JP2023554180A - ジストロフィー性表皮水疱症を治療するための物質および方法。 - Google Patents

ジストロフィー性表皮水疱症を治療するための物質および方法。 Download PDF

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Abstract

表皮水疱症（ＥＢ）は、ＶＩＩ型コラーゲンをコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子の変異によって引き起こされる。ＥＢは、表現型的に多様な遺伝性水疱症であり、皮膚、場合によっては粘膜や他の臓器にも影響を及ぼす。ＥＢの治療には、（ｉ）手術、（ｉｉ）化学療法、（ｉｉｉ）コラゲナーゼ活性阻害剤の使用、（ｉｖ）抗生物質の使用、（ｖ）抗炎症剤の使用、（ｖｉ）細胞療法、（ｖｉｉｉ）タンパク質療法、（ｉｘ）遺伝子療法など、多くの治療戦略が検討されてきた。ＥＢの遺伝子治療は、ＤＮＡやＲＮＡを操作することで治療効果を得ることを目的としている。特定のエクソンを標的とするアンチセンス療法が、エクソン７３と８０を標的とするなどのように報告されている。しかしながら、この種の治療戦略は、その薬学的コンプライアンスに関して改善されなければならなかった。本開示は、ＣＯＬ７Ａ１のエクソン７３を標的とする改良されたアンチセンス治療戦略を提供するものであり、これには、新規なトリシクロＤＮＡアンチセンス核酸の構想が含まれ、この核酸は、いくつかの実施形態では、脂質部分にコンジュゲートされていてもよい。

Description

本開示は、ジストロフィー性表皮水疱症の治療に関する医療分野に関する。
表皮水疱症（ＥＢ）は、表現型的に多様な遺伝性水疱症であり、皮膚および一部の亜型では粘膜や他の臓器に影響を及ぼす。臨床的には、ＥＢ患者は脆弱な皮膚を有し、最小限の外傷で水疱が生じやすい。ＥＢの亜分類は３０以上の臨床的亜型に及び、少なくとも２１の異なる遺伝子に病因となる変異が存在する。
ＤＥＢは、真皮と表皮の接着に不可欠な構造を形成するアンカー線維の構成要素であるＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子の変異によって引き起こされる。ＤＥＢは常染色体優性遺伝または常染色体劣性遺伝のいずれかのパターンで遺伝し、臨床的表現型には大きなばらつきがある。ＤＥＢは常染色体優性遺伝と常染色体劣性遺伝があり、臨床的表現型は多様である。皮膚剥離や水疱は、自然発症または軽微な外傷に続発し、特に全身性の劣性型では全身合併症を伴う慢性で広範な創傷に発展する。すべての粘膜（口腔、食道、眼、性器、肛門）が侵されることもある。
ＤＤＥＢとＲＤＥＢの両者の治療を管理するために、多くの治療戦略が検討されてきた。これらには、（ｉ）手術、（ｉｉ）扁平上皮癌が発生した場合の化学療法、（ｉｉｉ）コラゲナーゼ活性阻害剤（フェニトインなど）による全身治療、（ｉｖ）抗生物質（ミノサイクリン、トリメトプリムなど）、（ｖｉ）抗炎症剤（シクロスポリンなど）、（ｖｉ）同種線維芽細胞を用いた細胞治療などが含まれる。ミノサイクリン、トリメトプリム）、（ｖ）抗炎症化合物（シクロスポリンなど）、（ｖｉ）同種線維芽細胞、間葉系間質細胞、骨髄移植、復帰型モザイク皮膚／ケラチノサイトの移植などの細胞療法、（ｖｉｉｉ）組換えＣ７の皮内注射に基づくタンパク質療法、（ｉｘ）遺伝子療法を含む。
ＲＤＥＢにおける遺伝子治療戦略は、ＤＮＡやＲＮＡの操作によって治療効果をもたらすことを目的としている。典型的には、ウイルスを介した生体外遺伝子導入法が用いられ、患者の皮膚細胞を培養し、野生型タンパク質を発現する導入遺伝子をコードするウイルスベクターで形質転換した後、これらの遺伝子改変細胞を、上皮シートまたは同等の皮膚（表皮／真皮）を移植するか、あるいは（遺伝子を補充した線維芽細胞などの）皮内注射によって再移植する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のような遺伝子サイレンシング技術は、野生型対立遺伝子をサイレンシングすることなく変異型対立遺伝子をノックダウンするように設計されていれば、顕性型ＤＥＢに有用であり、このようなアプローチの治療的使用を支持する前臨床データがある（Ｐｅｎｄａｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ， Ｖｏｌ． １３２ ： １７４１－１７４３； Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｖｏｌ． １３３ ： ２７９３－２７９６）。ＲＤＥＢとＤＤＥＢの両方に関連するもう一つの方法は、プレメッセンジャーＲＮＡのスプライシングを調節して、変異エクソンのスキップを誘導することである。例えば、エクソン７０－１０４を欠損したＣＯＬ７Ａ１ミニ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで三量体化できる脱タンパク質をコードしている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， Ｖｏｌ． ２７５ ： ２４４２９－２４４３５）。このミニ遺伝子をＲＤＥＢ細胞に導入すると、細胞遊走アッセイにおいて野生型の表現型が回復した。
エクソン７３とエクソン８０は、多くの再発性の潜性および顕性変異を持つことから、当技術分野で特に注目されるものとして同定された。エクソン７３は最も多くの変異を有しており、ＲＤＥＢ患者の約７．５％がエクソン７３に少なくとも１つの変異を有している（Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ， Ｖｏｌ． ３２ ： １１００－１１０７）。エクソン８０の変異は少ないが、スペインではＲＤＥＢ対立遺伝子の４６％（Ｅｓｃａｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ， Ｖｏｌ． １６３ ： １５５－１６１）、チリでは４２％（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ， Ｖｏｌ． ６５ ： １４９－１５２）を占める創始者効果のある再発変異（ｃ．６５２７ｉｎｓＣ）がある。ＲＤＥＢ皮膚等価異種移植モデルで２’－Ｏ－メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）を用い、４００μｇから１ｍｇまでの用量でＡＯＮを１回または２回皮下注射すると、エクソン７３と８０の機能喪失変異を含むエクソンのスキップを誘導し、それによってＣ７の発現とアンカリング線維形成を回復させることができた（Ｔｕｒｃｚｙｎｓｋｉら、２０１６年、Ｖｏｌ．１３６ ： ２３８７－２３９５）。
ジストロフィー性表皮水疱症を治療するために、既知の治療戦略に関して代替または改良された治療手段を提供する必要性が、当技術分野において残っている。
発明の概要。
本開示は、以下：
５’－ＧＣＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧ－３’（配列番号１），
の配列番号１の核酸配列のＮ個の連続するヌクレオチドからなる核酸に関し、
ここで
－Ｎは、１３から１５の範囲の整数であり
－Ｎ－ｘヌクレオチドは、トリシクロヌクレオチドからなり、ｘは、１または２に等しい整数であり、
－ｘ個のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなり、そして
－各ヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して隣接するヌクレオチドに連結されている。
前記核酸のいくつかの実施形態において、トリシクロヌクレオチドは、本開示に記載の式（Ｉ）の化合物からなる。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、１つの２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなる。
前記核酸のいくつかの実施形態において、（ｉ）Ｎは１５であり、（ｉｉ）ｘは１を意味し、（ｉｉｉ）すべてのヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合からなり、そして（ｉｖ）前記核酸は、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなる１つのヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、本開示に記載の配列番号１のオリゴヌクレオチドからなり、ここで：（ｉ）すべてのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合からなり、そして（ｉｉ）すべてのヌクレオチドがトリシクロヌクレオチドからなり、ただし、５’末端から３’末端までの意味において、４位に位置するシトシルヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドからなる。
いくつかの実施形態において、前記核酸は、飽和脂肪酸部分および不飽和脂肪酸部分からなる群から選択される脂質部分のような、それに共有結合した１つ以上の脂質部分を含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸の５’末端ヌクレオチドは、パルミトイル基に共有結合している。
本開示はまた、本開示に記載の核酸を含むベクターにも関する。
本開示はまた、本明細書に記載の核酸、または本明細書に記載のベクター、および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物にも関する。
図１は、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３をスキップさせることを目的とした様々なアンチセンス核酸のスキップ効率を示す。縦軸：エクソンスキッピング効率の値。横軸：試験したアンチセンス核酸の名称。
詳細な説明。
本明細書では、エクソンスキッピング技術を用いて変異ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の機能を回復させる方法を開示する。この方法は、ＶＩＩ型コラーゲン機能不全の原因となる優性または劣性変異を有するＣＯＬ７Ａ１の変異エクソン７３の成熟ｍＲＮＡへの取り込みをブロックまたは阻止することを含む。これは、タンパク質をコードするエクソンを含むプレｍＲＮＡを、ＣＯＬ７Ａ１プレｍＲＮＡ中の標的エクソン７３の正しいスプライシングに必要な配列モチーフに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）にさらすことによって達成される。ＡＯＮはプレｍＲＮＡ中の相補的な必要配列に結合し、正常なスプライシングを妨げる。その代わり、標的エクソンは切り取られ、タンパク質に翻訳される成熟ｍＲＮＡには含まれず、標的エクソンによってコードされるアミノ酸配列は翻訳されたタンパク質から欠落する
定義
本明細書で使用される用語は、一般に当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、本開示の主題の製品および方法を説明する際の追加的な指針を提供するために、後述または本開示の他の箇所で説明される。
以下の定義は、本開示の文脈において適用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の参照語を含む。
本明細書に記載される本開示の態様および実施形態は、「有する（having）」、「含む（comprising）」、「からなる（consisting of）」、および「本質的にからなる（consisting essentially of）」態様および実施形態を含むことが理解される。「有する」、「からなる」、または「有する」、「含む」、「からなる」などの変形語は、記載された要素（物質組成物または方法ステップなど）の包含を意味するが、他の要素の排除を意味しないと理解される。用語「からなる（consisting of）」は、記載された要素（単数または複数）を含むことを意味し、追加的な要素を除外することを意味しない。から本質的になる」という用語は、記載された要素を含むことを意味し、他の要素が本発明の基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えない場合には、他の要素も含まれる可能性がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、選択された核酸配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖を指す。
「エクソンスキッピング」とは、一般に、選択された前処理ＲＮＡからエクソン全体またはその一部を除去することを指し、その結果、成熟ＲＮＡ（タンパク質成熟ｍＲＮＡへの翻訳など）から除外される。したがって、発現されたタンパク質形態には、スキップされたエクソンによって付加的にコードされるタンパク質部分は存在せず、通常は修飾された、しかし依然として機能的なタンパク質形態を形成する。
「ＣＯＬ７Ａ１」はヒトＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子を示す。ＣＯＬ７Ａ１の核酸配列については、ウェブサイトアドレスwww.omim.orgのＯＭＩＭ ＊１２０１２０を参照されたい。
「核酸塩基」とは、ワトソン-クリック型水素結合およびスタッキング相互作用を形成することができる窒素含有複素環部分を意味する。
用語「インターヌクレオシド連結」、「インターヌクレオシド連結基」、「インターヌクレオチド連結」、または「インターヌクレオチド連結基」は、本明細書において互換的に使用され、当該分野で知られているように、２つのヌクレオシド（すなわち、複素環式塩基部分および糖部分）単位間の任意のリンカーまたは連結を指す。ヌクレオシド間連結基」は、２つのヌクレオシド間、２つのヌクレオシドアナログ間、またはヌクレオシドとヌクレオシドアナログ間の連結に関与し得る。ヌクレオシド間連結基は核酸分子の骨格を構成する。インターヌクレオシド連結基は、核酸分子中に構成される２つの隣接するヌクレオシド残基を連結する化学基を指し、これは、（ｉ）２つの隣接するヌクレオシド残基を連結する化学基、（ｉｉ）ヌクレオシド残基と隣接するヌクレオシドアナログ残基とを連結する化学基、および（ｉｉｉ）第１のヌクレオシドアナログ残基と第２のヌクレオシドアナログ残基とを連結する化学基を包含し、これらのヌクレオシドアナログ残基は同一であってもよく、または別個であってもよい。本明細書中で使用される３′－５′ヌクレオシド間連結は、２つの隣接するヌクレオシド単位を連結するヌクレオシド間連結を指し、ここでその連結は、第１のヌクレオシドの糖部分の３’－炭素と第２のヌクレオシドの糖部分の５’－炭素との間である。
ホスホジエステルインターヌクレオシド結合は、ＤＮＡと同様にＲＮＡにも天然に存在するインターヌクレオシド結合であり、そのペントース（ＰＯ）糖部分のリン酸基と３’－および５’－ヒドロキシル基が関与している。
ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）をヌクレアーゼ活性から保護し、標的ＲＮＡに対する安定性を向上させるために、最も多く使用されている化学修飾である（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ２０１４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． ２４ （６） ： ３７４－３８７）。典型的なＰＳ結合はホスホジエステル（ＰＯ）結合と異なり、非架橋リン酸Ｏ原子がＳ原子で置換されているため、より高い安定性と細胞への取り込みが増加する（Ｂｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２３ ： ４２３９－４２４５）。ＰＳ修飾体は、ＰＯ修飾体と比較して生物学的利用能が向上するため、高い有効性が実証されており（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８４巻：７７０６－７７１０）、現在臨床プログラム中の薬剤のほとんどにＰＳ結合が含まれている（Ｃｒｏｏｋｅら、２０２０、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、第１４２巻（３５）：１４７５４－１４７７１）。
本明細書で使用される用語「脂質部分」は、典型的には、そして好ましくは、炭化水素、油、脂肪（脂肪酸、グリセリドなど）、ステロール、ステロイド、およびこれらの化合物の誘導体形態から誘導される部分を指す。適切な脂質部分には、脂肪酸およびその誘導体、炭化水素およびその誘導体、ならびにコレステロールなどのステロールから誘導される部分が含まれる。本明細書で使用する場合、脂質部分という用語には、脂質部分と親水性部分の両方を含む両親媒性化合物部分も含まれる。
用語「脂肪酸」は、本明細書で使用される場合、カルボン酸基で終端する炭化水素鎖を指し、前記炭化水素鎖は、典型的には、好ましくは、炭素長６～３２のアルキルまたはアルケニルであり、したがって、飽和または不飽和である。
「脂肪酸部分」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で定義されるような脂肪酸から誘導される部分を指し、ここで、前記脂肪酸の１つのカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）は、前記脂肪酸部分の－Ｃ（Ｏ）－基となり、この－Ｃ（Ｏ）－基は、直接的または間接的に前記オリゴヌクレオチドに連結される。
用語「アルキル」は、本明細書で使用される場合、炭素原子および水素原子のみからなり、不飽和を含まず、特定の数の炭素原子（例えば、（Ｃ６－３２）アルキルまたはＣ６－３２アルキル）を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合していてもよく、または典型的には結合している、直鎖または分岐炭化水素鎖ラジカルを指す。
その最も広い意味において、「治療する（treating）」または「治療（treatment）」という用語は、そのような用語が適用される障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状を逆転させること、緩和すること、進行を抑制すること、または予防することを指す。本開示の文脈において、「治療する」、「治療」などの用語は、特に、ジストロフィー性表皮水疱症を指す。
本明細書において、「治療上有効な量」および「予防上有効な量」という用語は、変異遺伝子の発現、特にエクソン７３において変異したＣＯＬ７Ａ１の発現によって媒介される病的過程の治療、予防、または管理において治療上の利益をもたらす量を指す。治療上有効な具体的な量は、通常の医師によって容易に決定することができ、標的遺伝子の発現によって媒介される病理学的プロセスの種類および段階、患者の病歴および年齢、ならびに変異遺伝子によって媒介される生物学的プロセスを阻害する他の治療剤の投与などの因子によって変化し得る。
本明細書で使用される場合、用語「個体」または「対象」は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。 哺乳動物としては、家畜化された動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。 最も好ましくは、個体または対象はヒトである。
詳細な開示
本発明者らは、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３を標的とする、エクソン７３のスキップを効率的に誘導する短い長さの核酸のファミリーを考えた。この核酸は、エクソン７３に変異を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有するヒト被験体の治療に有用であり、前記エクソンにおける１つ以上の変異の存在が疾患を引き起こし、特に、ジストロフィー性表皮水疱症を引き起こす。
本開示による核酸は、本明細書では「アンチセンス核酸」とも呼ばれ得る。
本開示を通して説明されるように、本明細書に記載される核酸は、当該技術分野で以前に記載されたヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３も標的とするアンチセンスポリヌクレオチドと比較して、著しく改善された特性を有する。
本発明者らは、鋭意研究の結果、エクソン７３のスキッピングを効率的に誘導し、かつヌクレオチド長が短いヒトＣＯＬ７Ａ１エクソン７３標的核酸を創製することに成功した。
本発明者らの知見によれば、ＣＯＬ７Ａ１エクソン７３を標的とする従来公知のアンチセンス核酸の長さは約２５から３０ヌクレオチドであった、
対照的に、本開示は、ＣＯＬ７Ａ１エクソン７３を標的とするアンチセンス核酸に関し、その長さは最大でも１５ヌクレオチドである。
従って、本発明者らは、標的ｍＲＮＡ配列に対する高い特異性を有し、また前記標的配列とのハイブリダイゼーションの高い安定性を有しながら、非常に短いヌクレオチド長の核酸を考案することに成功した。このことは、予想外にも、このような短いヌクレオチド長の核酸が、本明細書の実施例に示すように、ヒトＣＯＬ７Ａ１エクソン７３の効率的なスキップを引き起こす理由を説明する。
本開示は、以下：
５’－ＧＣＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧ－３’（配列番号１）、
の配列番号１の核酸配列のＮ個の連続するヌクレオチドからなる核酸に関し、
ここで
－Ｎは、１３から１５の範囲の整数であり
－Ｎ－ｘヌクレオチドはトリシクロヌクレオチドからなり、ｘは１または２に等しい整数であり
－ｘのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドからなり、そして
－各ヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して隣接するヌクレオチドに連結されている。
本明細書に記載される核酸が短いヌクレオチド長を有するという事実は、より長い核酸と比較して、それを必要とする被験体への投与時に組織におけるそれらの良好な分布を可能にする。本明細書に記載の核酸の良好な分布特性は、より長い核酸と比較して、その高い治療効率に実際に大きく寄与するであろう。
さらに、定義上、短い核酸は、長い核酸よりも有意に低い毒性を示す。その結果、本開示による核酸は、それを必要とする被験体に投与される場合、ＣＯＬ７Ａ１エクソン７３のスキップを誘導することを目的とした長いアンチセンス核酸よりも毒性が低い。
ちなみに、治療活性のある短い核酸を製造することは、長い核酸を合成するよりも低コストである。
予想外なことに、本明細書に記載された核酸は、そこに含まれるヌクレオチドがすべてホスホジエステル結合で構成されているにもかかわらず、酵素的切断を受けにくい。
本明細書に記載される核酸のヌクレオチドの大部分はトリシクロヌクレオチドからなり、この特徴は標的ｍＲＮＡ配列に対する高いハイブリダイゼーション特性に寄与し、高い親和性での結合と相補的ＲＮＡに対する高い選択性での結合の両方を包含する。さらに、トリシクロヌクレオチドはＲＮａｓｅＨ活性を惹起せず、血清中で顕著な安定性を示す。
さらに、上記のように、本明細書に開示される核酸は、１つまたは２つの２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドを含む。つまたは２つの２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドの存在は、核酸がホモダイマーを形成する傾向を減少させることを可能にし、従って、そのエクソンスキッピング効力にも寄与する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、１つまたは２つの２’－Ｏ－メチル－デオキシリボヌクレオチドの存在はまた、（ｉ）インビボでの核酸の生体内分布を改善し、（ｉｉｉ）望ましくない免疫刺激および他の非特異的効果を減少させると考える。
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結基は、核酸の生体内分布を促進するという有利な特性について当技術分野で知られているが、本発明者らは、本明細書に記載されるような核酸におけるその存在を除外した。
注目すべきことに、本明細書に記載の核酸は、標的ＲＮＡに安定に結合し、ヌクレアーゼ活性から保護されているが、これらの核酸はホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含んでいない。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結がないことが、本明細書に記載の核酸の毒性の低減に寄与していると考えている。
実際、トリシロンヌクレオチドは当該技術分野において周知であり、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む多くの遺伝性疾患における治療的スプライススイッチング補正のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造に既に使用されている（例示としてGoyenvalle et al. 2016 May 27;3(2):157-167を参照）。トリシクロヌクレオチドおよびトリシクロヌクレオチドの製造方法は、Steffens and Leumann, Journal of the American Chemical Society 1999 121 (14), 3249-3255により具体的に記載されている。
本開示の好ましい実施形態によれば、トリシクロヌクレオチドは、下記式（Ｉ）
Figure 2023554180000001
ここで、
－Ｒ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲを意味し、ここでＲは水素または（Ｃ１－Ｃ３）非置換アルキルであり、
－Ｒ２およびＲ３の各々は、一方が他方から独立して、ヌクレオシド間連結を意味し、そして
－「Ｂａｓｅ」は、核酸塩基を意味する
の化合物からなる。
式（Ｉ）のトリシクロヌクレオチドの最も好ましい実施形態において、Ｒ１はＯを意味し、これらの最も好ましい実施形態によれば、Ｒ２およびＲ３は、一方が他方から独立して、ヌクレオシド間連結を意味する。
本開示による式（Ｉ）のトリシクロヌクレオチドにおいて、核酸塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシンからなる群、すなわち、配列番号１の核酸において構成されるヌクレオチドにおいて表される核酸塩基において選択される。
本開示による核酸のさらに好ましい特徴は、その中に１つまたは２つの２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドが存在することである。予期せぬことに、本明細書に記載の核酸中の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドの存在は、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのエクソン７３中の標的配列にハイブリダイズするその能力を有意に変化させず、その生体内分布および安全性プロフィールを改善する。
最も好ましい実施形態において、本開示による核酸は、１つの２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドのみを含む。
本明細書の実施例に示されるように、本開示による核酸であって、単一の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドからなる核酸はすべて、５０％以上の有効性でエクソンスキッピングを誘導するので、求められるＣＯＬ７Ａ１エクソン７３スキッピングを効率的に誘導する。
実施例にも示されているように、前記単一の２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドの位置は、（ｉ）エクソンスキッピングの有効性のレベル、および（ｉｉ）核酸がホモ二量体を形成する能力の両方に寄与する可能性がある。
本開示による好ましい核酸は、（ｉ）整数Ｎが１５であり、（ｉｉ）整数ｘが１を意味し、（ｉｉｉ）すべてのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合からなり、そして（ｉｖ）前記核酸が、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなる１つのヌクレオチド（すなわち、トリシクロヌクレオチドからならない唯一のヌクレオチド）を含むものである。
本明細書に例示されるように、本開示による最適核酸は、単一の２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドが、５’－末端から３’－末端へのヌクレオチド番号付けセンスに従って、配列番号１のヌクレオチド位置４（Ｃ）、６（Ｃ）および７（Ｇ）からなる群から選択されるヌクレオチド位置に位置する。
４位（Ｃ）に単一の２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドを含む配列番号１の核酸は、本明細書では配列番号２の核酸としても参照される。
６位（Ｃ）に単一の２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドを含む配列番号１の核酸は、本明細書では配列番号４の核酸としても参照される。
７位（Ｇ）に単一の２’－Ｏ－メチルデオキシリボヌクレオチドを含む配列番号１の核酸は、本明細書では配列番号５の核酸としても参照される。
本開示による最も好ましい核酸は、配列番号１のオリゴヌクレオチドからなり、ここで、
－全てのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合からなり
－すべてのヌクレオチドは、５’－末端から３’－末端までの意味において、（ｉ）４位のシトシルヌクレオチド、（ｉｉ）６位のシトシルヌクレオチドおよび（ｉｉｉ）７位のグアニルヌクレオチドからなる群から選択される２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなる１つのヌクレオチドを除いて、トリシクロヌクレオチドからなる。
本開示による最も好ましい核酸は、配列番号１のオリゴヌクレオチドからなり、ここで、
－すべてのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合からなり
－すべてのヌクレオチドがトリシクロヌクレオチドからなり、ただし、４位に位置するシトシルヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの意味において、２’－Ｏ－メチルデオキシリボシトシルからなる。
本明細書ですでに述べたように、最も好ましいトリシクロヌクレオチドは、式（Ｉ）のものであり、式中、Ｒ１はＯを意味し、Ｒ１、Ｒ２および「塩基」は式（Ｉ）について定義したとおりである。
従って、少なくとも単一の２’－Ｏ－メチルヌクレオチドの位置が規定される上記の核酸において、そこに構成されるトリシクロヌクレオチドは、式（Ｉ）のトリシクロヌクレオチドであり、ここで（ｉ）Ｒ１はＯであり、そして（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３の各々はホスホジエステル結合を意味し、そして（ｉｉｉ）「塩基」は核酸塩基を意味する。
核酸合成
核酸を合成するための数多くの方法は、数十年前から当技術分野でよく知られており、当業者は容易に参照することができる。
本開示に従って使用するために、本明細書に記載の核酸は、当該分野で周知の多数の手順のいずれかを使用して、ｄｅ ｎｏｖｏ合成され得る。例えば、ｂ－シアノエチルホスホルアミダイト法；ヌクレオシドＨ－ホスホネート法。これらの化学的処理は、市場で入手可能な様々な自動核酸合成機によって行うことができる。これらの核酸は合成アナログ核酸と呼ばれることがある。
コンジュゲートされた核酸
本開示による核酸の好ましい実施形態では、前記核酸は、１つ以上の脂質部分にコンジュゲートされる、すなわち共有結合される。脂質部分への核酸のコンジュゲーションは、公知の様々な方法を用いて実施され得る（Benizriら、2019、Bioconjugate Chemistry、American Chemical Society、Vol.30 : 366-383 - （https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-02490446））。
当該技術分野において知られているように、アンチセンス核酸を脂質部分にコンジュゲートすることにより、当該アンチセンス核酸の組織ターゲティングが増大し、その有効性が増大する。本明細書において、本明細書に記載のアンチセンス核酸を１つ以上の脂質部分に結合させることは、その組織標的化能力を増加させ、したがってＣＯＬ７Ａ１エクソン７３スキッピングにおけるその効率を高める。
パルミチン酸はアルブミンに結合することが知られており、ＰＳ ＡＳＯへのパルミチン酸の結合はアルブミン結合を改善し、したがってパルミチン酸結合ＡＳＯのバイオアベイラビリティを高めることが期待される（Prakash et al, 2019, Nucleic Acids Research, Vol.47 (12) : 6029-6044）。
いくつかの好ましい実施形態では、単一の脂質部分が、直接またはリンカー基を介して、本明細書に記載の核酸に共有結合している。
最も好ましくは、１つ以上の脂質部分は、ホスホルアミダイト結合によって５’末端ヌクレオチドおよび／または３’末端ヌクレオチドに共有結合している。
いくつかの実施形態において、本開示による核酸であって、脂質部分にコンジュゲートされた核酸は、下記式（I）：
Lipid-[Linker]z-NuclAc (I)
の構造を有する（５’末端ヌクレオシドに連結された脂質部分で図示）
ここで
－Lipidとは、脂質部分を意味する、
－Linkerは、存在する場合、本開示による核酸に脂質部分を共有結合で連結することを可能にする化学リンカーを意味する、
－ｚは、０または１を意味する整数であり
－ＮｕｃｌＡｃは、本開示による核酸を意味する。
好ましい実施形態において、前記１つ以上の脂質部分は、１つ以上の脂肪酸からなる。
は、「Ｃ：Ｄ」の値によって指定される、
ここで、「Ｃ」はそこに含まれる炭素の総数、「Ｄ」はそこに含まれる不飽和結合の数である。
本開示によれば、脂肪酸は、カプロン酸（Ｃ６：０）、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）およびラウリン酸（Ｃ１２：Ｏ）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、リグノセリン酸およびセロチン酸（Ｃ２６：０）からなる飽和脂肪酸群において選択され得る。
いくつかの実施形態において、脂肪酸は、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）からなる不飽和脂肪酸群から選択され得る。
最も好ましい実施形態において、前記１つ以上の脂質部分は、パルミチン酸（すなわち、選択された核酸に「直接またはリンカー基を介して」共有結合した場合にパルミトイル基となる）からなる。
好ましい実施形態において、単一の脂肪酸部分は、直接またはリンカー基を介して、本開示による核酸に共有結合され、前記単一の脂肪酸部分は、最も好ましくは、前記核酸の５’末端に位置するヌクレオチドに共有結合される。
本明細書に記載される共役核酸の最も好ましい実施形態は、単一のパルミトイル基が、直接またはリンカー基を介して、前記核酸の５’末端に位置するヌクレオチドに共有結合しているものである。
いくつかの実施形態において、このようなコンジュゲート核酸は、以下の式（ＩＩ）：
Figure 2023554180000002
ここで
－「Ｐａｌｍ－（Ｃ＝０）－」は、パルミトイル部分を意味し、そして
－「ＮｕｃｌＡｃ」は、本開示による核酸を意味する。
上記式（ＩＩ）の共役核酸は、本明細書において「パーム－Ｃ６－アミノ－＊核酸」とも称され得る。容易に理解されるように、式（ＩＩ）の共役核酸コンジュゲートは、式（Ｉ）の共役アミノ酸の実施形態であり、ここで、
－「Lipid」は、パルミトイル部分を意味し、そして
－ｚは、１を意味し、そして「リンカー」は、Ｃ６アルキル基を意味する。
治療用途
本明細書に記載の核酸は、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのエクソン７３のスキッピングを引き起こすために使用され、その結果、非処置の患者例と比較して、ジストロフィー性表皮水疱症の症状の改善（すなわち、タンパク質の機能または安定性の回復）をもたらす。このような症状は、ミクロレベル（すなわち、免疫組織化学、免疫蛍光、ウェスタンブロット分析によって評価されるタンパク質の発現および／または局在の回復）；組織学的検査による皮膚病変の改善；外部上皮とその下の間質との間のアンカー線維形成能力によって評価されるタンパク質の機能性の回復／改善）で観察される。
本開示によるアンチセンス核酸は、単独でまたはベクターと関連してインビボで送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞へのアンチセンス核酸の輸送を容易にすることができる任意のビヒクルであり、好ましくは、コラーゲンＶＩＩを発現する細胞である。好ましくは、ベクターは、ベクターが存在しない場合に生じるであろう分解の程度と比較して、分解を低減した状態で核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンス核酸の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌源由来の他のビヒクルを含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターは好ましいタイプのベクターであり、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＩＶ－１のようなレンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ＨＳＶ－１のようなヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルス。名前が付いていないが、当技術分野で知られている他のベクターも容易に採用できる。臨床応用が検証され、アンチセンス核酸の導入に使用できるベクターの中では、レンチウイルス、レトロウイルス、ＡＡＶがエクソンスキッピング戦略により大きな可能性を示している。
レトロウイルスをベースとするベクターやレンチウイルスをベースとするベクターは、複製欠損型（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することはできるが、感染性粒子を製造することはできない）であり、ヒト遺伝子治療試験用に承認されている。これらのベクターは標的細胞のゲノムに組み込まれる性質があり、その結果、標的細胞とその子孫において持続的な導入遺伝子の発現が可能となる。
ヒトパルボウイルスＡＡＶ（Adeno-Associated Virus：アデノ随伴ウイルス）は、感染細胞のゲノムに統合して潜伏感染を成立させることができる、本来複製に欠陥のあるデペドウイルスである。最後の特性は哺乳類ウイルスの中でもユニークなもので、ヒトゲノムの１９番染色体（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）にあるＡＡＶＳ１と呼ばれる特定の部位に組み込まれる。ＡＡＶベースの組換えベクターはＲｅｐタンパク質を欠いており、ＡＡＶベクターは宿主ゲノムに低い有効性と低い特異性で統合し、主に安定な環状エピソームとして存在し、標的細胞内で数ヶ月から数年間持続することができる。そのため、ＡＡＶはヒト遺伝子治療のための潜在的ベクターとして大きな関心を集めている。このウイルスの有利な特性のひとつは、ヒトの病気との関連がないことと、感染させることができる様々な組織由来の細胞株の範囲が広いことである。実際、１２種類のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）が知られており、それぞれ異なる組織トロピズムを持っている（Wu et al.、2006）。それにもかかわらず、ＡＡＶは非常に貴重なベクターであり、現在では、選択的に対立遺伝子をノックダウンしたり、標的遺伝子のスプライシングを調節するために、小さなアンチセンス配列を導入するために広く用いられている（Goyenvalle et al.）
他のベクターとしてはプラスミドベクターがある。プラスミドベクターは、当技術分野で広範に記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrookら、1989を参照のこと。ここ数年、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターのような安全性の懸念がないため、特に有利である。プラスミドは様々な非経口的、粘膜的、局所的経路で送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは皮内、皮下、その他の経路で注射することができる。また、遺伝子銃を用いて表皮または粘膜表面に投与することもできる。プラスミドは、水溶液中、金粒子上への乾燥、またはリポソーム、デンドリマー、コクレアート、マイクロカプセル化などを含むがこれらに限定されない他のＤＮＡデリバリーシステムとの関連で投与することができる。
好ましい実施形態では、ベクター化されたアンチセンス配列は、その安定性とスプライソソームターゲッティングを確実にするために、Ｕ７やＵ１などの小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）と融合される（Goyenvalleら、2004；Montgomery and Dietz、1997）。
本開示のさらなる目的は、本明細書に記載の核酸、最も好ましくは本明細書に記載の共役核酸を前記患者に投与する工程を含む、ＤＥＢに罹患している患者の治療方法に関する。本開示によれば、変異したコラーゲンＶＩＩの機能を回復させるために、本明細書に記載の核酸を投与すると、ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡのエクソン７３が除去される。
より特定の実施態様において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表2に描写されるものであり、そして上記のようにベクターと関連し得る。
本発明はさらに、ジストロフィー性表皮水疱症の治療に使用するための、本明細書に記載の核酸、または前記核酸を含むベクターに関する。
本発明はまた、ジストロフィー性表皮水疱症の治療に使用するための、本明細書に記載の核酸、または前記核酸を含むベクターを含む医薬組成物を提供する。
本開示による核酸、または前記核酸を含むベクターに加えて、医薬組成物はまた、生理食塩水、リン酸ナトリウムなどの薬学的または生理学的に許容される担体を含み得る。組成物は一般に液体の形態であるが、必ずしもそうである必要はない。適切な担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水あめ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシ安息香酸塩、鉱油などが挙げられる。製剤はまた、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤などを含み得る。特に、本開示は、核酸またはそれを含むベクターの投与を含むので、遺伝子治療にいくらか似ている。当業者は、核酸がしばしば脂質（例えば、カチオン性脂質もしくは中性脂質、またはこれらの混合物）と一緒に、リポソームまたは他の適切なマイクロもしくはナノ構造物質（例えば、ミセル、リポコンプレックス、デンドリマー、エマルション、立方相など）の形態で送達されることを認識するであろう。
本開示による医薬組成物は、一般に、注射、例えば静脈内、皮下または筋肉内投与により投与される。いくつかの実施形態において、組成物の局所投与が行われ得る。
注射可能な製剤、例えば、無菌注射可能な水性懸濁液または油状懸濁液は、適切な分注剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、公知技術に従って処方することができる。無菌注射製剤はまた、例えば1，3-ブタンジオール中の溶液のように、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液であり得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載の核酸、または前記核酸を含んでなるベクターを、局所薬学的に受容可能なキャリアと混和して投与することが望ましい場合がある。局所薬学的に許容されるキャリアは、本明細書に記載の核酸またはそれを含んでなるベクターが、皮膚表面に直接適用された場合に安定で生物学的利用能を維持する、医薬の局所投与に従来使用可能な任意の実質的に非毒性のキャリアである。例えば、皮膚のケラチン層を角質層に浸透させるのに有効な当該分野で公知のようなキャリアが、本開示の核酸またはそれを含むベクターを関心領域に送達するのに有用であり得る。そのようなキャリアとしては、リポソームが挙げられる。本開示による核酸、または前記核酸を含むベクターは、従来の方法で媒体中に分散または乳化して液体製剤を形成するか、または半固体（ゲル）または固体担体と混合してペースト、粉末、軟膏、クリーム、ローションなどを形成することができる。
適切な局所薬学的に許容される担体としては、水、緩衝生理食塩水、ワセリン、鉱物油、植物油、動物油、マイクロクリスタリンワックス、パラフィンワックス、オゾセライトワックスなどの有機および無機ワックス、キサンタン、ゼラチン、セルロース、コラーゲン、デンプン、アラビアゴムなどの天然ポリマー、合成ポリマー、アルコール、ポリオールなどが挙げられる。担体は水混和性担体組成物とすることができる。このような水混和性の局所用薬学的に許容される担体組成物としては、治療の初期に1種以上の適切な成分を用いて製造されたものを挙げることができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの皮膚への放出を制御し、本開示の核酸、または前記核酸を含むベクターの皮膚上での接触時間を増加させるために、皮膚上に長時間付着するか、またはそれ自体を維持する送達系を有することが望ましい場合がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの持続放出または遅延放出は、より効率的な投与を提供し、その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与頻度が少なくなり、および／または投与量が減少し、患者のコンプライアンスが向上する。湿潤環境下での徐放または遅延放出に適した担体の例としては、ゼラチン、アラビアゴム、キサンタンポリマーなどが挙げられる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、治療部位の油性、脂肪性、ワックス状、または湿潤環境に曝したときに放出することができる医薬担体としては、ポリビニルハライドのような熱可塑性樹脂を含む、熱可塑性または可撓性の熱硬化性樹脂またはエラストマーが挙げられる、 ポリビニルエステル、ポリビニリデンハライド、ハロゲン化ポリオレフィンなどの熱可塑性樹脂、ブラジリエンシス、ポリジエン、ハロゲン化天然ゴム、合成ゴムなどのエラストマー、ポリウレタン、エポキシ樹脂などの可撓性熱硬化性樹脂などが挙げられる。制御された送達システムは、例えば、米国特許第5，427，778号明細書に記載されている。第5,427,778号には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（またはそれを含むベクター）を皮膚部位に送達するためのゲル製剤および粘性溶液が記載されている。ゲルは、皮膚を湿潤に保つ高い含水量、皮膚滲出液を吸収する能力、容易な適用、および洗浄による容易な除去という利点を有する。好ましくは、徐放性または遅延放出性担体はゲル、リポソーム、マイクロスポンジまたはマイクロスフェアである。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（またはそれを含むベクター）は、抗生物質、他の皮膚治癒剤、抗酸化剤を含むがこれらに限定されない他の薬学的に有効な薬剤と組み合わせて投与することもできる。
当業者であれば、本開示による核酸、または当該核酸を含むベクターを投与する量は、望ましくない疾患症状の改善を誘導するのに十分な量であることを認識するであろう。そのような量は、特に、患者の性別、年齢、体重、全体的な身体状態などのような因子に応じて変化し得、ケースバイケースで決定され得る。量はまた、治療される状態のタイプ、および治療プロトコールの他の構成要素（例えば、ステロイドのような他の医薬の投与など）に応じて変化し得る。一般に、好適な投与量は約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。ＡＯＮのウイルスベースの送達が選択される場合、適切な用量は、採用されるウイルス株、送達経路（筋肉内、静脈内、動脈内、またはその他）などの様々な要因に依存するが、典型的には、１０１０～１０１２ウイルス粒子／ｋｇの範囲であろう。当業者であれば、このようなパラメータは通常、臨床試験中に調整されることを認識するであろう。さらに、当業者であれば、本明細書に記載される治療によって疾患症状が完全に緩和される場合もあるが、そうである必要はないことを認識するであろう。症状の部分的または断続的な緩和でさえ、レシピエントにとって大きな利益となり得る。さらに、患者の治療は通常、１回で終わるものではない。むしろ、本開示による核酸は、得られる結果に応じて、数日間隔、数週間間隔、または数ヶ月間隔、あるいは数年間隔であってもよい、複数の機会に投与される可能性が高い。
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例および図は、本発明の範囲を限定するものとしていかなる意味においても解釈されるべきではない。
実施例１：ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３を標的とするアンチセンス核酸の合成
ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３を標的とするアンチセンス核酸の合成は、ＷＯ ２０１８／１９３４２８で公開されたＰＣＴ出願に記載されるように行った。
実施例２：本開示による核酸のエクソン７３スキップ効率
Ａ． 材料及び方法
１０μｇのｔｃＤＮＡをグリセロール５０％で希釈し、９０Ｖで２時間、Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒを用いた非変性アクリルアミド－Ｂｉｓ １５％ゲルにロードした。その後、アクリルアミドゲルをＳｔａｉｎｓ－Ａｌｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間穏やかに振とうしながらインキュベートし、Ｅｐｓｏｎ Ｓｃａｎで画像を取得した。
Ａ．２． スキップ効率
トランスフェクションの２日前に５０，０００細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＬＴＸ＋（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社製）を用い、製造元のプロトコールに従い、３用量のＡＳＯ（５０、１００、２００ｎＭ）を二重にトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、メーカーのプロトコールに従って全ＲＮＡを抽出した。次に、１μｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って逆転写した。最初の鎖を、ＣＯＬ７Ａ１のエクソン境界７０－７１およびエクソン７８に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにかけた（表Ｘ）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いたデンシトメトリー定量によってエクソンスキッピングの有効性を評価した。
Figure 2023554180000003
Ｂ． 結果
結果は本開示の末尾の表２に詳述されている。
表２の結果から、試験した核酸はすべて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで良好なエクソン７３スキップ効率を有し、その有効性は５０％以上であった。
ＳＹ－０８７１＿ＭＫ９８６およびＳＹ－０８７４＿ＭＫ９８９と呼ばれる核酸は、二量体化を誘導するため、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用には最適ではない。
注目すべきは、ＳＹ－８７０と呼ばれる核酸は二量体化を誘導しないことである。
表２ スッキッピング有効性
Figure 2023554180000004

Claims (16)

  1. 以下：
    ５’－ＧＣＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧ－３’（配列番号１）
    の配列番号１の核酸配列のＮ個の連続したヌクレオチドからなる核酸であって、
    ここで
    －Ｎは、１３から１５の範囲の整数であり
    －Ｎ－ｘヌクレオチドはトリシクロヌクレオチドからなり、ｘは１または２に等しい整数であり、
    －ｘヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなり、そして
    －各ヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して隣接するヌクレオチドに連結されている。
  2. トリシロンヌクレオチドが下記式（Ｉ）：
    Figure 2023554180000005
    の化合物からなる請求項１に記載の核酸であって、
    ここで、
    －Ｒ１はＯ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲを意味し、ここでＲは水素または（Ｃ１－Ｃ３）非置換アルキルであり
    －Ｒ２およびＲ３の各々は、一方が他方から独立して、ヌクレオシド間連結を意味し、そして
    －「Ｂａｓｅ」は、核酸塩基を意味する。
  3. Ｒ１がＯを意味し、Ｒ２およびＲ３が、一方が他方から独立して、請求項２に定義されるようなヌクレオシド間連結である、請求項１に記載の核酸。
  4. １つの２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドを含む、請求項１および２のいずれか１項に記載の核酸。
  5. 請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸であって、ここで：
    － ｎは１５であり
    － ｘは１を意味し
    － すべてのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合からなり、そして
    － 前記核酸は、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチドからなる１つのヌクレオチドを含む。
  6. 配列番号１のオリゴヌクレオチドからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸であって、ここで、：
    －すべてのヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合からなり、そして
    －すべてのヌクレオチドがトリシクロヌクレオチドからなり、ただし、４位に位置するシトシルヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの意味で、２’－Ｏ－メチルリボシトシルからなる。
  7. １つ以上の脂質部分が共有結合している、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸。
  8. 前記脂質部分の各々が、飽和脂肪酸部分および不飽和脂肪酸部分からなる群より独立して選択される、請求項６に記載の核酸。
  9. 前記１つ以上の脂質部分がパルミトイル基からなる、請求項７に記載の核酸。
  10. その５’末端ヌクレオチドがパルミトイル基と共有結合している、請求項６～８のいずれか１項に記載の核酸。
  11. 請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
  12. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１１に記載のベクター、および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
  13. 医薬品として使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１１に記載のベクター。
  14. ジストロフィー性表皮水疱症に罹患した対象を治療するための使用のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１１に記載のベクター。
  15. 変異したＶＩＩ型コラーゲンの機能障害に関与するＶＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン７３のスプライシングを阻止する工程を含む、変異したＶＩＩ型コラーゲンの機能を回復させる方法に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１１に記載のベクター。
  16. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸を前記患者に投与する工程を含む、ジストロフィー性表皮水疱症に罹患している患者の治療方法。
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