JP2023546725A - ブチロフィリンを含むホモ二量体及びヘテロ二量体タンパク質 - Google Patents

ブチロフィリンを含むホモ二量体及びヘテロ二量体タンパク質 Download PDF

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Abstract

本開示は、とりわけ、がん及び自己免疫のための免疫療法など、疾患の治療において使用を見出す、ブチロフィリンファミリータンパク質の一部を含むヘテロ二量体タンパク質及びキメラタンパク質を含む、組成物及び方法に関する。

Description

優先権
本出願は、２０２０年１０月２６日に出願された米国特許出願第６３／１０５，７４４号の利益及び優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、がん及び自己免疫のための免疫療法などの疾患の治療に用途を見出すヘテロ二量体タンパク質に関する。
電子的に提出されるテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＳＨＫ－０３３ＰＣ＿１１６９８１－５０３３＿ＳＴ２５；作成日：２０２１年４月１３日；ファイルサイズ：３５４，７４６バイト）。
ガンマデルタＴ細胞は、ヒトの全Ｔ細胞の高々５％でありながら、がんに対して重要な役割を果たす。最近の研究は、腫瘍に浸潤するガンマデルタＴ細胞の量が患者にとって好ましい転帰の優れた予測因子であることを示している。更に、ＣＡＲ－Ｔ療法で一般的に使用されるアルファベータＴ細胞とは異なり、ガンマデルタＴ細胞は自然免疫応答において役割を果たす。がんにおけるガンマデルタＴ細胞の予後的意義は、がんの治療戦略としてガンマデルタＴ細胞を操作する努力を促進してきた。現在のアプローチは、患者のガンマデルタＴ細胞を採取し、キメラ抗原受容体を発現するように改変し、及び／又は細胞培養でより多くの数に増殖させた後、改変ガンマデルタＴ細胞をがん患者に注入して戻すエクスビボ戦略に限定される（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｊｕｎ ２６；９：１４０９）。がん患者においてガンマデルタＴ細胞を直接操作する戦略は、ガンマデルタＴ細胞受容体によって直接認識される分子実体を最終的に同定することができないことによって妨げられてきた（Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（２）：１２１－１２８（２０１９））。実際、ガンマデルタＴ細胞の最も広く受け入れられている活性化因子は、主に、熱ショックタンパク質、イソペンチルピロホスファート（ＩＰＰ）生合成の非メバロナート経路の中間体（ＨＭＢ－ＰＰを含む）、細胞内細菌（例えば、マイコバクテリア及びリステリア）、ウイルス（例えば、サイトメガロウイルス）、及び他の脂質抗原などの細胞内分子を含む。
したがって、上記の分子の使用を必要としない、ガンマデルタＴ細胞が貢献する新規な組成物及び方法が、依然として必要とされている。
したがって、一態様では、本開示は、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１及び／又はＢＴＮ３Ａ１ブチロフィリンファミリータンパク質を含む第１のドメイン、又はその断片と、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接し、ヘテロ二量体化を促進するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、アルファ鎖は、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、アルファ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。
一態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質のうちの２つは、会合してヘテロ二量体を形成する。
実施形態では、標的化ドメインは、がん細胞の表面上のＣＤ１９に結合することができる。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、抗体様分子はｓｃＦｖである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞と係合することができる。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞はＶγ９δ２ Ｔ細胞である。
実施形態では、タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の機能を調節する。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞はＶγ９δ２ Ｔ細胞である。
実施形態では、アルファ鎖及びベータ鎖は、自己会合してヘテロ二量体を形成する。
様々な態様では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化、患者の免疫応答の調節、並びに／あるいはインビボでのガンマデルタＴ細胞の増殖の刺激に使用される。したがって、様々な態様では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、ヘテロ二量体タンパク質を含む有効量の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、がん、感染性疾患又は自己免疫疾患を治療する方法に使用される。
様々な態様では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、有効量の本開示の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与し、それによってガンマデルタＴ細胞のインビボ増殖を引き起こす、及び／又は有効量の本開示の医薬組成物をそれを必要とする対象に由来する細胞と接触させ、それによってガンマデルタＴ細胞のエクスビボ増殖を引き起こすことによって、ガンマデルタＴ細胞の増殖を刺激するために使用される。
様々な態様では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は、熱ショックタンパク質、イソペンチルピロホスファート（ＩＰＰ）生合成の非メバロナート経路の中間体（ＨＭＢ－ＰＰを含む）、細胞内細菌（例えば、マイコバクテリア及びリステリア）、ウイルス（例えば、サイトメガロウイルス）、及び他の脂質抗原の非存在下でガンマデルタＴ細胞の増殖を刺激するために使用される。
また、様々な態様において、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ヘテロ二量体タンパク質を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、自己免疫疾患を治療するための方法において使用される。更なる態様では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ウイルス感染又は他の細胞内病原体を含むがこれらに限定されない感染症を治療する方法に使用される。なお更なる態様では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、がんを治療する方法に使用される。
本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物、本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、又は本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞もまた、様々な態様で提供される。本明細書に開示される任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わされ得る。
一態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供し、ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片とが、第２のリンカーによって隣接している。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、アルファ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）第１のドメイン（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、含む。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。
一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造のキメラタンパク質に関し、式中、（ａ）は、（ａ１）－ＳＬ－（ａ２）の一般構造を含む第１のドメインであり、（ａ１）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、（ａ２）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、ＳＬは、約４～約５０アミノ酸長の可撓性を有するアミノ酸配列を含む、（ａ１）及び（ａ２）に隣接する第２のリンカーであり、（ｃ）は、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）膜タンパク質の細胞外ドメインから選択される標的化ドメインを含む第２のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接し、ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステイン残基を含む、リンカーである。
実施形態では、（ａ１）及び（ａ２）は、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質である。実施形態では、（ａ１）及び（ａ２）は、異なるブチロフィリンファミリータンパク質である。実施形態では、（ａ１）及び／又は（ａ２）は、可変ドメインを含むブチロフィリンファミリータンパク質の断片である。実施形態では、（ａ１）及び（ａ２）は、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから独立して選択されるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから独立して選択される。
実施形態では、標的化ドメインは、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる。実施形態では、標的化ドメインは、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９又はＰＳＭＡから選択される膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。
実施形態では、標的化ドメインは、抗体又はその抗原結合断片である。実施形態では、結合断片は、Ｆｖドメインを含む。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、結合断片は、ｓｃＦｖドメインを含む。
実施形態では、標的化ドメインは、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３０７、ｇｐＡ３３、メソテリン、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３／Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、ＮＹ－ｅｓｏ－１、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＳＬＮ、ＣＬＤＮ１８．２、Ｔｒｏｐ－２、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＤ２、ＣＤ２７６／Ｂ７－Ｈ３、ＤＬＬ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＨＥＲ２、Ａ３３、ＴＡＧ７２、５Ｔ４、ＣＡ９、ＣＤ７０、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＥｐＣａｍ、ＭＵＣ１７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒ、ＣＰＣ３、ＧＰＣ３、ＦＡＰ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１７１、ＳＳＴＲ２、ＦＯＬＲ１、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１、ＣＤ４４、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＣＤ１／ＰＤ１、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＬｅＹ、ＣＤ１３３、ＣＥＬＥＣ１２Ａ／ＣＬＬ１、ＦＬＴ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＦＣＲＨ５、ＳＬＡＭＦ７／ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＰＲＡＭＥ、ＥＧＦＲ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１７４／ＦＵＴ３／ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ／ＣＤ１７１、ＣＤ２２、ＣＤ５、ＬＧＲ５、ＬＧＲ５、ＣＬＬ－１、及びＧＤ３のうちの１つに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ３３に特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＬＬ－１に特異的に結合する。
実施形態では、リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、任意にヒトＩｇＧ１に由来する。実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ＦｃドメインがＩｇＧ４に由来し、任意にヒトＩｇＧ４に由来する。
実施形態では、キメラタンパク質は、ホモ二量体である。
一態様において、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質を含む医薬組成物に関する。
一態様において、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。実施形態では、発現ベクターは哺乳類用発現ベクター（mammalian expression vector）である。実施形態では、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
一態様では、本開示は、ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化の方法に関し、それを必要とする対象に、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
一態様では、本開示は、有効量の本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、患者の免疫応答を調節する方法に関する。
一態様では、本開示は、ガンマデルタＴ細胞の増殖を刺激する方法に関し、有効量の本明細書に開示の実施形態のいずれかの医薬組成物をそれを必要とする対象に投与し、それによりガンマデルタＴ細胞のインビボ増殖を引き起こすこと、及び／又は有効量の本明細書に開示の実施形態のいずれかの医薬組成物をそれを必要とする対象に由来する細胞と接触させ、それによりガンマデルタＴ細胞のエクスビボ増殖を引き起こすこと、を含む。
実施形態では、対象のＴ細胞は、第１のドメインによって活性化される。実施形態では、対象は腫瘍を有し、ガンマデルタＴ細胞は腫瘍の細胞を調節する。
一態様では、本開示は、がんを治療する方法に関し、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。実施形態では、がんは、リンパ腫である。実施形態では、がんは、白血病である。
ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質の非限定的な概略図を示す図である。これは、ｉ）リンカーを介してヒトＣＤ１９特異的ｓｃＦｖに隣接するヒトブチロフィリンＢＴＮ２Ａ１、及びｉｉ）ヒトＣＤ１９特異的ｓｃＦｖに隣接するヒトブチロフィリンＢＴＮ３Ａ１のヘテロ二量体を含む。このＧＡｍｍａ ＤＥＬｔａ Ｔ細胞ＥＮｇａｇｅｒ構築物は、本明細書ではＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ「ＧＡＤＬＥＮ」タンパク質とも呼ばれる。 ＦｃＸＬクロマトグラフィを使用した精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のための例示的なクロマトグラフを示す図である。当該タンパク質は、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（「アルファ」、鎖）及びＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（「ベータ」鎖）の両方の構築物を用いてＥｘｐｉＣＨＯ又はＥｘｐｉ２９３細胞をデュアルトランスフェクションすることによって生成されたものであり、ここでアルファ構築物及びベータ構築物と称されるものは、所望のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のヘテロ二量体化を促進する電荷分極リンカードメインを含んでいた。 精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析を示す図である。図２Ａはクーマシーブルーで染色したＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を示しており、純度が９０％超であったことを示している。 精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析を示す図である。図２Ｂは、精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体、抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体又は抗マウスＦｃ抗体で検出した後、非還元（non-reduced）条件（レーン「ＮＲ」）、還元（reduced）条件（レーン「Ｒ」）並びに還元条件及び脱グリコシル化条件の両方（レーン「ＤＧ」）を使用して、精製タンパク質をウエスタンブロットによって分析した。結果は、アルファ鎖及びベータ鎖の予測分子量と一致する分子量を有する２つの個々のタンパク質（β－メルカプトエタノールによる鎖間ジスルフィド結合の破壊後）に還元するジスルフィド結合タンパク質の存在を示す。還元条件のレーンと還元及び脱グリコシル化条件のレーンの両方との間の類似性に基づくと、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮ構築物は、グリコシル化がほとんどないようである。 精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析を示す図である。図２Ｃは、精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の二重カラーウエスタンブロット分析を示す。スターブライトブルー５２０とコンジュゲートした抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体及びＤｙｌｉｔｅ８００とコンジュゲートした抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体で検出した後、非還元条件（レーン「ＮＲ」）、還元条件（レーン「Ｒ」）並びに還元条件及び脱グリコシル化条件の両方（レーン「ＤＧ」）を使用して、ウエスタンブロットによって精製タンパク質を分析した。当該二重カラーウエスタンブロットは、ＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の存在を示した。 Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して決定された組換えＣＤ１９－Ｈｉｓタンパク質に対するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合速度を示す図である。組換えＣＤ１９－Ｈｉｓタンパク質を固定化し、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質を使用して検出した。ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体を陰性対照として使用した。示されているように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、ＣＤ１９－Ｈｉｓタンパク質に結合した。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による抗ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１抗体及びＣＤ１９への同時結合を示すＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。組換えＣＤ１９タンパク質をプレート上にコーティングし、プレートに結合した組換えＣＤ１９タンパク質による捕捉のために、漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体をプレートに添加した。結合を、電気化学発光（ＥＣＬ）読み出しを使用して抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を使用して検出した。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による抗ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１抗体及びＣＤ１９への同時結合を示すＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。組換えＣＤ１９タンパク質をプレート上にコーティングし、プレートに結合した組換えＣＤ１９タンパク質による捕捉のために、漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体をプレートに添加した。結合を、電気化学発光（ＥＣＬ）読み出しを使用して抗ＢＴＮ３Ａ１抗体を使用して検出した。 抗ＢＴＮ２Ａ１及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体に対するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による同時結合を示すＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。図５Ａは、図５Ｂで使用されるＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイの概略図を示す。 抗ＢＴＮ２Ａ１及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体に対するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による同時結合を示すＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。図５Ｂは、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による捕捉及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体による検出を用いて実施されたアッセイを示す。抗ＢＴＮ２Ａ１抗体をプレート上にコーティングし、プレートに結合した抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による捕捉のために漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体を使用して検出した。 抗ＢＴＮ２Ａ１及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体に対するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による同時結合を示すＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。図５Ｃは、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体による捕捉及び抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による検出を用いて実施されたアッセイを示す。抗ＢＴＮ３Ａ１抗体をプレート上にコーティングし、プレートに結合した抗ＢＴＮ３Ａ１抗体による捕捉のために漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を使用して検出した。 ＣＤ１９依存的様式でのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による細胞表面結合を示す図である。図６Ａは、フローサイトメトリによってアッセイした、表面上にＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＣＤ１９細胞）へのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合のパーセンテージを示すグラフである。ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体を結合のための陰性対照として使用した。 ＣＤ１９依存的様式でのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による細胞表面結合を示す図である。図６Ｂは、フローサイトメトリによってアッセイした、ＨＥＫ２９３親細胞へのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合のパーセンテージを示すグラフである。ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体を結合のための陰性対照として使用した。 本明細書中に開示されるＧＡＤＬＥＮタンパク質によるＤａｕｄｉ細胞への結合をＣＤ１９ｓｃＦｖ依存的様式で示す図である。図７Ａは、Ｄａｕｄｉ細胞がＣＤ１９＋であることを示す、アイソタイプ対照又は抗ＣＤ１９抗体で染色したＤａｕｄｉ細胞のフローサイトメトリプロファイルを示す。 本明細書中に開示されるＧＡＤＬＥＮタンパク質によるＤａｕｄｉ細胞への結合をＣＤ１９ｓｃＦｖ依存的様式で示す図である。図７Ｂは、フローサイトメトリによってアッセイした、Ｄａｕｄｉ細胞へのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はヒトＩｇＧ対照の結合のパーセンテージを示すグラフである。 ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に特異的に結合することを実証する図である。図８Ａは、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質によるＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞への細胞表面結合を示す。健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。単離したＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質、ＢＴＮ２Ａ１を欠く対照ヘテロ二量体タンパク質、又はヒトＩｇＧ対照とインキュベートした。結合を、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃドメインに結合するＡＰＣコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体を使用するフローサイトメトリによって検出した。 ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に特異的に結合することを実証する図である。図８Ｂは、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９＋Ｖδ１＋Ｔ細胞に結合しないことを示す。Ｖγ９＋Ｖδ１＋Ｔ細胞を、健康なドナー由来のＰＢＭＣから単離し、増殖させた。単離したＶγ９＋Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はヒトＩｇＧ対照とインキュベートした。結合を、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃドメインに結合するＡＰＣコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体を使用するフローサイトメトリによって検出した。 ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に特異的に結合することを実証する図である。図８Ｃは、ヒトＶγ９＋δ２＋Ｔ細胞へのヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖタンパク質による結合を示す。健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。単離したＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮ又はＢＴＮ３Ａ１／３Ａ２－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質と共にインキュベートした。 ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に特異的に結合することを実証する図である。図８Ｄは、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９－Ｔ細胞に結合しないことを示す。Ｖγ９－Ｔ細胞を単離し、健常ドナー由来のＰＢＭＣから増殖させた。単離したＶγ９－Ｔ細胞をヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮ又はＢＴＮ３Ａ１／３Ａ２－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質と共にインキュベートした。結合を、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃドメインに結合するＡＰＣコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体を使用するフローサイトメトリによって検出した。 ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に特異的に結合することを実証する図である。図８Ｅは、Ｖγ９δ２ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するヒトγδ Ｔ細胞へのヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合を、ＢＴＮ２Ａ１を欠くヘテロ二量体と比較して示すグラフである。インセットは、フローサイトメトリによって示された、Ｖγ９δ２ ＴＣＲを発現するヒトγδ Ｔ細胞へのヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合を、非染色細胞と比較して示す。 二量体化を必要とするＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞へのＢＴＮ２Ａ１タンパク質による細胞表面結合を示す図である。図９Ａは、溶液中の単量体として存在するＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓタンパク質、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞の結合％を示す。細胞上のＣＤ４７に結合するＳＩＲＰα－Ｈｉｓを陽性対照とした。結合を、Ｈｉｓタグの検出に基づいてフローサイトメトリを使用して検出した。 二量体化を必要とするＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞へのＢＴＮ２Ａ１タンパク質による細胞表面結合を示す図である。図９Ｂは、フローサイトメトリによって測定した、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞へのＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はヒトＩｇＧ対照の結合％を示す。ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質は、溶液中で二量体として存在する。これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１がＶγ９＋Ｖδ２Ｔ細胞受容体と相互作用するためにホモ二量体化する必要があることを示唆している。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体構築物の産生のための細胞株の構築（ＣＬＤ）を示す図である。図１０Ａは、アルファ鎖及びベータ鎖を別々に発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の同時トランスフェクションを示す。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体構築物の産生のための細胞株の構築（ＣＬＤ）を示す図である。図１０Ｂは、単一のベクターにおいて２つの別個のプロモーター下でアルファ鎖及びベータ鎖を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を使用したトランスフェクションを示す。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体構築物の産生のための細胞株の構築（ＣＬＤ）を示す図である。図１０Ｃは、電荷分極リンカーを有する構築物について１４日目に振盪フラスコ培養物のＭＳＤ－ＥＬＩＳＡベースの力価によってアッセイしたときのＳＧＶ及びＤＧＶミニプール中のＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の比較を示す。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体構築物の産生のための細胞株の構築（ＣＬＤ）を示す図である。図１０Ｄは、電荷分極リンカーを有する構築物についての細胞におけるアルファ鎖及びベータ鎖発現のｑＲＴ－ＰＣＲ評価によってアッセイされた、ＳＧＶ及びＤＧＶミニプールにおけるＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の比較を示す。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体構築物の産生のための細胞株の構築（ＣＬＤ）を示す図である。図１０Ｅは、ＦｃドメインにＫＩＨ突然変異を有する構築物（ＫＩＨ－Ｆｃ）及びＦｃＲｎ突然変異を有するＫＩＨ突然変異（ＫＩＨ－ＦｃＲｎ）についてのＤＧＶミニプールにおけるＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の比較を示す。 第２のバージョンのＧＡＤＬＥＮタンパク質：ホモ二量体融合タンパク質（限定されないが、例えば、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の可変ドメインが異なる種類のリンカーを使用してタンデムに一緒につながれ、ＩｇＧ４ Ｆｃ配列を介してＣＤ１９ｓｃＦｖ配列に融合されているＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体融合タンパク質）の概略図である。２つのそのような鎖は、ホモ二量体化して、Ｖγ９δ２ ＴＣＲ活性化のためのＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の機能性四量体単位を形成するであろう。 ホモ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。精製ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ ＩｇＧ４－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Ａ）；２，ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Ａ）；及び３，ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ ＩｇＧ４－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Ａ２）タンパク質を、抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体で検出した後、非還元条件（レーン「ＮＲ」）、還元条件（レーン「Ｒ」）を用いてウエスタンブロットによって分析した。 ホモ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。精製ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ ＩｇＧ４－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Ａ）；２，ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Ａ）；及び３，ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ ＩｇＧ４－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Ａ２）タンパク質を、抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体で検出した後、非還元条件（レーン「ＮＲ」）、還元条件（レーン「Ｒ」）を用いてウエスタンブロットによって分析した。 ＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した場合の、ＣＤ１９及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体へのＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による同時期の結合を実証する図である。組換えＣＤ１９タンパク質をプレート上にコーティングし、プレートに結合したＣＤ１９タンパク質による捕捉のために、示されたＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮホモ二量体タンパク質をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体を使用して検出した。 フローサイトメトリによってアッセイした、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）の存在下での、示されたＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質によるγδＴ細胞の活性化を示す図である。ＩｇＧを抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で陰性対照として使用した。 フローサイトメトリによってアッセイした、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）の存在下での、示されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質によるγδＴ細胞の活性化を示す図である。ＩｇＧを抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で陰性対照として使用した。 ２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）アプローチを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す図である。 二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）アプローチを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す図である。 ２つの単一遺伝子ベクター（図１５Ａ）及び二重遺伝子ベクター（図１５Ｂ）アプローチを用いて製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。精製したタンパク質を非還元条件（レーン「ＮＲ」）、還元条件（レーン「Ｒ」）並びに還元条件及び脱グリコシル化条件の両方（レーン「Ｄ」）で処理し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離し、抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体（青色バンド、三角形の矢印）又は抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体（緑色のバンド、正方形の矢印）で検出した。 ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質参照材料と比較して、２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）及び二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を用いて産生されたＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による、Ｂ細胞リンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）上に発現されたＣＤ１９への結合を比較するグラフである。ヒトＩｇＧタンパク質を陰性対照として使用し、６．２５μｇ／ｍｌの最高濃度で試験した。結合を、フローサイトメトリを使用して測定した。 ２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）及び二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を使用して産生された６．２５μｇ／ｍｌのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質によって誘導されたγδ Ｔ細胞の活性化の程度を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）の存在下で、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質参照材料との比較において、比較するグラフである。γδＴ細胞の活性化をプレート結合フォーマットでアッセイし、フローサイトメトリによってアッセイした。ＩｇＧを抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で陰性対照として使用した。 ヘテロ二量体化を促進し、ホモ二量体化を疎外するドメインとしての電荷分極リンカー及びノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ：ＫＩＨ）変異の概略図である。 電荷分極リンカー（ＣＰＬ）アプローチ及びＫＩＨ突然変異アプローチを使用して生成されたミニプールの培養上清中でＥＬＩＳＡアッセイを使用してアッセイした、ＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の量の棒グラフである。 電荷分極リンカー（ＣＰＬ）アプローチを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体又は抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体で検出した後、非還元（レーン「ＮＲ」）、還元（レーン「Ｒ」）並びに還元及び脱グリコシル化（レーン「Ｄ」）条件の両方を使用して、精製タンパク質をウエスタンブロットによって分析した。 ＫＩＨ突然変異アプローチを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。 ＦｃＲｎ突然変異を有するＫＩＨ突然変異アプローチ（ＫＩＨ－ＦｃＲｎを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。 電荷分極リンカー（ＣＰＬ）アプローチ、ＫＩＨ突然変異アプローチ、及びＦｃＲｎ突然変異を用いたＫＩＨ突然変異アプローチを使用して産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質を誘導したγδ Ｔ細胞の活性化の程度を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）の存在下での比較において、比較するグラフである。γδ Ｔ細胞の活性化を、ＴＮＦαの発現に基づいて、フローサイトメトリによるアッセイでプレート結合フォーマットで測定した。ＩｇＧを、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で陰性対照として使用した。 電荷分極リンカー（ＣＰＬ）アプローチ、ＫＩＨ突然変異アプローチ、及びＦｃＲｎ突然変異を用いたＫＩＨ突然変異アプローチを使用して産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質を誘導したγδ Ｔ細胞の活性化の程度を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）の存在下での比較において、比較するグラフである。γδ Ｔ細胞の活性化を、ＩＦＮγの発現に基づいて、フローサイトメトリによるアッセイでプレート結合フォーマットで測定した。ＩｇＧを、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で陰性対照として使用した。 電荷分極リンカー（ＣＰＬ）アプローチ、ＫＩＨ突然変異アプローチ、及びＦｃＲｎ突然変異を用いたＫＩＨ突然変異アプローチを使用して産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質を誘導したγδ Ｔ細胞の活性化の程度を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）の存在下での比較において、比較するグラフである。γδ Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ１０７ａの発現に基づいて、フローサイトメトリによるアッセイでプレート結合フォーマットで測定した。ＩｇＧを、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で陰性対照として使用した。
本開示は、とりわけ、ガンマデルタＴ細胞を標的とし、それらの活性化を引き起こし、同時に、また、例えば腫瘍細胞とシナプスを形成する能力を有する新規キメラタンパク質に関する。したがって、本発明の多機能キメラタンパク質は、治療のために対象の免疫系を調節する独自の手段を提供する。
本開示のヘテロ二量体タンパク質
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、アルファ鎖は、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、アルファ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。実施形態では、アルファ鎖及びベータ鎖は、自己会合して、ＢＴＮ２Ａ１２－ＢＴＮ３Ａ１２四量体を含むアルファ鎖及びベータ鎖のヘテロ二量体を形成する。
一態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。実施形態では、２つのヘテロ二量体タンパク質が会合して、ＢＴＮ２Ａ１２－ＢＴＮ３Ａ１２四量体を含む２本の鎖のヘテロ二量体を形成する。
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、アルファ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するアルファ鎖リンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片と、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片と、を含む第１のドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するベータ鎖リンカーと、を含む。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。実施形態では、アルファ鎖リンカー及びベータ鎖リンカーは、自己会合する。実施形態では、アルファ鎖及びベータ鎖は、自己会合して、ＢＴＮ２Ａ１２－ＢＴＮ３Ａ１２四量体を含むアルファ鎖及びベータ鎖のヘテロ二量体を形成する。実施形態では、アルファ鎖リンカー及びベータ鎖リンカーは、電荷分極リンカーであり、アルファ鎖リンカー及びベータ鎖リンカーの一方は正に帯電しており、他方は負に帯電している。実施形態では、アルファ鎖リンカー及びベータ鎖リンカーは、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を含むＦｃドメインを含む。実施形態では、アルファ鎖リンカー及びベータ鎖リンカーは、ＫＩＨ変異及びＦｃＲｎ変異を含むＦｃドメインを含む。
実施形態では、アルファ鎖及びベータ鎖は、自己会合してヘテロ二量体を形成する。
実施形態では、アルファ鎖の第１のドメインは、ＢＴＮ２Ａ１タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態では、アルファ鎖の第１のドメインは、配列番号３５又は配列番号７１のアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖の該第１のドメインは、配列番号３５又は配列番号７１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、ベータ鎖の第１のドメインは、ＢＴＮ３Ａ１タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態では、ベータ鎖の第１のドメインは、配列番号１９又は配列番号７２のアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、ベータ鎖の第１のドメインは、配列番号１９又は配列番号７２のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、標的化ドメインは、抗体又はその抗原結合断片である。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、抗体様分子は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖単独抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖単独抗体（shark heavy-chain-only antibody：ＶＮＡＲ）、ミクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディ；トランスボディ；アンティカリン（Anticalin）；アドネクチン；アフィリン；アフィマー、マイクロボディ；アプタマー；アルテラーゼ；プラスチック抗体；フィロマー；ストラドボディ；マキシボディ；エビボディ；フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ（immunobody）、トリオーマブ、トロイボディ；ペプボディ；ワクシボディ（vaccibody）、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から選択される。
実施形態では、リンカーは、（ａ）任意にカルボキシ末端においてブチロフィリンファミリータンパク質に隣接した第１の電荷分極コアドメインと、（ｂ）任意にカルボキシ末端においてブチロフィリンファミリータンパク質に隣接した第２の電荷分極コアドメインと、を含む。実施形態では、リンカーは、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメイン上の正に帯電したアミノ酸残基と負に帯電したアミノ酸残基との間の静電相互作用によってヘテロ二量体を形成する。実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインは、任意に可撓性を有するアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されるポリペプチドリンカーを含む。実施形態では、リンカーは、合成リンカー、任意にＰＥＧである。実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ１、任意にヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ４、任意にヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、第１の荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインは、電荷分極コアドメインのアミノ及び／又はカルボキシ末端に正及び／又は負に帯電したアミノ酸残基を有するペプチドを更に含む。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択される１又は複数のアミノ酸を含む。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基は、第１及び／又は第２の電荷分極コアドメイン中に正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチド中に存在する。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、ＹｎＸｎＹｎＸｎＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、式中、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号１）、ＹＹｎＸＸｎＹＹｎＸＸｎＹＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、式中、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号３）、及びＹｎＸｎＣＹｎＸｎＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、式中、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号５）から選択される配列を含む。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、配列ＲＫＧＧＫＲ（配列番号１１）又はＧＳＧＳＲＫＧＧＫＲＧＳ（配列番号１２）を含む。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基は、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される１又は複数のアミノ酸を含み得る。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基は、第１及び／又は第２の電荷分極コアドメイン中に負に帯電したアミノ酸残基を含むペプチド中に存在する。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、ＹｎＺｎＹｎＺｎＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である））（配列番号２）、ＹＹｎＺＺｎＹＹｎＺＺｎＹＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号４）、及びＹｎＺｎＣＹｎＺｎＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号６）から選択される配列を含む。
実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖のリンカーは、配列番号１５～１７、２８～３２及び５２～５５から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖のリンカーは、配列番号１５～１７、２８～３２及び５２～５５から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖のリンカーは、配列番号１５～１７及び２８～３２から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖のリンカーは、配列番号１５～１７及び２８～３２から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖の第２のドメインは、配列番号２０～配列番号２３から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖の第２のドメインは、配列番号２０～２７及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、アルファ鎖は、配列番号３７～３９から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖は、配列番号３７～３９から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、ベータ鎖は、配列番号４０～４２から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、ベータ鎖は、配列番号４０～４２から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、ヘテロ二量体キメラタンパク質は、（ａ）配列番号３７及び配列番号４０；（ｂ）配列番号３８及び配列番号４１；又は（ｃ）配列番号３９及び配列番号４２のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
ＧＡＤＬＥＮ融合タンパク質の例示的な実施形態の配列が以下の表に提供される（リーダー配列は二重下線付きフォントで示され、ヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインは太字下線付きイタリック体フォントで示され、ヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインは太字下線付きフォントで示され、リンカーのコアドメインは下線付き通常フォントで示され、抗ＣＤ１９ＳｃＦｖ配列は太字フォントで示される）。












一態様では、本開示は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、自己会合する２つの個々のポリペプチド鎖を含む。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインは同じである。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の標的化ドメインを含む第２のドメインは同じである。実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーは同じである。
実施形態では、第１のドメインは、１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片から選択される。実施形態では、第１のドメインは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、及びそれらの断片；並びに（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片を含む。
実施形態では、第１のドメインは、ブチロフィリンファミリータンパク質の断片を含み、この断片は、ガンマデルタＴ細胞受容体に結合することができ、任意に細胞外ドメインであり、任意に免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）及びＩｇＣ様ドメインの１又は複数を含む。実施形態では、第１のドメインはブチロフィリンファミリータンパク質の断片を含み、断片はＶγ９δ２ガンマデルタＴ細胞受容体に結合することができる。
実施形態では、第１のドメイン及び／又はヘテロ二量体タンパク質は、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞を調節するか、又は調節することができる。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞はＶγ９δ２ Ｔ細胞である。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞の調節は、ガンマデルタＴ細胞の活性化である。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞と腫瘍細胞との間にシナプスを形成することができ、並びに／あるいはヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化が可能である。
一態様では、本開示は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、自己会合する２つの個々のポリペプチド鎖を含む。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインは同じである。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の標的化ドメインを含む第２のドメインは同じである。実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーは同じである。
一態様では、本開示は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、アルファ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、及びそれらの断片、並びに（ｉｉ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、並びに（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）及び（ｉｉ）に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、本明細書に開示される実施形態のいずれかの可撓性を有するアミノ酸配列である。
一態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１を含む第１のドメイン、及びその断片、並びに（ｉｉ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。実施形態では、２つのヘテロ二量体タンパク質が会合して、ＢＴＮ２Ａ１２－ＢＴＮ３Ａ１２四量体を含む２本の鎖のヘテロ二量体を形成する。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体は、会合してヘテロ四量体を形成する。実施形態では、本分子は図１１の形態である。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される任意の実施形態のヘテロ二量体タンパク質の２つのヘテロ二量体キメラタンパク質を含む四量体キメラタンパク質に関し、四量体は、ホモ二量体化してＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１を含む四量体単位を形成する２つのタンパク質鎖を含む。実施形態では、四量体単位は、ＢＴＮ２Ａ１２－ＢＴＮ３Ａ１２四量体単位である。実施形態では、四量体キメラタンパク質は、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、四量体キメラタンパク質は、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．２％、又は少なくとも約９９．４％、又は少なくとも約９９．６％、又は少なくとも約９９．８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、四量体キメラタンパク質は、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、四量体キメラタンパク質は図１１に示され、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に含む。実施形態では、四量体キメラタンパク質は、図１１に示される通りであり、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に含む。
第１のドメイン
実施形態では、第１のドメインは、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、第１のドメインは２つの異なるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、Ｖ型ドメインを含む。適切なブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片は、全長タンパク質の細胞質ゾル尾部にＢ３０．２ドメインを含む天然ブチロフィリンファミリータンパク質に由来する。
実施形態では、第１のドメインはブチロフィリンサブファミリー２メンバーＡ１（ＢＴＮ２Ａ１）の一部である。実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮ２Ａ１の実質的に全ての細胞外ドメインを含む。実施形態では、第１のドメインはガンマデルタＴ細胞受容体（例えばＶγ９δ２）に結合することができる。ＢＴＮ２Ａ１は、ＢＴ２．１、ＢＴＦ１としても知られている。実施形態では、ＢＴＮ２Ａ１の一部は、ＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインの一部である。実施形態では、キメラタンパク質は、ドメイン、例えば細胞外ドメインＢＴＮ２Ａ１を更に含む。
本開示に適したヒトＢＴＮ２Ａ１の例示的なアミノ酸配列である、ヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＱＦＩＶＶＧＰＴＤＰＩＬＡＴＶＧＥＮＴＴＬＲＣＨＬＳＰＥＫＮＡＥＤＭＥＶＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹＫＧＧＲＥＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＴＴＦＶＳＫＤＩＳＲＧＳＶＡＬＶＩＨＮＩＴＡＱＥＮＧＴＹＲＣＹＦＱＥＧＲＳＹＤＥＡＩＬＨＬＶＶＡＧＬＧＳＫＰＬＩＳＭＲＧＨＥＤＧＧＩＲＬＥＣＩＳＲＧＷＹＰＫＰＬＴＶＷＲＤＰＹＧＧＶＡＰＡＬＫＥＶＳＭＰＤＡＤＧＬＦＭＶＴＴＡＶＩＩＲＤＫＳＶＲＮＭＳＣＳＩＮＮＴＬＬＧＱＫＫＥＳＶＩＦＩＰＥＳＦＭＰＳＶＳＰＣＡ（配列番号３５）
いくつかの実施形態では、本開示に適したヒトＢＴＮ２Ａ１の例示的なアミノ酸配列であるヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインの断片は、以下である。
ＱＦＩＶＶＧＰＴＤＰＩＬＡＴＶＧＥＮＴＴＬＲＣＨＬＳＰＥＫＮＡＥＤＭＥＶＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹＫＧＧＲＥＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＴＴＦＶＳＫＤＩＳＲＧＳＶＡＬＶＩＨＮＩＴＡＱＥＮＧＴＹＲＣＹＦＱＥＧＲＳＹＤＥＡＩＬＨＬＶ（配列番号７１）
実施形態では、本キメラタンパク質が、配列番号３５又は配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインを含むものである。実施形態では、本キメラタンパク質は、本明細書に記載のＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメイン、又はその変異体若しくは機能性断片を含み得る。例えば、キメラタンパク質は、上に提供したようなＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインの配列、又は本明細書に記載のＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアント若しくは機能的断片を含み得る。
ＢＴＮ２Ａ１誘導体は、Ｋａｒｕｎａｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ－２Ａ１ Ｄｉｒｅｃｔｌｙ Ｂｉｎｄｓ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ－Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ ａｎｄ Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．５２（３）：４８７－４９８（２０２０）によって記載された相同性モデルを含む利用可能な構造データから構築され得る。更に、理論に拘束されることを望むものではないが、ＢＴＮ２Ａ１のタンパク質構造相同性モデルは、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬリポジトリで入手可能である。Ｂｉｅｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ－ｎｅｗ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（Ｄ１）：Ｄ３１３－Ｄ３１９（２０１７）．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｒｉｇａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ ２Ａ１ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ γδ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７（６４７８）：ｅａａｙ５５１６（２０２０）．
実施形態では、第１のドメインはブチロフィリンサブファミリー３メンバーＡ１（ＢＴＮ３Ａ１）の一部である。実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮ３Ａ１の実質的に全ての細胞外ドメインを含む。実施形態では、第１のドメインはガンマデルタＴ細胞受容体（例えばＶγ９δ２）に結合することができる。ＢＴＮ３Ａ１はＢＴＦ５としても知られている。複数の実施形態では、ＢＴＮ３Ａ１の一部は、ＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインの一部である。実施形態では、キメラタンパク質は、ドメイン、例えば細胞外ドメインＢＴＮ３Ａ１を更に含む。
本開示に適したヒトＢＴＮ３Ａ１の例示的なアミノ酸配列である、ヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＱＦＳＶＬＧＰＳＧＰＩＬＡＭＶＧＥＤＡＤＬＰＣＨＬＦＰＴＭＳＡＥＴＭＥＬＫＷＶＳＳＳＬＲＱＶＶＮＶＹＡＤＧＫＥＶＥＤＲＱＳＡＰＹＲＧＲＴＳＩＬＲＤＧＩＴＡＧＫＡＡＬＲＩＨＮＶＴＡＳＤＳＧＫＹＬＣＹＦＱＤＧＤＦＹＥＫＡＬＶＥＬＫＶＡＡＬＧＳＤＬＨＶＤＶＫＧＹＫＤＧＧＩＨＬＥＣＲＳＴＧＷＹＰＱＰＱＩＱＷＳＮＮＫＧＥＮＩＰＴＶＥＡＰＶＶＡＤＧＶＧＬＹＡＶＡＡＳＶＩＭＲＧＳＳＧＥＧＶＳＣＴＩＲＳＳＬＬＧＬＥＫＴＡＳＩＳＩＡＤＰＦＦＲＳＡＱＲＷＩＡＡＬＡＧ（配列番号１９）
いくつかの実施形態では、本開示に適したヒトＢＴＮ２Ａ１の例示的なアミノ酸配列であるヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインの断片は、以下である。
ＡＱＦＳＶＬＧＰＳＧＰＩＬＡＭＶＧＥＤＡＤＬＰＣＨＬＦＰＴＭＳＡＥＴＭＥＬＫＷＶＳＳＳＬＲＱＶＶＮＶＹＡＤＧＫＥＶＥＤＲＱＳＡＰＹＲＧＲＴＳＩＬＲＤＧＩＴＡＧＫＡＡＬＲＩＨＮＶＴＡＳＤＳＧＫＹＬＣＹＦＱＤＧＤＦＹＥＫＡＬＶＥＬＫＶＡ（配列番号７２）
実施形態では、本キメラタンパク質が、配列番号１９又は配列番号７２のアミノ酸配列を有するヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインを含むものである。実施形態では、本キメラタンパク質は、本明細書に記載のＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメイン、又はその変異体若しくは機能性断片を含み得る。例えば、キメラタンパク質は、上に提供したようなＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインの配列、又は本明細書に記載のＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するそのバリアント若しくは機能的断片を含み得る。
ＢＴＮ３Ａ１誘導体は、以下を含む利用可能な構造データから構築され得る。Ｐａｌａｋｏｄｅｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｖ（ｇａｍｍａ）９Ｖ（ｄｅｌｔａ）２ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ＣＤ２７７／Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ－３（ＢＴＮ３Ａ）－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７：３２７８０－３２７９０（２０１２）；Ｖａｖａｓｓｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ ３Ａ１ ｂｉｎｄｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：９０８－９１６（２０１３）；Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂ３０．２ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ ３Ａ１ Ｂｉｎｄｓ Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｍｅｄｉａｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖ ｇａｍｍａ ９Ｖ ｄｅｌｔａ ２ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：４９０－５００（２０１４）；Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇａｍｍａｄｅｌｔａ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｔｎ３Ａ１ ｗｉｔｈ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９４：２３９０（２０１５）；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ ３Ａ１（ＢＴＮ３Ａ１）ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｖ ｇａｍｍａ ９Ｖ ｄｅｌｔａ ２ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４：Ｅ７３１１－Ｅ７３２０（２０１７）；Ｓａｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＢＴＮ３Ａ１ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓ ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｎｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｖｉａ ａ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｎｓｏｒ ｉｎ Ｉｔｓ Ｂ３０．２ Ｄｏｍａｉｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １２：２６３１－２６４３（２０１７）；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ ｕｐｏｎ Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ Ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｖ ｇａｍｍａ ９Ｖ ｄｅｌｔａ ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０：１０４３（２０１９）．
実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮ２Ａ１の一部を含む。実施形態では、ＢＴＮ２Ａ１の一部は、ＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメイン、又はそのγδＴ細胞受容体（例えば、γ９δ２）結合断片である。
実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮ３Ａ１の一部を含む。実施形態では、ＢＴＮ３Ａ１の一部は、ＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメイン、又はそのγδ Ｔ細胞受容体（例えば、γ９δ２）結合断片である。
実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮ２Ａ１の一部及びＢＴＮ３Ａ１の一部を含む。実施形態では、ＢＴＮ２Ａ１の一部は、ＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメイン、又はそのγδＴ細胞受容体（例えば、γ９δ２）結合断片である。実施形態では、ＢＴＮ３Ａ１の一部は、ＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメイン、又はそのγδ Ｔ細胞受容体（例えば、γ９δ２）結合断片である。実施形態では、第２のリンカーは、（ｉ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片に隣接する。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。例示的な第２のリンカーは、Ｇ（Ｇ３Ｓ）ｍ、又はＧＧＧＳｎであり、ここで、ｍ又はｎは２～６であり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７８）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）である。実施形態では、２つのヘテロ二量体タンパク質が会合して、ＢＴＮ２Ａ１２－ＢＴＮ３Ａ１２四量体を含む２本の鎖のヘテロ二量体を形成する。
標的化ドメインを含む第２のドメイン
一態様では、本開示は、ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインのヘテロ二量体タンパク質に関する。
本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質は、標的化ドメインを含む第２のドメインを含む。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、抗体様分子は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖単独抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖単独抗体（ＶＮＡＲ）、ミクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディ；トランスボディ；アンティカリン；アドネクチン；アフィリン；アフィマー、マイクロボディ；アプタマー；アルテラーゼ；プラスチック抗体；フィロマー；ストラドボディ；マキシボディ；エビボディ；フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオーマブ、トロイボディ；ペプボディ；ワクシボディ、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から選択される。実施形態では、抗体様分子はｓｃＦｖである。実施形態では、標的化ドメインは、細胞外ドメインである。実施形態では、標的化ドメインは、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０７、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１６、Ｐ－カドヘリン、ＳＳＴＲ２及びメソテリンのうちの１つに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９又はＰＳＭＡの細胞外ドメインの一部を含む。実施形態では、標的化ドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する。
標的化ドメインを含む第２のドメインの例示的な配列が以下に提供される。
例示的な標的化ドメインはｓｃＦＶｈ１９であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶの重鎖可変ドメインであり、以下の配列を有する。
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２０）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦＶｌｈ１９であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶの軽鎖可変ドメインであり、以下の配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳＲＦＭＩＳＥＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＰＡＧＴＴＤＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＤＳＹＧＹＲＧＱＧＴＱＶＴＶ（配列番号２１）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦｖＣＤ１９であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２２）
例示的な標的化ドメインは１９ｓｃＦｖ３であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２３）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦｖＣＤ１９ＶＨＶＬであり、これはマウスＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＶＳＧＤＴＩＴＦＹＹＭＨＦＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＤＥＳＴＫＹＳＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＫＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＴＹＦＣＩＹＧＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＴＳＬＧＥＴＶＴＩＱＣＱＡＳＥＤＩＹＳＧＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧＡＳＤＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＴＳＭＱＴＥＤＥＧＶＹＦＣＱＱＧＬＴＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号２４）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦｖＣＤ１９ＶＬＶＨであり、これはマウスＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＴＳＬＧＥＴＶＴＩＱＣＱＡＳＥＤＩＹＳＧＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧＡＳＤＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＴＳＭＱＴＥＤＥＧＶＹＦＣＱＱＧＬＴＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＶＳＧＤＴＩＴＦＹＹＭＨＦＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＤＥＳＴＫＹＳＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＫＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＴＹＦＣＩＹＧＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦＶｌＰＳＭＡであり、これはヒトＰＳＭＡに特異的なｓｃＦＶの軽鎖可変ドメインであり、以下の配列を有する。
ＲＫＧＧＫＲＧＳＧＳＧＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＡＳＳＴＧＡＶＴＳＧＮＹＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＫＦＬＶＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＴＬＷＹＳＮＲＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２６）
例示的な標的化ドメインは、ヒトＧＤ２に特異的なｓｃＦＶであるＧＤ２ｓｃＦｖ３であり、以下の配列を有する
ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭＫＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２７）
実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖の第２のドメインは、配列番号２０～２３及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖の第２のドメインは、配列番号２０～配列番号２３及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖の第２のドメインは、配列番号２０～２３及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカードメイン
実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーは、電荷分極コアドメインを含む。様々な実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、コアドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端に正又は負に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質を含む。例示的な実施形態では、第１の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に負に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に正に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。第２の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に正に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。
別の例示的な実施形態では、第１の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に正に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。第２の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に負に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に正に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の形成は、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端に位置する正に帯電したアミノ酸残基と負に帯電したアミノ酸残基との間の静電相互作用によって駆動される。更に、ホモ二量体タンパク質の形成は、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端に位置する正に帯電したアミノ酸残基又は負に帯電したアミノ酸残基間の反発によって防止される。
様々な実施形態では、電荷分極コアドメインのアミノ末端又はカルボキシ末端に正及び／又は負に帯電したアミノ酸残基を含むタンパク質は、約２～約５０アミノ酸長である。例えば、電荷分極コアドメインのいずれかの末端に正及び／又は負に帯電したアミノ酸残基を含むタンパク質は、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、又は約２アミノ酸長であり得る。
様々な実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基を含むタンパク質は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇから選択されるアミノ酸の１又は複数を含み得る。様々な実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基を含むタンパク質は、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される１又は複数のアミノ酸を含み得る。
様々な実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、以下の表に提供されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、又は９３％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み得る。
例えば、一実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、配列ＹＹｎＸＸｎＹＹｎＸＸｎＹＹｎ（式中、Ｘは、アルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙは、セリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸である；配列番号３）を含むペプチドを含み得る。例示的なペプチド配列は、ＲＫＧＧＫＲ（配列番号１１）又はＧＳＧＳＲＫＧＧＫＲＧＳ（配列番号１２）を含むが、これらに限定されない。
別の例示的な実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、配列ＹＹｎＺＺｎＹＹｎＺＺｎＹＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸である）を含むペプチドを含み得る。例示的なペプチド配列は、ＤＥＧＧＥＤ（配列番号１３）又はＧＳＧＳＤＥＧＧＥＤＧＳ（配列番号１４）を含むが、これらに限定されない。
一態様では、本開示は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、自己会合する２つの個々のポリペプチド鎖を含む。実施形態では、リンカーは、ヘテロ二量体化を促進する。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質又は２つの異なるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、Ｖ型ドメイン及び／又はＢ３０．２ドメインを含む。実施形態では、第１のドメインは、ブチロフィリン様（ＢＴＮＬ）ファミリータンパク質、例えば、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片である。
実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメイン上の正に帯電したアミノ酸残基と負に帯電したアミノ酸残基との間の静電相互作用によるヘテロ二量体である。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択される１又は複数のアミノ酸を含み得る。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基は、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される１又は複数のアミノ酸を含み得る。
したがって、実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、コアドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端に正又は負に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質を含む。例示的な実施形態では、第１の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に負に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に正に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。そのような実施形態では、第２の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に正に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。別の例示的な実施形態では、第１の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に正に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。そのような実施形態では、第２の電荷分極コアドメインは、カルボキシ末端に負に帯電したアミノ酸残基を有するタンパク質にリンカー（例えば、安定化ドメイン）によって隣接されたアミノ末端に正に帯電したアミノ酸を有するタンパク質を含み得る。
様々な実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、正又は負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質に隣接するリンカー（例えば、安定化ドメイン）を更に含む。実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、任意に、可撓性を有するアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域又は抗体配列から選択される。一実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ＩｇＧ１、任意にヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。他の実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ＩｇＧ４、任意にヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。
本明細書でコアドメインとも呼ばれる、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーの例示的な配列が以下に提供される。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有する。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有する。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有するＫＩＨＴ２２Ｙタンパク質である。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有するＫＩＨＹ８６Ｔタンパク質である。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有するＫＩＨＹ８６Ｔタンパク質である。
例示的な電荷分極コアドメイン（正－負）の配列が以下に提供される。
例示的な電荷分極コアドメイン（負－正）の配列が以下に提供される。
例示的な電荷分極コアドメイン（負－正）の配列が以下に提供される。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を含有する例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を含有する例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異及びＦｃＲｎ変異を含む例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異及びＦｃＲｎ変異を含む例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
様々な実施形態では、帯電したアミノ酸残基を含むタンパク質は、ヘテロ二量体を安定化するための追加の方法として、静電的に帯電したコアドメイン間のジスルフィド結合を促進するための１又は複数のシステイン残基を更に含み得る。
様々な実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメインの各々は、任意に安定化ドメインとして機能し得るリンカー配列を含む。様々な実施形態では、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来してもよく、又は例えばＣｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２（２）：１５３－１６７，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されているような実験的リンカーであり、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、リンカーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９及びＣｒａｓｔｏ ｅｔ．ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３０９－３１２に記載されているものなどのリンカー設計データベース及びコンピュータプログラムを使用して設計され得、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ＰＥＧなどの合成リンカーである。
他の実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）はポリペプチドである。実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、又は約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３又は約２アミノ酸長未満であり得る。
様々な実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、グリシン残基及びセリン残基（例えば、約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９７％のグリシン及びセリン）から実質的に構成される。
様々な実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、抗体のヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥであり、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、可撓性を有するスペーサーとして作用し、Ｆａｂ部分が空間内で自由に動くことを可能にする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラスの間で配列及び長さの両方が異なる。例えば、ヒンジ領域の長さ及び可撓性は、ＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６～２３１を包含し、それは自由に柔軟であるので、Ｆａｂ断片はそれらの対称軸の周りを回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋のうちの最初の重鎖間ジスルフィド架橋を中心とする球内を移動することができる。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２アミノ酸残基及び４つのジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠き、比較的短く、余分な重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された堅固なポリ－プロリン二重らせんを含む。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟性のないポリ－プロリン二重らせんを形成するその固有の伸長ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスとは異なる。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的遠く離れており、分子により大きな柔軟性を与える。ＩｇＧ３中の細長いヒンジもまた、他のサブクラスと比較してそのより高い分子量の原因である。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１とＩｇＧ２との中間である。ヒンジ領域の可撓性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順序で減少すると報告されている。他の実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し得、二量体化（Ｓ２２８Ｐを含む）又はＦｃＲｎ結合を増強するための１又は複数の突然変異を含み得る。
結晶学的研究によれば、免疫グロブリンヒンジ領域は、３つの領域：上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域に機能的に更に細分され得る。Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域は、ＣＨ１のカルボキシル末端から、動きを制限するヒンジ内の第１の残基、一般に２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基までのアミノ酸を含む。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメント柔軟性と相関する。コアヒンジ領域は重鎖間ジスルフィド架橋を含み、下部ヒンジ領域はＣＨ２ドメインのアミノ末端を結合し、ＣＨ２中の残基を含む。Ｉｄ．野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、ジスルフィド結合形成によって二量体化されると、ピボットとして作用すると考えられる環状オクタペプチドをもたらし、したがって柔軟性を付与する配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓを含む。様々な実施形態では、本リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の、上部ヒンジ領域、コア領域及び下部ヒンジ領域のうちの１つ、又は２つ、又は３つを含む。ヒンジ領域はまた、炭水化物結合のための多数の構造的に異なるタイプの部位を含む１又は複数のグリコシル化部位を含み得る。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７アミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、分泌免疫グロブリンにとって有利な特性と考えられる腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの耐性を付与する。様々な実施形態では、本開示のリンカー（例えば、安定化ドメイン）は、１又は複数のグリコシル化部位を含む。
様々な実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。様々な実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。様々な実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。複数の実施形態では、Ｆｃドメインは、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増加及び結合の増強を示す。実施形態では、Ｆｃドメインは、親和性を増加させ、ＦｃＲｎへの結合を増強する１又は複数の変異を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、親和性の増加及びＦｃＲｎへの結合の増強は、本発明のヘテロ二量体タンパク質のインビボ半減期を増加させると考えられる。
実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４２８、４３３若しくは４３４（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）又はその等価物における１又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、アミノ酸残基２５０におけるアミノ酸置換は、グルタミンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はトレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基２５４におけるアミノ酸置換は、トレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基２５６におけるアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はトレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換は、トレオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３０９におけるアミノ酸置換はプロリンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３１１におけるアミノ酸置換は、セリンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８５におけるアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン又はグリシンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８６におけるアミノ酸置換は、トレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン又はメチオニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８７におけるアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、トレオニン又はアラニンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基３８９におけるアミノ酸置換は、プロリン、セリン又はアスパラギンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換は、ロイシンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基４３３におけるアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、又はグルタミンによる置換である。一実施形態では、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、又はチロシンによる置換である。
実施形態では、Ｆｃドメイン（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）が１又は複数の変異、例えばアミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４又は４３６における置換を含む（Ｋａｂａｔのナンバリングによる。）。一実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、三重Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異又はＹＴＥ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、三重Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ突然変異又はＫＦＨ突然変異を含む。更なる実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＹＴＥ突然変異及びＫＦＨ突然変異を組み合わせて含む。
実施形態では、本発明の改変ヒト化抗体は、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４及び４３５に１又は複数の変異を含有するＩｇＧ定常領域を含む。例示的な変異は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ及びＨ４３５Ａを含む。一実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異又はＬＳ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異又はＱＬ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異又はＡＡＡ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異又はＩＨＨ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域はＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異及びＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を組み合わせて含む。
様々な実施形態では、Ｆｃドメインの安定性及び／又は半減期を増加させるために突然変異が導入される。例示的なＦｃ安定化変異体はＳ２２８Ｐである。更なる例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ及びＱ３１１Ｓであり、本発明のリンカー（例えば、安定化ドメイン）は、これらの変異体の１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つを含み得る。
ＩｇＧ定常領域における更なる例示的な変異は、例えば、Ｒｏｂｂｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７－６１５３，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４－２４，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１－８０，Ｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５１４：６４２－６４５，Ｇｒｅｖｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７－５０８、及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、リンカーは可撓性であり得、これには高度に可撓性が含まれるが、これに限定されない。様々な実施形態では、リンカーは、剛性アルファヘリックスを含むがこれに限定されない剛性であり得る。
様々な実施形態では、リンカーは機能的であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明のヘテロ二量体タンパク質の折り畳み及び／又は安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、及び／又は生物活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、ヘテロ二量体タンパク質を特定の細胞型又は位置に標的化するように機能し得る。
ヘテロ二量体タンパク質
一態様では、本開示は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、２つのポリペプチド鎖の複合体である。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖及びベータ鎖は、それぞれ独立して、（ａ）ブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。
実施形態では、アルファ鎖及びベータ鎖は、自己会合してヘテロ二量体を形成する。
実施形態では、第１のドメインは、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、第１のドメインは２つの異なるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、Ｖ型ドメインを含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片は、細胞質ゾル尾部にＢ３０．２ドメインを含む天然のブチロフィリンファミリータンパク質に由来する。
実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片から選択される。実施形態では、第１のドメインは、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、及びそれらの断片；並びに（ｂ）ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１及びその断片を含む。
実施形態では、第１のドメインは、ブチロフィリンファミリータンパク質の断片を含み、この断片は、ガンマデルタＴ細胞受容体に結合することができ、任意に細胞外ドメインであり、任意に免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）及びＩｇＣ様ドメインの１又は複数を含む。実施形態では、第１のドメインはブチロフィリンファミリータンパク質の断片を含み、断片はＶγ９δ２ガンマデルタＴ細胞受容体に結合することができる。
実施形態では、第１のドメインは、（ａ）配列番号１９、３５のいずれか１つのアミノ酸配列、又はその断片と、（ｂ）配列番号１９、３５のいずれか１つのアミノ酸配列、又はその断片と、を有するポリペプチドを含む。実施形態では、第１のドメインは、（ａ）配列番号１９又は配列番号７２と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号３５又は配列番号７１と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
加えて、又は代替において、本明細書中に開示される実施形態のいずれかでは、標的化ドメインにおいて、抗体又はその抗原結合断片である。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、抗体様分子は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖単独抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖単独抗体（ＶＮＡＲ）、ミクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディ；トランスボディ；アンティカリン；アドネクチン；アフィリン；アフィマー、マイクロボディ；アプタマー；アルテラーゼ；プラスチック抗体；フィロマー；ストラドボディ；マキシボディ；エビボディ；フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオーマブ、トロイボディ；ペプボディ；ワクシボディ、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から選択される。実施形態では、抗体様分子はｓｃＦｖである。実施形態では、標的化ドメインは、細胞外ドメインである。実施形態では、標的化ドメインは、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０７、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１６、Ｐ－カドヘリン、ＳＳＴＲ２及びメソテリンのうちの１つに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９又はＰＳＭＡの細胞外ドメインの一部を含む。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する。追加的又は代替的に、実施形態では、標的化ドメインは、配列番号２０～２７及び配列番号９４～１２６から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。実施形態では、標的化ドメインは、配列番号２０～２７及び配列番号９４～１２６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
追加的又は代替的に、実施形態では、リンカーは、（ａ）任意にカルボキシ末端においてブチロフィリンファミリータンパク質に隣接した第１の電荷分極コアドメインと、（ｂ）任意にカルボキシ末端においてブチロフィリンファミリータンパク質に隣接した第２の電荷分極コアドメインと、を含む。実施形態では、リンカーは、第１の電荷分極コアドメイン及び第２の電荷分極コアドメイン上の正に帯電したアミノ酸残基と負に帯電したアミノ酸残基との間の静電相互作用によってヘテロ二量体を形成する。実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインは、任意に可撓性を有するアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されるポリペプチドリンカーを含む。実施形態では、リンカーは、合成リンカー、任意にＰＥＧである。実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ１、任意にヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ４、任意にヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、第１の荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインは、電荷分極コアドメインのアミノ及び／又はカルボキシ末端に正及び／又は負に帯電したアミノ酸残基を有するペプチドを更に含む。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択される１又は複数のアミノ酸を含む。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基は、第１及び／又は第２の電荷分極コアドメイン中に正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチド中に存在する。
実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、ＹｎＸｎＹｎＸｎＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、式中、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号１）、ＹＹｎＸＸｎＹＹｎＸＸｎＹＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、式中、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号３）、及びＹｎＸｎＣＹｎＸｎＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、式中、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号５）から選択される配列を含む。実施形態では、正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、配列ＲＫＧＧＫＲ（配列番号１１）又はＧＳＧＳＲＫＧＧＫＲＧＳ（配列番号１２）を含む。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基は、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される１又は複数のアミノ酸を含み得る。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基は、第１及び／又は第２の電荷分極コアドメイン中に負に帯電したアミノ酸残基を含むペプチド中に存在する。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、ＹｎＺｎＹｎＺｎＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である））（配列番号２）、ＹＹｎＺＺｎＹＹｎＺＺｎＹＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号４）、及びＹｎＺｎＣＹｎＺｎＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸である）（配列番号６、ここで各ｎは独立して０～４の整数である）から選択される配列を含む。実施形態では、負に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドは、配列ＤＥＧＧＥＤ（配列番号１３）又はＧＳＧＳＤＥＧＧＥＤＧＳ（配列番号１４）を含む。
追加的に又は代替的に、実施形態では、第１のドメイン及び／又はヘテロ二量体タンパク質は、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞を調節するか、又は調節することができる。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞は、Ｖγ９δ２ガンマデルタＴ細胞である。
追加的又は代替的に、実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞と腫瘍細胞との間にシナプスを形成することができる。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化が可能である。
実施形態では、該ヘテロ二量体タンパク質は、配列番号１９、３５、７１又は７２と少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
実施形態では、第２のドメインは、ＬＡＧ－３タンパク質である。
実施形態では、第２のドメインは、ＰＤ－１タンパク質である。
実施形態では、第２のドメインは、ＴＩＧＩＴタンパク質である。
実施形態では、第２のドメインはＣＤ１９タンパク質結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、ＣＤＲ３又はＦａｂである。実施形態では、第２のドメインは、ＣＤ１９タンパク質であり、ヘテロ二量体タンパク質は、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる抗体又はその断片（例えば、抗体の抗原結合ドメインの一部を含む）を更に含む。
実施形態では、第２のドメインはＰＳＭＡタンパク質結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、ＣＤＲ３又はＦａｂである。実施形態では、第２のドメインは、ＰＳＭＡタンパク質であり、ヘテロ二量体タンパク質は、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる抗体又はその断片（例えば、抗体の抗原結合ドメインの一部を含む）を更に含む。
例示的な実施形態では、第２のドメインは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４などのＥＧＰの受容体である。
例示的な実施形態では、第２のドメインは、インスリンの受容体、又はインスリン受容体及び／又はＩＧＦ１若しくはＩＧＦ２受容体などのインスリン類似体である。
例示的な実施形態では、第２のドメインは、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）受容体及び／又はエフリン受容体（ＥｐｈＲ）などのＥＰＯの受容体である。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、可溶性（例えば、非膜結合）タンパク質のドメインを含み得る。様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、シグナル伝達に関与する可溶性タンパク質の断片（例えば、受容体と相互作用する可溶性タンパク質の一部）を含み得る。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含み得る。様々な実施形態では、細胞外ドメインの１つは免疫阻害シグナルを伝達し、細胞外ドメインの１つは免疫刺激シグナルを伝達する。
実施形態では、細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用することができる膜貫通タンパク質の一部を指す。様々な実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド又は受容体に結合し、シグナルを細胞に効果的に伝達するのに十分な膜貫通タンパク質の一部を指す。様々な実施形態では、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にある膜貫通タンパク質のアミノ酸配列全体である。様々な実施形態では、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にあり、当技術分野で公知の方法（例えば、インビトロリガンド結合アッセイ及び／又は細胞活性化アッセイ）を使用してアッセイされ得るようなシグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要な膜貫通タンパク質のアミノ酸配列の部分である。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を含み得る。様々な実施形態では、抗体結合ドメインの１つは免疫阻害シグナルを伝達し、抗体結合ドメインの１つは免疫刺激シグナルを伝達する。
実施形態では、免疫抑制シグナルとは、免疫応答を減弱又は排除するシグナルをいう。例えば、腫瘍学の文脈において、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減弱又は排除し得る。正常な生理学的条件下では、阻害性シグナルは、自己寛容（例えば、自己免疫の予防）の維持に有用であり、免疫系が病原性感染に応答している場合に組織を損傷から保護するのにも有用である。例えば、限定されないが、免疫阻害シグナルは、そのような阻害シグナルが遮断された場合に、細胞増殖、サイトカイン産生、細胞死滅活性又は食作用活性の増加を検出することによって同定され得る。
実施形態では、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の文脈において、そのようなシグナルは抗腫瘍免疫を増強し得る。例えば、限定されないが、免疫刺激シグナルは、白血球の増殖、サイトカイン産生、殺傷活性又は食作用活性を直接刺激することによって同定され得る。具体的な例は、受容体に対するリガンド（それぞれＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７又はＩＬ－２１）をコードする融合タンパク質を使用する、サイトカイン受容体、例えば、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ又はＩＬ－２１Ｒの直接的な刺激を含む。これらの受容体のいずれか１つからの刺激は、個々のＴ細胞サブセットの増殖及びサイトカイン産生を直接刺激し得る。
実施形態では、細胞外ドメイン又は抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）は、その受容体のリガンドによるシグナル伝達を競合的に阻害する可溶性タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、限定されないが、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の競合的阻害は、ＰＤ－１を使用して達成され得るか、又はＰＶＲの競合的阻害は、ＴＩＧＩＴを使用して達成され得た。実施形態では、細胞外ドメイン又は抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）は、人工的なシグナル伝達を提供するために使用されてもよい。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害シグナルを送達又はマスクする。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫刺激シグナルを送達又はマスクする。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、それぞれがヘテロ二量体ヒトタンパク質の１つのサブユニットに由来する２つの独立した結合ドメインを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質の一部として形成され得る例示的なタンパク質が表１に提供される。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、表１に提供される例示的なタンパク質のうちの１つを有する。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、表１に提供される例示的なタンパク質のうちの２つを有する。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、限定されないが、ＳＬＡＭＦ４、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、ＡＬＣＡＭ、Ｂ７－１、ＩＬ－４Ｒ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－１０Ｒα、ＩＬ－ｌ ０ Ｒ β、ＩＬ－１２ Ｒ β １、ＩＬ－１２ Ｒ β ２、ＣＤ２、ＩＬ－１３ Ｒ α １、ＩＬ－１３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＩＬＴ２／ＣＤＳ５ｊ、ＩＬＴ３／ＣＤＳ５ｋ、ＩＬＴ４／ＣＤＳ５ｄ、ＩＬＴ５／ＣＤＳ５ａ、ルテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＣＤＳ、インテグリンα Ｅ／ＣＤ１０３、ＣＤ６、インテグリンα Ｍ／ＣＤ １１ ｂ、ＣＤＳ、インテグリンα Ｘ／ＣＤ１１ｃ、インテグリンβ２／ＣＤｌＳ、ＫＩＲ／ＣＤ１５Ｓ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＣＤ２Ｓ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５Ｓｄ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＬＡＧ－３、ＣＤ４３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ４５、ＬＡＩＲ２、ＣＤＳ３、Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ Ｂ４－Ｒ１、ＣＤＳ４／ＳＬＡＭＦ５、ＮＣＡＭ－Ｌ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＮＴ－４、ＣＤ６９、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、共通γＣｈａｉｎ／ＩＬ－２ Ｒ γ、オステオポンチン、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ－１、ＣＲＴＡＭ、ＰＳＧＬ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、Ｌ－セレクチン、ＳＩＲＰ β １、ＳＬＡＭ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ－１、ＤＮＡＭ－１、チモポイエチン、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＴＩＭ－１、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－２、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＴＩＭ－６、グラニュリシン、ＩＣＡＭ－１／ＣＤ５４、ＩＣＡＭ－２／ＣＤ１０２、ＩＦＮ－γＲ１、ＩＦＮ－γ Ｒ２、ＴＳＬＰ、ＩＬ－１ Ｒ１及びＴＳＬＰ Ｒの細胞外ドメイン（適用可能な場合）を含む、ヒト白血球上に存在する１又は複数の分子を標的とするように操作され得る。
実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ８、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＨＫ１及びＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、並びに様々なＢ－７ファミリーリガンド（Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６及びＢ７－Ｈ７を含むが、これらに限定されない）を含む免疫阻害に関与する１又は複数の分子を標的とするように操作され得る。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害剤の細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害剤に対する抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を含む。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害特性を有する可溶性又は膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害特性を有する抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を含む。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、その同族受容体への阻害性シグナルリガンドの結合をシミュレートするが、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ又は他の白血球）への阻害性シグナル伝達を阻害する。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、限定するものではないが、腫瘍細胞の免疫阻害シグナルを遮蔽しながらＴ細胞に免疫刺激を送達することができる免疫阻害受容体細胞外ドメイン又は抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）及び免疫刺激リガンド細胞外ドメイン又は抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を含む。様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｔ細胞活性化の正味の結果を有するシグナルを送達する。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫刺激特性を有する可溶性又は膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫刺激特性を有する抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を含む。
様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、既知のサイトカイン、成長因子及び／又はホルモンのいずれかの変異体を含み得る。様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、サイトカイン、成長因子及び／又はホルモンの既知の受容体のいずれかの変異体を含み得る。様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、公知の細胞外ドメインのいずれかの変異体、例えば、既知のアミノ酸配列又は核酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、既知のタンパク質配列のいずれかと比較して１又は複数のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み得る。実施形態では、１又は複数のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠失及び切断から独立して選択され得る。
実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的置換及び／又は非保存的置換を含み得る。
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行われ得る。２０個の天然アミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類され得る。（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、上に示される６つの標準アミノ酸基の同じ群内に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド中に１つの負の電荷を保持する。更に、グリシン及びプロリンは、αヘリックスを破壊する能力に基づいて互いに置換され得る。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上に示される６つの標準アミノ酸群（１）～（６）の異なる群に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
様々な実施形態では、置換は、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡ及びδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、共通アミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスム、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、設計アミノ酸、例えば、βメチルアミノ酸、Ｃ α－メチルアミノ酸、Ｎ α－メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体）も含み得る。
コドン縮重を考慮することを含めて、遺伝暗号を参照することによってヘテロ二量体タンパク質のヌクレオチド配列に突然変異も行われ得る。
様々な実施形態では、本キメラタンパク質は、配列番号３３、３４及び３７～４２のうちの１又は複数と少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有し、それぞれが任意にリーダー配列を有するアミノ酸配列であるか、又はそれを含む（本明細書のあらゆる場所で二重下線により示されるように、実施形態では、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＩＫＧＶＱＣ（配列番号１８）は省略される。様々な実施形態では、本キメラタンパク質は、配列番号４３、４４及び５６～７０のうちの１又は複数と少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有し、それぞれが任意にリーダー配列を有するアミノ酸配列であるか、又はそれを含む（本明細書のあらゆる場所で二重下線により示されるように、実施形態では、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＩＫＧＶＱＣ（配列番号１８）は省略される。
これらの配列のいずれにおいても、以下のアミノ酸配列を有するコアドメインは、配列番号１６と少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（例えば、約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、又はそれを含む。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫活性化（例えば、腫瘍に対して）を促進することができ、それを含む方法で使用され得る。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害（例えば、腫瘍が生存することを可能にする）を抑制することができ、それを含む方法で使用され得る。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫活性化の改善及び／又は免疫阻害の抑制の改善を提供する。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫応答の振幅を調節すること、例えばエフェクター出力のレベルを調節することができるか、又はそれを含む方法で使用され得る。実施形態では、例えば、がんの治療に使用される場合、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫阻害と比較して免疫刺激の程度を変化させてＴ細胞応答の振幅を増加させ、それはサイトカイン産生、増殖又は標的殺傷能の増加レベルの刺激を含むが、これらに限定されない。
実施形態では、対象は、エクスビボで増殖させた自己又は同種のガンマデルタＴ細胞を更に投与される。
実施形態では、対象は、キメラ抗原受容体（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を発現する自己又は同種異系Ｔ細胞が更に投与される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、例として、Ｅｓｈｈａｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９０（２）：７２０－７２４，１９９３；Ｇｅｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１－５９３９，１９９９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．９（３）：２７９－２８６，２００３；Ｃｏｏｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１（４）：１６３７－１６４４，２００３；Ｉｍａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１８：６７６－６８４，２００４，Ｐａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２０１８；１７：９１；及びＳｃｈｍｉｄｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１８；９：２５９３に記載され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法と組み合わせて使用される場合、相乗的に作用する。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、腫瘍又はがんの治療においてＣＡＲ Ｔ細胞療法と組み合わせて使用される場合、相乗的に作用する。一実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、血液ベースの腫瘍の治療においてＣＡＲ Ｔ細胞療法と組み合わせて使用される場合、相乗的に作用する。一実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、固形腫瘍の治療においてＣＡＲ Ｔ細胞療法と組み合わせて使用される場合、相乗的に作用する。例えば、ヘテロ二量体タンパク質及びＣＡＲ Ｔ細胞の使用は、相乗的に作用して、腫瘍若しくはがんを低減若しくは排除するか、又は腫瘍若しくはがんの成長及び／若しくは進行及び／若しくは転移を遅延させ得る。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ＣＡＲ Ｔ細胞分裂を誘導する。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖を誘導する。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ＣＡＲ Ｔ細胞のアネルギーを防止する。
様々な実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、抗原（例えば、腫瘍抗原）、例えば、限定されないが、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、５Ｔ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４７、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ルイスＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＭＥＴ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ－１、ＩＬ１３Ｒα２、ｇｐ１００、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６（ＨＰＶ－１６ Ｅ６）、ＣＤ１７１、葉酸受容体アルファ（ＦＲ－α）、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、κ軽鎖、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＰＭＳＡ、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、並びに当技術分野で周知の他の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を含む。更なる例示的な腫瘍抗原としては、限定されないが、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－００１７－１Ａ／ＧＡ７３３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ－１及びＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２及びＰＳＡ－３、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトタンパク質、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン及びγ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００ Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ－１、ＮＡ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１ ＣＴ－７、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＣＤ１９、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＡＧＳ１６、ＭＵＣ１、ＧＰＮＭＢ、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２を含む。
例示的なＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ＪＣＡＲ０１４（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＪＣＡＲ０１５（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＪＣＡＲ０１７（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＪＣＡＲ０１８（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＪＣＡＲ０２０（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＪＣＡＲ０２３（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＪＣＡＲ０２４（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＫＴＥ－Ｃ１９（Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ）、ＢＰＸ－４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＰＸ－５０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＰＸ－６０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ｂｂ２１２１（Ｂｌｕｅｂｉｒｄ Ｂｉｏ）、ＣＤ－１９ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｃｅｌｌｓ（Ｚｉｏｐｈａｒｍ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）、ＵＣＡＲＴ１２３（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）、ＵＣＡＲＴ３８（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）、ＵＣＡＲＴＣＳ１（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）、ＯＸＢ－３０２（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ、ＭＢ－１０１（Ｍｕｓｔａｎｇ Ｂｉｏ）及びＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されたＣＡＲ Ｔ細胞を含むが、これらに限定されない。
実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、自家又は同種異系のガンマデルタＴ細胞である。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の表面上の阻害性リガンドをマスキングし、その免疫阻害性リガンドを免疫刺激性リガンドで置き換えることができるか、又はそれを含む方法に使用を見出す。したがって、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、いくつかの実施形態では、阻害性免疫シグナルを低減若しくは排除すること、及び／又は免疫刺激シグナルを増大若しくは活性化することができるか、又はそれを含む方法において使用を見出す。例えば、阻害性シグナルを有する（したがって、免疫応答を回避する）腫瘍細胞は、その後腫瘍細胞を攻撃することができるＴ細胞上の陽性シグナル結合の代わりに使用され得る。したがって、実施形態では、阻害性免疫シグナルは、本発明のヘテロ二量体タンパク質によってマスクされ、刺激性免疫シグナルは活性化される。このような有益な特性は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の単一構築物アプローチによって増強される。例えば、シグナル置換はほぼ同時に行われ得、シグナル置換は臨床的に重要な部位（例えば、腫瘍微小環境）で局所的になるように調整される。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫刺激受容体／リガンド対の結合を刺激又は増強することが可能であるか、又はそれを含む方法で使用を見出す。
他の実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、免疫調節を増強、回復、促進及び／又は刺激することができるか、又はそれを含む方法で使用を見出す。実施形態では、本明細書に記載の本ヘテロ二量体タンパク質は、限定するものではないが、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含む腫瘍細胞に対する１又は複数の免疫細胞の活性又は活性化を回復、促進及び／又は刺激する。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、Ｔ細胞の活性及び／又は活性化を増強、回復、促進及び／又は刺激し、これは、非限定的な例として、生存促進シグナル、自己分泌又は傍分泌増殖シグナル；ｐ３８ ＭＡＰＫ媒介シグナル、ＥＲＫ媒介シグナル、ＳＴＡＴ媒介シグナル、ＪＡＫ媒介シグナル、ＡＫＴ媒介シグナル又はＰＩ３Ｋ媒介シグナル；抗アポトーシスシグナル；及び／又は炎症誘発性サイトカイン産生若しくはＴ細胞遊走若しくはＴ細胞腫瘍浸潤の１又は複数を促進する及び／又はそれらに必要なシグナルを含む１又は複数のＴ細胞固有シグナルを活性化及び／又は刺激することを含む。
実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、Ｔ細胞（限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１又は複数）のうちの１又は複数の腫瘍又は腫瘍微小環境への増加を引き起こすことができるか、又はそれを含む方法で使用を見出す。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、腫瘍及び／又は腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の動員の減少を阻害する、及び／又は引き起こす方法において使用可能であるか、又はそれを含む方法において使用を見出す。実施形態では、本療法は、腫瘍部位及び／又はＴＭＥにおけるＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比を変化させて、Ｍ１マクロファージを優先し得る。
実施形態では、ヘテロ三量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の機能を調節する。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、有効量の本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質を対象に投与することを含む、腫瘍に対するＴ細胞不活性化及び／又は免疫寛容を阻害及び／又は低減することができ、それを含む方法で使用され得る。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ及びＩＬ－２２のうちの１又は複数を含むがこれらに限定されない様々なサイトカインの血清レベルを上昇させることができる。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、処置された対象の血清中のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２又はＩＦＮγを増強することができる。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を阻害、遮断及び／又は減少させるか、あるいは腫瘍形成促進性Ｔ細胞の細胞死を刺激し、誘導し、及び／又は増加させる。Ｔ細胞疲弊は、増殖機能及びエフェクター機能の進行性喪失を特徴とし、クローン欠失に至るＴ細胞機能不全の状態である。したがって、腫瘍促進性Ｔ細胞は、多くの慢性感染症及びがんの間に生じるＴ細胞機能不全の状態を指す。この機能不全は、不十分な増殖及び／又はエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現、及び機能的エフェクター又はメモリーＴ細胞の転写状態とは異なる転写状態によって定義される。疲弊は、感染及び腫瘍の最適な制御を妨げる。更に、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を開始することができるＴ細胞を指す。例示的な腫瘍形成促進性Ｔ細胞は、１又は複数のチェックポイント阻害受容体を発現するＴｒｅｇ、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞を含むが、これらに限定されない。チェックポイント阻害性受容体は、制御されていない免疫応答を防止又は阻害する免疫細胞上に発現される受容体（例えば、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ－３）を指す。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させることができ、それを含む方法で使用され得る。例示的なエフェクターＴ細胞は、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞；細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）；ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋）；エフェクターメモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ－１５Ｒ＋、ＣＣＲ７ｌｏｗ）；セントラルメモリーＴ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋；又はＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ－１５Ｒ＋）；ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ６２Ｌ－）及び後期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７－ＣＤ６２Ｌ－）を含むＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）；ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（低／－）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（－）ＣＤ２５（－）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８＋幹細胞メモリエフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋及びＣＣＲ５＋；又はαβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－１２Ｒ＋、ＩＦＮγＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋及びＣＣＲ８＋；又はαβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－４Ｒ＋、ＩＬ－３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ－１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）；ＴＨ９エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ－１Ｒ＋）；ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（－）エフェクターＴ細胞；並びにＩＬ－２、ＩＬ－４及び／又はＩＦＮ－γを分泌するエフェクターＴ細胞を含む。例示的な制御性Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５高制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ－３＋ＰＤ－１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ－１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢ低制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、ＢＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパー３型（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型の制御性細胞（ＮＫＴｒｅｇ）、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８－制御性Ｔ細胞及び／又はＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ガレクチン－１、ＩＦＮ－γ及び／又はＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞を含む。
様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間若しくは約９６時間、又は約１週間若しくは約２週間以下にわたってエフェクターＴ細胞を一過性に刺激することができ、それを含む方法で使用され得る。様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間若しくは約９６時間、又は約１週間若しくは約２週間以下にわたって、制御性Ｔ細胞を一過性に枯渇又は阻害することができ、それを含む方法において使用され得る。様々な実施形態では、エフェクターＴ細胞の一過性刺激及び／又は制御性Ｔ細胞の一過性の枯渇若しくは阻害は、実質的に患者の血流中、又は例えば骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）などのリンパ組織、非リンパ組織若しくは腫瘍微小環境を含む特定の組織／場所で起こる。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、限定されないが、使用の容易さ及び製造の容易さを含む利点を提供する。これは、２つの異なる免疫療法剤が単一の製品に組み合わされ、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスを可能にするためである。更に、２つの別個の薬剤の代わりに単一の薬剤を投与することにより、より容易な投与及びより大きな患者コンプライアンスが可能になる。更に、例えば、多数のジスルフィド結合及びグリコシル化などの翻訳後修飾を含む大きな多量体タンパク質であるモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、製造がより容易で費用効果が高い。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用の改善を可能にするので、相乗的な治療効果を提供する。実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、オフサイト及び／又は全身毒性を軽減する可能性を提供する。
実施形態では、第１のドメイン及び／又はヘテロ二量体タンパク質は、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞を調節するか、又は調節することができる。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞はＶγ９δ２ Ｔ細胞である。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞の調節は、ガンマデルタＴ細胞の活性化である。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞と腫瘍細胞との間にシナプスを形成することができ、並びに／あるいはヘテロ二量体タンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化が可能である。
本開示のキメラタンパク質
一態様では、本開示は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造のキメラタンパク質に関し、式中、（ａ）は、（ａ１）－ＳＬ－（ａ２）の一般構造を含む第１のドメインであり、（ａ１）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、（ａ２）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、ＳＬは、約４～約５０アミノ酸長の可撓性を有するアミノ酸配列を含む、（ａ１）及び（ａ２）に隣接する第２のリンカーであり、（ｃ）は、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）膜タンパク質の細胞外ドメインから選択される標的化ドメインを含む第２のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接し、ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステイン残基を含む、リンカーである。
実施形態では、キメラタンパク質は図１１に示され、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に含む。実施形態では、四量体キメラタンパク質は、図１１に示される通りであり、配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に含む。
第１のドメイン
実施形態では、第１のドメインは、以下の一般構造である。
（ａ１）ＳＬ－（ａ２）
式中、（ａ１）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、（ａ２）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、ＳＬは、（ａ１）及び（ａ２）に隣接し、約４～約５０アミノ酸長の可撓性を有するアミノ酸配列を含む第２のリンカーである。
実施形態では、第１のドメインは、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、第１のドメインは２つの異なるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、Ｖ型ドメインを含む。
実施形態では、（ａ１）及び（ａ２）は、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質である。実施形態では、（ａ１）及び（ａ２）は、異なるブチロフィリンファミリータンパク質である。実施形態では、（ａ１）及び／又は（ａ２）は、可変ドメインを含むブチロフィリンファミリータンパク質の断片である。実施形態では、（ａ１）及び（ａ２）は、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから独立して選択されるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから独立して選択される。
いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ブチロフィリンファミリータンパク質の断片を含み、断片は、ガンマデルタＴ細胞受容体に結合することができ、任意に可変ドメインを含む細胞外ドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ブチロフィリンファミリータンパク質の断片を含み、断片は、Ｖγ４及びＶγ９δ２ ＴＣＲから任意に選択されるガンマデルタＴ細胞受容体に結合することができる。
いくつかの実施形態では、第１のドメインは、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは２つの異なるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、Ｖ型ドメインを含む。適切なブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片は、全長タンパク質の細胞質ゾル尾部にＢ３０．２ドメインを含む天然ブチロフィリンファミリータンパク質に由来する。
本技術に適したヒトＢＴＮＬ３の例示的なアミノ酸配列は以下の通りである。
ＱＷＱＶＴＧＰＧＫＦＶＱＡＬＶＧＥＤＡＶＦＳＣＳＬＦＰＥＴＳＡＥＡＭＥＶＲＦＦＲＮＱＦＨＡＶＶＨＬＹＲＤＧＥＤＷＥＳＫＱＭＰＱＹＲＧＲＴＥＦＶＫＤＳＩＡＧＧＲＶＳＬＲＬＫＮＩＴＰＳＤＩＧＬＹＧＣＷＦＳＳＱＩＹＤＥＥＡＴＷＥＬＲＶＡＡＬＧＳＬＰＬＩＳＩＶＧＹＶＤＧＧＩＱＬＬＣＬＳＳＧＷＦＰＱＰＴＡＫＷＫＧＰＱＧＱＤＬＳＳＤＳＲＡＮＡＤＧＹＳＬＹＤＶＥＩＳＩＩＶＱＥＮＡＧＳＩＬＣＳＩＨＬＡＥＱＳＨＥＶＥＳＫＶＬＩＧＥＴＦＦＱＰＳＰＷＲＬＡＳ（配列番号８０）
本開示に適したヒトＢＴＮ２Ａ１の例示的なアミノ酸配列である、ヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＱＦＩＶＶＧＰＴＤＰＩＬＡＴＶＧＥＮＴＴＬＲＣＨＬＳＰＥＫＮＡＥＤＭＥＶＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹＫＧＧＲＥＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＴＴＦＶＳＫＤＩＳＲＧＳＶＡＬＶＩＨＮＩＴＡＱＥＮＧＴＹＲＣＹＦＱＥＧＲＳＹＤＥＡＩＬＨＬＶＶＡＧＬＧＳＫＰＬＩＳＭＲＧＨＥＤＧＧＩＲＬＥＣＩＳＲＧＷＹＰＫＰＬＴＶＷＲＤＰＹＧＧＶＡＰＡＬＫＥＶＳＭＰＤＡＤＧＬＦＭＶＴＴＡＶＩＩＲＤＫＳＶＲＮＭＳＣＳＩＮＮＴＬＬＧＱＫＫＥＳＶＩＦＩＰＥＳＦＭＰＳＶＳＰＣＡ（配列番号３５）
いくつかの実施形態では、本開示に適したヒトＢＴＮ２Ａ１の可変ドメインであるヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメインの断片は以下である。
ＱＦＩＶＶＧＰＴＤＰＩＬＡＴＶＧＥＮＴＴＬＲＣＨＬＳＰＥＫＮＡＥＤＭＥＶＲＷＦＲＳＱＦＳＰＡＶＦＶＹＫＧＧＲＥＲＴＥＥＱＭＥＥＹＲＧＲＴＴＦＶＳＫＤＩＳＲＧＳＶＡＬＶＩＨＮＩＴＡＱＥＮＧＴＹＲＣＹＦＱＥＧＲＳＹＤＥＡＩＬＨＬＶ（配列番号７１）
本開示に適したヒトＢＴＮ３Ａ１の例示的なアミノ酸配列である、ヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＱＦＳＶＬＧＰＳＧＰＩＬＡＭＶＧＥＤＡＤＬＰＣＨＬＦＰＴＭＳＡＥＴＭＥＬＫＷＶＳＳＳＬＲＱＶＶＮＶＹＡＤＧＫＥＶＥＤＲＱＳＡＰＹＲＧＲＴＳＩＬＲＤＧＩＴＡＧＫＡＡＬＲＩＨＮＶＴＡＳＤＳＧＫＹＬＣＹＦＱＤＧＤＦＹＥＫＡＬＶＥＬＫＶＡＡＬＧＳＤＬＨＶＤＶＫＧＹＫＤＧＧＩＨＬＥＣＲＳＴＧＷＹＰＱＰＱＩＱＷＳＮＮＫＧＥＮＩＰＴＶＥＡＰＶＶＡＤＧＶＧＬＹＡＶＡＡＳＶＩＭＲＧＳＳＧＥＧＶＳＣＴＩＲＳＳＬＬＧＬＥＫＴＡＳＩＳＩＡＤＰＦＦＲＳＡＱＲＷＩＡＡＬＡＧ（配列番号１９）
いくつかの実施形態では、本開示に適したヒトＢＴＮ２Ａ１の変数であるヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインの断片は以下である。
ＡＱＦＳＶＬＧＰＳＧＰＩＬＡＭＶＧＥＤＡＤＬＰＣＨＬＦＰＴＭＳＡＥＴＭＥＬＫＷＶＳＳＳＬＲＱＶＶＮＶＹＡＤＧＫＥＶＥＤＲＱＳＡＰＹＲＧＲＴＳＩＬＲＤＧＩＴＡＧＫＡＡＬＲＩＨＮＶＴＡＳＤＳＧＫＹＬＣＹＦＱＤＧＤＦＹＥＫＡＬＶＥＬＫＶＡ（配列番号７２）
本技術において好適であるヒトＢＴＮ３Ａ２の例示的なアミノ酸配列
ＱＦＳＶＬＧＰＳＧＰＩＬＡＭＶＧＥＤＡＤＬＰＣＨＬＦＰＴＭＳＡＥＴＭＥＬＫＷＶＳＳＳＬＲＱＶＶＮＶＹＡＤＧＫＥＶＥＤＲＱＳＡＰＹＲＧＲＴＳＩＬＲＤＧＩＴＡＧＫＡＡＬＲＩＨＮＶＴＡＳＤＳＧＫＹＬＣＹＦＱＤＧＤＦＹＥＫＡＬＶＥＬＫＶＡＡＬＧＳＮＬＨＶＥＶＫＧＹＥＤＧＧＩＨＬＥＣＲＳＴＧＷＹＰＱＰＱＩＱＷＳＮＡＫＧＥＮＩＰＡＶＥＡＰＶＶＡＤＧＶＧＬＹＥＶＡＡＳＶＩＭＲＧＧＳＧＥＧＶＳＣＩＩＲＮＳＬＬＧＬＥＫＴＡＳＩＳＩＡＤＰＦＦＲＳＡＱＰＷ（配列番号８１）
本技術において好適なヒトＢＴＮＬ８の例示的なアミノ酸配列は以下の通りである。
ＱＷＱＶＦＧＰＤＫＰＶＱＡＬＶＧＥＤＡＡＦＳＣＦＬＳＰＫＴＮＡＥＡＭＥＶＲＦＦＲＧＱＦＳＳＶＶＨＬＹＲＤＧＫＤＱＰＦＭＱＭＰＱＹＱＧＲＴＫＬＶＫＤＳＩＡＥＧＲＩＳＬＲＬＥＮＩＴＶＬＤＡＧＬＹＧＣＲＩＳＳＱＳＹＹＱＫＡＩＷＥＬＱＶＳＡＬＧＳＶＰＬＩＳＩＴＧＹＶＤＲＤＩＱＬＬＣＱＳＳＧＷＦＰＲＰＴＡＫＷＫＧＰＱＧＱＤＬＳＴＤＳＲＴＮＲＤＭＨＧＬＦＤＶＥＩＳＬＴＶＱＥＮＡＧＳＩＳＣＳＭＲＨＡＨＬＳＲＥＶＥＳＲＶＱＩＧＤＴＦＦＥＰＩＳＷＨＬＡＴＫ（配列番号８２）
様々な実施形態では、本キメラタンパク質は、それぞれがヘテロ二量体ヒトタンパク質の１つのサブユニットに由来する２つの独立した結合ドメインを含む。本発明のヘテロ二量体タンパク質の一部として形成され得る例示的なタンパク質が表２に提供される。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、表２に提供される例示的なタンパク質のうちの１つを有する。様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、表２に提供される例示的なタンパク質のうちの２つを有する。




実施形態では、第１のドメインは、（ａ１）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列と、（ａ２）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列と、を有するポリペプチドを含む。実施形態では、第１のドメインは、（ａ１）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３のいずれか１つのアミノ酸配列と、（ａ２）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３のいずれか１つのアミノ酸配列と、を有するポリペプチドを含む。実施形態では、第１のドメインは、（ｉ）ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８；（ｉｉ）ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１；（ｉｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ２；又は（ｉｖ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３の細胞外ドメインを含む。実施形態では、第１のドメインは、（ｉ）ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８；（ｉｉ）ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１；（ｉｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ２；又は（ｉｖ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３の可変ドメインを含む。
実施形態では、本キメラタンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから独立して選択されるタンパク質の２つのブチロフィリンファミリーの細胞外ドメインを含む。実施形態では、本キメラタンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから独立して選択されるタンパク質の２つのブチロフィリンファミリーの可変ドメインを含む。例えば、キメラタンパク質は、２つのブチロフィリンタンパク質のファミリー、又は配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３から独立して選択される２つのアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）の配列同一性を有するバリアント、可変ドメイン若しくはその機能的断片を含み得る。
実施形態では、第２のリンカーは、一般式Ｇ（Ｇ３Ｓ）ｍ又はＧＧＧＳｎのアミノ酸配列を含み、ｍ及びｎは１～１６の範囲内の整数である。実施形態では、第２のリンカーは、可撓性を有するアミノ酸配列である。例示的な第２のリンカーは、Ｇ（Ｇ３Ｓ）ｍ、又はＧＧＧＳｎであり、ここで、ｍ又はｎは２～６であり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７８）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）である。
標的化ドメインを含む第２のドメイン
本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質は、標的化ドメインを含む第２のドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体様分子は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖単独抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖単独抗体（ＶＮＡＲ）、ミクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディ；トランスボディ；アンティカリン；アドネクチン；アフィリン；アフィマー、マイクロボディ；アプタマー；アルテラーゼ；プラスチック抗体；フィロマー；ストラドボディ；マキシボディ；エビボディ；フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオーマブ、トロイボディ；ペプボディ；ワクシボディ、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から選択される。いくつかの実施形態では、抗体様分子はｓｃＦｖである。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３０７、ｇｐＡ３３、メソテリン、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３／Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、ＮＹ－ｅｓｏ－１、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＳＬＮ、ＣＬＤＮ１８．２、Ｔｒｏｐ－２、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＤ２、ＣＤ２７６／Ｂ７－Ｈ３、ＤＬＬ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＨＥＲ２、Ａ３３、ＴＡＧ７２、５Ｔ４、ＣＡ９、ＣＤ７０、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＥｐＣａｍ、ＭＵＣ１７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒ、ＣＰＣ３、ＧＰＣ３、ＦＡＰ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１７１、ＳＳＴＲ２、ＦＯＬＲ１、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１、ＣＤ４４、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＣＤ１／ＰＤ１、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＬｅＹ、ＣＤ１３３、ＣＥＬＥＣ１２Ａ／ＣＬＬ１、ＦＬＴ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＦＣＲＨ５、ＳＬＡＭＦ７／ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＰＲＡＭＥ、ＥＧＦＲ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１７４／ＦＵＴ３／ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ／ＣＤ１７１、ＣＤ２２、ＣＤ５、ＬＧＲ５、ＬＧＲ５、ＣＬＬ－１、及びＧＤ３のうちの１つに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ３３に特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＬＬ－１に特異的に結合する。
標的化ドメインを含む第２のドメインの例示的な配列が以下に提供される。
一態様では、本開示は、ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインのヘテロ二量体タンパク質に関する。
本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質は、標的化ドメインを含む第２のドメインを含む。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、抗体様分子は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖単独抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖単独抗体（ＶＮＡＲ）、ミクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディ；トランスボディ；アンティカリン；アドネクチン；アフィリン；アフィマー、マイクロボディ；アプタマー；アルテラーゼ；プラスチック抗体；フィロマー；ストラドボディ；マキシボディ；エビボディ；フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオーマブ、トロイボディ；ペプボディ；ワクシボディ、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から選択される。実施形態では、抗体様分子はｓｃＦｖである。実施形態では、標的化ドメインは、細胞外ドメインである。実施形態では、標的化ドメインは、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０７、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１６、Ｐ－カドヘリン、ＳＳＴＲ２及びメソテリンのうちの１つに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９又はＰＳＭＡの細胞外ドメインの一部を含む。実施形態では、標的化ドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する。実施形態では、標的化ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する。
実施形態では、標的化ドメインは、抗体又はその抗原結合断片である。実施形態では、結合断片は、Ｆｖドメインを含む。実施形態では、標的化ドメインは抗体様分子又はその抗原結合断片である。実施形態では、結合断片は、ｓｃＦｖドメインを含む。
標的化ドメインを含む第２のドメインの例示的な配列が以下に提供される。
例示的な標的化ドメインはｓｃＦＶｈ１９であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶの重鎖可変ドメインであり、以下の配列を有する。
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２０）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦＶｌｈ１９であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶの軽鎖可変ドメインであり、以下の配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳＲＦＭＩＳＥＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＰＡＧＴＴＤＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＤＳＹＧＹＲＧＱＧＴＱＶＴＶ（配列番号２１）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦｖＣＤ１９であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２２）
例示的な標的化ドメインは１９ｓｃＦｖ３であり、これはヒトＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２３）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦｖＣＤ１９ＶＨＶＬであり、これはマウスＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＶＳＧＤＴＩＴＦＹＹＭＨＦＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＤＥＳＴＫＹＳＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＫＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＴＹＦＣＩＹＧＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＴＳＬＧＥＴＶＴＩＱＣＱＡＳＥＤＩＹＳＧＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧＡＳＤＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＴＳＭＱＴＥＤＥＧＶＹＦＣＱＱＧＬＴＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号２４）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦｖＣＤ１９ＶＬＶＨであり、これはマウスＣＤ１９に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＴＳＬＧＥＴＶＴＩＱＣＱＡＳＥＤＩＹＳＧＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＧＡＳＤＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＴＳＭＱＴＥＤＥＧＶＹＦＣＱＱＧＬＴＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＶＳＧＤＴＩＴＦＹＹＭＨＦＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＤＥＳＴＫＹＳＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＫＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＴＹＦＣＩＹＧＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
例示的な標的化ドメインはｓｃＦＶｌＰＳＭＡであり、これはヒトＰＳＭＡに特異的なｓｃＦＶの軽鎖可変ドメインであり、以下の配列を有する。
ＲＫＧＧＫＲＧＳＧＳＧＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＡＳＳＴＧＡＶＴＳＧＮＹＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＫＦＬＶＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＴＬＷＹＳＮＲＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２６）
例示的な標的化ドメインは、ヒトＧＤ２に特異的なｓｃＦＶであるＧＤ２ｓｃＦｖ３であり、以下の配列を有する
ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭＫＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２７）
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－３であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－４であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－５であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－６であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－７であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－９であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ３３ｓｃＦｖ－１０であり、これはヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ２０ｓｃＦｖ－１であり、これはヒトＣＤ２０に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）は太字フォントで示されており、軽鎖の可変領域（ＶＬ）はイタリック体フォントで示されており、ＶＨとＶＬとを接続するリンカーは下線で示されている。）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ２０ｓｃＦｖ－２あり、これはヒトＣＤ２０に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）は太字フォントで示されており、軽鎖の可変領域（ＶＬ）はイタリック体フォントで示されており、ＶＨとＶＬとを接続するリンカーは下線で示されている。）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ２０ｓｃＦｖ－３であり、これはヒトＣＤ２０に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＤ２０ｓｃＦｖ－４であり、これはヒトＣＤ２０に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＧＰＲＣ５ＤｓｃＦｖ－１であり、これはヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＧＰＲＣ５ＤｓｃＦｖ－２であり、これはヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＴｒｏｐ２－１＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＴｒｏｐ２に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＴｒｏｐ２－１＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＴｒｏｐ２に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＴｒｏｐ２－２＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＴｒｏｐ２に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＴｒｏｐ２－２＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＴｒｏｐ２に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＥＡＣＡＭ５－１＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＥＡＣＡＭ５－１＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＥＡＣＡＭ５－２＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＥＡＣＡＭ５－２＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＥＡＣＡＭ５－３＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＥＡＣＡＭ５－３＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＣＥＡＣＡＭ５に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＬＬ１－１＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＣＬＬ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＬＬ１－１＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＣＬＬ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＬＬ１－２＿ｖＨｖＬであり、これはヒトＣＬＬ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＣＬＬ１－２＿ｖＬｖＨであり、これはヒトＣＬＬ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＲＯＲ１－ｖＨｖＬ－１であり、これはヒトＲＯＲ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＲＯＲ１－ｖＬｖＨ－１であり、これはヒトＲＯＲ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＲＯＲ１－ｖＬｖＨ－２であり、これはヒトＲＯＲ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＲＯＲ１－ｖＨｖＬ－２であり、これはヒトＲＯＲ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＲＯＲ１－ｖＨｖＬ－３であり、これはヒトＲＯＲ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
例示的な標的化ドメインはＲＯＲ１－ｖＬｖＨ－３であり、これはヒトＲＯＲ１に特異的なｓｃＦＶであり、以下の配列を有する（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）を接続するリンカーは下線で示される）：
実施形態では、キメラタンパク質の第２のドメインは、配列番号２０～２７及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、キメラタンパク質の第２のドメインは、配列番号２０～２３及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。実施形態では、アルファ鎖及び／又はベータ鎖の第２のドメインは、配列番号２０～２３及び９４～１２６から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６１％、又は少なくとも約６２％、又は少なくとも約６３％、又は少なくとも約６４％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約６６％、又は少なくとも約６７％、又は少なくとも約６８％、又は少なくとも約６９％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７１％、又は少なくとも約７２％、又は少なくとも約７３％、又は少なくとも約７４％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約７６％、又は少なくとも約７７％、又は少なくとも約７８％、又は少なくとも約７９％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約８９％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質に加えて、キメラタンパク質は、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＧＩＴの細胞外ドメインの一部を更に含み、がん細胞の表面上のその受容体／リガンドに結合することができる。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質に加えて、キメラタンパク質は、抗体又はその断片を更に含み（例えば、腫瘍エピトープに結合する抗体及び／又はＣＤＲ３の抗原結合ドメインの一部を含む）、がん細胞の表面の抗原に結合することができる。
実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質に加えて、キメラタンパク質は、腫瘍抗原（ＣＤ１９又はＰＳＭＡなど）を標的とし、がん細胞の表面上のその受容体／リガンドに結合することができるＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、又は抗体由来結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）の細胞外ドメインの一部を更に含む。実施形態では、ＢＴＮＬファミリータンパク質に加えて、キメラタンパク質は、抗体又はその断片を更に含み（例えば、抗体の抗原結合ドメインの一部を含む）、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる。
例示的な実施形態では、第２のドメインは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４などのＥＧＰの受容体である。
例示的な実施形態では、第２のドメインは、インスリンの受容体、又はインスリン受容体及び／又はＩＧＦ１若しくはＩＧＦ２受容体などのインスリン類似体である。
例示的な実施形態では、第２のドメインは、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）受容体及び／又はエフリン受容体（ＥｐｈＲ）などのＥＰＯの受容体である。
様々な実施形態では、キメラタンパク質は、可溶性（例えば、非膜結合）タンパク質のドメインを含み得る。様々な実施形態では、キメラタンパク質は、シグナル伝達に関与する可溶性タンパク質の断片（例えば、受容体と相互作用する可溶性タンパク質の一部）を含み得る。
様々な実施形態では、キメラタンパク質は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含み得る。様々な実施形態では、細胞外ドメインの１つは免疫阻害シグナルを伝達し、細胞外ドメインの１つは免疫刺激シグナルを伝達する。
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用することができる膜貫通タンパク質の一部を指す。様々な実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド又は受容体に結合し、シグナルを細胞に効果的に伝達するのに十分な膜貫通タンパク質の一部を指す。様々な実施形態では、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にある膜貫通タンパク質のアミノ酸配列全体である。様々な実施形態では、細胞外ドメインは、細胞又は細胞膜の外部にあり、当技術分野で公知の方法（例えば、インビトロリガンド結合アッセイ及び／又は細胞活性化アッセイ）を使用してアッセイされ得るようなシグナル伝達及び／又はリガンド結合に必要な膜貫通タンパク質のアミノ酸配列の部分である。
様々な実施形態では、キメラタンパク質は、抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を含み得る。様々な実施形態では、抗体結合ドメインの１つは免疫阻害シグナルを伝達し、抗体結合ドメインの１つは免疫刺激シグナルを伝達する。
いくつかの実施形態では、免疫抑制シグナルとは、免疫応答を減弱又は排除するシグナルをいう。例えば、腫瘍学の文脈において、そのようなシグナルは、抗腫瘍免疫を減弱又は排除し得る。正常な生理学的条件下では、阻害性シグナルは、自己寛容（例えば、自己免疫の予防）の維持に有用であり、免疫系が病原性感染に応答している場合に組織を損傷から保護するのにも有用である。例えば、限定されないが、免疫阻害シグナルは、そのような阻害シグナルが遮断された場合に、細胞増殖、サイトカイン産生、細胞死滅活性又は食作用活性の増加を検出することによって同定され得る。
いくつかの実施形態では、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の文脈において、そのようなシグナルは抗腫瘍免疫を増強し得る。例えば、限定されないが、免疫刺激シグナルは、白血球の増殖、サイトカイン産生、殺傷活性又は食作用活性を直接刺激することによって同定され得る。具体的な例は、受容体に対するリガンド（それぞれＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７又はＩＬ－２１）をコードする融合タンパク質を使用する、サイトカイン受容体、例えば、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ又はＩＬ－２１Ｒの直接的な刺激を含む。これらの受容体のいずれか１つからの刺激は、個々のＴ細胞サブセットの増殖及びサイトカイン産生を直接刺激し得る。
いくつかの実施形態では、細胞外ドメイン又は抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）は、その受容体のリガンドによるシグナル伝達を競合的に阻害する可溶性タンパク質を産生するために使用され得る。例えば、限定されないが、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の競合的阻害は、ＰＤ－１を使用して達成され得るか、又はＰＶＲの競合的阻害は、ＴＩＧＩＴを使用して達成され得た。いくつかの実施形態では、細胞外ドメイン又は抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）は、人工的なシグナル伝達を提供するために使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害シグナルを送達又はマスクする。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫刺激シグナルを送達又はマスクする。
実施形態では、標的化ドメインは、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる。実施形態では、標的化ドメインは、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９又はＰＳＭＡから選択される膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。
実施形態では、第２のドメインは、ＬＡＧ－３タンパク質の細胞外ドメインを含む。
実施形態では、第２のドメインは、ＰＤ－１タンパク質の細胞外ドメインを含む。
実施形態では、第２のドメインは、ＴＩＧＩＴタンパク質の細胞外ドメインを含む。
第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカードメイン
本明細書中に開示される実施形態のいずれかのリンカーが好適である。
様々な実施形態では、第１の電荷分極コアドメイン及び／又は第２の電荷分極コアドメインのそれぞれは、正又は負に帯電したアミノ酸を有するタンパク質に隣接するリンカー（例えば、安定化ドメイン）を更に含む。実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、任意に、可撓性を有するアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域又は抗体配列から選択される。一実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ＩｇＧ１、任意にヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。他の実施形態では、リンカー（例えば、安定化ドメイン）は、ＩｇＧ４、任意にヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。
本明細書でコアドメインとも呼ばれる、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーの例示的な配列が以下に提供される。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有する。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有する。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有するＫＩＨＴ２２Ｙタンパク質である。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有するＫＩＨＹ８６Ｔタンパク質である。
実施形態では、コアドメインは、以下の配列を有するＫＩＨＹ８６Ｔタンパク質である。
例示的な電荷分極コアドメイン（正－負）の配列が以下に提供される。
例示的な電荷分極コアドメイン（負－正）の配列が以下に提供される。
例示的な電荷分極コアドメイン（負－正）の配列が以下に提供される。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を含有する例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＩＥＧＲＭＤ（配列番号５２）。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を含有する例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＩＥＧＲＭＤ（配列番号５３）。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異及びＦｃＲｎ変異を含む例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＩＥＧＲＭＤ（配列番号５４）。
ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異及びＦｃＲｎ変異を含む例示的なＦｃドメインの配列が以下に提供される。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＩＥＧＲＭＤ（配列番号５５）。
実施形態では、リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、任意にヒトＩｇＧ１に由来する。実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ＦｃドメインがＩｇＧ４に由来し、任意にヒトＩｇＧ４に由来する。実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、配列番号１６～１７、２８～３２及び５２～５５から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
実施形態では、第１のドメイン及び／又はキメラタンパク質は、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞を調節するか、又は調節することができる。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞は、Ｖγ４又はＶγ９δ２を発現する。実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８を含み、Ｖγ４発現Ｔ細胞を調節する。実施形態では、第１のドメインはＶγ９δ２発現Ｔ細胞を調節する。実施形態では、第１のドメインは、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１、（ｂ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ２、又は（ｃ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３を含む。実施形態では、ガンマデルタＴ細胞の調節は、ガンマデルタＴ細胞の活性化である。実施形態では、キメラタンパク質は、ガンマデルタＴ細胞と腫瘍細胞との間にシナプスを形成することができ、並びに／あるいはキメラタンパク質は、ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化が可能である。
実施形態では、キメラタンパク質は、ホモ二量体である。
一態様において、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質を含む医薬組成物に関する。
一態様において、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラタンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。実施形態では、発現ベクターは哺乳類用発現ベクターである。実施形態では、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
疾患；処置方法及び患者の選択
一態様では、本開示は、がんを治療する方法を提供し、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。実施形態では、がんは、リンパ腫である。実施形態では、がんは、白血病である。実施形態では、がんは、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度の小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；又は慢性骨髄芽球性白血病である。実施形態では、がんは、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん；骨がん；脳及び中枢神経系がん；乳がん；腹膜がん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸直腸がん；結合組織がん；消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼のがん；頭頸部がん；胃がん（胃腸がんを含む）；神経膠芽腫；肝がん；肝細胞がん；上皮内新生物；腎又は腎臓がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がん）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔がん（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺がん；肉腫；皮膚がん；扁平上皮がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮又は子宮内膜がん；泌尿器系のがん；外陰がん；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他のがん腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに脂肪腫症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常な血管増殖である。実施形態では、がんは、前立腺がんである。実施形態では、がんは、上皮由来がんである。実施形態では、がんは、ヘテロ二量体タンパク質の第２のドメインの抗原性標的を発現することが既知である。実施形態では、がんは、限定されないが、ＭＨＣ Ｉ、ベータ２ミクログロブリン、ＴＡＰなどにおける変異を含む、アルファベータＴ細胞による認識を制限する変異を含むことが知られている。
実施形態では、対象は、エクスビボで増殖させた自己又は同種のガンマデルタＴ細胞を更に投与される。実施形態では、自己又は同種のガンマデルタＴ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する。実施形態では、対象は、キメラ抗原受容体を発現する自己又は同種Ｔ細胞が更に投与される。
一態様では、本開示は、自己免疫疾患又は障害を治療する方法を提供し、本明細書に開示される実施形態のいずれかの医薬組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含み、自己免疫疾患又は障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、サルコイドーシス、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、乾癬、過敏症反応（例えば、アレルギー、花粉症、喘息、及び急性浮腫はＩ型過敏反応を引き起こす）、及び血管炎から任意に選択される。
様々な実施形態では、本開示は、１又は複数の自己免疫疾患又は障害を治療するためのヘテロ二量体タンパク質の使用に関する。様々な実施形態では、自己免疫疾患又は障害の治療は、免疫刺激よりも免疫阻害を促進するために、本ヘテロ二量体タンパク質で免疫系を調節することを含み得る。例示的な本ヘテロ二量体タンパク質で治療可能な自己免疫疾患又は障害は、身体自体の抗原が免疫応答の標的となるもの、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、サルコイドーシス、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、乾癬、過敏症反応（例えば、アレルギー、花粉症、喘息、及び急性浮腫はＩ型過敏反応を引き起こす）、及び血管炎を含む。
本発明のヘテロ二量体タンパク質を使用して治療又は予防され得る例示的な自己免疫疾患又は自己免疫状態は、多発性硬化症、真性糖尿病、狼瘡、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、強皮症、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛症、メニアー症候群、移植拒絶反応（例えば、同種移植片拒絶の防止）、悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病及び他の自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、本開示は、がん及び／又は腫瘍、例えば、がん及び／又は腫瘍の治療又は予防に関する。本明細書の他の箇所に記載されるように、がんの治療は、様々な実施形態では、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するために、本ヘテロ二量体タンパク質で免疫系を調節することを含み得る。
がん又は腫瘍は、細胞の制御されない成長及び／又は異常な細胞生存の増加及び／又は身体の器官及び系の正常な機能を妨げるアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性のがん、ポリープ、過形成、並びに休眠腫瘍又は微小転移が含まれる。また、免疫系によって妨害されない異常な増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。がんは、原発性がん又は転移性がんであり得る。原発性がんは、臨床的に検出可能になる起源部位のがん細胞の領域であり得、原発性腫瘍であり得る。対照的に、転移性がんは、ある器官又は部分から別の隣接していない器官又は部分への疾患の広がりであり得る。転移性がんは、局所領域の周囲の正常組織に浸透し、浸潤する能力を獲得し、新しい腫瘍を形成するがん細胞によって引き起こされ得、これは局所転移であり得る。がんはまた、リンパ管及び／又は血管の壁を貫通する能力を獲得したがん細胞によって引き起こされ得、その後、がん細胞は血流を通って（それによって循環腫瘍細胞である）、体内の他の部位及び組織に循環することができる。がんは、リンパ又は血行性拡散などの過程に起因し得る。がんはまた、別の部位に静止し、血管又は壁を再貫通し、増殖し続け、最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。がんは、転移性（又は二次性）腫瘍であり得るこの新しい腫瘍であり得る。
がんは、転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得、これは二次性又は転移性の腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍の細胞と同様であり得る。一例として、乳がん又は結腸がんが肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は、肝臓に存在するが、異常な肝細胞ではなく、異常な乳房又は結腸細胞で構成される。したがって、肝臓の腫瘍は、肝臓がんではなく、転移性乳がん又は転移性結腸がんであり得る。
がんは、任意の組織に由来し得る。がんは、黒色腫、結腸、乳房、又は前立腺に由来し得、したがって、それぞれ元々皮膚、結腸、乳房、又は前立腺であった細胞で構成され得る。がんはまた、白血病又はリンパ腫であり得る血液悪性腫瘍であり得る。がんは、肝臓、肺、膀胱、又は腸などの組織に浸潤し得る。
本開示の代表的ながん及び／又は腫瘍は、がんは、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん；骨がん；脳及び中枢神経系のがん；乳がん；腹膜がん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸直腸がん；結合組織がん；消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼のがん；頭頸部がん；胃がん（胃腸がんを含む）；神経膠芽腫；肝がん；肝細胞がん；上皮内新生物；腎又は腎臓のがん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がん）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔がん（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺がん；肉腫；皮膚がん；扁平上皮がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮又は子宮内膜のがん；泌尿器系のがん；外陰がん；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他のがん腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに脂肪腫症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常な血管増殖を含むが、これらに限定されない。
実施形態では、がんは、上皮由来がんである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、治療抵抗性がんを有する対象を治療するために使用される。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１又は複数の免疫調節剤に対して抵抗性である対象を治療するために使用される。例えば、実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、１２週間程度の治療後に、治療に対する応答を示さないか、又は進行さえも示さない対象を治療するために使用される。例えば、実施形態では、対象は、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２剤に対して難治性であり、これらは、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ，ＭＥＲＣＫ）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１，ＣＵＲＥ ＴＥＣＨ）、ＭＫ－３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ，ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）及び／又はＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）難治性患者を含む。例えば、実施形態では、対象は、抗ＣＴＬＡ－４剤に対して難治性であり、例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）抵抗性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、様々な実施形態では、本開示は、１又は複数の免疫調節剤の単剤療法を含む様々な療法に反応しない患者を救済するがん治療の方法を提供する。
様々な実施形態では、本開示は、腫瘍微小環境内の細胞又は組織を標的とするヘテロ二量体タンパク質を提供する。実施形態では、腫瘍微小環境内の細胞又は組織は、ヘテロ二量体タンパク質の１又は複数の標的又は結合パートナーを発現する。腫瘍微小環境は、細胞、分泌タンパク質、生理学的小分子、及び腫瘍が存在する血管を含む細胞環境を指す。実施形態では、腫瘍微小環境内の細胞又は組織は、腫瘍血管系；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；がん関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞のうちの１又は複数である。様々な実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、がん細胞を標的とする。実施形態では、がん細胞は、ヘテロ二量体タンパク質の標的又は結合パートナーの１又は複数を発現する。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、本明細書に記載の受容体のいずれかを発現する細胞（例えば、がん細胞又は免疫細胞）を標的とし得る。例えば、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、本明細書に記載のサイトカイン、成長因子及び／又はホルモンの受容体のいずれかを発現する細胞を標的とし得る。
実施形態では、方法は、追加的薬剤に対して抵抗性である患者のヘテロ二量体タンパク質による治療を提供し、そのような「追加的薬剤」は、本明細書の他の箇所に記載されており、本明細書に記載の様々な化学療法剤を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、本発明のキメラ剤は、細胞内病原体を排除するために使用される。いくつかの態様において、本キメラ剤は、１又は複数の感染症を処置するために使用される。実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ及びＨＣＶを含む）、寄生虫感染症（例えば、マラリアを含む）、及び細菌感染症を治療する方法で使用される。様々な実施形態では、感染は免疫抑制を誘導する。例えば、ＨＩＶ感染症は、感染した対象において免疫抑制をもたらすことが多い。したがって、本明細書の他の箇所に記載されるように、そのような感染の治療は、様々な実施形態では、免疫阻害よりも免疫刺激を優先するために、本ヘテロ二量体タンパク質で免疫系を調節することを含み得る。あるいは、本開示は、免疫活性化を誘導する感染症を治療する方法を提供する。例えば、腸蠕虫感染は、慢性的な免疫活性化に関連している。これらの実施形態では、そのような感染症の治療は、免疫刺激よりも免疫阻害を優先するために、本ヘテロ二量体タンパク質で免疫系を調節することを含み得る。
様々な実施形態では、本開示は、例えば、気道、パピローマウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、及び肝炎ウイルスによる感染症などの内臓のウイルス感染症の急性又は慢性ウイルス感染症を含むが、これらに限定されない、ウイルス感染症を治療する方法を提供する。実施形態では、ウイルス感染は、フラビウイルス科のウイルスによって引き起こされる。実施形態では、フラビウイルス科のウイルスは、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルスから選択される。他の実施形態では、ウイルス感染は、ピコルナウイルス科のウイルス、例えばポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染は、オルトミクソウイルス科のメンバー、例えばインフルエンザウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染は、レトロウイルス科のメンバー、例えばレンチウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染は、パラミクソウイルス科のメンバー、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（例えば、おたふく風邪ウイルス）、麻疹ウイルス、及びヒトメタニューモウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染は、ブニヤウイルス科のメンバー、例えばハンタウイルスによって引き起こされる。他の実施形態では、ウイルス感染は、レオウイルス科のメンバー、例えばロタウイルスによって引き起こされる。
様々な実施形態では、本開示は、原虫感染又は蠕虫感染などの寄生生物感染を治療する方法を提供する。実施形態では、寄生虫感染は、原虫寄生生物によるものである。いくつかの実施形態では、オリチツィアブ（ｏｒｉｔｉｚｉａｂ）寄生生物は、腸内原虫、組織内原虫又は血液内原虫から選択される。例示的な原虫寄生生物は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリジウム・ムリス（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ）、トリパノソーマチダ・ガンビエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、トリパノソーマチダ・ロデシエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、トリパノソーマチダ・クルシ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａ ｃｒｕｓｉ）、リーシュマニア・メキシカナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ）、リーシュマニア・ブラジレンシス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リーシュマニア・トロピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・オバル（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、プラスモディウム・マラリエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、及びヒストモナス・メレアグリディス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を含むが、これらに限定されない。実施形態では、寄生生物感染症は、線虫（例えば、アデノフォリア（Ａｄｅｎｏｐｈｏｒｅａ））などの蠕虫寄生生物によるものである。複数の実施形態では、寄生生物は、セセメンテア（Ｓｅｃｅｍｅｎｔｅａ）（例えば、トリチュリス・トリチウラ（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、アスカリス・ルンブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、エンテロビウス・ベルミクラリス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、アンシロストマ・デュオデナール（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、ネカター・アメリカナス（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、ストロンギロイデス・ステルコラリス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、ウチェレリア・バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、ドラクンクルス・メディネンシス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）から選択される。実施形態では、寄生生物は、吸虫（例えば、住血吸虫、肝吸虫、腸吸虫及び肺吸虫）から選択される。実施形態では、寄生生物は、マンソニ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、ヘマトビウム住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、異形吸虫（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ）、ウェスタルマンニ肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）から選択される。実施形態では、寄生生物は、条虫（例えば、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）、小形条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）から選択される。
様々な実施形態では、本開示は、細菌感染症を治療する方法を提供する。様々な実施形態では、細菌感染は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性及び／又は嫌気性細菌によるものである。様々な実施形態では、細菌は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルキナ（Ｓａｒｃｉｎａ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ニッセリア（Ｎｉｓｓｅｒｉａ）、バクルス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）及び他の生物から選択されるが、これらに限定されない。実施形態では、細菌は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリゲン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、サルモネラ・チムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、シゲラ・ジセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、フランシセラ・チュラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レッテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スチュアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ハエモリチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、イェルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、イェルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、イェルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、イェルシニア・インテルメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンチセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ヘモリチカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリチカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、パステウレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パステウレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ブランハメラ・カタルハリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・フェータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、レギオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ネイセリア・ゴノルホエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ネイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、キンゲラ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス３４５２Ａ相同群（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ３４５２Ａ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｇｒｏｕｐ）、バクテロイデス・バルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・オバラス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｌｕｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・エゲルチイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、バクテロイデス・スプランクニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ジフィサイル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカスアガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピョゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・インテルメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・ヒカス亜種ヒカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、又はスタフィロコッカス・サッカロリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）から選択されるが、これらに限定されない。
更に別の他の態様では、本開示は、限定するものではないが、本明細書の他の箇所に記載される疾患又は障害、並びに炎症性疾患又は障害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植拒絶、及びＴ細胞増殖性障害などのＴ細胞媒介疾患及び障害を治療及び予防する方法に関する。
いくつかの態様において、本発明のキメラ剤は、例えば、免疫刺激シグナルを有する細胞外ドメイン又は免疫刺激シグナルを有する抗体結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ３、Ｆａｂ、ｓｃＦｖドメインなど）を介して、Ｔ細胞を活性化する方法において使用される。
いくつかの態様において、本キメラ剤は、免疫抑制シグナルの細胞伝達を防止する方法において使用される。
併用療法及びコンジュゲーション（Conjugation）
実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質及び対象に追加的薬剤を投与することを更に含む方法を提供する。実施形態では、本発明は、同時投与及び／又は同時製剤化に関する。本明細書に記載される組成物のいずれも、共製剤化及び／又は共投与され得る。
実施形態では、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質は、別の薬剤と同時投与された場合に相乗的に作用し、そのような薬剤が単剤療法として使用される場合に一般的に用いられる用量よりも低い用量で投与される。様々な実施形態では、本明細書で言及される任意の薬剤は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質のいずれかと組み合わせて使用され得る。
様々な実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のいずれかは、本明細書に開示される別のヘテロ二量体タンパク質と同時投与され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、自然免疫応答を誘導する１又は複数のヘテロ二量体タンパク質及び適応免疫応答を誘導する１又は複数のヘテロ二量体タンパク質の投与を含む併用レジメンは、相乗効果（例えば、相乗的な抗腫瘍効果）を提供し得ると考えられる。
様々な実施形態では、自然免疫応答を誘導する任意のヘテロ二量体タンパク質が、本開示において利用され得る。様々な実施形態では、適応免疫応答を誘導する任意のヘテロ二量体タンパク質が、本開示において利用され得る。
限定されないが、がん用途を含む実施形態において、本開示は、追加的薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例は、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、及びウレドパなどのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロフォスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソ尿素；エンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガムオール及びカリケアマイシンオメガオール（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照されたい）；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；同様にまた、ネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；抗アドレナリン、例えば、ミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；トグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトレリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２「－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えば、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥクレモフォアフリー、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ－１１）（５－ＦＵ及びロイコボリンを用いたイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメンを含むオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；細胞増殖を低下させるＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ））及びＶＥＧＦ－Ａの阻害剤並びに上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されない。更に、治療方法は、放射線の使用を更に含み得る。更に、治療方法は、光線力学的療法の使用を更に含み得る。
様々な実施形態では、限定されないが、がん用途を含めて、本追加的薬剤は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２並びに／あるいはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２との結合を遮断、低減及び／若しくは阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ，Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ－３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ，ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を増加及び／若しくは刺激する薬剤、及び／又はＣＤ１３７（４－１ＢＢ）と１若しくは複数の４－１ＢＢリガンド（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３及び抗４－１ＢＢ抗体）との結合を含む）、ＣＴＬＡ－４の活性及び／又はＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ－２及びＰＰＰ２Ｒ５Ａのうちの１若しくは複数とのＣＴＬＡ－４の結合及び／又はＯＸ４０ＬとのＯＸ４０の結合を減少及び／又は阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）から選択される１若しくは複数の免疫調節剤である。
限定されないが、感染症用途を含む実施形態では、本開示は、追加的薬剤としての抗感染薬に関する。実施形態では、抗感染薬は、限定されないが、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドホビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル及びホスカルネットを含む抗ウイルス剤である。実施形態では、抗感染薬は、セファロスポリン抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レバクイン、フロキシン、テクイン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン及びメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；及びカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、及びメロペネム）を含むがこれらに限定されない抗菌剤である。実施形態では、抗感染薬は、抗マラリア薬（例えば、クロロキン、キニーネ、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメータ／ルメファントリン、アトバコン／プログアニル及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、パモ酸ピランテル、及びアルベンダゾールを含む。
限定されないが、自己免疫用途を含む実施形態では、追加的薬剤は免疫抑制剤である。実施形態では、免疫抑制剤は、ステロイド系抗炎症剤又は非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に副腎皮質ステロイド及びそれらの合成類似体は、当技術分野で周知である。本開示において有用なコルチコステロイドの例としては、限定されないが、ヒドロキシルトリアムシノロン、α－メチルデキサメタゾン、β－メチルベタメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾンベンゾエート、ベタメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾンバレレート、クロベタゾールバレレート、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾンジアセテート、ジフルコルトロンバレレート、フルアドレノロン、フルクロロンアセトニド、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）アセテート、フルランドレノロン、ハロシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシノフィド、ベタメタゾン及びそのエステルの残部、クロロプレドニソン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオナートを含む。本開示で使用され得る（ＮＳＡＩＤＳ）は、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、サリチルミド、ベンジル－２，５－ジアセトキシ安息香酸、イブプロフェン、フリンダク、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナメート、フェニルブタゾン、及びインドメタシンを含むが、これらに限定されない。実施形態では、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノラート、及び低分子生物剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞増殖抑制剤であり得る。
実施形態では、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、修飾された（すなわち、共有結合が組成物の活性を妨げないように、組成物への任意の種類の分子の共有結合によって修飾された）誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、誘導体は、とりわけ、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などによって修飾された組成物を含む。多くの化学修飾のいずれも、限定するものではないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシンの代謝合成などを含む既知の技術によって行われ得る。更に、誘導体は、１又は複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。更に他の実施形態では、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、例示的な実施形態では、毒素、化学療法剤、放射性同位体、及びアポトーシス又は細胞死を引き起こす薬剤を含む細胞傷害剤を更に含む。そのような薬剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートされ得る。
したがって、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は翻訳後に修飾されて、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば蛍光色素、酵素、基質、生物発光材料、放射性物質、及び化学発光部分などの検出可能な部分、又は例えばストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素、細胞傷害剤、及び放射性物質などの機能性部分を付加することができる。
製剤
一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、無機若しくは有機酸と反応することができる十分に塩基性の官能基、又は無機若しくは有機塩基と反応して医薬的に許容される塩を形成することができるカルボキシル基を有し得る。医薬的に許容される酸付加塩は、当技術分野で周知のように、医薬的に許容される酸から形成される。そのような塩は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２－１９（１９７７）ａｎｄ Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙されている医薬的に許容される塩を含む。
実施形態では、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容される塩の形態である。
更に、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、医薬的に許容される担体又はビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与され得る。そのような組成物は、任意に、適切な投与のための形態を提供するように、適切な量の医薬的に許容される賦形剤を含み得る。医薬賦形剤は、液体、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。更に、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤が使用され得る。一実施形態では、医薬的に許容され得る賦形剤は、対象に投与されるとき、無菌である。水は、本明細書に記載の任意の薬剤が静脈内投与される場合、有用な賦形剤である。生理食塩水並びにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体賦形剤として、特に注射可能な溶液のために使用され得る。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含む。本明細書に記載の任意の薬剤は、所望であれば、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含み得る。
実施形態では、本明細書に記載の組成物は生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、ＰＢＳなどを含むが、これらに限定されない）に再懸濁される。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、半減期を延長するために、又はそうでなければ薬力学的及び薬物動態学的特性を改善するために、別の薬剤とコンジュゲート及び／又は融合され得る。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン又はＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、トランスフェリンなどのうちの１又は複数と融合又はコンジュゲートされ得る。様々な実施形態では、個々のヘテロ二量体タンパク質のそれぞれは、ＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５－２３９に記載されている薬剤のうちの１又は複数に融合され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
投与、投薬及び処置レジメン
本開示は、様々な製剤中の記載されたヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）を含む。本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、溶液、懸濁液、エマルジョン、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体を含有するカプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、懸濁液、又は使用に適した任意の他の形態をとることができる。タンパク質配列をコードするＤＮＡ構築物又はＲＮＡ構築物も使用され得る。一実施形態では、組成物はカプセルの形態である（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号明細書を参照されたい）。適切な医薬賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｓ．，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）に記載されている。
必要に応じて、ヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）を含む製剤は、可溶化剤も含むことができる。また、薬剤は、当技術分野で公知の適切なビヒクル又は送達装置を用いて送達され得る。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクル又は送達装置で共送達され得る。投与のための組成物は、任意に、注射部位の痛みを軽減するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含み得る。
本開示のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）を含む製剤は、単位剤形で好都合に提供され得、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。そのような方法は、一般に、治療薬を、１又は複数の補助成分を構成する担体と会合させる工程を含む。典型的には、製剤は、治療薬を液体担体、微粉化固体担体又はその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤の剤形に成形することによって調製される（例えば、湿式又は乾式造粒、粉末ブレンドなどの後、当技術分野で公知の従来の方法を使用して打錠する）。
一実施形態では、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。
投与経路は、例えば：皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、吸入による、又は局所的に、特に耳、鼻、目、又は皮膚への投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、経口又は非経口注射によって行われる。ほとんどの場合、投与は、本明細書に記載の任意の薬剤の血流中への放出をもたらす。
本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、経口投与され得る。そのようなヘテロ二量体タンパク質（及び／又は更なる薬剤）はまた、任意の他の好都合な経路によって、例えば、静脈内注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得、別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は全身的又は局所的であり得る。様々な送達系が知られており、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、投与に使用され得る。
特定の実施形態では、治療を必要とする領域に局所投与することが望ましい場合がある。一実施形態では、例えばがんの治療において、ヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍血管系を含む、腫瘍細胞を取り囲み及び／又は供給する細胞、分子、細胞外マトリックス及び／又は血管；腫瘍浸潤リンパ球；線維芽細胞網状細胞；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）；がん関連線維芽細胞；周皮細胞；他の間質細胞；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分；樹状細胞；抗原提示細胞；Ｔ細胞；制御性Ｔ細胞；マクロファージ；好中球；及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞）又はリンパ節に投与され、並びに／あるいは腫瘍微小環境又はリンパ節を標的とする。様々な実施形態では、例えばがんの治療において、ヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は腫瘍内投与される。
様々な実施形態では、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、従来の免疫療法（例えば、ＯＰＤＩＶＯ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＹＥＲＶＯＹ、及びＴＥＣＥＮＴＲＩＱのうちの１又は複数による治療）で見られるよりも少ない副作用を提供する二重の効果を可能にする。例えば、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、下垂体炎、大腸炎、肝炎、肺臓炎、発疹及びリウマチ性疾患など、皮膚、胃腸管、腎臓、末梢神経系及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、眼、膵臓、及び内分泌系を含む様々な組織及び器官に影響を及ぼす一般的に観察される免疫関連有害事象を低減又は防止する。更に、本局所投与、例えば腫瘍内投与は、従来の免疫療法（例えば、ＯＰＤＩＶＯ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＹＥＲＶＯＹ、及びＴＥＣＥＮＴＲＩＱのうちの１又は複数による治療）で使用されるように、標準的な全身投与、例えばＩＶ注入で見られる有害事象を回避する。
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下及び関節内の注射及び注入）に適した剤形は、例えば、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョンなどを含む。それらはまた、滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造されてもよく、使用直前に滅菌注射用媒体に溶解又は懸濁され得る。それらは、例えば、当技術分野で公知の懸濁化剤又は分散剤を含有し得る。
本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の投与量並びに投与スケジュールは、治療される疾患、対象の全般的な健康状態、及び投与する医師の裁量を含むがこれらに限定されない様々なパラメータに依存し得る。本明細書に記載される任意のヘテロ二量体タンパク質は、追加的薬剤の投与の前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、追加的薬剤の投与と同時に、又は追加的薬剤の投与に続いて（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、又は１２週間後）、それを必要とする対象に投与され得る。様々な実施形態では、本明細書に記載される任意のヘテロ二量体タンパク質及び追加的薬剤は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満間隔、１時間間隔、１時間～２時間間隔、２時間～３時間間隔、３時間～４時間間隔、４時間～５時間間隔、５時間～６時間間隔、６時間～７時間間隔、７時間～８時間間隔、８時間～９時間間隔、９時間～１０時間間隔、１０時間～１１時間間隔、１１時間～１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与される。
様々な実施形態では、本開示は、自然免疫応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質と、適応免疫応答を誘導する別のヘテロ二量体タンパク質との同時投与に関する。そのような実施形態では、自然免疫応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質は、適応免疫応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質の投与前、投与と同時、又は投与後に投与され得る。例えば、ヘテロ二量体タンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満間隔、１時間間隔、１時間～２時間間隔、２時間～３時間間隔、３時間～４時間間隔、４時間～５時間間隔、５時間～６時間間隔、６時間～７時間間隔、７時間～８時間間隔、８時間～９時間間隔、９時間～１０時間間隔、１０時間～１１時間間隔、１１時間～１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、又は４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態では、自然免疫応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質及び適応応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質は、１週間間隔で投与されるか、又は隔週で投与される（すなわち、自然免疫応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質の投与は、１週間後に、適応免疫応答を誘導するヘテロ二量体タンパク質の投与などが続く）。
本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の投与量は、症状の重症度、症状が治療又は予防されるかどうか、並びに治療される対象の年齢、体重及び健康状態を含むいくつかの因子に依存し得る。更に、特定の対象に関する薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態、薬力学又は有効性プロファイルに対する遺伝子型の効果）情報は、使用される投与量に影響を及ぼし得る。更に、正確な個々の投与量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排泄速度、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む様々な要因に応じていくらか調整され得る。投与量のいくつかの変動が予想され得る。
非経口注射による本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の投与の場合、投与量は、約０．１ｍｇ～約２５０ｍｇ／日、約１ｍｇ～約２０ｍｇ／日、又は約３ｍｇ～約５ｍｇ／日であり得る。一般に、経口投与又は非経口投与される場合、本明細書に記載される任意の薬剤の投与量は、約０．１ｍｇ～約１５００ｍｇ／日、又は約０．５ｍｇ～約１０ｍｇ／日、又は約０．５ｍｇ～約５ｍｇ／日、又は約２００～約１，２００ｍｇ／日（例えば、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ／日）であり得る。
実施形態では、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の投与は、治療当たり約０．１ｍｇ～約１５００ｍｇ、又は治療当たり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇ、又は治療当たり約０．５ｍｇ～約５ｍｇ、又は治療当たり約２００～約１，２００ｍｇ（例えば、治療当たり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）の投与量での非経口注射によるものである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の適切な投与量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ体重（その間の全ての値及び範囲を含む）の範囲内である。
別の実施形態では、送達は小胞、特にリポソーム中であり得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）を参照されたい）。
本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、制御放出手段若しくは徐放手段によって、又は当業者に周知の送達装置によって投与され得る。例としては、米国特許第３，８４５，７７０号、第３，９１６，８９９号、第３，５３６，８０９号、第３，５９８，１２３号、第４，００８，７１９号、第５，６７４，５３３号、第５，０５９，５９５号、第５，５９１，７６７号、第５，１２０，５４８号、第５，０７３，５４３号、第５，６３９，４７６、第５，３５４，５５６号及び５，７３３，５５６を含み、これらに限定されないが、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような剤形は、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、又はそれらの組み合わせを使用して１又は複数の活性成分の制御放出又は持続放出を提供して、所望の放出プロファイルを様々な割合で提供するのに有用であり得る。活性成分の制御放出又は持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度若しくは利用可能性、水の濃度若しくは利用可能性、又は他の生理学的条件若しくは化合物を含むがこれらに限定されない様々な条件によって刺激され得る。
別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい。また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。
別の実施形態では、制御放出システムは、治療される標的領域の近くに配置され得、したがって、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３による総説で論じられている他の制御放出系を使用してもよい。
本明細書中に記載される任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は更なる薬剤）の投与は、独立して、１日に１～４回、又は１ヶ月に１～４回、又は１年に１～６回、又は２年、３年、４年又は５年に１回であり得る。投与は、１日又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であってもよく、対象の生涯であってもよい。
本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）を利用する投与レジメンは、対象の種類、種、年齢、体重、性別及び医学的状態；治療される状態の重症度；投与経路；対象の腎機能又は肝機能；個体の薬理ゲノム構成；及び使用される本発明の特定の化合物を含む様々な因子に従って選択され得る。本明細書に記載される任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、１日１回の用量で投与され得、又は１日の総投与量は、１日２回、３回又は４回の分割用量で投与され得る。更に、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）は、投与レジメン全体にわたって断続的ではなく連続的に投与され得る。
細胞及び核酸
一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのヘテロ二量体タンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。実施形態では、発現ベクターは哺乳類用発現ベクターである。実施形態では、発現ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。実施形態では、一態様では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
様々な実施形態では、本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質（例えば、第１及び第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体タンパク質）をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。様々な実施形態では、発現ベクターはＤＮＡ又はＲＮＡを含む。様々な実施形態では、発現ベクターは哺乳類用発現ベクターである。
原核生物ベクター及び真核生物ベクターの両方がヘテロ二量体タンパク質の発現に使用され得る。原核生物ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列に基づく構築物を含む（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９６，６０：５１２－５３８を参照されたい）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために使用され得る調節領域の非限定的な例は、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７及びλＰＬを含む。原核生物発現ベクターの非限定的な例は、λｇｔベクター系列、例えばλｇｔ１１（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．４９－７８，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）及びｐＥＴベクター系列（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９９０，１８５：６０－８９）を含み得る。しかしながら、原核生物宿主－ベクター系は、哺乳動物細胞の翻訳後プロセシングの多くを行うことができない。したがって、真核生物宿主－ベクター系が特に有用であり得る。哺乳動物宿主細胞におけるヘテロ二量体タンパク質の発現のために、様々な調節領域が使用され得る。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＲＳＶ－ＬＴＲ）プロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞において有用であり得る誘導性プロモーターは、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳腺腫瘍ウイルス糖質コルチコイド応答性長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ）、β－インターフェロン遺伝子及びｈｓｐ７０遺伝子に関連するプロモーターを含むが、これらに限定されない（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９，４９：２７３５－４２；ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０，１０：１６５－７５を参照されたい）。熱ショックプロモーター又はストレスプロモーターはまた、組換え宿主細胞における融合タンパク質の発現を駆動するのに有利であり得る。
実施形態では、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である発現制御領域又はその相補体に作動可能に連結された、ヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の少なくとも第１及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする核酸又はその相補体を含む。発現制御領域は、ブロッキング剤及び／又は刺激剤が、発現ベクターで形質転換されたヒト細胞で産生されるように、核酸をコードする作動可能に連結されたブロッキング剤及び／又は刺激剤の発現を駆動することができる。
発現制御領域は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼす、プロモーター及びエンハンサーなど、調節ポリヌクレオチド（本明細書ではエレメントと呼ばれることもある）である。本発明の発現ベクターの発現制御領域は、作動可能に連結されたコード核酸をヒト細胞において発現させることができる。一実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、細胞は非腫瘍細胞である。一実施形態では、発現制御領域は、作動可能に連結された核酸に調節可能な発現を付与する。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結された核酸の発現を増加又は減少させ得る。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、誘導性と呼ばれることが多い。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、しばしば抑制性と呼ばれる。典型的には、そのような要素によって与えられる増加又は減少の量は、存在する信号の量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増加又は減少が大きくなる。
一実施形態では、本開示は、キューに応答して一過性に高レベルの発現をもたらすことができる誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近くにある場合、そのような発現制御配列を含むヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換された細胞を適切なキューに曝露することによって、高レベルの薬剤を一過性に産生するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域は、小分子化学化合物などのキューで刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。特定の例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号、第５，９３５，９３４号、第６，０１５，７０９号及び第６，００４，９４１号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発現制御領域及び遺伝子座制御領域は、天然プロモーター及びエンハンサーエレメントなどの全長プロモーター配列、並びに全長又は非変異体機能の全部又は一部を保持する部分配列又はポリヌクレオチド変異体を含む。本明細書で使用される場合、「機能性」という用語及びその文法上の変形は、核酸配列、部分配列又は断片に関して使用される場合、配列が天然核酸配列（例えば、非変異体又は非修飾配列）の１又は複数の機能を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「作動可能な連結」は、それらが意図された方法で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的並置を指す。核酸と作動可能に連結している発現制御エレメントの例において、その関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。典型的には、転写を調節する発現制御領域が、転写された核酸の５’末端付近に並置される（すなわち、「上流」）。発現制御領域はまた、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロンにおいて）に位置し得る。発現制御エレメントは、転写された配列から離れた距離（例えば、核酸からの１００～５００、５００～１０００、２０００～５０００又はそれを超えるヌクレオチド）に配置され得る。発現制御エレメントの具体例はプロモーターであり、これは通常、転写配列の５’側に位置する。発現制御エレメントの別の例は、転写配列の５’若しくは３’又は転写配列内に位置し得るエンハンサーである。
ヒト細胞において機能的な発現系は、当該分野で周知であり、ウイルス系を含む。一般に、ヒト細胞において機能的なプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡへのコード配列の下流（３’）転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常はコード配列の５’末端の近位に配置される転写開始領域、典型的には転写開始部位の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、正しい部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられる。プロモーターはまた、典型的には、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含み、典型的には、ＴＡＴＡボックスの１００から２００塩基対上流に位置する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、どちらの向きでも作用することができる。ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、広い宿主範囲を有するので、プロモーターとして特に使用されるのは哺乳動物ウイルス遺伝子からのプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター及びＣＭＶプロモーターを含む。
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、したがってプロモーターエレメントと共にコード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０に由来するものを含む。イントロンはまた、発現構築物に含まれ得る。
核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーベースのシステム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。インビボ遺伝子移入のために、リポソーム；キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマーベースの送達ビヒクルを含む多数の技術及び試薬も使用され得、ウイルスベクターは、インビボ形質導入にも適している。いくつかの状況では、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又はリガンドなどの標的化剤を提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、カプシドタンパク質又は特定の細胞型を指向するその断片、サイクリングにおいて内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質を、標的化するため及び／又は取込みを促進するために使用され得る。受容体媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９－４４３２（１９８７）；ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０－３４１４（１９９０）によって記載される。
必要に応じて、例えば組込み配列などの遺伝子送達剤も使用され得る。多数のインテグレーション配列が当技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ－Ｄｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１－４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１－３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２－３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ １５：３２６－３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３を参照されたい）。これらは、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼを含む。例は、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７－４８６，１９８１）、ラムダ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３－５４５，１９７４）、ＦＩｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７－２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０－６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７－６７８，２００４を参照されたい）、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、マリンファミリーのトランスポザーゼ（上記のＰｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．）、並びにレトロウイルス又はレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する成分を有するＡＡＶ、レトロウイルス、及び抗ウイルスなどのウイルスを組み込むための成分（Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３）を含む。更に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を挿入するために、直接及び標的化された遺伝子組込み戦略が使用され得る。
一態様では、本発明は、ウイルスベクターであるヘテロ二量体タンパク質（及び／又は追加的薬剤）を発現させるための発現ベクターを提供する。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが知られている（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１ １７，１２２，２００３参照）。例示的なウイルスベクターは、抗ウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものを含むが、他のウイルスベクターも使用され得る。インビボ使用のために、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクター、例えばαウイルス及びアデノウイルスが使用に適している。αウイルスの例示的なタイプは、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を含む。インビトロでの使用のために、宿主ゲノムに組み込まれるウイルスベクター、例えばレトロウイルス、ＡＡＶ及びＡｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓが適している。一実施形態では、本発明は、インビボで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む、インビボでヒト細胞に形質導入する方法を提供する。
様々な実施形態では、本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明のヘテロ二量体タンパク質を産生するために、発現ベクターが宿主細胞に導入され得る。細胞は、例えば、インビトロで培養され得るか、又は遺伝子操作され得る。有用な哺乳動物宿主細胞は、限定されないが、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞を含む（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｉｎ“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．を参照されたい）。これらは、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎系統（例えば、２９３、２９３－ＥＢＮＡ、又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３個の細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９７７，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞－ＤＨＦＲ（例えば、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８０，７７：４２１６）；ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ １９８０，２３：２４３－２５１）；マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ－３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）を含む。本明細書に記載の融合タンパク質を発現するための例示的ながん細胞型は、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺がん細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞腫細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びそのオバルブミントランスフェクタント、Ｅ．Ｇ７、マウスメラノーマ細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、並びにヒト小細胞肺がん細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７を含む。
宿主細胞は、健康なヒト、がん患者、及び感染性疾患を有する患者を含む正常な対象又は罹患した対象、民間の実験室寄託物、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの公的な培養物コレクションから、又は商業的供給業者から取得され得る。
インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボでの本発明のヘテロ二量体タンパク質の産生のために使用され得る細胞は、限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に造血幹細胞又は前駆細胞（例えば、骨髄から得られる場合）、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などを含む。細胞タイプの選択は、治療又は予防されている腫瘍又は感染症のタイプに依存し、当業者によって決定され得る。
Ｆｃ含有高分子（Ｆｃ融合タンパク質など）の産生及び精製は、製品間のわずかな改変を伴う標準化されたプロセスとなっている。例えば、多くのＦｃ含有高分子は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（又はその変異体）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（又はその変異体）によって、又は場合によっては細菌又は合成方法によって産生される。産生後、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞によって分泌されるＦｃ含有高分子は、タンパク質Ａカラムへの結合を通して精製され、続いて様々な方法を使用して「研磨」される。一般的に言えば、精製されたＦｃ含有高分子は、ある期間液体形態で保存され、長期間凍結され、又はいくつかの場合、凍結乾燥される。様々な実施形態では、本明細書で企図されるヘテロ二量体タンパク質の産生は、従来のＦｃ含有高分子と比較して固有の特徴を有し得る。特定の例では、ヘテロ二量体タンパク質は、特定のクロマトグラフィ樹脂を使用して、又はタンパク質Ａ捕捉に依存しないクロマトグラフィ法を使用して精製され得る。他の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、オリゴマー状態又は複数のオリゴマー状態で精製され、特定の方法を使用して特定のオリゴマー状態について濃縮され得る。理論に束縛されるものではないが、これらの方法は、特定の塩濃度、ｐＨ及び添加剤組成物を含む特定の緩衝液での処理を含むことができる。他の例では、そのような方法は、あるオリゴマー状態を別のオリゴマー状態よりも優先する処理を含むことができる。本明細書で得られるヘテロ二量体タンパク質は、当技術分野で指定されている方法を使用して更に「研磨」され得る。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、非常に安定であり、広範囲のｐＨ曝露（ｐＨ３～１２）に耐えることができ、多数の凍結／解凍ストレス（３回を超える凍結／解凍サイクル）に耐えることができ、高温での長期インキュベーション（４０℃で２週間を超える）に耐えることができる。他の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、そのようなストレス条件下での分解、脱アミドなどの証拠なしに、無傷のままであることが示される。
対象及び／又は動物
実施形態では、対象及び／又は動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又はサル、チンパンジー若しくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。他の実施形態では、対象及び／又は動物は、非哺乳動物、例えばゼブラフィッシュである。実施形態では、対象及び／又は動物は、蛍光タグ付けされた細胞（例えば、ＧＦＰ）を含み得る。実施形態では、対象及び／又は動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
実施形態では、対象及び／又は動物はヒトである。実施形態では、ヒトは、小児ヒトである。他の実施形態では、ヒトは成人ヒトである。他の実施形態では、ヒトは老年ヒトである。他の実施形態では、ヒトは患者と呼ばれ得る。
特定の実施形態では、ヒトは、約０ヶ月～約６ヶ月齢、約６～約１２ヶ月齢、約６～約１８ヶ月齢、約１８～約３６ヶ月齢、約１～約５歳、約５～約１０歳、約１０～約１５歳、約１５～約２０歳、約２０～約２５歳、約２５～約３０歳、約３０～約３５歳、約３５～約４０歳、約４０～約４５歳、約４５～約５０歳、約５０～約５５歳、約５５～約６０歳、約６０～約６５歳、約６５～約７０歳、約７０～約７５歳、約７５～約８０歳、約８０～約８５歳、約８５～約９０歳、約９０～約９５歳又は約９５～約１００歳の範囲内の年齢を有する。
他の実施形態では、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学的使用に関する。特定の実施形態では、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は家畜動物である。
本開示のヘテロ二量体タンパク質を作製する方法
本明細書で開示されるのは、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接し、ヘテロ二量体化を促進する、リンカーと、を含むヘテロ二量体タンパク質を作製する方法である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、２つの同じブチロフィリンファミリータンパク質又は２つの異なるブチロフィリンファミリータンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、自己会合する２つの個々のポリペプチド鎖を含む。そのようなヘテロ二量体タンパク質は、国際公開第２０２０／１４６３９３号に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、第１のドメインは、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬ由来のブチロフィリンファミリータンパク質を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから選択される。標的化ドメインは、本明細書に開示される実施形態のいずれかであり得る。リンカーは、本明細書に開示される実施形態のいずれかであり得る。
通常、ヘテロ二量体タンパク質は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。例示的な精製工程は、クロマトグラフィ（限定されないが、例えば、アフィニティークロマトグラフィ）を含む。精製方法は、タンパク質精製及び抗体精製の分野で周知である。精製プロセスの工程は、米国特許第５，４２９，７４６号、第９，７０８，３６５号、第１０，５７０，４３４号、第１０，５３３，０４５号、第９，６３１，００７号、第７，６９１，９８０号、第９，９３８，３１７号に開示され、その各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な実施形態では、本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質は、２つの変異体Ｆｃドメイン配列を含む。そのような変異体Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体タンパク質の自己集合及び／又は精製を促進するためのアミノ酸修飾を含む。ヘテロ二量体タンパク質の産生及び精製を促進する例示的なアミノ酸修飾は、ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする「ｓｋｅｗ」変異体（例えば、本明細書に記載の「ノブ及びホール」及び「電荷対」変形例）並びに「ｐＩ変異体」を含む。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０５，０８４号に一般的に記載されているように、ヘテロ二量体化のための有用な機構は、米国特許第９，６０５，０８４号明細書に記載されているような「ノブ及びホール」（「ＫＩＨ」）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０５，０８４号明細書に記載されているような「静電ステアリング」又は「電荷対」、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０５，０８４号に記載されているようなｐＩ変異体、及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０５，０８４号に概説されているような一般的な追加のＦｃ変異体を含む。
単一遺伝子ベクター（Single Gene Vectors）を使用する方法
一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質を作製する方法を提供し、方法は、（ｉ）アルファ鎖をコードする単一遺伝子ベクター及び／又はベータ鎖をコードする単一遺伝子ベクターを含む細胞を提供することと、（ｉｉ）細胞を培養することと、（ｉｉ）細胞の培養上清及び／又は溶解物からヘテロ二量体タンパク質を作製することと、を含む。
一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質を製造する方法を提供し、方法は、ａ）細胞の集団（限定されないが、例えば、ＥｘｐｉＣＨＯ及びＥｘｐｉ２９３細胞）を提供することと、ｂ）アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）で細胞集団を形質導入することと、ｃ）形質導入された細胞集団を培養して増殖させることと、ｄ）形質導入された細胞集団の培養上清及び／又は溶解物からヘテロ二量体タンパク質を抽出及び／又は精製することと、を含む。
実施形態では、そのような方法は図１０Ａに示す通りである。実施形態では、細胞（限定されないが、例えば、ＥｘｐｉＣＨＯ及びＥｘｐｉ２９３細胞）は、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）で同時トランスフェクトされる。実施形態では、細胞は、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）で実質的に同時にトランスフェクトされる。実施形態では、細胞は、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）で逐次的にトランスフェクトされる。実施形態では、細胞は、最初に、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）でトランスフェクトされた後、ベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）でトランスフェクトされる。実施形態では、細胞は、最初にベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）でトランスフェクトした後に、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）でトランスフェクトされる。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を同時トランスフェクトした細胞は、単離、濃縮又は精製される。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を同時トランスフェクトした細胞は、単離、濃縮又は精製されない。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を同時トランスフェクトした細胞は、任意に単離され、濃縮され、又は精製され、インビトロで培養される。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を同時トランスフェクトした細胞が培養で増殖される。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）で同時トランスフェクトされた細胞の培養上清及び／又は溶解物から抽出及び／又は精製される。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖及びベータ鎖は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインは同じである。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の標的化ドメインを含む第２のドメインは同じである。実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーは同じである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖は、（ａ）ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから選択されるブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから選択されるブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと；（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから選択される。実施形態では、標的化ドメインは、本明細書に開示される任意の実施形態の標的化ドメインである。実施形態では、リンカーは、本明細書に開示される任意の実施形態のリンカーである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖は、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１又はその断片を含む第１のドメイン（限定されないが、例えば、可変ドメイン）と、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）ＢＴＮ３Ａ１又はその断片を含む第１のドメイン（限定されないが、例えば、可変ドメイン）と、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。
二重遺伝子ベクター（Dual Gene Vectors）を使用する方法
一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質を作製する方法を提供し、方法は、（ｉ）アルファ鎖及びベータ鎖をコードする二重遺伝子ベクターを含む細胞を提供することと、（ｉｉ）細胞を培養することと、（ｉｉ）細胞の培養上清及び／又は溶解物からヘテロ二量体タンパク質を作製することと、を含む。
一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質を製造する方法を提供し、方法は、ａ）細胞の集団（限定されないが、例えば、ＥｘｐｉＣＨＯ及びＥｘｐｉ２９３細胞）を提供することと、ｂ）アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）で細胞集団を形質導入することと、ｃ）形質導入された細胞集団を培養して増殖させることと、ｄ）形質導入された細胞集団の培養上清及び／又は溶解物からヘテロ二量体タンパク質を抽出及び／又は精製することと、を含む。
実施形態では、そのような方法は図１０Ｂに示す通りである。実施形態では、細胞（限定されないが、例えば、ＥｘｐｉＣＨＯ及びＥｘｐｉ２９３細胞）は、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）でトランスフェクトされる。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）をトランスフェクトした細胞は、単離、濃縮又は精製される。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）をトランスフェクトした細胞は、任意に単離され、濃縮され、又は精製され、インビトロで培養される。実施形態では、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）をトランスフェクトした細胞が培養で増殖される。実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びベータ鎖（限定されないが、例えばＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）でトランスフェクトされた細胞の培養上清及び／又は溶解物から抽出及び／又は精製される。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖及びベータ鎖は、（ａ）１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の１又は複数のブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインは同じである。実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の標的化ドメインを含む第２のドメインは同じである。実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーは同じである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖は、（ａ）ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから選択されるブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから選択されるブチロフィリンファミリータンパク質又はその断片を含む第１のドメインと；（ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、（ｃ）第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み。実施形態では、ブチロフィリンファミリータンパク質は、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから選択される。実施形態では、標的化ドメインは、本明細書に開示される任意の実施形態の標的化ドメインである。実施形態では、リンカーは、本明細書に開示される任意の実施形態のリンカーである。
実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、アルファ鎖は、（ａ）ＢＴＮ２Ａ１又はその断片を含む第１のドメイン（限定されないが、例えば、可変ドメイン）と、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含み、ベータ鎖は、（ａ）ＢＴＮ３Ａ１又はその断片を含む第１のドメイン（限定されないが、例えば、可変ドメイン）と、（ｂ）標的化ドメインを含む第２のドメインであって、標的化ドメインが、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）細胞外ドメインから選択される、第２のドメインと、（ｃ）第１及び第２のドメインに隣接するリンカーと、を含む。
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を単純化することができるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、単位剤形で本明細書に記載される任意の組成物を含む。一実施形態では、単位剤形は、本明細書に記載の任意の薬剤及び医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する、無菌であり得るプレフィルドシリンジなどの容器である。キットは、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を指示するラベル又は印刷された説明書を更に含み得る。キットはまた、開瞼器、局所麻酔薬、及び投与位置のための洗浄剤を含み得る。キットはまた、本明細書中に記載される１又は複数の更なる薬剤を更に含み得る。一実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物及び有効量の別の組成物、例えば本明細書に記載の組成物を含有する容器を含む。
本明細書における実施例は、本技術の利点及び利益を例示するために、また、当業者が本技術のキメラタンパク質を調製又は使用することを更に補助するために提供される。本明細書の実施例はまた、本技術の好ましい態様をより完全に説明するために提示される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本技術の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。実施例は、上述した本技術の変形、態様又は実施形態のいずれかを含むか、又は組み込むことができる。上述の変形、態様又は実施形態はそれぞれ、本技術の任意の又は全ての他の変形、態様又は実施形態の変形を更に含むか又は組み込むこともできる。
実施例１：例示的なＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質の構築及び特性決定
本技術のヘテロ二量体タンパク質は、各々がブチロフィリンファミリーメンバー、コアドメイン及び抗原標的化ドメインを含む２つのキメラタンパク質の二量体を含む。「ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ」構築物は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＣＤ１９ｓｃＦｖに融合したヒトＢＴＮ２Ａ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むアルファ鎖と、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＣＤ１９ｓｃＦｖに融合したヒトＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むベータ鎖を含んでいた。図１Ａを参照されたい。ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖタンパク質（アルファ鎖）及びＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖタンパク質（ベータ鎖）をコードする構築物を生成した。このＧＡｍｍａ ＤＥＬｔａ Ｔ細胞ＥＮｇａｇｅｒ構築物は、本明細書ではＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ「ＧＡＤＬＥＮ」タンパク質とも呼ばれる。
１）ＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖタンパク質及び２）ＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖタンパク質をコードする２つのプラスミドのＥｘｐｉ２９３細胞における一過性同時トランスフェクションを介して産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質。アルファ構築物及びベータ構築物は、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（「アルファ」鎖）及びＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ（「ベータ」鎖）をコードした。アルファ鎖及びベータ鎖は、所望のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のヘテロ二量体化を促進する電荷分極リンカードメインを含有していた。一過性トランスフェクションからの細胞培養上清をトランスフェクションの６日後に回収し、ＦｃＸＬクロマトグラフィ樹脂で精製した。図１Ｂに示すように、ＦｃＸＬクロマトグラフィにより、得られたタンパク質が実質的に純粋であることが明らかになった。
タンパク質の純度を、非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を使用して更に評価した。図２Ａに示すように、クーマシーブルー染色ゲルは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が＞９０％の純度を有することを明らかにした（図２Ｂ及び２Ｃも参照されたい）。
精製されたタンパク質を、抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体、抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体又は抗マウスＦｃ抗体で検出した後、非還元条件、還元条件、並びに還元条件及び脱グリコシル条件の両方を使用してウエスタンブロットによって更に分析した。非還元型ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、単一バンド（図２Ｂのレーン「Ｌ」参照）として泳動し、ＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ鎖とＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ鎖との間の共有結合複合体形成を示した。図２Ｂに示すように、抗Ｆｃ抗体でプローブしたブロットは、還元的であるが脱グリコシル化されていない条件下で調製されたタンパク質を有する２つのバンドを明らかにした（図２Ｂのレーン「Ｒ」参照）。抗ヒトＢＴＮ２Ａ１及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体でプローブしたゲルは、抗Ｆｃプローブしたブロットで明らかにされた２つのバンドに対応する可動性を有するバンドを示した。興味深いことに、還元及び脱グリコシル化（レーン「ＤＧ」）条件下で調製されたタンパク質は単一のバンドをもたらし、これは抗ヒトＢＴＮ２Ａ１、抗ヒトＢＴＮ３Ａ１、又は抗マウスＦｃ抗体のいずれかで検出され得た。
ＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖモノマー及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖモノマーの同時検出を容易にするために、スターブライトブルー５２０とコンジュゲートした抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体及びＤｙｌｉｔｅ８００とコンジュゲートした抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体での検出後、非還元（レーン「ＮＲ」）、還元（レーン「Ｒ」）並びに還元及び脱グリコシル化（レーン「ＤＧ」）条件の両方を用いて、精製ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質をウエスタンブロットによって分析した。図２Ｃに示すように、二色ウエスタンブロット分析は、還元されたが非脱グリコシル化状態でのＢＴＮ２Ａ１－α及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の存在を示した。具体的には、青色のＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖバンドは、緑色のＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ単量体よりも遅く移動した（図２Ｃのレーン「Ｒ」参照）。非還元条件下（図２Ｃのレーン「ＮＲ」）並びに還元及び脱グリコシル化条件下（図２Ｃのレーン「ＤＧ」）の両方で調製されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、単一の青緑色バンドとして泳動した。
これらの結果は、（β－メルカプトエタノールによる鎖間ジスルフィド結合の破壊後に）２つの個々のタンパク質に還元するジスルフィド結合二量体タンパク質の存在を示す。これらのデータは、還元条件レーンと還元条件及び脱グリコシル化条件の両方のレーンとの間の類似性に基づいて、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮがグリコシル化されることを更に示唆した。これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖがＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖよりもグリコシル化されていることを更に示唆した。
実施例２：ＣＤ１９へのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合
ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質中に存在するＣＤ１９ｓｃＦｖの結合の結合速度論を研究するために、Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して結合アッセイを実施した。簡潔に述べると、組換えＣＤ１９－Ｈｉｓタンパク質をバイオセンサ上に固定化し、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体を添加した。ＣＤ１９－Ｈｉｓタンパク質に対するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合応答を、センサーグラムトレース上にリアルタイムでプロットした。図３に示すように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、時間依存性及び飽和性の動態で組換えＣＤ１９－Ｈｉｓタンパク質に結合した。比較すると、ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体はバックグラウンドシグナルのみを示した。これらの実験は、ヒトＣＤ１９へのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合についての以下の結合パラメータを明らかにした。
これらの結果は、本明細書に開示されるＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のＣ末端に位置するＣＤ１９ｓｃＦｖがＣＤ１９に特異的に結合することを実証している。
実施例３：ＣＤ１９及びＢＴＮ２Ａ１／ＢＴＮ３Ａ１リガンドへのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の同時結合
ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有する。ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１タンパク質のＥＣＤ及び天然ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質中に存在するＣＤ１９ｓｃＦｖがそれらのリガンドと同時に存在し得るかどうかを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して次に調査した。組換えＣＤ１９タンパク質をプレート上にコーティングし、プレートに結合した組換えＣＤ１９タンパク質による捕捉のために、漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を使用して検出した。図４Ａに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、用量依存的な結合を示したが、ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体は示さなかった。このアッセイにおけるシグナルの生成は、組換えＣＤ１９タンパク質及び抗ＢＴＮ２Ａ１抗体への同時結合を必要とするので、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＣＤ１９タンパク質及びＢＴＮ２Ａ１リガンドに同時に結合することができることを実証している。
別の実験では、組換えＣＤ１９タンパク質をプレート上にコーティングし、プレートに結合した組換えＣＤ１９タンパク質による捕捉のために、漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体を使用して検出した。図４Ｂに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、用量依存的な結合を示したが、ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体は示さなかった。このアッセイにおけるシグナルの生成は、組換えＣＤ１９タンパク質及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体への同時結合を必要とするので、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＣＤ１９タンパク質及びＢＴＮ３Ａ１リガンドに同時に結合することができることを実証している。
これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が、ＣＤ１９及びブリロフィリンＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１リガンドに同時に結合することができることを示している。まとめると、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がＣＤ１９ｓｃＦｖ及びブリロフィリンＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１末端の両方がそれらのリガンドに同時に結合することができることを実証している。
実施例４：ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のＢＴＮ２Ａ１リガンド及びＢＴＮ３Ａ１リガンドへの同時結合
ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１タンパク質のＥＣＤ及び天然ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質中に存在するＣＤ１９ｓｃＦｖがそれらのリガンドと同時に存在し得るかどうかを、ＭＳＤ ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して次に調査した。図５Ａは、ＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイの概略図を示す。抗ＢＴＮ２Ａ１抗体をプレート上にコーティングし、プレートに結合した抗ＢＴＮ２Ａ１抗体による捕捉のために漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体を使用して検出した。図５Ｂに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、用量依存的な結合を示した。このアッセイにおけるシグナルの生成は、プレートに結合した抗ＢＴＮ２Ａ１抗体及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体への同時結合を必要とするので、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がプレートに結合した抗ＢＴＮ２Ａ１抗体と抗ＢＴＮ３Ａ１抗体とを架橋することができることを実証している。
別の実験では、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体をプレート上にコーティングし、プレートに結合した抗ＢＴＮ３Ａ１抗体による捕捉のために漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体を使用して検出した。図５Ｃに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、用量依存的な結合を示した。このアッセイにおけるシグナルの生成は、プレートに結合した抗ＢＴＮ３Ａ１抗体及び抗ＢＴＮ２Ａ１抗体への同時結合を必要とするので、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質がプレートに結合した抗ＢＴＮ３Ａ１抗体と抗ＢＴＮ２Ａ１抗体とを架橋することができることを実証している。
これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体及び抗ＢＴＮ２Ａ１抗体に同時に結合することができることを示している。まとめると、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が、ブリロフィリンＢＴＮ２Ａ１リガンド／受容体及びＢＴＮ３Ａ１リガンド／受容体の両方に同時に結合し得ることを実証している。
実施例５：ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質によるＣＤ１９依存性細胞表面結合
ＣＤ１９＋細胞へのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の結合を試験するために、表面にＣＤ１９を発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＣＤ１９細胞）及びＨＥＫ２９３親細胞を使用した。漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質、又は結合のための陰性対照として使用したＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体をＨＥＫ２９３－ＣＤ１９細胞に添加した。ＨＥＫ２９３－ＣＤ１９細胞に結合したＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質を、抗Ｆｃ抗体を使用して検出し、フローサイトメトリを使用してアッセイした。図６Ａに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、ＨＥＫ２９３－ＣＤ１９細胞に対して用量依存的かつ飽和性の結合を示した。対照的に、ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体は、結合のバックグラウンドレベルのみを示した。データは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が０．８９ｎＭのＥＣ５０でＨＥＫ２９３－ＣＤ１９細胞に結合したことを示した。
別の実験では、漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体を親ＨＥＫ２９３細胞に添加した。結合ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質を、図６Ａのようにフローサイトメトリを使用してアッセイした。図６Ｂに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質及びＣＤ１９ｓｃＦｖを欠くヘテロ二量体の両方が、バックグラウンドレベルの結合しか示さなかった。
ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のＣＤ１９＋細胞への結合を、表面にＣＤ１９を発現するＤａｕｄｉ細胞を使用して更に調査した。Ｄａｕｄｉ細胞の表面上のＣＤ１９の発現を、フローサイトメトリを使用して確認した。図７Ａに示すように、アイソタイプ対照ではなく抗ＣＤ１９抗体がＤａｕｄｉ細胞を染色することができ、Ｄａｕｄｉ細胞がＣＤ１９＋であることが確認された。
漸増量のＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体をＤａｕｄｉ細胞に添加し、結合をフローサイトメトリを使用して検出した。図７Ｂに示されるように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、Ｄａｕｄｉ細胞に用量依存的かつ飽和可能な様式で結合したが、ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体は結合しなかった。これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が５ｎＭのＥＣ５０でＤａｕｄｉ細胞に結合したことを再び示した。
これらの結果は、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が用量依存的かつ飽和性の様式でＣＤ１９＋細胞に特異的に結合することを実証している。
実施例６：ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質によるγδ細胞への結合
次に、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質のγδ細胞への結合を研究した。健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。単離したＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質、ＢＴＮ２Ａ１を欠く対照ヘテロ二量体タンパク質、又はヒトＩｇＧ対照とインキュベートした。結合を、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃドメインに結合するＡＰＣコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体を使用するフローサイトメトリによって検出した。図８Ａに示されるように、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に特異的に結合した。対照的に、ＣＤ１９ｓｃＦｖを欠く対照ヘテロ二量体タンパク質又はヒトＩｇＧ対照は、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合しなかった。
別の実験では、Ｖγ９＋Ｖδ１＋Ｔ細胞を単離し、健康なドナー由来のＰＢＭＣから増殖させた。単離したＶγ９＋Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はヒトＩｇＧ対照とインキュベートした。結合を、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃドメインに結合するＡＰＣコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体を使用するフローサイトメトリによって検出した。図８Ｂに示すように、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質もヒトＩｇＧ対照もＶγ９＋Ｖδ１＋Ｔ細胞に結合しなかった。
更なる実験では、健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。単離したＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮ又はＢＴＮ３Ａ１／３Ａ２－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質と共にインキュベートした。結合をフローサイトメトリによって検出した。図８Ｃに示されるように、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、単離されたヒトＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合したが、ＢＴＮ３Ａ１／３Ａ２－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は結合しなかった。
更なる実験では、健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。図８Ｅ（挿入図）に示されるように、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、フローサイトメトリによって示されるように、非染色細胞と比較して、Ｖγ９δ２ ＴＣＲを発現するヒトγδ Ｔ細胞に結合した。漸増量のヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質又はＢＴＮ２Ａ１を欠くヘテロ二量体を、単離されたＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞とインキュベートし、結合をフローサイトメトリを使用して検出した。図８Ｅに示すように、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、４３ｎＭのＥＣ５０で、Ｖγ９δ２ ＴＣＲを発現するヒトγδ Ｔ細胞に対する用量依存的結合を示した。対照的に、ＢＴＮ２Ａ１を欠くヘテロ二量体は、Ｖγ９δ２ ＴＣＲを発現するＴ細胞に結合しなかった。
更に別の実験では、Ｖγ９－Ｔ細胞を単離し、健康なドナー由来のＰＢＭＣから増殖させた。単離したＶγ９－Ｔ細胞をヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮ又はＢＴＮ３Ａ１／３Ａ２－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質と共にインキュベートした。結合を、ヘテロ二量体タンパク質のＦｃドメインに結合するＡＰＣコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体を使用するフローサイトメトリによって検出した。図８Ｄに示すように、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質もＢＴＮ３Ａ１／３Ａ２－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質も、単離されたＶγ９－Ｔ細胞に結合しなかった。
これらの結果は、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質が用量依存的かつ飽和性の様式でＣＤ１９＋細胞に特異的に結合することを実証している。
実施例７：γδ細胞へのＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質による結合は二量体化を必要とする
次に、溶液中にモノマーとして存在するＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及びＳＩＲＰα－Ｈｉｓタンパク質によるＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞への結合を研究した。漸増量のＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓ及びＳＩＲＰα－Ｈｉｓタンパク質をＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に添加した。結合を、Ｈｉｓタグの検出に基づいてフローサイトメトリを使用して検出した。図９Ａに示すように、ＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓタンパク質は、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、ＳＩＲＰα－Ｈｉｓタンパク質は、用量依存的かつ飽和的に結合した細胞上のＣＤ４７に結合する。
この観察を更に調べるために、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ、ＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質、及びヒトＩｇＧ対照を使用した。ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ及びＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃタンパク質は、溶液中で二量体として存在する。Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞を、漸増量のＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ、ＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ、ヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質及びヒトＩｇＧ対照と共にインキュベートした。結合を、フローサイトメトリを使用して検出した。図９Ｂに示すように、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ及びヒトＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、用量依存的かつ飽和性の様式でＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合した。対照的に、ＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃタンパク質及びヒトＩｇＧ対照は、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合しなかった。これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１がＶγ９＋Ｖδ２Ｔ細胞受容体と相互作用するためにはホモ二量体化する必要があることを示唆している。
Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合したＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃタンパク質は溶液中に二量体として存在し、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞に結合しなかったＢＴＮ２Ａ１－Ｈｉｓタンパク質は溶液中に単量体として存在するので、これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１とのホモ二量体化又は例えばＢＴＮ３Ａ１とのヘテロ二量体化のいずれかであるＢＴＮ２Ａ１の二量体化が、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞への結合には必要であることを実証している。
実施例８：細胞株の開発及びＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮの産生
ヘテロ二量体化を促進するための電荷分極リンカー戦略をノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）突然変異と比較するために、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の３つのバージョン：電荷分極リンカー、Ｆｃドメイン中のＫＩＨ突然変異、ＫＩＨ突然変異及びＦｃＲｎ突然変異（図１９参照）を生成した。理論に拘束されるものではないが、ＫＩＨ突然変異及びＦｃＲｎ突然変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、新生児型Ｆｃ受容体への結合を増加させると考えられる。
２つのアプローチ、すなわち、アルファ鎖及びベータ鎖を別々に発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の同時トランスフェクション（図１０Ａ）、並びに単一ベクター中の２つの別々のプロモーターの下でアルファ鎖及びベータ鎖を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を使用したトランスフェクション（図１０Ｂ）を使用して製造可能性を評価するために、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体構築物について細胞株を構築した（Cell line development：ＣＬＤ）。
全てのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質分子に対するＣＬＤプロセスの間、アルファ鎖及びベータ鎖の発現をＭＳＤ ＥＬＩＳＡによってミニプールで評価し、プロセスの単一細胞クローニング段階に移行する可能性がある選択範囲を狭めて最上位のミニプールを選択可能にするために、ミニプールを順位付けした。２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の同時トランスフェクション又は二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を使用したトランスフェクションのいずれかによって産生された電荷分極リンカーを有するＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖（ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖（ＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）のミニプールを振盪フラスコ培養で増殖させた。ＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の発現を、１４日目にＭＳＤ－ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して分析した。タンパク質力価の比較を図１０Ｃに示す。ＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖ｍＲＮＡ及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖ｍＲＮＡの発現を、１４日目に定量ＲＴ－ＰＣＲを用いて分析した。図１０Ｄは、ＳＧＶ及びＤＧＶミニプールにおけるＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖ｍＲＮＡ及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖ｍＲＮＡの比較を示す。興味深いことに、二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）由来ミニプールは、ＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ鎖と比較して、より多くのＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ鎖を発現したが、ＳＧＶ由来ミニプールは、タンパク質及びＲＮＡレベルで比較的等量の２本の鎖を発現するようであった。
これらのデータは、２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）又は単一の二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）の両方を使用して、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質を含むＧＡＤＬＥＮタンパク質を産生することができることを示している。本明細書に示すように、２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の同時トランスフェクションは、実質的に等量の２本の鎖を産生した。単一の二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を使用して、例えばプロモーター強度及び／又はｍＲＮＡ安定性に関して、ＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ鎖の発現を更に最適化することができる。
更に、電荷分極リンカーが他の二量体化モチーフ、例えばＫＩＨ突然変異を有するＦｃドメイン並びにＫＩＨ突然変異及びＦｃＲｎ突然変異を有する別のＦｃドメインで置き換えられたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質構築物は、二重遺伝子ベクターアプローチのみを使用して生成された。ＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の発現を、１４日目にＭＳＤ－ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して、ＦｃドメインにＫＩＨ突然変異を有する構築物（ＫＩＨ－Ｆｃ）及びＦｃＲｎ突然変異を有するＫＩＨ突然変異を有する構築物（ＫＩＨ－ＦｃＲｎ）について分析した。力価の比較を図１０Ｅに示す。図１０Ｅ及び図１０Ｃに示すように、電荷分極リンカーを有する構築物と比較して、ＦｃドメインにＫＩＨ変異を有する構築物（ＫＩＨ－Ｆｃ）及びＦｃＲｎ変異を有するＫＩＨ変異を有する構築物（ＫＩＨ－ＦｃＲｎ）ミニプールにおいて、ＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ発現の有意な減少が観察された。
ＦｃドメインにＫＩＨ突然変異を有する構築物（ＫＩＨ－Ｆｃ）及びＦｃＲｎ突然変異を有するＫＩＨ突然変異を有する構築物（ＫＩＨ－ＦｃＲｎ）からの上位１２のミニプールを振盪フラスコ段階まで移動させて、電荷分極リンカー法がＫＩＨ突然変異よりもヘテロ二量体化に適しているかどうかを評価する二本鎖の発現レベルを更に評価する。
実施例９：２つの単一遺伝子ベクター又は二重遺伝子ベクターでトランスフェクトした細胞を用いたＧＡＤＬＥＮタンパク質の産生
ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質の製造の２つのアプローチを更に研究した。
アルファ鎖及びベータ鎖を別々に発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の同時トランスフェクション（図１０Ａ）、並びに単一ベクター中の２つの別々のプロモーターの下でアルファ鎖及びベータ鎖を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を使用したトランスフェクション（図１０Ｂ）の両方のアプローチを使用して、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質を調製した。精製したタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）に供して、それらの純度を評価した。２つの単一遺伝子ベクターを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを図１５Ａに示す。二重遺伝子ベクターを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを図１５Ｂに示す。図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、同様のＳＥＣプロファイルは、ＳＧＶ又はＤＧＶフォーマットのいずれかから製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ構築物から得られた。これらの結果は、ＧＡＤＬＥＮヘテロ二量体がこれらの製造フォーマットのいずれか１つから製造され得ることを実証している。
ＳＧＶ又はＤＧＶ産生フォーマットを更に評価するために、ＳＧＶ又はＤＧＶ産生フォーマットのいずれかから産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質をウェスタンブロッティングによって分析して、精製材料中のＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ鎖の存在を確認した。
簡潔に述べると、還元剤の非存在下（非還元条件）、β－メルカプトエタノールの存在下（還元条件）、又はβ－メルカプトエタノールと脱グリコシル化剤の両方の存在下（還元－脱グリコシル化条件）での変性後に、精製タンパク質をウエスタンブロットによって分析した。ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質を、抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体を用いて検出した。ＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖモノマー及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖモノマーの同時検出を容易にするために、２つのＩＲＤｙｅを使用して蛍光コンジュゲートさせた赤外線（ＩＲ）二次抗体を使用したＢＴＮ２Ａ１－及びＢＴＮ３Ａ１－結合抗体を使用した。図１６に示すように、抗ＢＴＮ２Ａ１抗体によって認識されるタンパク質バンドは青色（三角矢印）で示され、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体によって認識されるタンパク質バンドは緑色（四角矢印）で示される。非還元条件下で調製されたタンパク質（レーン「ＮＲ」）は単一バンドをもたらし、これは抗ヒトＢＴＮ２Ａ１及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体の両方で検出することができた（図１６、左及び右パネル）。還元条件下で調製されたタンパク質（レーン「Ｒ」）は２つのバンドをもたらし、その各々は抗ヒトＢＴＮ２Ａ１及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体で検出することができた（図１６、左及び右パネル）。興味深いことに、還元及び脱グリコシル化の両方の下で調製されたタンパク質（条件レーン「Ｄ」）は単一のバンドをもたらし、これは抗ヒトＢＴＮ２Ａ１及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体の両方で検出することができた（図１６、左及び右パネル）。還元条件のレーンと還元及び脱グリコシル化条件の両方のレーンとの間の類似性に基づくと、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮ構築物には、グリコシル化がほとんどないようである。これらのデータは、還元条件レーンと還元条件及び脱グリコシル化条件の両方のレーンとの間の類似性に基づくと、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮがグリコシル化されることが更に示唆された。これらのデータは、ＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖがＢＴＮ３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖよりもグリコシル化されていることを更に示唆した。
これらの結果は、２つの単一遺伝子ベクター（図１６左パネル）又は二重遺伝子ベクター（図１６、右パネル）を使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質が、（β－メルカプトエタノールによる鎖間ジスルフィド結合の破壊後に）２つの個々のタンパク質に還元するジスルフィド結合二量体タンパク質であることを示している。これらの結果は、両方の製造フォーマットが、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１に対する特異的抗体を使用して検出されるように両方の鎖を含む材料を製造したことを実証している。
ＳＧＶ又はＤＧＶ産生フォーマットから産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮヘテロ二量体タンパク質を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）上に発現されたＣＤ１９への結合について試験した。簡潔に述べると、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＳＧＶ又はＤＧＶ産生フォーマットから産生された６．２５μｇ、１．５６μｇ、又は０μｇのＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮヘテロ二量体タンパク質、又は陰性対照として使用した６．２５μｇのヒトＩｇＧと共にインキュベートした。結合を、フローサイトメトリを使用して検出した。図１７に示すように、ＳＧＶ又はＤＧＶのいずれかから産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、Ｄａｕｄｉ細胞上のＣＤ１９並びにＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ参照材料に結合することができた。
これらの結果は、２つの単一遺伝子ベクター又は二重遺伝子ベクターアプローチを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質が、ＣＤ１９への結合において同等に活性であることを示している。
２つの単一遺伝子ベクター及び二重遺伝子ベクターアプローチを使用して製造されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質によるγδ Ｔ細胞の活性化を評価するために、インビトロアッセイを使用した。簡潔に述べると、プレートを、（１）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）及びＩｇＧ（陰性対照）、（２）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質（参照材料）、（３）ＳＧＶフォーマットを使用して調製した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ調製ヘテロ二量体タンパク質、並びに（４）ＤＧＶフォーマットを使用して調製した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質でコーティングした。１×１０５個のヒトγδ Ｔ細胞を、プレートに結合した薬剤による刺激のためにプレートに加え、１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）中、ゴルジ複合体へのタンパク質輸送の阻害剤の存在下、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、γδ Ｔ細胞を採取し、活性化γδ Ｔ細胞の脱顆粒マーカーである抗ＣＤ１０７ａで染色し、フローサイトメトリによって分析した。ＣＤ１０７ａを発現するＶγ９＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリによって決定した。図１８に示すように、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質の各調製物は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせて、ＣＤ１０７ａの発現によって証明されるようにγδ Ｔ細胞を刺激することができた。一方、ＩｇＧと抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせは、バックグラウンドレベルで活性化をもたらした（図１８）。
これらの結果は、ＳＧＶ又はＤＧＶ産生フォーマットのいずれかから産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質の両方が、γδ Ｔ細胞を脱顆粒する能力において同様に機能したことを示している。
まとめると、これらの結果は、ヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質が、アルファ鎖及びベータ鎖を別々に発現する２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）の同時トランスフェクション（図１０Ａ）、及び１つのベクター中の２つの別々のプロモーターの下でアルファ鎖及びベータ鎖を発現する二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を用いたトランスフェクション（図１０Ｂ）のいずれかを用いて産生され得ることを示している。
実施例１０：各鎖上にＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１タンデムを有するＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質
理論に束縛されるものではないが、２つのブチロフィリンタンパク質の四量体がＶγ９δ２ ＴＣＲとの相互作用に関与し得ると考えられる。したがって、各鎖上にＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１タンデムを有するＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質を構築した。図１１に示すように、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の可変ドメインがタンデムにつなぎ合わされ、ＩｇＧ４ Ｆｃ配列を介してＣＤ１９ｓｃＦｖ配列に融合される、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ融合タンパク質の新しいバージョンを作製した。２つのそのような鎖は、ホモ二量体化して、Ｖγ９δ２ ＴＣＲ活性化のためのＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の機能性四量体単位を形成するであろう（図１１）。
したがって、単一のポリペプチド鎖にタンデムに配置されたＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１タンパク質の可変（Ｖ）ドメインのみを含むホモ二量体ＧＡＤＬＥＮ構築物を使用することの実現可能性を評価した。ＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来Ｆｃリンカーのいずれかを含有する３つの異なるＧＡＤＬＥＮ構築物を作製し、精製した。精製タンパク質を非還元（還元剤を添加せずに変性）、還元（β－メルカプトエタノールの存在下で変性）条件下でウエスタンブロットによって分析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ブロットを抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体でプローブした。ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の両方は、図１２Ａ～１２Ｂにおいて青色（ＢＴＮ２Ａ１）又は緑色（ＢＴＮ３Ａ１）で示される２つのＩＲＤｙｅｓを使用して蛍光コンジュゲートされた赤外線（ＩＲ）二次抗体を使用してＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１結合抗体を検出することによって同時に検出された。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ＢＴＮ２Ａ１－及びＢＴＮ３Ａ１－結合抗体は、同一のバンドを同定した。非還元条件は、還元条件下で見られるモノマーの二量体と一致するバンドを生成した。
これらの結果は、（β－メルカプトエタノールによる鎖間ジスルフィド結合の破壊後に）単一モノマーに還元するジスルフィド結合二量体タンパク質の存在を示している。更に、ＩｇＧ１及び２つのバージョンのＩｇＧ４由来のＦｃのそれぞれは、同様のプロファイルを示した。
次に、ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮホモ二量体タンパク質による２つのリガンドへの同時期の結合を調べた。ＭＳＤに基づくＥＬＩＳＡ法を使用して、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の可変ドメインを含有するホモ二量体ＧＡＤＬＥＮ構築物が組換えＣＤ１９に結合することができるかどうかを評価した。手短に言えば、組換えＣＤ１９タンパク質をプレート上にコーティングし、プレートに結合したＣＤ１９タンパク質による捕捉のために、示されたＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮホモ二量体タンパク質の漸増量をプレートに添加した。結合を、抗ＢＴＮ３Ａ１抗体、続いてスルホ標識抗ウサギ二次抗体を使用して検出した。両方のタンパク質に結合することができないタンパク質を陰性対照として使用した。図１３に示すように、ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮホモ二量体タンパク質のそれぞれは、用量依存性シグナルを示した。一方、陰性対照はバックグラウンドシグナルのみを示した。
これらの結果は、ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１の可変ドメインを含むＧＡＤＬＥＮ構築物が組換えＣＤ１９タンパク質に結合することができ、同時にＢＴＮ３Ａ１リガンドに結合することができることを実証する。
インビトロアッセイを使用して、ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質によるγδ Ｔ細胞の活性化を研究した。簡潔に述べると、プレートを、（１）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）及びＩｇＧ、（２）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質、（３）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質、並びに（４）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質でコーティングした。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせたＩｇＧを陰性対照として使用した。１×１０５個のヒトγδ Ｔ細胞を、プレートに結合した薬剤による刺激のためにプレートに加え、１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）中、ゴルジ複合体へのタンパク質輸送の阻害剤の存在下、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、γδ Ｔ細胞を採取し、活性化γδ Ｔ細胞の脱顆粒マーカーである抗ＣＤ１０７ａで染色し、フローサイトメトリによって分析した。ＣＤ１０７ａを発現するＶγ９＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリによって決定した。図１４Ａに示すように、約１０％のγδ Ｔ細胞は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせて、ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖ又はＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質で刺激した場合、ＣＤ１０７ａの発現を示した。この活性化レベルは、ＩｇＧと抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との組み合わせによってもたらされるバックグラウンド活性化よりも大きかったが（図１４Ｂ）、このインビトロアッセイにおいてＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質によってもたらされる活性化の程度よりも低かった（図１４Ｂ）。
これらの結果は、ＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖ及びＢＴＮ２Ａ１Ｖ／３Ａ１Ｖ－ＩｇＧ１－ＣＤ１９ｓｃＦｖホモ二量体タンパク質の両方がγδ Ｔ細胞を活性化することができることを示している。
実施例１１：ヘテロ二量体化の促進及びホモ二量体化の阻害（Disfavoring）のための、電荷分極リンカー及びノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質の比較
ヘテロ二量体化を促進するための電荷分極リンカー戦略をノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異と比較するために、ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質の３つのバージョン：電荷分極リンカー（図１９、左のイラスト）、Ｆｃドメイン中のＫＩＨ変異、並びにＦｃドメイン中のＫＩＨ変異及びＦｃＲｎ変異（両方とも図１９、右のイラスト）を作製した。理論に拘束されるものではないが、ＫＩＨ突然変異及びＦｃＲｎ突然変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質は、新生児型Ｆｃ受容体への結合を増加させると考えられる。アルファ鎖とベータ鎖との間の会合を促進することによってヘテロ二量体化を促進し、ホモ二量体化を阻害するように、電荷分極リンカー（ＣＰＬ）及びＦｃドメイン中のＫＩＨ突然変異が設計された。ＫＩＨは、二重特異性抗体を生成するために首尾よく使用されている。例えば、Ｅｌｄｅｓｏｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ ａｎｄ ＩＬ１ＲＡＰ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂｉ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ １４：６０９－６２１（２０２１）を参照されたい。
電荷分極リンカー又はノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質を構築した。ミニプールは、電荷分極リンカー（ＣＰＬ）並びに個々のアルファ鎖及びベータ鎖におけるＫＩＨ突然変異のいずれかを組み込んだＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ構築物のアルファ鎖及びベータ鎖を発現するベクターをトランスフェクトすることによって作製した。各ミニプールにおける各鎖（ＢＴＮ２Ａ１－アルファ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ）の発現レベルを、組換えＣＤ１９タンパク質を使用してヘテロ二量体タンパク質を捕捉し、ＢＴＮ２Ａ１特異的抗体又はＢＴＮ３Ａ１特異的抗体のいずれかで検出するＥＬＩＳＡ法によって定量した。ミニプールの培養上清中のＢＴＮ２Ａ１－α及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の量を定量した。図２０に示すように、ＣＰＬアプローチを使用して生成されたミニプールは、培養上清中に等量のＢＴＮ２Ａ１－α及びＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖を産生した。一方、驚くべきことに、ＫＩＨミニプールは、培養上清中のＢＴＮ２Ａ１－アルファ鎖の産生量が少なく、ＢＴＮ３Ａ１－ベータ鎖の産生量が非常に少なかった。
電荷分極リンカー又はノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質も、ウェスタンブロッティングによって分析した。簡潔に述べると、精製されたタンパク質を、還元剤の非存在下（非還元条件）、β－メルカプトエタノールの存在下（還元条件）、又はβ－メルカプトエタノールと脱グリコシル化剤の両方の存在下（還元－脱グリコシル化条件）で変性に供し、ウエスタンブロットによって分析した。ＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質を、抗ヒトＢＴＮ２Ａ１抗体及び抗ヒトＢＴＮ３Ａ１抗体を用いて検出した。図２１Ａに示すように、電荷分極リンカー戦略を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質中の抗ＢＴＮ２Ａ１及び抗ＢＴＮ３Ａ１抗体によって認識されるタンパク質バンドは、同様のレベルのＢＴＮ３Ａ１含有鎖及びＢＴＮ２Ａ１含有鎖を示した。
一方、ＦｃドメインにＫＩＨ変異を用いて産生されたＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質（図２１Ｂ）、及びＫＩＨ変異及びＦｃＲｎ変異（図２１Ｃ）は、ＢＴＮ３Ａ１含有鎖の発現が少なく、ＢＴＮ２Ａ１含有鎖が増加した。これらのデータは、ＥＬＩＳＡデータ（図２１Ａ）及びｑＰＣＲデータ（図１０Ｃ、図１０Ｄ及び図１０Ｅ）と一致する。これは、電荷分極リンカー戦略がヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質の形成においてＫＩＨよりも優れていることを示唆している。
電荷分極リンカー又はノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＧＡＤＬＥＮタンパク質も、γδ Ｔ細胞の刺激のためのインビトロアッセイによって分析した。簡潔に述べると、プレートを（（１）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン＃１４９８１０）及びＩｇＧ（陰性対照）、（２）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質、（３）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）及びＦｃＲｎ変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質、並びに（４）電荷分極リンカーを有する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質でコーティングした。１×１０５個のヒトγδ Ｔ細胞を、プレートに結合した薬剤による刺激のためにプレートに加え、１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）中、ゴルジ複合体へのタンパク質輸送の阻害剤の存在下、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、γδ Ｔ細胞を採取し、活性化γδ Ｔ細胞の脱顆粒マーカーである抗ＴＮＦα、抗ＩＦＮγ又は抗ＣＤ１０７ａで染色し、フローサイトメトリによって分析した。細胞傷害性サイトカインＴＮＦα、ＩＦＮγ又は脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現するＶγ９＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリによって決定した。図２２Ａに示されるように、ＦｃＲｎ変異を伴う又は伴わないノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質は、より少ないγδ Ｔ細胞を誘導してＴＮＦαを発現させた。同様に、ＦｃＲｎ変異を伴うか又は伴わないノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質は、より少ないγδ Ｔ細胞を誘導してＩＦＮγを発現させた（図２２Ｂ）。同様に、ＦｃＲｎ変異を伴うか又は伴わないノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＢＴＮ２Ａ１／３Ａ１－Ｆｃ－ＣＤ１９ｓｃＦｖヘテロ二量体タンパク質は、より少ないγδ Ｔ細胞を誘導してＣＤ１０７ａを発現させた（図２２Ｃ）。
まとめると、これらの結果は、電荷分極リンカーの使用が、ＧＡＤＬＥＮを作製するためのヘテロ二量体形成により適していることを示している。これらのデータは、とりわけ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）Ｆｃ技術が、操作された非対称ＣＨ３ドメインを有する二重特異性抗体の設計において大きく進歩したが、ヘテロ二量体ＧＡＤＬＥＮタンパク質については機能しないようであるので、驚くべきものである。
参照による組込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、本技術が先行発明によってそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に編成のためのものであり、決して本開示を限定することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、全てのセクションに等しく適用可能であり得る。
均等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して開示されているが、更なる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明が関連する技術分野内の既知の又は慣習的な実施に含まれるような、及び添付の特許請求の範囲に記載された以下の本質的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、又は適合を網羅することを意図していることが理解されよう。
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に具体的に開示された特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (118)

  1. アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質であって、
    前記アルファ鎖は、
    （ａ）ＢＴＮ２Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、
    （ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、
    （ｃ）前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、
    を含み、
    前記ベータ鎖は、
    （ａ）ＢＴＮ３Ａ１タンパク質又はその断片を含む第１のドメインと、
    （ｂ）ＣＤ１９に特異的に結合する標的化ドメインを含む第２のドメインと、
    （ｃ）前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカーと、
    を含む、
    ヘテロ二量体タンパク質。
  2. 前記アルファ鎖及び前記ベータ鎖が自己会合して前記ヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  3. 前記アルファ鎖の前記第１のドメインがＢＴＮ２Ａ１タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項１又は請求項２に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  4. 前記アルファ鎖の前記第１のドメインが、配列番号３５又は配列番号７１のアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  5. 前記アルファ鎖の前記第１のドメインが、配列番号３５又は配列番号７１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  6. 前記ベータ鎖の前記第１のドメインがＢＴＮ３Ａ１タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  7. 前記ベータ鎖の前記第１のドメインが、配列番号１９又は配列番号７２のアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  8. 前記ベータ鎖の前記第１のドメインが、配列番号１９又は配列番号７２のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項７に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  9. 前記標的化ドメインが抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  10. 前記標的化ドメインが抗体様分子又はその抗原結合断片である、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  11. 前記抗体様分子が、単一ドメイン抗体、組換え重鎖単独抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖単独抗体（shark heavy-chain-only antibody：ＶＮＡＲ）、ミクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディ；トランスボディ；アンティカリン；アドネクチン；アフィリン；アフィマー、マイクロボディ；アプタマー；アルテラーゼ；プラスチック抗体；フィロマー；ストラドボディ；マキシボディ；エビボディ；フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオーマブ、トロイボディ；ペプボディ；ワクシボディ、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２から選択される、請求項１０に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  12. 前記リンカーが、（ａ）カルボキシ末端にあってもよい、ブチロフィリンファミリータンパク質に隣接した第１の電荷分極コアドメインと、（ｂ）カルボキシ末端にあってもよい、ブチロフィリンファミリータンパク質に隣接した第２の電荷分極コアドメインと、を含む、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  13. 前記リンカーが、前記第１の電荷分極コアドメイン及び前記第２の電荷分極コアドメイン上の正に帯電したアミノ酸残基と負に帯電したアミノ酸残基との間の静電相互作用によってヘテロ二量体を形成する、請求項１２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  14. 前記第１の電荷分極コアドメイン及び／又は前記第２の電荷分極コアドメインが、可撓性を有するアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、又は抗体配列から選択されてもよい、ポリペプチドリンカーを含む、請求項１２又は請求項１３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  15. 前記リンカーが合成リンカーであり、ＰＥＧであってもよい、請求項１２～請求項１４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  16. 前記リンカーが、ヒトＩｇＧ１であってもよいＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項１２～請求項１５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  17. 前記リンカーが、ヒトＩｇＧ４であってもよいＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項１２～請求項１６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  18. 前記第１の電荷分極コアドメイン及び／又は前記第２の電荷分極コアドメインが、前記電荷分極コアドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に正に帯電したアミノ酸残基及び／又は負に帯電したアミノ酸残基を有するペプチドを更に含む、請求項１２～請求項１７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  19. 前記正に帯電したアミノ酸残基が、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸のうちの１又は複数を含む、請求項１３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  20. 前記正に帯電したアミノ酸残基が、前記第１の電荷分極コアドメイン及び／又は前記第２の電荷分極コアドメイン中の正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチド中に存在する、請求項１３又は請求項１４に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  21. 正に帯電したアミノ酸残基を含む前記ペプチドが、ＹｎＸｎＹｎＸｎＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号１）、ＹＹｎＸＸｎＹＹｎＸＸｎＹＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号３）、及びＹｎＸｎＣＹｎＸｎＹｎ（式中、Ｘはアルギニン、ヒスチジン又はリジンなどの正に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号５）から選択される配列を含む、請求項２０に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  22. 前記正に帯電したアミノ酸残基を含むペプチドが、配列ＲＫＧＧＫＲ（配列番号１１）又はＧＳＧＳＲＫＧＧＫＲＧＳ（配列番号１２）を含む、請求項２０又は請求項２１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  23. 前記負に帯電したアミノ酸残基が、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される１又は複数のアミノ酸を含んでもよい、請求項１３～請求項２２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  24. 前記負に帯電したアミノ酸残基が、前記第１の電荷分極コアドメイン及び／又は前記第２の電荷分極コアドメイン中の負に帯電したアミノ酸残基を含むペプチド中に存在する、請求項１３～請求項２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  25. 負に帯電したアミノ酸残基を含む前記ペプチドが、ＹｎＺｎＹｎＺｎＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号２）、ＹＹｎＺＺｎＹＹｎＺＺｎＹＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号４）、及びＹｎＺｎＣＹｎＺｎＹｎ（式中、Ｚはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸であり、Ｙはセリン又はグリシンなどのスペーサーアミノ酸であり、各ｎは独立して０～４の整数である）（配列番号６）から選択される配列を含む、請求項２４に記載のヘテロ二量体タンパク質。
  26. 前記アルファ鎖及び／又はベータ鎖の前記第２のドメインが、配列番号２０～２３から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項２５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  27. 前記アルファ鎖及び／又はベータ鎖の前記第２のドメインが、配列番号２０～２３から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項２６に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  28. 前記アルファ鎖及び／又はベータ鎖のリンカーが、配列番号１５～１７、配列番号２８～３２及び配列番号５２～５５から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項１７又は請求項１９～請求項２７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  29. 前記アルファ鎖及び／又はベータ鎖のリンカーが、配列番号１５～１７、配列番号２８～３２及び配列番号５２～５５から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項２８に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  30. 前記アルファ鎖が、配列番号３７～３９から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  31. 前記アルファ鎖が、配列番号３７～３９から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３０に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  32. 前記ベータ鎖が、配列番号４０～４２から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～請求項３１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  33. 前記ベータ鎖が、配列番号４０～４２から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３２に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  34. （ａ）配列番号３７及び配列番号４０；
    （ｂ）配列番号３８及び配列番号４１；又は
    （ｃ）配列番号３９及び配列番号４２
    のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  35. 前記第１のドメイン及び／又は前記ヘテロ二量体タンパク質が、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞を調節するか、又は調節することができる（modulates or is capable of modulating）、請求項１～請求項３４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  36. 前記ガンマデルタＴ細胞がＶγ９δ２Ｔ細胞である、請求項３５に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  37. 前記のガンマデルタＴ細胞の調節がガンマデルタＴ細胞の活性化である、請求項３５に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  38. 前記ヘテロ二量体タンパク質が、ガンマデルタＴ細胞と腫瘍細胞との間にシナプスを形成することができ、及び／又は前記ヘテロ二量体タンパク質が、ガンマデルタＴ細胞を同時活性化すること及びガンマデルタＴ細胞に腫瘍細胞を標的とさせることが可能である、請求項１～請求項３７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体キメラタンパク質。
  39. 請求項１～請求項３８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物。
  40. 請求項１～請求項３８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む、発現ベクター。
  41. 哺乳類用発現ベクター（mammalian expression vector）である、請求項４０に記載の発現ベクター。
  42. ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、請求項４０又は請求項４１に記載の発現ベクター。
  43. 請求項４０～請求項４２のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  44. ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化の方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項３９に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  45. 有効量の請求項３９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、患者の免疫応答を調節する方法。
  46. 有効量の請求項３９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与し、それによりガンマデルタＴ細胞のインビボ増殖を引き起こすこと、及び／又は
    有効量の請求項３９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に由来する細胞と接触させ、それによりガンマデルタＴ細胞のエクスビボ増殖を引き起こすこと、
    を含む、ガンマデルタＴ細胞の増殖を刺激する方法。
  47. 前記対象のＴ細胞が前記第１のドメインによって活性化される、請求項４４～請求項４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記対象が腫瘍を有し、前記ガンマデルタＴ細胞が前記腫瘍の細胞を調節する、請求項４４～請求項４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. がんを治療する方法を必要とする対象に、有効量の請求項３９に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
  50. 前記がんがリンパ腫である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記がんが白血病である、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記がんが、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度の小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；又は慢性骨髄芽球性白血病である、請求項４９～請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記がんが、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん；骨がん；脳及び中枢神経系のがん；乳がん；腹膜がん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸直腸がん；結合組織がん；消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼のがん；頭頸部がん；胃がん（胃腸がんを含む）；神経膠芽腫；肝がん；肝細胞がん；上皮内新生物；腎又は腎臓がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がん）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔がん（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺がん；肉腫；皮膚がん；扁平上皮がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮又は子宮内膜のがん；泌尿器系のがん；外陰がん；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他のがん腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに脂肪腫症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常な血管増殖である、請求項４９に記載の方法。
  54. 前記がんが前立腺がんである、請求項４９又は請求項５３に記載の方法。
  55. 前記がんが上皮由来がんである、請求項４９、請求項５３、又は請求項５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記がんがヘテロ二量体タンパク質の第２のドメインの抗原性標的を発現することが既知である、請求項４９～請求項５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記がんが、ＭＨＣ Ｉ、ベータ２ミクログロブリン、及び抗原プロセシングに関連する輸送体（Transporter associated with antigen processing：ＴＡＰ）における変異から選択されてもよい、アルファベータＴ細胞による認識を制限する変異を有する、請求項４９～請求項５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記対象に、エクスビボで増殖させた自己ガンマデルタＴ細胞又は同種ガンマデルタＴ細胞が更に投与される、請求項４９～請求項５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記自己ガンマデルタＴ細胞又は同種ガンマデルタＴ細胞がキメラ抗原受容体を発現する、請求項５８に記載の方法。
  60. 請求項１～請求項３４のいずれか一項に記載のホモ二量体キメラタンパク質を２つ含む四量体キメラタンパク質であって、前記四量体が、ホモ二量体化してＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１を含む四量体単位を形成する２つのタンパク質鎖を含む、四量体キメラタンパク質。
  61. 配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項６０に記載の四量体キメラタンパク質。
  62. 配列番号４３、４４及び５６～７０から選択されるアミノ酸配列と約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい、図１１に示される四量体キメラタンパク質。
  63. Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般構造を有するキメラタンパク質であって、
    式中、
    （ａ）は、（ａ１）－ＳＬ－（ａ２）の一般構造を含む第１のドメインであり、
    （ａ１）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、
    （ａ２）は、ブチロフィリンファミリータンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片であり、
    ＳＬは、約４～約５０アミノ酸長の可撓性を有する（flexible）アミノ酸配列を含む、（ａ１）及び（ａ２）に隣接する第２のリンカーであり、
    （ｃ）は、（ｉ）抗体、抗体様分子又はその抗原結合断片、及び（ｉｉ）膜タンパク質の細胞外ドメインから選択される標的化ドメインを含む第２のドメインであり、
    （ｂ）は、前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接し、ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステイン残基を含む、リンカーである、
    キメラタンパク質。
  64. 前記（ａ１）及び（ａ２）が、同じブチロフィリンファミリーの２つのタンパク質である、請求項６３に記載のキメラタンパク質。
  65. 前記（ａ１）及び（ａ２）が異なるブチロフィリンファミリーのタンパク質である、請求項６３に記載のキメラタンパク質。
  66. 前記（ａ１）及び／又は（ａ２）が、可変ドメインを含むブチロフィリンファミリータンパク質の断片である、請求項６３～請求項６５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  67. 前記（ａ１）及び（ａ２）が、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ２Ａ２、ＢＴＮ２Ａ３、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ１０、及びＳＫＩＮＴＬから独立して選択されるブチロフィリンファミリータンパク質を含む、請求項６３～請求項６６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  68. 前記ブチロフィリンファミリータンパク質が、ヒトＢＴＮ１Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトＢＴＮ２Ａ２、ヒトＢＴＮ２Ａ３、ヒトＢＴＮ３Ａ１、ヒトＢＴＮ３Ａ２、ヒトＢＴＮ３Ａ３、ヒトＢＴＮＬ２、ヒトＢＴＮＬ３、ヒトＢＴＮＬ８、ヒトＢＴＮＬ９、ヒトＢＴＮＬ１０、及びヒトＳＫＩＮＴＬから独立して選択される、請求項６７に記載のキメラタンパク質。
  69. 前記第１のドメインが、
    （ａ１）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３と９０％以上、又は９５％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列；及び
    （ａ２）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３と９０％以上、又は９５％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    を有するポリペプチドを含む、請求項６３～請求項６６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  70. 前記第１のドメインが、
    （ａ１）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３のいずれか１つ；及び
    （ａ２）配列番号１９、３５～３６、４５、７１～７２、８０～９３のいずれか１つ
    のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項６９に記載のキメラタンパク質。
  71. 前記第１のドメインが、
    （ｉ）ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８；
    （ｉｉ）ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１；
    （ｉｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ２；又は
    （ｉｖ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３
    の細胞外ドメインを含む、請求項６３～請求項７０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  72. 前記第１のドメインが、
    （ｉ）ＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８；
    （ｉｉ）ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１；
    （ｉｉｉ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ２；又は
    （ｉｖ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３
    の可変ドメインを含む、請求項６３～請求項６８のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  73. 前記第２のリンカーが、一般式Ｇ（Ｇ３Ｓ）ｍ又はＧＧＧＳｎのアミノ酸配列を含み、ｍ及びｎが１～１６の範囲内の整数である、請求項６３～請求項７２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  74. 前記標的化ドメインが、がん細胞の表面上の抗原に結合することができる、請求項６３～請求項７３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  75. 前記標的化ドメインが、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１９又はＰＳＭＡから選択される膜タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項６３～請求項７４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  76. 前記標的化ドメインが抗体又はその抗原結合断片である、請求項６３～請求項７４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  77. 前記結合断片がＦｖドメインを含む、請求項７６に記載のキメラタンパク質。
  78. 前記標的化ドメインが、抗体様分子又はその抗原結合断片である、請求項６３～請求項７４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  79. 前記結合断片がｓｃＦｖドメインを含む、請求項７８に記載のキメラタンパク質。
  80. 前記標的化ドメインが、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３０７、ｇｐＡ３３、メソテリン、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３／Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、ＮＹ－ｅｓｏ－１、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＳＬＮ、ＣＬＤＮ１８．２、Ｔｒｏｐ－２、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＤ２、ＣＤ２７６／Ｂ７－Ｈ３、ＤＬＬ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＨＥＲ２、Ａ３３、ＴＡＧ７２、５Ｔ４、ＣＡ９、ＣＤ７０、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＥｐＣａｍ、ＭＵＣ１７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒ、ＣＰＣ３、ＧＰＣ３、ＦＡＰ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１７１、ＳＳＴＲ２、ＦＯＬＲ１、ＭＵＣ１６、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１、ＣＤ４４、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＣＤ１／ＰＤ１、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＬｅＹ、ＣＤ１３３、ＣＥＬＥＣ１２Ａ／ＣＬＬ１、ＦＬＴ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＦＣＲＨ５、ＳＬＡＭＦ７／ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＰＲＡＭＥ、ＥＧＦＲ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１７４／ＦＵＴ３／ＬｅＹ、Ｌ１ＣＡＭ／ＣＤ１７１、ＣＤ２２、ＣＤ５、ＬＧＲ５、ＬＧＲ５、ＣＬＬ－１、及びＧＤ３のうちの１つに特異的に結合する、請求項７６～請求項７９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  81. 前記標的化ドメインがＣＤ１９に特異的に結合する、請求項８０に記載のキメラタンパク質。
  82. 前記標的化ドメインがＰＳＭＡに特異的に結合する、請求項８０に記載のキメラタンパク質。
  83. 前記標的化ドメインがＣＤ３３に特異的に結合する、請求項８０に記載のキメラタンパク質。
  84. 前記標的化ドメインがＣＬＬ－１に特異的に結合する、請求項８０に記載のキメラタンパク質。
  85. 前記標的化ドメインが、配列番号２０～２７及び９４～１２６から選択されるポリペプチドと９０％以上、又は９５％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項８０に記載のキメラタンパク質。
  86. 前記リンカーがヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項６３～請求項８５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  87. 前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１であってもよいＩｇＧ１に由来する、請求項８６に記載のキメラタンパク質。
  88. 前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４であってもよいＩｇＧ４に由来する、請求項８６に記載のキメラタンパク質。
  89. 前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、配列番号１６～１７、２８～３２及び５２～５５から選択されるポリペプチドと９０％以上、又は９５％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項８６に記載のキメラタンパク質。
  90. 前記第１のドメイン及び／又は前記キメラタンパク質が、γδ（ガンマデルタ）Ｔ細胞を調節するか、又は調節することができる、請求項６３～請求項８９のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  91. 前記ガンマデルタＴ細胞がＶγ４又はＶγ９δ２を発現する、請求項９０に記載のキメラタンパク質。
  92. 前記第１のドメインがＢＴＮＬ３及びＢＴＮＬ８を含み、Ｖγ４発現Ｔ細胞を調節する、請求項９０又は請求項９１に記載のキメラタンパク質。
  93. 前記第１のドメインがＶγ９δ２発現Ｔ細胞を調節する、請求項９０又は請求項９１に記載のキメラタンパク質。
  94. 前記第１のドメインが、
    （ａ）ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１、
    （ｂ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ２、又は
    （ｃ）ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮＡ３
    を含む、請求項９０、請求項９１及び請求項９３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  95. 前記のガンマデルタＴ細胞の調節がガンマデルタＴ細胞の活性化である、請求項９０～請求項９４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  96. 前記キメラタンパク質が、ガンマデルタＴ細胞と腫瘍細胞との間にシナプスを形成することができ、並びに／あるいは前記キメラタンパク質が、ガンマデルタＴ細胞を同時活性化すること及びガンマデルタＴ細胞に腫瘍細胞を標的とさせることが可能である、請求項６３～請求項９５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  97. ホモ二量体である、請求項６３～請求項９６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
  98. 請求項６３～請求項９７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質を含む医薬組成物。
  99. 請求項６３～請求項９７のいずれか一項に記載のキメラタンパク質の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む発現ベクター。
  100. 哺乳類用発現ベクターである、請求項９９に記載の発現ベクター。
  101. ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、請求項９９又は請求項１００に記載の発現ベクター。
  102. 請求項９９～請求項１０１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  103. ガンマデルタＴ細胞の同時活性化及び腫瘍細胞への標的化の方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項９８に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  104. 有効量の請求項９８に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、患者の免疫応答を調節する方法。
  105. 有効量の請求項９８に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与し、それによりガンマデルタＴ細胞のインビボ増殖を引き起こすこと、及び／又は
    有効量の請求項９８に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に由来する細胞と接触させ、それによりガンマデルタＴ細胞のエクスビボ増殖を引き起こすこと、
    を含む、ガンマデルタＴ細胞の増殖を刺激する方法。
  106. 前記対象のＴ細胞が前記第１のドメインによって活性化される、請求項１０３～請求項１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記対象が腫瘍を有し、前記ガンマデルタＴ細胞が前記腫瘍の細胞を調節する、請求項１０３～請求項１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. がんを治療する方法を必要とする対象に、有効量の請求項９８に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
  109. 前記がんがリンパ腫である、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記がんが白血病である、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記がんが、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度の小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；又は慢性骨髄芽球性白血病である、請求項１０８～請求項１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記がんが、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん；骨がん；脳及び中枢神経系のがん；乳がん；腹膜がん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸直腸がん；結合組織がん；消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼のがん；頭頸部がん；胃がん（胃腸がんを含む）；神経膠芽腫；肝がん；肝細胞がん；上皮内新生物；腎又は腎臓のがん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がん）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔がん（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺がん；肉腫；皮膚がん；扁平上皮がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮又は子宮内膜のがん；泌尿器系のがん；外陰がん；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；毛状細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに他のがん腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに脂肪腫症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常な血管増殖である、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記がんが前立腺がんである、請求項１０８又は請求項１１２記載の方法。
  114. 前記がんが上皮由来がんである、請求項１０８、請求項１１２、又は請求項１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記がんが前記キメラタンパク質の前記第２のドメインの抗原性標的を発現することが既知である、請求項１０８～請求項１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記がんが、ＭＨＣ Ｉ、ベータ２ミクログロブリン、及び抗原プロセシングに関連する輸送体（ＴＡＰ）における変異から選択されてもよい、アルファベータＴ細胞による認識を制限する変異を有する、請求項１０８～請求項１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記対象に、エクスビボで増殖させた自己ガンマデルタＴ細胞又は同種ガンマデルタＴ細胞が更に投与される、請求項１０８～請求項１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記自己ガンマデルタＴ細胞又は同種ガンマデルタＴ細胞がキメラ抗原受容体を発現する、請求項１１７に記載の方法。
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