JP2023546015A - がんの予防または処置における使用のためのｃａｓｐ８ａｐ２アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
本発明は、がんの予防または処置におけるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストの使用を提供する。好ましくは、アンタゴニストは、処置される対象において正常細胞の生存率を有意に低減することなく、がん細胞の生存率を低減する。さらに、処置の方法および前記方法において好適な医薬組成物もまた提供される。
Description
本発明は、がんの予防または処置におけるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストの使用に関する。好ましくは、アンタゴニストは、処置される対象において正常細胞の生存率を有意に低減することなく、がん細胞の生存率を低減する。さらに、処置の方法および前記方法において好適な医薬組成物もまた提供される。
がんは、世界で第２位の死亡原因である。全体として、がんの有病率は、実際に増加してきている。男性においては、最も高い百分率のがんの種類は、前立腺、肺および気管支、結腸および直腸、ならびに膀胱において発生する。女性においては、がんの有病率は、乳房、肺および気管支、結腸および直腸、子宮体部ならびに甲状腺において最も高い（Hassanpour et al., J. Cancer Res. Practice 4 (2017), 127-129）。
肺がんは、世界で最も高頻度のがん関連死亡原因である。その５年生存率は、がんの中で最も低いものの１つであり（３～１７％）、それは、顕著な研究および臨床的発展にもかかわらず、１９７０年以来大きく変化していない。肺がんは、２つの主要な組織学的な群、つまり、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ、すべての症例の１５％）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、８５％）に細分される。肺腺癌（ＬＵＡＤ）は、ＮＳＣＬＣのサブタイプであり、最も一般的な種類の肺がんで、すべての症例のおよそ４０％を占める。
手術、化学療法および放射線療法は、初期の肺がんに利用可能な標準的な第１選択処置である。しかしながら、患者のおよそ７５％は進行期（ＩＩＩ／ＩＶ）においてＮＳＣＬＣと診断され、それらの患者のおよそ６０～７０％は、使用できる可能性のある分子標的を生じる特定のゲノム異常を有する。それゆえ、標的化分子治療のための選択肢が、活発に研究されている。承認された標的化治療として、ＥＧＦＲ活性化突然変異（ＬＵＡＤ症例のおよそ２０％において検出される）を有する患者のためのいくつかの上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼアンタゴニスト（ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、および発癌性ＡＬＫ遺伝子再配置（２～７％）を有する患者のためのＡＬＫ ＴＫＩが挙げられる。
強い活性および高い初期応答率にもかかわらず、毒性および獲得耐性が、ＬＵＡＤの標的化治療の主要な問題となっている。
Hummon et al., Mol. Cancer 11 (2012), 1-22は、結腸腺癌細胞株の細胞生存率が、ｓｉＣＡＳＰ８ＡＰ２とのインキュベーションに際して低減されたことを説明している。Ｈｕｍｍｏｎらは、ｓｉＣＡＳＰ８ＡＰ２の、形質転換されていない結腸細胞の細胞生存率に対する効果については試験しなかった。
国際公開第２０１７／０６０１６９号パンフレットは、小細胞肺がんおよび他のがんに対する免疫療法における使用のためのペプチドに関する。国際公開第２０１７／０６０１６９号パンフレットは、特にアミノ酸配列ＳＭＭＰＤＥＬＬＴＳＬおよびＫＬＤＫＮＰＮＱＶをそれぞれ含むＣＡＳＰ８ＡＰ２ペプチドを説明している。国際公開第２０１７／０６０１６９号パンフレットは、これらのペプチドの任意のＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト活性を説明していない。これらのＣＡＳＰ８ＡＰ２ペプチドは、本出願の意味におけるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを表すものではない。
そのような観点において、がん、特に肺腺癌の処置のための新規手段および方法の提供について要求が存在している。特に、患者においてがん細胞の生存率を低減するが、非形質転換細胞の生存率に有意に有害に影響を及ぼさない、がんの効率的な処置について要求が存在している。
本発明の根底にある技術的問題は、特許請求の範囲において定義される主題の提供によって解決される。
第１の態様に従って、本発明は、がんの予防または処置における使用のためのカスパーゼ－８関連タンパク質－２（ＣＡＳＰ８ＡＰ２）アンタゴニストであって、但し、アミノ酸配列ＳＭＭＰＤＥＬＬＴＳＬ（配列番号１４０）を含むペプチドまたはアミノ酸配列ＫＬＤＫＮＰＮＱＶ（配列番号１４１）を含むペプチドではなく、好ましくは、がんは肺がん、乳がん、膵がんまたは肝がんからなる群から選択される、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを提供する。
第２の態様に従って、がんを処置するための方法であって、前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法が提供される。
第３の態様に従って、前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
第４の態様に従って、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼ媒介性アポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼ媒介性アポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法が提供される。
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼ媒介性アポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼ媒介性アポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法が提供される。
第５の態様に従って、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導された、がん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるがん細胞の細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法が提供される。
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導された、がん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるがん細胞の細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法が提供される。
第６の態様に従って、医薬組成物を調製するための方法であって、上記に挙げられる方法によってＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するステップと、特定したＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と混合するステップとを含む方法が、提供される。
本発明者らは驚くべきことに、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストが、大部分は生存可能である正常な細胞株、すなわち、非形質転換細胞株と比較して、より強力にかつ有意に、がん細胞の生存率を低減することを発見した。したがって、処置は、有効かつ安全であると考えられる。
ＣＲＩＳＰＲｉ－ドロップアウトスクリーニングを使用することによって、本発明者らは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２が肺腺癌細胞における必須生存因子であることを示すことができた。肺腺癌、乳がん、膵がんおよび肝がんを含む、がん細胞におけるＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子のノックダウンは、肺の正常な（非形質転換）細胞よりも大きくそれらの生存率を低減した。
元々カスパーゼ－８関連タンパク質として特定されたＦＬＡＳＨ（ＦＬＩＣＥ／ｃａｓｐａｓｅ－８－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｕｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）／ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、推定上の核輸送シグナル（ＮＥＳ）および核局在化シグナル（ＮＬＳ）の両方を有する高分子量タンパク質である。ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、細胞周期進行、とりわけＳ期における細胞周期進行、ヒストンｍＲＮＡのプロセッシング、アポトーシスの調節、および転写制御を含む様々な細胞プロセスにおいて役割を果たすことが報告された（Minamida et al., PLOS One 9 (2014), e108032, 1-11）。
ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、アポトーシス中のカスパーゼ－８のＣＤ９５（Ｆａｓ）媒介性活性化に関与していることが報告された（Imai et al., Nature 398 (1999), 777-785）。ＣＤ９５（Ｆａｓ）は、アポトーシス（細胞死）シグナルを細胞へ中継する細胞表面受容体分子である。Ｆａｓがそのリガンドの結合によって活性化されると、タンパク質溶解性タンパク質カスパーゼ－８は、Ｆａｓ関連アダプタータンパク質への結合によって、死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）として公知のシグナル伝達複合体へ動員される。刺激されたＦａｓはＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合するので、ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、おそらく、ＤＩＳＣシグナル伝達複合体の成分である。刺激されたＦａｓの非存在下においては、ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、カスパーゼ－８に結合する。ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、それゆえ、本発明以前は、Ｆａｓ媒介性アポトーシスにおけるカスパーゼ－８の活性化のために必要であると考えられていた。
それゆえ、本発明は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２が一般的なアポトーシス促進性因子として作用するという先行技術における仮定に反するものである。本発明による使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、正常細胞の生存率と比較して、がん細胞の生存率を有意に低減することは特に驚きである。
各生物学的反復について、データを、各々の陰性対照シグナルに対して正規化し、個々の値としてプロットした。バーの高さは平均値を表し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して有意性検定を行い、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５として表した。正常細胞株と、ＣＡＳＰ８ＡＰ２サイレンシングに感受性のＮＳＣＬＣ細胞株との間での有意性検定を、対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して行った。
各生物学的反復について、データを、各々の陰性対照シグナルに対して正規化し、個々の値としてプロットした。バーの高さは平均値を表し、エラーバーは範囲を表す。対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、ログ２変換した倍変化データについて有意性検定を行い、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５として表した。正常細胞株と、ＣＡＳＰ８ＡＰ２サイレンシングに感受性のＮＳＣＬＣ細胞株との間での有意性検定を、対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して行った。
発明の詳細な説明
「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が、本説明および特許請求の範囲において使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。本発明の目的のために、「～からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の、場合による実施形態であると考えられる。これ以降で群が少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これはまた、場合によりこれらの実施形態のみからなる群を開示すると理解すべきである。
「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が、本説明および特許請求の範囲において使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。本発明の目的のために、「～からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の、場合による実施形態であると考えられる。これ以降で群が少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これはまた、場合によりこれらの実施形態のみからなる群を開示すると理解すべきである。
単数名詞について言及するとき不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、特に言明されない限り、これはその名詞の複数形を含む。逆も同様に、名詞の複数形が使用される場合、それは単数形についてもまた言及している。
さらに、本説明および特許請求の範囲における第１、第２、第３または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）などの用語は、同様のエレメント間で区別するために使用され、必ずしも連続的または経時的な順序を説明するために使用されるものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であり、かつ本明細書において説明される本発明の実施形態は、本明細書において説明または例示される以外の順序において操作することができることを理解すべきである。
本発明の文脈において、示される任意の数値は、典型的に、当業者が、問題となっている特色の技術的効果をそれでも確実にすると理解するような正確さの間隔を伴う。本明細書において使用される場合、示される数値からの逸脱は、±１０％の範囲内であり、好ましくは±５％の範囲内である。±１０％、および好ましくは±５％の、示される数値間隔からの上記に挙げられる逸脱は、数値について本明細書において使用される「約」および「およそ」という用語によってもまた示される。
第１の態様に従って、本発明は、がんの予防または処置における使用のためのカスパーゼ－８関連タンパク質－２（ＣＡＳＰ８ＡＰ２）アンタゴニストの使用であって、但し、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストはアミノ酸配列ＳＭＭＰＤＥＬＬＴＳＬ（配列番号１４０）を含むペプチドまたはアミノ酸配列ＫＬＤＫＮＰＮＱＶ（配列番号１４１）を含むペプチドではない、使用を提供する。
「ＣＡＳＰ８ＡＰ２」は、カスパーゼ８関連タンパク質の略語である。ＣＡＳＰ８ＡＰ２の同義語は、ＣＥＤ－４、ＦＬＡＳＨおよびＲＩＰ２５である。好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２は、哺乳動物起源、特に好ましくはヒト起源のＣＡＳＰ８ＡＰ２である。ヒトＣＡＳＰ８ＡＰ２は、参照配列Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿０１２１１５．４を有し、これはｍＲＮＡ配列および推定タンパク質配列を提供する。
本明細書における「ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト」は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２、特にヒトＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合することができる任意の化合物を含む。また、この用語は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の転写および／もしくは翻訳、ならびに／もしくはＣＡＳＰ８ＡＰ２ ｍＲＮＡもしくはタンパク質の安定性を低減することができるか、または他の分子とのその相互作用を防止することができる化合物を含む。好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、アミノ酸配列ＳＭＭＰＤＥＬＬＴＳＬ（配列番号１４０）からなるペプチド、またはアミノ酸配列ＫＬＤＫＮＰＮＱＶ（配列番号１４１）からなるペプチドではない。
ＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合することができる化合物の結合特性は、ＥＬＩＳＡまたは発光アッセイによって、ＣＡＳＰ８ＡＰ２を、結合される抗原として使用して決定され得る。好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に特異的に結合する。
好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、がん細胞の生存率を低減する。「がん細胞の生存率」は、当技術分野において公知の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで決定され得る。例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ法には、トリパンブルー色素排除法または発光基質アッセイ、例えばＰｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイが含まれる。詳細は、実施例の節において説明される。
さらなる好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、処置を受容する対象において正常細胞の生存率を有意に低減しない。処置を受容する対象における正常細胞は、がんが固形腫瘍である場合、処置されるべきがんの外側に存在する。処置される正常細胞の生存率が処置されない細胞の生存率の６０％以上である場合、正常細胞の生存率は、「有意に低減されない」。好ましくは、処置されない細胞の生存率の８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上である。
特に好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、前記抗原に特異的に結合する抗ＣＡＳＰ８ＡＰ２抗体、またはその機能的断片である。マウス、ウサギおよびヤギを含む実験動物において特異的抗体を生成するための方法は、以下に概略されるように周知である。また、抗ＣＡＳＰ８ＡＰ２抗体は、ポリクローナルウサギ抗ヒトＦＬＡＳＨ（Ａｂｃａｍ社から市販されている）のように市販されている。
好ましくは、抗体は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質の、カスパーゼ－３、カスパーゼ－７および／またはカスパーゼ－８、好ましくはカスパーゼ－８への結合を中和する。そのような抗体は、抗ＣＡＳＰ８ＡＰ２抗体を生成し、続いて中和抗体についてスクリーニングすることによって得ることができる。そのようなスクリーニングアッセイの設計は、当業者にとってルーチン実験である。例えば、中和抗体は、競合結合アッセイ形式を使用してスクリーニングすることができる。
抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥ抗体であってもよく、ＩｇＧが好ましい。抗体の機能的結合性断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２またはｓｃＦｖ断片が含まれる。抗体または機能的断片は、誘導体を産生するためにコンジュゲートしてもよい。誘導体は、グリコシル化バリアントを含んでもよく、または凝集体を産生するために架橋結合によって得てもよい。
抗体は、当技術分野において公知の手段によって生成され得る。例えば、抗体は、実験動物を免疫化することによって生成され得る。関連抗体を産生するＢ細胞を、骨髄腫細胞と融合して、抗体の産生のために培養することができるハイブリドーマ細胞を産生してもよい。培地から抗体を精製するための方法は、公知である。例えば、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡ／Ｇ、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、当業者に公知である。
さらに好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、カスパーゼアンタゴニストであり、ここで、カスパーゼは、カスパーゼ－３、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８またはカスパーゼ－９である。好ましくは、カスパーゼアンタゴニストは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２と、内因性カスパーゼ－３（受託番号Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ２１９８６６．１）、カスパーゼ－７（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０１５７９９．１）、カスパーゼ－８（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０３８９８５．２）またはカスパーゼ９（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ０１９２０５．２）との結合を遮断することができるカスパーゼ－３、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８またはカスパーゼ－９のアナログである。より好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、カスパーゼ－３、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８またはカスパーゼ－９の断片である。
さらなる好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、低分子量化合物である。好ましくは、化合物は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質とカスパーゼとの相互作用をタンパク質レベルで低減することができ、好ましくは、カスパーゼは、カスパーゼ－３、カスパーゼ－７またはカスパーゼ－８である。最も好ましくは、カスパーゼは、カスパーゼ－８である。低分子量化合物は、利用可能な化学ライブラリーから選択することによって得てもよい。選択手技は、以下により詳細に説明される。
あるいは、さらに好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の転写および／もしくは翻訳、ならびに／またはＣＡＳＰ８ＡＰ２ ｍＲＮＡの安定性を阻害する。ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、それが、アンタゴニストの非存在下の状況と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の転写および／または翻訳を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％低減する場合、アンタゴニストであると考えられる。
所与の遺伝子の転写および／または翻訳を抑制するための手段、ならびにそれらを産生するための方法は、当業者に公知である。ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、配列特異的遺伝子サイレンシングによって作用し得る。
好ましい実施形態において、アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって作用する。オリゴヌクレオチドの骨格修飾に依存して、ＲＮアーゼＨのために分解が起こり得る。所与の標的配列に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計は、当業者に公知である；例えば、Aarstma-Rus et al., Molecular Therapy 17 (2009), 548-553を参照されたい。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子またはそれに近接した調節エレメントの領域に結合することができ、かつ／またはこの領域に少なくとも部分的に相補的であり、好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子はヒトＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子である。
さらなる好ましい実施形態において、アンタゴニストは、リボザイムであってもよい。リボザイムは、固有の触媒活性を有するＲＮＡ分子である。最も広範に研究されているリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムである。リボザイム内の触媒モチーフの両側には、標的ＲＮＡ切断部位の周囲の配列に相補的であり、そのｍＲＮＡ標的に対するリボザイムのガイドとして働く配列が存在する。
さらなる好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、一過性の配列特異的遺伝子サイレンシングをもたらす。好適な配列の設計のためのソフトウェアは、当業者が利用可能であり；例えば、Naito et al., Front. Genet. 3 (2012), 1-7を参照されたい。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の遺伝子発現に干渉することができ、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の１５ヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的なＲＮＡの第１の鎖、および長さが１５～３０ヌクレオチドのＲＮＡの第２の鎖を含み、ここで、第１の鎖および第２の鎖の少なくとも１２ヌクレオチドは、互いに相補的であり、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的特異的ｓｉＲＮＡの複雑な混合物であるｓｉＰＯＯＬの形態で提供される。より好ましくは、３０個のｓｉＲＮＡ（センスおよびアンチセンスそれぞれ）が使用される。特に、ｓｉＲＮＡは、配列番号２０～１３９のうちのいずれか１つから選択される核酸配列を有する。
さらなる好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡの効果が一過性の性質の効果である一方で、ｓｈＲＮＡは、高強度かつ維持可能な効果を可能にする。ｓｈＲＮＡのための設計ツールもまた、当業者に利用可能である。細胞質へのｓｈＲＮＡ発現ベクターの送達後、ベクターは、転写のために核へ輸送される必要がある；概略についてRao et al., 61 (2009), 746-759を参照されたい。
さらなる好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節において機能する小分子非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路のｓｉＲＮＡに似ている。ｍｉＲＮＡのための設計ツールは、当業者に利用可能であり；概略についてChen et al., Briefings in Bioinformatics 20 (2019), 1836-1852を参照されたい。
さらなる好ましい実施形態において、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、ＣＲＩＳＰＲ－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集は、２つの成分：ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼタンパク質（Ｃａｓ）またはその誘導体もしくは融合物を必要とする。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼを、特異的標的ＤＮＡ配列へ方向付け、それから、Ｃａｓヌクレアーゼはその部位でそのＤＮＡを切断し、二本鎖切断部位をもたらす。細胞はそれを、例えば非相同末端－末端結合によって修復しようとし、これは塩基の挿入または欠失によるエラーを起こしやすく、このことはタンパク質破壊をもたらす場合があり、特定の遺伝子をノックアウトするための好ましい経路である。さらに好ましい実施形態において、遺伝子発現は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）によって阻害される。ＣＲＩＳＰＲｉは、遺伝子へのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体の配列特異的結合を使用する。活性Ｃａｓ９の代わりに、エンドヌクレアーゼ機能を不活性化する特定の突然変異を有するｄＣａｓ９と命名されたそのバリアントが使用されるので、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ鎖を切断しない。ＤＮＡ鎖への複合体の結合のために、遺伝子転写はＲＮＡポリメラーゼの遮断によって阻害される。特に好ましい実施形態において、ｄＣａｓ９は、例えばＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）のタンパク質ドメインをさらに含む場合があり、これによって、ヒト細胞における結合された遺伝子の転写は、最大５０％、好ましくは最大８０％、より好ましくは最大９０％、特に好ましくは最大９９％低減される。ガイドＲＮＡのための設計ツールは、当業者に利用可能であり；例えば、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）の設計ツールを参照されたい。
好ましくは、ｓｇＲＮＡは、配列番号３～５で示される核酸配列のうちのいずれかを含む。より好ましくは、ｓｇＲＮＡは、配列番号３～５で示される核酸配列のうちのいずれかからなる。
「がん」とは、典型的に非制御細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。本明細書におけるこの用語は、任意の種類のがんを含む。これらの種類には、上皮細胞に由来する癌腫；肉腫；リンパ腫および白血病；生殖細胞腫瘍ならびに芽細胞腫が含まれる。より特に、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ ＡＬＬ）、扁平上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、胃腸がん、腎がん、卵巣がん、肝がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形性膠芽腫、子宮頸がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、頭頸部がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔がん、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）からなる群からの癌腫である。
好ましくは、がんは、癌腫である。より好ましくは、癌腫は、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌および結腸癌から選択される。さらにより好ましくは、がんは、肺がん、乳がんまたは膵がんである。特に好ましくは、がんは、肺腺癌、肺扁平上皮がん、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性／プロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性乳がん、三種陰性乳がん、膵管腺癌または肝細胞癌である。最も好ましくは、がんは肺腺癌である。
代替の好ましい実施形態において、がんは、結腸がんおよび／または直腸がんではない。さらなる代替の好ましい実施形態において、がんは、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒまたはｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）ではない。より好ましくは、がんは、結腸がんでも直腸がんでもない。
さらなる好ましい実施形態において、がんは肉腫である。好ましくは、肉腫は、骨腫瘍、軟骨腫瘍、脂肪腫瘍または神経腫瘍である。
さらなる好ましい実施形態において、がんは、リンパ腫および白血病である。
さらなる好ましい実施形態において、がんは、セミノーマおよび未分化胚細胞腫を含む生殖細胞腫瘍である。
さらなる好ましい実施形態において、がんは、芽細胞腫である。
さらなる好ましい実施形態において、ＪｕｎＢ経路は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストの投与に際してがんにおいて活性化されない。ＪｕｎＢ経路の活性化は、がんにおけるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストの存在下でのＪＵＮＢ ｍＲＮＡレベルを、非形質転換細胞におけるＪＵＮＢ ｍＲＮＡレベルと比較することによって決定され得る。ＪｕｎＢは、ＡＰ－１転写因子の成分である。
がんは、様々なステージであり得る。現在、本発明による処置は、がんの任意のステージにおいて有用であることが企図される。
別の態様に従って、本発明は、がんを予防または処置するための方法であって、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストおよびがんは、上記に定義される通りである。患者は、哺乳動物、好ましくはヒト患者である。
「予防することまたは処置すること」は、任意の種類の有益な効果、例えば疾患または障害の少なくとも１つの症状の寛解を含む。有益な効果は、基線に優る改善の形態をとってもよい。また、有益な効果は、がんのマーカーの有害な進行の阻止、減速、遅延または安定化の形態をとってもよい。有効な処置は、例えば、患者の疼痛を低減し、病変のサイズおよび／もしくは数を低減する場合があり、腫瘍の転移を低減もしくは予防する場合があり、かつ／または腫瘍増殖を減速する場合がある。
投与は、静脈内、皮下および経口を含む任意の経路による投与であり得る。経口は、好ましい投与経路である。好適な医薬組成物は、以下に概略される。
投与頻度および投与されるべき用量は、医師によって決定される。
ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストが小分子またはタンパク質である場合、毎日の投与量は、１μｇ～１００ｍｇの範囲内、好ましくは１０μｇ～１０ｍｇの範囲内であり得る。ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストが核酸である場合、毎日の投与量は、１μｇ～１００ｍｇの範囲内、好ましくは１０μｇ～１０ｍｇの範囲内であり得る。
医薬組成物は、毎日１回、２回または３回投与してもよい。処置は、好ましくは、少なくとも２週間、好ましくは少なくとも４週間、さらにより好ましくは少なくとも５２週間の期間にわたる。
上記に説明されるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、単独療法として、または公知の抗がん剤との組合せで適用することができる。好ましい公知の抗がん剤は、細胞毒、薬物または放射性同位体であり得る。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞に有害な（例えば、細胞を殺す）任意の薬剤を含む。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらのアナログまたはホモログが含まれる。治療剤には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣもしくはシス－ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）もしくはドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンもしくはアントラマイシン（ＡＭＣ））または有糸分裂阻害薬（例えば、ビンクリスチンもしくはビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の別の態様に従って、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。薬学的に許容される賦形剤は、当業者に公知である。好適な剤形を提供するために、粘着防止剤、結合剤、コーティング、着色料、崩壊剤、香料、滑剤、潤滑剤、保存剤、吸着剤、甘味料および／または媒体を使用することが公知である。好適な医薬剤形には、錠剤、カプセル、溶液、凍結乾燥形態、坐剤、糖衣錠が含まれる。
別の態様に従って、本発明は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定する方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼアポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼアポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法を提供する。
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼアポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼアポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法を提供する。
試験化合物は、小分子であり得る。好ましくは、小分子は、複雑な化学ライブラリー内にあるものである。ＣＡＳＰ８ＡＰ２への結合についての、ステップｉ）において定義される試験化合物のスクリーニングは、上記に概略されている。スクリーニングは、当業者に公知のハイスループット技法を含み得る。アポトーシス活性を決定するためのステップｉｉ）は、市販の試験キット、例えばＰｒｏｍｅｇａ社のＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７を使用して行うことができる。アッセイプロトコールの詳細は、以下の実施例の節において概略される。
好適な参照細胞株は、肺腺癌細胞株、好ましくはＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５９０８）であり得る。
ステップｉｉ）の代替のステップは、市販の試験キット、例えばＰｒｏｍｅｇａ社のＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ８を使用して、カスパーゼ３／７の代わりにカスパーゼ－８のアポトーシス活性が決定されるステップである。
ステップｉｉ）のさらなる代替のステップは、市販の試験キット、例えばＰｒｏｍｅｇａ社のＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ９を使用して、カスパーゼ８の代わりにカスパーゼ－９のアポトーシス活性が決定されるステップである。好ましくは、カスパーゼアポトーシス活性は、カスパーゼ－８のアポトーシス活性である。
別の態様に従って、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、試験化合物の存在下におけるがん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下における細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法が提供される。
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、試験化合物の存在下におけるがん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下における細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法が提供される。
ステップｉ）は、上記に概略されるように行われる。ステップｉｉ）は、古典的なトリパンブルー色素排除法を使用して行われ得る。あるいは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを、製造業者の使用説明書に従って使用してもよい。
好ましくは、がん細胞は、肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５９０８）である。
別の態様に従って、医薬組成物を調製するための方法であって、本発明の方法によってＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するステップと、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを薬学的に許容される賦形剤と混合するステップとを含む方法が、提供される。方法および薬学的賦形剤は、上記に説明される通りである。
本発明のさらなる好ましい実施形態は、以下の実施形態に関連する。
１．がんの予防または処置における使用のためのカスパーゼ－８関連タンパク質－２（ＣＡＳＰ８ＡＰ２）アンタゴニスト。
２．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、がん細胞の生存率を低減する、実施形態１に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
３．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、処置を受容する対象において正常細胞の生存率を有意に低減しない、実施形態１または２に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
４．前記がんは胃がんおよび／または結腸がんではないことを条件とする、実施形態１～３のいずれか１つに記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
５．がんは肺がん、乳がん、膵がんまたは肝がんからなる群から選択される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
６．がんは肺腺癌、肺扁平上皮がん、ＥＲ陽性／ＰＲ陽性乳がん、三種陰性乳がん、膵管腺癌または肝細胞癌であり、好ましくは、がんは肺腺癌である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２。
７．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の転写および／もしくは翻訳、ならびに／またはＣＡＳＰ８ＡＰ２ ｍＲＮＡもしくはタンパク質の安定性を低減する、実施形態１～６のいずれかに記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
８．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から選択される、実施形態７に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
９．アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子またはそれに近接した調節エレメントの領域に結合することができ、かつ／またはこの領域に少なくとも部分的に相補的であり、好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子はヒトＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子である、実施形態８に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
１０．ｓｉＲＮＡはＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の遺伝子発現に干渉することができ、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の１５ヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的なＲＮＡの第１の鎖、および長さが１５～３０ヌクレオチドのＲＮＡの第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖の少なくとも１２ヌクレオチドは互いに相補的であり、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する、実施形態８に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
１１．ｓｇＲＮＡはＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の１５ヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、加えてエンドヌクレアーゼ活性を欠くＣＲＩＳＰＲタンパク質は投与され、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は少なくともＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）タンパク質のドメインに融合されている、実施形態８に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
１２．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質に特異的に結合する抗体またはその結合性断片である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
１３．ＣＡＳＰ８ＡＰ２に特異的に結合する抗体は、カスパーゼ－３、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８またはカスパーゼ－９から選択されるカスパーゼへのＣＡＳＰ８ＡＰ２の結合を少なくとも部分的に遮断し、好ましくは、カスパーゼはカスパーゼ－８である、実施形態１２に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
１４．がんを予防または処置するための方法であって、実施形態１～１３のいずれか１つにおいて定義されるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを、それを必要とする患者へ投与するステップを含み、好ましくは、患者はヒトである、方法。
１５．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、がん細胞の生存率を低減する、実施形態１４に記載の方法。
１６．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、処置を受容する対象において正常細胞の生存率を有意に低減しない、実施形態１４または１５に記載の方法。
１７．前記がんは胃がんおよび／または結腸がんではないことを条件とする、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．がんは肺がん、乳がん、膵がんまたは肝がんからなる群から選択される、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．がんは肺腺癌、肺扁平上皮がん、ＥＲ陽性／ＰＲ陽性乳がん、三種陰性乳がん、膵管腺癌または肝細胞癌であり、好ましくは、がんは肺腺癌である、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．実施形態１～１３のいずれか１つに定義されるＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
２１．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼ媒介性アポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼ媒介性アポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼ媒介性アポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼ媒介性アポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
２２．選択した試験化合物は、試験化合物の非存在下におけるカスパーゼ媒介性アポトーシス活性と比較して、カスパーゼ媒介性アポトーシス活性を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％増加させる、実施形態２１に記載の方法。
２３．がん細胞は肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５９０８）から選択され、カスパーゼ媒介性アポトーシス活性はカスパーゼ－８のアポトーシス活性である、実施形態２１または２２に記載の方法。
２４．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導された、がん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるがん細胞の細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導された、がん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、試験化合物の非存在下におけるがん細胞の細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。
２５．がん細胞はＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５９０８）である、実施形態２４に記載の方法。
２６．ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを含む医薬組成物を調製するための方法であって、実施形態２１～２５のいずれか１つに記載の方法によってＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するステップと、ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と混合するステップとを含む方法。
本発明は、単に本発明の特定の実施形態を例示する目的のためであり、かつまたいかなるようにも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない以下の実施例において、さらに説明される。
[実施例１]
ＣＲＩＳＰＲｉ－ドロップアウトスクリーニングは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２を肺腺癌（ＬＵＡＤ）細胞株についての必須生存因子として特定した。
材料および方法
Ａ）ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングワークフロー
ＴＣＧＡおよびＴＡＮＲＩＣデータベースからの肺腺癌（ＬＵＡＤ）と正常肺患者試料との間で差次的に発現される２０５８個の遺伝子、ならびに３０個の機能アノテーション付き陽性対照遺伝子および１０個の公知のＬＵＡＤドライバー遺伝子に対応する４６３３個の転写開始部位（ＴＳＳ；単純化のために「転写物」とも称される）に対して、４２０００個のｓｇＲＮＡを設計し、注文した。得られるｓｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドライブラリー（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ｉｖ）－ｐｕｒｏベクターにクローニングし、クローニングステップ毎に高被覆率を維持した（ｓｇＲＮＡ当たりの得られるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数は２０００超であった）。プラスミドライブラリーを、高被覆率レンチウイルスライブラリーを産生するためにパッケージングベクターｐｓＰＡＸおよびエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。
ＣＲＩＳＰＲｉ－ドロップアウトスクリーニングは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２を肺腺癌（ＬＵＡＤ）細胞株についての必須生存因子として特定した。
材料および方法
Ａ）ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングワークフロー
ＴＣＧＡおよびＴＡＮＲＩＣデータベースからの肺腺癌（ＬＵＡＤ）と正常肺患者試料との間で差次的に発現される２０５８個の遺伝子、ならびに３０個の機能アノテーション付き陽性対照遺伝子および１０個の公知のＬＵＡＤドライバー遺伝子に対応する４６３３個の転写開始部位（ＴＳＳ；単純化のために「転写物」とも称される）に対して、４２０００個のｓｇＲＮＡを設計し、注文した。得られるｓｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドライブラリー（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ｉｖ）－ｐｕｒｏベクターにクローニングし、クローニングステップ毎に高被覆率を維持した（ｓｇＲＮＡ当たりの得られるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数は２０００超であった）。プラスミドライブラリーを、高被覆率レンチウイルスライブラリーを産生するためにパッケージングベクターｐｓＰＡＸおよびエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。
各細胞に最高で１つのｓｇＲＮＡが形質導入されることを確実にするために低い感染多重度（ＭＯＩ約０．３）で、かつすべてのｓｇＲＮＡの統計的検出力のある表示を確実にするために高被覆率（抗生物質選択後に１つのｓｇＲＮＡ当たり５００または１０００個の細胞）で、レンチウイルスライブラリーを８種のＬＵＡＤ細胞株（Ｃａｌｕ－６、ＰＣ－９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＮＣＩ－Ｈ８３８、ＮＣＩ－Ｈ１６５０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＮＣＩ－Ｈ３１２２およびＨＣＣ８２７）に形質導入した。形質導入後、細胞を４８時間のピューロマイシン選択にかけた。得られる細胞プールを、形質導入後２１日間培養で維持し、最低で５００倍または１０００倍の被覆率を得た。２１日目（エンドポイント）に、細胞を回収し、ペレット化し、次のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）単離のために瞬間冷凍した。各細胞株について２つの独立したスクリーニング反復を行った。
ｓｇＲＮＡ－挿入物を、ｇＤＮＡ（エンドポイント試料）およびプラスミドライブラリー（参照試料）からＰＣＲ増幅し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）にかけた。参照試料およびエンドポイント試料中のｓｇＲＮＡ表示、枯渇したｓｇＲＮＡおよび転写物の特定を、ＭＡＧｅＣＫパイプラインにより行った（Li, W., Xu, H., Xiao, T. et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol 15, 554 (2014)）。
結果
陰性対照転写物として演算集計した非標的化ｓｇＲＮＡ（Ｎ＝２０５）に対する、ＣＡＳＰ８ＡＰ２、主要必須遺伝子転写物（Ｎ＝２８９）、陽性対照遺伝子転写物（Ｎ＝１２７）についての、すべてのエンドポイントと参照試料との間の、陰性選択についてのロバストランクアグリゲーション（ＲＲＡ）スコアおよびｓｇＲＮＡ対応リードカウントにおける倍変化は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２を標的化するｓｇＲＮＡは、スクリーニングエンドポイントにおいてプールから有意に枯渇されたことを実証し、このことは肺がん生存率におけるＣＡＳＰ８ＡＰ２の本質的な役割を示唆した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す）。図１ＢおよびＣを参照されたい。
陰性対照転写物として演算集計した非標的化ｓｇＲＮＡ（Ｎ＝２０５）に対する、ＣＡＳＰ８ＡＰ２、主要必須遺伝子転写物（Ｎ＝２８９）、陽性対照遺伝子転写物（Ｎ＝１２７）についての、すべてのエンドポイントと参照試料との間の、陰性選択についてのロバストランクアグリゲーション（ＲＲＡ）スコアおよびｓｇＲＮＡ対応リードカウントにおける倍変化は、ＣＡＳＰ８ＡＰ２を標的化するｓｇＲＮＡは、スクリーニングエンドポイントにおいてプールから有意に枯渇されたことを実証し、このことは肺がん生存率におけるＣＡＳＰ８ＡＰ２の本質的な役割を示唆した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す）。図１ＢおよびＣを参照されたい。
[実施例２]
３種の個々のｓｇＲＮＡによるＣＡＳＰ８ＡＰ２のノックダウンは、ＬＵＡＤ細胞株Ｃａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）の細胞生存率における有意な減少を実証した。
材料および方法
ｓｇＲＮＡ選択、クローニングおよびレンチウイルス産生
ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにおいて使用される個々のｓｇＲＮＡを、ＭＡＧｅＣＫカウントパイプライン（Li et al.、上記に引用される）によって計算されるそれらの性能スコアによってランク付けし；すべてのスクリーニングした細胞株のすべての反復にわたり最も高い累積的性能スコアを有するＣＡＳＰ８ＡＰ２についての３種のｓｇＲＮＡ（ＥＮＳＴ０００００５５２４０１）を、スクリーニング結果の確証のために選択した。
３種の個々のｓｇＲＮＡによるＣＡＳＰ８ＡＰ２のノックダウンは、ＬＵＡＤ細胞株Ｃａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）の細胞生存率における有意な減少を実証した。
材料および方法
ｓｇＲＮＡ選択、クローニングおよびレンチウイルス産生
ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにおいて使用される個々のｓｇＲＮＡを、ＭＡＧｅＣＫカウントパイプライン（Li et al.、上記に引用される）によって計算されるそれらの性能スコアによってランク付けし；すべてのスクリーニングした細胞株のすべての反復にわたり最も高い累積的性能スコアを有するＣＡＳＰ８ＡＰ２についての３種のｓｇＲＮＡ（ＥＮＳＴ０００００５５２４０１）を、スクリーニング結果の確証のために選択した。
ｓｇＲＮＡ配列は、
ｓｇＮＣ＿１（対照）：ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧ（配列番号１）
ｓｇＮＣ＿２（対照）：ＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡ（配列番号２）
ｓｇＣ８ＡＰ２＿１：ＧＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＣＧＧＴ（配列番号３）
ｓｇＣ８ＡＰ２＿２：ＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣ（配列番号４）
ｓｇＣ８ＡＰ２＿３：ＧＣＧＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧ（配列番号５）
であった。
ｓｇＮＣ＿１（対照）：ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧ（配列番号１）
ｓｇＮＣ＿２（対照）：ＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡ（配列番号２）
ｓｇＣ８ＡＰ２＿１：ＧＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＣＧＧＴ（配列番号３）
ｓｇＣ８ＡＰ２＿２：ＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣ（配列番号４）
ｓｇＣ８ＡＰ２＿３：ＧＣＧＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧ（配列番号５）
であった。
個々のｓｇＲＮＡ構築物を、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈによりＥｓｐ３Ｉ－互換性粘着性末端を有する脱塩オリゴヌクレオチドの形態で合成し、Ｅｓｐ３Ｉによるベクターの制限酵素消化および続くｓｇＲＮＡ－オリゴヌクレオチドとのライゲーションによって、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ｉｖ）－ｐｕｒｏベクターへクローニングした。クローニングしたｓｇＲＮＡ含有構築物、パッケージングベクターｐｓＰＡＸ２およびエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＰＥＩ媒介性トランスフェクションによって、レンチウイルスを産生した。
肺腺癌（ＬＵＡＤ）細胞株のレンチウイルス形質導入
Ｃａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１９７５およびＮＣＩ－Ｈ８３８細胞株（各々ＡＴＣＣから得た）を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地においてルーチン培養した。形質導入のために、細胞を２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下において各々のレンチウイルスストックを形質導入した。２０時間後、レンチウイルス含有培地を除去し、細胞をＰＢＳにより洗浄し、同じプレート上において１：３の比に分け；細胞懸濁液の残りの３分の２は、次のＲＮＡ単離のために６ウェルプレートに播種した。２４時間後、形質導入に成功した細胞の選択のために、２４および６ウェルプレートの両方の培地をピューロマイシン（Ｃａｌｕ－６およびＮＣＩ－Ｈ８３８について０．５μｇ／ｍＬ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５について１μｇ／ｍＬ）を補充した培地に交換した。実験の終わりまでピューロマイシンを培地中で維持し、４８時間毎に補充した。
Ｃａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｈ１９７５およびＮＣＩ－Ｈ８３８細胞株（各々ＡＴＣＣから得た）を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地においてルーチン培養した。形質導入のために、細胞を２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下において各々のレンチウイルスストックを形質導入した。２０時間後、レンチウイルス含有培地を除去し、細胞をＰＢＳにより洗浄し、同じプレート上において１：３の比に分け；細胞懸濁液の残りの３分の２は、次のＲＮＡ単離のために６ウェルプレートに播種した。２４時間後、形質導入に成功した細胞の選択のために、２４および６ウェルプレートの両方の培地をピューロマイシン（Ｃａｌｕ－６およびＮＣＩ－Ｈ８３８について０．５μｇ／ｍＬ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５について１μｇ／ｍＬ）を補充した培地に交換した。実験の終わりまでピューロマイシンを培地中で維持し、４８時間毎に補充した。
ピューロマイシン添加の４８時間後（非形質導入対照細胞の完全な死の時点）、６ウェルプレートに播種したＣａｌｕ－６およびＮＣＩ－Ｈ８３８細胞を、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｎｉ／Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＲＮＡ溶解緩衝液を使用して溶解した（全Ｔ＝形質導入後４日間）。ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を、選択開始の７２時間後にＲＮＡ単離のために溶解した（全Ｔ＝形質導入後５日間）。Ｃａｌｕ－６からのＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して単離し、ＮＣＩ－Ｈ１９７５およびＮＣＩ－Ｈ８３８からのＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して製造業者の使用説明書に従って、ＤＮアーゼ処理は３０分間に延長して単離した。
ピューロマイシンの２４ウェルプレートへの添加の２４時間後、Ｃａｌｕ－６細胞を、ピューロマイシンを補充した培地中の同じプレートで１：４の比に分けた。７２時間後、細胞を、透明９６ウェルプレートのピューロマイシンを補充した培地中に比例して播種して、異なる形質導入にわたる細胞数の比を維持した（２４ウェルプレートの各ウェルからの細胞の１２％は、９６ウェルプレートの３つのウェル間で均等に分けられた）。４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｃａｌｕ－６細胞について行った（全Ｔ＝形質導入から８日間）。
ピューロマイシンの２４ウェルプレートへの添加の９６時間後、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を、ピューロマイシンを補充した培地中の同じプレートで１：３の比に分けた。７２時間後、形質導入したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を、透明９６ウェルプレートのピューロマイシンを補充した培地中に比例して播種した（２４ウェルプレートの各ウェルからの細胞の１２％は、９６ウェルプレートの３つのウェル間で均等に分けられた）。９６時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞について行った（全Ｔ＝形質導入から１３日間）。
ピューロマイシンの２４ウェルプレートへの添加の４８時間後、形質導入したＮＣＩ－Ｈ８３８細胞を、透明９６ウェルプレートに比例して播種した（２４ウェルプレートの各ウェルからの細胞の１６％は、９６ウェルプレートの３つのウェル間で均等に分けられた）。７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを、ＮＣＩ－Ｈ８３８細胞について行った（全Ｔ＝形質導入から７日間）。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、９６ウェルプレートにおいて製造業者のプロトコールに従って、ＰＢＳ中に１：４希釈したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を使用して行った。各生物学的反復を、技術的三連で行った。各生物学的反復について、データを、各々の陰性対照シグナルに対して正規化し、個々の値としてプロットした。バーの高さは平均値を表し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して有意性検定を行い、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５として表した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、９６ウェルプレートにおいて製造業者のプロトコールに従って、ＰＢＳ中に１：４希釈したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を使用して行った。各生物学的反復を、技術的三連で行った。各生物学的反復について、データを、各々の陰性対照シグナルに対して正規化し、個々の値としてプロットした。バーの高さは平均値を表し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して有意性検定を行い、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５として表した。
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびランダムヘキサマープライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造業者の使用説明書に従って、ＲＮＡを逆転写した。２ｘ Ｐｏｗｅｒ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓサイクラーを使用して、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を技術的三連で行った。ＧＡＰＤＨを、２－ｄｄＣｔ正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。プライマー配列は、以下の通りであった。
ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびランダムヘキサマープライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造業者の使用説明書に従って、ＲＮＡを逆転写した。２ｘ Ｐｏｗｅｒ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓサイクラーを使用して、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を技術的三連で行った。ＧＡＰＤＨを、２－ｄｄＣｔ正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。プライマー配列は、以下の通りであった。
ＣＡＳＰ８ＡＰ２－ＦＷ：ＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡ（配列番号６）
ＣＡＳＰ８ＡＰ２－ＲＶ：ＣＣＣＡＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＣＡＧＴＧ（配列番号７）
ＧＡＰＤＨ－ＦＷ：ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ－ＲＶ：ＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＣ（配列番号９）
ＣＡＳＰ８ＡＰ２－ＲＶ：ＣＣＣＡＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＣＡＧＴＧ（配列番号７）
ＧＡＰＤＨ－ＦＷ：ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ－ＲＶ：ＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＣ（配列番号９）
結果
Ａ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（ＣＴＧ）は、２種の陰性対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＮＣ）と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｇＲＮＡを発現する３種の構築物（ｓｇＣ８ＡＰ２）を独立的に形質導入したＬＵＡＤ細胞において、発光シグナルにおける有意な減少を示した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；１条件当たりＮ＝３）；図２Ａを参照されたい。
Ａ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（ＣＴＧ）は、２種の陰性対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＮＣ）と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｇＲＮＡを発現する３種の構築物（ｓｇＣ８ＡＰ２）を独立的に形質導入したＬＵＡＤ細胞において、発光シグナルにおける有意な減少を示した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；１条件当たりＮ＝３）；図２Ａを参照されたい。
Ｂ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、２種の陰性対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＮＣ）と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対する３種の独立したｓｇＲＮＡ（ｓｇＣ８ＡＰ２）によるノックダウンに際して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２発現における有意な減少を確認した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１条件当たりＮ＝３）；図２Ｂを参照されたい。
[実施例３]
ｓｉＰＯＯＬによるＣＡＳＰ８ＡＰ２のＲＮＡｉ媒介性ノックダウン
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクションおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ
正常（非形質転換）肺細胞株ＩＭＲ－９０およびＷＩ－３８細胞株（ＡＴＣＣから得た）を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＭＥＭイーグル培地（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中でルーチン培養した。すべてのＬＵＡＤ細胞株を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中でルーチン培養した。
ｓｉＰＯＯＬによるＣＡＳＰ８ＡＰ２のＲＮＡｉ媒介性ノックダウン
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクションおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ
正常（非形質転換）肺細胞株ＩＭＲ－９０およびＷＩ－３８細胞株（ＡＴＣＣから得た）を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＭＥＭイーグル培地（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中でルーチン培養した。すべてのＬＵＡＤ細胞株を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中でルーチン培養した。
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において透明９６ウェルプレートにて技術的三連で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクション試薬として使用して、細胞に逆トランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を上記に説明されるプロトコールに従って行った。
ＲＮＡ単離およびＲＴ－ｑＰＣＲのためのｓｉＰＯＯＬトランスフェクション
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において６ウェルプレートにて、９６ウェルフォーマットから比例してスケールアップした細胞数および試薬量を使用して、細胞に逆トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間において、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＲＮＡ溶解緩衝液により細胞を溶解した。次に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ単離を行った。ＲＮＡを逆転写し、上記に説明されるプロトコールに従ってＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において６ウェルプレートにて、９６ウェルフォーマットから比例してスケールアップした細胞数および試薬量を使用して、細胞に逆トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間において、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＲＮＡ溶解緩衝液により細胞を溶解した。次に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ単離を行った。ＲＮＡを逆転写し、上記に説明されるプロトコールに従ってＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
結果
ｓｉＰＯＯＬによるＣＡＳＰ８ＡＰ２のＲＮＡｉ媒介性ノックダウンは、非形質転換肺細胞株ＩＭＲ－９０およびＷＩ－３８の生存率と比較して、肺腺癌（ＬＵＡＤ）細胞株Ｃａｌｕ－６、ＰＣ－９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）の細胞生存率における有意な減少を実証した。
ｓｉＰＯＯＬによるＣＡＳＰ８ＡＰ２のＲＮＡｉ媒介性ノックダウンは、非形質転換肺細胞株ＩＭＲ－９０およびＷＩ－３８の生存率と比較して、肺腺癌（ＬＵＡＤ）細胞株Ｃａｌｕ－６、ＰＣ－９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）の細胞生存率における有意な減少を実証した。
Ａ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（ＣＴＧ）は、トランスフェクション後７２時間において、陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ）をトランスフェクトした各々の細胞株と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＣ８ＡＰ２）をトランスフェクトしたすべての試験した肺／ＬＵＡＤ細胞株についての発光シグナルにおける有意な減少を示した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す；１条件当たりＮ＝３～４）；図３Ａを参照されたい。
Ｂ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、トランスフェクション後４８時間において、ｓｉＮＣをトランスフェクトした各々の細胞株と比較して、ｓｉＣ８ＡＰ２をトランスフェクトしたすべての試験した肺およびＬＵＡＤ細胞株における有意なｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンを確認した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１条件当たりＮ＝３）；図３Ｂを参照されたい。
[実施例４]
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ発光アポトーシスアッセイ
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクションおよびＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏアポトーシスアッセイ
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において白色９６ウェルプレートにて技術的二連で、細胞に逆トランスフェクトした。バックグラウンドリードを得るために、培地の種類毎に２つのウェルを培地のみで満たした（トランスフェクション試薬を混合するために実験ウェルで使用したのと同体積のＯｐｔｉＭｅｍと混合した）。
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ発光アポトーシスアッセイ
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクションおよびＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏアポトーシスアッセイ
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において白色９６ウェルプレートにて技術的二連で、細胞に逆トランスフェクトした。バックグラウンドリードを得るために、培地の種類毎に２つのウェルを培地のみで満たした（トランスフェクション試薬を混合するために実験ウェルで使用したのと同体積のＯｐｔｉＭｅｍと混合した）。
トランスフェクション後４８時間において、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏアッセイ（Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ８およびＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ９、Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の使用説明書に従って行った。簡潔に説明すると、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ試薬を、提供された基質および緩衝液（推奨される通りにＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ８およびＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ９についてＭＧ－１３２を伴って供給した）と混合し、不透明管に分注し、－８０℃において保存した。アッセイ前に試薬を室温になるまで１．５時間平衡化した。各アリコートは、凍結融解の反復によるシグナル損失を避けるために、１回のみ使用された。
プレートを室温まで３０分間平衡化し、その後、等体積（１００μＬ／ウェル）のＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ試薬を添加した。その後、プレートを光から保護して、４００ｒｐｍの軌道振盪器に２分間置いて細胞溶解を促進し、室温で１時間インキュベートして発光シグナルを安定化させ、その後リードアウトを行った。各々のバックグラウンドリードを、実験リードから差し引いた。アッセイプロトコールのさらなる詳細は、https://www.promega.de/-/media/files/resources/protocols/technical-bulletins/101/caspase-glo-3-7-assay-protocol.pdf?la=enにおいて見出すことができる。
結果
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ発光アポトーシスアッセイは、トランスフェクション後４８時間において、陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ）をトランスフェクトした各々の細胞株と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＣ８ＡＰ２）をトランスフェクトした、ＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）におけるエフェクターカスパーゼ－３／７ならびに外因性（カスパーゼ－８）および内因性（カスパーゼ－９）カスパーゼカスケードの両方の有意な活性化を実証したが、正常肺細胞株ＩＭＲ－９０においては実証しなかった（スチューデントｔ検定；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す；１条件当たりＮ＝３）；図４を参照されたい。
Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ発光アポトーシスアッセイは、トランスフェクション後４８時間において、陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ）をトランスフェクトした各々の細胞株と比較して、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＣ８ＡＰ２）をトランスフェクトした、ＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）におけるエフェクターカスパーゼ－３／７ならびに外因性（カスパーゼ－８）および内因性（カスパーゼ－９）カスパーゼカスケードの両方の有意な活性化を実証したが、正常肺細胞株ＩＭＲ－９０においては実証しなかった（スチューデントｔ検定；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す；１条件当たりＮ＝３）；図４を参照されたい。
[実施例５]
フローサイトメトリーによるＢｒｄＵ組込み／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に基づく細胞周期解析
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクションおよびＢｒｄＵ組込み
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において１０ｃｍの細胞培養皿にて、９６ウェルフォーマットから比例してスケールアップした細胞数および試薬量を使用して、細胞に逆トランスフェクトした。トランスフェクション後４６時間において、ＢｒｄＵを、１０μＭの最終濃度になるように細胞培養培地に添加した。２時間後（トランスフェクションの４８時間後）、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、１５ｍＬ管に収集し、ペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、ボルテックスしながら２．５ｍＬの氷冷１００％エタノールを添加することより固定し、続いて４℃で一晩インキュベートした。保存のために、細胞を－２０℃に移した。
フローサイトメトリーによるＢｒｄＵ組込み／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に基づく細胞周期解析
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクションおよびＢｒｄＵ組込み
各々のｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造された；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す）を、１０ｎＭの最終濃度において１０ｃｍの細胞培養皿にて、９６ウェルフォーマットから比例してスケールアップした細胞数および試薬量を使用して、細胞に逆トランスフェクトした。トランスフェクション後４６時間において、ＢｒｄＵを、１０μＭの最終濃度になるように細胞培養培地に添加した。２時間後（トランスフェクションの４８時間後）、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、１５ｍＬ管に収集し、ペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、ボルテックスしながら２．５ｍＬの氷冷１００％エタノールを添加することより固定し、続いて４℃で一晩インキュベートした。保存のために、細胞を－２０℃に移した。
抗ＢｒｄＵ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリー解析
固定した細胞をペレット化し、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を補充したＰＢＳ中で洗浄し、２Ｍ ＨＣｌ中において２０分間インキュベートして、ＤＮＡ加水分解を促進し、続いてさらに洗浄し、０．１Ｍテトラホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中において２分間インキュベートした。その後、細胞を再び洗浄し、ペレット化し、光から保護してＦＩＴＣ標識した抗ＢｒｄＵ抗体（３６４１０４番、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と室温において１時間インキュベートした。その後、試料を洗浄し、ペレット化し、光から保護して１００μｇ／ｍＬのＲＮアーゼを補充した５０ｎｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム溶液と３７℃において１０分間インキュベートした。試料を氷上で維持し、光から保護し、即座にＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＦＡＣＳにおけるフローサイトメトリーによって解析した。一般的な細胞周期解析およびＢｒｄＵ組込み解析のために、ＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｗ／ＦＳＣ－Ｈに基づく排除基準を使用して単一細胞について、得られたシグナルをゲーティングした。ｓｕｂＧ１解析のために、ゲーティングしていない全細胞集団を使用した。解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアにおいて行った。
固定した細胞をペレット化し、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を補充したＰＢＳ中で洗浄し、２Ｍ ＨＣｌ中において２０分間インキュベートして、ＤＮＡ加水分解を促進し、続いてさらに洗浄し、０．１Ｍテトラホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中において２分間インキュベートした。その後、細胞を再び洗浄し、ペレット化し、光から保護してＦＩＴＣ標識した抗ＢｒｄＵ抗体（３６４１０４番、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と室温において１時間インキュベートした。その後、試料を洗浄し、ペレット化し、光から保護して１００μｇ／ｍＬのＲＮアーゼを補充した５０ｎｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム溶液と３７℃において１０分間インキュベートした。試料を氷上で維持し、光から保護し、即座にＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＦＡＣＳにおけるフローサイトメトリーによって解析した。一般的な細胞周期解析およびＢｒｄＵ組込み解析のために、ＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｗ／ＦＳＣ－Ｈに基づく排除基準を使用して単一細胞について、得られたシグナルをゲーティングした。ｓｕｂＧ１解析のために、ゲーティングしていない全細胞集団を使用した。解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアにおいて行った。
結果
フローサイトメトリーによるＢｒｄＵ組込み／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に基づく細胞周期解析は、トランスフェクション後４８時間におけるｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際して、Ｓ期のＢｒｄＵ陰性画分を有する正常肺細胞株ＩＭＲ－９０における細胞周期進行（Ａ）と、ＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５、Ｂ）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８、Ｃ）におけるＳ期のＢｒｄＵ陽性画分の細胞周期進行との間の差を実証した。
フローサイトメトリーによるＢｒｄＵ組込み／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に基づく細胞周期解析は、トランスフェクション後４８時間におけるｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際して、Ｓ期のＢｒｄＵ陰性画分を有する正常肺細胞株ＩＭＲ－９０における細胞周期進行（Ａ）と、ＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５、Ｂ）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８、Ｃ）におけるＳ期のＢｒｄＵ陽性画分の細胞周期進行との間の差を実証した。
図５の上部のパネルは、陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ）をトランスフェクトした細胞のＰＩ染色およびＢｒｄＵ組込みプロファイルを表す；図５の中央部のパネルは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＣ８ＡＰ２）をトランスフェクトした細胞を表す；図５の下部のパネルは、ｓｉＣ８ＡＰ２をトランスフェクトした細胞とｓｉＮＣをトランスフェクトした細胞との、アノテーション付きの細胞周期の定量およびそれらの調節解除の統計解析を表す（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す；Ｎ＝３）。ｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際してのＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞のｓｕｂＧ１期の画分の有意な増加は、アポトーシス率における増加を示唆した。ＮＣＩ－Ｈ８３８細胞において同じ傾向が観察され、一方で、ＩＭＲ－９０細胞においてｓｕｂＧ１細胞の百分率の差は検出されなかった。
[実施例６]
正常肺細胞株ＩＭＲ－９０ならびにＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）は、ｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際して、ｐ２１ ｍＲＮＡレベルの増加およびヒストンｍＲＮＡレベルの調節（調節解除）の同様のパターンを示した。
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクション、ＲＮＡ単離およびＲＴ－ｑＰＣＲ
上記に説明される通りに手技を行った。以下のプライマーを使用してＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
ＣＤＫＮ１Ａ＿４８３ＦＷ：ＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号１０）
ＣＤＫＮ１Ａ＿５７７ＲＶ：ＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧ（配列番号１１）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ－２０２＿７０４ＦＷ：ＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣ（配列番号１２）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ－２０２＿８１７ＦＷ：ＣＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＡ（配列番号１３）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ－２０１＿２５２ＦＷ：ＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＣＴＧＴ（配列番号１４）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ－２０１＿３２２ＲＶ：ＴＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡ（配列番号１５）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ－２０１＿２７４ＦＷ：ＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧ（配列番号１６）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ－２０１＿３６６ＲＶ：ＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号１７）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ－２０１＿６７ＦＷ：ＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＧＡＡＡＧ（配列番号１８）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ－２０１＿１２７ＲＶ：ＧＧＴＡＡＣＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴ（配列番号１９）
正常肺細胞株ＩＭＲ－９０ならびにＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）は、ｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際して、ｐ２１ ｍＲＮＡレベルの増加およびヒストンｍＲＮＡレベルの調節（調節解除）の同様のパターンを示した。
材料および方法
ｓｉＰＯＯＬトランスフェクション、ＲＮＡ単離およびＲＴ－ｑＰＣＲ
上記に説明される通りに手技を行った。以下のプライマーを使用してＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
ＣＤＫＮ１Ａ＿４８３ＦＷ：ＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号１０）
ＣＤＫＮ１Ａ＿５７７ＲＶ：ＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧ（配列番号１１）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ－２０２＿７０４ＦＷ：ＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣ（配列番号１２）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ－２０２＿８１７ＦＷ：ＣＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＡ（配列番号１３）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ－２０１＿２５２ＦＷ：ＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＣＴＧＴ（配列番号１４）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ－２０１＿３２２ＲＶ：ＴＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡ（配列番号１５）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ－２０１＿２７４ＦＷ：ＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧ（配列番号１６）
ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ－２０１＿３６６ＲＶ：ＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号１７）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ－２０１＿６７ＦＷ：ＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＧＡＡＡＧ（配列番号１８）
ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ－２０１＿１２７ＲＶ：ＧＧＴＡＡＣＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴ（配列番号１９）
ウェスタンブロット
上記に説明される通りに６ウェルフォーマットにおいてｓｉＰＯＯＬを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間において冷ＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼおよびプロテアーゼアンタゴニストを補充した冷ＲＩＰＡ緩衝液中において溶解した。氷上の細胞に緩衝液を添加し、細胞スクレーパーによりウェル全体に分配させ、氷上で３０分間インキュベートした。溶解物を１．５ｍＬ管に収集し、卓上遠心分離機において最高速度にて４℃で１５分間遠心分離して細胞屑を除去した。清浄化した溶解物を新しい管に移し、－８０℃において保存した。
上記に説明される通りに６ウェルフォーマットにおいてｓｉＰＯＯＬを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間において冷ＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼおよびプロテアーゼアンタゴニストを補充した冷ＲＩＰＡ緩衝液中において溶解した。氷上の細胞に緩衝液を添加し、細胞スクレーパーによりウェル全体に分配させ、氷上で３０分間インキュベートした。溶解物を１．５ｍＬ管に収集し、卓上遠心分離機において最高速度にて４℃で１５分間遠心分離して細胞屑を除去した。清浄化した溶解物を新しい管に移し、－８０℃において保存した。
ＢＣＡアッセイを使用してタンパク質濃度を決定した。１試料当たり２０または３０μｇのタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ）上にブロットした。ヒストンＨ３に対する一次抗体（９７１５番、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびアルファ／ベータ－チューブリンに対する一次抗体（２１４８番、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、１：１０００希釈で使用し；二次抗体（ペルオキシダーゼ－ヤギ抗ウサギ１１１－０３５－１４４番、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００００希釈で使用した。膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｐｌｕｓ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して現像し、シグナルをＥＣＬ ＣｈｅｍｏＣａｍ Ｉｍａｇｅｒ（Ｉｎｔａｓ）においてモニターした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを定量に使用した。
結果
正常肺細胞株ＩＭＲ－９０ならびにＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）は、ｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際して、ｐ２１ ｍＲＮＡレベルの増加およびヒストンｍＲＮＡレベルの調節（調節解除）の同様のパターンを示した。
正常肺細胞株ＩＭＲ－９０ならびにＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）およびＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）は、ｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンに際して、ｐ２１ ｍＲＮＡレベルの増加およびヒストンｍＲＮＡレベルの調節（調節解除）の同様のパターンを示した。
Ａ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰｏｏｌ（ｓｉＣ８ＡＰ２）または陰性対照ｓｉＰｏｏｌ（ｓｉＮＣ）によるトランスフェクション後４８時間における、ＣＤＫＮ１ＡおよびＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ ｍＲＮＡレベルについてのＲＴ－ｑＰＣＲの結果。すべての試験した細胞株は、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）ｍＲＮＡレベルおよびＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ ｍＲＮＡにおける有意な増加を実証した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す：１条件当たりＮ＝３）；図６Ａを参照されたい。
Ｂ）ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫおよびＨＩＳＴ１Ｈ３ＤについてのＲＴ－ｑＰＣＲの結果。すべての試験した細胞株は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定すると、ｓｉＣ８ＡＰ２トランスフェクション後４８時間に際して、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ ｍＲＮＡレベルにおける有意な減少を実証し、かつＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ ｍＲＮＡレベルにおける有意な変化を実証しなかった。正常肺細胞株ＩＭＲ－９０およびＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５は、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ ｍＲＮＡレベルにおける有意な減少を実証したが、一方で、ＬＵＡＤ細胞株ＮＣＩ－Ｈ８３８において有意な変化は観察されなかった；図６Ｂを参照されたい。
ｓｉＣ８ＡＰ２をトランスフェクトした細胞およびｓｉＮＣをトランスフェクトした細胞における、Ｃ）ウェスタンブロット分析およびＤ）ヒストンＨ３発現の各々の定量。すべての試験した細胞株においてヒストンＨ３のタンパク質レベルにおける変化は観察されなかった（スチューデントｔ検定；Ｎ＝３）；図６ＣおよびＤを参照されたい。
[実施例７]
ＣＡＳＰ８ＡＰ２のｓｉＰＯＯＬ媒介性ノックダウンは、非肺がん細胞株の細胞生存率に対する不均一な効果を実証した。
材料／方法および結果
Ａ）６種の追加の非肺がん細胞株：ＨＣＴ１１６（結腸がん）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳がん）、ＭＣＦ－７（乳がん）、ＨｅｐＧ２（肝がん）、Ｐａｎｃ－１（膵がん）およびＭＫＮ－４５（胃がん）について、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＣ８ＡＰ２）または陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ）によるトランスフェクション後４８時間において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（ＣＴＧ）を行った。ｓｉＰＯＯＬを、ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造した；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す。ＨＣＴ１１６細胞は、ＬＵＡＤ細胞において観察される平均的な減少に匹敵する、細胞生存率における強い減少を示した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、Ｃａｌｕ－６ ＬＵＡＤ細胞株において観察される効果ほど明白でない効果を示した。また、３種の他の細胞株は、生存率における有意な減少を示した。ＭＫＮ－４５細胞は効果を示したが、これは統計的有意性に達しなかった（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す：１条件当たりＮ＝３～４）。非ＬＵＡＤがん細胞株についての実験条件は、上記に説明されるＬＵＡＤ実験の各々の条件を再現した；図７Ａを参照されたい。
ＣＡＳＰ８ＡＰ２のｓｉＰＯＯＬ媒介性ノックダウンは、非肺がん細胞株の細胞生存率に対する不均一な効果を実証した。
材料／方法および結果
Ａ）６種の追加の非肺がん細胞株：ＨＣＴ１１６（結腸がん）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳がん）、ＭＣＦ－７（乳がん）、ＨｅｐＧ２（肝がん）、Ｐａｎｃ－１（膵がん）およびＭＫＮ－４５（胃がん）について、ＣＡＳＰ８ＡＰ２に対するｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＣ８ＡＰ２）または陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ）によるトランスフェクション後４８時間において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（ＣＴＧ）を行った。ｓｉＰＯＯＬを、ｓｉＴＯＯＬｓ Ｂｉｏｔｅｃｈにより設計および製造した；ｓｉＰｏｏｌ１の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０～７９に示す；ｓｉＰｏｏｌ２の３０個のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号８０～１３９に示す。ＨＣＴ１１６細胞は、ＬＵＡＤ細胞において観察される平均的な減少に匹敵する、細胞生存率における強い減少を示した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、Ｃａｌｕ－６ ＬＵＡＤ細胞株において観察される効果ほど明白でない効果を示した。また、３種の他の細胞株は、生存率における有意な減少を示した。ＭＫＮ－４５細胞は効果を示したが、これは統計的有意性に達しなかった（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す：１条件当たりＮ＝３～４）。非ＬＵＡＤがん細胞株についての実験条件は、上記に説明されるＬＵＡＤ実験の各々の条件を再現した；図７Ａを参照されたい。
Ｂ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、トランスフェクション後４８時間において、ｓｉＮＣをトランスフェクトした各々の細胞株と比較して、ｓｉＣ８ＡＰ２をトランスフェクトしたすべての試験した細胞株において有意なｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウンを確認した（スチューデントｔ検定；３個のアステリスクはｐ＜０．００１を表す；２個のアステリスクはｐ＜０．０１を表す；１個のアステリスクはｐ＜０．０５を表す；１条件当たりＮ＝３）；図７Ｂを参照されたい。
Ｃ）トランスフェクション後４８時間における、非標的化陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ、１０ｎＭ）をトランスフェクトした各々の細胞株と比較した、ｓｉＣ８ＡＰ２をトランスフェクトしたすべての試験した細胞株におけるｓｉＰＯＯＬ媒介性ＣＡＳＰ８ＡＰ２ノックダウン（ｓｉＣ８ＡＰ２、１０ｎＭ）を確認するためのＲＴ－ｑＰＣＲ（ｎ＝３～６）；図８Ａを参照されたい。
Ｄ）トランスフェクション後７２時間における、非標的化陰性対照ｓｉＰＯＯＬ（ｓｉＮＣ、１０ｎＭ）をトランスフェクトした各々の細胞株と比較した、非形質転換肺線維芽細胞株ＩＭＲ－９０およびＷＩ－３８、ＮＳＣＬＣ ＬＵＡＤ細胞株Ｃａｌｕ－６、ＰＣ－９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（Ｈ１９７５）、ＮＣＩ－Ｈ８３８（Ｈ８３８）ならびにＮＳＣＬＣ ＬＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０（Ｈ４６０）およびＮＣＩ－Ｈ１２９９（Ｈ１２９９）に対するＣＡＳＰ８ＡＰ２ ｓｉＰＯＯＬ媒介性ノックダウン（ｓｉＣ８ＡＰ２、１０ｎＭ）の効果を評価するためのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（ＣＴＧ）（ｎ＝３～４）；図８Ｂを参照されたい。
各生物学的反復について、データを、各々の陰性対照シグナルに対して正規化し、個々の値としてプロットした。バーの高さは平均値を表し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して有意性検定を行い、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５として表した。正常細胞株と、ＣＡＳＰ８ＡＰ２サイレンシングに感受性のＮＳＣＬＣ細胞株との間での有意性検定を、対応のない両側スチューデントｔ検定およびウェルチの補正を使用して行った。
Claims (15)
- がんの予防または処置における使用のためのカスパーゼ－８関連タンパク質－２（ＣＡＳＰ８ＡＰ２）アンタゴニストであって、但し、アミノ酸配列ＳＭＭＰＤＥＬＬＴＳＬ（配列番号１４０）を含むペプチドまたはアミノ酸配列ＫＬＤＫＮＰＮＱＶ（配列番号１４１）を含むペプチドではないＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、がん細胞の生存率を低減する、請求項１に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、前記処置を受容する対象において正常細胞の生存率を有意に低減しない、請求項１または２に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記がんは胃がんおよび／または結腸がんおよび／または直腸がんではないことを条件とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記がんは肺がん、乳がん、膵がんまたは肝がんからなる群から選択され；好ましくは、前記がんは肺腺癌、肺扁平上皮がん、ＥＲ陽性／ＰＲ陽性乳がん、三種陰性乳がん、膵管腺癌または肝細胞癌であり；より好ましくは、前記がんは肺腺癌である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストはＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の転写および／もしくは翻訳、ならびに／またはＣＡＳＰ８ＡＰ２ ｍＲＮＡもしくはタンパク質の安定性を低減する、請求項１～５のいずれかに記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはＣＲＩＳＰＲ－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子またはそれに近接した調節エレメントの領域に結合することができ、かつ／またはこの領域に少なくとも部分的に相補的であり、好ましくは、前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子はヒトＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子である、請求項７に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ｓｉＲＮＡは前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の遺伝子発現に干渉することができ、前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の１５ヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的なＲＮＡの第１の鎖、および長さが１５～３０ヌクレオチドのＲＮＡの第２の鎖を含み、前記第１の鎖および第２の鎖の少なくとも１２ヌクレオチドは互いに相補的であり、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する、請求項７に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ｓｇＲＮＡは前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２遺伝子の１５ヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、加えてエンドヌクレアーゼ活性を欠くＣＲＩＳＰＲタンパク質は投与され、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質は少なくともＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）タンパク質のドメインに融合されている、請求項７に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質に特異的に結合する抗体またはその結合性断片であり、好ましくは、ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質に特異的に結合する前記抗体は、カスパーゼ－３、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８またはカスパーゼ－９から選択されるカスパーゼへのＣＡＳＰ８ＡＰ２の結合を少なくとも部分的に遮断し、好ましくは、前記カスパーゼはカスパーゼ－８である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニスト。
- 請求項１～１１のいずれか一項に記載のＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、がん細胞株において、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導されたカスパーゼ媒介性アポトーシス活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップであって、前記カスパーゼはカスパーゼ－３／７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９から選択される、ステップと、
ｉｉｉ）前記試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、前記試験化合物の非存在下におけるカスパーゼ媒介性アポトーシス活性と比較して、カスパーゼ－３／７および／またはカスパーゼ－８および／またはカスパーゼ－９のアポトーシス活性を増加させる場合、前記試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。 - ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するための方法であって、
ｉ）ＣＡＳＰ８ＡＰ２タンパク質への結合について試験化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ）場合により、ステップｉ）において特定した試験化合物によって誘導された、がん細胞の細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するステップと、
ｉｉｉ）前記試験化合物がＣＡＳＰ８ＡＰ２に結合し、場合により、前記試験化合物の非存在下におけるがん細胞の細胞生存率と比較して、がん細胞の細胞生存率を低減する場合、前記試験化合物をＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストとして選択するステップと
を含む方法。 - ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを含む医薬組成物を調製するための方法であって、請求項１３または１４に記載の方法によってＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを特定するステップと、前記ＣＡＳＰ８ＡＰ２アンタゴニストを少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と混合するステップとを含む方法。
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