JP2024001884A - 質量分析法による細胞毒性の測定 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒト細胞を含む動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果を測定するための方法を提供する。【解決手段】動物細胞、栄養培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料を質量分析試料支持台の少なくとも１つの試料スポットで調製し、質量分析試料を試料スポットでインキュベート培養し、質量分析試料の残液を試料スポットから除去し、空間分解能質量分析計によって、空間分解質量スペクトルを試料スポットの少なくとも部分領域における複数の測定位置で測定記録し、各空間分解質量スペクトルを、動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの存在について分析し、細胞存在値を各測定位置に割り当て、動物細胞による被覆率を、測定位置の細胞存在値から、試料スポットの少なくとも部分領域について測定し、測定された被覆率から増殖能を導出し、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果が、測定された被覆率から間接的または直接的に導出される。【選択図】図５

Description

本発明は、動物細胞に対する細胞傷害性因子の細胞傷害性効果を測定するための質量分析法に関する。
ルーチン微生物検査室の２つの主な課題(tasks)は、病原微生物の同定ならびに細菌および真菌の抗菌薬感受性試験（すなわち耐性試験）である。
近年、様々な質量分析法が研究所およびルーチン微生物検査室に導入されている。特に、微生物検査室では、近年、特別な質量分析（ＭＳ）法である「マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型」（ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ）質量分析法が確立され、そしてこの１０年で適切なＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳ装置がほとんどの微生物検査室に設置された。
しかしながら、この方法のルーチン適用は、これまで、もっぱら細菌および真菌の病原体同定に焦点が当てられてきた。さらに、細菌および真菌の耐性を決定するための初めての適用もある。これまでは、これらの大部分はまだ開発段階にある。たとえば、特許文献１、非特許文献１は、ＭＳ試料支持台での微生物試料の培養および微生物物質に対する微生物の耐性の測定を記載している。
しかしながら、細菌および真菌の同定と、特定の抗微生物活性物質に対する細菌および真菌の耐性の決定の他にも、検査室において調査すべき、ＭＳが適用されていない他の態様がある。
ＰＣＲなどの分子生物学的検出法に加えて、これらは、通常は、細胞傷害性因子の影響が動物細胞（たとえば、継代細胞株）の増殖を介して光学的に（すなわち、呈色反応を検出するか、または細胞の活力および形態を顕微鏡の使用により測定することによって）検出される表現型検出法に基づいている。
調査すべき重要な態様は、たとえば、病原体の毒性である。毒性は、特定の微生物種の分離株の病原性の程度であり、ここで病原性とは、病原体が大型生物（宿主、たとえばヒト）に疾患をもたらす基本的能力を意味する。この場合、特定の関連する病原性表現型の標的検出（仮説に基づく）と、一般的な、毒性の表現型決定（仮説に基づかない）とを区別することができる。
別の重要な態様は、抗ウイルス薬に対するウイルスの感受性の測定および、抗ウイルス薬の細胞傷害性の測定である。細菌感染症に対する抗生物質の投与と同様に、抗ウイルス薬の投与は、通常、経験的に開始され、抗ウイルス耐性試験の結果によって必要に応じて調整される。これは、抗ウイルス薬（たとえば静ウイルス薬（ｖｉｒｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ））に耐性が認められる場合には別の抗ウイルス薬に切り替えることを意味する。治療された生体の状態に改善が見られない場合は、往々にして、病原体の耐性が疑われる最初の徴候であり、それが抗ウイルス薬感受性試験の根拠となる。表現型検査が利用可能であれば、ここでも役立つ。
細菌の病原性の検出、抗ウイルス薬に対するウイルスの感受性の測定、および抗菌薬、抗真菌薬、または抗ウイルス薬の細胞毒性の測定に加えて、化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性の検出も、表現型検査の適用分野である。
様々な方法が細胞傷害性または病原性の検出に利用できる。
特許文献１は、簡単なＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦを用いた微生物の増殖の検出を開示している。これは、微生物が高い増殖速度および細胞分裂速度を有しているために可能である。しかしながら、微生物用に開発された前記の方法は、特に、動物細胞の増殖および細胞分裂が、微生物の増殖および細胞分裂よりも通常著しく遅く、一般に細胞数がはるかに少ないため、動物細胞の増殖の検出に不向きであることが示されている。
通常、物質の病原性および細胞傷害性を測定するための動物細胞試験は、以下の方法の１つに基づいている：
（１）分子生物学的方法
（２）以下による動物細胞の生存率（細胞集団内の生細胞数としての生存率）の測定、すなわち、
・染色（表現型法）またはＭＳによる代謝活性の分析
・ＭＳを用いた特定の薬力学バイオマーカーの検出
・動物細胞の細胞計数、または顕微鏡法／イメージング法（表現型法）による動物細胞のコンフルエンスもしくは他の形態学的パラメータの測定。
たとえば、多くの場合、微生物毒性の検出はいまだに表現型によって行われている。分子生物学的方法（たとえばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）による遺伝子型検出は、毒性遺伝子が公知である例外的な場合（たとえばパントン‐バレンタインロイコシジン（Ｐａｎｔｏｎ‐Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ）および志賀毒素）にのみ可能である。
しかしながら、大部分の病原性特性は特定の遺伝子によってではなく複数の機構によってコードされており、その一部は分子生物学（遺伝子型決定）によっていまだ完全には解読されていない。さらに、病原体でのその制御は非常に複雑であるため、いわゆる遺伝子型（コードされた遺伝物質の全体）は、表現型（明確な特性）と必ずしも一致しない。
したがって、総合的な病原性の測定は表現型検出法によってのみ可能であるが、これらはいずれも複雑で高価であり、結果が得られるまで比較的長い時間を要する。その結果、研究所は、高価な装置および複雑な方法といった、一般的な病原性の測定に必要な要件を満たすことができるが、ルーチン検査室では通常できないため、病原性の測定は、現在のところ、ほぼ例外なく研究所に限定されている。
代謝活性は、たとえば、ＭＴＴ細胞傷害性試験［ＩＳＯ １０９９３‐５：２００９（Ｅ）］によって検出することができる。ＭＴＴ試験では、黄色物質ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド）が生存細胞によって代謝的に還元されて青紫色物質ホルマザンになる。生存細胞数は、測光法を用いて測定された色強度と相関する。染色の光検出には、通常、セミハイスループットＵＶ分光光度計が用いられる。
しかしながら、これらの試験の使用は、少なくとも２つの問題点によって著しく阻まれる。１つ目は、細胞傷害性試験を実施するために現在必要とされている時間の長さである。上記のＭＴＴ試験の場合、結果が出るまでの時間は約３日である。２つ目は、これらの試験が高度に専門化された検査室に限定されざるを得ないほどに、細胞傷害性試験の実施が技術的に非常に複雑であり、特別な装置を利用できることが必要であることである。
表現型法に加えて、真核細胞内の特定の個々の薬理学的バイオマーカーを検出して活性物質の効果を特異的に検出するために、間接的ＭＳ法が使用される。
ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦを用いた個々の薬力学バイオマーカーの検出については、非特許文献２に記載されている。ＭＡＬＤＩ支持体上の真核細胞については、非特許文献３に記載されている。試料は、新規なペプチドおよびタンパク質を発見する目的で分析された。
さらに、薬物の効果を研究するための個々の薬理学的バイオマーカーの検出のために、高空間分解能のＭＡＬＤＩ‐ＭＳＩを用いた方法も、個々の細胞における効果を可視化するために用いられている（非特許文献４、非特許文献５）。しかしながら、このためには、特定の薬理学的バイオマーカー（たとえば代謝物の変化）だけでなく、活性物質との直接的な関係も知らなければならない。別の欠点は、１つの薬理学的バイオマーカーをすべてのクラスの活性物質に普遍的に用いることができないことである。さらに、バイオマーカーの検出によって、通常、細胞の生存率または物質の細胞傷害性についてなんら信頼できる記載ができないことも不利である。さらに、特に細菌、真菌、またはウイルスなどの細胞傷害性因子は、動物細胞からのバイオマーカーを用いて検出することが困難である。さらに、高空間分解能ＭＡＬＤＩ ＭＳＩシステムは非常に高価であり、利用可能なルーチン検査室はわずかしかない。
したがって、細胞計数および細胞のコンフルエンス（または被覆率）の測定が代わりに用いられる。これらは、細胞の増殖および分裂能力を確実に検出するために顕微鏡モジュール、画像およびデータの取得、ならびに強力な画像およびデータ解析を用いる生細胞イメージング装置を用いて実施される（非特許文献６）。この場合の欠点は、必要な装置が非常に高価であることと、少数のルーチン検査室でしか利用できないことと、装置の操作のためにスタッフが特別な訓練を受けなければならないことである。簡単な顕微鏡を使用すれば装置の購入費は安くなるが、顕微鏡による評価は時間がかかり、かつ主観的である。
国際公開第ＷＯ ２０１８／０９９５００ Ａ１号明細書
Ｅ．Ａ．Ｉｄｅｌｅｖｉｃｈ， Ｋ．Ｓｐａｒｂｉｅｒ， Ｍ．Ｋｏｓｔｒｚｅｗａ， Ｋ．Ｂｅｃｋｅｒ， Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｉｒｅｃｔ‐ｏｎ‐ｔａｒｇｅｔ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｖｏｌｕｍｅ ２４， Ｉｓｓｕｅ ７， ２０１８ Ｕｎｇｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＭＡＬＤＩ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＯＡＴＰ２Ｂ１ Ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ２９４ Ｄｒｕｇｓ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２０２０ Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ，Ｊ．，Ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｍａｔｒｉｘ‐ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ‐ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ‐ｏｆ‐ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ‐ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４９， ｐ．４１‐４８（１９９９） Ｍｕｎｔｅａｎｕ Ｂ．ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂｅｌ‐Ｆｒｅｅ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｍａｔｒｉｘ‐Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ‐Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｂｉｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍａｇｉｎｇ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１４ Ｒａｍａｌｌｏ， Ｃ．ｅｔ ａｌ．， Ｆａｓｔ Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ‐Ｓｃａｌｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ‐Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｉｍａｇｉｎｇ， Ａｄｖ． Ｂｉｏｌｏｇｙ； ２０２１ Ｃａｒｌｓｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｈｉｇｈ‐Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊｕｌ ２０２０， ２１５‐２２５
本発明の目的は、従来技術の上に記載された欠点を克服することであり、特に、１つ（または複数）の細胞傷害性因子が存在するかどうかが不明の分析試料中の細胞傷害性因子の存在を測定するための代替方法を提供することであり、本方法は、信頼性があり、簡単、迅速、安価である。
本発明のさらなる目的は、動物細胞に対する潜在的細胞傷害性因子の効果およびその毒性を、信頼性をもって、簡単、迅速、安価に測定することである。
このような方法を実施するためのシステムを提供することが本発明のさらなる目的である。
この目的は、特許請求の範囲に記載の独立請求項１の特徴を有する方法、独立請求項２の特徴を有する方法、独立請求項３の特徴を有する方法、または独立請求項２１の特徴を有するシステムによって実現される。有利な実施の形態は、従属請求項に見出すことができる。
すなわち、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料が質量分析試料支持台の少なくとも１つの試料スポットに供給される試料供給ステップＡと、
質量分析試料が培養装置の質量分析試料支持台の試料スポットでインキュベートされる培養ステップと、
質量分析試料の残液が試料スポットから除去される液体除去ステップと、
空間分解質量スペクトルが、空間分解能質量分析計によって、試料スポットの少なくとも部分領域における複数の測定位置で記録される測定ステップＡであって、マトリックスベースの空間分解能質量分析計を使用するとき、測定ステップＡにおける空間分解質量スペクトルの記録の前に、先行する試料調製ステップＡにおいて、試料スポットの調製が、試料スポットの少なくとも１つの部分領域へのマトリックスの正しい位置への適用（ｔｒｕｅ‐ｔｏ‐ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）によって実施される測定ステップＡと、
各空間分解質量スペクトルが、動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの存在について分析され、細胞存在値が各測定位置に割り当てられる第１評価ステップＡと、
動物細胞による被覆率が、測定位置の細胞存在値から、試料スポットの少なくとも部分領域について測定される第２評価ステップＡと、
および／または、測定された被覆率から増殖能が導出される第３評価ステップＡと、
動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果が、第２評価ステップＡの測定された被覆率から間接的または直接的に導出される第４評価ステップＡであって、この目的のために、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果が、第２評価ステップＡ、第３評価ステップＡの２つのステップの少なくとも１つの結果から導出される第４評価ステップＡと、
を含む方法、を提供することによって、分析試料中の細胞傷害性因子の存在を、信頼性をもって、簡単、迅速、安価に確認することができる。さらに、動物細胞に対する潜在的細胞傷害性因子の効果を試験し、その毒性を、信頼性をもって、簡単、迅速、安価に測定することができる。
空間分解能質量分析計は、分析試料の細胞傷害性効果を測定するために使用することができることが示されている。動物細胞は、一般に、微生物と比較して増殖および分裂がはるかに遅く、試料スポットにおける細胞数（あれば）はわずかな増加に留まる。そのため、試料スポットごとの合計質量スペクトルを生成する非空間分解能（ｎｏｎ‐ｓｐａｔｉａｌ‐ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）質量分析計のための質量分析試料からの動物細胞の培養は、試料スポット全体で十分な細胞量を得るためには、それに応じて長時間実施しなければならない。これによって分析時間が長くなり、このような手法は適用には非実用的である。また、培養前に供給された動物細胞（種細胞）からの質量分析シグナルが、動物細胞に対するの細胞傷害性効果の検出をより困難にするため、試料スポットの合計質量スペクトルは、しばしば不明瞭である。一方で、分析試料の細胞傷害性効果の測定において、前述の欠点を回避するために、試料スポットの動物細胞の面積拡大、したがってその増殖能、最終的には細胞傷害性効果を測定することができることが認識されている。
好ましくは、試料スポットの動物細胞の面積の程度、増殖能、遊走能、および／または細胞傷害性効果が空間分解能質量分析計によって測定される。この目的のために、好ましくは、試料スポットの特定の時点の被覆率および／またはそれから導出される増殖能が測定される。特に好ましくは、試料スポットの動物細胞の伸長は、特定の時点における被覆率を測定することによって測定される。好ましくは、試料スポットの総面積は既知である。
これは、動物細胞でも細胞増殖および細胞拡大を迅速に検出することができることを意味する。これは、特に、付着増殖細胞に使用することができる。したがって、好ましくは、動物細胞は付着増殖（付着性増殖）動物細胞である。
また、空間分解能質量分析計による検出は、この目的のために以前用いられていた顕微鏡法またはイメージング法よりも迅速かつ簡単であり、場合によってはこの方が安価でもある。たとえば、検査室ですでに利用可能な質量分析計は、多くの場合、ソフトウェアの修正によってこの手法を実行することが可能である。さらに、このプロセスは普遍的に使用することができる。
統計的目的および測定精度の理由から、試料スポット上の不均一な試料分布を防ぐために、非空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦでも、測定は、すでに、通常、試料スポットの複数の測定位置で実施されているが、これらは、データ処理時または評価時に合計パラメータ／ＭＳスペクトルに合算される。このように、この場合、空間情報は使用されないままである。このように、多くの非空間分解能ＭＡＬＤＩ ＴｏＦには、通常、装置に関連する前提条件が存在する。非空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳを、記載された方法のために空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳに変換するためには、多くの場合、ソフトウェアの調整で十分であることが認識されている。
さらに、細胞傷害性効果を結論づけるためには、複数の測定位置で細胞の有無のみを確認するだけでよいので、動物細胞のほぼすべての細胞特異的質量分析シグネチャーが、動物細胞の検出、したがって細胞傷害性効果の検出に適していることが認識されている。検出する必要があるのは細胞の有無のみである。特定の代謝物の増加などの特定の薬理学的バイオマーカーは必要ない。たとえば、細胞の代謝状態に対する効果についての結論を引き出すためにバイオマーカーの濃度の変化を追跡することはない。したがって、たとえば細胞傷害性因子に代謝的に関連する特定の代謝活性または特定のバイオマーカーに関する知見は必要ない。細胞傷害性因子それ自体および動物細胞に対するその作用機序（たとえば代謝に関する作用機序）に関する情報も必要ない。また、複数の細胞傷害性因子が存在する場合の相互効果についての知見も必要ない。細胞傷害性因子が公知である必要さえない。このため、本方法は細胞傷害性因子に普遍的に適用可能である。
測定位置での細胞の存在を推定するために、１つまたは複数の細胞特異的質量分析シグネチャーが用いられる。次いで、これは、被覆率（請求項１および請求項２）または細胞拡大距離（請求項３）を測定して、細胞の増殖能、細胞の遊走能、および／または分析試料の細胞傷害性効果を推定するために用いられる。
本方法の好ましい適用において、分析試料が細胞傷害性効果を有する細胞傷害性因子を含むかどうかは、初めは不明である。動物細胞に対する細胞傷害性効果の存在は、この手法によって測定される。本方法による動物細胞に対する細胞傷害性効果の検出は、少なくとも１つの細胞傷害性因子の存在を示す。
分析試料における病原性病原体の存在は、動物細胞に対する細胞傷害性効果または細胞傷害性因子の存在から直接推論することができる。
本方法のさらに好ましい適用では、特定の潜在的な細胞傷害性因子が、動物細胞に対する実際の細胞傷害性効果を有する細胞傷害性因子であるかどうかが測定される。一方で、特定の種類の動物細胞に対する公知の細胞傷害性因子の効果は、さらに他の種類の動物細胞に対しても本方法を用いて試験することができる。さらに、細胞傷害性因子を潜在的に中和する因子も、細胞傷害性因子に対するその効果を試験することができる。
たとえば、請求項１、請求項２、および／もしくは請求項３、および／もしくはその従属請求項に記載の方法、ならびに／または請求項２１に記載のシステムを、病原性表現型の測定に使用してもよい。その効果が未知である医薬または物質も、その効果を試験することができる。本方法は、複合的な多因子病原性の検出において有利である。したがって、本方法は、相互効果においてのみその細胞傷害性効果を示す複数の細胞傷害性因子の存在下での細胞傷害性効果の検出にも適している。
マトリックスベースの質量分析計を使用するとき、その領域における質量分析シグナルの空間分解能（すなわち、試料スポットに対する動物細胞の位置）が歪まず、各測定位置の細胞存在値および／または被覆率を、本方法で信頼性をもって測定することができるように、正しい位置で試料にマトリックスを適用する必要があることも認識されている。マトリックスの正しい位置への適用の場合、マトリックスは、試料スポットでの動物細胞の細胞内容物および細胞成分の２次元混合が（ほぼ）回避されるように適用される。
好ましくは、特許請求されるプロセスは、それぞれの処理ステップを含む。あるいは、好ましくは、特許請求されるプロセスは、それぞれの処理ステップからなる。好ましくは、特許請求されるプロセスは、特許請求の範囲の文言の順に実施される。
空間分解質量スペクトルは、空間分解能質量分析計によって生成される。空間分解とは、好ましくは平面内で分解されることを意味する。測定位置は、その測定のために特別に標的とされる。好ましくは、測定位置の位置座標が記録される。好ましくは、測定位置の空間座標が各空間分解質量スペクトルに割り当てられる。好ましくは、空間分解能質量分析計は、試料スポットの複数の測定位置を特異的に測定し、好ましくは、それぞれの関連する測定位置の空間座標を、記録された各質量スペクトルに割り当てる。あるいは、好ましくは、空間分解能質量分析計は、試料スポットの各測定位置に空間座標を割り当て、好ましくは、記録された各質量スペクトルに測定位置を割り当てる。したがって、生成された各空間分解質量スペクトルを、試料スポットに定義された測定位置に割り当てることができる。さらに、好ましくは、測定位置の位置座標は記憶される。しかしながら、請求項１および請求項２に記載の本発明の特定の代替的な実施の形態において、測定位置の正確な位置座標を記録することなく、試料スポットの測定位置に空間分解質量スペクトルを割り当てるだけで十分な場合がある。決定的な要因は、測定位置が、空間分解能質量分析計によって、標的化された方法で（すなわち指定された測定位置に従って）測定され、測定位置の個々の質量スペクトルが全／合計質量スペクトルに含まれず、それぞれの測定に割り当てられることである。
各測定位置の空間座標が記録され、空間分解質量スペクトルに割り当てられる（請求項３）。
空間分解能質量分析計は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計であってもよいし、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計であってもよい。マトリックスベースの空間分解能質量分析計は、マトリックスベースのイオン化プロセスを用いる質量分析計である。これは、質量分析試料の分子をイオン化するために、前記のスペクトロメータが、マトリックス（通常は液体形態で適用される）を使用することを意味する。これらは、たとえば、ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ質量分析計を含む。非マトリックスベースの空間分解能質量分析計は、非マトリックスベースのイオン化方法を用いる質量分析計である。これは、前記のスペクトロメータが、質量分析試料の分子をイオン化するために、マトリックスを使用しないことを意味する。これらは、たとえば、ＤＥＳＩ質量分析計を含む。好ましくは、空間分解能質量分析計は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計である。好ましくは、空間分解能質量分析計は、マトリックスベースの空間分解ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳである。この目的のために、ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳは、空間分解質量スペクトルを記録することができるように構成される。さらに好ましくは、空間分解能質量分析計は、イメージング機能を有するＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳであり、これは、高い面密度を有する空間分解質量スペクトルの取得を可能にし、したがって精密な測定を可能にする。前記のスペクトロメータは取り扱いが容易であり、高速である。
さらに、非空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳは、簡単なソフトウェア変換によって空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳに変換することができる。簡単な非空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ ＭＳは、比較的安価に購入することができ、操作が容易であり、たとえば微生物の同定のための多くの検査室にすでに設置されているという利点がある。
このプロセスにおける動物細胞の付着および増殖は、培養ステップ中の１つの処理ステップで行うことができる。試料供給ステップＡ、Ｂにおいて動物細胞がすでに付着して供給されており、また、付着した動物細胞の増殖が培養ステップにおいてのみ行われることから、動物細胞の付着および増殖は、２つのステップにおいて行うこともできる。好ましい実施の形態では、試料供給ステップＡ、Ｂにおいて質量分析試料が供給されるとき、動物細胞、培地および／または細胞傷害性因子などの質量分析試料の成分は、試料スポットにすでに存在している。これは、たとえば、乾燥、冷却および／または凍結した形態で行うことができる。したがって、増殖可能な動物細胞がすでに存在する質量分析試料支持台を顧客に販売することができる。好ましい実施の形態では、質量分析試料が試料供給ステップＡ、Ｂで調製されるとき、動物細胞、培地および／または細胞傷害性因子などの質量分析試料の成分は、試料スポットにすでに存在する。この好ましい実施の形態では、液体（好ましくは緩衝液）、栄養培地または水に溶解または懸濁された、質量分析試料スポットの少なくとも１つの成分が供給される。特に好ましい実施の形態では、動物細胞および培地がすでに存在し、分析試料または細胞傷害性因子が適用される。たとえば、培地中の動物細胞は凍結乾燥することができる。さらに、乾燥または凍結乾燥した動物細胞および培地を試料スポットに局在化させるために、試料スポットに水溶性接着剤を供給してもよい。別の好ましい実施の形態では、動物細胞、培地および細胞傷害性因子を含む質量分析試料のすべての成分が、試料スポットに適用される。好ましくは、動物細胞は液体培地に懸濁される。
動物細胞は、少なくとも分析試料または細胞傷害性因子の適用前は、生存可能であり、増殖性および／または遊走性である。
培地は、動物細胞が増殖および／または遊走に必要とする成分をすべて含む。培地は、合成培地または複合培地とすることができる。さらに、培地は、細胞傷害性因子としての細菌または真菌の培養をさらに可能にする成分を含むこともできる。
培養ステップにおける培養装置の質量分析試料支持台の試料スポットでの質量分析試料の培養は、動物細胞の増殖を可能にする最適の培養条件を作り出す役割を果たす。好ましくは、対照試料を含む質量分析試料の培養は、同時に完了する。これによって、特定の時点で被覆率および／または細胞拡大距離を測定することが容易となる。これによって、増殖能および／または遊走能を測定することが容易となる。培養時間および培養条件は、動物細胞に適合させる。好ましくは、培養時間は、細胞傷害性因子を含まない対照試料の場合では、部分領域または試料スポット全体が培養終了時に動物細胞でほぼ完全に覆われるように選択される。
この目的のために、培養装置は、好ましくは動物細胞に最適の増殖条件を提供する。これらは、湿度、温度、二酸化炭素含有量および酸素含有量を含む。したがって、培養装置は、湿度、温度、培養装置内のＣＯ２含有量、培養装置内のＯ２含有量、および／または他の環境条件などの環境条件を制御する。ＣＯ２インキュベーターは、特に培養装置として機能することができる。あるいは、培養装置は、元の試料が得られた人体または動物体の条件と同様の条件に設定することもできる。好ましくは、培養装置内の空気は、質量分析試料の液体、特に培地が実質的に蒸発しないように水で飽和させる。
動物細胞に増殖、分裂および／または遊走する条件および時間を与えた後、残液が除去される。残液は、質量分析試料の液体成分の混合物である。たとえば、動物細胞はそれらに懸濁され、かつ／または細胞傷害性因子はそれらに溶解される。質量分析試料の液体成分は、培地、緩衝液、水、血液、尿、分泌物およびその他の液体成分を含んでもよい。残液は、好ましくは、吸収材との接触および／または乾燥によって除去される。乾燥は、たとえば、簡単な風乾、特定の換気および／または熱乾燥によって行うことができる。残液、特に培地を除去することによって、細胞特異的質量分析シグナルが検出されやすくなる。さらに、ほぼ乾燥した表面は、マトリックスの局所的な適用に有利である。非マトリックスベースの空間分解能質量分析計の場合では、測定が液体残渣の悪影響を受けないように、また、マトリックスベースの空間分解能質量分析計の場合では、マトリックスの正しい位置への適用を不可能にする動物細胞上の液体膜がなくなるように、残液が十分に除去されることが非常に重要である。
好ましくは、付着増殖動物細胞を用いるときは、残液を吸い上げる。これによって、懸濁液中の動物細胞が試料スポットに沈着し、結果が歪曲されるのがほぼ防止される。これによって、プロセスの精度が高まる。質量分析試料の培地および残りの成分からの非細胞特異的質量分析シグナルの干渉が減少する。あるいは、残液は乾燥によって除去される。これは、特に、懸濁培養した動物細胞を用いるとき、懸濁された細胞が試料スポットに沈着し、表面に付着することができるため有利になる。原理的には、付着増殖細胞を懸濁形態で適用する場合にも、試料スポットの残りの非付着動物細胞に応じて初期細胞数および培養時間を調整すれば、液体除去のための乾燥も可能である。特に、マトリックスベースの空間分解能質量分析計を使用する場合、信頼性をもって残液を除去するために、吸引後に乾燥を行うのが好ましい。これによって、続いてマトリックスを空間的に適用する場合の解像度が上がる。
マトリックスベースの空間分解能質量分析計を用いる場合、測定ステップＡの前に試料調製ステップＡが行われる。このステップは、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計にはない。試料調製ステップＡでは、試料スポットは、試料スポットの少なくとも部分領域にマトリックスを適用することによって調製される。これによって、試料スポットの、ある測定位置の検体と、試料スポットの他の測定位置の検体との混合がほぼ回避される。すべての検体はほぼその場に留まる。
正しい位置への適用の場合は、マトリックスは、１滴または数滴の大きな液滴の形態で試料スポットに適用されることはない。代わりに、適用は、好ましくは液滴または昇華のいずれかによって、試料スポットに分布する多数の小さい部分で行われる。マトリックスの適用は、好ましくは、試料スポットあたり多数のマトリックス液滴を適用することによって実施される。この場合、複数のマトリックス液滴は、好ましくは、分散して、試料スポットまたは試料スポットの部分領域に適用される。マトリックス液滴の適用は、適用方法に応じて、標的化されるか、または標的化されない。その結果、適用プロセスの終了時に、試料スポットの部分領域全体または試料スポット全体は、好ましくはマトリックス液滴で覆われ、そのため、部分領域の全動物細胞または試料スポット全体が、質量分析法による測定にアクセス可能になる。動物細胞が試料スポットにまたがる液滴によって覆われないことは、マトリックスの正しい位置への適用にとって非常に重要である。
マトリックスは、通常、特に細胞の破壊をもたらす。マトリックスの正しい位置への適用は、各動物細胞の細胞内容物および断片が試料スポットの大部分に広がって、細胞を含まない測定位置を覆うことがないようにする。これによって、測定の歪曲が防止される。試料スポット全体への大きなマトリックス液滴の適用の場合、試料スポット全体を覆う、拡散によって生じる細胞内容物の広い分布に起因して、細胞の位置の正確な空間分解能は、もはや不可能であろう。好ましくは、マトリックス液滴の直径は、動物細胞の直径よりもかなり小さい。これによって、細胞内容物が、ほぼ（元の）細胞境界内に留まることが支持される。マトリックス適用は、非マトリックスベースのＭＳ、すなわち、ＤＥＳＩまたはＳＩＭＳなどのイオン化方法を用いるＭＳには必要ない。
測定ステップＡにおいて、空間分解能質量分析計によって試料スポットの少なくとも部分領域の多数の測定位置で空間分解質量スペクトルを記録することによって、試料スポット上の測定された各測定位置には、次の評価ステップのための専用の質量スペクトルが割り当てられる。試料スポットの部分領域または試料スポット全体を測定位置とすることができる。好ましくは、試料スポットまたは試料スポットの部分領域は、全表面にわたって測定されず、格子の形態でランダムに測定、すなわちスキャンされる。測定位置の数および／または測定位置の格子は、空間分解能質量分析計だけでなく、本方法の所望の精度およびスピードに依存する。好ましくは、試料スポットの部分領域を系統的にスキャンする。これによって、この手法がスピードアップする。あるいは、試料スポット全体を系統的にスキャンすることもできる。これによって、プロセスの信頼性が向上する。
第１評価ステップＡにおいて、動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの存在について各空間分解質量スペクトルを分析することによって、その後の被覆率または細胞拡大距離の測定のためのデータベースが作成される。各空間分解質量スペクトルは、好ましくは単独で分析される。質量スペクトルが依然として空間的に分解されていることが非常に重要である。同じ測定位置の複数の質量スペクトルをオフセットすることができる。特に、計算には平均化を含めることができる。しかしながら、異なる測定位置からの質量スペクトルは合計されない。
好ましくは、細胞特異的質量分析シグネチャーは、記録された空間分解質量スペクトルにおいて、ほぼまたは完全に、明確に動物細胞に割り当てることができる選択された一連の質量分析シグナルからなる。さらに好ましくは、これらのシグナルは、バックグラウンドノイズよりも、および／または複数の非細胞特異的質量分析シグナルよりも有意に高い強度を有する。動物細胞の空間分解質量スペクトルの細胞特異的質量分析シグナルは、動物細胞または破壊された動物細胞に対する測定位置の位置に応じて若干異なる可能性はあるが、常に動物細胞の存在を示す。好ましくは、細胞特異的質量分析シグネチャーは、分析試料を変えても高い再現性を示す。さらに好ましくは、細胞特異的質量分析シグネチャーは、様々な異なる動物細胞にわたっても高い再現性を示す。これによって、プロセスの信頼性が向上する。細胞特異的質量分析シグナルおよび／または細胞特異的質量分析シグネチャーは、使用する動物細胞の種／種類によって異なる場合もある。前記シグナルは、特定の組織型、細胞培養株、生物または細胞のさらなる分類群に特異的であり得る。
空間分解質量スペクトル全体から選択された細胞特異的質量分析シグネチャーは、１つまたは複数の細胞特異的質量分析シグネチャーに組み込むことができる。細胞特異的質量分析シグナルおよび細胞特異的質量分析シグネチャーは、好ましくは、データ処理ユニットのデータベースにおいて参照値としてすでに利用可能であり、分析に使用することができる。
好ましくは、試料スポットのすべての測定位置に同じ細胞特異的質量分析シグネチャーが用いられる。また、代替的な実施の形態では、個々の測定位置または試料スポットの細胞特異的質量分析シグネチャーは、互いに異なってもよい。細胞特異的質量分析シグナルの多様な選択肢を有する、複数の細胞特異的質量分析シグネチャーを使用することもできる。細胞特異的質量分析シグネチャーまたは質量分析シグネチャーの選択において決定的な要因は、それが、動物細胞が存在するか否かを各測定位置について明確に測定することができることである。
特別な場合では、細胞特異的質量分析シグネチャーは、ただ１つの細胞特異的質量分析シグナルからなってもよい。これによって、空間分解質量スペクトルの分析が単純化されるが、本方法の頑健性が低下する場合がある。特に、糞便試料などの生物源試料(biological source sample)を用いる場合、源試料(source sample)の成分からのシグナルによる細胞特異的質量分析シグナルの重ね合わせによって、本方法の頑健性が低下する可能性がある。
したがって、好ましくは、複数の細胞特異的質量分析シグナルおよび／または複数の細胞特異的質量分析シグネチャーを含む細胞特異的質量分析シグネチャーが用いられる。特に、細胞特異的質量分析シグナルと同様なｍ／Ｚ比を有する非細胞特異的質量分析シグナルの割合が高い試料の場合、複数の細胞特異的質量分析シグナルは、細胞特異的質量分析シグネチャーにとって有益である。好ましくは、最も顕著な質量分析シグナルまたは細胞特異的質量分析シグナルの最も顕著な質量分析シグナルが、細胞特異的質量分析シグネチャーに用いられる。好ましくは、１つまたは複数の細胞特異的質量分析シグナルは、バックグラウンドノイズに対して高い強度を有し、かつ／または非細胞特異的シグナルから十分に離れている。バックグラウンドノイズに対して高い強度とは、質量分析シグナルの強度が、平均バックグラウンドノイズに対して少なくとも２倍であることを意味する。好ましくは、質量分析シグナルは、平均バックグラウンドノイズの少なくとも５倍高い。さらに好ましくは、質量分析シグナルは、平均バックグラウンドノイズの少なくとも１０倍高い。
特に好ましくは、質量分析シグナルは、平均バックグラウンドノイズの少なくとも５０倍高い。さらに、細胞特異的質量分析シグネチャーの細胞特異的質量分析シグナルは、好ましくは、非細胞特異的質量分析シグナルから十分離れている。好ましくは、細胞特異的質量分析シグネチャーは、少なくとも部分的にまたは完全に隣接する細胞特異的質量分析シグナルからなる。しかしながら、直接隣接しない細胞特異的質量分析シグナルも含んでもよい。
空間分解質量スペクトルが、細胞のどの部分を記録したかに応じて、得られた質量スペクトルが異なる場合がある。したがって、さらに好ましい実施の形態では、細胞の存在を測定するために、様々な細胞特異的質量分析シグネチャーを使用することができる。
別の特別な場合では、細胞特異的質量分析シグネチャーは、記録された空間分解質量スペクトルにおけるすべての細胞特異的質量分析シグナルからなってもよい。しかしながら、この特別な場合では、個々の細胞特異的質量分析シグナルの存在がたとえば培地の非細胞特異的質量分析シグナルによってマスクされる場合があるので、好ましくは分析ステップに重み付けが使用される。さらに、細胞特異的シグナルまたはシグネチャーは、好ましくは、培地または細胞傷害性因子などの質量分析試料の他の成分によって生成されないか、またはほとんど生成されない。したがって、細胞特異的質量分析シグネチャーの細胞特異的質量分析シグナルは、本質的に、質量分析試料中の培地、分析試料または他の成分の質量スペクトルには存在しない。これによって、動物細胞が測定位置に存在するか否かについて明確に示すことができる。
質量分析試料の成分は、たとえば、培地、動物細胞、分析試料、および培養または測定に必要なその他の成分である。さらに、質量分析試料の成分は、質量分析試料の成分の一部も含む。これには、緩衝液、水、固形物、および質量分析試料の成分を構成する他の部分を含むことができる。
さらに、動物細胞は、動物細胞が構成されるかまたは含まれる動物細胞の成分を有する。動物細胞の成分は、たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖質、リポソーム、酵素、および／または合成ブロック、断片および／またはそれらの代謝物、および／または細胞質を含んでもよい。好ましくは、細胞の分泌物質は、細胞の成分として含めない。さらに好ましくは、細胞特異的シグナルを生成する、動物細胞の成分の生きている動物細胞における量、存在または産生は、質量分析試料、特に細胞傷害性因子の成分の影響を受けない。
あるいは、質量分析試料の成分は、個別に測定することもできる。細胞特異的質量分析シグナルは、動物細胞の質量スペクトルと、培地、細胞傷害性因子および試料のその他の成分の質量スペクトルとを比較することによって測定することができる。たとえば、細胞特異的質量分析シグネチャーは、２つの対照試料に対して測定される。ここで第１対照試料は動物細胞を含まず、質量分析試料の培地および他の成分を含む。ここで第２対照試料は動物細胞を含む質量分析試料のすべての成分を含み、細胞傷害性因子または分析試料を含まない。この比較は、質量分析評価手法の分野で経験を積んだ専門家に公知の数学的手法によって実施される。
第１評価ステップＡ、Ｂにおいて、動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの存在に関する各空間分解質量スペクトルの分析に基づいて、測定ステップＡ、Ｂ中に、測定された測定位置に動物細胞または破壊された動物細胞が存在していたかどうかが測定される。第１評価ステップＡ、Ｂにおける動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの分析は、細胞特異的質量分析シグネチャーの分析に基づく。結果は、細胞存在値に割り当てられる。これは、請求項２記載の第１評価ステップＣおよび測定ステップＣにおける質量スペクトルについても同様に行う。好ましくは、細胞存在値は、「細胞が存在する」または「細胞が存在しない」という２つの値を有する。細胞存在値は、好ましくは、測定された各測定位置に割り当てられる。この細胞存在値から、被覆率または細胞拡大距離が測定される。質量スペクトルの評価、たとえば、特定のピークまたは強度の存在の分析と、細胞が存在するか否かのその後の評価は、「細胞存在値の割り当て」機能にも含まれる。好ましくは、細胞存在値は明示する必要はない。好ましくは、動物細胞が測定位置に存在するか否かの測定が、この特性を十分に満足する。
第２評価ステップＡ、Ｃにおいて、測定位置の細胞存在値から試料スポットの少なくとも部分領域についての動物細胞による被覆率を測定することによって、試料スポットの動物細胞の程度を容易に測定することができる。好ましくは、被覆率は、試料スポット全体について測定される。好ましくは、試料スポットの総面積は既知である。
被覆率は、試料スポット全体をスキャンする場合、直接測定することができ、部分領域をスキャンする場合、試料スポットについて外挿することができる。試料スポットの部分領域についての被覆率を測定する場合は、部分領域のサイズは、好ましくは既知である。
被覆率は、試料スポットまたは試料スポットの一部の領域が動物細胞によって覆われているか、または覆われていた（破壊された細胞の場合）割合を示す。好ましい実施の形態では、被覆率はコンフルエンスの程度である。ここで、被覆率は、付着増殖している動物細胞によって測定される。最も簡単な方法では、被覆率は、細胞存在値が負の測定位置の数に対する、細胞存在値が正の測定位置の数を定めることによって測定することができる。あるいは、被覆率は、部分領域に対する細胞存在値を定めることによって測定することもできる。
別の代替的な好ましい実施の形態では、本方法は、測定された被覆率から動物細胞の増殖能が導出される、さらなる第３評価ステップＡを含む。次いで、第４（好ましくは最終）評価ステップにおける細胞傷害性因子の細胞傷害性効果は、好ましくは、測定された動物細胞の増殖能から導出される。この評価ステップを導入することによって、簡単な方法で増殖能を測定することができる。好ましくは、増殖能は程度で等級付けされる。これには、質量分析試料の被覆率と、対照試料の被覆率または既存の参照値との比較を含む。利用可能な参照値は、好ましくはデータベースで利用可能である。好ましくは、対照試料は動物細胞および培地を含む。増殖レベルは、少なくとも２つの値を有する。第１の値では、細胞が増殖できない。すなわち、細胞傷害性因子は動物細胞に対する細胞傷害性効果を有する。第２の値では、細胞は完全に増殖する。すなわち、動物細胞の増殖能は細胞傷害性因子によって影響を受けない。２つの値の間に、等級付けされた増殖能を示す１つまたは複数の等級を設けてもよい。好ましくは、増殖能は百分率で示され、１００％は増殖が阻害されないことに相当する。
動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果は、第４（好ましくは最終）評価ステップにおける第２評価ステップＡ、Ｃの測定された被覆率から間接的または直接的に導出される。この目的のために、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果は、第２評価ステップＡ、Ｃおよび／または第３評価ステップＡのステップの少なくとも１つの結果から導出される。好ましい実施の形態では、これは、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果が、被覆率から直接導出されることを意味する。第３評価ステップＡは、この手法では実施されず、第４評価ステップＡ、Ｃは、第２評価ステップＡ、Ｃ後に実施される。これによって、中間値の測定を回避し、評価を単純化することができる。さらなる代替的な好ましい実施の形態では、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果は、第３評価ステップＡから測定された増殖度から、すなわち被覆率から間接的に導出される。これによって、分析試料の細胞傷害性効果が測定される前に動物細胞の増殖能を測定することができる。これは、等級付けられた被覆率に関して、また中間情報として特に有利である。
さらなる代替的な好ましい実施の形態では、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果は、第２評価ステップＡ、Ｃにおける測定された被覆率から、かつ第３評価ステップＡにおける増殖能から測定され、両方の結果が考慮される。細胞傷害性効果は、好ましくは、複数のレベルでマッピングされる。細胞傷害性効果を導出するために、培養時間を含めることができる。
さらに、動物細胞は付着増殖している動物細胞であることが好ましい。増殖は試料スポットの表面に付着して進行するため、本方法は、付着増殖している動物細胞に対して特に有利である。付着増殖している動物細胞は、試料スポットにほぼ局在するため、本方法の信頼性が向上する。したがって、この手法の間、動物細胞はほぼその場に留まる。さらに、前記細胞は、培養ステップ中に予め表面に優先的に付着し、懸濁液中ではなく、そこで増殖する。懸濁液中の付着増殖細胞はまた、懸濁細胞のような凝集体を形成しない。動物細胞の付着は、遊走能の単独測定にも必要である。
さらなる有利な実施の形態によれば、測定された被覆率が部分領域および／または試料スポットを代表するように、試料スポットの少なくとも１つの部分領域において、複数の測定位置が局所的に分布することが提供される。これによって、この手法の信頼性が向上する。
好ましくは、この目的のために、複数の測定位置は均一な格子を形成する。好ましくは、均一な格子において、各非エッジ測定位置は、直交する４方向において直接取り囲んでいる測定位置から等間隔に配置される。
さらに好ましい実施の形態では、試料供給ステップＡ、Ｂにおける質量分析試料は、潜在的細胞傷害性因子中和因子をさらに含む。したがって、動物細胞に対する細胞傷害性因子または分析試料の効果を測定することができるだけでなく、細胞傷害性因子または分析試料に対する別の因子の中和効果を測定することもできる。細胞傷害性因子中和因子は、以下の非網羅的な群から選択されてもよい：抗生物質、抗菌物質、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、医薬品、抗病原性薬、抗体。適用に応じて、他の細胞傷害性因子‐中和因子が選択される。特に、本方法において、たとえば、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスなどの細胞傷害性因子に対する細胞傷害性因子‐中和因子の有効性を評価するために、細胞傷害性因子‐中和因子を使用してもよい。
増殖度および／または細胞傷害性効果を導出するために、分析試料を含む質量分析試料に加えて、少なくとも１つの対照試料が本方法によって処理されることがさらに有利である。このプロセスにおいて、分析試料に類似する方法を用いて、異なる試料スポットで対照試料が測定され、評価される。質量分析試料は、分析試料を含むか、対照試料であるかのいずれかである。
好ましくは、対照試料および、分析試料を含む質量分析試料は、この手法を、同じ質量分析試料支持台で同時に受けるか、かつ／または異なる質量分析試料支持台で連続して受ける。好ましくは、対照試料は、細胞傷害性因子を含まず、かつ、質量分析試料に用いられる、分析試料と同じ動物細胞および培地を含む。好ましい対照試料は、被覆率、細胞拡大距離、増殖能、遊走能および／または細胞傷害性効果を含む評価結果が既知の試料である。これは、評価結果が未知の検査試料に関する分析試料とは区別される。好ましくは、各質量分析試料支持台で、複数の対照試料も分析される。
さらに、好ましくは、第２評価ステップＡ、Ｃにおける被覆率の測定後に、中間評価ステップＡにおいて、対照試料の被覆率と、分析試料を含む質量分析試料の被覆率との比較が実施される。さらに、好ましくは、第２評価ステップＢにおける細胞拡大距離の測定後に、中間評価ステップＢにおいて、対照試料の細胞拡大距離と、分析試料を含む質量分析試料の細胞拡大距離との比較が実施される。
したがって、対照試料は、好ましくは、少なくとも１つの潜在的細胞傷害性因子および／または少なくとも１つの細胞傷害性因子および／または少なくとも１つの潜在的な細胞傷害性因子‐中和因子を含まない。好ましくは、対照試料は、質量分析試料に用いられる、分析試料と同じ動物細胞および培地を含む。したがって、この比較は、好ましくは、第３評価ステップＡ、Ｂにおける増殖能の導出および／または第４（好ましくは最終）評価ステップにおける細胞傷害性効果の導出に含まれる。これによって、被覆率、細胞拡大および／または細胞増殖が、対応する細胞傷害性効果に正確に割り当てられることを確実にする。これはまた、複数のプロセスの実行間での比較可能性を確実にする。
別の好ましい実施の形態では、試料調製ステップＡ、Ｂにおいて、質量分析試料は、培地および分析試料を適用する前に、試料スポットに動物細胞を予め存在させることによって供給される。たとえば、細胞は、凍結または凍結乾燥した状態で試料スポットに供給されてもよい。たとえば、質量分析試料支持台は、製造業者が、予めこの形態で供給することができる。これには、使用者が動物細胞の適用を省けるという利点がある。
特に好ましくは、培地および分析試料の適用の前に、動物細胞が試料スポットに予め付着している。これによって、培養ステップにおける培養の時間が短縮される。好ましくは、試料調製ステップＡにおいて、試料スポットの一部のみが、すでに付着した動物細胞によって覆われているため、その後の培養ステップにおいても増殖が検出できる。これは、すでに付着した動物細胞が、好ましくは、培地および分析試料の適用の前に試料スポットを不完全に覆っていることを意味する。試料調製ステップＡにおいて、試料スポットの領域の１０％～９０％の被覆率が有利である。さらに、試料調製ステップＡにおいて、試料スポットの領域の２５％～７５％の被覆率が好ましい。試料調製ステップＡにおいて、試料スポットの領域の３０％～５０％の被覆率が特に好ましい。好ましくは、質量分析試料支持台は、動物細胞を試料スポットに予め付着させて提供される。好ましくは、動物細胞による試料スポットの表面被覆の変化を検出するために、十分な数の無細胞位置が存在する。
代替的な好ましい実施の形態では、試料供給ステップＡ、Ｂにおいて、試料スポットに懸濁形態で動物細胞を適用することによって動物細胞が供給される。これには、多くの場合細胞がよりよく増殖し、動物細胞の種類を選択することができるという利点がある。したがって、特定の適用では、試料供給ステップＡ、Ｂにおいて、特定の人または患者の組織細胞も、動物細胞として使用することができる。たとえば、同じ人からの腫瘍細胞および正常組織細胞に対する化学療法薬の効果を直接試験することができる。
さらに、動物細胞を懸濁形態で適用する場合、液体除去ステップの後に、試料支持台の動物細胞を洗浄し、残留洗浄液を除去することによって洗浄ステップを実施することが好ましい。これによって、測定ステップＡ、Ｂ、Ｃにおいて、付着細胞のみが検出されることを確実にする。あるいは、プロセスを短縮するために、液体除去ステップを洗浄ステップに置き換えることもできる。動物細胞の洗浄は、通常、洗浄液として緩衝液を用いて行われる。たとえば、洗浄液が適用され、再び除去される。洗浄液の量は、好ましくは、試料スポットが完全に覆われるか、または試料支持台全体が濡れるように選択される。洗浄液および／または残液の除去は、たとえば、乾燥および／または吸引／吸着、たとえば吸収媒体との接触によって行うことができる。
代替的な代替的な好ましい実施の形態では、試料供給ステップＡ、Ｂにおいて、質量分析試料は、培地および分析試料を適用する前に、たとえば非付着状態で試料スポットに動物細胞を予め存在させることによって供給される。たとえば、細胞は、凍結または凍結乾燥した状態で試料スポットに供給されてもよい。質量分析試料支持台は、たとえば、製造業者が、予めこの形態で納入することができる。これによって、エンドユーザーが、動物細胞自体を供給または追加する必要がなくなる。残りの質量分析試料（特に縫合培地および分析試料）の適用後、好ましい手法は、懸濁形態の動物細胞の適用について上記のように進めることである。
本発明の有利な実施の形態によれば、分析試料は、源試料を供給することによって供給される。これによって、源試料を調製する手間が省ける。本発明の別の有利な実施の形態によれば、分析試料は、源試料の成分、たとえば可溶性成分を供給することによって供給される。源試料の第１精製または第１分離によって、特に培養および／または測定ステップＡ、Ｂ、Ｃに悪影響を及ぼす源試料の成分を除去することができる。たとえば、糞便試料の場合、未消化の食物残渣などの大きな不溶性断片の除去が関連する。さらに、細胞傷害性因子の完全な単離と比較して、単離プロセス中に細胞傷害性因子が枯渇または変化するリスクが低減する。本発明の代替的な有利な実施の形態によれば、単離および／または精製した形態で源試料の細胞傷害性因子を供給することによって源試料が供給される。細胞傷害性因子は、源試料から単離されたものであってもよい。単離は、よりコストがかかるが、干渉を受けずにこの手法が実施されることを確実にする。
好ましくは、元になる試料(sample of origin)は生物源試料である。さらに、源試料は、好ましくは、以下の群から選択される：人の試料、動物の試料、植物の試料または環境試料。ヒトまたは動物からの試料は、たとえば、糞便試料、尿試料、血液試料、全血、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料、創傷分泌物試料、他の分泌物および排泄物試料、創傷または粘膜からのスワブ、組織試料、筋肉試料、脳試料、腫瘍試料、臓器試料または皮膚試料、軟組織試料、痰試料、排泄物試料、または穿刺液試料であってもよい。
たとえば、植物の試料は、潜在的な有毒植物の試料であってもよい。
環境試料は、たとえば、水または廃水試料、土壌試料、大気試料、表面試料とすることができ、または食品（たとえば肉、牛乳、ヨーグルトまたは任意の他の食品）の試料とすることもできる。
別の有利な実施の形態では、動物細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞および／またはヒト細胞である。したがって、動物細胞の種類は、適用に応じて選択することができる。得られる質量スペクトルおよび細胞特異的質量分析シグネチャーは、通常、それぞれ、使用する動物細胞の種類に依存する。
特に、人に対する潜在的細胞傷害性因子の効果を試験する場合、動物細胞としてヒト細胞が用いられる。細胞傷害性効果が、特定の人について特異的に調べようとする場合、その特定の人からのヒト細胞が特に好ましい。たとえば、投与前に化学療法薬の効果を調べるために、ヒトの腫瘍細胞および正常組織細胞に対する化学療法薬の細胞傷害性効果を試験することができる。動物細胞は、神経細胞、特にヒト神経細胞にすることもできる。これは、たとえば、細胞傷害性因子としての神経毒の存在を調べるために特に有利である。両生類細胞または魚類細胞などの脊椎動物細胞の使用によって、たとえば、環境毒素の高感度試験が可能になる。
さらに、動物細胞が継代細胞株、特に連続ヒト細胞株の場合、有利である。継代細胞株は、特に培養が容易である。現在入手可能な細胞培養株の大部分は哺乳動物細胞株である。例は、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ、ＨＥＣＫ、ＰＥＲＣおよびＣＨＯ細胞株を含む。その培養の容易さから、前記細胞は、たとえば、新たな薬剤の探索のための広範なスクリーニング法に使用するのに適している。別の好ましい実施の形態では、動物細胞は、ヒトまたは動物から採取された組織試料に由来する。さらに、動物細胞は、好ましくは、ヒトまたは動物から採取された腫瘍試料に由来する。これは、薬物の投与前に、このヒトまたは動物に対するその薬物の細胞傷害性効果を測定するための簡単な方法である。
本発明の有利な実施の形態によれば、少なくとも１つの細胞傷害性因子は、以下の群からのものである：同位体およびそのイオンを含む化学元素（特定の金属など）、そのイオンを含む低分子化学化合物、高分子化学化合物、医薬品、毒素、古細菌、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、藻類、寄生虫、微生物および他の伝染性生物学的病原体の成分または分泌物質、生物起源の細胞傷害性物質、ヒト試料からの微生物起源の細胞傷害性物質、化学療法薬、抗腫瘍薬、タンパク質、ペプチド、抗体、抗菌物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬または抗菌薬または殺生物剤。ここで、微生物は、特に古細菌、細菌、ウイルス、単細胞真菌、単細胞藻類、原生動物および／または他の単細胞寄生虫を含む。上記の細胞傷害性因子群のメンバーは、細胞傷害性因子のそれぞれの種類を表すが、それらの量または多様性を限定するものではないことは明確にする必要がある。それぞれの細胞傷害性因子は、好ましくは、多数の単一単位でもある。たとえば、細胞傷害性因子細菌は多数の細菌細胞である。さらに、細菌細胞は、１つまたは複数の細菌株に属することができる。さらに、たとえば、様々なアーキア細胞（古細菌）、ウイルス粒子（ウイルス）、真菌細胞（真菌）、原生動物細胞、藻類細胞、寄生虫生物（寄生虫）、タンパク質分子（タンパク質）なども含まれる。記載されている生物（微生物、寄生虫）は、すべて生死を問わない。さらに、すべての記載されている生物およびウイルスの成分および／または分泌物質も含まれる。原生動物などの寄生虫は、特に好ましい単細胞寄生虫である。さらに好ましくは、寄生虫は、寄生虫などの多細胞寄生虫の成分および／または分泌成分も含む。したがって、細胞傷害性因子の群は、好ましくは、化学化合物からウイルス、および生物の成分から微生物または他の伝染性生物学的病原体までの範囲におよぶ。広範な適用性は、特許請求されたプロセスの特別な利点である。この群からの様々な細胞傷害性因子は、質量分析試料中に組み合わせで存在してもよい。
特に好ましくは、分析試料は、細胞傷害性因子として、細菌細胞、たとえば１つまたは複数の細菌株の細菌細胞、またはその成分を含み、かつ細胞傷害性因子‐中和因子として、細菌細胞またはその成分に対する抗菌薬であって、細菌細胞またはその成分に対する抗菌効果を潜在的に有する抗菌薬を含む。したがって、細菌細胞またはその成分に対する抗菌薬の効果は、簡単な方法で試験することができる。細菌細胞またはその成分の細胞傷害性効果が予め測定されているか、または既知である場合、細菌細胞またはその成分および抗菌薬の存在下で動物細胞の増殖能に影響がないことは、これらの細菌細胞（細菌株）に対する抗菌薬の抗菌効果を示す。一方で、細菌細胞またはその成分および抗菌薬の存在下で動物細胞の増殖能が低下することは、抗菌薬に対する細菌細胞（細菌株）の（部分的な）耐性を示す。この目的のために、抗菌薬の効果機序または構造が既知である必要はなく、この場合、細胞傷害性因子‐中和効果のみが検出されるため、新規抗菌薬をスクリーニングする場合にはこれは利点である。同時に、動物細胞に対する抗菌薬の細胞傷害性効果を測定することができる。これは、当該細菌に対して特異的に作用する抗菌薬を選択するために同じ手法を使用することができるという利点を有する。動物細胞がヒト細胞である場合、ヒトに対する悪影響のリスクをさらに低減することができる。細菌細胞の成分は、細菌細胞によって分泌される物質を含む。
さらに、分析試料がどの細胞傷害性因子を含むかを知る必要はない。したがって、これらの方法を用いれば、生きている人間または動物の代わりに分析試料を用いて様々な細胞傷害性因子‐中和因子を試験することができる。
さらに好ましい実施の形態では、分析試料は、細胞傷害性因子ウイルス粒子として、たとえば１つまたは複数のウイルス株またはその成分を含み、かつ細胞傷害性因子中和因子として、ウイルス粒子またはその成分に対する抗ウイルス薬を含む。したがって、ウイルス粒子またはその成分に対する抗ウイルス薬の効果を容易に確認することができる。ウイルス粒子またはその成分の細胞傷害性効果が予め測定されているか、または既知である場合、ウイルス粒子またはその成分および抗ウイルス薬の存在下で動物細胞の増殖能に影響がないことは、これらのウイルス（ウイルス株）に対する抗ウイルス薬の抗ウイルス効果を示す。一方で、ウイルス粒子またはその成分および抗ウイルス薬の存在下で動物細胞の増殖能が低下することは、抗ウイルス薬に対するウイルス（ウイルス株）の（部分的な）耐性を示す。この目的のために、抗ウイルス薬の効果機序または構造は既知である必要はなく、この場合、効果のみが実証されるため、新規抗ウイルス薬をスクリーニングする場合にはこれは大きな利点である。同時に、動物細胞に対する抗ウイルス薬の細胞傷害性効果を測定することができる。これは、それぞれのウイルス（ウイルス株）に特異的に作用する抗ウイルス薬のみを選択することができるという利点を有する。ヒトに対する悪影響のリスクは、動物細胞がヒト細胞である場合、さらに低下させることができる。
代替的な有利な実施の形態では、分析試料は、細胞傷害性因子として真菌細胞（真菌株を含む）またはその成分を含み、かつ細胞傷害性因子‐中和因子として真菌細胞またはその成分に対する抗真菌薬を含む。したがって、真菌細胞またはその成分に対する抗真菌薬の効果も、簡単な方法で試験することもできる。真菌細胞またはその成分の細胞傷害性効果が予め測定されているか、または既知である場合、真菌細胞またはその成分および抗真菌薬の存在下で動物細胞の増殖能に影響がないことは、真菌細胞またはその成分に対する抗真菌薬の抗真菌効果を示す。一方で、真菌細胞またはその成分および抗真菌薬の存在下で動物細胞の増殖能が低下することは、抗真菌薬に対する真菌の（部分的な）耐性を示す。この目的のために、抗真菌薬の効果機序または構造は既知である必要はなく、この場合、効果のみが実証されるため、新規な抗ウイルス薬をスクリーニングする場合にはこれは大きな利点である。同時に、動物細胞に対する抗真菌薬の細胞傷害性効果を測定することができる。これは、それぞれの真菌に特異的に作用する抗真菌薬のみを選択することができるという利点を有する。ヒトに対する悪影響のリスクは、動物細胞がヒト細胞である場合、さらに低下させることができる。真菌細胞の成分は、真菌細胞によって分泌される物質も含む。
代替的な有利な実施の形態では、分析試料は、細胞傷害性因子として少なくとも１つの寄生虫またはその成分を含み、かつ細胞傷害性因子‐中和因子として寄生虫またはその成分に対する抗寄生虫薬を含む。したがって、寄生虫またはその成分に対する抗寄生虫薬の効果も容易に確認することができる。寄生虫またはその成分の細胞傷害性効果が予め測定されているか、または既知である場合、寄生虫またはその成分および抗寄生虫薬の存在下で動物細胞の増殖能に影響がないことは、寄生虫に対する抗寄生虫薬の抗寄生虫薬効果を示す。一方で、寄生虫またはその成分および抗真菌薬の存在下で動物細胞の増殖能が低下することは、抗寄生虫薬に対する寄生虫の（部分的な）耐性を示す。この目的のために、抗寄生虫薬の効果機序または構造は既知である必要はなく、この場合、効果のみが実証されるため、新規な抗寄生虫薬をスクリーニングする場合にはこれは大きな利点である。同時に、動物細胞に対する抗寄生虫薬の細胞傷害性効果を測定することができる。これは、それぞれの寄生虫に特異的に作用する抗寄生虫薬のみを選択することができるという利点を有する。ヒトに対する悪影響のリスクは、動物細胞がヒト細胞である場合、さらに低下させることができる。寄生虫の成分は、寄生虫によって分泌される物質も含む。
分析試料の濃度依存的細胞傷害性効果を測定するために、それぞれの場合において異なる濃度の分析試料を異なる試料スポットに供給することがさらに有利である。濃度依存的細胞傷害性効果は、好ましくは、異なる試料スポットの測定された被覆率（請求項１、請求項２）または測定された細胞拡大距離（請求項３）と、分析試料のそれぞれ異なる濃度との関数である。これによって、細胞毒性が生じる分析試料の濃度を測定するのが容易となる。これは、たとえば、抗生物質または化学療法薬などの医薬品有効成分研究において、適用濃度範囲の初期評価に使用することができる。
さらに、空間分解能質量分析計および／または質量分析計は、以下の群から選択されることが好ましい：レーザー脱離イオン化ＭＳ（ＬＤＩ‐ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ）、脱離エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＤＥＳＩ‐ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＥＳＩ‐ＭＳ）、二次イオンＭＳ（ＳＩＭＳ）、二次イオン質量分析法イメージングＭＳ（ＳＩＭＳイメージングＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型分析計ＭＳ（ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ）、ＭＡＬＤＩタンデム飛行時間型質量分析計ＭＳ（ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＴｏＦ‐ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ質量分析法イメージング（ＭＡＬＤＩ‐ＭＳＩ）またはマイクロ流体試料イオン化装置による空間分解能ＭＳ。
空間分解能質量分析計は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計と非マトリックスベースの空間分解能質量分析計とにさらに細分化することができる。マトリックスベースの空間分解能質量分析計では、マトリックス（好ましくは液体）が質量分析試料に添加される。これによって、レーザー衝撃時に、質量分析試料の検体をイオン化することが可能になる。次いで、生成された試料イオンが測定される。一方で、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計では、マトリックスは添加されない。この場合、質量分析試料の検体をイオン化し、質量分析試料から試料イオンを生成するために、マトリックスは必要ない。
たとえば、マトリックスベースの空間分解能質量分析計は、好ましくは以下のＭＳを含む：ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＥＳＩ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＴｏＦ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳＩ。非マトリックスベースの空間分解能質量分析計は、好ましくは、たとえば以下の空間分解能質量分析計を含む：ＬＤＩ‐ＭＳ、ＤＥＳＩ‐ＭＳ、ＳＩＭＳ、ＳＩＭＳイメージングおよびマイクロ流体試料イオン化装置による空間分解能質量分析計。
さらに、イオン移動度分析計との組み合わせは、すべて好ましい実施の形態に含まれる。
さらに好ましい実施の形態では、マトリックスの正しい位置への適用は、試料スポットへの複数のマトリックスマイクロ液滴またはマトリックスナノ液滴のスプレープロセス、昇華プロセスまたは連続方向位置決めによって行われる。スプレープロセスおよび昇華プロセスによるマトリックスの適用は概して標的化されないが、連続方向位置決めによる適用は、通常、標的化される。プロセスの簡単さおよびスピードのために、マトリックスの適用にはスプレー法を用いるのが特に好ましい。マトリックスは、マトリックススプレー装置を用いて、マトリックスを試料スポットに噴霧するかまたは質量分析試料支持台に噴霧することによって適用される。マトリックスは、好ましくは微分散して適用される。マトリックススプレー装置は、最小のマトリックス液滴（マトリックスマイクロ液滴および／またはマトリックスナノ液滴）を生成する。好ましくは、適用されるマトリックス液滴は０．０１～１００μｍの直径を有する。好ましくは、適用されるマトリックス液滴は０．０５～４０μｍの直径を有する。特に好ましくは、適用されるマトリックス液滴は０．１～１０μｍの直径を有する。マトリックスの正しい位置への適用のさらなる手法および詳細は、イメージング質量分析法のための試料調製の文脈において、当業者に公知である。
前記課題(task)は、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果を測定するためのさらなる方法であって、以下のステップ：
動物細胞、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料が質量分析試料支持台の少なくとも１つの試料スポットに供給される試料供給ステップＡと、
質量分析試料が培養装置の質量分析試料支持台の試料スポットでインキュベートされる培養ステップと、
質量分析試料の残液が試料スポットから除去される液体除去ステップと、
質量スペクトルが、質量分析計によって、試料スポットの少なくとも部分領域に分布する複数の測定位置で記録される測定ステップＣであって、マトリックスベースの空間分解能質量分析計を使用するとき、先行する試料調製ステップＡにおいて、試料スポットが、試料スポットの少なくとも１つの部分領域へのマトリックスの正しい位置への適用によって調製される測定ステップＣと、
各質量スペクトルが、動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの存在について分析される第１評価ステップＣと、
動物細胞による被覆率が、第１評価ステップＣの結果から試料スポットの少なくとも部分領域について測定される第２評価ステップＣと、
動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果が第２評価ステップＣの測定された被覆率から導出される第４評価ステップＣと、
を含む方法によってさらに解決される。
空間分解能質量分析計を使用しない方法によっても、試料の被覆率、および試料の被覆率から導出することができる細胞傷害性効果の測定が可能であることが示されている。本方法では、測定位置の正確な位置座標は必要ない。したがって、生成される質量スペクトルは空間分解されない。しかしながら、この手法では、試料スポットの測定位置の個々の質量スペクトルは、合計質量スペクトルに合算されない。測定位置は、少なくとも試料スポットの部分領域に分布する。測定位置は、ほぼランダムに分布している。好ましくは、前記の位置はほぼ均等に分布している。したがって、被覆率は、対応する多数の測定位置によって測定することができる。好ましくは、レーザービーム／脱離ビームおよび／または試料点の直径は既知である。この手法では、被覆率は統計的平均値を表す。測定される測定位置の量は、好ましくは、再現性が高く、十分な精度を有し、たとえば統計的に許容される標準偏差の形態で代表的被覆率を測定できるように十分に多い。
本方法は、空間分解能質量分析計を必要とせず、特に費用対効果が高いという利点を有する。必要なのは、試料スポットの様々な多数の測定位置を測定することができる質量分析計だけである。それによって、たとえば精密なＸ／Ｙテーブルおよび／またはミラーの精密な調整による測定位置の精密な調整は必要ない。試料スポットの多数の測定位置の多くが異なっている限り、各測定位置への近似的アプローチで十分である。しかしながら、他の方法と比較した場合の欠点は、測定位置の数に応じた測定された被覆率の精度および／または再現性の低下、および試料位置ごとに必要な時間の対応する増加である。さらに、より多数の測定位置が必要なため、レーザーまたは脱離ビームの直径は、好ましくは他の方法よりも小さい。好ましくは、レーザービームもしくは脱離ビームの直径または測定位置の直径は、必要な測定位置数で、測定位置の数学的重複がほぼないように選択される。好ましくは、細胞存在値は、各測定位置に割り当てられる。好ましくは、動物細胞による被覆率は、測定位置の細胞存在値から、試料スポットの少なくとも部分領域について測定される。さらに、第３評価ステップＡでは、増殖能は測定された被覆率から導出される。さらに好ましくは、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果は、被覆率および／または増殖能から導出される。
前記課題は、動物細胞に対する少なくとも１つの分析試料の細胞傷害性効果を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞、栄養培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する前記分析試料を含む質量分析試料が、質量分析試料支持台の少なくとも１つの試料スポットに供給される試料供給ステップＢであって、前記試料スポットが第１および第２部分領域を有し、動物細胞が前記試料スポットの前記第１部分領域に供給され、動物細胞が前記試料スポットの前記第２部分領域に供給されず、残りの質量分析試料が両方の部分領域に供給される試料供給ステップＢと、
質量分析試料が培養装置の質量分析試料支持台の試料スポットでインキュベートされる培養ステップと、
試料スポット上の質量分析試料の残液が除去される液体除去ステップと、
空間分解質量スペクトルが、空間分解能質量分析計によって、試料スポットの少なくとも２つの測定位置で記録される測定ステップＢであって、第１測定位置がなお動物細胞を有し、第２測定位置が動物細胞を有さず、かつ両測定位置が基準点を起点とした伸長の一方向に位置し、マトリックスベースの空間分解能質量分析計を使用するとき、測定ステップＢにおける空間分解質量スペクトルの記録の前に、先行する試料調製ステップＢにおいて、試料スポットの調製が、試料スポットの少なくとも両方の部分領域の一部へのマトリックスの正しい位置への適用によって実施される測定ステップＢと、
各空間分解質量スペクトルが、動物細胞の細胞特異的質量分析シグネチャーの存在について分析され、細胞存在値が各測定位置に割り当てられる第１評価ステップＡと、
細胞拡大距離が、基準点から遷移点までの少なくとも１つの距離から測定される第２評価ステップＢであって、各遷移点が、少なくとも第１および第２測定位置から計算される第２評価ステップＢと、
分析試料の細胞傷害性効果が、先行する評価ステップの結果から導出される第４評価ステップＢと、
を含む方法によってさらに解決される。
これによって、１つまたは複数の細胞傷害性因子を含むかどうかが不明の分析試料中の細胞傷害性因子の存在を、信頼性をもって、簡単、迅速、安価に確認することができる。さらに、動物細胞に対する潜在的細胞傷害性因子の効果を試験することができ、その毒性を、信頼性をもって、簡単、迅速、安価に測定することができる。
分析試料の細胞傷害性効果の測定のために、空間分解能質量分析計によって試料スポットの動物細胞の拡大を測定することによる、細胞拡大距離および／またはそれから導出される増殖能および／または遊走能の測定も使用することができることが示されている。好ましくは、本方法において、試料スポットの動物細胞の拡大は、細胞拡大距離を測定することによって測定される。請求項３によれば、直前の評価ステップの好ましい結果は細胞拡大距離であり、好ましい前述の評価ステップは第２評価ステップＢである。
あるいは、請求項３に記載の方法によれば、前述の評価ステップの結果は増殖能および／または遊走能であり、好ましい前述の評価ステップは第３評価ステップＢである。さらなる処理ステップは、特に、よりよい結果評価のために、使用者にさらなるデータを提供する。
動物細胞の細胞拡大距離が、増殖および／または細胞遊走に適した条件下で、増殖、細胞分裂および／または細胞遊走により、第１部分領域の外縁からの２次元の広がりの形態で開始することが、請求項３に記載の方法に決定的に重要である。培養ステップの開始時に、試料スポットの第１部分に隣接する試料スポットの第２部分に動物細胞が存在しないことが非常に重要である。細胞傷害性効果は、最終的には、動物細胞の拡大の程度によって測定される。たとえば、増殖および／または遊走による動物細胞での第２小領域の被覆の半径方向範囲は、分析試料または細胞学的因子の細胞傷害性効果の尺度である。
簡単な方法では、動物細胞の拡大の程度は、細胞拡大距離を測定することによって実現することができる。時間ｔにおける動物細胞の拡大領域の境界が測定される。拡大領域の境界の測定は、遷移点を測定することによって行う。遷移点の測定は、質量分析法によって境界における動物細胞の有無を検出することによって行う。次いで、基準点から遷移点までの距離を測定することによって細胞拡大距離を測定する。
試料供給ステップＢにおいて、第１部分領域に動物細胞を供給し、第２部分領域に動物細胞を供給しないことによって、動物細胞の程度を、増殖能、遊走能および／または細胞傷害性効果の信頼性のある尺度として使用することができる。好ましくは、動物細胞は付着増殖細胞である。さらに、好ましくは、動物細胞は、残りの質量分析試料を添加する前に予め第１部分領域に付着している。試料供給ステップＢは、第１サブステップと第２サブステップとに分けられる。したがって、試料供給ステップＢの第１サブステップにおいて、栄養培地を用いる動物細胞の第１培養が、試料スポットの第１部分領域で行われる。この場合、分析試料または細胞傷害性因子は存在しない。このプロセスにおいて、動物細胞は第１部分領域に付着し第１部分領域で増殖する。第２部分領域は、動物細胞が存在しないままである。これは、たとえば、栄養培地の標的適用によって行うことができる。試料供給ステップＢの第１サブステップ後に、残液が、好ましくは、第１部分領域から除去される。第１サブステップ後に、試料供給ステップＢの第２サブステップが行われる。試料供給ステップＢの第２サブステップにおいて、栄養培地、分析試料および質量分析試料のさらなる成分が、両方の部分領域または試料表面全体に適用される。この場合、動物細胞は適用されない。
培養ステップにおいて、第１部分領域の外縁から２次元の広がりが生じる。これは、好ましくは、培養ステップにおいてほぼ均一に行われる。この場合、拡大は、好ましくは、表面の両次元において行われる。特に、周囲に第２部分領域を有する第１部分領域の円形設計は、２次元の広がりをもたらす。あるいは、第１部分領域および第２部分領域は、拡大がほぼ１次元、すなわち１方向であるように設計することもできる。
さらに好ましくは、試料スポットは、付着していない動物細胞を除去するために、試料供給ステップＢの第１および／もしくは第２サブステップ後に、ならびに／または培養ステップ後に、洗浄液で洗浄される。
第１部分領域は、リングの形の第２部分領域によって完全に囲まれた円形表面とすることができる。あるいは、第１部分領域は、第２部分領域に完全に隣接していなくてもよい。決定的な要因は、両方の部分領域が互いに隣接していることである。
培養ステップおよび液体除去ステップは前述のように実施される。
測定ステップＢにおいて、空間分解能質量分析計を用いて、試料スポットの少なくとも２つの測定位置の空間分解質量スペクトルを記録することによって、動物細胞の拡大境界が測定される。拡大境界は、遷移点の助けを借りて直接測定される。第１測定位置には、なお動物細胞が存在する。第２測定位置には動物細胞は存在しない。したがって、第１測定位置および第２測定位置は、それぞれ動物細胞の拡大境界の異なる側にある。両測定位置は、好ましくは拡大境界に直接位置する。好ましくは、２つの測定位置は隣接する。２つの位置が拡大境界の近くに位置するほど、細胞拡大距離をより正確に測定することができる。動物細胞それぞれの少なくとも１つの拡大方向に沿った好ましい複数の測定によって、拡大境界に最も近接した第１測定位置および第２測定位置を見つけることができる。好ましくは、第２測定位置は第２部分領域に位置する。
先行する試料調製ステップＢにおける測定ステップＢでの空間分解質量スペクトルの記録の前に、マトリックスベースの空間分解能質量分析計を用いる試料スポットの少なくとも部分領域へのマトリックスの正しい位置への適用による試料スポットの調製は、試料調製ステップＡの枠組み内の同様な方法ですでに前に説明したが、この場合、対照的に、試料スポットの両方の部分領域の少なくともの一部へのマトリックスの適用が行われる。特に好ましくは、マトリックスは試料スポット全体に適用される。あるいは、マトリックスの適用は、基準点を起点とした拡大方向における試料スポットの両方の部分領域の一部に適用することができる。非マトリックスベースの空間分解能質量分析計を使用する場合、試料調製ステップＢは本方法では実施しない。
同様に、第１評価ステップＡについては、すでに前述した。
第２評価ステップＢでは、細胞拡大距離が測定される。これは、基準点から遷移点までの距離によって測定される。このプロセスでは、試料スポットの複数の距離を１つの細胞拡大距離として計算することもできる。たとえば、異なる拡大方向に沿った距離をこの目的のために使用することができる。各遷移点は、異なる細胞存在値を有する少なくとも第１および第２測定位置から計算される。第１測定位置は、好ましくは動物細胞の存在を示す細胞存在値を有する。第２測定位置は、好ましくは動物細胞の非存在を示す細胞存在値を示す。好ましくは、第１測定位置の前の、基準点を起点とした伸長方向にある１つ以上の測定位置は、本質的に、動物細胞の存在を示す細胞存在値を含む。さらに、第２測定位置の後ろの、基準点を起点とした伸長方向にある１つ以上の測定位置は、本質的に、動物細胞の非存在を示す細胞存在値を含む。これによって、遷移点を正確に測定することができる。
第４評価ステップＢでは、動物細胞に対する分析試料または細胞傷害性因子の細胞傷害性効果が、好ましくは細胞拡大距離から導出される。好ましくは、細胞拡大距離は、記憶された参照値または対照試料の値と比較される。好ましくは、分析試料を含む質量分析試料に加えて、少なくとも１つの対照試料に本方法が実施される。あるいは、対照試料からの記憶された参照値を使用することもできる。可能な対照試料の種類については、本明細書における対照試料についての説明を参照のこと。
さらに好ましい実施の形態では、請求項３に記載の方法は、動物細胞の増殖能および／または遊走能が、第２評価ステップＢの測定された細胞拡大距離から導出される第３評価ステップＢを含む。この場合、分析試料または細胞傷害性因子の細胞傷害性効果は、第４評価ステップＢにおいて、動物細胞の測定された増殖能および／または遊走能から導出される。
したがって、細胞傷害性効果は、細胞拡大距離から直接的に、または増殖能および／または遊走能を介して細胞拡大距離から間接的に導出される。直接的な導出は、この手法を単純化する。直接的な導出では、たとえば、１つの試料スポットまたは複数の試料スポットの複数の細胞拡大距離は、互いにオフセットすることもできる。特に、平均化を行うことができる。細胞拡大距離からの間接的な細胞傷害性効果の導出は、使用者にさらなる有用な中間情報を提供する。増殖能および／または遊走能の測定は、等級付けされた細胞拡大範囲に特に有用である。さらに、複数の細胞拡大範囲は、増殖能および／または遊走能を形成するために、互いにオフセットすることもできる。
さらなる代替的な実施の形態では、動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果は、第２評価ステップＢにおける測定された細胞拡大距離から、ならびに第３評価ステップＢにおける増殖能および／または遊走能から、両方の結果を考慮に入れて測定することができる。
細胞傷害性効果は、好ましくは、複数のレベルでマッピングされる。
さらに好ましい実施の形態では、請求項３に記載の方法は、中間評価ステップＢを含む。中間評価ステップＢにおいて、少なくとも１つの対照試料の細胞拡大距離と、分析試料を含む質量分析試料の細胞拡大距離との比較が行われる。この比較は、第３評価ステップＢにおける増殖能および／もしくは移動能の導出、ならびに／または第４評価ステップＢにおける細胞傷害性効果の導出に含めることができる。このようにして、分析試料の細胞傷害性効果は、細胞拡大距離から簡単な方法で信頼性をもって推測することができる。代替的な好ましい実施の形態では、比較は、記憶された参照値を用いて行われる。
前記課題は、さらに、空間分解能質量分析計によって動物細胞に対する分析試料の細胞傷害性効果を測定するためのシステムであって、空間分解質量スペクトルを生成するための少なくとも１つの空間分解能質量分析計と、試料スポットを有する質量分析試料支持台と、空間分解能質量分析計を制御し、生成される空間分解質量スペクトルを評価するためのデータ処理ユニットとを含むシステムにおいて、動物細胞の少なくとも１つの細胞特異的質量分析シグネチャーの存在について各空間分解質量スペクトルを分析し、少なくとも試料スポットの部分領域についての動物細胞の被覆率および／または試料スポットの少なくとも１つの伸長方向における動物細胞の細胞拡大距離を測定し、被覆率および／または細胞拡大距離から分析試料の細胞傷害性効果を導出するように構成されているステムによって解決される。
この文脈において、細胞傷害性効果は、好ましくは、被覆率および／または細胞拡大距離から直接的に、または被覆率および／または細胞拡大距離から測定された増殖能および／または遊走能を介して間接的に導出することができる。直接的にとは、平均化またはデータベースとの比較などの他の簡単で標準的な数学的計算を明示的に含む。
空間分解能質量分析計は、好ましくは、以下の群からの質量分析計を含む：ＬＤＩ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ、ＤＥＳＩ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＥＳＩ‐ＭＳ、ＳＩＭＳ、ＳＩＭＳイメージングＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＴｏＦ‐ＭＳ、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳＩ、マイクロ流体試料イオン化装置による空間分解能質量分析計。データ処理ユニットは、好ましくは、質量分析計に組み込まれるか、または別のシステムとして設置されるコンピュータである。さらに、コンピュータは、好ましくは、質量分析計を評価し制御するためのアルゴリズムを備えた適切なソフトウェアを含む。評価は、好ましくは、上で説明したこの手法の評価ステップを含む。また、データ処理ユニットは、好ましくは、前述の手法の測定ステップＡ、Ｂ、Ｃを実行するために空間分解能質量分析計を制御する。特に、ソフトウェアは、データ処理ユニットとともに、好ましくは、上で説明したこの手法のための計算を実行する。たとえば、対照試料の値は、ソフトウェアを用い、質量分析試料の値を用いて計算することもできる。さらに、ソフトウェアは、好ましくは、データ処理ユニットを用いて結果を表示する。好ましくは、質量分析試料における細胞傷害性効果に関する情報は、各試料スポットについて出力される。あるいはまたはさらに、増殖能および／または遊走能は、好ましくは、各試料スポットについて表示される。
好ましくは、システムは、請求項１、請求項２および／または請求項３、および／または従属請求項に記載の方法を実行するように適合される。あるいは、空間分解能質量分析計の代わりに、請求項３に記載の方法を実行するように適合される場合、システムは、非空間分解能質量分析計を含んでもよい。
本開示に記載の方法は、本開示に記載のシステムの操作モードとして適しているため、本方法を参照して上記で説明した実施の形態は、対応する方法でのシステムにも適用可能である。
同様に、請求項１およびその従属請求項によるプロセスを参照して説明された被覆率および／または増殖能などの特徴に関する実施の形態および説明は、当業者に自明な対応する移動可能性（ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ）によって、全部または一部が、請求項２および／または請求項３に記載のプロセスに適用可能である。
この手法およびシステムの用途は広い。以下では、「プロセス」という用語は、可能性のある適用に関して一律に使用し、したがってすべての特許請求されるプロセスおよびシステムを含む。本方法は、特に臨床分野において使用することができる。この手法の結果は、診断を支援することができる。病原性は、この手法における細胞傷害性効果から直接推定することができる。特に、細胞傷害性効果から、病原性病原体の存在を推定することができる。細胞傷害性因子の存在を検出することができるがその細胞傷害性効果を検出することができない他の分析方法と、本発明による方法との組み合わせは特に有利である。
たとえば、抗ウイルス薬（細胞傷害性因子‐中和因子）に対するウイルス（細胞傷害性因子）の耐性の正確な機構に関する情報がなくても、本方法は、抗ウイルス薬に対するウイルスの耐性を示すことができる。この目的のために、たとえば動物細胞として継代細胞株を使用することができる。例には、ウイルス単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のウイルス感染および／または発生を含む。
特に、微生物同定ソフトウェアモジュール（たとえばライブラリーを含むＢｒｕｋｅｒ’ｓ ＭＢＴ Ｃｏｍｐａｓｓ）と本方法との組み合わせによって、細胞傷害性因子の存在を検出することができるだけでなく、たとえばＭＡＬＤＩバイオタイパー（ｂｉｏｔｙｐｅｒ）による微生物の属および／または種に加えて、より正確な分類、特に病原性表現型のより正確な分類を行うこともできる。したがって、場合によっては、本方法によって分類学レベルの亜種および／または分類学レベルの病原型も測定することができる。これによって、たとえば診断を高速化および／または特定することができ、または臨床管理を改善することができる。以下は、いくつかの臨床応用の例である。たとえば、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の強毒株の存在は、本方法によって容易かつ迅速に検出することができる。
さらに、本方法は、たとえば、尿中の尿路病原性大腸菌株の関連病原性表現型の存在を容易かつ迅速に検出するために使用することができる。本方法は、たとえば、重度の下痢性疾患におけるクロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および／またはその毒素の検出にも適している。したがって、本方法は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症の迅速かつ信頼性のある同定を提供する。さらに、本方法は、たとえば、微生物同定ソフトウェアモジュールを用いたセレウス菌種の事前測定後のセレウス菌下痢毒素産生株の検出にも適している。
特に、本方法は、その病原性が特定の条件下でのみ発揮され、病原体の存在のみによって測定されるわけではない病原性病原体の検出にも適している。たとえば、本方法は、高病原性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株による心内膜炎の超急性経過と、弱病原性黄色ブドウ球菌株による心内膜炎の低急性経過とを区別するのに適している。
さらに、本方法は、動物細胞として神経細胞を用いた分析試料中のボツリヌス神経毒などの細胞傷害性因子の存在を容易に検出するのに適している。
さらに、本方法は、動物細胞として腫瘍細胞を用い、細胞傷害性因子として化学療法薬を用いる場合、化学療法の治療効果を予測するために、化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性を容易に測定するのに適している。
以下、本明細書における用語の定義を説明する。
・空間分解質量スペクトルは、生の質量分析データから、それぞれの質量範囲（ｍ／ｚ）の強度および関連する測定位置のみを示す処理されたピークリストまでを含む。空間分解質量スペクトルは、１つのまとまった質量範囲における複数の強度値だけでなく、複数の別の質量範囲の強度値からなることもできる。空間分解質量スペクトルは、本方法に使用する前に、たとえば、ベースライン補正（減算）、質量シグナルの平滑化、ノイズシグナルの除去、指定されたノイズ値を超える質量シグナルの選択、ならびに／またはピークリストを作成するためのピーク検出および／もしくは特徴検出を含む、シグナル処理を行ってもよい。空間分解質量スペクトルは、好ましくは単一の質量スペクトルである。各単一の質量スペクトルは、好ましくは１回の単回のレーザー衝撃またはビーム衝撃によって生成される。空間分解質量スペクトルは、同じ測定位置の個々の質量スペクトルが組み合わされる限りは１つの測定位置の合計質量スペクトルとすることができる。しかしながら、本発明の意味において、空間分解質量スペクトルは試料スポットの合計質量スペクトルではない。すなわち、試料スポットの異なる測定位置の個々の質量スペクトルは組み合わされない。好ましいｍ／ｚ範囲はｍ／ｚ１０００～ｍ／ｚ２０，０００であり、さらに好ましいｍ／ｚ範囲はｍ／ｚ２０００～ｍ／ｚ１５，０００であり、特に好ましいｍ／ｚ範囲はｍ／ｚ２０００～ｍ／ｚ１０，０００である。
・方法のより詳細な仕様が、文脈から当業者に明らかでないかまたは自明でない場合、方法という用語は、好ましくは、本発明全体に用いられる。したがって、方法のより詳細な仕様が文脈から明らかでないかまたは自明ではない場合、特定不可能な形の方法という用語は、好ましくは、当業者に適用可能な限り、特許請求の範囲（システムクレームを含む）の一部または全部を意味する。
・源試料は、抽出された試料である。好ましくは、前記試料は抽出後にほぼ変化していない。
・細胞傷害性および細胞傷害性効果とは、特定の細胞傷害性因子が免疫細胞などの動物細胞を損傷させる能力の尺度である。この尺度は、濃度依存的な場合もある。動物細胞に対する細胞傷害性は、増殖減速および／または増殖阻害であってもよい。さらに、動物細胞に対する細胞傷害性効果は、増殖抑制および／または増殖遅延であってもよい。さらに、動物細胞に対する細胞傷害性効果は、細胞分裂阻害および／または細胞分裂遅延であってもよい。さらに、動物細胞に対する細胞傷害性効果は、壊死性であってもよい。動物細胞に対する細胞傷害性効果は、細胞遊走阻害および／または細胞遊走遅延であってもよい。
・細胞傷害性因子は、（潜在的）細胞傷害性効果を有する因子である。前記因子は、動物細胞の増殖、細胞遊走、分裂および／または増殖を遅延もしくは停止させるか、または動物細胞を破壊することができる。細胞傷害性因子は、任意の化学物質または生物学的物質、特に、生死を問わず、活性または不活性の、少なくとも１種類の動物細胞に対して実際にまたは潜在的に細胞傷害性効果を有する細菌、ウイルス、真菌、微生物、寄生虫を含む。前記因子は、たとえば、溶解して、懸濁して、または表面（たとえば質量分析試料支持台の表面）に吸着もしくは固定させて使用することができる。温度または大気組成などの環境条件は、細胞傷害性因子ではない。
・動物細胞は、分類学的レベルが動物界である生物の細胞である。「動物細胞」の定義内の動物の群は、限定するものではないが、昆虫（たとえば節足動物および／または環形動物）、脊椎動物、哺乳動物、および／またはヒトの細胞を含む。原生動物および／またはユーグレナは、好ましくは動物細胞から除外する。さらに、動物細胞は、好ましくは組織形成細胞である。動物細胞は、好ましくは分析試料の一部ではない。動物細胞は、たとえば、ヒトまたは動物（特に哺乳動物）からの組織細胞または腫瘍細胞を試料とすることができる。特に、前記細胞は継代細胞株とすることができる。動物細胞は、適用の文脈において、その増殖能および／または遊走能が細胞傷害性因子または分析試料の細胞傷害性効果を測定するために用いられる動物細胞である。
・微生物は、好ましくは、古細菌および細菌を含むすべての原核生物を含む。さらに、微生物はすべての原生動物を含む。さらに、微生物は、酵母などの特定の（特に単細胞の）真菌、および（特に単細胞の）藻類などの特定の真核生物を含む。組織を形成する真核生物は、微生物には数えない。好ましくは、真核微生物は単細胞である。さらに、微生物はウイルスを含む。微生物は、ヒトを含む動物、植物または微生物宿主もしくは宿主細胞の表面および／または内部に優先的にコロニー形成および／または感染および／または存在する可能性がある。微生物は、好ましくは、環境（たとえば、水、土壌、空気、表面）において宿主とは独立して生息する微生物も含む。微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）という用語は、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）という用語と同義である。
・試料スポットは、好ましくは、質量分析試料または対照試料が適用され測定される質量分析試料支持台の小領域である。さらに、試料スポットは、好ましくは、質量分析試料を受領および／または培養することを目的とする質量分析試料支持台の小領域である。
・残液：質量分析試料のすべての成分を合わせた液体が残液である。無傷の動物細胞の細胞内容物は残液の一部ではない。
・動物細胞の拡大および面積の広がりは、好ましくは、動物細胞の増殖、成長および／または分裂によって引き起こされる動物細胞集団の面積の広がりを意味する。増殖、成長および／もしくは分裂の代わりに、または増殖、成長および／もしくは分裂に加えて、動物細胞の拡大および平面の拡大の文脈において、平面の広がりは、動物細胞の細胞遊走によって引き起こされる場合もある。
・コンフルエンスの程度は、付着増殖している動物細胞による試料スポットの表面の被覆率である。この場合、付着増殖動物細胞は、付着性増殖動物細胞という用語と同義である。
・分析試料は、評価結果が不明の試験試料、すなわち動物細胞に対する細胞傷害性効果が潜在的に存在する試料を含む。したがって、評価結果が不明である限り、既知の細胞傷害性物質を含む溶液も分析試料として含める。たとえば、種々の濃度の細胞傷害性として分類される物質および／または動物細胞としての種々の組織細胞を組み合わせて含む溶液も分析試料として分類される。分析試料は、空間分解能質量分析計で分析される試料である。分析試料は潜在的に少なくとも１つの細胞傷害性因子を含む。分析試料は、不変の状態で、すなわちたとえば源試料として試料スポットに供給されてもよく、または、好ましくは、試料スポットに供給する前に、当業者に公知の方法による増菌もしくは培養調製、濃縮および／または抽出もしくは精製ステップに供して、潜在的細胞傷害性因子を濃縮、分離または精製してもよい。
・対照試料は、参照値を作成するために用いられる。対照試料は、好ましくは、既知のおよび／または予想される評価結果を有する試料である。
好ましくは、前記試料には、評価結果が未知の分析試料を含む質量分析試料と平行してこの手法が実行される。あるいは、参照値は、予め作成され、データベースに記憶され、特許請求されるプロセスが実施されるときに検索される。よりよい理解のために、対照試料の例を以下に示す。対照試料は、好ましくは以下の群から選択することができる：
・ブランク試料；この手法にマトリックスが使用される場合、使用されるマトリックスのみが測定される
・栄養液からなる質量分析試料
・動物細胞からなる質量分析試料
・栄養液および動物細胞からなる質量分析試料
・１つまたは複数の細胞傷害性因子からなる質量分析試料
・１つまたは複数の細胞傷害性因子‐中和因子からなる質量分析試料
・質量分析試料は、栄養液、動物細胞、および使用する動物細胞に対する細胞傷害性効果が既知であり、したがって評価結果が既知である１つまたは複数の細胞傷害性因子を含む。
したがって、対照試料は、特に、質量分析試料の成分に質量範囲を割り当てるのに役立つ。これによって、細胞特異的質量分析シグナルと非細胞特異的質量分析シグナルとを区別し、細胞特異的質量分析シグネチャーを同定することが可能になる。さらに、前記シグナルは、増殖制御またはプロセス制御に用いられる。
これらの対照試料の選択、ここに記載されていないさらなる対照試料の追加およびそれらの組み合わせは、それぞれの適用、実験目的および分析試料および／または質量分析試料の組成から当業者に明らかである。あるいは、別の実施の形態では、記憶された参照値をこの手法に使用してもよい。
・増殖は、動物細胞の成長および分裂を含む。増殖能は、動物細胞の成長および分裂の尺度である。増殖能は、この手法において被覆率または細胞拡大距離によって測定される。
・遊走能は、独立して位置を変える細胞の能力を含む。動物細胞の位置のこの能動的な独立した（自働的な）変化が細胞遊走である。遊走能は、好ましくは、無指向性の自発的移動、指向性の走化性運動および／または運動速度の変化（ケモキネシス）を含む。
・細胞特異的質量分析シグナルは、動物細胞の任意の成分によって生成された質量分析シグナルを意味する。細胞特異的質量分析シグナルは、割り当て可能であり、好ましくは、質量分析試料に用いられた動物細胞に一意的に割り当て可能である。動物細胞の成分は、リポソームなどのタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、および／または動物細胞の他の成分にすることができる。好ましくは、動物細胞によって環境中に分泌される物質は含まない。
・細胞特異的質量分析シグネチャーは、たとえば、他の質量分析シグナルからのその強度、位置／質量範囲および／または距離に起因して、栄養培地、細胞傷害性因子、マトリックスおよび質量分析試料のその他の成分の存在下であっても、測定された測定位置での動物細胞の明確な同定に適している１つまたは複数の細胞特異的質量分析シグナルを選択したものを含む。好ましくは、少なくとも１つの選択された細胞特異的質量分析シグナルは特異的である。すなわち、他の質量分析シグナルからのその強度および質量範囲（ｍ／ｚ）および／またはｍ／ｚ間隔によって、非細胞特異的質量分析シグナルおよびバックグラウンドノイズとは明確に区別することができる。強度が、ほぼバックグラウンドノイズのばらつき範囲に含まれる細胞特異的質量分析シグナルは、特異的細胞特異的質量分析シグナルとしては含めない。好ましくは、質量分析シグネチャーのスペクトルライブラリーはデータベースに記憶される。さらに、好ましくは、少なくとも１つの細胞特異的質量分析シグネチャーは、スペクトルライブラリー中の動物細胞の各種類に割り当てられる。細胞特異的質量分析シグネチャーの記憶された参照スペクトルは、たとえば、質量、質量公差、平均強度、強度の散乱および発生確率を含んでもよい。細胞特異的質量分析シグネチャーおよび／または細胞特異的質量分析シグナル、特にスペクトルライブラリーの細胞特異的質量分析シグネチャーおよび／または細胞特異的質量分析シグナルは、たとえば、細胞傷害性因子を有する場合の、および特に、それを有さない場合の、動物細胞の異なる細胞培養についての複数の測定から生成される。好ましくは、細胞特異的質量分析シグナルおよび／または細胞特異的質量分析シグネチャーは、コンピュータ評価によって自動的に区別される。
・好ましくは、比較、照合、割り当て、導出、計算、測定、およびその他のプロセスの自動化可能なステップは、データ処理ユニットによって実施される。データ処理ユニットは、好ましくは、対応するソフトウェアを備えたコンピュータである。
以下、図面に示す実施の形態を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の実施の形態にかかる空間分解能質量分析計（ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ）の模式的な側面図を示す。 質量分析試料支持台の模式図を示す。 請求項１に記載の方法の様々な実施の形態を模式的に示しており、ａは、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を模式的に示す。 請求項１に記載の方法の様々な実施の形態を模式的に示しており、ｂは、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を模式的に示す。 請求項１に記載の方法の様々な実施の形態を模式的に示しており、ｃは、マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を模式的に示す。 請求項１に記載の方法の様々な実施の形態を模式的に示しており、ｄは、マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を模式的に示す。 図２ｃに示す方法に従って、請求項１に記載のプロセスの特に好ましい実施の形態の個々のステップを詳細に示しており、破線内の左側は上面図、右側は関連する側面図を示す。この例は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計の試料調製ステップでの実施の形態を示す。 図３－１の続きであり、請求項１に記載のプロセスの特に好ましい実施の形態の個々のステップを詳細にかつ模式的に示している。 図３－２の続きであり、請求項１に記載のプロセスの特に好ましい実施の形態の個々のステップを詳細にかつ模式的に示している。 請求項１に記載の方法の測定ステップＡの詳細を示す。 請求項１に記載の第１評価ステップＡの詳細を示す。 図２ｃに対応する、請求項１に記載の方法の評価ステップの結果の詳細を示す。 従属下位請求項と組み合わせた請求項１に記載の方法の様々なさらに好ましい実施の形態を模式的に示しており、ａは非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。 従属下位請求項と組み合わせた請求項１に記載の方法の様々なさらに好ましい実施の形態を模式的に示しており、ｂはマトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。さらにｂは、中間評価ステップを有する。 従属下位請求項と組み合わせた請求項１に記載の方法の様々なさらに好ましい実施の形態を模式的に示しており、ｃはマトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。さらに、ｃは、中間評価ステップを有する。 従属下位請求項と組み合わせた請求項１に記載の方法の様々なさらに好ましい実施の形態を模式的に示しており、ｄはマトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。さらに、ｄは、中間評価ステップを有する。 請求項３に記載の方法の好ましい実施の形態を模式的に示しており、ａは非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。 請求項３に記載の方法の好ましい実施の形態を模式的に示しており、ｂはマトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。 請求項３に記載の方法の好ましい実施の形態を模式的に示しており、ｃは非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。 請求項３に記載の方法の好ましい実施の形態を模式的に示しており、ｄはマトリックスベースの空間分解能質量分析計のための方法を示す。 請求項３に記載の第１および第２部分領域を有する試料スポットの実施の形態を模式的に示しており、ａは円形の試料スポットを示す。 請求項３に記載の第１および第２部分領域を有する試料スポットの実施の形態を模式的に示しており、ｂは細長い形状の試料スポットを示す。 請求項３に記載の第１および第２部分領域を有する試料スポットの実施の形態を模式的に示しており、ｃは分析試料の細胞傷害性効果がないかまたは弱い場合の培養ステップ中または培養ステップの後のａの試料スポットを示す。 図８ａ、図８ｂ、図８ｄに対応する、請求項３に記載の方法の評価ステップの結果の詳細を示す。 異なる対照試料の例示的な質量スペクトルを示しており、ａは選択された種類の動物細胞を含み、かつ細胞傷害性因子を含まない第１対照試料、ｂは細胞傷害性因子の存在下で、ａの場合と同じ動物細胞を含む対照試料、ｃは第３対照試料であって、動物細胞および細胞傷害性因子を含まず、培地および内部標準を含む第３対照試料を示す。この場合、参照スペクトルは、細胞特異的質量分析シグナルおよび細胞特異的質量分析シグネチャーを測定するために用いられる。 請求項２に記載の方法の異なる実施の形態を模式的に示しており、ａは、非マトリックスベースの質量分析計のための方法を示している。 請求項２に記載の方法の異なる実施の形態を模式的に示しており、ｂは、非マトリックスベースの質量分析計のための方法を示している。 請求項２に記載の方法の異なる実施の形態を模式的に示しており、ｃは、マトリックスベースの質量分析計のための方法を示している。 請求項２に記載の方法の異なる実施の形態を模式的に示しており、ｄは、マトリックスベースの質量分析計のための方法を示している。
図１ａは、簡単な質量分析計（ＭＳ）１０１、より正確には空間分解能質量分析計１、より正確にはＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ ２、より正確にはマトリックスベースの空間分解能質量分析計２１の簡略化された模式図を示す。これは、質量分析計の例示的な説明に過ぎない。イオンセレクター、フラグメンテーションセル、またはイオンリフレクターなどの他のシステム構成要素をシステムに組み込んでもよい。
ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ ２は、イオン源３および飛行時間型質量分析計１４（軸方向イオン注入）を含む。飛行時間型質量分析計１４は、飛行管４、検出器５、加速電極１３および加速経路１７を含む。
イオン源３は、ＸＹステージ７に配置された質量分析試料支持台６を含む。質量分析試料支持台６は、ＸＹテーブル７によってＸおよびＹの２次元で移動させることができる。さらに、イオン源３は、レーザー８とミラーおよび／またはレンズシステム１０とを含む。レーザー８は、レーザービーム９を生成する。レーザービーム９は、ミラーおよび／またはレンズシステム１０を介して質量分析試料支持台６の調製された質量分析試料１１に向けられる。レーザービーム９は、調製された質量分析試料１１から試料イオン１２を生成する。これらの試料イオン１２は、加速電極１３によって加速され、飛行時間型質量分析計１４の飛行管４を通過する。ここで試料イオン１２は、質量および電荷に基づいて分離される。最後に、試料イオン１２は検出器５によって検出される。飛行管４内の真空は、真空ポンプ１５によって生成される。
試料プレート６のレーザービーム９の位置は、ミラー／レンズシステム１０の移動および／またはＸＹテーブル７の移動によって変更される。好ましくは、レーザービームは、質量分析試料に衝突するとき、１ｎｍ～３００μｍのビーム直径を有する。好ましくは、レーザービームは、質量分析試料に衝突するとき、１００ｎｍ～１００μｍのビーム直径を有する。さらに、レーザービームは、好ましくは、質量分析試料に衝突するとき、１μｍ～１０μｍのビーム直径を有する。
ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ ２の場合、質量分析試料は、質量分析試料１１にマトリックス２９を適用し、次いでそれを乾燥させることによって調製される。
質量分析計１０１は、陽イオンモードまたは陰イオンモードで操作することができる。質量分析計１０１は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１を含むマトリックスベースの質量分析計と、空間分解能非マトリックスベースの質量分析計を含む非マトリックスベースの質量分析計とに分けることができる。マトリックスベースの質量分析計は、質量分析試料１１の検体を含むイオン源内の分子をイオン化して試料イオン１２を生成するために、追加の化学物質であるマトリックス２９を必要とする。一般に、これは液体で適用される。これによって、乾燥時に検体とともに共結晶化する。このプロセスで、検体分子は、結晶が生成する際にマトリックス２９の結晶中に「取りこまれる」。
多くの場合、使用するレーザー波長（たとえば３３７．１ｎｍの波長の窒素レーザー）のエネルギーを強く吸収する有機小分子が主なマトリックス物質として選択される。たとえば、シナピン酸、２．５‐ジヒドロキシ安息香酸、α‐シアノヒドロキシケイ皮酸、２，４，６‐トリヒドロキシアセトフェノンなどがマトリックス主物質として使用される。これらは、通常、溶媒およびその他の物質と混合されてマトリックス２９を形成する。多くの場合、水および、アセトニトリルまたはエタノールなどの有機溶媒が溶媒として用いられる。別の物質として、［Ｍ＋Ｈ］イオンを生成するための対イオン源として、多くの場合トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が用いられる。マトリックス２９の例には、アセトニトリル：水：ＴＦＡ（５０：５０：０．１）中のシナピン酸がある。次いで、短パルス高強度レーザーにより、結晶格子緩和後に、結晶の表面で爆発的な粒子脱離（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）が起きる。マトリックス２９とともに、封入された検体分子は質量分析計１０１の真空中に移動し、それによって質量スペクトル分析に利用可能になる。
この場合、代替的な質量分析計１０１、および特に脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）ＭＳなどの、質量分析試料支持台６の質量分析試料からイオンを生成する代替的なイオン源３を有する代替的な空間分解能質量分析計１も、本発明の範囲内で使用することができることを明示的に指摘する必要がある。
また、質量分析計１０１は、直交イオン注入、静電イオントラップ（たとえばＯｒｂｉｔｒａｐ（登録商標））、高周波イオントラップ、イオンサイクロトロン共振イオントラップおよび四重極質量フィルターを備えた飛行時間型質量分析計１４を含んでもよい。イオンガイドシステム、質量フィルター、イオン移動度セパレータおよびフラグメンテーションセルなどの他のシステム構成要素もこの質量分析システムに組み込んでもよい。
図１ｂは、簡単な質量分析試料支持台６の上面図の簡略化された模式図を示す。ＸＹ‐テーブル７および／またはミラーおよび／またはレンズシステム１０による、Ｘ方向およびＹ方向における、試料プレート６のレーザービーム９の位置の移動方向も示されている。質量分析試料支持台６は、試料スポット１６を有する。質量分析試料１１は試料スポット１６に適用される。質量分析試料支持台６は、少なくとも１つ、通常は複数の試料スポット１６を有する。試料スポット１６は、好ましくは円形表面として設計される。好ましくは、試料スポットは直径０．１ｍｍ～１０ｃｍを有する。好ましくは、試料スポットは直径０．２ｍｍ～８ｃｍを有する。好ましくは、試料スポットは直径０．５ｍｍ～４ｃｍを有する。特に好ましくは、試料スポットは直径１ｍｍ～１ｃｍを有する。特に好ましくは、試料スポットは直径２ｍｍ～６ｍｍを有する。試料スポットの直径は、たとえば、ビーム直径、動物細胞の濃度および／または動物細胞の細胞サイズに基づいて選択することができる。
少なくとも試料スポット１６の領域でのイオン化を促進するために、質量分析試料支持台６の表面は導電性である。このような質量分析試料支持台６は、たとえば、ポリプロピレンなどのポリマー、セラミックまたはガラスからなり、それによって、質量分析試料支持台６はステンレス鋼の層で被覆されることができる。ポリマー、セラミックまたはガラスは、カーボンブラックなどの導電性材料を含んでもよい。あるいは、質量分析試料支持台６は、導電性金属からなり、たとえば．質量分析試料支持台６は、通常、４８～９６の試料スポット１６を有する。さらに、前記の支持体は、複数の参照領域を有することができる。
図２ａ－図２ｄは、請求項１に記載の方法の個々のステップの様々な好ましい実施の形態を模式的に示す。処理ステップは、好ましくは示されている順序で実施される。
図２ａは、以下のステップが実施される本方法の特に好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、第４評価ステップＡ Ｓ８。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＡ Ｓ８における被覆率４５から直接導出される。しかしながら、当業者に公知の一般的な中間計算は、直接導出の範囲からは除外されない。本方法のこの好ましい実施の形態は、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計に用いられる。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４における複数の測定位置３３で記録される測定ステップＡ Ｓ４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、測定位置３３の細胞存在値４２から、試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＡ Ｓ６ａと、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第２評価ステップＡ Ｓ６ａの測定された被覆率４５から導出される第４評価ステップＡ Ｓ８と、
を含む、方法。
図２ｂは、以下のステップが実施される本方法の代替的な好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、第３評価ステップＡ Ｓ７、第４評価ステップＡ Ｓ８。細胞傷害性効果１９は、第４評価ステップＡ Ｓ８において、動物細胞の増殖能から、したがって間接的に被覆率４５から導出される。本方法のこの好ましい実施の形態は、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計に用いられる。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４における複数の測定位置３３で記録される測定ステップＡ Ｓ４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、測定位置３３の細胞存在値４２から、試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＡ Ｓ６ａと、
測定された被覆率４５から増殖能が導出される第３評価ステップＡ Ｓ７と、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第２評価ステップＡ Ｓ６ａの測定された被覆率４５から間接的に導出される第４評価ステップＡ Ｓ８であって、その目的のために、動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第３評価ステップＡ Ｓ７の導出された増殖能から導出される第４評価ステップＡ Ｓ８と、
を含む、方法。
図２ｃは、以下のステップが実施される本方法の特に好ましい代替的な実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＡ Ｓ４ａ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、第４評価ステップＡ Ｓ８。細胞傷害性効果１９は、第４評価ステップＡ Ｓ８における被覆率４５から直接導出される。本方法のこの好ましい実施の形態は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計１、２１に用いられる。測定ステップＡ Ｓ４ｂの前に、試料調製ステップＡ Ｓ４ａにおいてマトリックス２９の正しい位置への適用が行われる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
試料スポット１６の調製が、試料スポット１６の少なくとも１つの部分領域３４へのマトリックス２９の正しい位置への適用によって行われる試料調製ステップＡ Ｓ４ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４における複数の測定位置３３で記録される測定ステップＡ Ｓ４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、測定位置３３の細胞存在値４２から、試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＡ Ｓ６ａと、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第２評価ステップＡ Ｓ６ａの測定された被覆率４５から導出される第４評価ステップＡ Ｓ８と、
を含む、方法。
図２ｄは、以下のステップが実施される本方法の好ましい代替的な実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＡ Ｓ４ａ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、第３評価ステップＡ Ｓ７、第４評価ステップＡ Ｓ８。細胞傷害性効果は、第４評価ステップＡ Ｓ８において、動物細胞の増殖能から、したがって間接的に被覆率４５から導出される。本方法のこの好ましい実施の形態は、マトリックスベースの空間分解能質量分析計１、２１に用いられる。測定ステップＡ Ｓ４ｂの前に、試料調製ステップＡ Ｓ４ａにおいてマトリックス２９の正しい位置への適用が行われる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
試料スポット１６の調製が、試料スポット１６の少なくとも部分領域３４へのマトリックス２９の正しい位置への適用によって行われる試料調製ステップＡ Ｓ４ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４における複数の測定位置３３で記録される測定ステップＡ Ｓ４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、測定位置３３の細胞存在値４２から、試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＡ Ｓ６ａと、
測定された被覆率４５から増殖能が導出される第３評価ステップＡ Ｓ７と、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第２評価ステップＡ Ｓ６ａの測定された被覆率４５から間接的に導出される第４評価ステップＡ Ｓ８であって、その目的のために、動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第３評価ステップＡ Ｓ７の導出された増殖能から導出される第４評価ステップＡ Ｓ８と、
を含む、方法。
図３－１～図３－３は、図２ｃに示すフローチャートに対応する、請求項１に記載の方法の特に好ましい実施の形態の個々のステップを詳細にかつ模式的に示す。この文脈において、特定の個々のステップは、請求項２および／または請求項３に記載の請求項ステップを完全にまたは部分的に示すこともできる。
試料供給ステップＡ Ｓ１において、質量分析試料１１は、適用装置２２によって質量分析試料支持台６の試料スポット１６に適用される。この例では、適用はピペットを用いて実施される。質量分析試料１１は、増殖が可能な動物細胞２３を含む。
さらに、質量分析試料１１は、分析試料および培地を含む。この手法の例示的な説明のために、分析試料は細胞傷害性効果を何も示さず、または、細胞傷害性因子を何も含まない。この例では、質量分析試料１１の成分は、予め混合物中に適用される。他の好ましい実施の形態では、質量分析試料１１の成分は、連続してまたは互いに別々に部分的に適用される。さらに、たとえば、予め試料スポット１６に乾燥形態で動物細胞２３および／または培地を有する事前調製された質量分析試料支持台６の使用も含まれる。この例では、質量分析試料１１の成分は、混合溶液／懸濁液の形態で適用される。質量分析試料１１に加えて、動物細胞２３および培地を含むが細胞傷害性因子または分析試料を含まない対照試料も、別の試料スポット１６に適用される（図示せず）。対照試料は、質量分析試料１１と同様に処理され、後に、評価において参照値を得るために用いられる。
動物細胞２３は、たとえば、ＣＨＯまたはＭＤＣＫ細胞などの、増殖可能な継代細胞株の付着増殖細胞である。
質量分析試料１１の適用後に、培養ステップＳ２において動物細胞２３が培養される。この目的のために、質量分析試料支持台６は培養装置２４内に配置される。この例では、培養装置２４は細胞培養キャビネットである。ここで動物細胞２３の増殖が行われる。動物細胞２３がまだ付着していない場合、細胞傷害性因子が存在しなければ、動物細胞２３の付着もここで行われる。同様に、細胞傷害性因子が存在していない場合、このステップで動物細胞２３の増殖が行われる。培養装置２４は動物細胞２３の、最適の増殖条件、すなわち成長条件を提供する。培養装置２４は、培養装置２４内の湿度、温度、ＣＯ２含有量、Ｏ２含有量および／または他のパラメータを制御する。培養時間は、対照試料に基づくか、または予め決定された時間に基づいて設定される。したがって、培養装置２４において十分な培養時間を用いることによって、対照試料における被覆率４５が検出可能である。培養後、付着動物細胞２３、２５および非付着動物細胞２３、２６が試料スポット１６に存在する。非付着動物細胞２３、２５は、たとえば、なお懸濁状態にあり、沈降して付着することができなかった動物細胞２３であるか、または再び脱離した死んだ付着動物細胞２３である。
液体除去ステップＳ３ａにおいて、質量分析試料１１の培地および緩衝液などの液体成分が除去される。付着動物細胞２３、２５は、試料スポット１６の付着位置に留まる。これは、たとえば、試料スポット１６の質量分析試料１１に接触させる吸収材などの液体吸引装置２７によって行われる。質量分析試料１１の液体が吸い上げられると、非付着動物細胞２６も部分的にまたはほぼ完全に除去される。液体除去ステップＳ３ａの終了時の結果は、（ほぼ）乾燥した試料スポット１６である。
この例では、測定ステップＡ Ｓ４ｂにおいてマトリックスベースの空間分解能質量分析計１が用いられるため、上流の試料調製ステップＡ Ｓ４ａは測定前に実施されるが、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計では上流の試料調製ステップＡ Ｓ４ａは省略される。試料調製ステップＡ Ｓ４ａにおいて、スプレー装置２８によって質量分析試料支持台６にマトリックス２９が噴霧される。スプレー装置２８は、マトリックスマイクロ液滴３０および／またはマトリックスナノ液滴を生成する。さらに、スプレー装置２８は、すでに適用されたマトリックス液滴をマトリックス２９の適用時に乾燥させることができるように調整および設計される。これは、スプレー装置のスプレー速度を調整すること、マトリックス液滴をできるだけ小さく保つこと、および／または質量分析試料支持台６の表面を乾燥することによって実現される。さらに、揮発性の高いマトリックス２９を用いることもできる。これによって、マトリックス２９が正しい位置で適用されることを確実にする。これによって、試料スポット１６にマトリックス膜が形成されないか、または、一時的に顕著であるとともに薄く連続するマトリックス膜のみが形成されることを確実にする。特に、適用されるマトリックス２９は、動物細胞２３を破壊して、破壊された動物細胞３１を生成する。正しい位置への適用の場合、動物細胞２３の細胞成分および細胞内容物が、それぞれの動物細胞２３の位置にほぼ留まることが非常に重要である。
マトリックス２９の乾燥後、質量分析試料１１は、測定ステップＡ Ｓ４ｂにおいてマトリックスベースの空間分解能質量分析計２１によって測定される。この例では、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１はＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＭＳ ２である。この目的のために、空間分解質量スペクトル３８は、試料スポット１６の部分領域３４における複数の測定位置３３で記録される。測定位置３３は、試料スポット１６の部分領域３４を覆う格子３５の形で分布する。この例では、部分領域３４は格子３５によってカバーされている。
空間分解質量スペクトル３８は、空間分解質量スペクトル３８を処理し評価するソフトウェアを備えたコンピュータの形態のデータ処理ユニット３７に転送される。データ処理ユニット３７は、評価ステップを実行する。この例では、データ処理ユニット３７は第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａおよび第４評価ステップＡ Ｓ８を実行する。次いで、データ処理ユニット３７は、分析試料が細胞傷害性効果を有するかどうかを示す結果を与える。さらに、細胞傷害性効果４６の程度が示される。データ処理ユニット３７は、測定ステップＡ Ｓ４ｂにおいてマトリックスベースの空間分解能ＭＳ ２１を制御し、生成されたデータを格納するためにも用いられる。
図４は、請求項１に記載の方法の測定ステップＡ Ｓ４ｂを詳細にかつ模式的に示す。試料スポット１６の部分領域３４の各測定位置３３から、少なくとも１つの空間分解質量スペクトル３８が記録される。空間分解質量スペクトル３８は、質量分析シグナル３９を有する。これらは、特に、培地、動物細胞２３、および分析試料の残渣によって生成される。動物細胞２３の内容物および成分は、細胞特異的質量分析シグナル４０を生成する。これらは、データベースを用いて非細胞特異的質量分析シグナル５５とは区別される。データベースは、好ましくは、質量分析試料１１の個々の成分の対照試料を用いて予め作成されるか、または他のデータベースから作成される。データベースは、参照データ（参照値）および／または参照データセットを含む。参照データおよび参照データセットは、分光測定データまたはそれから導出されたデータを含んでもよい。前記データは、動物細胞２３、培地、マトリックス２９、標準品、細胞傷害性因子（すなわち、細菌、ウイルスおよび／または真菌またはこれらの群の成分（化学物質およびその他の潜在的細胞傷害性因子））、細胞傷害性因子‐中和因子、および／または分析試料の他の成分に由来してもよい。
参照データまたは参照データセットは、質量スペクトルおよび／または質量スペクトルから導出されるｎ組のデータを含んでもよい。ｎ組のデータの例には、質量分析シグナル３９の存在量およびそれらに関連する狭い質量チャネルのリストと、該当する場合、質量スペクトルについての任意のメタ情報とがある。導出データは、たとえば、元の質量スペクトルから生成される最も顕著な質量分析シグナル３９のピークリスト、または、ベースライン減算、導出、ノイズ除去などを用いて削減されたデータなどを含んでもよい。
マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１では、試料調製ステップＡ、Ｂ Ｓ４ａ、Ｓ１０４ａの後、ほぼ無傷の動物細胞２３の代わりに、次に、ほぼ破壊された動物細胞３１が測定位置３３には存在する。破壊された動物細胞３１が測定位置３３に存在する場合、空間分解質量スペクトル３８は細胞特異的質量分析シグナル４０も示す。非マトリックスベースの空間分解能質量分析計では、質量分析シグナル４０は、ほぼ無傷の動物細胞２３によって生成される。
したがって、図５における測定位置３３のある部分には破壊された動物細胞３１が存在し、測定位置３３の別の部分には破壊された動物細胞３１または動物細胞２３が存在しない。破壊された動物細胞３１が測定位置３３に存在しない場合、空間分解質量スペクトル３８は細胞特異的質量分析シグナル４０を示さない。
図５は、請求項１に記載の方法の第１評価ステップＡ Ｓ５を詳細にかつ模式的に示す。最初に、各空間分解質量スペクトル３８が、細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析される。前記シグネチャーは、データ処理ユニット３７によって、分析試料を含む質量分析試料１１の個々の測定位置３３の空間分解質量スペクトル３８またはそれから導出されたデータと、作成されたもしくは記憶された対照試料の質量スペクトルまたはそれから導出されたデータとの比較によって同定される。マッチング手順は、分析試料を含む質量分析試料の測定データまたはそれから導出されたデータと、生成されたもしくは記憶された対照試料の測定データまたはそれから導出されたデータとの間の一致の程度を測定する。たとえば、一致の程度は、ＭＡＬＤＩ Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（登録商標）（Ｂｒｕｋｅｒ社）などの市販システムに使用されているような類似性尺度（「スコア」）またはその対数（「ｌｏｇスコア」）を用いて測定することができる。さらに、たとえば、予め分類器訓練によって測定された計算規則の形態での分類器も、分類に使用することができる。他の方法は、当業者に公知である。
データ処理ユニット３７は、各空間分解質量スペクトル３８における細胞特異的質量分析シグネチャー４１を探索して、動物細胞が測定位置３３に存在していたかどうかを測定する。好ましくは、試料スポット１６の各測定位置３３に同じ質量分析シグネチャー４１が用いられる。それぞれの空間分解質量スペクトル３８における細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在に基づいて、細胞存在値４２が各測定位置３３に割り当てられる。空間分解質量スペクトル３８において細胞特異的シグネチャー４１が検出された場合、測定位置３３における動物細胞２３の存在を示す正の細胞存在値４３が測定位置３３に割り当てられる。空間分解質量スペクトル３８において細胞特異的シグネチャー４１が検出されない場合、動物細胞２３の非存在を示す負の細胞存在値４４が測定位置３３に割り当てられる。
図６は、図２ｃに対応する、請求項１に記載の方法の評価ステップ（第２評価ステップＡ Ｓ６ａおよび第４評価ステップＡ Ｓ８）の結果を詳細にかつ模式的に示す。この模式図は、主に、本願の範囲内で明確化するためのものである。図６における評価ステップは、データ処理ユニット３７によっても実施される。第１評価ステップＡ Ｓ５において各測定位置３３に細胞存在値４２が割り当てられた後、第２評価ステップＡ Ｓ６ａにおいて、動物細胞２３による試料スポット１６の部分領域３４の被覆率４５がそれから測定される。この目的のために、試料スポット１６の部分領域３４が、格子３５によって分割される。次いで、試料スポット１６の合計部分領域３４に対する正の細胞存在値４３を有する部分領域の割合が計算される。あるいは、正の細胞存在値４３の数が、負の細胞存在値４４の数に対して設定される。
次いで、第４（最終）評価ステップＳ８において、細胞傷害性効果４６が被覆率４５から導出される。この目的のために、被覆率４５が、対照試料の被覆率４５および／または記憶された被覆率４５と比較される。これに続いて、細胞傷害性効果４６の導出が行われる。これによって、細胞傷害性因子が質量分析試料１１に存在するかどうかも測定される。
たとえば、細胞傷害性因子の細胞傷害性効果４６は以下のように等級付けされる：
（ｉ）細胞傷害性効果４６なし（分析試料を含む質量分析試料１１の被覆率４５が、細胞傷害性因子なしの対照試料の被覆率４５に対応している）。動物細胞２３は、阻害されることなく増殖することができた。
（ｉｉ）強い細胞傷害性効果４６（動物細胞２３または動物細胞２３の増殖を試料スポット１６で検出することができなかった）。動物細胞２３の付着、増殖および／または細胞分裂は認められなかった。この場合、分析試料を含む質量分析試料１１の被覆率４５は、好ましくは、細胞増殖抑制作用のある細胞傷害性因子を含む対照試料の被覆率４５に対応するか、またはそれより低いか、または動物細胞２３を試料スポット１６で検出できなかった。
（ｉｉｉ）中程度の細胞傷害性効果４６（対照試料の５０％未満の被覆率４５を測定することができた）。
（ｉｖ）弱い細胞傷害性効果４６（対照試料の５０％を超える被覆率４５を検出することができた）。
代替的な好ましい実施の形態では、増殖能は被覆率４５から導出される（図６では図示せず）。ここで、被覆率４５は、質量分析試料１１の条件下で動物細胞２３がどの程度増殖することができるかを導出するために用いられる。次いで、増殖能から、細胞傷害性効果４６の導出が代替的にまたは追加的に行われる。
図７ａ～図７ｄは、選択された従属下位請求項と組み合わせた請求項１に記載の方法の様々な好ましい実施の形態を模式的に示す。処理ステップは、好ましくは、示された順序で実施される。すべての可能な組み合わせが示されているわけではない。しかしながら、残りの組み合わせは、当業者に容易に理解される。
図７ａは、以下のステップが行われる本方法の好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、洗浄ステップＳ３ｂ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、第４評価ステップＡ Ｓ８。第３評価ステップＡ Ｓ７を省略することによって、この手法が単純化される。洗浄ステップＳ３ｂにおいて、質量分析試料支持台６は、洗浄液（たとえば緩衝液）によってすすがれる。培養後のさらなる洗浄ステップＳ３ｂによって、たとえば、培地、損傷を受けた動物細胞２３から漏出した細胞内容物または質量分析試料１１の他の成分によって生成される、非細胞特異的質量分析シグナル５５、バックグラウンドシグナルおよびバックグラウンドノイズ５８は低減する。さらに、偽陽性細胞存在値４３を生じ、結果を偽らせる可能性のある非付着動物細胞２３が、洗浄によってさらなる信頼性をもって除去される。したがって、特に、本方法が、試料供給ステップＳ１において、懸濁形態での動物細胞２３の適用による動物細胞２３の供給を含み、動物細胞２３が試料スポット１６にすでに存在しない場合に、洗浄ステップＳ３ｂが推奨される。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＡ Ｓ８において、被覆率４５から導出される。本方法のこの好ましい実施の形態は、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計１に用いられる。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。
図７ｂは、以下のステップが実施される本方法の好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＡ Ｓ４ａ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、中間評価ステップＡ Ｓ６ｂ、第４評価ステップＡ Ｓ８。同様に、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１を用いる方法に中間評価ステップＡ Ｓ６ｂを使用することができる。
この手法は、好ましくは、対照試料を用い、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１を用いて実施される。中間評価ステップＡ Ｓ６ｂは、対照試料が存在する場合に実施される。したがって、細胞傷害性効果４６の評価を、簡単かつ信頼性のある方法で実施することができる。対照試料は、この手法の他の場所の計算に含めることもできる。中間評価ステップＡ Ｓ６において、対照試料の試料スポット１６の被覆率４５と、分析試料を含む質量分析試料１１の試料スポット１６の被覆率４５との比較が実施される。この目的のために、対照試料の被覆率４５を１００％の値とし、分析試料を含む質量分析試料１１の被覆率４５をこれに対して定める。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＡ Ｓ８において、質量分析試料と対照試料との被覆率４５の測定された比較から導出される。この目的のために、細胞傷害性効果４６は、たとえば、細胞傷害性効果４６の等級が被覆率４５の値の範囲に割り当てられたレベルに基づいて分類される。当業者に公知の一般的な中間計算はここに含まれる。
図７ｃは、以下のステップが実施される本方法の好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、洗浄ステップＳ３ｂ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、中間評価ステップＡ Ｓ６ｂ、第４評価ステップＡ Ｓ８。この手法は、好ましくは、試料供給ステップＡ Ｓ１において、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１を用い、対照試料を用い、かつ懸濁形態で動物細胞２３を適用することによって実施される。評価における対照試料の使用および組み込みによって、細胞傷害性効果４６の精密かつ信頼性のある評価が容易にもたらされる。Ｓ３ｂ洗浄ステップも、プロセスの信頼性および精度を高める。
図７ｄは、以下のステップが実施される本方法の好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、洗浄ステップＳ３ｂ、測定ステップＡ Ｓ４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＡ Ｓ６ａ、中間評価ステップＡ Ｓ６ｂ、第３評価ステップＡ Ｓ７、第４評価ステップＡ Ｓ８。本方法は、さらに動物細胞２３の増殖能が測定される場合、好ましくは、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１を用い、対照試料を用い、かつ試料供給ステップＡ Ｓ１において懸濁形態で動物細胞２３を適用して実施される。
図８ａ～図８ｄは、請求項３に記載の方法の好ましい実施の形態を模式的に示す。請求項１に記載の方法から逸脱するステップには、逸脱参照符号および文字Ｂが表示されている。しかしながら、処理ステップは、図３にすでに示した処理ステップと同じ本質的特徴を有する。処理ステップは、好ましくは、示された順序で実施される。
したがって図８ａは、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための本方法の特に好ましい実施の形態を示す。この手法では、以下のステップが実施される：試料供給ステップＢ Ｓ１０１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、測定ステップＢ Ｓ１０４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａ、第４評価ステップＢ Ｓ１０８。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＢ Ｓ１０８において細胞拡大距離５３から導出される。当業者に公知の一般的な中間計算はここに含まれる。処理ステップに関する詳細な説明は、図８ｂの図の説明にある。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果５６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１であって、試料スポット１６が第１および第２部分領域４７、４８を有し、動物細胞２３が試料スポット１６の第１部分領域４７に供給され、かつ動物細胞２３が試料スポット１６の第２部分領域４８に供給されず、残りの質量分析試料１１が両方の部分領域４７、４８に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
試料スポット１６上の質量分析試料１１の残液が除去される液体除去ステップＳ３ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも２つの測定位置５６、５７で記録される測定ステップＢ Ｓ１０４ｂであって、第１測定位置３３、５６がなお動物細胞２３を有し、第２測定位置３３、５７が動物細胞２３を有さず、両測定位置５６、５７が基準点５１を起点とした伸長方向５０の１つに位置する測定ステップＢ Ｓ１０４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３、５６、５７に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
細胞拡大距離５３が、基準点５１から遷移点５２までの少なくとも１つの距離から測定される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａであって、各遷移点５２が少なくとも第１および第２測定位置５６、５７から計算される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａと、
分析試料の細胞傷害性効果４６が、第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａの細胞拡大距離５３から導出される第４評価ステップＢ Ｓ１０８と、
を含む、方法。
図８ｂは、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１のための本方法の特に好ましい別の実施の形態を示す。この手法では、以下のステップが実施される：試料供給ステップＢ Ｓ１０１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＢ Ｓ１０４ａ、測定ステップＢ Ｓ１０４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａ、第４評価ステップＢ Ｓ１０８。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＢ Ｓ１０８において、細胞拡大距離５３から導出される。当業者に公知の一般的な中間計算はここに含まれる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果５６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１であって、試料スポット１６が第１および第２部分領域４７、４８を有し、動物細胞２３が試料スポット１６の第１部分領域４７に供給され、かつ動物細胞２３が試料スポット１６の第２部分領域４８に供給されず、残りの質量分析試料１１が両方の部分領域４７、４８に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
試料スポット１６上の質量分析試料１１の残液が除去される液体除去ステップＳ３ａと、
試料スポット１６の調製が、試料スポット４８の両方の部分領域４７、４８の少なくとも一部へのマトリックス２９の正しい位置への適用によって行われる試料調製ステップＢ Ｓ１０４ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも２つの測定位置５６、５７で記録される測定ステップＢ Ｓ１０４ｂであって、第１測定位置３３、５６がなお動物細胞２３を有し、第２測定位置３３、５７が動物細胞２３を有さず、両測定位置５６、５７が基準点５１を起点とした伸長方向５０の１つに位置する測定ステップＢ Ｓ１０４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３、５６、５７に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
細胞拡大距離５３が、基準点５１から遷移点５２までの少なくとも１つの距離から測定される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａであって、各遷移点５２が少なくとも第１および第２測定位置５６、５７から計算される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａと、
分析試料の細胞傷害性効果４６が、第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａの細胞拡大距離５３から導出される第４評価ステップＢ Ｓ１０８と、
を含む、方法。
請求項３または請求項２０に記載の他の好ましい実施の形態（たとえば図８ａ～図８ｄ）の例示として、ここでこの実施の形態を詳細に説明する。
・試料供給ステップＢ Ｓ１０１：動物細胞２３を第１部分領域４７に供給する。この目的のために、栄養培地とともに動物細胞２３を第１部分領域４７に配置し、そこでインキュベートする。動物細胞２３が増殖し、第１部分領域４７に付着した後、残液が除去される。このプロセスで、非付着動物細胞２３も除去される。次いで、動物細胞２３を含まない残りの質量分析試料１１が添加される。残りの質量分析試料１１は、特に、分析試料（たとえば細胞傷害性因子を潜在的に含む尿試料）および培地を含む。残りの質量分析試料１１は、試料スポット１６全体、すなわち第１部分領域４７および第２部分領域４８に適用される。
・培養ステップＳ２：動物細胞２３が、図３の図の説明における培養ステップＳ２と同様に培養される。
・液体除去ステップＳ３ａ：試料スポット１６上の質量分析試料１１の残液が除去される。このステップは図３の図の説明における液体除去ステップＳ３ａに類似している。
・試料調製ステップＢ Ｓ１０４ａ：この適用は、図３の図の説明における試料調製ステップＡ ４ａに類似している。この例では、マトリックス２９は、正しい位置で試料スポット１６全体に適用される。
・測定ステップＢ Ｓ１０４ｂ：空間分解質量スペクトル３８が複数の測定位置３３で記録される。代替的な好ましい実施の形態では、空間分解質量スペクトル３８が、その後の細胞拡大距離５３の測定が行われる伸長方向５０に沿った複数の測定位置３３でのみ記録される。これによって不必要な測定が省ける。
・第１評価ステップＳ５：各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３に割り当てられる。この第１評価ステップＳ５は、図４および図５の図の説明と同様に実施される。
・第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａ：伸長方向に沿った遷移点５２が測定される。参照値から遷移点５２までの距離によって細胞拡大距離が得られる。第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａについてのさらなる詳細は、図１０の説明で確認できる。
・第４評価ステップＢ Ｓ１０８：細胞傷害性効果が、細胞拡大距離５３と参照値との比較によって細胞拡大距離５３から導出される。これらは、記憶されたデータとしてすでに利用可能であるか、または対照試料の助けを借りて測定される。細胞拡大距離５３は、参照値に基づいて細胞傷害性効果４６に割り当てることができる。続いて、分析試料が細胞傷害性効果を有していたかどうかについて出力される。さらに、細胞傷害性効果がどの程度強かったかについて出力される。好ましくは、第４評価ステップＢ Ｓ１０８において、動物細胞の増殖能および／または遊走能および／または分析試料の病原性が細胞拡大距離５３から直接導出される。
図８ｃは、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計のための本方法の代替的な好ましい実施の形態を示す。この手法では、以下のステップが実施される：試料供給ステップＢ Ｓ１０１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、測定ステップＢ Ｓ１０４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａ、第３評価ステップＢ Ｓ１０７、第４評価ステップＢ Ｓ１０８。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＢ Ｓ１０８において、増殖能および／または遊走能から導出される。当業者に公知の一般的な中間計算はここに含まれる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果５６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１であって、試料スポット１６が第１および第２部分領域４７、４８を有し、動物細胞２３が試料スポット１６の第１部分領域４７に供給され、かつ動物細胞２３が試料スポット１６の第２部分領域４８に供給されず、残りの質量分析試料１１が両方の部分領域４７、４８に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
試料スポット１６上の質量分析試料１１の残液が除去される液体除去ステップＳ３ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、非マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも２つの測定位置５６、５７で記録される測定ステップＢ Ｓ１０４ｂであって、第１測定位置３３、５６がなお動物細胞２３を有し、第２測定位置３３、５７が動物細胞２３を有さず、両測定位置５６、５７が基準点５１を起点とした伸長方向５０の１つに位置する測定ステップＢ Ｓ１０４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３、５６、５７に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
細胞拡大距離５３が、基準点５１から遷移点５２までの少なくとも１つの距離から測定される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａであって、各遷移点５２が少なくとも第１および第２測定位置５６、５７から計算される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａと、
動物細胞２３の増殖能および／または遊走能が、測定された細胞拡大距離５３から導出される第３評価ステップＢ Ｓ１０７と、
分析試料の細胞傷害性効果４６が、第３評価ステップＢ Ｓ１０７の増殖能および／または遊走能から導出される第４評価ステップＢ Ｓ１０８と、
を含む、方法。
図８ｄは、マトリックスベースの空間分解能質量分析計２１のための本方法の代替的な好ましい実施の形態を示す。この手法では、以下のステップが実施される：試料供給ステップＢ Ｓ１０１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＢ Ｓ１０４ａ、測定ステップＢ Ｓ１０４ｂ、第１評価ステップＡ Ｓ５、第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａ、中間評価ステップＢ Ｓ１０６ｂ、第４評価ステップＢ Ｓ１０８。中間評価ステップＢ Ｓ１０６ｂでは、少なくとも１つの対照試料の細胞拡大距離５３と質量分析試料１１の細胞拡大距離５３との比較が実施される。この目的のために、対照試料の細胞拡大距離５３を１００％の値とし、質量分析試料１１の細胞拡大距離５３をこれに対して定める。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＢ Ｓ１０８において、測定された質量分析試料１１と対照試料との細胞拡大距離５３の比較から導出される。この目的のために、細胞傷害性効果は、細胞傷害性効果の等級が細胞拡大距離５３の値の範囲に割り当てられたレベルを用いて分類される。当業者に公知の一般的な中間計算はここに含まれる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果５６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１であって、試料スポット１６が第１および第２部分領域４７、４８を有し、動物細胞２３が試料スポット１６の第１部分領域４７に供給され、かつ動物細胞２３が試料スポット１６の第２部分領域４８に供給されず、残りの質量分析試料１１が両方の部分領域４７、４８に供給される試料供給ステップＢ Ｓ１０１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
試料スポット１６上の質量分析試料１１の残液が除去される液体除去ステップＳ３ａと、
試料スポット１６の調製が、試料スポット１６の両方の部分領域４７、４８の少なくともの一部へのマトリックス２９の正しい位置への適用によって行われる試料調製ステップＢ Ｓ１０４ａと、
空間分解質量スペクトル３８が、マトリックスベースの空間分解能質量分析計１によって試料スポット１６の少なくとも２つの測定位置５６、５７で記録される測定ステップＢ Ｓ１０４ｂであって、第１測定位置３３、５６がなお動物細胞２３を有し、第２測定位置３３、５７が動物細胞２３を有さず、両測定位置５６、５７が基準点５１を起点とした伸長方向５０の１つに位置する測定ステップＢ Ｓ１０４ｂと、
各空間分解質量スペクトル３８が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析され、細胞存在値４２が各測定位置３３、５６、５７に割り当てられる第１評価ステップＡ Ｓ５と、
細胞拡大距離５３が、基準点５１から遷移点５２までの少なくとも１つの距離から測定される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａであって、各遷移点５２が少なくとも第１および第２測定位置５６、５７から計算される第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａと、
少なくとも１つの対照試料の細胞拡大距離５３と、分析試料を含む質量分析試料１１の細胞拡大距離５３との比較が実施され、その比較が第４評価ステップＢ Ｓ１０８における細胞傷害性効果４６の導出に含まれる中間評価ステップＢ Ｓ１０６ｂと、
分析試料の細胞傷害性効果４６が、中間評価ステップＢ Ｓ１０６ｂからの比較を含む第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａの分析試料の細胞拡大距離５３から導出される第４評価ステップＢ Ｓ１０８と、
を含む、方法。
図９ａ－図９ｃは、請求項３に記載の試料スポット１６の好ましい実施の形態を模式的に示す。たとえば、図９ａは、試料供給ステップＢ Ｓ１０１における、第１部分領域４７および第２部分領域４８を有する円形の試料スポット１６を示す。動物細胞２３は、第１部分領域４７に予め供給されている。明確化のために、第１部分領域４７は、想像上の中断境界線４９によって第２部分領域４８から区切られている。第２部分領域４８には動物細胞２３が存在しない。以下の培養ステップＳ２において、好ましくは、伸長方向５０において、第２部分領域４８への動物細胞２３の伸長が行われる。伸長方向５０は、好ましくは、境界線４９に直交して延びている。
図９ｂは、試料供給ステップＢ Ｓ１０１における、請求項３に記載の試料スポット１６の代替的な実施の形態を示す。試料スポット１６は細長い。試料スポット１６も、第１部分領域４７および第２部分領域４８を有する。明確化のために、第１部分領域４７は、想像上の中断境界線４９によって第２部分領域４８から区切られている。動物細胞２３は、第１部分領域４７に予め供給されている。ここで、細胞拡大距離５３は、後に第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａにおいて、境界線４９に直交する境界線４９の異なる位置における１つのみの伸長方向５０において測定される。
試料スポット１６のさらなる実施の形態も本発明の範囲に含まれる。したがって、試料スポット１６のさらなる形態も含まれる。試料スポット１６が円形であり、第１部分領域４７および第２部分領域４８が、２つの部分領域４７、４８の隣接側が直線状の想像上の境界線４９を形成するように形成される実施の形態も含まれる。
図９ｃは、増殖が行われた培養ステップＳ２後の図９ａからの試料スポット１６を模式的に示す。動物細胞２３は、第１部分領域４７から境界線４９を超えて第２部分領域４８に広がっている。後の第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａにおける細胞拡大距離５３は伸長方向５０に測定される。
図１０は、たとえば、図８ａ～図８ｄおよび図９ｃに詳細に示されている請求項３に記載の方法の第２評価ステップＢ Ｓ１０６ａおよび第４評価ステップＢ Ｓ１０８を模式的に示す。特に、遷移点５２の計算および細胞拡大距離５３の測定が示されている。
この例では、伸長方向５０は同じ基準点５１から開始される。この例では、基準点５１は第１部分領域４７の中央にある。伸長方向５０の１つにある遷移点５２を測定するために、基準点５１を起点として細胞存在値４２が確認される。この目的のために、伸長方向５０において隣接する２つの測定位置３３、５６、５７において、伸長方向５０に沿って正の細胞存在値４３から負の細胞存在値４４への変化が測定される。このように、基準点５１から伸長方向５０において、ほぼすべての測定位置３３で、遷移点５２の前方に動物細胞２３が存在し、遷移点５２の後方に動物細胞２３がほとんど存在しない。したがって、遷移点５２は、伸長方向５０において、それぞれ異なる細胞存在値４２（正の細胞存在値４３および負の細胞存在値４４）を有する第１および第２測定位置５６、５７から計算される。遷移点５２は、好ましくは、２つの測定位置５６、５７の中央に位置する。基準点５１から遷移点５２までの距離によって細胞拡大距離５３が得られる。これは、好ましくは複数の伸長方向５０について測定される。これに続いて、試料スポット１６の計算された細胞拡大距離５３の平均化が行われる。分析試料１６の細胞傷害性効果４６は、平均化された細胞拡大距離５３から導出される。
たとえば、分析試料の細胞傷害性効果４６は以下のように等級付けされる。
（ｉ）細胞傷害性効果４６なし（分析試料を含む質量分析試料１１の細胞拡大距離５３が、細胞傷害性因子なしの対照試料の細胞拡大距離５３に対応している）。動物細胞２３は、阻害されることなく増殖および分裂することができた。
（ｉｉ）強い細胞傷害性効果５６（試料スポット１６で動物細胞２３が検出されなかったか、または試料スポット１６の第２部分領域４８で動物細胞２３が検出されなかった）。動物細胞２３の増殖または細胞分裂は認められなかった。細胞拡大距離５３はほぼ０である。あるいは、動物細胞２３は第１部分領域４７から剥離しており、それが、第１測定位置５６が第１部分領域４７の元の境界で検出することができない理由である。
（ｉｉｉ）中程度の細胞傷害性効果４６（細胞拡大５３は対照試料の５０％未満であった）。
（ｉｖ）弱い細胞傷害性効果４６（細胞拡大５３は対照試料の５０％を超えた）。
図１１は、細胞特異的質量分析シグナル４０、非細胞特異的質量分析シグナル５５および細胞特異的質量分析シグネチャー４１を有する種々の質量分析試料１１の例示的な質量スペクトル２０を示す。使用した質量分析計１０１は非空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦであった。また、マトリックス２９は正しい位置へは適用されなかった。したがって、質量スペクトル２０は、試料スポット１６全体の合計スペクトルを表し、本発明に従って生成されていない。さらに、質量スペクトル２０は空間分解されていない。ここでは、特に、細胞特異的質量分析シグナル４０、細胞特異的質量分析シグネチャー４１、非細胞特異的質量分析シグナル５５、および参照値測定の可能性を明らかにすることが意図されている。特に、図１１ｂの質量スペクトル２０は、培養ステップＳ２の前に予め存在していた少数の残留動物細胞２３（種細胞）が生成できるのが、主として弱い細胞特異的質量分析シグナル４０であるため、ここではおおよその例に過ぎない。
図１１ａは、動物細胞２３および培地を含む第１対照試料の質量スペクトル２０を示す。動物細胞２３は連続ヒト細胞株Ａ５４９の細胞である。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む複合培地ＤＭＥＮを培地として用いた。動物細胞２３の培養は２４時間実施した。細胞傷害性因子は存在しなかった。質量スペクトル２０は、動物細胞２３、培地、細胞傷害性因子およびマトリックス２９によって生成される質量分析シグナル３９を含む。質量分析シグナル３９は、細胞特異的質量分析シグナル４０、非細胞特異的質量分析シグナル５５および選択された細胞特異的質量分析シグネチャー４１を含む。
図１１ｂは、動物細胞２３、培地および細胞傷害性因子を含む第２対照試料（それぞれ細胞傷害性因子を含む分析試料を含む質量分析試料）の質量スペクトル２０を示す。動物細胞２３はまた、ヒト連続細胞株Ａ５４９の細胞である。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む複合培地ＤＭＥＮも、培地として用いた。細胞傷害性因子は、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウムである。動物細胞２３の培養は２４時間行った。質量スペクトル２０は、本質的に培地、細胞傷害性因子およびマトリックス２９によって生成される非細胞特異的質量分析シグナル５５を含む。培養ステップＳ２中に細胞傷害性因子が存在することに起因して、動物細胞２３は増殖しなかった。特異的な細胞特異的質量分析シグナル４０は存在しない。この例は、本発明に従っていない試料スポット１６全体の合計質量スペクトルであるため、この例では散発的な弱い細胞特異的質量分析シグナル４０が検出される可能性はあるが、これは空間分解能質量分析計１を用いる場合にはほとんど存在しない。これらの弱い細胞特異的質量分析シグナル４０は、最初に供給された少数の動物細胞２３（種細胞）に起因する。
さらに、弱く数の少ない質量分析シグナル３９は、動物細胞２３によって分泌されるタンパク質によって、破壊された動物細胞２３の細胞成分によって、または培養ステップＳ２中に試料スポット１６の個々の測定位置３３に部分的に分布している代謝物によって生成され得る。しかしながら、これらの質量分析シグナル３９も通常は低強度であり、必要に応じて、マトリックス２９の空間的に分布した適用の前に、任意の洗浄ステップＳ３Ｂによって簡単な方法で大部分除去することができる。しかしながら、好ましくは、このような干渉をほぼ受けない質量分析シグネチャー４１が選択される。この質量分析シグネチャー４１は、たとえば対応する対照試料を用いて測定することができる。また、たとえば、図１１ｂのように、非空間分解能ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦの試料スポット１６全体の合計質量スペクトルを用いて行うこともできる。このデータは、データ処理ユニット３７のデータベースに予め記憶させ、本方法に利用できるようにしてもよい。
図１１ｃは、培地および内部標準を含む第３対照試料であって、動物細胞２３および細胞傷害性因子を含まない第３対照試料の質量スペクトル２０を示す。培地およびマトリックス２９は、図１１ａおよび図１１ｂのものに対応する。細胞特異的質量分析シグナル４０は存在しない。
第１対照試料ａと、ｂおよびｃにおける第２および第３対照試料との質量スペクトル２０の比較から、質量分析シグナル３９は動物細胞２３、培地およびマトリックス２９に割り当てることができる。図１１ａにおける選択された細胞特異的質量分析シグネチャー４１は、細胞特異的質量分析シグナル４０を有する。これらの記録された細胞特異的質量分析シグナル４０は特異的である。したがって、細胞特異的質量分析シグネチャー４１の細胞特異的質量分析シグナル４０は、複数の非細胞特異的質量分析シグナル５５、バックグラウンドノイズ５８ならびに第２対照試料ｂおよび第３対照試料ｃのこの質量範囲における強度に対して特に高い強度差を有する。
特に、細胞特異的質量分析シグナル４０および細胞特異的質量分析シグネチャー４１を測定するためには、本明細書に記載されているように、対照試料の質量スペクトル２０の全部または一部の比較は好ましい選択肢である。他の対照試料とのさらなる比較も明示的に含まれる。特に、細胞特異的質量分析シグナル４０および細胞特異的質量分析シグネチャー４１の測定は、データベース、特に対照試料のデータベースに記憶された質量スペクトル２０、および／またはそれらから導出されたデータをマッチングすることによって実施することができる。細胞特異的質量分析シグナル４０、特に特異的な細胞特異的質量分析シグナル４０を測定するためのさらなる方法は当業者に十分に知られている。たとえば、本プロセスは、特徴検出、特徴選択および／または分類器訓練を含んでもよい。たとえば、１変量データ解析法および／または多変量データ解析法を分類器訓練に使用することができる。１変量データ解析法は、たとえば、受信者動作特性、ｔ検定、クラスカル・ウォリス検定および／またはＡＮＯＶＡを含む。多変量データ解析法は、たとえば、線形判別分析（ＬＤＡ）、ランダムフォレスト法、決定木、主成分分析（ＰＣＡ）、階層的および他のクラスタリング法、パターン認識、ニューラルネットワークおよび／またはＳＶＭを含む。
図１２ａ－図１２ｄは、請求項２に記載の方法の個々のステップを有する様々な好ましい実施の形態を模式的に示す。請求項１および請求項３に記載の方法から逸脱するステップには逸脱参照符号および文字Ｂが表示されている。しかしながら、処理ステップは、図３にすでに示した処理ステップと同じ本質的特徴を有する。したがって、異なる識別子（Ａ、Ｂ、Ｃ）にもかかわらず、請求項１に記載の方法の例から、個々のステップの様々な詳細を実施することができる。処理ステップは、好ましくは、示された順序で実施される。
したがって、図１２ａは、以下のステップが実施される本方法の特に好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、測定ステップＣ Ｓ２０４ｂ、第１評価ステップＣ Ｓ２０５、第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａ、第４評価ステップＣ Ｓ２０８。細胞傷害性効果４６は、第４評価ステップＣ Ｓ２０８において被覆率４５から直接導出される。しかしながら、当業者に公知の一般的な中間計算は、直接導出の範囲からは除外されない。本方法のこの好ましい実施の形態は、非マトリックスベースの質量分析計に用いられる。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞毒性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
質量スペクトル３８が、非マトリックスベースの質量分析計によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４に分布する複数の測定位置３３で記録される測定ステップＣ Ｓ２０４ｂと、
各質量スペクトル２０が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析される第１評価ステップＣ Ｓ２０５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、第１評価ステップＣ Ｓ２０５ｃの結果から試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａと、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａの測定された被覆率４５から直接導出される第４評価ステップＣ Ｓ２０８と、
を含む、方法。
図１２ｂは、以下のステップが実施される本方法の代替的な好ましい実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、測定ステップＣ Ｓ２０４ｂ、第１評価ステップＣ Ｓ２０５、第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａ、測定された被覆率４５から増殖能が導出される第３評価ステップＡ Ｓ７、第４評価ステップＣ Ｓ２０８。細胞傷害性効果１９は、第４評価ステップＣ Ｓ２０８において、動物細胞の増殖能から、したがって間接的に被覆率４５から導出される。本方法のこの好ましい実施の形態は非マトリックスベースの質量分析計に用いられる。マトリックス２９の正しい位置への適用は行われない。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
質量スペクトル２０が、非マトリックスベースの質量分析計によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４に分布する複数の測定位置３３で記録される測定ステップＣ Ｓ２０４ｂと、
各質量スペクトル２０が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析される第１評価ステップＣ Ｓ２０５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、第１評価ステップＣ Ｓ２０５ｃの結果から試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａと、
測定された被覆率４５から増殖能が導出される第３評価ステップＡ Ｓ７と、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第３評価ステップＡ Ｓ７の測定された増殖能から、したがって間接的に被覆率４５から導出される第４評価ステップＣ Ｓ２０８と、
を含む、方法。
図１２ｃは、以下のステップが実施される本方法の特に好ましい代替的な実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＳ４ａ、測定ステップＣ Ｓ２０４ｂ、第１評価ステップＣ Ｓ２０５、第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａ、第４評価ステップＣ Ｓ２０８。細胞傷害性効果１９は、第４評価ステップＣ Ｓ２０８において、被覆率４５から直接導出される。本方法のこの好ましい実施の形態はマトリックスベースの質量分析計に用いられる。測定ステップＣ Ｓ２０４ｂの前に、試料調製ステップＡ Ｓ４ａにおいて、マトリックス２９の正しい位置への適用が行われる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞毒性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
試料スポット１６の調製が、試料スポット１６の少なくとも１つの部分領域３４へのマトリックス２９の正しい位置への適用によって行われる試料調製ステップＡ Ｓ４ａと、
質量スペクトル２０が、マトリックスベースの質量分析計によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４に分布する複数の測定位置３３で記録される測定ステップＣ Ｓ２０４ｂと、
各質量スペクトル２０が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析される第１評価ステップＣ Ｓ２０５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、第１評価ステップＣ Ｓ２０５ｃの結果から試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａと、
測定された被覆率４５から増殖能が導出される第３評価ステップＡ Ｓ７と、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａの測定された被覆率４５から直接導出される第４評価ステップＣ Ｓ２０８と、
を含む、方法。
図１２ｄは、以下のステップが実施される本方法の好ましい代替的な実施の形態を示す：試料供給ステップＡ Ｓ１、培養ステップＳ２、液体除去ステップＳ３ａ、試料調製ステップＡ Ｓ４ａ、測定ステップＣ Ｓ２０４ｂ、第１評価ステップＣ Ｓ２０５、第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａ、第３評価ステップＡ Ｓ７、第４評価ステップＣ Ｓ２０８。細胞傷害性効果１９は、第４評価ステップＣ Ｓ２０８において、動物細胞の増殖能から、したがって間接的に被覆率４５から導出される。本方法のこの好ましい実施の形態はマトリックスベースの質量分析計に用いられる。測定ステップＣ Ｓ２０４ｂの前に、試料調製ステップＡ Ｓ４ａにおいてマトリックス２９の正しい位置への適用が行われる。
したがって、本プロセスは以下の特徴を有する：
動物細胞２３に対する分析試料の細胞毒性効果４６を測定するための方法であって、以下のステップ：
動物細胞２３、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料１１が、質量分析試料支持台６の少なくとも１つの試料スポット１６に供給される試料供給ステップＡ Ｓ１と、
質量分析試料１１が、培養装置２４の質量分析試料支持台６の試料スポット１６でインキュベートされる培養ステップＳ２と、
質量分析試料１１の残液が試料スポット１６から除去される液体除去ステップＳ３ａと、
試料スポット１６の調製が、試料スポット１６の少なくとも１つの部分領域３４へのマトリックス２９の正しい位置への適用によって実施される試料調製ステップＡ Ｓ４ａと、
質量スペクトル２０が、マトリックスベースの質量分析計によって試料スポット１６の少なくとも部分領域３４に分布する複数の測定位置３３で記録される測定ステップＣ Ｓ２０４ｂと、
各質量スペクトル２０が、動物細胞２３の細胞特異的質量分析シグネチャー４１の存在について分析される第１評価ステップＣ Ｓ２０５と、
動物細胞２３による被覆率４５が、第１評価ステップＣ Ｓ２０５ｃの結果から試料スポット１６の少なくとも部分領域３４について測定される第２評価ステップＣ Ｓ２０６ａと、
測定された被覆率４５から増殖能が導出される第３評価ステップＡ Ｓ７と、
動物細胞２３に対する分析試料の細胞傷害性効果４６が、第３評価ステップＡ Ｓ７の測定された増殖能から、したがって間接的に被覆率４５から導出される第４評価ステップＣ Ｓ２０８と、
を含む、方法。
１ 空間分解能質量分析計
２ ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ質量分析計
３ ＭＡＬＤＩイオン源
４ 飛行管
５ 検出器
６ 質量分析試料支持台
７ ＸＹテーブル
８ レーザー
９ レーザービーム
１０ ミラー／レンズシステム
１１ 質量分析試料
１２ 試料イオン
１３ 加速電極
１４ 飛行時間型質量分析計
１５ 真空ポンプ
１６ 試料スポット
１７ 加速経路
２０ 空間分解されない質量スペクトル
２１ マトリックスベースの空間分解能質量分析計
２２ 適用装置
２３ 動物細胞
２４ 培養装置
２５ 付着動物細胞
２６ 非付着動物細胞
２７ 液体吸引装置
２８ スプレー装置
２９ マトリックス
３０ マトリックスマイクロ液滴
３１ 破壊された動物細胞
３３ 測定位置
３４ 試料スポットの部分領域
３５ 格子
３７ データ処理ユニット
３８ 空間分解質量スペクトル
３９ 質量分析シグナル
４０ 細胞特異的質量分析シグナル
４１ 細胞特異的質量分析シグネチャー
４２ 細胞存在値
４３ 正の細胞存在値
４４ 負の細胞存在値
４５ 被覆率
４６ 細胞傷害性効果
４７ 第１部分領域
４８ 第２部分領域
４９ 境界線（例示的）
５０ 伸長方向
５１ 基準点
５２ 遷移点
５３ 細胞拡大距離
５５ 非細胞特異的質量分析シグナル
５６ 第１測定位置
５７ 第２測定位置
５８ バックグラウンドノイズ
１０１ 質量分析計
Ｓ１ 試料供給ステップＡ
Ｓ２ 培養ステップ
Ｓ３ａ 液体除去ステップ
Ｓ３ｂ 洗浄ステップ
Ｓ４ａ 試料調製ステップＡ
Ｓ４ｂ 測定ステップＡ
Ｓ５ 第１評価ステップＡ
Ｓ６ａ 第２評価ステップＡ
Ｓ６ｂ 中間評価ステップＡ
Ｓ７ 第３評価ステップＡ
Ｓ８ 第４評価ステップＡ
Ｓ１０１ 試料供給ステップＢ
Ｓ１０４ａ 試料調製ステップＢ
Ｓ１０４ｂ 測定ステップＢ
Ｓ１０６ａ 第２評価ステップＢ
Ｓ１０６ｂ 中間評価ステップＢ
Ｓ１０７ 第３評価ステップＢ
Ｓ１０８ 第４評価ステップＢ
Ｓ２０４ｂ 測定ステップＣ
Ｓ２０５ 第１評価ステップＡ
Ｓ２０６ａ 第２評価ステップＣ
Ｓ２０８ 第４評価ステップＣ

Claims (21)

  1. 動物細胞（２３）に対する分析試料の細胞傷害性効果（４６）を測定するための方法であって、以下の各ステップ：
    動物細胞（２３）、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料（１１）が、質量分析試料支持台（６）の少なくとも１つの試料スポット（１６）に供給される試料供給ステップＡ（Ｓ１）と、
    前記質量分析試料（１１）が、培養装置（２４）の前記質量分析試料支持台（６）の前記試料スポット（１６）でインキュベートされる培養ステップ（Ｓ２）と、
    前記質量分析試料（１１）の残液が前記試料スポット（１６）から除去される液体除去ステップ（Ｓ３ａ）と、
    空間分解質量スペクトル（３８）が、空間分解能質量分析計（１）によって、前記試料スポット（１６）の少なくとも部分領域（３４）における複数の測定位置（３３）で記録される測定ステップＡ（Ｓ４ｂ）であって、マトリックスベースの空間分解能質量分析計（２１）を使用するとき、前記測定ステップＡ（Ｓ４ｂ）における空間分解質量スペクトル（２１）の記録の前に、先行する試料調製ステップＡ（Ｓ４ａ）において、前記試料スポット（１６）の調製が、前記試料スポット（１６）の少なくとも１つの前記部分領域（３４）へのマトリックス（２９）の正しい位置への適用によって実施される測定ステップＡ（Ｓ４ｂ）と、
    各空間分解質量スペクトル（３８）が、前記動物細胞（２３）の細胞特異的質量分析シグネチャー（４１）の存在について分析され、細胞存在値（４２）が各測定位置（３３）に割り当てられる第１評価ステップＡ（Ｓ５）と、
    動物細胞（２３）による被覆率（４５）が、前記測定位置（３３）の前記細胞存在値（４２）から、前記試料スポット（１６）の少なくとも前記部分領域（３４）について測定される第２評価ステップＡ（Ｓ６ａ）と、
    および／または、前記測定された被覆率（４５）から増殖能が導出される第３評価ステップＡ（Ｓ７）と、
    前記動物細胞（２３）に対する前記分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）が、前記第２評価ステップＡ（Ｓ６ａ）の前記測定された被覆率（４５）から間接的または直接的に導出される第４評価ステップＡ（Ｓ８）であって、この目的のために、前記動物細胞（２３）に対する前記分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）が、第２評価ステップＡ（Ｓ６ａ）、第３評価ステップＡ（Ｓ７）の前記２つのステップの少なくとも１つの前記結果から導出される第４評価ステップＡ（Ｓ８）と、
    を含む、方法。
  2. 動物細胞（２３）に対する分析試料の細胞傷害性効果（４６）を測定するための方法であって、以下の各ステップ：
    動物細胞（２３）、培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する分析試料を含む質量分析試料（１１）が、質量分析試料支持台（６）の少なくとも１つの試料スポット（１６）に供給される試料供給ステップＡ（Ｓ１）と、
    前記質量分析試料（１１）が、培養装置（２４）の前記質量分析試料支持台（６）の前記試料スポット（１６）でインキュベートされる培養ステップ（Ｓ２）と、
    前記質量分析試料（１１）の残液が前記試料スポット（１６）から除去される液体除去ステップ（Ｓ３ａ）と、
    質量スペクトル（２０）が、質量分析計によって、前記試料スポット（１６）の少なくとも部分領域（３４）に分布している複数の測定位置（３３）で記録される測定ステップＣ（Ｓ２０４ｂ）であって、マトリックスベースの空間分解能質量分析計（２１）を使用するとき、先行する試料調製ステップＡ（Ｓ４ａ）において、前記試料スポット（１６）が、前記試料スポット（１６）の少なくとも１つの前記部分領域（３４）へのマトリックス（２９）の正しい位置への適用によって調製される測定ステップＣ（Ｓ２０４ｂ）と、
    各質量スペクトル（２０）が、前記動物細胞（２３）の細胞特異的質量分析シグネチャー（４１）の存在について分析される第１評価ステップＣ（Ｓ２０５）と、
    動物細胞（２３）による被覆率（４５）が、前記第１評価ステップＣ（Ｓ２０５）の前記結果から前記試料スポット（１６）の少なくとも前記部分領域（３４）について測定される第２評価ステップＣ（Ｓ２０６ａ）と、
    前記動物細胞（２３）に対する前記分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）が、前記第２評価ステップＣ（Ｓ２０６ａ）の前記測定された被覆率（４５）から導出される第４評価ステップＣ（Ｓ２０８）と、
    を含む、方法。
  3. 動物細胞（２３）に対する分析試料の前記細胞傷害性効果（５６）を測定するための方法であって、以下の各ステップ：
    動物細胞（２３）、栄養培地、および潜在的に細胞傷害性因子を有する前記分析試料を含む質量分析試料（１１）が、質量分析試料支持台（６）の少なくとも１つの試料スポット（１６）に供給される試料供給ステップＢ（Ｓ１０１）であって、前記試料スポット（１６）が第１および第２部分領域（４７、４８）を有し、前記動物細胞（２３）が前記試料スポット（１６）の前記第１部分領域（４７）に供給され、動物細胞（２３）が前記試料スポット（１６）の前記第２部分領域（４８）に供給されず、残りの質量分析試料（１１）が両方の部分領域（４７、４８）に供給される試料供給ステップＢ（Ｓ１０１）と、
    前記質量分析試料（１１）が、培養装置（２４）の前記質量分析試料支持台（６）の前記試料スポット（１６）でインキュベートされる培養ステップ（Ｓ２）と、
    前記試料スポット（１６）の前記質量分析試料（１１）の残液が除去される液体除去ステップ（Ｓ３ａ）と、
    空間分解質量スペクトル（３８）が、空間分解能質量分析計（１）によって、前記試料スポット（１６）の少なくとも２つの測定位置（５６、５７）で記録される測定ステップＢ（Ｓ１０４ｂ）であって、前記第１測定位置（３３、５６）がなお動物細胞（２３）を有し、前記第２測定位置（３３、５７）が動物細胞（２３）を有さず、両測定位置（５６、５７）が基準点（５１）を起点とした伸長の一方向（５０）に位置し、マトリックスベースの空間分解能質量分析計（１）を使用するとき、前記測定ステップＢ（Ｓ１０４ｂ）における前記空間分解質量スペクトル（３８）の記録の前に、先行する試料調製ステップＢ（Ｓ１０４ａ）において、前記試料スポット（１６）の調製が、前記試料スポット（４８）の少なくとも両方の部分領域（４７、４８）の一部へのマトリックス（２９）の正しい位置への適用によって実施される測定ステップＢ（Ｓ１０４ｂ）と、
    各空間分解質量スペクトル（３８）が、前記動物細胞（２３）の細胞特異的質量分析シグネチャー（４１）の存在について分析され、細胞存在値（４２）が各測定位置（３３）に割り当てられる第１評価ステップＡ（Ｓ５）と、
    細胞拡大距離（５３）が、基準点（５１）から遷移点（５２）までの少なくとも１つの距離から測定される第２評価ステップＢ（Ｓ１０６ａ）であって、各遷移点（５２）が、少なくとも前記第１および第２測定位置（５６、５７）から計算される第２評価ステップＢ（Ｓ１０６ａ）と、
    前記分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）が、前記先行する評価ステップの前記結果から導出される第４評価ステップＢ（Ｓ１０８）と、
    を含む、方法。
  4. 前記動物細胞（２３）が、付着増殖している動物細胞であることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記試料スポット（１６）の少なくとも１つの前記部分領域（３４）における前記複数の測定位置（３３）が、前記測定された被覆率（４５）が前記部分領域（３４）および／または前記試料スポット（１６）を代表するように空間的に分布することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
  6. 前記試料供給ステップＡ、Ｂ（Ｓ１、Ｓ１０１）における前記質量分析試料（１１）が、潜在的細胞傷害性因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記分析試料を含む前記質量分析試料（１１）に加えて、少なくとも１つの対照試料が本方法によって処理されることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記対照試料が、前記潜在的細胞傷害性因子および／または前記潜在的細胞傷害性因子‐中和因子を含まず、かつ、前記第２評価ステップＡ、Ｃ（Ｓ６ａ、Ｓ２０６ａ）における前記被覆率（４５）の前記測定後に、中間評価ステップＡ（Ｓ６ｂ）において、前記対照試料の前記被覆率（４５）と、前記分析試料を含む前記質量分析試料（１１）の前記被覆率（４５）との比較が実施され、前記比較が、前記第３評価ステップＡ（Ｓ７）における前記増殖能の前記導出および／または前記第４評価ステップＡ、Ｃ（Ｓ８、Ｓ１０８）における前記細胞傷害性効果（４６）の前記導出に含まれることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 前記試料供給ステップＡ、Ｂ（Ｓ１、Ｓ１０１）において、前記培地および前記分析試料の適用前に予め前記動物細胞（２３）が前記試料スポット（１６）に存在しているか、または前記動物細胞（２３）が前記試料スポット（１６）に懸濁形態で適用されることによって前記質量分析試料（１１）が供給されることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記試料供給ステップＡ、Ｂ（Ｓ１、Ｓ１０１）において、前記試料スポット（１６）に懸濁形態で前記動物細胞（２３）を適用することによって前記動物細胞（２３）が供給され、洗浄ステップ（Ｓ３Ｂ）において、前記動物細胞（２３）が前記試料支持台（１６）で洗浄され、かつ残留洗浄液が除去され、ここ前記で洗浄ステップ（Ｓ３Ｂ）が前記液体除去ステップ（Ｓ３ａ）に続くか、または前記液体除去ステップ（Ｓ３ａ）に代わることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記分析試料が、源試料、源試料の成分、または単離された細胞傷害性因子を供給することによって供給されることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記源試料が、以下の群：
    ヒト試料、
    動物試料、または
    環境試料
    から選択されることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記動物細胞（２３）が、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、および／またはヒト細胞であることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記動物細胞（２３）が、継代細胞株であるか、またはヒトもしくは動物から採取された組織試料もしくは腫瘍試料に由来することを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの細胞傷害性因子が、以下の群：
    化学元素、
    低分子化学化合物、
    高分子化学化合物、
    医薬品、
    毒素、
    古細菌、
    細菌、
    ウイルス、
    真菌、
    原生動物、
    藻類、
    寄生虫、
    微生物成分、
    微生物分泌物質、
    生物起源の細胞傷害性物質、
    ヒト試料からの微生物起源の細胞傷害性物質、
    化学療法薬、
    抗菌物質、
    抗ウイルス薬、
    抗真菌薬、
    抗菌薬、
    抗寄生虫薬、
    タンパク質、
    ペプチド、
    抗体、
    抗腫瘍薬、または
    殺生物剤
    からのものであることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記分析試料が、細胞傷害性因子として細菌細胞またはその成分を含み、かつ前記細胞傷害性因子‐中和因子が、前記細菌細胞またはその成分に対する抗菌薬であること、または
    前記分析試料が、細胞傷害性因子としてウイルス粒子またはその成分を含み、かつ前記細胞傷害性因子‐中和因子が、前記ウイルス粒子またはその成分に対する抗ウイルス薬であること、または
    前記分析試料が、前記細胞傷害性因子として真菌細胞またはその成分を含み、かつ前記細胞傷害性因子‐中和因子が前記真菌細胞またはその成分に対する抗真菌薬であること、または
    前記分析試料が、前記細胞傷害性因子として寄生虫を含み、前記細胞傷害性因子‐中和因子が、前記寄生虫に対する抗寄生虫薬であること、
    を特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記分析試料の濃度依存的細胞傷害性効果（４６）が、異なる濃度の前記分析試料をそれぞれ異なる試料スポット（１６）に供給することによって測定され、かつ前記濃度依存的細胞傷害性効果（４６）が、前記異なる試料スポット（１６）の前記測定された被覆率（４５）または前記測定された細胞拡大距離（５３）と、前記それぞれの異なる濃度の分析試料との関数であることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記空間分解能質量分析計（１）が、以下の群：
    ＬＤＩ質量分析計、
    ＭＡＬＤＩ質量分析計、
    ＤＥＳＩ質量分析計、
    ＭＡＬＤＥＳＩ質量分析計、
    ＳＩＭＳ、
    ＳＩＭＳイメージング質量分析計、
    ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ質量分析計（２）、
    ＭＡＬＤＩ‐ＴｏＦ‐ＴｏＦ質量分析計、
    ＭＡＬＤＩ‐ＭＳＩ質量分析計、または
    マイクロ流体試料イオン化装置を有する空間分解能質量分析計（１）
    から選択されることを特徴とする、請求項１または請求項３に記載の方法。
  19. 前記マトリックス（２９）の前記正しい位置への適用が、前記試料スポット（１６）へのスプレープロセス、昇華プロセスまたは複数のマトリックスマイクロ液滴（３０）もしくはマトリックスナノ液滴の連続方向位置決めによって行われることを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  20. 第３評価ステップＢ（Ｓ１０７）および／または中間評価ステップＢを含み、前記第３評価ステップＢ（Ｓ１０７）において、前記動物細胞（２３）の増殖能および／または遊走能が、前記第２評価ステップＢ（Ｓ１０６ａ）の前記測定された細胞拡大距離（５３）から導出され、前記第４評価ステップＢ（Ｓ１０８）において、前記分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）が、前記動物細胞（２３）の前記測定された増殖能および／もしくは前記遊走能ならびに／または前記細胞拡大距離（５３）から導出され、ならびに／または、前記中間評価ステップＢ（Ｓ１０６ｂ）において、少なくとも１つの対照試料の前記細胞拡大距離（５３）と、前記分析試料を含む前記質量分析試料（１１）の前記細胞拡大距離（５３）との比較が実施され、前記比較が、前記第３評価ステップＢ（Ｓ１０７）における前記増殖能および／もしくは前記遊走能の前記導出ならびに／または前記第４評価ステップＢ（Ｓ１０８）における前記細胞傷害性効果（４６）の前記導出に含まれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  21. 空間分解質量スペクトル（３８）を生成するための少なくとも１つの空間分解能質量分析計（１）、試料スポット（１６）を有する質量分析試料支持台（６）、および空間分解能質量分析計（１）を制御し、生成される前記空間分解質量スペクトル（３８）を評価するためのデータ処理ユニット（３７）を含む空間分解能質量分析計（１）によって、動物細胞（２３）に対する分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）を測定するためのシステムであって、前記データ処理ユニット（３７）が、前記動物細胞（２３）の少なくとも１つの細胞特異的質量分析シグネチャー（４１）の存在について各空間分解質量スペクトル（３８）を分析し、前記試料スポット（１６）の少なくとも部分領域（３４）における前記動物細胞（２３）による被覆率（４５）および／または前記試料スポット（１６）の少なくとも１つの伸長方向（５０）における前記動物細胞（２３）の細胞拡大距離（５３）を測定し、前記被覆率（４５）および／または前記細胞拡大距離（５３）から前記分析試料の前記細胞傷害性効果（４６）を導出するように構成されていることを特徴とする、システム。
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