JP2023550094A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２免疫優性ペプチドの構築物及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本出願は、同定したSARS-COV-2免疫優性ペプチドに対する免疫応答を誘導することによって、COVID-19を、治療するための、及び／又は予防するための、方法及び組成物を、提供する。【選択図】図２

Description

［関連出願の相互参照］
関連出願の相互参照 本出願は2020年11月12日に出願された米国仮出願第63/113,024号の利益を主張し、該出願の全内容は、本明細書にその全体が参考として援用される。
コロナウイルス病2019(COVID-19)は重症急性呼吸器症候群(SARS)-CoV-2(SARS-CoV-2)ウイルスによる感染症によって引き起こされる世界的な流行であり、世界中で50万人以上の生命を奪っており、何百万人もの人々に影響を与えている。SARS-CoV-2はヒトに感染することが知られている第7のコロナウイルスであり; SARS-CoV、MERS-CoV及びSARS-CoV-2は重度の病気を引き起こし得るが、HKU1、NL63、OC43及び229Eは軽度の症状(symptom)と関連する。有効なワクチン及び治療法を開発するには、適応免疫反応がどのようにウイルスを認識し、クリアするか、及びウイルスと免疫システムとの間の相互作用が病気の病態にどのように影響するかを理解する必要がある。現在まで、ほとんどの努力はB細胞媒介性の抗体のウイルスに対する反応に焦点を当ててきたが、どのように細胞傷害性CD8+ T細胞が感染した細胞を認識し、明確にするかについてはあまり理解されていない。
CD8 T細胞は様々な病原体からの防御に重要な役割を果たしており、多くのエビデンスから、これがSARS-CoV-2のケースであることが実証されている。密接に関連するSARS-CoVの研究は、CD8 T細胞がマウスモデルにおいて急性感染中に防御を提供し、記憶CD8 T細胞がヒトにおける急性感染後の体液性反応よりも長く持続することを明らかにしている。SARS-CoV-2感染の間、CD8 T細胞反応の大きさは、より軽度の疾病経過と相関し、防御的役割を示唆する。特に、SARS-CoV-2反応性T細胞は抗ウイルス抗体の非存在下で、無症状でウイルスをクリアしたSARS-CoV-2に曝露された症例において観察されており、さらにT細胞の保護作用を主張している。
現行のSARS-CoV-2ワクチン開発の取り組みは、主にSタンパク質に対する中和抗体の生成に集中している。臨床開発中のワクチンの大部分(及び米国のPh II/III候補のすべて)は、SプロテインA抗原のみを使用する。したがって、これらのワクチン候補は、自然感染中にCD8 T細胞によって認識される抗原の大部分を欠いている。実際に、SARS-CoV-2ST細胞ワクチン接種群のタンパク質反応を注意深く追跡することにより、CD8OOC反応の多様性と弱さが明らかになっている。SARS-CoV-2に対するより強固で耐久性のある防御を提供することを期待して、CD8 T細胞反応をより良好に関与させるために、より広範囲の抗原を組み込んだ次世代ワクチンが必要とされている。今日まで、開発中のSARS-CoV-2ワクチンは、ワクチン接種後に弱く可変性のCD8応答をもたらした(Mateus et al(2021)Science 374:eabj9853)。
本発明は、SARS-CoV-2免疫優性ペプチドの発見に少なくとも部分的に基づく。重要なことに、これらの免疫原性ペプチドのいくつかは、例えば、それらが連結されている場合、それらが別の他でポリペプチド中に配置されている場合、またはそれらが構築物上の他のペプチドと組み合わされている場合(例えば、細胞内抗原発現のための最適な免疫優性エピトープ中に充填することによって、T細胞応答有効性をベクターさせるための大きさを最大にするものなどの核酸ベクター構築物)、患者全体にわたってT細胞応答を誘発することができる。
いくつかの態様では、免疫原性ポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択される少なくとも2つのペプチドエピトープを含む。特定の態様では、前記少なくとも2つのペプチドエピトープが免疫原性ポリペプチド中で連結された順序で存在し、任意選択で、少なくとも1つ以上の免疫優性エピトープが2つ以上の写し中に存在する。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせることができる、多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では2写し、3写し、4写し、5写し、6写し、または1つの免疫優性エピトープの2写し、別の免疫優性エピトープの3写し、第3の免疫優性エピトープの1写しなどの、少なくとも1つまたは複数の免疫優性エピトープが2つ以上の写し中に存在する。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドが少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、またはそれ以上の前記ペプチドエピトープを含み、任意選択で、免疫原性ポリペプチドはHLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07のそれぞれにつき、少なくとも1つ、2つ、及び/または3つの免疫優性エピトープ(例えば、HLA-A*02及びHLA-A*11のそれぞれにつき、1つの免疫優性エピトープ、ならびにHLA-A*24及びHLA-B*07のそれぞれにつき、3つの免疫優性エピトープなど、列挙されたHLA-A*03、HLA-A*02及びHLA-A*03のそれぞれにつき、それぞれにつき、3つの免疫優性エピトープ)を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドが1A、1B、1C、1D、1E、及び1Fのそれぞれからの3つのペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドがペプチドエピトープ間にリンカーをさらに含む。ある特定の実施形態に、リンカーはペプチドエピトープのそれぞれについて少なくとも3つのアミノ酸を含み、前記少なくとも3つのアミノ酸は、それらのそれぞれのペプチドエピトープと連続するものである。ある特定の実施形態に、リンカーはプロテアソーム切断モチーフである。いくつかの実施形態では免疫原性ポリペプチドがOrf1ab、M、N、Orf3a、及びSからなる群から選択される1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、またはその1つ以上のタンパク質フラグメントをさらに含み、場合により、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質のフラグメントは機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードすることなくSARS-CoV-2を包含する。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドがリボソーム停止/再始動セグメント、IRESセグメント、及び/または翻訳後切断セグメントをさらに含み、場合により、翻訳後切断セグメントはP2Aセグメントである。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドが表1Gまたは表1Iなどの、本明細書に記載の表に提供されるアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
特定の態様では免疫原性ポリペプチドがそれぞれが少なくとも2つの前記ペプチドエピトープを含む少なくとも2つのペプチドフラグメントを含み、それぞれのペプチドフラグメント中の前記少なくとも2つの前記ペプチドエピトープは同じタンパク質のSARS-CoV-2に由来する。
上述のように、本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、前記少なくとも2つのペプチドフラグメントがSARS-CoV-2のNタンパク質、Mタンパク質、ORF1a/bタンパク質、またはORF3aタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドが前記ペプチドフラグメントの多くとも6つを含む。いくつかの実施形態では免疫原性ポリペプチドがOrf1ab、M、N、Orf3a、及びSからなる群から選択される1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、またはその1つ以上のタンパク質フラグメントをさらに含み、場合により、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質のフラグメントは機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードすることなくSARS-CoV-2を包含する。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドがリボソーム停止/再始動セグメント、IRESセグメント、及び/または翻訳後切断セグメントをさらに含み、場合により、翻訳後切断セグメントはP2Aセグメントである。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドが表1時間または表1Jなどの、本明細書に記載の表に提供されるアミノ酸配列のいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では免疫原性ポリペプチドがインビトロまたはインビボでT細胞応答を誘発することができ、場合により、T細胞応答は四量体染色アッセイ、T細胞活性化アッセイ、CD137染色アッセイ、細胞内IFNγ(IFNg)染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、及び/またはT細胞増殖アッセイによって決定される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態に、免疫原性ペプチドはSARS-CoV-2タンパク質に由来し、場合により、免疫原性ペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸長である。別の実施形態において、SARS-CoV-2タンパク質は、orf1a/b、Sタンパク質、Nタンパク質、M、orf3a、及びorf7aからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、免疫原性ペプチドが被検者においてT細胞反応を誘発することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドが1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープを含む。
Inさらに別の態様では本明細書に記載の少なくとも1つの免疫原性ペプチド(例えば、1、2、3、4、5、6、8、11、12、13、14、15、16、18、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、67、68、69、70、71、73、74、76、77、78)を含む免疫原性組成物 9、80、83、84、85、86、87、89、92、93、95、96、98、100、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、114、115、116、117、118、119、120、122、123、124、125、126、127、またはそれらの間の任意の範囲、例えば1~5個のペプチド)、任意選択で、Orf1ab、M、 N、Orf3a、及びS、またはその1つもしくは複数のタンパク質断片であって、任意選択で、1つまたは複数の完全長SARS-CoV-2タンパク質の断片は機能的SARS-CoV-2タンパク質及び/または2)アジュバントをコードすることなく、SARS-CoV-2タンパク質を包含する、断片が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態に、免疫原性化合物は、インビトロ及び/またはインビボでT細胞反応を誘発することができる。別の実施形態では、T細胞反応が四量体染色アッセイ、T細胞活性化アッセイ、CD137染色アッセイ、細胞内IFNg染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、及び/またはT細胞増殖アッセイによって決定される。
さらに別の態様では、表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択される少なくとも2つのペプチドエピトープ、ならびにMHC分子を含む免疫原性ポリペプチドを含む組成物が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態において、MHC分子はMHC多量体であり、場合により、MHC多量体は四量体である。別の実施形態では、MHC分子はMHCクラスI分子である。さらに別の実施形態ではMHC分子がHLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07からなる群から選択されるHLA血清型であるMHCα鎖を含み、任意選択で、HLA対立遺伝子はHLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0214、HLA-A*0217、HLA-A*0220、HLA-A*0224、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA *0260、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0103、HLA-A*116対立遺伝子、HLA-A*1101、HLA-A*1103、HLA-A*1105、HLA-A*2402、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*244 17、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458、HLA-B*0702、HLA-B*0705、HLA-B*709 、HLA-B*0710、HLA-B*0715、及びHLA-B*721対立遺伝子。これら及び他のhla対立遺伝子についての配列、特性、構造情報、機能情報、結合パートナーなどは、当技術分野で周知である(例えば、HLA.alleles.org/nomenclature/index.html、HLA.alleles.org/data/HLA-a.html、及びHLA.alleles.org/data/HLA-b.htmlのインターネットを参照されたい)。
別の態様では、MHC分子の文脈において、表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープを含む安定なMHC-ペプチド複合体が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態において、MHC分子はMHC多量体であり、場合により、MHC多量体は四量体である。別の実施形態では、MHC分子はMHCクラスI分子である。さらに別の実施形態ではMHC分子がHLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07からなる群から選択されるHLA血清型であるMHCα鎖を含み、任意選択で、HLA対立遺伝子はHLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0214、HLA-A*0217、HLA-A*0220、HLA-A*0224、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA *0260、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0103、HLA-A*116対立遺伝子、HLA-A*1101、HLA-A*1103、HLA-A*1105、HLA-A*2402、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*244 17、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458、HLA-B*0702、HLA-B*0705、HLA-B*709 、HLA-B*0710、HLA-B*0715、及びHLA-B*721対立遺伝子。さらに別の実施形態では、ペプチドエピトープ及びMHC分子は共有結合しており、かつ/またはMHC分子のα及びベータ鎖は共有結合している。別の実施形態では、安定なMHC-ペプチド複合体が検出可能な標識を含み、場合により、検出可能な標識はフルオロフォアである。
さらに別の態様では、本明細書に記載の安定なMHC-ペプチド複合体及び補助剤を含む免疫原性組成物が提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドまたはその相補体をコードする単離された核酸であって、場合により、単離された核酸がDNA、RNA、mRNA、cDNA、自己複製、環化、コンカテマー化されており、目的の遺伝子(例えば、ヘモグロビンA)に由来する5'非翻訳領域(5'UTR)及び/または3'UTRを含み、式プロモーターを含み、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含み、及び/または自己切断2Aペプチド(例えば、P2AまたはT2A)を含む、単離された核酸が提供される。
別の態様では、本明細書に記載の単離された核酸を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態ではでは、ベクターは式ベクターである。
本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドを符号化する基本核酸、またはそれを含むベクター物は免疫原性ポリペプチドが所望される(例えば、核酸が免疫原性ポリペプチドを符号化し、産生する)場合、本発明の任意の態様または実施形態において使用され得ることが企図される。核酸は符号化され、産生された免疫原性ポリペプチドのために免疫原性組成物であり、核酸自体のためではない。
さらに別の態様では、a)本明細書に記載される単離された核酸を含み、b)本明細書に記載されるベクターを含み、及び/またはc)本明細書に記載される1つ以上の免疫原性ポリペプチドを産生し、かつ/または細胞面に本明細書に記載される1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体を提示し、場合により細胞が遺伝子操作されている、細胞が提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載の免疫原性ペプチド及び/または本明細書に記載の安定なMHC-ペプチド複合体に特異的に結合する結合部分であって、場合により、結合部分が抗体、抗体の抗原結合フラグメント、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、単鎖TCR(scTCR)、キメラ抗原レセプター(CAR)、またはTCR及びエフェクタードメイン(場合により、細胞内にある膜貫通ドメイン及びエフェクタードメインをさらに含む)を含む融合タンパク質である結合部分が提供される。
さらに別の態様では、a)本明細書に記載の1つまたは複数の免疫原性ポリペプチド、及び/またはb)本明細書に記載の1つまたは複数の安定なMHC-ペプチド複合体を含むデバイス物またはキットであって、a)及び/またはb)のT細胞レセプターへの結合を検出するための試剤を場合により含む、前記デバイス物またはキットが提供される。
別の態様では、安定なMHC-ペプチド複合体に結合するT細胞を検出する方法であって、(a)T細胞を含むサンプルを、本明細書に記載される安定なMHC-ペプチド複合体と接触させる工程;及び(b)T細胞の安定なMHC-ペプチド複合体への結合を検出する工程、場合により、安定なMHC-ペプチド複合体に結合する安定なMHC-ペプチド特異的T細胞の割合をさらに決定する工程を含む方法が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態において、サンプルは、末梢血単核細胞(PBMC)を含む。別の実施形態では、T細胞はCD8+ T細胞である。さらに別の実施形態では、検出及び/または決定が蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタンブロット、または細胞内フローアッセイを使用して行われる。さらに別の実施形態では、サンプルが1つ以上のSARS-CoV-2タンパク質またはそのフラグメントと接触した、または接触した疑いのあるT細胞を含む。
さらにもう1つの態様において、被験体がSARS-CoV-2への曝露及び/または保護を有するかどうかを決定する方法であって、a)本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドまたは本明細書に記載される安定なMHC-ペプチド複合体で被験体から得られたT細胞を含む細胞集団をインキュベートする工程;及びb)反応性の存在またはレベルを検出する工程を包含し、ここで、制御レベルと比較して高いレベルの反応性の存在またはレベルは、被験体がSARS-CoV-2への曝露及び/または保護を有することを示す。
さらに別の態様ではSARS-CoV-2感染に罹患している対象の臨床転帰を予測するための方法が提供され、該方法はa)対象から得られたT細胞と本明細書に記載される1つ以上の免疫原性ペプチドまたは本明細書に記載される1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の反応性の存在またはレベルを決定する工程;及びb)aa制御から得られたものと反応性の存在またはレベルを比較する工程であって、制御が良好な臨床転帰を有する対象から得られ、制御と比較した対象サンプルにおける反応性の存在またはより高いレベルが対象が良好な臨床転帰を有することを示す工程を含む。
別の態様ではa)SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を被検者に提供する前に被検者から得られた第1のサンプルにおいて、被検者から得られたT細胞と本明細書に記載された1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の反応性の発明またはレベルを決定すること、及びb)本明細書に記載された1つ以上の免疫原性ペプチド、または本明細書に記載された1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体と、被検者から得られた第2のサンプルに発明する被検者から得られたT細胞との間の反応性の発明またはレベルを決定することを含む、SARS-CoV-2療法の有効性を評価する方法が提供され、ここで、第1のサンプルと比較した第2のサンプルにおける反応性の発明またはより高いレベルは療法が被検者におけるSARS-CoV-2の治療に有効であることの指標である。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態に、反応性のレベルはa)結合及び/またはb)T細胞活性化及び/またはエフェクター機能の存在によって示され、場合により、T細胞活性化またはエフェクター機能は、T細胞増殖、死滅、またはサイトカイン放出である。別の実施形態では本方法が工程a)及びb)をその後の時点で繰り返すことをさらに含み、任意選択で、被検者は第1の時点とその後の時点との間でSARS-CoV-2感染を改善するための処置を受けている。さらに別の実施形態ではT細胞結合、活性化、及び/またはエフェクター機能は蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタンブロット、または細胞内フローアッセイを使用して検出される。さらに別の実施形態では、制御レベルは参照番号である。別の実施形態では、制御レベルがSARS-CoV-2に曝露されていない対象のレベルである。
さらに別の態様では被検者におけるSARS-CoV-2感染を予防及び/または治療する方法が提供され、該方法は本明細書に記載の1つ以上の免疫原性ポリペプチド及び/または細胞を含む、及び/またはコードする免疫原性組成物を被検者に投与する工程を含む。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態に、免疫原性組成物は本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸、例えば、テーブル1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択される少なくとも2つのペプチドエピトープを含む免疫原性ポリペプチドを含む。一実施形態では免疫原性ペプチドがSARS-CoV-2タンパク質に由来し、任意選択で、免疫原性ペプチドは8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸長である。一実施形態では、SARS-CoV-2タンパク質がorf1a/b、Sタンパク質、Nタンパク質、M、orf3a、及びorf7aからなる群から選択される。一実施形態では、免疫原性ポリペプチドが被検者においてT細胞反応を誘発することができる。一実施形態では、免疫原性組成物が2つ以上の免疫原性ポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、免疫原性組成物が補助剤をさらに含む。さらに別の実施形態では、免疫原性組成物が被検者においてT細胞反応を誘発することができる。別の実施形態では、投与される免疫原性組成物が被検者においてSARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導する。さらに別の実施形態では、投与される免疫原性組成物が被検者においてSARS-CoV-2に対するT細胞免疫反応を誘導する。さらに別の実施形態では、T細胞免疫応答がCD8+ T細胞免疫応答である。
さらに別の態様では、a)方法上のMHC分子との関連で、本明細書に記載される前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープを提示する細胞を提供すること、任意選択で、少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドを符号化し発現する核酸を含む、本明細書に記載される少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープ物に結合するペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントを同定すること、b)方法上のMHC分子との関連で、複数の候補ペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントのペプチドエピトープへの結合を決定すること、及びc)MHC分子との関連でペプチドエピトープに結合する1つまたは複数のペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントを同定することを含む、本明細書に記載される少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープに結合するペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントを同定する方法が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態に、工程a)は、細胞の表面上のMHC分子を、表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープと接触させることを含む。別の実施形態では、工程a)が本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を、本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドをコードする基本核酸として、またはそのような基本核酸を含むベクターとして、例えば、テーブル1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープをコードする異種配列を含むものとして、細胞にトランスフェクトすることを含む。
別の態様では、a)MHC分子との関連で本明細書に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープを含む安定なMHC-ペプチド複合体を提供すること; b)安定なMHC-ペプチド複合体への複数の候補ペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントの結合を決定すること;及びc)安定なMHC-ペプチド複合体に結合する1つ以上のペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントを同定することを含む、本明細書に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープに結合するペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントを同定する方法が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態において、MHC分子はMHC多量体であり、場合により、MHC多量体は四量体である。別の実施形態では、MHC分子はMHCクラスI分子である。さらに別の実施形態ではMHC分子がHLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07からなる群から選択されるHLA血清型であるMHCα鎖を含み、任意選択で、HLA対立遺伝子はHLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0214、HLA-A*0217、HLA-A*0220、HLA-A*0224、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA *0260、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0103、HLA-A*116対立遺伝子、HLA-A*1101、HLA-A*1103、HLA-A*1105、HLA-A*2402、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*244 17、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458、HLA-B*0702、HLA-B*0705、HLA-B*709 、HLA-B*0710、HLA-B*0715、及びHLA-B*721対立遺伝子。さらに別の実施形態では、ペプチドエピトープ及びMHC分子は共有結合しており、かつ/またはMHC分子のα及びベータ鎖は共有結合している。別の実施形態では、安定なMHC-ペプチド複合体が検出可能な標識を含み、場合により、検出可能な標識はフルオロフォアである。さらに別の実施形態では、複数の候補ペプチド結合分子が1つまたは複数のT細胞レセプター(TCR)、またはTCRの1つまたは複数の抗原結合フラグメントを含む。さらに別の実施形態では、複数の候補ペプチド結合分子が少なくとも2、5、10、100、103、104、105、106、107、108、109、またはそれ以上の様々な候補ペプチド結合分子を含む。別の実施形態において、複数の候補ペプチド結合分子は、被検者からのサンプルまたは被検者の集団から得られる1つまたは複数の候補ペプチド結合分子を含むか;または複数の候補ペプチド結合分子が被検者からのサンプルから得られる親足場結合分子における変異を含む1つまたは複数の候補ペプチド結合分子を含む。さらに別の実施形態では、対象または対象の集団がa)SARS-CoV-2に感染していない、及び/またはCOVID-19から回復している、またはb)SARS-CoV-2に感染している、及び/またはCOVID-19を有する。さらに別の実施形態では対象または対象の集団が1つまたは複数の免疫原性ポリペプチドでワクチン接種されており、免疫原性ポリペプチドは表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープを含む。別の実施形態では被検者が哺乳動物であり、場合により、哺乳動物はヒト、霊長類、またはげっ歯類である。さらに別の実施形態では、被検者がHLAトランスジェニックマウスであり、及び/またはヒトTCRトランスジェニックマウスである。さらに別の実施形態では、サンプルはT細胞を含む。別の実施形態では、サンプルが末梢血単核細胞(PBMC)またはCD8+メモリーT細胞を含む。さらに別の実施形態では、TCRの抗原結合フラグメントが単鎖TCR(scTCR)である。
別の態様では本明細書に記載される方法に従って同定されるペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントが提供され、場合により、結合部分は抗体、ある抗原結合フラグメントの抗体、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、単鎖TCR(scTCR)、キメラ抗原レセプター(CAR)、またはTCR及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質である。
さらに別の態様では、本明細書に記載された方法によって同定されたTCRを発現する治療上有効量の遺伝子操作されたT細胞を被験体に投与することを含む、被験体におけるSARS-CoV-2感染を治療する方法が提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープに結合するTCRを発現する遺伝子操作T細胞の治療有効量を被検者に投与することを含む、被検者におけるSARS-CoV-2感染を治療する方法が提供される。
別の態様では、被検者におけるSARS-CoV-2感染を治療する方法が提供され、この方法は被検者に、MHC分子の文脈において本明細書に記載される少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドdecsribdのペプチドエピトープを含む安定なMHC-ペプチド複合体に結合するTCRを発現する、治療有効量の遺伝子操作されたT細胞を投与することを含む。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態において、MHC分子はMHC多量体であり、場合により、MHC多量体は四量体である。別の実施形態では、MHC分子はMHCクラスI分子である。さらに別の実施形態ではMHC分子がHLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07からなる群から選択されるHLA血清型であるMHCα鎖を含み、任意選択で、HLA対立遺伝子はHLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0211、HLA-A*0212、HLA-A*0214、HLA-A*0217、HLA-A*0220、HLA-A*0224、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA *0260、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0307、HLA-A*0101、HLA-A*0103、HLA-A*116対立遺伝子、HLA-A*1101、HLA-A*1103、HLA-A*1105、HLA-A*2402、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*244 17、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、HLA-A*2458、HLA-B*0702、HLA-B*0705、HLA-B*709 、HLA-B*0710、HLA-B*0715、及びHLA-B*721対立遺伝子。さらに別の実施形態では、ペプチドエピトープ及びMHC分子は共有結合しており、かつ/またはMHC分子のα及びベータ鎖は共有結合している。別の実施形態では、
安定なMHC-ペプチド複合体は検出可能な標識を含み、場合により、検出可能な標識は、フルオロフォアである。さらに別の実施形態では、T細胞がa)被検者、b)SARS-CoV-2に感染していないドナー(donor)、またはc)COVID-19から回収されたドナー(donor)から単離される。
さらに別の態様では、PBMCまたは方法を刺激する前に、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドを用いて被検者からのPBMCまたはT細胞を刺激すること、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸、本明細書に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープを含む安定なMHC-ペプチド複合体、または本明細書に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチドをコードし、かつ/またはその細胞面上にMHC分子の文脈で提示する細胞、例えば本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドを発現する構築物からのものによって、抗原特異的T細胞を生成すること、及び、b)インビトロで抗原特異的T細胞を増殖させること、任意にPBMCまたはT細胞を被検者から単離することによって、被検者におけるSARS-CoV-2感染を予防及び/または治療するT細胞が提供される。
本発明の任意の態様に適用することができ、及び/または本明細書に他の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、ある実施形態では、T細胞が未処理のT細胞、またはセントラル・メモリーT細胞(central memory T cell)、またはエフェクタ・メモリーT細胞(effector memory T cell)である。別の実施形態では、T細胞はCD8+メモリーT細胞である。さらに別の実施形態では、代理人がペプチドエピトープ、免疫原性ポリペプチド、安定なMHC-ペプチド複合体、T細胞レセプター、及び/またはT細胞の間の少なくとも1つの免疫複合体の形成に適した条件下で、かつ好適な期間、接するように置かれる。さらに別の実施形態ではペプチドエピトープ、免疫原性ポリペプチド、安定なMHC-ペプチド複合体、及び/またはT細胞レセプターは細胞によって発現され、細胞は1つまたは複数の工程の間に増殖及び/または単離される。別の実施形態では被検者が哺乳動物であり、場合により、哺乳動物はヒト、霊長類、またはげっ歯類である。
出願書類には、カラーで作成された少なくとも1つの図面が含まれている。カラー図面を有する本特許又は特許出願公開の写しは、請求及び必要な手数料の納付に応じて、庁によって提供される。
図1は免疫優性エピトープをコードする代理人ポリエピトープワクチンコンストラクト(例えば、免疫原性ポリペプチドの実施形態)を示す。 図2は代表的な次世代SARS-CoV-2ワクチン構築物(例えば、免疫原性ポリペプチドの実施形態)を示す。 図3は、各種ワクチン構築に対するCOVID-19患者記憶部CD8 T細胞の反応を示す。データは、2人の患者の平均である(個々のドットとして示される)。 図4は、選択されたワクチン構築がSタンパク質単独と比較して優れたCD8 T細胞活性化を示すことを示す。9例の記憶CD8 T細胞をSARS-CoV-2ワクチンコンストラクトに対する反応性について試験し、結果を得た。 図5A-図5Cは、代理人19-エピトープ構築物を示す。図5Aは、3aaリンカーを有する代表的な19-エピトープ構築物を示す。図5Bは、KAAリンカーを有する代表的な19-エピトープ構築物を示す。図5Cは、リンカーを含まない代表的な19-エピトープ構築物を示す。 図6A~図6Cは、代理人27-エピトープ構築物を示す。図6Aは、3aaリンカーを有する代表的な27-エピトープ構築物を示す。図6Bは、KAAリンカーを有する典型的な27-エピトープ構築物を示す。図6Cは、リンカーを含まない代表的な27-エピトープ構築物を示す。 図7は代理人フラグメント構築物(例えば、それぞれが少なくとも2つのペプチドエピトープを含む少なくとも2つのペプチドフラグメントの実施形態)を示す。 図8は、Sタンパク質セグメント及びP2Aに融合された典型的なフラグメント構築物を示す。 図9A~図9Eは、代理人ポリエピトープ構築物溶融体を示す。図9Aは、Sタンパク質セグメント及びP2Aに融合された3aaリンカーを有する代理人19-エピトープ構築物を示す。図9Bは、Sタンパク質セグメント及びP2Aに融合された3aaリンカーを有する代理人27-エピトープ構築物を示す。図9Cは、SARS-CoV-2 N、Orf1a、M、Orf3a、及びSタンパク質からの14フラグメント内に含まれる代理人19-エピトープ構築物を示す。それぞれのフラグメントは、27ヌクレオチド~195ヌクレオチドにわたる核酸配列によってコードされ、全部で19個の既知のエピトープをカバーする発見されたエピトープのうちの1つ以上を含有する。14フラグメント構築物は発見されたエピトープと同じプロテアソームフラグメントから提示され得る任意の電位免疫原性エピトープを含むように、及び発見されたエピトープに結合し、提示することが知られているMHC分子以外のMHC分子上に提示され得る電位未発見エピトープを含むように設計された。図9Dは(完全)SARS-CoV-2 M、N、及びOrf3aタンパク質全体に及ぶが、非連続フラグメントで表されるフラグメント内に含まれる代表的なポリペプチドープコンストラクト、ならびにSARS-CoV-2 Orf1ab及びSタンパク質由来の17個のエピトープと組み合わされたSタンパク質フラグメントを示す。この構築物は、ポリエピトープ構築物とフラグメントベースの構築物との組合せである。例えば、構築物の5'部は、周囲の3つの天然アミノ酸によって一緒に連結されたSARS-CoV-2のスパイク及びorf1abタンパク質からの17エピトープのコンカテマーである。構築物の3'部はフラグメントのコンカテマーであり、N、Orf3a、及びMタンパク質にまたがり、Sタンパク質の1つのフラグメントを含む。機能的タンパク質の産生を回避するために(例えば、Orf3aタンパク質は免疫抑制活性を有することが知られている)、N、Orf3a、及びMタンパク質を2~3フラグメントに分割し、それぞれのフラグメントの順序を交互にすることによって配列中に分散させた。発見された27個のエピトープはすべて、この構築物中に表される。SARS-CoV-2ゲノムの全体(完全体)N、Orf3a、及びM領域を含めたのは、N、Orf3a、及びMタンパク質が領域の大きさに合わせて調整された場合に、最高存在量のエピトープを含んでいたからである。理論に束縛されるものではないが、この部位は免疫原性エピトープのプロセシング及び提示を引き起こす生物学的ドライバーを有し、したがって、多くの様々なMHCによって提示され得るエピトープを含有する可能性が高く、構築物に応答し得る患者数を潜在的に増大させると考えられる。図中の名称B.1.617.2_S.PPは、差分バリアント(B.1.617.2)からのSタンパク質のPP安定化形態を指す。この代理人構築物に含まれるSタンパク質のフラグメントは、SARS-CoV-2のΔバリアントからのものである。図9EはSARS-CoV-2 ORF1ab及びSタンパク質由来のフラグメントと組み合わされた非連続フラグメントで表されるが、(完全)SARS-CoV-2 M、N、及びOrf3aタンパク質全体にわたるフラグメント内に含まれる代表的なポリエピトープコンストラクトを示す。B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3aは図9Dで説明したEpi-M/N/ORF3a構築物と同じ3'N、Orf3a、M及びSフラグメントを含むが、5'17epiフラグメント部が図9Dからの17エピトープを囲むOrf1ab及びSタンパク質からのフラグメントに置き換えられている点が異なる。これらは、14_フラグメントエピトープからの同じフラグメントである。図中の名称B.1.617.2_S.PPは、差分バリアント(B.1.617.2)からのSタンパク質のPP安定化形態を指す。この代理人構築物に含まれるSタンパク質のフラグメントは、SARS-CoV-2のΔバリアントからのものである。図9C~図9Eに示される典型的な配列は、リンカーなどの追加の配列を含まない。例えば、3AAリンカーはより大きなフラグメントが識別されたエピトープのためのリンカーの空間を提供し、リンカーが存在しないことがエピトープがセグメントの端部に直接的に存在しないことを保証するように、未識別エピトープが定義されないので、不要である。セグメントは、P2A部位なしで直接的に配置される。1つの例外は、3AAリンカーを含む図9Dのポリエピトープ部である。 図10は、SARS-CoV-2患者由来のメモリーT細胞(Tmem)プールが図9Cのワクチン構築を認識することを示す。14個のフラグメントmRNA構築物(図9Cに記載)を、単一のMHC-I分子を発現するように修飾された単対立遺伝子HEK293T細胞に脂質ナノ粒子して導入した。回収されたSARS-CoV-2患者から単離されたメモリーT細胞を、構築物処理された単対立遺伝子HEK293T細胞と共培養し、構築物に対する反応性を、ELISAによってインターフェロンガンマ放出を測定することによって試験した。 図11は、SARS-CoV-2の特異的エピトープを認識するTCRが図6Aの27ポリエピトープコンストラクトを含むLNPで処理された樹状細胞に反応することを示す。単球由来樹状細胞(moDC)を、SARS-CoV2の広範な感染前に、2019年に米国で採取された血から単離した。moDCを、図6Aの構築物のmRNAを含むLNPで処理した。表1Aまたは1Fからの各示されたエピトープに比T細胞をLNP処理moDCと共培養し、活性化誘導マーカ(AIM)CD69及びCD137のフローサイトメトリー汚染によってT細胞反応性を測定した。したがって、これらの構築物内に含まれるエピトープは、エピトープ特異的T細胞から反応を誘発するのに十分に処理され、提示される。 図12は、SARS-CoV-2のエピトープを認識するTCRが共通TRAV遺伝子を利用することを示している。表1A及びFからのYLQ、KLW、及びSPR抗原決定基を認識する特異的クローンの周波数が示されている。強調されているのは、共有優性TRAV遺伝子である。Ferretti et al(2020)免責 53: 1095-1107、とりわけ図4及び物質及び方法において、共通TRAV遺伝子がTCRによって利用されることを実証するさらなる支持についても参照されたい。 図13は、インビトロワクチンモデルの代表的な非限定的な例を示す。 図14は、パルスSARS-CoV-2免疫優性ペプチドが図13のインビトロワクチンモデルにおいてナイーブT細胞集団からペプチド特異的T細胞の拡大を誘導することを示す。MHC-ペプチド四量体染色を用いて、示されるようにペプチド比TCRを検出した。 図15は、ワクチン構築物が図13からのインビトロワクチンモデルにおいて、ナイーブT細胞集団からのペプチド特異的T細胞の増殖を誘導することを示す。 図16A~図16Cは試験したMHCによって提示されることが知られているエピトープに対応する既知のV領域(図12)が図9Cの構築物で処理されたインビトロワクチンモデルからの上位に拡大されたTCRクローンの中で優勢であるが、未処理対照からは優勢ではないことを示す。図16Aは、対照サンプルの最高値を上回る背景技術減算周波数でYLQペプチドに結合することが知られているTCRに対応する既知のTRAV遺伝子を強調する、拡大クローン化のTRAV遺伝子を示す。図16B及び16Cは、表1A及びFに記載の公知のペプチドで再刺激した場合の、図9Cのワクチン構築に応答する拡大クローン化のTRAV遺伝子を示す。対照サンプルの最高値を上回る背景技術減算周波数で、図9Cの構築内のペプチドに結合することが公知であるTCRに対応するTRAV遺伝子を、試験した示されたMHCについて強調する。したがって、これらの構築物は、SARS-CoV-2による自然感染に対する免疫応答を再現するインビトロワクチンモデルにおいて、ナイーブT細胞からの応答を誘導する。
[発明の詳細な説明]
本発明は少なくとも部分的にはSARS-CoV-2ウイルス特異的免疫原性ポリペプチドコンストラクトの発見に基づいており、これは、例えば、ワクチンとして使用することができる。回復期COVID‐19症例で認識された正確なT細胞標的をマップするために、系統的で包括的な調査を行った。驚くべきことに、この研究は患者にわたって再発的に認識される、非常に免疫優性のペプチド抗原の限られたセットを明らかにし、普遍的に認識されると思われるいくつかのものを含む。
免疫原性ペプチドを有するそのようなワクチンの設計を知らせるために、SARS-CoV-2による感染後にCD8 T細胞によって認識される標的の包括的なゲノムワイド解析を行った。6つの共通HLA対立遺伝子(HLA-A:02、HLA-A01、HLA-A03、HLA-A11、HLA-A24、及びHLA-B07)上で認識される標的のランドスケープ人の>85%が、これらの対立遺伝子の少なくとも1つを世界的に発現するセットがマッピングされた。適切なHLA対立遺伝子を有する患者の大多数が反復的に認識する各対立遺伝子に対する免疫優性エピトープのコア集合を同定し、検証した。全体エピトープは、MHC分子上に強固に提示され、患者間でナイーブCD8 T細胞レパートリーによって効率的に認識され、防御的である可能性が高いことが明らかにされた(防御的である可能性が高い全CD8 T細胞反応への寄与度に基づく)。特定のHLA対立遺伝子上に提示された正確なエピトープを同定することに加えて、SARS-CoV-2ゲノムに対するT細胞反応性のパターンも明らかにされた。N、M、及びORF3aタンパク質、ならびにORF1abの一部を含む、HLA対立遺伝子にわたって反復的に認識されるゲノムの領域が見出され、これらの領域は、さらなる対立遺伝子に制限されるCD8 T細胞反応を生成する可能性が高い魅力的なワクチン抗原を表す。流行性ベータコロナウイルスと交差反応性であるSARS-CoV-2ゲノムの比セグメントに対するCD8 T細胞反応も同定された。これらの領域は、それらを標的とするワクチンが流行性ベータコロナウイルスに反応性の任意の既存のCD8 T細胞を追加免疫することができ、より強力な反応を生じさせる可能性を有するので、特に興味深い。
これにより、SARS-CoV-2に対する自然免疫をより正確に再現するために、広いCD8 T細胞を含むワクチン候補の設計が可能となった。具体的には、設計されたワクチンがポリエピトープワクチン及びフラグメントベースのワクチンを含む。
ポリエピトープワクチンにおいて、多数の免疫優性CD8 T細胞エピトープを、単一のポリタンパク質としての発現のために連結した。この手法は、検証されたT細胞エピトープの最大密度を提供するという長所を有する。6~29の合計エピトープの範囲のバリアントを設計した。ポリエピトープワクチンの重要なデザイン特性は任意の非天然接合エピトープを最小限にしながら、所望の免疫優性エピトープの効率的なプロセシング及び提示を最大限にすることができることである。最適なプロテアソーム切断配列を含むポリエピトープも設計し、天然のタンパク質配列(全長タンパク質中のそれぞれのエピトープを直接的に取り囲むアミノ酸、これは、本発明者らのスクリーニングデーターに基づいて効率的な提示をもたらすことが検証されている)に由来するか、または合成プロテアソーム切断配列をインターエピトープリンカーとして使用した。予測される高親和性接合エピトープの生成を最小限にする最適エピトープ次数を選択する(数百万の試験バリアントから最適次数を選択する)バイオインフォマティクス手法も使用した。
フラグメントベースワクチンでは、一連のHLA対立遺伝子にわたって免疫優性であると同定されたSARS-CoV-2由来の一組のより長いゲノムセグメントを連結した。この手法はSARS-CoV-2タンパク質配列のより長い延伸を含むという長所を有し、本発明者らが調査しなかった追加のHLA対立遺伝子によって提示されるさらなるCD8 T細胞エピトープをコードする可能性を増大させる。これらのワクチンについて、2~6匹のセグメントを連結した。
どちらの種類のワクチンも、より広い文脈及びデリバリーの点で高度にモジュール化されている。これらは、CD8 T細胞反応を増強することに焦点を当てた単独ワクチンとしての役割を果たすことができ、または中和抗体反応を生成するように設計された抗原と一緒に共導入することができる。後者の場合、それらは、P2A配列などのリボソーム再開部位に続いて他の抗原と共に発現され得る。設計のいくつかは、最適化されたSタンパク質(タンパク質の安定性を増強するように設計された2つのプロリン変異を含む)、続いてP2A配列及びポリエピトープまたはポリフラグメントタンパク質を含む。これらは、mRNA、DNA、ウイルスベクターを用いて、または精製タンパク質として送達することができる。
構築物の特定のエピトープに関連する1つの実例として、本明細書では、CD8+ T細胞反応が同じHLA型を有する患者間で共有されるSARS-CoV-2における少数(3~8)の高抗原性(免疫優性)エピトープによって支配されることが決定された。これらのエピトープはSARS-CoV-2に主に特有であり(すなわち、「感冒」コロナウイルスでは生じない)、ウイルス分離株間で不変であり、各患者内の多数のクローン型によってしばしば標的化される。研究した6種のHLA型にわたって少なくとも29種の共有エピトープが同定された。特に、エピトープの~10%(29個中3個)のみがSタンパク質に存在し(すなわち、~90%のSARS-CoV-2免疫優性エピトープがSタンパク質の外に位置する)、より広いCD8+ T細胞反応を誘発するように設計された新しい種類のワクチンの必要性が強調される。実際に、英国、南アフリカ、ブラジル、またはデルタバリアントにおける変異のいずれも、これらの29のエピトープにおいて起こらず、いくつかのHLAタイプはSARS-CoV-2に感染した患者を分析するとき、いかなるスパイクタンパク質エピトープももたらさなかった(例えば、5人のA*01:01患者及び5人のA*11:01患者についてのスクリーニングデータはスパイクタンパク質のいかなるエピトープも同定しなかった)注目すべきことに、スクリーニングされた患者の94%は所与のHLAについての3つの最も優勢なエピトープのうちの少なくとも1つを認識し、患者の53%は、所与のHLAについて3つの最も優勢なエピトープのすべてを認識するT細胞を有することがT細胞されたことが決定された。18人の追加のA*02:01患者におけるさらなる確認分析は上位6人の同定されたA*02:01エピトープに比記憶部CD8+ T細胞の存在を繰り返し、単一細胞シークエンシングは患者がしばしば、それぞれのエピトープを標的とする>5個の異なったT細胞クローンを有することを明らかにしたが、同じT細胞レセプターVa及びVb領域が患者にわたってさえも、これらのエピトープを認識するために主に使用されることを明らかにした。これらの免疫優性エピトープの大部分(29中27)を標的とするT細胞は感冒を引き起こす風土病性コロナウイルスと交差反応せず、エピトープは変異の多い領域では起こらない。COVID‐19におけるCD8+ T細胞反応をより良く理解するための有用なツールを提供し、ワクチンデザインと現像に重要な意味を持つ。
したがって、本発明は部分的に、同定された免疫原性ポリペプチド構築物、これらの免疫原性ポリペプチド構築物を単独でまたはMHC分子と共に含む組成物、安定なMHC-ペプチド複合体、SARS-CoV-2に対するT細胞反応を診断、予後診断、及び監視する方法、ならびに同定された免疫原性ポリペプチド構築物を含む、及び/またはコードする免疫原性組成物を投与することによってSARS-CoV-2感染を予防及び/または処置するための方法に関する。
I. 定義
便宜上、本明細書、実施形態、及び添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語を本明細書にまとめる。
「a」及び「an」という部材は本部材の文法的目的の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。例として、「an element」は、1つの元素または2つ以上の元素を意味する。
本明細書において、「投与する」とは被検者に医薬品代理人物または医薬品組成物を提供することを意味し、医療専門家による投与及び自己投与を含むが、これらに限定されない。
「免疫反応」という語は、T細胞媒介性及び/またはB細胞媒介性免疫反応を含む。例示的な免疫反応には、T細胞反応、例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害性が含まれる。加えて、免疫反応という語はT細胞活性化、例えば、抗体産生(体液性応答)及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的にもたらされる免疫反応を含む。
従来のT細胞はTconvまたはTeffとしても知られ、エフェクター機能(例えば、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、抗自己認識など)を有し、1つまたは複数のT細胞レセプターの発現によって免疫反応を増大させる。TconまたはTeffは一般に、Tregではない任意のT細胞集団として定義され、例えば、naive T細胞、活性化T細胞、メモリーT細胞、休止Tcon、または、例えば、Th1またはTh2系統に向かって分化したTconを含む。いくつかの実施形態では、Teffが非Treg T細胞のサブセットである。いくつかの実施形態では、TeffがCD4+ TeffまたはCD8+ Teff、例えばCD4+ヘルパーTリンパ球(例えば、Th0、Th1、Tfh、またはTh17)及びCD8+細胞傷害性Tリンパ球である。本明細書においてさらに記載されるように、細胞傷害性T細胞はCD8+ Tリンパ球である。「NaiveTcon」は骨髄で分化したCD4+ T細胞であり、胸腺における中心選択の陽性及び陰性処理を首尾よく受けたが、抗原への曝露によってまだ活性化されていない。NaiveTconは一般に、L-セレクチン(CD62L)の表面発現、CD25、CD44またはCD69などの活性化マーカーの非存在、及びCD45ROなどの記憶部マーカーの非存在を特徴とする。したがって、NaiveTconは静止しており、非分裂であり、ホメオスタシス生存のためにインターロイキン-7(IL-7)及びインターロイキン-15(IL15)を必要とすると考えられている(少なくとも国際公開第2010/101870号を参照されたい)。そのような細胞の存在及び活性は、免疫反応を抑制する文脈において望ましくない。Tregとは異なり、Tconはアネルギー性ではなく、抗原に基づくT細胞レセプター活性化に応じて増殖することができる(Lechlerら(2001) Philos.トランス。R. Soc.ロンド。Biol。科学。356:625-637).腫瘍では、消耗した細胞がアネルギーの特徴を示すことがある。
「ワクチン」という用語は、目的の抗原に対する免疫応答を誘発する医薬組成物を指す。ワクチンは、被験体に防御免疫を付与することもできる。
「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。好ましいベクターの1つの型は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の自律複製及び/または式が可能なものである。それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。概して、組換えDNA技術における有用性の発現ベクターは多くの場合、一般に環状二本鎖DNAループを指し、それらのベクター形成では染色体に結合していない「プラスミド」の形成である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、互換的に使用される。しかし、当業者によって理解されるように、本発明は同等の機能を果たし、その後当技術分野で公知になる、発現ベクターのそのような他の形態を含むことが意図される。
「免疫療法剤」という語は、宿主免疫システムを刺激して、被検者におけるウイルス感染に対する免疫反応を生じさせることができる、任意の分子、ペプチド、抗体または他の代理人を含むことができる。様々な免疫療法剤が、本明細書に記載される構成及び方法において有益である。
「単離されたタンパク質」は細胞から単離された場合、または組換えDNA技術によって産生された場合、他のタンパク質、細胞物質、分離培地、及び培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な一部分は、細胞物質または他の混入タンパク質を、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織源から実質的に含まないか、または化学的に合成された場合に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、タンパク質がそれが単離または組換えにより産生される細胞の細胞構成要素から分離される、バイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントの調製物を含む。ある実施形態に、「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、約30%(乾燥重量で)未満の非バイオマーカータンパク質(本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる)、より好ましくは約20%未満の非バイオマーカータンパク質、さらにより好ましくは約10%未満の非バイオマーカータンパク質、最も好ましくは約5%未満の非バイオマーカーOOGを有する、バイオマーカータンパク質またはそのフラグメントの調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質またはそれらのフラグメント、例えば生物学的に活性なそのフラグメントが組換え的に産生される場合、それはまた、好ましくは実質的に培養培地を含まず、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の体積の約20%未満、より好ましくは約10%未満、最も好ましくは約5%未満を表す。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という語は重鎖定常領域によってコードされる抗体の種類(例えば、IgM、IgG1、IgG2Cなど)を指す。
本明細書で使用するとき、「K D」という語は、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数を指すものとする。抗体の結合親和性は標準的な抗体抗原アッセイ、例えば、競合アッセイ、飽和アッセイ、またはELISAもしくはRIAなどの標準的なイムノアッセイによって測定または決定することができる。
「キット」は少なくとも1つの試薬、例えば、特異的に検出するための、及び/または本発明によって包含されるマーカーの発現に影響を及ぼすための、プローブまたは低分子を含む任意の製造(例えば、パッケージまたは容器)である。また、本実施形態に係る方法を実施するための手段として、販売促進、流通、販売することができる。キットは、本発明に包含される方法において有用な組成物を発現するのに必要な1種以上の試薬を含んでもよい。ある特定の実施形態に、該キットは基準物質、例えば、細胞増殖、分割、マイグレーション、生残またはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響を及ぼさないかまたは調節しないタンパク質を符号化する核酸をさらに含んでもよい。当業者は一般的な分子標識(例えば、緑色蛍光タンパク質及びβガラクトシダーゼ)、遺伝子オントロジーリファレンスによる細胞増殖、分割、マイグレーション、生残もしくはアポトーシス、またはユビキタスハウスキーピングタンパク質を包含する経路のいずれにも分類されないタンパク質を含むが、これらに限定されない、多くのそのような制御タンパク質を想定することができる。キット中の試薬は個々のコンテナ中に、または単一の容器中の2つ以上の試薬の混合物として提供され得る。さらに、キット内での組成物の使用を記載する説明物質を含めることができる。
用語「防止する」、「防止すること」、「防止」、「防止的処置」などは疾患、障害、または条件を有さないが、疾患、障害、または条件を発症するリスクがあるか、または発症しやすい被検者における疾患、障害、または条件を発症する可能性を低下させることを指す。
用語「予後」は、ウイルス感染の可能性のある経過及び結果、または疾患からの回復の可能性の予測を含む。いくつかの実施形態では、統計的アルゴリズムの使用が個体におけるウイルス感染の予後を提供する。例えば、予後は、手術、ウイルス感染の臨床サブタイプの開発、1つ以上の臨床因子の開発、または疾患からの回復であり得る。
少なくとも1つのバイオマーカーの存在または濃度を検出または決定するために使用される「サンプル」という語は典型的には脳組織、脳脊髄流体、全血、プラズマ、プラズマ、唾液、尿、糞便(例えば、糞便)、涙、及び任意の他の身体流体(例えば、「体液」の規定のもとで上述されたよう)、または組織サンプル(例えば、生検)、例えば、小腸、大腸サンプル、または外科的切除組織である。特定の例において、本開示に包含される方法はサンプル中の少なくとも1つのマーカの本発明レベルを検出または決定する前に、個体からサンプルを得ることをさらに含む。
「低分子」という用語は当技術分野の用語であり、約1000分子重量未満または約500分子重量未満の分子を含む。ある実施形態に、低分子は、排他的にペプチド結合を含まない。別の実施形態では、低分子はオリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示的な低分子化合物としてはペプチド、ペプチドミメティック、核酸、糖類(carbohydrates)、有機小分子(例えば、ポリケチド)(カネら(1998)科学282:63)、及び天然産物抽出物ライブラリが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、化合物が小有機非ペプチド化合物である。更なる実施形態では、低分子は生合成ではない。
「特異的結合」という語は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には抗体が約10-7 M未満、例えば、約10-8 M、10-9Mまたは10-10 M以下の親和性(K D)で、解析対象物及び抗体として目的の抗原を使用するBIACORE(登録商標)アッセイ機器において表面プラズモン共鳴(SPR)テクノロジーによって決定される場合、解析対象物及び抗体として結合し、少なくとも1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.5-、3.0-、3.5-、4.0-、4.5-、5-、5.0-、6.0-、7.0-、8.0-、9.0-、または10.0倍以上の親和性で所定の抗原に結合する(e)g、BSA、カゼイン)は所定の抗原または密接に関連する抗原以外のものである。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。選択的結合が1つの抗原の結合を互いに区別する抗体の能力を指す。
「被検者」という用語はウイルス感染、例えば、SARS-CoV-2感染に罹患している任意の健康な動物、哺乳動物もしくはヒト、または任意の動物、哺乳動物もしくはヒトを指す。用語「被検者」は、「患者」と交換可能である
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間の「同一性パーセント」は「相同性パーセント」と同義であり、Karlin及びAltschul(ProcNatlAcadSciUSA 87、2264-2268、1990)のアルゴリズム、Karlin及びAltschul(ProcNatlAcadSciUSA 90、5873-5877、1993)によって改変されたアルゴリズムを使用して決定することができる。上記アルゴリズムは、Altschulら(JモルBiol。215、403-410、1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチドサーチはNBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行い、本明細書に記載のポリヌクレオチドに相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索は基準ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行われる。比較目的のためにギャップを有するアラインメントを得るために、Altschulら(Nucleic Acids Res。25、3389-3402、1997)に記載されているように、ギャップを有するBLASTを利用する。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)の初期パラメータが使用される。
「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書で使用される場合、対象化合物を1つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部に運搬または輸送することに関与する、物質を封入する液状または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒などの薬学的に許容される物質、組成物または媒体を意味する。
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」はバイオマーカー核酸の転写及び、もしあれば、RNA転写物の正常な転写後プロセシング(例えば、スプライシング)、及びRNA転写物の逆転写によって作製される成熟mRNAの全部または一部と相補的または相同的であるポリヌクレオチド(例えば、mRNA、hnRNA、cDNA、またはそのようなRNAもしくはcDNAのアナログ)である。
「T細胞」には、CD4+ T細胞及びCD8+T細胞が含まれる。T細胞という語はまた、Tヘルパー1型T細胞及びTヘルパー2型T細胞の両方を含む。「抗原提示細胞」という語は専門抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、ならびに他の抗原提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、及び乏突起膠細胞)を含む。
「T細胞レセプター」または「TCR」という語は、完全なTCRならびにその抗原結合部分または抗原結合フラグメントを包含すると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、TCRがαβ型またはγδ型のTCRを含む、無傷または完全長のTCRである。いくつかの実施形態ではTCRが全長TCR未満であるが、MHC-ペプチド複合体に結合するなど、MHC分子中に結合した特定ペプチドに結合する抗原結合部分である。いくつかの場合において、TCRの抗原結合部分またはフラグメントは全長または無傷のTCRの構造ドメインの一部のみを含み得るが、完全TCRが結合するMHC-ペプチド複合体などのペプチドエピトープに結合することができる。いくつかの場合において、抗原結合部分は比MHC-ペプチド複合体への結合のための結合部位を形成するのに充分な、TCRの可変ドメイン、例えば、TCRの可変α鎖及び可変β鎖を含む。一般に、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHC及び/またはMHC-ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域(CDR)を含む。
「治療効果」という用語は、薬理学的に活性な物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトにおける局所的または全身的効果を指す。したがって、この用語は、疾患の診断、硬化、軽減、処置または予防、または動物もしくはヒトにおける望ましい身体的もしくは精神的発達及び状態の向上における使用を意図した任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、任意の治療に適用可能な合理的な利益/リスク比率で、何らかの所望の局所または全身作用を生じるような物質の量を意味する。ある特定の実施形態に、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度などに依存する。例えば、本方法によって発見された特定の化合物は、このような治療に適用可能な妥当な利益/リスク比率をもたらすのに充分な量で投与することができる。
「治療有効量」及び「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益/リスク比率で、少なくともサブ集団の細胞において何らかの所望の治療効果をもたらすのに有効で化合物、物質、または化合物を含む化合物の量を意味する。対象化合物の毒性及び治療有効性は例えば、LD 50及びED 50を決定するための、細胞培養物または実験動物における通常の医薬品手続によって決定され得る。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。いくつかの実施形態でに、LD 50(致死量)を測定することができ、例えば、代理人の投与なしと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%またはそれ以上減少させることができる。同様に、ED 50(すなわち、症状(symptom)の最大阻害の半分を達成する濃度)を測定することができ、例えば、代理人について、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%またはそれ以上増加させることができる。また、同様に、IC 50を測定することができ、例えば、代理人について、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%またはそれ以上増加させることができる。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるT細胞免疫反応が少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはさらに100%増加し得る。別の実施形態では、ウイルス量の少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはさらに100%の減少が達成され得る。
被検者における疾患を「処理すること」または疾患を有する被検者を「処理すること」は少なくとも1つの疾患の症状(symptom)が低下するかまたは悪化を防止するように、被検者を薬学的処理、例えば薬物の投与に供することを指す。
「体液」という語は通常ではない流体(例えば、羊膜流体、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄流体、耳垢、カウパー流体またはプレ射精液、乳び、乳汁、糞便、雌射精液、侵入型流体、細胞内流体、リンパ液、月経、母乳、乳汁、粘液、胸腺液(pleural fluid)、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜流体、涙、尿、膣潤滑、硝子体液、嘔吐物)と同様に、身体から排泄または分泌される流体を指す。
「コーディング領域(coding region)」という用語はアミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、一方、「非コード領域」という用語はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域(例えば、5'及び3'非翻訳領域)を指す。
「相補的」という用語は、2つの核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の2つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第1の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第1の領域と逆平行である第2の核酸領域の残基と比水素結合(「塩基対合」)を形成することができることが知られている。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残渣は、残渣がグアニンである場合、第1の鎖と逆平行である第2の核酸鎖の残渣と塩基対合することができることが知られている。核酸の第1の領域は、2つの領域が逆平行に配置される場合、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対合することができる場合、同じまたは異なる核酸の第2の領域に相補的である。好ましくは、第1の領域は第1の部分を含み、第2の領域は第2の部分を含み、それによって、第1及び第2の部分が逆平行に配置される場合、第1の部分のヌクレオチド残渣の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が第2の部分のヌクレオチド残渣と塩基対合することができる。より好ましくは、第1の部分の全てのヌクレオチド残基が第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
本明細書で使用される場合、活性化免疫細胞に関して「共刺激する」という語は、共刺激分子が増殖またはエフェクター機能を誘導する第2の非活性化レセプター媒介シグナル(「共刺激シグナル」)を提供することができることを含む。例えば、共刺激シグナルは例えば、T細胞レセプター媒介シグナルを受けたT細胞において、サイトカイン分泌をもたらし得る。本明細書において、「活性化免疫細胞」とは、細胞レセプター媒介シグナルを、例えば、活性化レセプターを介して受けた免疫細胞を指す
「対象のための好適な処理計画を決定すること」という語は本解析の成果に基づいて、または本質的にまたは少なくとも部分的に基づいて、開始、改変及び/または終了される対象のための処理計画(すなわち、対象におけるウイルス感染の予防及び/または処理のために使用される単一の処理または様々な処理の組合せ)の決定を意味すると解釈される。例えば、術後に術後補助療法を開始し、再発のリスクを減らすことも、特定の化学療法の用量を変更することも考えられる。この判定は、本考案による解析の結果に加えて、治療される被検者の個人的特徴に基づくことができる。ほとんどの場合、被検者に適した治療計画の実際の決定は、主治医または医師によって行われる。
本明細書で使用される「補助剤」という用語は抗原の投与の前、一緒に、または後に投与されると、抗原単独の投与と比較して、抗原に対する免疫応答の質及び/または強度を加速、延長及び/または増強する物質を指す。補助剤は、ワクチン接種によって誘導される免疫応答の大きさ及び持続時間を増加させることができる。
本明細書で使用される「相同」は、同じ核酸鎖の2つの領域間、または2つの異なった核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域のヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占められる場合、領域はその位置で相同である。第1の領域は、各領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占められている場合、第2の領域と相同である。2つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占められる2つの領域のヌクレオチド残基位置の割合に関して表される。例えば、ヌクレオチド配列5'-ATTGCC-3'を有する領域及びヌクレオチド配列5'-TATGGC-3'を有する領域は、50%の相同性を共有する。好ましくは、第1の領域は第1の部分を含み、第2の領域は第2の部分を含み、それによって、各部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が同じヌクレオチド残基によって占められる。より好ましくは、各部分の全てのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占められている。
「免疫細胞」という語は、免疫反応に関与する細胞を指す。免疫細胞は造血起源のものであり、B細胞及びT細胞;ナチュラル・キラー細胞などのリンパ球;単球, マクロファージ,好酸球,マスト細胞,好塩基球、及び顆粒球などの骨髄性細胞を含む。
「SARS-CoV-2」または「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2」という語は、コロナウイルス病2019(COVID-19)の原因代理人を指す。SARS-CoV-2は、2020年3月11日に世界保健機関(WHO)によってパンデミックとして同定された。宿主細胞へのウイルスの侵入過程を支持する際、SARS-CoV2は、肺のII型肺胞細胞(AT2)、上部食道及び重層上皮細胞、ならびに回腸及び結腸からの吸収性腸細胞、胆管細胞、心筋細胞、腎近位尿細管細胞、ならびに膀胱尿路上皮細胞などの他の細胞などの下部気道において高度に発現されるACE2受容体に結合する。したがって、このウイルスに感染した患者は、急性呼吸窮迫症候群(ARD)をもたらす肺炎などの呼吸障害を経験するだけでなく、心臓、腎臓、及び消化管の障害も経験する。
SARS-CoV2ウイルスの根絶に特異的な治療法はない。SARS-CoVまたはMERS-CoV処理などの別のβコロナウイルスアプローチのための処理アプローチを使用することができる。ロピナビル/リトナビル、クロロキン、及びヒドロキシクロロキンを含むこれらのアプローチのいくつか。インターフェロンαのエアロゾル吸入は、一晩に2回も使用することができる。いくつかの場合において、リバビリンと組み合わせたインターフェロン-αの組み合わせは、一般的に使用されるコロナウイルス(例えば、MERS-CoV)を有する。インターフェロンとステロイド薬との併用は肺修理を加速し、酸素生存レベルを増加させることができることも見出された。しかしながら、インターフェロンαを用いた治療については一貫性のない結果が示されている。
SARS-CoV-2ウイルスは、ヒト及び他の哺乳動物に広く分布するサルベコウイルス、オルトコロナビリナサブファミリーに含まれる、エンベロープを有する、セグメント化されていない正センスRNAウイルスである。その直径は約65~125nmであり、RNAの一本鎖を含み、外表面上にクラウン様スパイクを備える。SARS-CoV2は以前に同定されたSARS-CoV及びMERS-CoVの後の新規βコロナウイルスであり、これは肺不全及び潜在的に致命的な気道感染をもたらし、主に広東、中国及びサウジアラビアにおいてアウトブレイクを引き起こした。
SARS-CoV-2のゲノムサイズは29.8kbから29.9kbまで変化し、そのゲノム構造は既知のCoVに対する特異的遺伝子特性に従った。ゲノムの3分の2より多い5'はorf1a/bポリタンパク質を符号化するorf1a/bを含み、3分の1は、スパイク(S)糖タンパク質、小包絡線(E)糖タンパク質、膜(M)糖タンパク質、及びヌクレオカプシド(N)タンパク質を含む4つの主要な構造タンパク質を符号化する遺伝子からなる。さらに、SARS-CoV-2は、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、及びORF8遺伝子によってコードされる6つの付属タンパク質を含む(Khailanyら(2020)Gene Rep 19:100682)。
ORF1ab遺伝子はコロナウイルスの最大の遺伝子セグメントであり、2つのORF、すなわちORF1a及びORF1bを構成し、リボソームフレームシフト事象に寄与することにより、2つの大きな重複ポリタンパク質pp1a(orf1aポリタンパク質)及びpp1ab(orf1abポリタンパク質)を産生する。ポリタンパク質はプロテアーゼ酵素、すなわち、nsp3及びnsp 5にコードされるパパイン様プロテアーゼ(PLpro)及びセリン型Mpro(キモトリプシン様プロテアーゼ(3CLpro))プロテアーゼによって補われる。続いて、開裂は、pp1aとpp1abとの間で、それぞれ非構造タンパク質(nsps)1~11及び1~16に起こる。nspはウイルスや宿主細胞の多くの過程で重要な役割を果たす。orf1aポリタンパク質及びorf1abポリタンパク質の代表的な配列を以下の表1Kに示す。
ORF3aは、SARS-CoV-2ゲノムによってコードされるアクセサリータンパク質の1つ。最近の研究は、SARS-CoV-2 ORF3aタンパク質の機能的ドメインが毒性、感染性、イオンチャネルフォーメーション、及びウイルス放出に関連することを示した(Issaら(2020)mSystems 5:e00266-20)。ORF3aの代表的な配列を以下の表1Kに示す。
ORF7aは別のSARS-CoV-2ゲノム符号化アクセサリータンパク質であり、主にゴルジ体に局在するが、細胞面上に見出すことができるI型膜貫通タンパク質から構成される。SARS-CoV ORF7aはウイルスゲノム中のORF7bと重複し、そこで転写調節配列(TRS)を共有する。いくつかの実施形態では、ORF7aが15-アミノ酸(aa)N末端シグナルペプチド、81-aa管腔ドメイン、21-aa膜貫通ドメイン、及び5-aa細胞質尾部を有する(テイラーら(2015) J.89:11820-11833).ORF7aの代表的な配列を以下の表1Kに示す。
スパイクまたはS糖タンパク質は、ウイルスの外側部分に見られる約150kDaの分子重量を有する膜貫通タンパク質である。Sタンパク質はウイルスのS1サブユニットに位置するRBDを有し、これは、宿主細胞、ACE2上のそのレセプターに結合することによって、ウイルスの宿主細胞への侵入を容易にする。Sタンパク質はウイルス表面に突出するホモ三量体を形成し、低気道細胞で発現されるアンギオテンシン変換酵素2(ACE2)との誘引により、外被ウイルスの宿主細胞への結合を促進する。この糖タンパク質は、宿主細胞フューリン様プロテアーゼによって2つのサブユニット、すなわちS1及びS2に切断される。パートS1は宿主ウイルス域の決定及びレセプター結合ドメイン構成による細胞指向性に関与し、一方、S2は、宿主細胞を伝達する際にウイルス融合を媒介するように機能する。S糖タンパク質の代表的な配列を以下の表1Kに示す。
Nタンパク質として知られるヌクレオカプシドは、ウイルスの核酸物質に構造的に結合する小胞体ゴルジ領域に局在するCoVの構造構成要素である。タンパク質はRNAに結合するので、ウイルスゲノム、ウイルス複製周期、及びウイルス感染に対する宿主細胞の細胞反応に関連する過程にタンパク質が関与する。Nタンパク質はまた、高度にリン酸化され、ウイルスRNAに対する親和性を増強する構造変化をもたらすことが示唆される。N糖タンパク質の代表的な配列を以下の表1Kに示す。
このウイルスの別の重要な部分は膜またはMタンパク質であり、これは、最も構造的に構造化されたタンパク質であり、ウイルス外被の形状を決定する役割を果たす。このタンパク質は、他のすべての構造タンパク質に結合することができる。Mタンパク質との結合は、ヌクレオカプシドまたはNタンパク質の安定化を助け、体内ビリオン内部のNタンパク質-RNA複合体を安定化することによってウイルス組立体の終了を促進する。Mタンパク質の典型的な配列を下表1Kに示す。
最後の構成要素は、このウイルスの製造及び成熟に関与する、SARS-CoV-2組織における最小のタンパク質であるエンベロープまたはEタンパク質である。
SARS-CoV-2のゲノム情報は公的に入手可能であり、例えば、NCBI重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2データベース(ncbi.nlm.nih.gov/SARS-cov-2/のインターネット上で入手可能)及びNGDCゲノム倉庫(bigd.big.ac.cn/gwh/に入手可能)から、配列決定された分離株についての疫学的データと共に得ることができる。特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝暗号(以下に示す)によって定義されるタンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列との間には、既知の明確な対応がある。同様に、遺伝暗号によって定義されるように、特定の核酸のヌクレオチド配列と、その核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には、既知の明確な対応が存在する。
遺伝暗号
アラニン(Ala、A) GCA、GCC、GCG、GCT
アルギニン(Arg、R) AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT
アスパラギン(Asn、N) AAC、AAT
アスパラギン酸(Asp, D) GAC、GAT
システイン(Cys、C) TGC, TGT
グルタミン酸(Glu, E) GAA、GAG
グルタミン(Gln、Q) CAA、CAG
グリシン(Gly、G) GGA、GGC、GGG、GGT
ヒスチジン(His、H) CAC、CAT
イソロイシン(Ile、I) ATA、ATC、ATT
ロイシン(Leu、L) CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG
リジン(Lys、K) AAA、AAG
メチオニン(Met、M) ATG
フェニルアラニン(Phe、F) TTC, TTT
プロリン(プロ、P) CCA、CCC、CCG、CCT
セリン(Ser、S) AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT
トレオニン(Thr、T) ACA、ACC、ACG、ACT
トリプトファン(Trp、W) TGG
チロシン(Tyr、Y) TAC、TAT
バリン(Val、V) GTA、GTC、GTG、GTT
終了信号(end) TAA、TAG、TGA
遺伝暗号の重要かつ既知の特徴はその冗長性であり、それによって、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の大部分について、2つ以上のコードヌクレオチド三つ組が使用され得る(上に示される)。したがって、いくつかの様々なヌクレオチド配列が、所与のアミノ酸配列をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列はすべての生物において同じアミノ酸配列の産生をもたらすので、機能的に等価であると考えられる(しかし、ある種の生物は、ある種の配列を他の生物よりも効率的に翻訳することができる)。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが、所与のヌクレオチド配列中に見出され得る。そのようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関係に影響を及ぼさない。
上記を考慮して、バイオマーカー核酸(またはその任意の一部)を符号化するDNAまたはRNAのヌクレオチド配列は、DNAまたはRNAをアミノ酸配列に翻訳するために遺伝暗号を使用して、ポリペプチドアミノ酸配列を誘導するために使用され得る。同様に、ポリペプチドアミノ酸配列について、ポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列は遺伝暗号から推定することができる(これはその冗長性のために、任意の所与のアミノ酸配列について多数の核酸配列を生成する)。したがって、本明細書における明細書及び/またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の明細書及び/または開示も含むと考えられるべきである。同様に、本明細書におけるポリペプチドアミノ酸配列の明細書及び/または開示は、アミノ酸配列をコードすることができる全ての考えられるヌクレオチド配列の明細書及び/または開示も含むと考えられるべきである。
II.ペプチド及び構築物
特定の態様では、同定されたSARS-COV-2免疫優性ペプチドまたは同定されたSARS-COV-2免疫優性ペプチドをコードする核酸の投与によるSARS-CoV-2に対する免疫反応の誘導を介したCOVD-19の治療及び/または防止のための方法物及び組成物が本明細書で提供される。
いくつかの態様では、少なくとも2つのペプチドエピトープ、または各が少なくとも2つのペプチドエピトープを含む少なくとも2つのペプチドフラグメントを含む免疫原性ポリペプチドが本明細書で提供される。これらの免疫原性ポリペプチドのペプチドエピトープに関連する様々な実施形態が以下に記載される(例えば、免疫優性ペプチドに関して記載されるペプチドエピトープは、免疫原性ポリペプチドの構成ペプチドエピトープでもあり得る)。
一定の例示的な免疫原性ポリペプチド(例えば、構築物)を、図1、図2、図5A~図5C、図6A~図6C、図7、図8、図9A、及び図9Bに示す。見られるように、免疫原性ポリペプチドは複数(例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29)ペプチドエピトープ(例えば、表1A~1Fからのもの)を含むことができ、任意選択で翻訳後切断セグメントがP2Aフラグメントで少なくとも2つのそのようなエピトープを有するSARS-CoV-2タンパク質のセグメントを含むことができ、Sタンパク質セグメント及び/またはリボソーム停止/再始動セグメント、IRESセグメント、及び/または翻訳後切断セグメントなどのさらなるセグメントをさらに有することができる。いくつかの実施形態では、対象のSARS-CoV-2タンパク質の断片が8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、49、40、41、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、57、58、59、60、61、62、63、64、65、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、1、82などのサイズによって定義することができる。83、84、85、92、86、95、92、95、95、101、102、103、106、108、109、112、113、114、115、116、117、118、119、120、135、140、155、160、165、170、185、190、205、210、215、220、235、240、255、260、265、270、275 280、295、280、305、315、320、330、335、340、345、350、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、 415、419、420、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1000、1005、1010、1015、1020、1025、1030、1035、1040、1045、1050、1055、1060、1065、1070、1075、1080、1085、1090、1095、1100、1105、1110、1115、1120、1125、1130、1135、1140、1145、1150、1155、1160、1165、1170、1175、1180、1185、1190、1195、1200、1205、1210、1215、1220、1235、1240、1245、1250、1255、1260、1265、1270、1271アミノ酸(AA)、または8~1271、30~40、15などの、両端を含む、その間の任意の範囲 -30、15-40、30-112、8-38、8-96、8-104、8-107、8-112、8-88、8-87、8-85、8-66、8-55、222-275、222-419、275-419、222~1271などが挙げられる。いくつかの実施形態では、最小のフラグメントが8Aにおけるエピトープである。いくつかの実施形態では、非エピトープフラグメントのための14のフラグメントワクチンコンストラクトが30~40AAであり、14のフラグメント=[3+9+3]エピトープ[3aa +エピトープ+ 3aa]における最小のフラグメントである。いくつかの実施形態ではでは、フラグメントにまたがるタンパク質の最大フラグメントは112 AAである。いくつかの実施形態では、Sタンパク質(1271 AAは38アミノ酸のフラグメントによってカバーされる。Nタンパク質(419 AA)が96 AA、104 AA、及び/または107 AA(例えば、N_Frag1 = 96 AA、N_Frag2 = 104 AA、及び/またはN_Frag3 = 107 AA)。いくつかの実施形態では、Orf3aタンパク質(275 AA)が85 AA、87 AA、及び/または88 AAの1つまたは複数のフラグメントによってカバーされる(例えば、3a_Frag1 = 88 AA、3a_Frag2 = 87 AA、及び/または3a_Frag 3 = 85 AA)。いくつかの実施形態では、Mタンパク質(222 AA)が55 AA及び/または66 AAの1つまたは複数のフラグメントによってカバーされる(たとえば、M_Frag1 = 66及び/またはM_Frag2 = 55)。
ある特定の実施形態に、SARS-COV-2免疫優性ペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープを含む(例えばからなる)。本明細書に記載のペプチドエピトープは、特定のアルファ鎖対立遺伝子を有する特定のHLA分子などのMHC分子と組み合わせることができる。例えば、表1AのペプチドはHLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0220、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、及び/またはHLA-A*274対立遺伝子;表1Cペプチドは以下によってコードされるHLA-A*03血清型を有するMHCと関連して同定されたHLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、及び/またはHLA-A*307;表1BのペプチドはHLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、及び/またはHLA-A*116対立遺伝子によってコードされるαがMHCに関連して同定され;表1DのペプチドはHLA-A*1101、HLA-A*1103、HLA-A*1104、及び/またはHLA-A*119対立遺伝子によってコードされるαがMHCに関連して同定された。HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405によってコードされるようなLA-A*24血清型A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、及び/またはHLA-A*2458対立遺伝子;ならびに表1Fペプチドは実施例においてさらに記載されるように、HLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715、及び/またはHLA-B*721対立遺伝子によってコードされるような、α鎖がHLA-B*07血清型を有するMHCと関連して同定された。いくつかの実施形態では、SARS-COV-2免疫優性ペプチドが表1Kから選択されるSARS-COV-2タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のSARS-COV-2免疫優性ペプチドが単独で、または補助剤と併用して投与される。
特定の態様では、本明細書に記載の1つまたは複数のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及び補助剤を含む組成物が本明細書に提供される。
［表１］ ［表２］ ［表３］ ［表４］ ［表５］ ［表６］ ［表７］
［化１］
>19_エピトープ_3aa_リンカー(288 aa)
YASALWEIQQVVDADHSYFTSDYYQLYSTQKHYVYIGDPAQLPAPDAYKTFPPTEPKKDKIWVATEGALNTPKDHIITVA
TSRTLSYYKLGAYALVYFLQSINFVRISLEIPRRNVATLQAEPNMMVTNNTFTLKGGAKNPLLYDANYFLCWHKDLSPRW
YFYYLGTGYYHTTDPSFLGRYMSAESLRPDTRYVLMDGRKVPTDNYITTYPGQCRFVTDTPKGPKVKYSTFKCYGVSPTK
LNDKYEQYIKWPWYIWLGSSSKLWAQCVQLHNDYVGYLQPRTFLLKYN

［化２］
>19_エピトープ_kaa_リンカー(228 aa)
ALWEIQQVVKAAFTSDYYQLYKAAVYIGDPAQLKAAKTFPPTEPKKAAATEGALNTPKKAAATSRTLSYYKKAAVYFLQS
INFKAAIPRRNVATLKAAMVTNNTFTLKKAALLYDANYFLKAASPRWYFYYLKAATTDPSFLGRYKAARPDTRYVLKAAP
TDNYITTYKAAVTDTPKGPKKAAKCYGVSPTKKAAQYIKWPWYIKAAKLWAQCVQLKAAYLQPRTFLL

［化３］
>19_epitope_no_linker (174 aa)
ALWEIQQVVFTSDYYQLYVYIGDPAQLKTFPPTEPKATEGALNTPKATSRTLSYYKVYFLQSINFIPRRNVATLMVTNNT
FTLKLLYDANYFLSPRWYFYYLTTDPSFLGRYRPDTRYVLPTDNYITTYVTDTPKGPKKCYGVSPTKQYIKWPWYIKLWA
QCVQLYLQPRTFLL

［化４］
>27_エピトープ_3aa_リンカー(412 aa)
HSYFTSDYYQLYSTQKHYVYIGDPAQLPAPYALVYFLQSINFVRIATYYLFDESGEFKLASHKNPLLYDANYFLCWHRKV
PTDNYITTYPGQITVATSRTLSYYKLGAPNMMVTNNTFTLKGGASIIKTIQPRVEKKKLKYEQYIKWPWYIWLGKDLSPR
WYFYYLGTGTYKNTCDGTTFTYASAVHAGTDLEGNFYGPFESLRPDTRYVLMDGQTACTDDNALAYYNTTSSSKLWAQCV
QLHNDYASALWEIQQVVDADDAYKTFPPTEPKKDKSTFKCYGVSPTKLNDAPSASAFFGMSRIGMLALLLLDRLNQLESK
SLEIPRRNVATLQAEYYHTTDPSFLGRYMSARDVDTDFVNEFYAYLCRFVTDTPKGPKVKYIWVATEGALNTPKDHIYVG
YLQPRTFLLKYN

［化５］
>27_エピトープ_kaa_リンカー(328 aa)
FTSDYYQLYKAAVYIGDPAQLKAAVYFLQSINFKAAYLFDESGEFKLKAALLYDANYFLKAAPTDNYITTYKAAATSRTL
SYYKKAAMVTNNTFTLKKAAKTIQPRVEKKAAQYIKWPWYIKAASPRWYFYYLKAANTCDGTTFTYKAAGTDLEGNFYKA
ARPDTRYVLKAACTDDNALAYYKAAKLWAQCVQLKAAALWEIQQVVKAAKTFPPTEPKKAAKCYGVSPTKKAAASAFFGM
SRKAALLLDRLNQLKAAIPRRNVATLKAATTDPSFLGRYKAADTDFVNEFYKAAVTDTPKGPKKAAATEGALNTPKKAAY
LQPRTFLL

［化６］
>27_epitope_nolinker (250 aa)
FTSDYYQLYVYIGDPAQLVYFLQSINFYLFDESGEFKLLLYDANYFLPTDNYITTYATSRTLSYYKMVTNNTFTLKKTIQ
PRVEKQYIKWPWYISPRWYFYYLNTCDGTTFTYGTDLEGNFYRPDTRYVLCTDDNALAYYKLWAQCVQLALWEIQQVVKT
FPPTEPKKCYGVSPTKASAFFGMSRLLLDRLNQLIPRRNVATLTTDPSFLGRYDTDFVNEFYVTDTPKGPKATEGALNTP
KYLQPRTFLL

表1時間
［化７］
>11_frag (500 aa)
YALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVA
TEGALNTPKDHIGTRNPEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADLNESLI
DLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYT
ELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYS
RYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLT
YTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVL
EGSVAYESLRPDTRYVLMDG

表1I
［化８］
> s-pp-p2a-19_エピトープ_3aa(1588 aa)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFD
NPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVY
SSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT
LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRV
QPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF
VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC
NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFL
PFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGS
NVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI
SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF
NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAG
TITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALN
TLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRV
DFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNT
FVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTRAKRSGS
GATNFSLLKQAGDVEENPGPYASALWEIQQVVDADHSYFTSDYYQLYSTQKHYVYIGDPAQLPAPDAYKTFPPTEPKKDK
IWVATEGALNTPKDHIITVATSRTLSYYKLGAYALVYFLQSINFVRISLEIPRRNVATLQAEPNMMVTNNTFTLKGGAKN
PLLYDANYFLCWHKDLSPRWYFYYLGTGYYHTTDPSFLGRYMSAESLRPDTRYVLMDGRKVPTDNYITTYPGQCRFVTDT
PKGPKVKYSTFKCYGVSPTKLNDKYEQYIKWPWYIWLGSSSKLWAQCVQLHNDYVGYLQPRTFLLKYN

［化９］
> s-pp-p2a-27_エピトープ_3aa(1712 aa)*
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFD
NPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVY
SSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT
LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRV
QPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF
VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC
NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFL
PFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGS
NVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI
SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF
NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAG
TITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALN
TLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRV
DFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNT
FVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTRAKRSGS
GATNFSLLKQAGDVEENPGPHSYFTSDYYQLYSTQKHYVYIGDPAQLPAPYALVYFLQSINFVRIATYYLFDESGEFKLA
SHKNPLLYDANYFLCWHRKVPTDNYITTYPGQITVATSRTLSYYKLGAPNMMVTNNTFTLKGGASIIKTIQPRVEKKKLK
YEQYIKWPWYIWLGKDLSPRWYFYYLGTGTYKNTCDGTTFTYASAVHAGTDLEGNFYGPFESLRPDTRYVLMDGQTACTD
DNALAYYNTTSSSKLWAQCVQLHNDYASALWEIQQVVDADDAYKTFPPTEPKKDKSTFKCYGVSPTKLNDAPSASAFFGM
SRIGMLALLLLDRLNQLESKSLEIPRRNVATLQAEYYHTTDPSFLGRYMSARDVDTDFVNEFYAYLCRFVTDTPKGPKVK
YIWVATEGALNTPKDHIYVGYLQPRTFLLKYN
* 注:図2(続き)の#2と記された27エピトープフラグメントは、35頁の「27_エピトープ_3aa_リンカー」と記された構築物のより正確な描写である。図2の構築物描写は図2(続き)に示される構築物描写のより早いバージョンであり、これらの構築物描写の各々は、図に提供される正確な構築物描写のより早い描写である。5-9.

［化１０］
>14_fragment (546 aa)
MLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKSLEIPRRNVATLQAELNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYSIIKTIQPRVEKKKLITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADKHYVYIGDPAQLPAP***

［化１１］
>B.1.617.2_S.PP_Epi-M/N/ORF3a (1099 aa)
MYASALWEIQQVVDADSSSKLWAQCVQLHNDKHYVYIGDPAQLPAPSLEIPRRNVATLQAERDVDTDFVNEFYAYLTYKNTCDGTTFTYASAPNMMVTNNTFTLKGGAATYYLFDESGEFKLASHYYHTTDPSFLGRYMSAESLRPDTRYVLMDGQTACTDDNALAYYNTTSIIKTIQPRVEKKKLCRFVTDTPKGPKVKYSTFKCYGVSPTKLNDRKVPTDNYITTYPGQVHAGTDLEGNFYGPFYVGYLQPRTFLLKYNGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPLSSMGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFKQGEIKDATPLDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAMSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEGLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKAYETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQAITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMV***

［化１２］
>B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3a (1221 aa)
MATYYLFDESGEFKLASHSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGRKVPTDNYITTYPGQQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYSTFKCYGVSPTKLNDRDVDTDFVNEFYAYLTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKHYVYIGDPAQLPAPSLEIPRRNVATLQAEVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTVHAGTDLEGNFYGPFSIIKTIQPRVEKKKLEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGYVGYLQPRTFLLKYNGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPLSSMGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFKQGEIKDATPLDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAMSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEGLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKAYETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQAITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMV***

表1J
［化１３］
>s-pp-p2a-11_frag (1800 aa)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFD
NPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVY
SSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT
LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRV
QPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF
VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC
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TIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDG

［化１４］
表1K
>YP_009724389(SARS-CoV-2 ORF1a/bタンパク質)
MESLVPGFNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEVLSEARQHLKDGTCGLVEVEKGVLPQLEQPYVFIKRSDARTAPHGHVMVELVAELEGIQYGRSGETLGVLVPHVGEIPVAYRKVLLRKNGNKGAGGHSYGADLKSFDLGDELGTDPYEDFQENWNTKHSSGVTRELMRELNGGAYTRYVDNNFCGPDGYPLECIKDLLARAGKASCTLSEQLDFIDTKRGVYCCREHEHEIAWYTERSEKSYELQTPFEIKLAKKFDTFNGECPNFVFPLNSIIKTIQPRVEKKKLDGFMGRIRSVYPVASPNECNQMCLSTLMKCDHCGETSWQTGDFVKATCEFCGTENLTKEGATTCGYLPQNAVVKIYCPACHNSEVGPEHSLAEYHNESGLKTILRKGGRTIAFGGCVFSYVGCHNKCAYWVPRASANIGCNHTGVVGEGSEGLNDNLLEILQKEKVNINIVGDFKLNEEIAIILASFSASTSAFVETVKGLDYKAFKQIVESCGNFKVTKGKAKKGAWNIGEQKSILSPLYAFASEAARVVRSIFSRTLETAQNSVRVLQKAAITILDGISQYSLRLIDAMMFTSDLATNNLVVMAYITGGVVQLTSQWLTNIFGTVYEKLKPVLDWLEEKFKEGVEFLRDGWEIVKFISTCACEIVGGQIVTCAKEIKESVQTFFKLVNKFLALCADSIIIGGAKLKALNLGETFVTHSKGLYRKCVKSREETGLLMPLKAPKEIIFLEGETLPTEVLTEEVVLKTGDLQPLEQPTSEAVEAPLVGTPVCINGLMLLEIKDTEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGDDTVIEVQGYKSVNITFELDERIDKVLNEKCSAYTVELGTEVNEFACVVADAVIKTLQPVSELLTPLGIDLDEWSMATYYLFDESGEFKLASHMYCSFYPPDEDEEEGDCEEEEFEPSTQYEYGTEDDYQGKPLEFGATSAALQPEEEQEEDWLDDDSQQTVGQQDGSEDNQTTTIQTIVEVQPQLEMELTPVVQTIEVNSFSGYLKLTDNVYIKNADIVEEAKKVKPTVVVNAANVYLKHGGGVAGALNKATNNAMQVESDDYIATNGPLKVGGSCVLSGHNLAKHCLHVVGPNVNKGEDIQLLKSAYENFNQHEVLLAPLLSAGIFGADPIHSLRVCVDTVRTNVYLAVFDKNLYDKLVSSFLEMKSEKQVEQKIAEIPKEEVKPFITESKPSVEQRKQDDKKIKACVEEVTTTLEETKFLTENLLLYIDINGNLHPDSATLVSDIDITFLKKDAPYIVGDVVQEGVLTAVVIPTKKAGGTTEMLAKALRKVPTDNYITTYPGQGLNGYTVEEAKTVLKKCKSAFYILPSIISNEKQEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPVCVETKAIVSTIQRKYKGIKIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGYVTHGLNLEEAARYMRSLKVPATVSVSSPDAVTAYNGYLTSSSKTPEEHFIETISLAGSYKDWSYSGQSTQLGIEFLKRGDKSVYYTSNPTTFHLDGEVITFDNLKTLLSLREVRTIKVFTTVDNINLHTQVVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHNSHEGKTFYVLPNDDTLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKYPQVNGLTSIKWADNNCYLATALLTLQQIELKFNPPALQDAYYRARAGEAANFCALILAYCNKTVGELGDVRETMSYLFQHANLDSCKRVLNVVCKTCGQQQTTLKGVEAVMYMGTLSYEQFKKGVQIPCTCGKQATKYLVQQESPFVMMSAPPAQYELKHGTFTCASEYTGNYQCGHYKHITSKETLYCIDGALLTKSSEYKGPITDVFYKENSYTTTIKPVTYKLDGVVCTEIDPKLDNYYKKDNSYFTEQPIDLVPNQPYPNASFDNFKFVCDNIKFADDLNQLTGYKKPASRELKVTFFPDLNGDVVAIDYKHYTPSFKKGAKLLHKPIVWHVNNATNKATYKPNTWCIRCLWSTKPVETSNSFDVLKSEDAQGMDNLACEDLKPVSEEVVENPTIQKDVLECNVKTTEVVGDIILKPANNSLKITEEVGHTDLMAAYVDNSSLTIKKPNELSRVLGLKTLATHGLAAVNSVPWDTIANYAKPFLNKVVSTTTNIVTRCLNRVCTNYMPYFFTLLLQLCTFTRSTNSRIKASMPTTIAKNTVKSVGKFCLEASFNYLKSPNFSKLINIIIWFLLLSVCLGSLIYSTAALGVLMSNLGMPSYCTGYREGYLNSTNVTIATYCTGSIPCSVCLSGLDSLDTYPSLETIQITISSFKWDLTAFGLVAEWFLAYILFTRFFYVLGLAAIMQLFFSYFAVHFISNSWLMWLIINLVQMAPISAMVRMYIFFASFYYVWKSYVHVVDGCNSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGVRRSFYVYANGGKGFCKLHNWNCVNCDTFCAGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVTVKNGSIHLYFDKAGQKTYERHSLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCEESSAKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSAEVAVKMFDAYVNTFSSTFNVPMEKLKTLVATAEAELAKNVSLDNVLSTFISAARQGFVDSDVETKDVVECLKLSHQSDIEVTGDSCNNYMLTYNKVENMTPRDLGACIDCSARHINAQVAKSHNIALIWNVKDFMSLSEQLRKQIRSAAKKNNLPFKLTCATTRQVVNVVTTKIALKGGKIVNNWLKQLIKVTLVFLFVAAIFYLITPVHVMSKHTDFSSEIIGYKAIDGGVTRDIASTDTCFANKHADFDTWFSQRGGSYTNDKACPLIAAVITREVGFVVPGLPGTILRTTNGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDSEYCRHGTCERSEAGVCVSTSGRWVLNNDYYRSLPGVFCGVDAVNLLTNMFTPLIQPIGALDISASIVAGGIVAIVVTCLAYYFMRFRRAFGEYSHVVAFNTLLFLMSFTVLCLTPVYSFLPGVYSVIYLYLTFYLTNDVSFLAHIQWMVMFTPLVPFWITIAYIICISTKHFYWFFSNYLKRRVVFNGVSFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSDVLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGAMDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGSDVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPRHVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQSAVKRTIKGTHHWLLLTILTSLLVLVQSTQWSLFFFLYENAFLPFAMGIIAMSAFAMMFVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLDMVDTSLSGFKLKDCVMYASAVVLLILMTARTVYDDGARRVWTLMNVLTLVYKVYYGNALDQAISMWALIISVTSNYSGVVTTVMFLARGIVFMCVEYCPIFFITGNTLQCIMLVYCFLGYFCTCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKNSIDAFKLNIKLLGVGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINKLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAFATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVIPDYNTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEISMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDAAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLKNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPMLQSADAQSFLNRVCGVSAARLTPCGTGTSTDVVYRAFDIYNDKVAGFAKFLKTNCCRFQEKDEDDNLIDSYFVVKRHTFSNYQHEETIYNLLKDCPAVAKHDFFKFRIDGDMVPHISRQRLTKYTMADLVYALRHFDEGNCDTLKEILVTYNCCDDDYFNKKDWYDFVENPDILRVYANLGERVRQALLKTVQFCDAMRNAGIVGVLTLDNQDLNGNWYDFGDFIQTTPGSGVPVVDSYYSLLMPILTLTRALTAESHVDTDLTKPYIKWDLLKYDFTEERLKLFDRYFKYWDQTYHPNCVNCLDDRCILHCANFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDGGCINANQVIVNNLDKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVENPHLMGWDYPKCDRAMPNMLRIMASLVLARKHTTCCSLSHRFYRLANECAQVLSEMVMCGGSLYVKPGGTSSGDATTAYANSVFNICQAVTANVNALLSTDGNKIADKYVRNLQHRLYECLYRNRDVDTDFVNEFYAYLRKHFSMMILSDDAVVCFNSTYASQGLVASIKNFKSVLYYQNNVFMSEAKCWTETDLTKGPHEFCSQHTMLVKQGDDYVYLPYPDPSRILGAGCFVDDIVKTDGTLMIERFVSLAIDAYPLTKHPNQEYADVFHLYLQYIRKLHDELTGHMLDMYSVMLTNDNTSRYWEPEFYEAMYTPHTVLQAVGACVLCNSQTSLRCGACIRRPFLCCKCCYDHVISTSHKLVLSVNPYVCNAPGCDVTDVTQLYLGGMSYYCKSHKPPISFPLCANGQVFGLYKNTCVGSDNVTDFNAIATCDWTNAGDYILANTCTERLKLFAAETLKATEETFKLSYGIATVREVLSDRELHLSWEVGKPRPPLNRNYVFTGYRVTKNSKVQIGEYTFEKGDYGDAVVYRGTTTYKLNVGDYFVLTSHTVMPLSAPTLVPQEHYVRITGLYPTLNISDEFSSNVANYQKVGMQKYSTLQGPPGTGKSHFAIGLALYYPSARIVYTACSHAAVDALCEKALKYLPIDKCSRIIPARARVECFDKFKVNSTLEQYVFCTVNALPETTADIVVFDEISMATNYDLSVVNARLRAKHYVYIGDPAQLPAPRTLLTKGTLEPEYFNSVCRLMKTIGPDMFLGTCRRCPAEIVDTVSALVYDNKLKAHKDKSAQCFKMFYKGVITHDVSSAINRPQIGVVREFLTRNPAWRKAVFISPYNSQNAVASKILGLPTQTVDSSQGSEYDYVIFTQTTETAHSCNVNRFNVAITRAKVGILCIMSDRDLYDKLQFTSLEIPRRNVATLQAENVTGLFKDCSKVITGLHPTQAPTHLSVDTKFKTEGLCVDIPGIPKDMTYRRLISMMGFKMNYQVNGYPNMFITREEAIRHVRAWIGFDVEGCHATREAVGTNLPLQLGFSTGVNLVAVPTGYVDTPNNTDFSRVSAKPPPGDQFKHLIPLMYKGLPWNVVRIKIVQMLSDTLKNLSDRVVFVLWAHGFELTSMKYFVKIGPERTCCLCDRRATCFSTASDTYACWHHSIGFDYVYNPFMIDVQQWGFTGNLQSNHDLYCQVHGNAHVASCDAIMTRCLAVHECFVKRVDWTIEYPIIGDELKINAACRKVQHMVVKAALLADKFPVLHDIGNPKAIKCVPQADVEWKFYDAQPCSDKAYKIEELFYSYATHSDKFTDGVCLFWNCNVDRYPANSIVCRFDTRVLSNLNLPGCDGGSLYVNKHAFHTPAFDKSAFVNLKQLPFFYYSDSPCESHGKQVVSDIDYVPLKSATCITRCNLGGAVCRHHANEYRLYLDAYNMMISAGFSLWVYKQFDTYNLWNTFTRLQSLENVAFNVVNKGHFDGQQGEVPVSIINNTVYTKVDGVDVELFENKTTLPVNVAFELWAKRNIKPVPEVKILNNLGVDIAANTVIWDYKRDAPAHISTIGVCSMTDIAKKPTETICAPLTVFFDGRVDGQVDLFRNARNGVLITEGSVKGLQPSVGPKQASLNGVTLIGEAVKTQFNYYKKVDGVVQQLPETYFTQSRNLQEFKPRSQMEIDFLELAMDEFIERYKLEGYAFEHIVYGDFSHSQLGGLHLLIGLAKRFKESPFELEDFIPMDSTVKNYFITDAQTGSSKCVCSVIDLLLDDFVEIIKSQDLSVVSKVVKVTIDYTEISFMLWCKDGHVETFYPKLQSSQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHFGAGSDKGVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDSDLNDFVSDADSTLIGDCATVHTANKWDLIISDMYDPKTKNVTKENDSKEGFFTYICGFIQQKLALGGSVAIKITEHSWNADLYKLMGHFAWWTAFVTNVNASSSEAFLIGCNYLGKPREQIDGYVMHANYIFWRNTNPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRLIIRENNRVVISSDVLVNN

［化１５］
>YP_009724390(SARS-CoV-2 Sタンパク質)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

［化１６］
>YP_009724397(SARS-CoV-2 Nタンパク質)
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA

［化１７］
>YP_009724391(SARS-CoV-2 orf3aタンパク質)
MDLFMRIFTIGTVTLKQGEIKDATPSDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPL

［化１８］
> YP_009724393.1(SARS-CoV-2 Mタンパク質)
MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ

［化１９］
> YP_009724395.1(SARS-CoV-2 orf7aタンパク質)
MKIILFLALITLATCELYHYQECVRGTTVLLKEPCSSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITLCFTLKRKTE
* 表1A~1Kに含まれるのは、ペプチドエピトープ、ならびに、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの全長にわたって表1A~1Kに列挙される任意の配列番号のアミノ酸配列と85~99%の同一性を含む間の任意の配列、またはそれらの一部である。そのようなポリペプチドは、本明細書においてさらに記載されるような全長ペプチドまたはポリペプチドの機能を有し得る。
表2
［化２０］
>19_エピトープ_3aa_リンカー(870 nt)
AtgtacgccagcgccctgtgggagatccagcaggtggtggacgctgatcacagctacttcacctctgattactaccagctttattctacacagaagcactacgtgtatatcggcgaccccgcccaactgcctgcccctgacgcctacaaaaccttcccccccacagaacccaaaaaggacaaaatctgggtcgccaccgagggcgccctgaacacccctaaagaccatatcatcaccgtggccacaagcagaaccctgagctattacaagctgggcgcttacgccctggtgtactttctgcagagcatcaacttcgtgcggatctccctggaaatccctaggcggaacgttgctaccctgcaggccgagcctaatatgatggtgaccaacaacaccttcaccctcaagggcggagccaagaaccccctgctgtacgacgccaattacttcctgtgctggcacaaggacctgtctccaagatggtatttctactacctgggcaccggctactaccacaccacagatccaagcttcctgggaagatacatgagcgctgaaagcctgagacctgataccagatacgtgctgatggacggcagaaaggtgcctaccgacaactacattaccacataccccggccagtgtagattcgtgacagacacccctaagggacctaaggtgaagtacagcacattcaagtgctacggcgtgtccccaacaaagctgaatgataaatacgagcagtacatcaagtggccttggtacatctggctgggcagcagctccaagctgtgggcccagtgcgtgcagctgcacaacgactacgtcggctacctgcaacctcggacatttctgctgaagtacaacTAG

［化２１］
>19_エピトープ_kaa_リンカー(690 nt)
AtggccctgtgggagatccagcaggttgtgaaggctgcattcacctctgattactaccagctgtacaaggccgccgtgtacatcggcgaccccgcccagctgaaggccgctaaaaccttcccccccaccgagcctaagaaagctgctgcaacagaaggcgccctgaatacacctaagaaagccgccgccacaagcagaacactgagctactacaagaaggccgctgtgtatttcctccagagcatcaacttcaaggccgctatccccaggcggaacgtggccaccctgaaagctgccatggtcaccaacaacacctttaccctgaagaaggccgccctgctgtacgacgccaattactttctgaaggccgcatctccacggtggtacttctactacctgaaggccgccaccaccgaccctagcttcctgggcagatacaaggccgccagacctgacaccagatacgtgctgaaagccgcccctaccgacaactacattacaacctacaaggccgccgtgacagatacccctaagggacctaaaaaggccgccaagtgctacggcgtgtccccaacaaagaaggccgctcagtacatcaagtggccttggtatatcaaggccgccaagctgtgggcccaatgtgtgcagctgaaggccgcctatctgcagcctagaaccttcctgctgTAG

［化２２］
>19_エピトープ_no_リンカー(528 nt)
AtggccctgtgggagatccagcaggtggtgttcaccagcgactactaccagctgtacgtgtacatcggcgaccccgctcagctgaagaccttcccacctaccgaacccaaggccaccgagggagccctgaacacccctaaggctacatctagaaccctgagctactacaaggtgtacttcctgcagtctatcaacttcatcccccggagaaacgtggccaccctgatggttaccaacaacacctttaccctgaagctgctgtacgacgccaattacttcctcagccctcggtggtatttctactaccttacaaccgaccctagcttcctgggcagatacagacctgacacaagatatgtgctgcctacagataattacatcaccacatacgtcaccgatacccccaaaggccctaaaaagtgctacggcgtgtcccctacaaagcagtacattaagtggccttggtacatcaagctgtgggcccagtgtgtgcagctgtatctgcaaccacggacatttctgctgTAG

［化２３］
>27_エピトープ_3aa_リンカー(1248 nt)
atgcacagctacttcaccagcgactactaccagctgtacagcacccagaagcactacgtgtacatcggcgaccccgcccagctgcccgccccctacgccctggtgtacttcctgcagagcatcaacttcgtgaggatcgccacctactacctgttcgacgagagcggcgagttcaagctggccagccacaagaaccccctgctgtacgacgccaactacttcctgtgctggcacaggaaggtgcccaccgacaactacatcaccacctaccccggccagatcaccgtggccaccagcaggaccctgagctactacaagctgggcgcccccaacatgatggtgaccaacaacaccttcaccctgaagggcggcgccagcatcatcaagaccatccagcccagggtggagaagaagaagctgaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcaaggacctgagccccaggtggtacttctactacctgggcaccggcacctacaagaacacctgcgacggcaccaccttcacctacgccagcgccgtgcacgccggcaccgacctggagggcaacttctacggccccttcgagagcctgaggcccgacaccaggtacgtgctgatggacggccagaccgcctgcaccgacgacaacgccctggcctactacaacaccaccagcagcagcaagctgtgggcccagtgcgtgcagctgcacaacgactacgccagcgccctgtgggagatccagcaggtggtggacgccgacgacgcctacaagaccttcccccccaccgagcccaagaaggacaagagcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctgaacgacgcccccagcgccagcgccttcttcggcatgagcaggatcggcatgctggccctgctgctgctggacaggctgaaccagctggagagcaagagcctggagatccccaggaggaacgtggccaccctgcaggccgagtactaccacaccaccgaccccagcttcctgggcaggtacatgagcgccagggacgtggacaccgacttcgtgaacgagttctacgcctacctgtgcaggttcgtgaccgacacccccaagggccccaaggtgaagtacatctgggtggccaccgagggcgccctgaacacccccaaggaccacatctacgtgggctacctgcagcccaggaccttcctgctgaagtacaacTGATAATAG

［化２４］
>27_エピトープ_kaa_リンカー(990 nt)
AtgtttacgtcagactactatcagctttacaaagcagccgtctatatcggggatcccgcccagcttaaagccgccgtgtatttcctgcagtccatcaacttcaaagcagcgtatttgttcgatgagtctggggagtttaaattgaaagctgccctcctctacgacgccaattattttcttaaagcggccccaacggataactatataacgacctacaaagcagctgccacatcccgaacactcagttattataagaaagcagccatggttacgaataacacttttacgctgaaaaaagctgcaaaaacgattcagccgcgggttgaaaagaaagctgcgcagtacataaagtggccatggtatatcaaagccgcctcccccagatggtacttctattatttgaaagcggccaacacatgcgacggtaccacgtttacatataaagctgcggggacagacttggaagggaatttttacaaggcggctcgcccagatacacgctacgttttgaaagccgcttgtactgatgataacgcattggcttactataaagcagcaaagctttgggcccagtgcgttcagctgaaggccgcagcgctctgggaaatccaacaggttgtgaaagccgcaaaaactttcccgccgacagaaccgaaaaaggcggcgaagtgctatggagtcagtcctactaaaaaggccgccgcgtcagccttctttggcatgagtcgcaaggctgctctgcttttggatcggctcaatcaactcaaagccgcaataccgagaaggaacgttgcgacattgaaggcggccacaacagacccgtcattcctgggcagatacaaggcagctgataccgacttcgtcaatgagttttacaaggcggcggtcactgacacaccgaaaggccccaaaaaggccgctgcgaccgagggtgcgttgaatacaccaaaaaaggcagcatatctccagccaaggacgttcctgctgTAG

［化２５］
>27_epitope_nolinker (756 nt)
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［化２６］
>11_frag (1506 nt)
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［化２７］
> s-pp-p2a-19_エピトープ_3aa(4767 nt)
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［化２８］
> s-pp-p2a-27_エピトープ_3aa(5139 nt)
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［化２９］
>14_fragment (1647 nt)
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［化３０］
>B.1.617.2_S.PP_Epi-M/N/ORF3a (3306 nt)
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［化３１］
>B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3a (3672 nt)
atggccacctactacctgttcgacgagagcggcgagttcaagctggccagccacagcaagctgatcgagtacaccgacttcgccaccagcgcctgcgtgctggccgccgagtgcaccatcttcaaggacgccagcggcaagcccgtgccctactgctacgacaccaacgtgctggagggcagcgtggcctacgagagcctgagacccgacaccagatacgtgctgatggacggcagaaaggtgcccaccgacaactacatcaccacctaccccggccagcagaccgcctgcaccgacgacaacgccctggcctactacaacaccaccaagggcggcagattcgtgctggccctgctgagcgacctgcaggacctgaagtgggccagattccccaagagcgacggcaccggcaccatctacaccgagctggagcccccctgcagattcgtgaccgacacccccaagggccccaaggtgaagtacagcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctgaacgacagagacgtggacaccgacttcgtgaacgagttctacgcctacctgacctacaagaacacctgcgacggcaccaccttcacctacgccagcgccctgtgggagatccagcaggtggtggacgccgacctgagagtggaggccttcgagtactaccacaccaccgaccccagcttcctgggcagatacatgagcgccctgaaccacaccaagaagtggaagcactacgtgtacatcggcgaccccgcccagctgcccgcccccagcctggagatccccagaagaaacgtggccaccctgcaggccgaggtgctgcagcagctgagagtggagagcagcagcaagctgtgggcccagtgcgtgcagctgcacaacgacatcctgctggccaaggacaccgtgcacgccggcaccgacctggagggcaacttctacggccccttcagcatcatcaagaccatccagcccagagtggagaagaagaagctggagaagtactgcgccctggcccccaacatgatggtgaccaacaacaccttcaccctgaagggcggcgcccccaccaaggtgaccttcggctacgtgggctacctgcagcccagaaccttcctgctgaagtacaacggcgacggcaagatgaaggacctgagccccagatggtacttctactacctgggcaccggccccgaggccggcctgccctacggcgccaacaaggacggcatcatctgggtggccaccgagggcgccctgaacacccccaaggaccacatcggcaccagaaaccccgccaacaacgccgccatcgtgctgcagctgccccagggcaccaccctgcccaagggcttctacgccgagggcagcagaggcggcagccaggccagcagcagaagcagcagcagaagcagaaacagcagcagaaacagcacccccggcgagaagtgggagagcggcgtgaaggactgcgtggtgctgcacagctacttcaccagcgactactaccagctgtacagcacccagctgagcaccgacaccggcgtggagcacgtgaccttcttcatctacaacaagatcgtggacgagcccgaggagcacgtgcagatccacaccatcgacggcagcagcggcgtggtgaaccccgtgatggagcccatctacgacgagcccaccaccaccaccagcgtgcccctgagcagcatgggcaccagccccgccagaatggccggcaacggcggcgacgccgccctggccctgctgctgctggacagactgaaccagctggagagcaagatgagcggcaagggccagcagcagcagggccagaccgtgaccaagaagagcgccgccgaggccagcaagaagcccagacagaagagaaccgccaccaaggcctacaacgtgacccaggccttcggcagaagaggccccgagcagacccagggcaacttcggcgaccaggagctgatcagacagggcaccgactacaagcactggccccagatcgcccagttcaagcagggcgagatcaaggacgccacccccctggacttcgtgagagccaccgccaccatccccatccaggccagcctgcccttcggctggctgatcgtgggcgtggccctgctggccgtgttccagagcgccagcaagatcatcaccctgaagaagagatggcagctggccctgagcaagggcgtgcacttcgtgtgcaacctgctgctgctgttcgtgaccgtgtacagccacctgctgctggtggccgccggcctggaggccatgagcgacaacggcccccagaaccagagaaacgcccccagaatcaccttcggcggccccagcgacagcaccggcagcaaccagaacggcgagagaagcggcgccagaagcaagcagagaagaccccagggcctgcccaacaacaccgccagctggttcaccgccctgacccagcacggcaaggagggcctgaagttccccagaggccagggcgtgcccatcaacaccaacagcagccccgacgaccagatcggctactacagaagagccaccagaagaatcagaggcctgttcgccagaaccagaagcatgtggagcttcaaccccgagaccaacatcctgctgaacgtgcccctgcacggcaccatcctgaccagacccctgctggagagcgagctggtgatcggcgccgtgatcctgagaggccacctgagaatcgccggccaccacctgggcagatgcgacatcaaggacctgcccaaggagcccttcctgtacctgtacgccctggtgtacttcctgcagagcatcaacttcgtgagaatcatcatgagactgtggctgtgctggaagtgcagaagcaagaaccccctgctgtacgacgccaactacttcctgtgctggcacaccaactgctacgactactgcatcccctacaacagcgtgaccagcagcatcgtgatcaccagcggcgacggcaccaccagccccatcagcgagcacgactaccagatcggcggctacaccgcccccagcgccagcgccttcttcggcatgagcagaatcggcatggaggtgacccccagcggcacctggctgacctacaccggcgccatcaagctggacgacaaggaccccaacttcaaggaccaggtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagaccttcccccccaccgagcccaagaaggacaagaagaagaaggcctacgagacccaggccctgccccagagacagaagaagcagcagaccgtgaccctgctgcccgccgccgacctggacgacttcagcaagcagctgcagcagagcatgagcagcgccgacagcacccaggccatcaccgtggccaccagcagaaccctgagctactacaagctgggcgccagccagagagtggccggcgacagcggcttcgccgcctacagcagatacagaatcggcaactacaagctgaacaccgaccacagcagcagcagcgacaacatcgccctgctggtgcagctgaacgagagcctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgTGATAATAG

［化３２］
>s-pp-p2a-11_frag (5403 nt)
atgttcgtttttctggttctgctgccactcgtgtcaagtcagtgcgtgaaccttactacaaggactcagctcccaccagcatacacgaatagttttacgcggggcgtgtactatccagacaaagtgtttcgcagctctgttctacattcaactcaagacctgtttttgcctttcttctccaatgtgacctggttccacgccatccacgtgagtggcacgaacgggaccaaacggtttgataacccagtgctgccttttaacgacggggtatatttcgcctctactgaaaaatccaacatcatccgcggctggattttcgggaccactcttgactccaagacccagtcactcctgatcgtaaacaatgcgaccaacgtcgtgattaaggtgtgcgagtttcaattctgtaacgaccctttcctgggtgtatattaccacaagaataataagtcctggatggaatcagagtttagagtatactctagcgctaacaactgtacttttgaatatgtgtcccaacccttcttgatggacttggagggaaaacagggaaattttaagaatctccgagagttcgtgtttaaaaacattgacggctatttcaagatatactctaagcatacacccatcaatctggtccgcgatctgccacaggggtttagcgcactggaaccgttggtggatctccccattgggattaatatcacccgtttccagacacttttagccttgcatcggagctacctaacccccggggactcaagtagcggctggactgcgggagcggccgcctattatgtcggatatctgcagcctcggacattcctcctgaagtacaatgagaatggcacaattacagacgcagtagactgtgccctggatccgctctccgaaaccaaatgcacgctgaaatcatttacggtggaaaaaggtatataccagaccagcaatttcagggtgcagcctacggagtccattgtccgtttccccaatatcaccaatctgtgtcctttcggcgaagtgtttaacgcaactaggttcgcgagtgtctacgcctggaaccgaaagagaatctcaaactgtgtggccgattacagcgtcctgtacaactccgcatctttcagtaccttcaagtgctacggggtcagccccaccaaacttaacgatctttgcttcactaacgtttatgccgatagttttgtcatcaggggcgacgaagtgcgacagattgcccctggacagacgggaaagatcgccgactataactataagctgccagacgatttcacaggatgcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggactctaaggtgggggggaattataattatttgtatagactgtttcgaaagtcaaaccttaagccatttgagagggatatcagcacagagatttaccaggcaggaagcaccccatgtaacggggtagaaggcttcaactgctacttccccctccagtcatatgggttccagcctaccaatggtgtgggttaccagccgtacagagtagtggttctttcatttgagctgctgcatgcccctgccaccgtctgcggacctaaaaaatctaccaatttagtgaaaaataagtgcgtgaattttaatttcaacggccttacgggcaccggcgtgctgactgagagcaataagaaattcttaccatttcagcagttcggccgcgacatagctgataccaccgatgcagttcgcgacccccagaccctggagatccttgacatcactccttgcagtttcggaggagtctcggtcatcacacctggaacaaacacatccaaccaggtggcagttctttaccaggatgtgaactgtaccgaagtgccagtggcaatccacgccgatcagttaactcccacctggagagtgtactctacaggctctaacgtcttccagactcgggccggttgccttattggggctgagcacgtgaacaactcctacgagtgcgacatacctattggtgccggcatctgtgccagctaccagacccaaaccaattcgccaaggcgagcgcgttctgtagcaagccagtcgattattgcctacactatgtccttaggtgctgagaactctgtggcttactctaacaactccatagcaattccaacaaactttacaattagtgttactactgaaatcttgcccgtcagcatgactaaaacctctgtcgattgtaccatgtacatttgtggggactctacagagtgcagcaatcttctgctccagtacggctctttttgtacgcagctgaaccgtgctctgactgggattgccgtcgagcaagataagaacacccaggaggtgtttgcccaagttaagcagatttataagacaccacccatcaaagacttcggcggatttaacttttctcagattctgcccgacccctccaagcccagcaagaggagctttatcgaggacctgctgttcaataaggtcacactcgctgatgcaggattcatcaagcagtatggcgattgcctcggagacatcgctgcgagagacctcatatgcgctcagaaattcaatggcctgacggtgctacctccgctactgactgacgaaatgatagctcagtacacgtcggctctcttggccggaacaatcacctccggatggacctttggcgcgggagcagcactacagatcccttttgcaatgcaaatggcttaccggttcaatggcataggggtaactcaaaatgtgctgtacgagaaccaaaaattgatcgctaaccagttcaacagcgccattgggaagatccaggattctttgtcctcaaccgccagtgcattgggcaagctccaggacgtcgttaaccagaacgctcaggccttaaacacgctggtcaaacagttgtcctccaattttggcgctatatccagcgttctcaatgatatcctttcccgcttagatccaccagaagctgaggtccaaattgataggttaataaccggcagactccagagcctgcaaacttacgtcacccagcaactcatacgcgccgcggagatccgcgctagcgcaaacctagctgccactaaaatgagtgagtgtgttctcggacagtctaagcgggtggacttttgcggcaaaggctatcacctcatgagcttcccccaaagcgcaccacatggcgttgtgttcttgcacgtgacttacgttcccgcacaggagaaaaatttcaccacagcccccgccatctgccatgatgggaaagctcattttccacgagaaggggtgttcgtgtcaaacggtacacactggtttgtcacacaaagaaatttttatgaacctcaaattatcacaactgacaataccttcgtgagcggaaactgtgatgtcgtaattgggatcgtaaacaacactgtgtatgacccccttcagcccgaactggacagtttcaaggaagagcttgacaagtatttcaagaaccatacttcaccagacgtagaccttggtgatatttcaggaatcaacgctagtgtggtgaacatccagaaagaaattgatcgcctcaatgaggtcgcgaaaaatctgaatgagtctctgatcgacctgcaagagttggggaagtacgaacagtatattaaatggccctggtacatttggctgggatttatagctggactcattgccattgttatggtcacaataatgctgtgttgcatgactagctgttgctcatgcctaaaagggtgctgcagttgcggctcctgttgcaagtttgatgaagacgatagcgagccggtccttaaaggcgttaagctacattatactagggctaagagatccggcagtggggcgaccaactttagcttgttgaagcaagcaggggacgtggaagaaaaccccggcccttacgccctagtgtactttctgcagtccattaacttcgttcggattatcatgaggttgtggctgtgttggaagtgtcggtcgaagaatccactcctgtacgatgcaaattactttctgtgctggcacggagacggcaaaatgaaagacctgtccccgagatggtatttttattatctgggtaccggtcccgaggcggggctgccctacggggcaaacaaagacggaatcatctgggtcgcaacagagggagctcttaatacacctaaagatcacattggcacccgcaatcccgagaagtactgtgccctggcccccaatatgatggtgacaaataacacctttacattaaagggcggggccccaaccaaggtgacattcggtacatacaagaatacctgtgacggcacaacgttcacgtatgcaagcgctctgtgggagatccaacaggtggtggacgccgacctgaatgaaagtctgattgatctccaggaactcggcaaatatgagcagtatatcaagtggccttggtacatctggctcggttttatcgctggtcttatcgccatcgtgatggtgcagactgcttgcaccgatgataatgcactcgcgtactacaacaccacaaaaggaggacgatttgtgctagccctgctcagtgatctgcaagatctcaaatgggcccgcttcccgaagtccgatggaaccggcacaatctatacagaattggaacctccttgtaggttcgtgaccgatactcccaagggtcccaaggtaaaatacctgcgggtagaagcttttgaatactaccacactactgacccatcttttctgggcagatatatgtctgcattaaatcacaccaaaaagtggataacagtggccacctcccggacactgtcatactataaactgggtgcatcccagcgggttgctggtgattccggattcgccgcctattcgcggtatagaatagggaattacaagttgaataccgaccactccagttctagtgataacatagccctgctggttcaggttcttcagcagctgagagtagaatcttccagcaagctgtgggcccagtgtgttcaactccacaa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>YP_009724389(SARS-CoV-2 ORF1a/bタンパク質)

>YP_009724390(SARS-CoV-2 Sタンパク質)

>YP_009724397(SARS-CoV-2 Nタンパク質)

>YP_009724391(SARS-CoV-2 orf3aタンパク質)

> YP_009724393.1(SARS-CoV-2 Mタンパク質)

> YP_009724395.1(SARS-CoV-2 orf7aタンパク質)
* 表2には、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性を有する、またはそれらの全長にわたって85~99%の同一性を含む、表1A~1Kのいずれか1つ。そのような核酸配列は本明細書にさらに記載されるような全長ペプチドまたはポリペプチドの1つまたは複数の機能を有するポリペプチドをコードすることができ、RNA核酸分子(例えば、ウレジンで置換されたチミン)を表すこともできる。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、orf1a/bポリペプチド及び/またはorf1a/bポリペプチドをコードする核酸である。Orf1a/bポリペプチドは、orf1a/bポリタンパク質のアミノ酸配列、及び/またはorf1a/b特異的免疫応答を誘発するのに十分な長さのorf1a/bアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態に、orf1a/bポリペプチドはアミノ酸配列に対応しないアミノ酸(例えば、orf1a/bアミノ酸配列及び非orf1a/bタンパク質またはポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)も含む。いくつかの実施形態では、orf1a/bポリペプチドがorf1a/bポリタンパク質またはそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
いくつかの実施形態では、orf1a/bポリペプチドが表1Kに記載のorf1a/bタンパク質アミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、700、600、700、800、600、800、900、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、65000、または7000。いくつかの実施形態では、連続するアミノ酸が表1Kに記載されるorf1a/bのアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、orf1a/bポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるorf1a/bペプチドエピトープからなる群から選択される1つまたは複数のペプチドエピトープを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
本明細書において提供されるいくつかの実施形態では、Sタンパク質ポリペプチド及び/またはSタンパク質ポリペプチドをコードする核酸である。Sタンパク質ポリペプチドは、Sタンパク質ポリタンパク質のアミノ酸配列、及び/またはSタンパク質特異的免疫反応を誘発するのに充分な長さのSタンパク質アミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態に、Sタンパク質ポリペプチドはアミノ酸配列に対応しないアミノ酸(例えば、Sタンパク質アミノ酸配列及び非Sタンパク質またはポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)も含む。いくつかの実施形態では、Sタンパク質ポリペプチドがSタンパク質ポリタンパク質またはそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態に、Sタンパク質ポリペプチドは、表1Kに記載のSタンパク質アミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、500、600、650、700、750、800、850、900、1000、1050、1100、1150、1200、または1250個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、連続するアミノ酸が表1Kに記載されるSタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、Sポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるSペプチドエピトープからなる群から選択される1つまたは複数のペプチドエピトープを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
本明細書において提供されるいくつかの実施形態では、Nタンパク質ポリペプチド及び/またはNタンパク質ポリペプチドをコードする核酸である。Nタンパク質ポリペプチドは、Nタンパク質ポリタンパク質のアミノ酸配列、及び/またはNタンパク質特異的免疫反応を誘発するのに充分な長さのNタンパク質アミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態に、Nタンパク質ポリペプチドはアミノ酸配列に対応しないアミノ酸(例えば、Nタンパク質アミノ酸配列及び非Nタンパク質またはポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)も含む。いくつかの実施形態では、Nタンパク質ポリペプチドがNタンパク質ポリタンパク質またはそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態に、Nタンパク質ポリペプチドは、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、80、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、または表1Kに記載のNタンパク質アミノ酸配列の300個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、連続するアミノ酸が表1Kに記載されるNタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、Nポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるNペプチドエピトープからなる群から選択される1つまたは複数のペプチドエピトープを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
本明細書において提供されるいくつかの実施形態では、Mタンパク質ポリペプチド及び/またはMタンパク質ポリペプチドをコードする核酸である。Mタンパク質ポリペプチドは、Mタンパク質ポリタンパク質のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、及び/またはMタンパク質特異的免疫反応を誘発するのに充分な長さのMアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態に、Mタンパク質ポリペプチドはアミノ酸配列に対応しないアミノ酸(例えば、Mタンパク質アミノ酸配列及び非Mタンパク質またはポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)も含む。いくつかの実施形態では、Mタンパク質ポリペプチドがNタンパク質ポリタンパク質またはそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態に、Mタンパク質ポリペプチドは、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、または220個の表1Kに記載のMタンパク質アミノ酸配列の連続アミノ酸を含むか、それから本質的になるか、それからなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、連続するアミノ酸が表1Kに記載されるMタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、Mポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるMペプチドエピトープからなる群から選択される1つまたは複数のペプチドエピトープを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、orf3aポリペプチド及び/またはorf3aポリペプチドをコードする核酸である。Orf3aポリペプチドは、orf3aポリタンパク質のアミノ酸配列、及び/またはorf3a特異的免疫応答を誘発するのに十分な長さのorf3aアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態に、orf3aポリペプチドはアミノ酸配列に対応しないアミノ酸(例えば、orf3aアミノ酸配列及び非orf3aタンパク質またはポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)も含む。いくつかの実施形態では、orf3aポリペプチドがorf3aポリタンパク質またはそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態に、orf3aポリペプチドは、表1Kに記載のorf3aアミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、または270個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、それからなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、連続するアミノ酸が表1Kに示されるorf3aタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、orf3aポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるorf3aペプチドエピトープからなる群から選択される1つまたは複数のペプチドエピトープを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、orf7aポリペプチド及び/またはorf7aポリペプチドをコードする核酸である。Orf7aポリペプチドは、orf7aポリタンパク質のアミノ酸配列、及び/またはorf7a特異的免疫応答を誘発するのに十分な長さのorf7aアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態に、orf7aポリペプチドはアミノ酸配列に対応しないアミノ酸(例えば、orf7aアミノ酸配列及び非orf7aタンパク質またはポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)も含む。いくつかの実施形態では、orf7aポリペプチドがorf7aポリタンパク質またはそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態に、orf7aポリペプチドは、表1Kに記載のorf7aアミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、または120個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、連続するアミノ酸が表1Kに示されるorf7aタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、orf7aポリペプチドが表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるorf7aペプチドエピトープからなる群から選択される1つまたは複数のペプチドエピトープを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
当業者に既知であるように、実質的な配列類似性を有するポリペプチドは、宿主動物において同一または非常に類似した免疫反応を引き起こし得る。したがって、本明細書に記載されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチドまたはそのフラグメントのいくつかの実施形態では、誘導体、等価物、バリアント、フラグメント、または変異体も、本明細書に提供される方法物及び構成物に適し得る。
SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドのいくつかの実施形態では、バリエーションまたは誘導体が本明細書において提供される。改変されたポリペプチドは例えば保存的置換によって改変されたアミノ酸配列を有し得るが、未改変のタンパク質抗原と反応する免疫反応を依然として誘発し、機能的等価物とみなされる。本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。同じ保存基内のアミノ酸が典型的にはタンパク質の機能に実質的に影響を及ぼすことなく、互いに置換し得ることは当技術分野において周知である。ある特定の実施形態によれば、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドのリガンド結合ドメインの誘導体、等価物、バリアント、または変異体は、本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチドまたはそのフラグメントの配列と少なくとも85%相同であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、相同性が少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、またはそれ以上である。
本開示に包含される免疫原性ペプチドはSARS-CoV-2タンパク質に由来するペプチドエピトープ、例えば、表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fに列挙されるものを含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドが8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドアミノ酸配列が保存的または非保存的変異を含み得る、修飾される。ペプチドは、最大で1、2、3、4、またはそれ以上の変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドが少なくとも1、2、3、4、またはそれ以上の変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは化学的に修飾され得る。例えば、ペプチドを変異させて、検出可能性、安定性、体内分布、薬物動態、半減期、表面電荷、疎水性、結合部位、pH、機能などのペプチド特性を修飾することができる。N-メチル化は、本発明に包含されるペプチドにおいて起こり得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドがホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元性メチル化などによる遊離アミン上のメチル化によって修飾され得る。
化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、バイオポリマー、両性ポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Fc領域、パルミチン酸もしくはミリストレートなどの単飽和炭素鎖、またはアルブミンを含み得る。Fc領域によるペプチドの化学修飾は、溶融Fc-ペプチドであり得る。ポリアミノ酸は例えば、反復単一アミノ酸(例えば、ポリグリシン)を有するポリアミノ酸配列、及びパターンに従っても従わなくてもよい混合ポリアミノ酸配列を有するポリアミノ酸配列、または前述の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では的に、本発明に包含されるペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び/または半減期を増大させるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、疎水性部分のアタッチメント(attachment)、例えば、N末端、該C末端、または内部アミノ酸を使用して、本願に包含されるペプチドの半減期を延長することができる。他の実施形態において、ペプチドは例えば、血清半減期に影響し得る翻訳後修飾(例えば、メチル化及び/またはアミド化)を含み得る。いくつかの実施形態では、(例えば、ミリストイル化及び/またはパルミチル化による)簡単な炭素鎖を融合タンパク質またはペプチドにコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態ではとして、単鎖炭素鎖は、融合タンパク質またはペプチドを、コンジュゲートしていない物質から容易に分離可能にし得る。例えば、非コンジュゲート物質から融合タンパク質またはペプチドを分離するために使用され得る方法としては溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。脂溶性部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延長することができる。コンジュゲートされた部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介してペプチドの半減期を延長する脂溶性部分であってもよい。いくつかの実施形態ではとして、脂溶性部分は、コレステロールまたはコレステン、コレスタン、コレスタジエン及びオキシステロールを含むコレステロール誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、該ペプチドがミリスチン酸(テトラデカン酸)またはその誘導体にコンジュゲートされ得る。他の実施形態において、ペプチドは半減期修飾代理人にカップリングされ得る(例えば、共役され得る)。半減期改変代理人としてはポリマー、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ(アミノ酸)、プロリン、アラニン、セリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、セリンを含む水溶性ポリマー、Fc領域、脂肪酸、パルミチン酸、又はアルブミンに結合する分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはリンカーが別の分子への共役または溶融を容易にするために、ならびにそのようなコンジュゲートまたは溶融分子からのペプチドの切断を容易にするために、スペーサーまたはリンカーとして働く1、2、3、4、またはそれ以上のアミノ酸残基などのペプチドにカップリングされ得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質またはペプチドが例えば、ペプチドの特性を改変または変化させることができる他の部分にコンジュゲートすることができる。
ペプチドは、画像化、リサーチ、治療、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート化療法、標的化薬物デリバリー、及び放射線療法において使用される代理人にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、ペプチドが検出可能な代理人、例えば、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤代理人、ナノ粒子、含金属ナノ粒子、金属キレート、X-線造影剤代理人、ポリエチレンテレフタレート代理人、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート化剤、または画像化に使用することができる別の好適な物質とコンジュゲートまたは融合させることができる。いくつかの実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の検出可能な部分がペプチドに連結され得る。放射性同位体の非限定的な実例としては、アルファ発光、ベータ発光、陽電子発光、及びガンマ発光が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体がアクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では的に、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、その放射性同位体がアクチニウム-225または鉛-212である。いくつかの実施形態では、近赤外色素が生物学的組織及び流体によって容易に消光されない。いくつかの実施形態ではフルオロフォアが650nmと4000nmとの間の波長で電磁波を発光する蛍光代理人であり、そのような発光はそのような代理人を検出するために使用される。コンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的な例としては、DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800、またはインドシアニングリーン(ICG)が挙げられる。いくつかの実施形態では、近赤外色素が多くの場合、シアニン色素(例えば、Cy7、Cy5.5、及びCy5)を含む。結合分子としての使用のための蛍光色素のさらなる非限定的な例は本発明がアクラジンオレンジ、アレクサフルオル(Alexa Fluor)790、750、700、680、660、及び647)及びその任意の誘導体、7-アクチノマイシンD、8-アニリノナフタレン-1-スルホン酸、ATTO染料及びその任意の誘導体、ベンサントロン、ビマン、9-10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、5,12-ビス(フェニルエチニル)ナフタセン、ビスベンズイミド、ブラインボウ、カルセイン、カルボジフルオレセイン及びその任意の誘導体、1-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン及びその任意の誘導体、DAPI、DiOC6、DyLight Fluors及びその任意の誘導体、エピコココノン、エチジウムブロミド、Fluo染料及びその任意の誘導体を含む。フルオロプローブ及びその任意の誘導体、フルオレセイン及びその任意の誘導体、フラ及びその任意の誘導体、ゲルグリーン及びその任意の誘導体、ゲルレッド及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及びその任意の誘導体、mアイソフォームタンパク質及びその任意の誘導体 例えば、mCherry、ヘタメチン色素及びその任意の誘導体、エスクスト染色、イミノクマリン、インジアンイエロー、インド-1及びその任意の誘導体、ラウルダン、ルシフェルイエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、ルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ニレ色素及びその任意の誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、リボグレン、RoGFP、ルブレン、スチルベン及びその任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、SYBR及びその任意の誘導体、。他の適切な蛍光染料としては、フルオレセイン及びフルオレセイン染料(例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはFITC、4'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインまたはFAMなど)、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、フィコエリトリン、エオシン、ローダミン染料(例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはTAMRA、カルボキシローダミン6G、カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、リサミンローダミンB、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン(TMR)など)、クマリン及びクマリン染料(例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン(AMCA等)、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514等)、テキサスレッド、テキサスレッドX、スペクトラムレッド、シアニン色素(例えばCY-3、Cy-5、CY -3.5、CY-5.5、ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680など)、BODIPY色素(BODIPY FL、BODIPR6g、BODIPTMR、BODIP530/550、BODIP564/570、BODIP576/589、BODIP581/591、BODIP630/650、BODIP650/665など)、IRDye(IRD40、IRD7 00、IRD 800など)が挙げられる。さらなる好適な検出可能な代理人は、PCT/US14/56177に記載されている。放射性同位体の非限定的な実例としては、アルファ発光、ベータ発光、陽電子発光、及びガンマ発光が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体がアクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では的に、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、その放射性同位体がアクチニウム-225または鉛-212である。
ペプチドは、放射線増感剤または光増感剤にコンジュゲートされ得る。放射線増感剤としてはABT-263、ABT-199、WEHI-539、パクリタキセル, カルボプラチン,シスプラチン,オキサリプラチン,ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体(例えば、5-フルオロデオキシウリジンなどのハロゲン化プリン又はピリミジン)が挙げられるが、実施例に限定されない。光増感剤の例としては以下が挙げられるが、実施例に限定されない:ナノ粒子、ポルフィリン及びポルフィリン誘導体(例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオシアニン、フタロシアニン、及びナフタロシアニン)、メタロポルフィリン、メタロフタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲナピリリウム色素、クロロフィル、クマリン、フラビン、ならびにアロキサジン及びリボフラビン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン(例えば、メロシアニン540)、フェオフィチン、サフィリン、テキサフィリン、ポルフィセン、フェノチアジニウムソラレン、キノン、ローダミン、チオフェン、ベルジン、キサンテン色素(例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル)、二量体及びオリゴマー形態のポルフィリン、ならびに5-アミノレブリン酸などのプロドラッグ。有利には、この手法が治療薬剤(例えば、薬物)及び電磁気エネルギ(例えば、照射または光線)の両方を同時に使用して、目的の細胞(例えば、免疫細胞)の高度に特異的な標的化を可能にする。いくつかの実施形態では、該ペプチドが例えば、直接的に、またはリンカーを介して、代理人と融合されるか、または共有結合的もしくは非共有結合的に連結される。
ペプチドは、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成などによって、組換え的または合成的に生成され得る。ペプチド合成は公知の合成方法によって、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を使用して、またはブチルオキシカルボニル(Boc)化学によって実施され得る。ペプチドフラグメントは、酵素的または合成的に一緒に連結され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸、例えばSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、該組成物が本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチドまたはそのフラグメントを符号化するオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、核酸がオープンリーディングフレームの発現に必須の調節エレメントを含む。このようなエレメントには、例えば、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが含まれ得る。さらに、エンハンサーが含まれてもよい。これらの元素は、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列に作動可能に連結され得る。
プロモーターとしてはサルウイルス40(SV40)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、例えば、HIV Long Terminal Repeat(LTR)プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、例えば、CMV前初期プロモーター、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、ラウス肉腫(RSV)からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、実施例に限定されない。適切なポリアデニル化信号の実施例としてはSV40ポリアデニル化信号及びLTRポリアデニル化信号が挙げられるが、これらに限定されない。
式に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントも核酸分子に含まれ得る。そのような付加要素は、エンハンサーを含む。エンハンサーとしては、上記のプロモーターが挙げられる。好ましいエンハンサー/プロモーターとしては、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ならびにCMV、RSV及びEBV由来のものなどのウイルスエンハンサーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸が単独で(例えば、裸の核酸として)使用され得るか、または以下にさらに記載されるように、担体またはデリバリーベクターに作動可能に組み込まれ得る。有用なデリバリーベクターとしては生分解性マイクロカプセル、免疫刺激錯体(ISCOM)またはリポソーム、及びウイルスまたはバクテリアなどの遺伝子操作弱毒生担体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本ベクターがレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、房室痘、改変ワクシニアアンカラ(MVA)及び他の組換えウイルスなどのウイルスベクターである。例えば、レンチウイルスベクターを用いてT細胞に感染させることができる。
III.核酸、ベクター、及び細胞
本考案のさらなる目的は、記載された免疫原性ポリペプチド、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びそのフラグメントをコードする核酸配列、ならびにそれらのTCR及びフラグメントに関する。いくつかの態様では、細胞内抗原発現のための最適な免疫優性エピトープにパッキングすることによって、ベクターの大きさをT細胞反応有効性に最大化する核酸ベクター構築物が本明細書に開示される。一般に、以下にさらに記載されるように、裸であるか、またはベクター内に組み込まれるかにかかわらず、本発明に包含される核酸は、mRNA(またはmRNAを生成するインビトロ転写発現ベクター)、DNAワクチンとして使用するための哺乳動物発現ベクターなどを含む、直接ワクチン構築物(またはそれらを作製するために使用されるベクター)であり得る。核酸は、ヒト対象中での高発現などの特定の目的のためにコドン最適化されてもよい。本発明に包含される核酸は、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性、または60~70%のG-C含有量などの間の任意の範囲など。
特定の実施形態では、本発明が本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸配列に関する。特定の実施形態では、本発明が本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドを符号化する核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸が塩基性であり得るか、またはプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、ウイルス、もしくはウイルスベクターなどの任意の好適なベクターに含まれ得る、DNA(例えば、cDNA)またはRNA(例えば、mRNA)である。
そのような基本核酸は一次mRNA構築物などの「一次構築物」であってもよく、これは、関心対象の1つ以上のポリペプチドをコードし、その中にコードされる関心対象のポリペプチドが翻訳されることを可能にするのに十分な構造的及び/または化学的特徴を保持するポリヌクレオチド転写体を指す。一次構築物は、本発明に包含されるポリヌクレオチドであってもよい。構造的または化学的に修飾される場合、一次構築物は、修飾されたmRNAなどの修飾された核酸と称され得る。核酸構築物は、ポリペプチドコード配列に加えて、当技術分野で周知のキャッピング配列、テーリング配列、環化配列などの配列を含んでもよい。例えば、テーリング配列は不在から500ヌクレオチド長までの範囲であり得る(例えば、少なくとも60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド)。尾部がポリA尾部である場合、長さは、ポリA結合タンパク質結合の単位で、またはそれに応じて決定され得る。この実施形態では、ポリAテールがポリA結合タンパク質の少なくとも4つの単量体を結合するのに十分な長さである。ポリA結合タンパク質単量体は、約38ヌクレオチドの延伸に結合する。したがって、約80ヌクレオチド及び160ヌクレオチドのポリAテールが機能的であることが観察されている。キャッピング領域は、キャップを形成する単一のキャップまたは一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態では、キャッピング領域が1~10(例えば、2~9、3~8、4~7、1~5、5~10、または少なくとも2、または10以下のヌクレオチド長)であり得る。いくつかの実施形態では、キャップはない。したがって、本発明に包含される核酸は2~40以上、例えば、2~19、2~28などのタンパク質コード領域を含むことができ、本明細書に記載される1つ以上の付加要素、例えば、開始及び/または終止コドン、翻訳配列、インターナルリボソームエントリー配列、タンパク質切断配列、シグナル配列、キャッピング配列、テーリング配列、制限配列、自己複製配列などをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、本願に包含される核酸が当技術分野で周知の化学的、酵素的、及び/またはリボザイム触媒によるように、環化及び/または連結されてもよい。新たに形成された5'-/3'-結合は、分子内または分子間であってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示に包含される核酸が自己複製性、例えば、自己複製RNA様mRNAである。RNAは大量に生産するのに費用効率が高く、ほぼ同じ日速さで商業的に合成されたDNA前駆体から、任意の所与の発見された配列からエンドトキシンを含まずに生成することができる。これは、ゲノムインテグレーションのリスクをもたらさず、機能するために細胞細胞質への接近を必要とするだけであるため、一般に、DNAよりも安全かつ容易に投与することができる。さらに、アルファウイルスまたはフラビウイルスゲノムに基づく自己複製RNA(repRNA)の利用可能性のため、最大の免疫原性及び抗原産生レベルを達成するために、非常に低い用量を使用することができる。いくつかの実施形態ではrepRNAが後代ビリオンの産生に必要なウイルス構造タンパク質を欠くが、翻訳及び複製の能力を保持する弱毒化ウイルスゲノムであり、したがって、RNAの翻訳の半減期を効果的に増大させることができる。例えば、1つまたは複数の外因性遺伝子をコードするRepRNAを細胞にデリバリーすると、1つまたは複数の外因性遺伝子をコードする等モル量の従来のmRNAを細胞にデリバリーすることから生じるものと比較して、細胞における外因性遺伝子の翻訳及び発現を効果的に増大させることができる。いくつかの実施形態では、RepRNAが非細胞病原性RepRNAである。一部の実施形態ではrepRNAがアルファウイルス自己増幅性repRNA(例えば、5'キャップ;5'非翻訳領域(5' UTR)、第1のオープンリーディングフレーム内にコードされる非構造遺伝子(例えば、NSP1-4)、ゲノムプロモーター領域(例えば、26Sサブゲノムプロモーター)、第2のオープンリーディングフレーム、3'非翻訳領域(3' UTR)及び3'ポリアデニル化テールを含む)である。repRNA分子はコードされる遺伝子配列のサイズに応じて、典型的には9,000~2万ヌクレオチド長である。非構造遺伝子は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)をコードする。典型的には、RdRpがエンドヌクレオース及び自己触媒分解に対して従来のRNAを保護するために使用される古典的ヌクレオチド修飾を許容しない。したがって、ナノカプセル化(例えば、ナノ粒子、脂質、脂質ナノ粒子、カチオン性分子、ポリマーなど)は発現プラットフォームにおける効果的な展開のために使用され得る。repRNAがモジュール式であり、オープンリーディングフレームは、関心の外因性配列を収容するように操作され得る。repRNAが宿主細胞の細胞質に沈着すると、repRNA NS遺伝子によってコードされるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)が細胞内で発現する。RdRpはrepRNA全体、すなわちrepRNAが符号化する抗原のRdRp写しのみを複製することができる(すなわち、サブゲノムプロモーターによって)repRNAは全長レプリコンのより多くの写し、及び第2のオープンリーディングフレーム内に含まれる遺伝子を符号化するmRNAのより多くの写しを合成することができるので、RNA媒介遺伝子デリバリーの全般的な有効性を増大させる。宿主細胞リボソームは、全長レプリコンコピーまたはより短い抗原のみのmRNAを翻訳し続け、repRNAによってコードされる遺伝子の式の増強をもたらす。
タンパク質産生をさらに増強するために、本発明は他のポリヌクレオチド、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラレン及びマイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、及びサファイリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン及びジヒドロフェナジン)、人造エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、及び葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質(例えば、糖タンパク質)、またはペプチド(例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子)、または抗体(例えば がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型、ホルモン及びホルモンレセプター、及び/または非ペプチド種(例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、及び薬物)に結合する。本発明に包含される核酸の代表的な例は実施例及び図面などにおいて本明細書に記載されており、当技術分野において周知である(少なくとも米国特許公開第2020/0354423号、米国特許公開第2020/0254086号、及び米国特許公開第2020/0155660号を参照されたい)。
「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は宿主を形質転換し、導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)を促進するために、DNAまたはRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。したがって、本発明によって包含されるさらなる目的は、本発明によって包含される核酸を含むベクターに関する。
そのようなベクターは被検者への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こすか、または直接発現させるために、プロモーター、エンハンサ、ターミネータなどの調節エレメントを含み得る。アニマル細胞の発現ベクターに用いられるプロモーター及びエンハンサーとしては、例えば、SV40の初期プロモーター及びエンハンサー(Mizukami Tet al。1987)、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRプロモーター及びエンハンサー(Kuwana Y et al。1987)、プロモーター(Mason JO et al。1985)及び免疫グロブリンH鎖のエンハンサー(Gillies SD et al。1983)などが挙げられる。
アニマル細胞のための任意の発現ベクターを使用することができる。好適なベクターとしては、例えば、pAGE107(Miyaji Hら、1990)、pAGE103(Mizukami Tら、1987)、pHSG274(Brady Gら、1984)、pKCR(O'Hare Kら、1981)、pSG1ベータd2-4-(Miyaji Hら、1990)などが挙げられる。プラスミドの他の代表的な例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または例えばpUC、pcDNA、pBRなどの組込みプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの代表的なものには、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びAAVベクターが含まれる。そのような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションによってなど、当技術分野で公知の技術によって産生され得る。ウイルス包装細胞の典型的な実例としては、PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv陽性細胞、293細胞などが挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは例えば、WO 95/14785、WO 96/22378、米国特許No.米国特許第5,882,877号。米国特許第6,013,516号。米国特許第4,861,719号。5,278,056号及びWO 94/19478号。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターベースのプラットホームを使用することができる。代表的な非限定的な実例としてはワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス、及びレンチウイルスが挙げられ、これらに限定されないが、特異的細胞型またはレセプターを標的とするように設計された任意の世代の第2、第3、またはハイブリッド第2/第3世代レンチウイルス及び組換えレンチウイルスが挙げられる(少なくともHuら(2011)Immunol Rev。239:45-61、Sakumaら(2012)Biochem J。443:603-618、Cooperら(2015) Nucl.酸残基。43:682-690, Zuffereyら(1998) J.72:9873-9880, 及び米国特許。パブル。2020/0010849).
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸及び/またはベクターによってトランスフェクト、感染または形質転換された細胞に関する。「形質転換」という語は「外来」(すなわち、外因性または細胞外)遺伝子、DNAまたはRNA配列の宿主細胞への導入を意味し、その結果、宿主細胞は導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生する。導入されたDNAまたはRNAを受信し、発現する宿主細胞は、「形質転換されている」
本発明に包含される核酸は、本発明に包含される組換えポリペプチドを、好適な発現システムにおいて産生するために使用され得る。「発現システム」という語は例えば、宿主細胞に導入されたベクターによって運ばれる外来DNAによってコードされるタンパク質の発現のための、好適な条件での宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。
一般的な発現システムには、大腸菌宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞及びベクターが含まれる。宿主細胞の他の例としては原核生物細胞(バクテリアなど)及び真核生物細胞(酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など)が挙げられるが、他に限定されない。具体的な例としては大腸菌、クルイベロミセスまたはサッカロミセス酵母、哺乳動物細胞株(例えば、ベロ細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞など)、ならびに一次または確立された哺乳動物細胞培養物(例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される)が挙げられる。また、マウスSP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、マウスP3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(以下、「DHFR遺伝子」という)が欠損しているCHO細胞(Urlaub Gら; 1980)、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL 1662、以下、「YB2/0細胞」という)等が挙げられる。YB2/0細胞は、キメラまたはヒト化抗体のADC活性がこの細胞において発現される場合に増強されるので、好ましい。
本発明はまた、本発明による本発明に包含されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びそのフラグメント、MHC分子、ならびにTCR及びそのフラグメントを発現する組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は(i)インビトロまたはエクスビボで上記の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞に導入する工程、(ii)得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養する工程、及び(iii)場合により、前記SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びそのフラグメント、MHC分子、ならびにTCR及びそのフラグメントを発現する細胞を選択する工程を含む。そのような組換え宿主細胞は、本発明に包含される診断、予後及び/または治療方法のために使用することができる。
別の態様では、本発明が選択的ハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び/または定量するために使用することができる。例えば、本開示に包含されるポリヌクレオチドは、寄託されたライブラリ中の部分的または完全長クローンを同定、単離または増幅するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドがヒトまたは哺乳動物核酸ライブラリ由来のcDNAから単離された、またはそわなければ相補的なゲノムまたはcDNA配列である。好ましくは、cDNAライブラリが少なくとも80%の完全長配列、好ましくは少なくとも85%または90%の完全長配列、より好ましくは少なくとも95%の完全長配列を含む。cDNAライブラリは、稀な配列の表現を増大させるために正規化することができる。低ストリンジェンシーまたは中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は典型的には相補的配列と比較して低い配列同一性を有する配列と共に使用されるが、これに限定されない。中程度及び高いストリンジェンシー条件を、より高いアイデンティティ配列のために任意に使用することができる。低ストリンジェンシー条件は約70%の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガスまたはパラロガス配列を同定するために使用することができる。任意に、本明細書に包含されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一部をコードする。本発明に包含されるポリヌクレオチドは、本発明に包含される抗体を符号化するポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに用いることができる核酸配列を包含する。例えば、Ausubel、上記; Colligan、上記を参照されたい(それぞれ、参照により本明細書に完全に組み込まれる)。
IV. ペプチドーMHC錯体
特定の態様では、本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びMHC分子を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドがMHC分子と安定な複合体を形成する。
本発明に包含される組成物及び方法において提供及び使用されるMHCタンパク質は、当技術分野で公知の任意の好適なMHC分子であり得る。一般に、それらは式(α-β-P)nを有し、式中、nは少なくとも2、例えば、2~10、例えば、4である。αは教室Iまたは教室II MHCタンパク質のα鎖である。βは、MHC教室Iタンパク質のための教室II MHCタンパク質またはβ2ミクログロブリンのβ鎖として本明細書において定義されるβ鎖である。Pはペプチド抗原である。
いくつかの実施形態では、MHCタンパク質がMHCクラスI錯体、例えば、HLA I錯体である。
MHCタンパク質は、任意の哺乳動物またはトリ種、例えば霊長類種、特にヒト;マウス、ネズミ及びハムスターを含むげっ歯類;ウサギ;ウマ、ウシ、イヌ、ネコなどに由来し得る。例えば、MHCタンパク質は、ヒトHLAタンパク質またはマウスH-2タンパク質に由来し得る。HLAタンパク質としては、教室IIサブユニットHLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα及びHLA-DRβ、ならびに教室Iタンパク質HLA-A、HLA-B、HLA-C及びβ2-ミクログロブリンが挙げられる。H-2タンパク質としては、教室IサブユニットH-2K、H-2D、H-2L、ならびに教室IIサブユニットI-Aα、I-Aβ、I-Eα及びI-Eβ、ならびにβ2-ミクログロブリンが挙げられる。いくつかの代理人MHCタンパク質の配列は、カバットらに見出すことができる。Immunological Interest、NIH Publication No。91-3242、pp724-815のタンパク質配列。MHCタンパク質サブユニットは、例えば膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの欠失によって、当技術分野で知られているように調製される、通常膜結合タンパク質の可溶型である。
教室Iタンパク質の場合、可溶型はα1、α2及びα3ドメインを含むことができる。水溶性教室IIサブユニットは、αサブユニットのα1及びα2ドメイン、ならびにβサブユニットのβ1及びβ2ドメインを含み得る。
α及びβサブユニットは、別々に産生され、インビトロで会合して安定なヘテロ二重鎖錯体を形成することができるか、またはサブユニットの両方が単一の細胞で発現され得る。MHCサブユニットを産生するための方法は、当技術分野において公知である。
ある特定の実施形態ではアルファ鎖がHLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0216、HLA-A*0217、HLA-A*0220、HLA-A*0224、HLA-A*0230、HLA-A*0 242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、及び/またはHLA-A*274対立遺伝子。他の実施形態では、MHC-ペプチド複合体が表1Cから選択されるペプチドエピトープと、そのアルファ鎖がHLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、及び/またはHLA-A*307対立遺伝子によってコードされるものなどのHLA-A*03血清型を有するMHCとを含む。さらに他の実施形態では、MHC-ペプチド複合体が表1Bから選択されるペプチドエピトープと、そのアルファ鎖がHLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、及び/またはHLA-A*116対立遺伝子によってコードされるものなどのHLA-A*01血清型を有するMHCとを含む。さらに他の実施形態では、MHC-ペプチド複合体が表1Dから選択されるペプチドエピトープと、そのアルファ鎖がHLA-A*11血清型、例えばHLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、及び/またはHLA-A*1119対立遺伝子によってコードされるものを有するMHCとを含む。他の実施形態では、MHC-ペプチド複合体が表1Eから選択されるペプチドエピトープと、そのアルファ鎖がHLA-A*24血清型、例えばHLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2405、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2410、HLA-A*2414、HLA-A*2417、HLA-A*2420、HLA-A*2422、HLA-A*2425、HLA-A*2426、及び/またはHLA-A*2458対立遺伝子によってコードされるものとを有するMHCとを含む。さらに他の実施形態では、MHC-ペプチド複合体が表1Fから選択されるペプチドエピトープと、そのアルファ鎖がHLA-B*07血清型、例えばHLA-B*0702、HLA-B*0704、HLA-B*0705、HLA-B*0709、HLA-B*0710、HLA-B*0715、及び/またはHLA-B*721対立遺伝子によってコードされるものを有するMHCとを含む。
MHC-ペプチド複合体を調製するために、サブユニットを抗原性ペプチドと組み合わせ、インビトロで折りたたんで、鎖内ジスルフィド結合ドメインを有する安定なヘテロダイマー複合体を形成することができる。該ペプチドは、最初のフォールディング反応に含まれてもよく、または後の工程で空のヘテロダイマーに添加されてもよい。本発明に包含される組成物及び方法において、これはSARS-CoV-2免疫原性ペプチドまたはそのフラグメントである。サブユニット及びペプチドのフォールディング及び会合を許可する条件は、当技術分野において公知である。一例として、ほぼ等モル量の可溶化α及びβサブユニットを尿素の溶液中で混合することができる。再折り畳みは、尿素を含まない緩衝溶液への希釈または透析によって開始される。ペプチドは、約pH5~5.5で約1~3日間、空の第2種ヘテロダイマーに充填され、その後、中和、濃縮、及びバッファー交換が行われる。しかしながら、特定の折り畳み条件は、本発明の実施にとって重要ではない。
単量体錯体(α-β-P)(本明細書の単量体)は、例えばMHC四量体について多量体化され得る。得られる多量体は、長期間にわたって安定である。好ましくは、多量体が当技術分野で知られているように(例えば、米国特許第5,635,363号に記載されているように)、αまたはβサブユニット上の比アタッチメント(attachment)部位を介して多価エンティティに単量体を結合させることによって形成することができる。MHCタンパク質は、それらの単量体または多量体のいずれかの形成で、ビーズまたは任意の他の保持体にコンジュゲートされてもよい。
多量体複合体は当技術分野で公知の免疫染色または他の方法で使用される場合に直接的に検出可能であるように標識されてもよく、または当技術分野で公知のように複合体に特異的に結合する(例えば、MHCタンパク質サブユニットに結合する)二次標識免疫試薬と併せて使用されてもよい。例えば、検出可能な標識は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)、Brilliant Violet(商標)421、Brilliant UVTM 395、Brilliant VioletTM 480、Brilliant VioletTM 421(BV421)、Brilliant BlueTM 515、APC-R700、またはAPC-Fire750などのフルオロフォアであってもよい。いくつかの実施形態では、多量体複合体が別の部分に特異的に結合することができる部分によって標識される。例えば、標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオチド、またはリガンドであり得る。目的の他の標識は、蛍光色素、色素、酵素、化学発光体、微粒子、放射性同位体、または他の直接的もしくは間接的に検出可能な代理人を含み得る。
いくつかの実施形態ではとして、細胞表面上にMHC分子との関連で免疫原性ペプチドを提示する細胞は組換えまたは異種抗原をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を細胞にトランスフェクトまたは形質導入することによって生成される。いくつかの実施形態ではとして、ベクターは、細胞によって発現された異種タンパク質の1つまたは複数のペプチド抗原を含む1つまたは複数のペプチド抗原が発現され、プロセシングされ、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)との文脈で細胞の表面上に提示される条件下で細胞に導入される。
一般に、MHC、すなわちMHC発現細胞を発現する細胞がベクターに接触する。細胞は、細胞面上にMHCを通常発現するもの、細胞面上にMHCの発現を発現及び/または上方制御するように誘導されるもの、または細胞面上にMHCを発現するように操作されたものであってもよい。いくつかの実施形態では、MHCが場合によっては細胞機構によって処理されるペプチド抗原を含むポリペプチドのペプチド抗原と錯体を形成することができる多型ペプチド結合部位または結合溝を含む。いくつかの場合において、MHC分子はT細胞、または他のペプチド結合分子上のTCRによって認識可能なコンフォメーションでの抗原の提示のために、ペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体を含む、細胞面上に提示または発現され得る。
いくつかの実施形態では、この細胞は有核細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は抗原提示細胞である。いくつかの実施形態ではとして、細胞は、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、内皮細胞または線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞が内皮細胞、例えば、内皮細胞株または一次内皮細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞が線維芽細胞細胞株または初代線維芽細胞細胞などの線維芽細胞である。
いくつかの実施形態ではとして、細胞は人工抗原提示細胞である。典型的には、aAPCがMHC分子の発現、刺激性及び共刺激性分子、Fcレセプター、接着分子、及び/またはサイトカイン(例えば、IL-2)を産生または分泌する能力を含む、天然APCの特徴を含む。通常、aAPCは上記の1つまたは複数の発現を欠く細胞株であり、1つまたは複数の導入(例えば、トランスフェクションまたは形質導入)によって生成される。MHC分子、低親和性Fc受容体(CD32)、高親和性Fc受容体(CD64)、共刺激シグナル(例えば、CD7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、ILT3、ILT4、3/TR6またはB7-H3のリガンド;またはCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、LIGHT、NKG2C、B7-H3、Tollリガンド受容体またはCD83)、細胞接着分子(例えば、ICAM-1またはLFA-3)、及び/またはサイトカインのリガンド(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、インターフェロン-α(IFNalpha)、インターフェロン-β(IFNβ)、インターフェロン-γ(IFNγ)、腫瘍壊死因子-α(TNFα)、腫瘍壊死因子-β(TNFβ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、及び顆粒球コロニー刺激因子(GCSF))。いくつかの場合において、aAPCはMHC分子を通常は発現しないが、MHC分子を発現するように操作されてもよく、またはいくつかの場合において、サイトカインによる刺激などによってMHC分子を発現するように誘導されてもよく、または誘導されてもよい。いくつかの場合において、aAPCはまた、例えば、抗‐CD3抗体、抗‐CD28抗体または抗CD2抗体を含み得る刺激リガンドを負荷され得る。aAPCを生成するための骨格として使用され得る例示的な細胞株は、K562細胞株または線維芽細胞細胞株である。種々のaAPCが当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許を参照されたい。米国特許第8,722,400号、公開出願第US2014/0212446号; Butler and Hirano(2014)Immunol Rev、257(1):10.1111/imr.12129;Suhoshki et al(2007) Mol.Ther、15:981-988)。
細胞によって発現される特定のMHCまたは対立遺伝子を決定または同定することは、十分に当業者の水準の範囲内である。いくつかの実施形態では、特定のMHC分子の発現が細胞をベクターと接触させる前に、例えば特定のMHC分子に特異的な抗体を用いることによって、評価または確認することができる。MHC分子に対する抗体は当技術分野において公知であり、例えば、以下に記載されるいずれかである。
いくつかの実施形態では、所望のMHC制約のMHC対立遺伝子を発現するように細胞を選択することができる。いくつかの実施形態では、例えば細胞株などの細胞のMHCタイピングが当技術分野において周知である。いくつかの実施形態ではとして、被検者から得られた初代細胞などの細胞のMHCタイピングは、分子ハプロタイプアッセイ(BioTest ABC SSPtray、BioTest Diagnostics Corp、Denville、NJ; SeCore Kits、Life Technologies、Grand Island、NY)を用いて組織タイピングを行うなど、当技術分野で周知の手続を用いて決定することができる。場合によっては配列ベースタイピング(SBT)を使用することなどによって、HLA遺伝子型を決定するために細胞の標準タイピングを実施することは十分に当業者の水準の範囲内である(Adamsら(2004)JTransl.Med、2:30; Smith(2012)方法Mol Biol、882:67-86).場合によっては、線維芽細胞細胞などの細胞のHLAタイピングが知られている。例えば、ヒト胎児肺線維芽細胞細胞株MRC-5はHLA-A*0201、A29、B13、B44 Cw7(C*702)であり;ヒト包皮線維芽細胞細胞株Hs68はHLA-A1、A29、B8、B44、Cw7、Cw16であり;WI-38細胞株はA*6801、B*0801、(Solache et al(1999)J Immunol、163:5512-5518; Ameres et al(2013) PloS Pathog.9:e1003383).ヒトトランスフェクタント線維芽細胞細胞株M1DR1/Ii/DMは、HLA-DR及びHLA-DMを発現する(Karakikeら(2012)FASEB J、26:4886-96)。
いくつかの実施形態では、MHC分子を発現するように操作またはトランスフェクトされた細胞がベクターに接触または導入される。いくつかの実施形態では、親細胞株を遺伝子改変することによって、細胞株を調製することができる。いくつかの実施形態では、その細胞が通常、特定のMHC分子が欠損しており、そのような特定のMHC分子を発現するように操作されている。いくつかの実施形態では的に、細胞は、組換えDNA技術を用いて遺伝子操作される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の安定なMHC-ペプチド複合体が安定なMHC-ペプチド複合体に結合するT細胞を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される安定なMHC-ペプチド複合体が例えば、蛍光標識されたMHC-ペプチド複合体に特異的に結合するT細胞(例えば、CD8+ T細胞)の量及び/または割合を検出することによって、被検者におけるT細胞反応をモニタリングするために使用される。MHC-ペプチド複合体特異的T細胞を検出するためにMHC-ペプチド複合体(例えば、MHC-ペプチド四量体)を生成、標識、及び使用する方法は、当技術分野で周知である。追加の明細書は例えば、米国特許に見られる。米国特許第7,776,562号。第8,268,964号及び米国特許。パブル。No。2019/0085048は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
V. 免疫原性組成物
いくつかの態様において、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及び/またはSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸及びアジュバントを含む医薬組成物(例えば、ワクチン組成物)が本明細書において提供される。いくつかの態様では、免疫原性ポリペプチド及び/または免疫原性ポリペプチドをコードする核酸及びアジュバントを含む医薬組成物(例えば、ワクチン組成物)が本明細書で提供される。いくつかの態様では、MHC分子と補助剤との関連でSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを含む安定なMHC-ペプチド複合体を含む医薬組成物(例えば、ワクチン組成物)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態でに、該組成物は複数(例えば、2つ以上の)SARS-CoV-2免疫原性ペプチドまたは核酸と、補助剤との組合せを含む。いくつかの実施形態では、該組成物がMHC分子と補助剤との関連でSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを含む複数(例えば、2つ以上の)安定なMHC-ペプチド複合体の組合せを含む。いくつかの実施形態では、上述の化合物が薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
本明細書に開示される薬学的組成物は以下に適合されるものを含む、固体または液体形態での出願のために特別に製剤化されてもよい:(1)経口出願、例えば、ドレンチ(水性または非水性溶液または懸濁液)、タブレット、例えば、頬側、舌下、及び全身吸収、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト、舌への適用のためのもの;または(2)非経口出願、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射による非経口出願、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤。
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及び/または核酸を、アジュバント、担体、及び場合により1つまたは複数の補助成分と会合させる工程を含む。概して、製剤は、本明細書に記載の代理人を液状担体、または微粉化固形担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
非経口投与に適した医薬組成物は本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及び/または核酸を、補助剤、ならびに使用直前に滅菌注射用溶液または分散液に再構成することができる1つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張性の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、または滅菌粉末を含み、これらは、糖、アルコール、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、製剤を意図するレシピエント(recipient)の血と等張にする溶質、または懸濁液もしくは増粘剤を含有することができる。
医薬組成物中で使用され得る好適な水性及び非水系担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びそれらの好適な混合物、植物油(例えば、オリーブオイル)、ならびに注射可能な有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が挙げられる。適切な流動性は例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
選択される投与経路にかかわらず、好適な水和形態で使用され得る本明細書に提供される代理人、及び/または本明細書に開示される医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。
いくつかの実施形態では、記載されている医薬組成物が被検者に投与された場合、SARS-CoV-2に感染している細胞に対する免疫反応を誘発することができる。そのような医薬組成物は、COIVD-19の予防的及び/または治療的処置のためのワクチン組成物として有用であり得る。
いくつかの実施形態では、医薬が生理学的に許容される補助剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、使用される補助剤が医薬組成物の免疫原性の増加を提供する。このようなさらなる免疫反応刺激化合物またはアジュバントは、(i)ペプチドの再構成後に本発明による医薬組成物に混合され、上記で定義された油ベースのアジュバントで任意に乳化されてもよく、(ii)上記で定義された本発明によって包含される再構成組成物の一部であってもよく、(iii)再構成されるペプチドに物理的に連結されてもよく、または(iv)治療される被検者、哺乳動物またはヒトに別々に投与されてもよい。補助剤は抗原の徐放を提供するものであってもよく(例えば、補助剤はリポソームであってもよい)、またはそれ自体が免疫原性であり、それによって抗原(すなわち、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド中に存在する抗原)と相乗的に機能する補助剤であってもよい。例えば、補助剤は抗原取り込みを促進し、免疫システム細胞を投与部位に動員し、または応答するリンパ系細胞の免疫活性化を促進する、公知の補助剤または他の物質であってもよい。アジュバントとしては免疫調節分子(例えば、サイトカイン)、油及び水エマルジョン、水酸化アルミニウム、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Bacto-Adjuvant、合成ポリマー、例えば、ポリアミノ酸及びアミノ酸の共ポリマー、サポニン、パラフィンオイル、ならびにムラミルジペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントがアジュバント65、α-GalCer、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、βグルカンペプチド、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、リピドA、リポ多糖、リポバント、モンタニド、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、Pam3CSK4、キルA、トレハロースジミコレートまたはザイモサンである。
いくつかの実施形態では、補助剤は免疫調節分子である。例えば、免疫調節分子は、免疫反応を増強するように設計された組換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、または免疫刺激性代理人もしくはサイトカイン、ケモカイン、または免疫刺激性代理人を符号化する核酸であってもよい。
免疫調節性サイトカインの例には、インターフェロン(例えば、IFNα、IFNβ及びIFNγ)、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17及びIL-20)、腫瘍壊死因子(例えば、TNFα及びTNFβ)、エリスロポエチン(EPO)、FLT-3リガンド、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、ラネート、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、ならびに上記のいずれかの機能性フラグメントが含まれる。
いくつかの実施形態では、CXC、CC、C、またはCX3Cケモカイン・レセプターであるケモカイン・レセプターに結合する免疫調節ケモカインもまた、本明細書に提供される化合物に含まれ得る。ケモカインの実例には、Mip1α、Mip-1β、Mip-3α(Larc)、Mip-3β、Rantes、Hcc-1、Mpif-1、Mpif-2、Mcp-1、Mcp-2、Mcp-3、Mcp-4、Mcp-5、Eotaxin、Tarc、Elc、I309、IL-8、Gcp-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、Nap-2、Ena-78、Gcp-2、Ip-10、Mig、I-Tac、Sdf-1、及びBca-1(Blc)、ならびに前述である。
いくつかの実施形態では、本発明が本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドを符号化する核酸、例えばSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを符号化する核酸に関する。いくつかの実施形態では、該組成物がSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを符号化するオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む。
細胞(例えば、筋肉細胞、例えば、抗原提示細胞(APC)、例えば、樹状細胞、マクロファージなど)によって取り込まれる場合、DNA分子は、染色体外分子として細胞中に存在してもよく、及び/または染色体中に組み込まれてもよい。細胞には、別々の遺伝物質として残存するプラスミドの形成で導入することができる。あるいは、染色体に組み込まれ得る線状DNAが細胞に導入され得る。場合により、細胞にDNAを導入する場合、染色体へのDNA組込みを促進する試剤を添加してもよい。
VI.結合部分
いくつかの態様では、本明細書に記載のペプチド及び/または本明細書に記載の安定なMHC-ペプチド複合体に結合する結合部分が提供される。例えば、約10-7 M(例えば、約10-7、約10-8、約10-9、約1010、約10タンパク質、約10T細胞レセプター、約10抗体、約10K d)以下の-14のような、-12及び/又は安定したMHC-ペプタイド複合体に特に結合する結合-11等が提供される。
いくつかの実施形態では、MHC分子がHLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及び/またはHLA-B*07からなる群から選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む。いくつかの実施形態ではでは、HLA-A*0201、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0212、HLA-A*0213、HLA-A*0214、HLA-A*0217、HLA-A*0219、HLA-A*0222、HLA-A*0230、HLA-A*0242、HLA-A*0253、HLA-A*0260、及びHLA-A*274対立遺伝子からなる群。特定の実施形態では、HLA対立遺伝子はHLA-A*0201である。いくつかの実施形態では、結合タンパク質が遺伝子操作され、単離され、及び/または精製される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質がキメラ、ヒト化、ヒト、霊長類、またはげっ歯類(例えば、ネズミまたはマウス)である定常領域を含む。例えば、ヒト可変領域はマウス定常領域とキメラ化され得るか、またはマウス可変領域はヒト定常領域及び/またはヒトフレームワーク領域とヒト化され得る。いくつかの実施形態では、この定常領域が機能性を改変するために変異させることができる(例えば、TCRα及びベータ鎖における対向する残基位置における非天然のシステイン置換の導入により、TCRαとベータ鎖との間の親和性を増大させるのに有用なジスルフィド結合を提供する)。同様に、機能性を修飾する(例えば、疎水性アミノ酸による残渣の天然に存在しない置換を導入することによって疎水性を増大させる)ために、本定常領域の膜貫通ドメインにおいて変異を行うことができる。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質のそれぞれのCDRが基準CDR配列と比較して、5個までのアミノ酸置換、挿入、欠失、またはそれらの組合せを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される結合タンパク質がT細胞レセプター(TCR)、TCRの抗原結合フラグメント、またはキメラ抗原レセプター(CAR)を含み得る。いくつかの実施形態では本明細書に開示される結合タンパク質が2つのポリペプチド鎖を含み得、その各々はTCRアルファ鎖のCDR3及びTCRベータ鎖のCDR3、またはTCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖の両方のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む可変領域を含む。いくつかの実施形態では結合タンパク質がTCR V α及びTCR V β領域の両方を含むが、単一のTCR定常ドメイン(C αまたはC β)のみを含む、単鎖TCR(scTCR)を含む。「キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)」(CAR)という語は融合タンパク質が細胞の表面上に存在する場合にレセプターとして機能することができる、宿主細胞中に天然に存在しない、または天然に存在しない方法で一緒に連結された2つ以上の天然に存在するアミノ酸配列を含むように操作された融合タンパク質を指す。本開示に包含されるCARは例えば、サデレーンら(2013年)抗原結合ドメイン(共刺激ドメインを任意に含む)を含む、がん(すなわち、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様分子、例えば、抗体もしくはTCR、またはキラー免疫受容体由来もしくはNK細胞由来の抗原結合ドメインから得られる)と、膜貫通ドメイン及び1つまたは複数の細胞内シグナリング・ドメイン(共刺激)とを含む細胞外部分を含み得る。3:388, Harris and Kranz (2016) Trends Pharmacol.科学。37:220, 及び石ら(2014)がんImmunol.イムノザー。63:1163).
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、またはキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR))はキメラ(例えば、2つ以上のドナー(donor)または種由来のアミノ酸残基またはモチーフを含む)、ヒト化(例えば、ヒトにおける免疫原性のリスクを低減するように改変または置換された非ヒト生物由来の残基を含む)、またはヒトである。
TCR、CAR、及びそれらの抗原結合フラグメントなどの操作された結合タンパク質を産生するための方法は当技術分野において周知である(例えば、Bowerman et al(2009) Mol.免疫。5:3000, 米国特許。米国特許第6,410,319号。米国特許第7,446,191号。パブル。米国特許第2010/065818号;。第8,822,647号、PCT公開。WO 2014/031687、米国特許No.米国特許第7,514,537号、及びBrentjensら(2007) Clin.がん研究所。73:5426).
いくつかの実施形態では本明細書に記載される結合タンパク質が細胞面上に発現されるTCRまたはその抗原結合フラグメントであり、細胞表面発現TCRは内因性TCRと比較して、CD3プロテインAとより効率的に会合することができる。TCRなどの結合タンパク質は、内因性TCRなどの内因性結合タンパク質と比較して、細胞上でより高い表面発現をT細胞のような細胞の表面上に発現させることもできる。本明細書において提供されるいくつかの実施形態では、本CARの結合ドメインが抗原特異的TCR結合ドメインを含むCARである(例えば、ワルセングら(2017)Scientific Reports 7:10713を参照されたい)。
また、出発結合タンパク質から変更された特性を有し得る修飾結合タンパク質を操作するための出発物質として、本明細書に開示されるV α及び/またはV β配列の1つまたは複数を有する結合タンパク質を使用して、周知の方法に従って調製され得る修飾結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、またはCAR)も提供される。結合タンパク質は1つまたは両方の可変領域(すなわち、V α及び/またはV β)内、例えば、1つまたは複数のCDR領域内及び/または1つまたは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残渣を修飾することによって操作され得る。追加的または代替的に、結合タンパク質は、定常領域内の残渣を修飾することによって操作され得る。
別の種類の可変領域修飾はV α及び/またはV β CDR1、CDR2及び/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させて、それによって関心の結合タンパク質の1つまたは複数の結合特性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発は変異を導入するために実施され得、タンパク質結合に対する作用、または目的の他の機能的特性は本明細書に記載され、実施例において提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価され得る。いくつかの実施形態では、保存的修飾(上述のよう)を導入することができる。変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であってもよい。いくつかの実施形態では、変異は置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4または5個以下の残渣が修飾される。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、またはCAR)は天然に存在するTCRと比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を有し得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質のそれぞれのCDRが基準CDR配列と比較して、5個までのアミノ酸置換、挿入、欠失、またはそれらの組合せを有する。アミノ酸の保存的置換は既知であり、天然に存在してもよく、または結合タンパク質が組換えにより産生される場合に導入されてもよい。アミノ酸置換、欠失、及び付加は当技術分野で公知の突然変異誘発方法を用いてタンパク質に導入することができる(例えば、Sambrook et al(2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3d ed、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NYを参照されたい)。オリゴヌクレオチド指向性部位特異的(またはセグメント特異的)突然変異誘発法を用いて、所望の置換、欠失、または挿入に従って改変された特定のコドンを有する改変ポリヌクレオチドを提供することができる。あるいは、アラニンスキャニング突然変異誘発、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、及びオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などの無作為または飽和突然変異誘発技術が免疫原ポリペプチドバリアントを調製するために使用され得る(例えば、上記のサンブルックらを参照されたい)。
当業者に公知の様々な基準は、ペプチドまたはポリペプチド中の特定の位置で置換されるアミノ酸が保存的(または類似)であるかどうかを示す。例えば、類似のアミノ酸または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似のアミノ酸は以下のカテゴリーに含まれ得る:塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン);酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸);非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン);非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン);ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン)。分類がより困難と考えられるプロリンは脂肪族側鎖を有するアミノ酸(例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、及びアラニン)と特性を共有する。いくつかの実施形態では、グルタミンのグルタミン酸への置換またはアスパラギンのアスパラギン酸への置換がグルタミン及びアスパラギンがそれぞれグルタミン酸及びアスパラギン酸のアミド誘導体である点で同様の置換と考えることができる。当技術分野で理解されるように、2つのポリペプチド間の「類似性」はポリペプチドのアミノ酸配列及びそれに対する保存されたアミノ酸置換を第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される(例えば、GENEWORKS(商標)、Align、BLASTアルゴリズム、または本明細書に記載され、当技術分野で実施される他のアルゴリズムを使用して)。
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、コードされる結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、またはCAR)は、「シグナルペプチド」(リーダー配列、リーダーペプチド、または輸送ペプチドとしても知られる)を含み得る。シグナルペプチドは、新たに合成されたポリペプチドを、細胞の内部または外部の適切な位置に標的化する。シグナルペプチドは、局在化または分泌が完了する間、または完了すると、ポリペプチドから除去され得る。シグナルペプチドを有するポリペプチドは本明細書では「プレタンパク質」と称され、シグナルペプチドが除去されたポリペプチドは本明細書では「成熟」タンパク質またはポリペプチドと称される。本明細書に記載のいくつかの実施形態では結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、またはCAR)は成熟V αドメイン、成熟V βドメイン、またはその両方を含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態では結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原結合フラグメント、またはCAR)は成熟TCR β鎖、成熟TCR α鎖、またはその両方を含む。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質が(a)TCRまたはその抗原結合フラグメントを含む細胞外構成要素;(b)エフェクタードメインまたはその機能的部位を含む細胞内構成要素;及び(c)細胞外及び細胞内構成要素を接続する膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本融合タンパク質がMHC分子(例えば、MHCクラスI分子)との文脈で本明細書に記載のペプチドエピトープを含むMHC-ペプチド抗原複合体に特異的に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメイン」または「免疫エフェクタードメイン」は、適切なシグナルを受けたときに細胞における免疫反応を直接的または間接的に促進することができる融合タンパク質またはレセプターの細胞内の一部またはドメインである。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインが結合したとき(例えば、CD3ζ)、または免疫細胞タンパク質もしくはその一部もしくは免疫細胞タンパク質複合体が標的分子に直接的に結合し、免疫細胞においてエフェクタードメインからのシグナル伝達を誘発するときにシグナルを受け取る免疫細胞タンパク質もしくはその一部もしくは免疫細胞タンパク質複合体に由来する。
エフェクタードメインは1つ以上のシグナリング・ドメインまたはモチーフ、例えば、共刺激分子中に見られるものなどの細胞内チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含む場合、細胞反応を直接的に促進し得る。理論に拘束されることを望むものではないが、ITAMはT細胞エフェクタドメインを含むT細胞レセプターまたは融合タンパク質によるリガンド係合後のT細胞活性化に有益であると考えられる。いくつかの実施形態では、細胞内構成要素またはその機能的部位がインスリンを含む。例示的な免疫エフェクタードメインとしてはCD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組合せからのものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインがリンパ球レセプターシグナリング・ドメイン(例えば、CD3ζまたはその機能的部位もしくはバリアント)を含む。
更なる実施形態に、本融合タンパク質の細胞内構成要素は、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD2、CD5、ICAM-l(CD54)、LFA-l(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFF-R、HVEM、LIGHT、MKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの機能的バリアント、またはそれらの任意の組合せから選択される共刺激ドメインまたはそれらの機能的部位を含む。いくつかの実施形態では、細胞内構成要素がCD28共刺激ドメインまたはその機能的部分もしくはバリアント(任意に、天然CD28タンパク質の186~187位にLLGG変異を含み得る(例えば、Nguyenら(2003)Blood 702:4320)、4-1BB共刺激ドメインまたはその機能的部分もしくはバリアント、またはその両方を含み得る)。
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインがCD3εエンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはCD27エンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはCD28エンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。さらに更なる実施形態には、エフェクタードメインが4-1BBエンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはOX40エンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはCD2エンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはCD5エンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはICAM-lエンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはLFA-lエンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。更なる実施形態に、エフェクタードメインはICOSエンドドメインまたはその機能的(例えば、シグナル伝達)部、またはその機能的バリアントを含む。
本発明に包含される細胞外構成要素及び細胞内構成要素は、膜貫通ドメインによって連結される。「膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、細胞膜に挿入することができるか、またはそれに及ぶことができる膜貫通タンパク質の一部である。膜貫通ドメインは細胞膜中で熱力学的に安定であり、一般に約15アミノ酸~約30アミノ酸の長さにわたる三次元構造を有する。膜貫通ドメインの構造は、アルファヘリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータヘリックス、またはそれらの任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態ではとして、膜貫通ドメインは公知の膜貫通タンパク質(例えば、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD27膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、またはそれらの任意の組合せ)を含むか、またはそれに由来する。
いくつかの実施形態では、本融合タンパク質の細胞外構成要素が結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されたリンカーをさらに含む。本明細書中で使用される場合、結合及び膜貫通ドメインを連結する融合タンパク質の構成要素に言及する場合、「リンカー」は約2個のアミノ酸~約500個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり得、これはリンカーによって連結される2つの領域、ドメイン、モチーフ、フラグメント、またはモジュラーの間のコンホメーション運動のための柔軟性及び余地を提供モジュール。例えば、リンカーは、結合ドメインを、融合タンパク質を発現する宿主細胞の表面から離れた位置に配置して、宿主細胞とターゲット細胞、抗原結合、及び活性化との間の適切な結合を可能にすることができる(Patelら(1999)Gene Therapy 6:412-419)。リンカー長は選択された標的分子、選択された結合エピトープ、または抗原結合ドメインが捕捉及び親和性に基づいて、抗原認識を最大化するように変化させることができる(例えば、ゲストら(2005) Immunother.28:203-11 及びPCT公開。国際公開第2014/031687号パンフレット)。例示的なリンカーとしてはGly x Ser yの1~約10個の繰り返しを有するグリシンセリンアミノ酸鎖を有するものが挙げられ、ここで、x及びyはそれぞれ独立して、0~10の整数であるが、ただし、x及びyは両方とも0ではない(例えば、(Gly 4 Ser)2、(Gly 3 Ser)2、Gly 2 Ser、または((Gly 3 Ser)2Gly 2 Ser))。
いくつかの実施形態では、本開示に包含される結合部分が操作されたタンパク質足場、その抗体または抗原結合フラグメント、TCR模倣抗体などであり得る。そのような結合部分は宿主を免疫し、抗体産生細胞及び/またはその抗体を得、モノクローナル抗体を産生するのに有用なハイブリドーマを作製するなどのルーチン免疫学的方法を用いて、本明細書に記載のペプチド及び/またはMHC-ペプチド複合体に対して設計及び/または作製することができる(例えば、ワットら(2006) Nat.バイオテクノロジー。24:177-183; GebauerとSkerra(2009) Curr.オピン。Chem Biol。13:245-255; Skerra et al(2008)FEBS J。275:2677-2683; Nygren et al(2008)FEBS J。275:2668-2676; Dana et al(2012) Exp.Rev.分子。中央値。14:e6; Sergeva et al(2011) Blood 117:4262-4272; PCT Publ.番号。WO 2007/143104、PCT/US86/02269、及びWO 86/01533;米国特許No.米国特許第4,816,567号; Betterら(1988)科学 240:1041-1043; Liuら(1987) Proc.Natl.Acad.科学。U.S.A。84:3439-3443; Liu et al(1987)JImmunol.139:3521-3526; Sun et al(1987) Proc.Natl.Acad.科学。84:214-218; Nishimuraら(1987)がんRes.47:999-1005; Wood et al(1985)性質 314:446-449; Shaw et al(1988)JNatl.がん研究所。80:1553-1559); Morrison、SL(1985)科学229:1202-1207; Oi et al(1986)Biotechniques 4:214; U.SPat.No。5,225,539; Jones et al(1986)性質 321:552-525; Verhoeyan et al(1988)科学 239:1534; 及びBeidler et al(1988)JImmunol.141:4053-4060.所望であれば、結合部分は例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)(例えば、免疫学における電流プロトコル、またはタンパク質科学、ジョンウィリーアンドソンズ、ニューヨーク、ニューヨーク)における電流プロトコル)のような従来の方法を用いて単離または精製することができる。
「抗体」及び「抗体」という用語は抗体(例えば、IgG、IgA、IgM、IgE)及び組換え抗体、例えば、単鎖抗体、キメラ及びヒト化抗体及び多重特異性抗体、ならびに前記のすべてのフラグメント及び誘導体を広く包含し、これらのフラグメント及び誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質または化学的な部分構造を含み得る。
さらに、イントラボディーは抗体の特性を有するが、関心の細胞内標的に結合及び/または阻害するために細胞内で発現することができる既知の抗原結合分子である(Chen et al(1994) Human Gene Ther.5:595-601).方法は抗体を標的(例えば、阻害)細胞内部分に適合させるために当技術分野で周知であり、例えば、単鎖抗体(scFv)の使用、過安定性のための免疫グロブリンVLドメインの修飾、細胞内環境の減少に抵抗するための抗体の修飾、細胞内安定性を増大させる及び/または細胞内局在化を調節する融合タンパク質の生成などである。細胞内抗体はまた、多細胞生物の1つ以上の細胞、組織または器官に導入及び発現させることができ、例えば、予防及び/または治療のために(例えば、遺伝子治療として)(少なくとも国際公開第08/020079号パンフレット、国際公開第94/02610号パンフレット、国際公開第95/22618号パンフレット、及び国際公開第03/014960号パンフレット;米国特許第7,004,940号パンフレット;カタネオ及びビオッカ(1997)細胞内抗体:デベロップメント及び出願(ランデス及びスプリンジャーベルラグ・プブルズ);コンターマン(2004)方法34:163-170;コヘンら(1998)Oncogene 17:2445-2456;オーフ・デル・マールら(2001)FEBS Lettを参照されたい)。508:407-412; Shaki-Loewensteinら(2005) J.Meth.303:19-39).
本明細書で使用される「抗体」という語は、抗体(または単に「抗体部」)の「抗原結合部分」も含む。本明細書で使用される「抗原結合部分」という語は抗原(例えば、本明細書に記載のペプチド及び/またはMHC-ペプチド複合体)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって行うことができることが示されている。「抗原結合部分」という抗体に含まれる結合フラグメントとしては、(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメント、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含むF(ab')2フラグメント、(iii)VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント、(iv)単一アームの抗体のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント、(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Wardら、(1989)Nature 341:544-546)、及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。さらに、Fvフラグメント、VL及びVHの2つのドメインは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を用いて、VL及びVH領域が一価ポリペプチド(一本鎖Fv(scFv)として知られている)を形成するために対合する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、それらを連結することができる(例えば、Bird et al(1988)科学 242:423-426;及びHuston et al(1988) Proc.Natl.Acad.科学。USA 85:5879-5883;及びOsbourn et al。1998、Nature Biotechnology 16: 778)。このような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」の語に包含されることが意図される。完全なIgGポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、比scFvの任意のVH及びVL配列をヒト免疫グロブリン定常領域cDNAまたはゲノム配列に連結することができる。VH及びVLはまた、タンパク質化学または組換えDNA技術のいずれかを使用して、Fb、Fvまたは他のフラグメントの免疫グロブリンの生成に使用することができる。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは二価のバイスペシフィック抗体(bispecific antibody)であり、VH及びVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、2つの抗原結合部位を作り出す(例えば、Holligerら(1993) Proc.Natl.Acad.科学。U.S.A。90:6444-6448; Poljak et al(1994) Structure 2:1121-1123).
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部と1つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合会合によって形成される、より大きな免疫接着ポリペプチドの一部であってもよい。このような免疫接着ポリペプチドとしては、例えば、四量体scFvポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov et al(1995)Human抗体and Hybridomas 6:93-101)、及び二価及びビオチン化scFvポリペプチドを作製するためのシステイン残基、タンパク質サブユニットペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov et al(1994) Mol.免疫。31:1047-1058).抗体分画、例えばFab及びF(ab')2フラグメントは、それぞれ、全抗体のパパインまたはペプシン消化などの従来の技術を用いて全抗体から調製することができる。さらに、抗体部位及び免疫接着ポリペプチドは本明細書に記載されるように、標準的な組換えDNA技術を用いて得ることができる。
抗体はポリクローナルもしくはモノクローナル;異種、同種、もしくは同系;またはそれらの修正形態(例えば、ヒト化、キメラなど)であり得る。抗体はまた、完全にヒトであり得る。好ましくは、本発明に包含される抗体が本明細書に記載のペプチド及び/またはMHC-ペプチド複合体に特異的または実質的に特異的に結合する。「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は本明細書で使用される場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の1つの種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指し、一方、「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位の複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体成分は、典型的にはそれが免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
本明細書に記載される他の結合部分と同様に、抗体はまた、「ヒト化」され得、これは、ヒト細胞によって作製されるのであろう抗体により密接に類似するように改変された可変及び定常領域を有する非ヒト細胞によって作製される抗体を含むことが意図される。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を改変して、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列中に見出されるアミノ酸を組み込むことによって。本発明に包含されるヒト化抗体はヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでの無作為または部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異)、例えばCDRを含み得る。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という語は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体も含む。
本開示に包含される結合タンパク質は、いくつかの実施形態では部分に共有結合することができる。いくつかの実施形態では、共有結合した部分がアフィニティータグまたは標識を含む。アフィニティータグは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、タンパク質Cタグ、Mycタグ、HaloTag、HAタグ、フラグタグ、Hisタグ、ビオチンタグ、及びV5タグからなる群から選択され得る。標識は蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、共有結合した部分が炎症性代理人、抗炎症性代理人、サイトカイン、トキシン、細胞傷害性分子、放射性同位体、または単鎖Fvなどの抗体からなる群から選択される。
結合タンパク質は、画像化、リサーチ、治療、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート化療法、標的化薬物デリバリー、及び放射線療法において使用される代理人にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質が検出可能な代理人、例えば、フルオロフォア、近赤外色素、造影剤代理人、ナノ粒子、含金属ナノ粒子、金属キレート、X-線造影剤代理人、ポリエチレンテレフタレート代理人、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート化剤、または画像化に使用することができる別の好適な物質とコンジュゲートまたは融合させることができる。いくつかの実施形態では1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の検出可能な部分は結合タンパク質に連結され得る。放射性同位体の非限定的な実例としては、アルファ発光、ベータ発光、陽電子発光、及びガンマ発光が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体がアクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では的に、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、その放射性同位体がアクチニウム-225または鉛-212である。いくつかの実施形態では、近赤外色素が生物学的組織及び流体によって容易に消光されない。いくつかの実施形態ではフルオロフォアが650nmと4000nmとの間の波長で電磁波を発光する蛍光代理人であり、そのような発光はそのような代理人を検出するために使用される。コンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的な例としては、DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800、またはインドシアニングリーン(ICG)が挙げられる。いくつかの実施形態では、近赤外色素が多くの場合、シアニン色素(例えば、Cy7、Cy5.5、及びCy5)を含む。本発明に従ってコンジュゲート分子として使用するための蛍光染料の追加の非限定的な例としては、アクラジンオレンジ、Alexa Fluors(登録商標)(例えば、Alexa Fluor(登録商標)790、750、700、680、660、及び647)ならびにその任意の誘導体、7-アクチノマイシンD、8-アニリノナフタレン-1-スルホン酸、ATTO(登録商標)染料及びその任意の誘導体、ベンサントロン、ビマン、9-10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、5,12-ビス(フェニルエチニル)ナフタセン、ビスベンズイミド、ブラインボウ、カルセイン、カルボジフルオレセイン及びその任意の誘導体、1-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン及びその任意の誘導体、DAPI、DiOC6、DyLight(登録商標)Fluors(登録商標)及びその任意の誘導体が挙げられる。コクノン、臭化エチジウム、Fluo染料及びその任意の誘導体、FluoProbe(登録商標)及びその任意の誘導体、Fura(登録商標)及びその任意の誘導体、GelGreen(登録商標)及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及び任意の誘導体 例えば、mCherry、ヘタメチン色素及びその任意の誘導体、エスクスト染色、イミノクマリン、インディアンイエロー、インドイエロー、インド-1及びその任意の誘導体、ルシフェリンイエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、メルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ナイル色素及びその任意の誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、リボグレン、RoGFP、ルブレン、スチルベン及びその任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、SYBR及びその任意の誘導体、シナプト-pHluorin、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス、テキサスレッド、チタンイエロー、TSQ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質及びYOYO-1などのその任意の誘導体。他の好適な蛍光染料としては、フルオレセイン及びフルオレセイン染料(例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはFITC、4'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインまたはFAMなど)、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、フィコエリトリン、エオシン、ローダミン染料(例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはTAMRA、カルボキシローダミン6G、カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、リサミンローダミンB、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン(TMR)など)、クマリン及びクマリン染料(例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン(AMCAなど)、オレゴングリーン(商標)488、500、514など)、テキサスレッド(登録商標)、テキサスレッド(登録商標)-X、スペクトラムレッド(登録商標)、スペクトラムグリーン(登録商標)、シアニン色素(例えば、CY-3、CY-3)、CY-5.5、Alexa Fluor(登録商標)色素(例えば、Alexa Fluor(登録商標)350、488、532、546、568、594、633、660、660、680など)、BODIPY(登録商標)色素(例えば、BODIPY(登録商標)FL、R6g、TMR、TR、530/550、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650、650/665など)、IRD色素(例えば、IRD40(商標)、IRD700(商標)、IRD800(商標)など)。さらなる好適な検出可能な代理人は当技術分野において周知である(例えば、PCT公開番号PCT/US14/56177)。放射性同位体の非限定的な実例としては、アルファ発光、ベータ発光、陽電子発光、及びガンマ発光が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体がアクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では的に、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、その放射性同位体がアクチニウム-225または鉛-212である。
結合タンパク質は、放射線増感剤または光増感剤にコンジュゲートされ得る。放射線増感剤としてはABT-263、ABT-199、WEHI-539、パクリタキセル, カルボプラチン,シスプラチン,オキサリプラチン,ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体(例えば、5-フルオロデオキシウリジンなどのハロゲン化プリン又はピリミジン)が挙げられるが、実施例に限定されない。光増感剤の例としては以下が挙げられるが、実施例に限定されない:ナノ粒子、ポルフィリン及びポルフィリン誘導体(例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオシアニン、フタロシアニン、及びナフタロシアニン)、メタロポルフィリン、メタロフタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲナピリリウム色素、クロロフィル、クマリン、フラビン、ならびにアロキサジン及びリボフラビン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン(例えば、メロシアニン540)、フェオフィチン、サッフィリン、テキサフィリン、ポルフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタリミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン(例えば、ソラレン、キノン、ローダミン、チオフェン、ベルジン、キサンテン色素(例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル)、二量体及びオリゴマー形態のポルフィリン、ならびに5-アミノレブリン酸などのプロドラッグ。有利には、この手法が治療薬剤(例えば、薬物)及び電磁気エネルギ(例えば、照射または光線)の両方を同時に使用して、目的の細胞(例えば、免疫細胞)の高度に特異的な標的化を可能にする。いくつかの実施形態では、結合タンパク質が例えば、直接的にまたはリンカーを介して、代理人と融合されるか、または共有結合的もしくは非共有結合的に連結される。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質は化学的に修飾され得る。例えば、結合タンパク質を変異させて、検出可能性、安定性、体内分布、薬物動態、半減期、表面荷電、疎水性、結合部位、pH、機能などのようなペプチド特性を修飾することができる。N-メチル化は、本開示に包含される結合タンパク質において起こり得るメチル化の1つの実例である。いくつかの実施形態では、結合タンパク質がホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元性メチル化などによる遊離アミン上のメチル化によって修飾することができる。
化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、バイオポリマー、両性ポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Fc領域、パルミチン酸もしくはミリストレートなどの単飽和炭素鎖、またはアルブミンを含み得る。結合タンパク質のFc領域による化学修飾は、溶融Fc-タンパク質であってもよい。ポリアミノ酸は例えば、反復単一アミノ酸(例えば、ポリグリシン)を有するポリアミノ酸配列、及びパターンに従っても従わなくてもよい混合ポリアミノ酸配列を有するポリアミノ酸配列、または前述の任意の組合せを含み得る。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質を修飾してもよい。いくつかの実施形態では、親結合タンパク質と実質的または有意な配列同一性を有し、親結合タンパク質の1つまたは複数の生物物理学的及び/または生物学的活性を維持する(例えば、結合特異性を維持する)機能的バリアントを生成する修飾。いくつかの実施形態では、変異は保存的アミノ酸置換である。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質が1つ以上の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでもよい。このような合成アミノ酸は例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、S-アセチルアミノメチルシステイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-ニトロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、βフェニルセリンβヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、l,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸モノアミド、n'-ベンジル-n'-メチルリジン、Ν',Ν'-dibenzyl-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、アミノシクロペンタンカルボン酸、オクチルアミノシクロヘキサンカルボン酸、a-アミノシクロヘプタンカルボン酸、2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γジアミノ酪酸、βジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びoc-tert-ブチルグリシン。
結合タンパク質はグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、環化(例えば、ジスルフィド架橋を介して)、または酸付加塩への変換、及び/または場合により二量体化もしくは重合、もしくは共役されてもよい。
いくつかの実施形態では、疎水性部分のアタッチメント(attachment)、例えばN末端、該C末端、または内部アミノ酸を使用して、本願に包含されるペプチドの半減期を延長することができる。他の実施形態では、結合タンパク質が例えば、血清半減期に影響を及ぼし得る翻訳後修飾(例えば、メチル化及び/またはアミド化)を含み得る。いくつかの実施形態では(例えば、ミリストイル化及び/またはパルミチル化による)簡単な炭素鎖は結合タンパク質にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、簡単な炭素鎖が結合タンパク質を非コンジュゲート物質から容易に分離可能にすることができる。例えば、結合タンパク質を非コンジュゲート物質から分離するために使用され得る方法としては溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。脂溶性部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延長することができる。コンジュゲートされた部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介してペプチドの半減期を延長する脂溶性部分であってもよい。いくつかの実施形態ではとして、脂溶性部分は、コレステロールまたはコレステン、コレスタン、コレスタジエン及びオキシステロールを含むコレステロール誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、結合タンパク質がミリスチン酸(テトラデカン酸)またはその誘導体にコンジュゲートされ得る。他の実施形態において、結合タンパク質は半減期修飾代理人にカップリング(例えば、共役)され得る。半減期改変代理人としてはポリマー、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ(アミノ酸)、プロリン、アラニン、セリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、セリンを含む水溶性ポリマー、Fc領域、脂肪酸、パルミチン酸、又はアルブミンに結合する分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはリンカーが別の分子への共役または溶融を促進するために、ならびにそのようなコンジュゲートまたは溶融分子からのペプチドの切断を促進するために、スペーサーまたはリンカーとして働く1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のアミノ酸残基などの結合タンパク質にカップリングされ得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質が例えば、結合タンパク質の特性を改変または変化させることができる他の部分にコンジュゲートすることができる。
結合タンパク質は、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成などによって、組換え的または合成的に生成され得る。ポリペプチド合成は公知の合成方法によって、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を使用して、またはブチルオキシカルボニル(Boc)化学によって実施され得る。ポリペプチドフラグメントは、酵素的または合成的に一緒に連結され得る。
本明細書において提供されるのは、本明細書に記載される結合タンパク質を産生する方法であって、(i)本明細書に記載される結合タンパク質をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を、前記結合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で培養する工程;及び(ii)発現された結合タンパク質を回収する工程を含む。
組換え的に産生された結合タンパク質を単離及び精製するのに有用な方法は例えば、結合タンパク質を培養培地中に分泌する好適な宿主細胞/ベクターシステムから上清を得ること、次いで市販のフィルターを用いて培地を濃縮することを含み得る。濃縮後、濃縮物は、単一の好適な精製行列、または親和性行列もしくはイオン交換樹脂などの一連の好適な行列に適用され得る。1つ以上の逆相HPLC工程を用いて、組換えポリペプチドをさらに精製することができる。これらの精製方法はまた、その自然界から免疫原を単離する場合に使用され得る。本明細書に記載される1つまたは複数の結合タンパク質の大規模産生のための方法は、適切な培養条件を維持するために監視及び制御されるバッチ細胞培養を含む。結合タンパク質の精製は、本明細書に記載され、当技術分野で公知の方法に従って実施することができる。
結合親和性を評価するため、及び/または結合分子が特定のリガンド(例えば、ペプチド抗原-MHC複合体)に特異的に結合するかどうかを決定するための様々なアッセイが既知である。当業者であれば、当技術分野で周知の多数の結合アッセイのいずれかを使用することなどによって、標的、例えば標的ポリペプチドのT細胞ペプチドエピトープに対する結合タンパク質の結合親和性を決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Biacore(商標)マシンを使用して、2つのタンパク質間の錯体の結合定数を決定することができる。錯体の酸解離定数(K D)は、バッファーがチップ上を通過するときの屈折率の経時変化を監視することによって決定することができる。1つのタンパク質の別のものへの結合を測定するための他の好適なアッセイとしては、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)などのイムノアッセイ、または蛍光、UV吸収、円偏光二色性もしくは核磁気共鳴(NMR)によるタンパク質の分光学的または光学的特性の変化をモニターすることによる結合の測定が挙げられる。他の例示的なアッセイとしては、ウェスタンブロット、ELISA、分析超遠心分離、分光法及びサーフェスプラズモン共鳴音(Biacore(商標))解析(例えば、Scatchardら(1949) Ann.N.Y.Acad.科学。51:660, Wilson (2002)Science 295:2103、Wolffら(1993)がんRes.53:2560, 及び米国特許。番号。5,283,173 及び5,468,614)、発現された核酸の検知のためのフロー・サイトメトリー、配列決定及び他の方法を含む。一例では、標的に対する見かけの親和性が種々の濃度の四量体への結合を評価することによって、例えば、MHC抗原ペプチド四量体などの標識多量体を用いたフロー・サイトメトリーによって測定される。1つの例示的な実施形態において、見かけのK Dの結合タンパク質は一連の濃度で標識された四量体の2倍希釈を用いて測定され、続いて、非線形回帰による結合曲線の決定が行われ、見かけのK Dは最大半量の結合を生じるリガンドの濃度として決定される。
VII.用途と方法
a. 診断方法
いくつかの態様では、被検者がSARS-CoV-2への曝露及び/またはSARS-CoV-2からの保護を有するかどうかを決定するための診断方法であって、(a)被検者から得られたサンプル(例えば、血液、単離されたPBMCまたは単離されたT細胞)を、本明細書に記載されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチド(例えば、表1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープ)、本明細書に記載されるMHC-ペプチド複合体、または本明細書に記載されるMHC-ペプチド複合体をコードし、かつ/もしくは提示する細胞、例えば、本明細書に記載される免疫原性ポリペプチド構築物からのものとインキュベートすること;ならびに(b)反応性のレベルを検出することを含み、制御レベルと比較してより高いレベルの反応性が被検者がSARS-CoV-
いくつかの実施形態では反応性のレベルがT細胞活性化またはエフェクター機能、例えば、限定されないが、T細胞増殖、死滅、またはサイトカイン放出によって示される。制御レベルは、SARS-CoV-2への曝露を有さない健常被検者の参照番号またはレベルであってもよい。
b. 治療方法
いくつかの態様では、COVID-19(すなわち、SARS-CoV-2感染)を予防及び/または治療するため、ならびに/あるいはSARS-CoV-2タンパク質またはそのフラグメントに対する免疫反応を誘導するために方法である。ある特定の実施形態に、本方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物を被検者に投与することを含む。
本明細書に記載される方法は、それを必要とする任意の対象を治療するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「それを必要とする被検者」は、COVID-19を有する、COVID-19を有する、及び/またはCOVID-19の素因を有する任意の被検者を含む。例えば、いくつかの実施形態では、被検者はCOVID-19を有する。いくつかの実施形態では、被検者がCOVID-19の治療を受けている。いくつかの実施形態ではとして、被検者は、加齢によりCOVID-19にかかりやすく、または被検者をCOVID-19にかかりやすくする免疫システムまたは他の重篤な基礎疾患を有する。
本明細書に開示される薬学的組成物は、経口及び非経口を含む、任意の適切な投与経路によって送達され得る。ある特定の実施形態に、医薬は一般に(例えば、経口または非経口投与により)送達される。特定の実施形態では、医薬組成物が皮下注射によって投与される。
被検者代理人の投与量は、代理人の血漿中濃度を参考にして決定することができる。例えば、最大血漿濃度(Cmax)及び時間0から無限大までの血漿濃度時間曲線下面積(AUC(0-4))を使用することができる。投薬量は、Cmax及びAUC(0~4)について上記の値をもたらすもの、ならびにそれらのパラメータについてより大きいまたはより小さい値をもたらす他の投薬量を含む。
医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変えることができる。
選択される投薬量は、使用される特定の代理人の活性、投与経路、投与の時期、使用される特定の化合物の排泄または代謝の速度、治療の期間、使用される特定の化合物と併用される他の薬物、化合物及び/または物質、治療される患者の年齢、性別、重量、状態、全身の健康及び以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存する。
当業者を有する医師または獣医師は必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は所望の治療効果を達成し、所望の効果が達成されるまで投与量を漸増させるために必要とされる濃度よりも低い濃度で、医薬組成物に使用される代理人の用量を処方及び/または投与することができる。
概して、本明細書に記載の代理人物の好適な1日用量は、治療作用を生じるのに効果的な最低用量である代理人の量である。そのような有効用量は一般に、上記の因子に依存する。
いくつかの実施形態でに、免疫原性組成物は、SRS-CoV-2免疫原性ペプチドを、医薬品投薬単位を構成するアジュバントと併用して含む。医薬品投薬単位は本明細書において、所定の時点で被検者に適用される活性成分(例えば、SRS-CoV-2免疫原性ペプチド及び/または補助剤)の量として定義される。医薬品投薬単位は単一の体積、例えば、単一のショットで被検者に適用されてもよく、または、身体の異なる位置、例えば、右肢及び左肢に適用される2、3、4、5またはそれ以上の別々の体積またはショットで適用されてもよい。単一の医薬投与単位を別々の体積で適用する理由は負の副作用を回避し、抗原競合及び/または組成分析の考慮事項を回避するなど、複数であり得る。本明細書において、薬学的投薬量の別々の体積は組成物が異なってもよく、すなわち、活性成分及び/またはアジュバントの異なる種類または組成物を含んでもよいことを理解されたい。
医薬品投薬単位は、有効量または有効量の一部であり得る。「有効量」は本明細書において、未処理の被験体と比較して、疾病(例えば、COVID-19)の症状(symptom)を予防及び/または低減するために必要とされる活性成分の量または用量として理解されるべきである。COVID-19の予防的及び/または治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、身体重量、及び全身の健康に応じて変化する。最終的に、主治医または獣医は、適切な量及び投薬レジメンを決定する。このような量は、「有効」量と称される。この有効量はまた、治療される被検者において有効な細胞T細胞応答を誘導することができる量、またはより好ましくは有効な全身性細胞T細胞応答であってもよい。
一態様では、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に対する免疫反応を被検者において誘発する方法が本明細書で提供される。本方法は本明細書に記載の医薬組成物を被検者に投与することを含み、医薬組成物は、被検者に投与されると、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に対する免疫反応を誘発する。
一般に、免疫反応は、体液性免疫反応、細胞媒介性免疫反応、またはその両方を含み得る。
体液性反応は、医薬組成物を投与された被検者からの血清中サンプル中の抗体濃度についての標準イムノアッセイによって決定され得る。細胞性免疫応答はT細胞を含む応答であり、インビトロまたはインビボで決定され得る。例えば、全般的な細胞性免疫反応は医薬組成物の投与後の好適な時間で被検者からサンプリングされた細胞(例えば、末梢血白血球(PBL))におけるT細胞増殖活性として決定され得る。例えば、PBMCを刺激剤と共に適切な時間インキュベートした後、[3 H]チミジン取り込みを決定することができる。増殖しているT細胞のサブセットは、フロー・サイトメトリーを用いて決定することができる。
特定の態様では、本明細書で提供される方法がヒト及び非ヒト哺乳動物の両方に投与することを含む。獣医学的用途も企図される。いくつかの実施形態では、被検者が免疫反応が誘発され得る任意の生体であってもよい。被験体としてはヒト、家畜、イヌ、ネコ、マウス、ネズミ、及びそれらの遺伝子導入種が挙げられるが、実施例に限定されない。
いくつかの実施形態では、医薬が適切な任意の時点で投与することができる。例えば、投与は、COVID-19を有する対象の治療前または治療中に行われ得、SARS-CoV-2感染が臨床的に検出不可能になった後に継続され得る。投与はまた、再発の徴候を示す被検者において継続されてもよい。
いくつかの実施形態では的には、治療的または予防的に有効な量で投与され得る。被検者への医薬組成物の投与は、公知手順を用いて、所望の効果を達成するのに十分な用量及び期間で行うことができる。
いくつかの実施形態では、医薬が任意の好適な部位で被検者に投与することができる。投与経路は、非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、静脈内(留置カテーテルを介することを含む)、求心性リンパ管を介する、または対象の状態を考慮して適切な任意の他の経路であり得る。好ましくは、投与量がSARS-CoV-2感染及び/またはそれに関連する症状(symptom)の免疫反応または予防的もしくは治療的処置を誘発することであり、所望の応答をもたらすのに有効量及び期間で投与される。
薬学的組成物は、被検者において免疫反応も誘発する治療を含む他の治療に続いて、先行して、または同時に与えられ得る。例えば、被検者は他の形態の免疫調節代理人によって、前もってまたは同時に治療されてもよく、そのような他の療法は好ましくは本明細書に記載される組成物の免疫原性を妨害しないような方法で提供される。
投与は介護者(例えば、医師、獣医師)によって適切に計時され得、被検者の臨床状態、投与の目的、及び/または企図または投与される他の治療に依存し得る。いくつかの実施形態では、初回投与量を投与し、免疫学的及び/または臨床的反応について被験体をモニタリングすることができる。免疫学的監視の好適な方法は、反応者としての患者の末梢血リンパ球(PBL)の使用、及び刺激剤として本明細書に記載される免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体を含む。免疫学的反応はまた、投与部位での遅延炎症反応によって決定され得る。最初の用量に続く1回以上の用量は、所望の効果が達成されるまで、必要に応じて、典型的には毎月、半毎月、または毎週投与され得る。その後、必要に応じて、特に免疫学的または臨床的利益が鎮静すると思われる場合には、追加の追加免疫または維持用量を投与してもよい。
c. MHC分子の文脈においてペプチドに結合する分子を同定する方法
いくつかの態様では、本明細書では1A、1B、1C、1D、1E、及び/または1Fから選択されるペプチドエピトープに結合するペプチド結合分子またはその抗原結合フラグメントを同定する方法が提供される。
いくつかの実施形態ではペプチド結合分子、すなわちMHC-ペプチド結合分子はMHC分子(MHC-ペプチド複合体)の文脈において、例えば細胞の面上に提示または提示されるペプチドエピトープに結合する、例えば特異的に結合する能力を有する分子またはその一部である。例示的なペプチド結合分子としては、MHC-ペプチド複合体への特異的結合能を示す、その単鎖免疫グロブリン可変領域(例えば、scTCR、scFv)を含む、T細胞レセプターもしくは抗体、またはその抗原結合部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドバインディング分子がTCRまたはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、ペプチドバインディング分子がTCR様抗体またはその抗原結合フラグメントなどの抗体である。いくつかの実施形態では、ペプチド結合分子が抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合するように操作されたものなどのTCR様抗体を含有するTCR様CARである。いくつかの実施形態では、ペプチドバインディング分子が天然源に由来してもよく、または部分的もしくは全体的に合成的もしくは組換え的に産生されてもよい。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープに結合する結合分子が1つ以上の候補TCR分子、抗体またはその抗原結合フラグメントなどの1つ以上の候補ペプチド結合分子をMHC-ペプチド複合体と接触させ、1つ以上の候補結合分子の各がMHC-ペプチド複合体に結合するか、例えば特異的に結合するかを評価することによって同定することができる。方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで行うことができる。方法はスクリーニングのための当該技術分野において周知であり、例えば米国特許No.パブル。2020/0102553.
いくつかの実施形態では、本方法が複数またはライブラリの結合分子、例えば複数またはライブラリのTCRまたは抗体をMHC制限エピトープと接触させること、及びそのようなエピトープに特異的に結合する分子を同定または選択することを含む。いくつかの実施形態では、複数の異なるTCRまたは複数の異なる抗体などの複数の異なる結合分子を含むライブラリまたは回収を、MHC制限エピトープへの結合についてスクリーニングまたは評価することができる。MHC拘束性ペプチドに特異的に結合する抗体分子を選択するためなどのいくつかの実施形態ではでは、ハイブリドーマ方法を用いることができる。
いくつかの実施形態では、複数の候補結合分子、例えば、ライブラリまたは候補結合分子の収集物を、同時にまたは連続して、ペプチド結合分子と個々に接触させるスクリーニング方法を用いることができる。特定のMHC-ペプチド複合体に特異的に結合するライブラリ要素を同定または選択することができる。いくつかの実施形態では、候補結合分子のライブラリまたは集合が少なくとも2、5、10、100、103、104、105、106、107、108、109、またはそれ以上の様々なペプチド結合分子を含み得る。
いくつかの実施形態では、この方法を用いて、2つ以上のMHCハプロタイプまたは2つ以上のMHC対立遺伝子に対する結合を示す、TCRまたは抗体などのペプチドバインディング分子を同定することができる。いくつかの実施形態では、TCRまたは抗体などのペプチド結合分子が複数のMHCクラスIハプロタイプまたは対立遺伝子との関連で提示されるペプチドエピトープに特異的に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの実施形態では、TCRまたは抗体などのペプチド結合分子が複数のMHCクラスIIハプロタイプまたは対立遺伝子との関連で提示されるペプチドエピトープに特異的に結合するか、またはそれを認識する。
結合親和性を評価するため、及び/または結合分子が特定のリガンド(例えば、MHC-ペプチド複合体)に特異的に結合するかどうかを決定するための様々なアッセイが知られている。当業者であれば、当技術分野で周知の多数の結合アッセイのいずれかを使用することなどによって、標的ポリペプチドのT細胞エピトープに対するTCRの結合親和性を決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、BIAcore機械を使用して、2つのタンパク質間の錯体の結合定数を決定することができる。錯体の酸解離定数(K D)は、バッファーがチップ上を通過するときの屈折率の経時変化を監視することによって決定することができる。1つのタンパク質の別のものへの結合を測定するための他の好適なアッセイとしては、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)などのイムノアッセイ、または蛍光、UV吸収、円偏光二色性もしくは核磁気共鳴(NMR)によるタンパク質の分光学的または光学的特性の変化をモニターすることによる結合の測定が挙げられる。他の例示的なアッセイとしては、ウェスタンブロット、ELISA、分析超遠心分離、分光法及びサーフェスプラズモン共鳴音(Biacore(登録商標))解析(例えば、Scatchardら(1949) Ann.N.Y.Acad.科学。51:660; Wilson (2002)Science 295:2103; Wolffら(1993)がんRes.53:2560; 及び米国特許番号5,283,173, 5,468,614、または同等物)、発現された核酸を検知するためのフロー・サイトメトリー、シークエンシング、及び他の方法。一例では、TCRに対する見かけの親和性が種々の濃度の四量体への結合を評価することによって、例えば、標識四量体を用いたフロー・サイトメトリーによって測定される。一実施形態ではTCRの見かけのK Dが一連の濃度の標識四量体の2倍希釈を用いて測定され、その後、非線形回帰によって結合曲線が決定され、見かけのK Dは最大半量結合を生じるリガンドの濃度として決定される。
いくつかの実施形態では、本方法が特定のペプチドが複合体中に存在する場合にのみ結合し、特定のペプチドが存在しない場合、または別の、重複しない、もしくは無関係のペプチドが存在する場合には結合分子を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、結合分子が結合ペプチドの非存在下ではMHCに実質的に結合せず、かつ/またはMHCの非存在下ではペプチドに実質的に結合しない。いくつかの実施形態では、結合分子は少なくとも部分的に特異的である。いくつかの実施形態では、例示的な同定された結合分子が特定のペプチドが存在する場合、MHC-ペプチド複合体に結合することができ、また、特定のペプチドに対して1つまたは2つの置換を有する関連ペプチドが存在する場合、結合することもできる。
いくつかの実施形態では、同定された抗体、例えばTCR様抗体を用いて、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する非TCR抗体を含むキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)を産生または生成することができる。
いくつかの実施形態では、TCRまたはTCR様抗体またはTCR様CARなどのペプチド結合分子を同定する方法がペプチド結合分子を発現するかまたは含む細胞を操作するために使用され得る。いくつかの実施形態では、すなわち細胞または操作された細胞はT細胞である。いくつかの実施形態ではとして、T細胞はCD4+またはCD8+ T細胞である。いくつかの実施形態では、ペプチド結合分子がMHCクラスIペプチド複合体、MHCクラスIIペプチド複合体及び/またはMHC-Eペプチド複合体を認識する。いくつかの実施形態ではMHCクラスIとの関連でペプチドを特異的に認識する、TCRまたは抗体またはCARなどのペプチド結合分子はCD8+ T細胞を操作するために使用され得る。いくつかの実施形態ではまた、MHCクラスIとの関連で提示されるペプチドの認識のための、TCR、抗体またはCARを発現するかまたは含む操作されたCD8+ T細胞の構成物を提供する。このような実施形態のいずれかにおいて、本細胞は、養子細胞療法の方法において使用され得る。
いくつかの実施形態では、TCRライブラリがPBMC、脾臓または他のリンパ器官に存在する細胞を含む、被検者から単離されたT細胞からのVα及びVβのレパートリーの増幅によって生成され得る。いくつかの場合において、T細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)から増幅され得る。いくつかの実施形態では、TCRライブラリがCD4+またはCD8+細胞から生成され得る。いくつかの実施形態ではとして、TCRは正常な健常被検者のT細胞源、すなわち、正常なTCRライブラリから増幅され得る。いくつかの実施形態では、TCRが罹患被検者のT細胞源、すなわち罹患TCRライブラリから増幅され得る。いくつかの実施形態では、縮重プライマーを用いて、ヒトから得られたT細胞などのサンプルにおけるRT-PCRなどによって、Vα及びVPの遺伝子レパートリーを増幅する。いくつかの実施形態ではscTvライブラリが未処理のVα及びVβライブラリから組み立てることができ、ここで、増幅産物はリンカーによって分離されるようにクローニングまたは組み立てられる。被検者及び細胞の供給源に応じて、ライブラリは、HLA対立遺伝子特異的であり得る。
あるいは、いくつかの実施形態ではTCRライブラリが親TCR分子またはスキャフォールドTCR分子の突然変異誘発または多様化によって生成され得る。例えば、いくつかの態様では、対象、例えばヒトまたはげっ歯類などの他の哺乳動物に、本方法によって同定されるペプチドなどのペプチドをワクチン接種することができる。いくつかの実施形態では、血中リンパ球を含むサンプルなどのサンプルを被検者から得ることができる。場合によっては、結合分子、例えば、TCRはサンプル、例えば、サンプルに含まれるT細胞から増幅され得る。いくつかの実施形態では、抗原特異的T細胞が例えば、ペプチドに対するCTL活性を評価するためのスクリーニングによって選択され得る。いくつかの態様では、例えば、抗原特異的T細胞上に存在するTCRは例えば、抗原に対する結合活性、例えば、特定の親和性またはアビディティーなどによって選択され得る。いくつかの態様では、TCRが例えばαまたはβ鎖の突然変異誘発などによる指向性進化に供される。いくつかの態様では、TCRのCDR内の特定の残基が変更される。いくつかの実施形態では、選択されたTCRが親和性成熟によって修飾され得る。いくつかの局面において、選択されたTCRは、抗原に対する親足場TCRとして使用され得る。
いくつかの実施形態では、被検者がCOVID-19を有するヒトなどのヒトである。いくつかの実施形態では、被検者がマウスなどのげっ歯類である。いくつかのそのような実施形態では、マウスがヒトMHC(すなわち、HLA)分子、例えば、HLA-A2を発現するマウスなどの遺伝子導入マウスである。See Nicholson et al.Advヘマトール。2012; 2012: 404081.
いくつかの実施形態では、被検者がヒトTCRを発現する遺伝子導入マウスであるか、または抗原陰性マウスである。See Li et al(2010) Nat Med.161029-1034; Obenausら(2015年) Nat Biotechnol.33:402-407.いくつかの態様では、被検者がヒトHLA分子及びヒトTCRを発現する遺伝子導入マウスである。
いくつかの実施形態では、例えば、被検者が遺伝子組換えHLAマウスである場合、同定されたTCRは例えば、キメラまたはヒト化されるように修飾される。いくつかの局面において、TCR足場は、公知の抗体ヒト化方法と類似のものなど、修飾される。
いくつかの実施形態では、そのような足場分子がTCRのライブラリを生成するために使用される。
例えば、いくつかの実施形態では、本ライブラリが親TCRまたはスキャフォールドTCR分子と比較して修飾または操作されたTCRまたはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では的な指向性進化方法を用いて、比MHC-ペプチド複合体に対してより高い親和性を有するなど、変化した特性を有するTCRを生成することができる。いくつかの実施形態では、ディスプレイ手法が既知のTCR、親TCR、または基準TCRを工学処理または修正することを含む。例えば、場合によっては、野生型TCRを、CDRの1つまたは複数の残渣が変異している変異誘発TCRを産生するための鋳型として使用することができ、所望の標的抗原に対するより高い親和性などの所望の変化した特性を有する変異体を選択する。いくつかの実施形態では指向性進化が限定されるものではないが、酵母ディスプレイ(Holler et al(2003)Nat Immunol 4:55-62; Holler et al(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97:5387-5392)、ファージディスプレイ(Li et al(2005)Nat Biotechnol 23:349-354)、またはT細胞ディスプレイ(Chervin et al(2008)J Immunol方法339:175-184)を含むディスプレイ方法によって達成される。
いくつかの実施形態では、ライブラリは可溶であってもよい。いくつかの実施形態では、該ライブラリが該TCRがファージまたは細胞の表面上に提示されるか、または細胞、リボソームまたは核酸、例えばRNAまたはDNAなどの粒子または分子に結合されるディスプレイライブラリである。典型的には、TCRライブラリ(正常及び疾病のTCRライブラリまたは多様化したライブラリを含む)がヘテロダイマーまたは単鎖形態を含む任意の形態で生成され得る。いくつかの実施形態ではとして、TCRの1つまたは複数の構成要素は、2本鎖ヘテロダイマーであってもよい。いくつかの実施形態では、Vα鎖とVβ鎖の対合がジスルフィド結合の導入によって促進され得る。いくつかの実施形態ではTCRライブラリの構成員がTCR単鎖(scTvまたはScTCR)であってもよく、場合によってはリンカーによって分離されたVα及びVβ鎖を含んでもよい。さらに、場合によってはライブラリからのTCRのスクリーニング及び選択の際に、選択されたメンバーは全長TCRヘテロダイマーもしくは単鎖形態などの任意の形態で、またはそれらの抗原結合フラグメントとして生成され得る。
MHC分子の文脈においてペプチドに結合する分子を同定する他の方法は米国特許出願第2020/0182884号にも記載されており、その全体が本明細書に参考として援用される。
d. 治験中の効果の監視
SARS-CoV-2療法(例えば、化合物、薬物、ワクチン、または細胞療法)がT細胞反応性(例えば、結合及び/またはT細胞活性化及び/またはエフェクター機能の存在)に及ぼす影響をモニタリングすることは、基本候補ペプチド結合分子スクリーニングだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドまたは組成物、そのようなSARS-CoV-2免疫原性ペプチド、MHC-ペプチド複合体、または細胞発現核酸、ベクター、免疫原性ペプチド、または本明細書に記載のMHC-ペプチド複合体をコードする核酸の、SARS-CoV-2感染に対する免疫反応(例えば、T細胞免疫反応)を増大させる有効性は、COVID-19に罹患している対象の臨床試験においてモニターすることができる。そのような治験において、結合及び/またはT細胞活性化及び/またはエフェクター機能(例えば、T細胞増殖、死滅、またはサイトカイン放出)の存在は、特定の細胞、組織、またはシステムの表現型の「読み出し」またはマーカとして使用することができる。同様に、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定されるTCRを発現するように操作されたT細胞、または本明細書に記載の免疫原性ペプチド、MHC-ペプチド複合体、またはMHC-ペプチド複合体をコードする及び/もしくは提示する細胞で刺激されたT細胞を用いて、SARS-CoV-2に感染した細胞に対する免疫反応を増大させる適応T細胞療法の有効性は、COVID-19に罹患した対象の臨床試験においてモニターすることができる。そのような治験において、結合及び/またはT細胞活性化及び/またはエフェクター機能(例えば、T細胞増殖、死滅、またはサイトカイン放出)の存在は、特定の細胞、組織、またはシステムの表現型の「読み出し」またはマーカとして使用することができる。
一実施形態では本発明がSARS-CoV-2療法(例えば、化合物、薬物、ワクチン、または細胞療法)による対象の治療の有効性をモニタリングするための方法を提供し、この方法はa)SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を対象に提供する前に対象から得られた第1の試料中の、対象から得られたT細胞と、本明細書に記載された1つ以上の免疫原性ペプチドまたは1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の反応性の存在またはレベルを決定する工程と、b)SARS-CoV-2療法の一部を提供した後に対象から得られた第2の試料中に存在する対象から得られたT細胞との間の反応性の存在またはレベルを決定する工程であって、第1の試料と比較して、第2の試料中の反応性の存在またはより高いレベルが療法がSARS-CoV-2の治療に有効であることを示す工程とを含む。被験者のCoV-2。
例えば、SARS-CoV-2療法の投与の増加は被検者から得られるT細胞と、本明細書に記載される1つ以上の免疫原性ペプチドまたは1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の反応性の存在またはレベルを増加させるため、すなわち、SARS-CoV-2療法の有効性を増加させるために望ましい場合がある。そのような実施形態によれば、被検者から得られたT細胞と、本明細書に記載される1つ以上の免疫原性ペプチドまたは1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の反応性の存在またはレベルは、観察可能な表現型反応がない場合であっても、SARS-CoV-2療法の有効性の指標として使用され得る。同様に、直接結合アッセイ、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタンブロット、または細胞内フローアッセイなどによる、T細胞と、本明細書に記載の1つまたは複数の免疫原性ペプチドまたは1つまたは複数の安定なMHC-ペプチド複合体との間の反応性の存在またはレベルの解析も、SARS-CoV-2治療を受ける患者を選択するために使用することができる。
例えば、直接結合アッセイにおいて、免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体は標識された免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体を検出することによって結合を決定することができるように、放射性同位体または酵素標識と結合させることができる。例えば、免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体は125 I、35 S、14 C、または3 Hで直接的または間接的に標識することができ、放射性同位体は、放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。あるいは免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体が例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は適切な基質の生成物への変換の決定によって検出される。免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体とT細胞との間の相互作用の決定は、通常の結合または酵素解析アッセイを用いて達成することもできる。上記アッセイ方法の1つ以上の実施形態において、アッセイの自動化に適応するために、免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体を固定化することが望ましい場合がある。
T細胞への免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体の結合は、反応物を収容するのに適した任意の容器中で達成することができる。このような容器の非限定的な実例としては、マイクロタイタープレート、試験チューブ、及びマイクロ遠心分離チューブが挙げられる。本明細書に記載される免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体の固定化形態は、膜、セルロース、ニトロセルロース、またはガラス繊維などの、多孔性、微孔性(平均孔径が約1ミクロン未満)またはマクロ多孔性(平均孔径が約10ミクロンを超える)物質などの固相に結合した免疫原性ペプチドまたはMHC-ペプチド複合体;アガロースまたはポリアクリルアミドまたはラテックスで作製されたものなどのビーズ;またはポリスチレンで作製されたものなどの皿、板、またはウェルの表面を含むこともできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される1つ以上の免疫原性ペプチドまたは1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体に対するT細胞の反応性が結合及び/またはT細胞活性化及び/またはエフェクター機能の存在である。「T細胞活性化」という語は増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカの発現から選択されるTリンパ球を指し、特に細胞傷害性Tリンパ球の1つまたは複数の細胞反応を指す。
1つ以上の免疫原性ペプチドまたは1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体に対するT細胞の反応性は本明細書に記載のT細胞の機能的パラメータ(例えば、増殖、サイトカイン放出、細胞毒性、細胞表面マーカー表現型の変化など)のいずれかに従って測定することができる。
サイトカイン産生及び/または放出は当技術分野で周知の方法、例えば、ELISA、酵素結合免疫吸収性スポット(ELISPOT)、Luminex(登録商標)アッセイ、細胞内サイトカイン汚染、及びフロー・サイトメトリー、ならびにそれらの組み合わせ(例えば、細胞内サイトカイン汚染及びフロー・サイトメトリー)によって測定することができる。実施される方法に従って決定することができる。
本明細書で使用される「サイトカイン」という語は生物学的または細胞的機能または処理(例えば、免疫、炎症、及び造血)を媒介及び/または調節する分子を指す。本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」、及び「インターロイキン」を含む。有用なサイトカインの実施例は、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10である。IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、及びTNF-β。
抗原特異的誘導または免疫反応の誘導から生じるT細胞の増殖及びクローン増殖は例えば、トリチウム化チミジンアッセイまたはMTTアッセイなどの非放射性アッセイの取り込みを介して決定することができる。
CTL活性を決定するための細胞毒性アッセイは当技術分野で日常的に実施されているいくつかの技術及び方法のいずれか1つを使用して実施することができる(例えば、Henkartら(2003)Fundamental Immunology 1127-1150)。抗原特異的T細胞反応性を測定するための方法のさらなる明細書は例えば、米国特許第10,208,086号及び米国特許出願第2017/0209573号に見出すことができ、その各々は、その全体が本明細書に参考として援用される。
VIII.細胞療法
特定の態様では、本方法が養子細胞療法を含み、それによって、提供されるMHC制限エピトープを標的とする遺伝子操作された細胞(例えば、TCRまたはTCR様CARを発現する細胞)を発現する細胞が対象に投与される。そのような投与はSARS-CoV-2に感染した細胞が破壊の標的となるように、抗原標的様式で細胞の活性化(例えば、T細胞活性化)を促進し得る。
したがって、提供される方法及び使用は、養子細胞療法のための方法及び使用を含む。いくつかの実施形態では、本方法が被験体、組織、または細胞、例えば、疾病、状態、または障害を有する、リスクがある、または有することが疑われるものへの細胞物またはそれを含む配合物の投与を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記集団、及び前記化合物は例えば、養子T細胞療法などの養子細胞療法を介して、治療されるべき特定の病気または条件を有する被検者に投与される。いくつかの実施形態ではとして、細胞物または配合物は、疾病または条件を有するか、またはそのリスクがある対象などの対象に投与される。いくつかの態様では、方法がそれによって、疾病または状態の1つまたは複数の症状(symptom)を治療、例えば改善する。
方法物は細胞を養子細胞療法のために投与するために、公知であり、提供される方法及び配合物に関連して使用することができる。例えば、養子T細胞療法方法は例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開第2003/0170238号;米国特許No.米国特許第4,690,915号(Rosenberg; Rosenberg(2011) Nat Rev Clin Oncol.8:577-585).例えば、Themeli et al(2013) Nat Biotechnol.31: 928-933; Tsukahara et al(2013)Biochem Biophys Res Commun 438: 84-89; Davila et al(2013) PLoS ONE 8:e61338.
いくつかの実施形態ではとして、細胞療法、例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法は細胞療法を受けようとする被検者から、またはそのような被検者に由来するサンプルから、単離及び/または他の方法で調製される、自家移植によって実施される。したがって、いくつかの局面において、細胞は治療を必要とする被検者、例えば、被検者に由来し、単離及び処理後に、細胞は、同じ被検者に投与される。
いくつかの実施形態ではとして、細胞療法、例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法は同種異系移植によって実施され、ここで、細胞は単離され、及び/またはさもなければ、細胞療法を受けようとするまたは最終的に細胞療法を受ける被験体、例えば、第1の被験体以外の被験体から調製される。このような実施形態では、細胞物が次いで、同じ種の別の対象、例えば、第2の対象に投与される。いくつかの実施形態ではとして、第1及び第2の被験体は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態ではとして、第1及び第2の被験者は遺伝的に類似している。いくつかの実施形態では、第2の被験者が第1の被験者と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。
いくつかの実施形態ではとして、細胞、細胞集団、または化合物が投与される被検者は、ヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態では、霊長類はサルまたは類人猿である。被験体は、男性または女性であってもよく、乳児、若年、青年、成人、及び高齢被験体を含む、任意の適切な年齢であってもよい。いくつかの実施形態では、被検者がげっ歯類などの非霊長類哺乳動物である。いくつかの実施形態では、患者または被験体が病気、養子細胞療法、及び/またはサイトカイン放出症候群(cytokine release syndrome)などの毒性結果を評価するための有効な動物モデルである。
TCR、TCR様抗体及びTCR様レセプター(例えば、CAR)を発現するTCR様抗体及び細胞などの結合分子は例えば、静脈内または皮下注射、眼内注射、眼球周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、眼球下注射、結膜下注射、テノンのう下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または後強膜傍デリバリーなどの注射によって、任意の好適な方法によって投与することができる。いくつかの実施形態では、それらは非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに、所望であれば局所治療のために、病巣内投与によって投与される。非経口輸液には、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬及び投与は、投与が短期であるか慢性であるかに部分的に依存し得る。様々な投与スケジュールは限定されるものではないが、様々な時間にわたる単回または複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む。
疾患の予防または治療のために、結合分子または細胞の適切な投与量は、治療される疾患の種類、結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、結合分子が予防または治療のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及び結合分子に対する反応、ならびに担当医の裁量に依存し得る。これらの化合物及び化合物及び細胞物は一度に、または一連の治療にわたって、いくつかの実施形態では適切に投与される。
特定の実施形態では細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は約100万~約1000億細胞の範囲、及び/または体重1キログラム当たりの細胞量、例えば100万~約500億細胞(例えば、約50万細胞、約2500万細胞、約500万細胞、約10億細胞、約50億細胞、約200億細胞、約300億細胞、約400億細胞、または前述の値のいずれか2つによって定義される範囲)、例えば約1000万~約1000億細胞(例えば、約2000万細胞、約3000万細胞、約4000万細胞、約6000万細胞、約7000万細胞、約8000万細胞、約900万細胞、約100億細胞、約250億細胞、約500億細胞、約750億細胞、約900億細胞、または範囲で対象に投与される 前述の値のいずれか2つによって定義され、場合によっては約1億細胞~約500億細胞(例えば、約1億2000万細胞、約2億5000万細胞、約350百万細胞、約450百万細胞、約650百万細胞、約800百万細胞、約900百万細胞、約30億細胞、約300億細胞、約450億細胞)、またはこれらの範囲及び/もしくは体重1キログラム当たりの任意の値によって定義される。投与量は、疾患もしくは障害及び/または患者及び/または他の治療に特有の属性に応じて変化し得る。
いくつかの実施形態では、例えば、被検者がヒトである場合、用量は約1×108未満の総組換えレセプター(例えば、CAR)発現細胞、PBMCまたは末梢血単核細胞(PBMC)を含み、例えば、2×106、5×106、1×107、5×10T細胞、もしくは1×108などの細胞などの約1×106~1×10OOJの範囲、またはそのような総細胞、または前記の数値のいずれか2つの間の範囲である。
いくつかの実施形態ではとして、細胞または結合分子(例えば、TCRまたはTCR様抗体)は併用治療の一部として、例えば、別の抗体または操作された細胞またはレセプターまたは代理人(例えば、細胞傷害性または治療薬剤)などの別の治療的処置と同時または逐次的に、任意の順序で投与される。
細胞または結合分子(例えば、TCRまたはTCR様抗体)いくつかの実施形態では、1つまたは複数の追加の治療薬剤と同時投与されるか、または別の治療的介入と関連して、同時または任意の順序で逐次投与される。いくつかの文脈では、細胞が細胞集団が1つまたは複数の追加の治療薬剤の効果を増強するように、またはその逆のように、十分に近い時点で別の療法と同時投与される。いくつかの実施形態ではとして、細胞または結合分子(例えば、TCRまたはTCR様抗体)は、1回または複数回の追加の治療薬剤の前に投与される。いくつかの実施形態でに、細胞または結合分子(例えば、TCRまたはTCR様抗体)は、1つまたは複数のさらなる治療薬剤に投与される。
細胞が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されると、いくつかの局面において、操作された細胞集団及び/または結合分子(例えば、TCRまたはTCR様抗体)の生物学的活性は、多くの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメータには、操作されたもしくは天然のT細胞または他の免疫細胞のインビボでの、例えば画像化による、またはエクスビボでの、例えばELISAまたはフロー・サイトメトリーによる特異的結合が含まれる。ある特定の実施形態に、操作された細胞のターゲット細胞を破壊する能力は例えば、Kochenderfer et al(2009)JImmunotherapy 32:689-702、及びHerman et al(2004)J免疫学的方法285:25-40に記載されている細胞毒性アッセイなど、当技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて測定することができる。ある特定の実施形態に、細胞の生物学的活性は、CD 107a、IFNγ、IL-2、及びTNFなどの特定のサイトカインの発現及び/または分泌をアッセイすることによって測定することもできる。いくつかの態様では、生物学的活性が腫瘍量または負荷の低下などの臨床転帰を評価することによって測定される。
ある特定の実施形態に、操作された細胞はそれらの治療的または予防的有効性が増加するように、多くの方法で修飾される。例えば、集団によって発現される操作されたCARまたはTCRは直接的に、またはリンカーを介して間接的にターゲティング部分にコンジュゲートされ得る。化合物、例えば、CARまたはTCRをターゲティング部分にコンジュゲートさせる実施は、当技術分野で公知である。例えば、Wadwa et al(1995)JDrug Targeting 3: 111及びUS Pat. 5,087,616。
特定の態様では本明細書に記載されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチド、またはそのようなSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸はこれらの抗原提示細胞で生成されたSARS-CoV-2-プライム、抗原提示細胞、及び/またはSARS-CoV-2特異的リンパ球を提供するための組成物及び方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、そのような抗原提示細胞及び/またはリンパ球がCOIVD-19(すなわち、SARS-CoV-2感染)の処理及び/または防止に使用される。
いくつかの態様では、抗原提示細胞を、本明細書に記載のSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、または少なくとも1つのSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と、単独で、またはアジュバントと組合せて、抗原提示細胞を、少なくとも1つのSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドが抗原提示細胞によって提示されるのに充分な条件下でインビトロで接触させることによって、SARS-CoV-2プライミングされた抗原提示細胞を作製するための方法が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態ではSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸は単独で、または補助剤との組合せで、抗原提示細胞を含む均質な、実質的に均質な、または不均質な組成物と接触させることができる。例えば、末梢血単核細胞、全血の軟膜分率、濃厚赤色細胞、照射血液、樹状細胞, 単球,マクロファージ,好中球、リンパ球、ナチュラル・キラー細胞、及びナチュラルキラーT細胞などであるが、これらに限定されない、全血、新鮮血液、またはこれらの分率を含むことができるが、これらに限定されない。場合により、抗原提示細胞の前駆体が使用される場合、前駆体は、前駆体を抗原提示細胞に分化させるのに充分な好適な培養条件下で培養され得る。いくつかの実施形態では、その抗原提示細胞(またはその前駆体)が骨髄系列の単球, マクロファージ,細胞、B細胞、またはランゲルハンス細胞から選択される。
抗原提示細胞と接して配置されるSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸の量は、日常的な実験によって当業者が決定することができる。一般に、抗原提示細胞は、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と、単独で、または補助剤との組合せで、細胞がT細胞の変調のためにプロセシングされた形態の抗原を提示するのに充分な期間にわたって接触させられる。ある実施形態, 抗原提示細胞において、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸の存在下で、単独で、または補助剤との組合せで、約1週間未満、例えば、約1分~約48時間、約2分~約36時間、約3分~約24時間、約4分~約12時間、約6分~約8時間、約8分~約6時間、約10分~約5時間、約15分~約4時間、約20分~約3時間、約30分~約2時間、及び約40分~約1時間インキュベートする。SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸の時間及び量は単独で、または補助剤との組合せで、抗原提示細胞が抗原を処理及び提示するために必須であり、例えば、パルスチェイス方法を使用して決定され得、ここで、コンタクトはウォッシュアウト時間及びリードアウトシステム、例えば、抗原反応性T細胞への曝露が続く。
ある特定の実施形態に、抗原提示細胞の内因性プロセシング経路への抗原のデリバリーのための任意の適切な方法を使用することができる。そのような方法にはpH感受性リポソームを含む方法、抗原の補助剤への結合、アポトーシス細胞デリバリー、樹状細胞へのパルス細胞、抗原を含む組換えキメラウイルス様微粒子(VLP)の樹状細胞株のMHCクラスIプロセシング経路への送達が含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態に、可溶化SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドを抗原提示細胞と共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドがMHCクラスI経路へのデリバリーのための抗原提示細胞の細胞質ゾルへの抗原の移動を増強するために、サイトリシンにカップリングされ得る。例示的な細胞溶解素としては、サポニン化合物、例えばサポニン含有免疫刺激複合体(ISCOM5)、孔形成毒素(例えばα毒素)、及びグラム陽性バクテリアの天然細胞溶解素、例えばリステリオリシンO(LLO)、ストレプトリシンO(SLO)、及びパーフリンゴリシンO(PFO)が挙げられる。
樹状細胞及びマクロファージなどのいくつかの実施形態では, 抗原提示細胞は当技術分野で公知の方法に従って単離し、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を抗原提示細胞に導入するための当技術分野で公知の方法によってポリヌクレオチドでトランスフェクトすることができる。トランスフェクションな試薬剤及び方法は当技術分野において公知であり、市販されている。例えば、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードするRNAは好適な媒体中で提供され得、抗原提示細胞との接触前に脂質(例えば、カチオン性脂質)と組み合わせられ得る。このような脂質の非限定的な実例としては、LIPOFECTINTM及びLIPOFECTAMINETMが挙げられる。次いで、得られたポリヌクレオチド脂質複合体を抗原提示細胞と接触させることができる。あるいは、ポリヌクレオチドがエレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションなどの技術を用いて抗原提示細胞に導入され得る。次いで、ポリヌクレオチド負荷抗原提示細胞を使用して、インビボまたはエクスビボでTリンパ球(例えば、細胞傷害性Tリンパ球)増殖を刺激することができる。ある実施形態に、エクスビボで増殖させたTリンパ球は、養子免疫療法の方法で被検者に投与される。
特定の態様では、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸とインビトロで接触させた抗原提示細胞を、単独で、または抗原提示細胞によって提示されるSARS-CoV-2免疫原性エピトープに十分な条件下でアジュバントと組合せて含む組成物が本明細書で提供される。
いくつかの態様において、SARS-CoV-2タンパク質に特異的なリンパ球を調製するための方法が本明細書において提供される。この方法は、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に対する免疫反応を誘発することができるSARS-CoV-2タンパク質特異的リンパ球を産生するのに充分な条件下で、リンパ球を上記の抗原提示細胞と接触させることを含む。したがって、本抗原提示細胞はまた、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に対する免疫反応を誘発するために、Tリンパ球及びBリンパ球を含むリンパ球を提供するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、Tリンパ球の調製物を上記の抗原提示細胞と一定時間(例えば、少なくとも約24時間)接触させて、Tリンパ球を抗原提示細胞によって提示されるSARS-CoV-2免疫原性エピトープにプライミングする。
いくつかの実施形態では、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチド、またはSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と共に、単独で、またはアジュバントと組合せて、集団の抗原提示細胞を異種集団の末梢血Tリンパ球と共培養することができる。細胞はSARS-CoV-2ポリペプチドに含まれるSARS-CoV-2エピトープが抗原提示細胞によって提示されるのに充分な期間及び条件下で共培養され時間、細胞に応答するTリンパ球の集団をプライミングする抗原提示細胞はSARS-CoV-2ウイルスによって感染される。ある特定の実施形態に、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に応答するようにプライミングされたTリンパ球及びBリンパ球が本明細書において提供される。
Tリンパ球は、末梢血、脾臓、及びリンパ節などの任意の好適な供給源から得ることができる。Tリンパ球は未粗調製物として、または部分的に粗されたもしくは実質的に粗された調製物として使用することができ、これは抗体を使用する免疫磁気またはフロー・サイトメトリー技術を含むが、これらに限定されない方法を含む、通常の技術によって得ることができる。
特定の態様では、上記の抗原提示細胞またはリンパ球と、薬学的に許容可能な担体及び/または希釈剤とを含む組成物(例えば、医薬組成物)が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、該組成物が上記のような補助剤をさらに含む。
ある特定の態様では本明細書で提供されるのはSARS-CoV-2ウイルスに感染している細胞に対する免疫応答を誘発するための方法であり、この方法は上記の抗原提示細胞またはリンパ球を、免疫応答を誘発するのに充分な有効量で被検者に投与することを含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、COVID-19の治療または予防のための方法であって、上記の抗原提示細胞またはリンパ球の有効量を被検者に投与することを含む。ある実施形態に、抗原提示細胞またはリンパ球は全身的に、好ましくは注射によって投与される。あるいは、全身的ではなく局所的に、例えば、組織への直接的な配合を介して、好ましくはデポ(depot)または徐放性製剤で投与してもよい。
ある特定の実施形態に、本明細書に記載の抗原刺激抗原提示細胞及びこれらの抗原提示細胞を用いて作製された抗原特異的Tリンパ球は、COVID-19の予防的または治療的処置のための免疫調節剤中の活性化合物として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSARS-CoV-2 -プライミングされた抗原提示細胞が被検者への養子移入のためのCD8+Tリンパ球、CD4+ Tリンパ球、及び/またはBリンパ球を生成するために使用され得る。したがって、例えば、SARS-CoV-2特異的リンパ球は、COVID-19に罹患している対象において治療目的のために養子移入され得る。
ある特定の実施形態に、本明細書に記載される抗原提示細胞及び/またはリンパ球は免疫反応を誘発するために、特に細胞に対する免疫反応を誘発するために、それ自体または組合せのいずれかで被検者に投与され得、SARS-CoV-2ウイルスによって感染される。いくつかの実施形態ではとして、抗原提示細胞及び/またはリンパ球は被検者(すなわち、自己細胞)に由来してもよく、または被検者とMHCが一致または不一致(例えば、同種異系)である別の被検者に由来してもよい。
抗原提示細胞及びリンパ球の単回または反復投与はケア提供者(例えば、医師)によって選択される細胞数及び治療を用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、前記抗原提示細胞及び/またはリンパ球が薬学的に許容可能な担体で投与される。好適な担体は、細胞を増殖させた増殖培地、またはリン酸緩衝生理食塩水などの任意の好適な緩衝培地であってよい。細胞は、単独で、または他の治療薬と併せて補助療法として投与され得る。
IX.キット
本発明はまた、キットを包含する。例えば、キットは免疫原性ペプチド、免疫原性ペプチドをコードする配列を含むベクター、本明細書に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、補助剤、及びそれらの組合せを含むことができ、好適な容器に包装され、そのような試薬を使用するための説明書をさらに含むことができる。キットはまた、別の容器に包装された投与ツールなどの他の構成要素を含んでもよい。
本開示は、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願、ならびに図面の含有量は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例1: SARS-CoV-2ワクチン構築物
SARS-CoV-2に対する最も強力なCD8 T細胞反応を生じさせるワクチンを構築するための検討を行った。これには、個々のエピトープに対する応答の大きさの最大化、及び全標的エピトープの幅の最大化が含まれる。同時に、ワクチン設計は、いくつかの制約に直面する。1つの重要な考察は全ワクチン構築物の限られたサイズであり、過剰なサイズはワクチンデリバリー・システム(例えば、mRNAまたはウイルスベクター)に課題をもたらし、完全な構築物の効率的な発現を妨げ得る。
ポリエピトープワクチンが本当に強固なT細胞反応を生み出す能力については、当分野においてかなりの疑念がある。この疑念は、2つの主な課題に集中している。第1の課題は、ワクチンに含まれる限られたエピトープの組に関する。ポリエピトープワクチンは主に、別個のコードされたペプチドエピトープのみを含む。対照的に、タンパク質全体を含むワクチンは、数千の異なるエピトープにプロセシングされ、異なるエピトープが異なるMHC対立遺伝子上に提示される。SARS-CoV-2 Sタンパク質の大きさがタンパク質ことは、考えられる全てのMHC対立遺伝子について多数の予測される高親和性結合剤が存在するほど多くの潜在的なエピトープを含む。ポリエピトープワクチンの課題は、制限されたMHC制限された所定の組のエピトープに対して、全タンパク質に対して自然に得られるよりも強い反応を誘発することである。第2の課題は、ポリエピトープワクチンの文脈におけるエピトープのプロセシング及び提示に関する。発見されたエピトープがSARS-CoV-2感染の文脈において効率的に提示されるからといって、それらがポリエピトープワクチンの文脈において提示されることを意味しない。この問題はポリエピトープワクチンに含まれるエピトープの数が限られているために特に深刻であり、ワクチン中のエピトープのごくわずかな画分でさえ存在しないことが、特定のMHC対立遺伝子に対して全く反応を誘発するワクチンの能力に劇的な影響を及ぼす可能性がある。
これらの課題は当該分野において広く理解されており、他のウイルスのための成功したポリエピトープワクチンの発展を妨げている。実際、近年行われたSARS-CoV-2エピトープ地図作成の研究に照らして、それぞれのMHC対立遺伝子上に認識された限られた一連の高度に免疫優性なエピトープを同定したとしても、これらの生物学的洞察が、これらの基本的な課題を克服する効果的なワクチンとなり得るかどうかについて、かなりの懐疑的な見方があった。
ポリエピトープワクチンの設計には、1)ワクチンに含まれる含量、及び2)含量が発現される状況を含む、2セットのオープンエンド決定がなされる。
これらの決定の両方に対する幅広い選択肢が探求された。これまでに開発された独自の薬剤(回復期COVID19群由来の高活性記憶CD8 T細胞)を利用して、様々なワクチンセットを実験的に検討するためにデザインした。
特に、DNA配列は、設計されたタンパク質ワクチン配列から逆翻訳され、次いで、GenSmart(商標)コドン最適化アルゴリズム(GenScript、Inc.;PCT公開公報第2020/0024917号も参照されたい)を用いて配列最適化された。DNAをgBlocks(Integrated DNA Technologies Inc.)として注文し、NEBuilder(登録商標)HiFi DNA組立体Master Mix
(New England Biolabs; カタログ番号E2621S)を用いてEcoRI線状化pHAGE-CMV-IRES-Puroベクター(Kula et al(2019)細胞178:1016-1028)に組み立てた。組立体を混合物及びGo!化学的にコンピテントな細胞(ザイモリサーチ;カタログ番号T3007)に形質転換し、個々のコロニーをサンガーシークエンシングのために選択した。
A*02:01発現HEK293細胞を、それぞれのワクチンコンストラクトで1の感染多重度(MOI)で形質導入し、ピューロマイシン(1.5 ug/mL、ギブコ)を用いて選択した。5x104細胞を96ウェルプレートに播種し、16時間静置した。回復期COVID-19症例から分離されたメモリーCD8 T細胞(Ferrettiら(2020)Immunity S1074-7613(20)30447-;doi.org/10.1016/j.immuni.2020.10.006で入手可能))を2:1のエフェクター対標的比率で添加し、16~18時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をピペッティングにより混合し、V底96ウェルプレートに移し、300xgで5分間遠心分離することによりペレット化した。上清を収集し、IFNγをエラ(タンパク質シンプル)を用いて測定した。細胞ペレットを、BV421結合抗CD8(BioLegend)、AF647結合抗CD69(Biolegend)、及びポリエチレン結合抗CD137(Miltenyi)抗体で染色し、サイトフレックスS(ベックマンコールター)で分析した。
結果は、ワクチンの状況及び内容の両方が予測されなかった方法でその性能に深刻な影響を及ぼすことを実証した。さらに、設計されたワクチン構築物は臨床試験における現行のワクチン候補よりも強固なCD8 T細胞反応を生成するために、非常に有望であることが観察された。
6つの共通MHC対立遺伝子上に提示された免疫優性エピトープが同定された: HLA-A*02:01、HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、及びHLA-B*07:02。同定された全ての29の免疫優性エピトープ(6 A2、8 A1、4 A3、5 A11、3 A24、3 B7)または19の免疫優性エピトープ(それぞれのMHCから3~4)のいずれかをコードするポリエピトープワクチンを設計した。19のエピトープを選択する際に、複数MHC対立遺伝子の提示を予測または検証したエピトープを含めた。これらの19個のエピトープは、以下に特定される表L1からのサブセットを含む。
表L1及び表L2から構成される以下の表Lは開示される構築物において使用され得る29個のペプチドエピトープ(例えば、表L1における配列、及び表L2におけるさらなるデータ)を同定する。表Lは、orf3a、M、及びN、ならびにorf1ab、タンパク質がT細胞エピトープを含むためのホットスポットであることを明確に示すことに留意されたい。
［表８］
［表９］
ワクチン文脈に関して、1つの重要な要素は、エピトープ間のリンカーである。リンカーは、エピトープが効率的に処理され、提示される可能性が高いかどうかの重要な決定要因である。試験された構築物は、全くリンカーを有さず(直接連結)、各エピトープの上流及び下流の3aa(隣り合うエピトープ間の合計で6aaの間隔について)、または各組のエピトープ間の最適化されたプロテアソーム切断配列「KAA」のいずれかを有していた。さらなる研究には、ポリエピトープワクチン内のエピトープの順序の最適化も含まれた。ここで、目的は高い親和性でMHCに結合するが、SARS-CoV-2ゲノム中には見出されない接合エピトープの生成を最小限にすることであった;そのようなエピトープは提示のために所望のエピトープと競合する。エピトープの順序を反復的に変更して、ポリエピトープコンストラクト内の最も高い親和性予測エピトープを除去するためのアルゴリズムを開発した。この方法を1万種の出発構築に適用し、最良の最終性能を有するバリアントを選択した。特に、差異に寄与する変数は、接合部ネオエピトープを評価する際にどのHLA対立遺伝子が考慮されるかの選択であることが決定された。この方法のために、表Lのエピトープが提示する6つのHLA対立遺伝子を選択した。次に、選択されたエピトープ間の考えられるすべてのジャンクションの包括的な組を生成した。NetMHC4.0アルゴリズム(Jurtzら(2017)JImmunol.199:3360-3368)調べた6つのMHC対立遺伝子上のMHC結合エピトープを決定するために使用した。それぞれのジャンクションについて、天然のウイルス配列に由来しない(すなわち、ジャンクション自体に起因して生じる)最も高い親和性の予測される結合剤を同定した。次に、エピトープのランダム開始順序が割り当てられた。所与の順序について、最も高い親和性の予測される接合部エピトープを同定した。構築物内で2つのエピトープを交換することができる全ての考えられる方法を評価し、最も低い親和性の残りの接合エピトープをもたらすエピトープ交換を選択した。この過程は、エピトープスワップが構築物をさらに改善することができなくなるまで反復された。このアルゴリズム全体を1万個のランダム開始次数で実行し、最良のパフォーマンスの最終次数(すなわち、最高親和性接合エピトープが最低の親和性を有する次数)を選択した。
種々の構築物を設計する過程で、ポリエピトープワクチン内の個々のエピトープの位置も変化させた。最後に、設計されたポリエピトープワクチンを、細胞質において発現されるスタンドアロン構築物として、または天然のSARS-CoV-2 Sタンパク質の後のポリシストロン性発現の文脈において(P2A配列を使用して、その天然のシグナル配列を使用して、Sタンパク質の膜貫通発現の直後に、本発明者らのポリエピトープワクチンの細胞質発現を可能にする)構築した。
これらの構築物を評価するために、レンチウイルス形質導入(低MOI)を使用して、HLA-A*02:01のみを発現するHEK293T細胞中でそれぞれの構築物を発現させた。次いで、改変HEK293T細胞を、一団の回復期COVID-19患者(例えば、A*02:01正COVID-19患者)由来の記憶CD8 T細胞と共培養した。IFNγ(IFNg)分泌を用いて、提示されたエピトープに対するT細胞反応の強度を評価した。これは、それぞれのワクチンに関して、エピトープがどれだけ効率的に提示されるかの読み出しを提供する。以前の研究に基づいて、大部分のCOVID19回復期の患者は試験したエピトープに対して記憶CD8 T細胞を生成することが知られており、したがって、反応の強度は、それぞれのワクチンコンストラクトにおいてエピトープが効率的に提示された先行直接的な読み出しを提供した。
いくつかの重要な制御を含めた。最初に、HEK293T細胞単独(ウイルス配列なし)を試験し、これをネガティブ・コントロール(「A2スクレップ」)として用いた。第2に、一組の3つの免疫優性HLA-A*02:01 SARS-CoV-2エピトープによるペプチドパルスをポジティブ・コントロールとして使用した(ペプチドパルスは高能率でMHCに直接的に負荷するため)(「A2 Screps + KLW/YLQ/LLY」)。第3に、Sタンパク質単独を使用した。これは、ポリエピトープ構築物による誘発されたT細胞反応の大きさをこのベースラインと比較することを可能にする、臨床試験において現在試験されているリード構築物である。最後に、3つの免疫優性HLA-A*02:01エピトープの各々にまたがる~500aaの大きなフラグメントもパルス試験に含めた。
実験の結果を図3及び図4に示し、いくつかの重要な結果を決定した。
第1に、それぞれのワクチンの文脈に応じて、エピトープ提示の有効性の間に有意差があることが観察された。特に、それぞれのエピトープの上流及び下流の3つのアミノ酸の使用は、リンカーの非存在またはKAAリンカーの使用よりも優れていると同定された。第二に、構築物の細胞質発現が重要であることが観察された。実際、Sタンパク質が免疫優性HLA-A*02:01エピトープの1つを含んでいたにもかかわらず、全長Sタンパク質に対する非常に弱い反応がいずれの症例でも観察された。実際、このエピトープ(「ORF S-1」)に及ぶSタンパク質からの500アミノ酸のフラグメントの発現はより強い反応をもたらし、それによって、全長Sタンパク質が特に不良な提示をもたらすことを強調する。第3に、ポリエピトープワクチンの直接式は、P2A配列の使用よりも強い式をもたらすことが観察された。概して、27エピトープからの発現は、19エピトープからの発現よりも強い反応をもたらした。
しかしながら、最も顕著な取り消しは、全体としてのワクチン構築物の効率であった。試験したポリエピトープコンストラクトの全てはSタンパク質単独よりも劇的により強力なT細胞活性をもたらし、最適なコンストラクトのいくつかはポジティブ・コントロールペプチドパルシングよりも良好に機能した。このことは非常に驚くべきことであり、適切なエピトープ、リンカー、及びタンパク質文脈を使用する場合のポリエピトープワクチンの可能性を強調している。
これらの結果は、ポリエピトープ構築物の有用性に懐疑的であった技術水準とは全く対照的である。例えば、Korberら(2009) J.(2009)83: 8300~8314はHIVに対するT-細胞に基づくワクチンアプローチの広範な概観を提供し、ポリエピトープワクチンに関するその節では、この理論的アプローチによって観察される免疫原生欠如を強調している。
実施された研究に基づいて、以下の2つが重要であることが見出された。第1は、エピトープ自体のアイデンティティである。含まれるエピトープは最高水準の機能的検証を有するものであり、それらは、実際のSARS-CoV-2感染の文脈において免疫優性である。他のエピトープは予測されるか、質量分析によって感染細胞上で検出されるか、または感受性抗原特異的拡大後に回復期の患者によって認識されるかのいずれかであることが同定されている;これは、それらが免疫優性であることを示さない(したがって、最も免疫原性であり、ワクチンとの関連で免疫システムによって効率的に認識される可能性が高い)。第2は、含まれるエピトープの個数である。いくつかの実施形態では、エピトープが広い多様性のHLA型(例えば、6つの共通HLAのそれぞれにつき少なくとも1つの免疫優性エピトープ)を包含するように選択される。複数HLA対立遺伝子によって提示されるいくつかのエピトープが存在することに留意されたい。したがって、わずか4または5個のエピトープを有する6つの対立遺伝子の各単一の免疫優性エピトープを得ることができる。したがって、例えば、6つの共通HLAのそれぞれにつき少なくとも1つの免疫優性エピトープの最小限の適用範囲を、4、5、6、またはそれ以上のエピトープで達成することができ、それによって、集団におけるHLA多様性の妥当な適用範囲を提供することができるそのようなHLA多様性適用範囲よりも少ないワクチンは大きな盲点を有し、準最適なHLA対立遺伝子を有する患者を見逃そう。より広義には、ワクチンの価値がより多くのエピトープを添加することによって著しく増大すると考えられる。いくつかの実施形態では、構築物が6つの共通HLAのそれぞれにつき少なくとも2つの免疫優性エピトープを有する。試験された構築物は最低18個のエピトープ(6個のHLA対立遺伝子の各およそ3個)を有し、これは、頑強で広範な応答の生成を増大させると考えられる。
1)どのエピトープ(またはタンパク質)が最も防御的であるかは必ずしも知られていないこと、2)含まれるエピトープの少なくとも1つに対してロバストなT細胞応答が生じる可能性が高いこと、及び3)複数エピトープに対するT細胞応答が有効性及び抗原エスケープバリアントを予防するために重要であることから、HLA対立遺伝子当たりの複数エピトープを有することは重要であると考えられる。
以下の因子は測定可能であるが、相対的に重要性が低いと判断された。
1つの要因は、エピトープ間のリンカーのアイデンティティである。種々のリンカーがある程度の有効性を示したが、3アミノ酸リンカーで見られるエピトープ提示の~2倍の向上は有意義であるが、より長いリンカーも同様に適している。
別の要因は、エピトープの順序である。エピトープの順序は接合エピトープを制限するように最適化されたが、様々なエピトープ順序を有する構築物は同等の成果を示したと考えられる。どのような接合エピトープが問題となると考えられるかについては、ハードカットオフ値は存在しない。概して、高親和性接合部エピトープは所望のエピトープと競合し、それによって、観察される免疫反応の大きさを低減すると考えられる。ワクチン構築について、予測された結合親和性<77 nM(例えば、≦75 nM、≦70 nM、≦65 nM、≦60 nM、≦55 nM、≦50 nM、≦45 nM、≦40 nM、≦35 nM、≦30 nM、≦25 nM、≦20 nM、≦15 nM、≦10 nM、≦5 nM、もしくはそれ未満、または50~75nMなどの間の任意の範囲)を有するすべての接合エピトープを除去した。開示された29エピトープワクチンのケースでは、これは構築物全体にわたる22の最高親和性予測結合剤が特に望ましいエピトープであることを意味する。予測される高親和性結合を有する単一のエピトープは劇的な影響を有さず、一般に、接合エピトープを除去する利益を測定することは困難であると考えられる。
さらに、関連する文脈における研究は、方位が提示の効率にほとんど影響しないことを示唆する。N末端のフラグメントの抗原決定基は必ず合成されるので、より効率的に提示されるが、いくつかの欠陥タンパク質産物はC末端を欠いている可能性がある。しかしながら、実験データは、様々な方向でのエピトープの一般的に同等の提示を示唆している。
全体ワクチンコンストラクトの大きさの制約のために、エピトープ反復を加えることと、追加の新規なエピトープを含むこととの間にはトレードオフがある。より広いH-LAの適用範囲及びより多くのエピトープ(より多くのウイルスタンパク質の適用範囲を提供する)を与えるために、さらなる新規なエピトープが優先された。
3aaリンカーは予備解析から比較的最も効果的であると思われた。より長いリンカーは3aaと同程度に効果的である可能性が高いが、それらはより大きな全ワクチン構築物を必要とし、非リンカーワクチンでさえ、いくらかの有効性を示した。したがって、全般的にリンカーを有することが有用である。
いくつかの実施形態では、リボソーム停止/再始動部位が最も堅牢かつ最小であるので、好ましい。IRESまたは翻訳後切断配列をある特定の実施形態て使用することもできる。いくつかの実施形態ではとして、Sタンパク質を共発現させて、ポリエピトープワクチンと共に抗体反応を可能にすることができる。2つのタンパク質は、どちらの順序でも発現され得ると考えられる。典型的には第1のタンパク質がより高いレベルの発現を有し、Sタンパク質のより高い発現を有することはより重大である可能性が高い(Sタンパク質単独ワクチンとより直接的に比べるためだけにする場合)。ワクチンは、どちらの方向にも作用することが期待される。
ポリシストロン性式の代替法は、2種類のワクチンを同時に送達することである(とりわけ、mRNAのようなデリバリー・システムを用いることが容易)。
これらの研究では、各種検知方法を使用することができる。例えば、四量体染色を用いて、反応性T細胞を定量するための個々のエピトープに対するT細胞、活性化アッセイ(例えば、CD137染色、細胞内IFNg染色など)、及び自然感染において生じたTCRレパートリーを再現することを実証するためのTCRシークエンシングを定量することができる。
実施例2:追加のSARS-CoV-2ワクチン構築物及び確認結果
上記の結果のさらなる確認において、さらなるSARS-CoV-2ワクチン構築物、例えば図に記載のものを設計した。9C-9E.
追加の解析も行って、上記の結果をさらに確認した。例えば、品種インビトロ解析を、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化されたワクチン構築を用いて行った。図10は、SARS-CoV-2患者から単離されたメモリーT細胞が図9Cに記載されるワクチン構築物の代理人LNP製剤で処置された細胞に反応することを示し、それによって、細胞がSARS-CoV-2に感染した細胞と同様の様式で認識され得るように、エピトープを効果的に処理及び提示し得ることを実証する。簡潔に述べると、メモリーT細胞を、CD8+メモリーT細胞単離キット(ミルテニー、カタログ番号130-094-412)を製造業者の指示に従って使用して、最近回復したSARS-CoV-2患者(Tmemプール)から単離した。Tmemプールを、図9Cの構築物の1 ug/mLのmRNA-LNP複合体で処理したHLA-A*02:01またはHLA-B*07:02のいずれかを発現するHLAクラスIヌルHEK293T細胞と共培養した。24時間後、ヒトIFN-γ第3世代単純プレックスエラアッセイ(タンパク質Simple、カタログ番号SPCKB-PS-002574)を用いて、製造業者の説明書に従ってインターフェロンガンマを測定した。
さらに、個々のTCRクローン化は、特異的エピトープ(図11に示される代表的なクローン化及びデーターなど)のプロセシング及び提示を評価するための試薬として使用することができる。例えば、図11は、図6Aに記載される27エピトープ構築物に含まれる4つの個々のエピトープがSARS-CoV-2のエピトープに特異的なTCRによって認識され得る様式で処理され、提示されることを示す。簡単に述べれば、単球を、HLA-A*02:01及びHLA-B*07:02陽性健常ドナー(donor)からのEasySepTMヒトCD14陽性選択キットII(StemCell Technologies、17858)を用いて単離し、インターロイキン-4及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下で48時間培養して、単球由来樹状細胞(moDC)と鑑別した。MoDCを、図6Aに記載の構築物由来の1 ug/mLのmRNAを含有するLNPで4時間処理し、次いで、TNFα、IL-1β、IL-6及びPGE2で処理した。48時間後、moDCを、各表1A及び表1Fに記載のLLY、SPR、KLW、またはYLQ抗原決定基のいずれかを認識する個々のTCRを形質導入したT細胞と共培養した。TCRの活性化を、AF647結合抗CD69(Biolegend、カタログ番号310918)及びポリエチレン結合抗CD137(Biolegend、カタログ番号309804)抗体をフロー・サイトメトリー(Cytoflex S、ベックマンコールター)によって検出することによって測定した。
興味深いことに、図9Cに記載されるワクチンコンストラクトのLNP配合は、共通TRAV遺伝子を利用してSARS-CoV-2エピトープ比TCRを生成することも決定された(図13-16)。
SARS-CoV-2による自然感染に反応して、SARS-CoV-2の同じ免疫優性エピトープを認識するTCRは共通のTRAV遺伝子を共有し、感染から回復した直後のSARS-CoV-2のメモリーT細胞(Tmem)によって利用される優性TRAV遺伝子である(図12)。ワクチン構築物がコビドン病患者由来のTmem細胞と同じTCR遺伝子を使用するナイーブレパートリーからのT細胞を拡大することを確認するために、インビトロワクチンモデルを実施した(図13)。簡単に述べると、図9Cに記載された構築物から1 ug/mLのmRNAを含むLNPで処理されたmoDCを、EasySepTMヒトナイーブCD8+ T細胞単離キットII (StemCell、17968)を用いて、SARS-CoV-2の広範な感染以前に2019年に採取された健康なドナー(donor)血から単離されたナイーブCD8 T細胞と共培養した。共培養物を96ウェルプレートの複数のウェルに分割して、ナイーブレパートリーからの特異的クローンの増殖を検出した。10日間の増殖後、各ウェルを4コピーに分割し、1コピーの各ウェルを、示されたペプチドについて蛍光標識された四量体(Tetramer Shop、cat.#HA02-070及びHB07-017)で染色し、フロー・サイトメトリー(Cytoflex S、Beckman Coulter)によって測定した。残りの複製物をプールし、それぞれ表1A及び表1Fからのそれぞれのペプチド1 ug/mLでパルスしたHLA-A*02:01またはHLA-B*07:02モノ対立遺伝子HEK293T細胞のいずれかで再刺激した(図13)。CD69及びCD137汚染によって同定された再活性化T細胞をフロー・サイトメトリー(モフロ・アストリオスEQ)によって選別し、配列決定して、拡大されたT細胞によって利用されるTRAV遺伝子を決定した。結果はパルスSARS-CoV-2免疫優性ペプチド、例えば、YLQペプチドがアッセイにおいてペプチド比T細胞の拡大を誘導すること(図14)、及び図9Cに記載されるワクチンコンストラクトがアッセイにおいてSARS-CoV比T細胞の拡大を誘導すること(図15)を実証する。興味深いことに、図9Cに記載されるワクチンコンストラクトのLNP配合は、共通TRAV遺伝子を利用してSARS-CoV-2エピトープ比TCRを生成することも決定された(図16)。
追加の確認実験を行ってもよい。
1つの代表的な実施形態では、処理及び提示アッセイが実施される。例えば、構築物(例えば、mRNA(mRNA-LNP)を封入する脂質ナノ粒子として製剤化された)を、構築物にターゲット細胞である樹状細胞(DC)に導入する。処理されたDCをエピトープ特異的T細胞と共培養し、T細胞の反応性を、例えば、表面活性化マーカ及びIFNgの解析によって測定する。T細胞が反応すると、エイトペは適切に処理され、提示される可能性が高い。構築物のエピトーププロセシング及び提示を比較するために、単球は、EasySepTMヒトCD14陽性選択キットII (StemCell Technologies社、17858)を用いて、関心エピトープに一致するHLA型を有する健康なドナー(donor)から単離される。単球を、顆粒球コロニー刺激因子(GM-CSF)及びインターロイキン4(IL-4)の存在下で72時間培養して、moDCに分化させる。72時間後、moDCを、各構築物の1 ug/mLのmRNAを含有するLNPで4時間処理し、次いで、TNFα、IL-1β、IL-6及びPGE2で処理する。48時間後、1:1のmoDC対T細胞の比率で、エピトープ特異的TCRを有するT細胞形質導入を培養物に添加し、24時間共培養する。T細胞活性化を、AIM CD69(Biolegend、カタログ番号309804)及びCD137(Biolegend、カタログ番号309804)のフローサイトメトリー汚染によって測定し、フロー・サイトメトリー(Cytoflex S、Beckman Coulter)によって測定する。エピトープ特異的T細胞の活性化を誘発することができる構築物は、TCRによって認識されるエピトープがプロセシングされ、T細胞活性化を誘導するのに十分に提示されることを示す。さらに、構築物間の単一エピトープのプロセシング及び提示を比較する場合、特定の構築物によって誘発されるより高いレベルのT細胞活性化は、測定されたエピトープについてのより高いレベルのプロセシング及び提示と解釈される。
別の代表的な実施形態では、インビトロワクチンアッセイを実施する。例えば、構築物(例えば、mRNA-LNP製剤)を、再度DC mRNA-LNPに導入し、DCを、2019年またはそれ以前に収集された(すなわち、非COVID曝露)ドナー(donor)血からの未処置T細胞と共培養する。共培養した細胞を96ウェルプレートの数百のウェルに分割し、ペプチド共役MHC四量体染色により抗原特異的増殖を測定する。応答の大きさは、抗原特異的クローン化で同定されたウェルの数によって測定される(図13)。10日間の拡大に続いて、T細胞をプールし、初期応答を誘発するために使用した構築物の1 ug/mLのmRNAで再度LNPで処理した、関心の単一のHLAを発現するHEK細胞で再活性化する。細胞をAIM CD69(Biolegend、カタログ番号309804)及びCD137(Biolegend、カタログ番号309804)で染色し、AIM二正細胞を選別し、再配列されたTCR遺伝子を配列決定する。アッセイは共培養に応答するT細胞を、コビド病患者からのメモリーT細胞と比較することができ、増殖したT細胞のレパートリーがアッセイされる。
さらに別の代表的な実施形態では、MHC増殖アッセイが実施される。例えば、構築物(例えば、mRNA-LNP製剤)を、ヒト胚腎(HEK)細胞などの細胞に導入し、COVID患者メモリーT細胞のHLAと一致する単一のHLAを発現させて、SARS-CoV-2タンパク質における免疫原性領域、例えばN、Orf3a、及びMが追加のHLA上に提示されるエピトープを含有するかどうかを決定し、その結果、ワクチン接種は、上記以外のHLAを有する個体において効果的である。構築物に応答する人の理論的割合を評価するために、CD8 Tmem細胞を単離し、CD8+メモリーT細胞単離キット(ミルテニー、カタログ番号130-094-412)を用いてSARS-CoV-2感染から最近回収され、表1に記載される既知のエピトープのもの以外のHLAを発現する患者から保存する。Tmem細胞を、対応するHLAを発現するモノ対立遺伝子HEK細胞と共培養し、T細胞活性化を、ヒトIFN-γ第3世代モノ純プレックスエラアッセイ(タンパク質Simple、カタログ番号SPCKB-PS-002574)。構築物で処理されたHEKは単一のHLAを含むので、Tmem細胞の活性化は、構築物上の抗原決定基が処理され、試験されたHLA上に提示されることを示す。さらに、COVID患者のTmem細胞の認知は、未定義のエピトープがSARS-CoV-2に曝露された患者の記憶部レパートリーにおける特異的T細胞を生成するのに充分であり、試験されたHLAを保有する患者が構築物によって送達されるエピトープに対するT細胞応答を生成することができる可能性が高いことを示す。
さらに別の代表的な実施形態では、インビボワクチンアッセイが実施される。例えば、動物モデル(例えば、ヒトTCRレパートリー及びヒトMHCを発現するように操作されたヒト化マウスモデル、例えば、VELOCI-T(登録商標)マウスモデル; Regeneron、Inc.)及びヒト対象を構築物で免疫して、抗SARS-CoV-2免疫及びエピトープ特異的T細胞反応を決定することができ、ペプチド共役MHC四量体染色、ELISPOTアッセイ、またはワクチン接種されたマウスまたは患者由来のTmem細胞を、対応するワクチン構築物のmRNAを保有するLNPで処置されたモノ対立遺伝子HEKと共培養する共培養アッセイを用いて、測定することができる。
参照による取り込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。競合する場合、本明細書における任意の定義を含む本出願が優先する。
また、その全体が参照により本明細書に組み込まれるのは、公開データベースにおけるエントリーと相関するアクセッション番号を参照する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列、例えば、The Institute for Genomic Research(TIGR)on World Wide Web at tigr.org及び/またはNational Center for Biotechnology Information(NCBI)on World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov。
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明によって包含される特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
［関連出願の相互参照］
本出願は、2020年11月12日に出願された米国仮出願第63/113,024号の利益を主張する；前記出願の全内容は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
コロナウイルス疾患2019(又は、COVID-19)は、重症急性呼吸器症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS))-CoV-2(SARS-CoV-2)ウイルスによる感染によって引き起こされるグローバルなパンデミックであり、世界中で500,000人超の生命を奪っており、何百万人もの人々に影響を与えている。SARS-CoV-2は、ヒトに感染することが知られている7番目のコロナウイルスである； SARS-CoV、MERS-CoV、及びSARS-CoV-2は、重度の疾患を引き起こし得るが、HKU1、NL63、OC43、及び229Eは、軽度の症状(symptom)と関連する。有効なワクチン及び治療法を開発するには、適応免疫応答が、どのようにして前記ウイルスを認識し、排除するのか、及び前記ウイルスと免疫システムとの間の相互作用が前記疾患の病態にどのように影響するのか、を理解する必要がある。現在までのところ、ほとんどの取り組みは、前記ウイルスに対するB細胞-媒介性の抗体応答に集中してきた。しかし、細胞傷害性CD8+ T細胞が、どのように感染した細胞を認識し、排除するのかについては、あまり理解されていない。
CD8 T細胞は、様々な病原体からの防御において、重要な役割を果たしており、多くのエビデンスから、これは、SARS-CoV-2にも当て嵌まることが実証されている。密接に関連するSARS-CoVの研究によって、動物モデルにおいて、CD8 T細胞は、感染の急性期の間に、防御を提供すること、及びメモリーCD8 T細胞は、ヒトにおいて、感染の急性期後に、体液性応答よりも長く持続すること、が明らかになっている。SARS-CoV-2への感染の間、CD8 T細胞応答の大きさは、より軽度の疾患経過と相関し、防御的な役割を示唆している。特に、SARS-CoV-2-応答性T細胞は、無症状で前記ウイルスを排除したSARS-CoV-2に曝露された患者において、抗ウイルス抗体の非存在下で、観察されており、これは、T細胞の保護的な役割を更に示している。
現行のSARS-CoV-2ワクチン開発への取り組みは、主にSタンパク質に対する中和抗体の生成に集中している。臨床開発中のワクチンの大部分（及び米国のPh II/III候補の全て）は、抗原として、Sタンパク質のみを使用する。その結果、これらのワクチン候補は、自然感染中にCD8 T細胞によって認識される抗原の大部分を欠いている。実際に、SARS-CoV-2のSタンパク質のワクチンでワクチン接種を受けた患者におけるT細胞応答を注意深く追跡すると、CD8 T細胞応答は、ばらつきがあること、且つ弱いこと、が明らかになった。SARS-CoV-2に対して、より堅牢である、且つ持続的である、防御を提供することを期待して、CD8 T細胞応答をより良好に関与させるために、より広範囲の抗原を組み込んだ次世代ワクチンが必要とされている。これまでのところ、開発中のSARS-CoV-2ワクチンは、ワクチン接種後に、弱い、且つばらつきのあるCD8応答をもたらした(Mateus et al. (2021) Science 374:eabj9853)。
本発明は、SARS-CoV-2免疫優性ペプチドの発見に、少なくとも部分的に、基づく。重要なことに、これらの免疫原性ペプチドのいくつかは、例えば、それらが連結している場合、その他それらがポリペプチド中に配置している場合、又はそれらが構築物（例えば、核酸ベクター構築物、例えば、細胞内での抗原発現のために、最適な免疫優性エピトープを中にパッキングすることによって、T細胞応答の有効性に対してベクターのサイズを最大化する核酸ベクター構築物）上の他のペプチドと組み合わされている場合、患者全体広くにわたってT細胞応答を誘発することができる。
いくつかの態様では、免疫原性ポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択される少なくとも2つのペプチド・エピトープを含む。ある特定の態様では、前記少なくとも2つのペプチド・エピトープは、免疫原性ポリペプチド中で、連結された順序で存在し、任意選択的に、ここで、少なくとも1種以上の免疫優性エピトープは、2つ以上のコピーとして存在する。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも1種以上の免疫優性エピトープは、2つ以上のコピーとして存在する（例えば、2コピー、3コピー、4コピー、5コピー、6コピー、若しくはそれを超えて、又は包括的な間の任意の範囲、例えば、2コピーのある免疫優性エピトープ、3コピーの別の免疫優性エピトープ、単一コピーの更に第3の免疫優性エピトープ等、で存在する）。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又はそれを超えた前記ペプチド・エピトープを含む、任意選択的に、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07の各々につき、少なくとも1つ、2つ、及び／又は3つの免疫優性エピトープを含む（例えば、列挙したHLAの各々につき1つの免疫優性エピトープ、列挙したHLAの各々につき2つの免疫優性エピトープ、列挙したHLAの各々につき3つの免疫優性エピトープ、又は、間の、包括的な、任意の範囲、例えば、HLA-A*02及びHLA-A*03の各々に対して1つの免疫優性エピトープ、プラスHLA-A*01及びHLA-A*11の各々に対して2つの免疫優性エピトープ、並びに、HLA-A*24及びHLA-A*07の各々に対して3つの免疫優性エピトープ、等）。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び1F、の各々に由来する3つのペプチド・エピトープを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、前記ペプチド・エピトープ間に、リンカーを更に含む。ある特定の実施形態では、前記リンカーは、前記ペプチド・エピトープの各々について少なくとも3つのアミノ酸を含む、ここで、前記少なくとも3つのアミノ酸は、それらの各々のペプチド・エピトープと連続するものである。ある特定の実施形態では、前記リンカーは、プロテアソーム切断モチーフである。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、Orf1ab、M、N、Orf3a、及びS、からなる群より選択される、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、又は1つ以上のそのタンパク質フラグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質の前記フラグメントは、機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードしないSARS-CoV-2タンパク質を包含する。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、リボソーム停止／再始動セグメント、IRESセグメント、及び／又は翻訳後切断セグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記翻訳後切断セグメントは、P2Aセグメントである。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、本出願に記載の表（例えば、表1G又は表1I）に提供されるアミノ酸配列の何れか1つを含む。
ある特定の態様では、前記免疫原性ポリペプチドは、少なくとも2つのペプチド・フラグメントを含む、ここで、前記ペプチド・フラグメントの各々は、少なくとも2つの前記ペプチド・エピトープを含む、ここで、各々のペプチド・フラグメント中の前記少なくとも2つの前記ペプチド・エピトープは、SARS-CoV-2の同じタンパク質に由来する。
上述のように、本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、いくつかの実施形態では、前記少なくとも2つのペプチド・フラグメントは、SARS-CoV-2の、Nタンパク質、Mタンパク質、ORF1a/bタンパク質、又はORF3aタンパク質、に由来する。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、最大6種の前記ペプチド・フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、Orf1ab、M、N、Orf3a、及びS、からなる群より選択される、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、又は1つ以上のそのタンパク質フラグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質のフラグメントは、機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードしないSARS-CoV-2タンパク質を包含する。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、リボソーム停止／再始動セグメント、IRESセグメント、及び／又は翻訳後切断セグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記翻訳後切断セグメントは、P2Aセグメントである。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、本出願に記載の表（例えば、表1H又は表1J）に提供されるアミノ酸配列の何れか1つを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、in vitro及び／又はin vivoで、T細胞応答を誘発することができる、任意選択的に、ここで、前記T細胞応答を、四量体染色アッセイ、T細胞活性化アッセイ、CD137染色アッセイ、細胞内IFNガンマ（IFNg）染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、及び／又はT細胞増殖アッセイによって、測定する。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、SARS-CoV-2タンパク質に由来する、任意選択的に、ここで、前記免疫原性ペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、又は15アミノ酸長である。別の実施形態では、前記SARS-CoV-2タンパク質は、orf1a/b、Sタンパク質、Nタンパク質、Mタンパク質、orf3a、及びorf7a、からなる群より選択される。更に別の実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、対象において、T細胞応答を誘発することができる。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープを含む。
更に別の態様では、免疫原性組成物［前記免疫原性組成物は、本出願に記載される少なくとも1つの免疫原性ペプチド(例えば、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127、若しくはそれを超えて、又は間の、包括的な、任意の範囲、例えば1-5個のペプチド)を含む、任意選択的に、ここで、前記免疫原性組成物は、1) Orf1ab、M、N、Orf3a、及びS、からなる群より選択される、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、若しくは1つ以上のそのタンパク質フラグメント、任意選択的に、ここで、前記1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質のフラグメントは、機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードしないSARS-CoV-2タンパク質を包含する、並びに／又は、2) アジュバント、を更に含む］、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記免疫原性組成物は、in vitro及び／又はin vivoで、T細胞応答を誘発することができる。別の実施形態では、前記T細胞応答を、四量体染色アッセイ、T細胞活性化アッセイ、CD137染色アッセイ、細胞内IFNg染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、及び／又はT細胞増殖アッセイによって、測定する。
更に別の態様では、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択される少なくとも2つのペプチド・エピトープを含む免疫原性ペプチド、並びにMHC分子、を含む組成物、が提供される
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。別の実施形態では、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。更に別の実施形態では、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。これら及び他のHLA対立遺伝子についての、配列、特性、構造情報、機能情報、結合パートナー等は、当該技術分野において周知である（例えば、hla.alleles.org/nomenclature/index.html, hla.alleles.org/data/hla-a.html, 及び hla.alleles.org/data/hla-b.html のワールド・ワイド・ウェブ[World Wide Web]を参照）。
別の態様では、MHC分子の中に、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープを含む、安定なMHC-ペプチド複合体、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。別の実施形態では、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。更に別の実施形態では、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及びHLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。更に別の実施形態では、前記ペプチド・エピトープと前記MHC分子は、共有結合している、及び／又は前記MHC分子のアルファ鎖とベータ鎖は、共有結合している。別の実施形態では、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、検出可能な標識を含む、任意選択的に、ここで、前記検出可能な標識は、蛍光色素分子である。
更に別の態様では、本出願に記載される安定なMHC-ペプチド複合体、及びアジュバント、を含む免疫原性組成物、が提供される。
更に別の態様では、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする単離された核酸、又はその相補体、任意選択的に、ここで、前記単離された核酸は、DNA、RNA、mRNA、cDNA、自己複製、環化、コンカテマー化されている、ここで、前記単離された核酸は、関心とする遺伝子（例えば、ヘモグロビンA等）に由来する、5'非翻訳領域(5'UTR)及び／若しくは3'UTRを含む、発現プロモーターを含む、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む、並びに／又は自己切断2Aペプチド（例えば、P2A若しくはT2A等）を含む、が提供される。
別の態様では、本出願に記載される単離された核酸、を含むベクター、が提供される。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、発現ベクターである。
本出願に記載される免疫原性ポリペプチドをコードする基本的な核酸、又は同物を含むベクター、を、免疫原性ポリペプチドが望まれる前記本発明の任意の態様又は実施形態で、使用することがある（例えば、前記核酸は、前記免疫原性ポリペプチドを、コードする、及び産生する）。前記核酸は、コードされる及び産生される、免疫原性ポリペプチドのために、免疫原性組成物であるのであって、核酸自体のためではない。
更に別の態様では、以下である、細胞、a) 本出願に記載の単離された核酸を含む、b) 本出願に記載のベクターを含む、並びに／又は、c) 本出願に記載の1種以上の免疫原性ポリペプチドを産生する、及び／若しくは本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体を、その細胞表面に提示する、任意選択的に、ここで、前記細胞は、遺伝子操作されている、が提供される。
更に別の態様では、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドに、及び／又は本出願に記載の安定なMHC-ペプチド複合体に、特異的に結合する結合部分構造、任意選択的に、ここで、前記結合部分構造は、抗体、抗体の抗原-結合フラグメント、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、単鎖TCR(scTCR)、キメラ抗原レセプター(CAR)、又はTCR及びエフェクター・ドメインを含む融合タンパク質（任意選択的に、細胞内にある膜貫通ドメイン及びエフェクター・ドメインを更に含む）、である、が提供される。
更に別の態様では、a) 本出願に記載の1種以上の免疫原性ポリペプチド、及び／又は、b) 本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体、を含むデバイス又はキット、ここで、前記デバイス又はキットは、任意選択的に、a)及び／又はb)が、T細胞レセプターに結合することを、検出するための試薬、を含む、が提供される。
別の態様では、以下を含む、安定なMHC-ペプチド複合体に結合するT細胞を検出する方法：a)T細胞を含むサンプルを、本出願に記載の安定なMHC-ペプチド複合体と接触させるステップ；及び、b)前記安定なMHC-ペプチド複合体に対する、T細胞の結合を検出するステップ、任意選択的に、前記安定なMHC-ペプチド複合体に結合する安定なMHC-ペプチド-特異的なT細胞の割合を更に測定するステップ、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記サンプルは、末梢血単核細胞(PBMC)を含む。別の実施形態では、前記T細胞は、CD8+ T細胞である。更に別の実施形態では、前記検出するステップ及び／又は測定するステップを、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタン・ブロット、又は細胞内フロー・アッセイ、を使用して、行う。更に別の実施形態では、前記サンプルは、1つ以上のSARS-CoV-2タンパク質又はそのフラグメントと、接触した、又は接触した疑いのある、T細胞を含む。
更に別の態様では、以下を含む、対象が、SARS-CoV-2、に対する曝露、及び／又は、からの防御、を有するかどうかを決定する方法：a) 前記対象から取得したT細胞を含む細胞集団を、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドと、又は本出願に記載の安定なMHC-ペプチド複合体と、インキュベートするステップ；及び、b) 応答性の、存在又はレベル、を検出するステップ、ここで、応答性が、存在すること又はコントロール・レベルと比較してより高いレベルであること、は、前記対象が、SARS-CoV-2、に対する曝露、及び／又は、からの防御、を有することを示す、が提供される。
更に別の態様では、以下を含む、SARS-CoV-2感染症に罹患している対象の臨床アウトカムを予測するための方法：a) 前記対象から取得したT細胞と、本出願に記載の1種以上の免疫原性ポリペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ；及び、b) 応答性の、存在又はレベル、を、コントロールの応答性の、存在又はレベル、と比較するステップ、ここで、前記コントロールを、良い臨床アウトカムを有する対象から取得する、ここで、前記対象における応答性が、存在すること又は前記コントロールと比較してより高いレベルであること、は、前記対象が、良い臨床アウトカムを有することを示す、が提供される。
別の態様では、以下を含む、SARS-CoV-2療法の有効性を評価する方法：a) SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を前記対象に提供する前に、前記対象から取得した第1のサンプルにおいて、前記対象から取得したT細胞と、本出願に記載の1種以上の免疫原性ペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ、及び、b) 本出願に記載の1種以上の免疫原性ポリペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体と、SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を提供した後に、前記対象から取得した第2のサンプルにおいて存在する、前記対象から取得したT細胞との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ、ここで、前記第1のサンプルに対して、前記第2のサンプルにおける応答性の、存在又はより高いレベルは、前記療法が、前記対象におけるSARS-CoV-2を治療するのに有効であることを示す、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、応答性のレベルは、a )結合の存在、並びに／又はb) T細胞活性化、及び／若しくはエフェクター機能、によって示される、任意選択的に、ここで、前記T細胞活性化、又はエフェクター機能は、T細胞増殖、傷害、又はサイトカイン放出、である。別の実施形態では、前記方法は、ステップa)及びb)を、後の時点で繰り返すステップを更に含む、任意選択的に、ここで、前記対象は、第1の時点と前記後の時点との間で、SARS-CoV-2感染症を改善するための治療を受けている。更に別の実施形態では、前記T細胞結合、活性化、及び／又はエフェクター機能を、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタン・ブロット、又は細胞内フロー・アッセイ、を使用して、検出する。更に別の実施形態では、前記コントロール・レベルは、参考数字である。別の実施形態では、前記コントロール・レベルは、SARS-CoV-2に曝露されていない対象のレベルである。
更に別の態様では、対象におけるSARS-CoV-2感染症を、予防する及び／又は治療する方法、ここで、前記方法は、本出願に記載の、1種以上の免疫原性ポリペプチドを、又は細胞を、含む、及び／又はコードする、免疫原性組成物の治療的有効量を、前記対象に投与するステップ、を含む、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記免疫原性組成物は、本出願に記載の免疫原性ポリペプチド（例えば、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択される少なくとも2つのペプチド・エピトープを含む、免疫原性ポリペプチド等）をコードする核酸、を含む。1つの実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、SARS-CoV-2タンパク質に由来する、任意選択的に、ここで、前記免疫原性ペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、又は15アミノ酸長である。ある実施形態では、前記SARS-CoV-2タンパク質は、orf1a/b、Sタンパク質、Nタンパク質、Mタンパク質、orf3a、及びorf7a、からなる群より選択される。1つの実施形態では、前記免疫原性ポリペプチドは、対象において、T細胞応答を誘発することができる。ある実施形態では、前記免疫原性組成物は、2つ以上の免疫原性ポリペプチドを含む。更に別の実施形態では、前記免疫原性組成物は、アジュバントを更に含む。更に別の実施形態では、前記免疫原性組成物は、対象において、T細胞応答を誘発することができる。別の実施形態では、投与した免疫原性組成物は、前記対象において、SARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導する。更に別の実施形態では、投与した免疫原性組成物は、前記対象において、SARS-CoV-2に対するT細胞免疫応答を誘導する。更に別の実施形態では、前記T細胞免疫応答は、CD8+ T細胞免疫応答である。
更に別の態様では、以下を含む、本出願に記載の前記少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに結合する、ペプチド結合分子又はその抗原結合フラグメント、を同定する方法：a) 細胞の表面上のMHC分子の中で、本出願に記載の前記少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを提示する、細胞を提供するステップ、任意選択的に、ここで、前記細胞は、前記少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドを、コードする、及び発現する、核酸を含む；b) 前記細胞上のMHC分子の中のペプチド・エピトープに対する、複数の候補ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントの、結合を測定するステップ；及び、c) MHC分子の中のペプチド・エピトープに結合する、1種以上のペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントを、同定するステップ、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記ステップa) は、細胞の表面上のMHC分子を、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープと接触させるステップ、を含む。別の実施形態では、前記ステップa)は、前記細胞を、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸で（例えば、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープをコードするヘテロな配列を含む等、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする基本的な核酸として、又はそのような基本的な核酸を含むベクターとして）、トランスフェクションするステップ、を含む。
別の態様では、以下を含む、本出願に記載の前記少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに結合する、ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントを、同定する方法：a) MHC分子の中に、本出願に記載の前記少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む、安定なMHC-ペプチド複合体を提供するステップ；b) 前記安定なMHC-ペプチド複合体に対する、複数の候補ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントの、結合を決定するステップ；及び、c) 前記安定なMHC-ペプチド複合体に結合する、1種以上のペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントを、同定するステップ、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。別の実施形態では、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。更に別の実施形態では、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。更に別の実施形態では、前記ペプチド・エピトープと前記MHC分子は、共有結合している、及び／又は前記MHC分子のアルファ鎖とベータ鎖は、共有結合している。別の実施形態では、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、検出可能な標識を含む、任意選択的に、ここで、前記検出可能な標識は、蛍光色素分子である。更に別の実施形態では、前記複数の候補ペプチド結合分子は、1つ以上のT細胞レセプター(TCR)、又はTCRの1つ以上の抗原結合フラグメント、を含む。更に別の実施形態では、前記複数の候補ペプチド結合分子は、少なくとも2、5、10、100、103、104、105、106、107、108、109、又はそれを超えた、様々な候補ペプチド結合分子を含む。別の実施形態では、前記複数の候補ペプチド結合分子は、対象からの又は対象の集団からの、サンプルから取得される1種以上の候補ペプチド結合分子を含む；又は、前記複数の候補ペプチド結合分子は、対象からのサンプルから取得される親スキャフォールド・ペプチド結合分子の中に変異を含む、1種以上の候補ペプチド結合分子を含む。更に別の実施形態では、前記対象又は対象の集団は、a)SARS-CoV-2に感染していない、及び／若しくはCOVID-19から回復している、又はb)SARS-CoV-2に感染している、及び／若しくはCOVID-19を有する。更に別の実施形態では、前記対象又は対象の集団は、1種以上の免疫原性ポリペプチドでワクチン接種を受けている、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープを含む。別の実施形態では、前記対象は、哺乳動物である、任意選択的に、ここで、前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、又はげっ歯類である。更に別の実施形態では、前記対象は、HLA-トランスジェニック・マウスである、及び／又はヒトTCRトランスジェニック・マウスである。更に別の実施形態では、前記サンプルは、T細胞を含む。別の実施形態では、前記サンプルは、末梢血単核細胞(PBMC)又はCD8+メモリーT細胞を、含む。更に別の実施形態では、TCRの抗原-結合フラグメントは、単鎖TCR(scTCR)である。
別の態様では、本出願に記載の方法に従って同定されたペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメント、が提供される、任意選択的に、ここで、前記結合部分構造は、抗体、抗体の抗原-結合フラグメント、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、一本鎖TCR(scTCR)、キメラ抗原レセプター(CAR)、又はTCR及びエフェクター・ドメインを含む融合タンパク質、である。
更に別の態様では、対象におけるSARS-CoV-2感染症を治療する方法、ここで、前記方法は、本出願に記載の方法によって同定されるTCRを発現する、遺伝子操作したT細胞の治療的有効量を、前記対象に投与するステップ、を含む、が提供される。
更に別の態様では、対象におけるSARS-CoV-2感染症を治療する方法、ここで、前記方法は、本出願に記載の少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに結合するTCRを発現する、遺伝子操作したT細胞の治療的有効量を、前記対象に投与するステップ、を含む、が提供される。
別の態様では、対象におけるSARS-CoV-2感染症を治療する方法、ここで、前記方法は、MHC分子の中に、本出願に記載の前記少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む、安定なMHC-ペプチド複合体に結合するTCRを発現する、遺伝子操作したT細胞の治療的有効量を、前記対象に投与するステップ、を含む、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。別の実施形態では、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。更に別の実施形態では、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。更に別の実施形態では、前記ペプチド・エピトープと前記MHC分子は、共有結合している、及び／又は前記MHC分子のアルファ鎖とベータ鎖は、共有結合している。別の実施形態では、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、検出可能な標識を含む、任意選択的に、ここで、前記検出可能な標識は、蛍光色素分子である。更に別の実施形態では、前記T細胞を、a) 前記対象、b) SARS-CoV-2に感染していないドナー(donor)、又はc) COVID-19から回復したドナー(donor)、から単離する。
更に別の態様では、対象におけるSARS-CoV-2感染症を、予防する又は治療する方法、ここで、前記方法は、前記対象に、抗原-特異的なT細胞を注入するステップを含む、ここで、前記抗原-特異的なT細胞を、以下によって作成する：a) 本出願に記載の免疫原性ポリペプチドで、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸で、本出願に記載の少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む安定なMHC-ペプチド複合体で、又は、細胞表面上のMHC分子の中の本出願に記載の少なくとも1種の免疫原性ポリペプチドのペプチド（例えば、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドを発現する構築物に由来する）を、コードする及び／若しくは提示する、細胞で、対象由来のPBMC又はT細胞、を刺激するステップ；並びに、b) in vitroにおいて、抗原-特異的なT細胞を増殖させるステップ、任意選択的に、PBMC又はT細胞を、前記PBMC又はT細胞を刺激する前に、前記対象から単離する、が提供される。
本発明の任意の態様に適用され得る、及び／又は本出願に記載される任意の他の実施形態と組み合わせ得る、多数の実施形態を更に提供する。例えば、1つの実施形態では、前記T細胞は、ナイーブT細胞、セントラル・メモリーT細胞(central memory T cell)、又はエフェクター・メモリーT細胞(effector memory T cell)、である。別の実施形態では、前記T細胞は、CD8+メモリーT細胞である。更に別の実施形態では、その剤を、前記ペプチド・エピトープ、免疫原性ポリペプチド、安定なMHC-ペプチド複合体、T細胞レセプター、及び／又はT細胞の間に、少なくとも1つの免疫複合体が形成されることに適した、条件下及び時間、接するように置く。更に別の実施形態では、前記ペプチド・エピトープ、免疫原性ポリペプチド、安定なMHC-ペプチド複合体、及び／又はT細胞レセプターを、細胞が発現する、並びに前記細胞を、1つ以上ステップの中で、増殖させる及び／又は単離する。別の実施形態では、前記対象は、哺乳動物である、任意選択的に、ここで、前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、又はげっ歯類、である。
本特許出願書類には、カラーで作成された少なくとも1つの図面が含まれている。本出願に関する庁は、カラー図面を有する本特許又は特許出願公開の写しを、請求及び必要な手数料の納付に応じて、提供するであろう。
図１は、免疫優性エピトープをコードする、代表的なポリエピトープ・ワクチン構築物（例えば、免疫原性ポリペプチドの実施形態）を示す。 図２は、代表的な次世代SARS-CoV-2ワクチン構築物（例えば、免疫原性ポリペプチドの実施形態）を示す。 図３は、様々なワクチン構築物に対するCOVID-19患者のメモリーCD8 T細胞の応答性を示す。本データは、2例の患者（個々のドットとして示す）の平均である。 図４は、選択したワクチン構築物は、Sタンパク質単独と比較して、優れたCD8 T細胞の活性化を示すことを示す。9例の患者由来のメモリーCD8 T細胞を、SARS-CoV-2ワクチン構築物に対する応答性について試験し、本データを得た。 図５Ａ-図５Ｃは、代表的な19-エピトープの構築物を示す。図５Ａは、3aaリンカーを有する代表的な19-エピトープの構築物を示す。図５Ｂは、KAAリンカーを有する代表的な19-エピトープの構築物を示す。図５Ｃは、リンカーを有さない代表的な19-エピトープの構築物を示す。 図６Ａ-図６Ｃは、代表的な27-エピトープの構築物を示す。図６Ａは、3aaリンカーを有する代表的な27-エピトープの構築物を示す。図６Ｂは、KAAリンカーを有する代表的な27-エピトープの構築物を示す。図６Ｃは、リンカーを含まない代表的な27-エピトープの構築物を示す。 図７は、代表的なフラグメント構築物（例えば、少なくとも2つのペプチド・フラグメントの実施形態であって、各々が少なくとも2つのペプチド・エピトープを含む)を示す。 図８は、Sタンパク質セグメント及びP2Aに融合した、代表的なフラグメント構築物を示す。 図９Ａ-図９Ｅは、代表的なポリエピトープの構築物の融合体を示す。図９Ａは、Sタンパク質セグメント及びP2Aに融合した、3aaリンカーを有する代表的な19-エピトープの構築物を示す。図９Ｂは、Sタンパク質セグメント及びP2Aに融合した、3aaリンカーを有する代表的な27-エピトープの構築物を示す。図９Ｃは、SARS-CoV-2のN、Orf1a、M、Orf3a、及びSタンパク質、に由来する14個のフラグメント内に含まれる、代表的な19-エピトープの構築物を示す。各々のフラグメントは、27ヌクレオチドから195ヌクレオチドまでの範囲である核酸配列によってコードされる、及び全部で19個の既知のエピトープをカバーする発見されたエピトープのうちの1つ以上を含有する。前記14個のフラグメントの構築物を、発見されたエピトープと同じプロテアソーム・フラグメントから提示され得る任意の免疫原性エピトープを潜在的に含むように、並びに発見されたエピトープに結合すること、及び提示すること、が知られているMHC分子、以外のMHC分子上に提示され得る、未発見エピトープを潜在的に含むように、設計する。図９Ｄは、SARS-CoV-2のOrf1ab及びSタンパク質由来の17個のエピトープと組み合わさった、全体の（全部の）SARS-CoV-2のM、N、及びOrf3aタンパク質に架かるが、非-連続なフラグメントで表されるフラグメント、並びにSタンパク質フラグメント、の中に含まれる代表的なポリペプチドの構築物、を示す。この構築物は、ポリエピトープの構築物とフラグメント・ベースの構築物との組み合わせである。例えば、前記構築物の5'部分は、SARS-CoV-2のスパイク及びorf1abタンパク質由来の17個のエピトープが、取り囲む3つの天然アミノ酸によって連結して一緒になった、コンカテマーである。前記構築物の3'部分は、N、Orf3a、及びMタンパク質を併せて架かるフラグメントのコンカテマーである、並びに前記Sタンパク質の1つのフラグメントを含む。機能的なタンパク質（例えば、Orf3aタンパク質は免疫抑制活性を有することが知られている）の産生を回避するために、N、Orf3a、及びMタンパク質を、2-3個のフラグメントに分割した、並びに各々のフラグメントの順序を交互にすることによって、配列中に分散させた。発見された27個のエピトープは全て、この構築物中に表れている。SARS-CoV-2ゲノムの全体の(全部の)N、Orf3a、及びM領域を含めた、なぜならば、N、Orf3a、及びMタンパク質は、前記領域のサイズに合わせて調整した場合に、エピトープを最も豊富に含むからである。理論に束縛されるものではないが、この領域は、免疫原性エピトープのプロセシング及び提示、を引き起こす生物学的ドライバーであり、従って、多くの様々なMHCによって提示され得るエピトープを含有する可能性が高く、前記構築物に応答し得る患者の数を増大させる可能性があるものと考えられる。図中の名称B.1.617.2_S.PPは、デルタ・バリアント(B.1.617.2)由来のSタンパク質のPP-安定化形態、を意味する。この代表的な構築物に含まれるSタンパク質のフラグメントは、SARS-CoV-2のデルタ・バリアントに由来する。図９Ｅは、SARS-CoV-2のOrf1ab及びSタンパク質由来のフラグメントと組み合わった、全体の（全部の）SARS-CoV-2のM、N、及びOrf3aタンパク質に架かるが、非-連続なフラグメントで表されるフラグメント、の中に含まれる代表的なポリペプチドの構築物、を示す。B.1.617.2_S.PP_EpiFrag-M/N/ORF3aは、図９Ｄで説明したEpi-M/N/ORF3a構築物と同じ3' N、Orf3a、M及びSフラグメントを含むが、5' 17epiフラグメント部分は、図９Ｄからの17エピトープを囲むOrf1ab及びSタンパク質からのフラグメントに置き換えられている点が異なる。これらは、14_フラグメント・エピトープからのフラグメントと同じである。図中の名称B.1.617.2_S.PPは、デルタ・バリアント(B.1.617.2)由来のSタンパク質のPP-安定化形態、を意味する。この代表的な構築物に含まれるSタンパク質のフラグメントは、SARS-CoV-2のデルタ・バリアントに由来する。図９Ｃ-図９Ｅに示される代表的な配列は、リンカー等の付加的な配列を含まない。例えば、3AAリンカーは、不要である。なぜならば、より大きなフラグメントは、同定済みのエピトープに対するリンカーの空間となるからである。未同定のエピトープは定義されないので、その結果、リンカーが存在しないことによって、エピトープは、直接的にセグメントの末端に無いことが確実になる。そのセグメントを、P2A部位無しで、直接的に配置する。1つの例外は、3AAリンカーを含む図９Ｄのポリエピトープ部分である。 図１０は、SARS-CoV-2患者由来のメモリーT細胞(Tmem)プールは、図９Ｃのワクチン構築物を認識する、ことを示す。14個のフラグメントmRNA構築物(図９Ｃに記載)を、単一のMHC-I分子を発現するように改変した、単対立遺伝子HEK293T細胞に、脂質ナノ粒子を使って導入した。回収したSARS-CoV-2患者から単離したメモリーT細胞を、構築物で処置した単対立遺伝子HEK293T細胞と共-培養し、前記構築物に対する応答性を、ELISAによってインターフェロン・ガンマの放出を測定することによって、試験した。 図１１は、SARS-CoV-2の特定のエピトープを認識するTCRが、図６Ａの27ポリエピトープの構築物を含むLNPで処置した樹状細胞に対して反応すること、を示す。単球由来の樹状細胞(monocyte-derived dendritic cells (moDCs))を、SARS-CoV2の感染拡大前の2019年に米国で採取した血液から単離した。moDCを、図６Ａの構築物のmRNAを含むLNPで処置した。表1A又は1Fからの示したエピトープの各々に対して特異的なT細胞を、LNP処置したmoDCと共-培養し、T細胞応答性を、活性化誘導マーカ(activation induced markers (AIM))CD69及びCD137に関する、フロー・サイトメトリー染色によって、測定した。従って、これらの構築物内に含まれるエピトープは、プロセシングを受け、及び十分に提示され、エピトープ特異的なT細胞からの応答を誘発する。 図１２は、SARS-CoV-2のエピトープを認識するTCRは、共通したTRAV遺伝子を利用することを示している。表1A及びＦからのYLQ、KLW、及びSPRエピトープを認識する特異的クローンの頻度を示す。共有される優性TRAV遺伝子をハイライトする。Ferretti et al. (2020) Immunity 53: 1095-1107も参照のこと、とりわけ図４並びに材料及び方法（materials and methods）において、共通TRAV遺伝子がTCRによって利用されることを実証する、更なる支持についても参照されたい。 図１３は、in vitroワクチン・モデルに関する、代表的な、非-限定的な例を示す。 図１４は、SARS-CoV-2免疫優性ペプチドでパルスをすると、図１３のin vitroワクチン・モデルにおいて、ナイーブT細胞の集団からペプチド-特異的なT細胞の増殖が誘導されることを示す。示すように、MHC-ペプチド四量体染色を使用して、ペプチド特異的なTCRを検出した。 図１５は、ワクチン構築物によって、図１３のin vitroワクチン・モデルにおいて、ナイーブT細胞の集団からペプチド-特異的なT細胞の増殖が誘導されることを示す。 図１６Ａ-図１６Ｃは、試験したMHCによって提示されることが知られているエピトープに対応する既知のV領域(図１２)が、図９Ｃの構築物で処置したin vitroワクチン・モデルからの、上位に増殖したTCRクローンの中では優位であるが、未処置のコントロールからのTCRクローンの中では優位はないこと、を示す。図１６Ａは、増殖したクローンのTRAV遺伝子を示し、コントロール・サンプルの最大値を上回る、バックグラウンドを差し引いた頻度で、YLQペプチドに結合することが知られているTCRに対応する既知のTRAV遺伝子をハイライトする。図１６Ｂ及び１６Ｃは、表1A及びFに記載の既知のペプチドで再刺激した場合に、図９Ｃのワクチン構築物に応答する増殖したクローンのTRAV遺伝子を示す。コントロール・サンプルの最大値を上回る、バックグラウンドを差し引いた頻度で、図９Ｃの構築物内のペプチドに結合することが知られているTCRに対応するTRAV遺伝子を、示した試験したMHCについて、ハイライトする。従って、これらの構築物は、SARS-CoV-2による自然感染に対する免疫応答を再現するin vitroワクチン・モデルにおいて、ナイーブT細胞からの応答を誘導する。
[発明の詳細な説明]
本発明は、少なくとも部分的には、SARS-CoV-2ウイルス-特異的な免疫原性ポリペプチドの構築物（これは、例えば、ワクチンとして使用することができる）の発見に基づく。回復期のCOVID-19患者によって認識された、T細胞ターゲットを正確にマップするために、系統的で包括的な調査を行った。驚くべきことに、本研究によって、患者全体広くにわたって繰り返し認識される、高度に免疫優性なペプチド抗原の限定的なセット（普遍的に認識されると思われるいくつかのものを含む）が明らかになった。
免疫原性ペプチドを持つこのようなワクチンの設計に役立てるため、SARS-CoV-2による感染後にCD8 T細胞によって認識されるターゲットに関する包括的なゲノム-ワイド解析を行った。6種の最もありふれたHLA対立遺伝子(HLA-A:02、HLA-A01、HLA-A03、HLA-A11、HLA-A24、及びHLA-B07)上で認識されるターゲットのランドスケープ - >85%の人々が、これらの対立遺伝子の内の少なくとも1種を広く発現するセットがマッピングされた。適切なHLA対立遺伝子を有する患者の大多数で繰り返し認識される、各対立遺伝子に対する免疫優性エピトープのコア・セットを同定し、検証した。これらのエピトープは、MHC分子上に堅牢に提示され、患者全体広くにわたって、ナイーブCD8 T細胞レパートリーによって効率的に認識され、防御的である可能性が高いことが明らかになった（全CD8 T細胞応答に対して、これらのエピトープが非常に大きく寄与していること［これは、防御的である可能性が高い］に基づく）。特定のHLA対立遺伝子上に提示されたエピトープを正確に同定することに加えて、SARS-CoV-2ゲノムに対するT細胞応答のパターンも明らかになった。HLA対立遺伝子全体広くにわたって繰り返し認識されるゲノムの領域－N、M、及びORF3aタンパク質、並びにORF1abの一部を含む－が見出され、これらの領域は、更なる対立遺伝子に拘束されるCD8 T細胞応答を生成する可能性が高い魅力的なワクチン抗原を表す。地域流行性の(endemic)ベータコロナウイルスと交差反応性であるSARS-CoV-2ゲノムの特定のセグメントに対するCD8 T細胞応答も同定された。これらの領域は、それらをターゲットとするワクチンは、地域流行性の(endemic)ベータコロナウイルスに対して応答性である任意の既存のCD8 T細胞をブーストすることができ、より堅牢な応答を生じさせる可能性を有するので、特に興味深い。
このデータにより、SARS-CoV-2に対する自然免疫をより正確に再現するための、広いセットのCD8 T細胞抗原を含むワクチン候補の設計が可能となった。具体的には、設計されたワクチンは、ポリ-エピトープ・ワクチン及びフラグメント-ベースのワクチン、を含む。
ポリエピトープ・ワクチンでは、多数の免疫優性CD8 T細胞エピトープを、単一のポリタンパク質としての発現させるために、連結した。このアプローチは、検証されたT細胞エピトープの最大密度を提供するという長所を有する。6-29の全エピトープの範囲のバリアントを設計した。ポリエピトープ・ワクチンに関する、重要な設計上での特徴は、任意の非-天然の接合部エピトープ(non-natural junctional epitope)を最小限にしながら、所望の免疫優性エピトープの効率的なプロセシング及び提示を最大限にすることができることである。最適なプロテアソーム切断配列を含むポリエピトープも設計した［天然のタンパク質配列（全長タンパク質中の各々のエピトープを直接的に取り囲むアミノ酸、これは、我々のスクリーニング・データに基づいて、効率的な提示をもたらすことが検証されている）に由来するか、又は合成プロテアソーム切断配列をエピトープ間のリンカーとして使用した］。予測される高-親和性の接合部エピトープの生成を最小限にする、最適なエピトープ順序を選択する（数百万の試験バリアントから最適な順序を選択する）為のバイオインフォマティクス手法も使用した。
フラグメント-ベースのワクチンでは、一連のHLA対立遺伝子全体広くにわたって免疫優性であると同定されたSARS-CoV-2由来の一組のより長いゲノム・セグメントを連結した。このアプローチは、SARS-CoV-2タンパク質配列のより長い範囲を含むという長所を有し、我々が検討しなかった、他のHLA対立遺伝子によって提示される、更なるCD8 T細胞エピトープをコードする可能性を増大させる。これらのワクチンについて、2-6種のセグメントを連結した。
どちらのクラスのワクチンも、より広い状況(context)及び送達の点で、高度にモジュール化されている。これらは、CD8 T細胞応答をブーストすることに焦点を当てた単独ワクチンとしての役割を果たすことができ、又は中和抗体反応を生成するように設計された抗原と一緒に共-導入することができる。後者の場合、それらは、P2A配列等のリボソーム再始動部位の後の他の抗原と共に、発現することがある。本設計のいくつかは、最適化されたSタンパク質（当該タンパク質の安定性を増強するように設計された2つのプロリン変異を含む）を含み、P2A配列及びポリエピトープ又はポリフラグメント・タンパク質、が続く。これらを、mRNA、DNA、ウイルス・ベクターを用いて、又は精製タンパク質として、送達することができる。
構築物の特定のエピトープに関連する1つの例として、同じHLA型を有する患者間で共有される、SARS-CoV-2中の少数(3-8)の高抗原性(免疫優性)エピトープによって、CD8+ T細胞応答が支配されることが、本出願で決定された。これらのエピトープは、SARS-CoV-2に主に特有であり（即ち、「風邪」コロナウイルスでは生じない）、ウイルス分離株間で不変であり、各患者内の複数のクローン型によってしばしばターゲット化される。研究した6種のHLA型全体広くにわたって、少なくとも29種の共有エピトープが同定された。特に、前記エピトープの約10%(29種中3種)のみが、Sタンパク質中に存在し（即ち、約90%のSARS-CoV-2免疫優性エピトープは、Sタンパク質の外に位置する）、このことは、より広いCD8+ T細胞応答を誘発するように設計された、新しいクラスのワクチンの必要性を強調する。実際に、英国、南アフリカ、ブラジル、又はデルタ・バリアントにおける変異のいずれも、これらの29種のエピトープの中に発生していない、並びにSARS-CoV-2に感染した患者を解析した場合に、いくつかのHLA型は、いかなるスパイク・タンパク質のエピトープももたらさなかった（例えば、5例のA*01:01患者及び5例のA*11:01患者についてのスクリーニング・データでは、スパイク・タンパク質中に、いかなるエピトープも同定されなかった）。注目すべきことに、スクリーニングした患者の94%は、所与のHLAについての3種の最も優性なエピトープのうちの少なくとも1種を認識すること、及び患者の53%は、所与のHLAについて3種の最も優性なエピトープの全てを認識するT細胞を有すること、が決定された。18例の追加のA*02:01患者において、更に確認分析を行うと、上位6種の同定されたA*02:01エピトープに特異的なメモリーCD8+ T細胞の存在が繰り返された、及び単一細胞シークエンシングによって、患者は、しばしば、各々のエピトープをターゲット化する>5種の異なったT細胞クローンを有すること、しかし、患者全体広くにわたってであっても、同じT細胞レセプターVa及びVb領域が、これらのエピトープを認識するために主に使用されること、が明らかになった。これらの免疫優性エピトープの大部分(29中27)をターゲットとするT細胞は、風邪を引き起こす地域流行性の(endemic)コロナウイルスと交差反応しない、及び前記エピトープは、変異の多い領域では、生じない。これらの結果は、COVID-19におけるCD8+ T細胞応答をより良く理解するための有用なツールを提供する、並びにワクチンを設計するための、及びと開発するための、重要な意味を持つ。
従って、本発明は、部分的に、同定した免疫原性ポリペプチドの構築物、これらの免疫原性ポリペプチドの構築物を、単独で又はMHC分子と共に、含む組成物、安定なMHC-ペプチド複合体、SARS-CoV-2に対するT細胞応答を診断する、予後予測する、及びモニタリングする方法、並びに同定した免疫原性ポリペプチドの構築物を、含む及び／又はコードする、免疫原性組成物を投与することによって、SARS-CoV-2感染症を、予防する及び／又は治療する、ための方法、に関する。
I. 定義
便宜の為に、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用する、ある特定の用語を、ここにまとめる。
冠詞「a」及び「an」を、本冠詞の文法的な目的物の1つ又は2つ以上(即ち、少なくとも1つ)を指す為に、本出願で使用する。例として、「an element」は、1つのelementを、又は2つ以上のelementを、意味する。
本出願で使用する場合、用語「投与する」は、対象に、医薬品を、又は医薬組成物を、提供することを意味する、及び、限定されるものではないが、医療専門家による投与、及び自己-投与、を含む。
用語「免疫応答」としては、T細胞媒介性の、及び／又はB細胞媒介性の免疫応答、が挙げられる。例示的な免疫応答としては、T細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害性、が挙げられる。加えて、用語免疫応答としては、T細胞活性化によって間接的に有効となる免疫応答、例えば、抗体産生(体液性応答)、及びサイトカイン応答性細胞（例えば、マクロファージ）の活性化、が挙げられる。
従来のT細胞（Tconv又はTeffとしても知られる）は、エフェクター機能（例えば、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、抗-自己-認識、等）を有し、1つ以上のT細胞レセプターが発現することによって、免疫応答を増大させる。Tcon又はTeffは、一般に、Tregではない任意のT細胞集団として定義され、例えば、ナイーブT細胞、活性化T細胞、メモリーT細胞、休止Tcon（resting Tcon）、又は、例えば、Th1系統に若しくはTh2系統に向かって分化したTcon、が挙げられる。いくつかの実施形態では、Teffは、非-Treg T細胞のサブセットである。いくつかの実施形態では、Teffは、CD4+ Teff、又はCD8+ Teff、例えばCD4+ヘルパーTリンパ球（例えば、Th0、Th1、Tfh、若しくはTh17）、及びCD8+細胞傷害性Tリンパ球、である。本出願で更に記載されるように、細胞傷害性T細胞は、CD8+ Tリンパ球である。「ナイーブTcon」は、骨髄で分化したCD4+ T細胞である、並びに胸腺における中心選択（central selection）の、ポジティブ・プロセス及びネガティブ・プロセスを、首尾よく経たが、抗原への曝露によってまだ活性化されていない。ナイーブTconは、一般に、L-セレクチン(CD62L)の表面発現、CD25、CD44又はCD69等の活性化マーカーが存在しないこと、及びCD45RO等のメモリー・マーカーが存在しないこと、を特徴とする。従って、ナイーブTconは、静止している、及び非-分裂である、ホメオスタシス生存の為に、インターロイキン-7(IL-7)及びインターロイキン-15(IL-15)、を必要とする、と考えられている（少なくとも、WO 2010/101870を参照されたい)。そのような細胞の、存在及び活性は、免疫応答を抑制する状況において、望ましくない。Tregとは異なり、Tconは、アネルギー性(anergic)ではない、及び抗原に基づくT細胞レセプター活性化に応じて、増殖することがある(Lechler et al. (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637)。腫瘍では、疲弊した細胞は、アネルギー(anergy)の特徴を示すことがある。
用語「ワクチン」は、関心とする抗原に対する免疫応答を誘発する医薬組成物を指す。前記ワクチンは、対象に対して、防御的な免疫を付与することもできる。
「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。好適なベクターのうちの1つのタイプは、エピソーム、即ち、染色体-外の複製が可能な核酸である。好適なベクターは、それに連結している核酸を、自律的に複製することが、及び／又は発現することが、可能なベクター、である。遺伝子の発現を指示することができるベクター（ベクターは、その遺伝子に、作動可能に、連結している）を、本出願において、「発現ベクター」と呼ぶ。一般的に、組み換えDNA技術において有用な発現ベクターは、しばしば、「プラスミド」（これは、一般に環状二本鎖DNAループを指し、それらのベクターの形態では、染色体に結合していない）の形態である。本明細書では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」を、互換的に使用する。しかし、当業者によって理解されるように、本発明は、均等な機能を果たし、その後当該技術分野で既知になるような、他の形態の発現ベクター、を含むことが意図される。
用語「免疫療法剤」としては、宿主の免疫系を刺激して、対象におけるウイルス感染に対する免疫応答を生じさせることができる、任意の分子、ペプチド、抗体又は他の薬剤、を挙げることができる。様々な免疫療法剤が、本出願に記載される組成物及び方法において、有用である。
「単離されたタンパク質」は、細胞から単離した場合では、若しくは組み換えDNA技術によって産生した場合では、他のタンパク質、細胞物質、分離培地、及び培養培地、を実質的に含まない、又は化学的に合成した場合では、化学的前駆体、若しくは他の化学物質、を実質的に含まない、タンパク質を指す。「単離された」、又は「精製された」、タンパク質、又はその生物学的に活性な部分は、前記抗体の、ポリペプチドの、ペプチド又は融合タンパク質の由来源である、細胞、若しくは組織、に由来する、細胞物質若しくは他の混入タンパク質を、実質的に含まない、又は化学的に合成した場合では、化学的前駆体若しくは他の化学物質を、実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、前記タンパク質を単離する細胞の、又は前記タンパク質を組み換えにより産生する細胞の、細胞構成要素から、前記タンパク質を分離する、という、バイオマーカー・ポリペプチドの調製、又はそのフラグメントの調製、を含む。1つの実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、約30%(乾燥重量で)未満の非-バイオマーカー・タンパク質(本出願では、「混入タンパク質」とも呼ぶ)、より好ましくは約20%未満の非-バイオマーカー・タンパク質、更により好ましくは約10%未満の非-バイオマーカー・タンパク質、及び、最も好ましくは約5%未満の非-バイオマーカー・タンパク質、を有する、バイオマーカー・タンパク質の調製、又はそのフラグメントの調製、を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド若しくは融合タンパク質、又はそれらのフラグメント、例えば、生物学的に活性なそれらのフラグメント、を組み換えにより生成する場合、それは、培養培地も実質的に含まない、即ち、培養培地は、前記タンパク質調製物の体積の、約20%未満、より好ましくは約10%未満、及び最も好ましくは5%未満、を表す。
本出願で使用する場合、用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス(例えば、IgM、IgG1、IgG2C等)を指す。
本出願で使用する場合、用語「KD」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図される。本発明によって包含される抗体の結合親和性を、標準的な抗体-抗原アッセイ、例えば、競合アッセイ、飽和アッセイ、又は標準的なイムノアッセイ、例えば、ELISA若しくはRIA等、によって、測定することがある、又は決定することがある。
「キット」は、少なくとも1種の試薬（例えば、本発明によって包含されるマーカーの発現、を特異的に検出する為の、及び／又は、に影響を及ぼす為の、プローブ又は低分子）を含む任意の製造物（例えば、パッケージ、又は容器）である。前記キットを、本発明が包含する方法を実施する為のユニットとして、宣伝する、配布する、又は販売する、ことがある。前記キットは、本発明が包含する方法において有用な組成物を表すのに必要な、1種以上の試薬を、含むことがある。ある特定の実施形態では、前記キットは、参考基準（例えば、細胞増殖、分裂、移動、生存又はアポトーシス、を制御するシグナリング経路、に影響を及ぼさない、又は、を調節しない、タンパク質をコードする核酸）を更に含むことがある。当業者は、多くのそのようなコントロール・タンパク質、例えば、限定されるものではないが、一般的な分子タグ(例えば、緑色蛍光タンパク質及びベータ-ガラクトシダーゼ)、GeneOntologyを参照して、細胞増殖、分裂、移動、生存若しくはアポトーシス、を包含する任意の経路の中で、分類されないタンパク質類、又はユビキタスなハウスキーピング・タンパク質（ubiquitous housekeeping proteins）等、を想定することができる。前記キット中の試薬を、個々の容器に入れて、又は2種以上の試薬の混合物を単一の容器に入れて、提供することがある。更に、キット内に、前記組成物の使用を記載する、説明資料、が含まれることがある。
用語「予防する（prevent）」、「予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的治療（prophylactic treatment）」等は、疾患、障害、又は症状、を発症する可能性を、対象（この対象は、疾患、障害、又は症状、を有さないが、疾患、障害、又は症状、を発症するリスクがある、又は、を発症しやすい）において、低下させることを指す。
用語「予後予測(prognosis)」は、ウイルス感染症の可能性のある経過及びアウトカム（outcome）、又はその疾患からの回復の可能性、に関する予測を含む。いくつかの実施形態では、統計的アルゴリズムを使用することで、個体におけるウイルス感染症の予後予測を行う。例えば、前記予後予測は、手術、ウイルス感染症の臨床的なサブタイプの発症、1種以上の臨床的な因子の発生、又はその疾患からの回復、であることがある。
少なくとも1種のバイオマーカーの、存在を又はレベルを、検出する又は決定する、為に使用される用語「サンプル」は、典型的には、脳組織、脳脊髄流体、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便(stool)(例えば、糞便(feces))、涙、及び任意の他の身体の流体(例えば、「体液」としての定義のもとで上述される)、又は組織サンプル(例えば、生検)、例えば、小腸、大腸サンプル、又は外科的切除組織である。ある特定の実施形態では、本発明によって包含される方法は、前記サンプル中の少なくとも1種のマーカーの、存在を又はレベルを、検出する又は決定する、前に、その個体から前記サンプルを得るステップ、を更に含む。
用語「低分子」は、当該技術分野の用語である、及び分子量約1000未満の分子、又は分子量約500未満の分子、を含む。1つの実施形態では、低分子は、ペプチド結合だけで構成されているわけではない。別の実施形態では、低分子は、オリゴマーではない。活性をスクリーニングすることがある例示的な低分子化合物としては、限定されるものではないが、ペプチド、ペプチドミメティック（peptidomimetics）、核酸、糖類(carbohydrates)、有機低分子(例えば、ポリケチド(polyketides))(Cane et al. (1998) Science 282:63)、及び天然物抽出ライブラリ、が挙げられる。別の実施形態では、前記化合物は、低分子有機非-ペプチド化合物である。更なる実施形態では、低分子は、生合成的ではない。
用語「特異的結合」は、抗体が所定の抗原に結合することを指す。典型的には、結合アッセイ、例えば、分析物として関心とする抗原を、及びリガンドとして前記抗体を、使用する、BIACORE（登録商標） アッセイ装置での表面プラズモン共鳴(SPR)技術、で測定した場合、前記抗体は、凡そ10-7 M未満、例えば、凡そ10-8 M、10-9 M若しくは10-10M未満、又は更により小さな値の、親和性(KD)で結合する、及び所定の抗原以外の、又は密接に関連する抗原以外の、非-特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)への結合に対するその親和性よりも、少なくとも1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.5-、3.0-、3.5-、4.0-、4.5-、5.0-、6.0-、7.0-、8.0-、9.0-、若しくは10.0-倍、又はより大きい、親和性で、所定の抗原に結合する。語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」を、本出願では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用する。選択的な結合は、ある抗原の結合を、別の抗原の結合から識別する抗体の能力を指す、相対的な用語である。
用語「対象」は、任意の健常な動物、哺乳動物若しくはヒト、又はウイルス感染症（例えば、SARS-CoV-2感染症）に罹患している、任意の動物、哺乳動物若しくはヒト、を指す。用語「対象」は、「患者」と互換である。
本出願で使用する場合、アミノ酸配列間の「同一性パーセント（percent identity）」は、「相同性パーセント（percent homology）」と同義であり、これを、Karlin及びAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, (1990)）の、Karlin 及び Altschul （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, (1993)）によって改変を受けた、アルゴリズムを用いて、決定する。この記載されたアルゴリズムは、Altschul et al. （J. Mol. Biol. 215:403-410, (1990)）の、NBLAST及びXBLAST、のプログラムの中に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12、を用いて行い、本出願に記載されるポリヌクレオチドに相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3、を用いて行い、参考ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得る。比較の為のギャップが入ったアラインメント(gapped alignment)を得る為には、Altschul et al.（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, (1997)）に記載されているように、Gapped BLASTを利用する。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、各々のプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)の既定パラメーターを、使用する。
語句「薬学的に許容される担体」は、本出願で使用する場合、薬学的に許容される物質、組成物又は媒体、例えば、身体のある臓器、又は部分から、身体の別の臓器、又は部分に、対象化合物を運搬すること、又は輸送すること、に関与する、物質を封入する、液状又は固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、又は溶媒、等、を意味する。
「転写されたポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド転写物」は、バイオマーカー核酸の転写、並びに、もしあれば、RNA転写物の正常な転写-後プロセシング(例えば、スプライシング)、及び前記RNA転写物の逆転写、によって作製される、成熟mRNAの、全部と又は一部と、相補的である又は相同的である、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA、hnRNA、cDNA、又はそのようなRNAの若しくはcDNAのアナログ)である。
用語「T細胞」には、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞が含まれる。用語T細胞はまた、Tヘルパー1型T細胞及びTヘルパー2型T細胞の両方を含む。用語「抗原-提示細胞」は、専門の抗原-提示細胞(例えば、Bリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、並びに他の抗原-提示細胞(例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、及びオリゴデンドロサイト)、を含む。
用語「T細胞レセプター」又は「TCR」は、完全なTCR、並びにその抗原-結合部分又は抗原-結合フラグメント、を包含すると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、前記TCRは、インタクトな又は完全長のTCR、例えば、αβ型のTCR又はγδ型のTCR等、である。いくつかの実施形態では、前記TCRは、完全長TCRよりも短いが、MHC分子中に結合した特定のペプチドに結合する、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合する、抗原-結合部分である。いくつかの場合では、TCRの抗原-結合部分又はフラグメントは、完全長のTCRの又はインタクトなTCRの、構造ドメインの一部分しか含まないが、完全長のTCRが結合する、ペプチド・エピトープ（例えば、MHC-ペプチド複合体等）に、依然として結合することができる。いくつかの場合では、抗原-結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体への結合の為の結合部位を形成するのに十分な、TCRの可変ドメイン（例えば、TCRの、可変α鎖及び可変β鎖等）を含む。一般的に、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHC及び／又はMHC-ペプチド複合体の認識に関与する、相補性決定領域(complementarity determining regions (CDRs))、を含む。
用語「治療効果」は、薬学的に活性な物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒト、における、局所的な又は全身的な効果、を指す。それ故に、その用語は、疾患の診断、治癒、軽減、治療又は予防、の際に、又は動物若しくはヒトにおける、望ましい、身体的な若しくは精神的な、発達及び状態、を向上させる際に、使用することを意図した任意の物質、を意味する。語句「治療有効量」は、任意の治療に適用可能な、合理的な利益／リスク比での、何らかの所望の、局所的な効果又は全身的な効果、を生みだす物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解性等に依存する。例えば、本発明によって包含される方法によって発見されたある特定の化合物を、このような治療に適用可能な、合理的な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で、投与することがある。
用語「治療有効量」及び「有効量」は、本出願で使用する場合、任意の医学的な治療に適用可能な、合理的な利益／リスク比で、動物の中の細胞の少なくともサブ集団において、何らかの所望の治療効果を生じさせるの有効である、本発明によって包含される、化合物の、材料の、又は化合物を含む組成物の、量を意味する。対象化合物の毒性及び治療有効性を、細胞培養又は実験動物における、標準的な薬学的な方法（例えば、LD50及びED50を決定する為の方法）によって、決定することがある。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。いくつかの実施形態では、LD50(致死用量)を、測定することがあり、例えば、前記薬剤を投与しない場合と比較して、前記薬剤について、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、又はそれを超えて、減少することがある。同様に、ED50(即ち、症状(symptom)を、最大の半分で、阻害することができる濃度)を、測定することがあり、例えば、前記薬剤を投与しない場合と比較して、前記薬剤について、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、又はそれを超えて、増加することがある。また、同様に、IC50を測定することがあり、例えば、前記薬剤を投与しない場合と比較して、前記薬剤について、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、又はそれを超えて、増加することがある。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるT細胞免疫応答は、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は更に100%、増加することがある。別の実施形態では、ウイルス負荷は、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%すら、減少することがある。
対象における疾患を「治療すること」、又は疾患を有する対象を「治療すること」は、少なくとも1つの疾患の症状(symptom)が、減少するように、又はより悪化することを防止するように、前記対象を薬学的な治療、例えば、薬物の投与、に供することを指す。
用語「体液」は、身体から、排泄される、又は分泌される、流体、並びに身体から、通常、排泄されない、又は分泌されない、流体(例えば、羊膜流体、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄流体、耳垢(cerumen and earwax)、カウパー流体又は尿道球腺液、乳糜、糜粥、糞便、雌射精液（潮吹き）、間質液、細胞内流体、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜流体、涙、尿、膣潤滑、硝子体液、嘔吐物)を指す。
用語「コーディング領域(coding region)」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す、一方、用語「ノンコーディング領域(noncoding region)」は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域(例えば、5'及び3'非翻訳領域)を指す。
用語「相補的」は、2本の核酸鎖の領域間の、又は同じ核酸鎖の2つの領域間の、配列相補性に関する広範な概念を指す。第1の核酸領域のアデニン残基は、第1の領域と逆平行である第2の核酸領域の残基と、その残基がチミン又はウラシルである場合、特異的な水素結合(「塩基対合」)を形成することができることが知られている。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基は、第1の領域と逆平行である第2の核酸領域の残基と、その残基がグアニンである場合、特異的な塩基対合をすることができることが知られている。核酸の第1の領域は、同じ又は異なる核酸の第2の領域に対して、その2つの領域が逆平行に配置していて、前記第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が前記第2の領域の残基と塩基対合することができる場合、相補的である。好ましくは、前記第1の領域は第1の部分を含む、及び前記第2の領域は第2の部分を含む、それによって、前記第1の部分及び前記第2の部分が逆平行に配置している場合、少なくとも約50%、及び好ましくは、少なくとも約75%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%、の第1の部分のヌクレオチド残基は、前記第2の部分のヌクレオチド残基と、塩基対合をすることができる。より好ましくは、前記第1の部分の全てのヌクレオチド残基は、前記第2の部分内のヌクレオチド残基と、塩基対合することができる。
本出願で使用する場合、活性化した免疫細胞に関して、用語「共刺激する」としては、共-刺激分子が、増殖又はエフェクター機能を誘導する、第2の、非-活性化レセプター媒介シグナル(「共-刺激シグナル」)、を提供することができること、が挙げられる。例えば、共-刺激シグナルは、例えば、T細胞-レセプター-媒介シグナルを受け取ったT細胞において、サイトカイン分泌をもたらすことがある。例えば、活性化レセプターを介して、細胞-レセプター媒介シグナルを受け取った免疫細胞を、本出願では、「活性化免疫細胞」と呼ぶ。
用語「対象の為の好適な治療レジメンを決定すること（determining a suitable treatment regimen for the subject）」は、本発明に係る解析の結果に、基づいて、又は本質的に基づいて、若しくは少なくとも部分的に基づいて、開始する、改変する、及び／又は終了する、対象の為の治療レジメン（即ち、対象におけるウイルス感染症を、予防する、及び／又は治療する、為に使用する、単一の療法、又は様々な療法の組み合わせ）を決定することを、意味すると解釈される。例えば、再発のリスクを減らすことを目的として、術後にアジュバント療法を開始すること、別の例としては、特定の化学療法の用量を変更すること、が挙げられる。前記決定は、本発明に係る解析の結果に加えて、治療するべき対象の個人的な特徴に基づくことがある。ほとんどの場合、担当医又は医師が、前記対象に適した治療レジメンを、実際に、決定するであろう。
本出願で使用する場合、用語「アジュバント」は、抗原の投与、の前に、と一緒に、又は、の後に、投与すると、前記抗原単独の投与と比較して、前記抗原に対する免疫応答の、質を及び／又は強度を、加速する、延長する、及び／又は増強する、物質を指す。アジュバントは、ワクチン接種によって誘導される免疫応答の、強度を及び持続時間を、増加させることができる。
本出願で使用される「相同な」は、同じ核酸鎖の2つの領域間の、又は2つの異なった核酸鎖の領域間の、ヌクレオチド配列の類似性を指す。両方の領域のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基によって占められる場合、その領域はその位置で相同である。第1の領域は、第2の領域に対して、各領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基の位置が同じ残基によって占められている場合、相同である。2つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占められる、2つの領域のヌクレオチド残基の位置の割合として、表される。例えば、ヌクレオチド配列5'-ATTGCC-3'を有する領域とヌクレオチド配列5'-TATGGC-3'を有する領域とは、50%の相同性を共有する。好ましくは、第1の領域は第1の部分を含む、及び第2の領域は第2の部分を含む、それによって、前記部分の各々の核酸残基の位置の、少なくとも約50%、及び、好ましくは、少なくとも約75%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%、は、同じヌクレオチド残基によって占められる。より好ましくは、前記部位の各々の全てのヌクレオチド残基の位置は、同じヌクレオチド残基によって占められる。
用語「免疫細胞」は、免疫応答の中で役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血起源の細胞である、並びに、免疫細胞としては、B細胞及びT細胞等のリンパ球；ナチュラル・キラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球等の骨髄細胞、が挙げられる。
用語「SARS-CoV-2」又は「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）」は、コロナウイルス疾患2019(coronavirus disease 2019 (COVID-19))の原因となる病原体を指す。SARS-CoV-2は、2020年3月11日に世界保健機関(WHO)によってパンデミックとして同定された。そのウイルスが宿主細胞の中に侵入する過程が支援される際に、SARS-CoV2は、肺のII型肺胞細胞(type II alveolar cells (AT2))等の下部気道、上部食道及び重層上皮細胞、並びに回腸及び結腸からの吸収性腸細胞、胆管細胞、心筋細胞、腎近位尿細管細胞、並びに膀胱尿路上皮細胞、等の他の細胞、において、高度に発現するACE2レセプターに結合する。従って、このウイルスに感染した患者は、急性呼吸窮迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS))をもたらす肺炎などの呼吸障害を経験するだけでなく、心臓、腎臓、及び消化管の障害も経験する。
患者の中のSARS-CoV2ウイルスを根絶する為の特異的な治療はない。SARS-CoV治療又はMERS-CoV治療等の、別のβ-コロナウイルス・アプローチのための治療アプローチを使用することができる。これらのアプローチのあるものは、ロピナビル／リトナビル(lopinavir/ritonavir)、クロロキン、及びヒドロキシクロロキン、を含む。一晩に2回の、インターフェロンαのエアロゾル吸入を使用することもある。いくつかの場合では、リバビリン（ribavirin）と組み合わせたインターフェロン-αの併用を、コロナウイルス(例えば、MERS-CoV)に、一般的に使用されてきている。インターフェロンとステロイド薬との併用は、肺の修復を加速し、酸素生存レベルを増加させることができることも見出された。しかしながら、インターフェロンαを用いた治療については一貫性の無い結果が示されている。
SARS-CoV-2ウイルスは、ヒト及び他の哺乳動物に広く分布するサルベコウイルス、オルト・コロナ・ビリナ・サブファミリー（sarbecovirus, ortho corona virinae subfamily）に含まれる、エンベロープを有する、セグメント化されていない、ポジティブ・センス(positive sense)のRNAウイルス、である。その直径は、約65-125 nmであり、RNAの一本鎖を含み、外表面上にクラウン-様スパイクを備える。SARS-CoV2は、以前に同定されたSARS-CoV及びMERS-CoV（これらは肺不全及び潜在的に致死的な気道感染をもたらし、主に広東（Guandong）、中国及びサウジアラビアにおいてアウトブレイクを引き起こした）の後の新規なβ-コロナウイルスである。
SARS-CoV-2のゲノムサイズは、29.8kbから29.9kbまでで変化し、そのゲノム構造は、既知のCoVに特異的な遺伝子特性に従った。5'側のゲノムの3分の2より多くは、orf1a/bポリタンパク質をコードするorf1a/bを含む、一方、3'側の3分の1は、スパイク(S)糖タンパク質、小エンベロープ(E)糖タンパク質、膜(M)糖タンパク質、及びヌクレオカプシド(N)タンパク質、を含む4種の主要な構造タンパク質をコードする遺伝子からなる。更に、前記SARS-CoV-2は、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、及びORF8遺伝子によってコードされる6種のアクセサリー・タンパク質（accessory proteins）を含む(Khailany et al. (2020)Gene Rep 19:100682)。
ORF1ab遺伝子は、前記コロナウイルスの最も大きい遺伝子セグメントである、並びに、それは、2種のORF、即ちORF1a及びORF1b、を構成し、リボソーム・フレーム・シフト事象に寄与することにより、2種の大きな重複ポリタンパク質、pp1a(orf1aポリタンパク質)及びpp1ab(orf1abポリタンパク質)、を産生する。本ポリタンパク質は、プロテアーゼ酵素、即ち、nsp3及びnsp 5にコードされている、パパイン-様プロテアーゼ(PLpro)及びセリン型Mpro(キモトリプシン-様プロテアーゼ(3CLpro))プロテアーゼによって、補われる。続いて、pp1aとpp1abとの間で、切断が起こり、それぞれ非構造タンパク質(nonstructural proteins (nsps))1-11及び1-16になる。前記nspは、ウイルス及び宿主細胞の中の多くのプロセスにおいて、重要な役割を果たす。orf1aポリタンパク質及びorf1abポリタンパク質の代表的な配列を、以下の表1Kに示す。
ORF3aは、SARS-CoV-2ゲノムによってコードされるアクセサリー・タンパク質のうちの1種である。最近の研究によれば、SARS-CoV-2のORF3aタンパク質の機能的ドメインは、毒性、感染性、イオン・チャネル形成、及びウイルス放出、に関連することが示された(Issa et al. (2020) mSystems 5:e00266-20)。ORF3aの代表的な配列を、以下の表1Kに示す。
ORF7aは、別のSARS-CoV-2ゲノムにコードされたアクセサリー・タンパク質であり、主にゴルジ体に局在するが、細胞表面上に見出すことができるI型膜貫通タンパク質から構成される。SARS-CoVのORF7aは、ウイルス・ゲノム中では、ORF7bと重複し、そこで、ORF7aとORF7bは、転写調節配列(transcriptional regulatory sequence (TRS))を共有する。いくつかの実施形態では、ORF7aは、15-アミノ酸(aa)のN-末端シグナル・ペプチド、81-aaの内腔ドメイン、21-aaの膜貫通ドメイン、及び5-aaの細胞質尾部、を有する(Taylor et al. (2015) J. Virol. 89:11820-11833)。ORF7aの代表的な配列を、以下の表1Kに示す。
スパイク又はS糖タンパク質は、前記ウイルスの外側部分に見られる、約150kDaの分子量を有する膜貫通タンパク質である。Sタンパク質は、前記ウイルスのS1サブユニットに位置するRBDを有し、これは、宿主細胞上のそのレセプター（ACE2）に結合することによって、前記ウイルスが宿主細胞の中に侵入することを促進する。Sタンパク質は、前記ウイルスの表面に突出するホモ三量体を形成し、下部気道細胞で発現が見られるアンギオテンシン変換酵素2(ACE2)に引き付けられることによって、エンベロープ・ウイルスが宿主細胞に結合することを促進する。この糖タンパク質は、宿主細胞のフーリン-様プロテアーゼ（furin-like protease）によって、2つのサブユニット、即ち、S1及びS2に切断される。S1部分は、レセプター結合ドメインを構成して、宿主ウイルス域の及び細胞指向性の、決定を担う、一方、S2は、宿主細胞を伝搬する際にウイルス融合を媒介するように機能する。S糖タンパク質の代表的な配列を、以下の表1Kに示す。
Nタンパク質として知られるヌクレオカプシドは、前記ウイルスの核酸物質に構造的に結合する、小胞体-ゴルジ領域に局在する、CoVの構造構成要素である。本タンパク質はRNAに結合するので、前記タンパク質は、ウイルス・ゲノム、ウイルス複製周期、及びウイルス感染に対する宿主細胞の細胞応答、に関連するプロセスに関与する。Nタンパク質はまた、高度にリン酸化を受けている、及びウイルスRNAに対する親和性を増強する構造変化をもたらすことが示唆される。N糖タンパク質の代表的な配列を、以下の表1Kに示す。
このウイルスの別の重要な部分は、膜又はMタンパク質であり、これは、最も構造的に構造化したタンパク質であり、ウイルス・エンベロープの形状を決定する際に、役割を果たす。このタンパク質は、他のすべての構造タンパク質に結合することができる。Mタンパク質との結合は、ヌクレオカプシド又はNタンパク質の安定化を促進する、及び内部ビリオンの内側で、Nタンパク質-RNA複合体を安定化することによって、ウイルスの組立て（viral assembly）が完結することを促進する。Mタンパク質の代表的な配列を、以下の表1Kに示す。
最後の構成要素は、このウイルスの産生及び成熟の際に役割を果たす、SARS-CoV-2構造の中で最も小さいタンパク質である、エンベロープ又はEタンパク質、である。
SARS-CoV-2のゲノム情報は公的に入手可能であり、例えば、NCBI重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2データベース(ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/のワールド・ワイド・ウェブ［World Wide Web］上で利用可能)及びNGDCゲノム・ウェアハウス（NGDC Genome Warehouse）(bigd.big.ac.cn/gwh/で利用可能)から、配列決定された分離株についての疫学的データと共に得ることができる。特定のタンパク質のアミノ酸配列と、前記タンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列との間には、遺伝コードによって定義されるように(以下に示す)、既知の明確な対応がある。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、その核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には、遺伝コードによって定義されるように、既知の明確な対応がある。
前記遺伝コードの、重要な且つ周知の特徴は、その冗長性であり、それによって、タンパク質を作製する為に使用されるアミノ酸の大部分について、2つ以上のコーディング・ヌクレオチド・トリプレットが使用され得る（上記した）。従って、いくつかの様々なヌクレオチド配列が、所与のアミノ酸配列をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列は、すべての生物において、同じアミノ酸配列の産生をもたらすので、機能的に均等であると考えられる（しかし、ある種の生物は、ある種の配列を、他の生物よりも効率的に、翻訳することができる）。更に、時折、プリン又はピリミジンのメチル化バリアントが、所与のヌクレオチド配列中に見出されることがある。そのようなメチル化は、トリヌクレオチド・コドンとその対応するアミノ酸との間のコード関係に、影響を及ぼすことは無い。
上記を考慮して、バイオマーカー核酸（又はその任意の一部）をコードするDNA又はRNAのヌクレオチド配列を使用して、DNA又はRNAをアミノ酸配列に翻訳する為の遺伝コードを使用しながら、ポリペプチド・アミノ酸配列を導くことがある。同様に、ポリペプチド・アミノ酸配列について、前記ポリペプチドをコードすることがある対応するヌクレオチド配列を、前記遺伝コードから推定することができる（これは、その冗長性の為に、任意の所与のアミノ酸配列について、複数の核酸配列が生成される）。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する本出願における記載及び／又は開示には、前記ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の記載及び／又は開示も含まれる、と考えるべきである。同様に、本出願におけるポリペプチド・アミノ酸配列の記載及び／又は開示には、前記アミノ酸配列をコードすることができる、全ての考えられるヌクレオチド配列の記載及び／又は開示も含まれる、と考えるべきである。
II. ペプチド及び構築物
ある特定の態様では、同定したSARS-COV-2免疫優性ペプチドを、又は同定したSARS-COV-2免疫優性ペプチドをコードする核酸を、投与することによる、SARS-CoV-2に対する免疫応答の誘導を介した、COVD-19を、治療するための及び／又は予防するのための、方法及び組成物が、本出願で提供される。
いくつかの態様では、少なくとも2つのペプチド・エピトープ、又は少なくとも2つのペプチド・フラグメント（これらの各々は、少なくとも2つのペプチド・エピトープを含む）を含む免疫原性ポリペプチドが、本出願で提供される。これらの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに関連する様々な実施形態を、以下に記載する（例えば、免疫優性ペプチドに関して記載されるペプチド・エピトープは、免疫原性ポリペプチドの構成ペプチド・エピトープであることもある)。
ある特定の例示的な免疫原性ポリペプチド(例えば、構築物)を、図１、図２、図５Ａ-図５Ｃ、図６Ａ-図６Ｃ、図７、図８、図９Ａ、及び図９Ｂに示す。見られるように、前記免疫原性ポリペプチドは、複数(例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29)個のペプチド・エピトープ（例えば、表1A-1Fまでに由来するペプチド・エピトープ）を含むことがある、そのようなエピトープを少なくとも2個有するSARS-CoV-2タンパク質のフラグメントを含むことがある、並びに更に追加的なセグメント（例えば、Sタンパク質セグメント、及び／又はリボソーム停止／再始動セグメント、IRESセグメント、及び／又は翻訳後切断セグメント、任意選択的に、ここで、前記翻訳後切断セグメントは、P2Aフラグメントである）を有することがある。いくつかの実施形態では、関心とするエピトープを含むSARS-CoV-2タンパク質のフラグメントを、サイズによって、例えば、8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 1, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 419, 420, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1000, 1005, 1010, 1015, 1020, 1025, 1030, 1035, 1040, 1045, 1050, 1055, 1060, 1065, 1070, 1075, 1080, 1085, 1090, 1095, 1100, 1105, 1110, 1115, 1120, 1125, 1130, 1135, 1140, 1145, 1150, 1155, 1160, 1165, 1170, 1175, 1180, 1185, 1190, 1195, 1200, 1205, 1210, 1215, 1220, 1235, 1240, 1245, 1250, 1255, 1260, 1265, 1270, 1271アミノ酸(AA)の間、又は、間の、包括的な、任意の範囲、例えば、8-1271, 30-40, 15-30, 15-40, 30-112, 8-38, 8-96, 8-104, 8-107, 8-112, 8-88, 8-87, 8-85, 8-66, 8-55, 222-275, 222-419, 275-419, 222-1271,等によって、規定することがある。いくつかの実施形態では、最も小さいフラグメントは、8AAのエピトープである。いくつかの実施形態では、非-エピトープ・フラグメントについての、代表的な14フラグメントのワクチン構築物は、30-40AAの範囲である、及び14フラグメントの内の最も小さいフラグメント=[3+9+3]エピトープ[3aa +エピトープ+ 3aa]。いくつかの実施形態では、タンパク質に架かるフラグメントの内の最も大きいフラグメントは、112 AAである。いくつかの実施形態では、Sタンパク質(1271 AA)は、38アミノ酸のフラグメントによってカバーされる。いくつかの実施形態では、Nタンパク質(419 AA)は、1つ以上の、96 AA、104 AA、及び／又は107 AA、によって、カバーされる（例えば、N_Frag1 = 96 AA、N_Frag2 = 104 AA、及び／又はN_Frag3 = 107 AA）。いくつかの実施形態では、Orf3aタンパク質(275 AA)は、85 AA、87 AA、及び／又は88 AAの、1つ以上のフラグメントによって、カバーされる（例えば、3a_Frag1 = 88 AA、3a_Frag2 = 87 AA、及び／又は3a_Frag 3 = 85 AA）。いくつかの実施形態では、Mタンパク質(222 AA)は、55 AA及び／又は66 AAの、1つ以上のフラグメントによって、カバーされる（例えば、M_Frag1 = 66及び／又はM_Frag2 = 55）。
ある特定の実施形態では、SARS-COV-2免疫優性ペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープを含む（例えば、からなる(consist of)）。本出願に記載されるペプチド・エピトープを、MHC分子（例えば、特定のアルファ鎖対立遺伝子を有する特定のHLA分子等）と組み合わせることがある。
例えば、実施例で更に記載するように、表1Aのペプチドを、HLA-A*02血清型（例えば、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, 及び／又はHLA-A*274対立遺伝子、によってコードされる血清型）を有するアルファ鎖のMHCとの関連で、特定する；表1Cペプチドを、HLA-A*03血清型（例えば、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、及び／又はHLA-A*307、によってコードされる血清型）を有するアルファ鎖のMHCとの関連で、特定する；表1Bのペプチドを、HLA-A*01血清型（例えば、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、及び／又はHLA-A*116対立遺伝子、によってコードされる血清型）を有するアルファ鎖のMHCとの関連で、特定する；表1Dのペプチドを、HLA-A*11血清型（例えば、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、及び／又はHLA-A*1119対立遺伝子、によってコードされる血清型）を有するアルファ鎖のMHCとの関連で、特定する；表1Eのペプチドを、HLA-A*24血清型（例えば、HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, 及び／又はHLA-A*2458 対立遺伝子、によってコードされる血清型）を有するアルファ鎖のMHCとの関連で、特定する；並びに、表1Fのペプチドを、HLA-A*07血清型（例えば、HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び／又はHLA-B*0721 対立遺伝子、によってコードされる血清型）を有するアルファ鎖のMHCとの関連で、特定する。いくつかの実施形態では、SARS-COV-2免疫優性ペプチドは、表１Ｋより選択されるSARS-COV-2タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、1つ以上のSARS-COV-2免疫優性ペプチドを、単独で、又はアジュバントと併用して、投与する。
ある特定の態様では、本出願に記載される1つ以上のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びアジュバント、を含む組成物が、本出願で提供される。
表1G
表1H
表1I


*注：図２(続き)中に、#2と記した27エピトープ・フラグメントは、35頁の「27_エピトープ_3aa_リンカー」とラベルした構築物を、より正確に図示したものある。図２中の構築物の図は、図２(続き)に示す構築物の図に関する、より初期のバージョンである、及びこれらの構築物の図の各々は、図５-９で提供する正確な構築物の図に関する、より初期の図である。

表1J
表1K
Figure 2023550094000047
Figure 2023550094000048
Figure 2023550094000049
Figure 2023550094000050
Figure 2023550094000051
Figure 2023550094000052
Figure 2023550094000053
Figure 2023550094000054
Figure 2023550094000055
 *ペプチド・エピトープ、並びに、それらの全長にわたって、表1A-1Kに列挙される任意の配列番号(SEQ ID NO)のアミノ酸配列と、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、若しくはそれを超えた、同一性、若しくは間の、包括的な、任意の範囲、例えば、85-99%の同一性等、を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子、又はそれらの一部、が、表1A-1Kに含まれる。そのようなポリペプチドは、本出願において更に記載されるような全長ペプチド又はポリペプチドの機能を有することがある。
表2
Figure 2023550094000056
Figure 2023550094000057
Figure 2023550094000058
Figure 2023550094000059
Figure 2023550094000060
Figure 2023550094000061
>YP_009724389(SARS-CoV-2のORF1a/bタンパク質)

>YP_009724390(SARS-CoV-2のSタンパク質)

>YP_009724397(SARS-CoV-2のNタンパク質)

>YP_009724391(SARS-CoV-2のorf3aタンパク質)

> YP_009724393.1(SARS-CoV-2のMタンパク質)

> YP_009724395.1(SARS-CoV-2のorf7aタンパク質)

*全長にわたって、表1A-1Kに列挙されるポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、若しくはそれを超えた同一性、若しくは、間の、包括的な、任意の範囲、例えば、85-99%の同一性、を有する核酸配列、又はそれらの一部、が、表2に含まれる。そのような核酸配列は、本出願に更に記載されるような全長ペプチド又はポリペプチドの1つ以上の機能を有するポリペプチドをコードすることがある、及びRNA核酸分子（例えば、ウリジン(uredines)で置換されたチミン)）を表すこともある。
いくつかの実施形態では、本出願は、orf1a/bポリペプチド、及び／又はorf1a/bポリペプチドをコードする核酸、を提供する。Orf1a/bポリペプチドは、orf1a/bポリタンパク質のアミノ酸配列に、及び／又はorf1a/b-特異的な免疫応答を誘発するのに十分な長さのorf1a/bアミノ酸配列の一部に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、orf1a/bポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対応しないアミノ酸も含む（例えば、orf1a/bアミノ酸配列と、非-orf1a/bタンパク質又はポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを、含む融合タンパク質）。いくつかの実施形態では、orf1a/bポリペプチドは、orf1a/bポリタンパク質又はそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
いくつかの実施形態では、前記orf1a/bポリペプチドは、表1Kに記載のorf1a/bタンパク質アミノ酸配列の、少なくとも8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 又は 7000個の連続するアミノ酸、を含む、から本質的になる、又は、からなる、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記連続するアミノ酸は、表1Kに記載されるorf1a/bのアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、orf1a/bポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるorf1a/bペプチド・エピトープからなる群より選択される1つ以上のペプチド・エピトープ、を含む、から本質的になる、又は、からなる。
いくつかの実施形態では、本出願は、Sタンパク質ポリペプチド、及び／又はSタンパク質ポリペプチドをコードする核酸、を提供する。Sタンパク質ポリペプチドは、Sタンパク質ポリタンパク質のアミノ酸配列に、及び／又はSタンパク質-特異的な免疫応答を誘発するのに十分な長さのSタンパク質アミノ酸配列の一部に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Sタンパク質ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対応しないアミノ酸も含む（例えば、Sタンパク質アミノ酸配列と、非-Sタンパク質又はポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを、含む融合タンパク質）。いくつかの実施形態では、Sタンパク質ポリペプチドは、Sタンパク質ポリタンパク質又はそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態では、前記Sタンパク質ポリペプチドは、表1Kに記載のSタンパク質アミノ酸配列の、少なくとも8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 又は 1250個の連続するアミノ酸、を含む、から本質的になる、又は、からなる、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記連続するアミノ酸は、表1Kに記載されるSタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、Sポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるSペプチド・エピトープからなる群より選択される1つ以上のペプチド・エピトープ、を含む、から本質的になる、又は、からなる。
いくつかの実施形態では、本出願は、Nタンパク質ポリペプチド、及び／又はNタンパク質ポリペプチドをコードする核酸、を提供する。Nタンパク質ポリペプチドは、Nタンパク質ポリタンパク質のアミノ酸配列に、及び／又はNタンパク質特異的な免疫応答を誘発するのに十分な長さのNタンパク質アミノ酸配列の一部に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Nタンパク質ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対応しないアミノ酸も含む（例えば、Nタンパク質アミノ酸配列と、非-Nタンパク質又はポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを、含む融合タンパク質）。いくつかの実施形態では、Nタンパク質ポリペプチドは、Nタンパク質ポリタンパク質又はそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態では、前記Nタンパク質ポリペプチドは、表1Kに記載のNタンパク質アミノ酸配列の、少なくとも8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 又は 300個の連続するアミノ酸、を含む、から本質的になるか、又は、からなる、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記連続するアミノ酸は、表1Kに記載されるNタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、Nポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるNペプチド・エピトープからなる群より選択される1つ以上のペプチド・エピトープ、を含む、から本質的になる、又は、からなる。
いくつかの実施形態では、本出願は、Mタンパク質ポリペプチド、及び／又はMタンパク質ポリペプチドをコードする核酸、を提供する。Mタンパク質ポリペプチドは、Mタンパク質ポリタンパク質のアミノ酸配列に、及び／又はMタンパク質特異的な免疫応答を誘発するのに十分な長さのMアミノ酸配列の一部に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Mタンパク質ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対応しないアミノ酸も含む（例えば、Mタンパク質アミノ酸配列と、非-Mタンパク質又はポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを、含む融合タンパク質）。いくつかの実施形態では、Mタンパク質ポリペプチドは、Mタンパク質ポリタンパク質又はそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態では、前記Mタンパク質ポリペプチドは、表1Kに記載のMタンパク質アミノ酸配列の、少なくとも8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 又は220個の連続するアミノ酸、を含む、から本質的になる、又は、からなる、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記連続するアミノ酸は、表1Kに記載されるMタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、Mポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるMペプチド・エピトープからなる群より選択される1つ以上のペプチド・エピトープ、を含む、から本質的になる、又は、からなる。
いくつかの実施形態では、本出願は、orf3aポリペプチド、及び／又はorf3aポリペプチドをコードする核酸、を提供する。Orf3aポリペプチドは、orf3aポリタンパク質のアミノ酸配列に、及び／又はorf3a特異的な免疫応答を誘発するのに十分な長さのorf3aアミノ酸配列の一部に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、orf3aポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対応しないアミノ酸も含む(例えば、orf3aアミノ酸配列と、非-orf3aタンパク質又はポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを、含む融合タンパク質)。いくつかの実施形態では、orf3aポリペプチドは、orf3aポリタンパク質又はそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態では、前記orf3aポリペプチドは、表1Kに記載のorf3aアミノ酸配列の、少なくとも8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 又は270個の連続するアミノ酸、を含む、から本質的になる、又は、からなる、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記連続するアミノ酸は、表1Kに記載されるorf3aタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、orf3aポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるorf3aペプチド・エピトープからなる群より選択される1つ以上のペプチド・エピトープ、を含む、から本質的になる、又は、からなる。
いくつかの実施形態では、本出願は、orf7aポリペプチド、及び／又はorf7aポリペプチドをコードする核酸、を提供する。Orf7aポリペプチドは、orf7aポリタンパク質のアミノ酸配列に、及び／又はorf7a特異的な免疫応答を誘発するのに十分な長さのorf7aアミノ酸配列の一部に、対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、orf7aポリペプチドは、前記アミノ酸配列に対応しないアミノ酸も含む（例えば、orf7aアミノ酸配列をと、非-orf7aタンパク質又はポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを、含む融合タンパク質）。いくつかの実施形態では、orf7aポリペプチドは、orf7aポリタンパク質又はそのフラグメントに対応するアミノ酸配列のみを含む。
ある特定の実施形態では、前記orf7aポリペプチドは、表1Kに記載のorf7aアミノ酸配列の、少なくとも8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 又は120個の連続するアミノ酸、を含む、から本質的になる、又は、からなる、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記連続するアミノ酸は、表1Kに記載されるorf7aタンパク質のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、orf7aポリペプチドは、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるorf7aペプチド・エピトープからなる群より選択される1つ以上のペプチド・エピトープ、を含む、から本質的になる、又は、からなる。
当業者には良く知られているように、実質的な配列類似性を有するポリペプチドは、宿主動物において、同一な又は非常に類似した、免疫応答を引き起こすことがある。従って、いくつかの実施形態では、本出願に記載されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチドの、又はそのフラグメントの、誘導体、均等物、バリアント、フラグメント、又は変異体、は、本出願に提供される方法及び組成物に好適であることもある。
いくつかの実施形態では、本出願は、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドの、バリエーション又は誘導体、を提供する。改変したポリペプチドは、例えば、保存的置換によって、改変したアミノ酸配列を有することがあるが、依然として、未改変のタンパク質抗原と反応する免疫応答を誘発する、そして機能的な均等物とみなされる。本出願で使用する場合、用語「保存的置換」は、別の、生物学的に類似した残基によるアミノ酸残基の置換を示す。同じ保存的グループ内のアミノ酸は、典型的には、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼすことなく、互いに置換し得ることは当該技術分野において周知である。ある特定の実施形態によれば、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドのリガンド-結合ドメインの、誘導体、均等物、バリアント、又は変異体、は、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド又はそのフラグメントの配列と、少なくとも85%相同であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、相同性は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又はそれを超えて、である。
本発明によって包含される免疫原性ペプチドは、SARS-CoV-2タンパク質に由来するペプチド・エピトープ、例えば、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、に列挙されるペプチド・エピトープ等、を含むことがある。いくつかの実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、8、9、10、11、12、13、14、又は15アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、前記ペプチドのアミノ酸配列は、改変されている、そしてそれは、保存的な又は非-保存的な、変異を含むことがある。ペプチドは、多くとも、1、2、3、4、又はそれを超えた、変異を含むことがある。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも、1、2、3、4、又はそれを超えた、変異を含むことがある。
いくつかの実施形態では、ペプチドを化学的に修飾することがある。例えば、ペプチドを変異させて、ペプチド特性（例えば、検出可能性、安定性、体内分布、薬物動態、半減期、表面電荷、疎水性、コンジュゲーション部位、pH、機能、等）を改変することがある。N-メチル化は、本発明によって包含されるペプチドにおいて起こり得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドを、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる、還元性メチル化等による、遊離アミン上のメチル化によって、修飾することがある。
化学的な改変は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレン・グリコール、バイオポリマー、両性ポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Fc領域、パルミチン酸若しくはミリストレイン酸等の単飽和炭素鎖、又はアルブミン、を含むことがある。ペプチドのFc領域による化学的な改変は、融合Fc-ペプチドであることがある。ポリアミノ酸としては、例えば、単一アミノ酸が反復するポリ・アミノ酸配列(例えば、ポリ・グリシン)、及びパターンに従っていることもある、若しくは従っていないこともある、入り混じったポリ・アミノ酸配列を有するポリ・アミノ酸配列、又は前述の任意の組み合わせ、を挙げることができる。いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるペプチドを改変して、その改変が、前記ペプチドの、安定性及び／又は半減期、を増大させることがある。いくつかの実施形態では、疎水性部分構造のアタッチメント(attachment)、例えば、N末端への、C末端への、又は内部アミノ酸へのアタッチメント(attachment)を利用して、本発明によって包含されるペプチドの半減期を延ばすことがある。他の実施形態では、ペプチドは、例えば、血清半減期に影響を及ぼし得る、翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／又はアミド化）を含むことがある。いくつかの実施形態では、（例えば、ミリストイル化及び／又はパルミチル化によって）簡単な炭素鎖を前記融合タンパク質又はペプチドにコンジュゲートすることがある。いくつかの実施形態では、前記簡単な炭素鎖によって、前記融合タンパク質又はペプチドは、コンジュゲートしていない物質から、容易に分離可能になることがある。例えば、前記融合タンパク質又はペプチドを、コンジュゲートしていない物質から分離する為に使用することがある方法としては、限定されるものではないが、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィ、が挙げられる。脂溶性の部分構造によって、血清アルブミンへの可逆的結合を介して、半減期が延びることがある。コンジュゲートした部分構造は、血清アルブミンへの可逆的結合を介して、ペプチドの半減期を延ばす脂溶性の部分構造であることがある。いくつかの実施形態では、前記脂溶性の部分構造は、コレステロール又はコレステロール誘導体、例えば、コレステン類、コレスタン類、コレスタジエン類及びオキシステロール類、等、であることがある。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、ミリスチン酸(テトラデカン酸)又はその誘導体、にコンジュゲートすることがある。他の実施形態では、ペプチドは、半減期を改変する薬剤にカップリング（例えば、コンジュゲート）することがある。半減期を改変する薬剤としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ポリマー、ポリエチレン・グリコール(PEG)、ヒドロキシエチル・デンプン、ポリビニル・アルコール、水溶性ポリマー、両性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ(アミノ酸)、プロリン、アラニン、及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Fc領域、脂肪酸、パルミチン酸、又はアルブミンに結合する分子。いくつかの実施形態では、スペーサー又はリンカーは、ペプチドに、カップリングすることがあり、例えば、別の分子へのコンジュゲート又は融合を容易にする為に、及びそのようなコンジュゲートした又は融合した分子からのペプチドの切断を容易にする為に、スペーサー又はリンカーとして働く、1、2、3、4、又はそれより多くの、アミノ酸残基等、である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質又はペプチドは、例えば、前記ペプチドの特性を改変することができる他の部分構造に、又は変化させることができる他の部分構造に、コンジュゲートすることがある。
ペプチドを、イメージング、研究、治療、セラノスティクス(theranostics)、医薬品、化学療法、キレート療法、ターゲット化した薬物送達、及び放射線療法、において使用する薬剤に、コンジュゲートすることがある。いくつかの実施形態では、ペプチドを、検出可能な薬剤、例えば、蛍光色素分子、近-赤外色素、造影剤、ナノ粒子、含金属ナノ粒子、金属キレート、X-線造影剤、PET剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート化剤、又はイメージングに使用することがある別の好適な物質、と、コンジュゲートすることがある、又は融合することがある。いくつかの実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれより多く、の検出可能な部分構造を、ペプチドに連結することがある。放射性同位体の非-限定的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記金属又は放射性同位体を、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウム、からなる群より選択する。いくつかの実施形態では、前記金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、又はイットリウム、である。いくつかの実施形態では、前記放射性同位体は、アクチニウム-225又は鉛-212である。いくつかの実施形態では、前記近-赤外色素は、生物学的な組織及び流体によって容易にクエンチ(quench)しない。いくつかの実施形態では、前記蛍光色素分子は、650 nmと4000 nmとの間の波長で、電磁波を放出する蛍光薬剤であり、そのような電磁波を利用して、そのような薬剤を検出する。コンジュゲート分子として使用することがある蛍光色素の非-限定的な例としては、DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800、又はインドシアニン・グリーン(ICG)、が挙げられる。いくつかの実施形態では、しばしば、近赤外色素として、シアニン色素(例えば、Cy7、Cy5.5、及びCy5)が挙げられる。本発明にによって包含されるコンジュゲート分子として使用する為の蛍光色素に関する追加の非-限定的な例としては、アクラジン・オレンジ又はイエロー(acradine orange or yellow)、Alexa Fluors(例えば、Alexa Fluor 790、750、700、680、660、及び647)並びにそれらの任意の誘導体、7-アクチノマイシンD、8-アニリノナフタレン-1-スルホン酸、ATTO色素及びその任意の誘導体、オーラミン-ローダミン染色剤及びその任意の誘導体、ベンサントロン（bensantrhone）、ビマン、9-10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、5,12-ビス(フェニルエチニル)ナタセン（5,12-bis(phenylethynyl)naththacene）、ビスベンズイミド、ブレインボウ（brainbow）、カルセイン、カルボディフルオレセイン(carbodyfluorescein )及びその任意の誘導体、1-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン及びその任意の誘導体、DAPI、DiOC6、DyLight Fluors及びその任意の誘導体、エピコッコノン(epicocconone)、エチジウム・ブロマイド、FlAsH-EDT2、Fluo色素及びその任意の誘導体、FluoProbe及びその任意の誘導体、フルオレセイン及びその任意の誘導体、Fura及びその任意の誘導体、GelGreen及びその任意の誘導体、GelRed及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及びその任意の誘導体、例えば、mCherry等のmアイソフォーム・タンパク質及びその任意の誘導体、ヘタメチン色素（hetamethine dye）及びその任意の誘導体、ヘキスト染色（hoeschst stain）、イミノクマリン（iminocoumarin）、インディアン・イエロー（indian yellow）、indo-1及びその任意の誘導体、ラウルダン（laurdan）、ルシファー・イエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、ルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ナイル色素及びその任意の誘導体、ペリレン（perylene）、フロキシン、フィコ色素（phyco dye）及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、リボグリーン、RoGFP、ルブレン、スチルベン及びその任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、SYBR及びその任意の誘導体、シナプト-フルオニン（synapto-pHluorin）、テトラフェニル・ブタジエン、トリス四ナトリウム（tetrasodium tris）、テキサス・レッド、チタン・イエロー、TSQ、ウンベリフェロン（umbelliferone）、ビオラントロン（violanthrone）、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein）及びYOYO-1、が挙げられる。他の好適な蛍光色素としては、限定されるものではないが、フルオレセイン及びフルオレセイン色素（例えば、フルオレセイン・イソチオシアニン又はFITC、ナフトフルオレセイン、4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン又はFAM、等)、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル系色素、オキソノール色素、フィコエリスリン（phycoerythrin）、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル-ローダミン又はTAMRA、カルボキシルローダミン6G、カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、リサミン・ローダミンB、ローダミン6G、ローダミン・グリーン（rhodamine Green）、ローダミン・レッド（rhodamine Red）、テトラメチルローダミン(TMR)、等)、クマリン及びクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン(AMCA)、等)、オレゴン・グリーン（Oregon Green）色素（例、Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514、等)、テキサス・レッド（Texas Red）、テキサス・レッド（Texas Red）-X、スペクトラム・レッド（SPECTRUM RED）、スペクトラム・グリーン（SPECTRUM GREEN）、シアニン色素（例えば、CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5、等)、Alexa Fluor色素（例えば、Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680、等)、BODIPY 色素（例えば、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、 BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、等)、IRD色素（例えば、IRD40、IRD700、IRD800、等)、等が挙げられる。更なる好適な検出可能な薬剤は、PCT/US14/56177に記載されている。放射性同位体の非-限定的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記金属又は放射性同位体を、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウム、からなる群より選択する。いくつかの実施形態では、前記金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、又はイットリウムである。いくつかの実施形態では、前記放射性同位体は、アクチニウム-225又は鉛-212である。
ペプチドを、放射線増感剤又は光増感剤にコンジュゲートすることがある。放射線増感剤としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体（例えば、5-フルオロデオキシウリジン等のハロゲン化プリン又はピリミジン)。光増感剤の例としては、限定されるものではないが、照射した場合に熱を生成する蛍光分子又はビーズ、ナノ粒子、ポルフィリン類及びポルフィリン誘導体類（例えば、クロリン類、バクテリオクロリン類、イソバクテリオクロリン類、フタロシアニン類、及びナフタロシアニン類)、メタロポルフィリン類、メタロフタロシアニン類、アンゲリシン類、カルコゲンアピリリウム色素（chalcogenapyrrillium dyes）、クロロフィル類、クマリン類、フラビン類並びにアロキサジン及びリボフラビン等の関連化合物、フラーレン類、フェオホルビド類、ピロフェオホルビド類、シアニン類（例えば、メロシアニン540）、フェオフィチン類、サフィリン類、テキサフィリン類、プルプリン類、ポルフィセン類、フェノチアジニウム類、メチレン・ブルー誘導体、ナフタルイミド類、ナイル・ブルー誘導体、キノン類、ペリレンキノン類（例えば、ヒペリシン類、ヒポクレリン類、及びセルコスポリン類)、ソラレン類、キノン類、レチノイド類、ローダミン類、チオフェン類、ベルジン類、キサンテン色素（例えば、エオシン類、エリスロシン類、ローズ・ベンガル類）、ポルフィリン類の二量体及びオリゴマー体、並びに5-アミノレブリン酸のようなプロドラッグ、が挙げられる。有利なことに、この手法によって、治療薬剤(例えば、薬物)及び電磁気的なエネルギー(例えば、照射又は光)の両方を同時に使用して、関心とする細胞(例えば、免疫細胞)を、非常に特異的にターゲット化することが可能になる。いくつかの実施形態では、前記ペプチドを、例えば、直接的に又はリンカーを介して、前記薬剤と融合する、又は共有結合的に若しくは非-共有結合的に連結する。
ペプチドを、組み換え的に又は合成的に、例えば、固相ペプチド合成又は液相ペプチド合成、等によって、生成することがある。ペプチド合成を、既知の合成方法によって、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を使用して、又はブチルオキシカルボニル(Boc)化学によって、実施することがある。ペプチド・フラグメントを、酵素的に又は合成的に、一緒に連結することがある。
いくつかの実施形態では、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸、又はそのフラグメント、例えば、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードするDNA分子、を、本出願は提供する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム（open reading frame）、又はそのフラグメント、を含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、前記オープン・リーディング・フレームの発現に必要な調節エレメントを含む。このようなエレメントとして、例えば、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル、を挙げることができる。更に、エンハンサーを挙げることができる。これらの要素を、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする配列、又はそのフラグメント、に作動可能に連結することができる。
プロモーターの例としては、限定されるものではないが、サル・ウイルス40(Simian Virus 40 (SV40))、マウス乳がんウイルス(Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV))プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodeficiency Virus (HIV))、例えば、HIV 長い末端反復(Long Terminal Repeat(LTR))プロモーター等、モロニー・ウイルス、サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus (CMV))、例えば、CMV最初期プロモーター(CMV immediate early promoter)、エプスタイン・バー・ウイルス(Epstein Barr Virus (EBV))、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma Virus (RSV))、由来のプロモーター、並びに、例えば、ヒト・アクチン、ヒト・ミオシン、ヒト・ヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒト・メタロチオネイン、等のヒト遺伝子由来のプロモーター、が挙げられる。好適なポリアデニル化シグナルの例としては、限定されるものではないが、SV40ポリアデニル化シグナル及びLTRポリアデニル化シグナル、が挙げられる。
発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントが前記核酸分子に含まれることもある。そのような付加的な要素としては、エンハンサーが挙げられる。エンハンサーとしては、本明細書に上記されるプロモーターが挙げられる。好ましいエンハンサー／プロモーターとしては、例えば、ヒト・アクチン、ヒト・ミオシン、ヒト・ヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、並びにCMV、RSV及びEBV由来のウイルス・エンハンサー等のウイルス・エンハンサー、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記核酸を、単独で使用することがある（例えば、裸のそのままの核酸(naked nucleic acids)として）、又は、以下に更に記載されるように、担体又は送達ベクターに、作動可能に組み込むことがある。有用な送達ベクターとしては、限定されるものではないが、生分解性マイクロカプセル、免疫-刺激複合体(immuno-stimulating complexes (ISCOMs))又はリポソーム、及びウイルス若しくはバクテリア等の、遺伝子操作をした、弱毒化した生物担体、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルス・ベクター、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペス・ウイルス、アデノウイルス、アデノ-随伴ウイルス、ワクシニア・ウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、AV-痘、改変ワクシニア・アンカラ(modified vaccinia Ankara (MVA))、及び他の組み換えウイルス、等、である。例えば、レンチウイルス・ベクターを用いて、T細胞に感染させることがある。
III. 核酸、ベクター、及び細胞
本発明の更なる目的は、記載された免疫原性ポリペプチド、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びそのフラグメント、MHC分子、並びにTCR及びそのフラグメント、をコードする核酸配列に関する。いくつかの態様では、細胞内での抗原発現のために、最適な免疫優性エピトープを中にパッキングすることによって、T細胞応答の有効性に対してベクターのサイズを最大化する核酸ベクター構築物を、本出願は開示する。一般的に、以下に更に記載するように、本発明によって包含される核酸は、裸のそのままであるか、又はベクター内に組み込まれるか、に関わらず、直接的なワクチン構築物(又はそれらを作製するために使用されるベクター)［例えば、mRNA(又はmRNAを生成するin vitro転写発現ベクター)、DNAワクチンとして使用するための哺乳動物発現ベクター、等］であることがある。本発明によって包含される核酸は、ヒト対象の中で高発現させる等の特定の目的のために、コドンが最適化されることがある。本発明によって包含される核酸を操作して、高い、グアニン及びシトシン（G-C）含有量、例えば、60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%,若しくはそれを超えた同一性、又は、間の、包括的な、任意の範囲、例えば、60-70%のG-C含有量等、を有することがある。
特定の実施形態では、本発明は、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸配列、に関する。特定の実施形態では、本発明は、本出願に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列、に関する。
典型的には、前記核酸は、DNA(例えば、cDNA)又はRNA(例えば、mRNA)分子である、これらは、基本的なものであることがある、又は好適なベクター（例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、ウイルス、若しくはウイルス・ベクター、等）に含まれることがある。
そのような基本的な核酸は、「一次構築物」（例えば、一次mRNA構築物等、これは、ポリヌクレオチド転写物［これは、関心とする1種以上のポリペプチドをコードする、及びその中にコードされる関心とするポリペプチドに翻訳されることを可能にするのに十分な、構造的な及び／又は化学的な特徴、を保持する］を指す）であってもよい。構造的に又は化学的に改変を受けた場合、前記一次構築物は、改変したmRNA等の改変した核酸、と呼ばれることがある。核酸構築物は、ポリペプチドをコードする配列に加えて、配列（例えば、当該技術分野で周知のキャッピング配列、尾部配列(tailing sequence)、環化配列等）を含むことがある。例えば、尾部配列は、不存在から500ヌクレオチド長までの範囲であることがある（例えば、少なくとも60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、又は500ヌクレオチド)。その尾部領域がポリA尾部である場合、その長さは、ポリA結合タンパク質結合の、単位で、又は、に応じて、決まることがある。この実施形態では、前記ポリA尾部は、ポリA結合タンパク質の少なくとも4つの単量体に結合するのに十分な長さである。ポリA結合タンパク質単量体は、約38ヌクレオチドの幅に結合する。従って、約80ヌクレオチドの及び160ヌクレオチドのポリAテールは、機能的であることが観察されている。キャッピング領域は、単一のキャップを、又は前記キャップを形成する一連のヌクレオチドを、含むことがある。この実施形態では、前記キャッピング領域は、1から10まで（例えば、2-9、3-8、4-7、1-5、5-10、若しくは少なくとも2、又は10以下のヌクレオチド長）であることがある。いくつかの実施形態では、前記キャップは不存在である。従って、本発明によって包含される核酸は、2から40までの、又はそれを超えた、例えば、2-19、2-28等の、タンパク質コード領域を含むことがある、及び本出願に記載される1つ以上の付加的な要素、例えば、開始及び／又は終止コドン、翻訳配列、配列内リボソーム進入配列（internal ribosomal entry sequence）、タンパク質切断配列、シグナル配列、キャッピング配列、尾部配列、制限酵素配列(restriction sequence)、自己複製配列、等、を更に含むことがある。いくつかの実施形態では、本発明によって包含される核酸は、当該技術分野で周知の、化学的な、酵素的な、及び／又はリボザイム触媒による、方法によって、環化されることがある、及び／又はコンカテマー化されることがある。新たに形成された5'-/3'-結合は、分子内又は分子間、であることがある。
いくつかの実施形態では、本出願によって包含される核酸は、自己複製性、例えば、自己複製RNA様mRNA、である。RNAは、大量に生産するのに費用効率が高い、及びRNAは、任意の所与の発見された配列から、商業的に合成されたDNA前駆体から、ほぼ同じ日という速さで、エンドトキシンを含まずに生成することができる。RNAは、DNAよりも安全かつ容易に投与することができる、何故なら、RNAは、ゲノム・インテグレーションのリスクをもたらさない、及び機能するために細胞の細胞質へのアクセスを必要とするだけである、からである。更に、アルファウイルスの又はフラビウイルスのゲノムに基いた自己複製RNA(repRNA)を利用することができるために、非常に低い用量を使用して、最大の免疫原性及び抗原産生レベルを達成することができる。いくつかの実施形態では、repRNAは、後代ビリオンを産生する為に必要なウイルス構造タンパク質を欠く弱毒化ウイルス・ゲノムである、しかし、翻訳及び複製の能力を保持する、そしてそれ故に、RNAの翻訳の半減期を効果的に増大させることができる。例えば、1つ以上の外因性遺伝子をコードするRepRNAを細胞に送達すると、前記細胞における外因性遺伝子の翻訳及び発現を、1つ以上の外因性遺伝子をコードする等モル量の従来のmRNAを細胞に送達することから生じるものと比較して、効果的に増大させることができる。いくつかの実施形態では、前記RepRNAは、非-細胞-病原性RepRNAである。いくつかの実施形態では、前記repRNAは、アルファウイルスの自己増幅性repRNA［例えば、5'キャップ；5'非翻訳領域(5' UTR)、第1のオープン・リーディング・フレーム内にコードされる非-構造遺伝子(例えば、NSP1-4)、ゲノム・プロモーター領域(例えば、26Sサブ-ゲノム・プロモーター)、第2のオープン・リーディング・フレーム、3'非翻訳領域(3' UTR)及び3'ポリ-アデニル化尾部、等を含む］である。repRNA分子は、コードされる遺伝子配列のサイズに応じて、典型的には、9,000と20,000ヌクレオチド長との間である。非-構造遺伝子は、RNA-依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)をコードする。典型的には、前記RdRpは、エンドヌクレオース及び自己触媒分解に対して従来のRNAを保護するために使用される古典的ヌクレオチド改変を許容しない。従って、ナノ-カプセル化（例えば、ナノ粒子、脂質、脂質ナノ粒子、カチオン性分子、ポリマー、等）を、発現プラットフォームを効果的に展開するために、使用することがある。repRNAは、変調因子である、及びオープン・リーディング・フレームを操作して、関心とする外因性配列を収容することができる。前記repRNAが宿主細胞の細胞質に置かれると、repRNA NS遺伝子によってコードされるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)が、前記細胞内で発現する。そして、前記RdRpは、repRNA全体、又はrepRNAがコードする抗原のRdRpコピーのみ、を複製することができる（即ち、サブ-ゲノム・プロモーターによって）。レプリコンRNAは、RNA-媒介の遺伝子送達の全般的な有効性を増大させる、なぜなら、前記repRNAは、全長レプリコンのコピーをより多く合成することができる、並びに前記第2のオープン・リーディング・フレーム内に含まれる遺伝子をコードするmRNAのコピーをより多く合成することができる、からである。宿主細胞リボソームは、全長レプリコン・コピー、又はより短い抗原のみのmRNA、を翻訳し続け、前記repRNAによってコードされる遺伝子の発現の増強をもたらす。
タンパク質産生を更に増強するために、本発明によって包含される核酸を、他のポリヌクレオチド、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラレン及びマイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、及びサフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン及びジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、MPEG2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、及び葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質(例えば、糖タンパク質)、又はペプチド(例えば、共-リガンドに対する特異的な親和性を有する分子)、又は抗体(例えば 、抗体、これは、がん細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞等の特定の細胞型に結合する)、ホルモン及びホルモン・レセプター、並びに／又は非-ペプチド種(例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、及び薬物)、にコンジュゲートするように設計することがある。本発明によって包含される核酸の代表的な例は、本出願、例えば、実施例及び図面等、において、記載される、並びに当該技術分野において周知である(少なくとも米国特許出願公開第2020/0354423号、米国特許出願公開第2020/0254086号、及び米国特許出願公開第2020/0155660号を参照されたい)。
用語「ベクター」、「クローニング・ベクター」及び「発現ベクター」は、DNA又はRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞の中に導入することができ、その結果、その宿主を形質転換し、その導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)を促進する、ことができる媒体、を意味する。従って、本発明によって包含される更なる目的は、本発明によって包含される核酸を含むベクター、に関する。
そのようなベクターは、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネータ―等、を含み、対象への投与時に前記ポリペプチドの発現を、引き起こす、又は指令を出す、ことがある。動物細胞の発現ベクターに用いられるプロモーター及びエンハンサーの例としては、SV40の初期プロモーター及びエンハンサー(Mizukami T. et al. 1987)、モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRプロモーター及びエンハンサー(Kuwana Y et al. 1987)、免疫グロブリンH鎖のプロモーター(Mason J O et al. 1985)及びエンハンサー(Gillies S D et al. 1983)等、が挙げられる。
動物細胞の為の任意の発現ベクターを使用することができる。好適なベクターの例としては、pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 ベータ d2-4-(Miyaji H et al. 1990)等、が挙げられる。プラスミドの他の代表的な例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は例えば、pUC、pcDNA、pBR等の組み込みプラスミド（integrative plasmid）、が挙げられる。ウイルス・ベクターの代表的な例としては、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペス・ウイルス、及びAAV、のベクター、が挙げられる。そのような組み換えウイルスを、当該技術分野で既知の技術、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクションすることによって、又はヘルパー・プラスミド若しくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションによって、産生することがある。ウイルス・パッケージング細胞の典型的な例としては、PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv-ポジティブ細胞、293細胞等、が挙げられる。そのような複製-欠損の組み換えウイルスを産生する為の詳細なプロトコルは、例えば、WO 95/14785, WO 96/22378, 米国特許第5,882,877号, 米国特許第6,013,516号, 米国特許第4,861,719号, 米国特許第5,278,056号, 及びWO 94/19478、の記載に見出すことができる。いくつかの実施形態では、ウイルス・ベクター-ベースのプラットホームを使用することがある。代表的な非-限定的な例としては、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス、及びレンチウイルス、が挙げられ、例えば、限定されるものではないが、第2世代の、第3世代の、又はハイブリッド第2／第3世代のレンチウイルス、及び、特異的な細胞型又はレセプターをターゲット化するように設計された任意の世代の組み換えレンチウイルス、が挙げられる（少なくとも、Hu et al. (2011) Immunol Rev. 239:45-61, Sakuma et al. (2012) Biochem J. 443:603-618, Cooper et al. (2015) Nucl. Acids Res. 43:682-690, Zufferey et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880, 及び米国特許出願公開2020/0010849、を参照）。
本発明の更なる目的は、本発明に係る、核酸及び／又はベクターによって、トランスフェクションされた、感染を受けた、又は形質転換された、細胞に関する。用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性の又は細胞外の）遺伝子、DNA又はRNA配列の導入を意味し、その結果、前記宿主細胞は、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、前記導入された遺伝子又は配列によってコードされる、タンパク質又は酵素、を産生する。導入されるDNA又はRNAを受け取り、発現する宿主細胞は、「形質転換されている」。
本発明によって包含される核酸を使用して、好適な発現システムにおいて、本発明によって包含される組み換えポリペプチドを産生することがある。用語「発現システム」は、例えば、前記ベクターによって運ばれた、及び前記宿主細胞に導入された外来DNAがコードするタンパク質を発現する為の、好適な条件下にある、宿主細胞及び適合性ベクター、を意味する。
よくある発現システムとしては、E.coli（大腸菌）宿主細胞及びプラスミド・ベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルス・ベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクター、が挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されるものではないが、原核生物細胞（例えば、バクテリア等）及び真核生物細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）、が挙げられる。具体的な例としては、大腸菌、クルイベロミセス又はサッカロミセス酵母（Kluyveromyces or Saccharomyces yeasts）、哺乳動物細胞株(例えば、Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞、等)、並びに初代又は確立された哺乳動物細胞培養物(例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、等から産生される)、が挙げられる。例としてはまた、マウスSP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、マウスP3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(以下、「DHFR遺伝子」という)を欠損しているCHO細胞（Urlaub G et al.;1980）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL 1662、以下、「YB2/0細胞」という）、等が挙げられる。前記YB2/0細胞は好適である、何故なら、この細胞において発現される場合に、キメラ抗体又はヒト化抗体のADCC活性が、増強されるからである。
本発明はまた、本発明に係る、本発明によって包含される、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びそのフラグメント、MHC分子、並びにTCR及びそのフラグメント、を発現する組み換え宿主細胞を産生する方法に関する、ここで、前記方法は、以下からなるステップを含む、(i)上記のような組み換え核酸又はベクターを、コンピテントな宿主細胞(competent host cell)の中に、in vitro又はex vivoで導入するステップ、(ii)取得した組み換え宿主細胞を、in vitro又はex vivoで培養するステップ、並びに(iii)任意選択的に、前記SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びそのフラグメント、MHC分子、並びにTCR及びそのフラグメント、を発現する細胞を選択するステップ。そのような組み換え宿主細胞を、本発明によって包含される、診断方法に、予後予測方法に、及び／又は治療方法に、使用することができる。
別の態様では、本発明は、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、本出願に開示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする、単離された核酸を提供する。従って、この実施形態のポリヌクレオチドを、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を、単離する為に、検出する為に、及び／又は定量する為に、使用することがある。例えば、本発明によって包含されるポリヌクレオチドを使用して、保管ライブラリ中の、部分的クローン又は全長クローンを、同定する、単離する、又は増幅する。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ヒトの又は哺乳動物の核酸ライブラリ由来であるcDNA、から単離された、又はその他、に対して相補的な、ゲノム配列又はcDNA配列、である。好ましくは、そのcDNAライブラリは、少なくとも80%の完全長配列、好ましくは、少なくとも85%又は90%の完全長配列、及びより好ましくは、少なくとも95%の完全長配列を含む。前記cDNAライブラリを正規化して、稀な配列が表現されることを増大させる。低ストリンジェンシーな又は中ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、しかし排他的ではなく、相補的配列との比較で低い配列同一性を有する配列で、使用される。中ストリンジェンシーな及び高ストリンジェンシーな条件を、より高い同一性に関する配列の為に、任意選択的に使用することができる。低ストリンジェンシーな条件は、約70%の配列同一性を有する配列に関する選択的なハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガスな（orthologous）配列又はパラロガスな（paralogous）配列を同定する為に使用されることがある。任意選択的に、本発明によって包含されるポリヌクレオチドは、本出願に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一部をコードする。本発明によって包含されるポリヌクレオチドは、本発明によって包含される抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的なハイブリダイゼーションの為に用いることができる核酸配列、を包含する（例えば、上掲のAusubel、及び上掲のColliganを参照されたい、各々の全体が本出願に参照により取り込まれる）。
IV. MHC-ペプチド複合体
ある特定の態様では、本出願は、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ペプチド及びMHC分子、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記SARS-CoV-2免疫原性ペプチドは、MHC分子と、安定な複合体を形成する。
本発明によって包含される、組成物及び方法において、提供される及び使用されるMHCタンパク質は、当該技術分野で既知の任意の好適なMHC分子であることがある。一般に、それらは式(α-β-P)nを有する、ここで、nは少なくとも2、例えば、2-10、例えば、4、である。αは、クラスI又はクラスII MHCタンパク質のα鎖である。βは、β鎖である、本出願では、クラスII MHCタンパク質のβ鎖、又はMHCクラスIタンパク質のためβ2ミクログロブリンのβ鎖、として定義される。Pは、ペプチド抗原である。
いくつかの実施形態では、前記MHCタンパク質は、MHCクラスI複合体、例えば、HLA I複合体である。
前記MHCタンパク質は、任意の哺乳動物又はトリ種、例えば、霊長類種、特にヒト；げっ歯類、例えば、マウス、ラット及びハムスター等；ウサギ；ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、等、に由来することがある。例えば、前記MHCタンパク質は、ヒトHLAタンパク質又はマウスH-2タンパク質、に由来することがある。HLAタンパク質としては、クラスIIサブユニットHLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα及びHLA-DRβ、並びにクラスIタンパク質HLA-A、HLA-B、HLA-C及びβ2-ミクログロブリン、が挙げられる。H-2タンパク質としては、クラスIサブユニットH-2K、H-2D、H-2L、並びにクラスIIサブユニットI-Aα、I-Aβ、I-Eα及びI-Eβ、並びにβ2-ミクログロブリン、が挙げられる。いくつかの代表的なMHCタンパク質の配列は、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, pp724-815、に見出すことができる。本発明に係る使用に好適なMHCタンパク質サブユニットは、普通は膜結合しているタンパク質の可溶型である、これは、当該技術分野で知られているように調製される（例えば、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの欠失による）。
クラスIタンパク質の場合、可溶型は、α1、α2及びα3ドメイン、を含むことがある。可溶性クラスIIサブユニットとしては、αサブユニットについてはα1及びα2ドメイン、並びにβサブユニットについてはβ1及びβ2ドメイン、が挙げられる。
前記α及びβサブユニットを、別々に生成し、安定なヘテロ二重鎖複合体を形成するようにin vitroで会合させることができる、又は前記サブユニットの両方を単一の細胞で発現させることがある。MHCサブユニットを生成するための方法は、当該技術分野において既知である。
ある特定の実施形態では、前記MHC-ペプチド複合体は、表1Aより選択されるペプチド・エピトープ、並びにMHC（このMHCのアルファ鎖は、HLA-A*02血清型、例えば、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, 及び／又はHLA-A*0274対立遺伝子、によってコードされる血清型等、を有する）、を含む。他の実施形態では、前記MHC-ペプチド複合体は、表1Cより選択されるペプチド・エピトープ、並びにMHC（このMHCのアルファ鎖は、HLA-A*03血清型、例えば、HLA-A*0301、HLA-A*0302、HLA-A*0305、及び／又はHLA-A*307対立遺伝子、によってコードされる血清型等、を有する）、を含む。更に他の実施形態では、前記MHC-ペプチド複合体は、表1Bより選択されるペプチド・エピトープ、並びにMHC（このMHCのアルファ鎖は、HLA-A*01血清型、例えば、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、及び／又はHLA-A*116対立遺伝子、によってコードされる血清型等、を有する）、を含む。更に他の実施形態では、前記MHC-ペプチド複合体は、表1Dより選択されるペプチド・エピトープ、並びにMHC（このMHCのアルファ鎖は、HLA-A*11血清型、例えば、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104、HLA-A*1105、及び／又はHLA-A*1119対立遺伝子、によってコードされる血清型等、を有する）、を含む。他の実施形態では、前記MHC-ペプチド複合体は、表1Eより選択されるペプチド・エピトープ、並びにMHC（このMHCのアルファ鎖は、HLA-A*24血清型、例えば、HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, 及び／又はHLA-A*2458 対立遺伝子、によってコードされる血清型等、を有する）、を含む。更に他の実施形態では、前記MHC-ペプチド複合体は、表1Fより選択されるペプチド・エピトープ、並びにMHC（このMHCのアルファ鎖は、HLA-A*07血清型、例えば、HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び／又はHLA-B*0721 対立遺伝子、によってコードされる血清型等、を有する）、を含む。
前記MHC-ペプチド複合体を調製するために、前記サブユニットを抗原性ペプチドと組み合わせ、in vitroで折り畳まれるようにして、鎖内ジスルフィド結合ドメインを有する安定なヘテロダイマー複合体を形成させることができる。前記ペプチドは、最初のフォールディング反応に含まれることがある、又は後のステップにおいて、空のヘテロダイマーに添加されることがある。本発明によって包含される組成物及び方法では、これは、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド又はそのフラグメントである。前記サブユニット及びペプチドの、フォールディング及び会合を可能にする条件は、当該技術分野において既知である。一例として、ほぼ等モル量の可溶化α及びβサブユニットを、尿素の溶液中で混合することがある。リフォールディングは、尿素を含まない緩衝溶液への希釈又は透析によって、開始する。ペプチドを、約pH5から5.5で、約1から3日間、空のクラスIIヘテロダイマーの中へ搭載し、その後、中和、濃縮、及びバッファー交換を行う。しかしながら、その特定のフォールディング条件は、本発明を実施することにとって重要ではない。
単量体複合体(α-β-P)（本出願の単量体）を、例えば、MHC四量体に、多量体化することがある。得られる多量体は、長期間にわたって安定である。好ましくは、前記多量体を、当該技術分野で既知なように（例えば、米国特許第5,635,363号に記載されているように）、α又はβサブユニット上の特異的なアタッチメント(attachment)部位を介して、多価のエンティティ（entity）に前記単量体を結合させることによって、形成することがある。前記MHCタンパク質を、それらの単量体又は多量体のいずれかで、ビーズに又は任意の他の保持体に、コンジュゲートすることもある。
多量体複合体を標識することがある、その結果、当該技術分野で既知の免疫染色又は他の方法で使用する場合に、直接的に検出可能になる、又は、当該技術分野で既知のように、前記複合体に特異的に結合する(例えば、MHCタンパク質サブユニットに結合する)二次標識免疫試薬と併せて使用することがある。例えば、検出可能な標識は、蛍光色素分子、例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサス・レッド(Texas Red)、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)、Brilliant VioletTM 421、Brilliant UVTM 395、Brilliant VioletTM 480、Brilliant VioletTM 421(BV421)、Brilliant BlueTM 515、APC-R700、又はAPC-Fire750、等、であることがある。いくつかの実施形態では、前記多量体複合体を、別の部分構造に特異的に結合することができる部分構造によって、標識する。例えば、前記標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオチド、又はリガンド、であることがある。関心とする他の標識としては、蛍光色素、色素、酵素、化学発光体、微粒子、放射性同位体、又は他の直接的に若しくは間接的に検出可能な剤、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞表面上に、MHC分子の中の免疫原性ペプチドを提示する細胞を、組み換えの又はヘテロな抗原をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルス・ベクター)を、前記細胞の中に、トランスフェクションする又は形質導入する、ことによって、生成する。いくつかの実施形態では、条件（1つ以上のペプチド抗原が、ある場合には、発現したヘテロなタンパク質の1つ以上のペプチド抗原が、前記細胞によって発現する、プロセシングを受ける、及び主要組織適合性遺伝子複合体（major histocompatibility complex (MHC)）分子の中で、前記細胞の表面上に提示される、条件）下で、前記ベクターを、前記細胞の中に導入する。
一般的に、前記ベクターを接触させる細胞は、MHCを発現する細胞、即ち、MHC-発現細胞、である。前記細胞は、その細胞表面上にMHCを普通に発現する細胞であることがある、即ち、その細胞表面上にMHCの発現を、発現するように、及び／又は上方制御するように、誘導される細胞、又はその細胞表面上にMHCを発現するように操作された細胞、であることがある。いくつかの実施形態では、前記MHCは、ある場合には、ポリペプチドのペプチド抗原（例えば、細胞装置によってプロセシングを受けたペプチド抗原等）と複合体を形成することができる、多型ペプチド結合部位又は結合溝、を含む。いくつかの場合では、MHC分子は、T細胞上のTCR、又は他のペプチド結合分子、によって認識可能なコンフォメーションでの抗原の提示のために、例えば、ペプチドとの複合体（即ち、MHC-ペプチド複合体）として、前記細胞表面上に、提示されることがある、又は発現することがある。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、有核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、抗原-提示細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、内皮細胞又は線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、内皮細胞、例えば、内皮細胞株又は初代内皮細胞等、である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、線維芽細胞、例えば、線維芽細胞細胞株又は初代線維芽細胞細胞等、である。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、人工抗原提示細胞（artificial antigen presenting cell (aAPC)）である。典型的には、aAPCは、天然APCの特徴（例えば、MHC分子、刺激性分子及び共刺激性分子、Fcレセプター、接着分子、の発現、及び／又はサイトカイン(例えば、IL-2)を産生する能力若しくは分泌する能力、等）を含む。通常、aAPCは、上記の1つ以上の発現を欠く細胞株である、及び、MHC分子、低親和性Fcレセプター(CD32)、高親和性Fcレセプター(CD64)、1つ以上の共-刺激シグナル(例えば、CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, リンホトキシン・ベータ・レセプター, ILT3, ILT4, 3/TR6 若しくはB7-H3のリガンド；又は、CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Toll リガンド・レセプター若しくはCD83のリガンド、に特異的に結合する抗体), 細胞接着分子 (例えば、ICAM-1 若しくは LFA-3) 並びに／又はサイトカイン（例えば、IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, インターフェロン-アルファ(IFNalpha), インターフェロン-ベータ(IFNbeta), インターフェロン-ガンマ(IFNgamma), 腫瘍壊死因子-アルファ(TNFalpha), 腫瘍壊死因子-ベータ(TNFbeta), 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF), 及び 顆粒球コロニー刺激因子 (GCSF))、の中から、1つ以上のその欠失している要素の導入（例えば、トランスフェクション又は形質導入）によって生成される。いくつかの場合では、aAPCは、MHC分子を通常は発現しない、しかし、操作してMHC分子を発現することがある、又は、いくつかの場合では、サイトカインによる刺激等によって、MHC分子を発現するように誘導されることがある。いくつかの場合において、aAPCはまた、刺激性リガンド（これには、例えば、抗-CD3抗体、抗-CD28抗体又は抗-CD2抗体、が挙げられる）を負荷されることもある。aAPCを生成するための骨格として使用され得る例示的な細胞株は、K562細胞株又は線維芽細胞細胞株、である。種々のaAPCが、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第8,722,400号、公開された出願第US2014/0212446号; Butler and Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1):10. 1111/imr.12129; Suhoshki et al. (2007) Mol. Ther., 15:981-988、を参照）。
細胞が発現する特定のMHC又は対立遺伝子を、決定すること、又は同定することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。いくつかの実施形態では、細胞をベクターと接触させる前に、特定のMHC分子の発現を、例えば、前記特定のMHC分子に対する特異的な抗体を用いることによって、評価することがある、又は確認することがある。MHC分子に対する抗体は、当該技術分野において既知であり、例えば、以下に記載される何れかである。
いくつかの実施形態では、所望のMHC制限条件のMHC対立遺伝子を発現させるために、前記細胞を選択することがある。いくつかの実施形態では、そのMHCタイピングの細胞は、例えば細胞株等、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、MHCタイピングの細胞（例えば、対象から取得した初代細胞等）を、分子ハプロタイプ・アッセイを用いる組織タイピングを行う等（BioTest ABC SSPtray, BioTest Diagnostics Corp., Denville, N.J.; SeCore Kits, Life Technologies, Grand Island, N.Y.）、当該技術分野で周知の手順を用いて、決定することがある。ある場合では、例えば、配列ベースのタイピング(sequence-based typing (SBT))を使用する等によって（Adams et al. (2004) J. Transl. Med., 2:30; Smith (2012) Methods Mol Biol., 882:67-86）、細胞の標準的なタイピングを実施してHLA遺伝子型を決定することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。ある場合には、そのHLAタイピングの細胞、例えば、線維芽細胞等、が知られている。例えば、ヒト胎児肺線維芽細胞細胞株MRC-5は、HLA-A*0201、A29、B13、B44 Cw7(C*702)である；ヒト包皮線維芽細胞細胞株Hs68は、HLA-A1、A29、B8、B44、Cw7、Cw16である；及びWI-38細胞株は、A*6801、B*0801である（Solache et al. (1999) J Immunol, 163:5512-5518; Ameres et al. (2013) PloS Pathog. 9:e1003383）。ヒトのトランスフェクタント線維芽細胞細胞株M1DR1/Ii/DMは、HLA-DR及びHLA-DMを発現する(Karakikes et al. (2012) FASEB J., 26:4886-96)。
いくつかの実施形態では、前記ベクターと接触させる、又は前記ベクターが導入される、細胞は、MHC分子を発現するように、操作される、又はトランスフェクションされる、細胞である。いくつかの実施形態では、親細胞株を遺伝子改変することによって、細胞株を調製することがある。いくつかの実施形態では、前記細胞は、通常、特定のMHC分子を欠損している、及びそのような特定のMHC分子を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、組み換えDNA技術を用いて、遺伝子操作される。
いくつかの実施形態では、本出願に記載の安定なMHC-ペプチド複合体を使用して、安定なMHC-ペプチド複合体に結合するT細胞を検出する。いくつかの実施形態では、本出願に記載される安定なMHC-ペプチド複合体を使用して、例えば、蛍光標識されたMHC-ペプチド複合体に特異的に結合するT細胞(例えば、CD8+ T細胞)の、量及び／又は割合、を検出することによって、対象におけるT細胞応答をモニタリングする。MHC-ペプチド複合体-特異的なT細胞を検出するために、MHC-ペプチド複合体（例えば、MHC-ペプチド四量体）を、生成する、標識する、及び使用する、方法は、当該技術分野で周知である。更なる記載を、例えば、米国特許第7,776,562号；米国特許第8,268,964号；及び米国特許出願公開第2019/0085048号、の中に見出すことができる（その全体が本出願に参照により取り込まれる）。
V. 免疫原性組成物
いくつかの態様では、本出願は、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド、及び／又はSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸、並びにアジュバント、を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）を、提供する。いくつかの態様では、本出願は、免疫原性ペプチド、及び／又は免疫原性ペプチドをコードする核酸、並びにアジュバント、を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）を、提供する。いくつかの態様では、本出願は、MHC分子の中にSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを含む安定なMHC-ペプチド複合体、及びアジュバント、を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）を、提供する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、複数（例えば、2種以上）の、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド、又は核酸、の組み合わせ、及びアジュバント、を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、複数（例えば、2種以上）の、MHC分子の中にSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを含む安定なMHC-ペプチド複合体、及びアジュバント、を含む。いくつかの実施形態では、上述の組成物は、薬学的に許容可能な担体を、更に含む。
本出願に開示される医薬組成物を、固体形態で、又は液体形態で、投与をするするために、特別に製剤化することがある、ここで、前記投与は、例えば、以下の目的に適応させた投与を含む： (1)経口投与、例えば、ドレンチ(drench)（水性の又は非-水性の、溶液又は懸濁液）、タブレット、例えば、頬側の、舌下の、及び全身性の吸収にターゲット化させたもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；又は(2)非経口投与、例えば、滅菌した溶液若しくは懸濁液、又は徐放性製剤、として、例えば、皮下注射投与、筋肉内注射投与、静脈内注射投与、又は硬膜外注射投与、による。
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本出願に記載の、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及び／又は核酸を、アジュバントと、担体と、及び、任意選択的に、1つ以上のアクセサリ成分と、会合させるステップ、を含む。一般的に、前記製剤を、本出願に記載の剤を、液体担体と、若しくは微粉化固体担体と、又はその両方と、均一に且つ密接に、会合させ、次いで、必要ならば、その生成物を成形する、ことによって、調製する。
非経口投与に好適な医薬組成物は、本出願に記載の、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド及び／又は核酸を、アジュバント、並びに1種以上の薬学的に許容可能な、滅菌した等張性の水性の若しくは非水性の溶液、分散液、懸濁液若しくはエマルジョン、と組み合わせて、含む、又は使用直前に滅菌した注射可能な溶液若しくは分散液に再構成することがある滅菌した粉末を、含む、これらは、糖、アルコール、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、製剤を意図するレシピエント(recipient)の血液と等張にする溶質、又は懸濁化剤若しくは増粘剤、を含むことがある。
前記医薬組成物中で使用することがある好適な、水性担体及び非水性担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、等）、及びそれらの好適な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、並びに注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、が挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング物質を使用することによって、分散液の場合には、必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を、維持することがある。
選択される投与経路に関わらず、好適な水和形態で使用することがある、本出願で提供される剤を、及び／又は本出願で開示される医薬組成物を、当業者に既知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化する。
いくつかの実施形態では、記載されている医薬組成物は、対象に投与した場合、SARS-CoV-2に感染している細胞に対する免疫応答を誘発することができる。そのような医薬組成物は、COIVD-19を、予防的に治療する及び／又は治療的に治療する、ためのワクチン組成物として、有用であることがある。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、生理学的に許容されるアジュバントを、更に含む。いくつかの実施形態では、使用されるアジュバントは、前記医薬組成物の免疫原性を増加させる。このような更なる免疫応答刺激化合物又はアジュバントは、(i)前記ペプチドの再構成後に、本発明に係る医薬組成物に混合され、上記で定義された油-ベースのアジュバントで任意選択的に乳化されることがある、(ii)上記で規定された本発明によって包含される再構成組成物の一部であることがある、(iii)再構成するべきペプチドに、物理的に連結することがある、又は(iv)治療するべき対象、哺乳動物又はヒトに別々に投与することがある。前記アジュバントは、抗原の徐放を提供するアジュバントであることがある（例えば、前記アジュバントは、リポソームであることがある）、又は前記アジュバントは、それ自体が免疫原性であり、それによって抗原（即ち、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド中に存在する抗原）と相乗的に機能する、アジュバントであることがある。例えば、前記アジュバントは、既知のアジュバント、又は、抗原取り込みを促進する、免疫システム細胞を投与部位に動員する、若しくは応答するリンパ系細胞の免疫活性化を促進する、他の物質、であることがある。アジュバントとしては、限定されるものではないが、免疫調節分子（例えば、サイトカイン）、油及び水エマルジョン、水酸化アルミニウム、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクト-アジュバント（Bacto-Adjuvant）、合成ポリマー（例えば、ポリ・アミノ酸、及びアミノ酸の共-ポリマー）、サポニン、パラフィン・オイル、並びにムラミル・ジペプチド、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記アジュバントは、アジュバント65、α-GalCer、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β-グルカン・ペプチド、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、脂質A、リポ多糖、リポバント（Lipovant）、モンタニド(Montanide)、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、Pam3CSK4、キルA（quil A）、トレハロース・ジミコレート又はザイモサン、である。
いくつかの実施形態では、前記アジュバントは、免疫調節分子である。例えば、前記免疫調節分子は、免疫応答を増強するように設計された、組み換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、若しくは免疫刺激性作用因子、又は、サイトカイン、ケモカイン、若しくは免疫刺激性作用因子、をコードする核酸、であることがある。
免疫調節性サイトカインの例としては、インターフェロン（例えば、IFNα、IFNβ及びIFNγ）、インターロイキン（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17及びIL-20）、腫瘍壊死因子（例えば、TNFα及びTNFβ）、エリスロポエチン（EPO）、FLT-3リガンド、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1アルファ、MIP-1β、ランテス(Rantes)、マクロファージ・コロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)及び顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM-CSF)、並びに上記のいずれかの機能性フラグメント、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ケモカイン・レセプター（即ち、CXC、CC、C、又はCX3Cケモカイン・レセプター）に結合する免疫調節性ケモカインもまた、本出願で提供される組成物に含まれることがある。ケモカインの例としては、限定されるものではないが、Mip1α, Mip-1β, Mip-3α (Larc), Mip-3β, ランテス(Rantes), Hcc-1, Mpif-1, Mpif-2, Mcp-1, Mcp-2, Mcp-3, Mcp-4, Mcp-5, エオタキシン(Eotaxin), タルク(Tarc), Elc, I309, IL-8, Gcp-2 Gro-α, Gro-β, Gro-γ, Nap-2, Ena-78, Gcp-2, Ip-10, Mig, I-Tac, Sdf-1, 及び Bca-1 (Blc), 並びに上記のいずれかの機能性フラグメント、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸、例えば、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードするDNA分子、を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、SARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードするオープン・リーディング・フレームを含む発現ベクターを含む。
細胞（例えば、筋肉細胞、抗原-提示細胞(APC)［例えば、樹状細胞、マクロファージ等］)によって取り込まれる場合、DNA分子は、染色体外分子として前記細胞中に存在することがある、及び／又はその染色体の中に組み込まれることがある。DNAは、別々の遺伝物質として維持されるプラスミドの形態で、細胞の中に導入されることがある。或いは、前記染色体の中に組み込まれ得る線状DNAが、前記細胞の中に導入されることがある。任意選択的に、細胞の中にDNAを導入する場合、染色体の中にDNAが組み込まれることを促進する試薬を添加することがある。
VI. 結合部分構造
いくつかの態様では、本出願に記載のペプチドに、及び／又は本出願に記載の安定なMHC-ペプチド複合体に、結合する結合部分構造が、提供される。例えば、T細胞レセプター（TCR）、抗体、の様な結合タンパク質等、例えば、約10-7 M（例えば、約10-7, 約10-8, 約10-9, 約10-10, 約10-11, 約10-12, 約10-13, 約10-14）以下のKdで、前記ペプチドに、及び／又は前記安定なMHC-ペプチド複合体に、特異的に結合する結合タンパク質等、が提供される。
いくつかの実施形態では、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及び／又はHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖、を含む。いくつかの実施形態では、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, 及びHLA-A*0274対立遺伝子、からなる群より選択される。特定の実施形態では、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201である。いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質は、遺伝子操作される、単離される、及び／又は精製される。
いくつかの実施形態では、本出願で提供される結合タンパク質は、キメラ、ヒト化、ヒト、霊長類、又はげっ歯類（例えば、ラット又はマウス）である定常領域、を含む。例えば、ヒト可変領域を、マウス定常領域を使って、キメラ化することがある、又はマウス可変領域を、ヒト定常領域及び／若しくはヒト骨格領域を使って、ヒト化することがある。いくつかの実施形態では、前記定常領域に変異を入れて、機能を改変することがある（例えば、TCRアルファ及びベータ鎖の中の対向する残基の位置に、非-天然のシステイン置換を導入し、TCRアルファとベータ鎖との間の親和性を増大させるのに有用なジスルフィド結合を提供する)。同様に、前記定常領域の膜貫通ドメインにおいて変異を入れて、機能を改変することがある（例えば、疎水性アミノ酸を使って、残基の非-天然の置換を導入することによって、疎水性を増大させる）。
いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質の各々のCDRは、参考CDR配列と比較して、最大5個のアミノ酸置換、挿入、欠失、又はそれらの組み合わせを有する。
いくつかの実施形態では、本出願に開示される結合タンパク質は、T細胞レセプター(TCR)、TCRの抗原-結合フラグメント、又はキメラ抗原レセプター(CAR)、を含むことがある。いくつかの実施形態では、本出願に開示される結合タンパク質は、2つのポリペプチド鎖を含むことがある、その各々は、TCRアルファ鎖のCDR3及びTCRベータ鎖のCDR3、又はTCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖の両方のCDR1、CDR2、及びCDR3、を含む可変領域、を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、単鎖TCR(scTCR)を含む、それは、TCR Vα及びTCR Vβドメインの両方を含むが、TCR定常ドメインは1つだけ(Cα又はCβ)を含む。用語「キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)」(CAR)は、天然に存在しない様式で、又は宿主細胞中に天然に存在しない様式で、一緒に連結した、2つ以上の天然に存在するアミノ酸配列、を含むように操作した融合タンパク質を指す、ここで、その融合タンパク質は、細胞の表面上に存在する場合に、レセプターとして機能することができる。本発明によって包含されるCARは、膜貫通ドメイン及び1つ以上の細胞内シグナリング・ドメイン（任意選択的に、共-刺激ドメインを含む)、に連結した、抗原-結合ドメイン（即ち、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン-様分子［例えば、抗体若しくはTCR］、から取得した、又は、に由来する、抗原-結合ドメイン、又はNK細胞由来のキラー免疫レセプター、に由来する、若しくは、から取得した、抗原結合ドメイン）を含む細胞外部分、を含むことがある（例えば、Sadelain et al. (2013) Cancer Discov. 3:388, Harris and Kranz (2016) Trends Pharmacol. Sci. 37:220, 及び Stone et al. (2014) Cancer Immunol. Immunother. 63:1163、を参照）。
いくつかの実施形態では、本出願に開示される結合タンパク質（例えば、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、又はキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR))は、キメラ（例えば、2つ以上のドナー(donor)又は種由来の、アミノ酸残基又はモチーフ、を含む)、ヒト化（例えば、ヒトにおける免疫原性のリスクを低減するように、改変された又は置換された、非-ヒト生物由来の残基を含む)、又はヒト、である。
操作した結合タンパク質（例えば、TCR、CAR、及びそれらの抗原-結合フラグメント、等）を産生する為の方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Bowerman et al. (2009) Mol. Immunol. 5:3000; 米国特許第6,410,319号; 米国特許第7,446,191号; 米国特許出願公開第2010/065818号; 米国特許第8,822,647号, PCT出願公開WO 2014/031687; 米国特許第7,514,537号; 及びBrentjens et al. (2007) Clin. Cancer Res. 73:5426）。
いくつかの実施形態では、本出願に記載される結合タンパク質は、細胞表面上に発現する、TCR、又はその抗原-結合フラグメント、である、ここで、その細胞表面上に発現するTCRは、内因性のTCRと比較して、CD3タンパク質と、より効率的に会合することができる。本発明によって包含される結合タンパク質（例えば、TCR等）は、T細胞のような細胞の表面上に発現させた場合、内因性の結合タンパク質（例えば、内因性のTCR等）と比較して、前記細胞上で、より高く表面発現をする。いくつかの実施形態では、本出願において、CARが提供される、ここで、前記CARの結合ドメインは、抗原-特異的なTCR結合ドメインを含む (例えば、Walseng et al. (2017) Scientific Reports 7:10713を参照されたい)。
また、出発結合タンパク質から特性が変わっていることがある、改変済み結合タンパク質を操作する為の出発材料として、本出願に開示されるVα及び／又はVβ配列の1つ以上を有する結合タンパク質を使用して、周知の方法に従って、調製することがある、改変済み結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、又はCAR)も提供される。1つ又は両方の可変領域(即ち、Vα及び／又はVβ)内の、例えば、1つ以上のCDR領域内の、及び／又は1つ以上の骨格領域内の、1つ以上の残基を改変することによって、結合タンパク質を操作することがある。追加的に又は代替的に、結合タンパク質を、前記定常領域内の残基を改変することによって、操作することがある。
別のタイプの可変領域の改変は、Vα及び／又はVβのCDR1、CDR2及び／又はCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させて、それによって、関心とする結合タンパク質の1つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善すること、である。部位-指向的な変異誘発、又はPCR-媒介の変異誘発を、実施して、変異を導入することがある、並びにタンパク質結合に対する効果を、又は関心とする他の機能的な特性を、本出願に記載されるように、及び実施例において提供されるように、in vitro、又はin vivoアッセイにおいて、評価することがある。いくつかの実施形態では、(上述のような)保存的な改変を導入することがある。前記変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であってもよい。いくつかの実施形態では、前記変異は、置換である。更に、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4又は5個以下の残基を、改変する。
いくつかの実施形態では、本出願に記載される結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、又はCAR)は、天然に存在するTCRと比較して、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加、を有することがある。いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質の各々のCDRは、参考CDR配列と比較して、最大5個の、アミノ酸置換、挿入、欠失、又はそれらの組み合わせ、を有する。アミノ酸の保存的な置換は、周知である、及び、天然に存在しても良い、又は前記結合タンパク質を組み換えにより産生する場合に、導入されてもよい。アミノ酸置換、欠失、及び付加を、当該技術分野で既知の変異誘発法を使用して、タンパク質に導入することがある（例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY）。オリゴヌクレオチド-指向性の部位-特異的(又は、セグメント特異的)変異誘発法を用いて、所望の置換、欠失、又は挿入に従って改変した特定のコドン、を有する改変したポリヌクレオチド、を提供することがある。或いは、ランダム変異誘発技術又は飽和変異誘発技術、例えば、アラニン・スキャニング変異誘発、エラーを引き起こしやすいポリメラーゼ連鎖反応の変異誘発、及びオリゴヌクレオチド-指向性の変異誘発、などを使用して、免疫原ポリペプチド・バリアントを調製することがある（例えば、前掲のSambrook et al. を参照）。
当業者に既知の様々な基準によって、ペプチド中の又はポリペプチド中の特定の位置で置換されるアミノ酸が保存的（又は類似）であるかどうかが示される。例えば、類似アミノ酸の置換又は保存的アミノ酸の置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、置換である。類似のアミノ酸は、以下のカテゴリーに含まれることがある：塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)；酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)；非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン)；非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)；ベータ-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン)。プロリン（これは、分類がより困難と考えられる）は、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、及びアラニン)と特性を共通する。いくつかの実施形態では、グルタミンをグルタミン酸に置換することは、又はアスパラギンをアスパラギン酸に置換することは、グルタミン及びアスパラギンが、それぞれグルタミン酸及びアスパラギン酸のアミド誘導体である点で、類似の置換と考えることができる。当該技術分野で理解されるように、2つのポリペプチド間の「類似性」を、前記ポリペプチドのアミノ酸配列及びそれに対する保存されたアミノ酸置換を、第2のポリペプチドの配列と比較することによって(例えば、GENEWORKSTM、Align、BLASTアルゴリズム、又は本出願に記載される、及び当該技術分野で実施される他のアルゴリズム、を使用して)、決定する。
本出願に記載される何れの実施形態では、コードされた結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、又はCAR)は、「シグナル・ペプチド」(リーダー配列、リーダー・ペプチド、又は移行ペプチド(transit peptide)、としても知られる)を含むことがある。シグナル・ペプチドは、新たに合成されたポリペプチドを、細胞の内部又は外部の適切な位置へ、ターゲット化する。シグナル・ペプチドは、局在化若しくは分泌の過程で、又は局在化若しくは分泌が一度完了すると、前記ポリペプチドから除去されることがある。シグナル・ペプチドを有するポリペプチドは、本出願では、「プレ-タンパク質」と呼ばれる、及びシグナル・ペプチドが除去されたポリペプチドは、本出願では、「成熟」タンパク質又はポリペプチドと呼ばれる。いくつかの実施形態では、本出願に記載される結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、又はCAR)は、成熟Vαドメイン、成熟Vβドメイン、又はその両方、を含む。いくつかの実施形態では、本出願に記載される結合タンパク質(例えば、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、又はCAR)は、成熟TCR β-鎖、成熟TCR α-鎖、又はその両方、を含む。
いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質は、以下を含む融合タンパク質である：(a)TCR又はその抗原-結合フラグメントを含む細胞外構成要素；(b)エフェクター・ドメイン又はその機能的部分を含む細胞内構成要素；及び(c)細胞外の及び細胞内の構成要素を繋げる膜貫通ドメイン。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、MHC分子(例えば、MHCクラスI分子)の中に本出願に記載のペプチド・エピトープを含むMHC-ペプチド抗原複合体に、特異的に結合することができる。
本出願で使用する場合、「エフェクター・ドメイン」又は「免疫エフェクター・ドメイン」は、適切なシグナルを受け取ったときに、細胞における免疫応答を、直接的に又は間接的に、促進することがある、融合タンパク質の又はレセプターの、細胞内の部分又はドメイン、である。いくつかの実施形態では、エフェクター・ドメインは、結合(例えば、CD3ζ)したときに、又は免疫細胞タンパク質若しくはその部分若しくは免疫細胞タンパク質複合体がターゲット分子に直接的に結合し、免疫細胞において、前記エフェクター・ドメインからのシグナル伝達が誘発されるときに、シグナルを受け取る、免疫細胞タンパク質若しくはその部分又は免疫細胞タンパク質複合体、に由来する。
エフェクター・ドメインは、それが、1つ以上のシグナリング・ドメイン又はモチーフ、（例えば、細胞内チロシン-ベースの活性化モチーフ(intracellular tyrosine-based activation motif (ITAM))等［例えば、共-刺激分子中に見られるモチーフ等］）を含む場合、細胞応答を、直接的に促進することがある。理論に拘束されることを望むものではないが、ITAMは、T細胞レセプターによる、又はT細胞エフェクター・ドメインを含む融合タンパク質による、リガンド係合後のT細胞活性化に有益であると考えられる。いくつかの実施形態では、前記細胞内構成要素又はその機能的部位は、ITAMを含む。例示的な免疫エフェクター・ドメインとしては、限定されるものではないが、CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2、又はこれらの任意の組み合わせ、に由来する免疫エフェクター・ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、エフェクター・ドメインは、リンパ球レセプター・シグナリング・ドメイン(例えば、CD3ζ、又はその機能的部位若しくはバリアント)を含む。
更なる実施形態では、前記融合タンパク質の細胞内構成要素は、CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD2, CD5, ICAM-l (CD54), LFA-l (CD11a/CD18), ICOS (CD278), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83と特異的に結合するリガンド、若しくはそれらの機能的バリアント、又はそれらの任意の組み合わせ、より選択される、共-刺激ドメイン又はそれらの機能的部分、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞内構成要素は、CD28共-刺激ドメイン、若しくはその機能的部分若しくはバリアント（これらは、天然CD28タンパク質の186-187位でのLL-GG変異を、任意選択的に、含むことがある［例えば、Nguyen et al. (2003) Blood 702:4320］）、4-1BB共-刺激ドメイン、若しくはその機能的部分若しくはバリアント、又はその両方、を含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター・ドメインは、CD3εエンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、CD27エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、CD28エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。なお更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、4-1BBエンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、OX40エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、CD2エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、CD5エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、ICAM-1エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、LFA-1エンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。更なる実施形態では、エフェクター・ドメインは、ICOSエンドドメイン若しくはその機能的(例えば、シグナリング)部分、又はその機能的バリアント、を含む。
本発明によって包含される、細胞外構成要素及び細胞内構成要素は、膜貫通ドメインによって、繋がっている。「膜貫通ドメイン」は、本出願で使用する場合、細胞膜の中に挿入されることが可能な、又は細胞膜を貫通することが可能な、膜貫通タンパク質の一部分である。膜貫通ドメインは、細胞膜中で熱力学的に安定である、及び一般的に長さが約15アミノ酸から約30アミノ酸までの範囲である、三次元構造を有する。膜貫通ドメインの構造は、アルファ・ヘリックス、ベータ・バレル、ベータ・シート、ベータ・ヘリックス、又はそれらの任意の組み合わせ、を含むことがある。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、既知の膜貫通タンパク質（例えば、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD27膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、若しくはそれらの任意の組み合わせ）、を含む、又は、に由来する。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の細胞外構成要素は、前記結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に配置されたリンカー、を更に含む。前記結合ドメイン及び前記膜貫通ドメインが繋がっている融合タンパク質の構成要素に言及する時に、本出願で使用される場合、「リンカー」は、約2個のアミノ酸から約500個のアミノ酸までを有する、アミノ酸配列であることがある、これは、前記リンカーによって繋がる、2つの、領域、ドメイン、モチーフ、フラグメント、又はモジュール、の間のコンホメーション運動の為の、柔軟性を、及び、余地を、提供することがある。例えば、本発明によって包含されるリンカーは、前記結合ドメインを、前記融合タンパク質を発現する宿主細胞の表面から離れた位置に配置して、宿主細胞とターゲット細胞との間の適切な接触、抗原結合、及び活性化、を可能にすることがある（Patel et al. (1999) Gene Therapy 6:412-419）。選択したターゲット分子、選択した結合エピトープ、又は抗原結合ドメインの捕捉性及び親和性、に基づいて、抗原認識を最大化するように、リンカー長を、変化させることができる(例えば、Guest et al. (2005) Immunother. 28:203-11 及び PCT出願公開WO 2014/031687)。例示的なリンカーとしては、GlyxSeryの1個から約10個の繰り返しを有する、グリシン-セリン・アミノ酸鎖を有するリンカーが挙げられる、ここで、x及びyは、それぞれ独立して、0から10までの整数である、但し、x及びyは、両方ともが0ではない（例えば、(Gly4Ser)2、(Gly3Ser)2、Gly2Ser、又はそれらの組み合わせ［例えば、((Gly3Ser)2Gly2Ser)等］）。
いくつかの実施形態では、本発明によって包含される結合部分構造は、操作されたタンパク質スキャフォールド、抗体又はその抗原結合フラグメント、TCR-模倣抗体、等、であることがある。そのような結合部分構造を、宿主を免疫する、抗体産生細胞を及び／又はその抗体を取得する、並びにモノクローナル抗体を産生するのに有用なハイブリドーマを作製する、等の、ルーチンな免疫学的方法を用いて、本出願に記載の、ペプチド及び／又はMHC-ペプチド複合体に対して、設計することがある、及び／又は作製することがある（例えば、Watt et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:177-183; Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opin. Chem Biol. 13:245-255; Skerra et al. (2008) FEBS J. 275:2677-2683; Nygren et al. (2008) FEBS J. 275:2668-2676; Dana et al. (2012) Exp. Rev. Mol. Med. 14:e6; Sergeva et al. (2011) Blood 117:4262-4272; PCT 出願公開WO 2007/143104, PCT/US86/02269, 及び WO 86/01533; 米国特許第4,816,567号; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; 米国特許第5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 及び Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060）。所望であれば、結合部分構造を、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティー・クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、レクチン・クロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)（例えば、Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y.)、のような従来の方法を用いて、単離することがある、又は精製することがある。
用語「抗体（antibody）」及び「抗体類（antibodies）」は、天然に存在する形態の抗体（例えば、IgG、IgA、IgM、IgE）及び組み換え抗体、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体、並びに多重特異性抗体、同様に、前記の全てに関するフラグメント及び誘導体（これらのフラグメント及び誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する）、を広く包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートした、タンパク質又は化学的な部分構造、を含むことがある。
更に、イントラボディー（intrabody）は、抗体の特性を有するが、関心とする細胞内のターゲット、に結合するために、及び／又はを阻害するために、細胞内で発現することができる、周知の抗原-結合分子である（Chen et al. (1994) Human Gene Ther. 5:595-601）。例えば、単鎖抗体(scFv)の使用、過安定性のための免疫グロブリンVLドメインの改変、還元性の細胞内環境に抵抗するための抗体の改変、細胞内安定性を増大させる及び／又は細胞内局在化を調節する融合タンパク質の生成、等、細胞内部分構造をターゲット化する（例えば、阻害する）ことに、抗体を適応させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、予防目的及び／又は治療目的（例えば、遺伝子治療として）、のために、細胞内抗体をまた、1種以上の、細胞、多細胞生物の、組織又は器官、に導入することもある、及び発現させることもある（少なくとも、PCT 公開 WO 08/020079, WO 94/02610, WO 95/22618, 及び WO 03/014960; 米国特許第7,004,940号; Cattaneo and Biocca (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications (Landes and Springer-Verlag publs.); Kontermann (2004) Methods 34:163-170; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Auf der Maur et al. (2001) FEBS Lett. 508:407-412; Shaki-Loewenstein et al. (2005) J. Immunol. Meth. 303:19-39、を参照）。
本出願で使用する場合、用語「抗体（antibody）」はまた、抗体の「抗原-結合部分」（又は単に「抗体部分」）、も含む。本出願で使用する場合、用語「抗原-結合部分」は、抗原（例えば、本出願に記載の、ペプチド及び／又はMHC-ペプチド複合体）に特異的に結合する作用能を保持する抗体の、1つ以上のフラグメント、を指す。抗体の抗原-結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって、遂行され得ることが示されてきている。抗体に関する用語「抗原-結合部分」の中に含まれる結合フラグメントの例としては、(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメント；(ii) F(ab')2フラグメント、ヒンジ領域で、ジスルフィド架橋によって、連結した、2つのFabフラグメントを含む、二価フラグメント；(iii)VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；(iv) 抗体の単一アームの、VL及びVHドメインからなるFvフラグメント、(v) dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、これは、VHドメインからなる、及び (vi)単離された相補性決定領域(CDR)、が挙げられる。更に、Fvフラグメントの2つのドメイン（VL及びVH）は、別々の遺伝子によってコードされているが、それらを、組み換え方法を用いて、それらを、単一のタンパク質鎖［その中では、VL及びVH領域が対合して、一価ポリペプチド（一本鎖Fv(scFv)として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 及び Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 並びに Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778、を参照）が形成される］として産生されることを可能にする合成リンカーによって、連結することがある。そのような単鎖抗体もまた、抗体に関する前記用語「抗原-結合部分」の中に包含されることが意図される。完全なIgGポリペプチドを、又は他のアイソタイプを、コードする発現ベクターを生成するために、特定のscFvの任意のVH及びVL配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域の、cDNA又はゲノム配列、に連結することがある。タンパク質化学又は組み換えDNA技術の何れかを使用して、免疫グロブリンの、Fab、Fv又は他のフラグメント、を生成する際に、VH及びVLを、使用することもある。ダイアボディ等の単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、二価のバイスペシフィック抗体(bispecific antibody)であり、VH及びVLドメインは、単一のポリペプチド鎖上で発現するが、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって前記ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと、対形成させ、それによって、2つの抗原結合部位を作り出す（例えば、Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123、を参照）。
更に、抗体又はその抗原-結合部分は、抗体又は抗体部分と1種以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合的な又は非共有結合的な会合によって形成される、より大きな免疫接着性ポリペプチドの一部であることがある。そのような免疫接着性ポリペプチドの例としては、ストレプトアビジン・コア領域を使用して四量体scFvポリペプチドを作製すること（Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、及びシステイン残基、タンパク質サブユニット・ペプチド及びC-末端ポリヒスチジン・タグを使用して、二価の及びビオチン化したscFvポリペプチドを作製すること（Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058）、が挙げられる。抗体の部分（例えば、Fab及びF(ab')2フラグメント）は、それぞれ、抗体の全体を、例えば、それぞれ、パパイン消化又はペプシン消化等の、従来の技術を用いて、抗体の全体から調製することがある。更に、抗体、抗体の部分及び免疫接着性ポリペプチドを、本出願に記載されるように、標準的な組み換えDNA技術を用いて、取得することがある。
抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル；異種、同種、若しくは同系；又はそれらの改変した形態（例えば、ヒト化、キメラ、等）、であることがある。抗体はまた、完全にヒトであることもある。好ましくは、本出願によって包含される抗体は、本出願に記載の、ペプチド及び／又はMHC-ペプチド複合体に、特異的に又は実質特異的に、結合する。用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」は、本出願で使用する場合、抗原の特定のエピトープと免疫応答をすることができる抗原結合部位の1つの種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指す、一方、用語「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位の複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫応答する特定の抗原に対する単一の結合親和性を示す。
本出願に記載される他の結合部分構造と同様に、抗体をまた、「ヒト化」することがある、これは、ヒト細胞によって作製されるであろう抗体により密接に類似するように改変した、可変領域及び定常領域を有する、非-ヒト細胞によって作製された抗体、を含むことが意図される。例えば、非-ヒト抗体のアミノ酸配列を改変することによって、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列中に見出されるアミノ酸を取り込ませる。本出願によって包含されるヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、in vitroでの、ランダムな変異誘発又は部位特異的変異誘発によって、又はin vivoでの体細胞突然変異によって、導入される変異）を、例えば、CDRの中に、含むことがある。本出願で使用する場合、用語「ヒト化抗体」は、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列を、ヒトの骨格配列に移し結合させた抗体も、含む。
本発明によって包含される結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、部分構造に共有結合することがある。いくつかの実施形態では、共有結合した部分構造は、親和性タグ(affinity tag)又は標識を含む。前記親和性タグを、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、タンパク質Cタグ、Mycタグ、HaloTag、HAタグ、Flagタグ、Hisタグ、ビオチン・タグ、及びV5タグ、からなる群より選択することがある。前記標識は、蛍光タンパク質であることがある。いくつかの実施形態では、前記共有結合した部分構造を、炎症性薬剤、抗-炎症性薬剤、サイトカイン、毒素、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は単鎖Fvなどの抗体、からなる群より選択する。
結合タンパク質を、イメージング、研究、治療、セラノスティクス(theranostics)、医薬品、化学療法、キレート療法、ターゲット化した薬物送達、及び放射線療法、において使用する薬剤に、コンジュゲートすることがある。いくつかの実施形態では、結合タンパク質を、検出可能な薬剤、例えば、蛍光色素分子、近-赤外色素、造影剤、ナノ粒子、含金属ナノ粒子、金属キレート、X-線造影剤、PET剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート化剤、又はイメージングに使用することがある別の好適な物質、と、コンジュゲートすることがある、又は融合することがある。いくつかの実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれより多く、の検出可能な部分構造を、結合タンパク質に連結することがある。放射性同位体の非-限定的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記金属又は放射性同位体を、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウム、からなる群より選択する。いくつかの実施形態では、前記金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、又はイットリウム、である。いくつかの実施形態では、前記放射性同位体は、アクチニウム-225又は鉛-212である。いくつかの実施形態では、前記近-赤外色素は、生物学的な組織及び流体によって容易にクエンチ(quench)しない。いくつかの実施形態では、前記蛍光色素分子は、650 nmと4000 nmとの間の波長で、電磁波を放出する蛍光薬剤であり、そのような電磁波を利用して、そのような薬剤を検出する。コンジュゲート分子として使用することがある蛍光色素の非-限定的な例としては、DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800、又はインドシアニン・グリーン(ICG)、が挙げられる。いくつかの実施形態では、しばしば、近赤外色素として、シアニン色素(例えば、Cy7、Cy5.5、及びCy5)が挙げられる。本発明に従ってコンジュゲート分子として使用する為の蛍光色素に関する追加の非-限定的な例としては、アクラジン・オレンジ又はイエロー(acradine orange or yellow)、Alexa Fluors(登録商標)(例えば、Alexa Fluor(登録商標)790、750、700、680、660、及び647)並びにそれらの任意の誘導体、7-アクチノマイシンD、8-アニリノナフタレン-1-スルホン酸、ATTO（登録商標）色素及びその任意の誘導体、オーラミン-ローダミン染色剤及びその任意の誘導体、ベンサントロン（bensantrhone）、ビマン、9-10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、5,12-ビス(フェニルエチニル)ナタセン（5,12-bis(phenylethynyl)naththacene）、ビスベンズイミド、ブレインボウ（brainbow）、カルセイン、カルボディフルオレセイン(carbodyfluorescein )及びその任意の誘導体、1-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン及びその任意の誘導体、DAPI、DiOC6、DyLight（登録商標）Fluors（登録商標）及びその任意の誘導体、エピコッコノン(epicocconone)、エチジウム・ブロマイド、FlAsH-EDT2（登録商標）、Fluo色素及びその任意の誘導体、FluoProbe（登録商標）及びその任意の誘導体、フルオレセイン及びその任意の誘導体、Fura（登録商標）及びその任意の誘導体、GelGreen（登録商標）及びその任意の誘導体、GelRed（登録商標）及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及びその任意の誘導体、例えば、mCherry等のmアイソフォーム・タンパク質及びその任意の誘導体、ヘタメチン色素（hetamethine dye）及びその任意の誘導体、ヘキスト染色（hoeschst stain）、イミノクマリン（iminocoumarin）、インディアン・イエロー（indian yellow）、indo-1及びその任意の誘導体、ラウルダン（laurdan）、ルシファー・イエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、ルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ナイル色素及びその任意の誘導体、ペリレン（perylene）、フロキシン、フィコ色素（phyco dye）及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、リボグリーン、RoGFP、ルブレン、スチルベン及びその任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、SYBR及びその任意の誘導体、シナプト-フルオニン（synapto-pHluorin）、テトラフェニル・ブタジエン、トリス四ナトリウム（tetrasodium tris）、テキサス・レッド、チタン・イエロー、TSQ、ウンベリフェロン（umbelliferone）、ビオラントロン（violanthrone）、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein）及びYOYO-1、が挙げられる。他の好適な蛍光色素としては、限定されるものではないが、フルオレセイン及びフルオレセイン色素（例えば、フルオレセイン・イソチオシアニン又はFITC、ナフトフルオレセイン、4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン又はFAM、等)、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル系色素、オキソノール色素、フィコエリスリン（phycoerythrin）、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル-ローダミン又はTAMRA、カルボキシルローダミン6G、カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、リサミン・ローダミンB、ローダミン6G、ローダミン・グリーン（rhodamine Green）、ローダミン・レッド（rhodamine Red）、テトラメチルローダミン(TMR)、等)、クマリン及びクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン(AMCA)、等)、オレゴン・グリーン（Oregon GreenTM）色素（例、Oregon GreenTM 488, 500, 514、等)、テキサス・レッド（Texas Red登録商標）、テキサス・レッド（Texas Red登録商標）-X、スペクトラム・レッド（SPECTRUM RED登録商標）、スペクトラム・グリーン（SPECTRUM GREEN登録商標）、シアニン色素（例えば、CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5、等)、Alexa Fluor登録商標 色素（例えば、Alexa Fluor登録商標 350, 488, 532, 546, 568, 594, 633, 660, 680、等)、BODIPY登録商標 色素（例えば、BODIPY登録商標 FL、R6G、TMR、TR、 530/550、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650、650/665、等)、IRD色素（例えば、IRD40TM、IRD700TM、IRD800TM、等)、等が挙げられる。更なる好適な検出可能な薬剤は、当該技術分野において周知である（例えば、PCT公開番号PCT/US14/56177)。放射性同位体の非-限定的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記金属又は放射性同位体を、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウム、からなる群より選択する。いくつかの実施形態では、前記金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、又はイットリウムである。いくつかの実施形態では、前記放射性同位体は、アクチニウム-225又は鉛-212である。
結合タンパク質を、放射線増感剤又は光増感剤にコンジュゲートすることがある。放射線増感剤としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体（例えば、5-フルオロデオキシウリジン等のハロゲン化プリン又はピリミジン)。光増感剤の例としては、限定されるものではないが、照射した場合に熱を生成する蛍光分子又はビーズ、ナノ粒子、ポルフィリン類及びポルフィリン誘導体類（例えば、クロリン類、バクテリオクロリン類、イソバクテリオクロリン類、フタロシアニン類、及びナフタロシアニン類)、メタロポルフィリン類、メタロフタロシアニン類、アンゲリシン類、カルコゲンアピリリウム色素（chalcogenapyrrillium dyes）、クロロフィル類、クマリン類、フラビン類並びにアロキサジン及びリボフラビン等の関連化合物、フラーレン類、フェオホルビド類、ピロフェオホルビド類、シアニン類（例えば、メロシアニン540）、フェオフィチン類、サフィリン類、テキサフィリン類、プルプリン類、ポルフィセン類、フェノチアジニウム類、メチレン・ブルー誘導体、ナフタルイミド類、ナイル・ブルー誘導体、キノン類、ペリレンキノン類（例えば、ヒペリシン類、ヒポクレリン類、及びセルコスポリン類)、ソラレン類、キノン類、レチノイド類、ローダミン類、チオフェン類、ベルジン類、キサンテン色素（例えば、エオシン類、エリスロシン類、ローズ・ベンガル類）、ポルフィリン類の二量体及びオリゴマー体、並びに5-アミノレブリン酸のようなプロドラッグ、が挙げられる。有利なことに、この手法によって、治療薬剤(例えば、薬物)及び電磁気的なエネルギー(例えば、照射又は光)の両方を同時に使用して、関心とする細胞(例えば、免疫細胞)を、非常に特異的にターゲット化することが可能になる。いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質は、例えば、直接的に又はリンカーを介して、前記薬剤と融合する、又は共有結合的に若しくは非-共有結合的に連結する。
いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質を化学的に改変することがある。例えば、結合タンパク質に変異を加えて、ペプチド特性、例えば、検出可能性、安定性、体内分布、薬物動態、半減期、表面電荷、疎水性、コンジュゲーション部位、pH、機能等を改変することがある。N-メチル化は、本発明によって包含される結合タンパク質において起こり得るメチル化の1つの例である。いくつかの実施形態では、結合タンパク質を、遊離アミン上のメチル化によって、例えば、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元性メチル化等によって、改変することがある。
化学的な改変は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレン・グリコール、バイオポリマー、両性ポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Fc領域、パルミチン酸若しくはミリストレイン酸等の単飽和炭素鎖、又はアルブミン、を含むことがある。結合タンパク質のFc領域による化学的な改変は、融合Fc-タンパク質であることがある。ポリアミノ酸としては、例えば、単一アミノ酸が反復したポリ・アミノ酸配列(例えば、ポリ・グリシン)、及びパターンに従っていることもある、若しくは従っていないこともある、入り混じったポリ・アミノ酸配列を有するポリ・アミノ酸配列、又は前述の任意の組み合わせ、を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本発明によって包含される結合タンパク質を改変することがある。いくつかの実施形態では、前記改変は、親結合タンパク質と実質的な又は有意な配列同一性を有し、前記親結合タンパク質の1つ以上の生物物理学的な及び／又は生物学的な活性を維持する(例えば、結合特異性を維持する)機能的バリアントを生成する。いくつかの実施形態では、前記変異は、保存的なアミノ酸置換である。
いくつかの実施形態では、本発明によって包含される結合タンパク質は、1つ以上の天然アミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含むことがある。そのような合成アミノ酸は、当該技術分野において周知である、及び、例えば、アミノシクロヘキサン・カルボン酸、ノルロイシン、a-アミノn-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、 4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、a-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1, 2, 3, 4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、Ν',Ν'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、a-アミノシクロペンタン・カルボン酸、oc-アミノシクロヘキサン・カルボン酸、a-アミノシクロヘプタン・カルボン酸、a-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノブチル酸、β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びoc-tert-ブチルグリシン、が挙げられる。
本発明によって包含される結合タンパク質は、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、環化(例えば、ジスルフィド架橋を介して)、若しくは酸付加塩への変換、及び／又は任意選択的に二量体化若しくはポリマー化、若しくはコンジュゲート化、等、改変されていることがある。
いくつかの実施形態では、疎水性部分構造のアタッチメント(attachment)、例えば、N-末端への、C-末端への、又は内部アミノ酸へのアタッチメント(attachment)を利用して、本発明によって包含されるペプチドの半減期を延ばすことがある。他の実施形態では、結合タンパク質は、例えば、血清半減期に影響を及ぼし得る、翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／又はアミド化）を含むことがある。いくつかの実施形態では、（例えば、ミリストイル化及び／又はパルミチル化によって）簡単な炭素鎖を前記結合タンパク質にコンジュゲートすることがある。いくつかの実施形態では、前記簡単な炭素鎖によって、前記結合タンパク質は、コンジュゲートしていない物質から、容易に分離可能になることがある。例えば、前記結合タンパク質を、コンジュゲートしていない物質から分離する為に使用することがある方法としては、限定されるものではないが、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィ、が挙げられる。脂溶性の部分構造によって、血清アルブミンへの可逆的結合を介して、半減期が延びることがある。コンジュゲートした部分構造は、血清アルブミンへの可逆的結合を介して、ペプチドの半減期を延ばす脂溶性の部分構造であることがある。いくつかの実施形態では、前記脂溶性の部分構造は、コレステロール又はコレステロール誘導体、例えば、コレステン類、コレスタン類、コレスタジエン類及びオキシステロール類、等、であることがある。いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質は、ミリスチン酸(テトラデカン酸)又はその誘導体、にコンジュゲートすることがある。他の実施形態では、結合タンパク質は、半減期を改変する薬剤にカップリング（例えば、コンジュゲート）することがある。半減期を改変する薬剤としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ポリマー、ポリエチレン・グリコール(PEG)、ヒドロキシエチル・デンプン、ポリビニル・アルコール、水溶性ポリマー、両性イオン水溶性ポリマー、水溶性ポリ(アミノ酸)、プロリン、アラニン、及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含む水溶性ポリマー、Fc領域、脂肪酸、パルミチン酸、又はアルブミンに結合する分子。いくつかの実施形態では、スペーサー又はリンカーは、結合タンパク質に、カップリングすることがあり、例えば、別の分子へのコンジュゲート又は融合を容易にする為に、及びそのようなコンジュゲートした又は融合した分子からのペプチドの切断を容易にする為に、スペーサー又はリンカーとして働く、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多くの、アミノ酸残基等、である。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、例えば、前記結合タンパク質の特性を改変することができる他の部分構造に、又は変化させることができる他の部分構造に、コンジュゲートすることがある。
結合タンパク質を、組み換え的に又は合成的に、例えば、固相ペプチド合成又は液相ペプチド合成、等によって、生成することがある。ポリペプチド合成を、既知の合成方法によって、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学を使用して、又はブチルオキシカルボニル(Boc)化学によって、実施することがある。ポリペプチド・フラグメントを、酵素的に又は合成的に、一緒に連結することがある。
本発明によって包含される態様では、本出願に記載される結合タンパク質を産生する方法を、本出願は提供する、ここで、前記方法は、以下のステップを含む：(i)本出願に記載される結合タンパク質をコードする配列を含む核酸によって形質転換をした、形質転換済み宿主細胞を、前記結合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、培養するステップ；及び(ii)その発現した結合タンパク質を回収するステップ。
組み換え的に産生した結合タンパク質を、単離する為に及び精製する為に、有用な方法は、例えば、前記結合タンパク質を培養培地中に分泌することに適した宿主細胞／ベクター・システムから上清を得るステップ、次いで市販のフィルターを用いて、前記培地を濃縮するステップ、を含むことがある。濃縮した後、その濃縮物は、単一の好適な精製マトリックス、又は一連の好適なマトリックス、例えば、親和性マトリックス若しくはイオン交換樹脂、等、に適用することがある。1つ以上の逆相HPLCのステップを利用して、組み換えポリペプチドを更に精製することがある。これらの精製方法をまた、免疫原を、その自然環境から単離する場合に、使用することがある。本出願に記載される1種以上の結合タンパク質を大規模に産生させる為の方法は、バッチ細胞培養を含むことがある、そのバッチ細胞培養を、適切な培養条件を維持する為に、モニタリングする、及び制御する。前記結合タンパク質の精製を、本出願に記載された、及び当該技術分野で既知である、方法に従って、実施することがある。
結合親和性を評価する為の、及び／又は結合分子が特定のリガンド(例えば、ペプチド抗原-MHC複合体)に、特異的に結合するかどうかを決定する為の、様々なアッセイが周知である。ターゲット、例えば、T細胞ペプチド・エピトープというターゲット・ポリペプチド、に対する結合タンパク質の結合親和性を、例えば、当該技術分野で周知の任意の多数の結合アッセイを使用すること等によって、決定することは、当業者のレベルの範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、BiacoreTM装置を使用して、2つのタンパク質間の複合体の結合定数を決定することがある。前記複合体の解離定数(KD)を、バッファーがチップ上を通過するときの屈折率の経時変化をモニタリングすることによって、決定することがある。あるタンパク質が別のタンパク質に結合することを測定する為の他の好適なアッセイとしては、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)等のイムノアッセイ、又は蛍光、UV吸収、円偏光二色性若しくは核磁気共鳴(NMR)によって、タンパク質の、分光学的な若しくは光学的な特性の変化をモニタリングすることによる結合の測定、が挙げられる。他の例示的なアッセイとしては、限定されるものではないが、ウェスタン・ブロット、ELISA、分析的超遠心分離、分光法及び表面プラズモン共鳴(BiacoreTM)解析(例えば、Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, Wilson (2002) Science 295:2103, Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53:2560, 並びに米国特許第5,283,173号及び第5,468,614号、を参照)、フロー・サイトメトリー、シークエンシング及び発現した核酸を検出する為の他の方法、が挙げられる。1つの例では、ターゲットに対する見かけの親和性を、種々の濃度の四量体への結合を評価することによって、例えば、ラベルした多量体を、例えば、MHC-抗原ペプチド四量体等を、用いたフロー・サイトメトリーによって、測定する。1つの代表的な例では、結合タンパク質の見かけのKDを、ある濃度範囲で、標識した四量体の2倍希釈を用いて、測定する、続いて、非-線形回帰による結合曲線の決定を行う。見かけのKDを、最大結合の半分の結合を生じるリガンドの濃度として決定する。
VII. 用途及び方法
a. 診断方法
いくつかの態様では、本出願は、以下を含む、対象が、SARS-CoV-2に暴露されたかどうか、及び／又は、SARS-CoV-2からの保護を有するかどうか、を決定するための、診断方法を提供する：(a)前記対象から取得したサンプル（例えば、血液、単離したPBMC又は単離したT細胞）を、本出願に記載されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチド（例えば、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／若しくは1F、より選択されるペプチド・エピトープ）、本出願に記載されるMHC-ペプチド複合体、又は例えば、本出願に記載される免疫原性ポリペプチドの構築物に由来する、本出願に記載されるMHC-ペプチド複合体を、コードする及び／若しくは提示する、細胞、と共に、インキュベートするステップ；並びに(b)応答性のレベルを検出するステップ；ここで、コントロールのレベルと比較して、より高いレベルの応答性は、前記対象が、SARS-CoV-2に暴露されていることを、及び／又は、SARS-CoV-2からの保護を有することを、示す。
いくつかの実施形態では、応答性のレベルを、T細胞活性化又はエフェクター機能、例えば、限定されるものではないが、T細胞増殖、傷害、又はサイトカイン放出、等、によって示す。コントロールのレベルは、SARS-CoV-2への曝露が無い健常な対象の、参考数字、又はレベル、であることがある。
b. 治療方法
いくつかの態様では、本出願は、COVID-19（即ち、SARS-CoV-2感染症）を、予防するための方法、及び／若しくは治療するための方法、並びに／又は、SARS-CoV-2タンパク質若しくはそのフラグメント、に対する免疫応答を誘導するための方法、を提供する。ある特定の実施形態では、前記方法は、本出願に記載の免疫原性組成物を、対象に投与するステップ、を含む。
本出願に記載される方法を使用して、それを必要とする任意の対象を治療することがある。本明細書で使用する場合、「それを必要とする対象（subject in need thereof）」としては、COVID-19を有する任意の対象、COVID-19を有したことがある任意の対象、及び／又はCOVID-19に罹り易い任意の対象、が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、前記対象は、COVID-19を有する。いくつかの実施形態では、前記対象は、COVID-19の治療を受けている。いくつかの実施形態では、前記対象は、加齢によりCOVID-19に罹り易い、又は前記対象をCOVID-19に罹り易くする、欠陥のある免疫システム又は他の重篤な基礎疾患、を有する。
本出願に開示される医薬組成物を、例えば、経口及び非経口等、任意の好適な投与経路によって、送達することがある。ある特定の実施形態では、前記医薬組成物を、一般的に（例えば、経口投与又は非経口投与により）送達する。特定の実施形態では、前記医薬組成物を、皮下注射投与によって、投与する。
対象剤の投薬量を、前記剤の血漿中濃度を参考にして、決定することがある。例えば、最大血漿濃度(Cmax)、及び時間0から無限大までの血漿濃度-時間曲線下の面積(AUC(0-4))、を使用することがある。投薬量は、Cmax及びAUC(0-4)について、上記の値をもたらす投薬量、並びにそれらのパラメータについて、より大きい値又はより小さい値、をもたらす他の投薬量、を含む。
前記医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルを、前記患者に対して毒性ではない、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量、を得るように変えることがある。
選択される投薬量レベルは、例えば、使用する特定の剤の活性、投与経路、投与の時期、使用する特定の化合物の排泄又は代謝の速度、治療の期間、使用する特定の化合物と併用する他の薬物、化合物及び／又は物質、治療する患者の、年齢、性別、体重、症状、全身の健康及び以前の病歴、並びに医学分野で既知の同様の因子、等、様々な因子に依存する。
通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を、容易に決定することができる、及び処方することができる。例えば、前記医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために、必要とされるよりも低いレベルで、前記医薬組成物に使用される剤の用量を、処方することがある、及び／又は投与することがある、並びに所望の効果が達成されるまで投薬量を漸増させることがある。
一般的に、本出願に記載の剤の好適な1日用量は、治療効果を生成するのに効果的な、最低用量である、前記剤の量である。そのような有効用量は、一般的に、上記の因子に依存する。
いくつかの実施形態では、前記免疫原性組成物は、ある量のSRS-CoV-2免疫原性ペプチドを、医薬品投薬単位を構成するアジュバントと併用して、含む。医薬品投薬単位を、本出願において、所定の時点で対象に適用される活性成分（例えば、SRS-CoV-2免疫原性ペプチド及び／又はアジュバント）の量として、定義する。医薬品投薬単位を、単一のボリューム(volume)（例えば、単一のショット）で、対象に適用することがある、又は、身体の異なる位置（例えば、右肢及び左肢）に適用する、2、3、4、5又はそれを超えた、別個のボリューム(volume)で又はショットで、適用することがある。単一の医薬品投薬単位を別個のボリューム(volume)で適用する理由は、例えば、ネガティブな副作用を回避する、抗原競合及び／又は組成物分析の考慮事項を回避する等、複数であることがある。医薬投薬量の別個のボリューム(volume)は、組成が異なっていることがある、即ち、異なる種類の又は組成の、活性成分及び／又はアジュバント、を含んでもよいことが、本出願において、理解されるべきである。
医薬品投薬単位は、有効量又は有効量の一部、であることがある。「有効量」は、未治療の対象と比較して、疾患(例えば、COVID-19)の症状(symptom)を、予防するために及び／又は低減するために、必要とされる活性成分の、量又は用量、として、本出願では、理解されるべきである。COVID-19の予防的治療及び／又は治療的治療のための本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、前記対象の年齢、体重、及び全身の健康、に応じて変化する。最終的に、担当の医師又は獣医師は、適切な量及び投薬レジメンを決定する。このような量は、「有効」量と称される。この有効量はまた、治療するべき対象において、有効な細胞性T細胞応答、又はより好ましくは有効な全身性細胞性T細胞応答、を誘導することができる量であることもある。
1つの態様では、本出願は、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を対象において誘発する方法、を提供する。前記方法は、以下を含む：本出願に記載の医薬組成物を、前記対象に投与するステップ、ここで、前記医薬組成物は、前記対象に投与されると、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を誘発する。
一般に、前記免疫応答としては、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、又はその両方、が挙げられる。
体液性応答を、前記医薬組成物を投与された対象からの血清中サンプル中の抗体レベルについての、標準的なイムノアッセイによって、測定することがある。細胞性免疫応答は、T細胞が関与する応答である、及びin vitro又はin vivoで測定することがある。例えば、一般的な細胞性免疫応答を、医薬組成物の投与後の好適な時間での、前記対象からサンプリングした細胞（例えば、末梢血白血球(peripheral blood lymphocyte (PBL))）におけるT細胞増殖活性として、測定することがある。例えば、PBMCを刺激剤と共に、適切な時間期間、インキュベートした後、[3H]チミジン取り込みを測定することがある。増殖しているT細胞のサブセットは、フロー・サイトメトリーを用いて、決定することができる。
ある特定の態様では、本出願で提供される方法は、ヒト及び非-ヒト哺乳動物の両方に投与するステップを含む。獣医学的用途も企図される。いくつかの実施形態では、前記対象は、免疫応答が誘発され得る任意の生物体であってもよい。対象の例としては、限定されるものではないが、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらの遺伝子導入種、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物を、適切な任意の時点で投与することがある。例えば、前記投与するステップを、COVID-19を有する対象の、治療前又は治療中、に行うことがある、及びSARS-CoV-2感染が臨床的に検出できなくなった後に継続することがある。前記投与するステップをまた、再発の徴候を示す対象において、継続することもある。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物を、治療的に又は予防的に有効な量で、投与することがある。前記医薬組成物を前記対象に投与するステップを、既知の手順を用いて、並びに所望の効果を達成するのに十分な、投薬量で及び時間期間で、行うことがある。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物を、任意の好適な部位で、前記対象に投与することがある。投与経路は、非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、静脈内（例えば、留置カテーテルを介する等)、求心性リンパ管を介する、又は前記対象の状態を考慮した適切な任意の他の経路、であることがある。好ましくは、前記用量は、所望の応答をもたらすのに有効な、量で及び時間期間で、投与される、前記免疫応答を誘発する、又は、SARS-CoV-2感染症の及び／若しくはそれに関連する症状(symptom)の、予防的治療若しくは治療的治療、を誘発する。
前記医薬組成物を、前記対象において免疫応答も誘発する療法等の他の療法に、続いて、先行して、又は同時に、投与することがある。例えば、前記対象は、他の形態の免疫調節剤によって、前もって又は同時に、治療を受けていても良い、そのような他の療法は、好ましくは、本出願に記載される組成物の免疫原性を妨害しないような方法で、提供される。
投与するステップは、ケア提供者（例えば、医師、獣医師）によって適切に計時されることがある、並びに、前記対象の臨床症状、投与の目的、及び／又は、企図される若しくは投与される他の療法、に依存することがある。いくつかの実施形態では、初回用量を投与し、免疫学的応答について及び／又は臨床的応答について、前記対象をモニタリングすることがある。免疫学的モニタリングの好適な方法は、応答者としての患者の末梢血リンパ球(PBL)を、及び刺激剤として本出願に記載される免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体を、使用するステップを含む。免疫学的応答をまた、投与部位での遅延性炎症反応によって、測定することもある。初回用量に続く1回以上の用量を、所望の効果が達成されるまで、適切に、典型的には、毎月、ほぼ毎月、又は毎週、投与することがある。その後、必要に応じて、特に免疫学的利益又は臨床的利益が弱まってきている思われる場合には、ブースター用量を又は維持用量を、更に投与することがある。
c. MHC分子の中のペプチドに結合する分子を同定する方法
いくつかの態様では、本出願は、表1A、1B、1C、1D、1E、及び／又は1F、より選択されるペプチド・エピトープに結合する、ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメント、を同定する方法、を提供する。
いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子、即ち、MHC-ペプチド結合分子、は、例えば、細胞の表面で、MHC分子の中で、提示される(presented)又はディスプレイされる(displayed)、ペプチド・エピトープ（MHC-ペプチド複合体）に、結合する（例えば、特異的に結合する）作用能を保持する、分子又はその部分、である。例示的なペプチド結合分子としては、MHC-ペプチド複合体への特異的な結合作用能を示す、T細胞レセプター若しくは抗体、又はそれらの抗原-結合部分、例えば、それらの単鎖免疫グロブリン可変領域（例えば、scTCR、scFv）等、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子は、TCR又はその抗原-結合フラグメント、である。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子は、抗体、例えば、TCR-様抗体、又はその抗原-結合フラグメント等、である。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子は、抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、TCR-様抗体等、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合するように操作されたもの等、を含むTCR-様CAR、である。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子は、天然の供給源に由来することがある、又は、部分的に若しくは全体的に、合成的に若しくは組み換え的に、産生されることがある。
いくつかの実施形態では、ペプチド・エピトープに結合する結合分子は、1種以上の候補ペプチド結合分子（例えば、1種以上の候補TCR分子、抗体、又はそれらの抗原-結合フラグメント等）を、MHC-ペプチド複合体と接触させ、1種以上の候補結合分子の各々が、前記MHC-ペプチド複合体に結合するかどうか（例えば、特異的に結合するかどうか）を評価することによって、同定されることがある。前記方法を、in vitro、ex vivo又はin vivo、で行うことがある。方法は、例えば、米国特許出願公開2020/0102553に記載されるように、スクリーニングのための当該技術分野において周知である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、複数の又はライブラリの結合分子（例えば、複数の又はライブラリの、TCR又は抗体）を、MHC-拘束エピトープと接触させるステップ、及びそのようなエピトープに特異的に結合する分子を、同定するステップ又は選択するステップ、を含む。いくつかの実施形態では、複数の種々な結合分子（例えば、複数の種々なTCR又は複数の種々な抗体等）を含むライブラリ又はコレクションを、MHC-拘束エピトープへの結合について、スクリーニングすることがある又は評価することがある。いくつかの実施形態（MHC-拘性ペプチドに特異的に結合する抗体分子を選択するため等）では、ハイブリドーマの方法を用いることがある。
いくつかの実施形態では、複数の候補結合分子（例えば、候補結合分子の、ライブラリ又はコレクション）を、同時に又は連続して、ペプチド結合分子と個々に接触させる、スクリーニング方法を用いることがある。特定のMHC-ペプチド複合体に特異的に結合するライブラリ・メンバーを、同定することがある又は選択することがある。いくつかの実施形態では、候補結合分子の、ライブラリ又はコレクションは、少なくとも2、5、10、100、103、104、105、106、107、108、109、又はそれを超えた、様々なペプチド結合分子を含むことがある。
いくつかの実施形態では、前記方法を用いて、2つ以上のMHCハプロタイプに又は2つ以上のMHC対立遺伝子に、対する結合を示す、ペプチド結合分子（例えば、TCR又は抗体等）を同定することがある。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子（例えば、TCR又は抗体等）は、複数のMHCクラスIハプロタイプ又は対立遺伝子の中で提示されるペプチド・エピトープ、に特異的に結合する、又は、を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子（例えば、TCR又は抗体等）は、複数のMHCクラスIIハプロタイプ又は対立遺伝子の中で提示されるペプチド・エピトープ、に特異的に結合する、又は、を特異的に認識する。
結合親和性を評価する為の、及び／又は結合分子が特定のリガンド(例えば、MHC-ペプチド複合体)に結合するかどうかを決定する為の、様々なアッセイが既知である。例えば、当該技術分野で周知の任意の多数の結合アッセイを使用すること等によって、ターゲット・ポリペプチドのT細胞エピトープに対するTCRの結合親和性を測定することは、当業者のレベルの範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、BIAcore装置を使用して、2つのタンパク質間の複合体の結合定数を決定することがある。前記複合体の解離定数(KD)を、バッファーがチップ上を通過するときの屈折率の経時変化をモニタリングすることによって、決定することがある。あるタンパク質が別のタンパク質に結合することを測定する為の他の好適なアッセイとしては、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)等のイムノアッセイ、又は蛍光、UV吸収、円偏光二色性若しくは核磁気共鳴(NMR)によって、タンパク質の、分光学的な若しくは光学的な特性の変化をモニタリングすることによる結合の測定、が挙げられる。他の例示的なアッセイとしては、限定されるものではないが、ウェスタン・ブロット、ELISA、分析的超遠心分離、分光法及び表面プラズモン共鳴(Biacore登録商標)解析(例えば、Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; Wilson (2002) Science 295:2103; Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53:2560; 及び米国特許第5,283,173号, 第5,468,614号, 又はそれに均等なもの)、フロー・サイトメトリー、シークエンシング及び発現した核酸を検出する為の他の方法、が挙げられる。1つの例では、TCRに対する見かけの親和性を、種々の濃度の四量体への結合を評価することによって、例えば、ラベルした四量体を用いるフロー・サイトメトリーによって、測定する。1つの例では、TCRの見かけのKDを、ある濃度範囲で、標識した四量体の2倍希釈を用いて、測定する、続いて、非-線形回帰による結合曲線の決定を行う。見かけのKDを、最大結合の半分の結合を生じるリガンドの濃度として決定する。
いくつかの実施形態では、前記方法を使用して、特定のペプチドが前記複合体中に存在する場合にのみ結合する、且つ、特定のペプチドが非存在である場合には、又は別の、重複しない、若しくは無関係のペプチドが存在する場合には、結合しない、結合分子を同定することがある。いくつかの実施形態では、前記結合分子は、その結合ペプチドの非存在下では、前記MHCに実質的に結合しない、及び／又は前記MHCの非存在下では、前記ペプチドに実質的に結合しない。いくつかの実施形態では、前記結合分子は、少なくとも部分的に特異的である。いくつかの実施形態では、例示的な同定された結合分子は、特定のペプチドが存在する場合には、MHC-ペプチド複合体に結合することがある、及び、前記特定のペプチドに対して1つ又は2つの置換を有する関連ペプチドが存在する場合にも、MHC-ペプチド複合体に結合することがある。
いくつかの実施形態では、同定した抗体（例えば、TCR-様抗体）を用いて、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する非-TCR抗体を含むキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)を、産生することがある又は生成することがある。
いくつかの実施形態では、ペプチド結合分子（例えば、TCR若しくはTCR-様抗体又はTCR-様CAR等）を同定する方法を使用して、ペプチド結合分子を発現する又は含む細胞を操作することがある。いくつかの実施形態では、細胞又は操作した細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態では、前記T細胞は、CD4+又はCD8+ T細胞である。いくつかの実施形態では、前記ペプチド結合分子は、MHCクラスIペプチド複合体、MHCクラスIIペプチド複合体、及び／又はMHC-Eペプチド複合体、を認識する。いくつかの実施形態では、MHCクラスIの中のペプチドを特異的に認識する、ペプチド結合分子（例えば、TCR、若しくは抗体、又はCAR等）を使用して、CD8+ T細胞を操作することがある。いくつかの実施形態ではまた、MHCクラスIの中で提示されるペプチドを認識するための、TCRを、抗体を又はCARを、発現する又は含む、操作したCD8+ T細胞の組成物も提供する。そのような実施形態の何れかでは、前記細胞を、養子細胞療法の方法において、使用することがある。
いくつかの実施形態では、TCRライブラリを、PBMC、脾臓又は他のリンパ器官に存在する細胞を含む、対象から単離されたT細胞、に由来するVα及びVβのレパートリーを増幅することによって、生成することがある。いくつかの場合では、T細胞を、腫瘍浸潤リンパ球(tumor-infiltrating lymphocytes (TILs))から、増幅することがある。いくつかの実施形態では、TCRライブラリを、CD4+又はCD8+細胞から、生成することがある。いくつかの実施形態では、前記TCRを、正常な健常対象のT細胞源から、即ち、正常なTCRライブラリから、増幅することがある。いくつかの実施形態では、前記TCRを、罹患した対象のT細胞源から、即ち、罹患TCRライブラリから、増幅することがある。いくつかの実施形態では、縮重プライマーを用いて、Vα及びVPの遺伝子レパートリーを、例えば、ヒトから取得したサンプル（例えば、T細胞等）におけるRT-PCR等によって、増幅する。いくつかの実施形態では、scTvライブラリを、ナイーブなVα及びVβライブラリから組み立てることがある、ここで、その増幅産物は、リンカーによって分離されるように、クローニングされる又は組み立てられる。前記対象の源及び細胞に応じて、前記ライブラリは、HLA対立遺伝子-特異的であることがある。
或いは、いくつかの実施形態では、TCRライブラリを、親TCR分子の又はスキャフォールドTCR分子の、変異誘発又は多様化、によって、生成することがある。例えば、いくつかの態様では、対象（例えば、ヒト又はげっ歯類等の他の哺乳動物）に、本方法によって同定されるペプチド等のペプチドを使って、ワクチン接種することがある。いくつかの実施形態では、血液リンパ球を含むサンプル等のサンプルを、前記対象から取得することがある。いくつかの場合では、結合分子（例えば、TCR）をサンプル（例えば、前記サンプルに含まれるT細胞）から、増幅することがある。いくつかの実施形態では、抗原-特異的なT細胞を、例えば、前記ペプチドに対するCTL活性を評価するためのスクリーニングによって、選択することがある。いくつかの態様では、例えば、抗原-特異的なT細胞上に存在するTCRを、例えば、結合活性（例えば、前記抗原に対する、特定の親和性（affinity）又は親和性（avidity）等）等によって、選択することがある。いくつかの態様では、前記TCRを、（例えば、α又はβ鎖の）指向性進化（例えば、変異誘発等）に供する。いくつかの態様では、前記TCRのCDR内の特定の残基を、改変することがある。いくつかの実施形態では、選択したTCRを、親和性成熟によって改変することがある。いくつかの態様では、選択したTCRを、前記抗原に対する親スキャフォールドTCRとして、使用することがある。
いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒト、例えば、COVID-19を有するヒト等、である。いくつかの実施形態では、前記対象は、げっ歯類、例えば、マウス等、である。いくつかのそのような実施形態では、前記マウスは、遺伝子導入マウス、例えば、ヒトMHC(即ち、HLA)分子（例えば、HLA-A2等）を発現するマウス等、である。Nicholson et al. Adv Hematol. 2012; 2012: 404081、を参照。
いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒトTCRを発現する遺伝子導入マウスである、又は抗原-陰性マウスである。Li et al. (2010) Nat Med. 161029-1034; Obenaus et al. (2015) Nat Biotechnol. 33:402-407、を参照。いくつかの態様では、前記対象は、ヒトHLA分子及びヒトTCRを発現する遺伝子導入マウスである。
いくつかの実施形態では、例えば、前記対象が遺伝子導入HLAマウスである場合、同定したTCRを、例えば、キメラ化されるように又はヒト化されるように、改変する。いくつかの態様では、TCRスキャフォールドは、既知の抗体ヒト化方法と類似なものなど、改変される。
いくつかの実施形態では、そのようなスキャフォールド分子を使用して、TCRのライブラリを生成する。
例えば、いくつかの実施形態では、前記ライブラリは、親TCR分子又はスキャフォールドTCR分子と比較して、改変された又は操作された、TCR又はその抗原-結合部分を含む。いくつかの実施形態では、指向性進化の方法を用いて、特異的なMHC-ペプチド複合体に対してより高い親和性を有する等、変化した特性を有するTCRを生成することがある。いくつかの実施形態では、ディスプレイ・アプローチは、既知の、親の、又は参考のTCRを、操作するステップ、又は改変するステップ、を含む。例えば、いくつかの場合では、野生型TCRを、CDRの内の1つ以上の残基が変異している、変異を誘発させたTCRを産生するための鋳型として使用することがある、及び所望のターゲット抗原に対するより高い親和性等の所望の変化した特性を有する変異体を選択する。いくつかの実施形態では、指向性進化を、限定されるものではないが、例えば、酵母ディスプレイ(Holler et al. (2003) Nat Immunol 4:55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:5387-5392)、ファージ・ディスプレイ(Li et al. (2005) Nat Biotechnol 23:349-354)、又はT細胞ディスプレイ(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods 339:175-184)、等、ディスプレイ方法によって、達成する。
いくつかの実施形態では、前記ライブラリは、可溶性であることがある。いくつかの実施形態では、前記ライブラリは、前記TCRが、ファージの又は細胞の表面上にディスプレイされる、又は、粒子若しくは分子、例えば、細胞、リボソーム若しくは核酸等、例えば、RNA又はDNA等、に結合する、ディスプレイ。ライブラリである。典型的には、前記TCRライブラリ（例えば、正常の及び疾患のTCRライブラリ、又は多様化したライブラリ、等）を、任意の形態（例えば、ヘテロダイマーとして、又は単鎖形態として、等）で生成することがある。いくつかの実施形態では、TCRの内の1つ以上のメンバーは、2本鎖ヘテロダイマー、であることがある。いくつかの実施形態では、Vα鎖とVβ鎖の対合を、ジスルフィド結合の導入によって、促進することがある。いくつかの実施形態では、TCRライブラリのメンバーは、TCR単鎖（scTv又はScTCR）であることがある、いくつかの場合では、リンカーによって分離されたVα鎖及びVβ鎖を含むことがある。更に、いくつかの場合では、前記ライブラリから、TCRを、スクリーニングした時に及び選択した時に、その選択したメンバーを、任意の形態（例えば、全長TCRヘテロダイマー、若しくは単鎖形態、又はそれらの抗原-結合フラグメント等）として、生成することがある。
MHC分子の中のペプチドに結合する分子を同定する他の方法は、米国特許出願第2020/0182884号（その全体が本出願に参照により取り込まれる）にも記載されいる。
d. 臨床試験の中での効果のモニタリング
T細胞応答性（例えば、結合の存在、及び／又はT細胞活性化、及び／又はエフェクター機能）に及ぼすSARS-CoV-2療法（例えば、化合物、薬物、ワクチン、又は細胞療法）の影響をモニタリングすることを、基本的な候補ペプチド-結合分子スクリーニングに際してだけでなく、臨床試験においても、適用することがある。例えば、SARS-CoV-2感染に対する免疫応答（例えば、T細胞免疫応答）を増大させるための、本出願に記載の、SARS-CoV-2免疫原性ペプチド若しくは組成物、そのようなSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸、MHC-ペプチド複合体、又は、核酸、ベクター、免疫原性ペプチド、若しくはMHC-ペプチド複合体を発現する細胞、の有効性を、COVID-19に罹患している対象の臨床試験において、モニタリングすることがある。そのような臨床試験では、結合の存在、及び／又はT細胞活性化、及び／又はエフェクター機能（例えば、T細胞増殖、傷害、又はサイトカイン放出）を、特定の細胞の、組織の、又はシステムの表現型に関する「読み出し（read out）」又はマーカーとして、使用することがある。同様に、本出願に記載のスクリーニング・アッセイによって決定したTCRを発現するように操作したT細胞を用いた適応性T細胞療法の有効性を、又は本出願に記載の、免疫原性ペプチドで、MHC-ペプチド複合体で、又はMHC-ペプチド複合体をコードする及び／若しくは提示する細胞で、刺激して、SARS-CoV-2に感染した細胞に対する免疫応答を増大させたT細胞を用いた適応性T細胞療法の有効性を、COVID-19に罹患した対象の臨床試験において、モニタリングすることがある。そのような臨床試験では、結合の存在、及び／又はT細胞活性化、及び／又はエフェクター機能（例えば、T細胞増殖、傷害、又はサイトカイン放出）を、特定の細胞の、組織の、又はシステムの表現型に関する「読み出し」又はマーカーとして、使用することがある。
1つの実施形態では、本発明は、SARS-CoV-2療法（例えば、化合物、薬物、ワクチン、又は細胞療法）による対象の治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する、前記方法は、以下のステップを含む、a) SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を前記対象に提供する前に、前記対象から取得した第1のサンプルにおいて、前記対象から取得したT細胞と、本出願に記載の1種以上の免疫原性ポリペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ、及び、b) 本出願に記載の、1種以上の免疫原性ポリペプチド又は1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体と、SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を提供した後に、前記対象から取得した第2のサンプルにおいて存在する、前記対象から取得したT細胞との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ、ここで、前記第1のサンプルに対して、前記第2のサンプルにおける応答性の、存在又はより高いレベルは、前記療法が、前記対象におけるSARS-CoV-2を治療するのに有効であることを示す。
例えば、前記SARS-CoV-2療法の処方を増加させることは、前記対象から取得したT細胞と、本出願に記載の1種以上の免疫原性ペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の応答性の、存在又はレベルを増加させるために、即ち、SARS-CoV-2療法の有効性を増加させるために、望ましい場合がある。そのような実施形態によれば、観察可能な表現型応答がない場合であっても、前記対象から取得したT細胞と、本出願に記載の1種以上の免疫原性ペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の応答性の、存在又はレベルを、SARS-CoV-2療法の有効性の指標として、使用することがある。同様に、例えば、直接結合アッセイ、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタン・ブロット、又は細胞内フロー・アッセイ等によって、T細胞と、本出願に記載の1種以上の免疫原性ペプチド又は本出願に記載の1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体との間の応答性の、存在又はレベルの解析を使用して、SARS-CoV-2療法を受ける患者を選択することもある。
例えば、直接結合アッセイでは、免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体を、放射性同位体標識又は酵素標識、とカップリングさせて、その結果、その標識した、免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体、を検出することによって、結合を測定することがある。例えば、免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体を、125I、35S、14C、又は3Hで、直接的に又は間接的に、標識することがある、及び前記放射性同位体を、放射放出の直接計数によって、又はシンチレーション計数によって、検出することがある。或いは、前記免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体を、例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼで、アルカリ・ホスファターゼで、又はルシフェラーゼで、酵素的に標識することがある、及びその酵素標識を、適切な基質から生成物への変換を測定することによって、検出することがある。免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体と、T細胞との間の相互作用、を測定することを、標準的な結合アッセイ又は酵素解析アッセイを用いて、行うこともある。上記アッセイ方法の1つ以上の実施形態では、前記アッセイの自動化に適応する為に、免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体を固定化することが望ましいことがある。
T細胞に対する、免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体の結合を、その反応物を収容するのに適した任意の容器中で、行うことがある。そのような容器の非-限定的な例としては、マイクロタイター・プレート、試験チューブ、及びマイクロ遠心分離チューブ、が挙げられる。本出願に記載の、免疫原性ペプチドの、又はMHC-ペプチド複合体の、固定化形態としては、孔性、ミクロ孔性（平均の孔直径が約1ミクロン未満)又はマクロ孔性（平均の孔直径が約10ミクロンを超える）材料のような、固相（例えば、膜、セルロース、ニトロセルロース、若しくはガラス繊維、等；ビーズ、例えば、アガロース、若しくはポリアクリルアミド、若しくはラテックスでできているビーズ等；又は、例えば、ポリスチレンでできている、ディッシュ、プレート、若しくはウェル、の表面、等）に結合した、免疫原性ペプチド又はMHC-ペプチド複合体、も挙げられる。
いくつかの実施形態では、1種以上の免疫原性ペプチド又は1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体、に対する、T細胞の応答性とは、本出願では、結合の存在、及び／又はT細胞活性化、及び／又はエフェクター機能、を言う。用語「T細胞活性化」とは、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現、から選択されるTリンパ球を指し、特に細胞傷害性Tリンパ球の1種以上の細胞応答を指す。
1種以上の免疫原性ペプチド又は1種以上の安定なMHC-ペプチド複合体、に対する、T細胞の応答性を、本出願に記載の何れかのT細胞の機能的パラメータ（例えば、増殖、サイトカイン放出、細胞傷害性、細胞表面マーカー表現型の変化、等）に従って、測定することができる。
サイトカイン産生及び／又は放出を、当該技術分野で周知の方法［例えば、ELISA、酵素結合免疫吸収性スポット(enzyme-linked immune absorbent spot (ELISPOT))、Luminex(登録商標)アッセイ、細胞内サイトカイン染色、及びフロー・サイトメトリー、並びにそれらの組み合わせ（例えば、細胞内サイトカイン染色とフロー・サイトメトリー）］によって、測定することができる。それを、実施する方法に従って、測定することができる。
本出願で使用される、用語「サイトカイン」とは、生物学的な又は細胞的な、機能又はプロセス（例えば、免疫、炎症、及び造血）、を媒介する、及び／又は、を調節する、分子を指す。本出願で使用される、用語「サイトカイン」としては、「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」、及び「インターロイキン」、が挙げられる。有用なサイトカインの例は、GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, 及び TNF-β、である。
抗原-特異的な免疫応答の誘導又は刺激から生じる、T細胞の、増殖及びクローン増殖を、例えば、トリチウム化チミジン・アッセイ又はMTTアッセイ等の非-放射性アッセイの取り込みを介して、測定することができる。
CTL活性を測定する為の細胞傷害アッセイを、当該技術分野においてルーチンに実施されている、いくつかの技術及び方法のうちの、何れか1つを用いて、実施することがある（例えば、Henkart et al. (2003) Fundamental Immunology 1127-1150）。抗原-特異的なT細胞応答性を測定する為の方法に関する更なる記載を、例えば、米国特許第10,208,086号及び米国特許出願第2017/0209573号、において、見出すことができる（その全体が本出願に参照により取り込まれる）。
VIII. 細胞療法
ある特定の態様では、前記方法は、養子細胞療法を含み、それによって、提供するMHC-拘束性エピトープをターゲティングする分子を発現する、遺伝子操作された細胞（例えば、TCRを又はTCR-様CARを、発現する細胞)を、対象に投与する。そのような投与によって、抗原-ターゲット化の様式で、前記細胞の活性化（例えば、T細胞の活性化）が促進され、その結果、SARS-CoV-2に感染した細胞は、破壊のターゲットとなる。
従って、提供される方法及び使用としては、養子細胞療法の為の、方法及び使用、が含まれる。いくつかの実施形態では、前記方法は、対象への、組織への、又は細胞への、例えば、前記疾患、症状、又は障害、を有する、のリスクがある、又は、を有することが疑われる、対象への、組織への、又は細胞への、前記細胞を又は前記細胞を含む組成物を、投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記細胞を、集団を、及び組成物を、治療するべき特定の、疾患又は症状、を有する対象に（例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法等、を介して）投与する。いくつかの実施形態では、前記細胞を又は組成物を、前記対象（例えば、前記疾患又は症状、を有する、又は、のリスクがある、対象等）に、投与する。いくつかの態様では、前記方法は、それによって、疾患の又は症状(condition)の、1つ以上の症状(symptom)を、治療する、例えば、改善する。
養子細胞療法の為の細胞を投与する為の方法は、既知である、並びに、養子細胞療法の為の細胞を投与する為の方法を、提供する方法に及び組成物に、関連して使用することがある。例えば、養子T細胞療法は、例えば、Gruenberg et alの米国特許出願公開第2003/0170238号； Rosenberg の米国特許第4,690,915号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8:577-585)、に記載されている。 例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31: 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438: 84-89; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8:e61338、を参照のこと。
いくつかの実施形態では、前記細胞療法（例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法）を、自家移植（この自家移植では、前記細胞を、前記細胞療法を受けようとする対象から、又は、そのような対象に由来するサンプルから、単離する、及び／又はその他、調製する）によって実施する。従って、いくつかの態様では、前記細胞は、治療を必要とする対象（例えば、患者）に由来する、及び前記細胞を、単離してプロセシングを施した後に、同じ対象に投与する。
いくつかの実施形態では、前記細胞療法（例えば、養子細胞療法、例えば、養子T細胞療法）を、同種異系移植（この同種異系移植では、前記細胞を、前記細胞療法を、受けようとする対象以外の、又は究極的に受ける対象以外の、対象［例えば、第1の対象］から、単離する、及び／又はその他、調製する）によって実施する。そのような実施形態では、前記細胞を次いで、同じ種の別の対象［例えば、第2の対象］に投与する。いくつかの実施形態では、前記第1及び第2の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、前記第1及び第2の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの実施形態では、前記第2の対象は、前記第1の対象と同じHLAクラス又はスーパータイプ（supertype）を発現する。
いくつかの実施形態では、前記細胞を、細胞集団を、又は組成物を、投与する対象は、ヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態では、前記霊長類は、サル又は類人猿、である。前記対象は、雄性又は雌性であってもよい、並びに任意の適切な年齢（例えば、乳児の、若年の、青年の、成人の、及び高齢の、対象等）であってもよい。いくつかの実施形態では、前記対象は、げっ歯類等の非-霊長類哺乳動物である。いくつかの実施例では、前記患者又は対象は、疾患の為の、養子細胞療法の為の、及び／又はサイトカイン放出症候群(cytokine release syndrome (CRS))等の毒性アウトカムを評価する為の、有効な動物モデルである。
前記結合分子［例えば、TCR、TCR-様抗体、及び前記TCR-様抗体を含むキメラ・レセプター（例えば、CAR）］を、並びに同分子を発現する細胞を、任意の好適な方法によって、例えば、注射投与、例えば、静脈内注射投与若しくは皮下注射投与、眼内注射投与、眼球周囲注射投与、網膜下注射投与、硝子体内注射投与、経中隔注射投与、強膜下注射投与、脈絡膜内注射投与、前房内注射投与、結膜下注射投与(subconjectval injection)、結膜下注射投与(subconjuntival injection)、テノン叢下注射投与（sub-Tenon's injection）、球後注射投与(retrobulbar injection)、球周囲注射投与(peribulbar injection)、又は、後強膜近傍送達（posterior juxtascleral delivery）、によって、投与することがある。いくつかの実施形態では、それらを、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに、局所治療の為に所望であれば、病巣内投与、によって、投与する。非経口投与にとしては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与、が挙げられる。投薬及び投与は、その投与が、短期であるか、又は慢性であるか、に部分的に依存することがある。様々な投薬スケジュールとしては、限定されるものではないが、様々な時点にわたる、単回投与又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス投与、が挙げられる。
疾患の、予防又は治療、を目的として、結合分子の又は細胞の適切な投薬量は、治療するべき疾患の種類、結合分子の種類、前記疾患の重症度及び経過、前記結合分子が予防目的又は治療目的の為に投与されるかどうか、過去の治療、患者の臨床歴及び前記結合分子に対する応答性、並びに担当医の裁量、に依存する。前記組成物、及び分子、並びに細胞を、いくつかの実施形態では、一度に、又は一連の治療にわたって、前記患者に、適切に、投与する。
ある特定の実施形態では、前記細胞を、又は細胞のサブタイプの個々の集団を、約100万個から約1000億個の細胞の範囲、及び／又は体重1キログラム当たりの細胞のその量、例えば、100万から約500億個の細胞（例えば、約500万個の細胞、約2500万個の細胞、約5億個の細胞、約10億個の細胞、約50億個の細胞、約200億個の細胞、約300億個の細胞、約400億個の細胞、若しくは前述の値の何れか2つによって定義される範囲）、例えば、約1000万から約1000億個の細胞（例えば、約2000万個の細胞、約3000万個の細胞、約4000万個の細胞、約6000万個の細胞、約7000万個の細胞、約8000万個の細胞、約9000万個の細胞、約100億個の細胞、約250億個の細胞、約500億個の細胞、約750億個の細胞、約900億個の細胞、若しくは前述の値の何れか2つによって定義される範囲）、及びいくつかの場合では、約1億個の細胞から約500億個の細胞（例えば、約1億2000万個の細胞、約2億5000万個の細胞、約3億5000万個の細胞、約4億5000万個の細胞、約6億5000万個の細胞、約8億個の細胞、約9億個の細胞、約30億個の細胞、約300億個の細胞、約450億個の細胞）、若しくはこれらの範囲の間の任意の値、並びに／又は体重1キログラム当たり、で、前記対象に投与する。投薬量は、疾患若しくは障害、及び／若しくは患者、並びに／又は他の治療、に特有の属性に応じて、変化することがある。
いくつかの実施形態では、例えば、前記対象がヒトである場合、前記用量は、全部で約1×108未満の、組み換えレセプター（例えば、CAR）-発現細胞、T細胞、又は末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells (PBMC))を含む、例えば、約1×106から1×108の範囲のそのような細胞、例えば、2×106、5×106、1×107、5×107、若しくは1×108若しくは全部の、そのような細胞等、又は前記の数値の何れか2つの間の範囲である。
いくつかの実施形態では、前記細胞又は結合分子（例えば、TCR又はTCR-様抗体）を、併用治療の一部として、別の治療的介入、例えば、別の抗体又は操作した細胞又はレセプター又は薬剤等、例えば、細胞傷害性薬剤又は治療薬剤等、と、例えば、同時に、又は任意の順序で逐次的に、投与することがある。
いくつかの実施形態では、前記細胞又は結合分子（例えば、TCR又はTCR-様抗体）を、1種以上の追加の治療薬剤と、又は別の治療的介入と関連して、同時に、又は任意の順序で逐次的に、共-投与することがある。いくつかの状況では、前記細胞を、その細胞集団が、1種以上の追加的な治療薬剤の効果を増強するように、又はその逆であるように、十分に近い時点で、別の療法と、共-投与する。いくつかの実施形態では、前記細胞又は結合分子（例えば、TCR又はTCR-様抗体）を、1種以上の追加的な治療薬剤の前に、投与する。いくつかの実施形態では、前記細胞又は結合分子（例えば、TCR又はTCR-様抗体）を、1種以上の追加的な治療薬剤の後に、投与する。
前記細胞を哺乳動物（例えば、ヒト）に投与すると、いくつかの態様では、その操作した細胞集団及び／又は結合分子（例えば、TCR又はTCR-様抗体）の生物学的活性を、多くの既知の方法の何れかによって、測定する。評価するパラメーターとしては、in vivoでの（例えば、イメージングによって）、又はex vivoでの（例えばELISA又はフロー・サイトメトリーによって）、操作したT細胞の若しくは天然のT細胞の、又は他の免疫細胞の、抗原に対する特異的な結合、が挙げられる。ある特定の実施形態では、ターゲット細胞を破壊するという前記操作した細胞の作用能を、当該技術分野において既知の好適な方法（例えば、細胞傷害アッセイ等、例えば、Kochenderfer et al. (2009) J. Immunotherapy 32:689-702, 及び Herman et al. (2004) J. Immunological Methods 285:25-40、に記載される細胞傷害アッセイ等）、を用いて測定することがある。ある特定の実施形態では、前記細胞の生物学的活性を、ある特定のサイトカイン（例えば、CD107a、IFNγ、IL-2、及びTNF等）の発現、及び／又は、の分泌、をアッセイすることによって、測定することもある。いくつかの態様では、前記生物学的活性を、臨床アウトカム、例えば、腫瘍組織量(tumor burden)又は負荷(load)の低減等、を評価することによって、測定する。
ある特定の実施形態では、操作した細胞を、それらの治療的有効性又は予防的有効性が、増加するように、あらゆる数の方法で改変する。例えば、前記集団が発現する、操作したCAR、又はTCRは、ターゲティング部分構造へ、直接的に、又はリンカーを介して間接的に、コンジュゲートすることがある。化合物（例えば、CAR、又はTCR）をターゲティング部分構造へコンジュゲートする実務は、当技術分野において、既知である。例えば、Wadwa et al. (1995) J. Drug Targeting 3:111 及び米国特許第5,087,616号、を参照のこと。
ある特定の態様では、SARS-CoV-2-プライミングした、抗原-提示細胞を、及び／又は、これらの抗原-提示細胞を使って生成される、SARS-CoV-2-特異的リンパ球を、提供するための組成物及び方法において、本出願に記載されるSARS-CoV-2免疫原性ペプチドを、又はそのようなSARS-CoV-2免疫原性ペプチドをコードする核酸を、使用することがある。いくつかの実施形態では、そのような抗原-提示細胞及び／又はリンパ球を、COIVD-19（即ち、SARS-CoV-2感染症）を、治療する際に、及び／又は予防する際に、使用する。
いくつかの態様では、抗原-提示細胞を、本出願に記載のSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドと、又は少なくとも1つのSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と、接触させることによって（前記抗原-提示細胞が、少なくとも1つのSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドを提示するのに十分な条件下のin vitroで、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、接触させることによって）、SARS-CoV-2-プライミングした、抗原-提示細胞を作製するための方法を、本出願は、提供する。
いくつかの実施形態では、前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドを、又は前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、抗原-提示細胞を含む、均質な、実質的に均質な、又は不均質な、組成物と、接触させることがある。例えば、前記組成物は、限定されるものではないが、全血、新鮮血液、又はこれらの分画（例えば、限定されるものではないが、末梢血単核細胞、全血の軟膜分画、濃縮赤血球、照射済み血液、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球、ナチュラル・キラー細胞、及びナチュラル・キラーT細胞、等）、を含むことがある。任意選択的に、抗原-提示細胞の前駆体を使用する場合、前記前駆体を抗原-提示細胞に分化させるのに十分な、好適な培養条件下で、前記前駆体を培養することがある。いくつかの実施形態では、前記抗原-提示細胞（又はその前駆体）は、単球、マクロファージ、骨髄系列の細胞、B細胞、樹状細胞、又はランゲルハンス細胞、より選択される。
単独で、又はアジュバントと組み合わせて、抗原-提示細胞と接して配置される、前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドの量を、又は前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸の量を、ルーチンな実験によって、当業者は決定することがある。一般的に、抗原-提示細胞を、前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドと、又は前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、細胞が、T細胞を変調させるためにプロセシングされた形態の抗原を、提示するのに十分な時間期間、接触させる。1つの実施形態では, 抗原-提示細胞を、前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドの存在下で、又は前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸の存在下で、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、約1週間未満、例えば、約1分から約48時間、約2分から約36時間、約3分から約24時間、約4分から約12時間、約6分から約8時間、約8分から約6時間、約10分から約5時間、約15分から約4時間、約20分から約3時間、約30分から約2時間、及び約40分から約1時間、インキュベートする。単独で、又はアジュバントと組み合わせて、抗原-提示細胞が前記抗原を、プロセシングするために及び提示するために、必要な、時間を、及び前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドの量を、又は前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸の量を、例えば、パルス-チェイス方法（pulse-chase method）を使用して、決定することがある、ここで、接触させた後、ウォッシュアウトの時間（washout period）を取る、及びリード-アウト・システム（read-out system）、例えば、抗原応答性T細胞、に暴露させる。
ある特定の実施形態では、抗原-提示細胞の内因性プロセシング経路に抗原を送達させるための任意の適切な方法を、使用することがある。そのような方法としては、限定されるものではないが、pH-感受性リポソーム、抗原をアジュバントにカップリングさせること、アポトーシス細胞送達、樹状細胞に細胞をパルスすること、抗原を含む組み換えキメラ・ウイルス-様微粒子(virus-like particles (VLPs))を樹状細胞株のMHCクラスIプロセシング経路に送達すること、を含む方法、が挙げられる。
1つの実施形態では、可溶化したSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドを、抗原-提示細胞と共に、インキュベートする。いくつかの実施形態では、前記SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドを、MHCクラスI経路に送達するために、細胞溶解素にカップリングさせて、抗原-提示細胞の細胞質ゾルの中に前記抗原が移動することを増強させることがある。例示的な細胞溶解素としては、サポニン化合物、例えば、サポニン含有免疫刺激複合体(Immune Stimulating Complexes (ISCOM5))、孔-形成毒素(例えばアルファ-毒素)、並びにグラム-陽性バクテリアの天然細胞溶解素、例えば、リステリオリシンO(listeriolysin O (LLO))、ストレプトリシンO(streptolysin O (SLO))、及びパーフリンゴリシンO(perfringolysin O (PFO))、が挙げられる。
いくつかの実施形態では, 抗原-提示細胞（例えば、樹状細胞及びマクロファージ等）を、当該技術分野で既知の方法に従って単離することがある、及びSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を抗原-提示細胞の中に導入するための当該技術分野で既知の方法によって、ポリヌクレオチドで、トランスフェクションすることがある。トランスフェクション試薬及び方法は、当該技術分野において既知である、及び市販されている。例えば、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードするRNAを、好適な媒体中で、提供することがある、及び抗原-提示細胞と接触させる前に、脂質（例えば、カチオン性脂質）と合わせることがある。そのような脂質の非-限定的な例としては、LIPOFECTINTM及びLIPOFECTAMINETM、が挙げられる。次いで、得られたポリヌクレオチド-脂質複合体を、抗原-提示細胞と接触させることがある。或いは、前記ポリヌクレオチドを、例えば、エレクトロポレーション又はリン酸カルシウム・トランスフェクション等の技術を用いて、抗原-提示細胞の中に導入することがある。次いで、ポリヌクレオチド-負荷した抗原-提示細胞を使用して、in vivo又はex vivoで、Tリンパ球（例えば、細胞傷害性Tリンパ球）増殖を刺激することがある。1つの実施形態では、そのex vivoで増殖させたTリンパ球を、養子免疫療法の方法で、対象に投与する。
ある特定の態様では、抗原-提示細胞（前記抗原-提示細胞が、SARS-CoV-2免疫原性エピトープを提示するのに十分な条件下、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、in vitroで、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドと、又はSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と、接触させた抗原-提示細胞）を含む組成物を、本出願は提供する。
いくつかの態様では、SARS-CoV-2タンパク質に特異的なリンパ球を調製するための方法を、本出願は提供する。前記方法は、SARS-CoV-2ウイルスが感染した細胞に対する免疫応答を誘発することができるSARS-CoV-2タンパク質-特異的リンパ球を生成するのに十分な条件下で、リンパ球を、上記の抗原-提示細胞と、接触させるステップ、を含む。従って、前記抗原-提示細胞を使用して、SARS-CoV-2ウイルスが感染した細胞に対する免疫応答を誘発するためのリンパ球（例えば、Tリンパ球及びBリンパ球等）、を提供することもある。
いくつかの実施形態では、Tリンパ球の調製物を、上記の抗原-提示細胞と、ある時間期間（例えば、少なくとも約24時間）接触させて、抗原-提示細胞によって提示されるSARS-CoV-2免疫原性エピトープに対して、Tリンパ球をプライミングする。
いくつかの実施形態では、SARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドと共に、又はSARS-CoV-2免疫原性ポリペプチドをコードする核酸と共に、これら単独で、又は更にアジュバントと組み合わせて、抗原-提示細胞の集団を、末梢血Tリンパ球のヘテロな集団と、共-培養することがある。前記SARS-CoV-2ポリペプチドに含まれるSARS-CoV-2エピトープが、前記抗原-提示細胞によって提示されるのに十分な、及び前記抗原-提示細胞が、前記SARS-CoV-2が感染した細胞に対して応答するようにTリンパ球の集団をプライミングするのに十分な、時間期間で、及び条件下で、前記細胞を共-培養することがある。ある特定の実施形態では、SARS-CoV-2ウイルスが感染した細胞に応答するようにプライミングされた、Tリンパ球及びBリンパ球を、本出願は提供する。
Tリンパ球を、任意の好適な供給源（例えば、末梢血、脾臓、及びリンパ節等）から取得することがある。前記Tリンパ球を、粗調製物として、又は部分的に精製された若しくは実質的に精製された調製物として、使用することがある、そしてこれを、標準的な技術、例えば、限定されるものではないが、抗体を使用する、免疫磁気技術又はフロー・サイトメトリー技術等、によって、取得することがある。
ある特定の態様では、上記の抗原-提示細胞又はリンパ球、並びに薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤、を含む組成物（例えば、医薬組成物）を、本出願は提供する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、上記のように、アジュバントを、更に含む。
ある特定の態様では、SARS-CoV-2ウイルスが感染している細胞に対する免疫応答を誘発するための方法を、本出願は提供する、ここで、前記方法は、上記の抗原-提示細胞又はリンパ球を、前記免疫応答を誘発するのに十分な有効量で、前記対象に投与するステップ、を含む。いくつかの実施形態では、COVID-19を、治療するための又は予防するための、方法、ここで、前記方法は、上記の抗原-提示細胞又はリンパ球の有効量を、前記対象に投与するステップ、を含む。1つの実施形態では、前記抗原-提示細胞を、又は前記リンパ球を、全身的に、好ましくは、注射投与によって、投与する。或いは、全身的ではなく局所的に、例えば、組織の中への直接的な注射投与を介して、好ましくはデポ(depot)剤又は徐放性製剤として、投与することがある。
ある特定の実施形態では、COVID-19を、予防的治療をするための又は治療的治療するための、免疫調節組成物中の活性化合物として、本出願に記載の抗原-プライミングをした抗原-提示細胞を、及びこれらの抗原-提示細胞を用いて作製した抗原-特異的なTリンパ球を、使用することがある。いくつかの実施形態では、本出願に記載される、SARS-CoV-2-プライミングした抗原-提示細胞を、前記対象への養子移入のための、CD8+ Tリンパ球、CD4+Tリンパ球、及び／又はBリンパ球、を生成するために、使用することがある。従って、例えば、SARS-CoV-2-特異的なリンパ球を、COVID-19に罹患している対象において、治療目的のために、養子移入することがある。
ある特定の実施形態では、免疫応答を誘発するために、特にSARS-CoV-2ウイルスが感染した細胞に対する免疫応答を誘発するために、本出願に記載される、抗原-提示細胞及び／又はリンパ球を、それ自体、又は組み合わせ、の何れかで、対象に投与することがある。いくつかの実施形態では、前記抗原-提示細胞及び／又はリンパ球は、前記対象に由来することがある（即ち、自己細胞）、又は前記対象と、MHCが一致又は不一致（例えば、同種異系）である別の対象に由来することがある。
前記抗原-提示細胞及びリンパ球の、単回投与又は複数回投与を、ケア提供者（例えば、医師）が選択する細胞数及び治療で、実施することがある。いくつかの実施形態では、前記抗原-提示細胞及び／又はリンパ球を、薬学的に許容可能な担体の中に入れて、投与する。好適な担体は、前記細胞を増殖させた増殖培地、又はリン酸緩衝生理食塩水等の任意の好適な緩衝培地、であることがある。前記細胞を、単独で、又は他の治療薬と併せた補助療法として、投与することがある。
IX. キット
本発明はまた、キットを包含する。例えば、前記キットは、免疫原性ペプチド、免疫原性ペプチドをコードする配列を含むベクター、本出願に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、アジュバント、及びそれらの組み合わせ、を、好適な容器に包装されて、含むことがある、並びにそのような試薬を使用する為の説明書を更に含むことがある。前記キットはまた、他の構成要素（例えば、別の容器に包装された投与ツール等）を含むこともある。
本開示を、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によって、更に説明する。この出願を通して引用される、全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願、並びに図面、の内容は、本出願に参照により取り込まれる。
実施例１： SARS-CoV-2ワクチン構築物
SARS-CoV-2に対する最も強力な可能性のあるCD8 T細胞応答を生じさせるワクチンを構築するための検討を行った。これには、個々のエピトープ各々に対する応答の大きさ、並びにターゲット化するエピトープ全体の幅、を最大化すること、が含まれる。同時に、ワクチンの設計は、いくつかの制約に直面する。1つの重要な検討項目は、ワクチン構築物全体のサイズが限られることである；即ち、過剰なサイズは、ワクチン送達システム（例えば、mRNA又はウイルス・ベクター等）にとっての課題となり、完全な構築物の効率的な発現を妨げ得る。
ポリエピトープ・ワクチンに、本当に堅牢なT細胞応答を生み出す作用能があるかについては、当分野においてかなりの疑念がある。この疑念は、2つの主な課題に集中している。第1の課題は、ワクチンに含まれるエピトープの限られた組、に関する。ポリエピトープ・ワクチンは主に、別個にコードされたペプチド・エピトープのみを含む。対照的に、タンパク質全体を含むワクチンは、数千の異なるエピトープにプロセシングされる - 異なるエピトープが異なるMHC対立遺伝子上に提示される。SARS-CoV-2のSタンパク質の大きさのタンパク質は、考えられる全てのMHC対立遺伝子について、多数の予測される高親和性結合体が存在するほど、多くの潜在的なエピトープを含む。ポリエピトープ・ワクチンの課題は、限定的な、MHC-拘束性の、所定の組のエピトープに対して、タンパク質全体に対して自然に得られるよりも、より強い応答を誘発するか、ということである。第2の課題は、ポリエピトープ・ワクチンの状況における、エピトープの、プロセシング及び提示、に関する。SARS-CoV-2感染症の状況において、発見されたエピトープが、効率的に提示されるからといって、それらが、ポリエピトープ・ワクチンの状況において、提示されるであろうことを、意味しない。この懸念は、ポリエピトープ・ワクチンに含まれるエピトープの数が限られているために、特に深刻である；即ち、前記ワクチン中のエピトープのごく僅かな部分でも提示されないことによって、特定のMHC対立遺伝子に対する応答を誘発するワクチンの作用能に劇的な影響を及ぼす可能性がある。
これらの課題は、当該分野において広く理解されている、そして、他のウイルスに対するポリエピトープ・ワクチンの開発の成功を妨げている。実際、近年行われたSARS-CoV-2エピトープ・マッピングの研究を、及び各々のMHC対立遺伝子上で認識される、限られた組の高度に免疫優性なエピトープが同定されたことを、鑑みたとしても、これらの生物学的な洞察が、これらの基本的な課題を克服する効果的なワクチンへと、トランスレーションされ得るかどうかについて、かなりの懐疑的な見方があった。
ポリエピトープ・ワクチンの設計に際して、1)前記ワクチンに含まれる内容物、及び2)前記内容物が発現する状況、を含む、2組のオープン-エンドな決定、がなされる。
これらの決定の両方に対する幅広い選択肢を、探索した。これまでに作製した独自の試薬（回復期のCOVID19患者群に由来する、高-活性メモリーCD8 T細胞)を利用して、様々な組のワクチンを設計し、実験的に検討した。
特に、DNA配列を、設計したタンパク質ワクチンの配列から逆翻訳した、次いで、GenSmartTMコドン最適化アルゴリズム（GenScript, Inc.; PCT公開 WO 2020/0024917 も参照のこと）を用いて、配列を最適化した。そのDNAをgBlocks(Integrated DNA Technologies Inc.)として注文し、NEBuilder （登録商標） HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs; Cat. #E2621S)を使用して、EcoRI-線状化pHAGE-CMV-IRES-Puroベクター(Kula et al. (2019) Cell 178:1016-1028)の中に組み立てた。組立体を、Mix & Go! 化学的なコンピテント細胞(Zymo Research; カタログ番号T3007)の中に形質転換し、個々のコロニーを選択して、サンガー・シークエンシング（Sanger sequencing）を行った。
A*02:01-発現HEK293細胞を、各々のワクチン構築物を使って、1とう感染多重度(multiplicity of infection (MOI))で、形質導入し、ピューロマイシン(1.5 ug/mL、Gibco)を用いて、選択した。5x104個の細胞を、96ウェル・プレートに播種し、16時間、静置した。回復期COVID-19患者から単離したメモリーCD8 T細胞（Ferretti et al. (2020) Immunity S1074-7613(20)30447-7; doi.org/10.1016/j.immuni.2020.10.006で利用可能）を、2:1というエフェクター対ターゲットの比率で、添加し、16-18時間、インキュベートした。インキュベートした後、前記細胞をピペッティングにより混合し、V-底96-ウェル・プレートに移し、300xgで5分間、遠心分離をすることによりペレット化した。その上清を収集し、Ella（Protein Simple）を用いて、IFNガンマを、測定した。その細胞ペレットを、BV421-コンジュゲートした抗-CD8(BioLegend)、AF647-コンジュゲートした抗-CD69(Biolegend)、及びPE-コンジュゲートした抗-CD137(Miltenyi)抗体、で染色し、Cytoflex S (Beckman Coulter)で解析した。
本結果は、ワクチンの状況及び内容の両方が、その性能に、予測されなかった様式で、深刻な影響を及ぼすこと、を実証した。更に、設計したワクチン構築物は、臨床試験にある現行のワクチン候補よりも、より堅牢なCD8 T細胞応答を生成する点で、非常に有望であること、が観察された。
6種の最もありふれたMHC対立遺伝子上に提示された免疫優性エピトープが同定された： HLA-A*02:01、HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、及びHLA-B*07:02。同定された29種の免疫優性エピトープ全て（6種のA2、8種のA1、4種のA3、5種のA11、3種のA24、3個のB7）、又は19種の免疫優性エピトープ（各々のMHCから3-4)、の何れかをコードするポリエピトープ・ワクチンを設計した。19種のエピトープを選択する際に、複数MHC対立遺伝子上での提示が、予測された又は検証された、エピトープを含めた。これらの19種のエピトープは、以下に特定される表L1由来のサブセットを含む。
表L1及び表L2から構成される以下の表Lは、開示する構築物において使用され得る29種のペプチド・エピトープを同定する（例えば、表L1における配列、及び表L2における更なるデータ）。表Lは、orf3a、M、及びN、並びにorf1ab、タンパク質が、T細胞エピトープを含むためのホットスポットであること、を明確に示すことに留意されたい。
表L1
表L2
ワクチンとの関連に関して、1つの重要な要因は、エピトープ間のリンカーである。前記リンカーは、前記エピトープが、効率的にプロセシングされ、提示される可能性が高いかどうかの重要な決定要因である。試験した構築物は、全くリンカーを有さない（直接連結）、各エピトープの上流及び下流の3aa（隣り合うエピトープ間の合計で6aaの間隔）、又は各組のエピトープ間に最適化されたプロテアソーム切断配列「KAA」、の何れかを有していた。更なる研究には、ポリエピトープ・ワクチン内のエピトープの順序の最適化も含まれた。本出願で、本目的は、高い親和性でMHCに結合するが、SARS-CoV-2ゲノム中には見出されない、接合部エピトープの生成を最小限にすることであった；そのようなエピトープは、所望のエピトープと、提示について、競合する。アルゴリズムを開発して、ポリエピトープの構築物内の、最も高い親和性が予測されたエピトープを除去するために、エピトープの順序を反復的に変更した。このアルゴリズムを、10,000種の出発構築物に適用し、最良の最終的な性能を有するバリアントを選択した。特に、差異に寄与する変数は、接合部ネオエピトープを評価する際にどのHLA対立遺伝子を考慮するのかに関する選択である、ことが決定された。前記アルゴリズムの目的のために、表Lのエピトープが提示される6種のHLA対立遺伝子を、選択した。次に、選択したエピトープ間の全ての考えられる接合に関する包括的な組を、生成した。NetMHC4.0アルゴリズム(Jurtz et al. (2017) J. Immunol. 199:3360-3368)を使用して、検討した6種のMHC対立遺伝子上のMHC結合エピトープを決定した。各々の接合部について、天然のウイルス配列に由来しない（即ち、接合自体に起因して生じる）最も高い親和性が予測された結合体を、同定した。次に、前記エピトープについて、ランダムな開始順序、を割り当てた。所与の順序について、最も高い親和性が予測された接合部エピトープを、同定した。前記構築物内で2つのエピトープを交換することができる、全ての考えられる方法を評価し、最も低い親和性が残る接合部エピトープをもたらすエピトープ交換、を選択した。エピトープ交換が前記構築物を更に改善することができなくなるまで、このプロセスを、反復した。このアルゴリズム全体を、10,000種のランダムな開始順序で実行し、最良のパフォーマンスの最終順序（即ち、最も高い-親和性の接合部エピトープが最も低い可能性の親和性を有する順序）を選択した。
種々の構築物を設計する過程で、ポリエピトープ・ワクチン内の個々のエピトープの位置も変化させた。最後に、設計したポリエピトープ・ワクチンを、細胞質において、又は天然のSARS-CoV-2のSタンパク質の後のポリシストロニックな発現の状況において（P2A配列を使用して、Sタンパク質のその天然のシグナル配列を使用する膜貫通発現の直後に、我々のポリエピトープ・ワクチンの細胞質発現を可能にする）、発現するスタンド-アロン（atand-alone）な構築物として、構築した。
これらの構築物を評価するために、レンチウイルスによる形質導入を（低いMOIで）使用して、HLA-A*02:01のみを発現するHEK293T細胞中で、各々の構築物を発現させた。次いで、その改変したHEK293T細胞を、回復期のCOVID-19患者（例えば、A*02:01-陽性のCOVID-19患者）のパネル由来のメモリーCD8 T細胞と、共-培養した。IFNガンマ(IFNg)の分泌を用いて、任意の提示されたエピトープに対する、T細胞応答の強度、を評価した。これは、各々のワクチンの状況において、前記エピトープがどれだけ効率的に提示されるか、に関する読み出し（readout）となる。以前の研究に基づいて、大部分のCOVID19回復期の患者は、試験したエピトープに対するメモリーCD8 T細胞を生成することが知られていた、従って、前記応答の強度は、各々のワクチン構築物において、前記エピトープがどれだけ効率的に提示されるか、に関する直接的な読み出し（readout）となった。
いくつかの重要なコントロールを含めた。最初に、HEK293T細胞単独（あらゆるウイルス配列無し）を試験した、これは、ネガティブ・コントロールとしての役割を果たした(「A2スクレップス（A2 Screps）」)。第2に、一組の3つの免疫優性HLA-A*02:01 SARS-CoV-2エピトープによるペプチド・パルスを、ポジティブ・コントロールとして使用した（ペプチド・パルスを行うと、高い効率で、MHCの上に直接的に負荷されるから）(「A2 Screps + KLW/YLQ/LLY」)。第3に、Sタンパク質単独を使用した。これは、臨床試験において現在試験されているリード構築物である、そしてこれにより、前記ポリエピトープの構築物により誘発されたT細胞応答の大きさを、このベースラインと、比較することが可能になる。最後に、3つの免疫優性HLA-A*02:01エピトープの各々に架かる~500aaの大きなフラグメントもまた、パルス実験に含めた。
本実験の結果を図３及び図４に示す、並びにいくつかの重要な結果を決定した。
第1に、各々のワクチンの状況に応じて、エピトープ提示の効率性の間に有意差があることが観察された。特に、各々のエピトープの上流及び下流の3つのアミノ酸を使用することは、リンカーの非存在よりも、又はKAAリンカーを使用することよりも、優れている、と同定された。第2に、前記構築物が細胞質で発現することが重要であることが観察された。実際、Sタンパク質が免疫優性HLA-A*02:01エピトープの内の1つを含んでいたという事実にも拘わらず、全長Sタンパク質に対する非常に弱い応答が、いずれの患者でも、観察された。実際、このエピトープ(「ORF S-1」)に架かるSタンパク質由来の500 aaのフラグメントの発現は、より強い応答をもたらし、それによって、全長Sタンパク質が、特に不良な提示をもたらす、ことが強調される。第3に、前記ポリエピトープ・ワクチンを直接的に発現させることは、P2A配列を使用することよりも、より強い発現がもたらされること、が観察された。一般的に、27個のエピトープからの発現は、19個のエピトープからの発現よりも、より強い応答をもたらした。
しかしながら、最も顕著な結論は、全体としてのワクチン構築物の効率性であった。試験したポリエピトープの構築物の全ては、Sタンパク質単独よりも、劇的により堅牢なT細胞活性をもたらした、及び最適な構築物の内のいくつかは、ポジティブ・コントロールのペプチドでパルスするよりも、より良好に機能した。この結果は、非常に驚くべきことであり、適切なエピトープ、リンカー、及びタンパク質状況、を使用する場合での、ポリエピトープ・ワクチンのポテンシャルを強調する。
これらの結果は、技術水準（ポリエピトープの構築物の有用性に懐疑的であった）とは、全く対照的である。例えば、Korber et al. (2009) J. Virol. (2009) 83: 8300-8314は、HIVに対するT-細胞に基づくワクチン・アプローチの広範な概観を提供する、及びそのポリエピトープ・ワクチンに関するセクションでは、この理論的アプローチによって、免疫原生の欠如が観察されることが、強調されている。
実施した研究に基づいて、以下の2つが重要であることが見出された。第1は、エピトープ自体のアイデンティティである。含まれるエピトープは、最も高いレベルの機能的検証を有するものである - それらは、実際のSARS-CoV-2感染症の状況において、免疫優性である。他のエピトープは、予測されるか、質量分析によって感染した細胞上で検出されるか、又は感受性抗原-特異的に増殖した後に回復期の患者によって認識されるか、の何れかであることが同定されている；即ち、これは、それらが、免疫優性であること（並びに、それ故に、ワクチンの状況において、最も免疫原性であること、及び前記免疫システムによって効率的に認識される、可能性が高いこと) を示さない。第2は、含まれるエピトープの個数である。いくつかの実施形態では、エピトープを、広い多様性のHLA型をカバーするように選択する（例えば、6種の最もありふれたHLAの内の各々につき、少なくとも1つの免疫優性エピトープ）。複数のHLA対立遺伝子によって提示されるいくつかのエピトープが存在すること、そして、僅か4又は5種のエピトープを使って、6種の対立遺伝子の各々での単一の免疫優性エピトープを取得することが可能なこと、に留意されたい。従って、例えば、6種の最もありふれたHLAの各々につき、少なくとも1つの免疫優性エピトープに関する最小限のカバーを、例えば、4、5、6、又はそれを超えたエピトープを使って達成することができ、それによって、前記集団におけるHLA多様性を合理的にカバーすることができる - そのようなHLA多様性のカバーがより少ないワクチンは、大きな盲点を有し、準最適なHLA対立遺伝子を有する患者を見逃す。より広義には、ワクチンの価値は、より多くのエピトープを添加することによって、著しく増大すると考えられる。いくつかの実施形態では、前記構築物は、6種の最もありふれたHLAの各々につき、少なくとも2種の免疫優性エピトープを有する。試験した構築物は、最低18種のエピトープ（6種のHLA対立遺伝子の各々について、凡そ3種）を有する、これによって、堅牢で且つ広範な応答の生成が増大する、と考えられる。
HLA対立遺伝子当たりに、複数のエピトープを有することは重要であると考えられる。なぜならば、1)どのエピトープ（又はタンパク質）が最も防御的であるかは、必ずしも知られていない、2)含まれるエピトープの内の少なくとも1つに対して、堅牢なT細胞応答が生じる可能性が、より高くなる、及び3)複数のエピトープに対するT細胞応答は、有効性及び抗原エスケープ・バリアントを防ぐこと、にとって重要である、からである。
以下の要因は測定可能ではあるが、相対的に重要性が低いと判断された。
1つの要因は、エピトープ間のリンカーのアイデンティティである。種々のリンカーがある程度の有効性を示した。3アミノ酸リンカーで、エピトープ提示の~2倍の向上が見られたことは意義深いことではあるが、より長いリンカーも同様に適している。
別の要因は、エピトープの順序である。エピトープの順序を最適化して、接合部エピトープを制限したが、様々なエピトープ順序を有する構築物は、同等の結果を示したと考えられる。どのような接合部エピトープが問題となると考えられるかについては、確かなカットオフ値は存在しない。一般的に、高親和性の接合部エピトープは、所望のエピトープと競合し、それによって、観察される免疫応答の大きさを低減すると考えられる。ワクチン構築物について、予測された結合親和性 < 77 nM (例えば、 ≦ 75 nM, ≦ 70 nM, ≦ 65 nM, ≦ 60 nM, ≦ 55 nM, ≦ 50 nM, ≦ 45 nM, ≦ 40 nM, ≦ 35 nM, ≦ 30 nM, ≦ 25 nM, ≦ 20 nM, ≦ 15 nM, ≦ 10 nM, ≦ 5 nM, 若しくはこれら未満、又は、間の、包括的な、任意の範囲、例えば、50-75 nM)である接合部エピトープは全て除いた。これは、開示した29エピトープ・ワクチンのケースでは、構築物全体にわたり、22の最も高い親和性が予測された結合体が、特に望ましいエピトープであること、を意味する。高い親和性の結合を有すると予測された単一のエピトープであったとしても劇的な影響を有さない、及び、一般的に、接合部エピトープを除去する利益を測定することは困難である、と考えられる。
更に、関連する状況における研究により、方向性は、提示の効率に、ほとんど影響しないことが示唆される。理論的には、フラグメントのN末端にあるエピトープであれば、より効率的に提示される可能性があるであろう。なぜならば、N末端は常に合成される一方で、いくつかの欠陥タンパク質産物はC末端を欠いている可能性があるからである。しかしながら、実験データによれば、様々な方向性にあるエピトープの提示は、概して同等であることが、示唆される。
全体ワクチン構築物でのサイズの制約のために、エピトープの反復を追加することと、追加の新規なエピトープを含ませることとの間には、トレードオフ（tradeoff）がある。より広いHLAをカバーするために、及びエピトープをより多くするために(より多くのウイルス・タンパク質をカバーする)、追加の新規なエピトープを優先した。
予備的な解析から、3aaリンカーは、比較的最も効果的であると思われた。より長いリンカーは、3aaと同程度に効果的である可能性が高いが、そうすると、全体としてより大きなワクチン構築物とする必要がある。そして、リンカーを持たないワクチンでさえ、いくらかの有効性を示した。従って、全般的に、リンカーを有することは、有用である。
いくつかの実施形態では、リボソーム停止／再始動部位は、好ましい、なぜならば、それは、最も堅牢で且つ最小であるからである。IRES又は翻訳後切断配列を、ある特定の実施形態では、使用することもある。いくつかの実施形態では、Sタンパク質を共-発現させて、ポリエピトープ・ワクチンと共に、抗体反応を可能にすることがある。2つのタンパク質を、どちらの順序でも発現させ得ると考えられる。典型的には、第1のタンパク質は、より高いレベルで発現する、及びSタンパク質がより高く発現することは、より重要である可能性が高い(Sタンパク質単独のワクチンとの直接的な比較のためだけであれば)。ワクチンは、どちらの方向性でも、機能することが期待される。
ポリシストロニックな発現に対する代替法は、一般的に、2種類のワクチンを同時に送達することである（とりわけ、mRNAのような送達システムを用いることで容易に行える)。
これらの研究では、様々な検出方法を使用することができる。例えば、四量体染色を使用して、個々のエピトープに対するT細胞を定量化することがある、T細胞活性化アッセイ(例えば、CD137染色、細胞内IFNg染色等)を使用して、応答性T細胞を定量化することがある、及びTCRシークエンシングを使用して、自然感染において生じたTCRレパートリーをワクチンが再現することを実証することがある。
実施例２：更なるSARS-CoV-2ワクチン構築物及び検証結果
上記の結果を更に検証することにおいて、更なるSARS-CoV-2ワクチン構築物、例えば図９Ｃ-９Ｅに記載のもの、を設計した。
更なる解析も行って、上記の結果を更に検証した。例えば、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化されたワクチン構築物を用いて、様々なin vitro解析を行った。図１０は、SARS-CoV-2患者から単離したメモリーT細胞が、図９Ｃに記載されるワクチン構築物の代表的なLNP製剤で処置した細胞に対して、応答することを示す、それによって、SARS-CoV-2が感染した細胞と同様の様式で認識され得るように、エピトープを、細胞が、効果的にプロセシングすること、及び提示すること、が実証される。簡潔に述べると、CD8+メモリーT細胞単離キット(Miltenyi, カタログ番号130-094-412)を製造業者の指示に従って使用して、メモリーT細胞を、最近回復したSARS-CoV-2患者から、単離した(Tmemプール)。Tmemプールを、図９Ｃの構築物の1 ug/mLのmRNA-LNP複合体で処置した、HLA-A*02:01又はHLA-B*07:02の何れかを発現するHLAクラスI-欠損HEK293T細胞と、共-培養した。24時間後、ヒトIFN-γ第3世代Simple Plex Ella Assay (Protein Simple, カタログ番号SPCKB-PS-002574) を製造業者の指示に従って使用して、インターフェロン・ガンマを測定した。
更に、個々のTCRクローンを、特定のエピトープ（例えば、図１１に示される代表的なクローン及びデータのエピトープ等）のプロセシング及び提示を評価するための試薬として、使用することができる。例えば、図１１は、図６Ａに記載される27エピトープの構築物に含まれる4つの個々のエピトープが、SARS-CoV-2のエピトープに対して特異的なTCRによって認識され得る様式に、プロセシングされること、及び提示されること、を示す。簡単に述べれば、単球を、HLA-A*02:01及びHLA-B*07:02陽性の健常ドナー(donor)から、EasySepTMヒトCD14陽性選択キットII(StemCell Technologies、17858)を用いて単離し、インターロイキン-4及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下で、48時間、培養して、単球由来樹状細胞(monocyte-derived dendritic cells (moDCs))に分化させた。MoDCを、図６Ａに記載の構築物由来の1 ug/mLのmRNAを含有するLNPで、4時間、処置し、次いで、TNFアルファ、IL-1ベータ、IL-6及びPGE2で、処置した。48時間後、moDCを、表1A及び表1Fに記載のLLY、SPR、KLW、又はYLQエピトープのいずれかを各々認識する個々のTCRを形質導入したT細胞と、共-培養した。TCRの活性化を、AF647-コンジュゲート化した抗-CD69抗体(Biolegend、カタログ番号310918)及びPE-コンジュゲート化した抗-CD137抗体(Biolegend、カタログ番号309804)を使って染色し、フロー・サイトメトリー(C Cytoflex S, Beckman Coulter)によって検出することによって、測定した。
興味深いことに、図９Ｃに記載されるワクチン構築物をLNP製剤化することによって、共通するTRAV遺伝子を利用するSARS-CoV-2エピトープ-特異的なTCRが生成されることも決定された（図１３－１６）。
SARS-CoV-2による自然感染への応答の際に、SARS-CoV-2の同じ免疫優性エピトープを認識するTCRは、共通のTRAV遺伝子を共有する、及び、そのTRAV遺伝子は、感染から回復した直後のSARS-CoV-2患者のメモリーT細胞(Tmem)によって利用されている優性TRAV遺伝子である(図１２)。ワクチン構築物が、COVID患者由来のTmem細胞と同じTCR遺伝子を使用するナイーブ・レパートリー由来のT細胞を増殖させることを検証するために、in vitroのワクチン・モデルを実施した(図１３)。簡単に述べると、図９Ｃに記載された構築物のmRNA 1 ug/mLを含むLNPで処置したmoDCを、EasySepTMヒト・ナイーブCD8+ T細胞単離キットII (StemCell、17968)を使用して、SARS-CoV-2の感染拡大以前の2019年に採取した健常ドナー(donor)血液から単離したナイーブCD8 T細胞と、共-培養した。その共-培養物を、96ウェル・プレートの複数のウェルに分割して、ナイーブ・レパートリー由来の特定クローンの増殖を検出した。10日間の増殖後、各ウェルを4コピーに分割し、1コピーの各ウェルを、示したペプチドについての蛍光標識した四量体(Tetramer Shop、カタログ番号HA02-070及びHB07-017)で染色し、フロー・サイトメトリー(Cytoflex S、Beckman Coulter)によって、測定した。残りのコピーをプールし、それぞれ表1A及び表1Fからの各々のペプチド 1 ug/mLでパルスした、HLA-A*02:01の又はHLA-B*07:02の何れかのモノ-対立遺伝子性であるHEK293T細胞で、再刺激した(図１３)。CD69及びCD137染色によって同定された、再-活性化されたT細胞を、フロー・サイトメトリー(MoFlo Astrios EQ)によって選別し、シークエンシングをして、増殖したT細胞によって利用されているTRAV遺伝子を決定した。本結果は、パルスしたSARS-CoV-2免疫優性ペプチド、例えば、YLQペプチド、が、本アッセイにおいて、ペプチド-特異的なT細胞の増殖を誘導することを(図１４)、及び図９Ｃに記載されるワクチン構築物が、本アッセイにおいて、SARS-CoV-特異的なT細胞の増殖を誘導することを(図１５)、実証する。興味深いことに、図９Ｃに記載されるワクチン構築物をLNP製剤化することによって、共通するTRAV遺伝子を利用するSARS-CoV-2エピトープ-特異的なTCRが生成されることも、決定された(図１６)。
更なる検証実験を行ってもよい。
1つの代表的な実施形態では、プロセシング及び提示アッセイを実施する。例えば、(例えば、mRNAを封入する脂質ナノ粒子として製剤化された(mRNA-LNP))構築物を、前記構築物にとってのターゲット細胞である樹状細胞(dendritic cells (DCs))に導入する。処置したDCを、エピトープ-特異的なT細胞と、共-培養し、前記T細胞の応答性を、例えば、表面活性化マーカー及びIFNgの解析等によって、測定する。T細胞が応答する場合、前記エピトープは、プロセシングを受ける、及び適切に提示される、可能性が高い。構築物のエピトープのプロセシング及び提示を比較するために、EasySepTMヒトCD14陽性選択キットII (StemCell Technologies、17858)を使用して、単球を、関心とするエピトープに一致するHLA型を有する健常ドナー(donor)から、単離する。単球を、顆粒球コロニー刺激因子(GM-CSF)及びインターロイキン4(IL-4)の存在下で、72時間、培養して、moDCに分化させる。72時間後、moDCを、各構築物のmRNA 1 ug/mLを含有するLNPで、4時間、処置し、次いで、TNFアルファ、IL-1ベータ、IL-6及びPGE2で、処置する。48時間後、その培養物に、1:1というmoDC対T細胞の比率で、エピトープ特異的なTCRを形質導入したT細胞を添加し、24時間、共-培養する。T細胞活性化を、AIM CD69(Biolegend、カタログ番号309804)及びCD137(Biolegend、カタログ番号309804)のフロー・サイトメトリー染色によって測定し、フロー・サイトメトリー(Cytoflex S、Beckman Coulter)によって測定する。エピトープ特異的なT細胞の活性化を誘発することができる構築物は、TCRによって認識されるエピトープが、プロセシングを受けること、及びT細胞活性化を誘導するのに十分な程に提示されること、を示す。更に、構築物間で、単一エピトープのプロセシング及び提示を比較した場合に、特定の構築物がより高いレベルのT細胞活性化を誘発することは、測定したエピトープについて、プロセシング及び提示がより高いレベルである、と解釈される。
別の代表的な実施形態では、in vitroのワクチン・アッセイを実施する。例えば、構築物（例えば、mRNA-LNP製剤）を、再度DCに導入し、mRNA-LNPDC及び前記DCを、2019年又はそれ以前に収集した(即ち、非-COVID曝露の)ドナー(donor)血液に由来するナイーブT細胞と、共-培養する。その共-培養した細胞を、96-ウェル・プレートの数百のウェルに分割し、抗原-特異的な増殖を、ペプチド-コンジュゲート化したMHC四量体染色によって、測定する。その応答の大きさを、抗原-特異的クローンで同定されたウェルの数によって、測定する(図１３)。10日間の増殖をさせた後、前記T細胞を、プールする、及び、初期応答を誘発するために使用した構築物のmRNA 1 ug/mLと一緒のLNPで再度処置した、関心とする単一のHLAを発現する、HEK細胞で、再-活性化する。前記細胞を、AIM CD69(Biolegend、カタログ番号309804)及びCD137(Biolegend、カタログ番号309804)で染色する、及び、AIM二重-陽性の細胞を選別する、並びに再配列されたTCR遺伝子をシークエンシングする。本アッセイは、前記共-培養に応答するT細胞を、COVID患者由来のメモリーT細胞と、比較することがある、及び増殖したT細胞のレパートリーを、解析する。
更に別の代表的な実施形態では、MHC増殖アッセイを実施する。例えば、SARS-CoV-2タンパク質（例えばN、Orf3a、及びM）における免疫原性領域が、追加のHLA上に提示され、その結果、ワクチン接種は、上記のHLA以外のHLAを有する個体において効果的になるであろう、エピトープを、含有するかどうかを決定するために、構築物(例えば、mRNA-LNP製剤)を、COVID患者メモリーT細胞のHLAと一致する単一のHLAを発現する、ヒト胚腎(human embryonic kidney (HEK))細胞等の細胞に、導入する。前記構築物に応答する人の理論的割合を評価するために、CD8 Tmem細胞を、CD8+メモリーT細胞単離キット(Miltenyi, カタログ番号130-094-412)を用いて、SARS-CoV-2感染症から最近回復した、及び表１に記載される既知のエピトープの内の1種以外のHLAを発現する、患者から、単離する、及びバンクする。前記Tmem細胞を、一致するHLAを発現する、モノ-対立遺伝子性のHEK細胞と共培養し、T細胞活性化を、ヒトIFN-γ第3世代Simple Plex Ella Assay (Protein Simple, カタログ番号SPCKB-PS-002574)を使用して、IFNガンマの放出を測定することによって、測定する。前記構築物で処置したHEKは、単一のHLAを含むので、Tmem細胞の活性化は、前記構築物上のエピトープがプロセシングを受けること、及び試験したHLA上に提示されること、を示す。更に、COVID患者のTmem細胞によって認識されることは、未定義のエピトープが、SARS-CoV-2に曝露された患者のメモリー・レパートリーにおいて、特定のT細胞を生成するのに、十分であること、及び試験したHLAを保有する患者は、前記構築物によって送達されるエピトープに対するT細胞応答を生成することができる可能性が高いこと、を示す。
更に別の代表的な実施形態では、in vivoのワクチン・・アッセイを実施する。例えば、動物モデル（例えば、ヒトTCRレパートリー及びヒトMHCを発現するように操作したヒト化マウス・モデル、例えば、VELOCI-T(登録商標)マウス・モデル; Regeneron, Inc.)及びヒト対象を、構築物を使って免疫して、抗-SARS-CoV-2免疫を決定することがある、並びに、ペプチド-コンジュゲート化したMHC四量体染色、ELISPOTアッセイ、又は共-培養アッセイ（この共-培養アッセイでは、ワクチン接種をしたマウス又は患者に由来するTmem細胞を、対応するワクチン構築物のmRNAを保有するLNPで処置したモノ-対立遺伝子性のHEKと、共-培養する）、を使用して、エピトープ特異的なT細胞応答を、測定することがある。
参照による取り込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的且つ個々に示され、参照により取り込まれるかのように、その全体が本出願に参照により取り込まれる。相反する場合には、本出願（任意の定義を含む）が優先される。
公開データベース中のエントリーに対応するアクセッション番号を参照する、任意のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列（例えば、ワールド・ワイド・ウェブ（World Wide Web）にあるtigr.orgのJ.C.ベンター研究所［The Institute for Genomic Research (TIGR)］、及び／又はワールド・ワイド・ウェブ（World Wide Web）にあるncbi.nlm.nih.govのアメリカ国立生物工学情報センター［the National Center for Biotechnology Information (NCBI)］によって、維持されている配列等）もまた、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
均等物
当業者は、本出願に記載される本発明によって包含される、特定の実施形態に対する、多くの均等物を、ルーチンにしかすぎない実験を使用して、認識するか、又は確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (93)

  1. 表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び／又は１Ｆ、より選択される少なくとも2つのペプチド・エピトープを含む免疫原性ポリペプチド。
  2. 請求項1に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、前記少なくとも2つのペプチド・エピトープを連結された順序で含む、任意選択的に、ここで、少なくとも1つ以上の免疫優性エピトープは、2つ以上のコピーとして存在する。
  3. 請求項２に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又はそれ以上の前記ペプチド・エピトープを含む、任意選択的に、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及びHLA-B*07の各々につき、少なくとも1つ、2つ、及び／又は3つの免疫優性エピトープを含む。
  4. 請求項２又は３に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び１Ｆの各々に由来する3つのペプチド・エピトープを含む。
  5. 請求項２から４の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、前記ペプチド・エピトープ間に、リンカーを更に含む。
  6. 請求項５に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記リンカーは、前記ペプチド・エピトープの各々について少なくとも3つのアミノ酸を含む、ここで、前記少なくとも3つのアミノ酸は、それらのそれぞれのペプチド・エピトープと連続するものである。
  7. 請求項５に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記リンカーは、プロテアソーム切断モチーフである。
  8. 請求項２から７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、Orf1ab、M、N、Orf3a、及びSからなる群より選択される、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、又は1つ以上のそのタンパク質フラグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質の前記フラグメントは、機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードしないSARS-CoV-2タンパク質を包含する。
  9. 請求項２から８の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、リボソーム停止／再始動セグメント、IRESセグメント、及び／又は翻訳後切断セグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記翻訳後切断セグメントは、P2Aセグメントである。
  10. 請求項２から９の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、表１Ｇ又は表１Ｉに提供されるアミノ酸配列の何れか1つを含む。
  11. 請求項１に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、少なくとも2つのペプチド・フラグメントを含む、ここで、前記ペプチド・フラグメントのそれぞれは、少なくとも2つの前記ペプチド・エピトープを含む、ここで、各々のペプチド・フラグメント中の前記少なくとも2つの前記ペプチド・エピトープは、SARS-CoV-2の同じタンパク質に由来する。
  12. 請求項１１に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記少なくとも2つのペプチド・フラグメントは、SARS-CoV-2の、Nタンパク質、Mタンパク質、ORF1a/bタンパク質、又はORF3aタンパク質、に由来する。
  13. 請求項１１又は１２に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、最大6つの前記ペプチド・フラグメントを含む。
  14. 請求項１１から１３の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、Orf1ab、M、N、Orf3a、及びSからなる群より選択される、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、又は1つ以上のそのタンパク質フラグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質のフラグメントは、機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードしないSARS-CoV-2タンパク質を包含する。
  15. 請求項１１から１４の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、リボソーム停止／再始動セグメント、IRESセグメント、及び／又は翻訳後切断セグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記翻訳後切断セグメントは、P2Aセグメントである。
  16. 請求項１１、１２、１４、及び１５の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、表１Ｈ又は表１Ｊに提供されるアミノ酸配列の何れか1つを含む。
  17. 請求項１から１６の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、in vitro及び／又はin vivoで、T細胞応答を誘発することができる、任意選択的に、ここで、前記T細胞応答を、四量体染色アッセイ、T細胞活性化アッセイ、CD137染色アッセイ、細胞内IFNg染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、及び／又はT細胞増殖アッセイによって、測定する。
  18. 請求項１から１７の何れか一項に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物、任意選択的に、ここで、前記免疫原性組成物は、
    1) Orf1ab、M、N、Orf3a、及びSからなる群より選択される、1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質、若しくは1つ以上のそのタンパク質フラグメントを、更に含む、任意選択的に、ここで、前記1つ以上の全長SARS-CoV-2タンパク質のフラグメントは、機能的SARS-CoV-2タンパク質をコードしないSARS-CoV-2タンパク質を包含する、並びに／又は、
    2) アジュバント、
    を更に含む。
  19. 請求項１８に記載の免疫原性組成物、ここで、前記免疫原性組成物は、in vitro及び／又はin vivoで、T細胞応答を誘発することができる、任意選択的に、ここで、前記T細胞応答を、四量体染色アッセイ、T細胞活性化アッセイ、CD137染色アッセイ、細胞内IFNg染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、及び／又はT細胞増殖アッセイによって、測定する。
  20. 請求項１８又は１９に記載の免疫原性組成物、ここで、前記免疫原性組成物は、対象において、T細胞応答を誘発することができる。
  21. 特許請求の範囲１から１７の何れか一項に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチド、及びMHC分子、を含む組成物。
  22. 請求項２１に記載の組成物、ここで、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。
  23. 請求項２１又は２２に記載の組成物、ここで、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。
  24. 請求項２１から２３の何れか一項に記載の組成物、ここで、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及び／又はHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。
  25. 安定なMHC-ペプチド複合体、ここで、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、MHC分子の中に、請求項１から１７の何れか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む。
  26. 請求項２５に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、ここで、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。
  27. 請求項２５又は２６に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、ここで、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。
  28. 請求項２５から２７の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、ここで、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及び／又はHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。
  29. 請求項２５から２８の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、ここで、前記ペプチド・エピトープ及び前記MHC分子は、共有結合している、並びに／又は前記MHC分子のアルファ鎖及びベータ鎖は、共有結合している。
  30. 請求項２５から２９の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、ここで、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、検出可能な標識を含む、任意選択的に、ここで、前記検出可能な標識は、蛍光色素分子である。
  31. 請求項２５から３０の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体、及びアジュバント、を含む、免疫原性組成物。
  32. 請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、又はその相補体、をコードする単離された核酸、任意選択的に、ここで、前記単離された核酸は、DNA、RNA、化学修飾RNA、mRNA、cDNA、自己複製、環化、コンカテマー化されている、ここで、前記単離された核酸は、5'非翻訳領域(5'UTR)及び／若しくは3'UTRを含む、発現プロモーターを含む、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む、並びに／又はP2A若しくはT2Aなどの自己切断2Aペプチドを含む。
  33. 請求項３２に記載の単離された核酸を含むベクター、任意選択的に、ここで、前記ベクターは、発現ベクターである。
  34. 以下である、細胞、
    a) 請求項３２に記載の単離された核酸を含む、
    b) 請求項３３に記載のベクターを含む、並びに／又は、
    c) 請求項１から１７の何れか一項に記載の、1つ以上の免疫原性ポリペプチドを産生する、及び／若しくは請求項２５から３０の何れか一項に記載の、1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体を、前記細胞の表面に提示する、
    任意選択的に、ここで、前記細胞は、遺伝子操作されている。
  35. 請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチドに、及び／又は請求項２５から３０の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体に、特異的に結合する結合部分構造、任意選択的に、ここで、前記結合部分構造は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、単鎖TCR(scTCR)、キメラ抗原レセプター(CAR)、又はTCR及びエフェクター・ドメインを含む融合タンパク質、である。
  36. a) 請求項１から１７の何れか一項に記載の1つ以上の免疫原性ポリペプチド、及び／又は、
    b) 請求項２５から３０の何れか一項に記載の1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体、
    を含むデバイス又はキット、
    ここで、前記デバイス又はキットは、任意選択的に、a)及び／又はb)が、T細胞レセプターに結合することを、検出するための試薬、を含む。
  37. 以下を含む、安定なMHC-ペプチド複合体に結合するT細胞を検出する方法：
    a)T細胞を含むサンプルを、請求項２５から３０の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体と接触させるステップ；及び、
    b)安定なMHC-ペプチド複合体に対する、T細胞の結合を検出するステップ、任意選択的に、前記安定なMHC-ペプチド複合体に結合する安定なMHC-ペプチド-特異的T細胞の割合を更に測定するステップ、任意選択的に、ここで、前記サンプルは、末梢血単核細胞(PBMC)を含む。
  38. 請求項３７に記載の方法、ここで、前記T細胞は、CD8+ T細胞である。
  39. 請求項３７又は３８に記載の方法、ここで、前記検出するステップ及び／又は測定するステップを、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタンブロット、又は細胞内フロー・アッセイ、を使用して、行う。
  40. 請求項３７から３９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記サンプルは、1つ以上のSARS-CoV-2タンパク質又はそのフラグメントと、接触した、又は接触した疑いのある、T細胞を含む。
  41. 以下を含む、対象が、SARS-CoV-2に対する、曝露及び／又は防御、を有するかどうかを決定する方法：
    a) 前記対象から取得したT細胞を含む細胞集団を、請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチドと、又は請求項２５から３０の何れか一項に記載の安定なMHC-ペプチド複合体と、インキュベートするステップ；及び、
    b) 応答性の、存在又はレベル、を検出するステップ、
    ここで、応答性の、存在又はコントロール・レベルと比較したより高いレベル、は、前記対象が、SARS-CoV-2に対する、曝露及び／又は防御、を有することを示す。
  42. 以下を含む、SARS-CoV-2感染症に罹患している対象の臨床アウトカムを予測するための方法：
    a) 前記対象から取得したT細胞と、請求項１から１７の何れか一項に記載の1つ以上の免疫原性ポリペプチド、又は請求項２５から３０の何れか一項に記載の1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体、との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ；及び、
    b) 応答性の、存在又はレベル、を、コントロールの応答性の、存在又はレベル、と比較するステップ、ここで、前記コントロールを、良い臨床アウトカムを有する対象から取得する；
    ここで、前記対象における応答性の、存在又は前記コントロールと比較したより高いレベル、は、前記対象が、良い臨床アウトカムを有することを示す。
  43. 以下を含む、SARS-CoV-2療法の有効性を評価する方法：
    a) SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を受ける前の前記対象から得られた第1のサンプルにおいて、前記対象から取得したT細胞と、請求項１から１７の何れか一項に記載の1つ以上の免疫原性ポリペプチド、又は請求項２５から３０の何れか一項に記載の1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体、との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ、及び、
    b) 請求項１から１７の何れか一項に記載の1つ以上の免疫原性ポリペプチド、又は請求項２５から３０の何れか一項に記載の1つ以上の安定なMHC-ペプチド複合体、と、SARS-CoV-2療法の少なくとも一部を受けた後の前記対象から得られた第2のサンプルにおいて存在する、前記対象から取得したT細胞との間の応答性の、存在又はレベル、を測定するステップ、
    ここで、前記第1のサンプルに対して、前記第2のサンプルにおける応答性の、存在又はより高いレベルは、前記療法が、前記対象におけるSARS-CoV-2を治療するのに有効であることを示す。
  44. 請求項４１から４３の何れか一項に記載の方法、ここで、応答性のレベルは、a )結合の存在、並びに／又はb) T細胞活性化、及び／若しくはエフェクター機能、によって示される、任意選択的に、ここで、前記T細胞活性化、又はエフェクター機能は、T細胞増殖、傷害、又はサイトカイン放出である。
  45. 請求項４１から４４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップa)及びb)を、後の時点で繰り返すステップを更に含む、任意選択的に、ここで、前記対象は、第1の時点と前記後の時点との間で、SARS-CoV-2感染症を改善するための治療を受けている。
  46. 請求項４１から４５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記T細胞結合、活性化、及び／又はエフェクター機能を、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)、免疫化学的、ウェスタンブロット、又は細胞内フロー・アッセイ、を使用して、検出する。
  47. 請求項４１から４６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コントロール・レベルは、参照番号である。
  48. 請求項４１から４７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コントロール・レベルは、SARS-CoV-2に曝露されていない対象のレベルである。
  49. 対象におけるSARS-CoV-2感染症を、予防する及び／又は治療する方法、ここで、前記方法は、請求項１から１７の何れか一項に記載の少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドを、又は請求項３４に記載の細胞を、含む、及び／又はコードする、免疫原性組成物の治療的有効量を、前記対象に投与するステップ、を含む。
  50. 請求項４９に記載の方法、ここで、前記免疫原性組成物は、請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含む。
  51. 請求項４９又は５０に記載の方法、ここで、前記核酸は、DNA、RNA、mRNA、cDNA、自己複製、環化、及び／又はコンカテマー化されている。
  52. 請求項４９から５１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記SARS-CoV-2タンパク質を、orf1a/b、Sタンパク質、Nタンパク質、Mタンパク質、orf3a、及びorf7a、からなる群より選択する。
  53. 請求項４９から５１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、対象において、T細胞応答を誘発することができる。
  54. 請求項４９から５２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記免疫原性組成物は、2つ以上の免疫原性ポリペプチドを含む。
  55. 請求項４９から５４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記免疫原性組成物は、アジュバントを更に含む。
  56. 請求項４９から５５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記免疫原性組成物は、対象において、T細胞応答を誘発することができる。
  57. 請求項４９から５６の何れか一項に記載の方法、ここで、投与した免疫原性組成物は、前記対象において、SARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導する。
  58. 請求項４９から５７の何れか一項に記載の方法、ここで、投与した免疫原性組成物は、前記対象において、SARS-CoV-2に対するT細胞免疫反応を誘導する。
  59. 請求項４９から５８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記T細胞免疫応答は、CD8+ T細胞免疫応答である。
  60. 以下を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに結合する、ペプチド結合分子又はその抗原結合フラグメント、を同定する方法：
    a) 細胞の表面上のMHC分子の中で、請求項１から１７の何れか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを提示する、細胞を提供するステップ、任意選択的に、ここで、前記細胞は、前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドを、コードする、及び発現する、核酸を含む；
    b) 前記細胞上のMHC分子の中のペプチド・エピトープに対する、複数の候補ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントの、結合を測定するステップ；及び、
    c) MHC分子の中のペプチド・エピトープに結合する、1つ以上のペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントを、同定するステップ。
  61. 請求項６０に記載の方法、ここで、前記ステップa) は、細胞の表面上のMHC分子を、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び／又は１Ｆ、より選択されるペプチド・エピトープと接触させるステップ、を含む。
  62. 請求項６０に記載の方法、ここで、前記ステップa)は、前記細胞を、塩基性核酸で、及び／又は前記塩基核酸を含むベクターで、トランスフェクトするステップ、を含む。
  63. 以下を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに結合する、ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントを、同定する方法：
    a) MHC分子の中の請求項１から１７の何れか一項に記載の、前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む、安定なMHC-ペプチド複合体を提供するステップ；
    b) 安定なMHC-ペプチド複合体に対する、複数の候補ペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントの、結合を決定するステップ；及び、
    c) 安定なMHC-ペプチド複合体に結合する、1つ以上のペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメントを、同定するステップ。
  64. 請求項６３に記載の方法、ここで、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。
  65. 請求項６３又は６４に記載の方法、ここで、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。
  66. 請求項６３から６５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及び／又はHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。
  67. 請求項６３から６６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ペプチド・エピトープ及び前記MHC分子は、共有結合している、並びに／又は前記MHC分子のアルファ鎖及びベータ鎖は、共有結合している。
  68. 請求項６３から６７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、検出可能な標識を含む、任意選択的に、ここで、前記検出可能な標識は、蛍光色素分子である。
  69. 請求項６０から６８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記複数の候補ペプチド結合分子は、1つ以上のT細胞レセプター(TCR)、又はTCRの1つ以上の抗原結合フラグメント、を含む。
  70. 請求項６０から６９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記複数の候補ペプチド結合分子は、少なくとも2、5、10、100、103、104、105、106、107、108、109、又はそれ以上の、様々な候補ペプチド結合分子を含む。
  71. 請求項６０から７０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記複数の候補ペプチド結合分子は、対象からの又は対象の集団からの、サンプルから得られる1つ以上の候補ペプチド結合分子を含む；又は、前記複数の候補ペプチド結合分子は、対象からのサンプルから得られる親スキャフォールド結合分子において変異を含む、1つ以上の候補ペプチド結合分子を含む。
  72. 請求項７１に記載の方法、ここで、前記対象又は対象の集団は、a)SARS-CoV-2に感染していない、及び／若しくはCOVID-19から回復している、又はb)SARS-CoV-2に感染している、及び／若しくはCOVID-19を有する。
  73. 請求項７１又は７２に記載の方法、ここで、前記対象又は対象の集団は、1つ以上の免疫原性ポリペプチドでワクチン接種を受けている、ここで、前記免疫原性ポリペプチドは、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び／又は１Ｆ、より選択されるペプチド・エピトープを含む。
  74. 請求項６８から７３の何れか一項に記載の方法、ここで、前記対象は、哺乳動物である、任意選択的に、ここで、前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、又はげっ歯類である。
  75. 請求項７１から７４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記対象は、HLA-トランスジェニック・マウスである、及び／又はヒトTCRトランスジェニック・マウスである。
  76. 請求項７１から７５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記サンプルは、T細胞を含む。
  77. 請求項７６に記載の方法、ここで、前記サンプルは、末梢血単核細胞(PBMC)又はCD8+メモリーT細胞を含む。
  78. 請求項６０から７７の何れか一項に従って同定されたペプチド-結合分子又はその抗原-結合フラグメント、任意選択的に、ここで、前記結合部分構造は、抗体、抗体の抗原-結合フラグメント、TCR、TCRの抗原-結合フラグメント、一本鎖TCR(scTCR)、キメラ抗原レセプター(CAR)、又はTCR及びエフェクター・ドメインを含む融合タンパク質、である。
  79. 対象におけるSARS-CoV-2感染症を治療する方法、ここで、前記方法は、前記対象に、請求項６３から７８の何れか一項に記載の方法によって同定されるTCRを発現する、遺伝子操作したT細胞の治療的有効量を、投与するステップ、を含む。
  80. 対象におけるSARS-CoV-2感染症を治療する方法、ここで、前記方法は、前記対象に、請求項１から１７の何れか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープに結合するTCRを発現する、遺伝子操作したT細胞の治療的有効量を、投与するステップ、を含む。
  81. 対象におけるSARS-CoV-2感染症を治療する方法、ここで、前記方法は、前記対象に、MHC分子の中に、請求項１から１７の何れか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む、安定なMHC-ペプチド複合体に結合するTCRを発現する、遺伝子操作したT細胞の治療的有効量を、投与するステップ、を含む。
  82. 請求項８１に記載の方法、ここで、前記MHC分子は、MHC多量体である、任意選択的に、ここで、前記MHC多量体は、四量体である。
  83. 請求項７９から８２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記MHC分子は、MHCクラスI分子である。
  84. 請求項７９から８３の何れか一項に記載の方法、ここで、前記MHC分子は、HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*11、HLA-A*24、及び／又はHLA-B*07、からなる群より選択されるHLA血清型であるMHCアルファ鎖を含む、任意選択的に、ここで、前記HLA対立遺伝子は、HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 対立遺伝子, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 対立遺伝子, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 対立遺伝子, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 対立遺伝子, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 及び HLA-B*0721 対立遺伝子、からなる群より選択される。
  85. 請求項７９から８４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ペプチド・エピトープ及び前記MHC分子は、共有結合している、並びに／又は前記MHC分子のアルファ鎖及びベータ鎖は、共有結合している。
  86. 請求項７９から８５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記安定なMHC-ペプチド複合体は、検出可能な標識を含む、任意選択的に、ここで、前記検出可能な標識は、蛍光色素分子である。
  87. 請求項７９から８６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記T細胞を、a) 前記対象、b) SARS-CoV-2に感染していないドナー(donor)、又はc) COVID-19から回復したドナー(donor)、から単離する。
  88. 対象におけるSARS-CoV-2感染症を、予防する又は治療する方法、ここで、前記方法は、前記対象に、抗原-特異的T細胞を注入することを含む、ここで、前記抗原-特異的T細胞を、以下によって作成する：
    a) 請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸、MHC分子の中に請求項１から１７の何れか一項の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを含む安定なMHC-ペプチド複合体、又は、MHC分子の中に請求項１から１７の何れか一項の前記少なくとも1つの免疫原性ポリペプチドのペプチド・エピトープを、コードする細胞、及び／若しくは細胞表面上に提示する細胞、で、対象由来のPBMC又はT細胞、を刺激するステップ；並びに、
    b) in vitroにおいて、抗原-特異的T細胞を増殖させるステップ、任意選択的に、PBMC又はT細胞を、前記PBMC又はT細胞を刺激する前に、前記対象から単離する。
  89. 請求項８８に記載の方法、ここで、前記T細胞は、ナイーブT細胞、セントラル・メモリーT細胞(central memory T cell)、又はエフェクター・メモリーT細胞(effector memory T cell)、である。
  90. 請求項８９に記載の方法、ここで、前記T細胞は、CD8+メモリーT細胞である。
  91. 請求項３６から９０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記薬剤を、前記ペプチド・エピトープ、免疫原性ポリペプチド、安定なMHC-ペプチド複合体、T細胞レセプター、及び／又はT細胞の間の、少なくとも1つの免疫複合体の形成に適した、条件下及び期間、接するように置く。
  92. 請求項３６から９１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ペプチド・エピトープ、免疫原性ポリペプチド、安定なMHC-ペプチド複合体、及び／又はT細胞レセプターを、細胞が発現する、並びに前記細胞を、1つ以上ステップの間に、増殖させる及び／又は単離する。
  93. 請求項３６から９２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記対象は、哺乳動物である、任意選択的に、前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、又はげっ歯類、である。
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