JP2023553609A - 対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法 - Google Patents

対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法 Download PDF

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Abstract

対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法が開示される。この方法は、対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値を決定する工程を含んでもよく、上記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値は、上記対象が脂質低下療法に応答する可能性を示す。【選択図】図１（１）

Description

本開示は、対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法、並びに対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクがあるか否かを判定する方法に関する。
高コレステロール血症、すなわち、血中の血清コレステロールレベルの上昇は、現在、多くの地理的領域における心血管疾患（ＣＶＤ）の主な原因である。血清コレステロールレベルの調節は、食事摂取、内因性産生、及び細胞代謝によって制御される。
スタチンは、しばしば、高コレステロール血症に罹患している対象のための第一選択薬物療法として使用される。しかしながら、多くの場合、対象は、直ちに又は長期間にわたり、応答しないか又は目標コレステロールレベルに達しない。患者によっては、スタチン療法に従わないものもある。さらに、心臓発作を起こした患者のかなりの部分は、最初の発作の１年以内に２回目の発作を起こす。従って、そのような患者がスタチン治療に応答するか否かを調べるために長期間待つことなく、そのような患者のコレステロールレベルを低下させる必要がある可能性がある。さらに、コレステロールを低下させる治療及び療法のほとんどは、細胞機構に影響を及ぼし、それゆえ、そのような細胞機構を定量化することができることは非常に有益である可能性がある。
この概要は、発明を実施するための形態において以下でさらに説明される概念の選択したものを簡略化された形で紹介するために提供される。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴又は本質的な特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求される主題の範囲を限定するために使用されることを意図するものでもない。
対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法が開示される。当該方法は、対象の生体試料（生物学的試料）から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値を決定する工程を含んでもよく、
上記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値は、上記対象が脂質低下療法に応答する可能性を示す。
対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクがあるか否かを判定する方法も開示される。当該方法は、対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値を決定する工程を含んでもよく、
上記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値は、上記対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは上記心血管疾患を発症するか又は有するリスクが高い可能性を示す。
本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、実施形態を例示し、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
ＰＢＭＣにおける機能欠陥の多重定量化のための自動分析パイプライン。Ａ）自動化された試料処理及び画像分析パイプラインの概略図。各実験について、凍結保存したＰＢＭＣ試料は解凍され、９６ウェルに分注され、１０％ＦＢＳ（完全培地）又は５％ＬＰＤＳ（脂質飢餓培地）とともに一晩インキュベートされた。細胞は蛍光ＬＤＬ（ＤｉＩ－ＬＤＬ）で標識されるか、又は３８４ウェルイメージングプレートに直接移され、自動的に固定され、染色され、自動ハイコンテントイメージングに供された。画像はＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒで定量され、単細胞データはＰｙｔｈｏｎツールで処理された。 ＰＢＭＣにおける機能欠陥の多重定量化のための自動分析パイプライン。Ｂ）５％ＬＰＤＳによる処理後のリンパ球及び単球の集団におけるＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みを示す代表的な画像。Ｃ）それぞれが４人の個体由来のＰＢＭＣの混合物からなる２つの標準（１、２）由来のリンパ球及び単球の集団における平均ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の自動定量化。１０回の実験からの各処理及び標準について、ｎ ＞７４０００個のリンパ球及び＞１６１００個の単球。Ｄ）ＬＰＤＳ処理後の対照ＥＢＶリンパ芽球（ＥＢＶ）及び単球におけるＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み。代表的な画像が示されている。Ｅ）１０回の独立した実験からの、（Ｃ）におけるような２つの標準からのＥＢＶリンパ芽球及び単球における平均ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の定量化。（Ｃ）におけるように、ＥＢＶリンパ芽球、単球についてはｎ ＞２００００。Ｆ）５％ＬＰＤＳによる処理後の、ＬＤＬＲ変異Ｃｙｓ３２５Ｔｙｒ又はＳｅｒ５８０Ｐｈｅを有する家族性高コレステロール血症（ＦＨ）患者から単離された単球及び標準（１）におけるＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みからの代表的な画像。Ｇ）（Ｆ）におけるように処理した単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の定量化。ｎ＝標準１については３９５４細胞、Ｃｙｓ３２５Ｔｙｒについては１７１７細胞、Ｓｅｒ５８０Ｐｈｅについては７８７細胞。＊＊＊＜０．００１、スケールバー＝１０μｍ、エラーバー＝９５％信頼区間（ＣＩ）。 Ｈｅ－ＦＨ患者の単球における不均質なＬＤＬ取り込み及びＬＤＬＲ表面発現。Ａ）実施例に含まれるＬＤＬＲ変異の概略図。Ｂ）２つの標準（１００％）に対して正規化された、５％ＬＰＤＳ処理後のＦＨ患者からの単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の定量化。平均して５８２０個の単球を１～３回の実験で各患者について定量した。黒い点はスタチンレシピエントを示す。エラーバー＝９５％ＣＩ。Ｃｙｓ３２５Ｔｙｒ及びＳｅｒ５８０Ｐｈｅは、図１Ｇからのものである。 Ｈｅ－ＦＨ患者の単球における不均質なＬＤＬ取り込み及びＬＤＬＲ表面発現。Ｃ）（Ｂ）と同じ順序で示される、２つの標準に対する単球ＬＤＬＲ表面発現の定量化。Ｄ）ＬＤＬＲ変異体Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ（ノース・カレリア）（ｎ＝７）、Ｇｌｕ６２６Ａｌａ（ｎ＝５）及びＰｏｇｏｓｔａ（ｎ＝３）についての単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の箱ひげ図（ボックスプロット）。Ｅ）単球ＬＤＬＲ表面発現とＤｉＩ－ＬＤＬ強度の相関。Ｆ）単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度と血中ＬＤＬコレステロール濃度との相関。Ｇ）スタチン単独療法を受けている患者についての単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度とＬＤＬ－コレステロール血漿レベルとの相関。散布図中の灰色領域は９５％ＣＩを示す。 正常な血中ＬＤＬ（２～２．５ｍｍｏｌ／ｌ ＬＤＬ、Ｎ－Ｃｈｏｌ）及び上昇したＬＤＬ（＞５ｍＭ ｍｍｏｌ／ｌ、Ｈ－Ｃｈｏｌ）を有する非ＦＨ個体における単球ＬＤＬ取り込みプロファイル。Ａ）Ｎ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌのサブグループについての高血中ＬＤＬ濃度についての遺伝的リスクスコア（ＬＤＬ－ＧＲＳ）の箱ひげ図。ＮＣｈｏｌ ｎ＝１８、Ｈ－Ｃｈｏｌ ｎ＝１９。＊＝０．０５。Ｂ）標準に対して正規化された、５％ＬＰＤＳによる処理後のＮ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌのサブグループにおける単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の定量化。平均して患者あたり１２６０個の単球が分析された。Ｃ）（Ｂ）において定量化されたＮ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌのサブグループについての単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の箱ひげ図。Ｎ－Ｃｈｏｌ ｎ＝１９、Ｈ－Ｃｈｏｌ ｎ＝２０。Ｄ）単球ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み（リポタンパク質飢餓後）及び股関節周囲の相関。Ｅ）５％ＬＰＤＳ及び１０％ＦＢＳ処理後に定量化された、標準と比較したＮ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌの個体の単球ＬＤＬ取り込みの差異。ｎ＝３９、＊＊＝０．０１。棒グラフのエラーバー＝９５％ＣＩ。散布図の灰色領域は９５％ＣＩを示す。 脂質動員アッセイ。Ａ）１０％ＦＢＳによる処理後のリンパ球及び単球の集団における脂質滴（ＬＤ）を示す代表的な画像。Ｂ）８回の独立した実験からの標準１及び２についての１０％ＦＢＳ又は５％ＬＰＤＳによる処理後のリンパ球及び単球の集団におけるＬＤの自動定量化。各処理及び標準について、ｎ＝ ＞２６０００リンパ球及び＞７９００単球。Ｃ）脂質動員アッセイの概略図。１０％ＦＢＳによる処理で、細胞は細胞質ＬＤに余剰脂質を貯蔵する。脂質飢餓（５％ＬＰＤＳ）は、脂質利用及びＬＤ数の減少をもたらす。脂質動員は、１０％ＦＢＳによる処理後のＬＤ数を５％ＬＰＤＳによる処理後に定量化されたＬＤ数で割ることによって計算される。棒グラフのエラーバー＝９５％ＣＩ、スケールバー＝１０μｍ。 脂質動員アッセイ。Ｄ）標準１及び２、ｎ＝８、についてのリンパ球及び単球の集団における脂質動員の定量化。Ｅ）（Ｄ）におけるように、標準１及び２、ｎ＝８、からの対照ＥＢＶリンパ芽球及び単球における脂質動員の比較。Ｆ）８回の独立した実験からの１０％ＦＢＳ又は５％ＬＰＤＳによる処理後の対照ＥＢＶリンパ芽球におけるＬＤ存在量の定量化。ｎ＝１０％ＦＢＳについて７４７７単球、及び５％ＬＰＤＳについて６８３８単球。Ｇ）ＦＨ患者についての脂質動員スコアの箱ひげ図提示。（Ｎｏｒｔｈ Ｋ． ｎ＝７、Ｇｌｕ６２６Ａｌａ ｎ＝５、Ｐｏｇｏｓｔａ ｎ＝３、他の変異体 ｎ＝１）。平均で、治療及び患者あたり２０００個を超える単球を分析した。棒グラフのエラーバー＝９５％ＣＩ、スケールバー＝１０μｍ。 単球脂質動員は、ＬＤＬ取り込みと相関し、上昇した血中ＬＤＬを有するドナーにおいて減少する。Ａ）単球ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み（図３Ｂ）に従って分類した、対照（Ｎ－Ｃｈｏｌ、ＬＤＬ ２～２．５ｍｍｏｌ／ｌ）及びＬＤＬ上昇個体（Ｈ－Ｃｈｏｌ、ＬＤＬ＞５ｍｍｏｌ／ｌ及び多遺伝子負荷の増加）由来の単球における脂質動員。Ｂ）Ｎ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌのサブグループについての脂質動員の箱ひげ図。Ｎ－Ｃｈｏｌ ｎ＝１９、Ｈ－Ｃｈｏｌ ｎ＝２０、＊＝０．０５。単球脂質動員とＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み能（５％ＬＰＤＳ処理後）（Ｃ）、血中ＬＤＬ濃度（Ｄ）又は股関節周囲（Ｅ）との相関。散布図中の灰色領域＝９５％ＣＩ。 遺伝的データと機能的データとを組み合わせたハイブリッドスコアは、血中ＬＤＬとの相関を改善する。Ａ）バイオバンクドナーについての高血中ＬＤＬ濃度についての遺伝的リスクスコア（ＬＤＬ－ＧＲＳ）と実際の血中ＬＤＬコレステロール濃との相関。Ｂ）ＬＤＬ－ＧＲＳと単球ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み能（５％ＬＰＤＳによる処理後）との組み合わせ及び血中ＬＤＬコレステロールレベルとの相関。Ｃ）ＬＤＬ－ＧＲＳと単球脂質動員との組み合わせ及び血液中のＬＤＬコレステロールレベルとの相関。Ｄ）ＬＤＬ－ＧＲＳ、単球ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み（５％ＬＰＤＳ後）及び脂質動員からなる三重ハイブリッドスコアの生成、並びにこのハイブリッドスコアと血中ＬＤＬコレステロール濃度との相関。ｎ＝３７。散布図中の灰色領域＝９５％ＣＩ。 単球における機能的読み出し、並びにそれらと単遺伝子性及び多遺伝子性高コレステロール血症における生理学的転帰との相関の概略図。 リンパ球及び単球の集団の同時定量化及びＬＤＬ取り込みの特異性。Ａ）ＤＡＰＩ（核）、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｇｒｅｅｎ（細胞質）及び抗ＣＤ３抗体（リンパ球）で染色したＰＢＭＣ細胞の代表的な画像。Ｂ）（Ａ）における黄色領域のズームイン図及び１１５μｍ２未満（リンパ球集団として指定される）及び１１５μｍ２超（単球集団として指定される）の細胞面積の細胞についての％ＣＤ３陽性細胞の自動定量化。ｎ＝２標準で、各々は、４人の個体由来のＰＢＭＣを含む。Ｃ）抗ＣＤ１４染色ＰＢＭＣの代表的ズームイン画像並びに（Ｂ）に定義されるリンパ球（Ｌｙｍ）及び単球（Ｍｏｎ）の集団におけるＣＤ１４陽性細胞％の定量化。ｎ＝２標準。エラーバー＝９５％ＣＩ。 リンパ球及び単球の集団の同時定量化及びＬＤＬ取り込みの特異性。Ｄ）１０回の実験からの１０％ＦＢＳ又は５％ＬＰＤＳによる処理後の２つの標準（１、２）からのリンパ球及び単球の集団におけるＤｉＩ－ＬＤＬ陽性オルガネラの自動定量化。各処理及び標準について、ｎ ＞７４０００リンパ球及び＞１６１００単球。Ｅ）１０％ＦＢＳ、５％ＬＰＤＳ、又はＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み相中に１００μｇ／ｍｌの天然ＬＤＬを補充した５％ＬＰＤＳ（ＬＰＤＳ＋ＬＤＬ）による処理後のリンパ球及び単球の集団についてのＤｉＩ－ＬＤＬ強度の定量化。Ｆ）７２時間の５％ＬＰＤＳ処理後の対照及び２人の家族性高コレステロール血症患者（ＦＨ）由来のＥＢＶリンパ芽球における細胞ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の定量化。エラーバー＝９５％ＣＩ。
第１の態様によれば、対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法が開示される。この方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員（ｌｉｐｉｄ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）能力の定量値を決定する工程
を含んでもよく、
上記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値は、上記対象が脂質低下療法に応答する可能性を示す。
第２の態様によれば、対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクがあるか否かを判定する方法が開示される。この方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値を決定する工程
を含んでもよく、
上記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又はその細胞の脂質動員能力の定量値は、上記対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは上記心血管疾患を発症するか又は有するリスクが高い可能性を示す。
本明細書において以下で説明される任意の実施形態は、第１の態様、第２の態様のいずれか、又はその両方に関連するものとして理解されてもよい。
当該方法を用いると、脂質低下療法、例えば、スタチン、ＰＣＳＫ９、エゼチミブ、エビナクマブ、及び／又はベンペド酸治療に対する対象の応答を試験し、これにより予測することが可能であってもよい。
それゆえ、スタチン治療等の特定の脂質低下治療のみに応答する可能性が低い対象を比較的迅速に特定することが可能であってもよく、その結果、対象はできるだけ早くより良好な作業療法を提供されてもよい。それは、より多くの対象がその目標脂質レベル（例えば、コレステロールレベル）を達成すること、及び／又はより良好な投薬により副作用を低減することも可能にしてもよい。従って、当該方法は、心血管疾患の発生率の低減を可能にしてもよい。
本明細書の文脈では、用語「治療」並びに「処置」及び「処理」は、当該技術分野において一般のように理解されてもよい。少なくともいくつかの実施形態では、それらは互換的に使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定することは、対象の血液中のどの脂質濃度が脂質低下療法によって達成されてもよいかを決定すること、及び／若しくは対象が脂質低下療法に応答して対象の血液中の目標脂質濃度に達する可能性を判定することを含むか、又はそのような決定をすることであってもよい。このような実施形態では、細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答して対象の血液中の目標脂質濃度に達する可能性を示し、かつ／又は対象の血液中のどの脂質濃度が脂質低下療法によって達成されてもよいかを示す。（目標）脂質濃度は、例えば、（目標）コレステロール濃度及び／又は（目標）ＬＤＬコレステロール濃度であってもよい。このような実施形態では、どの対象が脂質低下療法に少なくともある程度応答し得るかだけでなく、どの対象が脂質低下療法の所望の結果、例えば目標脂質濃度を達成し得るかを判定することが可能であってもよい。
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／若しくは細胞の脂質動員能力の定量値のいずれか１つ、又はそれらの任意の組み合わせは、対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定するために、又は対象が、アテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクがあるか否かを判定するために充分であってもよい。
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値を決定すること、及び／又は細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値を決定することは、単独で又は組み合わせて、細胞におけるＬＤＬＲ活性の定量値を決定することと見なされてもよい。ＬＤＬ取り込みは、少なくともいくつかの実施形態では、細胞におけるＬＤＬＲ活性のより良好な尺度であってもよい。しかしながら、それらは、より確実な（ロバストな）読み出し値を得るために組み合わされてもよい。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値を決定すること
を含み、
細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
細胞の脂質貯蔵能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞の脂質貯蔵能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
細胞における脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値及びその細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値及び細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値及びその細胞の脂質貯蔵能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値及び細胞の脂質貯蔵能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値及びその細胞の脂質貯蔵能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値及び細胞の脂質貯蔵能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞の脂質貯蔵能力の定量値及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞の脂質貯蔵能力の定量値及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、及びその細胞の脂質貯蔵能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、及び細胞の脂質貯蔵能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
一実施形態では、当該方法は、
対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、その細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、その細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及びその細胞の脂質動員能力の定量値を決定すること
を含み、
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び細胞の脂質動員能力の定量値は、対象が脂質低下療法に応答する可能性並びに／又はアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示す。
当該方法は、細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値を対照細胞の定量値又は対照値と比較することを含んでもよく、細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値の減少は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が低いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示し、かつ／又は細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値の増加は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が高いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を有する可能性が低いことを示す。
当該方法は、細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値を対照細胞の定量値又は対照値と比較することを含んでもよく、細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値の減少は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が低いこと、及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示し、かつ／又は細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値の増加は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が高いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を有する可能性が低いことを示す。
対象脂質低下療法に応答する可能性が高い対象、すなわち脂質低下療法に対する良好な応答者を特定することは、その対象が後に療法に応答しない場合、その対象が療法に従わなかったことを示し得るという点で有用であってもよい。対象が良好な応答者である場合、所望の効果を達成し、これにより潜在的な副作用の低減及び／又は薬物療法に対する順守の改善を達成するために、低レベルの薬物療法（例えば、より低い用量のスタチン）も可能にしてもよい。
当該方法は、細胞の脂質貯蔵能力の定量値を対照細胞の定量値又は対照値と比較することを含んでもよく、
細胞の脂質貯蔵能力の定量値の増加は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が低いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示し、かつ／又は細胞の脂質貯蔵能力の定量値の減少は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が高いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を有する可能性が低いことを示す。
当該方法は、細胞の脂質動員能力の定量値を対照細胞の定量値又は対照値と比較することを含んでもよく、
細胞の脂質動員能力の定量値の減少は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が低いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクが高いことを示し、かつ／又は細胞の脂質動員能力の定量値の増加は、対象が脂質低下療法に応答する可能性が高いこと、並びに／若しくはアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を有する可能性が低いことを示す。
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は、例えば、細胞を標識ＬＤＬ粒子と接触させること、これによって得ることができる得られた混合物を、標識ＬＤＬ粒子の細胞内部移行（インターナショナリゼーション、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を可能にするのに充分な期間インキュベートすること、並びに細胞によって内部移行された標識ＬＤＬ粒子の量及び／又は数を決定することによって決定されてもよい。代替的に又は追加的に、細胞によって内部移行された標識ＬＤＬ粒子の強度及び／又は標識ＬＤＬ粒子を含有するオルガネラ（細胞小器官）の定量化を使用して、細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値が決定されてもよい。標識ＬＤＬ粒子は、標識ＬＤＬ粒子とＬＤＬ受容体とによって複合体が形成されるように、細胞の表面上のＬＤＬ受容体（又は複数のＬＤＬ受容体）に結合してもよい。次いで、この複合体が細胞に内部移行されてもよい。しかしながら、細胞がＬＤＬを取り込む能力を測定することができる他の方法、例えば、ＡｐｏＢ（アポリポタンパク質Ｂ）又は人工ＬＤＬ分子を利用する方法が企図されてもよい。
細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値は、ＬＤＬＲの表面発現及び／又は細胞発現を含んでもよく、又はそれらであってもよい。ＬＤＬＲの発現は、例えば、抗ＬＤＬＲ抗体又はＬＤＬＲに結合することができる他のリガンドを使用することによって決定されてもよい。しかしながら、細胞におけるＬＤＬＲの発現を測定することができる他の方法、例えばＬＤＬＲ ｍＲＮＡの存在量を定量化する方法（例えば定量ＰＣＲ又はＲＮＡ配列決定による）が企図されてもよい。
脂質貯蔵能力の定量値は、例えば、細胞中の脂質滴（ＬＤ）（すなわち、細胞脂質滴）の定量値（例えば、量若しくは相対量、面積、強度及び／又は数）を決定することによって決定されてもよい。
細胞の脂質動員能力の定量値は、例えば、リポタンパク質枯渇培地中の細胞中の脂質滴（ＬＤ）の定量値に対する完全培地中の細胞中の脂質滴の定量値を決定することによって決定されてもよい。これは、例えば、リポタンパク質枯渇培地中の細胞中の脂質滴の定量値に対する完全培地中の細胞中の脂質滴の定量値の比を計算することによって行われてもよい。用語「完全培地」は、細胞の維持及び／又は増殖に必要とされるすべての成分を含有する細胞培養培地を指すものとして理解されてもよい。適切な完全培地の一例は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含有する培地である。リポタンパク質枯渇培地の一例は、ＦＢＳを含まないが５％ＬＰＤＳ（リポタンパク質欠損血清）を含む同等の培地（すなわち、対応する完全培地に匹敵する培地）である。
細胞中の脂質滴（ＬＤ）の定量値及び脂質貯蔵能力の定量値は、細胞内脂質貯蔵オルガネラ中の脂質滴の存在量を測定することによって決定されてもよい。細胞は、例えばプラスチック基板又はガラス基板に固定化（不動化）されてもよい。次いで、細胞が固定され、核染色剤及び脂質滴内に蓄積する疎水性フルオロフォアで染色されてもよい。次いで、この細胞は自動イメージングに供されてもよく、ソフトウェアツールを使用して、細胞及び各細胞中の個々の脂質滴が特定されてもよい。これは、細胞脂質滴の正確な数、それらのサイズ及び／又はそれらの蛍光強度を決定することを可能にしてもよい。この方法の詳細は、例えば、Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１７；８：１４８５８によって記述されている。この情報に基づいて、脂質動員を定量化することが可能である。
しかしながら、細胞の脂質動員能力の定量値を決定するための他の方法、例えば、異なる条件下での脂質の生化学的決定が企図されてもよく、又はフローサイトメトリーを使用して、その異なる条件下でのＬＤ強度が定量されてもよい。あるいは、脂質動員は、最初に細胞を高脂質負荷に曝露して多数の脂質滴を刺激し、次いでより少ない脂質を含有する完全培地に切り替え、これにより脂質動員をモニターすることによって測定されてもよい。自動顕微鏡法及び画像分析を用いて、脂質滴のより正確な定量化を達成することが可能である場合がある。フローサイトメトリーを使用して、細胞脂質滴強度を測定することもできようが、必ずしも脂質滴の数及びサイズを測定することはできない場合がある。それにもかかわらず、フローサイトメトリーを使用して、異なる条件下での強度変化を定量化し、従って脂質動員の計算を可能にすることができよう。また、脂質滴は、脂質滴関連タンパク質の抗体染色によって定量化することができよう。あるいは、細胞脂質含有量は、生化学的方法（例えば、溶媒を用いた細胞脂質抽出及び薄層クロマトグラフィー又は質量分析による定量）によって測定することができよう。
本明細書の文脈では、用語「脂質動員能力」は、細胞が貯蔵された脂質を利用する能力を指すものとして理解されてもよい。一実施形態では、用語「脂質動員能力」は、（例えば、同じ又は同等の細胞における）リポタンパク質枯渇培地中の脂質滴数、細胞脂質滴面積、及び／若しくは細胞脂質滴強度に対する完全培地中の脂質滴数、細胞脂質滴面積、及び／若しくは細胞脂質滴強度の比及び／又は倍数差を指すものとして理解されてもよい。しかしながら、脂質動員能力の定量値は、代替的に又は追加的に、完全培地及びリポタンパク質枯渇培地における脂質滴数、細胞脂質滴面積、及び／又は細胞脂質滴強度の差を決定することによって決定されてもよい。
対象の生体試料は、血液試料又は血液試料に由来する試料、例えばバフィーコート試料であってもよい。他の生体試料、例えば、線維芽細胞、角化細胞（ケラチノサイト）及び／又は間葉系幹細胞等の組織に由来する細胞試料が企図されてもよい。
細胞（すなわち、対象の生体試料から得られる細胞）は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含んでもよく、又は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であってもよい。ＰＢＭＣは、血液試料又はバフィーコート試料等の生体試料から、例えば密度勾配遠心分離によって得られてもよい。ＰＢＭＣは、陽性又は陰性の抗体選択技術によって選別されてもよい。
代替的に又は追加的に、細胞は、例えば、エプスタイン・バーウイルスで不死化されたリンパ球（ＥＢＶリンパ芽球）、好中球、及び／若しくは顆粒球を含むか、又はそれらであってもよい。
細胞は凍結保存されてもよい。
対象はヒトであってもよいが、対象は、追加的又は代替的に、動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ及び／若しくはげっ歯類、例えばマウス若しくはラット、又は任意の他の種であってもよい。
対象は、高脂血症を有してもよい。一実施形態では、対象は、高コレステロール血症及び／又は高トリグリセリド血症を有する。
第２の態様に係る方法では、心血管疾患は、例えば、狭心症若しくは心筋梗塞等の冠動脈疾患、脳卒中、心臓発作、脳血管疾患若しくは末梢動脈周囲疾患のうちの少なくとも１つを含んでもよく、又はそれらであってもよい。
対象は、いくつかの実施形態では、脂質低下療法を受けていてもよい。言い換えれば、対象は、生体試料が対象から得られるか又は得られた時点で脂質低下療法を受けていてもよいし、又は受けたことがある。他の実施形態では、生体試料は、未だ脂質低下療法を受けたことがない対象から得ることが可能であってもよく、又は得られてもよい。
脂質低下療法は、スタチン治療を含んでもよく、又はスタチン治療であってもよい。スタチンは、高コレステロール血症に罹患している対象のための第一選択薬物療法として使用されることが多い。しかしながら、対象は、スタチン療法を受けているとき、直ちに又は長期間にわたり、応答しないか又は目標コレステロールレベルに達成しないことが多い。一部の対象は、スタチン療法に従わない。さらに、心臓発作を起こした対象のかなりの部分が、最初の発作の１年以内に２回目の発作を有することが観察されている。従って、そのような対象がスタチン療法に応答するか否かを調べるために長期間待つことなく、そのような対象のコレステロールレベルを低下させる必要がある可能性がある。さらに、又はあるいは、脂質低下療法は、ＰＣＳＫ９阻害剤療法、エゼチミブ療法、エビナクマブ療法、及び／又はベンペド酸療法を含んでもよく、又はそれらであってもよい。他の可能性のある療法、治療又は脂質低下剤が、将来企図又は開発される可能性がある。
当該方法は、自動画像及びデータ分析を使用して行われてもよい。この方法は、ハイコンテントイメージングと、それに続く自動画像及びデータ分析を使用して行われてもよい。ハイコンテントイメージングは、自動蛍光顕微鏡法等の自動顕微鏡法を指してもよく、又はそれを含んでもよい。自動顕微鏡法は、例えば、自動広視野蛍光顕微鏡法及び／又は共焦点顕微鏡法を含んでもよい。ハイコンテントイメージングは、より良好な自動化及び／又は柔軟性を可能にしてもよい。それは、当該方法に必要とされる時間を短縮する場合もある。
当該方法は、ロボットプラットフォームを使用して行われてもよい。
しかしながら、他の方法が、代替的に又は追加的に企図されてもよい。例えば、当該方法は、フローサイトメトリー及び／又は非自動顕微鏡法を用いて行われてもよい。
細胞は表面上に固定化（不動化）されてもよい。例えば、それらは、ハイコンテントイメージングのために表面上に固定化されてもよい。細胞は、単層として表面上に固定化されてもよい。好適な表面は、例えば、ハイコンテントイメージングプレート等のプラスチック及び／又はガラス表面を含んでもよい。固定化は、保存及び保存後の（同じ）細胞の反復分析（例えば、画像取得）を可能にしてもよい。これは、２つ以上の細胞集団のグループ分け（分類）及び／又は識別を可能にしてもよい。固定化は、細胞凝集も防ぎ、細胞の染色及び／又はイメージングの自動化も可能にしてもよい。固定化細胞は、脂質滴及び／又は内部移行されたＬＤＬ粒子の定量的量を決定することを可能にする可能性がある細胞内分解能でのイメージングに好適であってもよい。固定化は、脂質滴及び／又は内部移行されたＬＤＬ粒子の細胞内局在化の決定も可能にしてもよい。
固定化細胞は表面に接着してもよい。接着を促進するために、表面は、改善された接着を可能にするように選択、処理及び／又は調製されてもよい。適切な表面がコーティングされてもよい。適切なコーティングは、例えば、ポリ－Ｄ－リシン（ＰＤＬ）コーティング、ポリ－Ｌ－リシンコーティング、コラーゲンコーティング、及び／又はラミニンコーティング等の、表面への細胞接着を促進する可能性があるコーティングを含んでもよい。
細胞は、２つ以上（すなわち、少なくとも２つ）の細胞集団にグループ分けされてもよく、及び／又は１つ以上の細胞集団が細胞から選択されてもよく、細胞集団のうちの少なくとも１つのＬＤＬを取り込む能力の定量値、ＬＤＬＲの発現の定量値、脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は脂質動員能力の定量値は、他の細胞集団とは別個に決定されてもよい。このために、細胞は表面上に固定化されてもよい。しかしながら、細胞の固定化は必要でない場合がある。例えば、細胞は、例えば、細胞集団に特異的な抗体を使用する抗体染色、若しくは２つ以上の細胞集団を区別することができる他のタイプの染色によって、及び／又はそれらの形態学的特性によって、２つ以上の細胞集団にグループ分けされてもよい。例えば、少なくとも１つの細胞集団は、（細胞内の他の細胞集団と比較して）最も高いシグナル対ノイズ比を示す細胞集団であってもよい。別の例として、ＰＢＭＣ細胞は、単球及びリンパ球（及び任意選択で他の細胞型）にグループ分けされてもよく、定量値は、単球、リンパ球、及びいずれかの他の任意選択の細胞集団について別々に決定されてもよい。単球は、コーティングされたイメージングプレート等の表面への接着後に広がり、拡大した細胞質領域をもたらしてもよいので、単球及びリンパ球は、サイズに基づいて互いに識別されてもよい。しかしながら、少なくともいくつかの実施形態では、単球、リンパ球、及び／又はいずれかの他の任意選択の細胞型若しくは細胞集団について別々に決定された定量値は組み合わされて、例えば相関で使用されてもよい。
しかしながら、細胞のＬＤＬを取り込む能力の定量値、ＬＤＬＲの発現の定量値、脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は脂質動員能力の定量値を決定するためには、細胞を２つ以上の細胞集団化にグループ分けすることは必要でない場合がある。例えば、上記定量値は、ＰＢＭＣ集団全体（又はその一部）から決定されてもよい。
対象の細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は、標識ＬＤＬ粒子を使用して決定されてもよい。しかしながら、対象の細胞がＬＤＬを取り込む能力の決定を可能にする可能性がある他の手段も企図されてもよい。ＬＤＬ粒子は、例えば、蛍光標識又は放射性標識されてもよい。ＬＤＬ粒子は、例えば凍結によって保存されてもよい。
対象の細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は、急速（スナップ）凍結によって保存されたＬＤＬ粒子を使用して決定されてもよい。急速凍結は、例えば、ＬＤＬ粒子の温度を－７０℃以下の温度まで非常に急速に、例えば、少なくとも１秒、又は少なくとも５秒、又は少なくとも１０秒、又は少なくとも３０秒、又は少なくとも１分の期間に低下させることによって行われてもよい。急速凍結の後、このように保存されたＬＤＬ粒子は、例えば、約－７０～約－８０℃の温度で保存されてもよい。しかしながら、それらは、他の温度、例えば約－１０℃未満若しくは約－２０℃未満の温度、又は約－１０℃～約－２０℃の範囲の温度で保存されてもよい。適切な温度でのＬＤＬ粒子の急速凍結及び任意選択の保存は、細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値の測定を変える可能性があるＬＤＬ粒子の凝集又は変性を防止する可能性がある。従って、ＬＤＬ粒子は、より長く貯蔵されてもよく、かつ／又はより信頼性の高い結果を提供してもよい。
細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、ＬＤＬＲの発現の定量値、脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は脂質動員能力の定量値は、複数の対象の生体試料から得ることができる細胞の混合物を含む標準を使用して正規化されてもよい。この複数の対象は、例えば、少なくとも２人、又は少なくとも３人、又は少なくとも４人、又は少なくとも５人、又は少なくとも１０人の対象、又は少なくとも１００人の対象を含んでもよく、又はそれらであってもよい。従って、例えば、単独の人の生体試料から得ることができる標準よりも再現性がありかつ／又は均一である標準を得ることが可能であってもよい。
大規模対照標準を使用してデータが正規化されてもよい。新しい対照標準が以前の対照標準と比較されて、長い時間枠にわたる試料の比較が可能にされてもよい。異なる重複対照標準が、例えば３つ以上の実験において測定されて、値を確実に比較するのに充分な値を有するようにしてもよい。例えば、これは、例えば４人以上の個体由来のＰＢＭＣの混合調製物を提供することによって行われてもよい。これらの標準は、各アリコートが１回の実験に充分であるように、分注（アリコート化）され凍結されてもよい。各試験又は実験について、新しいアリコートが使用されてもよい。これは、標準が各実験について同じ又は類似の品質であることを確実にしてもよい。新しい標準が作製されると、その標準は、例えば、対照培地及びリポタンパク質枯渇培地での処理の後のＬＤＬ取り込み及び脂質滴存在量を定量化することによって、以前の対照標準と比較されてもよい。細胞のバックグラウンドも定量化されてもよい。例えば、バックグラウンド、ＬＤＬ取り込み及び脂質滴存在量に関して以前の標準と類似している標準のみが、今後の実験のための適切な標準として考慮されてもよい。実験結果の長期比較可能性のために、ある標準から得られた結果を異なる標準を用いて得られた結果と比較することが有益であってもよい。それゆえ、実験上のばらつきによる影響を低減するために、複数の実験において異なる標準が測定されてもよい。
当該方法は、対象における高コレステロール血症を予防又は治療するために、脂質低下療法に応答する可能性が低い対象に治療を施し、これにより対象を治療することをさらに含んでもよい。治療は、スタチン、エゼチミブ、エビナクマブ、ベンペド酸、及び／若しくはＰＣＳＫ９阻害剤の投与を含んでもよく、又はそれらの投与であってもよい。一実施形態では、対象は、スタチン療法に応答する可能性が低い。
治療は、スタチン、エゼチミブ、エビナクマブ、ベンペド酸、及び／若しくはＰＣＳＫ９阻害剤の投与を含んでもよく、又はそれらの投与であってもよい。治療は、例えば、併用治療、例えば、スタチン及びエゼチミブを含む併用治療、又はスタチン及びＰＣＳＫ９阻害剤を含む併用治療の投与を含んでもよく、又はそれらの投与であってもよい。この治療は、対象が応答する可能性が低い脂質低下療法とは異なっていてもよい。例えば、対象が、スタチン治療に応答する可能性が低いと判断されている場合（対象は、生体試料が対象から得られるか又は得られた時点で、スタチン療法等の脂質低下療法をすでに受けていてもよくまだ受けていなくてもよい）、治療は、例えば、スタチン及びエゼチミブを含む併用治療、又はスタチン及びＰＣＳＫ９阻害剤を含む併用治療の投与を含んでもよく、又はそれらの投与であってもよい。他の可能な併用治療が、将来企図又は開発される可能性がある。
対象が脂質低下療法を受けている（すなわち、対象は、生体試料が対象から得られるか又は得られた時点で脂質低下療法を受けていてもよく、又は受けたことがある）実施形態では、治療は併用治療であってよく、すなわち、治療は追加の脂質低下療法を含んでもよく、又は追加の脂質低下療法であってもよい。その場合、追加の脂質低下治療は、対象がすでに受けている脂質低下療法とは異なる治療及び／又は対象がすでに受けている脂質低下療法に対する追加の治療であってもよい。
当該方法によって得られる結果は他の尺度と組み合わされて、対象が脂質低下療法に応答する可能性、並びに／又は対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクがあるかの判定が改善されてもよい。
当該方法は、細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、ＬＤＬＲの発現の定量値、脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は脂質動員能力の定量値に基づいてリスクスコアを計算することをさらに含んでもよい。
様々な他の特徴、尺度又は値が、リスクスコアの計算に含まれてもよい。このような他の特徴、尺度又は値は、例えば、以下のうちの１つ以上を含んでもよい：年齢、性別、食習慣、身体的測定値、例えば、肥満度指数（ＢＭＩ）、股関節周囲（ヒップ周り）、腰周囲、血液代謝産物、循環リポタンパク質濃度、遺伝的危険因子、家族歴及び／又は以前の病歴。このような他の特徴、尺度又は値は、生体試料が対象から得られる前、得られるのと同時に、又は得られた後に決定されてもよい。当業者が理解するように、特徴、尺度又は値のいくつかは、例えば質問表を使用して収集された情報、又は以前に収集された臨床データであってもよい。特徴、尺度又は値のいくつかは、生化学的若しくは臨床診断的測定及び／又は医学的診断によって決定されてもよい（又は決定されたものであってもよい）。
当該方法は、アテローム性動脈硬化症及び／若しくは血管疾患若しくはそのリスクに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーに基づいて、対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクがあるか否かを判定することをさらに含んでもよく、かつ／又は当該方法は、アテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患若しくはそのリスクに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在に基づいて、並びに細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、ＬＤＬＲの発現の定量値、脂質貯蔵能力の定量値、及び／若しくは脂質動員能力の定量値に基づいてリスクスコアを計算することをさらに含む。遺伝子分析、すなわち少なくとも１つの遺伝子マーカーの使用は、対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクがあるか否かの判定を改善してもよい。
一実施形態では、当該方法は、アテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患又はそのリスクに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在に基づいて、並びに細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、及び脂質動員能力の定量値に基づいて、リスクスコアを計算することを含む。リスクスコアは、少なくともいくつかの実施形態では、多遺伝子リスクスコアであってもよい。本明細書の文脈において、略語「ＧＲＳ」は、遺伝的リスクスコアを指すものとして理解されてもよい。
心血管疾患若しくはそのリスクに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカー、又はリスクスコアは、例えば、家族性高コレステロール血症のマーカー、ＬＤＬ受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）における変異、アポリポタンパク質Ｂ遺伝子（ＡＰＯＢ）における変異、ＬＤＬＲＡＰ１（低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１、ＡＲＨ）における変異、プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型遺伝子（ＰＣＳＫ９）における変異、並びに／又は多遺伝子リスクスコア、例えばＬＤＬ－ＧＲＳ、高トリグリセリド血症についてのＧＲＳ、及び／若しくは心血管疾患についてのＧＲＳを含んでもよいし、又はそれらであってもよい。
標識ＬＤＬ粒子の混合物を含む組成物も開示される。この混合物中のＬＤＬ粒子は、複数の個々の対象から得ることができてもよく、当該組成物は、標識の前又は後にこの組成物及び／又はＬＤＬ粒子を急速凍結することによって保存されてもよい。言い換えれば、当該組成物は、標識の前又は後に、急速凍結によってその組成物及び／又はＬＤＬ粒子を保存することによって得ることができてもよい。これは、ＬＤＬ粒子の凍結保存と称されてもよい。当該組成物の文脈において、ＬＤＬ粒子は、本明細書に記載される１つ以上の実施形態に係るいずれのＬＤＬ粒子であってもよい。
例えば、複数の個々の対象の血漿試料から得ることができるＬＤＬ粒子は、例えば標識のためにプールされる前に、最初に品質チェックされてもよい。例えば、目視検査及び／又はリポタンパク質濃度の定量などに基づいて非常に高い脂質含有量を有する試料からのＬＤＬ粒子は、上記混合物から除外されてもよい。これは、そのようなＬＤＬ粒子が必ずしも良好に機能しない可能性があるためである。
当該方法は、上記組成物を使用して細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値を正規化することを含んでもよい。
これより様々な実施形態を詳細に参照する。その例は添付の図面に示されている。
以下の説明は、当業者が本開示に基づいて実施形態を利用することができる程度に詳細にいくつかの実施形態を開示する。多くの工程又は特徴が本明細書に基づいて当業者に明白となるであろうから、実施形態のすべての工程又は特徴が詳細に論じられるわけではない。
実施例１
以下の様々な略語及び頭字語を、以下の実施例において使用する。
Ａｐｏ－Ｂ：アポリポタンパク質－Ｂ；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＥＢＶ：エプスタイン・バーウイルス；ＣＩ：信頼区間；ＤＡＰＩ：ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＤｉＩ：１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＦＢＳ：ウシ胎仔血清、ＦＨ：家族性高コレステロール血症；ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸；ＬＤ：脂質滴；ＬＤＬ：低密度リポタンパク質；ＬＤＬ－ＧＲＳ：ＬＤＬ遺伝的リスクスコア；ＬＤＬＲ：低密度リポタンパク質受容体；ＣＶＤ：心血管疾患；ＬＰＤＳ：リポタンパク質欠損血清；ＰＢＭＣ：末梢血単核球；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ＰＣＳＫ９：プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型；ＰＤＬ：ポリ－Ｄ－リシン；ＶＬＤＬ：超低密度リポタンパク質。
材料：リポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ）は、ウシ胎児血清から超遠心分離により得た（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８３；９８：２４１－２６０）。ＤｉＩ－ＬＤＬについては、ヒト血漿試料由来の新鮮なＬＤＬをまず密度遠心分離によって調製し（Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ（フィンランド赤十字社）認可３９／２０１６）（Ｓｔｅｐｈａｎ及びＹｕｒａｃｈｅｋ、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． １９９３；３４：３２５－３３０）、次いで１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチル－インドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）で標識した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １９８５；１２１：２００－２１１）。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ポリ－Ｄリジン（ＰＤＬ）及びＨｉｓｔｏｐａｃｑｕｅ ＰｒｅｍｉｕｍはＳｉｇｍａ（シグマ）から入手した。ＤｉＩ、抗マウスＡｌｅｘａ ５６８、ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ及びＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ ＧｒｅｅｎはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー）から入手した。マウス抗ＬＤＬＲ（クローン４７２４１３）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アールアンドディ・システムズ）から得た。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び血液試料：Ｈｅ－ＦＨ患者は、男性メタボリックシンドローム研究において特定し（Ｌａａｋｓｏら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２０１７；５８：４８１－４９３）、血液試料は、ヒトが関与する実験に関するヘルシンキ宣言に従って患者の経過観察（フォローアップ）中に得た。ＰＢＭＣ及びＥＢＶリンパ芽球細胞試料を得た２人のＨｅ－ＦＨ患者（Ｃｙｓ３２５Ｔｙｒ及びＳｅｒ５８０Ｐｈｅ）は以前に記載されている（Ｒｏｍａｎｏら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２０１１；５２：２０９５－２１００）。フィンランド人集団調査、ＦＩＮＲＩＳＫ ２０１２からのＰＢＭＣ試料、及びドナー関連データ（遺伝子型を含む）をＴＨＬ Ｂｉｏｂａｎｋ（ＴＨＬバイオバンク）（ｗｗｗ．ｔｈｌ．ｆｉ／ｂｉｏｂａｎｋ）から入手し、Ｂｉｏｂａｎｋ契約番号（２０１６＿１５、２０１６＿１１７及び２０１８＿１５）の下で使用した。バイオバンクからの上昇したＬＤＬレベル（ＬＤＬ＞５ｍＭ）を有するドナー及び正常コレステロール血（ＬＤＬ２．０～２．５ｍＭ）試験群のドナーは、年齢、性別及びＢＭＩをマッチさせた。いずれの群のドナーも、サンプリング時までにコレステロール低下薬物治療を受けず、食事摂取頻度調査票に基づくと、飽和脂肪又はトランス脂肪として高い割合のエネルギー摂取を受けなかった。健康な血液ドナーからのバフィーコート試料は、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ（認可３９２０１６）から得た。
細胞培養：対照ＥＢＶリンパ芽球（ＧＭ１４６６４）はＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（コーリエル細胞集積所）から入手し、１５％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（各１００Ｕ／ｍｌ）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。ＥＢＶリンパ芽球の連続培養のために、３×１０６個の細胞を週１回５ｍｌの新鮮な培地に移した。単回使用凍結保存ＥＢＶリンパ芽球アリコートを実験に使用した。細胞を７０％ＰＢＭＣ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１ｍＭ ＨＥＰＥＳ）、２０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。
ＰＢＭＣ単離：血液試料又はバフィーコート試料を、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ－Ｅ）と１：１で混合した。この血液混合物をＨｉｓｔｏｐａｃｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（１．００７３、単核細胞用）上で穏やかに層状にし、４００ｇで４０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ細胞層を取り出し、新しい１５ｍｌの反応チューブに移し、ＰＢＳ－Ｅと混合した。細胞を４００ｇで１０分間遠心分離し、２ｍｌの赤血球溶解緩衝液中で１分間インキュベートした（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）。１０ｍｌのＰＢＳ－Ｅを添加し、細胞をペレット化し、ＰＢＳ－Ｅで洗浄した。次いで、細胞を５ｍｌのＰＢＭＣ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に再懸濁し、計数し、ペレット化し、凍結培地（７０％ＰＢＭＣ培地、２０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁し、液体窒素中で凍結保存した。
細胞処理、ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み、イメージングプレートへの移動及び固定：凍結保存したＥＢＶリンパ芽球又はＰＢＭＣをＰＢＭＣ培地中で解凍し、４００ｇで１０分間遠心分離した。この細胞をＰＢＭＣ培地に再懸濁し、ＦＢＳ（１０％最終濃度）又はＬＰＤＳ（５％最終濃度）を含有する９６ウェルプレートのウェルに移し、２４時間インキュベートした。ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込み実験については、３０μｇ／ｍｌのＤｉＩ－ＬＤＬを３７℃で１時間添加した。その後、細胞をコニカル９６ウェルプレートに移し、４００ｇで１０分間遠心分離した。ロボットプラットフォーム（Ｏｐｅｎｔｒｏｎｓ（オープントロンズ）、ニューヨーク、米国）を用いて培地を除去し、細胞をＰＢＭＣ培地に再懸濁した。細胞を遠心分離し、自動的にＰＢＭＣ培地に再懸濁し、ＰＤＬコーティングした３８４ウェルハイコンテントイメージングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））に移した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１００μＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４中の４％パラホルムアルデヒドで自動的に固定し、ＰＢＳで洗浄した。脂質滴及びＬＤＬＲ表面染色については、細胞をＰＤＬコーティングした３８４ウェルハイコンテントプレートに直接移し、接着させ、自動的に固定し、ＰＢＳで洗浄した。
脂質滴分析：細胞を、以前に記載されたように（Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１７；８：１４８５８）処理したが、以下の変更を加えた：固定した細胞試料を１μｇ／ｍｌのＬＤ５４０（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（プリンストン・バイオモレキュラー・リサーチ））及び５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで自動的に染色した。光学スライスの３Ｄスタックを、ＮＡ ０．７５及び１．５ズームで４０×Ｐｌａｎｆｌｕｏｒ対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ（ニコン） Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ倒立顕微鏡、又は６３×水浸対物レンズ、ＮＡ１．１５を備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（パーキンエルマー） Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントイメージングシステムのいずれかを用いて自動的に取得した。画像スタックは、Ｈｕｙｇｅｎｓソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ｂ．ｖ．（サイエンティフィック・ボリューム・イメージング））又はオープンソースツールＰＳＦジェネレータ及びデコンボリューションラボ（ＰＳＦ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ａｎｄ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｌａｂ）に基づくカスタムメイドのＰｙｔｈｏｎツールのいずれかを用いて自動的にデコンボリューションした。カスタムＰｙｔｈｏｎツールを用いてデコンボリューションされた画像スタックから最大強度投影を行った。これらのツールは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｏｐａａｖｏｌ／Ｏｐｕｔｉｌｓ介してアクセスすることができる。脂質滴の自動定量化を、以前に記載されたように（Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１７；８：１４８５８；Ｓａｌｏら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ２０１９；５０：４７８－４９３．ｅ９；Ｖａｎｈａｒａｎｔａら、Ｔｒａｆｆｉｃ．２０２０；２１：３８６－３９７）行った。脂質滴数を、各イメージングプレートに含まれる２つの対照標準の平均に対して正規化した。
ＬＤＬＲ表面染色：染色手順はすべて自動的に行った。固定した細胞を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで１５分間クエンチし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をブロック溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）とともに１０分間インキュベートし、続いてブロック溶液中のマウス抗ＬＤＬＲで６０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体溶液（抗マウス－Ａｌｅｘａ ５６８、ＤＡＰＩ ５μｇ／ｍｌ及びＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｇｒｅｅｎ染色液０．２５μｇ／ｍｌ）とともに室温で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４０×水浸対物レンズ、ＮＡ１．１を備えたＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントイメージングシステムを使用して、ＤＡＰＩ（核）、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｇｒｅｅｎ（細胞質）、Ａｌｅｘａ ５６８（ＬＤＬＲ表面）及びＡｌｅｘａ ６４０（バックグラウンド）チャネルについて光学スライスの３Ｄスタックを取得した。カスタムビルドＰｙｔｈｏｎデコンボリューションツールを用いてＬＤＬＲ表面及びバックグラウンド画像を自動的にデコンボリューションし、最大強度投影を行った。得られた画像をＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｋａｍｅｎｔｓｋｙら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１１；２７：１１７９－１１８０）で自動的に分析した。各個々の細胞についてＬＤＬＲ表面強度をバックグラウンド除去し、各イメージングプレートに含まれる２つの標準から平均ＬＤＬＲ表面強度を減算することによって正規化した。
ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みの定量化：ＤｉＩ－ＬＤＬ標識し及び固定した細胞（細胞処理の節を参照）を、ロボットプラットフォーム（Ｏｐｅｎｔｒｏｎｓ）で自動的に処理した。細胞を５μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ及び０．５μｇ／ｍｌ ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄで染色し、３つのチャネル、ＤＡＰＩ（核）、ＤｉＩ－ＬＤＬ及びＣｅｌｌＭａｓｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（細胞質）の画像スタックを取得した。自動顕微鏡検査及びＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒによる単細胞定量を、ＬＤＬＲ表面染色の節に記載したように行った。複数の患者からＤｉＩ－ＬＤＬ標識ＰＢＭＣを洗浄し移すためのロボットワークフローは、イメージングプレートの個々のカラムについて定められたＤｉＩ－ＬＤＬ強度レベルをもたらし、これを標準を用いて決定し、プレート正規化と組み合わせて、平均細胞ＤｉＩ－ＬＤＬ強度及びＤｉＩ－ＬＤＬオルガネラ数を実験ごとに比較可能にした。
ＬＤＬ遺伝的リスクスコア：ＬＤＬ ＧＲＳは、Ｔａｌｍｕｄらによる以前に公開されたＧＲＳ及び５６９４５試料を用いた欧州ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）メタ分析（Ｔａｌｍｕｄら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ． ２０１３；３８１：１２９３－１３０１；Ｖｉｌｈｊａｌｍｓｓｏｎら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ２０１５；９７：５７６－５９２）の両方に基づいてＬＤｐｒｅｄ法を使用して計算した。ＬＤＬ取り込み及び脂質動員パラメータを０～１の範囲に正規化して、取り込みスコア及び動員スコアを生成した。ハイブリッドスコアは、ＬＤＬ－ＧＲＳ並びに取り込み及び／又は動員スコアの平均を表す。
データ分析：Ｐｙｔｈｏｎ（Ｐｙｔｈｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｐｙｔｈｏｎ（パイソン）ソフトウェア財団）、ｗｗｗ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ）をＰａｎｄａｓ（パンダス）パッケージ（Ｐａｎｄａｓ．ｐｙｄａｔａ．ｏｒｇ）とともに使用して、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒから得た単細胞データを分析した。１１５μｍ２未満の細胞質面積を有する細胞をリンパ球として分類し、１１５μｍ２を超える面積を有する細胞を単球として分類した。統計的有意性は、独立した試料について両側ｐ値を計算する「ｔｔｅｓｔ＿ｉｎｄｅ」関数を使用してＳｃｉＰｙ（サイパイ）（ＳｃｉＰｙ．ｏｒｇ）で評価した。データ可視化は、Ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ（マットプロットリブ）（Ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ．ｏｒｇ）及びＳｅａｂｏｒｎ（シーボーン）（Ｓｅａｂｏｒｎ．ｐｙｄａｔａ．ｏｒｇ）を用いて行った。
実施例２
初代ヒト細胞における高コレステロール血症関連機能欠陥の多重定量化のための自動パイプライン
自動分析パイプラインを設定して、２００万未満の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（２～４ｍｌの血液）から、異なる条件下で、ＬＤＬ取り込み、ＬＤＬＲ表面発現及び脂質貯蔵をスケーラブルかつロバストな様式で定量化した（図１Ａ）。重要な要件は、高感度、柔軟性、低コスト、及び高レベルの自動化であった。これらは、実験を９６及び３８４ウェルプレートに移し、細胞染色のための自動液体処理システムを使用し、ハイコンテントイメージングとそれに続く自動画像及びデータ分析を採用することによって達成された（図１Ａ）。凍結保存したＰＢＭＣを分析に利用した。細胞を９６ウェルプレートに回収し、完全培地（１０％ＦＢＳ）又はリポタンパク質飢餓培地（５％ＬＰＤＳ）中で２４時間インキュベートし、続いて自動試料調製及びイメージングを行った。異なる実験からの定量値を比較するために、正規化のために２つの標準を含めた。各標準は、４人の健康な血液ドナーからの大規模ＰＢＭＣ単離物の混合物であり、細胞を、１回使用アリコートについて定められた細胞密度で凍結保存した。
この自動分析パイプラインは、異なる白血球集団の同時定量化を可能にする（図８Ａ～Ｃ）。コーティングされたイメージングプレートへの細胞接着後、リンパ球は、ＣＤ３表面染色で可視化したところでは、小さいままである（図８Ａ、Ｂ）。単球は広がり、拡大した細胞質領域をもたらす（図８Ａ、Ｃ）。これは、サイズに基づく２つの細胞集団の識別を可能にする（図１Ｂ、図８Ａ～Ｃ）。第１のＬＤＬ取り込みをリンパ球及び単球の集団において比較した（図１Ｂ、Ｃ）。完全培地（１０％ＦＢＳ）において、単球及びリンパ球のＬＤＬ取り込みは同等であった。リポタンパク質飢餓（５％ＬＰＤＳ）は、予想通りＬＤＬ取り込みを増加させたが、ＤｉＩ－ＬＤＬ強度の増加は単球においてはるかに顕著であった（図１Ｃ）。この効果は、ＤｉＩ－ＬＤＬ陽性オルガネラの数を定量化する場合にも観察された（図８Ｄ）。重要なことに、ＤｉＩ－ＬＤＬの取り込みは、過剰の非標識ＬＤＬを添加することによってリンパ球及び単球において可逆的であり（図８Ｅ）、これは飽和可能な受容体媒介機構を支持している。
初代血液細胞における低いシグナル強度に起因して、エプスタイン・バーウイルスで不死化したリンパ球（ＥＢＶリンパ芽球）は、ＬＤＬ取り込み研究のための好ましい選択であることが多い。それゆえ、ＬＤＬ取り込みをＥＢＶリンパ芽球及び初代単球において比較した（図１Ｄ）。リポタンパク質飢餓後のシグナル強度は、細胞型間でほぼ同様であった（図１Ｅ）。しかしながら、単球は、完全培地中でより低いＤｉＩ－ＬＤＬ強度を示し、これは、ＥＢＶリンパ芽球と比較して、リポタンパク質飢餓時のＬＤＬ取り込みのより有効な刺激を意味した（図１Ｅ）。これらの細胞をさらに精査するために、ＥＢＶリンパ芽球及びＰＢＭＣの試料の両方が入手可能なＨｅ－ＦＨ患者試料を分析した（図１Ｆ、Ｇ）。Ｈｅ－ＦＨ患者のＥＢＶリンパ芽球では、ＤｉＩ－ＬＤＬ強度は対照と比較して減少したが、その低下は初代単球よりも明らかでなかった（図８Ｆ）。全体として、確立したパイプラインは、白血球におけるＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みの信頼できる定量化を提供し、単球は、分析のためにリンパ球又はＥＢＶリンパ芽球よりも適している。
実施例３
同じＬＤＬＲ変異を有するＨｅ－ＦＨ患者における不均質なＬＤＬ取り込み及びＬＤＬＲ表面発現
次に、上記分析パイプラインを使用して、男性メタボリックシンドローム（ＭＥＴＳＩＭ）コホート研究からの２１人のＦＨ患者を特徴付けた。被験者は、９つの異なるＬＤＬＲ変異体を含み、そのうちＰｒｏ３０９Ｌｙｓｆｓ＊（ＦＨ Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ）、Ｇｌｕ６２６Ａｌａ、及びＡｒｇ５９５Ｇｌｎ（ＦＨ Ｐｏｇｏｓｔａ）がいくつかの患者において観察され、Ｈｉｓ２０３Ｔｙｒは新規ＬＤＬＲ変異体を表す（図２Ａ）。１４人の患者がスタチン療法を受けていた（図２Ｂ、黒丸）。第１のＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みを、リポタンパク質飢餓後の単球において定量した。予想外に、ＬＤＬ取り込みは、同一のＬＤＬＲ変異体を有する個体で実質的に異なっていた（図２Ｂ）。これは、切断型ＬＤＬ受容体を生成するＮｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ ＬＤＬＲ変異体について最も顕著であった（図２Ａ）。重要なことに、ＬＤＬ取り込み率は、これらの個体のＬＤＬＲ表面発現と一致していた（図２Ｃ）。このことは、調節機構が、影響を受けていないＬＤＬＲ対立遺伝子の発現を増強し、かつ／又はコードされたタンパク質を安定化する可能性があることを示唆している。興味深いことに、ＦＨ－Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ ＬＤＬＲ変異体についてのＤｉＩ－ＬＤＬ強度の中央値は、Ｇｌｕ６２６Ａｌａ及びＦＨ－Ｐｏｇｏｓｔａ変異体と比較して低かった（図２Ｄ）。これは、ＦＨ Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ患者の血中ＬＤＬ濃度がＦＨ Ｐｏｇｏｓｔａ患者よりも高いことと一致している。全体として、ＬＤＬＲ表面発現とリポタンパク質飢餓後の細胞ＬＤＬ取り込みとの有意な相関があり（図２Ｅ）、これにより、より高いＬＤＬＲ表面提示がＬＤＬ取り込みの重要な決定因子であることが確認された。より高い単球ＬＤＬ取り込みは、より低い血中ＬＤＬレベルと相関する傾向があった（図２Ｆ）。この相関は、スタチンレシピエントのみを分析した場合に非常に有意になった（図２Ｇ）。
実施例４
正常又は上昇した血中ＬＤＬを有する非ＦＨ個体におけるＬＤＬ内部移行の評価
大多数の高コレステロール血症患者は、ＦＨ対立遺伝子を保有しない。それゆえ、上昇したＬＤＬレベル（血中ＬＤＬ＞５ｍＭ）を有する２０人のバイオバンクドナー（Ｈ－Ｃｈｏｌ）及び正常ＬＤＬレベル（血中ＬＤＬ２～２．５ｍＭ）を有する１９人のバイオバンクドナー（Ｎ－Ｃｈｏｌ）由来のＰＢＭＣにおいて細胞ＬＤＬ取り込みを調べた。ＤＮＡ配列決定により、共通のフィンランドＬＤＬＲ（Ｆｉｎｎｉｓｈ ＬＤＬＲ）変異体が被験者間に存在しないことが確認された。しかしながら、高血中ＬＤＬ濃度の遺伝的リスクスコア（ＬＤＬ－ＧＲＳ）（Ｒｉｐａｔｔｉら、Ｃｉｒｃ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｃｉｓ Ｍｅｄ． ２０２０；１３：ｅ００２７２５）は、Ｈ－Ｃｈｏｌ群において増加した（図３Ａ）。
Ｎ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌの個体のリポタンパク質飢餓後に単球ＤｉＩ－ＬＤＬ強度を定量し（図３Ｂ）、ＬＤＬ取り込みの大きい変動を観察したが、Ｎ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌの群の間では全体的に有意差はなかった（図３Ｃ）。両方の群は著しく低下したＬＤＬ内部移行を有するヒトを含んでおり（図３Ｂ）、最も低いＬＤＬ取り込み値はＨＣｈｏｌ個体において見られた。全体として、リポタンパク質飢餓後の単球ＬＤＬ取り込みは、血中ＬＤＬとの負の相関を示さなかった（データは示さず）。しかしながら、低いＬＤＬ取り込みはＨ－Ｃｈｏｌサブグループにおける血中ＬＤＬレベルの上昇と相関していた。これは、たとえこの相関が非常に高い血中ＬＤＬ濃度を有する一人の個体に依存したとしても、である（データ示さず）。
Ｎ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌの個体における不均質なＬＤＬ取り込み応答に潜在的に影響を及ぼすさらなる因子を調査するために、肥満について利用可能な２つの指標、肥満度指数（ＢＭＩ）及び股関節周囲の相関を行った。顕著なことに、股関節周囲の増加はＬＤＬ取り込みの減少と相関し（図３Ｄ）、同様の傾向がＢＭＩについて観察された（データは示さず）。
血液ドナー標準と比較すると、バイオバンクドナー由来の細胞は、リポタンパク質飢餓後に平均で３０％低いＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みを示した（図３Ｅ）。興味深いことに、この差は、ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みを、ＬＤＬＲが下方制御される完全培地（１０％ＦＢＳ）中で測定した場合には観察されなかった（図３Ｅ）。これは、バイオバンクドナー由来の細胞において、ＬＤＬＲがベースラインレベルで発現されるとき、最大ＬＤＬ取り込み能の欠陥がマスクされることを示唆する。
実施例５
単球における細胞の脂質貯蔵及び脂質動員の評価
細胞は、細胞内脂質滴（ＬＤ）中に過剰の脂質を貯蔵する。細胞が利用可能な充分な脂質を有する場合、細胞はリポタンパク質を取り込みにくいことが推論された。それゆえ、細胞ＬＤの定量を分析パイプラインに含め、システムを標準試料で検証した。完全培地（１０％ＦＢＳ）において、単球はリンパ球よりも多くのＬＤを示した（図４Ａ、Ｂ）。
リポタンパク質枯渇培地（５％ＬＰＤＳ）中での２４時間のインキュベーションは、両方の細胞集団におけるＬＤの数の有意な減少をもたらし、単球においてより顕著な減少があった（図４Ｂ）。同様に、ＬＤ面積は減少し、これは、ＬＤ数の減少が、より大きいＬＤを形成することによって補償されなかったことを示す（データは示さず）。注目すべきことに、完全培地中のＬＤの数は循環ＬＤＬレベルと相関せず、これは、インビトロでの白血球中の脂質貯蔵が単離前の循環ＬＤＬへの細胞曝露によって決定されないことを示唆した（データは示さず）。
次に、貯蔵された脂質を利用する細胞能力を測定するための脂質動員アッセイを確立した。脂質動員は、完全培地対リポタンパク質枯渇培地におけるＬＤ数の倍数差として定義した（図４Ｃ）。第１に、脂質動員は、リンパ球よりも単球において高かった（図４Ｄ）。これは、単球がリポタンパク質飢餓時にＬＤＬ内部移行のより大きい増加を示す（図１Ｃ）理由を説明するかもしれない。第２に、ＥＢＶリンパ芽球及び初代単球を比較した。標準からの単球は約３～５の脂質動員スコアを示したが、ＥＢＶリンパ芽球は１の値を記録した（図４Ｅ）。これは、２４時間のリポタンパク質飢餓の間の脂質動員が、ＥＢＶリンパ芽球において著しく低減されることを示す。実際、ＥＢＶリンパ芽球は、完全培地中で１０倍多いＬＤを含有し、ＬＤ数及び総ＬＤ面積は、リポタンパク質飢餓時にわずかにしか減少しなかった（図４Ｆ）。従って、単球は、ＬＤＬ取り込みを分析するためだけでなく、脂質動員を定量するためにもリンパ球及びＥＢＶリンパ芽球よりも優れている。
実施例６
脂質動員は、高コレステロール血症患者において低下し、ＬＤＬ取り込みと相関する
Ｈｅ－ＦＨ患者の単球において、脂質動員は、標準と比較して、ＬＤＬＲ変異体Ｎｏｒｔｈ Ｋａｒｅｌｉａ及びＧｌｕ６２６Ａｌａを発現する細胞において有意に減少した（図４Ｇ）。特有のＬＤＬＲ変異体を発現する細胞も、Ａｓｐ２６６Ａｓｎ及びＡｓｐ３６２Ａｌａ変異体を除いて、脂質動員の低下を示した（図４Ｇ）。これらのデータは、欠陥のあるＬＤＬＲ機能が脂質動員の低下と関連することが多いということを示唆している。
次いで、Ｎ－Ｃｈｏｌ及びＨ－Ｃｈｏｌのバイオバンクドナー由来の細胞が脂質動員の差を示すか否かを調べた。ＬＤＬ取り込みと同様に、両方のサブグループにおいて脂質動員の大きい変動が観察された（図５Ａ）。興味深いことに、群として、Ｈ－Ｃｈｏｌ個体は、Ｎ－Ｃｈｏｌ被験者と比較して有意に低い脂質動員率を示した（図５Ａ、Ｂ）。
これは、脂質動員がバイオバンクドナーにおけるＬＤＬ取り込み能と相関するか否かの精査を促した。より高い脂質動員を有する個体はより高いＬＤＬ内部移行も示したことが観察された（図５Ｃ）。さらに、脂質動員の低下は、より高い血漿ＬＤＬ濃度と相関した（図５Ｄ）。注目すべきことに、肥満指標は脂質動員と負に相関した（図５Ｅ）。まとめると、これらのデータは、高コレステロール血症の発症におけるＬＤＬ取り込みと脂質動員との相互関係について言及している。
実施例７
遺伝的細胞データ及び機能的細胞データのハイブリッドスコアは循環ＬＤＬとの相関を改善する
ＦＩＮＲＩＳＫ集団コホートのＨ－Ｃｈｏｌバイオバンクドナーは、増加したＬＤＬ－ＧＲＳ（図３Ａ）を示し、ＬＤＬ－ＧＲＳは血中ＬＤＬ濃度と相関した（図６Ａ）。注目すべきことに、ＬＤＬ－ＧＲＳは、リポタンパク質飢餓後のＬＤＬ取り込みと相関せず（データは示さず）、これは、ＬＤＬ－ＧＲＳ及び細胞ＬＤＬ取り込みが少なくとも部分的に異なるプロセスをモニターすることを示唆した。興味深いことに、ＬＤＬ－ＧＲＳと単球ＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みとを組み合わせて新規ハイブリッドスコアとすることは、血中ＬＤＬ濃度との相関を改善した（図６Ｂ）。ＬＤＬ取り込みと同様に、脂質動員はＬＤＬ－ＧＲＳと相関しなかった（データは示さず）。しかしながら、脂質動員とＬＤＬ－ＧＲＳとの組み合わせは、血中ＬＤＬとの相関を劇的に改善した（図６Ｃ）。
最後に、ＬＤＬ－ＧＲＳ、脂質動員及びＬＤＬ取り込みの三重ハイブリッドスコアは、血中ＬＤＬレベルとの最良の相関を示した（図６Ｄ）。
これらの例では、確立した多重化ハイコンテント分析パイプラインは、自動ワークフローにおいて細胞ＬＤＬ取り込みの分析及び細胞脂質貯蔵の定量化を統合する。これは、患者の白血球におけるＬＤＬ取り込みを定量化するために現在使用されているフローサイトメトリーに基づくアッセイに勝るいくつかの利点を提供する。１）コーティングされた表面への細胞の固定化は、細胞凝集を防止し、試料保存後の画像取得並びにリンパ球及び単球の集団の直接的な検出を可能にする。２）細胞染色手順は、容易に自動化することができる。３）必要とされる細胞は少なく、４）細胞レベル下の分解能は脂質滴及び内部移行ＬＤＬ粒子の定量化を可能にする。
線維芽細胞、リンパ球及びＥＢＶリンパ芽球は、ＬＤＬ取り込みアッセイのために選択される細胞型とみなされることが多い。本明細書では、単球は、ＥＢＶリンパ芽球よりも大きい検出窓を提供し、初代リンパ球の約２倍の高さのＤｉＩ－ＬＤＬ取り込みシグナル強度をもたらすことができるということが示される。さらには、単球は、リポタンパク質枯渇時の細胞内の脂質貯蔵及び脂質動員の定量化により適していることが見出された。
本実施例において、３１０を超える条件（アッセイ及び処理の組み合わせ）を６２の患者試料について分析した。処理速度は、各ＰＢＭＣ試料に対して実施されるアッセイ及び処理の数に依存する。自動パイプラインの現在の段階では、自動パイプラインは、１人の人によって操作されるとき、１２０の条件（例えば、２つのアッセイ及び２つの処理を用いた３０個のＰＢＭＣ試料）が３日で分析されることを可能にする。このスループットは、より多くの液体処理システムをパイプラインに追加し、画像処理のためのコンピューティングリソースを増加させることによって、大幅に増加させることができる。
脂質貯蔵の変化した調節が細胞ＬＤＬ取り込み及び循環ＬＤＬレベルにどのように影響を及ぼし得るかを調べるために、脂質動員アッセイを確立した。興味深いことに、脂質動員は、細胞ＬＤＬ取り込みよりも血中ＬＤＬ濃度との良好な相関を提供した。
それゆえ、脂質動員の定量化は、高コレステロール血症のリスクがある個体を特定するためのさらなる手段を提供する可能性がある。さらには、脂質動員とＬＤＬ取り込みとの相互関係は、高コレステロール血症の根底にある原因を解明するために複数の読み出し値を組み合わせることの付加価値を強調する。このアプローチは、代謝変化によって影響を受ける頻繁な障害である家族性複合型高脂血症の根底にある細胞機構へのより深い洞察も提供する可能性がある。肥満は、血中ＬＤＬレベルの上昇及びＣＶＤリスクの増加の素因になることが公知である。上記結果は、機構的レベルにおいて、肥満が細胞ＬＤＬ取り込み及び脂質動員の低下と相関するという証拠を提供する。興味深いことに、臨床試験は、スタチンが肥満個体においてあまり有効でない可能性があることを示す。スタチンがコレステロール合成を遮断し、ＬＤＬ内部移行を増加させることによって作用することを考慮すると、ＬＤＬ取り込み及び脂質動員能の低下は肥満の人におけるスタチンのより低い効力に寄与するという可能性が高い。
今までのところ、高コレステロール血症の臨床管理におけるリスク群を定義するか又は治療決定を導くために細胞パラメータを定量化することの付加価値は、明らかではない。しかしながら、正常な血中ＬＤＬ濃度を有する個体、高コレステロール血症の人、及びさらには同じＬＤＬ変異体を保有するＨｅ－ＦＨ患者において観察された細胞読み出し値の真に高い不均質性は、個別化されたリスク評価及び治療推奨のための新しい可能性を提供する可能性がある。
本研究は、これが実現可能であると思われる２つの状況を強調する。第１に、ＬＤＬ－ＧＲＳをＬＤＬ取り込み及び脂質動員の定量化と組み合わせて新規ハイブリッドスコアとすることが循環ＬＤＬとの相関を改善するということが観察された。とりわけ、高コレステロール血症の臨床症状が顕在化していない若い個体については、そのようなハイブリッドスコアは、高コレステロール血症及びＣＶＤの個別リスク評価を改善する可能性がある。第２に、スタチン治療中のＨｅ－ＦＨ患者について、低単球ＬＤＬ取り込みと高血中ＬＤＬとの有意な相関が見出された。これは、単球ＬＤＬ取り込み能が個体のスタチン応答性の予測を容易にする可能性があることを示唆してもよい。スタチン応答性が低い者については、エゼチミブ又はＰＣＳＫ９阻害剤による併用治療が、血中ＬＤＬ目標レベルを達成するために保証されてもよい。注目すべきことに、スタチン療法に対する応答は非常に不均質であり、冠状動脈性心疾患を有する人々の８０％までは血中ＬＤＬ目標レベルを達成せず、これは、より良い介入戦略が緊急に必要であることを強調する。
要約すると（図７参照）、上記結果は、正常及び上昇した血中ＬＤＬを有する個体並びに同一のＬＤＬＲ変異体を有するＨｅ－ＦＨ患者が、細胞ＬＤＬ取り込み及び脂質動員において高い変動を示すことを明らかにした。脂質動員は、高コレステロール血症患者において有意に減少し、より低いＬＤＬ取り込み能及びより高い血中ＬＤＬと相関した。さらには、ＬＤＬ取り込み及び脂質動員の低下は、肥満指標と相関した。
重要なことに、スタチン療法中のＨｅ－ＦＨ患者における個々のリスク評価及びＬＤＬ取り込みの分析のための遺伝子プラス細胞ベースのハイブリッドスコアの定量化は、高コレステロール血症におけるテーラーメイド医療（個別化医療）の新たな可能性を開く。
技術の進歩とともに、基本的なアイデアが様々な方法で実装されてもよいことが当業者には明らかである。従って、実施形態は、上記の例に限定されず、代わりに、実施形態は特許請求の範囲内で変わってもよい。
上記の実施形態は、互いとのいずれの組み合わせで使用されてもよい。実施形態のうちのいくつかは、さらなる実施形態を形成するようにともに組み合わされてもよい。本明細書に開示される方法、物、システム、又は使用は、本明細書の上記の実施形態のうちの少なくとも１つを含んでもよい。上記の利益及び利点は、１つの実施形態に関連してもよく、又はいくつかの実施形態に関連してもよいことが理解されよう。実施形態は、記載された課題のいずれか又はすべてを解決するもの、又は記載された利益及び利点のいずれか又はすべてを有するものに限定されない。「ある」項目への言及は、１つ以上のそれらの項目を指すことがさらに理解されるであろう。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、本明細書において、１つ以上の追加の特徴又は行為の存在を排除することなく、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの後に続く特徴又は行為を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するために使用される。

Claims (19)

  1. 対象が脂質低下療法に応答する可能性を判定する方法であって、
    前記対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、前記細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、前記細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記細胞の脂質動員能力の定量値を決定する工程
    を含み、
    前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、前記細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記細胞の脂質動員能力の定量値は、前記対象が脂質低下療法に応答する可能性を示す、方法。
  2. 対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクがあるか否かを判定する方法であって、
    前記対象の生体試料から得られた細胞が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む能力の定量値、前記細胞におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）の発現の定量値、前記細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記細胞の脂質動員能力の定量値を決定する工程
    を含み、
    前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記細胞におけるＬＤＬＲの発現の定量値、前記細胞の脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記細胞の脂質動員能力の定量値は、前記対象がアテローム性動脈硬化症及び／若しくは心血管疾患を発症するか又は有するリスクが高い可能性を示す、方法。
  3. 前記方法は、前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値を対照細胞の定量値又は対照値と比較する工程を含み、前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値の減少は、前記対象が脂質低下療法に応答する可能性が低いことを示し、かつ／又は前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値の増加は、前記対象が脂質低下療法に応答する可能性が高いことを示す請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか又は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記細胞は、単球を含むか又は単球である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記対象は高脂血症を有する請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記心血管疾患は、狭心症若しくは心筋梗塞等の冠動脈疾患、脳卒中、心臓発作、脳血管疾患、若しくは末梢動脈疾患のうちの少なくとも１つを含むか、又は狭心症若しくは心筋梗塞等の冠動脈疾患、脳卒中、心臓発作、脳血管疾患、若しくは末梢動脈疾患のうちの少なくとも１つである請求項２から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記脂質低下療法は、スタチン療法、ＰＣＳＫ９阻害剤療法、エゼチミブ療法、エビナクマブ療法、及び／若しくはベンペド酸療法を含むか、又はスタチン療法、ＰＣＳＫ９阻害剤療法、エゼチミブ療法、エビナクマブ療法、及び／若しくはベンペド酸療法である請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記方法は、ハイコンテントイメージングと、それに続く自動画像及びデータ分析を使用して行われる請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記細胞は、表面上に任意選択で単層として固定化される請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記細胞は２つ以上の細胞集団にグループ分けされ、前記細胞集団のうちの少なくとも１つの前記ＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記ＬＤＬＲの発現の定量値、前記脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記脂質動員能力の定量値は、他の細胞集団とは別個に決定される請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記対象の前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は標識ＬＤＬ粒子を使用して決定され、前記ＬＤＬ粒子は、任意選択で蛍光標識又は放射性標識される請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記対象の前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は、急速凍結によって保存されたＬＤＬ粒子を使用して決定される請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記ＬＤＬＲの発現の定量値、前記脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記脂質動員能力の定量値は、複数の対象の生体試料から得ることができる細胞の混合物を含む標準を使用して正規化される請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記方法は、前記心血管疾患又はそのリスクに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーに基づいて、前記対象が前記心血管疾患を発症するか若しくは有するリスクがあるか否かを判定することをさらに含み、かつ／又は前記方法は、前記心血管疾患又はそのリスクに関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在に基づいて、並びに前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記ＬＤＬＲの発現の定量値、前記脂質貯蔵能力の定量値、及び／若しくは前記脂質動員能力の定量値に基づいてリスクスコアを計算することをさらに含む請求項２から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記方法は、ハイコンテントイメージングと、それに続く自動化画像及びデータ分析を使用して行われ、
    前記細胞は、表面上に任意選択で単層として固定化され、
    前記細胞は２つ以上の細胞集団にグループ分けされ、前記細胞集団のうちの少なくとも１つの前記ＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記ＬＤＬＲの発現の定量値、前記脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記脂質動員能力の定量値は、他の細胞集団とは別個に決定され、
    前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値、前記ＬＤＬＲの発現の定量値、前記脂質貯蔵能力の定量値、及び／又は前記脂質動員能力の定量値は、複数の対象の生体試料から得ることができる細胞の混合物を含む標準を使用して正規化される
    請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記対象の前記細胞がＬＤＬを取り込む能力の定量値は、急速凍結によって保存されたＬＤＬ粒子を使用して決定される請求項１６に記載の方法。
  18. 前記細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むか又は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり、前記ＰＢＭＣ細胞は、単球、リンパ球、及び任意選択で他の細胞型にグループ分けされ、前記定量値は、単球、リンパ球、及びいずれかの他の任意選択の細胞集団について別々に決定される請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
  19. 標識ＬＤＬ粒子の混合物を含む組成物であって、前記混合物中の前記ＬＤＬ粒子は、複数の個々の対象から得ることができ、前記組成物は、標識の前又は後に前記組成物及び／又は前記ＬＤＬ粒子を急速凍結することによって保存される、組成物。
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