JP2024041996A - 線維芽細胞治療活性を増強する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】線維芽細胞集団の1つまたは複数の治療活性の増大に有用な組成物、細胞、プロトコールおよび手順を提供する。【解決手段】一実施形態では、線維芽細胞は、増殖因子を含む組成物で前処理され、前記増殖因子は、サイトカイン、ペプチドおよび/またはタンパク質でありうる。別の実施形態では、線維芽細胞は、多血小板血漿、および/または多血小板血漿からの誘導体とともに培養される。別の実施形態では、線維芽細胞は、個体への投与前に低酸素条件下で培養される。本開示は、例えば、創傷治癒アッセイおよびサイトカイン産生を含む、in vitroでの線維芽細胞の評価手段をさらに提供する。【選択図】なし
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、2017年1月11日に出願した米国仮出願第62/445,133号の恩典を請求するものであり、前記仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本願は、2017年1月11日に出願した米国仮出願第62/445,133号の恩典を請求するものであり、前記仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
(技術分野)
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生化学および医学の分野に関する。
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生化学および医学の分野に関する。
脊椎の骨格筋障害は、衰弱性背部痛を伴う非常によく見受けられるものであるが、莫大な心理社会的および経済的影響をもたらす。腰痛は、45歳未満の人々の身体障害の主原因であり、有意な経済的損失をもたらす[1]。アメリカ人の80%は、人生のある時点で腰痛を経験する[2]ことになり、腰痛は、有症状受診の2番目に多い理由である[3]。腰痛の原因は、小さな問題として症状が見つかる、損傷により誘発されたものから、それにより促進される慢性障害、ならびに変性脊椎すべり症および脊柱管狭窄症に至る変性脊椎疾患まで、様々である。慢性背部痛の圧倒的多数は、椎間板の変性を伴い、これは、脊柱管狭窄症および不安定症、神経根症、脊髄症、ならびに椎間板ヘルニアを含む、多数の異なる臨床状態として現れることがある。
椎間板変性と慢性腰痛の間の関連性は確立されているが、実は、椎間板変性は、腰痛なしに起ることもある。椎間板変性が多くの個体において無症状で自然過程として生じることは公知である。したがって、疼痛の原因は、「椎間板起因」と言われていない。必ずしも椎間板変性過程のためでなく、一部は、椎間板腔に浸潤して炎症および侵害受容を引き起こす肉芽組織に起因するからである[4]。
椎間板変性に関連する腰痛の大多数は神経根圧迫により引き起こされる(神経根症性疼痛)というのが一般的な見方であるが、座骨神経痛を有する患者の場合でさえ、磁気共鳴イメージングにより神経の圧迫が検出されないことは多い[5]。つい最近の研究は、腰椎椎間板ヘルニア自体が腰痛の主原因でなく、その代わりに、線維輪断裂などの線維輪破壊により引き起こされることを示唆している[6~9]。この輪自体が、様々な神経終末により包囲されていることから、環状輪の破壊に関連する炎症は疼痛を誘発するものであるという可能性が考えられる[10]。
おおまかに言えば、椎間板変性は、早くも10歳以前に始まり、このときに終板および髄核の様々な生化学的変化が明らかになる[11]。その後、10代には、脊索細胞が軟骨細胞により置換され始める。20代には、微細な線維結合組織網の喪失およびヒアリン化コラーゲン繊維による置換が起り、同時に、線維輪の亀裂が始まる。線維輪に似ている線維状II型コラーゲン構造での髄核ゼリー状物質の置換が、30代で始まり、40代にはほぼ常に存在する。60代までに、髄核は、保水プロテオグリカン量が完全に無くなり、その代わりに、空になるか、または非晶質物質で満たされる。この自然過程の間に、線維輪および髄核のための血管を含有する軟骨終板が線維軟骨で置換され、血流が漸減する。この円板外での血管と溶質の交換経路は、輪の外縁経由の経路と終板を通る経路の2つしかないので、終板血液供給の自然な衰退は、髄核細胞の機能/生存能力低下の原因となり、その結果としてプロテオグリカン合成減少および椎間板変性に至る[12]。
髄核におけるプロテオグリカンの合成は、髄核の細胞成分によって自然に起る。TGF-bおよびEGFなどの特異的増殖因子が、プロテオグリカン合成の刺激に関与する。興味深いことに、椎間板変性症を有する患者では、これらのサイトカインの量が、健常髄核細胞と比較して低下している[13]。プロテオグリカン合成阻害のもう1つの理由は、腰部の虚血によって引き起こされるより低いpHである[14]。その一方で、マトリックスメタロプロテアーゼがプロテオグリカンの切断に関与すること、およびマトリックスメタロプロテアーゼ活性のアップレギュレーションが椎間板変性と関連することは、公知である[15]。マトリックスメタロプロテアーゼの活性化が、TNFおよびIL-1などの炎症性サイトカインにより誘導されることは公知である[16]。加えて、動物実験により、椎間板セグメントに対する超生理学的負荷は、マトリックスメタロプロテアーゼのアップレギュレーションを誘導することが実証されている[17]。
したがって、腰痛は、少なくとも患者の大部分において、腰椎椎間板変性とともに起る炎症事象によって引き起こされるようである。炎症と疼痛の間の関連は、放射線により変性された椎間板が多数の対象においてメインを伴わないことを示す研究で確証される。対照的に、慢性難治性腰痛の侵害受容および症状の原因となると考えられている肉芽組織の存在により例示されるような、椎間板変性に関連する限局性炎症の存在[10、18]。
椎間板変性は、とてつもなく大きい、増加の一途を辿る影響を世界中に与え続けているが、現在の処置選択肢は、根本原因に対処していない。これらの選択肢は、病変早期における床上安静、非ステロイド性抗炎症薬、ならびにより後期における、以前の手法が疼痛を改善しなかった場合の手技、例えば、椎間板切除術、関節形成術(関節置換術)、人工髄核注射および固定術を含む。前に述べた手法は、予測不可能であるばかりでなく、ほぼ排他的に末期臨床症状を扱うものであり、したがって、疾患過程自体を変えるのには役に立たない。加えて、椎骨固定術などの手技は、作業負荷の生体力学的な配分が変わるため、隣接椎間板の椎間板変性の発生率増加をもたらす。
バイオテクノロジーと椎間板の生化学的構成および環境に対する我々の理解の両方の最近の進歩は、変性過程への関心増大につながり、椎間板温存に直接狙いを定めた新規処置を開発する可能性をもたらした。椎間板内のマトリックス合成および異化に有意な影響を与えることが判明したある特定の遺伝子が、これら2つの間のバランスの変更を探究する目標を科学者に与えた。この目標を達成するために、過去数年にわたって大きな注目が遺伝子療法に集中し、これらの努力が、椎間板変性の処置におけるその使用に関して有望な前臨床結果を生み出してきた[19]。
現在、椎間板変性に広く利用できる生物学的処置は無い。しかし、治療に役立つ可能性のある多くの異なる分子が研究されている。分子療法の焦点は、椎間板細胞外マトリックスにおけるこれらの変化の1つまたは複数の態様の予防または好転になってきている。分子の少なくとも4つの異なるクラスが、椎間板修復に有効である可能性がある。これらは、抗異化物質(anticatabolics)、分裂促進因子、軟骨形成モルフォゲンおよび細胞内調節因子を含む[20~22]。
上で述べたように、椎間板変性の特徴は、椎間板マトリックス中のプロテオグリカン、水およびII型コラーゲンの喪失を含む。さらに、高分子量プロテオグリカンの喪失、および定量することがより困難である他の変化(コラーゲン架橋、プロテオグリカンの組織化など)を含む、マトリックスの定性的変化は、あまり明確ではない。椎間板変性における重要な過程は、髄核における分化軟骨細胞表現型の、より線維性の表現型への変化であると思われる。考え合わせると、椎間板マトリックスのこれらの変化は、最終的には病的状態に関連する椎間板および椎骨構造の変更をもたらす[23、24]。
マトリックス喪失は、マトリックス合成と分解間のバランスであるため、合成増加させることにより、または分解を減少させることにより、椎間板マトリックスを増加させることが可能である。1つの手法は、分解酵素を阻害することによるマトリックス喪失の防止である。
変性した椎間板は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)濃度が上昇している。マトリックス中でのMMP活性は、通常は、組織MMP阻害剤(TIMP)により阻害される[25~27]。Wallachらは、これらの抗異化分子の1つであるTIMP-1が、in vitro実験でマトリックスプロテオグリカンの蓄積を増加させることができるかどうかを試験した。この研究者らは、実際、椎間板細胞におけるTIMP-1発現がプロテオグリカンの蓄積を増加させ、「測定合成速度」も上昇させることを見いだした[27]。
軟骨形成モルフォゲンは、分裂促進能を有するばかりでなく、標的細胞の軟骨細胞特異的表現型を増加させる能力を特徴とするものである、サイトカインである。軟骨形成モルフォゲンの研究のほとんどに、トランスフォーミング増殖因子-b(TGF-b)、骨形成タンパク質(BMP)または増殖分化因子(GDF)が用いられてきた。軟骨形成モルフォゲンは、椎間板細胞の線維性表現型を、より若年の、より「正常な」椎間板における椎間板核細胞のより多くの軟骨細胞表現型に戻すことができるので、特に魅力的である。定義により、これらの分子は、分泌分子であり、したがって自己分泌、パラ分泌および内分泌方式で作用しうる可能性がある。TGF-b1は、最初に研究される椎間板形態形成分子の1つである。Thompsonらは、TGF-b1が分裂促進因子であることを報告したが、細胞1個当たりのプロテオグリカン合成の有意な増加をもたらす、タンパク質同化性の高い分子であることも示した。アデノウイルス/CMVベクターを使用するTGF-bの遺伝子移入は、ウサギモデルにおいて椎間板変性の放射線学的徴候を好転させることができた[28]。
BMP-2は、もう1つの典型的な軟骨形成モルフォゲンである[29]。Yoonらは、組換えヒトBMP-2は、アグリカンおよびII型コラーゲン遺伝子発現の増加により示されるように、椎間板細胞プロテオグリカンの産生を増加させ、椎間板細胞の軟骨細胞表現型を有意に増加させるが、I型コラーゲン遺伝子の変化はないことを報告した[30]。Kimらは、BMP-2が、椎間板細胞プロテオグリカンの合成に対するニコチンの阻害効果を部分的に反転させることができることを報告した[31]。OP-1(骨形成タンパク質-1)としても公知のBMP-7は、椎間板細胞におけるマトリックス形成を増進させることによって強力なin vitro活性を明示したもう1つの椎間板細胞モルフォゲンである[32~34]。CDMP-1としても公知のGDF-5も、椎間板細胞の再生について考慮されるが、in vitroでの実験しか行われていない[35]。
本開示は、変性椎間板修復についての当技術分野における長年の切実な要求を満たす方法および組成物に関する。
本開示は、哺乳動物の1つまたは複数の椎間板における治療などの、個体における治療に有用なある特定の細胞に関する方法および組成物に関する。具体的な実施形態では、細胞は、特定のケースでは1つもしくは複数の生物活性物質および/または1つもしくは複数の条件への曝露によって改変された、線維芽細胞である。ある特定の実施形態では、曝露は、曝露を欠く線維芽細胞と比較して1つまたは複数の治療活性を向上させる。線維芽細胞のいずれの特定の治療活性を、1つもしくは複数の生物活性物質および/または1つもしくは複数の条件への1回または複数回の曝露によって増強させてもよいが、一部のケースでは、活性は、例として、抗炎症特性、血管新生特性、再生特性および/または椎間板再生特性である。線維芽細胞が向上された活性を有する特異的なケースでは、線維芽細胞は、直接または間接的に、個体の1つまたは複数の椎間板に関する医学的状態の少なくとも1つの症状の改善原因である。
特定の実施形態では、本開示の方法は、椎間板マトリックスの増加を直接または間接的にもたらし、これは、椎間板における合成を増加させることにより、分解を減少させることにより、および/または分解酵素を阻害することによってマトリックス喪失を防止することにより、もたらすことを含む。
一実施形態では、細胞および/または組織の再生に対する線維芽細胞の有効性を増大させるための方法であって、(任意選択的に)線維芽細胞を採取するステップ、線維芽細胞を1つもしくは複数の生物活性物質と接触させるステップ、および/または細胞および/もしくは組織の再生に対する線維芽細胞の有効性を向上させる条件下で線維芽細胞を培養するステップを含む方法を提供する。特異的な実施形態では、1つまたは複数の生物活性物質は、1つまたは複数のサイトカイン、例えば、増殖因子(例えば、FGF-アルファ、FGF-ベータ、および/またはTGF-ベータファミリーのメンバー)を含む。特異的なケースでは、1つまたは複数の生物活性物質は、多血小板血漿を含む。特定の実施形態では、線維芽細胞による細胞および/組織の再生は、免疫調節、血管新生、脊椎椎間板の再生、これらの組合せなどを含む。
利用される線維芽細胞は、(a)生検により採取され、培養され、増殖された線維芽細胞、(b)より大きな分化能力を有するこれらのそれらのサブセット、ならびに(c)それらの組合せからなる群から選択される。ある特定のケースでは、線維芽細胞は、ステージ特異的胎児抗原3(SSEA3)を発現する。ある特定のケースでは、線維芽細胞は、滅菌溶液、ヒドロゲル、移植可能な細胞マトリックス、デバイスおよびこれらの組合せからなる群から選択される、薬学的に許容される担体に含有される。
本開示の実施形態は、線維芽細胞におけるPD-1L発現を増加させる方法、線維芽細胞によるT細胞活性化を抑制する方法、および/または線維芽細胞によるインターフェロンガンマなどの1つもしくは複数の因子のT細胞産生を抑制する方法を含む。
上述は、後続の詳細な説明がよりよく理解さうるように、本開示の特徴および技術的利点の概要をかなり広く示したものである。さらなる特徴および利点を下段にて説明することとし、これが、本願における特許請求の範囲の主題を構成する。開示する概念および具体的な実施形態が、本設計の目的と同じ目的を実行するための他の構造の修飾または設計の基礎として容易に利用されうることは、当業者には理解されるはずである。そのような等価の構成が、添付の特許請求の範囲に記載の趣旨および範囲を逸脱しないことも、当業者には容易に判るはずである。さらなる目的および利点とともに、組織化と操作方法の両方に関して本明細書で開示する設計の特性であると考えられる新規特徴は、付属の図面に関連して考慮されると、後続の説明からよりよく理解されるであろう。しかし、図面の各々は、単に例証および説明を目的として提供するものに過ぎず、本開示の制限の定義として意図したものでないことを、明確に理解されたい。
本開示のさらに完全な理解のために、参照が、付属の図面とともに後続の説明が行われる。
I.定義の例
長年にわたる特許法の慣例に沿って、請求項を含めて、本明細書においける「1つの(a)」および「1つの(an)」という語は、含む(comprising)という語と連携して使用される場合、「1つまたは複数」を意味する。本発明の一部の実施形態は、本発明の1つもしくは複数の要素、方法ステップ、および/もしくは方法からなることもあり、またはそれらから本質的になることもある。本明細書に記載の任意の方法または組成物を、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実行することができると考えられる。
本開示で使用される「生体適合性ポリマー」は、カルボマー(ポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸ポリマー)、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール)、ポロキサマー(ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアクリレート、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ならびに多糖類、例えば、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の誘導体、特に、架橋ヒアルロン酸およびヒアルロン酸のエステル(例えば、ヒアルロン酸のベンジルエステル)、ヒドロキシアルキルセルロース(例えば、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース)、およびカルボキシアルキルセルロース(例えば、カルボキシメチルセルロース)などからなる群から選択される。
「増殖因子」は、生存組織に対して陽性反応を示す、例えば、組織増殖を促進する、任意の物質(単数または複数)を指す。例示的増殖因子としては、血小板由来増殖因子(PDGF)、血小板由来血管新生因子(PDAF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来上皮増殖因子(PDEGF)、血小板第4因子(PF-4)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-B)、酸性線維芽細胞増殖因子(FGF-A)、塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-B)、トランスフォーミング増殖因子A(TGF-A)、インスリン様増殖因子1および2(IGF-1およびIGF-2)、Bトロンボグロブリン関連タンパク質(BTG)、トロンボスポンジン(TSP)、フィブロネクチン、von Wallinbrand因子(vWF)、フィブロペプチドA(fibropeptide A)、フィブリノーゲン、アルブミン、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤1(PAI-1)、オステオネクチン、ランテス(regulated upon activation normal T cell expressed and presumably secreted:RANTES)、gro-A、ビトロネクチン、フィブリンD-二量体、第V因子、アンチトロンビンIII、免疫グロブリン-G(IgG)、免疫グロブリン-M(IgM)、免疫グロブリン-A(IgA)、a2-マクログロブリン、アンジオゲニン、Fg-D、エラスターゼ、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、腫瘍壊死因子(TNF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)およびインターロイキン-1(IL-1)、ケラチノサイト増殖因子-2(KGF-2)、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。上に挙げた増殖因子に共通の重要な特性と1つは、各物質が、細胞または組織増殖を増進するような、生物活性として公知の、生存組織に対する陽性反応を示すことが公知であるかまたはそのような陽性反応を示すと考えられていることである。
本明細書で使用される場合の「再生」という用語は、脊椎椎間板を含む領域、例えば損傷領域における新たな細胞および/または組織の増殖を指す。
本明細書で使用される場合の「治療有効量」という用語は、疾患を処置するために個体に投与されたときに、疾患の少なくとも1つの症状を改善することを含む、疾患のそのような処置を果たすのに十分である量を指す。
II.一般的実施形態
本開示は、in vivoで1つまたは複数の部位において少なくとも抗炎症特性、血管新生特性、再生特性および/または椎間板再生特性のために使用される線維芽細胞などの、線維芽細胞の治療活性を増大させる手段に関する。本開示の一実施形態では、線維芽細胞は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどを含む哺乳動物などの個体への投与前に、サイトカイン、増殖因子、ペプチドまたはこれらの組合せとともに培養される。別の実施形態では、本開示は、治療剤として使用される線維芽細胞についての再生能の増大であって、例えば、多血小板血漿(PRP)などの1つまたは複数の薬剤とともに(個体への投与前および/または投与中に)培養することによる再生能の増大を包含する。別の実施形態では、本開示は、1つもしくは複数の薬剤および/またはPRPを、例えば線維芽細胞と一緒に、併用投与することにより、治療活性のために1つまたは複数の線維芽細胞活性を増強する方法を提供する。特定のケースでは、増強された線維芽細胞は、個体の椎間板の医学的状態を処置する目的で、個体に送達される。一部のケースでは、個体は、例えば損傷した椎間板またはそのリスクのために、線維芽細胞増強を必要とすると判定される。リスクのある個体は、約40、45、50、55、60、65、70、75、80歳などより高齢である者、アスリートであるもしくはあった個体、身体活動を必要する職業を有する個体、脊椎損傷を有する個体、またはこれらの組合せ)である。
一部の実施形態では、線維芽細胞は、多血小板血漿に曝露され、そのような曝露は、直接または間接的に線維芽細胞を増強する結果となる。非常に多数の増殖因子、サイトカインおよびペプチドが、活性化された血小板から放出され、これを治療に活用する1つの手法は、多血小板血漿(PRP)としても公知の、血漿中に懸濁した自己血小板濃縮物の利用である。PRPを調製するためのいくつかの手段が当技術分野において公知であり、その一部は、下段で説明され、参照により本明細書に組み入れられる[36、37]。PRPの生成に使用されるデバイスの例としては、例えば、SmartPReP、3iPCCS、Sequestra、Secquire、CATS、Interpore Cross、Biomet GPS、およびHarvest’s BMACが挙げられる[38]。PRPの他の生成手段は、米国特許第5,585,007号、同第5,599,558号、同第5,614,204号、同第6,214,338号、同第6,010,627号、同第5,165,928号、同第6,303,112号、同第6,649,072号、および同第6,649,072号明細書に記載されており、これらの特許文献は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な実施形態では、個体への注射時に、例えば、線維芽細胞とともに事前に培養することなく、PRPを投与することができる。
本開示の一実施形態では、線維芽細胞は、それを必要とする個体に全身または局所送達され、前記個体は、多血小板血漿(PRP)および/またはヒアルロン酸(HA)を含有する担体(例えば、ヒドロゲル)使用することによる処理を含む、処置を必要とする個体を含み、特定のケースでは、PRPおよび/HAは、ゲル化剤としてのバトロキソビン(BTX)とブレンドされる。線維芽細胞は、PRP/HA/BTXヒドロゲルなどのヒドロゲルに封入されることもあり、例えば、増殖培地および/または(例えば)TGF-β1を伴うもしくは伴わない培地、両方において、ある特定の継続期間、例えば、1分(min)から21日までにわたって培養されることもある。いずれの細胞についても培養継続時間の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60(またはそれより長い分数、あるいは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間もしくはそれより長い時間)~1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日でありうる。時間の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分またはそれより長い分数~1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間もしくはそれより長い時間でありうる。
一実施形態では、ヒドロゲルは、ある特定の温度で、ある特定の期間、ゼリー状になる。ヒドロゲルは、18、19、20、21、22、23、24、25℃もしくはそれより高温で10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20分もしくはそれより長い分数、または35、36、37、38、39もしくは40℃もしくはそれより高温で、1、2、3、4、5分もしくはそれより長い分数、線維芽細胞が高い細胞生存率および増殖を維持するような様式で、ゼリー状になりうる。一実施形態では、本開示は、椎間板変性症を有する個体における局所送達(例えば、椎間板内注射による局所送達)のための線維芽細胞の使用を包含する。そのような実施形態では、線維芽細胞は、GAG産生を増強するために適切な条件で培養され、これは、少なくとも一部のケースでは、TGF-ベータなどの1つまたは複数のサイトカインとの培養により果たされる。線維芽細胞特異的使用のために変更されうる、間葉系幹細胞の増殖のための方法論が、参照により組み入れられる次の参考文献に提供されている[39]。
本開示は、線維芽細胞のための「再生補助剤(regenerative adjuvant)」として作用する1つまたは複数の生物活性物質の投与を含む、治療使用前の線維芽細胞の活性化の使用を包含する。製剤中の細胞は、培養単層で増殖中には典型的な線維芽細胞形態を示しうる。具体的には、細胞は、細長い伸長部を有する伸長した紡錘状または紡錘形の外観を示すこともあり、または細胞は、細胞質最先端を有しうる、より大きい扁平な星状細胞のように見えることもある。これらの形態の混合形態が観察されることもある。細胞は、例として、線維芽細胞特異的マーカーであるCD90(Thy-1)、35kDaの細胞表面糖タンパク質、および細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンを含む、正常な線維芽細胞に特有の1つまたは複数のタンパク質を発現しうる。具体的な形態での線維芽細胞投与製剤は、例として標準的な組織培養手順を使用して皮膚から増殖させた線維芽細胞を含む、線維芽細胞の懸濁液を含む、自己、同種異系または異種細胞療法製品でありうる。
III.細胞採取、培養および拡大技術の例
ある特定の実施形態では、任意の種類の線維芽細胞が再生方法に利用され、これらの方法のための(またはこれらの方法の一部としての)調製の際、線維芽細胞は、ある特定の技術を使用して採取され、培養され、拡大されうる。
本開示において利用される線維芽細胞は、一実施形態では、レシピエント個体自身の皮膚(自己製剤の場合)もしくは1名もしくは複数名の健常ドナーの皮膚(同種異系製剤の場合)の生検試料から増殖により生成され、またはそれらの組合せが利用されることもある。一部の実施形態では、若年ドナーからの線維芽細胞が使用されるが、他のケースでは、線維芽細胞は、若年ドナーからのものではなく、例えば中高年者を含む成人であってもよい。別の実施形態では、例えば、増殖の増進およびヘイフリック限界の克服を可能にするために、線維芽細胞に、1つまたは複数の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドがトランスフェクトされる。
細胞の誘導の後に、標準的な培養技術を使用して培養での拡大があることもある。皮膚組織(真皮および表皮層)は、対象の耳後部領域から生検されうるが、乳房または胃領域などの、他の領域に由来するものであってもよい。一実施形態では、出発物質は、標準的な無菌操作を使用して収集された複数(例えば、2、3、4、またはそれより多く)の3mmパンチ皮膚生検試料を含む。生検試料は、個体により収集され、滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)を含むものなどの、標準培地を含む容器(例えば、バイアル)に入れられる。生検試料は、適切な条件下で製造施設に移送される。一実施形態では、製造施設に到着後、生検試料は点検され、合格すると、製造エリアの直接移送される。次いで、工程開始時に、生検組織は洗浄され、その後、酵素的に消化される。洗浄後、ミンチングなしにリベラ-ゼ消化酵素溶液が添加され、生検組織は、適切な時間、適切な温度を使用して、例えば、37.0±2℃で1時間、インキュベートされる。生検組織消化時間は、培養中の細胞の生存率および増殖に影響を与えうる工程パラメータであり、このパラメータを常套的に最適化することができる。工程の例は、次の通りである:コラゲナーゼ/中性プロテアーゼ酵素カクテルであるリベラ-ゼを使用してもよく、これは、Lonza Walkersville,Inc.(Walkersville、Md.)から配合された状態で、およびRoche Diagnostics Corp.(Indianapolis、Ind.)から配合されていない状態で、入手される。あるいは、他の市販のコラゲナーゼ、例えば、Serva Collagenase NB6(Helidelburg、Germany)を使用してもよい。消化後、開始増殖培地(Initiation Growth Media)(IMDM、GA、10%ウシ胎仔血清(FBS))を添加して酵素を中和し、細胞を遠心分離によりペレット化し、5.0mLの開始増殖培地に再懸濁させる。あるいは、遠心分離を行わず、開始増殖培地の添加による酵素の完全不活性化にのみを行う。開始増殖培地を、細胞増殖および拡大開始用のT-175細胞培養フラスコに添加し、その後、細胞懸濁液を播種する。T-75、T-150、T-185またはT-225フラスコを、T-75フラスコの代わりに使用することができる。37±2℃.で、5.0±1.0%CO2で、細胞をインキュベートし、3~5日ごとに新鮮な完全増殖培地を供給する。この工程での全ての供給は、完全増殖培地の半分を除去し、同容積を新鮮培地で置換することによって行う。あるいは、完全供給を行うことができる。細胞は、継代前に30日より長くT-175フラスコ内に留まるべきでない。培養分裂中に十分な播種密度を確保するために、この工程を通してコンフルエンスをモニターする。細胞コンフルエンスが、T-175フラスコ内で40%またはそれより高くなったら、使用済み培地を除去すること、細胞を洗浄すること、およびトリプシン-EDTAで処理してフラスコ内の接着細胞を溶液中に放出することにより、細胞を継代する。次いで、細胞をトリプシン処理し、細胞拡大継続用のT-500フラスコに播種する。あるいは、1または2個のT-300フラスコ、1層セルスタック(1CS)、1層セルファクトリー(1CF)または2層セルスタック(2CS)をT-500フラスコの代わりに使用することができる。継代ごとに、および採取前に、形態が評価して、この工程を通して培養純度を通して培養純度をモニターする。形態は、細胞培養の形態実験の視覚基準と観察試料を比較することによって評価する。細胞は、培養単層で増殖中のとき、典型的な線維芽細胞形態を示す。細胞は、細長い伸長部を有する伸長した紡錘状または紡錘形どちらかの外観を示すこともあり、または細胞質最先端を有しうる、より大きい扁平な星状細胞のように見えることもある。これらの形態の混合形態が観察されることもある。低コンフルエンス領域の線維芽細胞は、ランダムに配向しているが同様の形をとることができる。細胞培養物中のケラチノサイトの存在も評価する。ケラチノサイトは、丸い不規則な形状に見え、より高いコンフルエンスでは敷石構造で組織化されているに見える。より低いコンフルエンスでは、ケラチノサイトは、小さいコロニーで観察することができる。37±2.0℃.で、5.0.+-.1.0%CO2で、細胞をインキュベートし、T-500フラスコでは3~5日ごとに、および10層セルスタック(10CS)では5~7日ごとに継代する。細胞は、継代前に10日より長くT-500フラスコ内に留まるべきでない。バルク製剤原料の安全性についての品質管理(QC)放出試験は、無菌性および内毒素試験を含む。T-500フラスコ内での細胞コンフルエンスが95%になったら、細胞を10CS培養容器に継代する。あるいは、2つの5層セルスタック(5CS)または10層セルファクトリー(10CF)を、10CSの代わりに使用することができる。10CS。10CSへの継代は、使用済み培地を除去すること、細胞を洗浄すること、およびトリプシン-EDTAで処理してフラスコ内の接着細胞を溶液中に放出することによって行う。次いで、細胞を10CSに移す。追加の完全増殖培地を添加してトリプシンを中和し、細胞をT-500フラスコから新鮮な完全増殖培地が入っている2Lビンにピペットで移す。2Lビンの内容物を10CSに移し、全層にわたって播種する。次いで、細胞を、37±2℃.で、5.0±1.0%CO2で、インキュベートし、5~7日ごとに新鮮な完全増殖培地を供給する。細胞は、継代前に20日より長く10CS内に留まるべきでない。一実施形態では、拡大した細胞を無タンパク質培地中である期間にわたってインキュベートすることにより、培養培地中に存在する免疫原性タンパク質が継代真皮線維芽細胞に実質的にない状態にする。初回採取 10CSにおいて細胞コンフルエンスが95%またはそれより高くなったら、細胞を採取する。採取は、使用済み培地を除去すること、細胞を洗浄すること、トリプシン-EDTAで処理してフラスコ内の接着細胞を溶液中に放出すること、および追加の完全増殖培地を添加してトリプシンを中和することにより行う。細胞を遠心分離により収集し、再懸濁させ、工程内QC試験を行って、全生細胞数および細胞生存率を判定する。
一部の実施形態では、初回10CS採取からの細胞数の結果を受け取った後、多数の細胞が必要とされる場合、複数のセルスタック(4つ以下の10CS)へのさらなる継代を行う。追加の継代のために、初回採取からの細胞を、新鮮な完全増殖培地が入っている2L培地ビンに添加する。再懸濁させた細胞を複数のセルスタックに添加し、37±2.0℃.で、5.0.+-.1.0%CO2でインキュベートする。細胞コンフルエンスが細胞採取前に80%またはそれより高くなければならないことを除いて、上で説明した通りにセルスタックに供給し、採取する。採取手順は、上で初回採取について説明したのと同じである。細胞および使用済み培地からマイコプラズマ試料を収集し、上で初回採取について説明した通りに細胞数および生存率を実行する。この方法は、免疫原性タンパク質を減少または消失させ、それによって、動物由来の試薬からのそれらの導入を回避する。工程残留物を低減させるために、細胞を無タンパク質凍結培地で凍結保存し、その後、最終的な注射を準備する前に解凍し、洗浄して、残存する残留物をさらに低減させる。さらなる継代からの細胞の採取および凍結保存が完了した後に、追加の製剤原料が必要とされる場合、凍結された製剤原料のアリコート--クライオバイアルを解凍し、5CSまたは10CS培養バイアルへの播種に使用する。あるいは、4層セルファクトリー(4CF)、2つの4CF、または2つの5Sを、5CSまたは10CSの代わりに使用することができる。細胞の凍結クライオバイアルを、上で説明した通り、解凍し、洗浄し、新鮮な完全増殖培地が入っている2L培地ビンに添加し、培養し、採取し、凍結保存する。細胞懸濁液を添加し、細胞コンフルエンスは、細胞採取前に80%またはそれより高くなければならない。
培養拡大の完了時に細胞を採取し、洗浄し、その後、細胞2.2×107個/mLを目標にして、細胞1.0~2.7×107個/mLを含有するように配合する。あるいは、目標を配合範囲内で調製して、様々な指示用量に適応させることができる。製剤原料は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)と、7.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)を加えたProfreeze-CDM(商標)(Lonza、Walkerville、Md.)とからなる凍結保存培地に懸濁した生存可能な、自己の、ヒト線維芽細胞の集団からなる。あるいは、より低いDMSO濃度を7.5%の代わりに使用してもよく、またはCryoStor(商標)CS5もしくはCryoStor(商標)CS10(BioLife Solutions、Bothell、Wash.)をIMDM/Profreeze/DMSOの代わりに使用してもよい。細胞数および生存率に加えて、製剤原料の純度/同一性が実行され、懸濁液が98%またはよれより高濃度の線維芽細胞を含有することを確認しなければならない。通常の細胞夾雑物は、ケラチノサイトを含む。純度/同一性アッセイは、線維芽細胞集団の純度パーセントを定量するために、CD90およびCD104(それぞれ、線維芽細胞およびケラチノサイト細胞の細胞表面マーカー)に対する蛍光標識抗体を利用する。CD90(Thy-1)は、35kDaの細胞表面糖タンパク質である。CD90タンパク質に対する抗体は、ヒト線維芽細胞に対して高い特異性を示すことが明らかにされている。CD104、インテグリンベータ4鎖、は、インテグリンアルファ6鎖(CD49f)と会合してアルファ6/ベータ4複合体を形成する、205kDaの膜貫通糖タンパク質である。この複合体は、ケラチノサイト細胞の分子マーカーとして作用することが明らかにされている(Adams and Watt 1991)。
CD104に対する抗体は、ヒトケラチノサイト細胞の100%と結合する。細胞数および生存率は、試料をViacount Dye Reagentとともにインキュベートし、Guava PCAシステムを使用して試料を分析することにより判定する。この試薬は、すべての有核細胞を染色する膜透過性色素、および損傷したまたは瀕死の細胞のみを染色する膜不透過性染色素ある、2つの色素で構成されている。この色素の組合せの使用によって、Guava PCAシステムによる、試料中に存在する細胞の総数の推定、およびどの細胞が生細胞、アポトーシス細胞または死細胞であるのかの判定が、可能になる。培養された自己線維芽細胞の純度/同一性の判定に使用するための方法をカスタム開発した。あるいは、T-175フラスコ(もしくは代替物)またはT-500フラスコ(もしくは代替物)のどちらかから、細胞増殖表面としてのマイクロキャリアが入っているスピナーフラスコに継代することができる。マイクロキャリアは、懸濁培養において足場依存性細胞のための増殖表面として使用される小さいビーズ様構造である。それらは、小さい体積で大きい細胞収量を産生するように設計されている。この装置内で、50mL~300mLの範囲の完全増殖培地の体積を500mL、1Lまたは2L滅菌使い捨てスピナーフラスコに添加する。滅菌マイクロキャリアをそのスピナーフラスコに添加する。培養物を、37±2.0℃で5.0±1.0%CO2のインキュベーター内で短時間(1~24時間)、放置して静的状態を維持して、または低RPM(15~30RRM)での撹拌プレートに載せて、細胞の担体への接着を可能にする。付着期間後、回転プレートの速度を上昇させる(30~120RPM)。細胞に、新鮮な完全増殖培地を、1~5日おきに供給するか、または色の変化により培地が使い果たされたように見えたら供給する。定期的に、マイクロキャリアをサンプリングし、細胞の単離し、細胞数および生存率分析を実行することにより、細胞を収集する。マイクロキャリア1個当たりの細胞の濃度を使用して、培養を規模拡大するタイミングを決定する。十分な細胞が産生されたら、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン-EDTAを使用してマイクロキャリアから採取し、スピナーフラスコ内のより大量のマイクロキャリアおよびより高体積の完全増殖培地(300mL~2L)に播種し直す。あるいは、追加のマイクロキャリアおよび完全増殖培地を、既存のマイクロキャリア培養物が入っているスピナーフラスコに直接添加することができ、それによって、トリプシン処理および再播種を使用せずに直接ビーズ間移動させることができる。あるいは、十分な細胞が、最初のT-175またはT-500フラスコから産生された場合、細胞を規模拡大量のマイクロキャリアに直接播種することができる。付着期間後、回転プレートの速度を上昇させる(30~120RPM)。細胞に、新鮮な完全増殖培地を、1~5日おきに供給するか、または色の変化により培地が使い果たされたように見えたら供給する。濃度が、所期の適応症のための所望の細胞数に達したら、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン-EDTAを使用して採取する。使い捨てスピナーフラスコ内で使用されるマイクロキャリアは、ポリブレンド、例えば、BioNOC II(登録商標)(Cesco Bioengineering、配給元Bellco Biotechnology、Vineland、N.J.)およびFibraCel(登録商標)(New Brunswick Scientific、Edison、N.J.)、ゼラチン、例えば、Cultispher-G(Percell Biolytica、Astrop、Sweden)、セルロース、例えば、Cytopore(商標)(GE Healthcare、Piscataway、N.J.)または被覆/非被覆ポリスチレン、例えば、2D MicroHex(商標)(Nunc、Weisbaden、Germany)、Cytodex(登録商標)(GE Healthcare、Piscataway、N.J.)またはHy-Q Sphere(商標)(Thermo Scientific Hyclone、Logan、Utah)から製造されうる。
別の実施形態では、スピナーフラスコ装置の代わりに自動ベローシステム、例えば、FibraStage(商標)(New Brunswick Scientific、Edison、N.J.)またはBelloCell(登録商標)(Cesco Bioengineering、配給元Bellco Biotechnology、Vineland、N.J.)を使用して、ポリブレンド2Dマイクロキャリア、例えば、BioNOC II(登録商標)およびFibraCel(登録商標)を用いて細胞を処理することができる。T-175(もしくは代替物)またはT-500(もしくは代替物)からの細胞を、マイクロキャリアと適切な量の完全増殖培地が入っているベローボトルに継代し、システムに入れる。システムは、反復固定サイクルでの酸素供給を可能にするために、培地をポンプでマイクロキャリア上に送って細胞に供給し、培地を引き取る。上で説明したのと同じ順序で、細胞をモニターし、供給し、洗浄し、採取する。あるいは、自動システムを使用して細胞を処理することができる。生検組織の消化後、または初回継代(T-175フラスコもしくは代替物)が完了した後、細胞を自動デバイスに播種してもよい。1つの方法は、自動細胞拡大(ACE)システムであり、これは、細胞を人間の介入なしに拡大することができる細胞増殖プラットフォームを形成するために互いに連結されている一連の市販または特注生産構成要素である。細胞は、足場依存性細胞付着を支持することができる積み重ねた円板からなる細胞タワーで、拡大される。システムは、自動的に培地を循環させ、細胞拡大段階完了し次第、採取のためのトリプシン処理を行う。
あるいは、ACEシステムは、細胞増殖表面、送達チューブ、培地および試薬、ならびに自動プログラミングサイクルの加熱/冷却、培地移入および排出のためのコンピュータ処理機能付きの機構を収容する永久基部からなる、規模縮小された単一ロットユニットバージョンである場合ある。受け取り次第、各滅菌照射ACE使い捨てユニットの包装を解き、充填済みバッグを掛けて無菌コネクタを介して既存チューブにバッグを接続することにより、培地および試薬を投入することになる。具体的な実施形態では、工程は、次のように続く:a)生物学的安全キャビネット(BSC)内で、抗生物質を含有する開始増殖培地が既に充填されている「増殖前チャンバ」(細胞タワーの一番上の小ユニット)に、酵素的に消化された生検試料からの細胞の懸濁液を導入する。BSCから、使い捨てユニットを、既に所定の位置にある永久ACEユニットに移すことになる;b)おおよそ3日後、増殖前チャンバ内の細胞は、トリプシン処理され、完全増殖培地が充填済みである細胞タワー自体に導入される。ここで、CO2注入により引き起こされる「バブリング作用」が、細胞が渦を巻きながら下降して円板の表面に均等に分配される様式で積もるような速度で、培地を循環させる;c)おおよそ7日間、細胞は、増殖のために放置される。この時、培養物が増殖していることを検証するためにコンフルエンスをチェックすることになる(記載時に方法不明)。また、このとき、完全増殖培地を新鮮な増殖培地で置換することになる。CGMを、3~4週間にわたって7日ごとに置換することになる。培養期間終了時に、所期の処置のための所望の細胞量をもたらす可能性があるような十分な増殖があることを検証するために、もう1度コンフルエンスがチェックされる。d)培養物は、十分にコンフルエントになったら、回収される。使用済み培地(上清)が容器から排液される。次いで、PBSがポンプで容器に(培地、FBSを細胞から洗い流すために)送られ、ほぼ直ちに排液される。トリプシン-EDTAが、増殖表面から細胞を剥離させるためにポンプで容器に送られる。回転分離機から、細胞を、インライン自動細胞計数デバイスを通って送ることになるか、または研究室分析による細胞数および生存率試験のための試料を収集することになる。特定数の細胞が計数され、適正な細胞濃に達したら、採取された細胞が収集バイアルに送達され、それを取り出して、低温凍結のために試料を小分けすることができる。
別の実施形態では、細胞供給、継代および採取を行うために、工程の全長または一部に自動ロボットシステムを使用する。消化およびT-175フラスコ(または代替物)への播種直後に、細胞をロボットデバイスに導入することができる。デバイスは、細胞をインキュベートする、細胞数および生存率分析を行う、ならびにより大きい培養容器に移す能力を有しうる。このシステムは、個々のロットを追跡するためのコンピューターカタログ作成機能も有しうる。既存の技術またはカスタマイズされたシステムをロボットオプションに使用してもよい。
線維芽細胞を得る団体は、線維芽細胞を、それらの増強を生じさせるために、および/またはそれらを個体に送達するために操作する団体であってもよく、なくてもよい。
IV.線維芽細胞およびその操作の例
それを必要とする個体への送達前に線維芽細胞を入手し、調製した後、線維芽細胞は、操作されることがあり、これは、治療のために有用な1つまたは複数の活性を増強することを含む。一部のケースでは、線維芽細胞は、それを必要とする個体への送達前(および/または中)に1つまたは複数の生物活性薬剤および/または条件に曝露され、また一部のケースでは、送達前(および/または中)の1つまたは複数の生物活性薬剤および/または条件への曝露を、培養ステップ中に行ってもよく、行わなくてもよい。
一実施形態では、線維芽細胞は、少なくとも1つの増殖因子である生物活性薬剤を含有する組成物または組成物の混合物との接触により予備活性化され、前記増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、血小板由来内皮増殖因子(PDEGF)、血小板由来血管新生因子(PDAF)、血小板第4因子(PF-4)、肝細胞増殖因子(HGF)およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定のケースでは、増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)線維芽細胞増殖因子(FGF)およびこれらの組合せである。特異的なケースでは、増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-ベータ)、血小板由来増殖因子BB(PDGF-BB)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)およびこれらの組合せからなる群から選択される。本開示の別の実施形態では、増殖因子含有組成物は、線維芽細胞の送達と同時に、またはその送達後に、個体に送達される。送達は、ある特定の実施形態では、注射により行われることもある。線維芽細胞は、レシピエント個体に対して自己であってもよく、同種異系であってもよく、または異種であってもよい。一部の実施形態では、血小板血漿組成物は、線維芽細胞と一緒に投与されるか、または線維芽細胞の投与後に投与され、血小板血漿組成物は、血小板および血漿を含有してもよく、それらから本質的になってもよく、またはそれらからなってもよく、骨髄および/または末梢血に由来してもよい。本開示は、これらの源のどちらかまたは両方からの血小板血漿組成物を使用することがあり、どちらかの血小板血漿組成物を、それを必要とする核もしくは輪のどちらかまたは両方を再生するために使用することもある。さらに、血小板血漿組成物は、濃縮骨髄(BMAC)とともに、またはそれなしで使用されることがある。例として、輪に挿入される場合、0.05~2.0ccの血小板血漿組成物が使用されることがあり、核に挿入される場合、0.05~3.0ccの血小板血漿組成物が使用されることがある。血小板は、上述の通り骨髄および末梢血中で見いだされうる、非有核血液細胞である。
本開示の様々な実施形態では、血小板血漿組成物は、全血および/または骨髄から遠心分離によって、例えば、(1)多血小板血漿、(2)乏血小板血漿および(3)フィブリノーゲンという三層に分画することにより、得ることができるだろう。血液からの前記層のうちの一層、例えば、多血小板血漿(PRP)からの血小板を使用する場合、血小板全体を使用してもよく、またはそれらの内容物を抽出し、例えばトロンビンおよび/もしくは塩化カルシウムを使用する細胞膜溶解手順によって血小板溶解物に濃縮してもよい。血小板全体を使用するか、または溶解物として使用するかを選ぶとき、再生および/または組織治癒(ヘルニアになった椎間板または断裂した椎間板の再生も、治癒も伴わない、瘢痕組織の形成を含むこともある)を所望する割合が考慮されうる。一部の実施形態では、溶解物のほうが、PRP(または骨髄からの乏血小板血漿)より迅速に作用するであろう。注目すべきこととして、骨髄に由来する乏血小板血漿は、血液からの多血小板血漿より高い血漿濃度を有し、これは、乏/多血小板血漿、(「PP/RP」または「PPP」)、としても公知である。PP/RPまたはPPPは、骨髄に由来する乏血小板血漿を指すために使用されうるものであり、好ましくは、PP/RPが使用され、またはPRPは、椎間板再生のための組成物の一部として使用される。(慣例により、略号PRPは、末梢血に由来する組成物のみを指し、PPP(またはPP/RP)は、骨髄に由来する組成物を指す。)様々な実施形態において、溶解物の形態であってもよく、またはなくてもよい、血小板血漿組成物は、次の機能のうちの1つまたは複数を果たしうる:(1)組織再生のための増殖因子および/またはサイトカインを放出する機能、(2)炎症を軽減する機能、(3)細胞シグナル伝達を誘引/起動する機能、(4)線維芽細胞増殖因子(FGF)による損傷した輪の線維芽細胞修復を開始させる機能、(5)椎間板線維輪を安定させる機能、(6)椎間板線維輪断裂を修復する機能、(7)椎間板への血管再形成を刺激する機能、ならびに(8)幹細胞活性化を刺激する機能。一部の実施形態では、血小板療法と幹細胞を併用することにより、背部痛の軽減に関して相乗作用がある場合もある。いずれにせよ、個体は、いずれかの種類の1つまたは複数の鎮痛薬を摂取し続けてきた可能性があり、摂取しており、または摂取することになる。
溶解物が使用される一部の実施形態では、サイトカインは、それらの機能的能力を最適化するために濃縮されうる。濃縮は、2ステップで遂行されうる。先ず、血液を入手し、濃縮して、濃縮する前のそのものの5~15%である体積にしてもよい。使用されうるデバイスとしては、血液濾過器または血液濃縮器が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、60ccの血液を6ccに濃縮してもよい。次に、濃縮された血液を濾過して水を除去してもよい。この濾過ステップは、濾過前のものの33%~67%(例えば、おおよそ50%)に体積をさらに低下さることができるだろう。したがって、例として、6ccの濃縮製品については、おおよそ3ccの製品が得られるように濾過して水を取り除くことができるだろう。多血小板血漿、乏血小板血漿およびフィブリノーゲンを血液から得る場合、例えば、20~500ccの末梢血、40~250ccの末梢血、または60~100ccの末梢血を採血することによって、それらを得てもよい。採血すべき血液の量は、変性した椎間板の数、および椎間板のサイズに依存することになる。典型的な椎間板が2~5ccまたは3~4ccの体積を有することは、当業者には分かるであろう。1つの具体的な実施形態では、線維芽細胞は、活性化PRPと一緒に処理されるか、または投与される。米国特許第9,011,929号明細書による活性化PRPの生成方法を使用してもよく、前記特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられ、前記特許文献には、本質的には、全血からPRPを分離するステップであって、3.2%クエン酸ナトリウムが入っている真空試験管に動物または患者から10mlの全血を収集するステップと、収集した全血についての1,750~1,900gでの3~5分間の第1の遠心分離を行うステップとをさらに含むステップ;前記遠心分離から得た血漿層とバフィーコートを含む上清液を収集するステップ;収集した上清液を鈍針によって新たな真空試験管に移し、収集した上清についての4,500~5,000gでの4~6分間の第2の遠心分離を行うステップ;および別の鈍針によって最下層に濃縮されたPRPを収集するステップ;分離ステップから収集した1mLのPRPを、三方コネクタによって、0.3~0.55mg/mLの濃度を有する塩化カルシウム溶液と混合するステップ;およびPRPと塩化カルシウム溶液の混合物を、I型コラーゲンと混合するステップであって、前記I型コラーゲンを混合前に室温で15~30分間、放置するステップと、PRPと塩化カルシウム溶液の混合物を、別の三方コネクタによって4回、不透明相中の20~50mg/mLの濃度を有するI型コラーゲンと混合するステップとをさらに含む、ステップを記載が記載されている。一部の実施形態では、線維芽細胞の投与は、生体適合性ポリマーおよび増殖培地、またはPRP、または血小板ゲルと一緒に行われる。
一実施形態では、同種異系線維芽細胞は、スクリーニングされたドナーから、上記と同様の方法を使用して得られる。この実施形態では、スクリーニングされたドナーは、線維芽細胞の拡大およびマスターセルバンク(MCB)の生成のための組織を提供する。適切な試験をMCBに関して行った後、マスターバンクから拡大した細胞を使用して、作業用セルバンク(WCB)を作成し、そしてまたこのWCBを、同種異系外用剤の形成に使用するための条件培地の製造のために拡大する。再プログラミングされた細胞は、正常な核型を有し、in vitroで拍動する心筋細胞に分化し、in vivoで3層すべての胚葉層の代表に分化する。多能性マーカーSSEA3を発現するヒト真皮線維芽細胞の亜集団は、Bryne,et al.,PLoS One,4(9):e7118(2009)により記載されたように、向上したiPSC生成効率を明示する。SSEA3陽性およびSSEA3陰性集団に、同一の実験条件下で、同じレトロウイルスベクターを用いて形質導入し、不活性化マウス胚線維芽細胞(MEF)に播種した。標準hESC条件下で3週間培養した後、3名の無関係なhESC生物学者が、二重盲検分析で、プレートをiPSCコロニー形成について検査した。iPSC形態を有するコロニーを採取し、拡大した。形質導入されたSSEA3陰性細胞での3回の生物学的反復実験すべてが、多数の大きいバックグラウンドコロニー(反復1回当たり10~27)を形成したが、iPSCコロニーは出現せず、対照的に、形質導入されたSSEA3陽性細胞での3回の生物学的反復実験すべてが、iPSCコロニー形成(1反復当たり4~5)をもたらしたが、非常に少数の大きいバックグラウンドコロニー(1反復当たり0~1)をもたらした。iPSC様コロニーに由来する細胞株のさらなる特性解析により、それらが、大きい核細胞質比、明確な境界および顕著な核小体を有する扁平コロニーとして増殖する、hESC様形態を有することが明らかになった。5系統をさらに拡大し、特性解析したとき、アルカリホスファターゼ、Nanog、SSEA3、SSEA4、TRA160およびTRA181を含む、hESCにより発現される肝要な多能性マーカーの発現を、すべてが明示した。SSEA3選択iPSCは、正常雄核型(46、XY)、in vitroで機能性の拍動する心筋細胞に分化する能力、およびin vivoで3層すべての胚葉層の代表に分化する能力も明示した。形質転換SSEA3陰性細胞からはiPSCコロニー形成も系統誘導も観察されなかったため、これは、これら3細胞が、SSE A3発現細胞と比較して有意に低い再プログラミング能を有するか、またはさらには再プログラミング能を有さないことを示す。加えて、SSEA3を強く発現する初代線維芽細胞の10倍濃縮は、対照誘導率と比較して有意に高いiPSC系統誘導効率(8倍増加)をもたらす(p<0.05)。SSEA3陽性細胞は、形態的にSSEA3陰性線維芽形態と区別不能に見え、さらに、SSEA3抗原の発現は、成体間葉または表皮幹細胞などの他の細胞型のマーカーとは考えられない。
本開示の一実施形態では、成人皮膚の真皮中に存在する、したがって単離されうる、SSEA3発現細胞の希少亜集団を活性化するために、多血小板血漿が使用される。これらのSSEA3発現細胞は、損傷に応答して細胞数が有意に減少され、これは、再生への関与を示す。これらのSSEA3発現再生関連(SERA)細胞を、初代細胞培養によって誘導し、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって精製し、特性解析した。SERA細胞は、骨髄および脂肪由来間葉幹細胞(MSC)に最も類似した包括的転写状態を明示し、最も高度に発現するSSEA3発現細胞は、CD105を同時発現した。しかし、これらの細胞は、脂肪細胞にも、骨芽細胞にも、軟骨細胞にも、分化することができない。
腰痛を有する個体の処置は、本開示の一実施形態によって、例えば、血管新生刺激または抗炎症活性の発現をアップレギュレートするように遺伝子改変された線維芽細胞の投与によって、遂行されうる。遺伝子が、アデノウイルス、アデノ随伴、レトロウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、クンジンウイルス、またはHSVベクター、リポソーム、ナノ粒子媒介型、ならびにエレクトロポレーションおよびSleeping Beautyトランスポゾンを含む、広範なアプローチによって、導入されうることは、当技術分野において公知である。トランスフェクトされうる血管新生刺激機能を有する遺伝子としては、VEGF、FGF-1、FGF-2、FGF-4、EGF、HGF、およびこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。加えて、HIF-1アルファ、HIF-2、NET、NF-kB、またはこれらの組合せを含む、血管新生カスケードの発現のアップレギュレーションに関連する転写因子も、腰痛の処置に使用される細胞にトランスフェクトされうる。例えば、TGF-a、TGF-b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-20 トロンボスポンジン、またはこれらの組合せなどの、炎症に対して阻害性の遺伝子を、使用してもよい。トランスフェクションは、血管新生を阻害する遺伝子の転写または翻訳を実質的に遮断する方式での遺伝子操作手段の投与にも利用されうる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは低分子干渉RNAを、腰痛の処置に使用するための細胞に、例えば、カンスタチン、IP-10、クリングル1-5、およびコラーゲンXVIII/エンドスタチンなどの、抗血管新生性タンパク質の発現を遮断するために、トランスフェクトしてもよい。加えて、腰痛の処置に使用される細胞の、IL-1、TNF-アルファ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-アルファ、IFN-ベータおよびIFN-ガンマをはじめとする炎症性タンパク質を発現させる能力を遮断するために、遺伝子阻害技術が使用されうる。記載した遺伝学的手段のみならずデコイオリゴヌクレオチドを使用して、炎症に付随して全般的に作用する転写因子を実質的に遮断することもできるだろう。遮断のための適切な転写因子としては、例えば、NF-kB複合体の様々なサブユニット、例えば、p55および/またはp60、STATファミリーメンバー、特に、STAT1、STAT5、STAT4、ならびにインターフェロン調節因子のメンバー、例えば、IRF-1、IFR-3およびIFR-8が挙げられる。背部痛の処置に有用な細胞の血管新生刺激能力の増強は、酸素制限条件下での培養によって行うことができる。一般に、幹細胞、特に、血管新生促進活性を有するものは、骨髄の低酸素ニッチに存在する傾向があることは、当技術分野では公知である。幹細胞が、より成熟した子孫に分化すると、それらは、骨髄のより酸素分圧の高い領域に遊走する。[40]。組織培養でこの重要な可変要素が研究に使用され、それらの研究によって、1.5%ほども低い酸素分圧を使用して、低酸素条件で、完全造血再構築が可能なヒトDC34幹細胞の卓越した拡大が得られることが実証された。正常酸素分圧と比較して5.8倍高度であった、低酸素下での強力な拡大は、制御条件下で放出されると強力な血管新生刺激になるVEGFなどのHIF-1依存性増殖因子の低酸素誘導に起因すると考えられた[41]。したがって、背部痛の処置に利用される細胞の培養は、1~3%などの、1.5%~1.9を含む、0.5%~4%の範囲の酸素条件で、行われうる。低酸素培養は、酸素分圧を低下させる方向に限定されず、組織培養の過程で酸素取込みを阻害するかまたは酸素取込みと競合する分子の投与も含みうる。加えて、本開示のある実施形態では、低酸素は、HIF-1転写因子のアップレギュレーションを引き起こす1つまたは複数の薬剤の誘導によって、誘導される。
線維芽細胞が低酸素に曝露される実施形態において、酸素レベルは、特異的な実施形態では、酸素0.1%~5%の間、0.1%~4%の間、0.1%~3%の間、0.1%~2%の間、0.1%~1%の間、0.1%~0.75%の間、0.1%~0.5%の間、0.1%~0.25%の間、0.2%~5%の間、0.2%~4%の間、0.2%~3%の間、0.2%~2%の間、0.2%~1%の間、0.2%~0.75%の間、0.2%~0.5%の間、0.5%~5%の間、0.5%~4%の間、0.5%~3%の間、0.5%~2%の間、0.5%~1%の間、0.5%~0.75%の間、0.75%~5%の間、0.75%~4%の間、0.75%~3%の間、0.75%~2%の間、0.75%~1%の間、1%~5%の間、1%~4%の間、1%~3%の間、1%~2%の間、2%~5%の間、2%~4%の間、2%~3%の間、3%~5%の間、3%~4%の間、または4%~5%%の間でありうる。これらの代表的酸素レベルを含む(しかしこれらに限定されない)低酸素条件への細胞の曝露期間は、単なる例として、30分(min)~3日、30min~2日、30min~1日、30min~12時間(hrs)、30min~8hrs、30min~6hrs、30min~4hrs、30min~2hrs、30min~1時間(hr)、1hr~3日、1hr~2日、1hr~1日、1~12hrs、1~8hrs、1~6hrs、1~4hrs、1~2hrs、2hrs~3日、2hrs~2日、2hrs~1日、2hrs~12hrs、2~10hrs、2~8hrs、2~6hrs、2~4hrs、2~3hrs、6hrs~3日、6hrs~2日、6hrs~1日、6~12hrs、6~8hrs、8hrs~3日、8hrs~2日、8hrs~1日、8~16hrs、8~12hrs、8~10hrs、12hrs~3日、12hrs~2日、12hrs~1日、12~18hrs、12~14hrs、1~3日、または1~2日の期間でありうる。
特異的な実施形態では、様々な培養手順後、生成された細胞は、臨床状況での使用前に血管新生活性および/または抗炎症活性について試験されうる。試験は、当業者に周知の様々な手段により行うことができるだろう。血管新生能の評価に関して、手段は、以下のものを含むが、これらに限定されない:a)in vitroで、ヒト臍帯静脈内皮細胞もしくは他の内皮集団を使用して、内皮細胞増殖を支持する能力(増殖の評価を、トリチウム標識チミジンの組込みを使用して行ってもよく、もしくは前記増殖内皮細胞の目視計数によって行ってもよい。MTTなどの生存性色素を使用してもよく、もしくは他の市販の指示薬を使用してもよい);b)皮下移植されたマトリックスにおける索形成を支持する能力(例えばマトリゲルもしくはフィブリンゲルを含みうる、マトリックスに、上記の通り生成した細胞を負荷し、動物に皮下移植する。動物は、免疫学的相違を否定するために免疫不全マウス、例えば、SCIDもしくはヌードマウスでありうる。移植後、内皮索形成を顕微鏡検査によって目視評価してもよい。細胞刺激血管新生を、前記細胞刺激血管新生に応答する宿主細胞に対して、区別するために、種特異的マーカーを使用してもよい);c)ニワトリ胚絨毛尿膜アッセイで発生する血管新生を加速する能力(胎生9日のニワトリ絨毛尿膜に細胞を直接またはマトリックス経由で移植し、おおよそ2日間にわたって培養してもよい。生体顕微鏡を使用して血管新生の可視化を行ってもよい)、および/またはd)上記の後肢虚血モデルにおいて新血管新生を刺激する能力。
可能性のある臨床使用のために生成または単離した線維芽細胞の抗炎症能力の評価も、行うことができるだろう。非常に多くの方法が、当技術分野において公知であり、例えば、それらは、in vitroで免疫学的パラメータを調節するための推定的抗炎症性線維芽細胞の評価を含みうる。推定的抗炎症性線維芽細胞を免疫細胞と様々な比率で共培養してもよい。活性化刺激を用いて免疫細胞を刺激してもよい。用量依存的に、炎症性サイトカインの産生を阻害する、または抗炎症性サイトカインの産生を増大させる、推定的抗炎症細胞の能力を、抗炎症活性を評価する出力システムとして使用してもよい。さらなる出力パラメータとしては、増殖、細胞傷害活性、炎症メディエーターの産生、または活性化に関連する表面マーカーのアップレギュレーションを挙げることができるだろう。評価されるサイトカインとしては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、TNF、IFNおよび/またはRANKLを挙げることができるだろう。具体的な免疫細胞は、新たに単離されることもあり、または不死化細胞株であることもある。免疫細胞は、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、ガンマデルタT細胞、またはこれらの組合せでありうる。免疫刺激は、抗体、リガンド、または別の細胞を含みうる。例としては、T細胞受容体との、CD28などの共刺激分子との、CD69などの活性化関連分子との、またはIL-2などの刺激性サイトカインの受容体との、抗体架橋が挙げられる。免疫刺激のさらなる例としては、混合リンパ球反応などの同種異系刺激細胞との共培養を挙げてもよく、またはレクチンなどの非特異的活性化因子での刺激を挙げてもよい。具体的なレクチンとしては、コンコナバリン-A、植物性血液凝集素、またはコムギ胚芽凝集素を挙げることができるだろう。他の非特異的刺激は、toll様受容体経路の活性化因子、例えば、リポ多糖、CpG DNAモチーフまたは細菌の膜画分でありうる。上記2段落に記載の方法は、単に、臨床使用に入る前に、本発明に記載の通り生成された細胞集団が所望の血管新生刺激効果または抗炎症効果を生じさせることができるかどうかを判定するために使用されうる例として、示されるものに過ぎない。これらの例は、単に、当業者が常套的な実験の使用により最適化することができるガイドとして提供されるものに過ぎない。
本明細書で提供される本開示のいずれの実施形態についても、腰痛の処置に使用される細胞は、後の使用のために凍結保存されることがあり、場合によっては輸送のために、凍結保存されることもある。当業者は、非常に多くの細胞凍結保存方法を知っている。通常は、細胞を凍結保護工程に向けて処理し、次いで、必要とされるまで冷凍保存してもよい。必要になったら、細胞には復活のための特別な配慮、および細胞機能に悪影響を及ぼしうる凍結保存剤を除去するための洗浄が必要である。一般に、凍結保存は、1)凍結保存剤、2)凍結速度の制御、および3)細胞を保管する温度である、3つの主要概念に、注意を払う必要がある。凍結保存剤は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、例えば、米国特許第6,461,645号明細書(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているような、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、i-エリトリトール、D-リビトール、D-マンニトール、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース、または塩化コリンを含みうる。当業者により利用される細胞の凍結保存方法は、DMSOが、細胞に自由に浸透することおよび細胞内小器官を保護することを可能にする条件下で、細胞に対して即時細胞傷害性にならない濃度のDMSOを含み、DMSOは、水と化合し、氷結晶形成から誘導される細胞傷害を防止する。20~25容量%の間の濃度での血漿への添加は、DMSOの保護効果を増大させることができる。DMSOの添加後、DMSOにより媒介される損傷を防止するために、細胞を4C未満の温度で保持すべきである。冬眠状態の細胞を実際に誘導する方法は、様々な冷却プロトコールの利用を含む。細胞型、凍結試薬、および細胞の濃度は、冷却方法を決定する際の重要な可変要素であるが、一般に、制御された一定の冷却速度が最適である。最適な凍結保存のために細胞の温度を下げることができる非常に多くのデバイスおよび装置が、当分野において公知である。1つのそのような装置は、Thermo Electron Corporationにより製造されるThermo Electro Cryomed Freezer(商標)である。Baxterにより製造されるようなCryoCyte(商標)容器で細胞を凍結させることもできる。凍結保存の一例は、次の通りである:Isolex System(商標)を製造業者の説明書(Baxter)に従って使用して、臍帯血からCD34細胞2×106個/mlを単離する。10%DMSOおよび20%血漿を含有するDMEM培地中で細胞をインキュベートする。1℃/分で0℃から-80℃への冷却を行う。細胞を使用する必要があるとき、37℃水浴で維持した水浴で細胞を迅速に解凍し、解凍し次第直ちに冷却する。細胞を迅速に洗浄する、緩衝溶液、または増殖因子を含有する溶液のどちらか。その後、精製された細胞を必要に応じて拡大に使用することができる。保管細胞情報(例えば、ドナー、起始細胞型(cell origination type)、細胞マーカーなど)のデータベースを、必要に応じて用意することもできる。
ある特定の実施形態では、線維芽細胞は、例えば、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、脂肪組織、包皮、胎盤および/または臍帯を含む組織に由来しうる。特異的な実施形態では、線維芽細胞は、胎盤、胎児、新生児または生体線維芽細胞またはこれらの混合物である。
個体への細胞の投与数は、少なくともある程度は本明細書に記載の因子に依存することとなり、当技術分野における常套的方法を使用して最適化されうる。特異的な実施形態では、単回投与が必要とされる。他の実施形態では、細胞の複数回投与が必要とされる。システムが、時間および状況によって変わりうる個体の特定の要求、細胞の喪失または個々の細胞の活性の喪失の結果としての細胞活性喪失率などのような、可変要因に依存することは、理解されるはずである。それ故、各々の個体が適正な投薬量についてモニターされうると予想され、個体のそのようなモニタリング実施は、当技術分野において常套的である。
一部の実施形態では、細胞は、Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco変法必須培地(DMEM)、イーグル変法必須培地(EMEM)、Optimem、イスコフ培地、またはこれらの組合せを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、1つまたは複数の培地組成物に供される。
特定のケースでは、線維芽細胞は、SSEA3、VEGF、FGF-1、FGF-2、FGF-4、EGF、HGF、HIF-1アルファ、HIF-2、NET、NF-kB、TGF-a、TGF-b、IL-4、IL-10、IL-13、IL-20 トロンボスポンジン、カンスタチン、IP-10、クリングル1-5、コラーゲンXVIII/エンドスタチン、IL-1、TNF-アルファ、IL-2、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-アルファ、IFN-ベータ、IFN-ガンマ、p55、p60、STAT1、STAT5、STAT4、IRF-1、IFR-3、IFR-8、またはこれらの組合せをコードするように組換え操作される。組換え技術が利用されるケースでは、1つまたは複数の型の線維芽細胞が、目的の1つまたは複数の遺伝子産物を各々がコードする1つまたは複数の発現ベクターを、保有するように操作される。組換え発現ベクターを、該ベクターを含有する宿主細胞の分泌を可能にする少なくとも1つのマーカーが存在しうる1つまたは複数のDNA分子または構築物に、挿入することができる。ベクターは、遺伝子および調節領域が単離され、適宜、ライゲートされ、適切なクローニング宿主にクローニングされ、シークエンシングまたは他の従来の手段により分析されうる、従来の方法で、調製することができる。詳細には、PCRを使用して、機能性ユニットのすべてまたは一部分を含む個々の断片を単離してもよく、その際、場合によっては、「プライマー対」、ライゲーション」、「in vitro変異誘発」などを適宜使用して、1または複数の変異を導入してもよい。完了し、適切な配列を有することが実証されたら、ベクターを、任意の適便な手段によって宿主細胞に導入することができるだろう。構築物を、感染または細胞への形質導入のために、レトロウイルスベクターを含む、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイル(HSV)、または他のものなどの、非複製、欠損ウイルスに組み込み、パッケージングしてもよい。ベクターは、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含みうる。あるいは、構築物を、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入してもよい。宿主細胞を、ベクターの導入前に、培養で増殖させ、拡大し、その後、ベクターの導入およびベクターの組込みのための適切な処理を行ってもよい。すると、細胞は、構築物中に存在するマーカーのおかげで拡大され、分泌される。首尾よく使用することができるだろう様々なマーカーには、hprt、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれる。
細胞における発現を可能にする1つまたは複数のプロモーター配列、例えばCMVプロモーター[Artuc et al.,Exp.Dermatol.1995,4:317-21]を含む、哺乳動物発現構築物に、本明細書に記載の遺伝子もしくは遺伝子産物、またはそれらの活性部分のいずれをクローニングしてもよい。適切な構築物の例としては、pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、PzeoSV2(+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto(これらの各々は、市販されている)、またはヒト包皮細胞における調節されたポリヌクレオチド発現を可能にするpSH発現ベクター[Ventura and Villa,1993,Biochem.Biophys.Commun.192:867-9]が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびパッケージングシステムの例は、複数のクローニング部位へのクローニングを可能し、導入遺伝子がCMVプロモーターから転写される、Retro-XベクターpLNCXおよびpLXSNを含む、Clontech、San Diego、Calif、USAにより販売されているものである。導入遺伝子が、5’LTRプロモーターから転写されることになる、pBabeなどの、Mo-MuLVに由来するベクターも含まれる。プラスミド転写を完了した後、線維芽細胞を、組織培養プレートからの剥離を可能にする手段によって、例えば、トリプシン処理によって回収し、増殖のために6ウェル(Nunc、Denmark)または24ウェルプレート(Nunc)のどちらかに移入する。トランスフェクションのおおよそ3日後、細胞培地を、改変線維芽細胞の増殖および拡大を可能にする培地に交換する。一例は、Neurobasal-A(Invitrogen)、1%D-グルコース(Sigma Aldrich)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(Invitrogen)、レチノイン酸を伴う2%B27サプリメント(Invitrogen)、0.2%EGF(Peprotech、USA)、0.08%FGF-2(Peprotech)、0.2%ヘパリン(Sigma Aldrich、USA)、および濃度1□Mにするためのバルプロ酸(Sigma-Aldrich)を含有する、Neurobasal A(NBA)増殖培地である。そしてその後、培地を週2回交換し、広範囲にわたるコロニー形成が達成されるまで、細胞を定期的に再播種(例えば、週に2~最大8回までの再播種;コロニーが成長し始めると、より定期的になる)して、再プログラミングされていない細胞を除去する。
一部の事例では、1つまたは複数の薬剤が、一過性発現のためのRNA分子として細胞に導入されうる。任意の改変細胞を含む、本開示の任意の細胞に、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび脂質媒介トランスフェクションを含む、様々な手段によって、RNAを送達することができる。特定の態様では、細胞へのベクターの導入は、トランスポゾンを介して行われうる。使用のための合成トランスポゾンの一例は、その血管新生剤遺伝子を含む発現カセットを含有するSleeping Beautyトランスポゾンである。あるいは、相同組換えのための当技術分野において公知であるような材料および方法を使用してベクターを特定の座位に組み込むことが所望される場合、相同組換えの標的部位を有することができるだろう。相同組換えのための、OMEGAまたはOベクターのどちらかを使用することができるだろう。例えば、Thomas and Capecchi,1987;Mansour,et al.,1988;and Joyner,et al.,1989を参照されたい。
ベクターを、少なくとも1つの薬剤(1つもしくは複数の腫瘍阻害剤、またはそれら断片を含む)と任意選択的に別のポリヌクレオチド(例えば、遺伝子)とをコードする単一のDNA分子として導入してもよく、または1つもしくは複数のポリヌクレオチド(例えば、遺伝子)を有する異なるDNA分子として導入してもよい。ベクターを、同時にまたは逐次的に、各々同じまたは異なるマーカーとともに、導入してもよい。説明に役立つ実例では、あるベクターは、特定の調節配列の制御下にある1つまたは複数の薬剤(例えば、血管新生剤)を含有するであろう。
ベクターDNAのストックを調製するために、およびトランスフェクションを行うために使用されうるベクターであって、有用なエレメント、例えば、細菌または酵母複製起点、選択可能および/または増幅可能なマーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター/エンハンサーなどを含むベクターは、当技術分野において公知であり、多くが市販されている。
ある特定の実施形態では、RNAまたはタンパク質様配列を同じ宿主細胞において他の選択されたRNAまたはタンパク質様配列と同時発現させることができるだろうと考えられる。同時発現は、宿主細胞への2つまたはそれより多くの別個の組換えベクターのコトランスフェクションによって果たすことができるだろう。あるいは、RNAについての複数の別個のコード領域を含むように単一の組換えベクターを構築してもよく、その場合、その単一のベクターをトランスフェクトした宿主細胞においてRNAを発現させることができよう。
一部の状況では、改変細胞を死滅させることが、例えば、その目的が処置を終わらせることであり、前記細胞が腫瘍性になる場合、細胞の存在後の不在が興味の対象となる研究、および/または別の事象において、望ましいことがある。このために、制御された条件下で改変細胞を死滅させることができる、ある特定の遺伝子産物、例えば、自殺遺伝子の発現をもたらすことができる。自殺遺伝子、カスパーゼ9の改変形態が、小分子、例えばAPI903と二量体化しうる、iCaspase9系は、当技術分野において公知である。例えば、Straathof et al.,Blood 105:4247-4254(2005)を参照されたい。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例証するために提供するものである。しかし、これらの実施例を、本発明の広い範囲を限定するものと決してみなすべきではない。
〔実施例1〕
多血小板血漿との培養は線維芽細胞の免疫抑制マーカーPD-1L発現を増進する
線維芽細胞を多血小板血漿(PRP)とともに培養して、治療使用のための増強された線維芽細胞を産生する。包皮線維芽細胞、ヒト骨髄MSCおよびヒト脂肪MSCをATCCから入手し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地において、健常ドナーから生成した図1に表記のPRP濃度で培養した。細胞を48時間にわたって培養した。PD-抗PDL1-PEまたはアイソタイプ対照(Becton Dickenson、Franklin Lakes、NJ)を、製造業者の説明書に従って染色に使用した。Live/Dead Fixable近赤外色素(live/dead fixable near-infrared dye)(Invitrogen)を使用して、死細胞を排除した。ゲートした生細胞の蛍光を平均蛍光強度(MFI)として定量した。図1から分かるように、PD-L1発現の増加が線維芽細胞において独特に観察された。
多血小板血漿との培養は線維芽細胞の免疫抑制マーカーPD-1L発現を増進する
線維芽細胞を多血小板血漿(PRP)とともに培養して、治療使用のための増強された線維芽細胞を産生する。包皮線維芽細胞、ヒト骨髄MSCおよびヒト脂肪MSCをATCCから入手し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地において、健常ドナーから生成した図1に表記のPRP濃度で培養した。細胞を48時間にわたって培養した。PD-抗PDL1-PEまたはアイソタイプ対照(Becton Dickenson、Franklin Lakes、NJ)を、製造業者の説明書に従って染色に使用した。Live/Dead Fixable近赤外色素(live/dead fixable near-infrared dye)(Invitrogen)を使用して、死細胞を排除した。ゲートした生細胞の蛍光を平均蛍光強度(MFI)として定量した。図1から分かるように、PD-L1発現の増加が線維芽細胞において独特に観察された。
〔実施例2〕
多血小板血漿との培養はT細胞活性化を抑制する線維芽細胞の能力を増強する
線維芽細胞をPRPとともに培養して、治療使用のための増強された線維芽細胞を産生する。包皮線維芽細胞、ヒト骨髄MSCおよびヒト脂肪MSCをATCCから入手し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地において、健常ドナーから生成した下記の多血小板血漿(PRP)濃度で培養した。細胞を48時間培養した。その後、細胞を同種異系末梢血単核細胞とともに播種し、1ml当たり0.5マイクログラムの植物性血液凝集素で刺激した。細胞を72時間にわたって共培養し、最後の12時間の培養中に1マイクロキューリーの滴定チミジンを添加した。増殖をシンチレーション測定によって評価した。観察された通り、PRPの添加は、線維画細胞の免疫抑制活性を独特に増強した。
多血小板血漿との培養はT細胞活性化を抑制する線維芽細胞の能力を増強する
線維芽細胞をPRPとともに培養して、治療使用のための増強された線維芽細胞を産生する。包皮線維芽細胞、ヒト骨髄MSCおよびヒト脂肪MSCをATCCから入手し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地において、健常ドナーから生成した下記の多血小板血漿(PRP)濃度で培養した。細胞を48時間培養した。その後、細胞を同種異系末梢血単核細胞とともに播種し、1ml当たり0.5マイクログラムの植物性血液凝集素で刺激した。細胞を72時間にわたって共培養し、最後の12時間の培養中に1マイクロキューリーの滴定チミジンを添加した。増殖をシンチレーション測定によって評価した。観察された通り、PRPの添加は、線維画細胞の免疫抑制活性を独特に増強した。
〔実施例3〕
多血小板血漿との培養はインターフェロンガンマのT細胞産生を抑制する線維芽細胞の能力を増強する
線維芽細胞を多血小板血漿(PRP)とともに培養して、治療使用のための増強された線維芽細胞を産生する。包皮線維芽細胞、ヒト骨髄MSCおよびヒト脂肪MSCをATCCから入手し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地において、健常ドナーから生成した下記の多血小板血漿(PRP)濃度で培養した。細胞を48時間培養した。その後、細胞を同種異系末梢血単核細胞とともに播種し、1ml当たり0.5マイクログラムの植物性血液凝集素で刺激した。細胞を48時間にわたって共培養し、インターフェロンガンマ産生の評価をELISAによって行った。観察された通り、インターフェロンガンマ産生の減少が、PRP処理線維芽細胞において独特に観察された。
多血小板血漿との培養はインターフェロンガンマのT細胞産生を抑制する線維芽細胞の能力を増強する
線維芽細胞を多血小板血漿(PRP)とともに培養して、治療使用のための増強された線維芽細胞を産生する。包皮線維芽細胞、ヒト骨髄MSCおよびヒト脂肪MSCをATCCから入手し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地において、健常ドナーから生成した下記の多血小板血漿(PRP)濃度で培養した。細胞を48時間培養した。その後、細胞を同種異系末梢血単核細胞とともに播種し、1ml当たり0.5マイクログラムの植物性血液凝集素で刺激した。細胞を48時間にわたって共培養し、インターフェロンガンマ産生の評価をELISAによって行った。観察された通り、インターフェロンガンマ産生の減少が、PRP処理線維芽細胞において独特に観察された。
(参考文献)
本明細書で言及したすべての特許および公表文献は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。すべての特許および公表文献は、個々の公表文献各々が、それら全体が参照により組み入れられていると具体的におよび個々に示されている場合と同程度に、参照により組み入れられる。
本明細書で言及したすべての特許および公表文献は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。すべての特許および公表文献は、個々の公表文献各々が、それら全体が参照により組み入れられていると具体的におよび個々に示されている場合と同程度に、参照により組み入れられる。
(特許文献)
米国特許第5,165,928号明細書
米国特許第5,165,928号明細書
米国特許第5,585,007号明細書
米国特許第5,599,558号明細書
米国特許第5,614,204号明細書
米国特許第6,010,627号明細書
米国特許第6,214,338号明細書
米国特許第6,303,112号明細書
米国特許第6,461,645号明細書
米国特許第6,649,072号明細書
米国特許第9,011,929号明細書
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本開示およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される通りの設計の趣旨および精神から逸脱することなく、この中で様々な変更、置換および代替を行うことができることは、理解されるはずである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載の工程、機械、製造、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図したものではない。本開示から当業者には容易に理解されるであろうが、本開示に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果すまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するまたは後に開発される工程、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを本発明に従って用いることができるだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内にそのような工程、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを含むことを意図したものである。
本開示およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される通りの設計の趣旨および精神から逸脱することなく、この中で様々な変更、置換および代替を行うことができることは、理解されるはずである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載の工程、機械、製造、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図したものではない。本開示から当業者には容易に理解されるであろうが、本開示に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果すまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するまたは後に開発される工程、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを本発明に従って用いることができるだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内にそのような工程、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを含むことを意図したものである。
Claims (1)
- 明細書又は図面に記載の発明。
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