KR101616603B1 - 메틸 데그론 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 수명 조절 방법 - Google Patents
메틸 데그론 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 수명 조절 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 분리된 메틸 데그론 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 메틸 데그론 펩타이드를 이용한 단백질 수명 조절제 스크리닝 방법, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 메틸 데그론 펩타이드 또는 유전자를 이용한 단백질 수명 조절 방법, 단백질 발현 조절 방법 및 항암 치료 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 메틸 데그론 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 메틸 데그론 펩타이드를 이용한 단백질 수명 조절제 스크리닝 방법, 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 메틸 데그론 펩타이드 또는 유전자를 이용한 단백질 수명 조절 방법, 단백질 발현 조절 방법 및 항암 치료 방법에 관한 것이다.
종래에는 유비퀴틴에 의한 단백질의 수명조절에 대한 이해가 있었으나, 메틸화에 의한 단백질의 수명 조절에 대한 연구가 없었다. 본 발명에서는 ROR alpha(이하 'RORα'라 함)에 있는 히스톤과 유사한 서열이 단백질의 메틸화을 유도하고, 메틸화된 단백질이 EZH2 단백질((Enhancer of Zeste Homolog 2 lysine methyltransferse, 이하 'EZH2'이라 함)에 의하여 유비퀴틴화가 진행되면서 단백질의 분해가 활성화되는 것을 밝힌 것이다.
한국 특허 공개번호 2010-035891호에서는 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저온 유도성 유전자에서 H3 히스톤 단백질의 27번째 아미노산인 리신에서의 3중 메틸화(H3K27me3)를 탐색하는 것을 특징으로 하는 식물체의 저온 노출 여부를 탐색하는 방법에 관한 것이다. 상기 특허는 히스톤의 삼중 메틸화를 이용하여 식물체의 저온 노출 여부 탐색방법으로, 히스톤단백질의 27번째 아미노산의 리신에서 3중 메틸화을 탐색하는 방법이 개시되어 있다.
일본 특허 공개번호 2005-512033호에서는 히스톤의 메틸화 및 이러한 메틸화에 따른 전사의 조절에 대한 개시가 있다.
그러나 상기 문헌 어디에도 메틸화를 통하여 단백질의 수명을 조절하는 특정한 서열에 대한 개시가 없다. 본 발명자들은 '메틸 데그론'이라는 특정서열이 메틸화-의존 유비퀴틴화를 유도하여 종국적으로 단백질의 분해를 유발하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 분리된 메틸 데그론 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 메틸 데그론 펩타이드를 돌연변이화시킨 수명이 연장된 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 수명 조절제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드를 이용한 단백질의 수명 조절 방법 및 서열번호 2의 메틸 데그론 유전자 서열을 이용한 단백질의 발현 조절 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드 및 서열번호 2의 메틸 데그론 유전자를 이용한 항암 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메틸 데그론 유전자를 암호화하는 분리된 유전자를 제공하고, 메틸 데그론 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 숙주세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 제 1 의 형태는 분리된 메틸 데그론 펩타이드 및 이를 암호화하는 분리된 메틸 데그론 유전자를 제공하고, 상기 메틸 데그론 유전자를 이용한 항암 치료 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 메틸 데그론 펩타이드는 서열번호 1이고, 메틸 데그론 유전자는 서열번호 2이다.
'메틸 데그론 펩타이드'는 ROR alpha(이하 'RORα'라 함)에 있는 히스톤과 유사한 서열을 포함하는 것을 말하고, 상기 서열에서 EZH2((Enhancer of Zeste Homolog 2 lysine methyltransferse)에 의하여 단백질의 메틸화가 유도되고, 메틸화된 단백질은 DCAF1(DDB1-CUL4-associated factor 1 adaptor)에 의하여 인식되며, 유비퀴틴-의존적 단백질 분해에 관여한다.
보다 상세하게는, 상기 메틸 데그론 유전자를 돌연변이시켜 항암관련 단백질의 수명을 연장하는 것을 특징으로 하는 항암 치료 방법 또는 상기 메틸 데그론 유전자를 이용하여 발암관련 단백질의 수명을 단축하는 것을 특징으로 하는 항암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제 2 의 형태는 메틸 데그론 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 수명이 감축된 융합 단백질이며, 발암 효과가 있는 것을 특징으로 하는 단백질을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 '융합 단백질'이라는 용어는 분리된 단백질을 코딩하는 두 개 이상의 유전자를 조합하여 만들어지는 단백질을 말하는 것으로서, 융합된 유전자의 번역은 하나의 폴리펩타이드가 된다.
본 발명의 제 3 의 형태는 메틸 데그론 펩타이드를 돌연변이화시킨 수명이 연장된 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 수명이 연장되어 항암 효과를 가져오는 단백질을 제공한다.
상기 돌연변이는 위치 선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 시키는 방법으로 메틸 데그론 펩타이드에서 돌연변이되면 EZH2에 의하여 메틸화가 되지 않으므로, DCAF1에 의하여 인식될 수 없어 유비퀴틴-의존적 단백질 분해가 일어나지 않음으로서 단백질의 수명이 연장된다.
본 발명의 제 4 의 형태는 a. 세포를 배양하는 단계; b. 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계; c. 메틸 데그론 펩타이드의 메틸화 정도를 탐색하는 단계; 및 d. 상기 메틸화 정도가 증가하면 단백질 수명 감축제로 판단하고, 상기 메틸화 정도가 감소하면 단백질 수명 증가제로 판단하는 단계;를 포함하는 단백질 수명 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 메틸화 분석은 면역화학적 방법, 방사선 동위원소 물질을 이용하는 방법, 전기영동에 따른 분자량 차이에 기초하는 방법 또는 형광염색물질을 이용하여 확인하는 방법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법일 수 있다.
본 발명의 제 5 의 형태는 a. 세포를 배양하는 단계; b. 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계; c. 메틸 데그론 펩타이드의 메틸화 정도를 탐색하는 단계; d. 상기 메틸화 정도가 증가하면 단백질 수명이 감축되고, 상기 메틸화 정도가 감소하면 단백질 수명이 증가되는 것으로 판단하는 단계; 및 e. 상기 메틸화된 단백질이 발암 관련 단백질이고, 상기 발암 단백질의 수명이 단축되는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
보다 상세하게는, 상기 암은 유방암, 간암, 방광암, 자궁경부암, 대장암, 신장암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 위암, 자궁암에서 선택되는 어느 하나의 암일 수 있다.
본 발명의 제 6 의 형태는 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드를 이용한 단백질의 수명 조절 방법 및 서열번호 2의 메틸 데그론 유전자 서열을 이용한 단백질 발현 조절 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 메틸 데그론 펩타이드가 포함되면 단백질 수명이 단축되고, 메틸 데그론 펩타이드가 돌연변이가 된 경우에는 단백질 수명이 연장되는 것이다.
본 발명의 제 7 의 형태는 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드를 이용한 항암 치료 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 상기 메틸 데그론 펩타이드 서열을 돌연변이화시켜 항암관련 단백질의 수명을 연장하는 것을 특징으로 하는 항암 치료 방법 또는 상기 메틸 데그론 펩타이드 서열을 포함시켜 발암관련 단백질의 수명을 단축하는 것을 특징으로 하는 항암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제 8 의 형태는 상기 메틸데그론 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 '벡터'라는 용어는 또 다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. '발현벡터'란 용어는 상기 벡터에 의하여 운반되는 각 재조합형 유전자에 의하여 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.
본 발명의 제 9 의 형태는 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA 가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다. 적합한 형질전화세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.
본 발명에 따른 메틸 데그론은 단백질의 수명을 조절하는데 이용할 수 있는 새로운 서열로서 단백질의 수명 조절이 필요한 다양한 분야에서 이용 가능하다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 특히 암 치료 효과가 있기 위하여 단백질의 수명을 조절할 필요가 있을 경우에 상기 서열을 삽입하여 주거나 결실 또는 돌연변이를 시킴으로써 단백질의 수명을 조절하여 암치료에 효율적으로 사용가능하다.
도 1은 히스톤 H3K27-유사 서열-포함 단백질의 탐색과정을 나타낸다. RORα의 Homo sapiens(h) 및 Mus musculus(m) 형태의 히스톤 H3K27-유사 서열을 포함하는 RORα의 N-말단을 정렬하였다.
도 2는 HEK-293 세포를 Flag-RORαWT 또는 K38A 돌연변이체를 위한 발현 구조체로 형질이입한 것을 나타낸다. 공동-면역침전 분석을 항-리신 메틸 항체를 사용하여 수행했고, 침전물을 RORα을 찾기 위하여 항-플라그 항체로 면역블랏(immunoblot)으로 분석하였다.
도 3은 MG132로 처리된 HEK-293세포에서 내생의 RORα와 EZH2 사이의 상호작용을 공동-면역침전분석으로 본 결과이다.
도 4는 GST 또는 GST-EZH2를 이용하여 메틸트랜스퍼라아제 분석 후에 RORα WT 및 K38A의 질량분석 결과를 나타낸다.
도 5는 단일-, 이중-, 또는 삼중-메틸 RORαK38의 특이성을 닷 블랏 분석 결과를 보여준다.
도 6은 플래그-히스톤 H3을 HEK-293 세포에서 발현하였고, 항-플래그 항체로 EZH2의 존재 또는 부존재하에서 면역침전한 결과를 나타낸다. H3K27 메틸화를 항-H3K27me2 및 H3K27me3 항체를 사용하여 면역블랏을 이용하여 측정하였다.
도 7은 면역침강 분석을 MG132와 EZH2의 존재 또는 부존재하에서 항-RORα항체를 사용하여 수행한 결과를 나타낸다.
도 8은 플래그-RORα WT 또는 K38A 돌연변이체를 HEK-293 세포에서 발현하였고, 항-플래그 항체로 면역침전한 후에 항-RORαme1 항체로 면역블랏한 결과를 나타낸다.
도 9는 EZH2에 대한 siRNA 및 GFT, miR101에 대한 대조구 siRNA을 플래그-RORα WT 및 K38A 돌연변이체와 함께 형질이입한 결과를 나타낸다. 항-플래그 항체로 면역침강한 후에 RORα의 단일-메틸화 정도를 항-RORαme1 항체로 관측한 결과를 나타낸다.
도 10은 WT 및 Ezh2-결핍(KO) MEF에서 EZH2 및 RORα 단백질 수준을 비교한 결과이다.
도 11은 Ezh2 KO MEF를 WT 또는 EZH2의 촉매적으로 비활성인 돌연변이(MT)로 재구성한 것을 나타낸다. 그리고 RORα 단백질의 수준 변화를 관찰하였다.
도 12는 ROR α 및 EZH2의 mRNA 수준을 WT 및 Ezh2 KO MEF에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 13 및 도 14는 HEK-293 세포를 지시된 siRNAs(도 13)로 , EZH2 WT/MT 발현 구조체(도 14)로 형질이입하였고, 시료를 사이크로헥시미드(20 ㎍/ml) 처리후에 지정된 시간에 RORα 단백질의 수준을 결정하기 위하여 수집한 결과를 나타낸다.
도 15는 RORα와 EZH2 WT 또는 MT와의 결합 친화도를 측정한 결과이다.
도 16은 플래그-RORα, HisMax-유비퀴틴 또는 EZH2 WT 또는 MT로 공동형질이입된 HEK-293 세포로부터의 단백질 추출물을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다.
도 17은 RORα WT 및 K38A 돌연변이체의 반감기를 HEK-293 세로에서 비교한 결과를 나타낸다. 형질이입된 세포를 사이클로헥시미드(20 ㎍/ml)으로 처리하고, 지정된 시간에 수집되어, RORα의 단백질 수준을 결정하기 위하여 면역블랏하였다.
도 18은 HisMax-유비퀴틴과 함께 플래그-RORα WT 또는 K38A 돌연변이체로 공동 형질이입된 HEK-293으로부터의 단백질 추출물을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다. RORα의 유비퀴틴화를 항-플래그 항체로 결정하였다.
도 19는 면역블랏을 MCF7 세포 내에서 DZNep(1 μM, 24시간)의 존재 또는 부존재하에서 EZH2 및 RORα 단백질 수준을 관측하기 위해서 수행한 결과를 나타낸다.
도 20은 RORα 유비퀴틴화 분석을 HEK-293T 세포내에서DZNep(1 μM, 24시간)의 존재 또는 부존재하에서 수행한 결과를 나타낸다.
도 21은 RORα-상호작용 단백질을 항-플래그 항체로 공동-면역침전하여, MG132의 존재하에서 플래그-RORα을 안정하게 발현하는 HEK-293 세포로부터 추출한 결과를 나타낸다. 음성 대조구로서, 플래그 공(empty) 벡터를 발현하는 세포를 사용했다. 결합된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 녹이고, LC-MS/MS 분석을 위해 준비했다. DCAF1 (DDB1-CUL4-associated factor 1 adaptor) 및 DDB1(damage-specific DNA binding protein 1)을 RORα-상호작용 단백질로 관측했다.
도 22는 RORα와 DCAF1 또는 DDB1의 결합을 면역블랏 분석에 의해 용출물로부터 관측한 결과를 나타낸다.
도 23은 4시간 동안 20 μM의 MG132로 처리된 HEK-293 세포에서 DCAF1 및 RORα의 공동-면역침전한 결과를 나타낸다. EZH2 WT의 과발현은 DCAF1과 RORα의 결합을 증가시켰으나 EZH2 MT의 과발현은 그렇지 않았다.
도 24는 DCAF1과 RORαWT 또는 K38A 돌연변이체의 결합 친화도를 MG132로 처리된 지정된 구조체를 발현하는 HEK-293세포에서 분석한 결과를 나타낸다.
도 25는 HEK-293 세포를 MG132의 존재하에서 EZH2 shRNA 및 지시된 발현 구조체로 형질이입 시킨 결과를 나타낸다.
도 26은 DCAF1 및 RORα 단백질 수준을 WT와 Dcaf1-결핍 MEF 사이에서 비교한 결과를 나타낸다.
도 27은 RORα, HisMax-유비퀴틴 및 DCAF1으로 공동형질이입한 HEK-293 세포로부터 단백질 추출물을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다.
도 28은 EZH2에 의해 증강된 RORα유비퀴틴화가 DCAF1 녹다운에 의해 감소된 결과를 나타낸다.
도 29는 DCAF1 또는 DDB1의 녹다운은 RORα에 CUL4B의 결합을 감소시키는 결과를 나타낸다.
도 30은 DDB1에 의해 매개되는 RORα의 유비퀴틴화는 EZH2의 녹다운에 의해 감소된 결과를 나타낸다.
도 31은 HEK-293 세포를 플래그-CUL4A 또는 CUL4B로 형질이입시키고, 공동-면역침전 분석을 항-플래그 항체로 EZH2의 존재 또는 부존재하에서 수행하고, 항-RORα항체를 이용하여 면역블랏을 수행한 결과를 나타낸다.
도 32는 CUL4B의 녹다운은 RORα 단백질 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 33은 RORα의 유비퀴틴화를 CUL4B에 의해서 증가됨을 나타낸다.
도 34는 CUL4B에 의한 증가된 RORα유비퀴틴화는 EZH2의 녹다운에 의해서 상당히 감소함을 나타낸다.
도 35는 HP1, Pc 및 MRG15로부터의 크로모 도메인과 잠정적인 cDCAF1과의 서열 비교를 나타낸다. 엄격하게 보존된 방향족 잔기를 노란색 박스로 하일라이트하였다.
도 36은 RORα 단백질(빨강)에 결합된 cDCAF1(초록)의 모델을 Pc(파랑) 및 HP1(분홍)의 크로모 도메인과 겹쳐보였다. cDCAF1의 네개의 소수성 잔기(Y563, Y578, P580 및 Y584)와 다른 단백질의 중첩된 잔기를 스틱 모델에서 나타내었고, 표시하였다. RORα 펩타이드의 메틸화된 K38을 스틱 모델에서 또한 나타내었다. K38의 메틸 그룹은 오랜지색으로 보였다.
도 37은 GST-DCAF1 WT 및 크로모 도메인 돌연변이체(Y563A, Y578A, P580A 및 Y584A)의 RORα K38me0, RORα38me1, H3K27me0 및 H3K27me3에의 결합을 시험관내 결합분석에 의해서 결정한 결과를 나타낸다.
도 38은 바이오틴화된 RORα K38me0 및 me1 단백질을 스트렙타비딘-컨쥬게이트된 세파로즈 비드에 고정화하였다. GST 및 GST-DCAF1 크로모 융합 단백질을 상기 비드에 첨가했고, 결합 분획을 면역블랏 분석한 결과를 나타낸다.
도 39는 HP1, Pc, DCAF1 및 변형된 DCAF1의 크로모 도메인의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 삽입된 아미노산 서열을 서열 정렬에서 노란색 박스로 하일라이트하였다.
도 40은 리신의 삼중-메틸 아미노 그룹에 결합된 변형된 DCAF1(라임색)의 모델화된 크로모 도메인을 Pc(파랑)의 크로모 도메인과 비교한 결과를 나타낸다. Y578^G579insK는 Y578과 G579사이에 삽입된 리신 잔기를 나타내고 Y584^W585insNK 는 Y584와 W585사이에 삽입된 아스파트산 및 트레오닌 잔기를 나타낸다.
도 41은 DCAF1의 K/NT-삽입된, K-삽입된 또는 NT-삽입된 돌연변이체와 RORα K38me0, RORαK38me1, H3K27me0 또는 H3K27me3 펩타이드와의 결합을 시험관내 결합 분석에 의해 측정한 결과를 나타낸다.
도 42는 RORα/H3 키메라 단백질의 도식적인 표현을 나타낸다.
도 43 및 도 44는 세포를 플래그-RORα WT 또는 RORα/H3 키메라 돌연변이체로 형질이입시켰다. 세포 추출물을 항-플래그 항체로 면역침강시키고, 항-EZH2(도 43) 및 항-DCAF1 항체(도 44)에 대해 면역블랏 분석을 수행하였다.
도 45는 세포를 HA-DCAF1 크로모 도메닌의 존재 또는 부존재하에서 RORαWT, K38A 또는 RORα/H3 키메라 돌연변이체로 형질이입시켰다. 면역침강분석을 항-HA 항체로 수행했고 및 결합 RORα를 항-플래그 항체로 면역블랏 분석에 의해 관찰한 결과를 나타낸다.
도 46은 세포를 EZH2 또는 MT 어느 하나로 형질이입하였고, 세포 추출물을 항-플래그 항체로 면역침강시켰다. 단일-메틸화된 RORα K38 수준 및 삼중-메틸화된 H3K27 수준을 항-RORαme1 항체 및 항-H3K27me3 항체 각각으로 관측한 결과를 나타낸다.
도 47은 플래그-RORα 또는 플래그-RORα/H3 키메라 돌연변이체, EZH2 WT 또는 ΔSET 돌연변이체로 공동형질이입된 세포로부터 단백질 추출물 및 HisMax-유비퀴틴을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다. RORα의 유비퀴틴화를 항-플래그 항체로 분석하였다.
도 48은 H3/RORα 키메라 돌연변이체의 도식적인 표현을 나타낸다.
도 49 및 도 50는 세포를 GFG-H3 WT 또는 H3/RORα 키메라 단백질로 형질이입하였다. 세포 추출물을 항-GFP 항체로 면역침강시키고 항-EZH2(도 49) 및 항-DCAF1(도 50) 항체에 대한 면역블랏을 하였다.
도 51은 EZH의 과량발현은 H3/RORα키메라 단백질의 단일-메틸화를 증가시켰음을 나타낸다.
도 52는 GFP-H3 WT 또는 GFP-H3/RORα 키메라 돌연변이체, EZH2 WT 또는 ΔSET 돌연변이체로 공동 형질이입된 세포로부터의 단백질 추출물과 HixMax-유비퀴틴을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다. RORα의 유비퀴틴화를 항-플래그 항체로 분석하였다.
도 53 내지 55는 RORE-루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 지정된 플라스미드로 293T 세포 내로 형질이입하였다. 루시퍼라아제 활성을 형질이입 후 48시간에 측정하였고, β-갈락토시다아제 활성에 의해 정상화하였다. 수치를 세 번의 독립 실험에 대한 평균±표준편차로 표현하였다. MG132(20μM)을 24 동안 처리하였다.
도 56은 5X RORE-루시퍼라아제 리포터 플라스미드을 RORα 및 DCAF1에 대한 siRNA로 293T 세포로 형질이입한 것을 나타낸다. 면역블랏 분석을 RORα및 DCAF1 단백질 수준을 측정하기 위해서 수행했다. 수치를 세 번의 독립 실험에 대한 평균±표준편차로 표현하였다.
도 57은 CHip 분석을 MCF7 세포에서 대조구 shRNA 또는 EZH shRNA의 존재하에서 p21 또는 GADD45 프로모터위에서 수행하였다.
도 58 내지 60은 공벡터 또는 RORα을 안정적으로 발현하는(도 58) 또는 대조구 siRNA 또는 DCAF1 siRNA로 형질이입된(도 59) 그리고 연질 아가에서 비클 또는 DZNep(2μM)로 처리된(도 60) MCF7 유방암 세포의 부착-비의존성 성장을 나타낸다. 대표적인 이미지를 각각을 그룹에 나타내었다. 면역블랏 분석을 각각 단백질 수준을 측정하기 위해서 수행하였다.
도 61은 정상 조직 시료(N)과 함께 인간 유방 육종 조직 시료(T)에서 RORα 및 EZH2의 면역블랏 결과를 나타낸다.
도 62는 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 계산된 상응되는 정상 조직과 비교하여 인간의 유방 육종 시료에서 β-액틴에 대한 ROR 또는 EZH2의 비율의 통계적 분석을 나타낸다. 데이타를 관측된 모든 세포의 메디안 및 50%(바) 및 99.3%(휘스커)의 분포를 보이는 휘스커 그래프로 나타내었다. ** P<0.05 및 *** P<0.005. 보여진 것은 인간의 유방 육종 시료로부터 단백질 발현 분석의 종합을 나타낸다.
도 63은 메틸-디그론을 특이적으로 인식하는 메틸 리더로서 역할을 하고, DDBq/CUL4-의존 유비퀴틴화 및 이에 연속적인 26S 프로테아좀에 의해 RORα의 분해를 하는 DCAF1에 대한 제안된 모델을 나타낸다.
도 2는 HEK-293 세포를 Flag-RORαWT 또는 K38A 돌연변이체를 위한 발현 구조체로 형질이입한 것을 나타낸다. 공동-면역침전 분석을 항-리신 메틸 항체를 사용하여 수행했고, 침전물을 RORα을 찾기 위하여 항-플라그 항체로 면역블랏(immunoblot)으로 분석하였다.
도 3은 MG132로 처리된 HEK-293세포에서 내생의 RORα와 EZH2 사이의 상호작용을 공동-면역침전분석으로 본 결과이다.
도 4는 GST 또는 GST-EZH2를 이용하여 메틸트랜스퍼라아제 분석 후에 RORα WT 및 K38A의 질량분석 결과를 나타낸다.
도 5는 단일-, 이중-, 또는 삼중-메틸 RORαK38의 특이성을 닷 블랏 분석 결과를 보여준다.
도 6은 플래그-히스톤 H3을 HEK-293 세포에서 발현하였고, 항-플래그 항체로 EZH2의 존재 또는 부존재하에서 면역침전한 결과를 나타낸다. H3K27 메틸화를 항-H3K27me2 및 H3K27me3 항체를 사용하여 면역블랏을 이용하여 측정하였다.
도 7은 면역침강 분석을 MG132와 EZH2의 존재 또는 부존재하에서 항-RORα항체를 사용하여 수행한 결과를 나타낸다.
도 8은 플래그-RORα WT 또는 K38A 돌연변이체를 HEK-293 세포에서 발현하였고, 항-플래그 항체로 면역침전한 후에 항-RORαme1 항체로 면역블랏한 결과를 나타낸다.
도 9는 EZH2에 대한 siRNA 및 GFT, miR101에 대한 대조구 siRNA을 플래그-RORα WT 및 K38A 돌연변이체와 함께 형질이입한 결과를 나타낸다. 항-플래그 항체로 면역침강한 후에 RORα의 단일-메틸화 정도를 항-RORαme1 항체로 관측한 결과를 나타낸다.
도 10은 WT 및 Ezh2-결핍(KO) MEF에서 EZH2 및 RORα 단백질 수준을 비교한 결과이다.
도 11은 Ezh2 KO MEF를 WT 또는 EZH2의 촉매적으로 비활성인 돌연변이(MT)로 재구성한 것을 나타낸다. 그리고 RORα 단백질의 수준 변화를 관찰하였다.
도 12는 ROR α 및 EZH2의 mRNA 수준을 WT 및 Ezh2 KO MEF에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 13 및 도 14는 HEK-293 세포를 지시된 siRNAs(도 13)로 , EZH2 WT/MT 발현 구조체(도 14)로 형질이입하였고, 시료를 사이크로헥시미드(20 ㎍/ml) 처리후에 지정된 시간에 RORα 단백질의 수준을 결정하기 위하여 수집한 결과를 나타낸다.
도 15는 RORα와 EZH2 WT 또는 MT와의 결합 친화도를 측정한 결과이다.
도 16은 플래그-RORα, HisMax-유비퀴틴 또는 EZH2 WT 또는 MT로 공동형질이입된 HEK-293 세포로부터의 단백질 추출물을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다.
도 17은 RORα WT 및 K38A 돌연변이체의 반감기를 HEK-293 세로에서 비교한 결과를 나타낸다. 형질이입된 세포를 사이클로헥시미드(20 ㎍/ml)으로 처리하고, 지정된 시간에 수집되어, RORα의 단백질 수준을 결정하기 위하여 면역블랏하였다.
도 18은 HisMax-유비퀴틴과 함께 플래그-RORα WT 또는 K38A 돌연변이체로 공동 형질이입된 HEK-293으로부터의 단백질 추출물을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다. RORα의 유비퀴틴화를 항-플래그 항체로 결정하였다.
도 19는 면역블랏을 MCF7 세포 내에서 DZNep(1 μM, 24시간)의 존재 또는 부존재하에서 EZH2 및 RORα 단백질 수준을 관측하기 위해서 수행한 결과를 나타낸다.
도 20은 RORα 유비퀴틴화 분석을 HEK-293T 세포내에서DZNep(1 μM, 24시간)의 존재 또는 부존재하에서 수행한 결과를 나타낸다.
도 21은 RORα-상호작용 단백질을 항-플래그 항체로 공동-면역침전하여, MG132의 존재하에서 플래그-RORα을 안정하게 발현하는 HEK-293 세포로부터 추출한 결과를 나타낸다. 음성 대조구로서, 플래그 공(empty) 벡터를 발현하는 세포를 사용했다. 결합된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 녹이고, LC-MS/MS 분석을 위해 준비했다. DCAF1 (DDB1-CUL4-associated factor 1 adaptor) 및 DDB1(damage-specific DNA binding protein 1)을 RORα-상호작용 단백질로 관측했다.
도 22는 RORα와 DCAF1 또는 DDB1의 결합을 면역블랏 분석에 의해 용출물로부터 관측한 결과를 나타낸다.
도 23은 4시간 동안 20 μM의 MG132로 처리된 HEK-293 세포에서 DCAF1 및 RORα의 공동-면역침전한 결과를 나타낸다. EZH2 WT의 과발현은 DCAF1과 RORα의 결합을 증가시켰으나 EZH2 MT의 과발현은 그렇지 않았다.
도 24는 DCAF1과 RORαWT 또는 K38A 돌연변이체의 결합 친화도를 MG132로 처리된 지정된 구조체를 발현하는 HEK-293세포에서 분석한 결과를 나타낸다.
도 25는 HEK-293 세포를 MG132의 존재하에서 EZH2 shRNA 및 지시된 발현 구조체로 형질이입 시킨 결과를 나타낸다.
도 26은 DCAF1 및 RORα 단백질 수준을 WT와 Dcaf1-결핍 MEF 사이에서 비교한 결과를 나타낸다.
도 27은 RORα, HisMax-유비퀴틴 및 DCAF1으로 공동형질이입한 HEK-293 세포로부터 단백질 추출물을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다.
도 28은 EZH2에 의해 증강된 RORα유비퀴틴화가 DCAF1 녹다운에 의해 감소된 결과를 나타낸다.
도 29는 DCAF1 또는 DDB1의 녹다운은 RORα에 CUL4B의 결합을 감소시키는 결과를 나타낸다.
도 30은 DDB1에 의해 매개되는 RORα의 유비퀴틴화는 EZH2의 녹다운에 의해 감소된 결과를 나타낸다.
도 31은 HEK-293 세포를 플래그-CUL4A 또는 CUL4B로 형질이입시키고, 공동-면역침전 분석을 항-플래그 항체로 EZH2의 존재 또는 부존재하에서 수행하고, 항-RORα항체를 이용하여 면역블랏을 수행한 결과를 나타낸다.
도 32는 CUL4B의 녹다운은 RORα 단백질 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 33은 RORα의 유비퀴틴화를 CUL4B에 의해서 증가됨을 나타낸다.
도 34는 CUL4B에 의한 증가된 RORα유비퀴틴화는 EZH2의 녹다운에 의해서 상당히 감소함을 나타낸다.
도 35는 HP1, Pc 및 MRG15로부터의 크로모 도메인과 잠정적인 cDCAF1과의 서열 비교를 나타낸다. 엄격하게 보존된 방향족 잔기를 노란색 박스로 하일라이트하였다.
도 36은 RORα 단백질(빨강)에 결합된 cDCAF1(초록)의 모델을 Pc(파랑) 및 HP1(분홍)의 크로모 도메인과 겹쳐보였다. cDCAF1의 네개의 소수성 잔기(Y563, Y578, P580 및 Y584)와 다른 단백질의 중첩된 잔기를 스틱 모델에서 나타내었고, 표시하였다. RORα 펩타이드의 메틸화된 K38을 스틱 모델에서 또한 나타내었다. K38의 메틸 그룹은 오랜지색으로 보였다.
도 37은 GST-DCAF1 WT 및 크로모 도메인 돌연변이체(Y563A, Y578A, P580A 및 Y584A)의 RORα K38me0, RORα38me1, H3K27me0 및 H3K27me3에의 결합을 시험관내 결합분석에 의해서 결정한 결과를 나타낸다.
도 38은 바이오틴화된 RORα K38me0 및 me1 단백질을 스트렙타비딘-컨쥬게이트된 세파로즈 비드에 고정화하였다. GST 및 GST-DCAF1 크로모 융합 단백질을 상기 비드에 첨가했고, 결합 분획을 면역블랏 분석한 결과를 나타낸다.
도 39는 HP1, Pc, DCAF1 및 변형된 DCAF1의 크로모 도메인의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 삽입된 아미노산 서열을 서열 정렬에서 노란색 박스로 하일라이트하였다.
도 40은 리신의 삼중-메틸 아미노 그룹에 결합된 변형된 DCAF1(라임색)의 모델화된 크로모 도메인을 Pc(파랑)의 크로모 도메인과 비교한 결과를 나타낸다. Y578^G579insK는 Y578과 G579사이에 삽입된 리신 잔기를 나타내고 Y584^W585insNK 는 Y584와 W585사이에 삽입된 아스파트산 및 트레오닌 잔기를 나타낸다.
도 41은 DCAF1의 K/NT-삽입된, K-삽입된 또는 NT-삽입된 돌연변이체와 RORα K38me0, RORαK38me1, H3K27me0 또는 H3K27me3 펩타이드와의 결합을 시험관내 결합 분석에 의해 측정한 결과를 나타낸다.
도 42는 RORα/H3 키메라 단백질의 도식적인 표현을 나타낸다.
도 43 및 도 44는 세포를 플래그-RORα WT 또는 RORα/H3 키메라 돌연변이체로 형질이입시켰다. 세포 추출물을 항-플래그 항체로 면역침강시키고, 항-EZH2(도 43) 및 항-DCAF1 항체(도 44)에 대해 면역블랏 분석을 수행하였다.
도 45는 세포를 HA-DCAF1 크로모 도메닌의 존재 또는 부존재하에서 RORαWT, K38A 또는 RORα/H3 키메라 돌연변이체로 형질이입시켰다. 면역침강분석을 항-HA 항체로 수행했고 및 결합 RORα를 항-플래그 항체로 면역블랏 분석에 의해 관찰한 결과를 나타낸다.
도 46은 세포를 EZH2 또는 MT 어느 하나로 형질이입하였고, 세포 추출물을 항-플래그 항체로 면역침강시켰다. 단일-메틸화된 RORα K38 수준 및 삼중-메틸화된 H3K27 수준을 항-RORαme1 항체 및 항-H3K27me3 항체 각각으로 관측한 결과를 나타낸다.
도 47은 플래그-RORα 또는 플래그-RORα/H3 키메라 돌연변이체, EZH2 WT 또는 ΔSET 돌연변이체로 공동형질이입된 세포로부터 단백질 추출물 및 HisMax-유비퀴틴을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다. RORα의 유비퀴틴화를 항-플래그 항체로 분석하였다.
도 48은 H3/RORα 키메라 돌연변이체의 도식적인 표현을 나타낸다.
도 49 및 도 50는 세포를 GFG-H3 WT 또는 H3/RORα 키메라 단백질로 형질이입하였다. 세포 추출물을 항-GFP 항체로 면역침강시키고 항-EZH2(도 49) 및 항-DCAF1(도 50) 항체에 대한 면역블랏을 하였다.
도 51은 EZH의 과량발현은 H3/RORα키메라 단백질의 단일-메틸화를 증가시켰음을 나타낸다.
도 52는 GFP-H3 WT 또는 GFP-H3/RORα 키메라 돌연변이체, EZH2 WT 또는 ΔSET 돌연변이체로 공동 형질이입된 세포로부터의 단백질 추출물과 HixMax-유비퀴틴을 Ni2 +-NTA 비드로 떨어뜨리도록 한 결과를 나타낸다. RORα의 유비퀴틴화를 항-플래그 항체로 분석하였다.
도 53 내지 55는 RORE-루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 지정된 플라스미드로 293T 세포 내로 형질이입하였다. 루시퍼라아제 활성을 형질이입 후 48시간에 측정하였고, β-갈락토시다아제 활성에 의해 정상화하였다. 수치를 세 번의 독립 실험에 대한 평균±표준편차로 표현하였다. MG132(20μM)을 24 동안 처리하였다.
도 56은 5X RORE-루시퍼라아제 리포터 플라스미드을 RORα 및 DCAF1에 대한 siRNA로 293T 세포로 형질이입한 것을 나타낸다. 면역블랏 분석을 RORα및 DCAF1 단백질 수준을 측정하기 위해서 수행했다. 수치를 세 번의 독립 실험에 대한 평균±표준편차로 표현하였다.
도 57은 CHip 분석을 MCF7 세포에서 대조구 shRNA 또는 EZH shRNA의 존재하에서 p21 또는 GADD45 프로모터위에서 수행하였다.
도 58 내지 60은 공벡터 또는 RORα을 안정적으로 발현하는(도 58) 또는 대조구 siRNA 또는 DCAF1 siRNA로 형질이입된(도 59) 그리고 연질 아가에서 비클 또는 DZNep(2μM)로 처리된(도 60) MCF7 유방암 세포의 부착-비의존성 성장을 나타낸다. 대표적인 이미지를 각각을 그룹에 나타내었다. 면역블랏 분석을 각각 단백질 수준을 측정하기 위해서 수행하였다.
도 61은 정상 조직 시료(N)과 함께 인간 유방 육종 조직 시료(T)에서 RORα 및 EZH2의 면역블랏 결과를 나타낸다.
도 62는 페어드 스튜던트 t-테스트에 의해 계산된 상응되는 정상 조직과 비교하여 인간의 유방 육종 시료에서 β-액틴에 대한 ROR 또는 EZH2의 비율의 통계적 분석을 나타낸다. 데이타를 관측된 모든 세포의 메디안 및 50%(바) 및 99.3%(휘스커)의 분포를 보이는 휘스커 그래프로 나타내었다. ** P<0.05 및 *** P<0.005. 보여진 것은 인간의 유방 육종 시료로부터 단백질 발현 분석의 종합을 나타낸다.
도 63은 메틸-디그론을 특이적으로 인식하는 메틸 리더로서 역할을 하고, DDBq/CUL4-의존 유비퀴틴화 및 이에 연속적인 26S 프로테아좀에 의해 RORα의 분해를 하는 DCAF1에 대한 제안된 모델을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험절차 및 방법
항체
다음의 상업적으로 입수가능한 항체가 사용되었다: RORα(Santa Cruz Biotechnology), FLAG (Sigma), EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2 lysine methlytransferase, BD Biosciences), Xpress (Invitrogen), DDB1(damage-specific DNA binding protein 1), CUL4B(cullin4B), DCAF1(DDB1-CUL4-associated factor 1), H3K27me2, H3K27me3, 및 메틸-Lys 항체(Abcam). RORαK38me1, RORαK38me2, 및 RORαK38me3 항체를 Abmart (중국)에 의해 생산되었다.
플라스미드 제조 및 사이트-
디렉티드
돌연변이화
RORαK38A 돌연변이 및 여러 가지 GST-DCAF1 크로모 도메인 돌연변이(Y563A, Y578A, P580A, 및 Y584A)를 nPfu-포르테 DNA 중합효소(Enzynomics)를 이용하여 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 이용하여 생산하였다.
3X-Flag-CMV-RORα 및 GST-DCAF1 크로모 도메인 WT를 주형으로 이용하였고, 각각의 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하였다.
액체 크로마토그래피-질량 분석기(
LC
-
MS
)
적은 양 (100 μM)의 합성 펩타이드(RORαWT)를 EZH2 효소(Enhancer of Zeste Homolog 2 lysine methyltransferse, 이하 'EZH2'이라 함)로 HMTase 분석에서 기질로 사용하였다; 반응은 10% TCA 침전으로 4 ℃에서 10분 동안 정지시켰다. 원심분리에 의해 침전물을 제거한 후, 상등액을 LC-MS로 분석하였다. 용출된 펩타이드는 50 mL/min의 유동 속도로 선형 구배(A: 100 % H2O, 0.1 % 포름산, B: 100 % ACN, 0.1 % 포름산)로 Luna 컬럼 (C18 PepMap 100, 150 X 1 mm 5 micron)으로 분리되었다.
전형적으로 2㎕의 시료가 사용되었다. 질량 분석은 나노-LC 시스템(NANOSPACE SI-2, Shiseido)과 연결된 선형 이온 트랩 질량분석기 (LCQ DECA XP, Thermo Finningan)로 수행했다. 이 질량분석방법은 한 번의 전체 질량분석 스캔(Mass range: 160-2000 m/z)과 함께 하나의 사이클로 하였다.
단백질 안정성 및 이미지 분석
세포는 여러 가지의 시간으로 20 ㎍/ml 사이클로 헥시미드로 처리되었고, 면역블랏 분석이 RORα 및 β-액틴 항체로 수행되었다. 이미지를 LSD-4000 미니 화학발광 이메져(FUJIFILM)를 사용하여 얻었고, 밴드 밀도는 제조자의 지시에 따라 Multi Gauge 스프트웨어(FUJIFILM)를 가진 덴시토미터로 정량분석하였다.
유비퀴틴화
분석
세포는 HisMax-유비퀴틴을 포함하는 플라스미드의 조합으로 형질이입하였다. 48시간 동안 항온반응 후에 세포를 MG132로 처리하고, 완충용액 A(6 M 구아니디니움-HCl, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, 0.01 M Tris-Cl [pH 8.0], 5 mM 이미다졸, 및 10 mM β-머캅토에탄올)로 분해되었고, 상온에서 4 시간 동안 Ni2 +-NTA 비드 (Qiagen)와 함께 항온반응되었다.
상기 비드는 연속적으로 완충용액 A, 완충용액 B (8 M urea, 0.1 M Na2PO4/NaH2PO4, 0.01 M Tris-Cl [pH 8.0], 및 10 mM β-머캅토에탄올) 및 완충용액 C(8 M urea, 0.1 M Na2PO4/NaH2PO4, 0.01 M Tris-Cl [pH 6.3], 및 10 mM β-머캅토에탄올)로 세척하였다. 결합된 단백질은 완충용액 D(200 mM 이미다졸, 0.15 M Tris-Cl [pH 6.7], 30 % 글리세롤, 0.72 M β-머캅토에탄올 및 5 % SDS)로 용출하였고, 면역블랏 분석을 하였다.
생체내
펩타이드
결합 분석
글루타치온-세파로즈 비드에 결합된 GST-태그된 DCAF1 크로모 도메인 WT 및 이의 돌연변이체를 준비했다. 상기 비드를 1 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드와 2 mM 디티오트레이톨이 보충된 1 ml의 결합 완충용액(10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4, 및 140 mM NaCl, pH 7.4))내에서 100 ㎍의 우태아혈청 알부민과 15 ㎍의 RORαK38me0, RORαK38me1, H3K27me0, 또는 H3K27me3 펩타이드와 혼합하였고, 뒤이어 상온에서 2시간 동안 항온반응되어졌다.
결합 완충용액으로 세척한 후 결합 단백질를 가진 단백질을 Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액내의 6.8 mg/ml의 글루타치온으로 용출하였고, 닷 블랏 분석에 의해 시각화되었다.
상동성
(
homology
)
모델링
RORα펩타이드(L31-S39)와 복합체를 이루고 있는 cDCAF1의 상동성 모델링은 DS MODELER(Sali and Blundell, 1993a)를 이용하여 수행하였다. HP (PDB id: 1KNA) 및 Pc (PDB id: 1PDQ)의 크로모 도메인을 주형으로 사용했고, 상기 주형의 H3 테일 펩타이드는 cDCAF1-RORα 모델링을 위한 RORα펩타이드로 치환하였다. HP (PDB id: 1KNA) 및 Pc (PDB id: 1PDQ)의 크로모 도메인을 주형으로 사용했고, 상기 주형에 있는 H3 테일 펩타이드는 cDCAF1-RORα 구조 모델링을 위한 RORα펩타이드로서 치환되었다. 제작된 모델은 CHARMm 포스필드(forcefield)로 DS CHARMm(Brooks et al., 1983) 표준 캐스캐이드 프로토콜로 모사하였다. 제한요소를 모사 동안에 cDCAF1의 모든 원자에 적용하였다. 익스플리시트 피리오딕 바운더리 모델(explicit periodic boundary model)을 수용액 상에서 분자를 용매화 하는데 사용하였다. 3000 스텝 최소화를 스티피스트 디선트 방법(steepest descent method)을 수행하였고, 뒤따라 3000 스텝 최소화를 컨쥬케이트 그라디언트 방법(conjugate gradient method)를 이용하여 수행하였다. 최소화한 후 복합체 구조를 300K까지 가열시켜 700ps 동안 평형화시켰다. 1ns 동안 300K에서 최종적으로 분자동력학적 모사를 수행하였다. 이런 모든 모사에서 시간 스텝은 1fs이고 분자 상호간 상호작용에 관련된 컷오프 거리는 14Å이다. 최종 모사의 가장 낮은 에너지 구조를 구조 분석을 위하여 선택하였다. 추가의 세개의 삽입(Y578^G579insK, Y584^W585insNT)을 포함하는 변형된 cDCAF1을 DS MODELER에서 모델화하였고, Pc의 크로모 도메인 위로 중첩시켰다. 삼중메틸화된 Lys을 포함하는 히스톤 펩타이드와의 복합체내에서 변형된 cDCAF1분자동력 모사를 위한 방법은 cDCAF1-RORα에서 기술한 것과 실질적으로 같다. 정제된 모델의 전체의 입체화학의 품질은 PROCHECK 프로그램에 의해 평가되었다(Laskowski et al., 1993).
세포 형질전환 분석
공벡터 또는 RORα를 안정적으로 발현하는 MCF 유방암 세포 또는 대조 siRNA 또는 DCAF1 siRNAs로 형질이입된 또는 DANep(2mM)의 존재 및 부존재하에서 처리된 세포의 비부착증식(anchorage-independent growth)을 연한천(soft aga)에서 콜로니 형성을 분석하여 결정하였다. 세포(105)를 5%의 CO2에서 3주 동안 10% FBS를 포함하는 0.4% 노블 아가(noble agar)를 포함하는 DMEM 배지에 놓았고, 100 μM보다 큰 콜로니를 계수하고 분석하였다.
인간의 유방암 조직 시료
인간의 조직 시료에서 RORα및 EZH2 단백질 발현의 분석을 위하여 43쌍의 신선한 냉동 유방암 조직 및 이에 매치되는 정상조직을 선택하였다. 상기 냉동된 신선한 인간 조직 시료는 서울대학교 병원으로부터 공급되었다. 면역블랏 이미지를 LSD-4000 미니 화학발광 이메져 (FUJIFILM)을 이용하여 얻었고, 밴드 밀도는 제조자의 지시에 따라 Multi Gauge 소프트웨어(FUJIFILM)로 정량화하였다.
<
실시예
1>
ROR
α의
K38
에서
EZH2
메틸트랜스퍼라아제
-매개 모노-메틸화
비록 어떤 메틸트랜스퍼라아제는 핵내의 히스톤 뿐만 아니라 전사인자 및 히스톤 변형자에 작용하는 것으로 보였지만, 같은 메틸트랜스퍼라아제에 대한 히스톤 및 비-히스톤 단백질에 대한 특별한 기질 특이성의 가능성에 대해서는 심도있게 연구되지 않았다. 이제까지 EZH2의 비-히스톤 기질에 대하여 알려진 바 없다는 가정하에, 히스톤 기질에 대한 기질 특이성을 발견 및 비교하기로 하였고, 이들에 대한 기초적인 기작을 밝히기로 하였다. EZH2에 의해서 메틸화되는 히스톤 H3K27의 지역, 즉 R-K-S 아미노산 서열에 비슷한 아미노산 서열을 컴퓨터를 이용하여 스크리닝 하였다(도 1). 상기 스크리닝을 통하여, 627개의 단백질 히트가 나왔고, 469개 단백질을 고려하였고, 이들은 레퍼러스 시쿼언스(RefSeq) 데이터베이스로부터 어노테이트 및 보호되었다. 어노테이션을 위한 데이타베이션, 시각화 및 직접화된 탐색(Annotation, Visualization and Integrated Discovery; DAVID) 생물정보학 리소스 (http://david.abcc.ncigcrf.gov/)는 많은 수의 유전자 리스트를 기능적으로 관련된 유전자 그룹으로 감소시켜 고속 대량 기술에 의해 생물학적 정보를 규명할 수 있도록 도와주는 신속한 수단을 제공한다. 따라서 DAVID를 이용하여 이들 단백질의 기능적인 어노테이션 및 클러스터링을 수행하였다. 단백질 기능의 여러 카테고리가 있는데, 발명자들은 전사 조절에 관여하는 52개의 단백질을 자세히 살펴보았다. 고아 핵 수용체(orphan nuclear receptor) RORα (Gigue et al., 1994; Hamilton et al., 1996; Kim et al., 2011; Lee et al., 2010)를 이들 그룹에서 나타는 세개의 핵 수용체로부터 선택하였다. "R-K-S" 서열은 RORα 의 N-말단 도메인에 위치하고 있었고, 메틸화에 대한 수용체로서 작용하는 것으로 예측되었다(도 1). 따라서 RORα에 있는 히스톤-유사 서열이 EZH2로 예시되는 H3K27 히스톤 메틸트랜스퍼라아제에 의해 RORα K38 메틸화가 될 수 있게 하고 리신 잔기가 알라닌 잔기로 대체되어 리신 메틸화가 없어진 K38A 돌연변이체를 만든다고 가정하였다. 공-면역침전 분석은 K38A 돌연변이가 RORα 메틸화를 없앴다는 것을 보였고, 이는 K38이 RORα의 메틸-수용체이라는 것을 제시한다 (도 2).
내생 수준의 RORα와 EZH2의 결합을 공동 면역침전 분석으로 확인하였다(도 3). EZH2에 의해 RORα가 메틸화되는지 여부를 확인하고, RORα의 메틸화 상태를 확인하기 위하여 RORα 의 31-40 아미노산을 가지고 있는 펩타이드(LNQESARKSE)를 시험관내에서 EZH2에 의해 메틸화시켰고, 질량분광법으로 분석하였다. 비-메틸화된 야생형(WT) 펩타이드는 1161.6 Da에서 주된 피크를 가졌고, EZH2로 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 분석 후에 모노-메틸화된 펩타이드는 펩타이드 샘플 준비동안에 결합되어진 K+의 38-Da 매스와 함께 1215 Da에서 나타났다(도 4). 한편, EZH2에 의해 RORα K38A의 메틸화 상태에 감지될 만한 변화는 없었다(도 4). 이를 종합하면, 이들 데이터는 EZH2는 K38 사이트에 하나의 메틸 그룹의 추가를 유도하는 것을 나타낸다. EZH2이 H3K27의 이중 및 삼중 메틸화의 히스톤 기질 특이성을 가지고 있기 때문에, 비-히스톤 기질인 RORα의 모노 메틸화의 예상치 못한 발견은 EZH2가 히스톤 및 비 히스톤 단백질의 구별되는 기질 특이성이 있는지 탐색하도록 하였다. 따라서, 발명자들은 RORα의 K38 단일-, 이중-, 또는 삼중-메틸-특이적 항체를 만들었고, 이들이 비-메틸화된 RORα 펩타이드와 교차 반응을 가지지 않도록 했다(도 5). EZH2는 주로 이중- 및 삼중-메틸화된 히스톤 H3K27을 생산할 수 있었지만(도 6), 단일-메틸화된 RORα만이 EZH2의 엑토픽(etopic) 발현으로 K38 사이트에서 발견되었다(도 7). 면역침전 분석은 RORα K38A 돌연변이가 항-RORα 단일-메틸 특이적 항체에 의해 인식되지 않았다(도 8). 더욱이, 특이적 siRNA 또는 miR101에 의한 EZH2의 녹다운은 RORα의 단일-메틸화의 현저한 감소를 일으켰다(도 9). 이러한 결과를 바탕으로, EZH2-의존 모노 메틸화는 RORα의 K38에서 발생된다고 결론을 내렸다.
<
실시예
2>
EZH2
-매개
ROR
α 메틸화는
ROR
α을 불안정화
EZH2-매개 RORα 리신 메틸화의 기능적인 결과를 밝히고자 하였다. WT와 EZH2-결핍(Ezh2-/-) 쥐의 배아 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblasts; MEFs)에서의 RORα의 단백질 발현을 비교하였다. 흥미롭게도, RORα 단백질 수준은 WT MEF에 비교하여서 Ezh2-/- MEF에서 상당한 정도로 더 증가하였다(도 10). EZH2 WT 또는 EZH2의 촉매적으로 불활성인 EZH2의 H689A 돌연변이(MT)의 재구성은 RORα 단백질 수준이 EZH2 WT-재구성된 EZH2-/- MEFs 에서만 감소된다는 것을 보여 주었다(도 11). 그러나 이러한 조건에서 RORα의 mRNA 수준은 영향을 받지 않았고(도 12), 이는 EZH2가 RORα 단백질의 안정성에 영향을 미친다는 것을 제시한다. 따라서 EZH2와 RORα 단백질 발현사이의 역상관 관계를 살펴보았다. 내재적인 RORα의 반감기는 단백질합성 억제제인 사이클로헥사미드(cycloheximide, CHX)의 처리로 EZH2의 녹다운에 의해서 상당히 증가하였다(도 13). EZH2의 효소활성이 RORα 단백질의 안정성을 조절하는데 직접적으로 필요한지를 조사하기 위해 EZH2 WT 또는 EZH2 MT를 과발현시켜 RORα의 반감기를 모니터링했다. EZH2 MT의 과량발현은 CHX로 처리된 세포에서 RORα의 반감기를 증가시켰고(도 14), 이는 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 RORα의 단백질 안정성의 조절에 필요하다는 것을 제시한다.
유비퀴틴-프로테아솜 경로가 RORα 분해에 관계되는지를 확인하고, 추가적으로 EZH2의 도입이 RORα의 메틸화의 증가를 허용함으로써 RORα 유비퀴틴화를 증가시켰는지 살펴보기 위해서, 26S 프로테아솜 억제제인 MG132의 존재할 때, EZH2로 RORα 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 비록 EZH2 WT 및 EZH2 MT 모두가 RORα에 쉽게 결합하였지만(도 15), EZH2 WT 만이 RORα 유비퀴틴화를 증가시킬 수 있었고(도 16), 이는 RORα 유비퀴틴화를 증가시키는 EZH2의 능력이 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 활성에 필요하다는 것을 보인다. 더욱이, RORα K38A 돌연변이는 단백질 수준을 상당히 안정화시켰고(도 17), 이는 RORα 분해는 K38 메틸화에 의존한다는 것을 보인다. K38 메틸화가 RORα 유비퀴틴화에 직접적으로 영향을 주는지 더 확인하기 위해서, MG132의 존재하에서 RORα WT 및 RORα K38A에 대한 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 실제로 RORα K38A 돌연변이는 RORα WT와 비교하여 볼 때, RORα 유비퀴틴화에서 상당한 감소를 가져왔다(도 18). 다음으로 DZNep에 의해 예시되는 EZH2 소분자 억제제가 EZH2-매개 RORα 분해를 없애는지 확인하였다. DZNep의 처리는 EZH2 단백질 수준을 감소시켰고, RORα 단백질 수준을 증가시켰다(도 19). DZNep의 존재 및 부존재하에서 RORα의 유비퀴틴화를 비교하였고, RORα 유비퀴틴화 수준은 DZNep 의 처리로 감소하는 것을 발견하였다(도 20). 이들을 종합하면, 이들 결과는 EZH2에 의한 K38 단일-메틸화는 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통한 RORα 분해의 전제조건이다.
<
실시예
3> 선택적으로 단일-메틸화된 기질을 인식하는
DCAF1
의 발견
크로모(chromo) 도메인(Cavalli and Paro, 1998; Fischle et al., 2003; Flanagan et al., 2005; Kim et al., 2006; Maurer-Stroh et al., 2003; Min et al., 2003; Sun et al., 2008) 같이 메틸-인식 도메인을 포함하는 어떤 기질 수용체는 단일-메틸화된 기질을 유비퀴틴-의존 분해 기작을 연결하는데 필요할 것이라고 생각되었다. 따라서 RORα-상호작용 단백질을 유비퀴틴-의존 분해 경로를 막기 위해 MG132의 존재하에 흡착 크로마토그래피로 관찰하였고, 액체 크로마토그래피 질량분석기/질량분석기(LC-MS/MS)을 뒤이어 하였다(도 21). 흥미롭게도, 이전에 CUL-4 포함 복합체(Angers et al., 2006; Higa et al., 2006; Nishitani et al., 2006; He et al., 2006; 및 Jin et al., 2006)로 보고된 DDB1 및 DCAF1이 RORα 결합 단백질로 발견되었다. 포유류에서 두 개의 밀접하게 연관된 CUL4, CUL4A 및 CUL4B가 발견되었고, CUL4 E3 리가아제는 다른 쿨린(cullin) 패밀리 구성원과 어댑터로서 WD40-유사 반복-포함 단백질 DDB1을 도입하는 점에서 달랐다(Hu et al., 2004; Hu et al., 2008; Wang et al., 2006). DCAF1 및 DDB1의 RORα의 결합은 특이한 항체를 이용하여 용출물로부터 면역블랏 분석에 이해서 추가적으로 확인되었다(도 22).
비록 인산화, 글리코실레이션 및 프롤린 하이드록실레이션 같은 전사 후 변형이 쿨린-기초 E3 리가아제의 인지에 필요한 특이한 메틸 데그론을 만드는데 필요하였지만(Bruick and McKnight, 2001; Ivan et al., 2001; Westbrook et al., 2008; Wu et al., 2007; 및 Yim et al., 2009), 메틸화된 기질의 인지에 대한 분자적 기작은 보고되지 않았다. DCAF1이 메틸화된 RORα의 인지에 필요한 메틸-결합 도메인을 가진 기질 수용체로서 역할을 하는지 그리고 이에 의해 뒤따르는 유비퀴틴화 및 분해에 역할을 하는지 알아보기 위하여, EZH2 WT 또는 MT의 존재하에서 DCAF1의 공-면역침전 분석을 수행하였다. 실제로, EZH2 WT의 도입(EZH2 MT는 아님)은 의미있게 DCAF1에 대한 RORα의 결합을 증가시켰다(도 23). RORα와 DCAF1 사이의 상호작용이 메틸화-의존적인지를 더 확인하기 위하여, RORα WT 및 K38A 돌연변이를 비교하는 공면역침전 분석을 수행하였다. RORα와 DCAF1의 결합은 메틸화의존적인 것으로 보였다. 왜냐하면 RORα WT만이 DCAF1과 상호작용할 수 있었고, RORα K38A는 상당히 감소된 상호작용을 보였기 때문이다(도 24). DCAF1에 대한 RORα의 메틸화-의존적인 결합과 일치하게, 면역침전 분석은 항- RORα K38 단일-메틸-특이적 항체로 EZH2의 녹다운이 있는 경우 및 없는 경우로 수행하였다. EZH2의 녹다운은 상당한 정도로 DCAF1에 대한 RORα의 결합을 감소시켰으나, RORα K38A 돌연변이는 DCAF1 및 DDB1과의 의미있는 상호작용을 보이는데 실패하였다(도 25). 이를 종합하면, 이들 데이터는 EZH2-의존적 RORα 메틸화가 DCAF1에의 결합에 필수적인 것을 보인다.
다음으로, DCAF1이 직접적으로 RORα 단백질의 안정성에 영향을 주는 지 조사하였다. 실제로 DCAF1-결핍 MEFS(Dcaf1 -/-)에서 RORα 단백질 수준은 WT MEFs의 것보다 매우 높았다(도 26). DCAF1이 메틸화된 기질을 연속하는 유비퀴틴-의존적 분해 경로를 연결하는 기능적 기질 수용체로 역할을 하는 지를 확인하기 위하여, RORα 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 증가된 DCAF1 의 발현은 RORα의 유비퀴틴화를 증가시켰다(도 27). 다음으로 DCAF1 및 EZH2 RORα의 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 안정성을 조절하기 위하여 결합하는지를 확인하였다. 실제로 EZH2의 도입은 파격적으로 RORα의 유비퀴틴화를 증가시켰으나, DCAF1의 녹다운은 RORα의 유비퀴틴화의 의미있는 감소를 가져왔다(도 28). DCAF1의 녹다운은 RORα의 CUL4B로의 결합을 상당하게 감소시켰다(도 29). 흡착 크로마토그래피에 의해서 RORα 결합 단백질로서 DDB1의 발견에 기초하여(도 21), DDB1의 녹다운이 DCAF1 이 하는 것처럼 RORα의 CUL4B에 영향을 주는지 확인하였다. DDB1의 녹다운은 의미있는 수준으로 RORα의 CUL4B에의 결합을 감소시켰다(도 29). 다음으로 DDB1의 존재 또는 부존재하에서 DDB1 및 EZH2가 RORα 유비퀴틴를 조절하기 위하여 결합하는지를 확인하기 위하여 생체내 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. 일관되게, DDB1의 도입은 RORα의 유비퀴틴화를 증가시켰고, EZH2의 녹다운은 RORα의 유비퀴틴화에 상당한 감소를 가져왔다(도 30). 이를 종합하면, 이들 데이터는 DCAF1 및 DDB1이 EZH2-의존 RORα 유비퀴틴화에 필요하다는 것을 보인다.
CUL4 및 CUL4B E3 유비퀴틴 리가아제만이 DDB1를 어답터로 도입하는 것으로 보고되었기 때문에, RORα의 CUL4A 및 CUL4B에의 상호적인 결합을 조사하였다. RORα은 CUL4 및CUL4B 모두에 결합하였고, EZH2의 도입은 공-면역침전으로 확인된 것처럼 이 결합을 증가시켰다(도 31). CUL4A의 세포질내 위치됨과 비교하여 CUL4B의 핵내 위치됨에 기초하여 CUL4 파라로그(paralogue) 중의 하나를 RORα 유비퀴틴화 및 단백질 안정성 분석를 위해 시험하였다. CUL4B의 녹다운은 RORα 단백질 수준을 의미있는 수준으로 증가시켰다(도 32). CUL4B가 RORα 유비퀴틴화를 담당하는지 그리고 EZH2-의존적 RORα 메틸화가 CUL4B-의존 유비퀴틴화의 필요조건인지를 확인하기 위해, CUL4B및 EZH2 shRNA를 도입하였고, RORα 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. CUL4B의 과대발현은 RORα의 유비퀴틴화를 상당한 정도로 증가시켰고(도 33), 이 증가는 EZH2의 녹다운에 의하여 거의 완벽하게 사라졌다(도 34). 이것을 종합하며, 우리의 데이터는 EZH-중재 RORα의 메틸화가 RORα의 유비퀴틴화을 유발하고, 메틸화된 RORα의 인지 및 이에 다른 CUL4-의존 유비퀴틴화 및 분해를 위하여 DCAF1이 DDB1과 함께 기질 수용체로서 역할을 한다는 것을 강하게 보인다.
<
실시예
4>
DCAF1
의한 메틸화된 기질의 인지에 대한
분자적
기작
DCAF1(cDCAF1)의 잠재적인 크로모 도메인이 단일-메틸 기질을 인지하는지를 확인하였다. 크로모 도메인의 결합 포켓의 소수성 아미노산이 기능에 중요하다고 보고 되었다(예를 들어 메틸화된 기질의 인지)(Fischle et al., 2003; Jacobs and Khorasanizadeh, 2002; 및 Nielsen et al., 2002). HP1, Pc 및 MRG15의 크로모 도메인은 결합 포켓 내에 네 개의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다(도 35에서 노란색 박스로 하일라이트 됨) (Eissenberg and Elgin, 2000; Flanagan et al., 2005; Hayakawa et al., 2007; Jones et al., 2000; Lachner et al., 2001; Messmer et al., 1992; Pardo et al., 2002; Platero et al., 1995; 및 Smothers and Henikoff, 2000). 서열 정렬 뿐만 아니라 RORα 펩타이드에 결합된 cDCAF1의 모델 구조에 기초하여 DCAF1의 Y563, Y578, P580 및 Y584가 RORα 펩타이드의 K38 메틸-암모니움 그룹에 맞추어지는 기질 인식 포켓을 형성하는 중요한 잔기로 제안되었다(도 36). 그러나, 삼중-메틸 히스톤 H3을 인지하는 Pc 또는 HP1의 크로모 도메인의 소수성 결합 포켓과 달리 DCAF1은 작은 결합 포켓을 가지고 있으며, 이것은 히스톤 H3의 삼중-메틸 그룹에 대해서는 충분한 공간을 제공해 주지 않는다(도 36). 이들 결과들은 DCAF1이 잠정적인 단일-메틸 리더로서 작용한다고 제안하게 하였다. 때문에 cDACF1이 직접적으로 단일-메틸 펩타이드를 인지하는지를 조사하기 위해, WT 및 돌연변이 cDCAF1의 비-메틸화된 생체 내 RORα, 단일-메틸화된 RORα, 비-메틸화된 히스톤 H3K27 및 삼중-메틸화된 히스톤 H3K27에의 펩타이드 결합 분석을 수행했다. WT cDCAF1은 단일-메틸화된 RORα 단백질에만 결합할 수 있었으나, cDCAF1 (Y563A, Y578A, P580A, and Y584A)의 중요한 결합 포켓에서의 아미노산의 돌연변이는 cDCAF1의 단일-메틸화된 RORα 펩타이드에의 결합을 제거하였다(도 37). 이와 평행하게, GST-풀다운 분석은 cDCAF1이 선택적으로 단일-메틸화된 RORα에만 결합하고, 비-메틸화된 RORα에는 결합하지 않는다는 것을 확인하였다(도 38).이를 종합해보면, 이들 생체내 분석은 cDCAF1이 크로모 도메인내의 소수성 결합 포켓을 이용하여 특이적으로 단일-메틸화된 RORα를 인지하고, 삼중-메틸화된 히스톤 H3K27를 인지하지 못한다는 것을 강하게 제시한다. 이들 결과들은 DCAF1가 단일-메틸화만을 구별하며, 특이적으로 메틸화를 유비퀴틴-의존성 분해에 연결한다는 것을 보인다.
DCAF1이 단일-메틸화를 인지할 수 있는 능력이 이의 포켓 크기 때문인지를 좀 더 명확히 하고 확인하기 위하여, 이의 포켓 사이즈를 Pc 또는 HP1 과 비슷한 크기로 확대하는 전략을 개발하였다. 서열 정렬 및 모델링 분석으로부터, Y578과 G597 사이에 Lys (K) 및 Y584와 W585 사이의 Asn-Thr(NT) 모두의 삽입은 포켓 사이즈를 확대시킬 수 있다고 예측되었다(도 39에서 노란색 박스로 하일라이트 됨). 실제로, K과 NT의 삽입은 삼중-메틸 히스톤 H3 펩타이드를 인지하는 능력의 증가와 함께 단일-메틸 RORα 펩타이드에의 DCAF1의 결합 능력을 감소시켰다(도 40 및 41). 다른 한편, K 또는 NT 어느 하나의 삽입은 DCAF1의 단일-메틸 RORα 펩타이드에의 결합에 영향을 주지 않았다(도 41).
생체내 펩타이드 결합 분석 뿐만 아니라 모델링 구조에 기초하여, 첫번째 단일-메틸 리더로서 비교적 작은 결합 포켓을 가져서 단일-메틸 기질을 수용하고, 이중 또는 삼중 메틸화된 기질은 수용할 수 없는 DCAF1를 발견하였다. 이를 종합하면, 이들 결과는 DCAF1이 메틸 데그론(Methy Degron)을 가진 단일-메틸화된 기질은 구별하며, 특이적으로 단일-메틸화와 유비퀴틴-의존성 분해 기구를 연결한다는 것을 보인다. 이들 결과를 기초로 이전에 인지되지 못했던 EZH2-DCAF1/DDB1/CUL4 가 비-히스톤 단백질 안정성의 조절에 역동적인 조절에 중요한 역할을 하는 새로운 메틸화-특이적인 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체로 역할을 하는 분자 조절 기작을 제시한다.
<
실시예
5>
DCAF1
에 의한
메틸
데그론의
인식
RORα에 있는 히스톤-유사 단백질이 DCAF1에 의해 인식되기 위하여 필요 또는 충분한지 여부를 알아보기 위하여, RORα의 히스톤-유사 서열(aa 29-47)의 서열을 히스톤 H3 서열(aa 18-36)의 서열로 치환하여, RORα/H3 키메라 단백질을 생산하였다(도 42). 비록 RORα/H3 키메라 단백질이 EZH2 및 RORα에 결합을 하지만(도 43), RORα 야생형과 비교하여 보았을 때 DACF1에 결합하는 능력을 거의 완전히 읽어 버렸다(도 44). 더욱이 RORα 야생형과 다르게, RORα K38A 및 RORα/H3 키메라 단백질 모두 cDCAF1에 상당히 결합하였다(도 45).
DCAF1이 RORα/H3 키메라 단백질과 상호작용에 실패하였기 때문에, RORα/H3 단백질이 히스톤 H3K27과 비슷하게 EZH2에 의하여 삼중-메틸화되고, DCAF1에 의하여 인식되는 것이 방해되고, 이로 인해 유비퀴틴화 의존 분해가 방해되지 않는 것으로 추론되었다.
사실, RORα/H3 키메라 단백질은 EZH2에 의하여 삼중-메틸화 되었고, 이는 H3K27me3에 의하여 관찰되나, RORαme1 항체에 의해서는 관찰되지 않음에 의해 보여졌다(도 46). 더욱이 RORα 야생형 단백질과 대조적으로 RORα/H3 키메라 단백질은 EZH2 야생형은 도입으로 유비퀴틴화가 증가되는 것을 보이지 않았다(도 47). 이들 결과는 히스톤 H3 서열에 상응하는 RORα에 있는 19개 아미노산의 히스톤-유사 단백질의 교체가 삼중-메틸화를 재건하는데 충분하였다. 따라서 DCAF1의 특이적인 모노-메틸화된 기질의 인식과 이에 따른 DDB1/CUL4B E3 유비퀴틴 리가아제 복합체의 연결은 분명하게 메틸화 상태에 의하여 부여되었다.
RORα 내에 있는 히스톤-유사 서열이 유비퀴틴-의존 분해를 위하여 DCAF1에 의해 인식되어지는 메틸-데그론으로 작용하는지를 확인하기 위하여, RORα 히스톤-유사 서열(aa 29-47)을 히스톤 H3 서열(aa 18-36)에 삽입하여 H3/ RORα 키메라 단백질을 생산하였다(도 48). H3/ RORα 키메라 단백질은 히스톤 H3 와 유사한 패턴으로 EZH2와 상호작용할 수 있었으나(도 49), 그러나 흥미롭게도 이것은 히스톤 H3와 다르게 DACF1의 결합능력을 필요로 하였다(도 50). 사실, H3/ RORα 키메라 단백질은 EZH2에 의해서 모노-메틸화될 수 있고, 이는 RORα 야생형과 유사하게 RORαme1 항체에 의해 관찰되어짐으로써 보여졌다(도 51). 더욱이 히스톤 H3 단백질과 다르게, H3/ RORα 키메라 단백질은 EZH2 활성-의존적인 방법으로 유비퀴틴화를 증가시켰다(도 52). EZH2ΔSET 돌연변이체는 즉 효소활성이 없어진 것은 H3/ RORα 키메라 단백질에 의한 유비퀴틴화를 상당한 정도로 감소시켰다. 이들을 종합하면, 이들 데이터는 RORα내에 있는 히스톤-유사 서열은 메틸 데그론(Methyl-Degron)으로 역할을 하고, 이것은 DCAF1의 결합 및 이에 따른 유비퀴틴-의존적 단백질 분해를 일으킨다는 것을 보인다.
<
실시예
6>
ROR
α의 메틸화-의존적인
유비퀴틴화에
의한
ROR
α
타켓
유전자의 전사 억제
다음으로 EZH-의존적 메틸화 및 이에 따른 유비퀴틴-의존적 RORα의 분해의 RORα-의존적 유전자의 전사에 대한 기능적인 결과를 조사하였다. EZH2 MT의 경우에는 그렇지 않으나, EZH2 WT의 도입은 RORα-의존적 RORE-루시퍼라아제이 활성을 감소시켰다(도 53).
RORα WT에 비교하여, RORα K38A는 RORE-루시퍼라아제 활성을 더 증가시킬 수 있었다(도 53). 비슷하게, EZH2 녹다운은 RORα의 전사적 활성을 강력하게 하였다(도 54). 흥미롭게도 RORα K38A 돌연변이체는 M132의 부존재하에서 RORα WT 보다 더 강한 전사적 활성을 보였다. 반면에 M132의 존재하에서는 이런 차이는 없어졌다(도 55). 도 3H에 보인 유비퀴틴화 분석의 데이타와 일치하게 DCAF1 녹다운은 RORα의 전사적 활성을 증가시켰다(도 56). 이런 병행되게, 면역블랏 분석은 증가된 RORE-루시퍼라아제 활성이 증가된 RORα 단백질 수준과 상관되어 있다는 것을 확인하였다(도 56). 이들 결과는 EZH2-의존 메틸화 및 DCAF1-매개된, RORα의 유비퀴틴-의존 분해가 RORα-의존 타켓 유전자의 전사에 영향을 주는 것을 보인다.
p21은 프로모터에 기능적인 RORE를 가진 잘 알려진 RORα 타겟 유전자들중의 하나이고(Grechez-Cassiau et al., 2008; Steinman et al., 1998)이기 때문에 그리고 p21 전사 수준이 EZH2에 의하여 영향을 받은지를 알아보기 위하여 MCF 유방암 세포내의 p21 프로모터에 ChIP 분석을 수행하였다. ChIP 분석은 EZH2 녹다운이 RNA 중합효소 II의 도입이 수반되는 RORα 도입을 증가시켰다(도 57). RORE 포함
GADD45 프로모터을 또한 조사하였고, 비슷한 결과가 관찰되었다(도 57). 이를 종합하면, 이들 결과는 EZH2-의존 메틸화가 유비퀴틴-의존적 RORα의 분해를 유발하고, RORα 타겟 유전자의 전사 억제를 일으킨다는 것을 보인다.
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실시예
7> 메틸화-의존
ROR
α
유비퀴틴화의
기능적 결과
DCAF1이 RORα의 분해를 담당하고 있다고 보면, 이들 흥미로운 결과에 뒷받침되는 생리적으로 관련된 기능이 있다고 예상하는 것이 합리적이다. 유방암 및 전립선암에서 향상된 EZH2 단백질의 수준이 관찰되었고, EZH2가 발암유전자로 기능하는 것으로 제안되었고, 따라서 암 진단의 마커로 사용될 수 있다(Bachmann et al., 2006; Kleer et al., 2003; Varambally et al., 2002).
RORα 단백질 수준이 형질전환할 수 있는 세포의 능력을 궁극적으로 바꿀 수 있는지를 확인하기 위하여, RORα 단백질의 수준을 조절하는 여러 가지의 접근을 시도했다. 첫번째, MCF7 유방암 세포에서 RORα의 과량발현은 연질 아가에서의 벡터 대조구와 비교했을 때, 콜로니에서 상당한 감소를 가져왔다(도 58). 둘째로, DCAF1의 넉다운(knockdown)은 RORα 단백질 수준을 안정화시킴으로서 연질 아가에서 콜로니의 수가 상당히 감소되었다(도 59). 더욱이, DZNep (1 mM)로 처리된 MCF 유방암 세포는 세포의 형질전환에 대한 억제 효과가 있었다(도 60). 따라서, 형질전환 분석은 RORα의 메틸화-의존에 의해 부여되는 EZH2 및 RORα 단백질 수준 사이의 역상관관계를 강하게 지지한다.
EZH2와 RORα 사이의 역상관관계는 정상 대응 세포에 비교하여 유방 육종 세포 시료에서 발견이 되었다. RORα 단백질 수준은 EZH2 수준이 매우 높은 육종에서 매우 낮았고(도 61), 이는 이들 발견에 대한 생물학적 중요성을 강하게 지지한다. 실제로 정상 시료와 비교하여 육종 시료에서 감소된 RORα 및 증가된 EZH2 단백질 수준은 통계학적으로 유의하다(도 62). 43명의 유방암 환자 시료에서 정상 샘플과 비교하여 육종 샘플에서 EZH2 단백질 수준이 높은 것은 30건이 있었다. 이들 30건 중, 25 육종 시료는 상당히 감소된 RORα 단백질 수준을 보였고, 이는 육종에서 증가된 EZH2가 RORα의 분해를 촉진시킬 것이라는 것을 지지한다.
<110> SNU R&DB Foundation
<120> Methyl degron peptide and methods of controlling protein life
span
<130> PN120031-01
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial ROR-alpha
<400> 1
Pro Leu Asn Gln Glu Ser Ala Arg Lys Ser Glu Pro Pro Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Methyl Degron
<400> 2
ccgctgaacc aggaatccgc ccgcaagagc gagccgcctg cc 42
Claims (26)
- 서열번호 1의 분리된 메틸 데그론 펩타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2) lysine methyltransferase에 의하여 메틸화(methylation)이 되는 것을 특징으로 하는 메틸 데그론 펩타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 DCAF1(DDB1-CUL4-associated factor 1 adaptor)에 의하여 인식되는 것을 특징으로 하는 메틸 데그론 펩타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 유비퀴틴-의존적 단백질 분해에 관여하는 것을 특징으로 하는 메틸 데그론 펩타이드.
- 삭제
- 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드 또는 상기 메틸데그론 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 이용한 단백질 수명 조절 방법.
- 삭제
- 삭제
- 천연의 단백질에 포함된 서열번호 1의 메틸데그론 펩타이드의 9번째 아미노산인 리신이 돌연변이화된 수명이 연장된 돌연변이 단백질.
- 제 9 항에 있어서, 상기 단백질은 수명이 연장되어 항암 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
- a. 세포를 배양하는 단계;
b. 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계;
c. 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드의 메틸화 정도를 탐색하는 단계; 및
d. 상기 메틸화 정도가 증가하면 단백질 수명 감축제로 판단하고, 상기 메틸화 정도가 감소하면 단백질 수명 증가제로 판단하는 단계;를 포함하는 단백질 수명 조절제 스크리닝 방법. - a. 세포를 배양하는 단계;
b. 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계;
c. 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드의 메틸화 정도를 탐색하는 단계;
d. 상기 메틸화 정도가 증가하면 단백질 수명이 감축되고, 상기 메틸화 정도가 감소하면 단백질 수명이 증가되는 것으로 판단하는 단계; 및
e. 상기 메틸화된 단백질이 발암 관련 단백질이고, 상기 발암 단백질의 수명이 단축되는 것을 확인하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법. - 제 12 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암, 방광암, 자궁경부암, 대장암, 신장암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 위암, 자궁암에서 선택되는 어느 하나의 암인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 전립선암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
- 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드를 이용한 단백질의 수명 조절 방법.
- 서열번호 2의 메틸 데그론 유전자 서열을 이용한 단백질의 발현 조절 방법.
- 제 15 항에 있어서, 천연의 단백질에 포함된 메틸데그론 펩타이드의 9번째 아미노산인 리신을 돌연변이화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 수명 연장 방법.
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- 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드 서열을 포함시켜 단백질의 수명을 단축시키는 것을 특징으로 하는 단백질 수명 조절 방법.
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- 서열번호 1의 메틸 데그론 펩타이드를 암호화하는 분리된 유전자.
- 제 23 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 유전자.
- 서열번호 2의 메틸 데그론 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 25 항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 숙주세포.
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