JP2020025534A - Ketooctadecadienoic acid production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ケトオクタデカジエン酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing ketooctadecadienoic acid.
近年、リノール酸やオレイン酸を酵素やその他の手段を用いて反応させて得られる水酸化脂肪酸やオキソ脂肪酸などが、いわゆる希少脂肪酸として注目されている。これら希少脂肪酸は、人々の健康、医療への関心の高まりと共に、特にその生理活性などの様々な産業利用への応用という点から期待されている。中でもリノール酸のオキソ誘導体であるケトオクタデカジエン酸の一種である１３−オキソ−オクタデカジエン酸や９−オキソ−オクタデカジエン酸は、脂質代謝改善等の生活習慣病を改善する活性が見いだされたことから、顕著な脂肪燃焼効果を示す機能性成分として、内外で活発な研究が行われている。 In recent years, hydroxylated fatty acids and oxo fatty acids obtained by reacting linoleic acid and oleic acid using enzymes and other means have attracted attention as so-called rare fatty acids. These rare fatty acids are expected to be applied to various industrial uses such as their physiological activity, as well as increasing interest in health and medical care of people. Among them, 13-oxo-octadecadienoic acid and 9-oxo-octadecadienoic acid, which are one of ketooctadecadienoic acids, which are oxo derivatives of linoleic acid, are found to have an activity of improving lifestyle-related diseases such as improving lipid metabolism. Therefore, active research has been conducted inside and outside as a functional component showing a remarkable fat burning effect.
これらケトオクタデカジエン酸は、以前よりトマトの中に含有されていることが知られているが、その含有量は約１ｎｇ／ｍｇ程度までとごく微量であり、食品または医薬品の有効成分として利用するために十分な供給源とはなり得ない。したがって、より高い含有量でケトオクタデカジエン酸を含有する供給源や、より効率的なケトオクタジエン酸の合成が望まれていた。 It has been known that these ketooctadecadienoic acids have been contained in tomatoes for a long time, but the content is very small, up to about 1 ng / mg, and is used as an active ingredient in foods or pharmaceuticals. It cannot be a sufficient source to do so. Therefore, a source containing ketooctadecadienoic acid at a higher content and more efficient synthesis of ketooctadienoic acid have been desired.
例えば、特許文献１には、ケトオクタデカジエン酸の合成方法として、マンガン、亜鉛、鉄、銅またはマグネシウムなどの金属の存在下、且つ２０℃未満の温度で、リノール酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させる工程を備える、ケトオクタデカジエン酸の製造方法が記載されている。 For example, in Patent Document 1, as a method for synthesizing ketooctadecadienoic acid, lipoxygenase is used as a raw material containing linoleic acid in the presence of a metal such as manganese, zinc, iron, copper, or magnesium at a temperature of less than 20 ° C. A method for producing ketooctadecadienoic acid, which comprises a step of reacting an enzyme material containing the same, is described.
特許文献１に記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法は、触媒として金属を用いるものであり、合成したケトオクタデカジエン酸を食品用途や医薬品用途に使用する場合には、生成物に金属が含有されるリスクがある。また、副生成物の生成を抑制し、収率を向上させるために、特許文献１に記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法では２０℃未満の反応温度とすることが不可欠となっており、その製造プロセスにおいて、生産設備上、温度調整において煩雑な機器・機材を必要とするものであった。 The method for producing ketooctadecadienoic acid described in Patent Literature 1 uses a metal as a catalyst, and when the synthesized ketooctadecadienoic acid is used for food or pharmaceutical use, the product contains metal. There is a risk of being included. In addition, in order to suppress the generation of by-products and improve the yield, in the method for producing ketooctadecadienoic acid described in Patent Document 1, a reaction temperature of less than 20 ° C. is indispensable, In the manufacturing process, complicated equipment and equipment are required for temperature adjustment in production equipment.
また、特許文献１に記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法では、酵素としてリポキシゲナーゼが使用されている。使用する酵素として、このリポキシゲナーゼとともにデヒドロゲナーゼの添加も示唆されているが、リポキシゲナーゼ自体が脂肪酸の反応を顕著に促進する酵素であるため、特に２０℃以上の反応温度では、リポキシゲナーゼにより過酸化物が大量に生成され、生成したケトオクタデカン酸をさらに酸化させてしまう。このため、目的物質であるケトオクタデカン酸の最終的な収率が低下してしまうという問題がある。酵素を使用して安全にかつ安定的に、効率良くケトオクタデカジエン酸を合成するケトオクタデカジエン酸の製造方法が求められている。 In the method for producing ketooctadecadienoic acid described in Patent Document 1, lipoxygenase is used as an enzyme. As an enzyme to be used, the addition of dehydrogenase together with this lipoxygenase has been suggested, but since lipoxygenase itself is an enzyme that significantly promotes the reaction of fatty acids, particularly at a reaction temperature of 20 ° C or higher, a large amount of peroxide is produced by lipoxygenase. The ketooctadecanoic acid produced is further oxidized. For this reason, there is a problem that the final yield of ketooctadecanoic acid as a target substance is reduced. There is a need for a method for producing ketooctadecadienoic acid that uses an enzyme to safely, stably, and efficiently synthesize ketooctadecadienoic acid.
本発明は、これまで供給が難しかったケトオクタデカジエン酸を、酵素を利用して、安全にかつ安定的に、効率良く製造することのできるケトオクタデカジエン酸の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a method for producing ketooctadecadienoic acid, which has been difficult to supply until now, by using enzymes to produce ketooctadecadienoic acid safely, stably, and efficiently. Aim.
本発明は、（ａ）脂肪酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた反応混合物に含まれる前記リポキシゲナーゼの酵素反応を停止させる工程を含む、ケトオクタデカジエン酸の製造方法に関する。 The present invention includes (a) a step of causing an enzyme material containing a lipoxygenase to act on a raw material containing a fatty acid, and (b) a step of stopping the enzymatic reaction of the lipoxygenase contained in the reaction mixture obtained in the step (a). And a method for producing ketooctadecadienoic acid.
さらに、（ｃ）前記工程（ｂ）を経て得られた生成物に脱水素酵素を作用させる工程を含むケトオクタデカジエン酸の製造方法に関する。 Further, the present invention relates to a method for producing ketooctadecadienoic acid, which comprises the step of (c) reacting a dehydrogenase on the product obtained through the step (b).
前記脂肪酸を含む原料が、リノール酸を構成成分として含有する油脂を含む原料、リノール酸を含む原料、または、リノール酸であるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The raw material containing the fatty acid is preferably a raw material containing an oil or fat containing linoleic acid as a constituent component, a raw material containing linoleic acid, or a method for producing ketooctadecadienoic acid, which is linoleic acid.
前記酵素材料を作用させる工程を、１０℃以上、６０℃以下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid, in which the step of allowing the enzyme material to act is performed at a temperature of 10 ° C. or more and 60 ° C. or less, is preferred.
前記酵素材料を作用させる工程を、２０℃以上、５０℃以下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid, in which the step of allowing the enzyme material to act is performed at a temperature of 20 ° C. or more and 50 ° C. or less, is preferred.
前記酵素材料を作用させる工程において、前記酵素材料を０．５時間以上、７２時間以下作用させるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 In the step of allowing the enzyme material to act, a method for producing ketooctadecadienoic acid in which the enzyme material is allowed to act for 0.5 to 72 hours is preferable.
前記酵素反応を停止させる工程を、前記リポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid is preferably performed in which the step of stopping the enzymatic reaction is performed by inactivating the enzyme activity of the lipoxygenase.
前記失活が、加熱処理またはｐＨ調整により行われるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the deactivation is performed by heat treatment or pH adjustment is preferred.
前記加熱処理を、前記反応混合物を７０℃以上、１４０℃以下に加熱することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid, in which the heat treatment is performed by heating the reaction mixture to 70 ° C. or more and 140 ° C. or less, is preferable.
前記ｐＨ調整を、前記反応混合物をｐＨ６未満またはｐＨ１２超に調整することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid, in which the pH is adjusted by adjusting the reaction mixture to a pH lower than 6 or higher than pH 12, is preferred.
前記酵素反応を停止させる工程を、前記リポキシゲナーゼを前記反応混合物から除去することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid, wherein the step of stopping the enzymatic reaction is preferably performed by removing the lipoxygenase from the reaction mixture.
前記酵素反応を停止させる工程を、前記反応混合物に前記リポキシゲナーゼの阻害剤を添加し、前記リポキシゲナーゼの酵素活性を阻害することにより行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid is preferably performed in which the step of stopping the enzymatic reaction is performed by adding the inhibitor of the lipoxygenase to the reaction mixture and inhibiting the enzyme activity of the lipoxygenase.
前記脱水素酵素が、アルコール脱水素酵素であるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid, wherein the dehydrogenase is an alcohol dehydrogenase, is preferred.
前記脱水素酵素を作用させる工程を、補因子の存在下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid in which the step of allowing the dehydrogenase to act is preferably performed in the presence of a cofactor.
前記補因子が、ＮＡＤ+であるケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid in which the cofactor is NAD + is preferable.
前記脱水素酵素を作用させる工程を、０℃以上、５０℃以下で行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid, in which the step of allowing the dehydrogenase to act is performed at a temperature of 0 ° C or higher and 50 ° C or lower.
前記脱水素酵素を作用させる工程を、６以上、１２以下のｐＨで行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid, wherein the step of allowing the dehydrogenase to act is performed at a pH of 6 or more and 12 or less.
前記脂肪酸を含む原料に前記リポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させてのち０．５〜２４時間以内に前記加熱処理を行うケトオクタデカジエン酸の製造方法が好ましい。 A method for producing ketooctadecadienoic acid, wherein the heat treatment is performed within 0.5 to 24 hours after the enzyme material containing the lipoxygenase is allowed to act on the raw material containing the fatty acid.
本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法によれば、二つの異なる酵素を独立して順次反応させることができるため、反応収率の点から従来問題となっていた副生成物の生成量が著しく抑制され得る。したがって、効率良くケトオクタデカジエン酸を製造することができる。また、合成の温度も室温とすることができ、特に２０℃以上の反応温度でも十分な収率でケトオクタデカジエン酸を製造することができる。さらに、本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法では、特殊な金属を使用する必要がない。２種類の酵素だけが用いられるため、従来技術よりも、より簡便な方法でケトオクタデカジエン酸を製造することができる。 According to the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention, two different enzymes can be reacted independently and sequentially, so that the amount of by-products which has conventionally been a problem from the viewpoint of reaction yield is reduced. It can be significantly suppressed. Therefore, ketooctadecadienoic acid can be efficiently produced. In addition, the synthesis temperature can be set to room temperature, and ketooctadecadienoic acid can be produced with a sufficient yield even at a reaction temperature of 20 ° C. or more. Further, in the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention, it is not necessary to use a special metal. Since only two types of enzymes are used, ketooctadecadienoic acid can be produced by a simpler method than in the prior art.
ケトオクタデカジエン酸とは、特定の微生物や植物において、リノール酸の酸化的代謝によって得られる代謝物の一つである。リノール酸は、リノール酸代謝酵素の一つであるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase：ＬＯＸ）の作用により酵素的に過酸化脂質（ヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ））へと変換され、この過酸化脂質（ＨＰＯＤＥ）は、非酵素的、または、酵素的に例えばペルオキシダーゼなどによってラジカルを放出して水酸化脂肪酸であるヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）へと変換される。ヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）にアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）などの脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が作用することなどによって、脂肪酸のオキソ誘導体であるケトオクタデカジエン酸が生成される。 Ketooctadecadienoic acid is one of metabolites obtained by oxidative metabolism of linoleic acid in specific microorganisms and plants. Linoleic acid is enzymatically converted into lipid peroxide (hydroperoxyoctadecadienoic acid (HPODE)) by the action of lipoxygenase (LOX), which is one of linoleic acid metabolizing enzymes. ) Is non-enzymatically or enzymatically releases radicals by, for example, peroxidase or the like, and is converted into hydroxyoctadecadienoic acid (HODE), a hydroxylated fatty acid. By the action of dehydrogenase (dehydrogenase) such as alcohol dehydrogenase (ADH) on hydroxyoctadecadienoic acid (HODE), ketooctadecadienoic acid, which is an oxo derivative of fatty acid, is produced.
ケトオクタデカジエン酸としては、具体的には、例えば、９−オキソ−１０，１２−オクタデカジエン酸（本明細書中、９−ｏｘｏＯＤＡとも略記される。）、１３−オキソ−９，１１−オクタデカジエン酸（本明細書中、１３−ｏｘｏＯＤＡとも略記される。）、５−オキソ−６，８−オクタデカジエン酸、６−オキソ−９，１２−オクタデカジエン酸、８−オキソ−９，１２−オクタデカジエン酸、１０−オキソ−８，１２−オクタデカジエン酸、１１−オキソ−９，１２−オクタデカジエン酸、１２−オキソ−９，１３−オクタデカジエン酸および１４−オキソ−９，１２−オクタデカジエン酸等が挙げられる。なお、これら化合物に異性体が存在する場合には全ての異性体およびその混合物を含むものとする。 As the ketooctadecadienoic acid, specifically, for example, 9-oxo-10,12-octadecadienoic acid (abbreviated as 9-oxoODA in the present specification), 13-oxo-9,11. -Octadecadienoic acid (herein also abbreviated as 13-oxoODA), 5-oxo-6,8-octadecadienoic acid, 6-oxo-9,12-octadecadienoic acid, 8-oxo -9,12-octadecadienoic acid, 10-oxo-8,12-octadecadienoic acid, 11-oxo-9,12-octadecadienoic acid, 12-oxo-9,13-octadecadienoic acid and 14 -Oxo-9,12-octadecadienoic acid; When isomers exist in these compounds, all isomers and mixtures thereof are included.
本発明は、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）によって酵素的にリノール酸をヒドロペルオキシオクタデカジエン酸（ＨＰＯＤＥ）やヒドロキシオクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）に変換させたのち、ＬＯＸを失活させ、その後に必要に応じＡＤＨなどの脱水素酵素を作用させて高効率にケトオクタデカジエン酸を製造するための方法を提供する。ＬＯＸの失活はＨＰＯＤＥが生成された後でもよく、ＨＯＤＥが生成された後でもよい。以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 The present invention provides a method for enzymatically converting linoleic acid to hydroperoxyoctadecadienoic acid (HPODE) or hydroxyoctadecadienoic acid (HODE) by lipoxygenase (LOX), inactivating LOX, and then, if necessary, Provided is a method for producing ketooctadecadienoic acid with high efficiency by allowing a dehydrogenase such as ADH to act. LOX deactivation may occur after HPODE has been generated or after HODE has been generated. Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本発明のいくつかの実施形態において、ケトオクタデカジエン酸は、脂肪酸を含む原料から製造される。脂肪酸を含む原料としては、例えば、脂肪酸を構成成分として含有する油脂を含む原料、脂肪酸を含む原料、および脂肪酸などが挙げられる。好ましくは、脂肪酸を含む原料は、リノール酸を構成成分として含有する油脂を含む原料、リノール酸を含む原料、または、リノール酸である。ここで、リノール酸としては、リノール酸に限定されず、共役リノール酸であってもよく、また、リノール酸のエステル体などを含んでいてもよい。 In some embodiments of the present invention, ketooctadecadienoic acid is produced from a raw material that includes fatty acids. Examples of the raw material containing a fatty acid include a raw material containing an oil or fat containing a fatty acid as a constituent component, a raw material containing a fatty acid, and a fatty acid. Preferably, the raw material containing a fatty acid is a raw material containing an oil or fat containing linoleic acid as a constituent, a raw material containing linoleic acid, or linoleic acid. Here, the linoleic acid is not limited to linoleic acid, but may be conjugated linoleic acid, or may include an ester of linoleic acid.
リノール酸を構成成分として含有する油脂を含む原料またはリノール酸を含む原料としては、特に限定されるものではなく、例えば、植物体、動物体またはバクテリア体において、リノール酸を構成成分とする油脂を含むような原料またはリノール酸を含むような原料であれば、本実施形態の製造方法に好適に使用することができる。リノール酸を構成成分とする油脂またはリノール酸の含量が多いことが知られている、ダイズ、ヒマ、ベニバナもしくはトウモロコシなどの植物体、または、卵などの動物体を使用すれば、結果的に高収量でケトオクタデカジエン酸を生成させることができるため、このような原料を用いることが好ましい場合がある。また、上述の原料から抽出および／または精製された高純度のリノール酸を原料として用いてもよい。 Raw materials containing fats and oils containing linoleic acid as a component or raw materials containing linoleic acid are not particularly limited.For example, in plants, animals or bacteria, fats and oils containing linoleic acid as a component are used. A raw material that contains linoleic acid or a raw material that contains linoleic acid can be suitably used in the production method of the present embodiment. Use of a plant such as soybean, castor, safflower or corn, or an animal such as egg, which is known to have a high content of fats or oils containing linoleic acid or linoleic acid, results in high yield. Since ketooctadecadienoic acid can be produced in a yield, it is sometimes preferable to use such a raw material. Further, high-purity linoleic acid extracted and / or purified from the above-mentioned raw materials may be used as a raw material.
本発明のいくつかの実施形態において、ケトオクタデカジエン酸は、上述の脂肪酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させることにより製造される。リポキシゲナーゼを含む酵素材料としては、リポキシゲナーゼを含む植物体、動物体またはバクテリア体の材料を使用してもよく、例えば上述の原料に含まれるリポキシゲナーゼを、酵素材料に含まれる天然由来のリポキシゲナーゼとしてそのまま使用してもよい。脂肪酸の酸化反応を効率的に進めるという観点から、例えば大豆などの植物体、例えば卵などの動物体、またはバクテリア体から適当な単離精製技術により精製された、天然由来、すなわち植物由来、動物由来またはバクテリア由来のリポキシゲナーゼが使用されてもよい。また、遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたリポキシゲナーゼあるいは化学的に合成されたリポキシゲナーゼが使用されてもよい。さらには、市販品を利用することもできる。また、酵素材料はリポキシゲナーゼ以外に他の酵素を含んでいてもよい。 In some embodiments of the present invention, ketooctadecadienoic acid is produced by reacting the above-mentioned fatty acid-containing raw material with a lipoxygenase-containing enzyme material. As the enzyme material containing lipoxygenase, a plant, animal or bacterial material containing lipoxygenase may be used.For example, lipoxygenase contained in the above-mentioned raw materials may be used as it is as a naturally-derived lipoxygenase contained in the enzyme material. May be. From the viewpoint of efficiently promoting the oxidation reaction of fatty acids, for example, a plant derived from a plant, such as a soybean, an animal such as an egg, or a bacterial body, which is purified by a suitable isolation and purification technique, that is, a plant-derived animal, Lipoxygenase of bacterial origin or of bacteria may be used. A lipoxygenase produced as a recombinant by a genetic engineering technique or a chemically synthesized lipoxygenase may be used. Further, commercially available products can also be used. In addition, the enzyme material may contain other enzymes in addition to lipoxygenase.
酵素材料は、使用する原料に応じて、適宜その使用量を選択することができる。例えば、原料に含まれるリノール酸１０ｇに対し、精製した酵素換算で、１００〜３０００００ユニットのリポキシゲナーゼが含まれるような酵素材料が使用される。原料に含まれるリノール酸１０ｇに対し、２０００〜１８００００ユニットのリポキシゲナーゼが使用されてもよい。また、５０００〜９００００ユニットのリポキシゲナーゼが使用されてもよい。なお、本明細書において１ユニットとは、リノール酸を基質とし、３ｍＬ（幅１ｃｍ）の石英セル内において、ｐＨ９、温度２５℃で１分間に波長２３４ｎｍにおける基質溶液の吸光度を０．００１増加させる酵素量と定義される。したがって、ここでリポキシゲナーゼ活性１ユニットは、毎分０．１２μｍｏｌのリノール酸を酸化する量に相当する。 The amount of the enzyme material can be appropriately selected according to the raw material used. For example, an enzyme material containing 100 to 300,000 units of lipoxygenase in terms of purified enzyme is used for 10 g of linoleic acid contained in the raw material. 2000 to 180,000 units of lipoxygenase may be used for 10 g of linoleic acid contained in the raw material. Alternatively, 5000 to 90000 units of lipoxygenase may be used. In the present specification, one unit refers to linoleic acid as a substrate, and increases the absorbance of the substrate solution at a wavelength of 234 nm by 0.001 in a 3 mL (1 cm wide) quartz cell at a pH of 9 and a temperature of 25 ° C. for 1 minute. Defined as the amount of enzyme. Therefore, one unit of lipoxygenase activity here corresponds to an amount that oxidizes 0.12 μmol of linoleic acid per minute.
脂肪酸を含む原料に酵素材料を作用させる反応温度は、使用する原料に応じて適宜設定することができるが、０〜９０℃であることが好ましい。０℃未満では溶媒が凍ってしまい、反応が進行しない恐れがある。また、９０℃より高い温度では酵素材料に含まれるＬＯＸがすぐに失活してしまう。例えば、酵素材料を作用させる反応温度は、１０℃以上、６０℃以下とすることができる。好ましくは、酵素材料を作用させる反応温度は、１５℃以上、５０℃以下であり得る。好ましくは、２０℃以上、５０℃以下であり得る。好ましくは、３０℃以上、５０℃以下である。 The reaction temperature at which the enzyme material is allowed to act on the raw material containing the fatty acid can be appropriately set according to the raw material used, but is preferably 0 to 90 ° C. If the temperature is lower than 0 ° C., the solvent may freeze and the reaction may not proceed. At a temperature higher than 90 ° C., LOX contained in the enzyme material is immediately deactivated. For example, the reaction temperature at which the enzyme material acts can be set to 10 ° C. or more and 60 ° C. or less. Preferably, the reaction temperature at which the enzyme material is allowed to act may be 15 ° C or higher and 50 ° C or lower. Preferably, it can be 20 ° C. or higher and 50 ° C. or lower. Preferably, it is 30 ° C. or more and 50 ° C. or less.
なお、本明細書に記載の反応または工程は、適切な溶媒中で実施することができる。適切な溶媒は、当業者によって容易に選択され得る。適切な溶媒とは、本明細書に記載の反応または工程が、反応が実施される上述のような温度において、反応物、中間体および／または生成物と実質的に反応性でない溶媒である。また、本明細書に記載の反応または工程は、１種の溶媒中で実施されてもよいし、または、２種以上の溶媒の混合物中で実施されてもよい。 Note that the reactions or steps described in this specification can be carried out in an appropriate solvent. Appropriate solvents can be readily selected by those skilled in the art. Suitable solvents are those that are substantially non-reactive with the reactants, intermediates and / or products at the temperatures at which the reactions or steps described herein are performed, as described above. Also, the reactions or steps described herein may be performed in one type of solvent, or may be performed in a mixture of two or more types of solvents.
脂肪酸を含む原料に酵素材料を作用させる作用時間は、酵素材料に含まれるＬＯＸの含有量や反応温度に応じて適時設定すればよいが、例えば、０．５〜１４４時間が好ましい。０．５時間より作用時間が短いとＬＯＸによる酸化反応が進まない恐れがある。酵素材料の作用時間が７２時間より長くなると、副反応が起こりやすくなる。より好ましくは、酵素材料の作用時間が０．５〜７２時間程度であることが望ましい。さらに、２４〜７２時間であることが望ましい。 The action time for allowing the enzyme material to act on the fatty acid-containing raw material may be set as appropriate according to the content of LOX contained in the enzyme material and the reaction temperature, and for example, is preferably 0.5 to 144 hours. If the action time is shorter than 0.5 hour, the oxidation reaction by LOX may not proceed. If the action time of the enzyme material is longer than 72 hours, side reactions are likely to occur. More preferably, the action time of the enzyme material is desirably about 0.5 to 72 hours. Furthermore, it is desirable that it is 24-72 hours.
ＬＯＸを含む酵素材料を作用させる反応は、ｐＨ６〜１２程度の範囲内で行われ得る。ｐＨ６未満またはｐＨ１２超過では、反応溶液中で、酵素材料に含まれるＬＯＸが失活および／または変性する恐れがある。特には、ＬＯＸを含む酵素材料を作用させる反応がｐＨ９〜１２の条件下で行われることが好ましい。さらに、ｐＨ１０〜１２の条件下でＬＯＸの失活を行うことが好ましい。このような範囲内のｐＨであると、原料に含まれるリノール酸が乳化し易く、反応が進みやすい場合がある。反応におけるｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を用いて行うことができ、例えば、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムもしくはリン酸水素カリウムなどのカリウム塩、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムもしくはリン酸水素ナトリウムなどのナトリウム塩、トリエチルアミンなどのアミン類、または、アンモニアなどを用いて行うことができる。 The reaction that causes the enzyme material containing LOX to act can be performed within a pH range of about 6 to 12. If the pH is lower than 6 or higher than 12, the LOX contained in the enzyme material may be deactivated and / or denatured in the reaction solution. In particular, it is preferable that the reaction for causing the enzyme material containing LOX to act is performed under conditions of pH 9 to 12. Further, it is preferable to deactivate LOX under conditions of pH 10 to 12. When the pH is in such a range, linoleic acid contained in the raw material is easily emulsified, and the reaction may easily proceed. The pH in the reaction can be adjusted using a known pH adjuster, for example, potassium hydroxide, potassium carbonate, potassium salts such as potassium hydrogen carbonate or potassium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, sodium carbonate, carbonate The reaction can be performed using a sodium salt such as sodium hydrogen or sodium hydrogen phosphate, an amine such as triethylamine, or ammonia.
上述の脂肪酸を含む原料とリポキシゲナーゼを含む酵素材料との反応により、脂肪酸に酸素分子が添加されて、過酸化脂質および／または水酸化脂肪酸が生成される。本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法では続いて、脂肪酸を含む原料とリポキシゲナーゼを含む酵素材料との反応によって得られた反応混合物中においてリポキシゲナーゼの酵素反応が停止される。 Oxygen molecules are added to the fatty acid by the reaction between the above-described raw material containing the fatty acid and the enzyme material containing the lipoxygenase, so that lipid peroxide and / or hydroxylated fatty acid is produced. In the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention, the enzymatic reaction of lipoxygenase is subsequently stopped in a reaction mixture obtained by reacting a raw material containing fatty acids with an enzyme material containing lipoxygenase.
リポキシゲナーゼの酵素反応の停止は、特に限定されないが、例えば、リポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることによって行われ得る。リポキシゲナーゼの酵素活性の失活方法としては、加熱処理によるリポキシゲナーゼ活性の失活処理、ｐＨ調整によるリポキシゲナーゼ活性の失活処理などが挙げられる。リポキシゲナーゼの酵素反応の停止は、また、リポキシゲナーゼを例えば限外ろ過またはゲルろ過などにより反応混合物から除去することでもできるし、または担体表面に酵素を吸着、結合もしくはゲル内に含包させたいわゆる固定化酵素を用いてカラムなどの反応塔を通せばリポキシゲナーゼは自然と反応系から除去される。または、リポキシゲナーゼと相互に作用して選択的にリポキシゲナーゼの反応を阻害する阻害剤などの試薬を反応混合物に添加することにより実施されてもよい。すなわち、本明細書中、広義の意味において、リポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることのみならず、リポキシゲナーゼの酵素活性を阻害することおよびリポキシゲナーゼを除去することもリポキシゲナーゼの酵素反応を停止させることに含まれるものとする。 The termination of the lipoxygenase enzyme reaction is not particularly limited, but can be performed, for example, by inactivating the lipoxygenase enzyme activity. Examples of a method for inactivating the lipoxygenase enzyme activity include a heat treatment for inactivating the lipoxygenase activity and a pH adjustment for inactivating the lipoxygenase activity. The lipoxygenase enzyme reaction can also be stopped by removing the lipoxygenase from the reaction mixture, for example, by ultrafiltration or gel filtration, or by adsorbing the enzyme on the carrier surface, binding or enclosing the enzyme in a gel. If lipoxygenase is passed through a reaction tower such as a column using an immobilized enzyme, lipoxygenase is naturally removed from the reaction system. Alternatively, it may be carried out by adding a reagent such as an inhibitor that interacts with lipoxygenase and selectively inhibits the reaction of lipoxygenase to the reaction mixture. That is, in the present specification, in a broad sense, not only inactivating the enzyme activity of lipoxygenase, but also inhibiting the enzyme activity of lipoxygenase and removing the lipoxygenase include stopping the enzyme reaction of lipoxygenase. Shall be
本発明のいくつかの実施形態において、リポキシゲナーゼの酵素反応の停止は、反応混合物を加熱処理することによってリポキシゲナーゼ活性を失活させることにより実施され得る。加熱処理による失活は、簡便な制御で、また大量に製造する場合でも効率よく行うことができる点から特に好ましい。加熱処理の加熱温度と保持時間は、リポキシゲナーゼが十分に失活できる条件に適宜設定することができる。例えば加熱温度としては、７０℃以上が好ましい。より短時間でリポキシゲナーゼの酵素活性を失活させることが好ましい場合には、加熱温度を９０℃以上とすることが望ましい。加熱温度の上限値は特に規定されないが、反応混合物中の溶媒が揮発しすぎない程度の温度が好ましく、例えば一般的なオートクレーブ処理における温度（１２０〜１４０℃）程度とすることができる。この程度の温度でリポキシゲナーゼの酵素反応の停止工程を行うことにより、例えば、製造したケトオクタデカジエン酸が食品や医薬品用途に用いられる場合、リポキシゲナーゼ活性の失活と同時に生成物が加熱殺菌されるため、特に好ましい場合がある。保持時間、すなわちリポキシゲナーゼの失活処理時間は特に規定されないが、一般的には、５分以上とすることができ、好ましくは１０分以上が望ましい。 In some embodiments of the present invention, terminating the enzymatic reaction of lipoxygenase can be performed by inactivating the lipoxygenase activity by heat treating the reaction mixture. Inactivation by heat treatment is particularly preferred because it can be performed easily with a simple control and can be performed efficiently even in the case of mass production. The heating temperature and the holding time of the heat treatment can be appropriately set to conditions under which lipoxygenase can be sufficiently inactivated. For example, the heating temperature is preferably 70 ° C. or higher. When it is preferable to inactivate the enzyme activity of lipoxygenase in a shorter time, the heating temperature is preferably 90 ° C. or higher. The upper limit of the heating temperature is not particularly limited, but is preferably a temperature at which the solvent in the reaction mixture does not volatilize too much. For example, the temperature may be about the temperature (120 to 140 ° C.) in general autoclave treatment. By performing the step of stopping the enzyme reaction of lipoxygenase at such a temperature, for example, when the produced ketooctadecadienoic acid is used for food or pharmaceutical applications, the product is heat sterilized at the same time as the inactivation of lipoxygenase activity. Therefore, it may be particularly preferable in some cases. The retention time, that is, the lipoxygenase inactivation treatment time is not particularly limited, but can be generally 5 minutes or more, preferably 10 minutes or more.
リポキシゲナーゼ活性の失活が、ｐＨ調整により行われる場合、反応混合物のｐＨが、ｐＨ６未満またはｐＨ１２超に調整される。ｐＨの調整は、上述のような公知のｐＨ調整剤を用いて行うことができる。 When the inactivation of the lipoxygenase activity is performed by adjusting the pH, the pH of the reaction mixture is adjusted to less than pH 6 or more than pH 12. The pH can be adjusted using the known pH adjuster as described above.
本発明のいくつかの実施形態において、阻害剤などの試薬を反応混合物に添加してリポキシゲナーゼの酵素活性を阻害することによりリポキシゲナーゼの酵素反応が停止される。リポキシゲナーゼ阻害剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシウレア誘導体、レドックス阻害剤、および非レドックス阻害剤などが含まれ、一例として、これらに限定される訳ではないが、Ｎ−［１−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イルエチル］−Ｎ−ヒドロキシウレア（ジロートン）、１−［４−［５−（４−フルオロフェノキシ）−２−フリル］ブト−３−イン−２−イル］−１−ヒドロキシ−ウレア、テトラヒドロ−４−［３−［［４−（２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル)フェニル]チオ]フェニル）−２Ｈ−ピラン-4-カルボキサミド（ＣＪ−１３６１０）、２−（１２−ヒドロキシドデカ−５，１０−ジイニル）−３，５，６−トリメチル−シクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（ドセベノン）、６−［［３−フルオロ−５−（４−メトキシオキサン−４−イル）フェノキシ］メチル］−１−メチル−キノリン−２−オン（ＺＤ２１３８）等が挙げられる。 In some embodiments of the present invention, the enzyme reaction of lipoxygenase is stopped by adding a reagent such as an inhibitor to the reaction mixture to inhibit the enzyme activity of lipoxygenase. Lipoxygenase inhibitors include, for example, N-hydroxyurea derivatives, redox inhibitors, non-redox inhibitors, and the like. By way of example and not limitation, N- [1-benzo [b] Thien-2-ylethyl] -N-hydroxyurea (zileuton), 1- [4- [5- (4-fluorophenoxy) -2-furyl] but-3-yn-2-yl] -1-hydroxy-urea Tetrahydro-4- [3-[[4- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) phenyl] thio] phenyl) -2H-pyran-4-carboxamide (CJ-13610), 2- (12- (Hydroxydodeca-5,10-diynyl) -3,5,6-trimethyl-cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione (dosebenone), 6-[[3-fluoro 5- (4-methoxy-oxane-4-yl) phenoxy] methyl] -1-methyl - quinolin-2-one (ZD2138), and the like.
本発明のいくつかの実施形態において、続いて、脱水素化反応を行うため、リポキシゲナーゼの酵素反応が停止された後、得られた生成物に脱水素酵素が作用される。これにより、ケトオクタデカジエン酸が製造される。ここで使用される脱水素酵素としては、上記の過酸化脂質や水酸化脂肪酸を基質として利用し、脂肪酸のオキソ誘導体に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、好ましくはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）である。また、酵素の由来は特に制限されない。キュウリなどの植物由来のＡＤＨまたは酵母などの微生物由来のＡＤＨが使用されてもよく、さらに、動物由来のＡＤＨが使用されてもよい。また、遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたＡＤＨあるいは化学的に合成されたＡＤＨが使用されてもよい。さらには、市販品のＡＤＨを利用することもできる。より反応を効率的に進めるためには植物または酵母由来から精製されたものを使うことができる。 In some embodiments of the present invention, the enzymatic reaction of lipoxygenase is stopped to perform a dehydrogenation reaction, and then the resulting product is subjected to dehydrogenase. Thereby, ketooctadecadienoic acid is produced. The dehydrogenase used here is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of converting the above-mentioned lipid peroxide or hydroxylated fatty acid as a substrate and converting it to an oxo derivative of a fatty acid. Enzyme (ADH). The origin of the enzyme is not particularly limited. ADH derived from plants such as cucumber or ADH derived from microorganisms such as yeast may be used, and ADH derived from animals may be used. Further, ADH produced as a recombinant by a genetic engineering technique or chemically synthesized ADH may be used. Furthermore, a commercially available ADH can also be used. In order to promote the reaction more efficiently, those purified from plants or yeast can be used.
本発明のいくつかの実施形態において、脱水素酵素を作用させる工程は、補因子の存在下で行われることが好ましい。補因子は、リポキシゲナーゼの酵素反応が停止される工程を経て得られる生成物に添加され得る。補因子はまた、酵素と共に混合物として、生成物に添加されてもよい。補因子は、脱水素酵素の種類に応じて、選択することができる。補因子の例は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などを含むことができるが、これらに限定されない。好ましくは、補因子はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）である。補因子の添加濃度は、脱水素化反応が効率良く進む程度の濃度であればよい。 In some embodiments of the present invention, the step of activating dehydrogenase is preferably performed in the presence of a cofactor. A cofactor can be added to the product obtained through the step in which the enzymatic reaction of lipoxygenase is stopped. The cofactor may also be added to the product as a mixture with the enzyme. Cofactors can be selected according to the type of dehydrogenase. Examples of cofactors can include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ), flavin adenine dinucleotide (FAD), flavin mononucleotide (FMN), and the like. It is not limited to these. Preferably, the cofactor is nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ). The concentration of the cofactor to be added may be such that the dehydrogenation reaction proceeds efficiently.
ＡＤＨの使用量は、使用する原料に応じて、適宜選択され得るが、例えば、原料に含まれるリノール酸１０ｇに対し、精製した酵素換算で、１０〜１５０００ユニットのＡＤＨが使用されてもよい。また、１５０００ユニットより多い量のＡＤＨが使用されてもよい。２０〜５０００ユニットのＡＤＨが使用されてもよく、また、１００〜５００ユニットのＡＤＨが使用されてもよい。なお、本明細書において１ユニットとは、ｐＨ８．８、２５℃の条件下、１分間で、１．０μｍｏｌのエタノールをアセトアルデヒドに変換する酵素量と定義される。 The amount of ADH used can be appropriately selected according to the raw material used. For example, 10 to 15000 units of ADH in terms of purified enzyme may be used for 10 g of linoleic acid contained in the raw material. Also, more than 15000 units of ADH may be used. 20-5000 units of ADH may be used, and 100-500 units of ADH may be used. In this specification, one unit is defined as an amount of an enzyme that converts 1.0 μmol of ethanol to acetaldehyde in one minute under a condition of pH 8.8 and 25 ° C.
ＡＤＨを作用させる作用温度は、使用する原料に応じて適宜設定することができるが、０〜５０℃であることが好ましい。０℃未満では溶媒が凍ってしまい、反応が進行しない恐れがある。また、５０℃より高い温度ではＡＤＨ酵素がすぐに失活してしまう。より好ましくは、１０℃以上、４０℃以下であり得る。 The action temperature at which ADH acts can be appropriately set according to the raw materials used, but is preferably 0 to 50 ° C. If the temperature is lower than 0 ° C., the solvent may freeze and the reaction may not proceed. At a temperature higher than 50 ° C., the ADH enzyme is immediately deactivated. More preferably, it can be 10 ° C or higher and 40 ° C or lower.
ＡＤＨを作用させる作用時間は、反応温度等に応じて適時設定され得るが、例えば、１〜７２時間程度が好ましい。反応効率の観点からは、ＡＤＨの作用時間は、２４時間程度で十分である。 The duration of the action of ADH can be set appropriately according to the reaction temperature and the like, but is preferably, for example, about 1 to 72 hours. From the viewpoint of reaction efficiency, about 24 hours is sufficient for the action time of ADH.
ＡＤＨを作用させる反応は、好ましくは、ｐＨ６〜１２程度の範囲内で行われ得る。ｐＨ６未満またはｐＨ１２超過では、ＡＤＨが失活および／または変性する恐れがある。特には、ｐＨ８〜１２の条件下で行われることが好ましい。したがって、ＬＯＸを含む酵素材料を作用させる工程と同程度のｐＨ条件とすることができ、この場合、ＡＤＨを作用させる工程においてｐＨを再度調整する必要がないため、好ましい。反応におけるｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を用いて行うことができ、例えば、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムまたはリン酸水素カリウムなどのカリウム塩、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムもしくはリン酸水素ナトリウムなどのナトリウム塩、トリエチルアミンなどのアミン類、または、アンモニアなどを用いて行うことができる。 The reaction for acting ADH can be performed preferably in a pH range of about 6 to 12. Below pH 6 or above pH 12, ADH may be inactivated and / or denatured. In particular, it is preferable to carry out the reaction under the condition of pH 8 to 12. Therefore, the pH condition can be set to the same level as that of the step of applying the enzyme material containing LOX. In this case, it is not necessary to adjust the pH again in the step of applying the ADH, which is preferable. The pH in the reaction can be adjusted using a known pH adjuster, for example, potassium hydroxide, potassium carbonate, potassium salts such as potassium hydrogen carbonate or potassium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, sodium carbonate, carbonate The reaction can be performed using a sodium salt such as sodium hydrogen or sodium hydrogen phosphate, an amine such as triethylamine, or ammonia.
リポキシゲナーゼの酵素反応が停止された工程後の生成物にＡＤＨを作用させることにより、先にリポキシゲナーゼとの反応によって生成された、脂肪酸のリポキシゲナーゼ代謝物である過酸化脂質や水酸化脂肪酸がケトオクタデカジエン酸に変換される。したがって、本実施形態の製造方法によれば、副生成物の生成が顕著に抑制され、ケトオクタデカジエン酸を安定して製造することができる。 By reacting ADH on the product after the step in which the enzymatic reaction of lipoxygenase was stopped, lipid peroxides and hydroxylated fatty acids, which are lipoxygenase metabolites of fatty acids previously produced by reaction with lipoxygenase, are converted to ketooctadeca. Converted to dienoic acid. Therefore, according to the production method of the present embodiment, generation of by-products is significantly suppressed, and ketooctadecadienoic acid can be produced stably.
本発明の実施形態においてはＨＰＯＤＥが生成した後に加熱処理を行うことによりＬＯＸを失活させて、引き続き加熱処理を行うことによりケトオクタデカジエン酸を得ることもできる。この場合、脂肪酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させてのち０．５〜２４時間以内に加熱処理を行い、その加熱処理時間は１０分以上、好ましくは３０分以上が望ましい。 In the embodiment of the present invention, it is also possible to deactivate LOX by performing a heat treatment after the generation of HPODE, and to obtain ketooctadecadienoic acid by subsequently performing a heat treatment. In this case, after the enzyme material containing lipoxygenase is allowed to act on the raw material containing fatty acid, heat treatment is performed within 0.5 to 24 hours, and the heat treatment time is desirably 10 minutes or more, preferably 30 minutes or more.
本明細書に記載の工程は、当該技術分野で知られている適切な分析方法に従ってモニターすることができる。生成物の生成は、種々の分光手段によって、またはクロマトグラフィーによって、モニターされ得る。本発明の製造方法によれば、リノール酸を含む原料から、ケトオクタデカジエン酸の中でも、特に、９−オキソ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ｏｘｏＯＤＡ）および１３−オキソ−９，１１−オクタデカジエン酸（１３−ｏｘｏＯＤＡ）が生成する。９−ｏｘｏＯＤＡや１３−ｏｘｏＯＤＡなどの生成は、例えば、ＬＣ−ＭＳなどの分析手段により確認され得、また、その濃度も定量的に分析され得る。よって、リノール酸からの生成物の変換収率、いわゆる収率が算出される。 The steps described herein can be monitored according to any suitable analytical method known in the art. Product formation can be monitored by various spectroscopic means or by chromatography. According to the production method of the present invention, from a raw material containing linoleic acid, among ketooctadecadienoic acids, particularly, 9-oxo-10,12-octadecadienoic acid (9-oxoODA) and 13-oxo-9, 11-Octadecadienoic acid (13-oxo ODA) is produced. The production of 9-oxoODA and 13-oxoODA can be confirmed by analytical means such as LC-MS, and the concentration can be quantitatively analyzed. Thus, the conversion yield of the product from linoleic acid, the so-called yield, is calculated.
なお、ケトオクタデカジエン酸には、上述のように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｚ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）、（Ｚ，Ｚ体）など様々な異性体が存在するが、機能性成分としてのその効果はほぼ同等であり、したがって、以下の実施例に述べるケトオクタデカジエン酸の収率はこれら異性体を合算したものである。 As described above, ketooctadecadienoic acid has various isomers such as (E, E-form), (Z, E-form), (E, Z-form), (Z, Z-form). However, its effect as a functional component is almost the same, and thus the yield of ketooctadecadienoic acid described in the following examples is the sum of these isomers.
上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法は、追加で、生成したケトオクタデカジエン酸を精製する工程を含んでいてもよい。例えば、生成したケトオクタデカジエン酸は、一般的な精製方法によって、例えば、溶媒抽出後に薄層クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーによって分離精製されてもよい。精製方法および条件は、実験によって異なっていてよく、例えばクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ精製における溶離液や溶媒、固定相などは適宜選択されてよい。しかしながら、製造されたケトオクタデカジエン酸は、精製せずにケトオクタデカジエン酸を含む反応溶液そのままで、または、粗精製処理に供した、例えば溶媒抽出後に乾燥させたもの等の粗精製物で使用されてもよい。 The method for producing ketooctadecadienoic acid according to the above-described embodiment may additionally include a step of purifying the generated ketooctadecadienoic acid. For example, the produced ketooctadecadienoic acid may be separated and purified by a general purification method, for example, thin-layer chromatography or liquid chromatography after solvent extraction. Purification methods and conditions may vary depending on the experiment. For example, eluents, solvents, stationary phases, and the like in chromatography and HPLC purification may be appropriately selected. However, the produced ketooctadecadienoic acid is a crude solution such as a reaction solution containing ketooctadecadienoic acid without purification, or a crude purified product such as one subjected to a crude purification treatment, for example, dried after solvent extraction. May be used.
上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法により製造されたケトオクタデカジエン酸の中でも、９−ｏｘｏＯＤＡ体や１３−ｏｘｏＯＤＡ体は、ＰＰＡＲα活性化作用が報告されており、脂肪燃焼作用等が期待でき（例えばKim YI, et al., Mol. Nutr. Food. Res., 55 (2011) 585.やYoung-il Kim, et al., PLoSONE, 7 (2012) 2）、例えば肥満や脂質代謝異常、インスリン抵抗性を原因とした糖尿病や、高脂血症、動脈硬化、心疾患の予防や改善に用いることができる。例えば実用に供するのはサプリメントや食品、機能性食品、化粧品等に添加して用いることができる。 Among the ketooctadecadienoic acids produced by the method for producing ketooctadecadienoic acid according to the above-described embodiment, the 9-oxoODA form and the 13-oxoODA form have been reported to have a PPARα activating action, and a fat burning action. (Eg, Kim YI, et al., Mol. Nutr. Food. Res., 55 (2011) 585. and Young-il Kim, et al., PLoSONE, 7 (2012) 2). It can be used to prevent or improve diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, and heart disease caused by abnormal lipid metabolism and insulin resistance. For example, for practical use, it can be used by adding to supplements, foods, functional foods, cosmetics, and the like.
また、本発明者らは、ケトオクタデカジエン酸を植物に作用させることで強力な抵抗性誘導効果を示す植物賦活剤として利用できることを見出しており、さまざまな植物の成長促進効果や果実の収量増加効果、病害抑制効果を示すことを知見している。例えば病害抑制に関して効果のある具体的な例としては、キュウリ、スイカ、メロン、カボチャなどウリ科の葉の灰色カビ病、つる割れ病、つる枯病、ベト病、トマト、ナス、ジャガイモなどナス科の青枯れ病、萎凋病、半身萎凋病、立枯病、褐色根腐病、バラやイチゴなどバラ科植物のうどん粉病、黒星病、灰色カビ病、炭疽病、ホウレンソウなどヒユ科のベト病、ハクサイ、キャベツ、コマツナなどアブラナ科の黒腐病、軟腐病、斑点細菌病、リゾクトニア病、ニンジンなどセリ科の白絹病、イネ科植物のいもち病などに有効である。 In addition, the present inventors have found that ketooctadecadienoic acid can be used as a plant activator that exhibits a strong resistance inducing effect by acting on plants, and has a growth promoting effect of various plants and a yield of fruits. It is found that it shows an increasing effect and a disease suppressing effect. For example, specific examples that are effective in controlling disease include soybeans such as cucumber, watermelon, melon, and squash such as gray mold, vine wilt, vine wilt, downy mildew, tomato, eggplant, potato, etc. Blight, wilt, half-body wilt, wilt, brown root rot, powdery mildew of roses such as roses and strawberries, scab, gray mold, anthrax, downy mildew of spinach, spinach It is effective against black rot, soft rot, spot bacterial disease, rhizoctonia disease such as Chinese cabbage, cabbage and komatsuna, white silk disease such as carrots such as carrots, and blast of grasses.
上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法によれば、二つの異なる酵素を使用して、ケトオクタデカジエン酸が簡便に、安定的かつ効率的に製造され得る。これまで供給が難しかったケトオクタデカジエン酸を十分な収率で製造できるため、ケトオクタデカジエン酸の生理活性解析や産業利用への応用が期待できる。さらに、金属の添加を必要とすることなしに、ケトオクタデカジエン酸を安定して製造することができるため製造されたケトオクタデカジエン酸が様々な分野で安全に使用できる点でも本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法は有用であり、得られたケトオクタデカジエン酸は、機能性食品、医薬品、化粧品、植物賦活剤等の原料として特に適している。 According to the method for producing ketooctadecadienoic acid according to the above-described embodiment, ketooctadecadienoic acid can be produced simply, stably and efficiently using two different enzymes. Since ketooctadecadienoic acid, which has been difficult to supply until now, can be produced with a sufficient yield, it can be expected to be applied to bioactivity analysis and industrial use of ketooctadecadienoic acid. Furthermore, ketooctadecadienoic acid can be produced stably without the need for addition of a metal, so that the produced ketooctadecadienoic acid can be used safely in various fields. The method for producing ketooctadecadienoic acid is useful, and the obtained ketooctadecadienoic acid is particularly suitable as a raw material for functional foods, pharmaceuticals, cosmetics, plant activators, and the like.
また、上述した実施形態に係るケトオクタデカジエン酸の製造方法によれば、二つの異なる酵素を独立して順次反応させれば室温で効率よくケトオクタデカジエン酸を製造でき、特別な温度調節装置や温度調節が必須ではないため、製造における省力化・省資源化・省エネルギー化、ひいては製造コストの削減が達成され得ると考えられる。 Further, according to the method for producing ketooctadecadienoic acid according to the above-described embodiment, ketooctadecadienoic acid can be produced efficiently at room temperature by reacting two different enzymes independently and sequentially, and a special temperature control Since equipment and temperature control are not indispensable, it is considered that labor saving, resource saving and energy saving in manufacturing, and reduction in manufacturing cost can be achieved.
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。 The present invention will be described based on examples, but the present invention is not limited to the examples.
ケトオクタデカジエン酸の製造
・実施例１
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）２．８ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）７．０ｇ、および、蒸留水３００ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の試験溶液のｐＨは１１であった。
Production of ketooctadecadienoic acid Example 1
As a fatty acid-containing raw material, 2.8 g of linoleic acid having a purity of 80% (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and 7.0 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 300 mL of distilled water were added thereto. In addition, test solutions were prepared. At this time, the pH of the test solution was 11.
試験溶液にリポキシゲナーゼ（シグマアルドリッチ社製、Glycine max由来）を０．２ｍｇ添加し、３０℃で３６時間反応させたのち、反応混合物を９０℃の湯浴中に５分間置いて、酵素を失活させた。反応溶液を室温に戻した後に、アルコール脱水素酵素（和光純薬工業株式会社製、Yeast由来）を０．２ｍｇ添加し、３０℃にてさらに２４時間反応させた。 After adding 0.2 mg of lipoxygenase (Sigma-Aldrich, Glycine max) to the test solution and reacting at 30 ° C. for 36 hours, the reaction mixture was placed in a 90 ° C. water bath for 5 minutes to inactivate the enzyme. I let it. After returning the reaction solution to room temperature, 0.2 mg of alcohol dehydrogenase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from Yeast) was added, and the mixture was further reacted at 30 ° C. for 24 hours.
反応終了後の試験溶液中の生成物を、標準物質としてケイマンケミカル社製の１３−ｏｘｏＯＤＡを用いて、ＭＳ2スペクトル解析を用いてＬＣ−ＭＳにて同定した。また、検出波長 ＵＶ ２７２ｎｍで、絶対検量線法により定量を行った。また９−ｏｘｏＯＤＡは、１３−ｏｘｏＯＤＡの吸光度を参考にして定量した。 The product in the test solution after completion of the reaction was identified by LC-MS using MS 2 spectrum analysis using 13-oxo ODA manufactured by Cayman Chemical Co. as a standard substance. In addition, quantification was performed by an absolute calibration curve method at a detection wavelength of UV 272 nm. 9-oxoODA was quantified with reference to the absorbance of 13-oxoODA.
（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、表１に示されるように、収率５．４％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は１０．９％であった。なお、収率（％）は以下の式に基づいて求めた。
収率（％）＝（生成した１３−ｏｘｏＯＤＡまたは９−ｏｘｏＯＤＡのｗｔ％）/（使用した原料リノール酸の初期ｗｔ％）
As shown in Table 1, 13-oxo ODA with a yield of 5.4% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 10.9%. The yield (%) was determined based on the following equation.
Yield (%) = (wt% of 13-oxo ODA or 9-oxo ODA produced) / (initial wt% of raw linoleic acid used)
・実施例２
試験溶液のリポキシゲナーゼとの反応時間を、３６時間に替えて、２４時間にしたこと以外は実施例１と同様に操作・分析を行った。
-Example 2
The operation and analysis were carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction time of the test solution with lipoxygenase was changed to 36 hours and to 24 hours.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率３．５％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は３．７％であった。 As shown in Table 1, 13-oxo ODA having a yield of 3.5% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 3.7%.
・実施例３
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）２．８ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）４．０ｇ、リン酸水素二カリウム（和光純薬工業株式会社製）２３．３ｇ、および、蒸留水３００ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の試験溶液のｐＨは９．０であった。
-Example 3
As a raw material containing a fatty acid, 2.8 g of linoleic acid having a purity of 80% (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and 4.0 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and dipotassium hydrogen phosphate ( 23.3 g of the product (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 300 mL of distilled water were added to prepare a test solution. At this time, the pH of the test solution was 9.0.
試験溶液にリポキシゲナーゼ（シグマアルドリッチ社製、Glycine max由来）を０．４ｍｇ添加し、１５℃で３時間反応させたのち、反応混合物を９０℃の湯浴中に９０分間置いて、酵素を失活させた。反応終了後の生成物に対して、実施例１と同様に操作・分析を行った。 After adding 0.4 mg of lipoxygenase (Sigma-Aldrich, Glycine max) to the test solution and reacting at 15 ° C. for 3 hours, the reaction mixture was placed in a 90 ° C. water bath for 90 minutes to inactivate the enzyme. I let it. The operation and analysis were performed on the product after the reaction in the same manner as in Example 1.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．６％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は１．２％であった。 As shown in Table 1, 13-oxo ODA with a yield of 2.6% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 1.2%.
・比較例１
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）０．１ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）０．２３ｇ、および、蒸留水１０ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の溶液のｐＨは１１であった。
-Comparative example 1
As a raw material containing fatty acids, 0.1 g of linoleic acid having a purity of 80% (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and 0.23 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 10 mL of distilled water were added thereto. In addition, test solutions were prepared. The pH of the solution at this time was 11.
試験溶液にリポキシゲナーゼ（シグマアルドリッチ社製、Glycine max由来）およびアルコール脱水素酵素（和光純薬工業株式会社製、Yeast由来）を、同時に、それぞれ０．０４ｍｇ添加し、５℃で２４時間反応させた。反応終了後の試験溶液中の生成物を、実施例１と同様に分析し、定量を行った。 Lipoxygenase (manufactured by Sigma-Aldrich, Glycine max) and alcohol dehydrogenase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Yeast) were simultaneously added to the test solution at a rate of 0.04 mg, respectively, and reacted at 5 ° C for 24 hours. . The product in the test solution after completion of the reaction was analyzed and quantified in the same manner as in Example 1.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．２％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は０．０２％であった。 As shown in Table 1, 13-oxo ODA with a yield of 2.2% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 0.02%.
・比較例２
反応温度を、５℃に替えて、３０℃にしたこと以外は比較例１と同様に操作・分析を行った。
-Comparative example 2
The operation and analysis were performed in the same manner as in Comparative Example 1 except that the reaction temperature was changed to 5 ° C. and 30 ° C.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．２％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は０．３７％であった。 As shown in Table 1, 13-oxo ODA with a yield of 2.2% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 0.37%.
・比較例３
脂肪酸を含む原料として、純度８０％のリノール酸（和光純薬工業株式会社製）０．２８ｇを用い、これに炭酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）０．１５ｇ、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）０．０５ｇ、および、蒸留水１０ｍＬを加えて試験溶液を調製した。この時の溶液のｐＨは１０．２であった。
-Comparative example 3
As a raw material containing fatty acids, 0.28 g of linoleic acid having a purity of 80% (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and 0.15 g of potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and sodium hydrogen carbonate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were used. A test solution was prepared by adding 0.05 g of Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) and 10 mL of distilled water. At this time, the pH of the solution was 10.2.
試験溶液に大豆粉末（品種：フクユタカ）０．２ｇおよびＭｎ含有酵母（５％、メディエンス社製）０．１ｇを添加し、５℃で２４時間反応させた。反応終了後の試験溶液中の生成物を、実施例１と同様に分析し、定量を行った。 0.2 g of soybean powder (variety: Fukuyutaka) and 0.1 g of Mn-containing yeast (5%, manufactured by Medience) were added to the test solution, and reacted at 5 ° C. for 24 hours. The product in the test solution after completion of the reaction was analyzed and quantified in the same manner as in Example 1.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率２．９％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は０．５％であった。 As shown in Table 1, 13-oxo ODA with a yield of 2.9% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 0.5%.
・比較例４
反応温度を、５℃に替えて、３０℃にしたこと以外は比較例５と同様に操作・分析を行った。
-Comparative example 4
The operation and analysis were performed in the same manner as in Comparative Example 5 except that the reaction temperature was changed to 5 ° C. and 30 ° C.
表１に示されるように、（Ｅ，Ｅ体）、（Ｅ，Ｚ体）などの異性体の合算収率として、収率１．９％の１３−ｏｘｏＯＤＡを得た。このとき９−ｏｘｏＯＤＡの収率は１．１％であった。 As shown in Table 1, 13-oxo ODA with a yield of 1.9% was obtained as the combined yield of isomers such as (E, E form) and (E, Z form). At this time, the yield of 9-oxo ODA was 1.1%.
表１に示されるように、実施例１〜３のケトオクタデカジエン酸の収率は、比較例１〜４におけるケトオクタデカジエン酸の収率よりもはるかに高いものであった。したがって、本発明のケトオクタデカジエン酸の製造方法が高収率でケトオクタデカジエン酸を生成するという顕著に優れた効果を有していることがわかる。 As shown in Table 1, the yield of ketooctadecadienoic acid in Examples 1 to 3 was much higher than the yield of ketooctadecadienoic acid in Comparative Examples 1 to 4. Therefore, it is understood that the method for producing ketooctadecadienoic acid of the present invention has a remarkably excellent effect of producing ketooctadecadienoic acid in high yield.
なお、比較例３および４で用いた大豆粉末には、リポキシゲナーゼとアルコール脱水素酵素との両方が含まれていると考えられるため、比較例３および４の結果は、リポキシゲナーゼおよびアルコール脱水素酵素の同時添加と同等の条件下で得られているものと考えられる。比較例３および４では、この大豆粉末に加え、さらに、金属を供給するＭｎ含有酵母が試験溶液に添加されている。すなわち、比較例３および４では、金属触媒が寄与するケトオクタデカジエン酸の生成反応促進効果も付与されているにもかかわらず、比較例３および４の収率は、実施例１〜３と比較して低いものにすぎない。この結果からも、本発明の製造方法が、リノール酸からのケトオクタデカジエン酸の変換収率において優れた効果を有していることがわかる。 Since the soybean powder used in Comparative Examples 3 and 4 is considered to contain both lipoxygenase and alcohol dehydrogenase, the results of Comparative Examples 3 and 4 indicate that lipoxygenase and alcohol dehydrogenase were used. It is considered that these were obtained under the same conditions as in the simultaneous addition. In Comparative Examples 3 and 4, in addition to the soybean powder, a Mn-containing yeast for supplying a metal was added to the test solution. That is, in Comparative Examples 3 and 4, the yields of Comparative Examples 3 and 4 were the same as those of Examples 1 to 3, although the effect of accelerating the formation reaction of ketooctadecadienoic acid contributed by the metal catalyst was also given. It is only low in comparison. These results also show that the production method of the present invention has an excellent effect on the conversion yield of ketooctadecadienoic acid from linoleic acid.
Claims (18)
（ｂ）工程（ａ）で得られた反応混合物に含まれる前記リポキシゲナーゼの酵素反応を停止させる工程
を含む、ケトオクタデカジエン酸の製造方法。 (A) a step of causing an enzyme material containing lipoxygenase to act on a raw material containing fatty acids, and (b) a step of stopping the enzymatic reaction of the lipoxygenase contained in the reaction mixture obtained in step (a). A method for producing dienoic acid.
（ｃ）前記工程（ｂ）を経て得られた生成物に脱水素酵素を作用させる工程
を含む請求項１記載のケトオクタデカジエン酸の製造方法。 further,
2. The method for producing ketooctadecadienoic acid according to claim 1, further comprising the step of: (c) reacting a dehydrogenase on the product obtained through the step (b).
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