの、重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。Ｆｖ断片は、抗体の単一のアームの、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むが、定常領域を欠く。Ｆｖ断片の２つドメインである、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、例えば、組換え方法を使用して、ＶＬ領域と、ＶＨ領域とが対合して、一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を形成する、単一のタンパク質鎖となることを可能とする合成リンカーにより接合されうる。Ｆｖ及びｓｃＦｖに関する、さらなる情報について、例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（１９８８）、４２３～４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５（１９８８）、５８７９～５８８３；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、２６９～３１５；ＷＯ１９９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号並びに米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。
Ｆａｂ断片とは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む一価抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片とは、ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋により連結された、２つのＦａｂ断片を含む、二価断片である。ダイアボディーは、二価でありうる、２つのエピトープ結合性部位を含む。例えば、ＥＰ０４０４０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１及びＨｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（１９９３）、６４４４～６４４８を参照されたい。ＤＡＲＴ（商標）（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ダイアボディーフォーマットに基づくが、さらなる安定性のために、Ｃ末端のジスルフィド架橋を特徴とする（Ｍｏｏｒｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１７、４５４２～５１（２０１１）））もまた、形成されうる。抗体断片はまた、単離ＣＤＲも含みうる。抗体断片の総説について、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９（２００３）、１２９～１３４を参照されたい。
ヒト由来の抗体又はヒト化抗体は、ヒトにおいて、免疫原性が小さい、又はこれを有さず、非免疫原性エピトープの数が、非ヒト抗体と比較して少ない。抗体及びこれらの断片は、一般に、ヒト対象において、抗原性のレベルが低減されている、又は抗原性を有さないように選択される。
選択された細胞型により発現されたモチーフに特異的に結合する抗体は、当業者に公知の、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ方法、ヒト抗体若しくはヒト化抗体を作出する方法又は抗体を産生するように操作された、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を使用する方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１及び同第６，２９１，１５８号を参照されたい）を使用して調製されうる。部分的に、又は完全に合成の抗体によるファージディスプレイライブラリーは、利用可能であり、選択された細胞型モチーフに結合しうる、抗体又はその断片についてスクリーニングされうる。例えば、結合性ドメインは、Ｆａｂファージライブラリーを、目的の標的に特異的に結合するＦａｂ断片についてスクリーニングすることにより同定されうる（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：３４４、２００５を参照されたい）。ヒト抗体についてのファージディスプレイライブラリーもまた、利用可能である。加えて、目的の標的を、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭ－マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において、免疫原として使用する、ハイブリドーマ開発のための従来の戦略は、ターゲティングリガンドの結合性ドメインを開発するのに使用されうる。特定の実施形態において、抗体は、選択されたリンパ球により発現されたモチーフに特異的に結合するが、非特異的構成要素又は非関連標的と交差反応しない。同定されたら、抗体をコードする、アミノ酸配列又は核酸配列は、単離及び／又は決定されうる。
アプタマーは、細胞膜を越える送達、細胞内コンパートメントへの送達又は核内への送達を含む、選択的送達を容易とするようにデザインされうる。アプタマーを作る方法及びこのようなアプタマーを、ＮＰの表面へとコンジュゲートする方法については、例えば、Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８、８０（３）、５６７～５７２頁において記載されている。特定の実施形態において、本開示のアプタマーは、ＣＤ１３３に結合する。
特定の実施形態において、ペプチドアプタマーとは、両方の末端において、タンパク質の土台へと接合されたペプチドループ（標的タンパク質に特異的である）を指す。この二重の構造的制約は、ペプチドアプタマーの結合アフィニティーを、抗体と同等なレベルへと、大きく増大させる。可変ループの長さは、典型的に、８～２０アミノ酸（例えば、８～１２アミノ酸）であり、土台は、安定、可溶性、小型及び非毒性である、任意のタンパク質（例えば、チオレドキシンＡ、ステリンＡ三重突然変異体、緑色蛍光タンパク質、エグリンＣ及び細胞内転写因子Ｓｐｌ）でありうる。ペプチドアプタマーの選択は、酵母ツーハイブリッド系（例えば、Ｇａｌ４酵母ツーハイブリッド系）又はＬｅｘＡ相互作用トラップ系など、異なる系を使用してなされうる。
核酸アプタマーとは、Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５～９、１９９７及びＣｅｒｃｈｉａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５２８：１２～１６、２００２により記載されている通り、標的タンパク質又は他の分子への、高アフィニティー及び高特異性による結合を決定づける、特異的な球状構造へとフォールディングすることにより機能する、一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）によるリガンドである。特定の実施形態において、アプタマーは、小型（１５ＫＤ又は１５～８０ヌクレオチドの間又は２０～５０ヌクレオチドの間）である。アプタマーは、一般に、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；例えば、Ｔｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５～５１０、１９９０；Ｇｒｅｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．、７５～８６、１９９１及びＧｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：７６３～７９７、１９９５を参照されたい）と称されている手順により、１０１４～１０１５のランダムオリゴヌクレオチド配列からなるライブラリーから単離される。アプタマーを作出する、さらなる方法について、例えば、米国特許第６，３４４，３１８号；同第６，３３１，３９８号；同第６，１１０，９００号；同第５，８１７，７８５号；同第５，７５６，２９１号；同第５，６９６，２４９号；同第５，６７０，６３７号；同第５，６３７，４６１号；同第５，５９５，８７７号；同第５，５２７，８９４号；同第５，４９６，９３８号；同第５，４７５，０９６号及び同第５，２７０，１６号において記載されている。シュピーゲルマーは、少なくとも１つのβ－リボース単位が、β－Ｄ－デオキシリボース又は例えば、β－Ｄ－リボース、α－Ｄ－リボース、β－Ｌ－リボースから選択される、修飾糖単位により置きかえられたことを除き、核酸アプタマーと同様である。
特定の実施形態において、ＲＮＡアプタマー配列は、細胞上又は細胞内のアプタマーリガンドに対する結合アフィニティーを有する。特定の実施形態において、アプタマーリガンドは、例えば、細胞膜の細胞外面又は細胞外側において、少なくとも部分的に結合可能であるように、細胞上にある。例えば、アプタマーリガンドは、細胞表面タンパク質でありうる。したがって、アプタマーリガンドは、融合タンパク質の１つの部分であることが可能であり、融合タンパク質の他の１つの部分は、膜アンカードメイン又は膜貫通ドメインを有する。特定の実施形態において、アプタマーリガンドは、細胞内にある。例えば、アプタマーリガンドは、細胞内に内部化されうる、すなわち、細胞膜内に（細胞膜を越えて）、例えば、細胞質内に、細胞小器官（ミトコンドリアを含む）内に、エンドソーム内に、又は核内に内部化されうる。特定の実施形態において、アプタマーは、相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型及び治療用核酸配列を含みうる、ドナー鋳型配列を含みうる。
本明細書において開示された、選択された細胞をターゲティングするリガンドは、ＮＰの、ＨＳＣへの選択的送達を達成するように、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、Ｓｃａ－１、ＣＤ１１７、ＬＨＲＨ受容体及び／又はＡＨＲに結合しうる。既に指し示された通り、特定の実施形態は、ターゲティングリガンドとして、ＣＤ３４抗体、ＣＤ９０抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１６４抗体、アプタマー、ヒト黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、デガレリクス酢酸塩（ＬＨＲＨ受容体のアンタゴニスト）又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １のうちの１つ以上を含む。
特定の実施形態において、ＣＤ３４に結合するターゲティングリガンドは、ヒト抗体又はヒト化抗体である。特定の実施形態において、ＣＤ３４に結合するターゲティングリガンドは、抗体クローン：５８１；抗体クローン：５６１；抗体クローン：ＲＥＡ１１６４若しくは抗体クローン：ＡＣ１３６又はこれらに由来する結合性断片である。
特定の実施形態において、ＣＤ３４に結合する結合性ドメインは、ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１３９）を含むＣＤＲＬ１配列、ＱＶＳＮＲＦＳ（配列番号１４０）を含むＣＤＲＬ２配列、ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１４１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１４２）を含むＣＤＲＨ１配列、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＫＹＡＥＥＦＫＧ（配列番号１４３）を含むＣＤＲＨ２配列及びＧＹＧＮＹＡＲＧＡＷＬＡＹ（配列番号１４４）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。ＣＤ３４に結合する結合性ドメインに関する、さらなる情報について、ＷＯ２００８ＣＮ０１９６３を参照されたい。さらなるＣＤ３４結合性ドメインもまた、市販されている。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＱＢＥＮＤ／１０；クローン：ＱＢＥＮＤ／１０；カタログ＃：ＭＡ１－１０２０２）を提供している。
特定の実施形態において、ＣＤ９０に結合する結合性ドメインは、抗体クローン：５Ｅ１０；抗体クローン：ＤＧ３；抗体クローン：ＲＥＡ８９７又はこれらに由来する結合性断片である。
特定の実施形態において、ＣＤ９０に結合する結合性ドメインは、配列
Figure 2024045297000003
 を含む単鎖抗体である。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ヒト結合性ドメイン又はヒト化結合性ドメインである。ＣＤ９０に結合する結合性ドメインに関する、さらなる情報について、ＷＯ２０１７ＵＳ３５９８９を参照されたい。ＣＤ９０結合性ドメインはまた、市販もなされている。例えば、Ａｂｃａｍは、抗ＣＤ９０／Ｔｈｙ１抗体（［ＥＰＲ３１３３］；クローン：ＥＰＲ３１３３；カタログ＃：ａｂ１３３３５０）を提供している。
特定の実施形態において、ＣＤ１３３に結合する結合性ドメインは、抗体クローン：ＲＥＡ８２０；抗体クローン：ＲＥＡ７５３；抗体クローン：ＲＥＡ８１６；抗体クローン：２９３Ｃ３；抗体クローン：ＡＣ１４１；抗体クローン：ＡＣ１３３；抗体クローン：７又はこれらに由来する結合性断片である。
特定の実施形態において、ＣＤ１３３に結合する結合性ドメインは、Ｃ１７８ＡＢＣ－ＣＤ１３３ＭＡｂに由来する。特定の実施形態において、結合性ドメインは、
Figure 2024045297000004
 の可変軽鎖及び
Figure 2024045297000005
 の可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＱＳＳＱＳＶＹＮＮＮＹＬＡ（配列番号１４８）を含むＣＤＲＬ１配列、ＲＡＳＴＬＡＳ（配列番号１４９）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＧＥＦＳＣＤＳＡＤＣＡＡ（配列番号１５０）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＩＤＬＮＮＹ（配列番号１５１）を含むＣＤＲＨ１配列、ＦＧＳＤＳ（配列番号１５２）を含むＣＤＲＨ２配列及びＧＧＬを含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ヒト結合性ドメイン又はヒト化結合性ドメインである。ＣＤ１３３に結合する結合性ドメインに関する、さらなる情報について、ＷＯ２０１１０８９２１１、米国公開第２０１８／０１０５５９８号及び／又は米国公開第２０１３／０２２４２０２号を参照されたい。ＣＤ１３３結合性ドメインはまた、市販もなされている。例えば、Ａｂｃａｍは、抗ＣＤ１３３抗体（［ＥＰＲ２０９８０－４５；クローン：ＥＰＲ２０９８０－４５；カタログ＃：ａｂ２２６３５５）を提供している。
特定の実施形態において、ＣＤ１３３に結合する結合性ドメインは、アプタマーである。アプタマーは、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のアプタマーである、Ａ１５又はＢ１９でありうる。特定の実施形態において、アプタマーＡ１５とは、１５の塩基及び式：Ｃ１８２Ｈ２１９Ｆ９Ｎ５８Ｏ１０４Ｐ１６を伴うＲＮＡアプタマーを指す。このアプタマーは、５５４９．５８の分子量及び配列修飾：２－フルオロピリミジン、３’逆位デオキシチミジンキャップ、５’蛍光ＤＹ６４７タグを有する。また、Ｓｈｉｇｄａｒら（２０１３）、「ＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ ＣＤ１３３」、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、３３０、８４、ＰＭＩＤ：２３１９６０６０も参照されたい。特定の実施形態において、アプタマーＢ１９とは、１９の塩基及び式：Ｃ２２１Ｈ２６３Ｆ１０Ｎ７３Ｏ１３１Ｐ２０を伴うＲＮＡアプタマーを指す。このアプタマーは、６８４７．３２の分子量及び配列修飾：２－フルオロピリミジン、３’逆位デオキシチミジンキャップ、５’蛍光ＤＹ６４７タグを有する。また、Ｓｈｉｇｄａｒら（２０１３）、「ＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ ＣＤ１３３」、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、３３０、８４、ＰＭＩＤ：２３１９６０６０も参照されたい。
特定の実施形態において、ＲＮＡアプタマーは、ＣＣＣＵＣＣＵＡＣＡＵＡＧＧＧ（配列番号１５３）を含むコンセンサス配列を含む。特定の実施形態において、ＲＮＡアプタマーは、
Figure 2024045297000006
 を含むコンセンサス配列を含む。ＣＤ１３３アプタマーに関する、さらなる情報について、ＥＰ２８８０１８５を参照されたい。
特定の実施形態は、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）に結合するターゲティングリガンドの使用を含む。特定の実施形態は、ＬＨアルファサブユニット及びＬＨベータサブユニットを利用しうる。特定の実施形態において、アルファサブユニットは、
Figure 2024045297000007
 を含む。
特定の実施形態において、ＬＨベータサブユニットは、
Figure 2024045297000008
 を含む。
ＬＨＲ又は他のＨＳＣ１／ＨＳＣ２マーカーに結合する、多数の抗体が市販されている。例えば、抗ＬＨＲ抗体は、Ａｂｃａｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ａｂｂｅｘａ、Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどから市販されている。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、ＧＹＳＩＴＳＧＹＧ（配列番号５７）を含むＣＤＲＨ１；ＩＨＹＳＧＳＴ（配列番号５８）を含むＣＤＲＨ２；ＡＲＳＬＲＹ（配列番号５９）を含むＣＤＲＨ３並びにＳＳＶＮＹ（配列番号６０）を含むＣＤＲＬ１；ＤＴＳを含むＣＤＲＬ２及びＨＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号６１）を含むＣＤＲＬ３を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、ＧＦＳＬＴＴＹＧ（配列番号６２）を含むＣＤＲＨ１；ＩＷＧＤＧＳＴ（配列番号６３）を含むＣＤＲＨ２及びＡＥＧＳＳＬＦＡＹ（配列番号６４）を含むＣＤＲＨ３並びにＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹ（配列番号６５）を含むＣＤＲＬ１；ＷＡＳを含むＣＤＲＬ２及びＱＮＤＹＳＹＰＬＴ（配列番号６６）を含むＣＤＲＬ３を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、ＧＹＳＦＴＧＹＹ（配列番号６７）を含むＣＤＲＨ１；ＩＹＰＹＮＧＶＳ（配列番号６８）を含むＣＤＲＨ２及びＡＲＥＲＧＬＹＱＬＲＡＭＤＹ（配列番号６９）を含むＣＤＲＨ３並びにＱＳＩＳＮＮ（配列番号７０）を含むＣＤＲＬ１；ＮＡＳを含むＣＤＲＬ２及びＱＱＳＮＳＷＰＹＴ（配列番号７１）を含むＣＤＲＬ３を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、
Figure 2024045297000009
 を含む重鎖及び
Figure 2024045297000010
 を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、
Figure 2024045297000011
 を含む重鎖及び
Figure 2024045297000012
 を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、
Figure 2024045297000013
 を含む重鎖及び
Figure 2024045297000014
 を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、
Figure 2024045297000015
 を含む重鎖及び
Figure 2024045297000016
 を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態において、抗ＬＨＲ結合剤は、
Figure 2024045297000017
 を含む、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのサブユニットベータ３（ＣＧＢ３；ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０ＤＮ８６）を含む。
特定の実施形態は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に結合するターゲティングリガンドの使用を含む。ＡＨＲは、基本的な螺旋－ループ－螺旋型の転写因子のファミリーメンバーである。ＡＨＲは、異物代謝酵素の機能並びにいくつかの化合物の毒性及び発がん特性を調節する。ＡＨＲはまた、ＨＳＣの多能性及び幹細胞性の調節においても、重要な役割を果たす。ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １（ＳＲ１）による、ＡＨＲの阻害は、ＣＤ３４を発現する細胞の増大及び免疫不全マウスに生着する能力を保持する細胞の増大をもたらすことが示されている。
特定の実施形態において、４－（２－（（２－（ベンゾ［ｂ］チオフェン－３－イル）－９－イソプロピル－９Ｈ－プリン－６－イル）アミノ）エチル）フェノールとしてもまた公知のＳＲ１は、Ｃ２４Ｈ２３Ｎ５ＯＳの化学式及び以下の構造：
Figure 2024045297000018
 を有する。
ＳＲ１は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ；ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ及びＡｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡなどの販売元から市販されている。
特定の実施形態において、選択された細胞をターゲティングするリガンドの結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体モチーフ抗体；Ｔ細胞α鎖抗体；Ｔ細胞β鎖抗体；Ｔ細胞γ鎖抗体；Ｔ細胞δ鎖抗体；ＣＣＲ７抗体；ＣＤ１ａ抗体；ＣＤ１ｂ抗体；ＣＤ１ｃ抗体；ＣＤ１ｄ抗体；ＣＤ３抗体；ＣＤ４抗体；ＣＤ５抗体；ＣＤ７抗体；ＣＤ８抗体；ＣＤ１１ｂ抗体；ＣＤ１１ｃ抗体；ＣＤ１６抗体；ＣＤ１９抗体；ＣＤ２０抗体；ＣＤ２１抗体；ＣＤ２２抗体；ＣＤ２５抗体；ＣＤ２８抗体；ＣＤ３４抗体；ＣＤ３５抗体；ＣＤ３９抗体；ＣＤ４０抗体；ＣＤ４５ＲＡ抗体；ＣＤ４５ＲＯ抗体；ＣＤ４６抗体；ＣＤ５２抗体；ＣＤ５６抗体；ＣＤ６２Ｌ抗体；ＣＤ６８抗体；ＣＤ８０抗体；ＣＤ８６抗体ＣＤ９０抗体；ＣＤ９５抗体；ＣＤ１０１抗体；ＣＤ１１７抗体；ＣＤ１２７抗体；ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）抗体；ＣＤ１４８抗体；ＣＤ１６３抗体；ＣＤ１６４抗体；Ｆ４／８０抗体；ＩＬ－４Ｒα抗体；Ｓｃａ－１抗体；ＣＴＬＡ－４抗体；ＧＩＴＲ抗体；ＧＡＲＰ抗体；ＬＡＰ抗体；グランザイムＢ抗体；ＬＦＡ－１抗体又はトランスフェリン受容体抗体を含む。
Ｔ細胞への選択的ＮＰ送達を結果としてもたらすターゲティングリガンドは、ＣＤ３に結合する結合性ドメインであって、ＯＫＴ３（米国特許第５，９２９，２１２号において記載されている）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、２０Ｇ６－Ｆ３、４Ｂ４－Ｄ７、４Ｅ７－Ｃ９、１８Ｆ５－Ｈ１０又はＴＲ６６のうちの少なくとも１つに由来する結合性ドメインを含みうる。特定の実施形態において、結合性ドメインは、
Figure 2024045297000019
 の可変軽鎖及び
Figure 2024045297000020
 の可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、
Figure 2024045297000021
 の可変軽鎖及び
Figure 2024045297000022
 の可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ（配列番号１６４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１６５）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＷＳＳＮＰＦＴ（配列番号１６６）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ（配列番号１６７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号１６８）を含むＣＤＲＨ２配列及びＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ（配列番号１６９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号１７０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１７１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１７２）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１７３）を含むＣＤＲＨ２配列及びＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１７４）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＱＳＬＶＨＤＮＧＮＴＹ（配列番号１７５）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１７１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＦＴＦＳＮＡＷ（配列番号１７５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＫＡＲＳＮＮＹＡＴ（配列番号１７６）を含むＣＤＲＨ２配列及びＲＧＴＹＹＡＳＫＰＦＤＹ（配列番号１７７）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＱＳＬＥＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号１７９）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１７１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＦＴＦＳＮＡＷ（配列番号１７６）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＫＤＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号１８０）を含むＣＤＲＨ２配列及びＲＹＶＨＹＧＩＧＹＡＭＤＡ（配列番号１８１）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＱＳＬＶＨＴＮＧＮＴＹ（配列番号１８２）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号１８３）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＦＴＦＴＮＡＷ（配列番号１８４）を含むＣＤＲＨ１配列、ＫＤＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号１８５）を含むＣＤＲＨ２配列及びＲＹＶＨＹＲＦＡＹＡＬＤＡ（配列番号１８６）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、結合性ドメインは、ヒト結合性ドメイン又はヒト化結合性ドメインである。ＣＤ３に結合する結合性ドメインに関する、さらなる情報について、米国特許第８７８５６０４号、ＰＣＴ／ＵＳ１７／４２２６４及び／又はＷＯ０２０５１８７１を参照されたい。ＣＤ３結合性ドメインはまた、市販もなされている。例えば、ＬＳＢｉｏは、ＰａｔｈＰｌｕｓ（商標）ＣＤ３モノクローナル抗体ＩＨＣ ＬＳ－Ｂ８６６９（クローン：ＳＰ７；カタログ＃：ＬＳ－Ｂ８６６９－１００）を提供している。
ＣＤ４発現Ｔ細胞は、ＣＤ４に結合する結合性ドメインによる、選択的ＮＰ送達のためにターゲティングされうる。特定の実施形態において、結合性ドメインは、
Figure 2024045297000023
 の可変軽鎖及び
Figure 2024045297000024
 の可変重鎖を含む。特定の実施形態において、結合性ドメインは、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１８９）を含むＣＤＲＬ１配列、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号１９０）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＹＹＳＹＲＴ（配列番号１９１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨ（配列番号１９２）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧ（配列番号１９３）を含むＣＤＲＨ２配列及びＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹ（配列番号１９４）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。特定の実施形態において、結合性ドメインは、ヒト結合性ドメイン又はヒト化結合性ドメインである。ＣＤ４に結合する結合性ドメインに関する、さらなる情報について、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８ＵＳ０５４５０号を参照されたい。ＣＤ４結合性ドメインはまた、市販もなされている。例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓは、ヒトＣＤ４抗体（クローン：３４９３０；カタログ＃：ＭＡＢ３７９）を提供している。
ＣＤ２８は、ヒトの末梢Ｔ細胞のうちの、８０％において存在する、表面糖タンパク質であり、休眠Ｔ細胞及び活性化Ｔ細胞の両方において存在する。ＣＤ２８は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）及びＢ７－２（ＣＤ８６）に結合する。特定の実施形態において、ＣＤ２８結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体又は９Ｄ７抗体に由来する。ＣＤ２８に結合する、さらなる抗体は、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２及びＥＸ５．３Ｄ１０を含む。さらに、１ＹＪＤは、マイトジェン抗体（５．１１Ａ１）のＦａｂ断片と複合した、ヒトＣＤ２８の結晶構造をもたらす。特定の実施形態において、９Ｄ７と競合しない抗体が選択される。
特定の実施形態において、ＣＤ２８結合性ドメインは、ＴＧＮ１４１２に由来する。特定の実施形態において、ＴＧＮ１４１２の可変重鎖は、
Figure 2024045297000025
 を含み、ＴＧＮ１４１２の可変軽鎖は、
Figure 2024045297000026
 を含む。
特定の実施形態において、ＣＤ２８結合性ドメインは、ＨＡＳＱＮＩＹＶＷＬＮ（配列番号１９７）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＡＳＮＬＨＴ（配列番号１９８）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＱＧＱＴＹＰＹＴ（配列番号１９９）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨ（配列番号２００）を含むＣＤＲＨ１配列、ＣＩＹＰＧＮＶＮＴＮＹＮＥＫ（配列番号２０１）を含むＣＤＲＨ２配列及びＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶ（配列番号２０２）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、ＣＤ２８結合性ドメインは、ＨＡＳＱＮＩＹＶＷＬＮ（配列番号１９７）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＡＳＮＬＨＴ（配列番号１９８）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＱＧＱＴＹＰＹＴ（配列番号１９９）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＳＹＹＩＨ（配列番号２０３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＣＩＹＰＧＮＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＤ（配列番号２０４）を含むＣＤＲＨ２配列及びＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶ（配列番号２０２）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
活性化Ｔ細胞は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を発現する。特定の実施形態において、４－１ＢＢ結合性ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＳ（配列番号２０５）を含むＣＤＲＬ１配列、ＡＳＮＲＡＴ（配列番号２０６）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＲＳＮＷＰＰＡＬＴ（配列番号２０７）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＹＹＷＳ（配列番号２０８）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＮＨを含むＣＤＲＨ２配列及びＹＧＰＧＮＹＤＷＹＦＤＬ（配列番号２０９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
特定の実施形態において、４－１ＢＢ結合性ドメインは、ＳＧＤＮＩＧＤＱＹＡＨ（配列番号２１０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＱＤＫＮＲＰＳ（配列番号２１１）を含むＣＤＲＬ２配列及びＡＴＹＴＧＦＧＳＬＡＶ（配列番号２１２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖並びにＧＹＳＦＳＴＹＷＩＳ（配列番号２１３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＫＩＹＰＧＤＳＹＴＮＹＳＰＳ（配列番号１０１）を含むＣＤＲＨ２配列及びＧＹＧＩＦＤＹ（配列番号１０２）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む。
本明細書において開示された、特定の実施形態は、ＣＤ８上のエピトープに結合するターゲティングリガンドを含む。特定の実施形態において、ＣＤ８結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＯＫＴ８抗体に由来する。例えば、特定の実施形態において、ＣＤ８結合性ドメインは、ＲＴＳＲＳＩＳＱＹＬＡ（配列番号１０３）を含むＣＤＲＬ１配列、ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号１０４）を含むＣＤＲＬ２配列及びＱＱＨＮＥＮＰＬＴ（配列番号１０５）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む、ヒト結合性ドメイン又はヒト化結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、ＣＤ８結合性ドメインは、ＧＦＮＩＫＤ（配列番号１０６）を含むＣＤＲＨ１配列、ＲＩＤＰＡＮＤＮＴ（配列番号１０７）を含むＣＤＲＨ２配列及びＧＹＧＹＹＶＦＤＨ（配列番号１０８）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含む、ヒト結合性ドメイン又はヒト化結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である。これらは、ＯＫＴ８抗体のＣＤＲ配列を反映する。
ＮＫ細胞受容体に結合する結合性ドメインを伴う市販抗体の例は、５Ｃ６及び１Ｄ１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）；ＫＩＲ２ＤＬ４に結合するｍＡｂ ３３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）から市販されている）；ＮＫｐ４４に結合するＰ４４－８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）から市販されている）；ＣＤ８に結合するＳＫ１及びＣＤ１６に結合する３Ｇ８を含む。ＫＩＲ２ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する結合性ドメインは、配列：
Figure 2024045297000027
 の、可変軽鎖領域及び配列：
Figure 2024045297000028
 の、可変重鎖領域を含む。さらなるＮＫ結合性抗体について、ＷＯ／２００５／０００３１７２及び米国特許第９，４１５，１０４号において記載されている。
マクロファージの表面上において発現されるタンパク質に結合する市販抗体は、ＣＤ１１ｂに結合するＭ１／７０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販されている）；ＣＤ６８に結合するＫＰ１（ＡＢＣＡＭ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍから市販されている）；ＣＤ１６３に結合するａｂ８７０９９（ＡＢＣＡＭから市販されている）を含む。
所与のＣＤＲ又はＦＲの、正確なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（Ｋａｂａｔによる番号付けスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７～９４８（Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けスキーム）；Ｍａｃｃａｌｌｕｍら（１９９６）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２～７４５（Ｃｏｎｔａｃｔによる番号付けスキーム）；Ｍａｒｔｉｎら（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６：９２６８～９２７２（ＡｂＭによる番号付けスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐら（２００３）、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７（１）：５５～７７（ＩＭＧＴによる番号付けスキーム）並びにＨｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３０９（３）：６５７～６７０（「Ａｈｏ」による番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、いくつかの周知のスキームを使用して、たやすく決定されうる。所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、同定のために使用されたスキームに応じて変動しうる。例えば、Ｋａｂａｔスキームが、構造アライメントに基づくのに対し、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。番号付けは、Ｋａｂａｔによるスキーム及びＣｈｏｔｈｉａによるスキームのいずれについても、挿入文字、例えば、「３０アミノ酸」により調整される挿入及び一部の抗体内に現れる欠失を伴う、最も一般的な抗体領域の配列長に基づく。２つのスキームは、ある特定の挿入及び欠失（「インデル」）を、異なる位置に配置する結果として、示差的な番号付けをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複合体の結晶構造についての解析に基づき、多くの点において、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けスキームと同様である。特定の実施形態において、本明細書において開示された抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔによる番号付けに従う。
特定の実施形態において、機能獲得遺伝子改変が意図される場合、選択的送達は、意図／選択された細胞型へと挿入された構築物の発現を制限する、調節性エレメントを組み入れることにより増強されうる。例えば、選択的送達は、ＨＳＣのために、ＣＤ４５プロモーター、ウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡＳＰ）プロモーター又はインターフェロン（ＩＦＮ）ベータプロモーターを使用することにより；ＨＳＣ若しくはＴ細胞のために、マウス幹細胞ウイルスプロモーター若しくは遠位ｌｃｋプロモーターを使用することにより、又はＢ細胞のために、Ｂ２９プロモーターを使用することにより増強されうる。
また、ポリ（エチレンイミン）／ＤＮＡ（ＰＥＩ／ＤＮＡ）複合体など、リンパ球による内部化及び／又はリンパ球へのトランスフェクションも容易としうる、他の薬剤もまた、使用されうる。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、例えば、アミン－スルフヒドリル架橋剤又はスルフヒドリル－スルフヒドリル架橋剤を、多様なＰＥＧスペーサー及び／又はＧｌｙ－Ｓｅｒスペーサーと共に使用して、ヌクレアーゼへと連結されうる。スペーサーの付加は、コグネイト受容体又は細胞表面タンパク質に結合するための可撓性を可能とする。特定の実施形態において、スペーサーは、１～５０；１０～５０；２０～５０；３０～５０；１～５００；１０～２５０；２０～２００；３０～１５０；４０～１００；５０～７５又は５～７５の間の反復単位又は残基を有しうる。
（Ｖ）細胞集団の供給源及び加工
ＨＳＣ、ＨＳＰＣ及び他のリンパ球の供給源は、年齢の適切なドナーに由来する、臍帯血、胎盤血、骨髄、末梢血、胚細胞、大動脈－性腺－中腎由来細胞、リンパ、肝臓、胸腺及び脾臓を含む。血液試料を含む生物学的試料の回収及び加工などに関する方法は、公知である。例えば、Ａｌｓｅｖｅｒら、１９４１、Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６；ＤｅＧｏｗｉｎら、１９４０、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．１１４：８５０；Ｓｍｉｔｈら、１９５９、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、３８：５７３；Ｒｏｕｓ及びＴｕｒｎｅｒ、１９１６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２３：２１９及びＨｕｍ、１９６８、「Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６～１６０頁；Ｋｏｄｏら、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、７３：１３７７～１３８４を参照されたい。回収された全ての試料は、所望されない構成要素についてスクリーニングされ、現時点において受け入れられている現行の基準に従い、廃棄、処理又は使用される。特定の実施形態において、生物学的試料は、目的の細胞集団を含有する、任意の生物学的流体、組織、血液細胞生成物及び／又は臓器を含む。
目的の細胞集団の供給源又はこれを含む生物学的試料は、当技術分野において一般に公知の、任意の手順を使用して、対象から得られうる。特定の実施形態において、末梢血中のＨＳＣ／ＨＳＰＣは、回収の前に動員される。末梢血ＨＳＣ／ＨＳＰＣは、任意の方法により動員されうる。末梢血ＨＳＣ／ＨＳＰＣは、対象の末梢血中を循環するＨＳＣ／ＨＳＰＣの数を増大させる、本明細書において記載されている、又は当技術分野において公知の、任意の薬剤（複数可）により、対象を処置することにより動員されうる。例えば、特定の実施形態において、末梢血は、１つ以上のサイトカイン又は増殖因子（例えば、Ｇ－ＣＳＦ、キットリガンド（ＫＬ）、ＩＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１１、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、トロンボポエチン又はＧＭ－ＣＳＦ（サルグラモスチムなど））により、対象を処置することにより動員される。末梢血を動員するための方法において使用されうる、異なる種類のＧ－ＣＳＦは、フィルグラスチム及び長時間作用型Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ化フィルグラスチムを含む。特定の実施形態において、末梢血は、１つ以上のケモカイン（例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α／ＣＣＬ３））、ケモカイン受容体リガンド（例えば、ケモカイン受容体２リガンドである、ＧＲＯβ及びＧＲＯβΔ４）、ケモカイン受容体類似体（例えば、ＣＴＣＥ－００２１、ＣＴＣＥ－０２１４などの、間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ－１α）タンパク質類似体又はＭｅｔ－ＳＤＦ－１βなどのＳＤＦ－１α）又はケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ＡＭＤ３１００などのケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）アンタゴニスト）により、対象を処置することにより動員される。
特定の実施形態において、末梢血は、１つ以上の抗インテグリンシグナル伝達剤（例えば、抗最後期抗原４（ＶＬＡ－４）抗体又は抗血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）抗体を遮断する機能）により、対象を処置することにより動員される。
末梢血は、シクロホスファミド、エトポシド又はパクリタキセルなど、１つ以上の細胞傷害薬により、対象を処置することにより動員されうる。
特定の実施形態において、末梢血は、ある特定の時間にわたり、対象へと、上記において列挙された薬剤のうちの１つ以上を、投与することにより動員されうる。例えば、対象は、ＨＳＣ／ＨＳＰＣの回収の前に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間にわたり、毎日１回又は毎日２回、注射（例えば、皮下注射、静脈内注射又は腹腔内注射）を介して、１つ以上の薬剤（例えば、Ｇ－ＣＳＦ）により処置されうる。具体的な実施形態において、ＨＳＣ／ＨＳＰＣは、ＨＳＣ／ＨＳＰＣの、末梢血への動員のために使用された薬剤の、最終回の投与の後、１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１４、１６、１８、２０又は２４時間以内に回収される。特定の実施形態において、ＨＳＣ／ＨＳＰＣは、増殖因子（例えば、Ｇ－ＣＳＦ）及びケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ＡＭＤ３１００などのＣＸＣＲ４受容体アンタゴニスト）又は増殖因子（例えば、Ｇ－ＣＳＦ又はＫＬ）及び抗インテグリン剤（例えば、ＶＬＡ－４抗体を遮断する機能）など、上記において記載された、又は当技術分野において公知の、２つ以上の異なる種類の薬剤により、対象を処置することにより動員される。異なる種類の動員剤は、共時的に投与される場合もあり、逐次的に投与される場合もある。末梢血を動員する方法に関する、さらなる情報について、例えば、Ｃｒａｄｄｏｃｋら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、９０（１２）：４７７９～４７８８；Ｊｉｎら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６：３９；Ｐｅｌｕｓ、２００８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１５（４）：２８５～２９２；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ、９１（７）：２２３１～２２３９；Ｔｒｉｃｏｔら、２００８、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９３（１１）：１７３９～１７４２及びＷｅａｖｅｒら、２００１、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２７（２）：Ｓ２３～Ｓ２９を参照されたい。
末梢血に由来するＨＳＣ／ＨＳＰＣは、対象の静脈へと挿入された、シリンジ又はカテーテルを介して、血液から回収されうる。例えば、特定の実施形態において、末梢血は、アフェレーシス装置を使用して回収されうる。血液は、カテーテルを介して、静脈から、アフェレーシス装置へと流れ、アフェレーシス装置は、ＨＳＣ／ＨＳＰＣを含む白血球を、残りの血液から分離し、次いで、残りの血液を、対象の体内へと戻す。アフェレーシスは、十分な、選択された細胞型（例えば、ＨＳＣ、Ｔ細胞）が回収されるまで、数日間（例えば、１～５日間）にわたり実施されうる。
特定の実施形態において、ＮＰは、異質性の細胞集団内の、選択された細胞型を選択的にターゲティングするため、収集された試料を、本明細書において開示されたＮＰへと曝露する前に、選択された細胞型の、さらなる回収又は単離が必要とされない。特定の実施形態において、収集された試料は、ＮＰの添加を除き、他の操作を受けていない。
一部の実施形態において、対象から回収された血液細胞は、例えば、血漿画分を除去し、後続のＮＰへの曝露のために、細胞を、適切な緩衝液中又は培地中に入れるように、洗浄される。特定の実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）により洗浄される。一部の実施形態において、洗浄液は、カルシウム及び／若しくはマグネシウム並びに／又は多くの二価カチオン若しくは全ての二価カチオンを欠く。洗浄は、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ）を使用して達せられうる。接戦流濾過（ＴＦＦ）もまた、実施されうる。特定の実施形態において、細胞は、洗浄の後に、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有ＰＢＳなど、様々な生体適合性緩衝液中において再懸濁させられうる。
特定の実施形態において、本明細書において開示されたＮＰへの曝露の前に、一部の限定的な、さらなる細胞の回収及び単離に携わることが有益でありうる。特定の実施形態において、選択された細胞型は、任意の適切な技法を使用して、試料から、回収及び単離されうる。適切な回収手順及び単離手順は、磁気分離；蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：１００４；Ｌｕら、１９８６、Ｂｌｏｏｄ、６８（１）：１２６～１３３）；アフィニティークロマトグラフィー；モノクローナル抗体へと接合された薬剤又はモノクローナル抗体と共に使用された薬剤；固体マトリックスへと接合された抗体による「パニング」（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７３：９３９～９５３）；ダイズなどのレクチンを使用する、選択的凝集反応（Ｒｅｉｓｎｅｒら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７７：１１６４）などを含む。特定の実施形態は、限定的単離を利用しうる。限定的単離とは、例えば、赤血球及び／又は接着性食細胞の除去による、粗細胞濃縮を指す。
特定の実施形態において、対象試料（例えば、血液試料）は、例えば、磁気粒子へと、直接的に、又は間接的にコンジュゲートされた抗体を、磁気細胞分離器、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と関連させて使用する、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを使用して、図２に関して記載された細胞プロファイルについて、選択／濃縮するように加工されうる。特定の実施形態において、一部の限定的な細胞濃縮が実施される場合、試料中の細胞は、ＣＤ３４単独；ＣＤ１３３＋単独；ＣＤ９０＋単独；ＣＤ１６４＋単独；ＣＤ４６＋単独又はＬＨ＋単独に基づき濃縮されうる。特定の実施形態において、細胞は、多様な組合せにおける、ＣＤ３４；ＣＤ１３３＋；ＣＤ９０＋；ＣＤ１６４＋；ＣＤ４６＋；ＡＨＲ＋又はＬＨ＋のうちの１つ以上に基づき濃縮及び／又は単離されうる。特定の実施形態において、ＬＨ＋とは、細胞が、ＬＨＲＨ受容体を発現することを意味する。特定の実施形態において、ＡＨＲ＋とは、細胞が、アリール炭化水素受容体を発現することを意味する。
最小操作ではないが、低操作が実施される場合、ＨＳＣ／ＨＳＰＣを拡大することが有用でありうる。拡大は、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ、例えば、Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ５、Ａｎｇｐｔｌ７及びＭｆａｐ４）；エリスロポエチン；線維芽細胞増殖因子－１（ＦＧＦ－１）；Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；インスリン増殖因子２（ＩＦＧ－２）；インターロイキン３（ＩＬ－３）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；インターロイキン７（ＩＬ－７）；インターロイキン１１（ＩＬ－１１）；幹細胞因子（ＳＣＦ；また、ｃ－ｋｉｔリガンド又はマスト細胞増殖因子としても公知である）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びこれらの類似体（この場合、類似体は、天然に存在する増殖因子の生物学的活性を有する、増殖因子の、任意の構造変異体を含む；例えば、ＷＯ２００７／１１４５２２７及び米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号を参照されたい）など、１つ以上の増殖因子の存在下において生じうる。
特定の実施形態において、ＨＳＣ／ＨＳＰＣ又はリンパ球を拡大するために適する増殖因子の量又は濃度は、増殖を促進するのに効果的な量又は濃度である。リンパ球集団は、好ましくは、ヒト対象への少なくとも１回の注入を施すのに十分な数の細胞、典型的に１ｋｇ当たりの細胞約１０４個～１ｋｇ当たりの細胞１０９個が得られるまで、拡大される。
ＨＳＣ／ＨＳＰＣ又はリンパ球を拡大するために適する増殖因子の量又は濃度は、増殖因子調製物の活性及び増殖因子とリンパ球との種間の対応関係などに依存する。一般に、増殖因子（複数可）と、リンパ球とが、同じ種である場合、増殖因子の、培養培地中の総量は、１ｎｇ／ｍｌ～５μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ又は５ｎｇ／ｍｌ～２５０ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態において、増殖因子の量は、５～１０００又は５０～１００ｎｇ／ｍｌの範囲でありうる。
特定の実施形態において、増殖因子は、以下の濃度：２５～３００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５～３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３Ｌ、２５～１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３の、拡大培養条件において存在する。特定の実施形態において、５０、１００又は２００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；５０、１００又は２００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３Ｌ；５０又は１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ；５０又は１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３が使用されうる。
ＨＳＣ／ＨＳＰＣ又はリンパ球は、フィブロネクチン（ＦＮ）又はその断片（例えば、ＣＨ－２９６（Ｄａｏら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ、９２（１２）：４６１２～２１））又はＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（組換えヒトフィブロネクチン断片；（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などの細胞外マトリックスタンパク質が、結合された組織培養ディッシュ内において拡大されうる。
Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ＨＳＣ／ＨＳＰＣを拡大するために、特に有用でありうる。特定の実施形態において、ＨＳＣ／ＨＳＰＣは、ＨＳＣ／ＨＳＰＣを、固定化されたＮｏｔｃｈアゴニスト及び５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；固定化されたＮｏｔｃｈアゴニスト並びに５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌの、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－６、ＴＰＯ及びＳＣＦの各々又は固定化されたＮｏｔｃｈアゴニスト並びに５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌの、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－６、ＴＰＯ及びＳＣＦの各々並びに１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１又はＩＬ－３へと曝露することにより拡大されうる。
適切な培養条件及び／又は拡大条件に関する、さらなる一般情報について、米国特許第７，３９９，６３３号；米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ」、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９４）；Ｖａｍｕｍ－Ｆｉｎｎｅｙら、１９９３、血液、１０１：１７８４～１７８９；Ｏｈｉｓｈｉら、２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１０：１１６５～１１７４；Ｄｅｌａｎｅｙら、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１６（２）：２３２～２３６；ＷＯ２００６／０４７５６９Ａ２；ＷＯ２００７／０９５５９４Ａ２；米国特許第５，００４，６８１号；ＷＯ２０１１／１２７４７０Ａ１；ＷＯ２０１１／１２７４７２Ａ１を参照し、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、２００６年８月の２章、及びこの中に引用されている参考文献を参照されたい。
最小操作ではないが、低操作による製造が実施される場合、試料は、密度ベースの細胞分離方法及び関連する方法を使用することにより、Ｔ細胞について濃縮されうる。例えば、白血球は、赤血球を溶解させ、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配又はＦｉｃｏｌｌ勾配を介して、試料を遠心分離することにより、末梢血中の他の細胞型から分離されうる。
特定の実施形態において、特定のＴ細胞型について濃縮されていない、バルクＴ細胞集団が使用されうる。特定の実施形態において、選択されたＴ細胞型は、細胞マーカーベースの陽性選択及び／又は陰性選択に基づき濃縮及び／又は単離されうる。異なるＴ細胞亜集団についての細胞マーカーについては、上記において記載されている。特定の実施形態において、高レベルの１つ以上の表面マーカーについて陽性である、又はこれらを発現する細胞、例えば、ＣＣＲ７ Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ２７ Ｔ細胞、ＣＤ２８ Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ Ｔ細胞、ＣＤ１２７ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ４５ＲＡ Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的な亜集団、は、陽性選択法又は陰性選択法により単離される。
ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用して、陽性選択及び拡大されうる。
特定の実施形態において、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋の選択ステップは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するのに使用される。このようなＣＤ８＋／ＣＤ４＋集団は、１つ以上のナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団及び／又はエフェクターＴ細胞亜集団において発現された、又は比較的高度に発現されたマーカーについての陽性選択又は陰性選択により、亜集団へと、さらに分取されうる。
一部の実施形態において、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮が実行される。特定の実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ細胞の両方のＣＤ６２Ｌサブセットに存在する。ＰＢＭＣは、例えば抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用することによって、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８及び／又はＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分について濃縮又は枯渇することができる。
一部の実施形態において、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮は、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ３及び／又はＣＤ１２７の、正の表面発現又は高度の表面発現に基づき、一部の態様において、ＴＣＭ細胞についての濃縮は、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現する細胞又はこれらを高度に発現する細胞についての陰性選択に基づく。一部の態様において、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇並びにＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ６２Ｌを発現する細胞についての、陽性選択又は濃縮により実行される。一態様において、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮は、ＣＤ４の発現に基づき選択された細胞の陰性画分により出発し、これを、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づく陰性選択並びにＣＤ６２Ｌに基づく陽性選択にかけて実行される。一部の態様において、このような選択は、同時に実行され、他の態様において、いずれかの順序において、逐次的に実行される。ＣＤ４ベースの分離に由来する、陽性画分及び陰性画分の両方、任意選択的に、以下の１つ以上の、さらなる陽性選択ステップ又は陰性選択ステップが保持されるように、一部の態様において、ＣＤ８＋の細胞集団又は亜集団の調製において使用された、同じＣＤ４発現ベースの選択ステップがまた、ＣＤ４＋の細胞集団又は亜集団を発生させるのにも使用される。
特定の例において、ＰＢＭＣ試料又は他の白血球試料は、ＣＤ４＋細胞の選択にかけられ、この場合、陰性画分及び陽性画分の両方が保持される。次いで、陰性画分は、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡ又はＲＯＲ１の発現に基づく陰性選択及びＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ６２Ｌなど、セントラルメモリーＴ細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択にかけられ、この場合、陽性選択及び陰性選択は、いずれかの順序において実行される。
特定の実施形態において、細胞の濃縮は、ＦＡＣＳ分取された、バルクＣＤ８＋細胞集団を結果としてもたらす。
Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞集団を拡大する、培養誘発組成物中においてインキュベートされうる。インキュベーションは、バッグ、細胞培養物プレート、フラスコ、チャンバー、クロマトグラフィーカラム、架橋ゲル、架橋ポリマー、カラム、培養物ディッシュ、中空糸、マイクロ滴定プレート、シリカコーティングガラスプレート、チューブ、チューブセット、ウェル、バイアル又は培養若しくは細胞培養のための他の容器など、培養容器内において実行されうる。
培養条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時、薬剤、例えば、栄養物質、アミノ酸、抗生剤、イオン及び／又はサイトカイン、ケモカイン、抗原などの刺激因子、結合性パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体及び細胞を活性化するようにデザインされた、他の任意の薬剤のうちの１つ以上を含みうる。
一部の態様において、インキュベーションは、ＵＳ６，０４０，１７７；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら（２０１２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６５１～６６０；Ｔｅｒａｋｕｒａら（２０１２）、Ｂｌｏｏｄ、１：７２～８２及び／又はＷａｎｇら（２０１２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９～７０１において記載された技法などの技法に従い実行される。
Ｔ細胞を培養するための、例示的な培養培地は、（ｉ）非必須アミノ酸、ナトリウムピルビン酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ；（ｉｉ）ＨＥＰＥＳ、５～１５％のヒト血清、１～３％のＬ－グルタミン、０．５～１．５％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．２５×１０－４～０．７５×１０－４Ｍのβ－メルカプトエタノールを伴うＲＰＭＩ；（ｉｉｉ）１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ－１６４０；（ｉｖ）１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ培地並びに（ｖ）５％のヒトＡＢ型血清（Ｇｅｍｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）、１％のＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び２％のＮ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充された、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む。Ｔ細胞培養培地はまた、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）からも市販されている。このような培養培地へと添加されうる、さらなるＴ細胞活性化成分については、下記において、より詳細に記載される。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、培養誘発組成物へと非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を添加し（例えば、結果として得られる細胞集団が、拡大される初期集団内の各Ｔリンパ球につき、少なくとも５、１０、２０又は４０個以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）、培養物をインキュベートする（例えば、Ｔ細胞の数を拡大するのに十分な時間にわたり）ことにより拡大される。一部の態様において、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含みうる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防止するように、３０００～３６００ｒａｄの範囲のガンマ線により照射される。一部の態様において、フィーダー細胞は、Ｔ細胞の集団が添加される前に、培養培地へと添加される。
任意選択的に、インキュベーションは、ＥＢＶ形質転換非分裂リンパ芽球（ＬＣＬ）を、フィーダー細胞として添加するステップをさらに含みうる。ＬＣＬは、６０００～１０，０００ｒａｄの範囲のガンマ線により照射されうる。一部の態様において、ＬＣＬフィーダー細胞は、ＬＣＬフィーダー細胞の、初期Ｔリンパ球に対する比を、少なくとも１０：１とするなど、任意の適切な量において施される。
一部の実施形態において、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の増殖に適する温度、例えば、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃又は３７℃を含む。
Ｔ細胞のための活性化培養条件は、培養誘発組成物のＴ細胞が、増殖又は拡大する条件を含む。
（ＶＩ）細胞の製剤及び低温保存
最小操作による製造加工を使用して遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変の後に、対象へと、直接投与されうる。特定の実施形態において、遺伝子改変細胞は、対象への投与のために、細胞ベースの組成物へと製剤化されうる。細胞ベースの組成物とは、対象への投与のために、薬学的に許容される担体と共に調製された細胞を指す。
細胞の投与の、例示的な担体及び投与方式について、米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号の１４～１５頁において記載されている。さらなる医薬担体について、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１版、Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ編）、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）において記載されている。
特定の実施形態において、細胞は、培養培地から採取され、洗浄され、治療有効量において、担体へと濃縮されうる。例示的な担体は、食塩液、緩衝食塩液、生理食塩液、水、ハンクス液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ－Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、Ｐｌａｓｍａ－ＬｙｔｅＡ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せを含む。
特定の実施形態において、担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は他のヒト血清成分又はウシ胎仔血清が補充されうる。特定の実施形態において、注入のための担体は、５％のＨＡＳ又はデキストロースを伴う緩衝食塩液を含む。さらなる等張剤は、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールなど、三価以上の糖アルコールを含む、多価糖アルコールを含む。
担体は、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び／又はトリメチルアミン塩などの緩衝剤を含みうる。
安定化剤は、増量剤から、容器壁面への細胞の付着を防止する一助となる添加剤に至る機能の範囲にわたる、広範な類型の賦形剤を指す。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸及びトレオニンなどのアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクシトール、グリセロール及びイノシトールなどシクリトールなどの、有機糖又は糖アルコール；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、果糖及びグルコースなどの単糖；ラクトース、マルトース及びスクロースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖並びにデキストランなどの多糖を含みうる。
必要な場合又は有益な場合、細胞ベースの組成物は、注射部位における疼痛を和らげるように、リドカインなどの局所麻酔剤を含みうる。
例示的な保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルチノール、シクロヘキサノール及び３－ペンタノールを含む。
例えば、細胞ベースの組成物中の、細胞の治療有効量は、細胞１０２個を超える、細胞１０３個を超える、細胞１０４個を超える、細胞１０５個を超える、細胞１０６個を超える、細胞１０７個を超える、細胞１０８個を超える、細胞１０９個を超える、細胞１０１０個を超える又は細胞１０１１個を超える治療有効量でありうる。患者が前処置されている場合、体重１ｋｇ当たりの注入されたＣＤ３４＋細胞、最小において２００万個と同等の生成物が好ましい。前処置されていない患者において、体重１ｋｇ当たりのＣＤ３４＋細胞、最小において１００万個が、許容可能でありうる。
本明細書において開示された、細胞ベースの組成物中において、細胞は、一般に、１リットル以下、５００ｍＬ以下、２５０ｍＬ以下又は１００ｍＬ以下の容量である。よって、投与された細胞の密度は、典型的に、１ｍＬ当たりの細胞１０４個、１ｍＬ当たりの細胞１０７個又は１ｍＬ当たりの細胞１０８個を超える。
本明細書において開示された、細胞又は細胞ベースの組成物は、例えば、注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、還流又は洗浄による投与のために調製されうる。細胞又は細胞ベースの組成物は、骨髄内注入、静脈内注入、皮内注入、動脈内注入、リンパ節内注入、リンパ管内注入、腹腔内注入、病変内注入、前立腺内注入、膣内注入、直腸内注入、局所注入、髄腔内、腫瘍内注入、筋内、小胞内注入及び／又は皮下注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のためにさらに製剤化されうる。
特定の実施形態において、細胞又は細胞ベースの組成物は、投与のための遺伝子改変及び／又は製剤化が完了したら、合理的な範囲において、可能な限り早急に、それを必要とする対象へと投与される。特定の実施形態において、細胞を低温保存することは、必要又は有益でありうる。「凍結させられた／凍結すること」及び「低温保存された／低温保存すること」という用語は、互換的に使用されうる。凍結は、凍結乾燥を含む。特定の実施形態において、新鮮な細胞の低温保存は、非所望の細胞集団を低減しうる。したがって、特定の実施形態は、ＮＰが、試料へと投与される前に、生物学的試料を低温保存することを含む。特定の実施形態において、低温保存の前に、血小板を除去するように、生物学的試料は、洗浄される。
当業者により理解される通り、細胞の凍結は、破壊的でありうる（Ｍａｚｕｒ，Ｐ．、１９７７、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４：２５１～２７２を参照されたい）が、このような損傷を防止するための、多数の手順が利用可能である。例えば、損傷は、（ａ）低温保護剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御及び／又は（ｃ）分解反応を最小化するのに、十分に低い温度における保管により回避されうる。例示的な低温保護剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ及びＢｉｓｈｏｐ、１９５９、Ｎａｔｕｒｅ、１８３：１３９４～１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ－Ｓｍｉｔｈ、１９６１、Ｎａｔｕｒｅ、１９０：１２０４～１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ、１９６０、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ及びＲａｖｄｉｎ、１９６２、Ｎａｔｕｒｅ、１９６：５４８）、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ－エリトリトール、Ｄ－リビトール、Ｄ－マンニトール（Ｒｏｗｅら、１９６２、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、２１：１５７）、Ｄ－ソルビトール、ｉ－イノシトール、Ｄ－ラクトース、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒら、１９６０、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５：５２０）、アミノ酸（Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ及びＢｅｎｄｅｒ、１９６０、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２０：６５１）、メタノール、アセトアミド、グリセロール一酢酸塩（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ、１９５４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、５６：２６５）及び無機塩（Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ及びＢｅｎｄｅｒ、１９６０、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１０４：３８８；Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ及びＢｅｎｄｅｒ、１９６１、「Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｉｒｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉｌｂｅｒｙ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、５９頁）を含む。特定の実施形態において、ＤＭＳＯが使用されうる。血漿の添加（例えば、２０～２５％の濃度まで）は、ＤＭＳＯの保護効果を強化しうる。ＤＭＳＯの添加の後、４℃を上回る温度において、１％のＤＭＳＯ濃度は、毒性でありうるため、細胞は、凍結まで、０℃において保たれうる。
細胞の低温保存において、冷却速度の緩徐な制御が、極めて重要な場合があり、異なる低温保護剤（Ｒａｐａｔｚら、１９６８、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、５（１）：１８～２５）及び異なる細胞型は、異なる最適冷却速度を有する（冷却速度の、幹細胞の生存及びそれらの移植可能性に対する影響について、例えば、Ｒｏｗｅ及びＲｉｎｆｒｅｔ、１９６２、Ｂｌｏｏｄ、２０：６３６；Ｒｏｗｅ、１９６６、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、３（１）：１２～１８；Ｌｅｗｉｓら、１９６７、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、７（１）：１７～３２及びＭａｚｕｒ、１９７０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６８：９３９～９４９を参照されたい）。水が、氷に変わる場合の融合相の熱は、最小であるものとする。冷却手順は、例えば、プログラム型凍結デバイス又はメタノール浴手順の使用により実行されうる。プログラム型凍結装置は、最適の冷却速度の決定を可能とし、再現可能な標準的冷却を容易とする。
特定の実施形態において、ＤＭＳＯ処理細胞は、氷上において、あらかじめ冷却し、低温メタノールを含有するトレーへと移し、これを、－８０℃の機械式冷凍庫（例えば、Ｈａｒｒｉｓ又はＲｅｖｃｏ）に入れることができる。１℃～３℃／分の冷却速度を指し示す、メタノール浴及び試料の熱電対による測定値が、好ましい場合がある。少なくとも２時間後に、検体は、－８０℃の温度に到達することが可能であり、液体窒素（－１９６℃）へと、直接入れることができる。
完全な凍結の後、細胞は、速やかに、長期極低温保管用容器へと移されうる。特定の実施形態において、試料は、液体窒素（－１９６℃）中又は窒素蒸気（－１℃）中において、極低温保管されうる。このような保管は、高性能の液体窒素冷凍庫の利用可能性により容易とされる。
細胞の操作、低温保存及び長期にわたる保管のための、さらなる検討事項及び手順は、以下の例示的な参考文献：米国特許第４，１９９，０２２号；同第３，７５３，３５７号及び同第４，５５９，２９８号；Ｇｏｒｉｎ、１９８６、Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１５（１）：１９～４８；「Ｂｏｎｅ－Ｍａｒｒｏｗ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｐａｎｅｌ、Ｍｏｓｃｏｗ、１９６８年７月２２～２６日、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ、Ｖｉｅｎｎａ、１０７～１８６頁；Ｌｉｖｅｓｅｙ及びＬｉｎｎｅｒ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２７：２５５；Ｌｉｎｎｅｒら、１９８６、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３４（９）：１１２３～１１３５；Ｓｉｍｉｏｎｅ、１９９２、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、４６（６）：２２６～３２において見出されうる。
低温保存の後、凍結細胞は、当業者に公知の方法に従う使用のために融解させうる。凍結細胞は、速やかに融解させ、融解させたらすぐに冷やすことが好ましい。特定の実施形態において、凍結細胞を含有するバイアルを、そのネック部まで、温水浴中に浸漬させると、細胞懸濁液が、融解し、温水から、内部の氷塊への熱伝導を増大させるにつれて、軽微な回転動が、細胞懸濁液の混合を確保する。氷が、完全に溶けたらすぐに、バイアルを、氷上に置くことができる。
特定の実施形態において、方法は、融解時における細胞の凝集を防止するのに使用されうる。例示的な方法は、凍結の前及び／又は後における、ＤＮアーゼ（Ｓｐｉｔｚｅｒら、１９８０、Ｃａｎｃｅｒ、４５：３０７５～３０８５）、低分子量デキストラン及びクエン酸、ヒドロキシエチルデンプン（Ｓｔｉｆｆら、１９８３、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１７～２４）などの添加を含む。
当業者により理解される通り、ヒトに対して毒性である、低温保護剤が使用される場合、治療的使用の前に除去されるべきである。ＤＭＳＯは、重大な毒性を有さない。
（ＶＩＩ）ナノ粒子製剤
本明細書において開示されたＮＰはまた、対象への直接的な投与のために、製剤化もなされうる。図４に描示される通り、ＡｕＮＰのサイズは、ヒト体内の生体内分布に影響を及ぼすように選択されうる。本開示における使用に適するＮＰは、任意の形状であることが可能であり、５ｎｍ～１０００ｎｍのサイズ、例えば、５ｎｍ～１０ｎｍ、５～５０ｎｍ、５ｎｍ～７５ｎｍ、５ｎｍ～４０ｎｍ、１０ｎｍ～３０又は２０ｎｍ～３０ｎｍの範囲でありうる。ＮＰはまた、１０ｎｍ～１５ｎｍ、１５ｎｍ～２０ｎｍ、２０ｎｍ～２５ｎｍ、２５ｎｍ～３０ｎｍ、３０ｎｍ～３５ｎｍ、３５ｎｍ～４０ｎｍ、４０ｎｍ～４５ｎｍ又は４５ｎｍ～５０ｎｍ、５０ｎｍ～５５ｎｍ、５５ｎｍ～６０ｎｍ、６０ｎｍ～６５ｎｍ、６５ｎｍ～７０ｎｍ、７０ｎｍ～７５ｎｍ、７５ｎｍ～８０ｎｍ、８０ｎｍ～８５ｎｍ、８５ｎｍ～９０ｎｍ、９０ｎｍ～９５ｎｍ、９５ｎｍ～１００ｎｍ、１００ｎｍ～１０５ｎｍ、１０５ｎｍ～１１０ｎｍ、１１０ｎｍ～１１５ｎｍ、１１５ｎｍ～１２０ｎｍ、１２０ｎｍ～１２５ｎｍ、１２５ｎｍ～１３０ｎｍ、１３０ｎｍ～１３５ｎｍ、１３５ｎｍ～１４０ｎｍ、１４０ｎｍ～１４５ｎｍ、１４５ｎｍ～１５０ｎｍ、１００ｎｍ～５００ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、２００ｎｍ～２５０ｎｍ、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、３００ｎｍ～３５０ｎｍ、３５０ｎｍ～４００ｎｍ、４００ｎｍ～４５０ｎｍ又は４５０ｎｍ～５００ｎｍの範囲のサイズも有しうる。特定の実施形態において、５５０ｎｍを超えるＮＰは、除外される。これは、＞６００ｎｍの粒子又は凝集粒子が、細胞への取込みに適さないためである。
組成物中の、ＮＰの治療有効量は、少なくとも０．１％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも１％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも１０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも２０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも３０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも４０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも５０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも６０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも７０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも８０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも９０％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子；少なくとも９５％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子又は少なくとも９９％ｗ／ｖ若しくは％ｗ／ｗの粒子を含みうる。
（ＶＩＩＩ）キット
本開示はまた、本明細書において開示された要素のうちの、任意の１つ以上を含有するキットも提示する。特定の実施形態において、キットは、ガイドＲＮＡ及び標的配列を切断することが可能なヌクレアーゼを含む、本明細書において記載されたＮＰを含みうる。加えて、キットは、１つ以上のＨＤＴ、ターゲティングリガンド及び／又はポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＥＩ）を含みうる。要素は、個別に提供される場合もあり、組合せにより提供される場合もあり、バイアル、ボトル、バッグ又はチューブなど、任意の適切な容器により提供されうる。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語による指示書を含む。
特定の実施形態において、キットは、本明細書において開示された要素のうちの１つ以上を利用する工程における使用のための、１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器により提供されうる。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は保管緩衝液を提供しうる。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態において提供される場合もあり、使用の前に、１つ以上の他の構成要素の添加を要求する形態において（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態において）提供される場合もある。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、任意の緩衝液でありうる。一部の実施形態において、緩衝液は、アルカリである。一部の実施形態において、緩衝液は、７～１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、ガイドＲＮＡ（例えば、ｃＲＮＡ）、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）、Ａｕコア及び／又は相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。
キットはまた、細胞を、投与のために、回収、加工、改変、及び／又は製剤化する、１つ以上の構成要素も含みうる。キットは、低操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）又は最小操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）を経た、エクスビボにおける細胞製造を実施するための構成要素と共に提供されうる。臨床従事者のための製品及び／又は指示書もまた、含まれうる。
（ＩＸ）例示的な使用方法
指し示された通り、選択された細胞型は、対象から得られうる。特定の実施形態において、細胞は、元の試料が、治療有効量において導出された、同じ対象へと再導入される。特定の実施形態において、細胞は、治療有効量において、異なる対象へと投与される。
本明細書において開示された組成物及び製剤は、対象（ヒト、獣医科動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類など）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど）及び研究動物（サル、ラット、マウス、魚類など）を処置するために使用されうる。特定の実施形態において、対象は、ヒト患者である。
本明細書において記載された、低操作又は最小操作により製造された、ＮＰ組成物又は細胞製剤を使用して処置されうる疾患の例は、単成性血液障害、血友病、グレーブス病、関節リウマチ、悪性貧血、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、バッテン病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）又は異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、筋ジストロフィー、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）、ピルビン酸キナーゼ欠損症、シュバックマン－ダイアモンド－ブラックファン貧血、先天性角化不全症、嚢胞性線維症、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルーゲーリック秒）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、原発性骨髄線維症、巨核球無形成症／先天性血小板減少症、毛細血管拡張性運動失調症、β－サラセミアメジャー、ＣＬＬ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄端急性白血病、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、補体障害、先天性（Ｘ連鎖）無ガンマグロブリン血症、家族性血球貪食性リンパ組織球増多症、ホジキンリンパ腫、ハーラー症候群、高ＩｇＭ症、ＩｇＧサブクラス欠損症、若年性骨髄単急性白血病、ムコ多糖症、多発性骨髄腫、骨髄異形成、非ホジキンリンパ腫、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、抗体産生不全症を伴う原発性免疫不全疾患、赤芽球癆、不応性貧血、選択的ＩｇＡ欠損症、重度再生不良性貧血、ＳＣＤ及び／又は特異抗体産生不全症を含む。
（Ｘ）例示的な製造実施形態及び比較
Figure 2024045297000029
例示的な製造プロトコールの比較
Figure 2024045297000030
Figure 2024045297000031
Figure 2024045297000032
Figure 2024045297000033
（ＸＩ）ナノ粒子の性能を評価するアッセイ
細胞集団によるＮＰの取込みの有効性、細胞生存率に対する、ＮＰの取込みに由来する効果及び本明細書において記載されたＮＰを使用して遺伝子改変された細胞集団を含む、最小操作を経た血液細胞生成物中の、任意の余剰ＮＰの存在を含む、明細書において記載されたＮＰの有効性を評価するのに、当技術分野で公知のアッセイが使用されうる。選択された細胞集団の、遺伝子編集の存在、レベル又は遺伝子編集率もまた、上記で記載した通りに決定されうる。アッセイはまた、本明細書において記載されたＮＰを含む治療用製剤が、さらなる開発のために選択されるのかどうか、及び／又は本明細書において記載されたＮＰを使用して遺伝子改変された細胞集団を含む、最小操作を経た血液細胞生成物が、さらなる開発のために選択されるのかどうかを決定するのにも使用されうる。
細胞集団によるＮＰの取込みは、当技術分野で公知のいくつかの方法であって、共焦点顕微鏡、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）並びにＩＣＰ－質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、ＩＣＰ－原子発光分光法（ＩＣＰ－ＡＥＳ）及びＩＣＰ－発光分光法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を含む、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）法を含む方法により評価されうる。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及び／又はドナー鋳型は、染料で標識される場合があり、共焦点顕微鏡を使用して、細胞による取込みについて評価されうる。特定の実施形態において、蛍光的に標識付けされた抗体であって、細胞表面マーカーを認識する抗体を使用するＦＡＣＳは、目的の細胞集団が、標識付けされたＮＰによりターゲティングされているのかどうかについて調べるのに、共焦点顕微鏡と共に使用されうる。特定の実施形態において、標識付けされた抗体であって、細胞表面マーカーを認識する抗体が、磁化微粒子上に存在し、標識付けされたＮＰにより、どの細胞集団がターゲティングされているのかを決定するのに、免疫磁気ビーズベースの分取が実施されうる。特定の実施形態において、ＩＣＰ法は、定性的／定量的微量元素検出を可能とする。ＩＣＰの特定の実施形態は、検出のために、試料を微粒化又は励起するのに、プラズマを使用する。特定の実施形態において、ＩＣＰは、ラジオ周波数発生器のエネルギーを、ＩＣＰ用のアルゴン、ヘリウム又は窒素など、適切な気体へと向けることにより、発生させうる。特定の実施形態において、ＩＣＰ－ＭＳは、本明細書において記載されたＮＰを使用して遺伝子改変された細胞集団を含む、最小操作を経た血液細胞生成物中の、任意の余剰ＮＰを検出するのに使用されうる。
特定の実施形態において、標的細胞のうちの、５０％～１００％、５０％～９０％又は５０％～８０％は、本明細書において記載されたＮＰを取り込む。特定の実施形態において、標的細胞のうちの、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％は、本明細書において記載されたＮＰを取り込む。特定の実施形態において、標的細胞は、本明細書において記載されたＮＰにより、遺伝子改変のためにターゲティングされる細胞である。特定の実施形態において、標的細胞は、細胞上の細胞表面マーカーに結合する、ＮＰ上のターゲティングリガンドを介して、ＮＰによりターゲティングされる細胞である。特定の実施形態において、非標的細胞は、本明細書において記載されたＮＰにより、遺伝子改変のためにターゲティングされない細胞である。特定の実施形態において、非標的細胞は、それらが、ＮＰ上のターゲティングリガンドにより認識される細胞表面マーカーを発現しないために、本明細書において記載されたＮＰによりターゲティングされない細胞である。
死細胞を、もっぱら標識するので、生存細胞と死細胞とを弁別するのに使用されうる染料である、トリパンブルーを使用して、異なる時点において、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置の後における細胞生存率を解析することができる。トリパンブルーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）など、市販品の販売元から入手可能である。細胞の計数は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製のＣｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒなどの細胞カウンターを使用して実施されうる。各試料の細胞生存率パーセントは、平均値±ＳＤとして記録及び報告されうる。
細胞生存率はまた、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）アッセイキットなど、蛍光ベースのアッセイを使用しても解析されうる。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）アッセイにおいて、２つの化合物が、生存細胞と死細胞とを識別しうる。第１の、細胞非透過性の染料（例えば、エチジウムホモ二量体１）は、生細胞の表面だけに結合し、極めて薄暗い蛍光をもたらす一方、死細胞の細胞膜を透過し、内部分子に結合し、極めて明るい蛍光をもたらす。第２の、細胞透過性の非蛍光染料（例えば、カルセインＡＭ）は、生存細胞内のエラステラーゼ活性により、蛍光形（例えば、カルセイン）へと転換されうる。標識付けされた細胞は、適切な励起値及び発光値を使用する、蛍光顕微鏡下において、イメージングされうる。生細胞及び死細胞は、適切なソフトウェアを使用して、カウント及びイメージングされうる。
特定の実施形態において、標的細胞のうちの、７０％～１００％、７０％～９０％又は７０％～８０％は、本明細書において記載されたＮＰを含む治療用製剤による処置の後で、生存可能である。特定の実施形態において、標的細胞のうちの、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％は、本明細書において記載されたＮＰを含む治療用製剤による処置の後で、生存可能である。
特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰにより処置されたＨＳＣ／ＨＳＰＣの適応度は、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ（また、メチルセルロースアッセイとしても公知である）により評価されうる。ＣＦＣアッセイにおいて、ＨＳＣ／ＨＳＰＣが、半固体培地中において、サイトカインの刺激に応答して、コロニーへと増殖し、分化する能力を評価しうる。細胞は、組換えヒト増殖因子を含有するメチルセルロース中に播種し、指定された時間にわたりインキュベートしうる。結果として得られたコロニーを、播種された細胞数（例えば、播種された細胞１００，０００個）当たりのコロニー形成細胞数を決定するように、実体顕微鏡上において、カウントし、形状について評定しうる。
特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰにより処置されたＨＳＣ／ＨＳＰＣの適応度は、致死線量未満において照射された免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ－／－；ＮＳＧ）マウスを使用するインビボ研究により評価されうる。これらの研究は、骨髄抑制宿主を再構成する細胞の能力により、ＨＳＣ／ＨＳＰＣの適応度を評価しうる。特定の実施形態において、指定された数の細胞が、ＮＳＧマウスへと注入される場合があり、マウスは、ＨＳＣ／ＨＳＰＣの生着を評価するために、何週間もにわたり追跡される。
ＨＳＣ／ＨＳＰＣ及び／又は他の細胞集団の生着は、生物学的試料（例えば、血液、骨髄、脾臓）を、マウスから回収し、細胞表面マーカーに結合する、蛍光標識付け抗体を使用して、ＦＡＣＳを実施することにより評価されうる。特定の実施形態において、ＦＡＣＳは、ＣＤ４５発現細胞（ＨＳＣ／ＨＳＰＣ）、ＣＤ２０発現細胞（Ｂ細胞）、ＣＤ１４発現細胞（単球）、ＣＤ３発現細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ４発現細胞（Ｔ細胞）及びＣＤ８発現細胞（Ｔ細胞）のレベルを検出しうる。特定の実施形態において、細胞表面マーカーに結合する抗体を含有する、小型の磁化粒子を含む、免疫磁気ビーズベースの分取が使用されうる。
特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰを含む治療用製剤は、インビボにおける再注入試験に対する、治療用製剤適性を決定するための、出荷試験を受ける場合がある。特定の実施形態において、出荷試験は、グラム染色、３日間の滅菌試験、１４日間の滅菌試験、マイコプラズマ、内毒素及びトリパンブルーによる細胞生存率を含む。特定の実施形態において、出荷試験が、グラム染色、３日間の滅菌試験、１４日間の滅菌試験及びマイコプラズマ；≦０．５ＥＵ／ｍＬの内毒素；及びトリパンブルーによる、≧７０％生存率について陰性結果をもたらす場合、治療用製剤は、さらなる開発へと進められうる。
特定の実施形態において、本明細書において記載されたＮＰを使用して遺伝子改変された細胞集団を含む、最小操作を経た血液細胞生成物の性能は、ＮＳＧマウスを使用して、インビボにおいて評価されうる。特定の実施形態において、ＨＳＣ／ＨＳＰＣ及び／又は他の細胞集団の生着は、上記で記載した通りに評価されうる。
本明細書において記載されたＮＰを使用して遺伝子改変された細胞集団を含む、最小操作を経た血液細胞生成物を注入されたマウスは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒら、「Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２０１２；２：１４５～１６５において記載されたプロトコールに従い、注入の、健康状態（例えば、毛繕い、体重、活動レベル）に対する、任意の効果について、視覚的にモニタリングされうる。特定の実施形態において、注入された血液細胞生成物中の、ＮＰの存在は、ＩＣＰ－ＭＳにより評価されうる。特定の実施形態において、マウスの尿中及び糞便中の、ＮＰの存在は、全てのＮＰが、クリアランスされたのかどうか（質量収支）を決定するように、注入後の、所与の時点（例えば、７２時間後）において、ＩＣＰ－ＭＳにより評価されうる。特定の実施形態において、７２時間にわたる、尿／糞便中の最小閾値は、０であり、最大閾値は、注入された全質量を超えない。生体内蓄積が指し示される場合、生存マウスについての、マイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）によるイメージングを実施して、蓄積の位置について評価することができる。特定の実施形態において、ＩＣＰ－ＭＳ及び／又は剖検もまた、生体内蓄積のための部位を決定するのに実施されうる。特定の実施形態において、マイクロＣＴ、剖検及び／又は微量元素解析（例えば、ＩＣＰ－ＭＳ）は、注入されたマウスにおける、ＮＰの潜在的な毒性を評価するように、組織病理学と組み合わされうる。特定の実施形態において、注入されたマウスにおける臓器毒性は、全てのドナーに由来する非処置対照と比べて比較される。特定の実施形態において、組織病理学について、最小閾値は、毒性なしであり、最大閾値は、各標的臓器について公表されている、有害事象基準を使用してグレードづけされる。
（ＸＩＩ）例示的実施形態
１．低操作又は最小操作を受けた生物学的試料中の、選択された細胞集団を遺伝子改変する方法であって、本明細書において開示されたナノ粒子（ＮＰ）を、生物学的試料へと添加するステップを含む方法。
２．ＮＰが、金ＮＰ（ＡｕＮＰ）である、実施形態１に記載の方法。
３．ＮＰが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、ｇＲＮＡの一方の末端が、リンカーへとコンジュゲートされ、ｇＲＮＡの他方の末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされ、リンカーは、ｇＲＮＡの、ＮＰの表面への共有結合的連結を可能とする、実施形態１又は２に記載の方法。
４．ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、実施形態３に記載の方法。
５．ｃｒＲＮＡの３’末端が、リンカーへとコンジュゲートされている、実施形態４に記載の方法。
６．ｃｒＲＮＡの５’末端が、リンカーへとコンジュゲートされている、実施形態４に記載の方法。
７．ｃｒＲＮＡの５’末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされている、実施形態４又は５に記載の方法。
８．ｃｒＲＮＡの３’末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされている、実施形態４又は６に記載の方法。
９．リンカーが、チオール修飾を伴うスペーサーを含む、実施形態３～８のいずれかに記載の方法。
１０．スペーサーが、オリゴエチレングリコールスペーサーである、実施形態９に記載の方法。
１１．オリゴエチレングリコールスペーサーが、原子１０～２６個のオリゴエチレングリコールスペーサーである、実施形態１０に記載の方法。
１２．オリゴエチレングリコールスペーサーが、原子１８個のオリゴエチレングリコールスペーサーである、実施形態１０又は１１に記載の方法。
１３．ｃｒＲＮＡが、配列番号５；配列番号６；配列番号１３；配列番号１４又は配列番号２２５～２６４に明示された配列を含む、実施形態３～１２のいずれかに記載の方法。
１４．ＮＰが、ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼより、ＮＰの表面から離れたドナー鋳型をさらに含む、実施形態３～１３のいずれかに記載の方法。
１５．ドナー鋳型が、治療用遺伝子を含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．治療用遺伝子が、骨格タンパク質４．１、グリコフォリン、ｐ５５、Ｄｕｆｆｙの対立遺伝子、グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質の遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；Ｃ９ＯＲＦ７２、α２β１；αｖβ３；αｖβ５；αｖβ６３；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ－３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼＮ；ＨＨＶ－７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ－１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；α－ジストログリカン；ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ－１、ＢＤＮＦ、ベータ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ－ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ－１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ－１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ－１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ－４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ及びＦａｎｃＷ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ１、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ－１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ＩＬ－１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ－１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ－１、ＬＵＣＡ－２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ－３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭＡ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ－ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ－１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、Ｆ８、Ｆ９、ＨＢＢ、ＣＹＢ５Ｒ３、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ並びにＳＬＣ４６Ａ１を含む、又はこれらをコードする、実施形態１５に記載の方法。
１７．ドナー鋳型が、修飾を受けるゲノム配列に対する相同性を有する配列を含む相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）を含む、実施形態１４～１６のいずれかに記載の方法。
１８．ＨＤＴが、配列番号２；配列番号４；配列番号８；配列番号１５；配列番号３３～４１又は配列番号４４～５２に明示された配列を含む、実施形態１８に記載の方法。
１９．ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、実施形態１４～１８のいずれかに記載の方法。
２０．ＮＰが、少なくとも３つの層と会合したＡｕＮＰであり、第１の層が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含み、第２の層が、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、第３の層が、ヌクレアーゼを含み、第１の層が、ＡｕＮＰコアの表面に対する最近接層であり、第２の層が、ＡｕＮＰコアの表面に対する、第２の最近接層であり、第３の層が、ＡｕＮＰコアの表面に対する、第３の最近接層である、実施形態１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．第１の層が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．添加するステップが、生物学的試料１ミリリットル（ｍＬ）当たりのＮＰ １、２、３、４、５、８、１０、１２、１５又は２０μｇの量において添加するステップである、実施形態１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．生物学的試料及び添加されたＮＰが、１～４８時間にわたりインキュベートされる、実施形態１～２２のいずれかに記載の方法。
２４．生物学的試料及び添加されたＮＰが、試験が、ＮＰの、細胞への取込みを確認するまでインキュベートされる、実施形態１～２２のいずれかに記載の方法。
２５．試験が、共焦点顕微鏡イメージング法又は誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）法を含む、実施形態２４に記載の方法。
２６．試験が、ＩＣＰ－質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、ＩＣＰ－原子発光分光法（ＩＣＰ－ＡＥＳ）又はＩＣＰ－発光分光法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を含む、実施形態２４又は２５に記載の方法。
２７．ＮＰが、正帯電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））コーティングと会合している、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
２８．正帯電ポリマーコーティングが、ＮＰの表面を創出し、表面が、任意選択的に、ドナー鋳型を含む、実施形態２７に記載の方法。
２９．ＮＰが、ターゲティングリガンドを含む、実施形態１～２８のいずれかに記載の方法。
３０．ターゲティングリガンドが、抗体若しくはこの抗原結合性断片、アプタマー、タンパク質及び／又は結合性ドメインを含む、実施形態２９に記載の方法。
３１．ターゲティングリガンドが、ＮＰの表面を越えて伸長する、実施形態２９又は３０に記載の方法。
３２．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体又はアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に結合する結合性分子（例えば、抗体クローン：５８１；抗体クローン：５６１；抗体クローン：ＲＥＡ１１６４；抗体クローン：ＡＣ１３６；抗体クローン：５Ｅ１０；抗体クローン：ＤＧ３；抗体クローン：ＲＥＡ８９７；抗体クローン：ＲＥＡ８２０；抗体クローン：ＲＥＡ７５３；抗体クローン：ＲＥＡ８１６；抗体クローン：２９３Ｃ３；抗体クローン：ＡＣ１４１；抗体クローン：ＡＣ１３３；抗体クローン：７；アプタマーＡ１５；アプタマーＢ１９；ＨＣＧ（タンパク質／リガンド）；黄体形成ホルモン（ＬＨタンパク質／リガンド）又は前出のうちのいずれかに由来する結合性断片）である、実施形態２９～３１のいずれかに記載の方法。
３３．ターゲティングリガンドが、抗ヒトＣＤ３抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ３４抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４６抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ９０抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１６４抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３アプタマー、ヒト黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、デガレリクス酢酸塩又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １である、実施形態２９～３２のいずれかに記載の方法。
３４．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、連結されている、実施形態２９～３３のいずれかに記載の方法。
３５．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミノ酸リンカー（例えば、直接的アミノ酸リンカー、可撓性アミノ酸リンカー又はタグ（例えば、Ｍｙｃ Ｔａｇ又はＳｔｒｅｐ Ｔａｇ）ベースのアミノ酸リンカー）を介して連結されている、実施形態３４に記載の方法。
３６．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、ポリエチレングリコールを介して連結されている、実施形態３４又は３５に記載の方法。
３７．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミン－スルフヒドリル間架橋剤を介して連結されている、実施形態３４～３６のいずれかに記載の方法。
３８．ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９又はＭｅｇａ－ＴＡＬから選択される、実施形態３～３７のいずれかに記載の方法。
３９．ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１である、実施形態３～３８のいずれかに記載の方法。
４０．ヌクレアーゼへと連結されたターゲティングリガンドが、ＮＰと会合したｓｓＤＮＡより、ＮＰの表面から離れている、実施形態３４～３９のいずれかに記載の方法。
４１．ＮＰが、本明細書において記載された、ｃｒＲＮＡターゲティング部位と会合している、実施形態１～４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．配列番号１；配列番号３；配列番号２０～３２；配列番号４２；配列番号４３；配列番号８４～９７又は配列番号２１４～２２４を含む配列から選択される配列を含むゲノム部位をターゲティングする、実施形態１～４１のいずれかに記載の方法。
４３．遺伝子改変のために、配列番号５；配列番号６；配列番号１３；配列番号１４又は配列番号２２５～２６４から選択される配列を伴うゲノム部位をターゲティングするステップを含む、実施形態１～４２のいずれかに記載の方法。
４４．選択された細胞集団が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞から選択される血液細胞を含む、実施形態１～４３のいずれかに記載の方法。
４５．血液細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＨＳＣを含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．血液細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋ＨＳＣを含む、実施形態４４又は４５に記載の方法。
４７．血液細胞が、ＬＨ＋ＨＳＣを含む、実施形態４４～４６のいずれかに記載の方法。
４８．血液細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＣを含む、実施形態４４～４７のいずれかに記載の方法。
４９．血液細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋ＨＳＣを含む、実施形態４４～４８のいずれかに記載の方法。
５０．血液細胞が、ＡＨＲ＋ＨＳＣを含む、実施形態４４～４９のいずれかに記載の方法。
５１．血液細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、実施形態４４～５０のいずれかに記載の方法。
５２．血液細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、実施形態４４～５１のいずれかに記載の方法。
５３．血液細胞が、ヒト血液細胞である、実施形態４４～５２のいずれかに記載の方法。
５４．生物学的試料が、末梢血及び／又は骨髄を含む、実施形態１～５３のいずれかに記載の方法。
５５．生物学的試料が、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）動員末梢血及び／又はプレリキサホル動員末梢血を含む、実施形態１～５４のいずれかに記載の方法。
５６．５％～５０％の、平均値全遺伝子編集率をもたらす、実施形態１～５５のいずれかに記載の方法。
５７．選択された細胞集団内の、６０％を超える細胞生存率をもたらす、実施形態１～５６のいずれかに記載の方法。
５８．実施形態１～５７のいずれか一項に記載の方法に従い改変された細胞。
５９．電気穿孔を受けていない、実施形態５８に記載の細胞。
６０．ウイルスベクターへと曝露されていない、実施形態５８又は５９に記載の細胞。
６１．ドナー鋳型又はＨＤＴをコードするウイルスベクターへと曝露されていない、実施形態５８～６０のいずれかに記載の細胞。
６２．細胞を、生物学的試料から分離することを意図された細胞分離工程を受けていない、実施形態５８～６１のいずれかに記載の細胞。
６３．磁気による細胞分離工程を受けていない、実施形態５８～６２のいずれかに記載の細胞。
６４．実施形態５８～６３のいずれかに記載の細胞を含む治療用製剤。
６５．治療用核酸配列を、それを必要とする対象へと施す方法であって、実施形態５８～６３のいずれかに記載の細胞又は実施形態６４に記載の治療用製剤を、対象へと投与し、これにより、治療用核酸配列を、対象へと施すステップを含む方法。
６６．直径が３０ｎｍ未満であるコア；
ｇＲＮＡが、３’末端及び５’末端を含み、３’末端が、化学修飾を伴うスペーサーへとコンジュゲートされ、５’末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされ、化学修飾が、コアの表面へと、共有結合的に連結されている、－ヌクレアーゼのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；
正帯電ポリマーが、２５００ダルトン未満の分子量を有し、ＲＮＰ複合体を取り囲み、コアの表面と接触する、正帯電ポリマーコーティング；並びに
正帯電ポリマーコーティングの表面上の、ドナー鋳型（例えば、任意選択的に、相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）を含む）
を含む、ナノ粒子（ＮＰ）。
６７．コアが、金（Ａｕ）を含む、実施形態６６に記載のＮＰ。
６８．コアの、ヌクレアーゼに対する重量／重量（ｗ／ｗ）比が、０．６である、実施形態６６又は６７に記載のＮＰ。
６９．コアの、ＨＤＴに対するｗ／ｗ比が、１．０である、実施形態６６～６８のいずれかに記載のＮＰ。
７０．直径が７０ｎｍ未満である、実施形態６６～６９のいずれかに記載のＮＰ。
７１．０．２未満の多分散性指数（ＰＤＩ）を有する、実施形態６６～７０のいずれかに記載のＮＰ。
７２．ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）のｃｒＲＮＡを含む、実施形態６６～７１のいずれかに記載のＮＰ。
７３．ｃｒＲＮＡが、配列番号５；配列番号６；配列番号１３；配列番号１４又は配列番号２２５～２６４に明示された配列を含む、実施形態７２に記載のＮＰ。
７４．ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９を含む、実施形態６６～７３のいずれかに記載のＮＰ。
７５．正帯電ポリマーコーティングが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）；ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン；セルロース、デキストラン、スペルミン、スペルミジン又はポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）を含む、実施形態６６～７４のいずれかに記載のＮＰ。
７６．正帯電ポリマーが、１５００～２５００ダルトンの分子量を有する、実施形態６６～７５のいずれかに記載のＮＰ。
７７．正帯電ポリマーが、２０００ダルトンの分子量を有する、実施形態６６～７６のいずれかに記載のＮＰ。
７８．化学修飾が、遊離チオール官能基、遊離アミン官能基又は遊離カルボン酸官能基を含む、実施形態６６～７７のいずれかに記載のＮＰ。
７９．スペーサーが、オリゴエチレングリコールスペーサーを含む、実施形態６６～７８のいずれかに記載のＮＰ。
８０．オリゴエチレングリコールスペーサーが、原子１８個のオリゴエチレングリコールスペーサーを含む、実施形態７９に記載のＮＰ。
８１．ＨＤＴが、修飾を受けるゲノム配列に対する相同性を有する配列を含む、実施形態６６～８０のいずれかに記載のＮＰ。
８２．ＨＤＴが、配列番号２；配列番号４；配列番号８；配列番号１５；配列番号３３～４１又は配列番号４４～５２に明示された配列を含む、実施形態８１に記載のＮＰ。
８３．ＨＤＴが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、実施形態６６～８２のいずれかに記載のＮＰ。
８４．ドナー鋳型が、治療用遺伝子を含む、実施形態６６～８３のいずれかに記載のＮＰ。
８５．治療用遺伝子が、骨格タンパク質４．１、グリコフォリン、ｐ５５、Ｄｕｆｆｙの対立遺伝子、グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質の遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；Ｃ９ＯＲＦ７２、α２β１；αｖβ３；αｖβ５；αｖβ６３；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ－３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼＮ；ＨＨＶ－７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ－１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；α－ジストログリカン；ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ－１、ＢＤＮＦ、ベータ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ－ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ－１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ－１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ－１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ－４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ及びＦａｎｃＷ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ１、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ－１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ＩＬ－１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ－１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ－１、ＬＵＣＡ－２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ－３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭＡ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ－ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ－１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、Ｆ８、Ｆ９、ＨＢＢ、ＣＹＢ５Ｒ３、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ並びにＳＬＣ４６Ａ１をコードする、実施形態８４に記載のＮＰ。
８６．ＮＰが、ヌクレアーゼへと連結されたターゲティングリガンドをさらに含む、実施形態６６～８５のいずれかに記載のＮＰ。
８７．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体又はアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に結合する結合性分子を含む、実施形態８６に記載のＮＰ。
８８．ターゲティングリガンドが、抗ヒトＣＤ３抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ３４抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４６抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ９０抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１６４抗体若しくはこの抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３アプタマー、ヒト黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、デガレリクス酢酸塩又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １を含む、実施形態８６又は８７に記載のＮＰ。
８９．ターゲティングリガンドが、抗体クローン：５８１；抗体クローン：５６１；抗体クローン：ＲＥＡ１１６４；抗体クローン：ＡＣ１３６；抗体クローン：５Ｅ１０；抗体クローン：ＤＧ３；抗体クローン：ＲＥＡ８９７；抗体クローン：ＲＥＡ８２０；抗体クローン：ＲＥＡ７５３；抗体クローン：ＲＥＡ８１６；抗体クローン：２９３Ｃ３；抗体クローン：ＡＣ１４１；抗体クローン：ＡＣ１３３；抗体クローン：７；アプタマーＡ１５；アプタマーＢ１９；ＨＣＧ（タンパク質／リガンド）；黄体形成ホルモン（ＬＨタンパク質／リガンド）又は前出のうちのいずれかに由来する結合性断片を含む、実施形態８６～８８のいずれかに記載のＮＰ。
９０．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、連結されている、実施形態８６～８９のいずれかに記載のＮＰ。
９１．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミノ酸リンカー（例えば、直接的アミノ酸リンカー、可撓性アミノ酸リンカー及び／又はタグベースのアミノ酸リンカー）を介して連結されている、実施形態９０に記載のＮＰ。
９２．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介して連結されている、実施形態８６～９１のいずれかに記載のＮＰ。
９３．ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミン－スルフヒドリル間架橋剤を介して連結されている、実施形態８６～９２のいずれかに記載のＮＰ。
９４．実施形態６６～９３に記載のＮＰ及び生物学的試料を含む組成物。
９５．生物学的試料が、選択された細胞集団を含む、実施形態９４に記載の組成物。
９６．選択された細胞集団が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞から選択される血液細胞を含む、実施形態９５に記載の組成物。
９７．血液細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＨＳＣ；ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋ＨＳＣ；ＬＨ＋ＨＳＣ；ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣ；ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋ＨＳＰＣ及び／又はＡＨＲ＋ＨＳＰＣを含む、実施形態９５に記載の組成物。
９８．血液細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、実施形態９５に記載の組成物。
９９．生物学的試料が、末梢血、骨髄、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）動員末梢血及び／又はプレリキサホル動員末梢血を含む、実施形態９４～９８のいずれかに記載の組成物。
１００．ＮＰが、生物学的試料中に、生物学的試料１ミリリットル（ｍＬ）当たりのＮＰ １、２、３、４、５、８、１０、１２、１５又は２０μｇの量である、実施形態９４～９９のいずれかに記載の組成物。
１０１．実施形態９４～９９のいずれかに記載の、１つ以上の構成要素を含むキット。
（ＸＩＩＩ）実験例
［実施例１］ 金ナノ粒子コアの合成
サイズ範囲を１５ｎｍとする金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を、わずかな改変を加えて、Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈの方法（Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈら（１９５１）、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１（０）：５５～７５）により合成した。０．２５ｍＭの塩化金酸溶液を、沸点へと至らせ、３．３３％のクエン酸ナトリウム溶液を添加することにより還元し、還流系下において、１０分間にわたり、強く撹拌した。合成されたＮＰを、３回にわたり洗浄し、高純度水中に再分散させた。
Ｃｐｆ１及びＣａｓ９ガイドＲＮＡの構造：３’末端において、２つの特注の修飾を伴う、単一のＣｐｆ１ガイドＲＮＡを、市販品の供給源（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＩＤＴ）から注文した。第１の修飾は、原子１８個のオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）スペーサー（ｉＳｐ１８）を含み、第２の修飾は、チオール修飾を含んだ。ＯＥＧスペーサー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）など）、オリゴヌクレオチド１つ当たり１つの比であり、オリゴヌクレオチド間の静電斥力を防止するのに用いられた。原子１８個のスペーサーを使用する一方、他の長さもまた、適切であった。チオール修飾もまた、オリゴヌクレオチド１つ当たり１つの比において付加され、オリゴヌクレオチドを、ＡｕＮＰの表面へと結合する共有結合的相互作用のベースとして用いられた。
Figure 2024045297000034
 ｃａｓ９のために、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む、２部型ガイド系を使用した。上記と同じ１８スペーサー－チオール修飾であるが、これを、５’末端に伴う、Ｃａｓ９のためのｃｒＲＮＡを、ＩＤＴから注文した。
Figure 2024045297000035
 付属のｔｒａｃｒＲＮＡは、非修飾であった。これらの配列において、「ｒ」は、ＲＮＡを表し、読取りを容易とするためのスペースを与える。
Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰの調製：１８スペーサー－チオール修飾を伴うｃｒＲＮＡを使用した。１０μｇ／ｍＬの濃度のＡｕＮＰを、ＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡのｗ／ｗ比を０．５として、ｃｒＲＮＡ溶液へと添加した。この後、ｐＨを３とするクエン酸緩衝液を、１０ｍＭの濃度において添加し、５分間にわたり混合した。調製されたＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡナノコンジュゲートを遠心分離し、ＰＢＳ中に再分散させた。次いで、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを、ＡｕＮＰ／Ｃｐｆ１のｗ／ｗ比を０．６として添加した。２０００ＭＷのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、０．００５％の濃度において添加し、十分に混合した。最終ステップにおいて、ｓｓＤＮＡ鋳型を、ＡｕＮＰ／ｓｓＤＮＡのｗ／ｗ比を１として添加した。
［実施例２］ 高度に強力な遺伝子編集ナノ粒子による、造血幹／前駆細胞内の、ターゲティングされた相同性指向修復
要旨
エクスビボにおける、造血幹／前駆細胞内の、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集は、遺伝子疾患を是正し、感染性疾患から保護し、がんのための新たな処置をもたらしている。相同組換え、電気穿孔に続き、非組込型ウイルスの形質導入を伴う、遺伝子編集のための、現行の工程は、一部の遺伝子座において、高レベルの遺伝子編集を結果としてもたらす一方、この複雑な操作は、細胞毒性を結果としてもたらし、移植された血液細胞の適応度を損なっている。本実施例において、コロイドＡｕＮＰを使用して、高度に強力な遺伝子編集ＮＰを開発した。単一のＮＰの取込み時に要求される全ての機構の送達を確保するために、電気穿孔又はウイルスに対する必要を伴わずに、細胞の受動的侵入が可能なローディングデザインを開発した。この小型であり、高度に単分散性であるＮＰは、リソソームにトラップされることを回避し、観察可能な毒性を伴わずに、初代ヒト造血幹／前駆細胞内の核への局在化に成功した。ＮＰ媒介型遺伝子編集は、効率的であり、治療対象である、複数の遺伝子座において、異なる遺伝子編集ヌクレアーゼにより維持された。ヒト化マウスにおける、ＮＰ処置初代細胞の生着動態は、非処置細胞と比べて良好であり、インビボにおける、観察可能な分化の差違を伴わなかった。これは、遺伝子編集ペイロード全体の、初代ヒト造血幹／前駆細胞への、効率的な、受動的送達についての、初めての実証である。
序説
造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）における、レトロウイルス媒介型遺伝子補正は、多様な遺伝子障害、感染障害及び悪性障害についての治癒的転帰を示している（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３７１（１５）：１４０７～１４１７（２０１４）；Ｃｉｃａｌｅｓｅら、Ｂｌｏｏｄ、１２８（１）：４５～５４（２０１６）；Ｓｅｓｓａら、Ｌａｎｃｅｔ、３８８（１００４３）：４７６～４８７（２０１６）；Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙら、ＪＡＭＡ、３１３（１５）：１５５０～１５６３（２０１５）及びＤｕｎｂａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５９（６３７２）（２０１８））。遺伝子改変自家ＨＳＰＣ又は遺伝子改変「自己」ＨＳＰＣの使用により、移植片－宿主間免疫応答の危険性を消失させ、同種造血幹細胞移植において要求される免疫抑制薬の必要性がなくなる。しかし、ＨＳＰＣ遺伝子治療の効果的な実施は、いくつかの大きな難題に直面する。現在のところ、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）品質において、限定数量の治療用レトロウイルスベクターを作製しうるが、この技術の、広範な使用に対する、大きな障害を生み出している。十分なベクター数量を製造することの難題に加えて、挿入による突然変異誘発に起因する、悪性腫瘍の発症により証拠立てられた、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクターの使用と関連する遺伝毒性の危険性が公知である（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０２（５６４４）：４１５～４１９（２００３）；Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４８（３）：２５５～２５６（２００３）；Ｏｔｔら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１２（４）：４０１～４０９（２００６）及びＳｔｅｉｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１６（２）：１９８～２０４（２０１０））。これらの難題の全ては、遺伝子改変のための、非ウイルス的手段の開発を動機づけた。
最も顕著に、遺伝子編集は、レトロウイルス媒介型遺伝子導入に対する、より安全な代替法として提起され、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）－Ｃａｓヌクレアーゼなど、操作ヌクレアーゼの開発により可能とされている（Ｃｏｒｎｕら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２３（４）：４１５～４２３（２０１７））。これらのプログラム化可能なヌクレアーゼは、ヌクレアーゼタンパク質構成要素による切断のために、ＤＮＡ内の標的特異的な配列へと、１つ以上のＲＮＡ分子を組み込む。これらのうち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、最もよく研究されている。このヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｅｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）である、２つのＲＮＡ分子と複合体化して、ＮＧＧ配列からなる、コグネイトのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を認識し、次いで、ＤＮＡ内に、平滑末端の二本鎖切断を施す。この切断は、いくつかの細胞機構により修復されうるが、２つの最も一般的な機構は、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向修復（ＨＤＲ）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ、１８（８）：４９５～５０６（２０１７））である。後者が生じるために、切断部位と相同な、無傷の鋳型配列が存在しなければならない。姉妹染色分体が、鋳型として用いられうるが、ＨＤＲ効率を増強するように、余剰の合成鋳型分子もまた提供されうる。この鋳型のフランキング領域は、切断部位のフランキング領域に、著明に、又は完全にマッチしなければならないが、ＨＤＲが生じる場合に、新たなＤＮＡの、正確な編集又は新たなＤＮＡの、ゲノムへの付加を可能とする、新たな遺伝子コードも、この中に挿入されうるのに対し、ＮＨＥＪの場合、挿入及び／又は欠失（インデル）が、最も起こりうる帰結である（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ、１８（８）：４９５～５０６（２０１７））。近年、Ｃｐｆ１（又はＣａｓ１２ａ）もまた、ゲノム編集における有用性を裏付けている。このヌクレアーゼは、異なるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位（例えば、ＴＴＴＮ［配列中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴでありうる］）を認識する点において、Ｃａｓ９と異なり、単一のガイドＲＮＡを要求し、５’突出を伴う、ＤＮＡの粘着切断を結果としてもたらす（Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ、１６３（３）：７５９～７７１（２０１５））。Ｃｐｆ１の小さなサイズ及び粘着末端化切断は、鋳型オリゴヌクレオチドが与えられると、送達の容易さ及びＨＤＲの起こりやすさを増強すると想定されている。
ＨＳＰＣによる遺伝子治療における、最大の有用性のために、細胞毒性を伴わずに、効率的に、信頼できる形で作動するＤＮＡ鋳型を伴う、又はこれを伴わない、選択されたデザイナーヌクレアーゼを含む送達プラットフォームが、理想的となる。ＨＳＰＣにおけるこの手法のための、現行の臨床技術は、ｍＲＮＡ又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体としての、操作ヌクレアーゼ構成要素の電気穿孔を要求する。ＨＤＲが好ましい場合、最も効果的な方法は、電気穿孔に続く、非組込型ウイルスベクターによる形質導入（Ｄｅｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、５３９（７６２９）：３８４～３８９（２０１６））又は指定された細胞濃度における、化学修飾された、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型を伴う、規定された濃度の、操作ヌクレアーゼ構成要素の、同時的な電気穿孔（Ｄｅ Ｒａｖｉｎら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、９（３７２）（２０１７））となっている。電気穿孔は、毒性を誘導することが公知であり、さらに、ペイロードの各構成要素を取り込む細胞の数又は電気穿孔による送達に成功する各構成要素の濃度を制御する手段も存在しない（Ｌｅｆｅｓｖｒｅら、ＢＭＣ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、３：１２～１２（２００２））。最後に、非組込型ウイルスを、鋳型として使用する場合、系は、ＧＭＰグレードのウイルス粒子が入手可能であることにも、さらに依存する。したがって、遺伝子編集構成要素を送達するために、ＮＰベースの送達が、精力的に追究されている（Ｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２６（７）：４５２～４６２（２０１５））。
この点で、脂質ベースのＮＰ、ポリマーベースのＮＰ及びＡｕＮＰは、遺伝子編集構成要素の、細胞への送達に、大きな可能性をもたらす（Ｆｉｎｎら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２２（９）：２２２７～２２３５（２０１８）；Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１（１１）：８８９～９０１（２０１７）及びＬｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２（７）：４９７～５０７（２０１８））。ポリマーナノ粒子及び脂質ナノ粒子が、「封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）」又は「封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）」送達媒体を表すのに対し、ＡｕＮＰに固有の表面ローディングは、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質など、異なる分子による、正確な修飾及び機能化を容易とする（Ｒｏｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２（５７７６）：１０２７～１０３０（２００６））。表面積は既知であるため、ペイロード構成要素の、制御されたローディングは、ＡｕＮＰ調製物の均一性を確保し、より予測可能な送達をもたらす（Ｄｉｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２２（６）：１０７５～１０８３（２０１４））。最後に、ＡｕＮＰは、脂質ナノ担体及びポリマーナノ担体と比較して、比較的非毒性であると考えられる（Ｐａｎら、Ｓｍａｌｌ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ｄｅｒ Ｂｅｒｇｓｔｒａｓｓｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、３（１１）：１９４１～１９４９（２００７）；Ａｌｋｉｌａｎｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎａｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（７）：２３１３～２３３３（２０１０）及びＬｅｗｉｎｓｋｉら、Ｓｍａｌｌ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ｄｅｒ Ｂｅｒｇｓｔｒａｓｓｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、４（１）：２６～４９（２００８））が、これは、ＨＳＰＣなど、非悪性の分裂体細胞に、極めて重要である。実際、Ｌｅｅらは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１の、筋肉及び脳などの非分裂体細胞組織への送達における、ポリマー封入型ＡｕＮＰデザインの有用性を裏付けている（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１（１１）：８８９～９０１（２０１７）及びＬｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２（７）：４９７～５０７（２０１８））が、これらの担体は、ＨＳＰＣ内又は付属のオリゴヌクレオチド鋳型を伴う場合の効能を裏付けていない。さらに、ポリマー封入の、Ａｕナノコアとの組合せは、全体のＮＰサイズを、大きく増大させ、ＮＰの細胞毒性プロファイルを変更する。
ＨＤＲを支援する、一本鎖ＤＮＡ鋳型（ＨＤＴ）を伴う、又はこれを伴わない、遺伝子編集構成要素（ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ）の、ＡｕＮＰの表面における、層ごとのコンジュゲーションであって、ポリマー封入を要求しないコンジュゲーションにより、簡略なＡｕＮＰ（例えば、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ）ベースの遺伝子編集をデザインした（図５Ｃ及び１２Ａ）。
１９ｎｍのＡｕＮＰコアは、クエン酸還元方法（Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈら、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１（０）：５５～７５（１９５１））を使用して合成した。合成されたＮＰは、高度に単分散性であり、観察された多分散性指数（ＰＤＩ）は、０．０５であった（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。異なる層の、調製及びコンジュゲーションのための工程は、図５Ｃに見出すことができる。第１の層において、１８ヌクレオチドのオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）スペーサー及び末端のチオールリンカーと共に合成された、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９のためのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（ｃｒＲＮＡ－１８スペーサー－ＳＨ）を、半共有結合的なＡｕ－チオール間相互作用により、Ａｕの表面へと接合させた（配列情報は、図３４において見出すことができる）。ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ並びに二本鎖ＤＮＡを伴う、これらのＣａｓヌクレアーゼの、公表された結晶構造についての解析は、スペーサー－チオールリンカーの、ｃｒＲＮＡへの付加が、ガイドセグメントの認識及びヌクレアーゼ活性に対して、影響を及ぼさないことを示唆した（Ｙａｍａｎｏ Ｔら、Ｃｅｌｌ、１６５（４）：９４９～９６２（２０１６）及びＬｅｅら、ｅＬｉｆｅ、６：ｅ２５３１２（２０１７））。ＯＥＧスペーサーアームの組入れは、ｃｒＲＮＡの鎖間の静電斥力を低減して、ＡｕＮＰの表面上におけるローディング能を増大させた。図１２Ｂに示される通り、ｃｒＲＮＡを伴うＡｕＮＰコアは、ＰＤＩを０．０５とする、２２ｎｍのＮＰサイズを結果としてもたらした。次いで、ヌクレアーゼの、ｃｒＲＮＡの３Ｄ構造に対する天然のアフィニティーにより、ヌクレアーゼタンパク質を、表面にロードされたｃｒＲＮＡの５’側ハンドルへと接合させた。ヌクレアーゼの接合は、Ｃｐｆ１について、ＰＤＩを０．０８とする、ＮＰのサイズを、４０ｎｍへと増大させた。このＲＮＰロードＡｕＮＰを、ＨＤＴが存在しない、ヌクレアーゼ活性の比較のためのベースとして用いた。ＨＤＴローディングのために、ＲＮＰロードＡｕＮＰを、分枝状の低分子量（２０００）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりさらにコーティングして、最外層における、ＨＤＴの静電コンジュゲーションのためのベースを調製した。この「完全ロード」ＡｕＮＰは、６４ｎｍのサイズを裏付け、観察されたＰＤＩを０．１７とする、高度な単分散性を維持した（図１２Ａ～１２Ｃ）。透過電子顕微鏡画像及び各接合ステップの後における、微細な局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）シフトの観察から、凝集を伴わない、一様な形状が推測された（図１２Ａ、１２Ｄ）。ＮＰのゼータ電位は、－２６ｍＶ～＋２７ｍＶにわたり変化し、完全な積層を伴った（図１２Ｅ）。最終的なＮＰの、この正電荷は、製剤化後４８時間にわたり、それらが観察されなかったので、時間経過にわたる、沈殿及び凝集を防止した可能性が高い。
この高度に安定であり、単分散性である構造は、ＡｕＮＰと、遺伝子編集構成要素との、重量／重量（ｗ／ｗ）比の調整による。ＡｕＮＰと、Ｃｐｆ１との、異なるｗ／ｗ比についての解析は、Ｃｐｆ１の低比は、凝集を誘発し、最適のｗ／ｗ比は、０．６であることを裏付けた（図１３Ａ、１３Ｂ）。Ｃｐｆ１のローディング能力は、この比において、８．８μｇ／ｍＬであることが見出された。Ｃｐｆ１と対照的に、ＡｕＮＰと、ＨＤＴとの低ｗ／ｗ比は、凝集をもたらし、最適のｗ／ｗ比は、１であった（図１３Ｃ、１３Ｄ）。
このＮＰの、初代ＨＳＰＣに対する影響を決定するために、ＨＳＰＣを、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）により動員された健常成人ボランティアに由来する、ＣＤ３４の発現に基づく、白血球アフェレーシス生成物から単離した。細胞を、支持培地中において培養し、ＡｕＮＰ製剤を、培養物へと、１０μｇ／ｍＬの濃度において添加した。Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰを伴うインキュベーションの、２４時間後及び４８時間後における、生存－死滅染色及びトリパンブルー染料除外アッセイの両方により、ＣＤ３４＋細胞内の、潜在的な毒性について解析した（図１５Ａ～１５Ｃ）。Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰにより処置された試料は、いずれのアッセイにおいても、８０％を超える生存率を裏付け、トリパンブルーアッセイによる、処置細胞と非処置細胞との間の変動は見られなかった。
ＨＳＰＣは、トランスフェクトすることが極めて困難であることが公知であるが、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰによる処置後６時間以内における、共焦点顕微鏡によるイメージングは、良好な取込み及び遺伝子編集構成要素の、初代ＨＳＰＣの核内の局在化を示した（図１４Ａ～１４Ｅ）。本実施例において、蛍光により標識付けされたｃｒＲＮＡ及びＨＤＴの両方の、細胞の生体内分布を、ｚ方向において追跡したところ、いずれの場合にも、明確な核局在化が観察された（図１４Ｅ）。
Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰの、遺伝子編集のための有用性について調べるために、ＨＳＰＣ内の、治療価値が裏付けられている、２つの異なるゲノムの遺伝子座：（１）３番染色体上の、ケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子及び（２）１１番染色体上の、ガンマグロビン（γ－グロビン）遺伝子プロモーターをターゲティングした。ＣＣＲ５の破壊は、ＣＣＲ５共受容体の発現を介して、ウイルスの付着及び侵入を消失させることによる、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に対する抵抗性と関連している（Ｌｏｐａｌｃｏら、Ｖｉｒｕｓｅｓ、２（２）：５７４～６００（２０１０））。ＨＳＰＣにおける、この破壊のターゲティングは、後代である、将来のＴ細胞を、ＨＩＶ感染に対して抵抗性とする。代替的に、γ－グロビンプロモーター内の、特異的な欠失の導入は、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）として公知の、天然に存在する現象を反復するが、これは、鎌状赤血球病及びβ－サラセミアなどの異常ヘモグロビン症の処置に有用であることが示されている（Ａｋｉｎｓｈｅｙｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１８（１）：１９（２０１１））。
コンピューター上の、ＣａｓＯＦＦｉｎｄｅｒソフトウェアによる、ＣＣＲ５標的についてのオフターゲット解析は、ヒトゲノム内に相同部位が見られないことを裏付け、Ｃｐｆ１についてのミスマッチは、３ｂｐ未満であった（図３５Ａ～３５Ｄ）（Ｂａｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ、３０（１０）：１４７３～１４７５（２０１４））。単一のガイドＲＮＡによりアクセス可能な、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の両方のＰＡＭ部位をコードする標的部位を選び出し、これらの２つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの直接的な比較を可能とした（図７Ａ、７Ｂ）。しかし、試験を始める前に、ＨＤＴは、Ｃｐｆ１に最適化した。既存のデータは、ＲｕｖＣドメインによる、非標的鎖の切断が、Ｎｕｃドメインによる標的鎖の切断に必須であることを裏付けた（Ｙａｍａｎｏ Ｔら、Ｃｅｌｌ、１６５（４）：９４９～９６２（２０１６））。したがって、ＤＮＡの標的鎖及び非標的鎖のためにデザインされたＨＤＴについて調べた。このＨＤＴは、中央部に、ＣＣＲ５の発現を破壊し、ＨＤＲ解析を可能とする、８ｂｐの、ＮｏｔＩ制限酵素による切断部位を伴う、各末端における、Ｃｐｆ１切断部位（ＰＡＭから１７ｂｐ下流である）を挟む、４０ｂｐの相同性アームから構成された。ＴＩＤＥ（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を使用したところ、非標的鎖に対する全編集率８．１％が観察され、標的鎖に対する全編集率７．８％が観察され、非標的鎖に対してデザインされたＨＤＴを使用した場合のＨＤＲは、標的鎖に対してデザインされたＨＤＴを使用した場合のＨＤＲである５．４％と比較して、７．３％であった（図２１Ａ）。これらの結果は、Ｔ７ＥＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素消化アッセイ（図２１Ｂ）により確認され、Ｙａｍａｎｏ Ｔら、Ｃｅｌｌ、１６５（４）：９４９～９６２（２０１６）により既に公表されているデータと緊密に相関した。
次に、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰを、ＡｕＮＰコアの、分子グレード水中に懸濁させられた量に基づき、異なる濃度（５μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ）において調製することにより、初代ＨＳＰＣ内の、ＨＤＲの効率を最適化した。１０μｇ／ｍＬの濃度は、最高の全編集率及びＨＤＲ率を裏付け、濃度の増大は、細胞毒性の増大及び低ＨＤＲ率を裏付けた（図２１Ｃ、２１Ｄ）。
典型的に、エクスビボにおける遺伝子導入のための臨床操作時に、ＨＳＰＣは、組換えフィブロネクチン断片（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標））の層上、組換えヒト増殖因子を含有する無血清培地中において培養される。患者への注入のための最終製剤は、採取され、２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅなど、非発熱物質姓等張性溶液中に懸濁させられたＨＳＰＣからなる。これらの試薬の影響を決定するために、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ ＮＰによる遺伝子編集を、ＨＳＡ、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）又はプールされたヒトＡ／Ｂ型血清の存在下において調べた。いずれの試薬についても、細胞毒性の変化は観察されなかった（図２２Ａ）が、いずれの試薬も、全編集率及びＨＤＲ率を低減した（図２２Ｂ、２２Ｃ）。したがって、後続の全ての実験のために、ＨＤＴ（製剤中に組み入れた場合）を、非標的ＤＮＡ鎖に対してデザインし、全ての製剤を、１０μｇ／ｍＬの分子グレード水中濃度において、培養物中のＨＳＰＣへと添加し、ＨＳＰＣを、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）又はＨＳＡを伴わない、無血清の支持培地中において培養した。
ＨＳＰＣ内において、Ｃｐｆ１により作られた、５’突出を伴う粘着末端切断が、Ｃａｓ９による平滑末端切断より、ＨＤＲに好適であることが仮定された。この仮定について検証するため、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の両方について、ＨＤＴを伴うＣＣＲ５遺伝子座及びＨＤＴを伴わないＣＣＲ５遺伝子座をターゲティングする、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰを調製した。比較のために、送達は、各構成要素の濃度を同一として、電気穿孔により、並列的に実施した。留意すべきことに、いかなる条件下においても、２’Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ－リボヌクレオチド及びホスホロチオエートなど、さらなる化学修飾（Ｙｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３５：１１７９（２０１７））を、ガイドＲＮＡへと組み入れなかった。ＴＩＤＥ解析は、２％～２５％の間の全編集範囲を裏付けたが、有意性は、最小限であった（図２３Ａ）。しかし、ＴＩＤＥ及び次世代シーケンシングの両方により、電気穿孔と比較して、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰにより送達されたＣｐｆ１又はＣａｓ９により処置されたＨＳＰＣ内のＨＤＲを指し示すＮｏｔＩ制限部位の組込みの増大が観察され、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９より高性能であった（図２３Ａ～２３Ｃ）。全ての試料について、全ての細胞生存率は、７０％を上回ったが、ＡｕＮＰにより処置された試料中において、高生存率が観察され、Ｃａｓ９を、電気穿孔ではなく、ＡｕＮＰにより送達した場合に、特に、有意に高い生存率が観察された（図２３Ｄ）。これらの試料中の、ＨＳＰＣの適応度は、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイにより解析したが、ＣＦＣの可能性又は形状の差違は観察されなかった（図２３Ｅ、２３Ｆ）。この標準的ＣＦＣアッセイは、より短期的な血液前駆細胞を表す［Ｗｏｇｎｕｍ Ｂ．、Ｙｕａｎ Ｎ．、Ｌａｉ Ｂ．、Ｍｉｌｌｅｒ Ｃ．Ｌ．（２０１３）、「Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｈｅｌｇａｓｏｎ Ｃ．、Ｍｉｌｌｅｒ Ｃ．（編）、「Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、９４６巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ］ので、長期にわたる再増殖能の尺度として、元のアッセイによるコロニーを再播種した。二代目ＣＦＣの数又は種類に、モック（非処置）対照試料と比べた有意差は観察されなかったが、ＡｕＮＰ処置試料中の、電気穿孔試料と比べた、高ＣＦＣ数のパターンも観察されなかった（図２４Ａ、２４Ｂ）。
Ｃｐｆ１の、ＨＤＲに対する好適性を確認するために、同じ仮定を、γ－グロビンプロモーター遺伝子座においても検証した。ここでもまた、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の両方のＰＡＭ配列が、同一の標的切断部位により同定され、オフターゲットの切断は予測されなかった（図８Ａ、８Ｂ；図３５Ａ～３５Ｄ）。文献化されている、このプロモーター内の、抑制性の結合性部位と重複する、ＨＰＦＨと関連する、１３ｂｐの欠失（Ａｋｉｎｓｈｅｙｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１８（１）：１９（２０１１））を挿入する、ＨＤＴを使用した。初代ＨＳＰＣ内において得られた結果は、この遺伝子座においても、同じ傾向を示し、Ｃｐｆ１含有Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰについて、Ｃａｓ９含有ＮＰと比較して、高レベルのＨＤＲが見られた（図２５）。
次のステップは、ＮＰ処置が、エクスビボ再注入の後において、ＨＳＰＣの適応度を損なったのかどうかを決定することであった。ＨＳＰＣの適応度の、最も良好な尺度は、骨髄抑制宿主を再構成する能力である。したがって、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、エクスビボにおいて、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰにより処置し、マウス１匹当たりの細胞１０６個において、致死線量未満において照射された免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ－／－；ＮＳＧ）マウスへと注入した。マウスを、２２週間にわたり追跡したところ、移植後８週間において、最大の生着が観察され、安定的な生着は、移植後約１６週目に確立された（図２７Ａ）。マウスの体重を、研究の経過にわたりモニタリングしたところ、時間経過にわたり安定であった（図２８）。驚くべきことに、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ又はＡｕＮＰ単独により処置されたＨＳＰＣは、モック（非処置）細胞より高レベルにおいて生着したが、動態は、同様であった（図２７Ｂ）。異なる血液細胞系統について解析した。Ｂ細胞の再構成は、移植の１０週間後において、ピークに到達し、次いで、２２週目を通して安定し始めた（図２７Ｃ）。初期の単球生着は、高度であったが、最初の８週間にわたり減少し、安定化した（図２７Ｄ）。１６週目まで、低レベルのＴ細胞が観察されたが、次いで、全ての研究群について増大した（図２７Ｅ）。Ｂ細胞、単球又はＴ細胞の比率に、エクスビボにおいて投与されたＨＳＰＣ処置と比べた有意差は観察されなかった。
２２週間後に、マウスを屠殺し、骨髄試料、脾臓試料、胸腺試料及び末梢血試料を回収した。剖検試料についてのフローサイトメトリー解析は、ＡｕＮＰ処置群及びＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ処置群が、モック群と比較して、高レベルの生着と関連することを示した（図２９Ａ～２９Ｄ）。重要なことは、複能性ＣＤ３４＋細胞の頻度が、ＡｕＮＰ処置動物の、骨髄、脾臓及び末梢血において高く（図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｄ）、ＣＤ２０発現細胞の頻度が、脾臓、胸腺及び末梢血において高かった（図２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄ）ことである。骨髄試料についての、ヒト特異的ＣＦＣアッセイは、生着結果と緊密に相関し、ＡｕＮＰ処置群及びＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ処置群が、モック処置群と比較して、有意に大きなコロニー数を有することを示した（図２７Ｆ）。これは、これらの群内の、複能性前駆細胞の数が大きいことと緊密に関連した（図２７Ｇ）。これらの結果がまた、移植の前に処置されたＨＳＰＣ注入生成物中において観察されたＣＦＣアッセイの結果とも緊密に相関したことは、エクスビボにおいて培養されたＨＳＰＣ内における、ＡｕＮＰ処置の肯定的な効果を示唆する（図３０Ａ～３０Ｂ）。全ての処置試料についてのコロニー形状を、図３１に示す。
移植時における、ＨＳＰＣ内のＴＩＤＥ解析により、遺伝子編集に関連して、９．８％の全編集及び９．３％のＨＤＲが観察された（図３２Ａ、３３）。安定的な全遺伝子編集レベル（５％）が、末梢血細胞内において観察され、２０週目において、１７％という、１つの一過性の高値が観察された（図３２Ｂ）。興味深いことに、ＮｏｔＩ制限酵素の組込みレベルは、全ての時点にわたり、一貫して、１％未満であった（図３２Ｃ）。異なる組織に由来する剖検試料の解析は、ＨＤＲが、血液、骨髄及び脾臓において、同等に低度であることを示した（図３２Ｄ、３２Ｅ）。
遺伝子編集は、未知の遺伝子を同定し、遺伝子機能を理解し、先天性又は後天性の遺伝子疾患において、不全遺伝子を補正する、遺伝子スクリーニングのために有望な手法である（Ｘｉｏｎｇら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎａ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７（１）：１３１～１５４（２０１６））。遺伝子編集技術は、基礎科学から、臨床応用へと、急速に進展しつつあるが、遺伝子編集構成要素の、ＨＳＰＣへの送達のための、臨床技術分野における現行技術は、おそらく、レトロウイルス媒介型の遺伝子導入より、はるかに複雑な、ＡＡＶによる形質導入を伴う、電気穿孔を要求する。ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質の送達から達成された、全ての経験にもかかわらず、遺伝子編集構成要素を送達するための、効果的であり、安全である、一般化可能な手法が存在しないことは、多様な細胞型及び組織が、異なる送達戦略を要求しうることを示唆する。
本研究において、Ａｕを使用して、広く適用可能な遺伝子編集送達系を開発した。この多層型ＮＰは、ＮＰの単分散性に対して、ほとんど影響を及ぼさない、単一のＡｕＮＰコア上に、ＤＮＡ修復鋳型を伴い、又はこれを伴わずに、要求される全ての遺伝子編集構成要素をパッケージングすることが可能であった。各構成要素のローディングステップにおける、厳密な特徴付けは、デザインにとって、極めて重要であった。最適のＮＰは、非凝集状態を維持し、トランスフェクトすることが難しい、ＣＤ３４＋血液細胞へと侵入することに成功した。他の細胞型によるデータは、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰが、エンドサイトーシスを介して、小胞の内側に内部化され、次いで、小胞が、バーストし、細胞質へと放出されることを示した。ＰＥＩ誘導性のプロトンスポンジ効果は、ＨＳＰＣのリソソームからの逃避を容易としうる（Ｂｅｎｊａｍｉｎｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２１（１）：１４９～１５７（２０１３））。加えて、ＰＥＩは、ヌクレアーゼタンパク質上の核局在化シグナルに加えて、ペイロードの送達を容易としうる、ＮＰの核内トラフィッキングにおいて能動的な役割を果たすことが示されている（Ｒｅｚａら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８（２）：０２５１０３（２０１７））。本実施例においてターゲティングされた、ＣＣＲ５遺伝子座及びγ－グロビンプロモーター遺伝子座は、極めて固有であり、同じガイド認識部位により、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９のためのＰＡＭ部位をコードし、本ＮＰによる、これらの２つのヌクレアーゼプラットフォームの、バイアスのない比較を可能とする。重要なことは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを、ＮＰ内に組み入れた場合に、１０μｇ／ｍＬのＡｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ濃度が、最大において、ＣＣＲ５遺伝子座における、１３．４％のＨＤＲを伴う、１７．６％の全編集及びγ－グロビンプロモーター遺伝子座における、８．８％のＨＤＲを伴う、１２．１％の全編集をもたらしたことである。全編集及びＨＤＲの結果が、電気穿孔媒介型送達以上であったことは、ＨＳＰＣの生物学的特性が、ＡｕＮＰを送達方式とする場合の、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集に、より適することを示唆する。また、ＮＰ内の、Ｃａｓ９と対比して、Ｃｐｆ１により観察された、高レベルのＨＤＲも、粘着末端化ヌクレアーゼ切断が、少なくともこれらの治療的に妥当な遺伝子座において、ＨＤＲに好適でありうることを示唆する（Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ、１６３（３）：７５９～７７１（２０１５）及びＮａｋａｄｅら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、８（３）：２６５～２７３（２０１７））。
コロニーアッセイ結果及び異種移植生着データは、エクスビボ処置の後において、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＴ－ＮＰ処置が、ＨＳＰＣの適応度に対して、有害作用を及ぼさなかったことを裏付け、再増殖可能性が、増大さえしうることを示唆する。
Ａｕ／遺伝子編集ＮＰは、遺伝子編集機構の、ＨＳＰＣへの、驚異的に、効率的であり、安全である送達をもたらすことの証拠が提示される。本研究は、遺伝子編集構成要素を送達するための、利用可能な送達ツールキットを拡大する。
材料
ＮＰの合成及び特徴付け：ＡｕＮＰを、わずかな改変を加えて、Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈの方法（Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈら、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１（０）：５５～７５（１９５１）及びＳｈａｈｂａｚｉら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、１２（１６）：１９６１～１９７３（２０１７））により合成した。０．２５ｍＭの塩化金酸溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、沸点へと至らせ、３．３３％のクエン酸ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加することにより還元し、還流系下において、１０分間にわたり、強く撹拌した。合成されたＮＰを、１７０００×ｇにおいて、１５分間にわたり遠心分離することにより、３回にわたり洗浄し、超純水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に再分散させた。
本研究において使用された、全てのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。Ｃａｓ９酵素及びＣｐｆ１酵素は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ，ＬＬＣ（Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）から購入した。ＡｓＣｐｆ１のために、１８オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）スペーサー－チオール修飾を伴うｃｒＲＮＡを、３’末端において使用し、ＳｐＣａｓ９のために、５’末端において使用した（配列情報は、図３４において見出すことができる）。Ｃａｓ９ヌクレアーゼのための、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖（ｇＲＮＡ）は、それらを、二重鎖緩衝液中、等モル濃度において混合し、９５℃において、５分間にわたりインキュベートし、卓上において冷却することにより作った。１０μｇ／ｍＬの濃度のＡｕＮＰを、ＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡのｗ／ｗ比を０．５として、ｃｒＲＮＡ溶液又はｇＲＮＡ溶液へと添加した。クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を、１０ｍＭとなるように添加し、結果として得られる溶液を、５分間にわたり混合した。調製されたＡｕＮＰ／ｃｒＲＮＡナノコンジュゲートを遠心分離し、１５４ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に再分散させた。次いで、ヌクレアーゼを、ＡｕＮＰ／Ｃｐｆ１又はＡｕＮＰ／Ｃａｓ９のｗ／ｗ比を０．６として添加し、溶液を、上下にピペッティングすることにより混合し、１５分間にわたりインキュベートした。この後、ＮＰを、１６０００ｇにおいて、１５分間にわたり遠心分離し、ＮａＣｌ溶液中に再分散させた。２０００ＭＷのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を、０．００５％の濃度において添加し、十分に混合し、１０分間にわたるインキュベーションの後、ＮＰを、１５０００ｇにおいて、１５分間にわたり遠心分離し、ＮａＣｌ溶液中に再分散させた。最終ステップにおいて、ＨＤＴを、ＡｕＮＰ／ＨＤＴのｗ／ｗ比を２として添加し、１０分間にわたるインキュベーションの後、ＮＰを遠心分離し、ＮａＣｌ溶液中に再分散させた。
調製されたＮＰのサイズ及び形状は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）（ＪＥＯＬ ＪＥＭ １４００、日本、東京、昭島、日本電子株式会社）により特徴づけた。まず、ＰＥＬＣＯ ｅａｓｉＧｌｏｗ Ｇｌｏｗ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）を使用して、炭素コーティンググリッドに、グロー放電させることにより、試料を負染色した。容量２μＬの試料を、グリッド上に滴下させ、３０秒後、これを拭い取り、洗浄し、０．７５％のギ酸ウラニル溶液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）中において染色した。最後に、グリッドを、乾燥機内において、終夜乾燥させ、ＴＥＭによりイメージングした（Ｂｏｏｔｈら、ＪｏＶＥ（５８）：３２２７（２０１１））。
ＮＰの流体力学的サイズ及び多分散性指数は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓデバイス（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）により特徴づけた。測定は、三連において実行し、結果は、平均値±ＳＤとして報告した。低容量のディスポーザブルキュベット（ＺＥＮ００４０）（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を、測定のために使用した。
ＮＰのゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用することにより特徴づけた。Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｆｏｌｄｅｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｅｔａ Ｃｅｌｌ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を、測定のために使用し、結果を、平均値±ＳＤとして報告する。
ＮａｎｏＤｒｏｐデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ＡｕＮＰの局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）におけるシフトを特定することにより、ＣＲＩＳＰＲ構成要素の層ごとのコンジュゲーションもまた特徴づけた。
ＣＤ３４＋細胞の単離及び培養
初代ヒトＣＤ３４＋細胞を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ；フィルグラスチム；Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）により動員された健常ドナーから単離した。全白血球アフェレーシス生成物を得、既に公表されたプロトコール（Ａｄａｉｒら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、７：１３１７３（２０１６））を使用して、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）Ｐｒｏｄｉｇｙデバイス上における、免疫磁気ビーズベースの分離により、ＣＤ３４発現細胞を精製した。結果として得られるＣＤ３４＋細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び全て、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製である、組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ３）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）の各々１００ｎｇ／ｍＬずつを含有する、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中において培養した。インキュベーション条件は、３７℃、８５％の相対湿度、５％のＣＯ２及び正常酸素状態であった。
インビトロにおける遺伝子編集研究
ＣＤ３４＋細胞を融解させ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３及びＴＰＯを含有する、ＳＦＥＭ ＩＩ培地中において、終夜、あらかじめ刺激した。この後、細胞を、９６ウェルプレートに、１ｍＬ当たり１×１０６個において播種し、ＡｕＮＰの濃度を１０μｇ／ｍＬとする、Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰにより処置した。全てのインビトロ実験は、三連において実行した。インキュベーションの４８時間後、細胞を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（Ｄ－ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により洗浄し、ｇＤＮＡによる抽出及び遺伝子編集解析のために採取した。
比較のために、ＣＲＩＳＰＲ構成要素の電気穿孔もまた実行した。そうするために、４９ピコモルのｃｒＲＮＡ又はｇＲＮＡを、同量のＣｐｆ１又はＣａｓ９ヌクレアーゼ（８．５ピコモル）と混合し、１５分間にわたりインキュベートした。細胞を、電気穿孔緩衝液中に分散させ、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と混合した。混合物を、１ｍｍ電気穿孔キュベットへと添加し、２５０Ｖ及び５ミリ秒間のパルス持続時間の下において、ＢＴＸ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ ｄｅｖｉｃｅ（ＢＴＸ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、電気穿孔した。この後、細胞を培養し、２４時間後に洗浄するのに続き、さらに２４時間にわたるインキュベーションを行った。インキュベーションの４８時間後、細胞を、Ｄ－ＰＢＳにより洗浄し、ｇＤＮＡの抽出及び遺伝子編集解析のために採取した。
細胞生存率解析
Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰ及び電気穿孔による処置の後の、異なる時点において、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、細胞生存率について解析した。１０μＬのトリパンブルー染料（０．４％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０μＬの細胞懸濁液と混合し、１０μＬの混合物を、ディスポーザブルの細胞カウント用チャンバースライドへと適用し、デバイスへと挿入した。各試料の細胞生存率パーセントを記録し、平均値±ＳＤとして報告した。
結果を確認するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、細胞生存率もまた解析した。細胞を、Ｄ－ＰＢＳ中において洗浄し、遠心分離により沈降化させた。次いで、細胞懸濁液のアリコートを、カバースリップへと移した。蓋付きの３５ｍｍのペトリディッシュ内、３７℃において、細胞を、ガラス製のカバースリップの表面へと定着させた。Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（２μＭ）及びエチジウムホモ二量体１（ＥｔｈＤ－１）（４μＭ）の作業溶液を調製し、全ての細胞が、溶液により覆われるように、組み合わされたＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）アッセイ試薬１５０μＬを、２２ｍｍの矩形のカバースリップの表面へと添加した。細胞を、蓋付きのディッシュ内、室温において、３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、１０μＬのＤ－ＰＢＳを、清浄な顕微鏡スライドへと添加し、カバースリップを裏返して、顕微鏡スライド上にマウントした。Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭについての、４９４／５１７ｎｍ、及びＥｔｈＤ－１についての５２８／６１７ｎｍの励起値及び発光値を使用して、標識付け細胞を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ Ｌｉｖｅ、日本）下においてイメージングした。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ｖＨＳＣソフトウェア（ｖ１．６．３．０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、生細胞及び死細胞をカウントした。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖ １．５ｉ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して加工した。
コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ
ＣＦＣアッセイのために、製造元の仕様書に従い、細胞を、組換えヒト増殖因子を含有するメチルセルロース（Ｈ４２３０：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）中に播種し、１４日間にわたりインキュベートした。結果として得られたコロニーを、播種された細胞１００，０００個当たりのコロニー形成細胞数を決定するように、実体顕微鏡（ＺＥＩＳＳ Ｓｔｅｍｉ ５０８、Ｇｅｒｍａｎｙ）上において、カウントし、形状について評定した。
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによるゲノム編集の検出
全遺伝子編集百分率について解析するために、製造元のプロトコールに従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔットを使用して、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅した。
ＣＲＩＳＰＲ標的部位（７５５ｂｐ）（配列情報は、図３４において見出すことができる）を挟むゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し、製造元のプロトコールに従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製した。合計２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、２μＬの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び超純水と混合して、１９μＬの最終容量とし、ヘテロ二重鎖の形成を可能とする再アニーリング工程にかけた：９５℃において、５分間、－２℃／秒において、９５℃から８５℃へと低下させ、－０．１℃／秒において、８５℃から２５℃へと低下させ、４℃を保持した。再アニーリングの後、産物を、１μＬのＴ７ＥＩヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）により処理し、３７℃において、１５分間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、消化された産物を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットにより精製し、２％アガロースゲル上において解析した。ゲルは、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づいた。インデル百分率は、式：遺伝子改変％＝１００×（１－（１－切断率）１／２）により決定した。
ＮｏｔＩによる制限酵素消化
ＣＲＩＳＰＲ標的部位（７５５ｂｐ）を挟むゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し、製造元のプロトコールに従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製した。合計１０００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、５μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、１μＬのＮｏｔＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び超純水と混合して、５０μＬの最終容量とした。３７℃において、１５分間にわたるインキュベーションの後、消化された産物を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットにより精製し、２％アガロースゲル上において解析した。ゲルは、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づいた。遺伝子挿入百分率は、式：遺伝子改変％＝１００×（１－（１－切断率）１／２）により決定した。
ＴＩＤＥアッセイによるゲノム編集の検出
ＣＲＩＳＰＲ標的部位（７５５ｂｐ）（配列情報は、図３４において見出すことができる）を挟むゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し、製造元のプロトコールに従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製した。サンガーシーケンシングは、２０ｎｇのＤＮＡ試料を、４μＬのＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び超純水と混合して、１０μＬの最終容量とすることにより実行した。サイクルシーケンシングの後、試料を、３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により解析した。得られた配列を、ＴＩＤＥソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌ／）にかけ、遺伝子改変パーセントとして報告した（Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２（２２）：ｅ１６８～ｅ１６８（２０１４））。
Ｍｉｓｅｑ解析
ＣＲＩＳＰＲ標的部位（７５５ｂｐ）（配列情報は、図３４において見出すことができる）を挟むゲノム領域に対する、一次ＰＣＲを実行し、製造元のプロトコールに従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製した。二次ＰＣＲは、プライマーを、ＣＲＩＳＰＲ標的部位を挟むゲノム領域（１５７ｂｐ）上の、Ｍｉｓｅｑアダプター配列と共に使用して実行し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製した。５μＬの試料を、２％のアガロースゲルにかけることにより、特異的バンドを点検した。この後、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｉｎｄｅｘキット（９６インデックス）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、８サイクルとして使用して、ＤＮＡのインデックス付けを実行した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製した。最後に、調製されたライブラリーを、４ｎＭへと希釈し、プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により解析した。社内製のバイオインフォマティクスパイプラインを使用して、シーケンシングリードを解析した。ペアドハイスループットシーケンシングリード（Ｍｉｓｅｑ）を、ＰＡＩＲ［ＰＭＩＤ：２４１４２９５０］と組み合わせた。次いで、組み合わされたリードに、特注のＰｙｔｈｏｎスクリプトによりフィルターをかけた。完全なプライマー配列を伴わないリードは廃棄した。プライマー配列を、リードからトリミングし、次いで、同一な配列を、群としてまとめた。Ｅｍｂｏｓｓソフトウェアパッケージによる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈによるアライメントアルゴリズムを使用して、配列リードを、参照単位複製配列に照らしてアライメントした［ＰＭＩＤ：５４２０３２５、Ｋｒｕｓｋａｌ、Ｊ．Ｂ．（１９８３）、「Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ及びＪ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ（編）、「Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ， ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、１～４４頁、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ］。このアライメントアルゴリズムにより使用されたオプションは、－ｇａｐｏｐｅｎ：１０．０、－ｇａｐｅｘｔｅｎｄ：０．５及び－ａｆｏｒｍａｔ３：ｓａｍであった。次いで、特注のＰｙｔｈｏｎスクリプトにより、ＳＡＭ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｍａｐ）アウトプットによる、ＣＩＧＡＲ（Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ Ｇａｐ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ）ストリングを読み取り、この情報を使用して、挿入及び欠失を同定及び定量した。アライメントされた各配列はまた、参照単位複製配列とも比較して、置換突然変異を同定した。１つのリードだけにおいて見出された突然変異は、解析から除外した。次いで、突然変異配列を含有する表、リードカウント及び各突然変異についての頻度を、さらなる解析のために出力した。各シーケンシングランにおいて、移植前の同じ動物に由来する電気穿孔細胞からなる対照試料が、突然変異クラス（挿入、欠失、置換、挿入及び置換など）の平均頻度を決定し、これを使用して、対応する突然変異クラスからの、各突然変異についての、片側二項検定を実施した。＜０．０５のｐ値を裏付ける場合、被験試料からの突然変異を保持した。全ての特注のスクリプトは、依頼に応じて入手可能である。
インビボのＮＳＧマウスにおける生着研究
動物を伴う、全ての実験は、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ（ＯＬＡＷ）によるＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ（ＰＨＳ）ｐｏｌｉｃｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）によるＡｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ及びＩＡＣＵＣプロトコール第１８６４号に従う、規制機関ガイドラインに従い行った。
ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｓｚｊ（ＮＯＤＳＣＩＤガンマ－／－；ＮＳＧ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得、社内の無菌飼育条件下において飼育した。成体マウス（８～１２週齢）に、セシウム照射器により、１７５ｃＧｙの全身照射を施した３～４時間後に、１％のヘパリン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含有する３０μＬのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁させられた、初代ヒトＣＤ３４＋血液細胞１×１０６個の、単回の肝内注射を施した。生着の４週間後、眼窩後穿刺により血液を回収して、フローサイトメトリーにより、ヒト血液細胞レベルを決定した。追跡期間にわたり、隔週において、血液を回収した。白血球を、単離し、既に報告されている（Ｈａｗｏｒｔｈら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ、６：１７～３０（２０１７））通りに、抗ヒトＣＤ４５抗体（クローン：２Ｄ１）、ＣＤ３（クローン：ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（クローン：ＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ２０（クローン：２Ｈ７）及びＣＤ１４（クローン：Ｍ５Ｅ２）（全て、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ製）により染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上において回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して解析した。
共焦点顕微鏡イメージング
細胞内の生体内分布を追跡するために、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ及びＨＤＴを、それぞれ、５’末端において、Ａｌｅｘａ ４８８フルオロフォア及びＡｌｅｘａ ６６０フルオロフォア（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により蛍光タグづけした。Ａｕ／ＣＲＩＳＰＲ ＮＰを調製し、細胞と共に、６時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を洗浄し、ＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈ内の、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ（商標）ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中に分散させた。２滴のＮｕｃＢｌｕｅ（商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）試薬（励起／発光：３６０／４６０ｎｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、細胞へと添加し、室温において、３０分間にわたりインキュベートした。最後に、細胞は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉ－Ｐｈｏｔｏｎ ｗｉｔｈ Ａｉｒｙｓｃａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上においてイメージングした。ＺＥＮ Ｌｉｔｅソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、画像を解析した。イメージングは、バックグラウンドを補正した後に、６０倍の対物レンズを使用して実行した。
統計学的解析
全てのデータは、平均値±標準偏差として報告し、統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０３ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）により、対応のあるスチューデントのｔ検定を使用して実施した。＜０．０５のｐ値を、統計学的に有意であると考えた。
［実施例３］ インビトロにおけるターゲティング効率
本実施例の目標は、ＮＰを、混合細胞集団（操作されていない血液又は骨髄産物）内の、特異的な血液細胞型（ＨＳＰＣ又はＴ細胞）へとターゲティングしうることを示すことである。
現在のところ、血液細胞における、臨床遺伝子治療は、標的免疫細胞（例えば、ＨＳＰＣ又はＴ細胞）を、他の血液細胞型から精製することを要求する。遺伝子編集物に特異的に結合することが可能であり、これらを、精製を伴わずに、免疫細胞へと送達しうるＮＰにより、患者特異的細胞療法のために、細胞を、エクスビボにおいて精製及び培養する必要性がなくなるので、現行の遺伝子治療製造工程が、劇的に簡略化される。さらに、これは、インビボにおける、全世界的に、最もポータブルな遺伝子治療戦略を表す、遺伝子編集の、血液細胞への送達の可能性を加速化させる。この、高度に簡略化された製造戦略は、「最小操作」手法と称される。
本実施例における被験細胞型は、１）初代ヒトＨＳＰＣ（ＣＤ３４＋細胞及び／又はＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ９０＋細胞）及び２）初代ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞）を含む。ＨＳＰＣのための、臨床的に妥当な供給源は、骨髄、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）動員末梢血及びＡＭＤ３１００（プレリキサホル）動員末梢血を含む。Ｔ細胞のための、臨床的に妥当な供給源は、全末梢血を含む。
編集される遺伝子座は、１）鎌状赤血球病などの異常ヘモグロビン症において妥当なＨＳＰＣ内のγ－グロビンプロモーター及び２）ＨＩＶ感染の背景において妥当なＴ細胞内のＣＣＲ５を含む。
ＨＳＰＣ内の被験ターゲティング分子は、ａ）ＣＤ３４、ＣＤ９０又はＣＤ１３３に結合する抗体（単独において、又は２つの組合せにおいて調べられる）；ｂ）ＣＤ１３３（単独において調べられ、抗体又はリガンドと組み合わせて調べられられる）に結合するアプタマー並びにｃ）リガンド：ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｒｅｇｅｎｉｎ １）を含む。Ｔ細胞内の被験ターゲティング分子は、ａ）ＣＤ３、ＣＤ４に結合する抗体（単独において、又は組合せにおいて調べられる）及びｂ）ＣＤ３（単独において調べられ、抗体と組み合わせて調べられられる）に結合するアプタマーを含む。これらの分子型の各々を、既存のＮＰへと添加するのに要求される化学反応は、アミン－スルフヒドリル間架橋剤又はスルフヒドリル－スルフヒドリル間架橋剤を、多様なＰＥＧスペーサーと共に利用する。
健常ドナーに由来する、非操作の血液細胞生成物を、各ターゲティング分子又はこの組合せ又はセットにつき、１つずつのアリコートに分割する。各ターゲティング分子を、ＮＰの表面提示カーゴとして調べる。取込みを追跡するために、ガイドＲＮＡ（最内層）に、遠赤外蛍光染料によりタグづけする。標的細胞集団及び非標的細胞集団を、遠赤外を下回る、異なる波長のフルオロフォアを使用して、蛍光標識付けされた抗体により追跡する。実験は、上記において言及された、各血液細胞供給源について、最小において６例～最大において１０例の、固有のドナーについて反復した（生物学的多連）。
共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーを使用して、標的細胞及び非標的細胞による、ＮＰの取込みを評価する。いずれのアッセイについても、さらなる試験のための、ターゲティング分子、細胞型及び／又は血液生成物の選択のための指標は、（ｉ）標的細胞のうちの、最小において５０％～最大において１００％が、赤色蛍光表現型を示すこと及び（ｉｉ）非標的細胞のうちの、最小において０％～最大において２０％が、赤色蛍光表現型を示すことを含みうる。さらなる試験のための、ターゲティング分子、細胞型及び／又は血液生成物の選択のための基準は、（ｉ）平均値において≧５０％の標的細胞（ＨＳＰＣ又はＴ細胞）による赤色蛍光が、ドナーにわたり、少なくとも１つの実験群について、１つの臨床的に妥当な細胞型内において観察されること及び（ｉｉ）≦２０％の赤色蛍光が、ドナーにわたり、他の任意の非標的細胞型について観察されることを含みうる。
ターゲティング分子、細胞型及び／又は血液生成物の、さらなる試験からの除外についての基準は、（ｉ）全ての被験実験条件において、＜５０％の標的細胞による取込み又は（ｉｉ）＞２０％の非標的細胞による取込みが観察されることを含みうる。
本研究は、どの被験ターゲティング分子が、ＮＰを、最も良好な選択性により、操作されていない、臨床的に妥当な血液細胞生成物中の、所望の細胞表現型と会合させるのかを決定する。
［実施例４］ インビトロにおける、最小操作細胞産物の、前臨床的査定
本実施例は、開示されたＮＰが、遺伝子治療のための、血液細胞生成物の「最小操作」を達成し、エクスビボにおける、標的細胞の、精製及び培養に対する必要性をなくすための、臨床的に実施可能戦略であることを裏付けることを目的とする。
ターゲティング型ＮＰの、臨床への移行のために、最小操作を経た血液細胞生成物の、ヒト患者への再注入のための現行の基準（表３を参照されたい）を満たす、臨床スケールにおける製造の実現可能性を裏付ける。スケールアップの実現可能性を裏付けるために、臨床スケールにおける、非操作のヒトドナー血液生成物中の、ターゲティング分子（実施例３により同定された）を伴う、本開示の、ＡｕＮＰベースの遺伝子編集送達系、ターゲティング分子を伴わない、同遺伝子編集送達系について調べる。この実現可能性データは、精製、培養物、電気穿孔又は操作ウイルスを含まない、患者特異的細胞療法のための、革新的な製造法を確立するために、極めて重要となる。
さらなる試験のための、特異的な血液生成物及び細胞型と関連する指標又は基準（実施例３による）は、本実施例のための標的となる。１つを超える細胞型及び血液生成物が、さらなる試験のための基準を満たす場合、最高性能の（すなわち、最高のレベルの遺伝子編集及び最も良好なターゲティング能の）ものを、まず、さらに調べ、性能の劣る候補物質を、この後において調べる。
ＨＳＰＣ及びＴ細胞のための、臨床的に妥当な供給源は、実施例３に記載された通り：（ｉ）ＨＳＰＣのための、骨髄、ＧＣＳＦ動員末梢血及びＡＭＤ３１００（プレリキサホル）動員末梢血並びに（ｉｉ）Ｔ細胞のための、全末梢血である。
編集される遺伝子座は、実施例３に記載された通り：１）ＨＳＰＣ内のγ－グロビンプロモーター及び２）Ｔ細胞内のＣＣＲ５である。
血液／骨髄生成物は、少なくとも３例の個別のドナーから回収する。各ドナーに由来する、各生成物を、３つの等量のアリコート：処置なし（モック対照）のためのアリコート、本開示の、ＡｕＮＰベースの（非ターゲティング）遺伝子編集送達系による処置のためのアリコート及び本開示の、ＡｕＮＰベースの遺伝子編集送達系＋選択されたターゲティング分子による処置のためのアリコートへと分ける。
本実施例において使用されるアッセイは、蛍光支援細胞分取（ＦＡＣＳ）又は免疫磁気ビーズベースの分取、遺伝子編集解析、微量元素解析誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、生存率アッセイ及び出荷試験（すなわち、再注入試験に対する適性）を含む。ＦＡＣＳ又は免疫磁気ビーズにより、細胞を分取するために、他の全てのパラメータを十分に評価するのに必要とされる、標的細胞プールの最小純度は≧９０％であり、最大純度は１００％である。非標的（陰性）画分の純度について、閾値の要件は存在しない。遺伝子編集解析のために、標的細胞表現型についての最小閾値は、２０％の全遺伝子編集であり、最大閾値は、５０％の遺伝子編集であり；非標的細胞表現型についての最小閾値は、０％の遺伝子編集であり、最大閾値は、２０％の遺伝子編集である。生成物は、自家細胞生成物、遺伝子改変細胞生成物の再注入のための、標準的な出荷基準（下記の表３を参照されたい）を満たさなければならない。微量元素解析は、最終的な製剤化生成物に対して、注入どれだけの質量のＡｕが存在するのかを理解することだけを目的として実施される。最小閾値は、存在せず、最大閾値は、初期処置のために添加された全質量（最大において１０μｇ／ｍＬの出発細胞生成物）を超えることができない。下記において論じられる選択基準が満たされた場合、実施例５において、このデータを使用して、インビボにおける生体内分布及びクリアランスについて査定する。
さらなる試験のための、ＮＰの選択のための基準は、（ｉ）平均値において≧２０％の全遺伝子編集が、ドナーにわたり、標的細胞だけにおいて観察されること及び（ｉｉ）他の全ての出荷基準を満たしながら、細胞生存率が≧７０％であることを含みうる。
本実施例は、選択されたＮＰが、ヒト血液細胞生成物を伴う最小操作法に適すること又はどの細胞型若しくは血液生成物構成要素（血清、マクロファージなど）が、成功に対する最大の難関を提示するのかを裏付けうる。
Figure 2024045297000036
［実施例５］ インビボにおける、最小操作ヒト細胞生成物についての、前臨床的査定
本実施例は、免疫不全マウスモデルにおいて、最小操作ヒト血液細胞生成物の前臨床安全性及び実現可能性を裏付ける。
遺伝子改変ヒト血液細胞の安全性及び効能を裏付ける、確立されたモデルは、異種移植である。このモデルにおいて、ヒト血液細胞を、照射された免疫不全マウスへと移植する。このモデルは、１例のヒトドナーに由来する細胞を、多くの個別のマウスにわたり移植することを可能とする。このモデルにおいて研究されうるパラメーターは、動物における血液細胞の挙動、毒性、生体内分布及びクリアランスを含む。重要なことは、再注入時に、一部のＡｕＮＰが、最小操作を経た血液細胞生成物中においてもなお存在することが可能であり、本研究が、ＮＰ投与の生理学的影響を理解する一助となりうることが予期されることである。この情報は、手法の、臨床への移行に重要であり、また、インビボにおける、直接投与研究にも有用となる。本実施例において、さらなる研究のために選択された、最小操作ヒト血液細胞生成物（実施例４による）を、致死線量未満において照射された免疫不全マウスへと注入して、細胞性能（生着）並びに血液細胞生成物と共に注入された、任意の剰余のＮＰの生体内分布及びクリアランスについてモニタリングする。これは、開示された技術についての「デリスキング」実験であると考えられうる。
さらなる研究のために、実施例３により選択された、特異的な血液生成物及び細胞型は、これらの研究のための標的となる。
ＨＳＰＣ及びＴ細胞のための、臨床的に妥当な供給源は、実施例３及び４に記載された通り：（ｉ）ＨＳＰＣのための、骨髄、ＧＣＳＦ動員末梢血及びＡＭＤ３１００（プレリキサホル）動員末梢血並びに（ｉｉ）Ｔ細胞のための、全末梢血である。
編集される遺伝子座は、実施例３及び４に記載された通り：１）ＨＳＰＣ内のγ－グロビンプロモーター及び２）Ｔ細胞内のＣＣＲ５である。
実施例４における、３例の個体ドナーに由来する、最小操作血液／骨髄生成物を、致死線量未満の全身照射後１２～２４時間以内に、免疫不全マウスへと注入する。ヒト細胞の生着を、移植後の時間経過にわたりモニタリングするほか、遺伝子編集細胞の生着並びに動物の全体的健康状態及び福利についてもモニタリングする。注入後において、これらのマウスから、イメージング、尿及び糞便を得て、注入生成物中に存在しうるＮＰの、生体内分布及びクリアランスを決定することができる。
研究において行われる、アッセイ及び実験は、注入されたマウスの健康状態についての、目視によるモニタリング（毛繕い、体重及び活動性のレベル）；移植後における血液学的回復；遺伝子編集細胞の生着及び存続；注入後７２時間にわたる、注入された生成物についての、ＩＣＰ－ＭＳによる微量元素解析並びに全てのＮＰが、クリアランスされたのかどうか（質量収支）を決定するための、尿及び糞便についての、ＩＣＰ－ＭＳによる解析を含む。生体内蓄積が指し示される場合、生存マウスについての、マイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）によるイメージングを実施して、蓄積の位置について評価することができる。蓄積が、マイクロＣＴにより可視化するのに低度に過ぎる場合、剖検及びＩＣＰ－ＭＳによる、さらなる微量元素解析を実施して、生体内蓄積についての部位を決定することができる。マイクロＣＴ、剖検及び／又は微量元素解析を、組織病理学と組み合わせて、潜在的な毒性について評価することができる。これらの多様なアッセイについてのリードアウトの閾値は、後続の数段落において記載される。
生着及び存続
フローサイトメトリーを使用して、ヒトＣＤ４５発現細胞の、血液中レベル、骨髄中レベル及び脾臓中レベルを評価することができる。最小閾値は、０％であり、最大閾値は、１００％である。
遺伝子編集解析
最小閾値は、ヒト細胞内における５％であり、最大閾値は、１００％である。マウス細胞を編集するのに十分なＮＰが、製剤中に依然として存在することは予期されないが、アッセイは、遺伝子編集が、下記において記載される、生体内蓄積を提示する、マウスＣＤ４５発現細胞内又は任意の組織内において検出されるのかどうかについても査定する。
健康状態のモニタリング
疼痛及び苦痛の査定（最小：ＰＤ１、最大：ＰＤ４）並びに身体状態の査定（最小：ＢＣ１、最大：ＢＣ５）を、実施された各マウスについて、ＮＰの投与の前に、次いで、ＮＰの投与後、毎日３日間にわたり実施し、この後、毎週実施する。スコア付けは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒら、「Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２０１２；２：１４５～１６５により公表されているスコア付けに基づく。任意の有害作用を、記録し、まとめる。
微量元素解析
７２時間にわたる、尿／糞便中の最小閾値は、０であり、最大閾値は、注入された全質量を超えない。組織中の最小閾値は、０であり、最大閾値は、注入された全質量を超えない。
マイクロＣＴイメージング
最小閾値は、造影剤による増強を伴わない場合の値であり、最大閾値は、未決定である。
組織病理学
アッセイは、全てのドナーによる、非処置対照と比べて顕著な臓器毒性を評価する。最小閾値は、毒性なしであり、最大閾値は、各標的臓器について公表されている、有害事象基準を使用してグレードづけされる。
本実施例において記載された研究は、最小操作を経たヒト血液生成物の、インビボにおける、前臨床の安全性及び効能を確立する。
（ＸＩＶ）結語
開示された核酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において規定された、ヌクレオチド塩基についての標準的な略号を使用して示される。各核酸配列について、１つの鎖だけが示されるが、相補鎖も含まれるものとして理解される。
本明細書において開示されたタンパク質配列及び／又は核酸配列の変異体もまた、使用されうる。変異体は、本明細書において記載又は開示された、タンパク質配列及び核酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性又は９９％の配列同一性を伴う配列を含み、この場合、変異体は、実質的に同様の生物学的機能又は改善された生物学的機能を呈する。
「配列同一性％」とは、配列を比較することにより決定された、２つ以上の配列の間の関係を指す。当技術分野において、「同一性」とはまた、このような配列の連なりの間のマッチにより決定された、タンパク質配列及び核酸配列の間の配列類縁性の程度も意味する。「同一性」（「類似性」と称されることが多い）は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４）；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ。、Ｉ部（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．編））、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）及び「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）において記載された方法を含む、公知の方法により、たやすく計算されうる。同一性を決定する、好ましい方法は、被験配列の間の最も良好なマッチをもたらすようにデザインされる。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムにおいてコード化されている。配列アライメント及び同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算ソフトパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施されうる。配列の多重アライメントもまた、Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１～１５３（１９８９））を、デフォルトのパラメーター（ギャップペナルティー＝１０、ギャップ長ペナルティー＝１０）により使用して実施されうる。妥当なプログラムはまた、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０（１９９０））；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎによるアルゴリズムを組み込む、ＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ、「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．」、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、会合日：１９９２年１月１１～２０日、編者：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ、出版元：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙも含む。本開示の文脈において、解析のために、配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は、参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときに、ソフトウェアにより元からロードされていた値又はパラメーターの任意のセットを意味する。
特定の実施形態において、変異体のタンパク質は、保存的アミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、参照配列の構造特徴を、実質的に変化させない場合がある（例えば、置換アミノ酸は、参照配列内において生じる螺旋を切断したり、参照配列を特徴付ける、他の種類の二次構造を破壊したりする傾向がないものとする）。当技術分野において認識されている、ポリペプチドの二次構造及び三次構造の例について、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ」（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））及びＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：１０５（１９９１）において記載されている。
特定の実施形態において、「保存的置換」は、以下の保存的置換群：群１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；群２：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；群３：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；群４：アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；群５：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）及び群６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）のうちの１つにおいて見出される置換を伴う。
加えて、アミノ酸は、同様の機能又は化学構造又は組成により、保存的置換群（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）へと群分けされうる。例えば、脂肪族への群分けは、置換を目的として、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅを含みうる。互いに対する保存的置換であると考えられたアミノ酸を含有する、他の群は、硫黄含有群：Ｍｅｔ及びシステイン（Ｃｙｓ）；酸性群：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ及びＧｌｎ；小型脂肪族残基群、非極性残基群又は弱極性残基群：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；極性残基群、負帯電残基群及びこれらのアミドによる群：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；極性残基群、正帯電残基群：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；大型脂肪族残基群、非極性残基群：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ並びに大型芳香族残基群：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐを含む。さらなる情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙにおいて見出される。
特定の実施形態において、「アフィニティー」とは、抗体の、単一の結合性部位と、この標的マーカーとの、非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバー（すなわち、抗体及び標的マーカー）の間の、１：１の相互作用を反映する、内因性の結合アフィニティーを指す。抗体の、この標的マーカーに対するアフィニティーは、一般に、解離定数（Ｋｄ）又は会合定数（ＫＡ）により表されうる。アフィニティーは、当技術分野で公知の、一般的な方法により測定されうる。
当業者により理解される通り、本明細書において記載された細胞マーカーに結合する、いくつかの抗体及びターゲティングリガンドが市販されている。
特定の実施形態において、結合アフィニティーは、室温又は３７℃、生理学的ｐＨ（７．４）を近似する緩衝塩溶液など、妥当なインビトロ条件において評価されうる。
特定の実施形態において、「～に結合する」とは、抗体が、この標的マーカーと、１０－８Ｍ以下、特定の実施形態において、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、特定の実施形態において、１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ、特定の実施形態において、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、特定の実施形態において、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ又は特定の実施形態において、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍの解離定数（ＫＤ）により会合することを意味する。用語はさらに、抗体が、存在する、他の生体分子に結合しない（例えば、他の生体分子に、１０－４Ｍ以上、特定の実施形態において、１０－４Ｍ～１Ｍの解離定数（ＫＤ）により結合する）ことを指し示すのにも使用されうる。
特定の実施形態において、「～に結合する」とは、抗体が、この標的マーカーと、１０７Ｍ－１以上、特定の実施形態において、１０５Ｍ－１～１０１３Ｍ－１、特定の実施形態において、１０５Ｍ－１～１０１０Ｍ－１、特定の実施形態において、１０５Ｍ－１～１０８Ｍ－１、特定の実施形態において、１０７Ｍ－１～１０１３Ｍ－１又は特定の実施形態において、１０７Ｍ－１～１０８Ｍ－１のアフィニティー定数（すなわち、会合定数、ＫＡ）により会合することを意味する。用語はさらに、抗体が、存在する、他の生体分子に結合しない（例えば、他の生体分子に、１０４Ｍ－１以下、特定の実施形態において、１０４Ｍ－１～１Ｍ－１の会合定数（ＫＡ）により結合する）ことを指し示すのにも使用されうる。
指し示された通り、特定の実施形態は、ターゲティングリガンドの結合性ドメインの変異体を利用しうる。ターゲティングリガンドの結合性ドメインの変異体は、抗体の、標的エピトープへの結合に、有害な影響を及ぼさない、１つ以上の保存的アミノ酸置換又は１つ以上の非保存的置換を有する変異体を含みうる。
特定の実施形態において、ＶＬ領域は、本明細書において開示された方法に従い作製され、特徴づけられた抗体と比較した場合に、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０の）挿入、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０の）欠失、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）又は上記において言及された変化の組合せを含みうる。挿入、欠失又は置換は、各ＣＤＲが、変化を含まない、又は１つ、２つ又は３つ以下の変化を含み、改変ＶＬ領域を含む抗体が、標的エピトープに、参照抗体と同様のアフィニティーにより、なおも特異的に結合しうることを条件として、この領域の、アミノ末端若しくはカルボキシ末端又はこれらの両方を含む、ＶＬ領域内の任意の場所に存在しうる。
特定の実施形態において、ＶＨ領域は、開示されたＶＨに由来しうる、又はこれらに基づく場合があり、本明細書において開示された方法に従い作製され、特徴づけられた抗体と比較した場合に、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０の）挿入、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０の）欠失、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換）又は上記において言及された変化の組合せを含みうる。挿入、欠失又は置換は、各ＣＤＲが、変化を含まない、又は１つ、２つ又は３つ以下の変化を含み、改変ＶＨ領域を含む抗体が、その標的エピトープに、参照抗体と同様のアフィニティーにより、なおも特異的に結合しうることを条件として、この領域の、アミノ末端若しくはカルボキシ末端又はこれらの両方を含む、ＶＨ領域内の任意の場所に存在しうる。
ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４及び本明細書において記載された他のＣＤへの言及は、当業者により理解される。他の読者のために、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原は、細胞の表面上において発現されたタンパク質であって、特異的抗体を介して検出可能なタンパク質である。ＣＤ３４は、骨髄細胞のうちの１～４％において発現された、高グリコシル化Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ４５ＲＡは、ＩＩＩ型フィブロネクチンと関連し、２０５～２２０ｋＤａの分子量を有し、Ｂ細胞、ナイーブＴ細胞及び単球において発現される。ＣＤ９０は、ヒトの前胸腺細胞上において見出された、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞アンカリング分子である。ＣＤ１１７は、骨髄幹細胞のうちの、１～４％において見出された、ｃ－ｋｉｔリガンド受容体である。ＣＤ１２３Ａは、サイトカイン受容体スーパーファミリー及びＩＩＩ型フィブロネクチンスーパーファミリーと関連し、７０ｋＤａの分子量を有し、骨髄幹細胞、顆粒球、単球及び巨核球において発現される。ＣＤ１３３は、未分化造血前駆細胞及び他の幹細胞において発現された、５回膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１６４は、ヒト造血前駆細胞及び骨髄間質細胞により発現された、Ｉ型内在性膜貫通シアロムチンである。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、本開示の実施は、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技法を利用しうる。これらの方法について、以下の刊行物において記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版（１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩＮ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）のシリーズ；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、「ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら編、「ＰＣＲ ２：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（１９９５）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編、「Ａｎａｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８８）並びにＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８７）を参照されたい。
当業者により理解される通り、本明細書において開示された各実施形態は、その、特定の言明された要素、ステップ、成分又は構成要素を含みうる、これらから本質的になりうる、又はこれらからなりうる。したがって、「～を含む」又は「～を含むこと」という用語は、「～を含む、これらからなる、又はこれらから本質的になる」と復唱するように解釈されるべきである。「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という移行用語は、「～を含むがこれらに限定されない」を意味し、指定された要素、ステップ、成分又は構成要素の、多量における包含もなお可能とする。「～からなること」という移行句は、指定されていない、任意の要素、ステップ、成分又は構成要素を除外する。「～から本質的になること」という移行句は、実施形態を、指定された要素、ステップ、成分又は構成要素及び実施形態に、実質的に影響を及ぼさない、要素、ステップ、成分又は構成要素に限定する。実質的な効果は、最小操作にかけられた、エクスビボの血液細胞生成物中において、意図された細胞型を、選択的に遺伝子改変する能力の、統計学的に有意な低減を引き起こす。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書及び特許請求の範囲において使用された、成分の数量、分子量、反応条件などの特性を表す、全ての数全ての場合において、「約」という用語により修飾されていると理解されるものとする。したがって、逆の指示がない限り、本明細書及び付属の特許請求の範囲に明示された数値パラメーターは、本発明により得られることが求められた所望の特性に応じて変動しうる近似値である。少なくとも、均等物についての原則の適用を、特許請求の範囲に限定しようとする試みとしてではなく述べると、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効数字の桁数に照らして、通常の丸めの技法を適用することにより理解されるものとする。さらなる明確さが要求される場合、「約」という用語は、言明された数値又は範囲と共に使用された場合に、当業者へと、合理的に帰せられる意味を有する、すなわち、言明された値から±２０％；言明された値から±１９％；言明された値から±１８％；言明された値から±１７％；言明された値から±１６％；言明された値から±１５％；言明された値から±１４％；言明された値から±１３％；言明された値から±１２％；言明された値から±１１％；言明された値から±１０％；言明された値から±９％；言明された値から±８％；言明された値から±７％；言明された値から±６％；言明された値から±５％；言明された値から±４％；言明された値から±３％；言明された値から±２％又は言明された値から±１％の範囲内で、言明された値又は範囲よりいくぶんか大きな値若しくは範囲、又はいくぶんか小さな値若しくは範囲を描示する。
広範囲にわたる本発明について説明する、数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、具体例において明示された数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、任意の数値は、固有に、それらのそれぞれの試験測定値において見出された標準偏差から必然的に生じる、ある特定の誤差を含有する。
本発明について記載する文脈において（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用された、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その」などは、本明細書において、若しくは文脈により、そうでないことが指し示されない限り、又は逆の記載がない限り、の両方単数形及び複数形を対象とするものとする。本明細書における、値の範囲の列挙は、ある範囲内に収まる各個別の値に、個別に言及する簡略法として用いられることだけを意図するものである。本明細書において、そうでないことが指し示されない限りにおいて、各個別の値は、それが、本明細書において、個別に列挙された場合と同様に、本明細書へと組み込まれる。本明細書において記載された全ての方法は、本明細書において、若しくは文脈により、そうでないことが指し示されない限り、又は逆の記載がない限り、任意の適切な順序において実施されうる。本明細書において提示された、任意の例又は例示的な表現及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、本発明を、よりよく例示することだけを意図するものであり、別の形において特許請求されている、本発明の範囲に対して、限定を付与するものではない。本明細書における、いかなる表現も、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施に不可欠であると指し示すものとして理解されないものとする。
本明細書において開示された、本発明の、代替的な要素又は実施形態の群分けは、限定として理解されないものとする。各群のメンバーは、個別に言及及び特許請求される場合もあり、本明細書において見出された、群の他のメンバー又は他の要素との、任意の組合せにおいて言及及び特許請求される場合もある。群の、１つ以上のメンバーが、簡便性及び／又は特許性を理由として、群内に組み入れられる場合もあり、群から削除される場合もあることが予期される。任意のこのような組入れ又は削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を含有すると考えられ、したがって、付属の特許請求の範囲において使用された、全てのマーカッシュ群についての、文書による記載を実現する。
本明細書において、本発明者らに公知である、本発明を実行するための、最良の方式を含む、本発明の、ある特定の実施形態が記載される。当然ながら、前出の記載を読めば、これらの記載された実施形態に対する変動は、当業者に明らかとなる。本発明者は、当業者が、必要に応じて、このような変動を利用することを期待しており、本発明者らは、本発明が、本明細書において具体的に記載されたのとは別の形において実施されることを意図する。したがって、本発明は、本明細書に付属の特許請求の範囲において列挙された対象物に対する、全ての改変及びこれらの均等物を、適用可能な法規により許容されるものとして含む。さらに、本明細書において、若しくは文脈により、そうでないことが指し示されない限り、又は逆の記載がない限り、上記において記載された要素の、これらの全ての可能な変動における、任意の組合せは、本発明に包含される。
さらに、本明細書を通して、特許、出版刊行物、雑誌論文及び他の文書（本明細書において参照された材料）への、多くの参照がなされている。参照された材料の各々は、参照により、これらの参照された教示について、これらの全体において、本明細書に個別に組み込まれる。
最後に、本明細書において開示された、本発明の実施形態は、本発明の原理を例示することが理解されるものとする。利用されうる、他の改変も、本発明の範囲内にありうる。したがって、限定ではなく、例を目的とする、本発明の代替的な構成は、本明細書における教示に従い利用されうる。したがって、本発明は、示され、記載される通りに、正確に限定されるわけではない。
本明細書において示された詳細は、本発明の好ましい実施形態についての例として、例示的な議論だけを目的とするものであり、本発明の、多様な実施形態の、原理及び概念的側面についての、最も有用であり、たやすく理解される記載であると考えられるものを提示することを目標として提示されている。この点で、図面及び／又は例と共に理解された記載は、当業者に、本発明のいくつかの形態が、実際に、どのようにして実施されうるのかを明らかとするので、本発明の構造的詳細を、本発明についての根本的な理解に必要である以上に詳細に示す、いかなる試みもなされていない。
本開示において使用された、定義及び説明は、以下の例において、明確に、曖昧さを廃する形において改変されない限りにおいて、又は意味の適用が、任意の構築を、無意味又は本質的に無意味とする場合、将来における、任意の構築において、統制的であることを意味し、このことが意図される。用語の構築が、用語を無意味又は本質的に無意味とする場合、定義は、「Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」、３版又は「Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４）など、当業者に公知の辞書から理解されるものとする。

Claims (83)

  1. 生物学的試料中の造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）集団を遺伝子改変する方法であって、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を、生物学的試料へと添加するステップを含み、ＡｕＮＰが、
    直径が２０ｎｍ未満である金（Ａｕ）コア；
    ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、３’末端及び５’末端を含み、３’末端が、チオール修飾を伴うスペーサーへとコンジュゲートされ、５’末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされ、チオール修飾が、Ａｕコアの表面へと、共有結合的に連結され、ｃｒＲＮＡが、配列番号２６２；配列番号１３；配列番号１４又は配列番号２４１～２６１に明示された配列を有する、ｃｒＲＮＡ－ヌクレアーゼのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；
    正帯電ポリエチレンイミンポリマーが、２５００ダルトン未満の分子量を有し、ＲＮＰ複合体を取り囲み、Ａｕコアの表面と接触する、正帯電ポリエチレンイミンポリマーコーティング；並びに
    正帯電ポリマーコーティングの表面上に、相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）を含み、ＨＤＴ鋳型が、配列番号４８；配列番号４；配列番号１５；配列番号３３～４１；配列番号４４～４７又は配列番号４９～５１に明示された配列を含む、ドナー鋳型；並びに
    ＲＥＡ８２０、ＲＥＡ７５３、ＲＥＡ８１６、２９３Ｃ３、ＡＣ１４１、ＡＣ１３３、又は７の抗体クローンの結合性ドメインを含み、アミン－スルフヒドリル間架橋剤又はスルフヒドリル－スルフヒドリル間架橋剤を介してヌクレアーゼへと連結されている、ＣＤ１３３ターゲティングリガンド
    を含み、
    ＨＳＰＣ集団が、電気穿孔、ＨＤＴをコードするウイルスベクター又は磁気による細胞分離工程へと曝露されておらず、方法が、３０％以下のＨＳＰＣ細胞毒性を結果としてもたらし、ＨＳＰＣ集団内において、少なくとも１０％の遺伝子編集効率をもたらす、方法。
  2. ｃｒＲＮＡが、配列番号２５；配列番号３；配列番号２４；配列番号２６～３２；配列番号４２；配列番号４３又は配列番号２１４～２２４に明示された配列をターゲティングする、請求項１に記載の方法。
  3. ｃｒＲＮＡが、配列番号２６２、配列番号２６１又は配列番号２５９に明示された配列を有する、請求項１に記載の方法。
  4. ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 正帯電ポリマーコーティングが、２０００ダルトンの分子量を伴うポリエチレンイミンを含む、請求項１に記載の方法。
  6. Ａｕコアの、ヌクレアーゼに対する重量／重量（ｗ／ｗ）比が、０．６である、請求項１に記載の方法。
  7. Ａｕコアの、ＨＤＴに対するｗ／ｗ比が、１．０である、請求項１に記載の方法。
  8. 生物学的試料中の、選択された細胞集団を遺伝子改変する方法であって、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を、生物学的試料へと添加するステップを含み、ＡｕＮＰが、
    直径が３０ｎｍ未満である金（Ａｕ）コア；
    ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、３’末端及び５’末端を含み、３’末端が、化学修飾を伴うスペーサーへとコンジュゲートされ、５’末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされ、化学修飾が、Ａｕコアの表面へと、共有結合的に連結されている、ｇＲＮＡ－ヌクレアーゼのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；
    正帯電ポリマーが、２５００ダルトン未満の分子量を有し、ＲＮＰ複合体を取り囲み、Ａｕコアの表面と接触する、正帯電ポリマーコーティング；並びに
    正帯電ポリマーコーティングの表面上に、相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）を含む、ドナー鋳型
    を含み、
    選択された細胞集団が、電気穿孔又はコードするウイルスベクターへと曝露されておらず、方法が、選択された細胞集団の３０％以下の細胞毒性を結果としてもたらし、選択された細胞集団内において、少なくとも１０％の遺伝子編集効率をもたらす、方法。
  9. Ａｕコアの、ヌクレアーゼに対する重量／重量（ｗ／ｗ）比が、０．６である、請求項８に記載の方法。
  10. Ａｕコアの、ＨＤＴに対するｗ／ｗ比が、１．０である、請求項８に記載の方法。
  11. ＡｕＮＰが、直径が７０ｎｍ未満である、請求項８に記載の方法。
  12. ＡｕＮＰが、０．２未満の多分散性指数（ＰＤＩ）を有する、請求項８に記載の方法。
  13. ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）のｃｒＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
  14. ｃｒＲＮＡが、配列番号１；配列番号３；配列番号２０～３２；配列番号４２；配列番号４３；配列番号８４～９７又は配列番号２１４～２２４に明示された配列をターゲティングする、請求項１３に記載の方法。
  15. ｃｒＲＮＡが、配列番号５；配列番号６；配列番号１３；配列番号１４又は配列番号２２５～２６４に明示された配列を含む、請求項１３に記載の方法。
  16. ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９を含む、請求項８に記載の方法。
  17. 正帯電ポリマーコーティングが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）；ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン；セルロース、デキストラン、スペルミン、スペルミジン又はポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）を含む、請求項８に記載の方法。
  18. 正帯電ポリマーが、１５００～２５００ダルトンの分子量を有する、請求項８に記載の方法。
  19. 正帯電ポリマーが、２０００ダルトンの分子量を有する、請求項８に記載の方法。
  20. 化学修飾が、遊離チオール官能基、遊離アミン官能基又は遊離カルボン酸官能基を含む、請求項８に記載の方法。
  21. スペーサーが、オリゴエチレングリコールスペーサーを含む、請求項８に記載の方法。
  22. オリゴエチレングリコールスペーサーが、原子１８個のオリゴエチレングリコールスペーサーを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. ＨＤＴが、修飾を受けるゲノム配列に対する相同性を有する配列を含む、請求項８に記載の方法。
  24. ＨＤＴが、配列番号２；配列番号４；配列番号８；配列番号１５；配列番号３３～４１又は配列番号４４～５２に明示された配列を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. ＨＤＴが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項８に記載の方法。
  26. ドナー鋳型が、治療用遺伝子を含む、請求項８に記載の方法。
  27. 治療用遺伝子が、骨格タンパク質４．１、グリコフォリン、ｐ５５、Ｄｕｆｆｙの対立遺伝子、グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質の遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；Ｃ９ＯＲＦ７２、α２β１；αｖβ３；αｖβ５；αｖβ６３；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ－３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼＮ；ＨＨＶ－７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ－１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；α－ジストログリカン；ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ－１、ＢＤＮＦ、ベータ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ－ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ－１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ－１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ－１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ－４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ及びＦａｎｃＷ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ１、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ－１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ ＩＬ－１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ－１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ－１、ＬＵＣＡ－２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ－３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭＡ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ－ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ－１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、Ｆ８、Ｆ９、ＨＢＢ、ＣＹＢ５Ｒ３、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ並びにＳＬＣ４６Ａ１を含む、又はこれらをコードする、請求項２６に記載の方法。
  28. ＡｕＮＰが、ヌクレアーゼへと連結されたターゲティングリガンドをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  29. ターゲティングリガンドが連結されたＡｕＮＰが、直径６０～１５０ｎｍである、請求項２８に記載の方法。
  30. ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体又はアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に結合する結合性分子を含む、請求項２８に記載の方法。
  31. ターゲティングリガンドが、抗ヒトＣＤ３抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ３４抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４６抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ９０抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１６４抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３アプタマー、ヒト黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、デガレリクス酢酸塩又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １を含む、請求項２８に記載の方法。
  32. ターゲティングリガンドが、抗体クローン：５８１；抗体クローン：５６１；抗体クローン：ＲＥＡ１１６４；抗体クローン：ＡＣ１３６；抗体クローン：５Ｅ１０；抗体クローン：ＤＧ３；抗体クローン：ＲＥＡ８９７；抗体クローン：ＲＥＡ８２０；抗体クローン：ＲＥＡ７５３；抗体クローン：ＲＥＡ８１６；抗体クローン：２９３Ｃ３；抗体クローン：ＡＣ１４１；抗体クローン：ＡＣ１３３；抗体クローン：７；アプタマーＡ１５；アプタマーＢ１９；ＨＣＧ（タンパク質／リガンド）又は黄体形成ホルモン（ＬＨタンパク質／リガンド）を含む、請求項２８に記載の方法。
  33. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミノ酸リンカーを介して連結されている、請求項２８に記載の方法。
  34. アミノ酸リンカーが、直接的アミノ酸リンカー、可撓性アミノ酸リンカー又はタグベースのアミノ酸リンカーを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介して連結されている、請求項２８に記載の方法。
  36. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミン－スルフヒドリル間架橋剤又はスルフヒドリル－スルフヒドリル間架橋剤を介して連結されている、請求項２８に記載の方法。
  37. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、ＰＥＧ及びアミン－スルフヒドリル間架橋剤を介して連結される、又はＰＥＧ及びスルフヒドリル－スルフヒドリル間架橋剤を介して連結されている、請求項２８に記載の方法。
  38. 選択された細胞集団が、選択された細胞を、生物学的試料から取り出す、磁気分離工程を受けていない、請求項２８に記載の方法。
  39. 選択された細胞集団が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞から選択される血液細胞を含む、請求項８に記載の方法。
  40. 血液細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＨＳＣ；ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋ＨＳＣ；ＬＨ＋ＨＳＣ；ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣ；ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋ＨＳＰＣ及び／又はＡＨＲ＋ＨＳＰＣを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 血液細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 生物学的試料が、末梢血、骨髄、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）動員末梢血及び／又はプレリキサホル動員末梢血を含む、請求項８に記載の方法。
  43. 添加するステップが、生物学的試料１ミリリットル（ｍＬ）当たりのＡｕＮＰ １、２、３、４、５、８、１０、１２、１５又は２０μｇの量において添加するステップである、請求項８に記載の方法。
  44. 生物学的試料及び添加されたＡｕＮＰが、１～４８時間にわたりインキュベートされる、請求項４２に記載の方法。
  45. 生物学的試料及び添加されたＡｕＮＰが、ＡｕＮＰの細胞への取込みを試験によって確認するまでインキュベートされる、請求項４２に記載の方法。
  46. 試験が、共焦点顕微鏡イメージング、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）－質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）、ＩＣＰ－原子発光分光法（ＩＣＰ－ＡＥＳ）又はＩＣＰ－発光分光法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 請求項８に記載の方法に従い改変された細胞。
  48. 請求項４７に記載の細胞を含む治療用製剤。
  49. 治療用核酸配列を、治療用核酸配列を必要とする対象へと施す方法であって、請求項４７に記載の細胞又は請求項４８に記載の治療用製剤を対象へと投与することにより、治療用核酸配列を対象へと施すステップを含む、方法。
  50. 直径が３０ｎｍ未満である金（Ａｕ）コア；
    ｇＲＮＡが、３’末端及び５’末端を含み、３’末端が、化学修飾を伴うスペーサーへとコンジュゲートされ、５’末端が、ヌクレアーゼへとコンジュゲートされ、化学修飾が、Ａｕコアの表面へと、共有結合的に連結されている、ガイドＲＮＡ－ヌクレアーゼのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；
    正帯電ポリマーが、２５００ダルトン未満の分子量を有し、ＲＮＰ複合体を取り囲み、Ａｕコアの表面と接触する、正帯電ポリマーコーティング；並びに
    正帯電ポリマーコーティングの表面上に、相同性指向修復鋳型（ＨＤＴ）を含む、ドナー鋳型
    を含む金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）。
  51. Ａｕコアの、ヌクレアーゼに対する重量／重量（ｗ／ｗ）比が、０．６である、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  52. Ａｕコアの、ＨＤＴに対するｗ／ｗ比が、１．０である、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  53. 直径が７０ｎｍ未満である、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  54. ０．２未満の多分散性指数（ＰＤＩ）を有する、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  55. ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）のｃｒＲＮＡを含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  56. ｃｒＲＮＡが、配列番号１；配列番号３；配列番号２０～３２；配列番号４２；配列番号４３；配列番号８４～９７又は配列番号２１４～２２４に明示された配列をターゲティングする、請求項５５に記載のＡｕＮＰ。
  57. ｃｒＲＮＡが、配列番号５；配列番号６；配列番号１３；配列番号１４又は配列番号２２５～２６４に明示された配列を含む、請求項５５に記載のＡｕＮＰ。
  58. ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９を含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  59. 正帯電ポリマーコーティングが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）；ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン；セルロース、デキストラン、スペルミン、スペルミジン又はポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）を含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  60. 正帯電ポリマーが、１５００～２５００ダルトンの分子量を有する、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  61. 正帯電ポリマーが、２０００ダルトンの分子量を有する、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  62. 化学修飾が、遊離チオール官能基、遊離アミン官能基又は遊離カルボン酸官能基を含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  63. スペーサーが、オリゴエチレングリコールスペーサーを含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  64. オリゴエチレングリコールスペーサーが、原子１８個のオリゴエチレングリコールスペーサーを含む、請求項６３に記載のＡｕＮＰ。
  65. ＨＤＴが、修飾を受けるゲノム配列に対する相同性を有する配列を含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  66. ＨＤＴが、配列番号２；配列番号４；配列番号８；配列番号１５；配列番号３３～４１又は配列番号４４～５２に明示された配列を含む、請求項６５に記載のＡｕＮＰ。
  67. ＨＤＴが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  68. ドナー鋳型が、治療用遺伝子を含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  69. 治療用遺伝子が、骨格タンパク質４．１、グリコフォリン、ｐ５５、Ｄｕｆｆｙの対立遺伝子、グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質の遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；Ｃ９ＯＲＦ７２、α２β１；αｖβ３；αｖβ５；αｖβ６３；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ－３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼＮ；ＨＨＶ－７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ－１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；α－ジストログリカン；ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、ラミニン受容体、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ－１、ＢＤＮＦ、ベータ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ－ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ－１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ－１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ－１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ－４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ、ＦａｎｃＯ、ＦａｎｃＰ、ＦａｎｃＱ、ＦａｎｃＲ、ＦａｎｃＳ、ＦａｎｃＴ、ＦａｎｃＵ、ＦａｎｃＶ及びＦａｎｃＷ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ１、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ－１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ＩＬ－１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ－１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ－１、ＬＵＣＡ－２、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ－３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭＡ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ－ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ－１、ＹＥＳ、ｚａｃ１、イズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＨＹＡＬ１、Ｆ８、Ｆ９、ＨＢＢ、ＣＹＢ５Ｒ３、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ並びにＳＬＣ４６Ａ１をコードする、請求項６８に記載のＡｕＮＰ。
  70. ヌクレアーゼへと連結されたターゲティングリガンドをさらに含む、請求項５０に記載のＡｕＮＰ。
  71. ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体又はアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に結合する結合性分子を含む、請求項７０に記載のＡｕＮＰ。
  72. ターゲティングリガンドが、抗ヒトＣＤ３抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ３４抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ４６抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ９０抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１６４抗体若しくはその抗原結合性断片、抗ヒトＣＤ１３３アプタマー、ヒト黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、デガレリクス酢酸塩又はＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １を含む、請求項７０に記載のＡｕＮＰ。
  73. ターゲティングリガンドが、抗体クローン：５８１；抗体クローン：５６１；抗体クローン：ＲＥＡ１１６４；抗体クローン：ＡＣ１３６；抗体クローン：５Ｅ１０；抗体クローン：ＤＧ３；抗体クローン：ＲＥＡ８９７；抗体クローン：ＲＥＡ８２０；抗体クローン：ＲＥＡ７５３；抗体クローン：ＲＥＡ８１６；抗体クローン：２９３Ｃ３；抗体クローン：ＡＣ１４１；抗体クローン：ＡＣ１３３；抗体クローン：７；アプタマーＡ１５；アプタマーＢ１９；ＨＣＧ（タンパク質／リガンド）；黄体形成ホルモン（ＬＨタンパク質／リガンド）又は前出のうちのいずれかに由来する結合性断片を含む、請求項７０に記載のＡｕＮＰ。
  74. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミノ酸リンカーを介して連結されている、請求項７０に記載のＡｕＮＰ。
  75. アミノ酸リンカーが、直接的アミノ酸リンカー、可撓性アミノ酸リンカー又はタグベースのアミノ酸リンカーを含む、請求項７４に記載のＡｕＮＰ。
  76. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介して連結されている、請求項７０に記載のＡｕＮＰ。
  77. ヌクレアーゼと、ターゲティングリガンドとが、アミン－スルフヒドリル間架橋剤を介して連結されている、請求項７０に記載のＡｕＮＰ。
  78. 請求項８に記載のＡｕＮＰ及び選択された細胞集団を含む生物学的試料を含む組成物。
  79. 生物学的試料が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞から選択される血液細胞を含む、選択された細胞集団を含む、請求項７８に記載の組成物。
  80. 血液細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＨＳＣ；ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋ＨＳＣ；ＬＨ＋ＨＳＣ；ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣ；ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋ＨＳＰＣ及び／又はＡＨＲ＋ＨＳＰＣを含む、請求項７９に記載の組成物。
  81. 血液細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項７９に記載の組成物。
  82. 生物学的試料が、末梢血、骨髄、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）動員末梢血及び／又はプレリキサホル動員末梢血を含む、請求項７８に記載の組成物。
  83. ＡｕＮＰが、生物学的試料中に、生物学的試料１ミリリットル（ｍＬ）当たりのＡｕＮＰ １、２、３、４、５、８、１０、１２、１５又は２０μｇの量である、請求項７８に記載の組成物。
JP2024008489A 2018-12-05 2024-01-24 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造 Pending JP2024045297A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862775721P 2018-12-05 2018-12-05
US62/775,721 2018-12-05
PCT/US2019/064780 WO2020118110A1 (en) 2018-12-05 2019-12-05 Reduced and minimal manipulation manufacturing of genetically-modified cells
JP2021531982A JP7428712B2 (ja) 2018-12-05 2019-12-05 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021531982A Division JP7428712B2 (ja) 2018-12-05 2019-12-05 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024045297A true JP2024045297A (ja) 2024-04-02

Family

ID=70975543

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021531982A Active JP7428712B2 (ja) 2018-12-05 2019-12-05 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造
JP2024008489A Pending JP2024045297A (ja) 2018-12-05 2024-01-24 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021531982A Active JP7428712B2 (ja) 2018-12-05 2019-12-05 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220025403A1 (ja)
EP (1) EP3891276A4 (ja)
JP (2) JP7428712B2 (ja)
KR (1) KR20210102309A (ja)
CN (1) CN113302292B (ja)
AU (1) AU2019392748A1 (ja)
CA (1) CA3121800A1 (ja)
IL (1) IL283705A (ja)
WO (1) WO2020118110A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110029161A (zh) * 2019-05-16 2019-07-19 中国人民解放军第四军医大学 Charge综合征致病基因chd7突变检测试剂盒
EP3964585A1 (en) * 2020-09-03 2022-03-09 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Cd62l specific lentiviral vector particle for targeted transduction of t cell subsets
WO2022150369A1 (en) * 2021-01-06 2022-07-14 Exicure Operating Company Compounds for the treatment of batten disease
US20240360414A1 (en) * 2021-01-15 2024-10-31 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Systems and Methods for Base Editing Of HBG1/2 Gene Promoter and Fetal Hemoglobin Induction
CN118234855A (zh) * 2021-09-01 2024-06-21 小利兰斯坦福大学董事会 Rna指导的千碱基规模基因组重组工程
WO2023164636A1 (en) * 2022-02-25 2023-08-31 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for homology-directed repair gene modification

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475994B2 (en) 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
JP2005255582A (ja) 2004-03-10 2005-09-22 Japan Science & Technology Agency 光照射を用いた遺伝子または薬物導入発現方法
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
CN110872583A (zh) * 2012-12-12 2020-03-10 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵和治疗应用的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
WO2016014794A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
US10711068B2 (en) * 2015-03-26 2020-07-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD133 monoclonal antibodies and related compositions and methods
CN108137819B (zh) * 2015-08-13 2022-04-01 约翰霍普金斯大学 制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法
US20180237800A1 (en) * 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
KR101956450B1 (ko) * 2016-05-11 2019-03-08 성균관대학교산학협력단 Rna 특이적 전달용 나노입자 복합체 및 이의 제조방법
KR20180025509A (ko) * 2016-08-31 2018-03-09 한양대학교 산학협력단 Cd133을 타겟팅하는 펩타이드-금나노입자 복합체 프로브
US9816093B1 (en) * 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
AU2017378431A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
CN108498460B (zh) * 2017-02-24 2023-03-28 国家纳米科学中心 金纳米簇-脂质体复合颗粒及其制备方法和应用
US20180334697A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Sensor Kinesis Corporation Method for isothermal dna detection using a modified crispr/cas system and the apparatus for detection by surface acoustic waves for gene editing

Also Published As

Publication number Publication date
CA3121800A1 (en) 2020-06-11
EP3891276A1 (en) 2021-10-13
WO2020118110A1 (en) 2020-06-11
JP2022513720A (ja) 2022-02-09
AU2019392748A1 (en) 2021-06-10
CN113302292A (zh) 2021-08-24
JP7428712B2 (ja) 2024-02-06
CN113302292B (zh) 2024-10-01
EP3891276A4 (en) 2022-07-27
KR20210102309A (ko) 2021-08-19
IL283705A (en) 2021-07-29
US20220025403A1 (en) 2022-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7428712B2 (ja) 低／最小操作による遺伝子改変細胞の製造
US11857574B2 (en) Genetically engineered T cells with Regnase-1 and/or TGFBRII disruption have improved functionality and persistence
JP6734283B2 (ja) 遺伝子治療用ポイントオブケア及び／又はポータブルプラットフォーム
JP2021106611A (ja) ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節
US20230279441A1 (en) Genomic safe harbors for genetic therapies in human stem cells and engineered nanoparticles to provide targeted genetic therapies
US20210139935A1 (en) Methods of manufacturing car-t cells
US20210079347A1 (en) Genetically engineered t cells having improved persistence in culture
WO2021003432A1 (en) Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
US20230346836A1 (en) Genetically engineered t cells with disrupted casitas b-lineage lymphoma proto-oncogene-b (cblb) and uses thereof
JP2022191410A (ja) 全身においてタンパク質を発現させるためのプラットフォームとしての遺伝子工学操作された造血幹細胞
Figueiredo et al. Generation of HLA universal megakaryocytes and platelets by genetic engineering
US20230158110A1 (en) Gene editing of monogenic disorders in human hematopoietic stem cells -- correction of x-linked hyper-igm syndrome (xhim)
Wilcox Gene Therapy for Platelet Disorders
WO2022232839A1 (en) Methods for improved production of primary cd34+ cells
WO2023150393A2 (en) Inhibitor-resistant mgmt modifications and modification of mgmt-encoding nucleic acids
Hoban Site-Specific Gene Correction of Hematopoietic Stem Cells for Sickle Cell Disease

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240221

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240221