JP2024026604A - Ketooctadecadienoic acid production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ケトオクタデカジエン酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing ketooctadecadienoic acid.
近年、リノール酸やオレイン酸を酵素やその他の手段を用いて反応させて得られる水酸化脂肪酸やオキソ脂肪酸などが、いわゆる希少脂肪酸として注目されている。これら希少脂肪酸は、人々の健康、医療への関心の高まりと共に、特にその生理活性などの様々な産業利用への応用という点から期待されている。中でもリノール酸のオキソ誘導体であるケトオクタデカジエン酸の一種である１３－オキソ－オクタデカジエン酸や９－オキソ－オクタデカジエン酸は、脂質代謝改善等の生活習慣病を改善する活性が見いだされたことから、顕著な脂肪燃焼効果を示す機能性成分として、内外で活発な研究が行われている。 In recent years, hydroxylated fatty acids and oxo fatty acids, which are obtained by reacting linoleic acid and oleic acid using enzymes or other means, have attracted attention as so-called rare fatty acids. These rare fatty acids are expected to be used in various industrial applications, especially due to their physiological activity, as interest in people's health and medical care increases. Among them, 13-oxo-octadecadienoic acid and 9-oxo-octadecadienoic acid, which are types of ketooctadecadienoic acid, which are oxo derivatives of linoleic acid, have been found to have activity in improving lifestyle-related diseases such as improving lipid metabolism. As a result, active research is being conducted both domestically and internationally as a functional ingredient that exhibits significant fat-burning effects.
これらケトオクタデカジエン酸は、以前よりトマトの中に含有されていることが知られているが、その含有量は約１ｎｇ／ｍｇ程度までとごく微量であり、食品または医薬品の有効成分として利用するために十分な供給源とはなり得ない。したがって、より高い含有量でケトオクタデカジエン酸を含有する供給源や、より効率的なケトオクタジエン酸の合成が望まれていた。 Ketooctadecadienoic acid has long been known to be contained in tomatoes, but its content is extremely small, about 1 ng/mg, and it is used as an active ingredient in foods and medicines. There cannot be a sufficient source of supply for this purpose. Therefore, a source containing a higher content of ketooctadecadienoic acid and a more efficient synthesis of ketooctadecadienoic acid have been desired.
例えば、特許文献１には、ケトオクタデカジエン酸の合成方法として、マンガン、亜鉛、鉄、銅またはマグネシウムなどの金属の存在下、且つ２０℃未満の温度で、リノール酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させる工程を備える、ケトオクタデカジエン酸の製造方法が記載されている。 For example, Patent Document 1 describes a method for synthesizing ketooctadecadienoic acid in which lipoxygenase is applied to a raw material containing linoleic acid in the presence of a metal such as manganese, zinc, iron, copper, or magnesium at a temperature of less than 20°C. A method for producing ketooctadecadienoic acid is described, comprising the step of acting an enzyme material comprising:
特許文献１に記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法は、触媒として金属を用いるものであり、合成したケトオクタデカジエン酸を食品用途や医薬品用途に使用する場合には、生成物に金属が含有されるリスクがある。また、副生成物の生成を抑制し、収率を向上させるために、特許文献１に記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法では２０℃未満の反応温度とすることが不可欠となっており、その製造プロセスにおいて、生産設備上、温度調整において煩雑な機器・機材を必要とするものであった。 The method for producing ketooctadecadienoic acid described in Patent Document 1 uses a metal as a catalyst, and when the synthesized ketooctadecadienoic acid is used for food or pharmaceutical applications, metals may not be present in the product. There is a risk of it being contained. In addition, in order to suppress the production of by-products and improve the yield, in the method for producing ketooctadecadienoic acid described in Patent Document 1, it is essential to set the reaction temperature to less than 20 ° C. In the manufacturing process, complicated equipment and equipment were required for production equipment and temperature control.
また、特許文献１に記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法では、酵素としてリポキシゲナーゼが使用されている。使用する酵素として、このリポキシゲナーゼとともにデヒドロゲナーゼの添加も示唆されているが、リポキシゲナーゼ自体が脂肪酸の反応を顕著に促進する酵素であるため、特に２０℃以上の反応温度では、リポキシゲナーゼにより過酸化物が大量に生成され、生成したケトオクタデカン酸をさらに酸化させてしまう。このため、目的物質であるケトオクタデカン酸の最終的な収率が低下してしまうという問題がある。酵素を使用して安全にかつ安定的に、効率良くケトオクタデカジエン酸を合成するケトオクタデカジエン酸の製造方法が求められている。 Furthermore, in the method for producing ketooctadecadienoic acid described in Patent Document 1, lipoxygenase is used as an enzyme. It has been suggested that dehydrogenase may be added along with lipoxygenase as an enzyme to be used, but since lipoxygenase itself is an enzyme that significantly accelerates the reaction of fatty acids, lipoxygenase produces a large amount of peroxide, especially at reaction temperatures of 20°C or higher. , which further oxidizes the formed ketooctadecanoic acid. Therefore, there is a problem in that the final yield of ketooctadecanoic acid, which is the target substance, decreases. There is a need for a method for producing ketooctadecadienoic acid that safely, stably, and efficiently synthesizes ketooctadecadienoic acid using an enzyme.
本発明は、これまで供給が難しかったケトオクタデカジエン酸を、酵素を利用して、安全にかつ安定的に、効率良く製造することのできるケトオクタデカジエン酸の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention aims to provide a method for producing ketooctadecadienoic acid, which can be produced safely, stably, and efficiently using enzymes, which has hitherto been difficult to supply. purpose.
本発明は、（ａ）脂肪酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた反応混合物に含まれる前記リポキシゲナーゼの酵素反応を停止させる工程を含む、ケトオクタデカジエン酸の製造方法に関する。 The present invention includes (a) a step of causing an enzyme material containing lipoxygenase to act on a raw material containing a fatty acid, and (b) a step of stopping the enzymatic reaction of the lipoxygenase contained in the reaction mixture obtained in step (a). , relates to a method for producing ketooctadecadienoic acid.
さらに、（ｃ）前記工程（ｂ）を経て得られた生成物に脱水素酵素を作用させる工程を含むケトオクタデカジエン酸の製造方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for producing ketooctadecadienoic acid, which includes the step of (c) allowing a dehydrogenase to act on the product obtained through the step (b).
前記脂肪酸を含む原料が、リノール酸を構成成分として含有する油脂を含む原料、リノール酸を含む原料、または、リノール酸であるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The raw material containing the fatty acid is preferably a raw material containing an oil or fat containing linoleic acid as a constituent, a raw material containing linoleic acid, or a method for producing ketooctadecadienoic acid, which is linoleic acid.
前記酵素材料を作用させる工程を、１０℃以上、６０℃以下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of applying the enzyme material is carried out at a temperature of 10°C or higher and 60°C or lower is preferred.
前記酵素材料を作用させる工程を、２０℃以上、５０℃以下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of applying the enzyme material is carried out at a temperature of 20° C. or higher and 50° C. or lower is preferred.
前記酵素材料を作用させる工程において、前記酵素材料を０．５時間以上、７２時間以下作用させるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 In the step of allowing the enzyme material to act, a method for producing ketooctadecadienoic acid is preferred, in which the enzyme material is allowed to act for 0.5 hours or more and 72 hours or less.
前記酵素反応を停止させる工程を、前記リポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of stopping the enzyme reaction is carried out by deactivating the enzymatic activity of the lipoxygenase is preferred.
前記失活が、加熱処理またはｐＨ調整により行われるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the deactivation is performed by heat treatment or pH adjustment is preferred.
前記加熱処理を、前記反応混合物を７０℃以上、１４０℃以下に加熱することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the heat treatment is performed by heating the reaction mixture to a temperature of 70° C. or higher and 140° C. or lower is preferred.
前記ｐＨ調整を、前記反応混合物をｐＨ６未満またはｐＨ１２超に調整することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 Preferably, the method for producing ketooctadecadienoic acid is performed by adjusting the pH of the reaction mixture to less than 6 or more than 12.
前記酵素反応を停止させる工程を、前記リポキシゲナーゼを前記反応混合物から除去することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid is preferred, in which the step of stopping the enzymatic reaction is performed by removing the lipoxygenase from the reaction mixture.
前記酵素反応を停止させる工程を、前記反応混合物に前記リポキシゲナーゼの阻害剤を添加し、前記リポキシゲナーゼの酵素活性を阻害することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid is preferred, in which the step of stopping the enzyme reaction is carried out by adding an inhibitor of the lipoxygenase to the reaction mixture to inhibit the enzymatic activity of the lipoxygenase.
前記脱水素酵素が、アルコール脱水素酵素であるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the dehydrogenase is an alcohol dehydrogenase is preferred.
前記脱水素酵素を作用させる工程を、補因子の存在下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of causing the dehydrogenase to act is carried out in the presence of a cofactor is preferred.
前記補因子が、ＮＡＤ+であるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the cofactor is NAD + is preferred.
前記脱水素酵素を作用させる工程を、０℃以上、５０℃以下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of causing the dehydrogenase to act is carried out at a temperature of 0° C. or higher and 50° C. or lower is preferred.
前記脱水素酵素を作用させる工程を、６以上、１２以下のｐＨで行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of causing the dehydrogenase to act is carried out at a pH of 6 or more and 12 or less is preferred.
前記脂肪酸を含む原料に前記リポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させてのち０．５～２４時間以内に前記加熱処理を行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid is preferred, in which the heat treatment is performed within 0.5 to 24 hours after the enzyme material containing lipoxygenase is allowed to act on the raw material containing the fatty acid.
本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法によれば、二つの異なる酵素を独立して順次反応させることができるため、反応収率の点から従来問題となっていた副生成物の生成量が著しく抑制され得る。したがって、効率良くケトオクタデカジエン酸を製造することができる。また、合成の温度も室温とすることができ、特に２０℃以上の反応温度でも十分な収率でケトオクタデカジエン酸を製造することができる。さらに、本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法では、特殊な金属を使用する必要がない。２種類の酵素だけが用いられるため、従来技術よりも、より簡便な方法でケトオクタデカジエン酸を製造することができる。 According to the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention, two different enzymes can be reacted independently and sequentially, so the amount of by-products produced, which has traditionally been a problem in terms of reaction yield, can be reduced. can be significantly suppressed. Therefore, ketooctadecadienoic acid can be efficiently produced. Further, the synthesis temperature can also be set to room temperature, and in particular, ketooctadecadienoic acid can be produced with a sufficient yield even at a reaction temperature of 20° C. or higher. Furthermore, the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention does not require the use of special metals. Since only two types of enzymes are used, ketooctadecadienoic acid can be produced in a simpler manner than with conventional techniques.
ケトオクタデカジエン酸とは、特定の微生物や植物において、リノール酸の酸化的代謝によって得られる代謝物の一つである。リノール酸は、リノール酸代謝酵素の一つであるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase：ＬＯＸ）の作用により酵素的に過酸化脂質（ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ））へと変換され、この過酸化脂質（ＨＰＯＤＥ）は、非酵素的、または、酵素的に例えばペルオキシダーゼなどによってラジカルを放出して水酸化脂肪酸であるヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）へと変換される。ヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）にアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）などの脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が作用することなどによって、脂肪酸のオキソ誘導体であるケトオクタデカジエン酸が生成される。 Ketooctadecadienoic acid is one of the metabolites obtained by oxidative metabolism of linoleic acid in specific microorganisms and plants. Linoleic acid is enzymatically converted into lipid peroxide (hydroperoxyoctadecadienoic acid (HPODE)) by the action of lipoxygenase (LOX), which is one of the enzymes that metabolize linoleic acid. ) is converted to hydroxyoctadecadienoic acid (HODE), which is a hydroxylated fatty acid, non-enzymatically or enzymatically, e.g., by peroxidase, etc., by releasing radicals. Ketooctadecadienoic acid, which is an oxo derivative of a fatty acid, is produced by the action of a dehydrogenase such as alcohol dehydrogenase (ADH) on hydroxyoctadecadienoic acid (HODE).
ケトオクタデカジエン酸としては、具体的には、例えば、９－オキソ－１０，１２－オクタデカジエン酸（本明細書中、９－ｏｘｏＯＤＡとも略記される。）、１３－オキソ－９，１１－オクタデカジエン酸（本明細書中、１３－ｏｘｏＯＤＡとも略記される。）、５－オキソ－６，８－オクタデカジエン酸、６－オキソ－９，１２－オクタデカジエン酸、８－オキソ－９，１２－オクタデカジエン酸、１０－オキソ－８，１２－オクタデカジエン酸、１１－オキソ－９，１２－オクタデカジエン酸、１２－オキソ－９，１３－オクタデカジエン酸および１４－オキソ－９，１２－オクタデカジエン酸等が挙げられる。なお、これら化合物に異性体が存在する場合には全ての異性体およびその混合物を含むものとする。 Specifically, the ketooctadecadienoic acid includes, for example, 9-oxo-10,12-octadecadienoic acid (herein also abbreviated as 9-oxoODA), 13-oxo-9,11 -Octadecadienoic acid (herein also abbreviated as 13-oxoODA), 5-oxo-6,8-octadecadienoic acid, 6-oxo-9,12-octadecadienoic acid, 8-oxo -9,12-octadecadienoic acid, 10-oxo-8,12-octadecadienoic acid, 11-oxo-9,12-octadecadienoic acid, 12-oxo-9,13-octadecadienoic acid and 14 -oxo-9,12-octadecadienoic acid and the like. In addition, when isomers exist in these compounds, all isomers and mixtures thereof are included.
本発明は、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）によって酵素的にリノール酸をヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ）やヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）に変換させたのち、ＬＯＸを失活させ、その後に必要に応じＡＤＨなどの脱水素酵素を作用させて高効率にケトオクタデカジエン酸を製造するための方法を提供する。ＬＯＸの失活はＨＰＯＤＥが生成された後でもよく、ＨＯＤＥが生成された後でもよい。以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 The present invention involves enzymatically converting linoleic acid into hydroperoxyoctadecadienoic acid (HPODE) or hydroxyoctadecadienoic acid (HODE) using lipoxygenase (LOX), then deactivating LOX, and then as needed. Provided is a method for producing ketooctadecadienoic acid with high efficiency by using a dehydrogenase such as ADH. LOX may be deactivated after HPODE is generated or after HODE is generated. EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the form for implementing this invention is demonstrated in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本発明のいくつかの実施形態において、ケトオクタデカジエン酸は、脂肪酸を含む原料から製造される。脂肪酸を含む原料としては、例えば、脂肪酸を構成成分として含有する油脂を含む原料、脂肪酸を含む原料、および脂肪酸などが挙げられる。好ましくは、脂肪酸を含む原料は、リノール酸を構成成分として含有する油脂を含む原料、リノール酸を含む原料、または、リノール酸である。ここで、リノール酸としては、リノール酸に限定されず、共役リノール酸であってもよく、また、リノール酸のエステル体などを含んでいてもよい。 In some embodiments of the invention, ketooctadecadienoic acid is produced from raw materials that include fatty acids. Examples of raw materials containing fatty acids include raw materials containing oils and fats containing fatty acids as constituent components, raw materials containing fatty acids, fatty acids, and the like. Preferably, the raw material containing a fatty acid is a raw material containing an oil or fat containing linoleic acid as a constituent, a raw material containing linoleic acid, or linoleic acid. Here, linoleic acid is not limited to linoleic acid, and may be conjugated linoleic acid, or may include esters of linoleic acid.
リノール酸を構成成分として含有する油脂を含む原料またはリノール酸を含む原料としては、特に限定されるものではなく、例えば、植物体、動物体またはバクテリア体において、リノール酸を構成成分とする油脂を含むような原料またはリノール酸を含むような原料であれば、本実施形態の製造方法に好適に使用することができる。リノール酸を構成成分とする油脂またはリノール酸の含量が多いことが知られている、ダイズ、ヒマ、ベニバナもしくはトウモロコシなどの植物体、または、卵などの動物体を使用すれば、結果的に高収量でケトオクタデカジエン酸を生成させることができるため、このような原料を用いることが好ましい場合がある。また、上述の原料から抽出および／または精製された高純度のリノール酸を原料として用いてもよい。 There are no particular limitations on the raw materials containing fats and oils containing linoleic acid as a constituent, or the raw materials containing linoleic acid. Any raw material containing linoleic acid or linoleic acid can be suitably used in the manufacturing method of this embodiment. If oils and fats containing linoleic acid or plant materials such as soybean, castor, safflower, or corn, or animal materials such as eggs, which are known to have a high content of linoleic acid, are used, the result will be high. It may be preferable to use such raw materials because they can produce ketooctadecadienoic acid in high yields. Further, high purity linoleic acid extracted and/or purified from the above-mentioned raw materials may be used as the raw material.
本発明のいくつかの実施形態において、ケトオクタデカジエン酸は、上述の脂肪酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させることにより製造される。リポキシゲナーゼを含む酵素材料としては、リポキシゲナーゼを含む植物体、動物体またはバクテリア体の材料を使用してもよく、例えば上述の原料に含まれるリポキシゲナーゼを、酵素材料に含まれる天然由来のリポキシゲナーゼとしてそのまま使用してもよい。脂肪酸の酸化反応を効率的に進めるという観点から、例えば大豆などの植物体、例えば卵などの動物体、またはバクテリア体から適当な単離精製技術により精製された、天然由来、すなわち植物由来、動物由来またはバクテリア由来のリポキシゲナーゼが使用されてもよい。また、遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたリポキシゲナーゼあるいは化学的に合成されたリポキシゲナーゼが使用されてもよい。さらには、市販品を利用することもできる。また、酵素材料はリポキシゲナーゼ以外に他の酵素を含んでいてもよい。 In some embodiments of the invention, ketooctadecadienoic acid is produced by reacting a raw material containing the fatty acid described above with an enzyme material containing lipoxygenase. As the enzyme material containing lipoxygenase, materials from plants, animals, or bacteria containing lipoxygenase may be used. For example, the lipoxygenase contained in the above-mentioned raw materials is used as it is as the naturally-derived lipoxygenase contained in the enzyme material. You may. From the viewpoint of efficiently proceeding with the oxidation reaction of fatty acids, natural sources, that is, plant-derived, animal-derived materials purified by appropriate isolation and purification techniques from plants such as soybeans, animal bodies such as eggs, or bacteria. or bacterially derived lipoxygenases may be used. Furthermore, lipoxygenase produced as a recombinant by genetic engineering techniques or chemically synthesized lipoxygenase may be used. Furthermore, commercially available products can also be used. Furthermore, the enzyme material may contain other enzymes in addition to lipoxygenase.
酵素材料は、使用する原料に応じて、適宜その使用量を選択することができる。例えば、原料に含まれるリノール酸１０ｇに対し、精製した酵素換算で、１００～３０００００ユニットのリポキシゲナーゼが含まれるような酵素材料が使用される。原料に含まれるリノール酸１０ｇに対し、２０００～１８００００ユニットのリポキシゲナーゼが使用されてもよい。また、５０００～９００００ユニットのリポキシゲナーゼが使用されてもよい。なお、本明細書において１ユニットとは、リノール酸を基質とし、３ｍＬ（幅１ｃｍ）の石英セル内において、ｐＨ９、温度２５℃で１分間に波長２３４ｎｍにおける基質溶液の吸光度を０．００１増加させる酵素量と定義される。したがって、ここでリポキシゲナーゼ活性１ユニットは、毎分０．１２μｍｏｌのリノール酸を酸化する量に相当する。 The amount of the enzyme material to be used can be appropriately selected depending on the raw material used. For example, an enzyme material is used that contains 100 to 300,000 units of lipoxygenase in terms of purified enzyme per 10 g of linoleic acid contained in the raw material. 2,000 to 180,000 units of lipoxygenase may be used per 10 g of linoleic acid contained in the raw material. Also, 5000 to 90000 units of lipoxygenase may be used. In this specification, 1 unit means that the absorbance of a substrate solution at a wavelength of 234 nm is increased by 0.001 in 1 minute at pH 9 and temperature 25° C. in a 3 mL (width 1 cm) quartz cell using linoleic acid as a substrate. Defined as the amount of enzyme. Therefore, one unit of lipoxygenase activity corresponds to the amount of oxidizing 0.12 μmol of linoleic acid per minute.
脂肪酸を含む原料に酵素材料を作用させる反応温度は、使用する原料に応じて適宜設定することができるが、０～９０℃であることが好ましい。０℃未満では溶媒が凍ってしまい、反応が進行しない恐れがある。また、９０℃より高い温度では酵素材料に含まれるＬＯＸがすぐに失活してしまう。例えば、酵素材料を作用させる反応温度は、１０℃以上、６０℃以下とすることができる。好ましくは、酵素材料を作用させる反応温度は、１５℃以上、５０℃以下であり得る。好ましくは、２０℃以上、５０℃以下であり得る。好ましくは、３０℃以上、５０℃以下である。 The reaction temperature at which the enzyme material is applied to the raw material containing fatty acids can be appropriately set depending on the raw material used, but is preferably 0 to 90°C. If the temperature is below 0°C, the solvent may freeze and the reaction may not proceed. Furthermore, at temperatures higher than 90°C, LOX contained in the enzyme material is quickly deactivated. For example, the reaction temperature at which the enzyme material is applied can be 10°C or higher and 60°C or lower. Preferably, the reaction temperature at which the enzyme material is reacted may be 15°C or higher and 50°C or lower. Preferably, the temperature may be 20°C or higher and 50°C or lower. Preferably, the temperature is 30°C or higher and 50°C or lower.
なお、本明細書に記載の反応または工程は、適切な溶媒中で実施することができる。適切な溶媒は、当業者によって容易に選択され得る。適切な溶媒とは、本明細書に記載の反応または工程が、反応が実施される上述のような温度において、反応物、中間体および／または生成物と実質的に反応性でない溶媒である。また、本明細書に記載の反応または工程は、１種の溶媒中で実施されてもよいし、または、２種以上の溶媒の混合物中で実施されてもよい。 Note that the reactions or steps described herein can be carried out in a suitable solvent. Appropriate solvents can be readily selected by those skilled in the art. A suitable solvent is one in which the reactions or processes described herein are substantially non-reactive with the reactants, intermediates and/or products at the temperatures described above at which the reactions are carried out. Additionally, the reactions or steps described herein may be performed in one solvent or a mixture of two or more solvents.
脂肪酸を含む原料に酵素材料を作用させる作用時間は、酵素材料に含まれるＬＯＸの含有量や反応温度に応じて適時設定すればよいが、例えば、０．５～１４４時間が好ましい。０．５時間より作用時間が短いとＬＯＸによる酸化反応が進まない恐れがある。酵素材料の作用時間が７２時間より長くなると、副反応が起こりやすくなる。より好ましくは、酵素材料の作用時間が０．５～７２時間程度であることが望ましい。さらに、２４～７２時間であることが望ましい。 The action time for the enzyme material to act on the fatty acid-containing raw material may be appropriately set depending on the LOX content contained in the enzyme material and the reaction temperature, and is preferably 0.5 to 144 hours, for example. If the action time is shorter than 0.5 hours, the oxidation reaction by LOX may not proceed. When the action time of the enzyme material is longer than 72 hours, side reactions are likely to occur. More preferably, the action time of the enzyme material is about 0.5 to 72 hours. Furthermore, it is desirable that the time be 24 to 72 hours.
ＬＯＸを含む酵素材料を作用させる反応は、ｐＨ６～１２程度の範囲内で行われ得る。ｐＨ６未満またはｐＨ１２超過では、反応溶液中で、酵素材料に含まれるＬＯＸが失活および／または変性する恐れがある。特には、ＬＯＸを含む酵素材料を作用させる反応がｐＨ９～１２の条件下で行われることが好ましい。さらに、ｐＨ１０～１２の条件下でＬＯＸの失活を行うことが好ましい。このような範囲内のｐＨであると、原料に含まれるリノール酸が乳化し易く、反応が進みやすい場合がある。反応におけるｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を用いて行うことができ、例えば、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムもしくはリン酸水素カリウムなどのカリウム塩、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムもしくはリン酸水素ナトリウムなどのナトリウム塩、トリエチルアミンなどのアミン類、または、アンモニアなどを用いて行うことができる。 The reaction in which the enzyme material containing LOX acts can be carried out within a pH range of approximately 6 to 12. If the pH is less than 6 or more than 12, LOX contained in the enzyme material may be deactivated and/or denatured in the reaction solution. In particular, it is preferable that the reaction in which the enzyme material containing LOX acts is carried out under conditions of pH 9 to 12. Furthermore, it is preferable to deactivate LOX under conditions of pH 10 to 12. If the pH is within such a range, the linoleic acid contained in the raw material may be easily emulsified, and the reaction may be likely to proceed. The pH in the reaction can be adjusted using a known pH adjuster, such as potassium salts such as potassium hydroxide, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, or potassium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, sodium carbonate, and potassium carbonate. This can be carried out using sodium salts such as sodium hydrogen or sodium hydrogen phosphate, amines such as triethylamine, or ammonia.
上述の脂肪酸を含む原料とリポキシゲナーゼを含む酵素材料との反応により、脂肪酸に酸素分子が添加されて、過酸化脂質および／または水酸化脂肪酸が生成される。本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法では続いて、脂肪酸を含む原料とリポキシゲナーゼを含む酵素材料との反応によって得られた反応混合物中においてリポキシゲナーゼの酵素反応が停止される。 Oxygen molecules are added to the fatty acids through the reaction of the above-mentioned fatty acid-containing raw material and the lipoxygenase-containing enzyme material to produce peroxidized lipids and/or hydroxylated fatty acids. In the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention, the enzymatic reaction of lipoxygenase is then stopped in the reaction mixture obtained by the reaction of the fatty acid-containing raw material and the lipoxygenase-containing enzyme material.
リポキシゲナーゼの酵素反応の停止は、特に限定されないが、例えば、リポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることによって行われ得る。リポキシゲナーゼの酵素活性の失活方法としては、加熱処理によるリポキシゲナーゼ活性の失活処理、ｐＨ調整によるリポキシゲナーゼ活性の失活処理などが挙げられる。リポキシゲナーゼの酵素反応の停止は、また、リポキシゲナーゼを例えば限外ろ過またはゲルろ過などにより反応混合物から除去することでもできるし、または担体表面に酵素を吸着、結合もしくはゲル内に含包させたいわゆる固定化酵素を用いてカラムなどの反応塔を通せばリポキシゲナーゼは自然と反応系から除去される。または、リポキシゲナーゼと相互に作用して選択的にリポキシゲナーゼの反応を阻害する阻害剤などの試薬を反応混合物に添加することにより実施されてもよい。すなわち、本明細書中、広義の意味において、リポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることのみならず、リポキシゲナーゼの酵素活性を阻害することおよびリポキシゲナーゼを除去することもリポキシゲナーゼの酵素反応を停止させることに含まれるものとする。 The enzymatic reaction of lipoxygenase can be stopped by, for example, deactivating the enzymatic activity of lipoxygenase, although it is not particularly limited. Examples of methods for deactivating the enzymatic activity of lipoxygenase include deactivation of lipoxygenase activity by heat treatment and deactivation of lipoxygenase activity by pH adjustment. Termination of the enzymatic reaction of lipoxygenase can also be achieved by removing the lipoxygenase from the reaction mixture, for example by ultrafiltration or gel filtration, or by adsorbing, binding or encapsulating the enzyme on the surface of a carrier, so-called immobilization. Lipoxygenase is naturally removed from the reaction system by passing it through a reaction tower such as a column using enzyme. Alternatively, it may be carried out by adding to the reaction mixture a reagent such as an inhibitor that interacts with lipoxygenase and selectively inhibits the lipoxygenase reaction. That is, in the present specification, in a broad sense, stopping the enzymatic reaction of lipoxygenase includes not only inactivating the enzymatic activity of lipoxygenase, but also inhibiting the enzymatic activity of lipoxygenase and removing lipoxygenase. shall be provided.
本発明のいくつかの実施形態において、リポキシゲナーゼの酵素反応の停止は、反応混合物を加熱処理することによってリポキシゲナーゼ活性を失活させることにより実施され得る。加熱処理による失活は、簡便な制御で、また大量に製造する場合でも効率よく行うことができる点から特に好ましい。加熱処理の加熱温度と保持時間は、リポキシゲナーゼが十分に失活できる条件に適宜設定することができる。例えば加熱温度としては、７０℃以上が好ましい。より短時間でリポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることが好ましい場合には、加熱温度を９０℃以上とすることが望ましい。加熱温度の上限値は特に規定されないが、反応混合物中の溶媒が揮発しすぎない程度の温度が好ましく、例えば一般的なオートクレーブ処理における温度（１２０～１４０℃）程度とすることができる。この程度の温度でリポキシゲナーゼの酵素反応の停止工程を行うことにより、例えば、製造したケトオクタデカジエン酸が食品や医薬品用途に用いられる場合、リポキシゲナーゼ活性の失活と同時に生成物が加熱殺菌されるため、特に好ましい場合がある。保持時間、すなわちリポキシゲナーゼの失活処理時間は特に規定されないが、一般的には、５分以上とすることができ、好ましくは１０分以上が望ましい。 In some embodiments of the invention, termination of the lipoxygenase enzymatic reaction may be performed by inactivating lipoxygenase activity by heat treating the reaction mixture. Deactivation by heat treatment is particularly preferred because it can be easily controlled and efficiently performed even when produced in large quantities. The heating temperature and holding time of the heat treatment can be appropriately set to conditions that can sufficiently deactivate lipoxygenase. For example, the heating temperature is preferably 70°C or higher. If it is preferable to deactivate the enzyme activity of lipoxygenase in a shorter time, it is desirable to set the heating temperature to 90° C. or higher. The upper limit of the heating temperature is not particularly defined, but it is preferably a temperature at which the solvent in the reaction mixture does not volatilize too much, and can be, for example, about the temperature (120 to 140° C.) in general autoclave treatment. By performing the step of stopping the enzymatic reaction of lipoxygenase at this temperature, for example, when the manufactured ketooctadecadienoic acid is used for food or pharmaceutical purposes, the product is heat sterilized at the same time as the lipoxygenase activity is deactivated. Therefore, it may be particularly preferable. The holding time, that is, the lipoxygenase deactivation treatment time is not particularly defined, but generally it can be 5 minutes or more, preferably 10 minutes or more.
リポキシゲナーゼ活性の失活が、ｐＨ調整により行われる場合、反応混合物のｐＨが、ｐＨ６未満またはｐＨ１２超に調整される。ｐＨの調整は、上述のような公知のｐＨ調整剤を用いて行うことができる。 When deactivation of lipoxygenase activity is carried out by pH adjustment, the pH of the reaction mixture is adjusted to below pH 6 or above pH 12. The pH can be adjusted using a known pH adjuster such as those described above.
本発明のいくつかの実施形態において、阻害剤などの試薬を反応混合物に添加してリポキシゲナーゼの酵素活性を阻害することによりリポキシゲナーゼの酵素反応が停止される。リポキシゲナーゼ阻害剤としては、例えば、Ｎ－ヒドロキシウレア誘導体、レドックス阻害剤、および非レドックス阻害剤などが含まれ、一例として、これらに限定される訳ではないが、Ｎ－［１－ベンゾ［ｂ］チエン－２－イルエチル］－Ｎ－ヒドロキシウレア（ジロートン）、１－［４－［５－（４－フルオロフェノキシ）－２－フリル］ブト－３－イン－２－イル］－１－ヒドロキシ－ウレア、テトラヒドロ－４－［３－［［４－（２－メチル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル)フェニル]チオ]フェニル）－２Ｈ－ピラン-4-カルボキサミド（ＣＪ－１３６１０）、２－（１２－ヒドロキシドデカ－５，１０－ジイニル）－３，５，６－トリメチル－シクロヘキサ－２，５－ジエン－１，４－ジオン（ドセベノン）、６－［［３－フルオロ－５－（４－メトキシオキサン－４－イル）フェノキシ］メチル］－１－メチル－キノリン－２－オン（ＺＤ２１３８）等が挙げられる。 In some embodiments of the invention, the enzymatic reaction of lipoxygenase is stopped by adding a reagent, such as an inhibitor, to the reaction mixture to inhibit the enzymatic activity of lipoxygenase. Lipoxygenase inhibitors include, for example, N-hydroxyurea derivatives, redox inhibitors, and non-redox inhibitors, including, by way of example and not limitation, N-[1-benzo[b] thien-2-ylethyl]-N-hydroxyurea (zileuton), 1-[4-[5-(4-fluorophenoxy)-2-furyl]but-3-yn-2-yl]-1-hydroxy-urea , tetrahydro-4-[3-[[4-(2-methyl-1H-imidazol-1-yl)phenyl]thio]phenyl)-2H-pyran-4-carboxamide (CJ-13610), 2-(12- hydroxydodeca-5,10-diynyl)-3,5,6-trimethyl-cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione (docebenone), 6-[[3-fluoro-5-(4-methoxyoxy San-4-yl)phenoxy]methyl]-1-methyl-quinolin-2-one (ZD2138) and the like.
本発明のいくつかの実施形態において、続いて、脱水素化反応を行うため、リポキシゲナーゼの酵素反応が停止された後、得られた生成物に脱水素酵素が作用される。これにより、ケトオクタデカジエン酸が製造される。ここで使用される脱水素酵素としては、上記の過酸化脂質や水酸化脂肪酸を基質として利用し、脂肪酸のオキソ誘導体に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、好ましくはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）である。また、酵素の由来は特に制限されない。キュウリなどの植物由来のＡＤＨまたは酵母などの微生物由来のＡＤＨが使用されてもよく、さらに、動物由来のＡＤＨが使用されてもよい。また、遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたＡＤＨあるいは化学的に合成されたＡＤＨが使用されてもよい。さらには、市販品のＡＤＨを利用することもできる。より反応を効率的に進めるためには植物または酵母由来から精製されたものを使うことができる。 In some embodiments of the invention, a dehydrogenase is subsequently applied to the resulting product after the enzymatic reaction of lipoxygenase has been stopped to perform a dehydrogenation reaction. This produces ketooctadecadienoic acid. The dehydrogenase used here is not particularly limited as long as it is an enzyme that can convert the above-mentioned lipid peroxides and hydroxylated fatty acids into oxo derivatives of fatty acids as a substrate. enzyme (ADH). Furthermore, the origin of the enzyme is not particularly limited. ADH derived from plants such as cucumber or ADH derived from microorganisms such as yeast may be used, and ADH derived from animals may also be used. Furthermore, ADH produced as a recombinant by genetic engineering techniques or chemically synthesized ADH may be used. Furthermore, commercially available ADH can also be used. In order to proceed with the reaction more efficiently, those purified from plants or yeast can be used.
本発明のいくつかの実施形態において、脱水素酵素を作用させる工程は、補因子の存在下で行われることが好ましい。補因子は、リポキシゲナーゼの酵素反応が停止される工程を経て得られる生成物に添加され得る。補因子はまた、酵素と共に混合物として、生成物に添加されてもよい。補因子は、脱水素酵素の種類に応じて、選択することができる。補因子の例は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などを含むことができるが、これらに限定されない。好ましくは、補因子はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）である。補因子の添加濃度は、脱水素化反応が効率良く進む程度の濃度であればよい。 In some embodiments of the invention, it is preferred that the step of acting the dehydrogenase is performed in the presence of a cofactor. Cofactors can be added to the product obtained through a step in which the enzymatic reaction of lipoxygenase is stopped. Cofactors may also be added to the product as a mixture with the enzyme. Cofactors can be selected depending on the type of dehydrogenase. Examples of cofactors can include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ), flavin adenine dinucleotide (FAD), flavin mononucleotide (FMN), etc. Not limited to these. Preferably, the cofactor is nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ). The concentration of the cofactor to be added may be such that the dehydrogenation reaction proceeds efficiently.
ＡＤＨの使用量は、使用する原料に応じて、適宜選択され得るが、例えば、原料に含まれるリノール酸１０ｇに対し、精製した酵素換算で、１０～１５０００ユニットのＡＤＨが使用されてもよい。また、１５０００ユニットより多い量のＡＤＨが使用されてもよい。２０～５０００ユニットのＡＤＨが使用されてもよく、また、１００～５００ユニットのＡＤＨが使用されてもよい。なお、本明細書において１ユニットとは、ｐＨ８．８、２５℃の条件下、１分間で、１．０μｍｏｌのエタノールをアセトアルデヒドに変換する酵素量と定義される。 The amount of ADH to be used can be appropriately selected depending on the raw material used, but for example, 10 to 15,000 units of ADH may be used in terms of purified enzyme per 10 g of linoleic acid contained in the raw material. Also, amounts of ADH greater than 15,000 units may be used. 20-5000 units of ADH may be used, and 100-500 units of ADH may be used. In this specification, 1 unit is defined as the amount of enzyme that converts 1.0 μmol of ethanol into acetaldehyde in 1 minute under conditions of pH 8.8 and 25° C.
ＡＤＨを作用させる作用温度は、使用する原料に応じて適宜設定することができるが、０～５０℃であることが好ましい。０℃未満では溶媒が凍ってしまい、反応が進行しない恐れがある。また、５０℃より高い温度ではＡＤＨ酵素がすぐに失活してしまう。より好ましくは、１０℃以上、４０℃以下であり得る。 The temperature at which ADH acts can be appropriately set depending on the raw material used, but is preferably 0 to 50°C. If the temperature is below 0°C, the solvent may freeze and the reaction may not proceed. Furthermore, at temperatures higher than 50°C, the ADH enzyme is quickly deactivated. More preferably, the temperature may be 10°C or higher and 40°C or lower.
ＡＤＨを作用させる作用時間は、反応温度等に応じて適時設定され得るが、例えば、１～７２時間程度が好ましい。反応効率の観点からは、ＡＤＨの作用時間は、２４時間程度で十分である。 The action time for ADH can be set appropriately depending on the reaction temperature, etc., but is preferably about 1 to 72 hours, for example. From the viewpoint of reaction efficiency, about 24 hours is sufficient for the action time of ADH.
ＡＤＨを作用させる反応は、好ましくは、ｐＨ６～１２程度の範囲内で行われ得る。ｐＨ６未満またはｐＨ１２超過では、ＡＤＨが失活および／または変性する恐れがある。特には、ｐＨ８～１２の条件下で行われることが好ましい。したがって、ＬＯＸを含む酵素材料を作用させる工程と同程度のｐＨ条件とすることができ、この場合、ＡＤＨを作用させる工程においてｐＨを再度調整する必要がないため、好ましい。反応におけるｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を用いて行うことができ、例えば、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムまたはリン酸水素カリウムなどのカリウム塩、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムもしくはリン酸水素ナトリウムなどのナトリウム塩、トリエチルアミンなどのアミン類、または、アンモニアなどを用いて行うことができる。 The reaction in which ADH acts can preferably be carried out within a pH range of approximately 6 to 12. If the pH is less than 6 or more than 12, ADH may be deactivated and/or denatured. In particular, it is preferable to carry out the reaction under conditions of pH 8 to 12. Therefore, the pH conditions can be the same as in the step of acting with an enzyme material containing LOX, and in this case, it is preferable because there is no need to readjust the pH in the step of acting with ADH. Adjustment of the pH in the reaction can be carried out using a known pH adjuster, for example, potassium salts such as potassium hydroxide, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate or potassium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, sodium carbonate, carbonate, etc. This can be carried out using sodium salts such as sodium hydrogen or sodium hydrogen phosphate, amines such as triethylamine, or ammonia.
リポキシゲナーゼの酵素反応が停止された工程後の生成物にＡＤＨを作用させることにより、先にリポキシゲナーゼとの反応によって生成された、脂肪酸のリポキシゲナーゼ代謝物である過酸化脂質や水酸化脂肪酸がケトオクタデカジエン酸に変換される。したがって、本実施形態の製造方法によれば、副生成物の生成が顕著に抑制され、ケトオクタデカジエン酸を安定して製造することができる。 By acting ADH on the product after the step in which the enzymatic reaction of lipoxygenase has been stopped, lipid peroxide and hydroxylated fatty acid, which are lipoxygenase metabolites of fatty acids produced by the reaction with lipoxygenase, are converted into ketooctadecase. Converted to dienoic acid. Therefore, according to the production method of this embodiment, the production of by-products is significantly suppressed, and ketooctadecadienoic acid can be stably produced.
本発明の実施形態においてはＨＰＯＤＥが生成した後に加熱処理を行うことによりＬＯＸを失活させて、引き続き加熱処理を行うことによりケトオクタデカジエン酸を得ることもできる。この場合、脂肪酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させてのち０．５～２４時間以内に加熱処理を行い、その加熱処理時間は１０分以上、好ましくは３０分以上が望ましい。 In an embodiment of the present invention, it is also possible to deactivate LOX by performing heat treatment after HPODE is generated, and then to obtain ketooctadecadienoic acid by subsequently performing heat treatment. In this case, heat treatment is performed within 0.5 to 24 hours after the enzyme material containing lipoxygenase is applied to the raw material containing fatty acids, and the heat treatment time is desirably 10 minutes or more, preferably 30 minutes or more.
本明細書に記載の工程は、当該技術分野で知られている適切な分析方法に従ってモニターすることができる。生成物の生成は、種々の分光手段によって、またはクロマトグラフィーによって、モニターされ得る。本発明の製造方法によれば、リノール酸を含む原料から、ケトオクタデカジエン酸の中でも、特に、９－オキソ－１０，１２－オクタデカジエン酸（９－ｏｘｏＯＤＡ）および１３－オキソ－９，１１－オクタデカジエン酸（１３－ｏｘｏＯＤＡ）が生成する。９－ｏｘｏＯＤＡや１３－ｏｘｏＯＤＡなどの生成は、例えば、ＬＣ－ＭＳなどの分析手段により確認され得、また、その濃度も定量的に分析され得る。よって、リノール酸からの生成物の変換収率、いわゆる収率が算出される。 The processes described herein can be monitored according to appropriate analytical methods known in the art. Product formation can be monitored by various spectroscopic means or by chromatography. According to the production method of the present invention, from a raw material containing linoleic acid, 9-oxo-10,12-octadecadienoic acid (9-oxoODA) and 13-oxo-9, 11-octadecadienoic acid (13-oxoODA) is produced. The production of 9-oxoODA, 13-oxoODA, etc. can be confirmed by analytical means such as LC-MS, and the concentration thereof can also be quantitatively analyzed. Thus, the conversion yield of the product from linoleic acid, the so-called yield, is calculated.
なお、ケトオクタデカジエン酸には、上述のように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｚ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）、（Ｚ，Ｚ体）など様々な異性体が存在するが、機能性成分としてのその効果はほぼ同等であり、したがって、以下の実施例に述べるケトオクタデカジエン酸の収率はこれら異性体を合算したものである。 As mentioned above, ketooctadecadienoic acid has various isomers such as (E, E form), (Z, E form), (E, Z form), and (Z, Z form). However, their effects as functional components are almost the same, and therefore the yield of ketooctadecadienoic acid described in the following examples is the sum of these isomers.
上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法は、追加で、生成したケトオクタデカジエン酸を精製する工程を含んでいてもよい。例えば、生成したケトオクタデカジエン酸は、一般的な精製方法によって、例えば、溶媒抽出後に薄層クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーによって分離精製されてもよい。精製方法および条件は、実験によって異なっていてよく、例えばクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ精製における溶離液や溶媒、固定相などは適宜選択されてよい。しかしながら、製造されたケトオクタデカジエン酸は、精製せずにケトオクタデカジエン酸を含む反応溶液そのままで、または、粗精製処理に供した、例えば溶媒抽出後に乾燥させたもの等の粗精製物で使用されてもよい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid according to the above-described embodiment may additionally include a step of purifying the produced ketooctadecadienoic acid. For example, the produced ketooctadecadienoic acid may be separated and purified by a general purification method, for example, by solvent extraction followed by thin layer chromatography or liquid chromatography. Purification methods and conditions may vary depending on the experiment; for example, eluents, solvents, stationary phases, etc. in chromatography and HPLC purification may be selected as appropriate. However, the produced ketooctadecadienoic acid can be used as a reaction solution containing ketooctadecadienoic acid without purification, or as a crude product that has been subjected to a crude purification treatment, such as a product that has been dried after solvent extraction. may be used in
上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法により製造されたケトオクタデカジエン酸の中でも、９－ｏｘｏＯＤＡ体や１３－ｏｘｏＯＤＡ体は、ＰＰＡＲα活性化作用が報告されており、脂肪燃焼作用等が期待でき（例えばKim YI, et al., Mol. Nutr. Food. Res., 55 (2011) 585.やYoung-il Kim, et al., PLoSONE, 7 (2012) 2）、例えば肥満や脂質代謝異常、インスリン抵抗性を原因とした糖尿病や、高脂血症、動脈硬化、心疾患の予防や改善に用いることができる。例えば実用に供するのはサプリメントや食品、機能性食品、化粧品等に添加して用いることができる。 Among the ketooctadecadienoic acids produced by the method for producing ketooctadecadienoic acid according to the above-described embodiment, 9-oxoODA and 13-oxoODA are reported to have a PPARα activation effect and have a fat burning effect. etc. (e.g. Kim YI, et al., Mol. Nutr. Food. Res., 55 (2011) 585. and Young-il Kim, et al., PLoSONE, 7 (2012) 2), such as obesity and It can be used to prevent or improve diabetes caused by abnormal lipid metabolism and insulin resistance, hyperlipidemia, arteriosclerosis, and heart disease. For example, for practical use, it can be added to supplements, foods, functional foods, cosmetics, etc.
また、本発明者らは、ケトオクタデカジエン酸を植物に作用させることで強力な抵抗性誘導効果を示す植物賦活剤として利用できることを見出しており、さまざまな植物の成長促進効果や果実の収量増加効果、病害抑制効果を示すことを知見している。例えば病害抑制に関して効果のある具体的な例としては、キュウリ、スイカ、メロン、カボチャなどウリ科の葉の灰色カビ病、つる割れ病、つる枯病、ベト病、トマト、ナス、ジャガイモなどナス科の青枯れ病、萎凋病、半身萎凋病、立枯病、褐色根腐病、バラやイチゴなどバラ科植物のうどん粉病、黒星病、灰色カビ病、炭疽病、ホウレンソウなどヒユ科のベト病、ハクサイ、キャベツ、コマツナなどアブラナ科の黒腐病、軟腐病、斑点細菌病、リゾクトニア病、ニンジンなどセリ科の白絹病、イネ科植物のいもち病などに有効である。 In addition, the present inventors have discovered that ketooctadecadienoic acid can be used as a plant activator that exhibits a strong resistance-inducing effect by acting on plants, and has various effects on promoting growth and improving fruit yield. It is known that it has an increasing effect and a disease suppressing effect. For example, specific examples of effective disease control include gray mold on the leaves of cucurbits, such as cucumbers, watermelons, melons, and pumpkins; bacterial wilt, wilt, half-wilt, damping-off, brown root rot, powdery mildew of plants of the Rosaceae family, such as roses and strawberries, scab, gray mold, anthracnose, downy mildew of plants of the Amaranthaceae family, such as spinach, It is effective against black rot, soft rot, bacterial spot disease, Rhizoctonia disease in Brassicaceae such as Chinese cabbage, cabbage, and komatsuna, white silk disease in Apiaceae such as carrots, and blast in Poaceae plants.
上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法によれば、二つの異なる酵素を使用して、ケトオクタデカジエン酸が簡便に、安定的かつ効率的に製造され得る。これまで供給が難しかったケトオクタデカジエン酸を十分な収率で製造できるため、ケトオクタデカジエン酸の生理活性解析や産業利用への応用が期待できる。さらに、金属の添加を必要とすることなしに、ケトオクタデカジエン酸を安定して製造することができるため製造されたケトオクタデカジエン酸が様々な分野で安全に使用できる点でも本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法は有用であり、得られたケトオクタデカジエン酸は、機能性食品、医薬品、化粧品、植物賦活剤等の原料として特に適している。 According to the method for producing ketooctadecadienoic acid according to the embodiment described above, ketooctadecadienoic acid can be produced simply, stably, and efficiently using two different enzymes. Since it is possible to produce ketooctadecadienoic acid, which has been difficult to supply until now, with a sufficient yield, it is expected that it will be useful for analyzing the physiological activity of ketooctadecadienoic acid and for industrial use. Furthermore, the present invention also has the advantage that ketooctadecadienoic acid can be stably produced without the need for the addition of metals, and thus the produced ketooctadecadienoic acid can be used safely in various fields. The method for producing ketooctadecadienoic acid is useful, and the obtained ketooctadecadienoic acid is particularly suitable as a raw material for functional foods, pharmaceuticals, cosmetics, plant activators, and the like.
また、上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法によれば、二つの異なる酵素を独立して順次反応させれば室温で効率よくケトオクタデカジエン酸を製造でき、特別な温度調節装置や温度調節が必須ではないため、製造における省力化・省資源化・省エネルギー化、ひいては製造コストの削減が達成され得ると考えられる。 Further, according to the method for producing ketooctadecadienoic acid according to the embodiment described above, ketooctadecadienoic acid can be efficiently produced at room temperature by independently and sequentially reacting two different enzymes, and special temperature control is required. Since equipment and temperature control are not essential, it is thought that labor-saving, resource-saving, and energy-saving in manufacturing, as well as a reduction in manufacturing costs, can be achieved.
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。 Although the present invention will be explained based on examples, the present invention is not limited to the examples only.
ケトオクタデカジエン酸の製造
・実施例１
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）２．８ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）７．０ｇ、および、蒸留水３００ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の試験溶液のｐＨは１１であった。
Production of ketooctadecadienoic acid/Example 1
As a raw material containing fatty acids, 2.8 g of linoleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a purity of 80% was used, and 7.0 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 300 mL of distilled water were added to this. In addition, test solutions were prepared. The pH of the test solution at this time was 11.
試験溶液にリポキシゲナーゼ（シグマアルドリッチ社製、Glycine max由来）を０．２ｍｇ添加し、３０℃で３６時間反応させたのち、反応混合物を９０℃の湯浴中に５分間置いて、酵素を失活させた。反応溶液を室温に戻した後に、アルコール脱水素酵素（和光純薬工業株式会社製、Yeast由来）を０．２ｍｇ添加し、３０℃にてさらに２４時間反応させた。 Add 0.2 mg of lipoxygenase (manufactured by Sigma-Aldrich, derived from Glycine max) to the test solution, react at 30°C for 36 hours, and then place the reaction mixture in a 90°C water bath for 5 minutes to inactivate the enzyme. I let it happen. After the reaction solution was returned to room temperature, 0.2 mg of alcohol dehydrogenase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from Yeast) was added, and the reaction solution was further reacted at 30° C. for 24 hours.
反応終了後の試験溶液中の生成物を、標準物質としてケイマンケミカル社製の１３－ｏｘｏＯＤＡを用いて、ＭＳ2スペクトル解析を用いてＬＣ－ＭＳにて同定した。また、検出波長 ＵＶ ２７２ｎｍで、絶対検量線法により定量を行った。また９－ｏｘｏＯＤＡは、１３－ｏｘｏＯＤＡの吸光度を参考にして定量した。 The product in the test solution after the completion of the reaction was identified by LC-MS using MS 2 spectrum analysis using 13-oxoODA manufactured by Cayman Chemical Co. as a standard substance. Further, quantification was performed using an absolute calibration curve method at a detection wavelength of UV 272 nm. Furthermore, 9-oxoODA was quantified with reference to the absorbance of 13-oxoODA.
（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、表１に示されるように、収率５．４％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は１０．９％であった。なお、収率（％）は以下の式に基づいて求めた。
収率（％）＝（生成した１３－ｏｘｏＯＤＡまたは９－ｏｘｏＯＤＡのｗｔ％）/（使用した原料リノール酸の初期ｗｔ％）
As shown in Table 1 as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form), 13-oxoODA was obtained in a yield of 5.4%. At this time, the yield of 9-oxoODA was 10.9%. Note that the yield (%) was determined based on the following formula.
Yield (%) = (wt% of generated 13-oxoODA or 9-oxoODA)/(initial wt% of raw material linoleic acid used)
・実施例２
試験溶液のリポキシゲナーゼとの反応時間を、３６時間に替えて、２４時間にしたこと以外は実施例１と同様に操作・分析を行った。
・Example 2
The operation and analysis were performed in the same manner as in Example 1, except that the reaction time of the test solution with lipoxygenase was changed to 24 hours instead of 36 hours.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率３．５％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は３．７％であった。 As shown in Table 1, 13-oxoODA was obtained with a yield of 3.5% as a combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxoODA was 3.7%.
・実施例３
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）２．８ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）４．０ｇ、リン酸水素二カリウム（和光純薬工業株式会社製）２３．３ｇ、および、蒸留水３００ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の試験溶液のｐＨは９．０であった。
・Example 3
As a raw material containing fatty acids, 2.8 g of linoleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a purity of 80% was used, and 4.0 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and dipotassium hydrogen phosphate ( A test solution was prepared by adding 23.3 g (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 300 mL of distilled water. The pH of the test solution at this time was 9.0.
試験溶液にリポキシゲナーゼ（シグマアルドリッチ社製、Glycine max由来）を０．４ｍｇ添加し、１５℃で３時間反応させたのち、反応混合物を９０℃の湯浴中に９０分間置いて、酵素を失活させた。反応終了後の生成物に対して、実施例１と同様に操作・分析を行った。 Add 0.4 mg of lipoxygenase (manufactured by Sigma-Aldrich, derived from Glycine max) to the test solution, react at 15°C for 3 hours, and then place the reaction mixture in a 90°C water bath for 90 minutes to inactivate the enzyme. I let it happen. The product after the completion of the reaction was operated and analyzed in the same manner as in Example 1.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．６％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は１．２％であった。 As shown in Table 1, 13-oxoODA was obtained with a yield of 2.6% as a combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxoODA was 1.2%.
・比較例１
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）０．１ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）０．２３ｇ、および、蒸留水１０ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の溶液のｐＨは１１であった。
・Comparative example 1
As a raw material containing fatty acids, 0.1 g of linoleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a purity of 80% was used, and 0.23 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 10 mL of distilled water were added to this. In addition, test solutions were prepared. The pH of the solution at this time was 11.
試験溶液にリポキシゲナーゼ（シグマアルドリッチ社製、Glycine max由来）およびアルコール脱水素酵素（和光純薬工業株式会社製、Yeast由来）を、同時に、それぞれ０．０４ｍｇ添加し、５℃で２４時間反応させた。反応終了後の試験溶液中の生成物を、実施例１と同様に分析し、定量を行った。 Lipoxygenase (manufactured by Sigma-Aldrich, derived from Glycine max) and alcohol dehydrogenase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from Yeast) were added at the same time to the test solution in an amount of 0.04 mg each, and the mixture was allowed to react at 5°C for 24 hours. . The product in the test solution after the completion of the reaction was analyzed and quantified in the same manner as in Example 1.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．２％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は０．０２％であった。 As shown in Table 1, 13-oxoODA was obtained with a yield of 2.2% as a combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxoODA was 0.02%.
・比較例２
反応温度を、５℃に替えて、３０℃にしたこと以外は比較例１と同様に操作・分析を行った。
・Comparative example 2
The operation and analysis were performed in the same manner as in Comparative Example 1 except that the reaction temperature was changed to 30°C instead of 5°C.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．２％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は０．３７％であった。 As shown in Table 1, 13-oxoODA was obtained with a yield of 2.2% as a combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxoODA was 0.37%.
・比較例３
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）０．２８ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）０．１５ｇ、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）０．０５ｇ、および、蒸留水１０ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の溶液のｐＨは１０．２であった。
・Comparative example 3
As a raw material containing fatty acids, 0.28 g of linoleic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a purity of 80% was used, along with 0.15 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and sodium hydrogen carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A test solution was prepared by adding 0.05 g (manufactured by Yaku Kogyo Co., Ltd.) and 10 mL of distilled water. The pH of the solution at this time was 10.2.
試験溶液に大豆粉末（品種：フクユタカ）０．２ｇおよびＭｎ含有酵母（５％、メディエンス社製）０．１ｇを添加し、５℃で２４時間反応させた。反応終了後の試験溶液中の生成物を、実施例１と同様に分析し、定量を行った。 0.2 g of soybean powder (variety: Fukuyutaka) and 0.1 g of Mn-containing yeast (5%, manufactured by Medience) were added to the test solution, and the mixture was reacted at 5° C. for 24 hours. The product in the test solution after the completion of the reaction was analyzed and quantified in the same manner as in Example 1.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．９％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は０．５％であった。 As shown in Table 1, 13-oxoODA was obtained with a yield of 2.9% as a combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxoODA was 0.5%.
・比較例４
反応温度を、５℃に替えて、３０℃にしたこと以外は比較例５と同様に操作・分析を行った。
・Comparative example 4
The operation and analysis were performed in the same manner as in Comparative Example 5, except that the reaction temperature was changed to 30°C instead of 5°C.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率１．９％の１３－ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９－ｏｘｏＯＤＡの収率は１．１％であった。 As shown in Table 1, 13-oxoODA was obtained with a yield of 1.9% as a combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxoODA was 1.1%.
表１に示されるように、実施例１～３のケトオクタデカジエン酸の収率は、比較例１～４におけるケトオクタデカジエン酸の収率よりもはるかに高いものであった。したがって、本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法が高収率でケトオクタデカジエン酸を生成するという顕著に優れた効果を有していることがわかる。 As shown in Table 1, the yields of ketooctadecadienoic acid in Examples 1 to 3 were much higher than those in Comparative Examples 1 to 4. Therefore, it can be seen that the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention has a remarkable effect of producing ketooctadecadienoic acid in high yield.
なお、比較例３および４で用いた大豆粉末には、リポキシゲナーゼとアルコール脱水素酵素との両方が含まれていると考えられるため、比較例３および４の結果は、リポキシゲナーゼおよびアルコール脱水素酵素の同時添加と同等の条件下で得られているものと考えられる。比較例３および４では、この大豆粉末に加え、さらに、金属を供給するＭｎ含有酵母が試験溶液に添加されている。すなわち、比較例３および４では、金属触媒が寄与するケトオクタデカジエン酸の生成反応促進効果も付与されているにもかかわらず、比較例３および４の収率は、実施例１～３と比較して低いものにすぎない。この結果からも、本発明の製造方法が、リノール酸からのケトオクタデカジエン酸の変換収率において優れた効果を有していることがわかる。 In addition, since the soybean powder used in Comparative Examples 3 and 4 is thought to contain both lipoxygenase and alcohol dehydrogenase, the results of Comparative Examples 3 and 4 are based on the content of lipoxygenase and alcohol dehydrogenase. It is thought that this was obtained under the same conditions as simultaneous addition. In Comparative Examples 3 and 4, in addition to this soybean powder, Mn-containing yeast that supplies metals was also added to the test solution. That is, in Comparative Examples 3 and 4, although the metal catalyst contributed to the effect of promoting the production reaction of ketooctadecadienoic acid, the yields of Comparative Examples 3 and 4 were lower than those of Examples 1 to 3. It's just low in comparison. This result also shows that the production method of the present invention has an excellent effect on the conversion yield of ketooctadecadienoic acid from linoleic acid.
Claims (18)
（ｂ）工程（ａ）で得られた反応混合物に含まれる前記リポキシゲナーゼの酵素反応を停止させる工程
を含む、ケトオクタデカジエン酸の製造方法。 (a) a step of causing an enzyme material containing lipoxygenase to act on a raw material containing a fatty acid; and (b) a step of stopping the enzymatic reaction of the lipoxygenase contained in the reaction mixture obtained in step (a). Method for producing dienic acid.
（ｃ）前記工程（ｂ）を経て得られた生成物に脱水素酵素を作用させる工程
を含む請求項１記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法。 moreover,
The method for producing ketooctadecadienoic acid according to claim 1, comprising the step of (c) allowing a dehydrogenase to act on the product obtained through the step (b).
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