JP2023546561A - ウイルスタンパク質および宿主タンパク質の分解のためのキメラコンジュゲートならびに使用方法 - Google Patents

ウイルスタンパク質および宿主タンパク質の分解のためのキメラコンジュゲートならびに使用方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、必須ウイルスタンパク質またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質を標的とし、それを分解するキメラについて記載する。具体的には、本出願のキメラは、標的タンパク質（例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、メインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）、もしくは他の非構造タンパク質（例えば、ＮＳＰ９もしくはＮＳＰ１２）、または宿主タンパク質、例えば、ブロモドメイン２、ブロモドメイン３、もしくはブロモドメイン４））に結合する部分を、タンパク質分解薬を動員する部分と組み合わせ、それによって、標的タンパク質を分解させる。一部の場合では、キメラは、タンパク質分解薬としてＨＤＭ２に係合することによって、それ自体が抗ウイルス活性を有するｐ５３を同時に誘導する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／０９１，７６９号に基づく優先権の利益を主張し、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本明細書は、コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表のコピーとともに提出されている。ＣＲＦは、００５３０－０４０９ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２０２１年１０月１４日に作成され、サイズが２５，１３２バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、ウイルスタンパク質、例えば、必須ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、メインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）、他の非構造タンパク質（例えば、ＮＳＰ９もしくはＮＳＰ１２）、またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質、例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質（例えば、ブロモドメイン２、ブロモドメイン３、もしくはブロモドメイン４）の分解を標的とするキメラコンジュゲート、すなわち、タンパク質分解標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）に関する。本開示はまた、ウイルス感染症、特に、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置および予防において、そのようなキメラコンジュゲートを使用する方法にも関する。また、ウイルスの成熟および複製を阻害するために、ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、メインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）、ならびに他の非構造ウイルスタンパク質（例えば、ＮＳＰ９またはＮＳＰ１２）を阻害するペプチドも開示される。これらのペプチドは、ウイルス感染症（例えば、コロナウイルス感染症）を処置するために使用することができる。
背景
ＰＬｐｒｏおよびＭｐｒｏは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスを含むＲＮＡウイルスの生活環における必須酵素である。ＰＬｐｒｏは、ウイルス複製に必要とされる、ウイルスおよび細胞基質におけるペプチドおよびイソペプチド結合を加水分解することによってウイルスポリタンパク質および宿主細胞タンパク質をプロセシングする多官能性システインプロテアーゼである（Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， Ｙ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８， １２５１１－２７ （２０１４））。Ｍｐｒｏは、ウイルスの生活環に必須である成熟タンパク質（ＮＳＰ５－１６）を生じる自己プロセシングタンパク質分解反応において主要な役割を果たす、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主なタンパク質分解プロセシング酵素である（Ｃｈａｎｇ， Ｇ．Ｇ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， １１５－１２８ （２００９）。コロナウイルス非構造タンパク質、例えば、ＮＳＰ９およびＮＳＰ１２は、ウイルス複製に関与する必須タンパク質である。ＰＬｐｒｏおよびＭｐｒｏのプロテアーゼ活性を阻害し、他のウイルスＮＳＰを阻害する、いくつかの化合物が、開発されている（例えば、Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ． ２０１４， Ｊｉｎ Ｚ Ｎａｔｕｒｅ ２０２０、Ａｎａｎｄ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００， １７６３－７ （２００３）、Ｇｈｏｓｈ， Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５２， ５２２８－４０ （２００９）、Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， Ｙ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ １１５， ２１－３８ （２０１５）を参照されたい）。しかしながら、これらの阻害剤は、十分に強力ではなく、したがって、部分的な阻害しか達成されない。ウイルス、例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とし、宿主系がＣＯＶＩＤ－１９などの感染症を撃退するのを可能にする、効率的な治療薬を開発することが急務である。
Ａｎａｎｄ，Ｋ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３００、１７６３～７ Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００９）５２、５２２８～４０ Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ，Ｙ．Ｍ．，ら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ（２０１５）１１５、２１～３８
要旨
本開示は、ウイルスタンパク質またはウイルス病原性に関与する宿主タンパク質の分解を標的とするキメラコンジュゲート（「キメラ」）、すなわち、タンパク質分解標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）の特徴付けおよび使用に関する。一部の場合では、これらのウイルスタンパク質は、ウイルスの複製、感染性、または病原性に必須のタンパク質である。そのようなキメラは、任意のＲＮＡウイルスの必須ウイルスタンパク質を分解し、それによって、そのようなＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染症を処置することができる。具体的には、本開示のキメラは、必須コロナウイルスタンパク質、例えば、パパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、メインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）、または別の非構造タンパク質（例えば、ＮＳＰ９およびＮＳＰ１２）を分解するために使用することができる。本開示のキメラはまた、ウイルス病原性に関与する宿主タンパク質、特に、ブロモドメイン２、ブロモドメイン３、およびブロモドメイン４（それぞれ、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４）の分解も標的化され得る。例えば、本開示は、図７および１４Ａに示される分子のそれぞれを包含する。
本開示はまた、ウイルス感染症、特に、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）の処置において、そのようなキメラを使用する方法についても記載する。本開示のキメラは、ウイルスタンパク質または宿主タンパク質を標的とする部分（例えば、ペプチド、ステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、小分子、ウォーヘッド（ｗａｒｈｅａｄ）で誘導体化された小分子、またはヌクレオチドアナログ）を、タンパク質分解を誘導する部分（例えば、タンパク質分解薬（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄｅｒ）に結合するか、もしくはそれを動員する、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子）と組み合わせる。したがって、そのようなキメラは、目的とされる任意のウイルスタンパク質（例えば、コロナウイルスＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ、ＮＳＰ９、ＮＳＰ１２など）またはウイルス病原性に関与する任意の宿主タンパク質（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４など）を標的とするために使用することができる、二官能性ステープルペプチド－小分子コンジュゲート、ペプチド－小分子コンジュゲート、ステープルペプチド－ペプチドコンジュゲート、ペプチド－ステープルペプチドコンジュゲート、ステープルペプチド－ステープルペプチドコンジュゲート、ペプチド－ペプチドコンジュゲート、小分子－ステープルペプチドコンジュゲート、および小分子－小分子コンジュゲートなどであり得る。
本開示は、目的とされるウイルスタンパク質（例えば、コロナウイルスＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ、ＮＳＰ９、ＮＳＰ１２など）またはウイルス病原性に関与する任意の宿主タンパク質（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４など）の分解だけでなく、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸと複合体を形成していないｐ５３タンパク質の量の増加も行うための、組成物および方法を提供する。これにより、ｐ５３に媒介される、ウイルス複製および／または病原性の抑制が可能となる。したがって、本組成物は、抗ウイルス（例えば、抗ＳＡＲＳ）活性の相加的または相乗的増加を提供する。
ウイルスタンパク質、例えば、ＭｐｒｏおよびＮＳＰ９に結合し、それを阻害することができる、ペプチドも開示される。
第１の態様では、本開示は、第２の部分に結合している第１の部分を含み、第１の部分および第２の部分が、互いに直接的に結合しているか、またはリンカーを介して互いに結合している、キメラを特徴とする。第１の部分は、分解について標的化される第１のタンパク質に結合する。一部の場合では、第１のタンパク質は、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルス非構造タンパク質（ＮＳＰ）、またはブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質から選択される。第２の部分は、第２のタンパク質に結合し、第２のタンパク質は、「タンパク質分解薬」であるか、またはそれを動員する。一部の場合では、第２のタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼである。
別の態様では、本開示は、直接的またはリンカーを介して第２の部分に結合している、ウイルスタンパク質（Ｍｐｒｏ、ＰＬｐｒｏ、ＮＳＰ９、ＮＳＰ１２）または宿主タンパク質（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、もしくはＢＲＤ４）に結合するための手段を含むキメラに関する。第２の部分は、第２のタンパク質に結合し、第２のタンパク質は、「タンパク質分解薬」であるか、またはそれを動員する。一部の場合では、第２のタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼである。
別の態様では、本開示は、直接的にまたはリンカーを介して、Ｅ３リガーゼに結合する手段（例えば、ＨＤＭ２、ＶＨＬ、セレブロン、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ、ＣＯＰ１）に結合している、分解について標的化される第１のタンパク質（例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルス非構造タンパク質（ＮＳＰ）、またはブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質）に結合する第１の部分を提供する。
一部の場合では、第１の部分および第２の部分は、リンカーを介して互いに結合している。例えば、リンカーは、ペプチドリンカー、化学リンカー、グリシン－セリンリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２６）もしくは（Ｇ４Ｓ）５（配列番号２７）、ベータ－アラニン（Ｚ）リンカー、ベータ－アラニンおよびアラニン（ＺＡ）リンカー、またはポリエチレングリコールリンカーであり得る。
ある特定の場合では、第１の部分は、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含む。
一部の場合では、コロナウイルスプロテアーゼは、パパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、またはメインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）であり、コロナウイルスＮＳＰは、ＮＳＰ９またはＮＳＰ１２であり、ＢＥＴタンパク質は、ブロモドメイン２（ＢＲＤ２）、ブロモドメイン３（ＢＲＤ３）、またはブロモドメイン４（ＢＲＤ４）である。
１つの場合では、コロナウイルスプロテアーゼは、ＰＬｐｒｏであり、第１の部分は、ＰＬｐｒｏに結合する。ＰＬｐｒｏに結合する第１の部分は、ＰＬｐｒｏ阻害剤であり得る。一部の場合では、ＰＬｐｒｏ阻害剤は、ＧＲＬ－０６１７もしくはそのＰＬｐｒｏ結合性アナログ、ジスルフィラム、またはＰＬｐｒｏ結合性チオプリンアナログである。
ある特定の場合では、コロナウイルスプロテアーゼは、Ｍｐｒｏであり、第１の部分は、Ｍｐｒｏに結合する。一部の場合では、Ｍｐｒｏ阻害剤は、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、ＡＳＣ０９、ＡＳＣ０９Ｆ、ＧＣ３７６、ＧＣ８１３、エブセレンカルボン酸、またはペプチドである。ある特定の場合では、ペプチドは、配列番号２または配列番号３に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドは、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する。ある特定の場合では、ペプチドは、１～５個のアミノ酸置換を除いて、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、ペプチドは、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがＭｐｒｏに結合し、それを阻害する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
一部の場合では、ＢＥＴタンパク質は、ＢＲＤ４であり、第１の部分は、ＢＥＴタンパク質に結合する。一部の場合では、ＢＥＴタンパク質に結合する第１の部分は、ＢＥＴタンパク質阻害剤である。ある特定の場合では、ＢＥＴタンパク質阻害剤は、ＪＱ１、ＡＢＢＶ－０７５、Ｉ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７２６、ＯＴＸ０１５、もしくはＰＦＩ－１、またはＢＲＤ４、ＢＲＤ３、および／もしくはＢＲＤ２に結合するそれらのアナログである。
一部の場合では、コロナウイルスＮＳＰは、ＮＳＰ９であり、第１の部分は、ＮＳＰ９に結合する。一部の場合では、ＮＳＰ９に結合する第１の部分は、ＮＳＰ９阻害剤である。ある特定の場合では、第１の部分は、配列番号４または配列番号５に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、ペプチドは、ＮＳＰ９に結合する。ある特定の場合では、ペプチドは、１～５個のアミノ酸置換を除いて、配列番号４または配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み、ペプチドは、ＮＳＰ９に結合する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがＮＳＰ９に結合する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
ある特定の場合では、コロナウイルスＮＳＰは、ＮＳＰ１２であり、第１の部分は、ＮＳＰ１２に結合する。一部の場合では、ＮＳＰ１２に結合する第１の部分は、ＮＳＰ１２阻害剤である。ある特定の場合では、第１の部分は、レムデシビル酸もしくはＮＳＰ１２に結合するそのアナログ、またはソホスブビル酸もしくはＮＳＰ１２に結合するそのアナログである。
一部の場合では、第２のタンパク質は、ヒト二重微小染色体（ｈｕｍａｎ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ）２（ＨＤＭ２）、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）、セレブロン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、細胞アポトーシス阻害タンパク質（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｃＩＡＰ）、または構成的光形態形成（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）１（ＣＯＰ１）である。一部の場合では、第２の部分は、タンパク質分解薬に結合するか、またはそれを動員する、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子を含む。一部の場合では、第２の部分は、小分子であるセレブロン結合性部分を含む。一部の場合では、小分子は、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、およびセレブロンに結合するそれらのアナログからなる群より選択される。一部の場合では、第２の部分は、サリドマイド部分を含む。１つの場合では、サリドマイド部分は、以下に提供される構造：
Figure 2023546561000002
 またはそのセレブロン結合性アナログ
を含む。
一部の場合では、サリドマイド部分は、以下に提供される構造：
Figure 2023546561000003
 またはそのセレブロン結合性アナログ
を含む。
ある特定の場合では、サリドマイド部分は、以下に提供される構造：
Figure 2023546561000004
 またはそのセレブロン結合性アナログ
を含む。
一部の場合では、第２の部分は、必要に応じてＶＨ ０３２およびそのＶＨＬ結合性アナログからなる群より選択される、ＶＨＬ結合性部分を含む。ある特定の場合では、ＶＨＬ結合性部分は、以下の構造：
Figure 2023546561000005
 またはそのＶＨＬ結合性アナログ
を含む。
一部の場合では、ＶＨＬ結合性部分は、以下の構造：
Figure 2023546561000006
 またはそのＶＨＬ結合性アナログ
を含む。
一部の場合では、第２の部分は、ＨＤＭ２結合性部分を含む。ある特定の場合では、ＨＤＭ２結合性部分は、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合する、ｐ５３のトランス活性化ドメインのペプチド、またはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチドを含む。一部の場合では、ＨＤＭ２結合性部分は、ＡＴＳＰ－７０４１、ＳＰ６４５、またはそのＨＤＭ２結合性バリアントであるステープルペプチドである。
ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱ＃（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号７）を含み、ここで、（Ｒ８）は、（Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニンであり、＃は、シクロブチルアラニンであり、（Ｓ５）は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン、またはそのＨＤＭ２結合性バリアントである。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸が置換されていない、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの１つまたは複数が、保存的アミノ酸と置換されている、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を除いて、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがＨＤＭ２に結合する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱＬ（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号１）を含み、ここで、（Ｒ８）は、（Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニンであり、＃は、シクロブチルアラニンであり、（Ｓ５）は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン、またはそのＨＤＭ２結合性バリアントである。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸が置換されていない、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの１つまたは複数が、保存的アミノ酸と置換されている、アミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を除いて、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ステープルペプチドは、ＨＤＭ２に結合する。置換は、保存的アミノ酸とのものであり得る。一部の場合では、ペプチドがＨＤＭ２に結合する限り、置換は、非保存的アミノ酸とのものであってもよい。
一部の場合では、ＨＤＭ２結合性部分は、ヌトリン－３ａまたはそのＨＤＭ２結合性アナログである。一部の場合では、ＨＤＭ２結合性部分は、以下の構造：
Figure 2023546561000007
 を含む。
ある特定の場合では、第２の部分は、Ａ４１００９９．１またはそのＸＩＡＰ結合性アナログであるＸＩＡＰ結合性部分を含む。一部の場合では、ＸＩＡＰ結合性部分は、以下の構造：
Figure 2023546561000008
 を含む。
ある特定の場合では、第２の部分は、ＳＭ－１２９５、ＳＭ－１２８０、またはそのｃＩＡＰ結合性アナログであるｃＩＡＰ結合性部分を含む。
一部の場合では、第２の部分は、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドであって、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるペプチドを含む。ペプチドは、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含む。改変バージョンは、天然結合コンセンサス配列内に、少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む。ある特定の場合では、ＷＤ４０リピートタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＨＤＭ２またはＶＨＬの基質アダプターである。一部の場合では、天然結合コンセンサス配列、配列番号１４もしくは１５、またはそのバリアント、バリアントが、１～６個のアミノ酸の位置においてコンセンサス配列とは異なる。
ある特定の場合では、第２の部分は、ＣＯＰ１結合性部分を含む。一部の場合では、ＣＯＰ１結合性部分は、トリブルズシュードキナーゼ（Ｔｒｉｂｂｌｅｓ Ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）１（Ｔｒｉｂ１）ペプチドまたはそのＣＯＰ１結合性バリアントであるペプチドである。一部の場合では、ペプチドは、配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号６）、または配列番号６に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
一部の場合では、タンパク質分解薬は、第１のタンパク質の分解を促進する。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、第１のタンパク質のユビキチン化および分解を促進する。
別の態様では、本開示は、図７または図１４Ａに示される分子のうちのいずれか１つの構造を有する分子を含むキメラに関する。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示されるペプチドまたはキメラと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。一部の場合では、医薬組成物は、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内投与のために製剤化される。
さらに別の態様では、本開示は、コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。
別の態様では、本開示は、コロナウイルスのウイルス複製の遮断およびそのウイルス感染性の低減の両方を、それを必要とする対象において行うための方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。一部の場合では、コロナウイルスは、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
別の態様では、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製の遮断を、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。
別の態様では、本開示は、ＲＮＡウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法を特徴とする。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、キメラ、または医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の場合では、上述の方法は、対象に、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン－ベータ、およびイカチバントからなる群より選択される１つまたは複数の薬剤を投与するステップをさらに含み得る。
一部の場合では、対象は、ヒト、霊長類、コウモリ、トリ、マウス、シチメンチョウ、ウシ、ブタ、ネコ、およびイヌからなる群より選択される。１つの場合では、対象は、ヒトである。
別の態様では、本開示は、配列番号２もしくは３に記載のアミノ酸配列、またはそのバリアント（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、もしくは７個のアミノ酸置換もしくは欠失により配列番号２もしくは３とは異なるペプチド）を含むペプチドであって、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する、ペプチドを提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を含み、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドであって、少なくとも２個のアミノ酸置換により、３個または６個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、ペプチドが、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する、安定化ペプチドを特徴とする。アミノ酸置換により、３個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられる場合、非天然アミノ酸は、いずれも、Ｓ５である。アミノ酸置換により、６個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられる場合、非天然アミノ酸は、それぞれ、Ｒ８［（Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニン］およびＳ５［（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン］、またはＲ５［（Ｒ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン］およびＳ８［（Ｓ）－２－（７’－オクテニル）アラニン］である。
一部の場合では、ペプチドまたは安定化ペプチドは、５０個未満、４０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、または２１個未満のアミノ酸の長さである。
別の態様では、本開示は、配列番号４もしくは５に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを含むペプチドであって、ＮＳＰ９に結合する、ペプチドを特徴とする。一部の場合では、ペプチドは、ＮＳＰ９の二量体化を阻害する。
別の態様では、本開示は、配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を含み、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドであって、少なくとも２個のアミノ酸置換により、３個または６個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、ペプチドが、ＮＳＰ９に結合する、安定化ペプチドを提供する。一部の場合では、安定化ペプチドは、ＮＳＰ９の二量体化を阻害する。
一部の場合では、ペプチドまたは安定化ペプチドは、５０個未満、４０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、または２１個未満のアミノ酸の長さである。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示されるペプチドまたは安定化ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
さらに別の態様では、本開示は、コロナウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、本明細書において開示されるペプチド、安定化ペプチド、または医薬組成物を投与するステップを含む。一部の場合では、対象は、ヒト対象である。一部の場合では、対象は、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、またはウシである。
本開示はまた、ＭｐｒｏまたはＮＳＰ９を阻害するための手段と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も特徴とする。
特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載するものと同様のまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書において記載する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本出願がコントロールすることになる。材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
疑いがあればそれを回避するために、「一部の実施形態では」、「ある特定の実施形態では」、「ある特定の場合では」、「一部の場合では」、「さらなる実施形態では」、「一実施形態では」、および「さらなる実施形態では」などの表現は、本明細書に記載される実施形態のいずれも、それらの実施形態の特徴のそれぞれを組み合わせることを念頭に読み取られるように、ならびに本開示が、それらの実施形態の特徴の組合せが一実施形態において詳細に説明されているのと同じように取り扱われる必要があるように、使用および意図されることが強調される。同じことが、添付の特許請求の範囲および実施例において例証されている実施形態および特徴の任意の組合せにも当てはまり、これらはまた、説明において開示される対応する実施形態からの特徴と組み合わされることも意図されており、一貫性および簡潔さのみを目的として、実施形態は、従属性によって特徴づけられているが、実際に、（多重）従属性に起因して結び付けることができるそれぞれの実施形態および特徴の組合せは、文字通り開示されていると認識されるものであり、さまざまな選択肢の中から選ばれたものとして解釈されるものではない。この文脈において、当業者であれば、実施例において開示されている実施形態および特徴が、そこで例証されているものと同じ機能を有する均等物に一般化されるよう意図することを、認識するであろう。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、ＰＬｐｒｏおよびＨＤＭ２に指向されるステープルペプチド－タンパク質分解標的化キメラ（ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ）が、ＰＬｐｒｏタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２必須プロテアーゼ）を分解し、宿主細胞におけるｐ５３レベルを増加させる機序を示す、概略図である。ＨＤＭ２結合性ステープルペプチドは、ｐ５３を、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ－ｐ５３複合体から変位させ、それによって、遊離ｐ５３のレベルを増加させ（上向きの矢印によって示される）、一方で、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのＰＬｐｒｏ結合性部分は、ＰＬｐｒｏに結合し、それをＥ３ユビキチンリガーゼであるＨＤＭ２に近接させ、これによって、ＰＬｐｒｏのユビキチン化および最終的な分解が生じる（下向きの矢印によって示される）。Ｕｂ：ユビキチン、Ｈｄｍ２：ヒト二重微小染色体２、ｐ５３：腫瘍タンパク質ｐ５３、ＰＬｐｒｏ：パパイン様プロテアーゼ、Ｅ２：ユビキチン結合酵素。
図２の上部パネルは、さまざまな種類のステープルペプチドを生成するために使用する、例示的な非天然アミノ酸の化学構造を示す。図２の中央パネルは、ペプチドヘリックスの長さに沿って異なる距離にまたがるさまざまな長さのステープル（ｉ，ｉ＋３、ｉ，ｉ＋４、およびｉ，ｉ＋７）を用いたステープルペプチドの生成を示す。図２の下部パネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォーク（ｓｔａｐｌｅ ｗａｌｋ）がどのように達成されるかを示す。
図３は、さまざまな種類の二重および三重ステープル化戦略を、ステープルペプチドを生成するための例示的なステープルウォークとともに示す。
図４は、ステッチペプチドを生成するための例示的なステープルウォークを示す。
図５は、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのペプチドリガンド成分が、変異誘発、差示的ステープルまたはステッチ挿入、および置換、欠失、付加、または誘導体化によるペプチド配列の変異によって最適化され得るさまざまな方法を示す。
図６は、ステープルペプチド（この場合では、ｉ，ｉ＋７ステープルペプチド）を生成するために利用することができる例示的な閉環メタセシス（ＲＣＭ）ステープル化反応を示す。
図７は、必須ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質（ＰＬｐｒｏ）、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に結合する宿主タンパク質（ＢＲＤ４および／またはＢＲＤ２）を標的とするようにデザインされた２つのステープルペプチドキメラの構造を示す：ＢＲＤ４（ＪＱ１／ＳＰ６４５ ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ、上部）およびＰＬｐｒｏ（ＧＲＬ０６１７／ＳＰ６４５ ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ、下部）。ステープルペプチド（ＳＰ６４５（ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱＬ（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号１））は、Ｅ３リガーゼであるＨＤＭ２に結合し、それを動員するために組み込まれ、小分子（ＪＱ１またはＧＲＬ０６１７）は、標的タンパク質（それぞれ、ＢＲＤ４またはＰＬｐｒｏ）に結合するために含まれる。可変の長さおよび組成のリンカーは、タンパク質標的の最適な係合を確実にするために、キメラの２つの結合性成分の間に導入される。
図８Ａは、さまざまなＨＤＭ２結合性ステープルｐ５３ペプチド（ＳＡＨ－ｐ５３－１～４、それぞれ、配列番号４０～４３）のα－ヘリックス安定化のレベルを、野生型ｐ５３１４－２９（配列番号１１）と比較して示す。図８Ｂは、ＨＤＭ２に対するさまざまなステープルｐ５３ペプチド（ＳＡＨ－ｐ５３－１～４、配列番号４０～４３）の親和性を、野生型ｐ５３１４－２９（配列番号１１）と比較して示す。
図９Ａは、抗ＨＩＶ治療薬エンフビルチド、単一ステープル化エンフビルチド、および二重ステープル化エンフビルチドの時間に対する崩壊のプロットを表し、プロテアーゼ耐性をペプチドに付与するステープルの能力を強調表示する。図９Ｂは、さまざまな分子およびキメラについて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価される複合体の形成を決定するトレースを示す。ＢＲＤ４に指向されるＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ＋ＨＤＭ２（第５のトレース）は、複合体の形成を誘導したが、一方で、ＨＤＭ２単独（上部のトレース）、ＢＲＤ４単独（第２のトレース）、ＨＤＭ２＋ＢＲＤ４（第３のトレース）、ＨＤＭ２＋ＢＲＤ４＋ＳＰ６４５＋ＪＱ１（第４のトレース）は誘導しなかった。
図１０Ａは、ビヒクルで処置したＨｅＬａ細胞（上の段）とは異なり、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４で処置した細胞は、サイトゾルから（拡散染色）からＢＲＤ４が実験的に係留している核ラミナへのＨＤＭ２の再局在化を呈する（下の段）ことを示す画像である。図１０Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイによって決定される、ビヒクルまたはＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＰＬｐｒｏの存在下におけるＰＬｐｒｏタンパク質およびユビキチン化ＰＬｐｒｏタンパク質のレベルのウエスタンブロットの画像である。
図１１Ａは、さまざまな濃度のＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４に曝露したＳＪＳＡ－１細胞におけるＢＲＤ４およびｐ５３レベルのウエスタンブロットの画像である。アクチン抗体が、ローディング対照として使用されている。図１１Ｂは、選択的プロテアソーム阻害剤カルフィルゾミブの存在下でさまざまな濃度のＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４に曝露したＳＪＳＡ－１細胞におけるＢＲＤ４およびｐ５３レベルのウエスタンブロットの画像である。アクチン抗体が、ローディング対照として使用されている。
図１２Ａは、ＳＰ６４５単独で処置した細胞におけるＢＲＤタンパク質（ＢＲＤ２／３／４）およびｐ５３転写標的ＨＤＭ２のレベルを示す。図１２Ｂは、ＪＱ１単独で処置した細胞におけるＢＲＤタンパク質（ＢＲＤ２／３／４）およびｐ５３転写標的ＨＤＭ２のレベルを示す。図１２Ｃは、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４で処置した細胞におけるＢＲＤタンパク質（ＢＲＤ２／３／４）およびｐ５３転写標的ＨＤＭ２のレベルを示す。
図１３Ａは、ＳＰ６４５、ＪＱ１、またはＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４の存在下におけるＳＪＳＡ－１細胞の生存度パーセンテージ（％）を示す。データは、平均±ＳＥＭを表し、それぞれの群について対で＊ｐ＜０．０５である。図１３Ｂは、さまざまな濃度のＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＰＬｐｒｏ１の存在下におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ Ｅ６細胞のパーセンテージ（％）を示す。データは、平均±ＳＥＭを表し、最初の３つのバー対最後の２つのバーで＊ｐ＜０．０５である。
図１４Ａは、感染した宿主細胞のＭＤＭ２によるウイルスＮＳＰ９の標的化された分解を誘導するようにデザインされた、２つのＳＰ－ＰＲＯＴＡＣＳ、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－１（配列番号５４）およびＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－２（配列番号５５）の組成を示す。図１４Ｂは、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－１およびＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－２が、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイによって示されるように、ＭＤＭ２を動員して、ウイルス標的タンパク質ＵＳＰ９をユビキチン化することができることを示す。
詳細な説明
本開示は、タンパク質分解標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）、例えば、ステープルペプチドタンパク質分解標的化キメラ（ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ）を使用して、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルス病原性にとって重要な必須ウイルスタンパク質）を分解することができるという発見に基づく。一部の場合では、これらのＰＲＯＴＡＣは、宿主細胞においてｐ５３の上昇を同時に誘導して、ウイルス複製および病原性を妨げる。本開示は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを、ＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス）タンパク質標的に近接させ、分解を誘導する（例えば、治療目的で）分子を特徴とする。分解のためのウイルス標的は、任意のウイルスタンパク質（例えば、必須ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスプロテアーゼもしくは他の非構造タンパク質（ＮＳＰ））、またはウイルス病原性を促進する宿主タンパク質（例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質））であり得る。一部の場合では、ウイルスタンパク質は、コロナウイルスパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、またはメインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）であり、コロナウイルスＮＳＰは、ＮＳＰ９またはＮＳＰ１２である。ある特定の場合では、ＢＥＴタンパク質は、ブロモドメイン２（ＢＲＤ２）、ブロモドメイン３（ＢＲＤ３）、またはブロモドメイン４（ＢＲＤ４）である。他の場合では、宿主タンパク質は、Ｓｅｃ６１、小胞体膜タンパク質トランスロコンである。
本開示は、ウイルスタンパク質標的を標的とする（例えば、ウイルスタンパク質（例えば、必須ウイルスタンパク質）またはウイルス病原性を促進する宿主タンパク質に結合する）第１の部分を、「タンパク質分解薬」であるかまたはそれを動員するタンパク質に結合する第２の部分（例えば、リガンド）と組み合わせることによって、タンパク質分解を誘導する部分としての機能を果たすキメラを提供する。例えば、第２の部分は、標的のユビキチン化を触媒する酵素または複合体を動員し、このようにして分解の標的を標識し、それが、プロテアソームによって分解される。一部の場合では、「タンパク質分解薬」は、ウイルスタンパク質をユビキチン化し、そうしてそれを分解の標的とするＥ３リガーゼである。
第１の部分は、必須ウイルスタンパク質または宿主タンパク質に結合する、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチドもしくはステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含み得る。一部の場合では、第１の部分は、ＰＬｐｒｏ結合剤、例えば、ＧＲＬ－０６１７もしくはそのＰＬｐｒｏ結合性アナログ、ジスルフィラム、またはＰＬｐｒｏ結合性チオプリンアナログである。他の場合では、第１の部分は、Ｍｐｒｏ結合剤、例えば、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、ＡＳＣ０９、ＧＣ３７６、ＧＣ８１３、エブセレンカルボン酸、または配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドである。一部の場合では、第１の部分は、ＮＳＰ９結合剤、例えば、配列番号４または配列番号５に記載の配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドである。他の場合では、第１の部分は、ＮＳＰ１２結合剤、例えば、レムデシビル酸、ソホスブビル酸、またはこれらのアナログである。ある特定の場合では、第１の部分は、ＢＥＴタンパク質結合剤、例えば、ＪＱ１、ＡＢＢＶ－０７５、Ｉ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７２６、ＯＴＸ０１５、もしくはＰＦＩ－１、またはこれらのアナログである。他の場合では、第１の部分は、Ｓｅｃ６１タンパク質結合剤、例えば、ＰＳ３０６１またはそのアナログである。
第２の部分は、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するかもしくはそれを動員するリガンド（例えば、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子）、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドを含み得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ヒト二重微小染色体２（ＨＤＭ２）、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）、セレブロン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、細胞アポトーシス阻害タンパク質（ｃＩＡＰ）、または構成的光形態形成１（ＣＯＰ１）であり得る。ある特定の場合では、ＨＤＭ２結合性部分は、ＨＤＭ２および／もしくはＨＤＭＸに結合するｐ５３のトランス活性化ドメインのペプチドもしくはステープルペプチド、または小分子（例えば、ヌトリン－３ａもしくはヌトリン－３ａの誘導体、例えば、ＲＧ７１１２およびＲＧ７３８８（イダサヌトリン（Ｉｄａｓａｎｕｔｌｉｎ）））もしくはそのＨＤＭ２結合性アナログを含み得る。一部の場合では、セレブロン結合性部分は、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、またはそのセレブロン結合性アナログである。他の場合では、ＶＨＬ結合性部分は、ＶＨ ０３２またはそのＶＨＬ結合性アナログである。一部の場合では、ＸＩＡＰ結合性部分は、Ａ４１００９９．１またはそのＸＩＡＰ結合性アナログである。ある特定の場合では、ｃＩＡＰ結合性部分は、ＳＭ－１２９５もしくはＳＭ－１２８０、またはそのｃＩＡＰ結合性アナログである。他の場合では、ＣＯＰ１結合性部分は、トリブルズシュードキナーゼ１（Ｔｒｉｂ１ －ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｑ９６ＲＵ８）に由来する８～５０個のアミノ酸の配列のペプチドまたはステープルペプチドを含み得る。分解薬タンパク質に効果的に結合し、それを動員するペプチドまたは小分子を、必須ウイルスタンパク質またはウイルス病原性を補助する宿主タンパク質を標的とする小分子、ペプチド、またはヌクレオチドアナログと組み合わせることによって、この新規のクラスのデグロンキメラは、ウイルス感染症と闘う新規な化合物を提供する。一部の場合では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。本開示はまた、記載されるデグロンキメラを含む医薬組成物も提供する。さらに、本開示は、記載されるそのようなキメラおよび組成物を使用して、ウイルス感染症を処置し、ウイルス複製を遮断し、ウイルス感染性を低減させる、方法を提供する。ＰＬｐｒｏはまた、宿主免疫系を回避するウイルス機序にも関与するため、本開示のキメラの重要な利点は、それらが、ウイルス複製の遮断および免疫系が感染細胞を殺滅させる能力の回復の両方を行うように設計されていることである。
本開示に包含されるキメラの非限定的な例には、図７および１４Ａに示される分子のそれぞれが含まれる。
Ｉ．分解について標的化される第１のタンパク質
分解について標的化される第１のタンパク質は、ウイルス病原性において役割を果たす任意のタンパク質であり得る。一部の場合では、ウイルスタンパク質は、必須ウイルスタンパク質である。一部の場合では、分解について標的化されるタンパク質は、ウイルスのなんらかの活性を補助する宿主タンパク質である。
Ｉ．（ａ）必須ウイルスタンパク質
本開示のキメラにより標的化され得る必須ウイルスタンパク質には、ウイルスの複製および／または病原性、例えば、細胞へのウイルスの進入において役割を果たす任意のウイルスタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、ＲＮＡウイルス、例えば、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に由来するウイルスタンパク質である。例えば、ウイルスタンパク質は、ＮＳＰ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に由来するコロナウイルスプロテアーゼである。一部の実施形態では、コロナウイルスプロテアーゼは、ＰＬｐｒｏまたはＭｐｒｏである。一部の実施形態では、ＮＳＰは、ＮＳＰ９またはＮＳＰ１２である。他の実施形態では、必須ウイルスタンパク質は、ＲＮＡウイルス、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ジカウイルス、およびエンテロウイルスに由来するウイルスタンパク質である。
Ｉ．（ａ）（１）コロナウイルスプロテアーゼ
本明細書において記載するコロナウイルスプロテアーゼとしては、メインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）およびパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）が挙げられ、これらは、コロナウイルスゲノムＲＮＡの複製に必須であるレプリカーゼポリタンパク質をプロセシングするために必要である。これらのコロナウイルスプロテアーゼは、広範なタンパク質分解プロセシングによって、２つの翻訳されたウイルスポリタンパク質（ＰＰ１ＡおよびＰＰ１ＡＢ）を、協調された様式で個々の機能的構成要素に切断する（Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０２０， ９：１２９）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主なタンパク質分解プロセシング酵素として、Ｍｐｒｏは、ウイルスの生活環に必須である成熟タンパク質（ＮＳＰ５－１６）を生じる自己プロセシングタンパク質分解反応において主要な役割を果たす（Ｃｈａｎｇ， Ｇ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， １１５－１２８ （２００９））。ウイルス複製におけるＭｐｒｏ（３Ｃ様プロテアーゼ（３ＣＬｐｒｏ）としても知られる）の機能的重要性が、ヒトにおける緊密に関連する相同性の不在と組み合わさることにより、Ｍｐｒｏは、抗ウイルス薬の設計のための有望な標的となっている。
ＰＬｐｒｏは、ウイルスポリタンパク質およびウイルス複製に必要とされる宿主細胞タンパク質をプロセシングする多官能性システインプロテアーゼである（Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， Ｙ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８， １２５１１－２７ （２０１４））。ＰＬｐｒｏはまた、ｐ５３分解の促進（Ｍａ－Ｌａｕｅｒ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１３， Ｅ５１９２－２０１ （２０１６））および宿主免疫系の回避（脱ユビキチン化および脱ＩＳＧ化活性（Ｒａｔｉａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ １０， ｅ１００４１１３ （２０１４））のためのウイルス機序にも関与する。したがって、抗ウイルス薬でＰＬｐｒｏを標的とすることは、ウイルス複製を阻害することだけでなく、周囲の未感染細胞において細胞死を引き起こし得る感染細胞におけるシグナル伝達カスケードの調節不全を阻害することにおいても、利点を有し得る。
Ｉ．（ａ）（２）コロナウイルス非構造タンパク質
本明細書において記載するコロナウイルス非構造タンパク質（ＮＳＰ）は、本開示のキメラを使用して標的化され得る必須タンパク質である。これらの非構造タンパク質としては、コロナウイルスプロテアーゼ、ＮＳＰ９およびＮＳＰ１２が挙げられる。コロナウイルスの複製および転写は、レプリカーゼ遺伝子においてコードされる１５個または１６個のウイルスＮＳＰによって駆動され、それらのいずれも、本開示のキメラによって標的化され得る。これらのＮＳＰは、ＰＰ１ａおよびＰＰ１ａｂレプリカーゼポリタンパク質の翻訳時または翻訳後プロセシング中に産生される（ｔｅ Ｖｅｌｔｈｕｉｓ， Ａａｒｔｊａｎ ＪＷ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８，１ （２０１０）： ２０３－１４）。複数サブユニットのコロナウイルスＲＮＡ合成機構は、ＮＳＰの複合体である（Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒ， Ｒ．Ｎ．， Ｗａｒｄ， Ａ．Ｂ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０， ２３４２ （２０１９））。
ＮＳＰ９は、ウイルス複製複合体の必須タンパク質である。その活性はまた、タンパク質－タンパク質相互作用モチーフＧＸＸＸＧ（配列番号８）を含むパラレルアルファ－ヘリックスによって媒介されるその二量体化に依存する。ＮＳＰ１２は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性を有する、コロナウイルスＲＮＡ複製複合体の触媒サブユニットである。ＮＳＰ１２は、ウイルスＲＮＡ複製を遮断するすべてのウイルスポリメラーゼおよびヌクレオチドアナログに共通のアーキテクチャを有する。
Ｉ．（ａ）（３）ウイルス病原性を促進する宿主タンパク質
本開示のキメラにより標的化され得るタンパク質の別の例は、ウイルス病原性において役割を果たす宿主タンパク質であり得る。例えば、宿主タンパク質は、ヒトタンパク質、例えば、ブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質である。一部の実施形態では、ＢＥＴタンパク質は、ブロモドメイン２（ＢＲＤ２）またはブロモドメイン４（ＢＲＤ４）である。他の実施形態では、ＢＥＴタンパク質は、ブロモドメイン３（ＢＲＤ３）である。
ＩＩ．キメラの第１の部分
本開示のキメラの第１の部分は、分解について標的化されるタンパク質（例えば、コロナウイルスプロテアーゼ）に結合する。第１の部分は、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチドもしくはステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、第１の部分は、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスの複製または病原性に必要とされる必須ウイルスタンパク質）を標的とし得る。一部の場合では、第１の部分は、ウイルス病原性を補助する宿主タンパク質を標的とし得る。第１の部分は、分解について標的化されるタンパク質に結合することができるが、それ自体は、必ずしもなんらかの阻害作用またはアゴニスト作用を有するわけではない「分子グルー」として、完全にまたは部分的に作用し得る。
一部の実施形態では、第１の部分は、Ｍｐｒｏ結合剤、例えば、Ｍｐｒｏ阻害剤であるか、またはそれを含む。他の実施形態では、第１の部分は、ＰＬｐｒｏ結合剤、例えば、ＰＬｐｒｏ阻害剤であるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、第１の部分は、ＮＳＰ結合剤、例えば、ＮＳＰ阻害剤（例えば、ＮＳＰ９またはＮＳＰ１２阻害剤）であるか、またはそれを含む。他の実施形態では、第１の部分は、ＢＥＴ結合剤、例えば、ＢＲＤ阻害剤（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、またはＢＲＤ４阻害剤）であるか、またはそれを含む。
ＩＩ．（ａ）Ｍｐｒｏ結合剤
本開示によって包含されるＭｐｒｏ結合剤としては、Ｍｐｒｏと直接的に相互作用する薬剤、例えば、Ｍｐｒｏ阻害剤が挙げられる。Ｍｐｒｏ阻害剤は、Ｍｐｒｏ二量体化および／またはＭｐｒｏ酵素活性を阻害し得る。Ｍｐｒｏ阻害剤、例えば、Ｊｉｎ Ｚ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ２０２０ ５８２：２８９－２９３、Ｚｕｍｌａ Ａ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． ２０１６ （１０）：３２７、Ｌｉ Ｇ ａｎｄ Ｃｌｅｒｃｑ ＥＤ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．， Ｆｅｂ ２０２０、Ｇｈｏｓｈ Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０２０ １５（１１）： ９０７－９３２に記載されているものを、本開示において使用することができる。
一部の実施形態では、Ｍｐｒｏ結合剤は、ペプチド（例えば、組換えまたは合成により産生されたペプチド）である。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにＭｐｒｏと相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。Ｍｐｒｏの酵素活性は、アルファヘリックス配列ＴＶＮＶＬＡＷＬＹＡＡＶＩＮＧＤ（配列番号９）によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号９は、ペプチドをベースとした二量体化阻害剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、Ｍｐｒｏ結合剤ペプチドは、少なくとも６個（例えば、配列番号９の７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個の連続したアミノ酸）を含み得る。一部の場合では、Ｍｐｒｏ結合剤ペプチドは、例えば、配列番号９とは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入によって異なる、配列番号９のバリアントであってもよく、ここで、バリアントは、依然としてＭｐｒｏと二量体を形成することができる。
一部の実施形態では、Ｍｐｒｏ結合剤ペプチドは、例えば、配列番号２または３のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号２または３のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号２または３におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％の同一性、少なくとももしくは約８０％、少なくとも８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または１００％の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、Ｍｐｒｏに結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および／または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてＭｐｒｏに結合することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるＭｐｒｏ結合性ペプチドのうちのいずれかのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがＭｐｒｏに結合する限り、変動し得る。
ある特定の実施形態では、ペプチドは、それらが、１～４個（例えば、１個、２個、３個、４個）のアミノ酸置換を有することで配列番号２または３から変動しているという点で、配列番号２または３のペプチドとは異なる。例えば、「Ｘ」とラベル付けされた位置は、配列番号２または３において、以下のように置換され得る：ＡＴＸＮＶＬＸＷＬＹＸＡＶＩＸＧＤ（配列番号５１）。Ｘは、保存的アミノ酸残基であってもよく、または非保存的アミノ酸残基であってもよい。一部の場合では、それぞれのＸは、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である（例えば、Ｓ５）。
本明細書に記載するキメラにおいて利用することができる例示的なＭｐｒｏ結合剤は、以下に提供される構造を有する。
表１に示されるＭｐｒｏ結合剤またはそれらのＭｐｒｏ結合性アナログのいずれかを、本開示のキメラにおいて利用することができる。
ＩＩ．（ｂ）ＰＬｐｒｏ結合剤
本開示によって包含されるＰＬｐｒｏ結合剤としては、ＰＬｐｒｏと直接的に相互作用する薬剤、例えば、ＰＬｐｒｏ阻害剤が挙げられる。ＰＬｐｒｏ阻害剤は、ＰＬｐｒｏ酵素活性を阻害することができる。ＰＬｐｒｏ阻害剤、例えば、Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， Ｙ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８， １２５１１－２７ （２０１４）、Ｌｉ Ｇ ａｎｄ Ｃｌｅｒｃｑ ＥＤ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．， Ｆｅｂ ２０２０、Ｇｈｏｓｈ， Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５２， ５２２８－４０ （２００９）、Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， Ｙ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ １１５， ２１－３８ （２０１５）、Ｅｌｆｉｋｙ Ａ ａｎｄ Ｉｂｒａｈｉｍ ＮＳ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｆｅｂ １１， ２０２０、ａｒｔｉｃｌｅ／ｒｓ－１３８４９／ｖ１ ＤＯＩ： １０．２１２０３／ｒｓ．２．２３２８０／ｖ１、Ｌｉｎ ＭＨ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ２０１８；１５０：１５５－１６３に記載されるものを、本開示のキメラにおいて使用することができる。
本明細書に記載するキメラにおいて利用することができる例示的なＰＬｐｒｏ結合剤は、以下に提供される構造を有する。
表２に示されるＰＬｐｒｏ結合剤またはそれらのＰＬｐｒｏ結合性アナログのいずれかを、本開示のキメラにおいて利用することができる。
ＩＩ．（ｃ）ＮＳＰ９結合剤
本開示のＮＳＰ９結合剤は、ＮＳＰ９と直接的に相互作用することができる薬剤である。ＮＳＰ９結合剤は、ＮＳＰ９二量体化および／またはＮＳＰ９酵素活性を抑制する、ＮＳＰ９阻害剤であり得る。一部の実施形態では、ＮＳＰ９結合剤は、ペプチド（例えば、組換えまたは合成により産生されたペプチド）である。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにＮＳＰ９と相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。ＮＳＰ９の酵素活性は、アルファヘリックス配列ＮＬＮＲＧＭＶＬＧＳＬＡＡＴＶＲＬＱ（配列番号１０）によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号１０は、ペプチドをベースとした二量体化結合剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、ＮＳＰ９結合剤ペプチドは、少なくとも６個（例えば、配列番号１０の７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、または１８個の連続したアミノ酸）を含み得る。一部の場合では、ＮＳＰ９結合剤ペプチドは、バリアントペプチドが依然としてＮＳＰ９に結合する限り、配列番号１０において少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のアミノ酸置換または欠失を含み得る。一部の場合では、ＮＳＰ９結合剤ペプチドは、配列ＧＸＸＸＧ（配列番号８）を含み、ここで、それぞれのＸは、任意のアミノ酸であり得る。一部の場合では、Ｘは、任意の１つのＭ、ノルロイシン（Ｂ）、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｇ、またはＩである。
一部の実施形態では、ＮＳＰ９阻害剤ペプチドは、例えば、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号４または５のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号４または５におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとも８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または１００％の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、ＮＳＰ９に結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および／または欠失を含み得る。例えば、アミノ酸は、保存的であるかどうかにかかわらず、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含み得る。したがって、本明細書において開示される任意のＮＳＰ９結合性ペプチドのアミノ酸配列は、バリアントペプチドが依然としてＮＳＰ９に結合する限り、変動し得る。一部の場合では、配列番号４もしくは５のＮＳＰ９結合剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、配列のそれぞれの末端において、１個、２個、または３個のアミノ酸だけ短縮されていてもよい。他の場合では、配列番号４もしくは５のＮＳＰ９結合剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、ステープルを含まなくてもよく、１つのステープル（例えば、Ｒ８とＳ５との間に形成されるステープル）を含んでもよく、または二重ステープル化されていてもよい。
ＩＩ．（ｄ）ＮＳＰ１２結合剤
本開示のＮＳＰ１２結合剤は、ＮＳＰ１２と直接的に相互作用する薬剤を含む。ＮＳＰ１２結合剤は、ＮＳＰ１２酵素活性を抑制する、ＮＳＰ１２阻害剤であり得る。一部の実施形態では、ＮＳＰ１２阻害剤は、レムデシビルまたはソホスブビルアナログ（例えば、レムデシビル酸またはソホスブビルカルボン酸、またはその薬学的に許容される塩）である。
レムデシビルの構造は、以下の通りである。
Figure 2023546561000017
 ソホスブビルの構造は、以下の通りである。
Figure 2023546561000018
ＩＩ．（ｅ）ＢＥＴ結合剤
本開示のＢＥＴ結合剤には、ＢＥＴタンパク質、例えば、ブロモドメイン２（ＢＲＤ２）、ＢＲＤ３、および／またはＢＲＤ４と直接的に相互作用する薬剤が含まれる。ＢＥＴタンパク質結合剤は、ＢＥＴ酵素活性を抑制する、ＢＥＴタンパク質阻害剤であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載するキメラにおいて利用することができるＢＥＴ阻害剤は、以下に提供される構造を有する。
Figure 2023546561000019
Figure 2023546561000020
表３に示されるＢＥＴ阻害剤またはそれらのＢＥＴ阻害アナログのいずれかを、本開示のキメラにおいて利用することができる。
ＩＩＩ．キメラによって標的化される第２のタンパク質
本開示のキメラにより標的化される第２のタンパク質は、標的化される第１のタンパク質（例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスＮＳＰ、またはＢＥＴタンパク質）を分解するタンパク質分解薬であるか、またはそれを動員する。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解薬タンパク質、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例としては、ヒト二重微小染色体２（ＨＤＭ２）、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）、セレブロン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、細胞アポトーシス阻害タンパク質（ｃＩＡＰ）、または構成的光形態形成１（ＣＯＰ１）が挙げられる。
ＩＶ．キメラの第２の部分
本開示のキメラの第２の部分は、標的タンパク質（例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスＮＳＰ、またはＢＥＴタンパク質）を分解する「タンパク質分解薬」（例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼ）であるか、またはそれを動員する、タンパク質に結合する。一部の実施形態では、第２の部分は、標的のユビキチン化を触媒する酵素または複合体を動員し得る。「タンパク質分解薬」の例は、標的タンパク質をユビキチン化し、それによって、そのタンパク質を、プロテアソームによる分解の標的として標識する、Ｅ３リガーゼである。
第２の部分は、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子であり得る。一部の実施形態では、第２の部分は、セレブロン結合性部分、ＶＨＬ結合性部分、ＨＤＭ２結合性部分、ＸＩＡＰ結合性部分、ｃＩＡＰ結合性部分、またはＣＯＰ１結合性部分であるか、またはそれを含む。
ＩＶ．（ａ）セレブロン結合性部分
本開示のキメラの第２の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、セレブロン結合性部分であり得る。セレブロンに結合する小分子の非限定的な例としては、サリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、それらのアナログ、およびそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
セレブロンに結合することができる小分子は、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000021
Figure 2023546561000022
一実施形態では、セレブロンに結合する小分子は、以下に提供される構造を有するサリドマイドに基づいている。
Figure 2023546561000023
一部の実施形態では、セレブロン結合性部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている。一部の場合では、セレブロン部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＣ末端にコンジュゲートしている。ある特定の場合では、セレブロン部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端とＣ末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。
一部の場合では、セレブロンに結合する小分子（サリドマイド）は、第１のタンパク質を標的とする部分（例えば、ペプチド）のＮ末端にコンジュゲートしていてもよい。小分子（サリドマイド）が、ペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている場合、それは、以下に示す構造を有する。
Figure 2023546561000024
ある特定の場合では、小分子（サリドマイド）が、第１のタンパク質を標的とするペプチドのＣ末端にコンジュゲートしている場合、それは、以下に示す構造を有する。
Figure 2023546561000025
ある特定の場合では、セレブロン結合性部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端とＣ末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。
ＩＶ．（ｂ）ＶＨＬ結合性部分
本開示のキメラの第２の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、ＶＨＬ結合性部分であり得る。ＶＨＬに結合する小分子の非限定的な例としては、ＶＨ ０３２およびそのＶＨＬ結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
ＶＨＬに結合することができる小分子は、以下の構造を有する。
ＶＨ ０３２：
Figure 2023546561000026
一部の場合では、ＶＨＬ部分が、アミンにコンジュゲートしている場合、以下に示すカルボキシレートアナログが用いられる。
Figure 2023546561000027
一部の場合では、ＶＨＬ部分は、以下の構造（酸性残基へのカップリングに適合する）を含む。
Figure 2023546561000028
一部の実施形態では、ＶＨＬ結合性部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている。一部の場合では、ＶＨＬ部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＣ末端にコンジュゲートしている。ある特定の場合では、ＶＨＬ部分は、第１のタンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端とＣ末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。
ある特定の場合では、ＶＨＬ結合性部分は、以下に挙げられるペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド、またはそのＶＨＬ結合性バリアントである：
ＬＡＰＡＡＧＤＴＩＩＳＬＤＦ（配列番号１２）－Ｅ３リガーゼ：ＶＨＬ、
ＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号１３）－Ｅ３リガーゼ：ＶＨＬ。
バリアントは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸位置において（例えば、別のアミノ酸との置換、挿入、または欠失によって）配列番号１２または１３とは異なり得るが、ただし、それが依然としてＶＨＬに結合することを条件とする。
ＩＶ．（ｃ）ＨＤＭ２結合性部分
本開示のキメラの第２の部分は、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合するｐ５３のトランス活性化ドメインの小分子、ペプチドもしくはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチド（例えば、ステッチ化されている）であるか、またはそれを含む、ＨＤＭ２結合性部分であり得る。ＨＤＭ２に結合する小分子の非限定的な例としては、ヌトリン－３、ヌトリン－３ａ、ヌトリン－３ａ誘導体、例えば、ＲＧ７１１２およびＲＧ７３８８（イダサヌトリン）、ならびにそれらのＨＤＭ２結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
ヌトリン－３ａは、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000029
 ＲＧ７１１２は、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000030
 ＲＧ７３８８は、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000031
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２結合性部分は、当該技術分野において公知のｐ５３ペプチドまたはステープルｐ５３ペプチド（例えば、ｐ５３のトランス活性化ドメイン（ＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（配列番号１１）を含むペプチド）、ＨＤＭ２に結合するそのバリアント、またはそのステープル化バージョン）である。ある特定の場合では、ＨＤＭ２結合性部分は、ＨＤＭＸとＨＤＭ２との間の複合体に直接的に結合し、それを動員する、安定化またはステープルｐ５３ペプチドである。一部の実施形態では、ステープルｐ５３ペプチドは、ＨＤＭＸに結合することができ、ＨＤＭＸ／ＨＤＭ２複合体を動員することができる。ある特定の実施形態では、ステープルｐ５３ペプチドは、直接的または間接的に、ＨＤＭ２に結合するか、またはＨＤＭ２に結合するＨＤＭＸに結合する。
一部の場合では、本開示のＨＤＭ２結合性ステープルペプチドは、残基（Ｒ５）、（Ｒ８）、（Ｓ５）、および（Ｓ８）を有する。そのような配列（例えば、配列番号１、７、および４０～４７）において、「Ｒ」および「Ｓ」は、非天然アミノ酸の立体化学を指し、一方で「５」および「８」は、非天然アミノ酸のオレフィン側鎖における炭素残基の数を指す。したがって、「（Ｒ５）」は、（Ｒ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン［（Ｒ）－α－（４’－ペンテニル）アラニンとしても知られる］であり、「（Ｒ８）」は、（Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニン［（Ｒ）－α－（７’－オクテニル）アラニンとしても知られる］であり、「（Ｓ５）」は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン［（Ｓ）－α－（４’－ペンテニル）アラニンとしても知られる］であり、「（Ｓ８）」は、（Ｓ）－２－（７’－オクテニル）アラニン［（Ｓ）－α－（７’－オクテニル）アラニンとしても知られる］である。一部の場合では、配列番号１、７、および４０～４７は、（Ｒ８）が（Ｒ５）で置き換えられ、同時に、（Ｓ５）が（Ｓ８）で置き換えられるように、変動し得る。そのようなバリアントＨＤＭ２結合性ステープルペプチドは、本開示に包含される。配列番号１、７、および４０～４７のこれらのバリアントは、ＨＤＭ２に結合する能力を保持する。例えば、配列番号１のバリアント配列は、配列番号４９であり、配列番号７のバリアント配列は、配列番号５０である。
本開示のキメラにおいて使用され得るステープルｐ５３ペプチドの非限定的な例を、以下に列挙する。
ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱＬ（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号１）－ＳＰ６４５
ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱ＃（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号７）－ＡＴＳＰ－７０４１、＃はシクロブチルアラニンである
ＬＴＦ（Ｒ５）ＥＹＷＡＱＬ（Ｓ８）ＳＡＡ（配列番号４９）－ＳＰ６４５バリアント配列２
ＬＴＦ（Ｒ５）ＥＹＷＡＱ＃（Ｓ８）ＳＡＡ（配列番号５０）－ＡＴＳＰ－７０４１バリアント配列
ＬＳＱＥＴＦＳＤ（Ｒ８）ＷＫＬＬＰＥ（Ｓ５）（配列番号４０）－ＳＡＨ－ｐ５３－１
ＬＳＱＥ（Ｒ８）ＦＳＤＬＷＫ（Ｓ５）ＬＰＥＮ（配列番号４１）－ＳＡＨ－ｐ５３－２
ＬＳＱ（Ｒ８）ＴＦＳＤＬＷ（Ｓ５）ＬＬＰＥＮ（配列番号４２）－ＳＡＨ－ｐ５３－３
ＬＳＱＥＴＦ（Ｒ８）ＤＬＷＫＬＬ（Ｓ５）ＥＮ（配列番号４３）－ＳＡＨ－ｐ５３－４
ＬＳＱＥＴＦ（Ｒ８）ＮＬＷＫＬＬ（Ｓ５）ＱＮ（配列番号４４）－ＳＡＨ－ｐ５３－５
ＬＳＱＱＴＦ（Ｒ８）ＮＬＷＲＬＬ（Ｓ５）ＱＮ（配列番号４５）－ＳＡＨ－ｐ５３－６
ＱＳＱＱＴＦ（Ｒ８）ＮＬＷＫＬＬ（Ｓ５）ＱＮ（配列番号４６）－ＳＡＨ－ｐ５３－７
ＱＳＱＱＴＦ（Ｒ８）ＮＬＷＲＬＬ（Ｓ５）ＱＮ（配列番号４７）－ＳＡＨ－ｐ５３－８
ＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合し、本開示のキメラにおいて使用することができる、ステープルｐ５３ペプチドおよび他のペプチドの他の例としては、ＡＬＲＮ－６９２４、ならびに米国特許第１０，２０２，４３１号、同第９，６１７，３０９号、同第９，５５６，２２７号、同第９，５２７，８９６号、同第９，５１７，２５２号、同第９，５０５，８０４号、同第９，５０５，８０１号、同第９，４０８，８８５号、同第９，１７５，０４５号、同第９，１６３，３３０号、同第８，９２７，５００号、同第８，８８９，６３２号、同第８，５９２，３７７号、同第８，５８６，７０７号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４００１８３０２号、同第ＵＳ２０１５０２４６９４６号、同第２０１７０２１２１２５号、同第ＵＳ２０１８００３００９０号、同第２０１９００７６５０４号、国際特許出願第ＷＯ２００８１０６５０７号、同第ＷＯ２０１４０６５７６０号、および欧州特許出願第ＥＰ２９１２４６３号に提供されるステープルまたはステッチｐ５３ペプチドが挙げられるがこれらに限定されず、これらの文献のすべての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の場合では、依然としてＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合する配列番号１、７、４０～４７、および４９～５０のうちのいずれか１つのバリアントは、本開示によって包含される。これらのバリアントは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸位置において（例えば、異なるアミノ酸との置換、挿入、または欠失によって）配列番号１、７、４０～４７、および４９～５０のうちのいずれか１つとは異なり得、ここで、バリアントは、ＨＤＭ２に結合するその能力を保持する。１つの例では、配列番号１または７におけるトリプトファン（「Ｗ」）残基は、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン）によって置換され得る。ある特定の実施形態では、バリアントは、１～６個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個）のアミノ酸置換を有することで配列番号１または７から変動しているという点で、配列番号１または７のペプチドとは異なる。例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５”とラベル付けされている残基は、配列番号１または７において、以下のように置換され得る：Ｘ１ＴＦ（Ｒ８）Ｘ２ＹＸ３ＡＱＸ４ （Ｓ５）Ｘ５ＡＡ（配列番号４８）、ここで、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ５は、任意のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｗ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、ナフチルアラニン、Ｅ、Ｄ、Ｙ、シクロブチルアラニン、およびそれらの側鎖アナログ）であり、Ｘ３は、Ｗ、Ｆ、または３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、Ｘ４は、Ｌまたはロイシン模倣体（例えば、シクロブチルアラニン）である。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号１または７におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％の同一性、少なくとももしくは約８０％、少なくとも８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または１００％の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および／または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸペプチドのうちのいずれのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合する限り、変動し得る。
一部の場合では、ｐ５３のトランス活性化ドメイン（ＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（配列番号１１））、ＨＤＭ２に結合するバリアント、またはその安定化（例えば、ステープル化もしくはステッチ化）形態は、本開示のキメラにおいて使用することができる。一部の場合では、上記の配列の太字のＦ、Ｗ、およびＬは、置換されない。一部の場合では、上記の配列の太字のＦ、Ｗ、およびＬのうちの１つまたは複数は、保存的置換によってのみ置換される。ある特定の場合では、上記の配列の１つまたは複数のアスパラギン酸（Ｄ）は、アスパラギンで置換される。ある特定の場合では、上記の配列の１つまたは複数のグルタミン酸（Ｅ）は、グルタミンで置換される。一部の場合では、上記の配列のリシンは、アルギニンで置換される。一部の場合では、上記の配列の第１のロイシンは、グルタミンで置換される。一部の場合では、フェニルアラニンの後のセリンおよび／またはフェニルアラニンの前のスレオニンは、任意のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸、例えば、Ｒ８）によって置換される。一部の場合では、リシンの後のロイシンおよび／またはプロリンは、任意のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸、例えば、Ｓ５）によって置換される。一部の場合では、配列番号１１の第１、第２、第３、第４、および／または第５のＮ末端アミノ酸は、欠失していてもよい。一部の場合では、配列番号１１のＣ末端アミノ酸のうちの１個、２個、および／または３個は、欠失していてもよい。ある特定の場合では、配列番号１１の第１、第２、第３、第４、および／または第５のＮ末端アミノ酸、ならびにＣ末端アミノ酸のうちの１個、２個、および／または３個は、欠失していてもよい。これらの置換のうちの１つまたは複数の組合せが、本開示によって包含されることを理解されたい。一部の場合では、ペプチドまたは安定化ペプチドは、中性であるか、または正に荷電している。すべての場合で、ペプチドまたは安定化ペプチドは、ＨＤＭ２に結合する（例えば、ナノモル濃度の親和性で）。一部の場合では、ペプチドまたはステープルペプチドは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のアミノ酸の長さである。
ある特定の場合では、第２の部分のペプチドは、以下に列挙されるペプチドのうちの１つのアミノ酸配列またはそのＨＤＭ２結合性バリアント（バリエーションは、先行する段落に記載されるように行われ得る）、例えば、Ｃｈｏｎｇ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１０ Ａｐｒ ３０； ３９８（２）： ２００－２１３に記載されるものを有する：
ＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３８）－ｐ５３トランス活性化ドメイン配列、
ＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ（配列番号３９）－ＰＭＩ １２（ｄｕｏｄｅｃｉｍａｌ）ペプチド阻害剤。
本明細書に記載するキメラにおいて用いることができるｐ５３ペプチドの他の例は、国際公開第ＷＯ２０１７／１６５６１７号（図７）および同第ＷＯ２０１２／０６５１８１号（図１Ｃ）において開示されており、これらのすべての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる（特に、ステープル化されたおよびステープル化されていないｐ５３ペプチドの開示に関して）。
ステープルｐ５３ペプチドは、それらの構造安定性、ペプチド溶解度、細胞透過性、およびステープルｐ５３ペプチドが組み込まれる本明細書において開示されるキメラの関連する分解効力を強化するために、改変することができる。例えば、ｐ５３ペプチドは、α－ヘリックス含有量を増加させ、ＨＤＭ２に対する高い結合親和性を保持し、細胞取り込みを強化するなどのために、改変することができる。ｐ５３ペプチドにおける一部の残基は、適切な電荷を達成するために、置換することができる。例えば、ステープルｐ５３ペプチドにおけるアスパラギン酸およびグルタミン酸は、ペプチドの電荷を調節するために、すなわち、細胞浸透を強化するためにペプチドの電荷を負から中性または正へと変更するために、アスパラギンおよびグルタミンと置き換えられ得る。ｐ５３ペプチドにおけるある特定のアミノ酸残基はまた、核外輸送の回避（Ｌ１４Ｑ）および／または潜在的なユビキチン化の回避（Ｋ２４Ｒ）のために、変異され得る。
Ｆ１９、Ｗ２３、およびＬ２６は、ＨＤＭ２との相互作用に関して重要なヒトｐ５３残基である。Ｒａｊ， Ｎ． ａｎｄ Ａｔｔａｒｄｉ， Ｌ．Ｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ． ２０１７ Ｊａｎ； ７（１）： ａ０２６０４７。本開示のキメラにおいて使用することができるステープルｐ５３ペプチドには、ヒトｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６３７）のアミノ酸１４～２９に対応するトランス活性化ドメイン配列のすべてもしくは一部、またはそのバリアント（例えば、少なくとも必須の相互作用アミノ酸Ｆ１９、Ｗ２３、およびＬ２６）を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて測定した場合に、完全にまたは部分的に、ｐ５３のＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、またはＨＤＭＸおよびＨＤＭ２への結合を阻害する。ＨＤＭ２およびＨＤＭＸに係合するｐ５３トランス活性化ドメインのヒト野生型アミノ酸配列は、
ＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（配列番号１１）
を含み、
これは、全長ｐ５３のアミノ酸１４～２９に対応する。
ステープルｐ５３ペプチドのいずれかまたはすべてのアミノ酸は、必須の相互作用するアミノ酸（上記を参照されたい）を除いて、置換することができ、かつ／または必須の相互作用するアミノ酸（上記を参照されたい）のうちの１つもしくは複数は、１つもしくは複数の保存的置換で置換されてもよい。例えば、Ｃｏｆｆｉｌｌ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２０１６ ３０： ２８１－２９２およびＢａｅｋ ａｔ ｅｌ ＪＡＣＳ ２０１２ １３： １０３－６を参照されたい。一部の場合では、配列番号１１の第１、第２、第３、第４、および／または第５のＮ末端アミノ酸は、欠失していてもよい。一部の場合では、配列番号１１のＣ末端アミノ酸のうちの１個、２個、および／または３個は、欠失していてもよい。ある特定の場合では、配列番号１１の第１、第２、第３、第４、および／または第５のＮ末端アミノ酸、ならびにＣ末端アミノ酸のうちの１個、２個、および／または３個は、欠失していてもよい。
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型および／または完全に機能性の配列から（その活性を破壊することも、実質的に変化させることもなしに）変更することができる残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型および／または完全に機能性の配列から変化させた場合に、ポリペプチド活性の破壊または実質的な破壊をもたらす残基である。
「必須」アミノ酸残基という用語は、本明細書で使用される場合、必須アミノ酸の保存的置換を含む。一般に、「必須」アミノ酸残基は、アルファヘリックスの相互作用面において見出される。
本明細書において開示されるステープルｐ５３ペプチドに含めるのに好適な保存的置換は、以下で考察されており、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置き換えられる置換を含み得る。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。保存的アミノ酸置換の１つの例では、配列番号１１における必須アミノ酸フェニルアラニン（Ｆ１９）が、アラニンと置き換えられ得る。
ＩＶ．（ｄ）ＸＩＡＰ結合性部分
本開示のキメラの第２の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、ＸＩＡＰ結合性部分であり得る。ＸＩＡＰに結合する小分子の非限定的な例としては、Ａ４１００９９．１またはそのＸＩＡＰ結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。
ＸＩＡＰ結合性部分Ａ４１００９９．１は、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000032
ＩＶ．（ｅ）ｃＩＡＰ結合性部分
本開示のキメラの第２の部分は、小分子であるか、またはそれを含む、ｃＩＡＰ結合性部分であり得る。ｃＩＡＰに結合する小分子の非限定的な例としては、ＳＭ－１２９５もしくはＳＭ－１２８０、またはそのｃＩＡＰ結合性アナログが挙げられるが、これらに限定されない。ｃＩＡＰ結合性部分ＳＭ－１２９５は、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000033
 ｃＩＡＰ結合性部分ＳＭ－１２８０は、以下の構造を有する。
Figure 2023546561000034
ＩＶ．（ｆ）ＣＯＰ１結合性部分
本開示のキメラの第２の部分は、ペプチドまたはステープルペプチドであるか、またはそれを含む、ＣＯＰ１結合性部分であり得る。ＣＯＰ１に結合するペプチドの非限定的な例としては、以下の配列を有するトリブルズシュードキナーゼ１（Ｔｒｉｂ１）ペプチドが挙げられるが、これに限定されない：ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号６）またはそのバリアント。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号６におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％の同一性、少なくとももしくは約８０％、少なくとも８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または１００％の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、ＣＯＰ１に結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および／または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、０個、１個、２個、３個、４個、５個、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてＣＯＰ１に結合することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるＣＯＰ１結合性ペプチドのうちのいずれのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがＣＯＰ１に結合する限り、変動し得る。
ＩＶ．（ｇ）基質アダプター結合性ペプチド
本開示のキメラの第２の部分は、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるタンパク質に結合するペプチドであり得る。一部の場合では、ペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ－４０タンパク質に結合する。ペプチドは、浅い溝にあるＥ３ユビキチンリガーゼの基質認識ドメインに結合し、Ｎ－またはＣ末端のいずれかにおける同化（すなわち、ステープルペプチド配列のコンジュゲート）に対して耐性がある。Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する例示的な基質アダプターとしては、ＨＤＭ２およびＶＨＬが挙げられる。
ある特定の場合では、第２の部分のペプチドは、トリブルズシュードキナーゼ１（Ｔｒｉｂ１）タンパク質配列：ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号６）またはそのバリアントに基づく。
ある特定の場合では、第２の部分のペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列に基づいている。一部の場合では、第２の部分のペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列のバリアント（例えば、置換、欠失、または挿入バリアント）である。Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列の非限定的な例を以下に示す。
Figure 2023546561000035
†モチーフパターンは以下の命名法を使用する：「．」は任意のアミノ酸タイプを指定し、「［Ｘ］」はその位置において許可されるアミノ酸タイプ（複数可）を指定し、パターンの最初における「＾Ｘ」は、配列がアミノ酸タイプＸで開始することを指定し、「［＾Ｘ］」は、その位置がタイプＸ以外のアミノ酸を有することができることを示し、次のように指定される数「Ｘ｛ｘ，ｙ｝」のｘおよびｙは、その位置において必要な「Ｘ」アミノ酸タイプの最小および最大数を指定する。翻訳後に改変（例えば、リン酸化およびプロリンヒドロキシル化）されることが公知である第１級デグロン内の保存残基の位置を太字で示す。
Ｖ．第２の部分のペプチド
本明細書に記載するキメラは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合性ペプチド（例えば、配列番号１、６、７、１２、１３、３８～４７、および４９～５０）を、第２の部分として含み得る。第２の部分のペプチドは、安定化またはステープルペプチドであり得る。当該技術分野において公知の任意の他のペプチドもまた、第２の部分として、本開示のキメラに組み込むことができる。例えば、Ｍｅｓｚａｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｓｉｇｎａｌ．， １０（４７０）：ｅａａｋ９９８２ （２０１７）；Ｇｕｈａｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ７：１０２３９， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０２３９ （２０１６）；米国特許第９，７８３，５７５号；同第９，２９７，０１７号；および同第９，１１５，１８４号を参照されたく、これら全ては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のペプチド（すなわち、配列番号１、６、７、１２、１３、３８～４７および４９～５０）のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換；１個または複数の欠失（例えば、１、２、３）；１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）；またはこれらの任意の２つまたはそれを超える組合せを有するペプチドを含む。適切なＥ３リガーゼと相互作用するバリアントが選択される。
本開示の第２の部分のペプチドは、１０００ｎＭを下回る結合親和性でその関連するＥ３リガーゼに結合し得る。ある特定の場合では、第２の部分ペプチドは、４から２０個のアミノ酸長（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個）である。
ある特定の場合では、第２の部分ペプチドは、配列番号１、６、７、１２、１３、３８～４７および４９～５０のうちのいずれか１つに記載のペプチドのアミノ酸配列を有する。一部の場合では、第２の部分ペプチドは、配列番号１、６、７、１２、１３、３８～４７および４９～５０のうちのいずれか１つに記載のペプチドのバリアントであるアミノ酸配列を有する。バリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換；１個または複数の欠失（例えば、１、２、３）；１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）；またはこれらの任意の２つまたはそれを超える組合せを有する第２の部分ペプチドを含む。
ＶＩ．安定化ペプチド
本開示のキメラの第１および／または第２の部分は、安定化ペプチド（例えば、ステープルペプチド）を含み得る。ペプチドヘリックスは、多くの重要な生物学的プロセス（例えば、アポトーシス）を調節する鍵となるタンパク質－タンパク質相互作用の重要なメディエーターであるが、そのようなヘリックスが、タンパク質の範囲内でその背景を無視して解釈され、単離して調製された場合、それは折りたたまれず、ランダムコイルコンフォメーションをとる場合があり、生物活性において劇的な減少につながり、したがって治療的潜在力が低下する。この問題を回避するために、構造的に安定化したペプチドを用いることができる。一部の場合では、構造的に安定化したペプチドは、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって接合した少なくとも２個の改変アミノ酸を含む。本明細書において記載する安定化ペプチドは、ステープルペプチド、ステッチペプチド、複数のステッチを含むペプチド、複数のステープルを含むペプチド、またはステープルおよびステッチのミックスを含むペプチド、ならびに他の化学的戦略によって構造的に強化されたペプチドを含む（例えば、Ｂａｌａｒａｍ Ｐ． Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９９２；２：８４５；Ｋｅｍｐ ＤＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９６；１１８：４２４０；Ｏｒｎｅｒ ＢＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００１；１２３：５３８２；Ｃｈｉｎ ＪＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００１；４０：３８０６；Ｃｈａｐｍａｎ ＲＮ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００４；１２６：１２２５２；Ｈｏｒｎｅ ＷＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００８；４７：２８５３；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ （Ｃａｍｂ）． ２００９ Ｏｃｔ ７； （３７）： ５５８８－５５９０；Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．， ２０１５，４４：９１－１０２；および Ｇｕｎｎｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０１６，１４：８００２－８０１３を参照されたく、これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。安定化ペプチドのさらなる例については、例えば、国際公開第ＷＯ２０１９／１１８８９３号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ペプチドをステープル化することによって安定化することができる（例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５７：６２７５－６２８８ （２０１４）を参照されたく、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ステープルペプチドは、生体活性ペプチドの天然のα－ヘリックス形状を強化し、安定化された構造、ｉｎ ｖｉｖｏでのプロテアーゼ耐性、強化された標的結合親和性、および好ましい薬理学を付与する（Ｗａｌｅｎｓｋｙ， Ｌ．Ｄ． ＆ Ｂｉｒｄ， Ｇ．Ｈ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５７， ６２７５－８８ （２０１４）、Ｗａｌｅｎｓｋｙ， Ｌ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５， １４６６－７０ （２００４））。ペプチドは、その天然二次構造を維持する点で「安定化」されている。例えば、ステープル化は、α－ヘリックス二次構造を有する傾向があるポリペプチドが、その天然α－ヘリックスコンフォメーションを維持することを可能にする。この二次構造は、タンパク質の分解的切断および熱に対するポリペプチドの抵抗性を増加させ、標的への結合親和性、疎水性、および細胞透過性も増加させる場合がある。したがって、本明細書において記載するステープル（架橋）ポリペプチドは、対応する非ステープル（非架橋）ポリペプチドと比較して改善された生物活性を有する。
「ペプチドのステープル化」は、合成方法論から作り出された用語であり、ポリペプチド鎖に存在する２個のオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有接合し（例えば、「一緒にステープル化され」）、架橋環を形成している（例えば、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６６： ５２９１－５３０２， ２００１；Ａｎｇｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７：３２８１， １９９４を参照のこと）。「ペプチドのステープル化」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような反応を促進し、単一の「ステープル」ポリペプチドを提供する任意の数の反応条件および／または触媒を使用した、ポリペプチド鎖に存在する場合がある２個の（例えば、少なくとも一対の）二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有および三重結合含有側鎖の接合を含む。「マルチプライ（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）ステープル」ポリペプチドという用語は、１個を超える個々のステープルを含み、２個、３個、またはそれを超えるさまざまな間隔の独立したステープルを含んでいてもよいポリペプチドを指す。さらに「ペプチドのステッチ化」という用語は、本明細書で使用される場合、２個のステープルが、例えば共通の残基に連結している「ステッチ」（例えば、直列のまたはマルチプライステープル）ポリペプチドを提供する、単一のポリペプチド鎖における複数のかつ直列の「ステープル化」事象を指す。ペプチドのステッチ化は、例えば、ＷＯ２００８／１２１７６７およびＷＯ２０１０／０６８６８４で開示されており、これら両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の場合では、ステープルは、本明細書で使用される場合、不飽和結合を保持することができるかまたは減少させることができる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、炭化水素のステープル化によって安定化することができる。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は、２個、３個、または６個のアミノ酸で隔てられ、置換されたアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である。多数の公知の非天然のまたは自然界には存在しないアミノ酸が存在し、これらのうちのいずれかは、ステープルペプチドに含まれる場合がある。自然界には存在しないアミノ酸の一部の例は、４－ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ－アミノ酪酸、ベータ－シアノアラニン、ノルバリン、４－（Ｅ）－ブテニル－４（Ｒ）－メチル－Ｎ－メチル－Ｌ－トレオニン、Ｎ－メチル－Ｌ－ロイシン、１－アミノ－シクロプロパンカルボン酸、１－アミノ－２－フェニル－シクロプロパンカルボン酸、１－アミノ－シクロブタンカルボン酸、４－アミノ－シクロペンタンカルボン酸、３－アミノ－シクロヘキサンカルボン酸、４－ピペリジル酢酸、４－アミノ－ｌ－メチルピロール－２－カルボン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２－アミノヘプタン二酸、４－（アミノメチル）安息香酸、４－アミノ安息香酸、オルト－、メタ－およびパラ－置換フェニルアラニン（例えば、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；－ＣＦ３；－ＣＮ；－ハロ；－ＮＯ２；ＣＨ３で置換された）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（例えば、－Ｃ＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；－ＣＦ３；－ＣＮ；－ハロ；－ＮＯ２；ＣＨ３でさらに置換された）、ならびにスタチンである。さらに、アミノ酸は、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、またはグリコシル化されたアミノ酸残基を含むように誘導体化することができる。
炭化水素ステープルポリペプチドは、２個の非天然アミノ酸間に１個または複数のテザー（連結）を含み、このテザーは、ポリペプチドのα－ヘリックス二次構造を顕著に強化する。一般的に、テザーは、１つまたは２つの螺旋ターン（すなわち、約３．４または約７個のアミノ酸）の長さにわたって伸長する。したがって、ｉおよびｉ＋３個目；ｉおよびｉ＋４個目；またはｉおよびｉ＋７個目に位置するアミノ酸は、化学的修飾および架橋に関して理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが、配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有する場合、Ｘ１とＸ４との間、またはＸ１とＸ５との間、またはＸ１とＸ８との間の架橋がそのペプチドの有用な炭化水素のステープル化形態であり、Ｘ２とＸ５との間、またはＸ２とＸ６との間、またはＸ２とＸ９との間などの架橋も同様である。複数の架橋（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）の使用も検討される。複数の架橋の使用は、ペプチドの安定化および最適化において非常に効果的であり、特にペプチド長の増加を伴う。したがって、本開示のキメラに組み込まれ得るペプチドは、配列をさらに安定化させるためか、またはより長いポリペプチド伸長の構造安定化、タンパク質分解抵抗性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性、および／または生物活性の強化を促進するために、ポリペプチド配列内に１個を超える架橋を組込み得る。炭化水素ステープルポリペプチドの作製および使用に関する追加の説明は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１７２２８５号、同第２０１０／０２８６０５７号、および同第２００５／０２５０６８０号で見出すことができ、これら全ての内容は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋３個目の残基にある場合、Ｒ－プロペニルアラニンおよびＳ－ペンテニルアラニン；またはＲ－ペンテニルアラニンおよびＳ－ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋４個目の残基にある場合、Ｓ－ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルが、ｉおよびｉ＋７個目の残基にある場合、Ｓ－ペンテニルアラニンおよびＲ－オクテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。一部の場合では、ペプチドがステッチ化されている場合、「ステッチ」に関与するペプチドのアミノ酸は、ビス－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニン；またはビス－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンで置換されている。
ステープルまたはステッチ位置は、ステープルウォークにおいてさまざまなステープル位置を試験することによって変更することができる。
図２（上部）は、さまざまな架橋化合物を生成するために使用することができる非天然アミノ酸の例示的な化学構造を示す。図２（中央）は、ｉ位残基とｉ＋３位残基との間；ｉ位残基とｉ＋４位残基との間；およびｉ位残基とｉ＋７位残基との間に炭化水素架橋を有するペプチドを示す。図２（下部）は、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを示す。図３は、ダブルおよびトリプルステープル化戦略を含むさまざまなペプチド配列、ならびに例示的なステープルウォークを示す。図４は、さまざまな長さの分岐状ステッチ部分を使用した例示的なステープルウォークを示す。
一態様では、安定化ポリペプチドは式（Ｉ）
Figure 2023546561000036
 （式中、
各Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ４－Ｋ－Ｒ４］ｎであり；これらはそれぞれ０～６個のＲ５で置換されており；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６であるか、または
Figure 2023546561000037
 であり、
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは１～４の整数であり；
ｘは２～１０の整数であり；
各ｙは、独立して、０～１００の整数であり；
ｚは、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数であり；各Ｘａａは、独立してアミノ酸である）を有する。
テザーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルキル、Ｃ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルケニル、またはＣ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルキニル）を含んでいてもよい。テザーされたアミノ酸は、アルファ二置換（例えば、Ｃ１～Ｃ３またはメチル）とすることができる。
一部の場合では、ｘは２、３、または６である。一部の場合では、各ｙは、独立して、１から１５または３から１５の整数である。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ３アルキルである。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはメチルである。例えば、Ｒ１およびＲ２は、両方ともメチルとすることができる。一部の場合では、Ｒ３はアルキル（例えば、Ｃ８アルキル）であり、ｘは３である。一部の場合では、Ｒ３はＣ１１アルキルであり、ｘは６である。一部の場合では、Ｒ３はアルケニル（例えば、Ｃ８アルケニル）であり、ｘは３である。一部の場合では、ｘは６であり、Ｒ３はＣ１１アルケニルである。一部の場合では、Ｒ３は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の場合では、Ｒ３は－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－である。
別の態様では、２個のアルファ、アルファ二置換立体中心は、両方ともＲ立体配置もしくはＳ立体配置（例えば、ｉ、ｉ＋４個目の架橋）であるか、または一方の立体中心はＲであり、もう一方はＳ（例えば、ｉ、ｉ＋７個目の架橋）である。したがって、式Ｉ
Figure 2023546561000038
 として図示する場合、例えば、ｘが３のとき、Ｃ’およびＣ”二置換立体中心は、両方ともＲ立体配置とすることができるか、または両方ともＳ立体配置とすることができる。ｘが６である場合、Ｃ’二置換立体中心はＲ立体配置であり、Ｃ”二置換立体中心はＳ立体配置である。Ｒ３二重結合は、ＥまたはＺ立体化学配置とすることができる。
一部の場合では、Ｒ３は、［Ｒ４－Ｋ－Ｒ４］ｎであり；Ｒ４は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。
一部の実施形態では、本開示は、２個、３個、または６個のアミノ酸で隔てられた２個のアミノ酸の側鎖が内部ステープルで置き換えられた；３個のアミノ酸の側鎖が内部ステッチで置き換えられた；４個のアミノ酸の側鎖が２個の内部ステープルで置き換えられた、または５個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルおよび内部ステッチの組合せで置き換えられた、内部架橋された（「ステープル化された」または「ステッチ化された」）ペプチドを特徴とする。ステープル化された／ステッチ化されたペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のアミノ酸長とすることができる。
ある特定の場合では、安定化ペプチドは、分解について標的化されるタンパク質（例えば、コロナウイルスプロテアーゼ）に結合する細胞内タンパク質のペプチド、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するペプチド、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプター（例えば、ＷＤ４０リピートタンパク質）に結合するペプチドである。
本開示のキメラに組み込むことができるステープルペプチドの非限定的な例を、以下に列挙する。
ＡＴＶＮＶＬＡＷＬＹＡＡＶＩＮＧＤ（配列番号２）－Ｍｐｒｏ結合性ペプチド
ＡＴＶＮＶＬＡＷＬＹＸ１ＡＶＩＸ２ＧＤ（配列番号３）－Ｍｐｒｏ結合性ペプチド
ＡＮＬＮＡＧＢＸ１ＬＧＳＸ２ＡＡＴＶＥＬＱ（配列番号４）－ＮＳＰ９結合性ペプチド
ＡＮＬＮＲＧＢＸ１ＬＧＳＸ２ＡＡＴＶＲＬＱ（配列番号５）－ＮＳＰ９結合性ペプチド
ここで、Ｂ＝ノルロイシンであり、Ｘ１およびＸ２は、同じである（例えば、（Ｓ５））。
ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱ＃（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号７）－ＡＴＳＰ－７０４１、＃＝シクロブチルアラニンである
ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱＬ（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号１）－ｐ５３（ＳＰ６４５）ある特定の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号１～７、１２、１３、３８～４７および４９～５０のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる。ある特定の実施形態では、本開示は、ステープル／ステッチの位置が異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ－ヘリックスの非相互作用面上に１から７（例えば、１、２、３、４、５、６、７）個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。他の場合では、置換は非保守的である。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ－ヘリックスの相互作用面上に１から５（例えば、１、２、３、４、５）個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。ステープルペプチドに対する例示的な変形／改変のタイプを図５に示す。
ＶＩＩ．安定化ペプチドにおけるテザー
炭化水素テザーが、本開示の安定化ペプチドにおいて使用される。一部の場合では、他のテザーもまた、本開示の安定化ペプチドにおいて用いられ得る。例えば、テザーは、１個または複数のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド、またはトリアゾール部分を含んでいてもよい。一部の場合では、天然に存在するアミノ酸側鎖を、テザー中に組み込むことができる。例えば、テザーは、官能基、例えばセリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第１級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸中の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミン中のアミドとカップリングすることができる。したがって、２個の天然に存在しないアミノ酸をカップリングすることによって作製されるテザーを使用するのではなく、天然に存在するアミノ酸を使用してテザーを生成することが可能である。天然に存在するアミノ酸とともに単一の天然に存在しないアミノ酸を使用することも可能である。トリアゾール含有（例えば、１，４トリアゾールまたは１，５トリアゾール）架橋を使用することができる（例えば、Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５：１１３７；ＷＯ２０１０／０６０１１２を参照のこと）。更に、異なるタイプのステープル化を行う他の方法は当技術分野において周知であり、それを用いることができる（例えば、ラクタムステープル化：Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２７：２９７４－２９８３ （２００５）；ＵＶ付加環化ステープル化：Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ２１：１４７２－１４７５ （２０１１）；ジスルフィドステープル化：Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１１３：９３９１－９３９２ （１９９１）；オキシムステープル化：Ｈａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ４７：１０９１５－１０９１７ （２０１１）；チオエーテルステープル化：Ｂｒｕｎｅｌ ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ５５２－２５５４ （２００５）；光スイッチ（Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ）ステープル化：Ｊ． Ｒ． Ｋｕｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， ９７：３８０３－３８０８ （２０００）；ダブルクリックステープル化：Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ５：１８０４－１８０９ （２０１４）；ビス－ラクタムステープル化：Ｊ． Ｃ． Ｐｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１９：４５５－４６０ （１９９７）；およびビス－アリール化ステープル化：Ａ． Ｍ． Ｓｐｏｋｏｙｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １３５：５９４６－５９４９ （２０１３）を参照のこと）。
テザーの長さが変わる場合がある点が更に想定される。例えば、二次性アルファ－ヘリックス構造に対して比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合、長さが短いテザーを使用することができるが、一部の場合では、二次性アルファ－ヘリックス構造に対して拘束は低いことが望ましく、したがって長いテザーが望まれる場合がある。
さらに、主にアルファヘリックスの片面上にあるテザーを与えるために、アミノ酸ｉからｉ＋３個目、ｉからｉ＋４個目、およびｉからｉ＋７個目までのテザー全長は共通であるが、テザーは、アミノ酸の数の任意の組合せに及ぶように合成することができ、複数のテザーを導入するように組み合わせて使用することもできる。
一部の場合では、本明細書において記載する炭化水素テザー（すなわち、架橋）は、更に操作することができる。一例では、（例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス（ＲＣＭ）を使用して合成されるような）炭化水素アルケニルテザーの二重結合を酸化し、（例えば、エポキシ化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化を介して）、以下の化合物のうちの１つを提供することができる。
Figure 2023546561000039
エポキシド部分か、または遊離ヒドロキシル部分のうちの１つのいずれかは、さらに官能基化することができる。例えば、エポキシドは、例えば、治療剤に結合するために使用することができる追加の官能性を与える求核試薬で処置することができる。あるいはそのような誘導体化は、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端の合成操作によってまたはアミノ酸側鎖を介して達成することができる。他の薬剤、例えばポリペプチドが細胞中に侵入するのを促進する薬剤を、官能基化テザーに結合させることができる。
一部の場合では、アルファ二置換アミノ酸は、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善するためにポリペプチドにおいて使用する。しかし、アルファ二置換アミノ酸は必須ではなく、（例えば、テザーされたアミノ酸において）モノ－アルファ置換基を使用した場合も想定される。
ステープルポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコール誘導体；第２のポリペプチド；炭水化物などを含んでいてもよい。ポリマーまたは他の薬剤がステープルポリペプチドに連結している場合、組成物は実質的に均質であることが望ましい場合がある。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が付加すると、ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性が改善される場合がある。例えば、ＰＥＧ化を行うと、腎クリアランスを低下させることができ、より安定な血漿濃度をもたらす場合がある。ＰＥＧは水溶性ポリマーであり、式：
ＸＯ－－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－－ＣＨ２ＣＨ２－Ｙ
（式中、ｎは２から１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端改変、例えばＣ１～４アルキルであり；Ｙは、ポリペプチドのアミン基（これらに限定されないが、リシンのイプシロンアミン、またはＮ末端を含む）への、アミド、カルバメートまたは尿素連結である）としてポリペプチドへ連結しているとして表すことができる。Ｙはまた、チオール基（これらに限定されないがシステインのチオール基を含む）へのマレイミド連結であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接的にまたは間接的に連結するための他の方法は、当業者であれば公知である。ＰＥＧは、直鎖状または分岐状とすることができる。さまざまな官能基化誘導体を含むＰＥＧのさまざまな形態が市販されている。
分解可能な連結を骨格において有するＰＥＧを使用することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解するための対象であるエステル連結を用いて調製することができる。分解可能なＰＥＧ連結を有するコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３、ＷＯ９９／１４２５９、およびＵ．Ｓ．６，３４８，５５８に記載されている。
ある特定の実施形態では、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間体リンカーを介して本明細書において記載する薬剤に結合している。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１から２０個のアミノ酸で構成されており（ｍａｄｅ ｕｐ ｏｆ）、アミノ酸は、２０種類の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの一部は、当業者であれば十分に理解しているようにグリコシル化されていてもよい。他の実施形態では、１から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸で構成されている。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、アルキルリンカー、例えば－ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）－（式中、ｎ＝２～２０）を使用することができる。これらのアルキルリンカーは、任意の立体障害のない基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等でさらに置換されていてもよい。米国特許第５，４４６，０９０号では、二官能性ＰＥＧリンカー、および各ＰＥＧリンカー末端でペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用が記載されている。
一部の実施形態では、安定化ペプチドも、例えば、細胞取込みをさらに促進するために、またはｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加させるために改変してもよい。例えば、ペプチド模倣大員環をアシル化またはＰＥＧ化すると、細胞取込みが促進され、バイオアベイラビリティが増加し、血液循環が増加し、薬物動態が変化し、免疫原性が減少しおよび／または必要とされる投与頻度が減少する。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるステープルペプチドは、（例えば、非ステープルペプチドと比較して）細胞膜を貫通するための強化された能力を有する。
本明細書において記載する安定化ペプチドを合成する方法は当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用する場合がある。さまざまなステップを、代替の配列または順序で行い、所望の化合物を得てもよいことは理解されるであろう。本明細書において記載する化合物の合成において有用である合成化学的変換および官能基を保護する方法論（保護および脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｒ． Ｌａｒｏｃｋ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９８９）；Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｄ． Ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９９）；Ｌ． Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｆｉｅｓｅｒ， Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９４）；およびＬ． Ｐａｑｕｅｔｔｅ， ｅｄ．， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９５）、ならびにこれらのその後の版に記載されているものを含む。
安定化ペプチドは、当業者であれば周知の化学的合成方法によって作製することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ３ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ， ｅｄ． Ｇｒａｎｔ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９２， ｐ． ７７を参照されたい。したがって、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａまたは４３１において、側鎖が保護されたアミノ酸を使用してｔ－ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学作用で保護されたα－ＮＨ２を用いた固相合成の自動化Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を使用して合成することができる。
本明細書において記載するペプチドを作製する一様式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用することである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子を用い、酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は、合成のために使用する溶媒に不溶性であり、過剰な試薬および副生成物を洗い流すのを比較的単純にかつ迅速にする。Ｎ末端は、酸において安定なＦｍｏｃ基で保護されるが、塩基によって取り外し可能である。任意の側鎖官能基は、塩基で安定であり、酸に不安定な基で保護される。
長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを使用して個々の合成ペプチドを連接させることによって作製してもよい。あるいは、長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコール含む周知の標準的なマニュアルとして提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳し、好ましくは遺伝子が発現される生物に最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的には必要に応じてペプチドおよび任意の調節性エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製する。合成遺伝子を、好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞中にトランスフェクトする。次いで、ペプチドを、選択された発現系および宿主に適切な好適な状態下で発現させる。ペプチドは精製し、標準的な方法によって特徴付ける。
ペプチドは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループットマルチチャンネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用したハイスループット組合せ様式で作製することができる。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を高めるために、レトロインベルソ結合（Ｃ（Ｏ）－ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ－ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ－ＣＨ２またはＣＨ２－Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ－ＣＨ２またはＣＨ２－Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２－ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）－ＮＨ）；トランス－オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換トランス－オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）－ＣＨＲ）またはＣＨＲ－Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）；およびフルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）－ＣＦＲまたはＣＦＲ－Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である）で置き換えることができる。
ポリペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によってさらに改変することができる。上記で示すように、ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１～Ｃ２０直鎖状または分岐状アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびこれらの組合せにコンジュゲートすることができる。さまざまな長さのオレフィン側鎖を含むα、α－二置換非天然アミノ酸は、公知の方法で合成することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１３：９２７６， １９９１；Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １２２：５８９１， ２０００；およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ４４６：３６９， ２００８；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１１）。ペプチドに関しては、ｉ＋７個目のステープルに連結したｉ個目を使用する（ヘリックス２回転が安定化される）場合、ａ）１個のＳ５アミノ酸および１個のＲ８を使用するか、またはｂ）１個のＳ８アミノ酸および１個のＲ５アミノ酸を使用する。Ｒ８は、出発キラル助剤がＲ－アルキル－立体異性体をもたらすことを除いて、同様の経路を使用して合成する。また、８－ヨードオクテンを５－ヨードペンテンの代わりに使用する。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂上での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して固体支持体上で合成する（例えば、ＷＯ２０１０／１４８３３５を参照のこと）。
Ｆｍｏｃ－保護されたα－アミノ酸（オレフィンアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓ５－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｒ８－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｒ８－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓ８－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｒ５－ＯＨ以外）、２－（６－クロロ－１－Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡは、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィンアミノ酸合成は、当技術分野において報告されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｓｙｎｔｈ．， ８０：３１， ２００３）。
本開示のキメラに組み込まれ得る本明細書において開示されるステープル化され、精製されたペプチドを得る（例えば、合成する）のに好適な方法もやはり、当技術分野において公知である（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ． ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ４４６：３６９－３８６ （２００８）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１１；Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０５：１４６６－１４７０ （２００４）；Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２：５８９１－５８９２ （２０００）；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願公開第１２／５２５，１２３号；および２０１０年５月２５日に登録された米国特許第７，７２３，４６８号を参照されたく、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、ペプチドは、非ステープルペプチド混入物質を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法としては、例えば、固相支持体上でのペプチド合成がある。環化後、固相支持体は、単離し、溶媒溶液、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物中に懸濁してもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含んでいてもよい。特定の実施形態では、５０％／５０％ＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液を使用する。溶液は、１、６、１２または２４時間インキュベートしてもよく、その後、樹脂は、例えばジクロロメタンまたはＮＭＰで洗浄してもよい。一実施形態では、樹脂はＮＭＰで洗浄する。振盪および溶液中への不活性ガスのバブリングを行ってもよい。
本開示の安定化（例えば、ステープル）ポリペプチドの特性は、例えば、例として、国際公開第ＷＯ２０１９／１１８８９３号に記載される方法を使用して、アッセイすることができ、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩＩＩ．リンカー
上述の構築物において使用することができるリンカーに関しては、特に制限はない。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、例えばアミノプロピオン酸、アミノブタン酸、アミノペンタン酸、またはアミノヘキサン酸である。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴエチレングリコール、すなわち、ＮＨ２－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｘ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨである。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態では、約１から３０個の残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸）を含む任意の（ａｎｙ ａｒｂｉｔｒａｒｙ）単一鎖ペプチドをリンカーとして使用することができる。他の実施形態では、リンカーは、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、１０から６０、１０から７０、１０から８０、１０から９０、１０から１００、１０から１４４、または１０から１５０個のアミノ酸長である。ある特定の場合では、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基のみを含む。そのようなペプチドリンカーの例としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ；ＧｌｙＳｅｒ；ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号１６）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１７）；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号１８）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１９）；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号２０）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号２１）；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号２２）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号２３）；（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号２４）ｎ（ここで、ｎは１またはそれよりも多い整数である）；および（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ）ｎ（配列番号２５）ｎ（ここで、ｎは１またはそれよりも多い整数である）がある。一部の場合では、リンカーは、リンカーの各コピーにおけるセリン残基が別のアミノ酸で置き換えられていることを除いて、配列番号１６のアミノ酸配列の複数のコピー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピー）を有する。
一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー、化学リンカー、グリシン－セリンリンカー、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２６）、（Ｇ４Ｓ）５（配列番号２７）、ベータ－アラニン（Ｚ）リンカー、ベータ－アラニンおよびアラニン（ＺＡ）リンカー、またはポリエチレングリコールリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、ベータ－アラニンを含む。別の実施形態では、リンカーは、ベータ－アラニンおよびアラニンリンカーを含む。
他の実施形態では、リンカーペプチドは、（従来のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーペプチドリピートのジャンクションにおいて生じる）アミノ酸配列ＧＳＧが存在しないように改変される。例えば、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＸＸ）ｎＧＧＧＧＳ（配列番号２８）およびＧＧＧＧＳ（ＸＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２９）（ここで、Ｘは、配列へ挿入することができ、配列ＧＳＧを含むポリペプチドはもたらさない任意のアミノ酸であり、ｎは０から４である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーペプチドの配列は、（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳ（ここで、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＳであり、ｎは０から４である）（配列番号３０）である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳ（ここで、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＱであり、ｎは０から４である）（配列番号３１）である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳ（ここで、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＡであり、ｎは０から４である）（配列番号３２）である。更に別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、ＧＧＧＧＳ（ＸＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ＸはＰであり、ｎは０から４である）（配列番号３３）である。一実施形態では、本発明のリンカーペプチドは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＡ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）を含むか、またはそれからなる。別の実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＱ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号３５）を含むかまたはそれからなる。更に別の実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列（ＧＧＧＰＳ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号３６）を含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（ＰＧＧＧＳ）２（配列番号３７）を含むかまたはそれからなる。
ある特定の実施形態では、リンカーは、合成化合物リンカー（化学的架橋剤）である。市場で入手可能な架橋剤の例としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－ＥＧＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ－ＤＳＴ）、ビス［２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、およびビス［２－（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ－ＢＳＯＣＯＥＳ）がある。
ある特定の実施形態では、リンカーは、図７で図示するリンカーである。
ＩＸ．Ｍｐｒｏ阻害剤ペプチド
本開示は、配列番号２または３に記載の配列を有する新規なペプチドであって、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する（例えば、Ｍｐｒｏ二量体化および／またはＭｐｒｏ酵素活性を阻害する）ことができ、それによって、ウイルス（例えば、コロナウイルス）の成熟および／または複製を阻害することができる、ペプチドを特徴とする。本開示はまた、バリアント、例えば、配列番号２または３とは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または１３個のアミノ酸が異なる配列も特徴とし、ここで、バリアントは、Ｍｐｒｏを阻害する。一部の場合では、ペプチドは、配列番号２または３におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％の同一性、少なくとももしくは約８０％、少なくとも８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または１００％の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、Ｍｐｒｏに結合し、Ｍｐｒｏ二量体化および／またはＭｐｒｏ酵素活性を阻害する。一部の場合では、これらのペプチドは、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）活性を阻害する（例えば、ウイルスの成熟および複製を阻害する）。
一部の実施形態では、Ｍｐｒｏ阻害剤ペプチドは、組換えまたは合成により産生されたペプチドである。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにＭｐｒｏと相互作用し、その二量体化および／または酵素活性を阻害する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、それらが、１～５個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸置換を有することで配列番号２または３から変動しているという点で、配列番号２または３のペプチドとは異なる。一部の場合では、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）が、配列番号２の３位および７位に挿入される。一部の場合では、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）が、配列番号２の１１位および１５位に挿入される。ある特定の場合では、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５）が、配列番号２の３位および７位、ならびに１１位および１５位に挿入される。これらのステープルペプチドのそれぞれは、これらのステープルペプチドが、Ｍｐｒｏに結合しそれを阻害するその能力を保持する限り、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換をさらに含み得る。例えば、「Ｘ」とラベル付けされた位置は、配列番号２または３において、以下のように置換され得る：ＡＴＸＮＶＬＸＷＬＹＸＡＶＩＸＧＤ（配列番号５１）。Ｘは、保存的アミノ酸残基であってもよく、または非保存的アミノ酸残基であってもよい。一部の実施形態では、「Ｘ」は、非天然アミノ酸、例えば、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン（Ｓ５）である。それらの実施形態では、ペプチドは、ｉ位とｉ＋４位との間で単一ステープル化または二重ステープル化されていてもよい。
Ｍｐｒｏの酵素活性は、アルファヘリックス配列ＴＶＮＶＬＡＷＬＹＡＡＶＩＮＧＤ（配列番号９）によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号９は、ペプチドをベースとした二量体化阻害剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、Ｍｐｒｏ阻害剤ペプチドは、少なくとも６個（例えば、配列番号９の７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個の連続したアミノ酸）を含み得る。一部の場合では、Ｍｐｒｏ結合剤ペプチドは、例えば、配列番号９とは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入によって異なる、配列番号９のバリアントであってもよく、ここで、バリアントは、依然としてＭｐｒｏと二量体を形成することができる。
一部の実施形態では、Ｍｐｒｏ阻害剤ペプチドは、例えば、配列番号２または３のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号２または３のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。
あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および／または欠失を含み得る。例えば、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含み得るが、ただし、ペプチドが依然としてＭｐｒｏに結合し、その二量体化および／または酵素活性を阻害することができることを条件とする。したがって、本明細書において開示されるＭｐｒｏ阻害剤ペプチドのうちのいずれのアミノ酸配列も、バリアントペプチドがＭｐｒｏに結合し、それを阻害する限り、変動し得る。
Ｘ．ＮＳＰ９阻害剤ペプチド
本開示は、配列番号４または５に記載の配列を有する新規なペプチドであって、ＮＳＰ９に結合し、それを阻害する（例えば、ＮＳＰ９二量体化および／またはＮＳＰ９酵素活性を阻害する）ことができ、それによって、ウイルス（例えば、コロナウイルス）の成熟および／または複製を阻害することができる、ペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、ＮＳＰ９阻害剤ペプチドは、組換えまたは合成により産生されたペプチドである。そのようなペプチドは、ペプチドが本明細書に記載するようにＮＳＰ９と相互作用する限り、非架橋であっても、ステープル化されていても、ステッチ化されていてもよい。
ＮＳＰ９の酵素活性は、アルファヘリックス配列ＮＬＮＲＧＭＶＬＧＳＬＡＡＴＶＲＬＱ（配列番号１０）によって媒介されるホモ二量体を形成することに依存する。配列番号１０は、ペプチドをベースとした二量体化結合剤を作製するために使用することができる。一部の場合では、ＮＳＰ９阻害剤ペプチドは、少なくとも６個（例えば、配列番号１０の７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、または１８個の連続したアミノ酸）を含み得る。一部の場合では、ＮＳＰ９阻害剤ペプチドは、バリアントペプチドが依然としてＮＳＰ９に結合し、それを阻害する限り、配列番号１０において少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のアミノ酸置換または欠失を含み得る。一部の場合では、ＮＳＰ９阻害剤ペプチドは、配列ＧＸＸＸＧ（配列番号８）を含む。
一部の実施形態では、ＮＳＰ９阻害剤ペプチドは、例えば、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、配列番号４または５のアミノ酸配列の一部分または複数の部分と関連するか、またはそれに対して同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
一部の場合では、ペプチドは、配列番号４または５におけるアミノ酸に対して、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとも８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または１００％の同一性を有し得、ここで、ペプチドは、ＮＳＰ９に結合する。あるいは、またはさらに、ペプチドは、保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸置換および／または欠失を含み得る。例えば、アミノ酸は、保存的であるかどうかにかかわらず、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含み得る。したがって、本明細書において開示されるＮＳＰ９阻害剤ペプチドのアミノ酸配列は、バリアントペプチドが依然としてＮＳＰ９に結合し、それを阻害する限り、変動し得る。
一部の場合では、配列番号４もしくは５のＮＳＰ９阻害剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、配列のそれぞれの末端において、１個、２個、または３個のアミノ酸だけ短縮されていてもよい。他の場合では、配列番号４もしくは５のＮＳＰ９阻害剤ペプチドまたはそれらのバリアントは、ステープルを含まなくてもよく、１つのステープル（例えば、Ｓ５とＳ５との間（ｉ，ｉ＋４位）、Ｒ８とＳ５との間（ｉ，ｉ＋７位）、またはＳ５とＲ８との間（ｉ，ｉ＋７）に形成されるステープル）を含んでもよく、または二重ステープル化されていてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、それらが、１～４個（例えば、１個、２個、３個、４個）のアミノ酸置換を有することで配列番号４または５から変動しているという点で、配列番号４または５のペプチドとは異なる。例えば、「Ｘ」とラベル付けされた位置は、配列番号４において、以下のように置換され得る：ＡＮＬＮＡＧＢＸＬＧＳＸＡＡＴＶＥＬＱ（配列番号５２）。Ｘは、保存的アミノ酸残基であってもよく、または非保存的アミノ酸残基であってもよい。一部の実施形態では、「Ｘ」は、非天然アミノ酸、例えば、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニン（Ｓ５）である。それらの実施形態では、ペプチドは、ｉ位とｉ＋４位との間で単一ステープル化され得る。一部の場合では、必要とされるコアペプチド配列は、ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｇモチーフ（配列番号８）であり、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、任意のアミノ酸であり得る。一部の場合では、Ｘ１＝Ｍ、ノルロイシン（Ｂ）、Ａ、またはＧであり、Ｘ２＝Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｍ、またはＢであり、Ｘ３＝Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＩである。
ＸＩ．処置の方法
本明細書において開示されるキメラは、キメラ分子が結合する標的タンパク質（例えば、ウイルスタンパク質、例えば、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスＮＳＰ、または宿主ＢＥＴタンパク質）の分解を促進することができる。ある特定の場合では、本開示のキメラによって分解されるタンパク質は、コロナウイルスＰＬｐｒｏタンパク質である。一部の場合では、コロナウイルスＭｐｒｏタンパク質は、本開示のキメラによって分解される。他の場合では、コロナウイルスＮＳＰ９タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。ある特定の場合では、コロナウイルスＭｐｒｏタンパク質は、本開示のキメラによって分解される。さらに他の場合では、宿主ＢＲＤ２タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。一部の場合では、宿主ＢＲＤ３タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。さらに一部の場合では、宿主ＢＲＤ４タンパク質は、本開示のキメラによって分解される。コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルスＮＳＰ、および／または宿主ＢＥＴタンパク質の分解は、例えば、コロナウイルス感染症を処置すること、コロナウイルス複製を阻害すること、コロナウイルス負荷を低減すること、コロナウイルス感染症または疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）と関連する症状を処置すること、ウイルス病原性を低減すること、コロナウイルスクリアランスまでの時間を低減すること、およびコロナウイルス感染症を有する対象の臨床転帰における死亡率を低減することにおいて、有用である。本開示のキメラは、個体がコロナウイルス疾患（例えば、ＳＡＲＳまたはＣＯＶＩＤ－１９）を発症するであろう危険性を低減する方法を、さらに提供する。一部の場合では、本開示のキメラでのコロナウイルス感染症の処置は、症状、例えば、発熱および悪寒、咳嗽、息切れまたは呼吸困難、疲労、筋肉痛または体の痛み、頭痛、味覚または嗅覚の喪失、咽喉痛、鼻詰まりまたは鼻水、吐き気または嘔吐、ならびに下痢を低減させる。
本開示は、ＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）によって引き起こされる感染症または疾患の予防および／または処置を、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）において行うために、本明細書に記載するキメラのいずれかを使用する方法を特徴とする。本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」などの用語は、対象が患う疾患または状態を軽減する、阻害する、または好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）ことを指す。例えば、本開示のキメラは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９を処置するために使用することができる。本開示はまた、疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）またはその症状を、完全にまたは部分的に予防する方法も特徴とする。
本開示は、既知のまたは疑いのあるコロナウイルスへの曝露の後に、コロナウイルス感染症の臨床徴候を呈する対象（例えば、ヒト、霊長類、コウモリ、トリ、マウス、シチメンチョウ、ウシ、ブタ、ネコ、イヌなど）におけるコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症を治療的に処置する方法をさらに提供する。コロナウイルス感染症と診断されている個体と濃厚接触している対象、および発熱（３８℃を超えることが多い）、悪寒、咳嗽、息切れまたは呼吸困難、疲労、筋肉痛または体の痛み、頭痛、味覚喪失、嗅覚喪失、咽喉痛、鼻詰まりまたは鼻水、吐き気または嘔吐、下痢を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の症状を呈する対象は、本開示の方法での処置に適格であると考えられる。主題の方法の利点は、コロナウイルス感染症の重症度が低減されること、例えば、ウイルス負荷が低減されること、および／またはウイルスクリアランスまでの時間が低減されること、および／または罹患率もしくは死亡率が低減されることである。
一部の実施形態では、本開示は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症の処置または予防を、それを必要とするかまたはその危険性がある対象において行うための方法であって、対象に、本開示のキメラ組成物を、１つまたは複数の抗ウイルス薬、またはコルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、およびインターフェロン－ベータを含むがこれらに限定されない他の薬剤と組み合わせて含む組成物を投与することによって行う、方法を提供する。
本開示は、まだコロナウイルスに感染していない個体、および／またはコロナウイルス感染症に典型的な症状を呈していない個体において、コロナウイルス感染症を予防的に処置する方法を提供する。そのような個体としては、例えば、医療従事者、ＣＯＶＩＤ－１９を有する個体と限定された空間にいる人物（例えば、商用航空会社の職員、例えば、客室乗務員およびパイロット、旅行者、会議出席者など）、ならびにＣＯＶＩＤ－１９を有する個体と同じ世帯の居住者を含む、ＣＯＶＩＤ－１９を有する個体と接触したものが挙げられる。本開示の利点は、個体が病的なコロナウイルス感染症を発症するであろう危険性が低減されることである。
本明細書で使用される場合、「コロナウイルス」という用語は、コロナウイルス科の任意のメンバーを含み、これには、コロナウイルス属の任意のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。コロナウイルス属としては、アルファコロナウイルス（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）株（例えば、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、およびＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ベータコロナウイルス（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）株（例えば、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ １（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ガンマコロナウイルス（Ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）（例えば、トリ伝染性気管支炎ウイルス、およびシチメンチョウコロナウイルス）、ならびにデルタコロナウイルス（Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）株（例えば、ブタコロナウイルスＨＫＵ１５、メジロコロナウイルスＨＫＵ１６、スズメコロナウイルスＨＫＵ１７、シキチョウコロナウイルスＨＫＵ１８、ゴイサギコロナウイルスＨＫＵ１９、ヒドリガモコロナウイルスＨＫＵ２０、およびバンコロナウイルスＨＫＵ２１）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しており、本開示のキメラで処置され得る。「コロナウイルス」という用語は、さらに、天然に存在する（例えば、野生型）コロナウイルス、天然に存在するコロナウイルスバリアント、および研究室において生成されたコロナウイルスバリアント（選択によって生成されたバリアント、化学的改変によって生成されたバリアント、および遺伝子改変されたバリアント（例えば、組換えＤＮＡ方法によって研究室において改変されたコロナウイルス）を含む）を含む。
一般的に、方法は、対象を選択すること、および例えば、医薬組成物中のまたは医薬組成物としての、有効量の１つまたは複数の本開示のキメラを対象に投与すること、ならびにコロナウイルス感染症、例えば、ＳＡＲＳまたはＣＯＶＩＤ－１９の予防または処置に必要とされるように必要に応じて投与を反復することを含み、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内で投与してもよい。対象は、例えば、対象がコロナウイルス感染症を有すること、または有すると疑われることを決定することに基づいて、処置に選択してもよい。
任意の特定の患者に関する特異的投薬量および処置レジメンは、さまざまな因子に左右されることになり、その因子としては、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する患者の傾向、状態または症状、ならびに処置する医師の判断がある。
有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬として投与してもよい。治療有効量の治療化合物（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、１日当たり１回または複数回から１週当たり１回または複数回、投与することができ、隔日で１回を含む。当業者であれば、これらに限定されないが、疾患または障害の重症度、治療歴、対象の全身的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある特定の因子が、対象を効果的に処置するために必須の投薬量およびタイミングに影響を与える場合があることは理解するであろう。更に、本明細書において記載する治療有効量の治療化合物を用いた対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含んでいてもよい。例えば、有効量を、少なくとも一回投与してもよい。
一部の実施形態では、本開示のキメラおよび処置の方法は、予防的に使用される。例えば、本方法は、コロナウイルス感染症に易罹患性であるかまたは罹患する危険性にあると決定された対象に、本明細書に記載するキメラおよび／またはキメラを含む組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載するキメラは、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン－ベータ、およびイカチバントを含むリストから選択される１つまたは複数の薬剤を含む、ウイルス感染症を処置するための１つまたは複数の公知かつ好適な医薬品と組み合わせて投与され得る。その文脈において、１つまたは複数の薬剤および本開示のキメラは、キメラを含む組成物と、同時に、または逐次的に、すなわち、単一の製剤として、または一緒にもしくは個々にのいずれかでパッケージングされた別個の製剤として、投与され得る。
一部の実施形態では、本開示のキメラは、図１および図１２Ａ～Ｃに示されるように、ウイルスの複製および／または病原性に必要な標的タンパク質（例えば、ＰＬｐｒｏタンパク質またはＢＲＤ）を相乗的に分解すること、および宿主細胞におけるｐ５３レベルを増加させることによって、二重の作用を有し得る。実施例４も参照されたい。さらに、ＰＬｐｒｏは、宿主免疫系を回避するウイルス機序にも関与するため、本開示のキメラは、ウイルス複製の遮断、および感染細胞を殺滅させる免疫系の能力の回復の両方を行うことができる。
ＸＩＩ．医薬組成物
本明細書において記載する１個または複数の安定化ペプチドまたはキメラのうちのいずれかは、医薬組成物としてまたはそれにおいて使用するために製剤化することができる。そのような組成物は、任意の経路、例えば食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された任意の経路を介した対象への投与のために、製剤化するかまたは適応させることができる。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲ Ｄａｔａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｍａｎｕａｌ第００４版（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍにおいて利用可能である）に記載されている。例えば、組成物は、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内経路による投与のために製剤化または適合され得る。これらの経路には、吸入（例えば、経口および／または鼻吸入（例えば、ネブライザーまたはスプレーを介した））、注射（例えば、静脈内、動脈内、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹腔内、筋肉内、および／または皮下）；および／または経口投与、経粘膜投与、および／または局所投与（局所（例えば、鼻）スプレーおよび／または液剤を含む）が含まれる。本開示の組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．００１～約１００ｍｇの範囲の投薬量で、または特定の薬物の要件に応じて、投与され得る。あるいは、またはさらに、組成物は、例えば、ＦＤＡ Ｄａｔａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｍａｎｕａｌ（ＤＳＭ）（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＡｐｐｒｏｖａｌＰｒｏｃｅｓｓ／ＦｏｒｍｓＳｕｂｍｉｓｓｉｏｎＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ／ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＳｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓ／ＤａｔａＳｔａｎｄａｒｄｓＭａｎｕａｌｍｏｎｏｇｒａｐｈｓにおいて入手可能）において記載されている、食品医薬品局に承認されている方法のいずれかに従って投与され得る。
典型的には、本開示の医薬組成物は、１日当り約１～約６回、または代替的には連続的な注入として、投与される。そのような投与は、慢性的または急性的な治療として使用することができる。単回剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、処置される宿主および具体的な投与様式に応じて変動するであろう。典型的な調製物は、約５％～約９５％の活性キメラ（重量／重量）を含むであろう。あるいは、そのような調製物は、約２０％～約８０％の活性キメラを含む。
一部の実施形態では、本開示のキメラの有効用量としては、例えば、静脈内で投与される、例えば、約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～１００００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～５０００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～２５００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～１０００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～９００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～８００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～７００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～６００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～５００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～４００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～３００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～２００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～１００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～９０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～８０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～７０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～６０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～５０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～４０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～２０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１～１５、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１～１０、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、もしくは１０～３０；または０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１～５ｍｇ／ｋｇ／日を挙げることができるが、これらに限定されない。
上記で引用されたものよりも低いかまたは高い用量が、必要とされる場合がある。任意の特定の対象に関する特異的投薬量および処置レジメンは、さまざまな因子に左右されることになり、その因子としては、用いられる特定のキメラの活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する対象の傾向、状態または症状、ならびに処置する医師の判断がある。
患者の状態の改善に応じて、維持用量の本開示のキメラ、組成物、または組合せが、必要に応じて、投与され得る。続いて、投薬量または投与の頻度、またはその両方が、症状の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで、低減され得る。対象は、しかしながら、疾患症状の任意の再発時には、長期間の間欠的な処置を必要とし得る。
本開示の組成物におけるキメラは、選択的な生物学的特性を強化するために適切な機能性を付加することによって、改変され得る。そのような改変は、当該技術分野において公知であり、これには、所与の生物学的コンパートメント（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透を増加させ、経口アベイラビリティを増加させ、溶解度を増加させて注射による投与を可能にし、代謝を変化させ、排出の速度を変化させるものが含まれる。
一部の場合では、医薬組成物は、有効量の１個または複数のキメラを含んでいてもよい。「有効量」および「処置に有効な」という用語は、本明細書で使用される場合、意図する効果または生理学的アウトカムをもたらすためのその投与（例えば、コロナウイルス感染症の処置）の背景内で有効な期間（急性または慢性投与および周期的または連続的投与を含む）で利用される、本明細書において記載する１個または複数のキメラまたは医薬組成物の量または濃度を指す。本明細書に記載する１つまたは複数のキメラまたは医薬組成物の有効量としては、標的タンパク質（例えば、コロナウイルスＰＬｐｒｏ、コロナウイルスＭｐｒｏ、コロナウイルスＮＳＰ９、コロナウイルスＮＳＰ１２、宿主ＢＲＤ２、宿主ＢＲＤ３、または宿主ＢＲＤ４）のレベルの減少、ならびに／または細胞における宿主ｐ５３レベル（例えば、タンパク質レベル）および／もしくはｐ５３活性（例えば、生物学的活性）の増加を促進する量が挙げられる。キメラの治療有効量は、状態（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を治癒することを要求されるものではないが、状態の処置を提供するであろう。
本開示の医薬組成物は、１つまたは複数のキメラ、ならびに任意の薬学的に許容される担体および／またはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、医薬組成物は、疾患または感染症（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）または疾患の症状のモジュレーションまたは好転を達成するために有効な量で、１つまたは複数の追加の治療剤をさらに含み得る。１つまたは複数の治療剤としては、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン－ベータ、およびイカチバントが挙げられるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される担体」という用語は、本開示のキメラとともに対象に投与してもよく、その薬理学的活性を破壊せず、治療量のキメラを送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である担体またはアジュバントを指す。
本開示の医薬組成物において使用してもよい薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、これらに限定されるものではないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、例えばｄ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬品投薬形態において使用する界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）または他の同様の高分子送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂がある。シクロデキストリン、例えばα－、β－、およびγ－シクロデキストリンも、本明細書において記載するキメラの送達を強化するために有利に使用してもよい。
本開示のキメラの薬学的に許容される塩には、薬学的に許容される無機および有機酸および塩基に由来するものが含まれる。好適な酸性塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロメチルスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム塩、およびＮ－（アルキル）４＋塩が挙げられる。
本開示の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、製剤のｐＨは、キメラまたはその送達形態の安定性を強化するための薬学的に許容される酸、塩基または緩衝剤を用いて調整してもよい。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変部内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
医薬組成物は、吸入および／または経鼻投与のための液剤または散剤の形態であってもよい。そのような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）および懸濁化剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化してもよい。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製してもよい。
医薬組成物は、非毒性非経口で許容される希釈剤または溶媒中の、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として注射用滅菌液剤または懸濁剤などの注射可能な滅菌調製物の形態であってもよい。用いてもよい許容されるビヒクルおよび溶媒のうちの１つは、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌、固定油を、溶媒または懸濁媒体として慣例的に用いる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を用いてもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射可能な調製物において有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えば特にそのポリオキシエチル化型のオリーブ油またはヒマシ油も同様である。これらの油性液剤または懸濁剤には、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース、または薬学的に許容される投薬形態の製剤、例えばエマルションおよび／もしくは懸濁剤において通常使用する同様の分散剤も含まれる場合がある。他の通常使用する界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）またはＳｐａｎ（登録商標）および／または薬学的に許容される固形剤、液剤、もしくは他の投薬形態の製造において通常使用する他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ促進剤も、製剤の目的で使用してもよい。
医薬組成物は、任意の経口で許容される投薬形態で、経口で投与することができ、その投薬形態としては、これらに限定されないが、カプセル剤、錠剤、エマルション剤および水性懸濁剤、分散剤および液剤がある。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチがある。滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムも通常添加される。カプセル剤形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。水性懸濁剤および／またはエマルション剤が経口で投与される場合、活性成分は、乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わせて油性相中に懸濁するかまたは溶解してもよい。必要に応じて、ある特定の甘味料および／または香味料および／または着色剤を添加してもよい。
本開示の医薬組成物はまた、直腸投与のために坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、本開示のキメラを、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって、直腸内で融解して活性成分を放出する、好適な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。そのような材料としては、例えば、カカオバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の組成物が、本明細書に記載するキメラと１つまたは複数の追加の治療剤または予防剤との組合せを含む場合、キメラおよび追加の薬剤のいずれも、単剤療法レジメンにおいて通常投与される投薬量の約１～１００％、より好ましくは約５～９５％の投薬量レベルで存在すべきである。追加の薬剤は、例えば、複数回用量レジメンの一部として、本開示のキメラとは別個に投与され得る。あるいは、それらの薬剤は、単回剤形の一部として、本開示のキメラと一緒に単一の組成物に混合されてもよい。
一部の場合では、本明細書において開示される１個または複数のキメラは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲート組成物は、一価または多価であってもよい。例えば、コンジュゲート組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートしている本明細書において開示される１個のペプチドを含んでいてもよい。あるいは、コンジュゲート組成物は、担体にコンジュゲートしている２個またはそれを超える本明細書において開示されるペプチドを含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、２個の実体が互いに「コンジュゲート」している場合、これらは直接的または間接的な共有または非共有相互作用によって連結している。ある特定の実施形態では、会合は共有性である。他の実施形態では、会合は非共有性である。非共有相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、静電的相互作用などがある。間接的共有相互作用は、２個の実体が共有的に連結されている場合、必要に応じてリンカー基を介する。
担体タンパク質は、対象における免疫原性を増加させるかまたは強化する任意のタンパク質を含んでいてもよい。例示的な担体タンパク質は、当技術分野において記載されている（例えば、Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５８：２３０９－２３１２， １９９０；Ｄｅｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７１７５－７１７９， １９９１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５７：３８２３－３８２７， １９８９；Ｓｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５９：４５５５－４５６１，１９９１；Ｓｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１５１０－１５２４， １９８７；およびＳｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２：４４４０－４４４４， １９９４を参照のこと）。高分子担体は、１個または複数の第１級および／または第２級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含む天然または合成材料であってもよい。担体は、水溶性であってもよい。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において開示されるキメラ（以下で「Ｘ」として示される）のうちのいずれか１つまたは複数を、以下の方法において使用するための方法を提供する。
本明細書において開示される１つまたは複数の状態（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、以下の例において「Ｙ」として言及される）の処置において医薬品として使用するためのキメラＸ。Ｙの処置のための医薬品の製造のためのキメラＸの使用、およびＹの処置において使用するためのキメラＸ。
Figure 2023546561000040
Figure 2023546561000041
Figure 2023546561000042
配列番号１４および１５におけるモチーフパターンは、以下の命名法を使用する：「．」は、任意のアミノ酸タイプを指し、「［Ｘ］」は、その位置において許容されるアミノ酸タイプを指し、パターンの開始点における「＾Ｘ」は、配列がアミノ酸タイプＸで開始することを指し、「［＾Ｘ］」は、その位置がタイプＸ以外の任意のアミノ酸を有し得ることを示し、数字が続いて「Ｘ｛ｘ，ｙ｝」として示され、ここで、ｘおよびｙは、その位置に置いて必要とされる「Ｘ」アミノ酸タイプの最小数および最大数を示す。翻訳後改変（例えば、リン酸化およびプロリンヒドロキシル化）されることが知られている一次デグロン内の保存される残基の位置は、太字で示される。配列番号１、７、４０～４８、および５４～５５において、（Ｒ８）は、 （Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニンであり、（Ｓ５）は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニンである。配列番号４８において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ５は、任意のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｗ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、ナフチルアラニン、Ｅ、Ｄ、Ｙ、シクロブチルアラニン、およびそれらの側鎖アナログ）であり、Ｘ３：Ｗ、Ｆ、または３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニンであり、Ｘ４：Ｌまたはロイシン模倣体（例えば、シクロブチルアラニン）である。配列番号４９～５０において、（Ｒ５）は、（Ｒ）－２－（４’－ペンテニル）アラニンであり、（Ｓ８）は、（Ｓ）－２－（７’－オクテニル）アラニンである。配列番号７および５０において、＃は、シクロブチルアラニンである。配列番号３～５において、Ｘ１およびＸ２は、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニンである。配列番号４～５において、Ｂは、ノルロイシンである。配列番号２８～２９において、Ｘは、配列に挿入することができ、配列ＧＳＧを含むポリペプチドをもたらさない任意のアミノ酸であり、ｎは、０～４である。配列番号５１～５２において、Ｘは、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニンである。配列番号５４～５５において、Ｚは、ベータ－アラニンである。
以下の例は、特許請求する発明を更に例示するために提供され、発明の範囲を限定するものとして判断されるべきではない。特定の材料が言及されている範囲で、それは例示を目的とするにすぎず、本発明を限定することを意図しない。当業者であれば、発明の能力を行使することなくかつ発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を発展させることができる。
（実施例１）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生活環の必須タンパク質を分解するためのＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの合成
ステープルまたはステッチｐ５３ペプチドを樹脂上で合成し、可変長のリンカー（例えば、β－アラニン、ＰＥＧ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーなど）、続いて、縮合反応のために必要に応じて誘導体化された選択した小分子を付加することによって、ステープルペプチドタンパク質分解標的化キメラ（ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ）を、標的化されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の分解のために生成した。図２～５によって、これらのキメラの安定化（すなわち、ステープルまたはステッチ）ペプチド部分をデザインする際のアプローチの多様性が実証される。例えば、ＳＰ６４５は、２つのアミノ酸を、６つのアミノ酸が隣接する（ｉ，ｉ＋７位）非天然アミノ酸Ｓ－オクテニルアラニンおよびＲ－ペンテニルアラニンと置き換えることによって合成した（図６を参照されたい）。図７は、ＳＰ６４５（配列番号１）の構造を示す。必要とされるα，α－二置換アミノ酸の合成を、以前に説明されているように行った（Ｗａｌｅｎｓｋｙ， Ｌ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５， １４６６－７０ （２００４）、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ， Ｃ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２， ５８９１－５８９２ （２０００））。固相Ｆｍｏｃ化学およびルテニウムに触媒されるオレフィンメタセシスを、ペプチド合成およびステープル形成に使用し、続いて、リンカーおよび小分子を標準的なカップリング化学を使用して樹脂上で付加した。
ＰＬｐｒｏ阻害剤ＧＲＬ－０６１７を組み込むために、例えば、化学的置換を、そのＮＨ２基を介して達成した。ＧＲＬ－０６１７－酸（１１．３ｍｇ、０．０２８１ｍｍｏｌ、１当量）を、室温で、ＤＭＦ（０．２８ｍｌ、０．１Ｍ）中に溶解したＮ－（４－アミノブチル）－２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）アセトアミドトリフルオロアセテート（１４．５ｍｇ、０．０２８１ｍｍｏｌ、１当量）と合わせた。ＤＩＰＥＡ（１４．７マイクロリットル、０．０８４３ｍｍｏｌ、３当量）およびＨＡＴＵ（１０．７ｍｇ、０．０２８１ｍｍｏｌ、１当量）を、次いで、ペプチドに添加し、そのＮ末端Ｆｍｏｃを、ピペリジンで事前に脱保護し、混合物を、２０時間、窒素下で反応させた。最終的なＳＰ－ＰＲＯＴＡＣは、ペプチドの脱保護および切断、ＬＣ／ＭＳによる精製、ならびにアミノ酸分析による定量後に得た。ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのＣ末端を、結合分析のためにＦＩＴＣでさらに誘導体化した。
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのプロトタイプパネルは、Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ８８， １２５１１－２７ （２０１４）、Ｇｈｏｓｈ， Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５２， ５２２８－４０ （２００９）、Ｂａｅｚ－Ｓａｎｔｏｓ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．， １１５， ２１－３８ （２０１５）、およびＺｈａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３６８， ４０９－４１２ （２０２０）、およびＧｏｒｇｕｌｌａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ５８０， ６６３－６６８ （２０２０））に記載されている報告されている化合物を含む、ＰＬｐｒｏおよびＭｐｒｏを標的とする小分子を組み込んでいた。上記のプロセスを適用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅタンパク質およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ＰＬｐｒｏ（図７）に結合する、ブロモドメインを含むタンパク質（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４）を標的としそれを分解する、例示的なＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを生成した。
重要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的（ＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ、ＮＳＰ９、およびＮＳＰ１２）の追加のペプチドおよび分子モジュレーターを、上述の方法を使用して、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣに組み込んでもよい。表５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的、分子のタイプ、およびＳＰ－ＰＲＯＴＡＣに組み込まれる分子の名称／構造を列挙する。関心が持たれるものの例としてはとりわけ、ＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ、ＮＳＰ９阻害剤、およびＮＳＰ１２阻害剤を組み込んだＳＰ－ＰＲＯＴＡＣである。
Figure 2023546561000043
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣはまた、宿主タンパク質、例えば、ブロモドメインタンパク質、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、および／またはＢＲＤ４も標的とし得る。ＪＱ１は、ＢＲＤ４に結合する例示的な分子である。
さらに、以下の表６は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの例、およびこれらの標的に結合し得るリガンド分子のタイプを列挙する。表６に列挙される分子は、表５の例示的な分子に、直接的に結合するか、またはリンカーを介して連結させて、ウイルスタンパク質またはウイルス病原性を補助する宿主タンパク質の分解のために、分解薬（例えば、Ｅ３リガーゼ）を動員することができる。
Figure 2023546561000044
（実施例２）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの結合親和性を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの結合親和性を評価するために、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ、ＨＤＭ２、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質標的の間の三元複合体の形成をモニタリングする定量的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ベースのアッセイをデザインした。Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号５３）およびトロンビン切断部位を有する組換えＨＤＭ２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質（例えば、ＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ）をｐＥＴ２８ａベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、親和性Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー、続いて、記載のようにタグ切断およびＳＥＣによって精製する（Ｂｅｎ－Ｎｕｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２８（７）： ８４７－８５７ （２０２０）、Ｂｅｒｎａｌ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２９， ２４５６－７ （２００７））。成分を、１：１：１の比で混合し、ＳＥＣプロファイルを、それぞれのタンパク質単独およびＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを添加しないタンパク質の組合せとの比較で、記録する。この様式で、所望される結合性複合体を形成するＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの能力を、文書化する。この結合親和性ＳＥＣアッセイの適用の例として、図９Ｂは、ＢＲＤ４に指向されるＳＰ－ＰＲＯＴＡＣが、ＢＲＤ４とＨＤＭ２との間の複合体の形成を誘導したことが見出されたが（一番下のトレース）、一方で、ＨＤＭ２単独、ＢＲＤ４単独、ＨＤＭ２＋ＢＲＤ４、ＨＤＭ２＋ＢＲＤ４＋ＳＰ６４５＋ＪＱ１は、ＳＥＣによって評価した場合に複合体の形成を誘導しなかったことを示す。これらの結果により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望されるタンパク質複合体の核となる、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの能力が確認された。
（実施例３）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの細胞浸透度
２つの機能が１つになった（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）生細胞タンパク質相互作用アッセイを使用して（Ｈｅｒｃｅ， Ｈ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ９， ７６２－７７１ （２０１７））、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣがＨｅＬａ細胞に進入する能力、および所望される三元複合体を生成する能力を同時に評価した。簡単に述べると、ＧＦＰを認識するラクダ科由来の一本鎖ＶＨＨ抗体を、そのラミニン融合を介して、核ラミナに局在化させた。ＧＦＰ－ＨＤＭ２およびＲＦＰ－融合体としての標的ウイルスタンパク質を、次いで、細胞において一過的に発現させ、続いて、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣまたはビヒクルで処置した。両方の標的に係合する細胞浸透剤ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣは、ＲＦＰ－ウイルスタンパク質を、ＧＦＰ－ＨＤＭ２が係留された核ラミナに濃縮させることが見出され、これにより、ＧＦＰ／ＲＦＰオーバーレイにおけるシグナルによってスコア付けされる、タンパク質の共局在化が生じた。図１０Ａに示されるように、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４は、ＨＤＭ２をサイトゾル（拡散パターン、上部）から、ＢＲＤ４が実験的に係留している核ラミナ（集中パターン、下部）に再局在化させ、これによって、共局在化（下部、右側）が生じた。これらの結果により、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏで所望されるタンパク質複合体の核となる、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの能力が確認された（図１０Ａ）。
（実施例４）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを使用したウイルスＰＬｐｒｏタンパク質ユビキチン化
ウイルス標的のユビキチン化を可能にする三元複合体を形成するＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの能力を測定するために、ＨＤＭ２ユビキチンリガーゼキット（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを行い、ウイルスタンパク質分子量における対応するユビキチンシフトを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした。図１０Ｂに示されるように、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＰＬｐｒｏ１（１０μＭ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＤＭ２に媒介されるＰＬｐｒｏのユビキチン化を誘導した。これらの結果は、ＨＤＭ２近接性を誘導することにより、ウイルス標的（例えば、ＰＬｐｒｏ）ユビキチン化を達成することができることを示す。
（実施例５）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に結合する宿主タンパク質の選択的な分解
細胞内タンパク質分解に関してアッセイするために、ＳＪＳＡ－１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ）を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）培養培地（ＣＭ）中で、３７℃で湿度制御されたＣＯ２平衡化インキュベーターにおいて継代した。処置の前日に、細胞を継代し、６ウェルプレート中に１００，０００細胞／ｍＬの密度で播種した。２４時間後に、細胞を、プロテアソーム阻害剤であるカルフィルゾミブ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＢｌｏｃｋｓ Ｉｎｃ、カタログＩＤ：Ｆ－４７７０）、４００ｎＭ）の存在下または非存在下において、２時間、さまざまな濃度のＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４（例えば、０．１～１０μＭ）で処置し、その後で、それらを採取し、溶解させた。細胞溶解物を、次いで、アクチン（対照）、ｐ５３、およびＢＲＤ４抗体を使用し、標準的なウエスタンブロット技術を使用してアッセイして、タンパク質レベルおよびローディング対照のためのアクチン抗体を評価した。
図１１Ａに示されるように、ＢＲＤ４に指向されるＳＰ－ＰＲＯＴＡＣは、用量応答的に、ＳＪＳＡ－１細胞におけるｐ５３レベルを増加させ、ＢＲＤ４レベルを減少させた。プロテアソーム阻害剤（カルフィルゾミブ）の存在下において、ＢＲＤ４分解は、阻害された（図１１Ｂ）。
（実施例６）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣによる培養細胞のタンパク質のランドスケープの変化
ハイコンテントスクリーニングにより得られたもっとも強力なＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ化合物を、天然で易罹患性のヒト由来Ｈｕｈ７細胞（Ｍｏｓｓｅｌ， Ｅ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９， ３８４６－５０ （２００５））およびＡＣＥ２を発現するＣａｌｕ－３細胞（Ｔｓｅｎｇ， Ｃ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９， ９４７０－９ （２００５））において試験した。播種した細胞を、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの連続希釈物（開始用量１０μＭ、三連）で１時間処置した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＵＳＡ／ＷＡ－ＣＤＣ－ＷＡ１／２０２０、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ９８５３２５．１）でチャレンジした。培養上清から試料採取し、ＲＮＡｓｅ阻害剤の存在下でウイルスを溶解させ、逆転写（ＲＴ）および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、記載のように行った（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ （２０１８））。ＣＤＣにより検証されているＢＨＱでクエンチした色素対プライマーを、ＩＤＴから購入し、Ｃｔ値からゲノム当量を計算した。
もっとも強力な抗ウイルス活性を示したＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを使用して、Ｈｕｈ７およびＣａｌｕ－３細胞（５０％を上回る感染性）を処置し、続いて、タンパク質レベルにおける動的変化についてモニタリングした。処置した細胞を、１０％ ＳＤＳ含有緩衝液において時間をわたり（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間）溶解させ、溶解物を、ｐ５３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的（ＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ）、およびアクチン対照についてのウエスタン分析に供した。機序上のｐ５３誘導および標的－タンパク質特異的分解（例えば、ＰＬｐｒｏ、Ｍｐｒｏ、ＢＲＤ４）を示す、処置細胞に由来する溶解物は、記載のように行われるグローバルプロテオミクス分析も受ける（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８， １３７６－８１ （２０１５））。この様式で、細胞タンパク質のランドスケープ全体にわたる作用のＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ特異性を、ＢＲＤ４に指向されるＳＰ－ＰＲＯＴＡＣについて試験した（図１２Ａ～Ｃ）。対照（ステープルペプチドＳＰ６４５単独（図１２Ａ）および非連結型小分子ＪＱ１単独（図１２Ｂ））とは対照的に、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４（図１２Ｃ）は、ＢＲＤ ２／３／４タンパク質レベルの低減、およびｐ５３転写標的、例えば、ＨＤＭ２の誘導の両方を行うことが見出された。これらの結果は、最適な抗ウイルス活性が、ｐ５３誘導および標的タンパク質分解の相乗的なＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ機序から導出されたことを示す。
（実施例７）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣによる培養細胞の機序上の細胞傷害の改善
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞傷害アッセイを行った。ＳＪＳＡ－１細胞を、ＳＰ６４５、ＪＱ１、またはＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４で７２時間、示される濃度で処置し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を、技術的に三連で行い、化合物、タンパク質、または細胞の独立した調製物を用いて少なくとも２回反復し、一元配置分散分析を使用して分析した。０．０５を下回る両側ｐ値を、有意とみなした。
図１３Ａにおいて見られるように、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＢＲＤ４は、ＳＰ６４５およびＪＱ１単独と比較して、ＳＪＳＡ－１細胞の機序上の細胞傷害を有意に改善した（生存度パーセントの減少）。
（実施例８）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣによる培養細胞のウイルス感染の遮断
エボラウイルスに対する以前のスクリーニングに基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のハイスループットなウイルス検出プラットフォームを開発した（Ａｎａｎｔｐａｄｍａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ６０， ４４７１－８１ （２０１６））。３８４ウェルの形式で播種したＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの連続希釈物（開始用量５０μＭ）で１時間処置し、三連で行い、続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＵＳＡ／ＷＡ－ＣＤＣ－ＷＡ１／２０２０、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ９８５３２５．１）で４時間チャレンジして、１０～２０％の細胞の制御感染を達成した（試験化合物の動的範囲を評価するのに最適な感染性）。次いで、感染した細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中で再洗浄し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオキャプシドモノクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、続いて抗マウスＩｇ二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で免疫染色し、細胞体をＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋブルーで対比染色した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ Ｅｃｌｉｐｓｅ自動化顕微鏡においてｚ面でイメージングし、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアによって分析し、感染細胞を総細胞で除すことによって感染効率を計算した。図１３Ｂは、２５μＭおよび５０μＭのＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＰＬｐｒｏ１が、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を遮断することが見出されたことを示す。
（実施例９）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのα－らせん度の測定
小分子二量体化がＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの成分であるステープルペプチド（例えば、ＳＰ６４５、ＡＴＳＰ－７０４１など）の構造に影響を及ぼさないことを確実にするため、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのらせん度を、円偏光二色性（ＣＤ）によって溶液中で測定する（Ｂｉｒｄ， Ｇ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ４４６， ３６９－８６ （２００８））。５０μＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）またはＭｉｌｌｉ－Ｑ脱イオン水中で再構成した化合物を用いて、ＣＤスペクトルを、Ａｖｉｖ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ分光計（モデル４１０）で記録する。１９０～２６０ｎｍの５回のスキャンを平均して、それぞれのスペクトルを得、これを、波長対残基平均楕円率としてプロットし、らせん度％を、記載のように計算する（Ｆｏｒｏｏｄ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９０， ８３８－４２ （１９９３））。上記の方法の例として、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのらせん度を、４つのＨＤＭ２結合性ステープルｐ５３ペプチドステープルペプチド（ＳＡＨ－ｐ５３－１～４、配列番号４０～４３）について、Ｂｅｒｎａｌ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２９（９）：２４５６－２４５７ （２００７）．）に示されるように、円偏光二色性によって評価した。図８Ａ（Ｂｅｒｎａｌ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．における図１Ｃと同一）は、ＳＡＨ－ｐ５３－４（配列番号４３）が、ＳＡＨ－ｐ５３－１～３（配列番号４０～４２）または野生型ｐ５３ペプチド（配列番号１１）よりも安定であったことを示す。
（実施例１０）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのタンパク質分解安定性の測定
ステープルペプチドの重要な特性は、ステープル自体および誘導されるらせん状フォールディングによる不安定なアミド結合の遮蔽に起因するｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質分解に抵抗するそれらの能力である。タンパク質分解安定性を決定するために、比較可能なタンパク質分解分析を、（Ｂｉｒｄ， Ｇ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， １５， ６， １３４０－１３４８ （２０２０））によって記載のように液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００）を行って、細胞およびｉｎ ｖｉｖｏ研究に関して、最もプロテアーゼ耐性が高い化合物を特定する。反応試料は、ＤＭＳＯ中の５μｌのＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ（１ｍＭストック）および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４からなる１９５μｌの緩衝液から構成される。ゼロ時間試料の注射時に、２．５μｌの１００ｎｇ／μＬプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、インタクトな化合物の量を、時間をわたっての逐次的な注射によって定量する。時間に対する平均二乗変位（ＭＳＤ）面積のプロットにより、指数関数型崩壊曲線を生成し、半減期を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰分析によって決定する。このタンパク質分解安定性評価の適用の例は、Ｂｉｒｄ Ｇ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ Ａｕｇｕｓｔ １０， ２０１０ １０７ （３２） １４０９３－１４０９８．に示されている。図９Ａ（Ｂｉｒｄ Ｇ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．に由来）は、単一ステープル化および二重ステープル化された抗ＨＩＶ治療薬エンフビルチドが、ステープル化されていないエンフビルチドと比較して、顕著なプロテアーゼ耐性を有することが見出されたことを示す。エンフビルチドの安定性は、ステープルの数に比例して増加した。
（実施例１１）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの結合親和性を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのそれぞれの成分について相対結合親和性を評価するために、蛍光偏光（ＦＰ）結合分析を行い、ここで、Ｃ末端ＦＩＴＣ誘導体化ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ（例えば、２５ｎＭ）を、結合緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＤＴＴ）中で、個々にそれぞれのタンパク質の連続希釈物（例えば、ＨＤＭ２、ＰＬｐｒｏ）とともにインキュベートする。ＦＰを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において平衡状態で測定し、データをプロットし、Ｋｄ値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して計算する。このＦＰ分析の適用の例は、Ｂｅｒｎａｌ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２９（９）：２４５６－２４５７ （２００７）に示されている。図８Ｂ（Ｂｅｒｎａｌ Ｆ． ｅｔ ａｌ．における図１Ｄと同一）は、さまざまなステープルｐ５３ペプチド（配列番号４０～４３）のＨＤＭ２への相対結合親和性を示す。ＳＡＨ－ｐ５３－４は、ＳＡＨ－ｐ５３－１～３または野生型ｐ５３ペプチドと比較して高い親和性で、ＨＤＭ２に結合することが見出された。
（実施例１２）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のヒト化ＡＣＥ２受容体マウスモデルにおけるリードＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの抗ウイルス活性
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験を、気道上皮においてヒトＡＣＥ２受容体を発現し（ＭｃＣｒａｙ， Ｐ．Ｂ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１， ８１３－２１ （２００７）、Ｙａｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０２０））、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した（Ｎｅｔｌａｎｄ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２， ７２６４－７５ （２００８）、Ｔｓｅｎｇ， Ｃ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１， １１６２－７３ （２００７））トランスジェニックマウスにおいて行う。抗エボラウイルス治療薬の評価のために開発された方法を使用して、実験を行う（Ｐａｓｃａｌ， Ｋ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１８， Ｓ６１２－ｓ６２６ （２０１８）、Ｓａｋｕｒａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４７， ９９５－８ （２０１５））。ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを、まず、耐容性に関して試験する。３回の処置のそれぞれについて、１０匹（雄性５匹、雌性５匹）の群で２０匹のマウスに、高用量または低用量のＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを、１日２回で１０日間、腹腔内投薬する。別の１０匹のマウスの群には、対照として食塩水のみを受容させる。動物は、それぞれの用量の前に試験し、有害作用が観察された場合には、処置を中止する。１０日間の投薬後に、高用量において耐容性が示されない場合、より低い用量を使用する。耐容性を示したＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを、ｈＡＣＥ２マウス疾患モデルにおいて有効性に関して試験する。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウス（ＪＡＸ、１アーム当たりｎ＝２０匹、雄性１０匹、雌性１０匹）に、１日目に、１０４ＰＦＵのウイルス投薬量を鼻内に接種し、続いて、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ（投薬量および頻度は、耐容性およびＰＫの結果に基づく）での腹腔内処置を１０日間毎日行う（２日目～１２日目）。１つの群には、対照としてビヒクルを受容させる。マウスを継続的にモニタリングして、体重および臨床徴候を記録する。４日目（ウイルス血症のピーク）に、それぞれの群から４匹のマウスを、安楽死させ、細胞溶解液（ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、記載されるように（Ｂａｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ５８３， ８３０－８３３ （２０２０）調製した肺ホモジネート上清からｑＰＣＲによって、ウイルス負荷を定量する。もっとも有効な処置の用量を精緻化して、マウスを保護する最低量を決定する。同じ実験デザインを使用するが、３つの群に、４倍の増分でより低用量の処置を受容させる。それぞれの実験では、性別を生物学的変数として割り当て、雄性マウスおよび雌性マウスを同じ数で用いる。
ｉｎ ｖｉｖｏ耐容性について、１０匹のマウス／用量／化合物、および食塩水対照の１０匹のマウスを使用し、マウスを、１０日目（または有害徴候の場合にはそれよりも早い時点）に安楽死させ、毒性について試験する。研究は、増加した毒性を検出する８０％の検出力を有する（６０％ ｖ １０％）、ｐ＝０．１０。ｉｎ ｖｉｖｏ有効性について、疾患進行は、１０％を上回る体重減少、努力呼吸、または発育不良として定義し、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣで処置した動物を、ビヒクルで処置した動物と比較した。１群当たり１６匹の動物（に加えて４日目の評価のための４匹のマウス）により、処置したマウスの７０％、対して対照マウスの２２％の無増悪を検出する８１％の検出力が得られるであろう、ｐ＝０．０５。進行までの時間を、カプランおよびマイヤーの方法、ならびにログランク検定ｓを使用した差についての検定を使用して評価する。
（実施例１３）
ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを使用したウイルスＮＳＰ９タンパク質ユビキチン化
別のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と三元複合体を形成する代替的にデザインしたＳＰ－ＰＲＯＴＡＣの能力を測定するために、本発明者らは、（１）ｉ，ｉ＋４単一ステープル化ＮＳＰ９結合性ペプチド（配列番号４）がＮ末端に配置され、ＳＰ－６４５（配列番号１）に連結されたものから構成される、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－１（配列番号５４）と称されるもの、または（２）ＳＰ－６４５（配列番号１）がＮ末端に配置され、ｉ，ｉ＋４単一ステープル化ＮＳＰ９結合性ペプチド（配列番号４）に連結されたものから構成される、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－２（配列番号５５、図１４Ａ）と称されるもののいずれかのＳＰ－ＰＲＯＴＡＣを生成した。いずれの場合にも、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣは、組換えＨＤＭ２、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９、および組換えＮＳＰ９の間で三元複合体の核を形成して、ウイルス標的タンパク質ＮＳＰ９のＨＤＭ２ユビキチン化を可能にすることに成功した。ＨＤＭ２ユビキチンリガーゼキット（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを行い、ウイルスタンパク質の分子量における対応するユビキチンシフトを、ウエスタンブロット分析によってモニタリングした。図１４Ｂに示されるように、ＳＰ－ＰＲＯＴＡＣ－ＮＳＰ９－１および－２（１０μＭ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＤＭ２に媒介されるＮＳＰ９のユビキチン化を誘導した。これらの結果は、ＨＤＭ２近接性を誘導することにより、分解のための標的化されるウイルスタンパク質（例えば、ＮＳＰ９）のユビキチン化を達成することができることを示す。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに併記してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (71)

  1. 第２の部分に結合している第１の部分を含むキメラであって、前記第１の部分および第２の部分が、互いに直接的に結合しているか、またはリンカーを介して互いに結合しており、
    前記第１の部分が、分解について標的化される第１のタンパク質に結合し、前記第１のタンパク質が、コロナウイルスプロテアーゼ、コロナウイルス非構造タンパク質（ＮＳＰ）、またはブロモドメインおよびエクストラ末端ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質から選択され、
    前記第２の部分が、第２のタンパク質に結合し、前記第２のタンパク質が、タンパク質分解薬であるか、またはそれを動員する、
    キメラ。
  2. 前記第２のタンパク質が、Ｅ３ユビキチンリガーゼである、請求項１に記載のキメラ。
  3. 前記第１の部分および前記第２の部分が、リンカーを介して互いに結合しており、必要に応じて、前記リンカーが、ペプチドリンカー、化学リンカー、グリシン－セリンリンカー、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２６）、（Ｇ４Ｓ）５（配列番号２７）、ベータ－アラニン（Ｚ）リンカー、ベータ－アラニンおよびアラニン（ＺＡ）リンカー、またはポリエチレングリコールリンカーである、請求項１に記載のキメラ。
  4. 前記第１の部分が、小分子、ウォーヘッドで誘導体化された小分子、ペプチド、ステープルペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたペプチド、ウォーヘッドで誘導体化されたステープルペプチド、またはヌクレオチドアナログを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ。
  5. 前記コロナウイルスプロテアーゼが、パパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）、またはメインプロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）であり、前記コロナウイルスＮＳＰが、ＮＳＰ９またはＮＳＰ１２であり、前記ＢＥＴタンパク質が、ブロモドメイン２（ＢＲＤ２）、ブロモドメイン３（ＢＲＤ３）、またはブロモドメイン４（ＢＲＤ４）である、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ。
  6. 前記コロナウイルスプロテアーゼが、ＰＬｐｒｏであり、前記第１の部分が、ＰＬｐｒｏに結合する、請求項５に記載のキメラ。
  7. ＰＬｐｒｏに結合する前記第１の部分が、ＰＬｐｒｏ阻害剤である、請求項６に記載のキメラ。
  8. 前記ＰＬｐｒｏ阻害剤が、ＧＲＬ－０６１７もしくはそのＰＬｐｒｏ結合性アナログ、ジスルフィラム、またはＰＬｐｒｏ結合性チオプリンアナログである、請求項７に記載のキメラ。
  9. 前記コロナウイルスプロテアーゼが、Ｍｐｒｏであり、前記第１の部分が、Ｍｐｒｏに結合する、請求項５に記載のキメラ。
  10. Ｍｐｒｏに結合する前記第１の部分が、Ｍｐｒｏ阻害剤である、請求項９に記載のキメラ。
  11. 前記Ｍｐｒｏ阻害剤が、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、ＡＳＣ０９、ＧＣ３７６、ＧＣ８１３、エブセレンカルボン酸、または配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、前記ペプチドが、Ｍｐｒｏに結合する、請求項１０に記載のキメラ。
  12. 前記ＢＥＴタンパク質が、ＢＲＤ４であり、前記第１の部分が、前記ＢＥＴタンパク質に結合する、請求項５に記載のキメラ。
  13. 前記ＢＥＴタンパク質に結合する前記第１の部分が、ＢＥＴタンパク質阻害剤である、請求項１２に記載のキメラ。
  14. 前記ＢＥＴタンパク質阻害剤が、ＪＱ１、ＡＢＢＶ－０７５、Ｉ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７２６、ＯＴＸ０１５、もしくはＰＦＩ－１、またはＢＲＤ４、ＢＲＤ３、および／もしくはＢＲＤ２に結合するそれらのアナログである、請求項１３に記載のキメラ。
  15. 前記コロナウイルスＮＳＰが、ＮＳＰ９であり、前記第１の部分が、ＮＳＰ９に結合する、請求項５に記載のキメラ。
  16. ＮＳＰ９に結合する前記第１の部分が、ＮＳＰ９阻害剤である、請求項１５に記載のキメラ。
  17. 前記第１の部分が、配列番号４または配列番号５に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであり、前記ペプチドが、ＮＳＰ９に結合する、請求項１６に記載のキメラ。
  18. 前記コロナウイルスＮＳＰが、ＮＳＰ１２であり、前記第１の部分が、ＮＳＰ１２に結合する、請求項５に記載のキメラ。
  19. ＮＳＰ１２に結合する前記第１の部分が、ＮＳＰ１２阻害剤である、請求項１８に記載のキメラ。
  20. 前記第１の部分が、レムデシビル酸もしくはＮＳＰ１２に結合するそのアナログ、またはソホスブビル酸もしくはＮＳＰ１２に結合するそのアナログである、請求項１９に記載のキメラ。
  21. 前記第２のタンパク質が、ヒト二重微小染色体２（ＨＤＭ２）、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）、セレブロン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、細胞アポトーシス阻害タンパク質（ｃＩＡＰ）、または構成的光形態形成１（ＣＯＰ１）である、請求項１から２０のいずれか一項に記載のキメラ。
  22. 前記第２の部分が、前記タンパク質分解薬に結合するか、またはそれを動員する、ペプチド、ステープルペプチド、または小分子を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のキメラ。
  23. 前記第２の部分が、必要に応じてサリドマイド、ポマリドマイド、レナリドマイド、アバドマイド、およびセレブロンに結合するそれらのアナログからなる群より選択される、小分子であるセレブロン結合性部分を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のキメラ。
  24. 前記第２の部分が、サリドマイド部分を含む、請求項２３に記載のキメラ。
  25. 前記サリドマイド部分が、以下に提供される構造：
    Figure 2023546561000045
     またはそのセレブロン結合性アナログ
    を含む、請求項２４に記載のキメラ。
  26. 前記サリドマイド部分が、以下に提供される構造：
    Figure 2023546561000046
     またはそのセレブロン結合性アナログ
    を含む、請求項２４に記載のキメラ。
  27. 前記サリドマイド部分が、以下に提供される構造：
    Figure 2023546561000047
     またはそのセレブロン結合性アナログ
    を含む、請求項２４に記載のキメラ。
  28. 前記第２の部分が、必要に応じてＶＨ ０３２およびそのＶＨＬ結合性アナログからなる群より選択される、ＶＨＬ結合性部分を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のキメラ。
  29. 前記ＶＨＬ結合性部分が、以下の構造：
    Figure 2023546561000048
     またはそのＶＨＬ結合性アナログ
    を含む、請求項２８に記載のキメラ。
  30. 前記ＶＨＬ結合性部分が、以下の構造：
    Figure 2023546561000049
     またはそのＶＨＬ結合性アナログ
    を含む、請求項２８に記載のキメラ。
  31. 前記第２の部分が、ＨＤＭ２結合性部分を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のキメラ。
  32. 前記ＨＤＭ２結合性部分が、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭＸに結合する、ｐ５３のトランス活性化ドメインのペプチド、またはステープルペプチド、または他の方法で化学的に安定化されたペプチドを含む、請求項３１に記載のキメラ。
  33. 前記ＨＤＭ２結合性部分が、ＡＴＳＰ－７０４１、ＳＰ６４５、またはそのＨＤＭ２結合性バリアントであるステープルペプチドである、請求項３２に記載のキメラ。
  34. 前記ステープルペプチドが、配列ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱ＃（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号７）、またはペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号７に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    （ｂ）前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸が、置換されていない、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    （ｃ）前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの１つもしくは複数が、保存的アミノ酸で置換されており、（Ｒ８）が、（Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニンであり、＃が、シクロブチルアラニンであり、（Ｓ５）が、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニンもしくはそのＨＤＭ２結合性バリアントである、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、ペプチドを含み、
    前記ペプチドが、ＨＤＭ２に結合する、
    請求項３３に記載のキメラ。
  35. 前記ステープルペプチドが、配列ＬＴＦ（Ｒ８）ＥＹＷＡＱＬ（Ｓ５）ＳＡＡ（配列番号１）、またはそのＨＤＭ２結合性バリアント、またはペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号１に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    （ｂ）前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸が、置換されていない、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    （ｃ）前記ペプチドの相互作用面のアミノ酸のうちの１つもしくは複数が、保存的アミノ酸で置換されている、配列番号１に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含み、
    （Ｒ８）が、（Ｒ）－２－（７’－オクテニル）アラニンであり、（Ｓ５）が、（Ｓ）－２－（４’－ペンテニル）アラニンである、ペプチドを含み、
    前記ペプチドが、ＨＤＭ２に結合する、
    請求項３３に記載のキメラ。
  36. 前記ＨＤＭ２結合性部分が、ヌトリン－３ａまたはそのＨＤＭ２結合性アナログである、請求項３１に記載のキメラ。
  37. 前記ＨＤＭ２結合性部分が、以下の構造：
    Figure 2023546561000050
     を含む、請求項３６に記載のキメラ。
  38. 前記第２の部分が、Ａ４１００９９．１またはそのＸＩＡＰ結合性アナログであるＸＩＡＰ結合性部分を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のキメラ。
  39. 前記ＸＩＡＰ結合性部分が、以下の構造：
    Figure 2023546561000051
     を含む、請求項３８に記載のキメラ。
  40. 前記第２の部分が、ＳＭ－１２９５、ＳＭ－１２８０、またはそのｃＩＡＰ結合性アナログであるｃＩＡＰ結合性部分を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のキメラ。
  41. 前記第２の部分が、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドを含み、前記ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含み、前記改変型が、前記天然結合コンセンサス配列内に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載のキメラ。
  42. 前記ＷＤ４０リピートタンパク質が、Ｅ３ユビキチンリガーゼＨＤＭ２またはＶＨＬの基質アダプターである、請求項４１に記載のキメラ。
  43. 前記天然結合コンセンサス配列、配列番号１４もしくは１５、またはそのバリアント、前記バリアントが、１～６個のアミノ酸の位置において前記コンセンサス配列とは異なる、請求項４１に記載のキメラ。
  44. 前記第２の部分が、ＣＯＰ１結合性部分を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のキメラ。
  45. 前記ＣＯＰ１結合性部分が、トリブルズシュードキナーゼ１（Ｔｒｉｂ１）ペプチドまたはそのＣＯＰ１結合性バリアントであるペプチドである、請求項４４に記載のキメラ。
  46. 前記ペプチドが、配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号６）、または配列番号６に記載の配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項４５に記載のキメラ。
  47. 前記タンパク質分解薬が、前記第１のタンパク質を分解する、請求項１から４６のいずれか一項に記載のキメラ。
  48. 請求項１から４７のいずれか一項に記載のキメラと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  49. 前記医薬組成物が、経口、静脈内、局所、頬内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、鼻内、肺、または気管内投与のために製剤化される、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１から４５のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項４７もしくは４８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  51. コロナウイルスのウイルス複製の遮断およびウイルス感染性の低減の両方を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１から４７のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項４８もしくは４９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  52. 前記コロナウイルスが、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製の遮断を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１から４７のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項４８もしくは４９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  54. ＲＮＡウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１から４５のいずれか一項に記載のキメラまたは請求項４８もしくは４９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  55. 前記対象に、コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、レムデシビル、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、キナーゼ阻害剤、補体阻害剤、イベルメクチン、ヒドロキシクロロキン、ファビピラビル、インターフェロン－ベータ、およびイカチバントからなる群より選択される１つまたは複数の薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項５０から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記対象が、ヒト、霊長類、コウモリ、トリ、マウス、シチメンチョウ、ウシ、ブタ、ネコ、およびイヌからなる群より選択される、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 配列番号２もしくは３に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを含むペプチドであって、前記ペプチドが、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する、ペプチド。
  58. 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を含み、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化ペプチドであって、少なくとも２個のアミノ酸置換により、３個または６個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、前記ペプチドが、Ｍｐｒｏに結合し、それを阻害する、安定化ペプチド。
  59. ５０個を下回る、４０個を下回る、３５個を下回る、３０個を下回る、または２５個を下回るアミノ酸の長さである、請求項５７または５８に記載のペプチドまたは安定化ペプチド。
  60. 配列番号４もしくは５に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを含むペプチドであって、前記ペプチドが、ＮＳＰ９に結合する、ペプチド。
  61. 配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を含み、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するペプチドを含む安定化ペプチドであって、少なくとも２個のアミノ酸置換により、３個または６個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸が、非天然アミノ酸と置き換えられ、前記ペプチドが、ＮＳＰ９に結合する、安定化ペプチド。
  62. ５０個を下回る、４０個を下回る、３５個を下回る、３０個を下回る、または２５個を下回るアミノ酸の長さである、請求項６０または６１に記載のペプチドまたは安定化ペプチド。
  63. 請求項５８から６２のいずれか一項に記載のペプチドまたは安定化ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  64. コロナウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項５８から６２のいずれか一項に記載のペプチドもしくは安定化ペプチド、または請求項６３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  65. 図７または図１４Ａに示される分子のうちのいずれか１つの構造を有する化合物を含むキメラ。
  66. 請求項６５に記載のキメラと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  67. コロナウイルスによって引き起こされるウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項６５に記載のキメラまたは請求項６６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  68. コロナウイルスのウイルス複製の遮断およびウイルス感染性の低減の両方を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項６５に記載のキメラまたは請求項６６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  69. ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製の遮断を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項６５に記載のキメラまたは請求項６６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  70. ＲＮＡウイルス感染症の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項６５に記載のキメラまたは請求項６６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  71. 前記対象が、ヒトである、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024003300A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Aptadegrad, S.L. Dna aptamer conjugates recognizing and degrading coronavirus proteins
GB202214796D0 (en) 2022-10-07 2022-11-23 Tocris Cookson Ltd Compounds
GB202214800D0 (en) 2022-10-07 2022-11-23 Tocris Cookson Ltd Compounds

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
US6362276B1 (en) 1998-01-07 2002-03-26 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Degradable heterobifunctional poly(ethylene glycol) acrylates and gels and conjugates derived therefrom
US7192713B1 (en) 1999-05-18 2007-03-20 President And Fellows Of Harvard College Stabilized compounds having secondary structure motifs
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
BR0001870B1 (pt) 2000-05-29 2014-02-25 Peptídeo, processo de obtenção de peptídeo, formulação compreendendo peptídeo, método de prevenção de crescimento de parasitas, fungos e bactérias, método para inativar a endotoxina de bactérias gram-negativas
CN1187449C (zh) * 2003-06-05 2005-02-02 中国科学院上海药物研究所 可溶性sars病毒3cl蛋白酶的表达和纯化
PT2332968T (pt) 2003-11-05 2016-08-17 Harvard College Péptidos alfa-helicoidais adequados para a activação ou inibição da morte celular
JP5649825B2 (ja) 2007-01-31 2015-01-07 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 安定化させたｐ５３ペプチドおよびその使用法
WO2008106507A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 University Of South Florida Mdm2/mdmx inhibitor peptide
KR101525754B1 (ko) 2007-03-28 2015-06-09 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 스티칭된 폴리펩티드
WO2009042237A2 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Dana Farber Cancer Institute Methods and compositions for modulating bcl-2 family polypeptides
US8586707B2 (en) 2008-09-16 2013-11-19 The Research Foundation Of State University Of New York Stapled peptides and method of synthesis
EP2342222B1 (en) 2008-09-22 2018-03-21 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
JP2012509902A (ja) 2008-11-24 2012-04-26 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッド 改善された特性を有するペプチド模倣大環状分子
JP5731986B2 (ja) 2008-12-09 2015-06-10 ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート インコーポレイテッド Ｍｃｌ−１の特異的調節の方法及び組成物
CA3037721A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Structured viral peptide compositions and methods of use
JP2012532929A (ja) 2009-07-13 2012-12-20 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ 二機能性のステープリングされたポリペプチドおよびそれらの使用
US9297017B2 (en) 2010-06-08 2016-03-29 University Of Washington Methods and compositions for targeted protein degradation
WO2012065181A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Cancer therapies and diagnostics
US9517252B2 (en) 2011-09-09 2016-12-13 Agency For Science, Technology And Research p53 activating peptides
US9408885B2 (en) 2011-12-01 2016-08-09 Vib Vzw Combinations of therapeutic agents for treating melanoma
SG11201404648PA (en) 2012-02-15 2014-09-26 Aileron Therapeutics Inc Peptidomimetic macrocycles
WO2014052647A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 President And Fellows Of Harvard College Proline-locked stapled peptides and uses thereof
EP2904000A4 (en) 2012-10-01 2016-04-20 Agency Science Tech & Res PEPTIDES AND METHODS OF TREATING CANCER
KR101616603B1 (ko) 2012-10-11 2016-04-28 서울대학교산학협력단 메틸 데그론 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 수명 조절 방법
WO2014065760A1 (en) 2012-10-25 2014-05-01 Agency For Science, Technology And Research Methods for determining resistance against molecules targeting proteins
EP2912463A4 (en) 2012-10-25 2016-03-23 Agency Science Tech & Res METHODS FOR DETERMINING RESISTANCE AGAINST MOLECULES TARGETING PROTEINS
US9115184B2 (en) 2013-03-01 2015-08-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Light-inducible system for regulating protein stability
CN112972378A (zh) * 2014-09-24 2021-06-18 艾瑞朗医疗公司 拟肽大环化合物及其制剂
SG11201706562QA (en) 2015-02-13 2017-09-28 Agency Science Tech & Res NON-MEMBRANE DISRUPTIVE p53 ACTIVATING STAPLED PEPTIDES
EP3433261A4 (en) 2016-03-23 2019-12-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS, ASSAYS AND METHODS FOR TARGETING HDM2 AND HDMX FOR INVERTING P53 INHIBITION IN PEDIATRIC CANCERS
US20200354413A1 (en) 2017-12-15 2020-11-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized peptide-mediated targeted protein degradation

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