JP2023543351A - 効率的かつ特異的なゲノム編集のためのコンストラクト及びその使用 - Google Patents

効率的かつ特異的なゲノム編集のためのコンストラクト及びその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に開示される実施形態は、新規な核酸誘導型ヌクレアーゼ、新規なガイド核酸、及び新規な標的化可能なヌクレアーゼシステム、ならびに使用方法を含む。いくつかの実施形態では、操作された非天然の核酸誘導型ヌクレアーゼは、標的化可能なヌクレアーゼシステム中で既知のガイド核酸と共に使用することができる。特定の実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼシステムを使用して、ヒト及び他の種の標的化ゲノムを編集することができる。いくつかの実施形態では、方法としては、反復的遺伝子操作法及び追跡可能な遺伝子操作法が挙げられるが、これらに限定されない。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１８日出願の米国仮出願第６３／０８０，５５２号及び２０２１年５月６日出願の米国仮出願第６３／１８５，３１５号の優先権を主張するものであり、これらの出願は参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）の略である。回文配列リピートでは、ヌクレオチドの配列は両方向で同じである。これらの回文配列リピートのそれぞれの後に、スペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）遺伝子の小クラスターは、ＣＲＩＳＰＲ配列に隣接して位置している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、原核生物に一種の獲得免疫を提供するプラスミド及びファージ内に存在するものなどの、外来遺伝要素に対する耐性を付与できる原核免疫システムである。スペーサー配列を持つＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質が外因性ＤＮＡを認識して切断するのを助ける。ＣＲＩＳＰＲ配列は細菌ゲノムの約５０％に見られ、配列決定された古細菌の９０％近くが、不要な代謝産物の生合成を防ぎ、資源を最適に分配して全体的な細胞の適応度を最大化する、効率的で堅牢な代謝及び調節ネットワークを選択している。その構造及び機能を理解するためのアプローチが限られたこれらのネットワークの複雑さ、ならびに細胞ネットワークを再プログラミングして様々な応用のためにこれらのシステムを修飾する能力のために、この分野の進歩は困難なものとなっている。細胞ネットワークを再プログラミングするための特定のアプローチは、複雑な経路の単一の遺伝子を修飾することを目的としているが、単一の遺伝子を修飾した結果、この遺伝子または他の遺伝子への望ましくない修飾が発生して、求められているエンドポイントを達成するために必要な変更を特定するのを妨げ、また修飾によって求められるエンドポイントを困難にする場合がある。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによるゲノム編集及び操作は、生物学及びバイオテクノロジー全般に劇的な影響を与えた。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集システムは、ポリヌクレオチド誘導型ヌクレアーゼ、ゲノムの特異的領域を切断するようにヌクレアーゼを誘導するガイドポリヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））、及び任意選択的に、切断されたｄｓＤＮＡを修復することによって目的の部位にプログラム可能な編集を組み込むために使用され得るドナーＤＮＡカセットを必要とする。最初期のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集の実演及び応用では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び関連するｇＲＮＡが使用されていた。これらのシステムは、細菌から動物及び場合によってはヒトなどの高次哺乳類システムまで包含する様々な種における遺伝子編集に使用されている。しかしながら、とりわけプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の特異性、編集効率、及びオフターゲット率などの重要な編集パラメーターが、種、遺伝子座、及びヌクレアーゼに依存することは、十分に実証されている。全体的な編集機能を拡張及び改善するために利用可能な新規なヌクレアーゼシステムを特定して迅速に特性決定することに関心が高まっている。
Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９と比較して異なる特徴を有するゲノム編集が可能な単一のＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼであることが知られている。特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａに基づくシステムは、ゲノムへのドナーＤＮＡの迅速かつ信頼性の高い導入を可能にする。更に、Ｃａｓ１２ａはゲノム編集を拡張する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａゲノム編集は、ヒト細胞のみならず、植物を含む他の生物においても評価されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａシステムのいくつかの特徴は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と比較すると異なる。
Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼは、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、５’－ＴＴＴＮ－３’（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ）及び５’－ＴＴＮ－３’（ＦｎＣａｓ１２ａ））を認識し、一方で、ＳｐＣａｓ９の匹敵する配列はＮＧＧであることは知られている。Ｃａｓ１２ａのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列の５’末端に位置し、これは、Ｃａｓ９では３’末端にある。更に、Ｃａｓ１２ａは、プロトスペーサーの＋１８／＋２３位付近で、そのＰＡＭの遠位にあるＤＮＡを切断することができる。この切断は千鳥状のＤＮＡオーバーハング（例えば粘着末端）を生成するが、Ｃａｓ９は両方の鎖のプロトスペーサーの３’位の後にそのＰＡＭの近くで切断して平滑末端を作成する。特定の方法では、ヌクレアーゼの認識を変更することで、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａに勝る改善をもたらし、精度を改善させることができる。更に、Ｃａｓ１２ａは単一のｃｒＲＮＡによって誘導され、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないため、Ｃａｓ９によって使用されるｓｇＲＮＡよりも短いｇＲＮＡ配列が得られる。
Ｃａｓ１２ａは、ｃｒＲＮＡプロセシング中に機能する追加のリボヌクレアーゼ活性を示すことも知られている。Ｃａｓ１２ａは、様々な種（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対する編集ツールとして使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって認識されるものと比較して代替的ＰＡＭシーケンスの使用を可能にする。
よく知られているＣａｓ１２ａタンパク質－ＲＮＡ複合体は、ＴリッチＰＡＭを認識し、切断によって千鳥状のＤＮＡ二本鎖切断をもたらす。Ｃａｓ１２ａタイプのヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルによって形成されるシュードノット構造と相互作用する。シード領域及び３’末端から構成されるガイドＲＮＡセグメントは、標的ＤＮＡ配列と相補的な結合配列を有している。これまでに特性決定されているＣａｓ１２ａタイプのヌクレアーゼは、単一のｇＲＮＡで機能し、ｇＲＮＡアレイを処理することが実証されている。Ｃａｓ１２ａタイプ及びＣａｓ９ヌクレアーゼシステムは非常に影響力が強いことが証明されているが、どちらのシステムも、遺伝子編集技術で想定されるあらゆる応用を可能にするために必要とされるほど予測どおりに機能することは実証されていない。
現状では、効率及び精度が向上した改善されたＣＲＩＳＰＲ編集システムを操作するための様々な取り組みが試みられており、これには、ＰＡＭの特異性、安定性、及びｇＲＮＡ及び／またはヌクレアーゼの配列の操作が含まれる。例えば、ｇＲＮＡの安定性を高めることが予想されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの化学修飾は、ヒト細胞中で３．８倍高いインデル頻度をもたらすことがわかっている。更に、他の研究は、Ｃａｓ１２ａの構造誘導型突然変異誘発を含んでおり、認識されるＰＡＭ配列の範囲が増加したバリアントを特定するためにスクリーニングされている。これらの操作されたＡｓＣａｓ１２ａは、確立されたＴＴＴＶ配列に加えてＴＹＣＶ及びＴＡＴＶ ＰＡＭを認識し、インビトロ及び試験したヒト細胞で活性が強化されている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つのバージョンであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、標的化ゲノムを編集するのに有用なツールを提供するように修飾されている。合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成したＣａｓ９ヌクレアーゼを細胞内に送達することにより、細胞のゲノムを所定の位置で切断／編集して、既存の遺伝子を削除する、及び／または新しい遺伝子を追加することが可能となり得る。これらのシステムは有用であるが、標的化編集の効率及び精度に関するいくつかの重要な制限、不正確な編集の問題、ならびに、遺伝子置換などの商業的に関連する状況で用いられる場合の障害を有する。したがって、効率が改善された指向性かつ正確な編集のための改善された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムに対する必要性が存在する。
実施形態１は、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼを含む組成物であって、（ｉ）配列番号１４３～１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または配列番号１４３～１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、組成物を提供する。実施形態２．配列番号１４４、１５３、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１４４、１５３、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の組成物。実施形態３．配列番号１４４と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１４４と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態１または２に記載の組成物。実施形態４．配列番号１５３と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１５３と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。実施形態５．配列番号２２９と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号２２９と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。実施形態６．前記配列同一性が少なくとも８０％である、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。実施形態７．前記配列同一性が少なくとも９５％である、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。実施形態８．前記配列同一性が１００％である、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。実施形態９．前記操作されたヌクレアーゼポリペプチドが、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含有しない、または、前記操作されたヌクレアーゼポリペプチドをコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドが前記ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含有しない、実施形態１に記載の組成物。実施形態１０．配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態９に記載の組成物。実施形態１１．配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態１０に記載の組成物。実施形態１２．標的化可能なガイド核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む組成物であって、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作されたガイド核酸ヌクレアーゼを含み、（ｉｉ）適合性のガイド核酸を更に含む、組成物。実施形態１３．前記ガイド核酸がｇＲＮＡであり、前記複合体がＲＮＰである、実施形態１２に記載の組成物。実施形態１４．前記ガイド核酸が、スプリットガイド核酸である、実施形態１２または１３に記載の組成物。実施形態１５． 前記ｇＲＮＡが操作されたｇＲＮＡである、実施形態１３または１４に記載の組成物。実施形態１６．前記操作されたｇＲＮＡが、保存されたｇＲＮＡを含む、実施形態１５に記載の組成物。実施形態１７．前記保存されたｇＲＮＡが、配列番号２９１～３２５のうちのいずれか１つ、またはその部分を含む、実施形態１６に記載の組成物。実施形態１８．前記保存されたｇＲＮＡが、配列番号２９１～３２５のうちのいずれか１つの部分を含む、実施形態１７に記載の組成物。実施形態１９．前記部分が、前記ＲＮＡの二次構造のヌクレオチド配列を含む高度に保存された部分である、実施形態１８に記載の組成物。実施形態２０．前記二次構造がシュードノットを含む、実施形態１８に記載の組成物。実施形態２１．前記ｇＲＮＡが合成ｇＲＮＡである、実施形態１３～２０のいずれか１項に記載の組成物。実施形態２２． 前記ｇＲＮＡが１つ以上の化学修飾を含む、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態２３．標的ポリヌクレオチド中の標的配列またはその近傍に鎖切断を生成する方法であって、前記標的配列を、実施形態１２～２２のいずれか１項に記載の標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体と接触させ、前記複合体の前記適合性のガイド核酸が、前記標的配列を標的化することと、前記標的化可能なガイド核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体に、前記鎖切断を生成させることと、を含む方法。実施形態２４．前記標的ポリヌクレオチドが細胞ゲノム中にある、実施形態２３に記載の方法。実施形態２５．前記標的配列に挿入されるべき編集テンプレートを提供することを更に含む、実施形態２３または２４に記載の方法。実施形態２６．前記編集テンプレートが導入遺伝子を含む、実施形態２５に記載の方法。実施形態２７．前記標的ポリヌクレオチドがセーフハーバー部位である、実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の方法。実施形態２８．実施形態２３に記載の実施形態によって生成された細胞。実施形態２９．実施形態２３に記載の方法によって生成された生物。実施形態３０．配列番号１～１４２及び２２５～２２８のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む操作された１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、組成物。実施形態３１．配列番号１、５、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、及び２２５のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態３０に記載の組成物。実施形態３２．前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、またはその両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする、実施形態３０または３１に記載の組成物。実施形態３３．前記追加のアミノ酸配列が、（ｉ）１つ以上のＮＬＳ、（ｉｉ）１つ以上の精製タグ、（ｉｉｉ）１つまたは切断配列、及び（ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧのうちの少なくとも１つを含む、実施形態３２に記載の組成物。実施形態３４．前記追加のアミノ酸配列が、（ｉ）１つ以上のＮＬＳ、（ｉｉ）１つ以上の精製タグ、（ｉｉｉ）１つまたは切断配列、及び（ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧのうちの少なくとも２つを含む、実施形態３２に記載の組成物。実施形態３５．前記追加のアミノ酸配列が、（ｉ）１つ以上のＮＬＳ、（ｉｉ）１つ以上の精製タグ、（ｉｉｉ）１つまたは切断配列、及び（ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧのうちの少なくとも３つを含む、実施形態３２に記載の組成物。実施形態３６．前記追加のアミノ酸配列が、（ｉ）１つ以上のＮＬＳ、（ｉｉ）１つ以上の精製タグ、（ｉｉｉ）１つまたは切断配列、及び（ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧを含む、実施形態３２に記載の組成物。実施形態３７．前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドがコドン最適化されている、実施形態３０～３６のいずれか１つに記載の組成物。実施形態３８．前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化されている、実施形態３７に記載の組成物。実施形態３９．配列番号２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、２２６、及び３３０のうちいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態３９に記載の組成物。実施形態４０．前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドが、Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅに対してコドン最適化されている、実施形態３７に記載の組成物。実施形態４１．配列番号３、７、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、及び２２７のうちいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態４０に記載の組成物。実施形態４２．前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドが、ヒトに対してコドン最適化されている、実施形態３７に記載の組成物。実施形態４３．配列番号３、７、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、及び２２７のうちいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態４２に記載の組成物。実施形態４４．前記配列同一性が少なくとも８０％である、実施形態３０～４３のいずれか１つに記載の組成物。実施形態４５．前記配列同一性が少なくとも９５％である、実施形態３０～４３のいずれか１つに記載の組成物。実施形態４６．前記配列同一性が１００％である、実施形態３０～４３のいずれか１つに記載の組成物。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
以下の図面は本明細書の一部をなし、かつ本開示のある特定の実施形態を更に証明するために含まれる。特定の実施形態は、これらの図面のうち１つ以上を本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より深く理解され得る。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ２核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ５核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ６核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ８核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ９核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１０核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１１核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１１＿Ｌ６７９Ｆ（ＡＲＴ１１＊）核酸誘導型ヌクレアーゼの切断効率を評価するための枯渇アッセイを示す例示的なグラフである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ２核酸誘導型ヌクレアーゼの遺伝子編集効率を評価するための実験的なＧａｌＫ編集アッセイを示す例示的なヒストグラムプロットである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１１核酸誘導型ヌクレアーゼの遺伝子編集効率を評価するための実験的なＧａｌＫ編集アッセイを示す例示的なヒストグラムプロットである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１１核酸誘導型ヌクレアーゼの様々なＰＡＭ部位の濃縮度を示す例示的なヒストグラムプロットである。 本明細書に開示されるいくつかの実施形態のＡＲＴ１１＿Ｌ６７９Ｆ核酸誘導型ヌクレアーゼの様々なＰＡＭ部位の濃縮度を示す例示的なヒストグラムプロットである。 Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＡＲＴ１１のＴＲＡＣ遺伝子を横切って並べられたガイドの％ＩＮＤＥＬを示す。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、新規な核酸誘導型ヌクレアーゼ、ガイド核酸（例えばｇＲＮＡ）、及び標的化可能なヌクレアーゼシステム、ならびに使用方法に関する。その他の実施形態では、操作された非天然の核酸誘導型ヌクレアーゼ、ガイド核酸、及び標的化可能なヌクレアーゼシステムを作製及び使用する方法が開示される。いくつかの実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼシステムを使用して、ヒトゲノム及または他の種のゲノムを編集することができる。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、アミノ酸配列、例えば、配列番号１４３～１７７及び２２９によって表される配列を有するポリペプチドを含み得る。実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１～１４２及び２２５～２２８によって表される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含み得る。実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１７８～１８８のうちの１つ以上によって表されるｇＲＮＡを含み得る。その他の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１７８～１８８によって表すことができる。その他の実施形態では、ｇＲＮＡとしては、本明細書に開示される方法及びシステムのための合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｆＲＮＡとして役立つスプリットｇＲＮＡが挙げられ得る。本明細書に開示される実施形態において役立つその他の配列を以下に提供する。
以下のセクションでは、本開示の様々な実施形態を詳述するために、様々な例示的な組成物及び方法について説明する。当業者には、様々な実施形態を実施するために、本明細書で概説した詳細のすべてまたは一部を採用する必要はなく、日常的な実験を通じて濃度、時間、及びその他の詳細が変更可能であることは明らかであろう。場合によっては、周知の方法または成分は、説明に含まれていない。
本明細書で使用するとき、ゲノム編集の「調節」及び「操作」という用語は、本明細書に開示される特定の実施形態の標的化遺伝子または遺伝子クラスターのうち１つ以上の増加、減少、アップレギュレーション、ダウンレギュレーション、誘導、編集活性の変化、結合の変化、切断の変化などを意味し得る。
本開示の特定の実施形態では、当該技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術を採用することができる。こうした技術は、文献で十分に説明されており、かつ当業者に理解されている。
その他の実施形態では、従来の技術による調製のために本明細書で使用されるプライマーは、配列決定プライマー及び増幅プライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、従来の技術で使用されるプラスミド及びオリゴマーは、合成されたオリゴマー及びオリゴマーカセットを含み得る。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム及び使用方法が提供される。ヌクレアーゼシステムは、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼの発現に関与する転写産物及び他の要素を含むことができ、これとしては、新規の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質及びガイド配列（ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡ）、または新規のｇＮＡ、例えば、本明細書に開示される新規のｇＲＮＡをコードする配列が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトを含むことができ、その開示は本明細書に提供される。その他の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムは、ｇＮＡ（例えばｇＲＮＡ）または少なくとも１つの新規なｇＮＡ、例えばｇＲＮＡ中に少なくとも１つの既知の配列、例えば少なくとも１つの既知のガイド配列または少なくとも１つの既知の足場配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヒトまたは他の種における目的の遺伝子を編集するためのシステムで使用することができる。
細菌及び古細菌の標的化可能なヌクレアーゼシステムは、精密なゲノム編集のための強力なツールとして登場した。しかし、天然のヌクレアーゼは、核酸配列及びタンパク質のサイズに起因する発現及び送達の課題などのいくつかの制限を有する。特定の実施形態では、本明細書に開示される新規の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトは、対象における標的化遺伝子の標的化の変更、及び／または標的化遺伝子編集の効率及び／または精度の向上のために作製することができる。本明細書に開示される新規の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトの他の用途は、例えば、本明細書に開示されるものであり得る。
これらの実施形態によれば、Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９と比較して異なる特徴を有するゲノム編集が可能な単一のＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼであることが知られている。特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａに基づくシステムは、ゲノムへのドナーＤＮＡの迅速かつ信頼性の高い導入を可能にする。更に、Ｃａｓ１２ａはゲノム編集を拡張する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａゲノム編集は、ヒト細胞のみならず、植物を含む他の生物においても評価されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａシステムのいくつかの特徴は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と比較すると異なる。
Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼは、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、５’－ＴＴＴＮ－３’（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ）及び５’－ＴＴＮ－３’（ＦｎＣａｓ１２ａ））を認識し、一方で、ＳｐＣａｓ９の匹敵する配列はＮＧＧであることは知られている。Ｃａｓ１２ａのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列の５’末端に位置し、これは、Ｃａｓ９では３’末端にある。更に、Ｃａｓ１２ａは、プロトスペーサーの＋１８／＋２３位付近で、そのＰＡＭの遠位にあるＤＮＡを切断することができる。この切断は千鳥状のＤＮＡオーバーハング（例えば粘着末端）を生成するが、Ｃａｓ９は両方の鎖のプロトスペーサーの３’位の後にそのＰＡＭの近くで切断して平滑末端を作成する。特定の方法では、ヌクレアーゼの認識を変更することで、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａに勝る改善をもたらし、精度を改善させることができる。更に、本明細書の特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａは単一のｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって誘導され得、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないため、Ｃａｓ９によって使用されるｓｇＲＮＡよりも短いｇＲＮＡ配列が得られる。本明細書の特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ１２ａで見られる単一のｇＲＮＡによってではなく、スプリットｇＲＮＡ、例えば合成ｇＲＮＡであるスプリットｇＲＮＡ、調節されたヌクレオチドを含むスプリットｇＲＮＡ、もしくはその他の操作されたスプリットｇＲＮＡ、または本明細書に開示されるその他の操作されたスプリットｇＲＮＡによって誘導され得る。
Ｃａｓ１２ａが、ｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ、例えば、操作されたスプリットｇＲＮＡなどのスプリットｇＲＮＡ）プロセシングにおいて機能する追加のリボヌクレアーゼ活性を示すことも知られている。Ｃａｓ１２ａは、様々な種（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対する編集ツールとして使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって認識されるものと比較して代替的ＰＡＭシーケンスの使用を可能にする。本明細書に開示される新規なヌクレアーゼは、同じまたは代替的なＰＡＭ配列を更に認識することができる。これらの新規なヌクレアーゼは、既知のマルチプレックスアプローチと比較してマルチプレックスゲノム編集の代替的なシステムを提供でき、哺乳動物遺伝子編集における改善されたシステムとして使用できる。ｇＲＮＡプロセシングの他の意味は、本明細書で論じられる通りであり、例えば、ｇＲＮＡ、例えば、特定のヌクレアーゼのためのＲＮＡ中の二次構造、例えばシュードノット領域などの二次構造に対して重要な配列であり得る保存または高度に保存されたＲＮＡ配列を含む操作されたスプリットｇＲＮＡなどのスプリットｇＲＮＡの産生、及び／または本明細書で論じられる他の意味である。
よく知られているＣａｓ１２ａタンパク質－ＲＮＡ複合体は、ＴリッチＰＡＭを認識し、切断によって千鳥状のＤＮＡ二本鎖切断をもたらす。Ｃａｓ１２ａタイプのヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルによって形成されるシュードノット構造と相互作用する。シード領域及び３’末端から構成されるガイドＲＮＡセグメントは、標的ＤＮＡ配列と相補的な結合配列を有している。これまでに特性決定されているＣａｓ１２ａタイプのヌクレアーゼは、単一のｇＲＮＡで機能し、ｇＲＮＡアレイを処理することが実証されている。Ｃａｓ１２ａタイプ及びＣａｓ９ヌクレアーゼシステムは非常に影響力が強いことが証明されているが、どちらのシステムも、遺伝子編集技術で想定されるあらゆる応用を可能にするために必要とされるほど予測どおりに機能することは実証されていない。
現状では、効率及び精度が向上した改善されたＣＲＩＳＰＲ編集システムを操作するための様々な取り組みが試みられており、これには、ＰＡＭの特異性、安定性、及びｇＲＮＡ及び／またはヌクレアーゼの配列の操作が含まれる。例えば、ｇＲＮＡの安定性を高めることが予想されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの化学修飾は、ヒト細胞中で３．８倍高いインデル頻度をもたらすことがわかっている。更に、他の研究は、Ｃａｓ１２ａの構造誘導型突然変異誘発を含んでおり、認識されるＰＡＭ配列の範囲が増加したバリアントを特定するためにスクリーニングされている。これらの操作されたＡｓＣａｓ１２ａは、確立されたＴＴＴＶ配列に加えてＴＹＣＶ及びＴＡＴＶ ＰＡＭを認識し、インビトロ及び試験したヒト細胞で活性が強化されている。
Ｃａｓ１２ａ様ヌクレアーゼ及び操作されたＣａｓ１２ａ様ヌクレアーゼ（操作されたデザイナーヌクレアーゼ）、ならびにｇＮＡ、例えば操作されたｇＮＡなどのｇＲＮＡ、例えば本明細書に開示されるｇＲＮＡは、細菌、他の原核生物における使用が企図される。その他の実施形態では、操作されたデザイナーヌクレアーゼは、単細胞真核生物、例えば酵母などの真核生物、哺乳動物における使用、ならびに鳥類及び魚類での使用が企図される。特定の実施形態では、操作されたデザイナーヌクレアーゼは、ヒト細胞での使用が企図される。これらの実施形態によれば、これらのコンストラクトは、例えば、ｇＲＮＡが由来する対照と比較して他の望ましい特徴を保持しながら、野生型ｇＲＮＡ配列の特定の特徴を変更するために生成される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたｇＲＮＡコンストラクトは、当該技術分野で既知の、あるいは未だに発見されていないＣａｓ１２ａｓから生成することができ、これとしては、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｓｐ（例えばＡＭ ＿Ｃａｓ１２ａ株Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ２８２８）、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｍ ｓｐ．（ＳＣ＿Ｃａｓ１２ａ、株Ｌ２１－ＲＰｕｌ－Ｄ３）、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ ｓｐ． Ａｎ２２（Ｂ＿Ｃａｓ１２ａ；Ａｎ２２ Ａｎ２２）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＧＷ－Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－６ ｓｐ．ＸＳ５，（ＢＢ＿Ｃａｓ１２ａ，０８Ｅ１４０Ｃ０１）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ ｓｐ．（ＰＤ＿Ｃａｓ１２ａ、株８－Ｐ５）、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ｔａｎａｋａｅｉ ｓｐ．（ＣＴ＿Ｃａｓ１２ａ、単離ＣＩＭ：ＭＡＧ ２９４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ ｓｐ．（ＬＢ＿Ｃａｓ１２ａ，Ｔ３５０）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＦ１６－５（Ｃｏ＿Ｃａｓ１２ａ，ＡＦ１６－５ ＡＦ１６－５．Ｓｃａｆ１）、もしくはＣａｔｅｎｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．ＣＣＢ－ＱＢ４ （Ｃａ＿Ｃａｓ１２ａ、ＣＣＢ－ＱＢ４種）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ（陽性対照は、このＣａｓ１２ａの誘導体である）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＦＢ＿Ｃａｓ１２ａ）、及び／または合成コンストラクト（ＳＣ＿Ｃａｓ１２ａ）、または類似物が挙げられ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、コンストラクトは、新規なヌクレアーゼを作成するために、既知のＣａｓ１２ａｓに対して６０％以下の同一性を含むことができる。特定の実施形態では、新規なＣａｓ１２ａ由来コンストラクトは、対照または野生型Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼと比較して、オフターゲティング率が低下し、及び／または編集機能が改善されたコンストラクトを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼコンストラクトのオフターゲティング率は、改善された編集のために対照と比較して減少させることができる。例えば、オフターゲティング率は容易に試験できる。これらの実施形態によれば、野生型ｇＲＮＡプラスミドを使用して、実験的に設計されたｇＲＮＡと比較してベースラインのオフターゲット編集を評価し、対照Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼまたは当技術分野で陽性対照として知られている他のヌクレアーゼ（例えばＭＡＤ７）と比較して新規なヌクレアーゼの精度を評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼコンストラクトは、既知のヌクレアーゼの保存されたコード化モチーフを共有することができる。その他の実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼコンストラクトは、保存されたコード化ペプチドモチーフを既知のヌクレアーゼと共有しない。特定の実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼコンストラクトは、コードされたヌクレアーゼ内のペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）をコードしない。特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトは、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦをコードせず、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９によって表されるポリペプチドを含み得る。その他の実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトポリペプチドは、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトポリペプチドは、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦを含み、配列番号１５２～１６０、１６４、１６７、１６８、１７０、及び１７６によって表されるポリペプチドによって表され得る。
特定の方法では、スペーサー変異をプラスミドに導入して、いつ置換ｇＲＮＡ配列が作成されるか、または欠失もしくは挿入変異体を試験することができる。これらのプラスミドコンストラクトのそれぞれを使用して、ゲノム編集の精度及び効率、例えば、欠失、置換、または挿入をテストできる。
あるいは、本明細書に開示される組成物及び方法によって作成されたヌクレアーゼコンストラクトは、所定の期間にわたって編集効率を観察することによって、選択された標的に対する最適なゲノム編集時間に関して試験することができる。
本明細書に開示される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼの使用のための標的ポリヌクレオチドの例は、シグナル伝達生化学的経路に関連する配列／遺伝子または遺伝子セグメント、例えば、シグナル伝達生化学的経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドを含み得る。本明細書で企図されるその他の実施形態は、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドに関連する標的ポリヌクレオチドの例に関する。
「疾患関連」または「障害関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、対照と比較して異常なレベルの転写産物または翻訳産物をもたらすか、または、非疾患対照の組織もしくは細胞と比較して、疾患に罹患した組織に由来する細胞中で異常な形態をもたらす、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指すことができる。これは、異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子である可能性がある。これは、異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子か、あるいは遺伝子が１つ以上の変異を含有し、変更された発現または発現が健康状態または障害の発生及び／または進行と直接相関する遺伝子である可能性がある。疾患または障害関連遺伝子は、疾患または障害の原因または進行の直接的原因である、あるいは疾患または障害の原因または進行の原因である遺伝子（複数可）と連鎖不均衡にある変異（複数可）または遺伝的多様性を有する遺伝子を指すことができる。転写または翻訳された産物は、既知または未知である可能性があり、正常または異常なレベルである可能性がある。
当業者は、疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例が以下から入手可能であることを理解している。ＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）、及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（ワールド・ワイド・ウェブ上で入手可能）。遺伝性障害及び障害関連状態、遺伝性障害の更なる例、は本明細書に開示されている。
本明細書で企図される遺伝性障害には、以下が含まれ得るが、これらに限定されない。
新生物形成：この障害に関連する遺伝子：ＰＴＥＮ；ＡＴＭ；ＡＴＲ；ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ２；ＥＲＢＢ３；ＥＲＢＢ４；Ｎｏｔｃｈ１；Ｎｏｔｃｈ２；Ｎｏｔｃｈ３；Ｎｏｔｃｈ４；ＡＫＴ；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＨＩＦ；ＨＩＦＩ ａ；ＨＩＦ３ａ；Ｍｅｔ；ＨＲＧ；Ｂｃ１２；ＰＰＡＲアルファ；ＰＰＡＲガンマ；ＷＴ１（ウイルムス腫瘍）；ＦＧＦ受容体ファミリーメンバー（５つのメンバー：１、２、３、４、５）：ＣＤＫＮ２ａ；ＡＰＣ；ＲＢ（網膜芽細胞腫）；ＭＥＮ１；ＶＨＬ；ＢＲＣＡ１；ＢＲＣＡ２；ＡＲ（アンドロゲン受容体）；ＴＳＧ１０１；ＩＧＦ；ＩＧＦ受容体；Ｉｇｆｌ（４バリアント）；Ｉｇｆ２（３バリアント）；Ｉｇｆ１受容体；Ｉｇｆ２受容体；Ｂａｘ；Ｂｃ１２；カスパーゼファミリー（９つのメンバー、１、２、３、４、６、７、８、９、１２）；Ｋｒａｓ；Ａｐｃ。
加齢性黄斑変性症：これらの疾患に関連する遺伝子Ａｂｃｒ；Ｃｃ１２；Ｃｃ２；ｃｐ（セムロプラスミン）；Ｔｉｍｐ３；カテプシンＤ；ＶＩｄｌｒ；Ｃｃｒ２。
統合失調症障害：この障害に関連する遺伝子：ニューレグリン１（Ｎｒｇ１）；Ｅｒｂ４（ニューレグリンの受容体）；コンプレキシン１（Ｃｐ１ｘ１）；Ｔｐｈ１トリプトファンヒドロキシラーゼ；Ｔｐｈ２トリプトファンヒドロキシラーゼ２；ニューレキシン１；ＧＳＫ３；ＧＳＫ３ａ；ＧＳＫ３ｂ。
トリヌクレオチドリピート障害：この障害に関連する遺伝子：５ＨＴＴ（ハンチントンＤｘ）；ＳＢＭＡ／ＳＭＡＸ１／ＡＲ（ケネディＤｘ）；ＦＸＮ／Ｘ２５（フリードライヒ運動失調症）；ＡＴＸ３（マチャド－ジョセフＤｘ）；ＡＴＸＮ１及びＡＴＸＮ２（脊髄小脳失調症）；ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィー）；アトロフィン１及びＡｔｎ１（ＤＲＰＬＡ Ｄｘ）；ＣＢＰ（Ｃｒｅｂ－ＢＰ－全体的不安定性）；ＶＬＤＬＲ（アルツハイマー病）；Ａｔｘｎ７；Ａｔｘｎ１０。
脆弱Ｘ症候群：この障害に関連する遺伝子：ＦＭＲ２；ＦＸＲ１；ＦＸＲ２；ｍＧＬＵＲＳ。
セクレターゼ関連障害：この障害に関連する遺伝子：ＡＰＨ－１（アルファ及びベータ）；プレセニルｎ（Ｐｓｅｎｌ）；ニカストリン（Ｎｃｓｔｎ）；ＰＥＮ－２。
その他：この障害に関連する遺伝子：Ｎｏｓｌ；Ｐａｉｐｌ；Ｎａｔｉ；Ｎａｔ２。
プリオン関連障害：この障害に関連する遺伝子：Ｐｒｐ。
ＡＬＳ：この障害に関連する遺伝子：ＳＯＤ１；ＡＬＳ２；ＳＴＥＸ；ＦＵＳ；ＴＡＲＤＢＰ；ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－ａ；ＶＥＧＦ－ｂ；ＶＥＧＦ－ｃ）。
薬物嗜癖：この障害に関連する遺伝子：Ｐｒｋｃｅ（アルコール）；Ｄｒｄ２；Ｄｒｄ４；ＡＢＡＴ（アルコール）；ＧＲＩＡ２；ＧｒｍＳ；Ｇｒｉｎｌ；Ｈｔｒｌｂ；Ｇｒｉｎ２ａ；Ｄｒｄ３；Ｐｄｙｎ；Ｇｒｉａｌ（アルコール）。
自閉症：この障害に関連する遺伝子：Ｍｅｃｐ２；ＢＺＲＡＰ１；ＭＤＧＡ２；ＳｅｍａＳＡ；ニューレキシン１；脆弱Ｘ（ＦＭＲ２ （ＡＦＦ２）；ＦＸＲ１；ＦＸＲ２；ＭｇｌｕｒＳ）。
アルツハイマー病：この障害に関連する遺伝子：Ｅｌ；ＣＨＩＰ；ＵＣＨ；ＵＢＢ；Ｔａｕ；ＬＲＰ；ＰＩＣＡＬＭ；クラステリン；ＰＳ１；ＳＯＲＬ１；ＣＲ１；ＶＩｄｌｒ；Ｕｂａｌ；Ｕｂａ３；ＣＨＩＰ２８（Ａｑｐ１，アクアポリン１）；Ｕｃｈｌｌ；Ｕｃｈ１３；ＡＰＰ。
炎症及び免疫関連障害：この障害に関連する遺伝子：ＩＬ－１０；ＩＬ－１（ＩＬ－ｌａ；ＩＬ－１ｂ）；ＩＬ－１３；ＩＬ－１７（ＩＬ－１７ａ（ＣＴＬＡ８）；ＩＬ－１７ｂ；ＩＬ－１７ｃ；ＩＬ－１７ｄ；ＩＬ－１７ｆ）；１１－２３；Ｃｘ３ｃｒｌ；ｐｔｐｎ２２；ＴＮＦａ；ＩＢＤに対するＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５；ＩＬ－６；ＩＬ－１２（ＩＬ－１２ａ；ＩＬ－１２ｂ）；ＣＴＬＡ４；Ｃｘ３ｃ１１、ＡＡＴ欠乏症／変異、ＡＩＤＳ（ＫＩＲ３ＤＬ１、ＮＫＡＴ３、ＮＫＢ１、ＡＮＩＢ１１、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ１）；自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＴＮＦＲＳＦ６、ＡＰＴ１、ＦＡＳ、ＣＤ９５、ＡＬＰＳ１Ａ）；複合免疫不全（ＩＬ２ＲＧ、ＳＣＩＤＸ１、ＳＣＩＤＸ、ＩＭＤ４）；ＨＩＶ－１（ＣＣＬ５、ＳＣＹＡ５、Ｄ１７Ｓ１３６Ｅ、ＴＣＰ２２８）、感受性または感染（ＩＬ１０、ＣＳＩＦ、ＣＭＫＢＲ２、ＣＣＲ２、ＣＭＫＢＲ５、ＣＣＣＫＲ５（ＣＣＲ５））；免疫不全（ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＤ、ＨＩＧＭ２、ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０、ＵＮＧ、ＤＧＵ、ＨＩＧＭ４、ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４ＯＬＧ、ＨＩＧＭ１、ＩＧＭ、ＦＯＸＰ３、ＩＰＥＸ、ＡＩＩＤ、ＸＰＩＤ、ＰＩＤＸ、ＴＮＦＲＳＦ１４Ｂ、ＴＡＣＩ）；炎症（ＩＬ－１０、ＩＬ－１（ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－１ｂ）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７（ＩＬ－１７ａ（ＣＴＬＡ８）、ＩＬ－１７ｂ、ＩＬ－１７ｃ、ＩＬ－１７ｄ、ＩＬ－１７ｆ）、１１－２３、Ｃｘ３ｃｒｌ、ｐｔｐｎ２２、ＴＮＦａ、ＩＢＤに対するＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２（ＩＬ－１２ａ、ＩＬ－１２ｂ）、ＣＴＬＡ４、Ｃｘ３ｃ１１）；重症の複合免疫不全（ＳＣＩＤｓ）（ＪＡＫ３、ＪＡＫＬ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＡＲＴＥＭＩＳ、ＳＣＩＤＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＡＤＡ、ＰＴＰＲＣ、ＣＤ４５、ＬＣＡ、ＩＬ７Ｒ、ＣＤ３Ｄ、Ｔ３Ｄ、ＩＬ２ＲＧ、ＳＣＩＤＸ１、ＳＣＩＤＸ、ＩＭＤ４）。
パーキンソン病：この障害に関連する遺伝子：ｘ－シヌクレイン；ＤＪ－１；ＬＲＲＫ２；パーキン；ＰＩＮＫ１。
血液及び凝固障害：これらの障害に関連する遺伝子：貧血（ＣＤＡＮ１、ＣＤＡ１、ＲＰＳ１９、ＤＢＡ、ＰＫＬＲ、ＰＫ１、ＮＴ５Ｃ３、ＵＭＰＨ Ｉ、ＰＳＮ１、ＲＨＡＧ、ＲＨ５０Ａ、ＮＲＡＭＰ２、ＳＰＴＢ、ＡＬＡＳ２、ＡＮＨ Ｉ、ＡＳＢ、ＡＢＣＢ７、ＡＢＣ７、ＡＳＡＴ）；不全リンパ球症候群（ＴＡＰＢＰ、ＴＰＳＮ、ＴＡＰ２、ＡＢＣＢ３、ＰＳＦ２、ＲＩＮＧＩ １、ＭＨＣ２ＴＡ、Ｃ２ＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ５）、出血性障害（ＴＢＸＡ２Ｒ、Ｐ２ＲＸ Ｉ、Ｐ２Ｘ Ｉ）；Ｈ因子及びＨ因子様－１（ＨＦ１、ＣＦＨ、ＨＵＳ）；Ｖ因子及びＶＩＩＩ因子（ＭＣＦＤ２）；ＶＩＩ因子欠乏症（Ｆ７）；Ｘ因子欠乏症（Ｆ１０）；ＸＩ因子欠乏症（Ｆ１１）；ＸＩＩ因子欠乏症（（Ｆ１２、ＨＡＦ）；ＸＩＩＩＡ因子欠乏症（Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ａ）；因子欠乏症（Ｆ１３Ｂ）；ファンコニ貧血（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＣＡ、ＦＡ１、ＦＡ、ＦＡＡ、ＦＡＡＰ９５、ＦＡＡＰ９０、ＦＬＪ３４０６４、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＣＤ、ＦＡＤ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＸＲＣＣ９、ＦＡＮＣＧ、ＢＲＩＰ１、ＢＡＣＨ１、ＦＡＮＣＪ、ＰＨＦ９、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＩＣＩＡＡ１５９６）；血球貪食リンパ組織球増多症候群（ＰＲＦ１、ＨＰＬＨ２、ＵＮＣ１３Ｄ、ＭＵＮＣ１３－４、ＨＰＬＨ３、ＨＬＨ３、ＦＨＬ３）；血友病Ａ（Ｆ８、Ｆ８Ｃ、ＨＥＭＡ）；血友病Ｂ（Ｆ９、ＨＥＭＢ）、出血性障害（ＰＩ、ＡＴＴ、Ｆ５）；白血球欠乏症及び障害（ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＣＡＭＢ、ＬＡＤ、ＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２ＢＡ、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ５、ＬＶＷＭ、ＣＡＣＨ、ＣＬＥ、ＥＩＦ２Ｂ４）；鎌状細胞貧血（ＨＢＢ）；サラセミア（ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＬＣＲＢ、ＨＢＡ１）。
細胞調節不全及び腫瘍障害：これらの障害に関連する遺伝子：Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ７）；白血病（ＴＡＬＩ ＴＣＬ５、ＳＣＬ、ＴＡＬ２、ＦＬＴ３、ＮＢＳ １ 、ＮＢＳ、ＺＮＦＮＩＡＩ、ＩＫ１、ＬＹＦ１、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸ４Ｂ、ＢＣＲ、ＣＭＬ、ＰＨＬ、ＡＬＬ、ＡＲＮＴ、ＫＲＡＳ２、ＲＡＳＫ２、ＧＭＰＳ、ＡＦＩＯ、ＡＲＨＧＥＦＩ２、ＬＡＲＧ、ＫＩＡＡ０３８２、ＣＡＬＭ、ＣＬＴＨ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰ、ＣＨＩＣ２、ＢＴＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＰＢＴ、ＬＰＰ、ＮＰＭ１、ＮＵＰ２１４、Ｄ９Ｓ４６Ｅ、ＣＡＮ、ＣＡＩＮ、ＲＵＮＸ １ 、ＣＢＦＡ２、ＡＭＬ１、ＷＨＳＣ １ ＬＩ 、ＮＳＤ３、ＦＬＴ３、ＡＦ１Ｑ、ＮＰＭ １ 、ＮＵＭＡ１、ＺＮＦ１４５、ＰＬＺＦ、ＰＭＬ、ＭＹＬ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＡＦＩ ０、ＣＡＬＭ、ＣＬＴＨ、ＡＲＬＩ １、ＡＲＬＴＳ１、Ｐ２ＲＸ７、Ｐ２Ｘ７、ＢＣＲ、ＣＭＬ、ＰＨＬ、ＡＬＬ、ＧＲＡＦ、ＮＦＩ、ＶＲＮＦ、ＷＳＳ、ＮＦＮＳ、ＰＴＰＮＩ １、ＰＴＰ２Ｃ、ＳＨＰ２、ＮＳ １ 、ＢＣＬ２、ＣＣＮＤ１、ＰＲＡＤ１、ＢＣＬ１、ＴＣＲＡ、ＧＡＴＡ１、ＧＦ１、ＥＲＹＦ１、ＮＦＥ１、ＡＢＬ１、ＮＱＯ１、ＤＩＡ４、ＮＭＯＲ１、ＮＵＰ２Ｉ４、Ｄ９Ｓ４６Ｅ、ＣＡＮ、ＣＡＩＮ）。
代謝、肝臓、腎臓障害：これらの障害に関連する遺伝子：アミロイド神経障害（ＴＴＲ、ＰＡＬＳ）；アミロイド症（ＡＰＯＡ１、ＡＰＰ、ＡＡＡ、ＣＶＡＰ、ＡＤ１、ＧＳＮ、ＦＧＡ、ＬＹＺ、ＵＲ、ＰＡＬＳ）；肝硬変（ＫＡＴＩ ８、ＫＲＴ８、ＣａＨｌＡ、ＮＡＩＣ、ＴＥＸ２９２、ＫＩＡＡ１９８８）；膵嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ、ＡＢＣＣ７、ＣＦ、ＭＲＰ７）；グリコーゲン蓄積症（ＳＬＣ２Ａ２、ＧＬＵＴ２、Ｇ６ＰＣ、Ｇ６ＰＴ、Ｇ６ＰＴ１、ＧＡＡ、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰＳ、ＡＧＬ、ＧＤＥ、ＧＢＥ１、ＧＹＳ２、ＰＹＧＬ、ＰＦＫＭ）；肝細胞腺腫、１４２３３０（ＴＣＦ１、ＨＮＦ１Ａ、ＭＯＤＹ３）、早発型肝不全、及び神経障害（ＳＣＯＤ１、ＳＣＯ１）、肝性リパーゼ欠乏症（ＬＩＰＣ）、肝芽腫、癌及び癌腫（ＣＴＮＮＢ１、ＰＤＧＦＲＬ、ＰＤＧＲＬ、ＰＲＬＴＳ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＰ５３、Ｐ５３、ＬＦＳ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＰＲＩ、ＭＥＴ、ＣＡＳＰ８、ＭＣＨ５；髄質嚢胞性腎疾患（ＵＭＯＤ、ＨＮＦＪ、ＦＪＨＮ、ＭＣＫＤ２、ＡＤＭＣＫＤ２）；フェニルケトン尿症（ＰＡＨ、ＰＫＵ１、ＱＤＰＲ、ＤＨＰＲ、ＰＴＳ）；多嚢胞性腎・肝疾患（ＦＣＹＴ、ＰＫＨＤ１、ＡＲＰＫＤ、ＰＫＤ２、ＰＫＤ４、ＰＫＤＴＳ、ＰＲＫＣＳＨ、Ｇ１９Ｐ１、ＰＣＬＤ、ＳＥＣ６３）。
筋肉／骨格障害：これらの障害に関連する遺伝子：ベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ＢＭＤ、ＭＹＦ６）；デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ＢＭＤ）；エメリー・ドレーフス型筋ジストロフィー（ＬＭＮＡ、ＬＭＮ１、ＥＭＤ２、ＦＰＬＤ、ＣＭＤ１Ａ、ＨＧＰＳ、ＬＧＭＤ１Ｂ、ＬＭＮＡ、ＬＭＮ１、ＥＭＤ２、ＦＰＬＤ、ＣＭＤ１Ａ）；顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＭＤ１Ａ、ＦＳＨＤ１Ａ）；筋ジストロフィー（ＦＫＲＰ、ＭＤＣ１Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｉ、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＭ、ＬＡＲＧＥ、ＫＩＡＡ０６０９、ＭＤＣ１Ｄ、ＦＣＭＤ、ＴＴＩＤ、ＭＹＯＴ、ＣＡＰＮ３、ＣＡＮＰ３、ＤＹＳＦ、ＬＧＭＤ２Ｂ、ＳＧＣＧ、ＬＧＭＤ２Ｃ、ＤＭＤＡ１、ＳＣＧ３、ＳＧＣＡ、ＡＤＬ、ＤＡＧ２、ＬＧＭＤ２Ｄ、ＤＭＤＡ２、ＳＧＣＢ、ＬＧＭＤ２Ｅ、ＳＧＣＤ、ＳＧＤ、ＬＧＭＤ２Ｆ、ＣＭＤ１Ｌ、ＴＣＡＰ、ＬＧＭＤ２Ｇ、ＣＭＤ１Ｎ、ＴＲＩＭ３２、ＨＴ２Ａ、ＬＧＭＤ２Ｈ、ＦＫＲＰ、ＭＤＣ１Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｉ、ＴＴＮ、ＣＭＤ１Ｇ、ＴＭＤ、ＬＧＭＤ２Ｊ、ＰＯＭＴ１、ＣＡＶ３、ＬＧＭＤ１Ｃ、ＳＥＰＮ１、ＳＥＬＮ、ＲＳＭＤ１、ＰＬＥＣ１、ＰＬＴＮ、ＥＢＳ１）；大理石骨病（ＬＡＰＳ、ＢＭＮＤ１、ＬＲＰ７、ＬＲ３、ＯＰＰＧ、ＶＢＣＨ２、ＣＬＣＮ７、ＣＬＣ７、ＯＰＴＡ２、ＯＳＴＭ１、ＧＬ、ＴＣＩＲＧ１、ＴＩＲＣ７、０Ｃ１１６、ＯＰＴＢ１）；筋萎縮症（ＶＡＰＢ、ＶＡＰＣ、ＡＬＳ８、ＳＭＮ１、ＳＭＡ１、ＳＭＡ２、ＳＭＡ３、ＳＭＡ４、ＢＳＣＬ２、ＳＰＧ１７、ＧＡＲＳ、ＳＭＡＤ１、ＣＭＴ２Ｄ、ＨＥＸＢ、ＩＧＨＭＢＰ２、ＳＭＵＢＰ２、ＣＡＴＦ１、ＳＭＡＲＤ１）。
神経性障害（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）及び神経障害（Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）：これらの障害に関連する遺伝子：ＡＬＳ（ＳＯＤ１、ＡＬＳ２、ＳＴＥＸ、ＦＵＳ、ＴＡＲＤＢＰ、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－ａ、ＶＥＧＦ－ｂ、ＶＥＧＦ－ｃ）；アルツハイマー病（ＡＰＰ、ＡＡＡ、ＣＶＡＰ、ＡＤ１、ＡＰＯＥ、ＡＤ２、ＰＳＥＮ２、ＡＤ４、ＳＴＭ２、ＡＰＢＢ２、ＦＥ６５Ｌ１、ＮＯＳ３、ＰＬＡＵ、ＵＲＫ、ＡＣＥ、ＤＣＰＩ、ＡＣＥＩ、ＭＰＯ、ＰＡＣＩＰ１、ＰＡＸＩＰＩＬ、ＰＴＩＰ、Ａ２Ｍ、ＢＬＭＨ、ＢＭＨ、ＰＳＥＮ１、ＡＤ３）；自閉症（Ｍｅｃｐ２、ＢＺＲＡＰ Ｉ、ＭＤＧＡ２、Ｓｅｍａ５Ａ、Ｎｅｕｒｅｘ １、ＧＬＯ１、ＭＥＣＰ２、ＲＴＴ、ＰＰＭＸ、ＭＲＸ１６、ＭＲＸ７９、ＮＬＧＮ３、ＮＬＧＮ４、ＫＩＡＡ１２６０、ＡＵＴＳＸ２）；脆弱Ｘ症候群（ＦＭＲ２、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ｍＧＬＵＲ５）；ハンチントン病及びハンチントン病様障害（ＨＤ、ＩＴ１５、ＰＲＮＰ、ＰＲＩＰ、ＪＰＨ３、ＪＰ３、ＨＤＬ２、ＴＢＰ、ＳＣＡ１７）；パーキンソン病（ＮＲ４Ａ２、ＮＵＲＲ１、ＮＯＴ、ＴＩＮＵＲ、ＳＮＣＡＩＰ、ＴＢＰ、ＳＣＡ１７、ＳＮＣＡ、ＮＡＣＰ、ＰＡＲＫ１、ＰＡＲＫ４、ＤＪ１、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫＳ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ６、ＵＣＨＬ１、ＰＡＲＫＳ、ＳＮＣＡ、ＮＡＣＰ、ＰＡＲＫ１、ＰＡＲＫ４、ＰＲＫＮ、ＰＡＲＫ－２、ＰＤＪ、ＤＢＨ、ＮＤＵＦＶ２）；レット症候群（ＭＥＣＰ２、ＲＴＴ、ＰＰＭＸ、ＭＲＸ１６、ＭＲＸ７９、ＣＤＫＬ５、ＳＴＫ９、ＭＥＣＰ２、ＲＴＴ、ＰＰＭＸ、ＭＲＸ１６、ＭＲＸ７９、ｘ－シヌクレイン、ＤＪ－１）；統合失調症ニューレグリン１（Ｎｒｇ１）、Ｅｒｂ４（ニューレグリンの受容体）、コンプレキシン１（Ｃｐ１ｘ１）、Ｔｐｈ１トリプトファンヒドロキシラーゼ、Ｔｐｈ２、トリプトファンヒドロキシラーゼ２、ニューレキシン１、ＧＳＫ３、ＧＳＫ３ａ、ＧＳＫ３ｂ、５－ＨＴＴ（Ｓ１ｃ６ａ４）、ＣＯＭＴ、ＤＲＤ（Ｄｒｄ ｌａ）、ＳＬＣ６Ａ３、ＤＡＯＡ、ＤＴＮＢＰ１、Ｄａｏ（Ｄａｏｌ））；セクレターゼ関連障害（ＡＰＨ－１（アルファ及びベータ）、プレセニリン（Ｐｓｅｎｌ）、ニカストリン，（Ｎｃｓｔｎ）、ＰＥＮ－２、Ｎｏｓｌ、Ｐａｒｐｌ、Ｎａｔｌ、Ｎａｔ２）；トリヌクレオチドリピート障害（ＨＴＴ（ハンチントンＤｘ）、ＳＢＭＡ／ＳＭＡＸ１／ＡＲ（ケネディＤｘ）、ＦＸＮ／Ｘ２５（フリードライヒ運動失調症）、ＡＴＸ３（マチャド－ジョセフＤｘ）、ＡＴＸＮ１及びＡＴＸＮ２（脊髄小脳失調症）、ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィー）、アトロフィン１及びＡｔｎ１（ＤＲＰＬＡ Ｄｘ）、ＣＢＰ（Ｃｒｅｂ－ＢＰ－全体的不安定性）、ＶＬＤＬＲ（アルツハイマー病）、Ａｔｘｎ７、Ａｔｘｎ１０）。
眼関連障害：これらの障害に関連する遺伝子：加齢性黄斑変性症（Ａｂｅｒ、Ｃｃ１２、Ｃｃ２、ｃｐ（セルロプラスミン）、Ｔｉｍｐ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ、Ｖｌｄ１ｒ、Ｃｃｒ２）；白内障（ＣＲＹＡＡ、ＣＲＹＡ１、ＣＲＹＢＢ２、ＣＲＹＢ２、ＰＩＴＸ３、ＢＦＳＰ２、ＣＰ４９、ＣＰ４７、ＣＲＹＡＡ、ＣＲＹＡ１、ＰＡＸ６、ＡＮ２、ＭＧＤＡ、ＣＲＹＢＡ１、ＣＲＹＢ１、ＣＲＹＧＣ、ＣＲＹＧ３、ＣＣＬ、ＬＩＭ２、ＭＰ１９、ＣＲＹＧＤ、ＣＲＹＧ４、ＢＦＳＰ２、ＣＰ４９、ＣＰ４７、ＨＳＦ４、ＣＴＭ、ＨＳＦ４、ＣＴＭ、ＭＩＰ、ＡＱＰＯ、ＣＲＹＡＢ、ＣＲＹＡ２、ＣＴＰＰ２、ＣＲＹＢＢ１、ＣＲＹＧＤ、ＣＲＹＧ４、ＣＲＹＢＢ２、ＣＲＹＢ２、ＣＲＹＧＣ、ＣＲＹＧ３、ＣＣＬ、ＣＲＹＡＡ、ＣＲＹＡ１、ＧＪＡ８、ＣＸ５０、ＣＡＥ１、ＧＪＡ３、ＣＸ４６、ＣＺＰ３、ＣＡＥ３、ＣＣＭ１、ＣＡＭ、ＫＲＩＴ１）；角膜混濁及びジストロフィー（ＡＰＯＡ１、ＴＧＦＢＩ、ＣＳＤ２、ＣＤＧＧ１、ＣＳＤ、ＢＩＧＨ３、ＣＤＧ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＲＯＰ２、Ｍ１Ｓ１、ＶＳＸ１、ＲＩＮＸ、ＰＰＣＤ、ＰＰＤ、ＫＴＣＮ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ２、ＰＩＰ５Ｋ３、ＣＦＤ）；先天性扁平角膜（ＫＥＲＡ、ＣＮＡ２）；緑内障（ＭＹＯＣ、ＴＩＧＲ、ＧＬＣ１Ａ、ＪＯＡＧ、ＧＰＯＡ、ＯＰＴＮ、ＧＬＣ１Ｅ、ＦＩＰ２、ＨＹＰＬ、ＮＲＰ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＧＬＣ３Ａ、ＯＰＡＬ、ＮＴＧ、ＮＰＧ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＧＬＣ３Ａ）；レーバー先天性黒内障（ＣＲＢ１、ＲＰ１２、ＣＲＸ、ＣＯＲＤ２、ＣＲＤ、ＲＰＧＲＩＰ１、ＬＣＡ６、ＣＯＲＤ９、ＲＰＥ６５、ＲＰ２０、ＡＩＰＬ１、ＬＣＡ４、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＧＵＣ２Ｄ、ＬＣＡ１、ＣＯＲＤ６、ＲＤＨ１２、ＬＣＡ３）；黄斑ジストロフィー（ＥＬＯＶＬ４、ＡＤＭＤ、ＳＴＧＤ２、ＳＴＧＤ３、ＲＤＳ、ＲＰ７、ＰＲＰＨ２、ＰＲＰＨ、ＡＶＭＤ、ＡＯＦＭＤ、ＶＭＤ２）。
Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＩＴＧＡ５；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＰＴＥＮ；ＥＩＦ４Ｅ；ＰＲＫＣＺ；ＧＲＫ６；ＭＡＰＫ１；ＴＳＣ１；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＩＫＢＫＢ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＤＫ８；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＮＦＫＢ２；ＢＣＬ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＭＡＰＫ８；ＢＣＬ２Ｌ１；ＭＡＰＫ３；ＴＳＣ２；ＩＴＧＡｌ；ＫＲＡＳ；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＲＥＬＡ；ＰＲＫＣＤ；ＮＯＳ３；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＣＤＫ２；ＰＰＰ２ＣＡ；ＰＩＭ１；ＩＴＧＢ７；ＹＷＨＡＺ；ＩＬＫ；ＴＰ５３；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＤＹＲＫ１Ａ；ＣＤＫＮ１Ａ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＰＤＰＫ１；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＣＴＮＮＢ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＰＡＫ３；ＩＴＧＢ３；ＣＣＮＤ１；ＧＳＫ３Ａ；ＦＲＡＰ１；ＳＦＮ；ＩＴＧＡ２；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＢＲＡＦ；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３；ＦＯＸＯ１；ＳＯＫ；ＨＳ Ｐ９ＯＡＡ１；ＲＰ Ｓ ６ＫＢ１。
ＥＲＫ／ＭＡＰＫ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＩＴＧＡ５；ＨＳＰＢ１；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＲＡＣ１；ＲＡＰ１Ａ；ＴＬＮ１；ＥＩＦ４Ｅ；ＥＬＫ１；ＧＲＫ６；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＤＫ８；ＣＲＥＢ１；ＰＲＫＣＩ；ＰＴＫ２；ＦＯＳ；ＲＰＳ６ＫＡ４；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＩＴＧＡｌ；ＥＴＳ１；ＫＲＡＳ；ＭＹＣＮ；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＰＰＡＲＧ；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＳＲＣ；ＣＤＫ２；ＰＰＰ２ＣＡ；ＰＩＭ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＩＴＧＢ７；ＹＷＨＡＺ；ＰＰＰ１ＣＣ；ＫＳＲ１；ＰＸＮ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＤＹＲＫ１Ａ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＡＫ４；ＰＩＫ３Ｒ１；ＳＴＡＴ３；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＩＴＧＢ３；ＥＳＲ１；ＩＴＧＡ２；ＭＹＣ；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＣＲＫＬ；ＢＲＡＥ；ＡＴＦ４；ＰＲＫＣＡ；ＳＲＦ；ＳＴＡＴ１；ＳＧＫ。
グルココルチコイド受容体細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＲＡＣ１；ＴＡＦ４Ｂ；ＥＰ３００；ＳＭＡＤ２；ＴＲＡＦ６；ＰＣＡＦ；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＳＭＡＤ３；ＡＫＴ２；ＩＫＢＫＢ；ＮＣＯＲ２；ＵＢＥ２Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＲＥＢ１；ＦＯＳ；ＨＳＰＡ５；ＮＦＫＢ２；ＢＣＬ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＢＣＬ２Ｌ１；ＭＡＰＫ３；ＴＳＣ２２Ｄ３；ＭＡＰＫ１０；ＮＲＩＰ１；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＲＥＬＡ；ＳＴＡＴ５Ａ；ＭＡＰＫ９；ＮＯＳ２Ａ；ＰＢＸ１；ＮＲ３Ｃ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＴＲＡＦ２；ＳＥＲＰＩＮＥ１；ＮＣＯＡ３；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＣＤＫＮ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＩＬ８；ＮＣＯＡ２；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＴＧＦＢＲ１；ＥＳＲ１；ＳＭＡＤ４；ＣＥＢＰＢ；ＪＵＮ；ＡＲ；ＡＫＴ３；ＣＣＬ２；ＭＭＰ １；ＳＴＡＴ１；ＩＬ６；ＨＳＰ９ＯＡＡ１。
軸索誘導細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＲＯＣＫ１；ＩＴＧＡ５；ＣＸＣＲ４；ＡＤＡＭ１２；ＩＧＦ１；ＲＡＣ１；ＲＡＰ１Ａ；Ｅｌ Ｆ４Ｅ；ＰＲＫＣＺ；ＮＲＰ１；ＮＴＲＫ２；ＡＲＨＧＥＦ７；ＳＭＯ；ＲＯＣＫ２；ＭＡＰＫ１；ＰＧＦ；ＲＡＣ２；ＰＴＰＮ１１；ＧＮＡＳ；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＥＲＢＢ２；ＰＲＫＣＩ；ＰＴＫ２；ＣＦＬ１；ＧＮＡＱ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＣＸＣＬ１２；ＰＩＫ３Ｃ３；ＷＮＴ１１；ＰＲＫＤ１；ＧＮＢ２Ｌ１；ＡＢＬ１ ；ＭＡＰＫ３；ＩＴＧＡ１；ＫＲＡＳ；ＲＨＯＡ；ＰＲＫＣＤ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＩＴＧＢ７；ＧＬＩ２；ＰＸＮ；ＶＡＳＰ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＡＫ４；ＡＤＡＭ１７；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＧＵＩ；ＷＮＴ５Ａ；ＡＤＡＭ１０；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＩＴＧＢ３；ＣＤＣ４２；ＶＥＧＦＡ；ＩＴＧＡ２；ＥＰＨＡ８；ＣＲＫＬ；ＲＮＤ１；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３；ＰＲＫＣＡ。
エフリン受容体細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＲＯＣＫ１；ＩＴＧＡ５；ＣＸＣＲ４；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＲＡＣ１；ＲＡＰ１Ａ；ＧＲＫ６；ＲＯＣＫ２；ＭＡＰＫ１；ＰＧＦ；ＲＡＣ２；ＰＴＰＮ１１；ＧＮＡＳ；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＤＯＫ１；ＣＤＫ８；ＣＲＥＢ１；ＰＴＫ２；ＣＦＬ１；ＧＮＡＱ；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＣＸＣＬ１２；ＭＡＰＫ８；ＧＮＢ２Ｌ１；ＡＢＬ１；ＭＡＰＫ３；ＩＴＧＡ１；ＫＲＡＳ；ＲＨＯＡ；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＳＲＣ；ＣＤＫ２；ＰＩＭ１；ＩＴＧＢ７；ＰＸＮ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＤＹＲＫ１Ａ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＡＫ４、ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＳＴＡＴ３；ＡＤＡＭ１０；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＩＴＧＢ３；ＣＤＣ４２；ＶＥＧＦＡ；ＩＴＧＡ２；ＥＰＨＡ８；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＣＲＫＬ；ＢＲＡＦ；ＰＴＰＮ１３；ＡＴＦ４；ＡＫＴ３；ＳＧＫ。
アクチン細胞骨格細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＡＣＴＮ４；ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＲＯＣＫ１；ＩＴＧＡ５；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＲＡＣ１；ＩＮＳ；ＡＲＨＧＥＦ７；ＧＲＫ６；ＲＯＣＫ２；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＤＫ８；ＰＴＫ２；ＣＦＬ１；ＰＩＫ３ＣＢ；ＭＹＨ９；ＤＩＡＰＨ１；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；Ｆ２Ｒ；ＭＡＰＫ３；ＳＬＣ９Ａ１；ＩＴＧＡ１；ＫＲＡＳ；ＲＨＯＡ；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＣＤＫ２；ＰＩＭ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＩＴＧＢ７；ＰＰＰ１ＣＣ；ＰＸＮ；ＶＩＬ２；ＲＡＦ１；ＧＳＮ；ＤＹＲＫ１Ａ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＡＫ４；ＰＩＰ５Ｋ１Ａ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＩＴＧＢ３；ＣＤＣ４２；ＡＰＣ；ＩＴＧＡ２；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＣＲＫＬ；ＢＲＡＦ；ＶＡＶ３；ＳＧＫ。
ハンチントン病細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＧＦ１；ＥＰ３００；ＲＣＯＲ１；ＰＲＫＣＺ；ＨＤＡＣ４；ＴＧＭ２；ＭＡＰＫ１；ＣＡＰＮＳ１；ＡＫＴ２；ＥＧＦＲ；ＮＣＯＲ２；ＳＰ１；ＣＡＰＮ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＨＤＡＣ５；ＣＲＥＢ１；ＰＲＫＣ１；ＨＳ ＰＡ５ ；ＲＥＳＴ；ＧＮＡＱ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＩＧＦ１Ｒ；ＰＲＫＤ１；ＧＮＢ２Ｌ１；ＢＣＬ２Ｌ１；ＣＡＰＮ１；ＭＡＰＫ３；ＣＡＳＰ８；ＨＤＡＣ２；ＨＤＡＣ７Ａ；ＰＲＫＣＤ；ＨＤＡＣ１１；ＭＡＰＫ９；ＨＤＡＣ９；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＨＤＡＣ３；ＴＰ５３；ＣＡＳＰ９；ＣＲＥＢＢＰ；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＰＫ１；ＣＡＳＰ１；ＡＰＡＦ１；ＦＲＡＰ１；ＣＡＳＰ２；ＪＵＮ；ＢＡＸ；ＡＴＦ４；ＡＫＴ３；ＰＲＫＣＡ；ＣＬＴＣ；ＳＧＫ；ＨＤＡＣ６；ＣＡＳＰ３。
アポトーシス細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＲＯＣＫ１；ＢＩＤ；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＢＡＫ１；ＢＩＲＣ４；ＧＲＫ６；ＭＡＰＫ１；ＣＡＰＮＳ１；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＩＫＢＫＢ；ＣＡＰＮ２；ＣＤＫ８；ＦＡＳ；ＮＦＫＢ２；ＢＣＬ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰＫ８；ＢＣＬ２Ｌ１；ＣＡＰＮ１；ＭＡＰＫ３；ＣＡＳＰ８；ＫＲＡＳ；ＲＥＬＡ；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＣＤＫ２；ＰＩＭ１；ＴＰ５３；ＴＮＦ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＣＡＳＰ９；ＤＹＲＫ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＣＨＵＫ；ＡＰＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＰＡＫ３；ＬＭＮＡ；ＣＡＳＰ２；ＢＩＲＣ２；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＢＲＡＦ；ＢＡＸ；ＰＲＫＣＡ；ＳＧＫ；ＣＡＳＰ３：ＢＴＲＣ３：ＰＡＲＰＩ。
Ｂ細胞受容体細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＲＡＣ１；ＰＴＥＮ；ＬＹＮ；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＩＫＢＫＢ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＲＥＢ１；ＳＹＫ；ＮＦＫＢ２；ＣＡＭＫ２Ａ；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＢＣＬ２Ｌ１；ＡＢＬ１；ＭＡＰＫ３；ＥＴＳ１；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＲＥＬＡ；ＰＴＰＮ６；ＭＡＰＫ９；ＥＧＲ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＢＴＫ；ＭＡＰＫ１４；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＣＤＣ４２；ＧＳＫ３Ａ；ＦＲＡＰ１；ＢＣＬ６；ＢＣＬ１０；ＪＵＮ；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＴＦ４；ＡＫＴ３；ＶＡＶ３；ＲＰＳ６ＫＢ１。
白血球の血管外遊出細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＡＣＴＮ４；ＣＤ４４；ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＲＯＣＫ１；ＣＸＣＲ４；ＣＹＢＡ；ＲＡＣ１；ＲＡＰ１Ａ；ＰＲＫＣＺ；ＲＯＣＫ２；ＲＡＣ２；ＰＴＰＮ１１；ＭＭＰ１４；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＲＫＣＩ；ＰＴＫ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＣＸＣＬ１２；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＰＲＫＤ１；ＡＢＬ１；ＭＡＰＫ１０；ＣＹＢＢ；ＭＡＰＫ１３；ＲＨＯＡ；ＰＲＫＣＤ；ＭＡＰＫ９；ＳＲＣ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＢＴＫ；ＭＡＰＫ１４；ＮＯＸ１；ＰＸＮ；ＶＩＬ２；ＶＡＳＰ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＣＴＮＮＤ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＴＮＮＢ１；ＣＬＤＮ１；ＣＤＣ４２；ＦＵＲ；ＩＴＫ；ＣＲＫＬ；ＶＡＶ３；ＣＴＴＮ；ＰＲＫＣＡ；ＭＭＰｌ；ＭＭＰ９。
インテグリン細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＡＣＴＮ４；ＩＴＧＡＭ；ＲＯＣＫ１；ＩＴＧＡ５；ＲＡＣ１；ＰＴＥＮ；ＲＡＰ１Ａ；ＴＬＮ１；ＡＲＨＧＥＦ７；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＣＡＰＮＳ１；ＡＫＴ２；ＣＡＰＮ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＴＫ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＣＡＶ１；ＣＡＰＮ１；ＡＢＬ１；ＭＡＰＫ３；ＩＴＧＡｌ；ＫＲＡＳ；ＲＨＯＡ；ＳＲＣ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＩＴＧＢ７；ＰＰＰ１ＣＣ；ＩＬＫ；ＰＸＮ；ＶＡＳＰ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＡＫ４；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＴＮＫ２；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＩＴＧＢ３；ＣＤＣ４２；ＲＮＤ３；ＩＴＧＡ２；ＣＲＫＬ；ＢＲＡＦ；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３。
急性期応答細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＩＲＡＫ１；ＳＯＤ２；ＭＹＤ８８；ＴＲＡＦ６；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＩＫＢＫＢ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＦＯＳ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＰＩＫ３ＣＢ；ＭＡＰＫ８；ＲＩＰＫ１；ＭＡＰＫ３；ＩＬ６ＳＴ；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＩＬ６Ｒ；ＲＥＬＡ；ＳＯＣＳ１；ＭＡＰＫ９；ＦＴＬ；ＮＲ３Ｃ１；ＴＲＡＦ２；ＳＥＲＰＩＮＥ１；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＲＡＦ１；ＰＤＫ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＦＲＡＰ１；ＣＥＢＰＢ；ＪＵＮ；ＡＫＴ３；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ６。
ＰＴＥＮ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＩＴＧＡＭ；ＩＴＧＡ５；ＲＡＣ１；ＰＴＥＮ；ＰＲＫＣＺ；ＢＣＬ２Ｌ１１；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＡＫＴ２；ＥＧＦＲ；ＩＫＢＫＢ；ＣＢＬ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＰＴＫ２；ＮＦＫＢ２；ＢＣＬ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＢＣＬ２Ｌ１；ＭＡＰＫ３；ＩＴＧＡ１；ＫＲＡＳ；ＩＴＧＢ７；ＩＬＫ；ＰＤＧＦＲＢ；ＩＮＳＲ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＣＡＳＰ９；ＣＤＫＮ１Ａ；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＰＤＧＦＲＡ；ＰＤＰＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＩＴＧＢ３；ＣＤＣ４２；ＣＣＮＤ１；ＧＳＫ３Ａ；ＩＴＧＡ２；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３；ＦＯＸＯ１；ＣＡＳＰ３。
ｐ５３細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＲＰＳ６ＫＢ１ ＰＴＥＮ；ＥＰ３００；ＢＢＣ３；ＰＣＡＦ；ＦＡＳＮ；ＢＲＣＡ１；ＧＡＤＤ４５Ａ；ＢＩＲＣ５；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＨＥＫ１；ＴＰ５３ＩＮＰ１；ＢＣＬ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＴＨＢＳ １；ＡＴＲ；ＢＣＬ２Ｌ１；Ｅ２Ｆ１；ＰＭＡＩＰ１；ＣＨＥＫ２；ＴＮＦＡＳＦ１０Ｂ；ＴＰ７３；ＲＢ１；ＨＤＡＣ９；ＣＤＫ２；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＭＡＰＫ１４；ＴＰ５３；ＬＲＤＤ；ＣＤＫＮ１Ａ；ＨＩＰＫ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＲＡＭ２Ｂ；ＡＰＡＦ１；ＣＴＮＮＢ１；ＳＩＲＴ１；ＣＣＮＤ１；ＰＲＫＤＣ；ＡＴＭ；ＳＦＮ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＪＵＮ；ＳＮＡＩ２；ＧＳＫ３Ｂ；ＢＡＸ；ＡＫＴ３。
アリール炭化水素受容体細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＨＳＰＢ１；ＥＰ３００；ＦＡＳＮ；ＴＧＭ２；ＲＸＲＡ；ＭＡＰＫ１；ＮＱＯ１；ＮＣＯＲ２；ＳＰ１；ＡＲＮＴ；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＦＯＳ；ＣＨＥＫ１；ＳＭＡＲＣＡ４；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰＫ８；ＡＬＤＨ１Ａ１；ＡＴＲ；Ｅ２Ｆ１；ＭＡＰＫ３；ＮＲＩＰ１；ＣＨＥＫ２；ＲＥＬＡ；ＴＰ７３；ＧＳＴＰ１；ＲＢ１；ＳＲＣ；ＣＤＫ２；ＡＨＲ；ＮＦＥ２Ｌ２；ＮＣＯＡ３；ＴＰ５３；ＴＮＦ；ＣＤＫＮ１Ａ；ＮＣＯＡ２；ＡＰＡＦ１；ＮＦＫＢ１；ＣＣＮＤ１；ＡＴＭ；ＥＳＲ１；ＣＤＫＮ２Ａ；ＭＹＣ；ＪＵＮ；ＥＳＲ２；ＢＡＸ；ＩＬ６；ＣＹＰ１Ｂ１；ＨＳＰ９ＯＡＡ１。
異物代謝細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＥＰ３００；ＰＲＫＣＺ；ＲＸＲＡ；ＭＡＰＫ１；ＮＱＯ１；ＮＣＯＲ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＡＲＮＴ；ＰＲＫＣＩ；ＮＦＫＢ２；ＣＡＭＫ２Ａ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＰＲＫＤ１；ＡＬＤＨ１Ａ１；ＭＡＰＫ３；ＮＲＩＰ１；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＰＲＫＣＤ；ＧＳＴＰ１；ＭＡＰＫ９；ＮＯＳ２Ａ；ＡＢＣＢ１；ＡＨＲ；ＰＰＰ２ＣＡ；ＦＴＬ；ＮＦＥ２Ｌ２；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＲＡＦ１；ＣＲＥＢＢＰ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＫＥＡＰ１；ＰＲＫＣＡ；ＥＩＦ２ＡＫ３；ＩＬ６；ＣＹＰ１Ｂ１；ＨＳＰ９ＯＡＡ１。
ＳＡＰＬ／ＪＮＫ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＲＡＣ１；ＥＬＫ１；ＧＲＫ６；ＭＡＰＫ１；ＧＡＤＤ４５Ａ；ＲＡＣ２；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＦＡＤＤ；ＣＤＫ８；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＲＩＰＫ１；ＧＮＢ２Ｌ１；ＩＲＳ１；ＭＡＰＫ３；ＭＡＰＫ１０；ＤＡＸＸ；ＫＲＡＳ；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＣＤＫ２；ＰＩＭ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＴＲＡＦ２；ＴＰ５３；ＬＣＫ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＤＹＲＫ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＣＤＣ４２；ＪＵＮ；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＣＲＫＬ；ＢＲＡＦ；ＳＧＫ。
ＰＰＡｒ／ＲＸＲ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＡＡ２；ＥＰ３００；ＩＮＳ；ＳＭＡＤ２；ＴＲＡＦ６；ＰＰＡＲＡ；ＦＡＳＮ；ＲＸＲＡ；ＭＡＰＫ１；ＳＭＡＤ３；ＧＮＡＳ；ＩＫＢＫＢ；ＮＣＯＲ２；ＡＢＣＡ１；ＧＮＡＱ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＭＡＰＫ８；ＩＡＳＩ；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＲＥＬＡ；ＰＲＫＡＡ１；ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＮＣＯＡ３；ＭＡＰＫ１４；ＩＮＳＲ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ２；ＣＨＵＫ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＴＧＦＢＡｌ；ＳＭＡＤ４；ＪＵＮ；ＩＬ１Ｒ１；ＰＲＫＣＡ；ＩＬ６；ＨＳＰ９ＯＡＡ１；ＡＤＩＰＯＯ。
ＮＦ－ＫＢ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＩＲＡＫ１；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＥＰ３００；ＩＮＳ；ＭＹＤ８８；ＰＲＫＣＺ：ＴＲＡＦ６；ＴＢＫ１；ＡＫＴ２；ＥＧＦＲ；ＩＫＢＫＢ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＢＴＲＣ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＲＩＰＫ１；ＨＤＡＣ２；ＫＲＡＳ；ＲＥＬＡ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＴＲＡＦ２；ＴＬＲ４：ＰＤＧＦＲＢ；ＴＮＦ；ＩＮＳＲ；ＬＣＫ；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＰＤＧＦＲＡ；ＮＦＫＢ１；ＴＬＲ２；ＢＣＬ１０；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３；ＴＮＦＡＩＰ３；ＩＬ１Ｒ１。
ニューレグリン細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＥＲＢＢ４；ＰＲＫＣＥ；ＩＴＧＡＭ；ＩＴＧＡ５：ＰＴＥＮ；ＰＲＫＣＺ；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ２；ＰＲＫＣＩ；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＰＲＫＤ１；ＭＡＰＫ３；ＩＴＧＡ１；ＫＲＡＳ；ＰＲＫＣＤ；ＳＴＡＴ５Ａ；ＳＲＣ；ＩＴＧＢ７；ＲＡＦ１；ＩＴＧＢ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＤＡＭ１７；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＰＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＩＴＧＢ３；ＥＲＥＧ；ＦＲＡＰ１；ＰＳＥＮ１；ＩＴＧＡ２；ＭＹＣ；ＮＲＧ１；ＣＲＫＬ；ＡＫＴ３；ＰＲＫＣＡ；ＨＳ Ｐ９ＯＡＡ１；ＲＰＳ６ＫＢ１。
Ｗｎｔ及びベータカテニン細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＣＤ４４；ＥＰ３００；ＬＲＰ６；ＤＶＬ３；ＣＳＮＫ１Ｅ；ＧＪＡ１；ＳＭＯ；ＡＫＴ２；ＰＩＮ１；ＣＤＨ１；ＢＴＲＣ；ＧＮＡＱ；ＭＡＲＫ２；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＷＮＴ１１；ＳＲＣ；ＤＫＫ１；ＰＰＰ２ＣＡ；ＳＯＸ６；ＳＦＲＰ２：ＩＬＫ；ＬＥＦ１；ＳＯＸ９；ＴＰ５３；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＴＣＦ７Ｌ２；ＡＫＴ１；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＷＮＴ５Ａ；ＬＡＰＳ；ＣＴＮＮＢ１；ＴＧＦＢＲ１；ＣＣＮＤ１；ＧＳＫ３Ａ；ＤＶＬ１；ＡＰＣ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＭＹＣ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３；ＳＯＸ２。
インスリン受容体シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＴＥＮ；ＩＮＳ；ＥＩＦ４Ｅ；ＰＴＰＮ１；ＰＲＫＣＺ；ＭＡＰＫ１；ＴＳＣ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＣＢＬ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＲＫＣＩ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＩＡＳＩ；ＭＡＰＫ３；ＴＳＣ２；ＫＲＡＳ；ＥＩＦ４ＥＢＰ１；ＳＬＣ２Ａ４；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＰＰＰ１ＣＣ；ＩＮＳＲ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＰＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＧＳＫ３Ａ；ＦＲＡＰ１；ＣＲＫＬ；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＫＴ３；ＦＯＸＯ１；ＳＧＫ；ＲＰＳ６ＫＢ１。
ＩＬ－６細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＨＳＰＢ１；ＴＲＡＦ６；ＭＡＰＫＡＰＫ２；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＩＫＢＫＢ；ＦＯＳ；ＮＦＫＢ２：ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＭＡＰＫ１０；ＩＬ６ＳＴ；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＩＬ６Ｒ；ＲＥＬＡ；ＳＯＣＳ１；ＭＡＰＫ９；ＡＢＣＢ１；ＴＲＡＦ２；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＭＡＰ２Ｋ２；ＩＬ８；ＪＡＫ２；ＣＨＵＫ；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＣＥＢＰＢ；ＪＵＮ；ＩＬ１Ｒ１；ＳＲＦ；ＩＬ６。
肝胆汁うっ滞細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＲＡＫ１；ＩＮＳ；ＭＹＤ８８；ＰＲＫＣＺ；ＴＲＡＦ６；ＰＰＡＲＡ；ＲＸＲＡ；ＩＫＢＫＢ；ＰＲＫＣＩ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰＫ８；ＰＲＫＤ１；ＭＡＰＫ１０；ＲＥＬＡ；ＰＲＫＣＤ；ＭＡＰＫ９；ＡＢＣＢ１；ＴＲＡＦ２；ＴＬＲ４；ＴＮＦ；ＩＮＳＲ；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＩＬ８；ＣＨＵＫ；ＮＲ１Ｈ２；ＴＪＰ２；ＮＦＫＢ１；ＥＳＲ１；ＳＲＥＢＦ１；ＦＧＦＲ４；ＪＵＮ；ＩＬ１Ｒ１；ＰＲＫＣＡ；ＩＬ６。
ＩＧＦ－１細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＩＧＦ１；ＰＲＫＣＺ；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＮＥＤＤ４；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＲＫＣＩ；ＰＴＫ２；ＦＯＳ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＲＳ１；ＭＡＰＫ３；ＩＧＦＢＰ７；ＫＲＡＳ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＹＷＨＡＺ；ＰＸＮ；ＲＡＦ１；ＣＡＳＰ９；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＰＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＩＧＦＢＰ２；ＳＦＮ；ＪＵＮ；ＣＹＲ６１；ＡＫＴ３；ＦＯＸＯ１；ＳＲＦ；ＣＴＧＦ；ＲＰＳ６ＫＢ１。
ＮＲＦ２媒介性酸化ストレス応答シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＥＰ３００；ＳＯＤ２；ＰＲＫＣＺ；ＭＡＰＫ１；ＳＱＳＴＭ１；ＮＱＯ１；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＲＫＣＩ；ＦＯＳ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＰＲＫＤ１；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＰＲＫＣＤ；ＧＳＴＰ１；ＭＡＰＫ９；ＦＴＬ；ＮＦＥ２Ｌ２；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＭＡＰＫ１４；ＲＡＦ１；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＰＩＢ；ＪＵＮ；ＫＥＡＰ１；ＧＳＫ３Ｂ；ＡＴＦ４；ＰＲＫＣＡ；ＥＩＦ２ＡＫ３；ＨＳＰ９ＯＡＡ１。
肝線維症／肝星細胞活性化シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＥＤＮ１；ＩＧＦ１；ＫＤＲ；ＦＬＴ１；ＳＭＡＤ２；ＦＧＦＲ１；ＭＥＴ；ＰＧＦ；ＳＭＡＤ３；ＥＧＦＲ；ＦＡＳ；ＣＳＦ１；ＮＦＫＢ２；ＢＣＬ２；ＭＹＨ９；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＬ６Ｒ；ＲＥＬＡ；ＴＬＲ４；ＰＤＧＦＲＢ；ＴＮＦ；ＲＥＬＢ；ＩＬ８；ＰＤＧＦＲＡ；ＮＦＫＢ１；ＴＧＦＢＲ１；ＳＭＡＤ４；ＶＥＧＦＡ；ＢＡＸ；ＩＬ１Ｒ１；ＣＣＬ２；ＨＧＦ；ＭＭＰ１；ＳＴＡＴ１；ＩＬ６；ＣＴＧＦ；ＭＭＰ９。
ＰＰＡＲシグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＥＰ３００；ＩＮＳ；ＴＲＡＦ６；ＰＰＡＲＡ；ＲＸＲＡ；ＭＡＰＫ１；ＩＫＢＫＢ；ＮＣＯＲ２；ＦＯＳ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＭＡＰＫ３；ＮＲＩＰ１；ＫＲＡＳ；ＰＰＡＲＧ；ＲＥＬＡ；ＳＴＡＴ５Ａ；ＴＲＡＦ２；ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＰＤＧＦＲＢ；ＴＮＦ；ＩＮＳＲ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＣＨＵＫ；ＰＤＧＦＲＡ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＪＵＮ；ＩＬ１Ｒ１；ＨＳＰ９ＯＡＡ１。
ＦｃイプシロンＲＩシグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＲＡＣ１；ＰＲＫＣＺ；ＬＹＮ；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＳＹＫ；ＰＲＫＣＩ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＰＲＫＤ１；ＭＡＰＫ３；ＭＡＰＫ１０；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＰＲＫＣＤ；ＭＡＰＫ９；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＢＴＫ；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＰＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＡＫＴ３；ＶＡＶ３；ＰＲＫＣＡ。
Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＲＡＰ１Ａ；ＲＧＳ１６；ＭＡＰＫ１；ＧＮＡＳ；ＡＫＴ２；ＩＫＢＫＢ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＲＥＢ１；ＧＮＡＱ；ＮＦＫＢ２；ＣＡＭＫ２Ａ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＲＥＬＡ；ＳＲＣ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＦＹＮ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＰＤＰＫ１；ＳＴＡＴ３ ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＢＲＡＦ；ＡＴＦ４；ＡＫＴ３；ＰＲＫＣＡ。
イノシトールリン酸代謝シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＰＴＥＮ；ＧＲＫ６；ＭＡＰＫ１；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＤＫ８；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＭＡＰＫ９；ＣＤＫ２；ＰＩＭ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＤＹＲＫ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＩＰ５Ｋ１Ａ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＡＴＭ；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＢＲＡＦ；ＳＧＫ。
ＰＤＧＦシグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＥＩＦ２ＡＫ２；ＥＬＫ１；ＡＢＬ２；ＭＡＰＫ１；ＰＩＫ３ＣＡ；ＦＯＳ；ＰＩＫ３ＣＢ；Ｐ ＩＫ３ Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＣＡＶ１；ＡＢＬ１；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＳＲＣ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＰＤＧＦＲＢ；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＧＦＲＡ；ＳＴＡＴ３；ＳＰＨＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＭＹＣ；ＪＵＮ；ＣＲＫＬ；ＰＲＫＣＡ；ＳＲＦ；ＳＴＡＴ１；ＳＰＨＫ２ ＶＥＧＦシグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＡＣＴＮ４；ＲＯＣＫ１；ＫＤＲ；ＦＬＴ１；ＲＯＣＫ２；ＭＡＰＫ１；ＰＧＦ；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＡＲＮＴ；ＰＴＫ２；ＢＣＬ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＢＣＬ２Ｌ１；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＨＩＦ１Ａ；ＮＯＳ３；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＰＸＮ；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＥＬＡＶＬ１；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＳＦＮ；ＶＥＧＦＡ；ＡＫＴ３；ＦＯＸＯ１；ＰＲＫＣＡ。
ナチュラルキラー細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＲＡＣ１；ＰＲＫＣＺ；ＭＡＰＫ１；ＲＡＣ２；ＰＴＰＮ１１；ＫＩＲ２ＤＬ３；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＳＹＫ；ＰＲＫＣＩ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＰＲＫＤ１；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＰＲＫＣＤ；ＰＴＰＮ６；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＬＣＫ；ＲＡＦ１；ＦＹＮ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＡＫ４；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＡＫＴ３；ＶＡＶ３；ＰＲＫＣＡ。
細胞周期：Ｇｌ／Ｓチェックポイント制御シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＨＤＡＣ４；ＳＭＡＤ３；ＳＵＶ３９Ｈ１；ＨＤＡＣ５；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＢＴＲＣ；ＡＴＲ；ＡＢＬ１；Ｅ２Ｆ１；ＨＤＡＣ２；ＨＤＡＣ７Ａ；ＲＢ１；ＨＤＡＣ１１；ＨＤＡＣ９；ＣＤＫ２；Ｅ２Ｆ２；ＨＤＡＣ３；ＴＰ５３；ＣＤＫＮ１Ａ；ＣＣＮＤ１；Ｅ２Ｆ４；ＡＴＭ；ＲＢＬ２；ＳＭＡＤ４；ＣＤＫＮ２Ａ；ＭＹＣ；ＮＲＧ１；ＧＳＫ３Ｂ；ＲＢＬ１；ＨＤＡＣ６。
Ｔ細胞受容体シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＲＡＣ１；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＩＫＢＫＢ；ＣＢＬ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＦＯＳ；ＮＦＫＢ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＲＥＬＡ、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＢＴＫ；ＬＣＫ；ＲＡＦ１；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ、ＦＹＮ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＣＨＵＫ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＮＦＫＢ１；ＩＴＫ；ＢＣＬ１０；ＪＵＮ；ＶＡＶ３。
死受容体障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＣＲＡＤＤ；ＨＳＰＢ１；ＢＩＤ；ＢＩＲＣ４；ＴＢＫ１；ＩＫＢＫＢ；ＦＡＤＤ；ＦＡＳ；ＮＦＫＢ２；ＢＣＬ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰＫ８；ＲＩＰＫ１；ＣＡＳＰ８；ＤＡＸＸ；ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ；ＲＥＬＡ；ＴＲＡＦ２；ＴＮＦ；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＣＡＳＰ９；ＣＨＵＫ；ＡＰＡＦ１；ＮＦＫＢ１；ＣＡＳＰ２；ＢＩＲＣ２；ＣＡＳＰ３；ＢＩＲＣ３。
ＦＧＦ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＲＡＣ１；ＦＧＦＲ１；ＭＥＴ；ＭＡＰＫＡＰＫ２；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＲＥＢ１；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＭＡＰＫ１３；ＰＴＰＮ６；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＭＡＰＫ１４；ＲＡＦ１；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＦＧＦＲ４；ＣＲＫＬ；ＡＴＦ４；ＡＫＴ３；ＰＲＫＣＡ；ＨＧＦ。
ＧＭ－ＣＳＦ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＬＹＮ；ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＡＭＫ２Ａ；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＧＮＢ２Ｌ１；ＢＣＬ２Ｌ１；ＭＡＰＫ３；ＥＴＳ１；ＫＲＡＳ；ＲＵＮＸ１；ＰＩＭ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＣＣＮＤ１；ＡＫＴ３；ＳＴＡＴ１。
筋萎縮性側索硬化症細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＢＩＤ；ＩＧＦ１；ＲＡＣ１；ＢＩＲＣ４；ＰＧＦ；ＣＡＰＮＳ１；ＣＡＰＮ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＢＣＬ２；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＢＣＬ２Ｌ１；ＣＡＰＮ１；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＴＰ５３；ＣＡＳＰ９；ＰＩＫ３Ｒ１；ＲＡＢ５Ａ；ＣＡＳＰ１；ＡＰＡＦ１；ＶＥＧＦＡ；ＢＩＲＣ２；ＢＡＸ；ＡＫＴ３；ＣＡＳＰ３；ＢＩＲＣ３ ＰＴＰＮ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＳＯＣＳ１；ＳＴＡＴ５Ａ；ＰＴＰＮ６；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＲＡＦ１；ＣＤＫＮ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＦＲＡＰ１；ＡＫＴ３；ＳＴＡＴ１。
ＪＡＫ／Ｓｔａｔ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＴＰＮ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＳＯＣＳ１；ＳＴＡＴ５Ａ；ＰＴＰＮ６；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＲＡＦ１；ＣＤＫＮ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＡＫＴ１；ＪＡＫ２；ＰＩＫ３Ｒ１；ＳＴＡＴ３；ＭＡＰ２Ｋ１；ＦＲＡＰ１；ＡＫＴ３；ＳＴＡＴ１。
ニコチン酸及びニコチンアミド代謝細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＩＲＡＫ１；ＰＲＫＡＡ２；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＧＲＫ６；ＭＡＰＫ１；ＰＬＫ１；ＡＫＴ２；ＣＤＫ８；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＰＲＫＣＤ；ＰＲＫＡＡ１；ＰＢＥＦ１；ＭＡＰＫ９；ＣＤＫ２；ＰＩＭ１；ＤＹＲＫ１Ａ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＡＫ３；ＮＴ５Ｅ；ＴＴＫ；ＣＳＮＫ１Ａ１；ＢＲＡＦ；ＳＧＫ。
ケモカイン細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＣＸＣＲ４；ＲＯＣＫ２；ＭＡＰＫ１；ＰＴＫ２；ＦＯＳ；ＣＦＬ１；ＧＮＡＱ；ＣＡＭＫ２Ａ；ＣＸＣＬ１２；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ１３；ＲＨＯＡ；ＣＣＲ３；ＳＲＣ；ＰＰＰ１ＣＣ；ＭＡＰＫ１４；ＮＯＸ１；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＭＡＰ２Ｋ１；ＪＵＮ；ＣＣＬ２；ＰＲＫＣＡ。
ＩＬ－２細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＡＫＴ２；ＰＩＫ３ＣＡ；ＳＹＫ；ＦＯＳ；ＳＴＡＴ５Ｂ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＳＯＣＳ１；ＳＴＡＴ５Ａ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＬＣＫ；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＪＡＫ１；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＪＵＮ；ＡＫＴ３。
シナプス長期抑制シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＧＦ１；ＰＲＫＣＺ；ＰＲＤＸ６；ＬＹＮ；ＭＡＰＫ１；ＧＮＡＳ；ＰＲＫＣＩ；ＧＮＡＱ；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＩＧＦ１Ｒ；ＰＲＫＤ１；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＧＲＮ；ＰＲＫＣＤ；ＮＯＳ３；ＮＯＳ２Ａ；ＰＰＰ２ＣＡ；ＹＷＨＡＺ；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＲＫＣＡ。
エストロゲン受容体細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＴＡＦ４Ｂ；ＥＰ３００；ＣＡＲＭ１；ＰＣＡＦ；ＭＡＰＫ１；ＮＣＯＲ２；ＳＭＡＲＣＡ４；ＭＡＰＫ３；ＮＲＩＰ１；ＫＲＡＳ；ＳＲＣ；ＮＲ３Ｃ１；ＨＤＡＣ３；ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＲＢＭ９；ＮＣＯＡ３；ＲＡＦ１；ＣＲＥＢＢＰ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＮＣＯＡ２；ＭＡＰ２Ｋ１；ＰＲＫＤＣ；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２。
タンパク質ユビキチン化経路細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＴＲＡＦ６；ＳＭＵＲＦ１；ＢＩＲＣ４；ＢＲＣＡｌ；ＵＣＨＬ１；ＮＥＤＤ４；ＣＢＬ；ＵＢＥ２Ｉ；ＢＴＲＣ；ＨＳＰＡ５；ＵＳＰ７；ＵＳＰ１０；ＦＢＸＷ７；ＵＳＰ９Ｘ；ＳＴＵＢ１；ＵＳＰ２２；Ｂ２Ｍ；ＢＩＲＣ２；ＰＡＲＫ２；ＵＳＰ８；ＵＳＰ１；ＶＨＬ；ＨＳＰ９ＯＡＡ１；ＢＩＲＣ３。
ＩＬ－１０細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＴＲＡＦ６；ＣＣＲ１；ＥＬＫ１；ＩＫＢＫＢ；ＳＰ１；ＦＯＳ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ１３；ＲＥＬＡ；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＪＡＫ１；ＣＨＵＫ；ＳＴＡＴ３；ＮＦＫＢ１；ＪＵＮ；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ６。
ＶＤＲ／ＲＸＲ活性化シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＥＰ３００；ＰＲＫＣＺ；ＲＸＲＡ；ＧＡＤＤ４５Ａ；ＨＥＳ１；ＮＣＯＲ２；ＳＰ１；ＰＲＫＣＩ；ＣＤＫＮ１Ｂ；ＰＲＫＤ１；ＰＲＫＣＤ；ＲＵＮＸ２；ＫＬＦ４；ＹＹ１；ＮＣＯＡ３；ＣＤＫＮ１Ａ；ＮＣＯＡ２；ＳＰＰ１；ＬＡＰＳ；ＣＥＢＰＢ；ＦＯＸＯ１；ＰＲＫＣＡ。
ＴＧＦ－ベータ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＥＰ３００；ＳＭＡＤ２；ＳＭＵＲＦ１；ＭＡＰＫ１；ＳＭＡＤ３；ＳＭＡＤ１；ＦＯＳ；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＭＡＰＫ９；ＲＵＮＸ２；ＳＥＲＰＩＮＥ１；ＲＡＦ１；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＲＥＢＢＰ；ＭＡＰ２Ｋ２；ＭＡＰ２Ｋ１；ＴＧＦＢＲ１；ＳＭＡＤ４；ＪＵＮ；ＳＭＡＤ５。
Ｔｏｌｌ様受容体細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＩＲＡＫ１；ＥＩＦ２ＡＫ２；ＭＹＤ８８；ＴＲＡＦ６；ＰＰＡＲＡ；ＥＬＫ１；ＩＫＢＫＢ；ＦＯＳ；ＮＦＫＢ２；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ１３；ＲＥＬＡ；ＴＬＲ４；ＭＡＰＫ１４；ＩＫＢＫＧ；ＲＥＬＢ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＣＨＵＫ；ＮＦＫＢ１；ＴＬＲ２；ＪＵＮ。
ｐ３８ ＭＡＰＫ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＨＳＰＢ１；ＩＲＡＫ１；ＴＲＡＦ６；ＭＡＰＫＡＰＫ２；ＥＬＫ１；ＦＡＤＤ；ＦＡＳ；ＣＲＥＢ１；ＤＤＩＴ３；ＲＰＳ６ＫＡ４；ＤＡＸＸ；ＭＡＰＫ１３；ＴＲＡＦ２；ＭＡＰＫ１４；ＴＮＦ；ＭＡＰ３Ｋ７；ＴＧＦＢＲ１；ＭＹＣ；ＡＴＦ４；ＩＬ１Ｒ１；ＳＲＦ；ＳＴＡＴ１。
ニューロロフィン（Ｎｅｕｒｏｌｒｏｐｈｉｎ）／ＴＲＫ細胞シグナル伝達障害：これらの障害に関連する遺伝子：ＮＴＲＫ２；ＭＡＰＫ１；ＰＴＰＮ１１；ＰＩＫ３ＣＡ；ＣＲＥＢ１；ＦＯＳ；ＰＩＫ３ＣＢ；ＰＩＫ３Ｃ３；ＭＡＰＫ８；ＭＡＰＫ３；ＫＲＡＳ；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ；ＲＡＦ１；ＭＡＰ２Ｋ２；ＡＫＴ１；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＤＰＫ１；ＭＡＰ２Ｋ１；ＣＤＣ４２；ＪＵＮ；ＡＴＦ４。
遺伝子修飾に関連するその他の細胞機能不全障害が本明細書において企図され、これは例えば、ＦＸＲ／ＲＸＲ活性化、シナプス長期増強、カルシウムシグナル伝達、ＥＧＦシグナル伝達、心血管系における低酸素症シグナル伝達、ＲＸＲ機能のＬＰＳ／ＩＬ－１媒介性阻害、ＬＸＲ／ＲＸＲ活性化、アミロイドプロセシング、ＩＬ－４シグナル伝達、細胞周期：Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ損傷チェックポイント制御、心臓血管系における一酸化窒素シグナル伝達、プリン代謝、ｃＡＭＰ媒介性シグナル伝達、ミトコンドリア機能障害、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、小胞体ストレス経路、ピリミジン代謝、パーキンソンシグナル伝達、心臓及びベータアドレナリンシグナル伝達、解糖／糖新生、インターフェロンシグナル伝達、ソニックヘッジホッグシグナル伝達、グリセロリン脂質代謝、リン脂質分解、トリプトファン代謝、リジン分解、ヌクレオチド切出修復経路、デンプン及びスクロース代謝、アミノ糖代謝、アラキドン酸代謝、概日リズムシグナル伝達、凝固系、ドーパミン受容体シグナル伝達、グルタチオン代謝、グリセロ脂質代謝、リノール酸代謝、メチオニン代謝、ピルビン酸代謝、アルギニン及びプロリン代謝、エイコサノイドシグナル伝達、フルクトース及びマンノース代謝、ガラクトース代謝、スチルベン、クマリン及びリグニン生合成、抗原提示経路、ステロイドの生合成、ブタン酸代謝、クエン酸塩サイクル、脂肪酸代謝、グリセロリン脂質代謝、ヒスチジン代謝、イノシトール代謝、シトクロムＰ４５０による生体異物の代謝、メタン代謝、フェニルアラニン代謝、プロパン酸代謝、セレノアミノ酸代謝、スフィンゴ脂質代謝、アミノホスホン酸代謝、アンドロゲン及びエストロゲン代謝、アスコルビン酸及びアルダル酸代謝、胆汁酸生合成、システイン代謝、脂肪酸生合成、グルタミン酸受容体シグナル伝達、ＮＲＦ２媒介性酸化ストレス応答、ペントースリン酸経路、ペントースとグルクロン酸との相互変換、レチノール代謝、リボフラビン代謝、チロシン代謝、ユビキノン生合成、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの分解、グリシン、セリン、及びスレオニンの代謝、リジン分解、痛み／味覚、もしくはミトコンドリア機能の発達神経学、またはこれらの組み合わせである。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、天然配列、操作された配列、または合成バリアントの操作されたヌクレオチド配列を包含することができる。非天然ヌクレアーゼシステムを得るために行うことができる操作の種類の非限定的な例は以下の通りである。操作には、異種宿主細胞などの宿主細胞における発現を促進または改善するためのコドン最適化が含まれる場合がある。操作により、ヌクレアーゼのサイズまたは分子量を小さくして、発現または送達を容易にすることができる。操作は、ＰＡＭの特異性を変更するか、または認識されるＰＡＭの範囲を広げるために、ＰＡＭの選択を変更することができる。操作は、標的化可能なヌクレアーゼシステムの安定性、処理能力、特異性、または効率を変更、増加、または減少させることができる。操作は、タンパク質の安定性を変更、増加、または減少させることができる。操作は、核酸スキャンの処理能力を変更、増加、または減少させることができる。操作は、標的配列の特異性を変更、増加、または減少させることができる。操作は、ヌクレアーゼ活性を変更、増加、または減少させることができる。操作は、編集効率を変更、増加、または減少させることができる。操作は、形質転換効率を変更、増加、または減少させることができる。操作は、ヌクレアーゼを変更、増加、もしくは減少させるか、または核酸発現を誘導することができる。本明細書で使用するとき、非天然核酸配列は、合成バリアントの操作された配列または操作されたヌクレオチド配列であり得る。こうした非天然の核酸配列は、当業者に既知の方法を使用して、増幅、クローン化、構築、合成、合成オリゴヌクレオチドもしくはｄＮＴＰからの生成、または別の方法で得ることができる。特定の実施形態では、本明細書に開示される非天然の核酸誘導型ヌクレアーゼの例としては、操作されたポリペプチド配列（例えば、配列番号１４３～１７７、２２９、２５７～２６２、及び３３０、本明細書に記載の追加のアミノ酸配列も含む場合がある）；従って（ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ）コードする操作されたポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１～１４２、２２５～２２８、２３０～２５６、及び２３０、本明細書に記載の追加のヌクレオチド配列も含む場合がある）；合成バリアントまたはその一部のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列（例えば、配列番号１７８～１８８、表３に記載される配列、またはその一部）の一部を含む、これらの核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性があるＲＮＡ、例えば操作されたｇＲＮＡを含む１つ以上のポリヌクレオチド；及び／または本明細書に記載されるその他のものを含む核酸誘導型ヌクレアーゼが挙げられ得る。
核酸誘導型ヌクレアーゼが本明細書に開示される。開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボでの適用のために、インビトロで、または原核細胞、古細菌細胞、もしくは真核細胞において機能的であることが理解される。好適な核酸誘導型ヌクレアーゼは、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋａｎｄｌｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｏｒｅａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒが挙げられるがこれらに限定されない属に由来する生物に由来し得る。こうした属の生物の種は、本明細書で別に議論されている通りであり得る。好適なｇＲＮＡは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｔｅｓ、及びＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓが挙げられるがこれらに限定されない界内の属または未分類属由来の生物に由来し得る。好適なｇＲＮＡは、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、及びＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓが挙げられるがこれらに限定されない門内の属または未分類属由来の生物に由来し得る。好適なｇＲＮＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ、Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、及びＴｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓが挙げられるがこれらに限定されない目内の属または未分類属由来の生物に由来し得る。好適なｇＲＮＡは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｒｙｏｍｏｏｒｐｈａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎａｕｔｉｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｐｉｓｃｉｒｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｃｅａｅが挙げられるがこれらに限定されない科内の属または未分類属由来の生物に由来し得る。いくつかの実施形態では、好適なｇＲＮＡは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、及びＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａを含む科内の属または未分類属由来の生物に由来し得る。その他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、２０１５年１２月１８日出願の米国特許出願公開第ＵＳ２０１６０２０８２４３号、２０１３年３月１５日出願の米国特許出願公開第ＵＳ２０１４００６８７９７号、２０１３年１０月１５日出願の米国特許第８，６９７，３５９号、及びＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１５ Ｏｃｔ．２２；１６３（３）：７５９－７１で説明されている。
本開示の方法、システム、及び組成物での使用に適したいくつかの核酸誘導型ヌクレアーゼとしては、以下のものなどであるがこれらに限定されない生物に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＸＳ５、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｓｐ．、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＯＥ１、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ １９１８８、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ経口分類群２７４、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ ｓｅｒｏｖａｒ Ｌｙｍｅ ｓｔｒ．１０、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．結晶構造体（５Ｂ４３） Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ Ｂ３１６、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：２９０、Ｋａｎｄｌｅｒｉａ ｖｉｔｕｌｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＫＡ００２７４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３－２、Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ ＧＤ／７、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｕｍｂａｅ ＤＳＭ ７３７４、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＥＦＢ－Ｎ１、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ ＡＴＣＣ ３５８９６、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ ＡＴＣＣ ４９０２５、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ ＤＳＭ １０７１１、Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．ＨＩ０００９、Ｃａｎｄｉｄｔｕｓ ｋｅｆｅｌｄｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ＣａｓＹ．４、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ ＷＯＲ ２ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＦ２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＳＰ２．１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃａｔｅｎｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．ＣＣＢ－ＱＢ４、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＡＦ１６－５、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、ｔａｎａｋａｅｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＧＷ－Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－６、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ ｓｐ．Ａｎ２２、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｍ、及びＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つと少なくとも５０％同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のうち１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％、または１００％同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１のうち１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％、または１００％同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３、１４４、１４７、１４８、１５０、及び１５１のいずれか１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼは、保存されたペプチドモチーフ、またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、こうしたモチーフをコードするヌクレオチド配列を、既知のヌクレアーゼと共有しない。特定の実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼは、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含まない。特定の実施形態では、本明細書に開示されるヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、コードされたヌクレアーゼ内のペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）をコードしない。配列番号２２４のモチーフは、全く存在しなくてもよく、または配列番号２２４と比較して、１、２、３、４、５、または５を超える置換アミノ酸を有してもよい。置換は、保存的もしくはラジカル、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、配列番号２２４以外の配列は、少なくとも１つのラジカル置換を有し得る。特定の実施形態では、配列番号２２４以外の配列は、スニース指数（Ｓｎｅａｔｈ’ｓ ｉｎｄｅｘ）で少なくとも１０、１５、２０、または２５の値を有する少なくとも１、２、３、または４個の置換を有し得る。特定の実施形態では、配列番号２２４以外の配列は、スニース指数で少なくとも２５の値を有する少なくとも１個の置換を有し得る。
本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４４のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３によって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、本明細書に記載されるものなどの追加のアミノ酸配列を含まなくても、操作された配列であるアミノ酸配列、すなわち任意の既知の天然配列と一致しないアミノ酸配列を含み得る。本明細書の特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２９によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２９によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２９によって表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２９によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２９によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２９のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、ヌクレアーゼポリペプチドの全アミノ酸配列であってもよく、または上記のように追加のアミノ酸配列が付加された元のヌクレアーゼポリペプチドであってもよい。
したがって、明らかとなるように、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステム、その成分及び生成物を提供及び／または利用する組成物及び方法、ならびに他の組成物及び方法が本明細書に開示される。本明細書で使用するとき、「操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステム」とは、本明細書では、新規な操作された核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトとも称することができ、非天然の核酸誘導型ヌクレアーゼシステムなどは、システムが非天然である核酸誘導型ヌクレアーゼシステムとも称することができる。このシステムは、ａ）場合によっては１つ以上の位置で更にプロセシングした後の、例えば宿主細胞中で用いられる、１つ以上の方法で用いられる、その最終形態にある１つ以上の成分、ｂ）１つ以上の成分をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含むことができ、このシステムはａ）及びｂ）を含むことができる。この成分は、１）操作された核酸誘導型ヌクレアーゼ、またはその活性部分などのその一部、２）操作された核酸誘導型ヌクレアーゼまたはその一部と適合性の操作されたガイド核酸、例えばｇＲＮＡ、及び／または、コードまたはその他のポリヌクレオチドの場合、３）１つ以上の操作されたポリヌクレオチド、のうちの１つ以上を含む。このシステムは、編集テンプレートなどの他の成分を更に含むことができる。
本明細書で使用するとき、本明細書では新規とも称される「操作する、操作された」などは、非天然の組成物または方法を指すことができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示される非天然の核酸誘導型ヌクレアーゼの例としては、ポリヌクレオチド配列、例えば操作されたポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書でより詳細に説明される、配列番号１～１４２、２２５～２２８及び３３０、またはそのサブグループ）を用いて産生された核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び、合成バリアントのｇＮＡ、例えばｇＲＮＡ配列（例えば配列番号１７８～１８８）を挙げることができる。特定の実施形態では、ｇＮＡ、例えば表３に示され、本明細書でより詳細に説明されるｇＲＮＡを含む合成バリアントが使用され得る。
特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼが本明細書で提供される。本明細書で使用するとき、「操作された核酸誘導型ヌクレアーゼ」または同様の用語は、非天然の核酸誘導型ヌクレアーゼであり、ヌクレアーゼは、操作されたヌクレアーゼポリペプチド及び／またはそれをコードする１つ以上の操作されたポリヌクレオチドを含むことなどの任意の理由で非天然であってよい。
本明細書で使用するとき、「核酸誘導型ヌクレアーゼ」は、本明細書では単にヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａ様などとも称され、これは、適合性のガイド核酸、例えば適合性ｇＲＮＡと共に標的ポリヌクレオチド中の標的配列で、またはその近くで結合して切断可能なヌクレアーゼを指し得る。本明細書で、標的核酸、標的ポリヌクレオチド配列などとも称される「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有する配列を指し得、ここで標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがヌクレアーゼ複合体、例えば操作されたヌクレアーゼ複合体の活性を可能にする。標的化可能なヌクレアーゼ複合体の標的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。「標的ポリヌクレオチド」は、その用語などが本明細書で使用される場合、標的配列が位置するポリヌクレオチドを指すことができる。
ガイド核酸（ｇＮＡ）、例えばｇＲＮＡ、及びｇＮＡもしくはｇＲＮＡ、またはｇＮＡもしくはｇＲＮＡの一部をコードするポリヌクレオチドが本明細書で開示される。特定の実施形態では、ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、操作されたｇＮＡ、例えば操作されたｇＲＮＡである。
本明細書で使用するとき、「ガイド核酸」または「ガイドポリヌクレオチド」（ｇＮＡ）は、１つ以上のポリヌクレオチドを指すことができ、ｇＮＡは、１）標的配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び２）核酸誘導型ヌクレアーゼと相互作用または複合体形成できる足場配列を含む。ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体が標的配列またはその近傍に位置して切断するために、適合性の核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することが必要である。本明細書でＲＮＡガイドポリヌクレオチドとも称される「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」は、そのヌクレオチドが天然または修飾のいずれかのリボヌクレオチドである、ｇＮＡである。
標的化可能なヌクレアーゼ複合体の標的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。「標的ポリヌクレオチド」は、その用語などが本明細書で使用される場合、標的配列が位置するポリヌクレオチドを指すことができる。標的ポリヌクレオチドは、コードヌクレオチドまたは非コードヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、標的配列は、セーフハーバー部位（ＳＨＳ）である標的ポリヌクレオチド内にある。
ガイド核酸は、１つ以上の核酸として提供することができる。
特定の実施形態では、ガイド核酸、例えばｇＲＮＡは、会合して機能的ガイド核酸、例えばｇＲＮＡ（スプリットまたはデュアルガイド核酸、例えばスプリットまたはデュアルｇＲＮＡ）を形成する２つの別個のポリヌクレオチドとして提供される。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、スプリットｇＮＡ、例えばスプリットｇＲＮＡを含む適合性ｇＮＡ、例えば適合性ｇＲＮＡと結合され、ここでヌクレアーゼ、またはそれが由来するヌクレアーゼ配列は、その天然の状態ではスプリットｇＮＡ、例えばスプリットｇＲＮＡとは結合しないが、単一ｇＮＡ、例えば単一ｇＲＮＡと結合する。これらの天然ヌクレアーゼの少なくともいくつか、例えばＣａｓ１２ａでは、天然ｇＲＮＡにｔｒａｃｒＲＮＡが存在しない。本明細書の特定の実施形態では、スプリットｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。これらの非天然ｇＮＡの更なる議論は、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０２１０６７７８８号を参照されたい。
特定の実施形態では、ガイド配列及び足場配列は、単一のポリヌクレオチド（単一のガイド核酸、例えば、単一のｇＲＮＡ）として提供される。
本明細書に開示される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼは、適合性ｇＮＡ、例えば適合性ｇＲＮＡと結合すると、本明細書でリボ核タンパク質（ＲＮＰ）（ｇＲＮＡの場合）、複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼなどとも称される標的化可能なヌクレアーゼ複合体を形成し、これは、ガイド核酸のガイド配列によって決定される標的ポリヌクレオチド内の標的配列と結合し、標的配列で、またはその付近で切断することが可能である。ガイドポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むことができる。ガイドポリヌクレオチドがＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイドポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるプラスミド、線状コンストラクト、または編集カセットなどのポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によってコードされ得る。
一般に、ガイドポリヌクレオチドは、適合性の核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することができ、標的配列とハイブリダイズすることができ、それによってヌクレアーゼを標的配列に向かわせる。ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成することができる対象の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドと適合性のある核酸誘導型ヌクレアーゼと称され得る。更に、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することが可能なガイドポリヌクレオチドは、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性のあるガイドポリヌクレオチドまたはガイド核酸と称され得る。
ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、天然のｇＮＡ、例えば天然のｇＲＮＡであり得る。特定の実施形態では、ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、操作されたｇＮＡ、例えば操作されたｇＲＮＡである。「操作されたガイド核酸」、例えば「操作されたｇＲＮＡ」は、その用語を本明細書で使用するとき、新規なガイド核酸、例えば新規なｇＲＮＡとも称されてよく、非天然のガイド核酸、例えば非天然のｇＲＮＡ、または直交ｇＮＡ、例えば直交ｇＲＮＡを含むことができる。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの内因性宿主内に見出されないガイド核酸と適合することができる。こうした直交ガイド核酸は、経験的試験によって決定することができる。直交ガイド核酸は、異なる細菌種に由来するか、合成されているか、さもなければ非天然となるように操作されている場合がある。
核酸誘導型ヌクレアーゼと適合する直交ガイド核酸は、１つ以上の共通の特徴を含むことができる。共通の特徴には、シュードノット領域外の配列が含まれる場合がある。共通の特徴には、シュードノット領域が含まれる場合がある。共通の特徴には、一次配列または二次構造が含まれ得る。
標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体が本明細書に開示される。「標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体」などは、その用語を本明細書で使用するとき、適合性ｇＮＡに結合した核酸誘導型ヌクレアーゼを指すことができ、複合体は、標的ポリヌクレオチド中の標的配列またはその近くに結合し、そこで少なくとも１つの鎖切断を生成する機能を有する。特定の実施形態では、標的化可能な核酸誘導型複合体は、ｇＲＮＡであるｇＮＡを含み、こうした複合体は「リボ核タンパク質」または「ＲＮＰ」と称され得る。特定の実施形態では、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰは、操作された標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えば操作されたＲＮＰである。「操作された標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体」、例えば「操作されたＲＮＰ」などは、それらの用語を本明細書で使用するとき、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰを指すことができ、ここでは、核酸誘導型ヌクレアーゼが操作された核酸誘導型ヌクレアーゼを含むか、ガイド核酸、例えばｇＲＮＡが操作されたガイド核酸、例えば操作されたｇＲＮＡを含むか、またはその両方である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ及びｇＮＡ、例えばｇＲＮＡの両方が操作されている。操作された核酸誘導型ヌクレアーゼが使用される実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼなどの任意の適切な核酸誘導型ヌクレアーゼが使用され得る。操作されたｇＮＡ、例えば操作されたｇＲＮＡが使用される実施形態では、本明細書に開示される操作されたｇＮＡ、例えば操作されたｇＲＮＡなどの、任意の好適な操作されたｇＮＡ、例えば操作されたｇＲＮＡが使用され得る。
標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰは、当技術分野で既知の任意の好適な方法で産生することができる。一方の極では、核酸誘導型ヌクレアーゼ及びその適合性ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡの両方が合成で産生され、続いて結合されて、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰ形成される。複合体は、任意の好適な方法、例えばエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入することができる。もう一方の極では、宿主細胞に導入された１つ以上のポリヌクレオチドの転写及び／または翻訳によって、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰが宿主細胞中で産生され、ここで１またはそれ以上のポリヌクレオチドは、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰの１つ以上の成分をコードする部分、例えば、用いられる場合、ヌクレアーゼをコードする１つ以上の部分、１つ以上のｇＮＡ、例えばｇＲＮＡをコードする１つ以上の部分、及び１つ以上の編集テンプレートをコードする１つ以上の部分を含有する。本明細書で論じられ、かつ当技術分野で知られているようにポリヌクレオチドを操作可能にして、１つ以上のベクターを産生するために、調節要素及びその他を追加することができる。１つ以上のベクターは、任意の好適な方法によって宿主細胞に導入される。様々な成分が細胞によって産生され、細胞内で標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰ内に集合する。これらのうちいずれか、またはこれら両極間の任意の変形が使用可能であり、また当外技術分野で広く説明されてきた。例えば、米国特許第１０，３３７，０２８号を参照されたい。特定の実施形態では、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼは、１つ以上の適切なベクターにパッケージ化された好適な１またはそれ以上のポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼを産生する第１の宿主細胞に導入し、続いて抽出し、好適な程度まで精製することによって、第１の宿主細胞内で産生される。本明細書に記載の様々な精製タグ、切断配列、ＦＬＡＧ、及び３ＸＦＬＡＧが、ヌクレアーゼの単離及び精製を助けるのに有用であることは明らかであろう。特定の実施形態では、１つ以上の適合性ｇＮＡ、例えば、１つ以上の適合性ｇＲＮＡ、例えば１つ以上の修飾されたヌクレオチド、例えばスプリットｇＮＡ、例えばスプリットｇＲＮＡ、または単一のｇＮＡ、例えば単一のｇＲＮＡ（特定の実施形態ではスプリットｇＮＡ）であり得る１つ以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む１つ以上の適合性ｇＲＮＡが、完全なｇＮＡまたはｇＲＮＡとして合成される。合成されたｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、宿主細胞に導入され得、ここで、適合性ｇＮＡ、例えば適合性ｇＲＮＡがヌクレアーゼに遭遇すると、標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰに結合する。合成されたｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、続いて宿主細胞に導入される標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰの形成を可能にするのに十分な時間、細胞外の好適なヌクレアーゼと接触させることができる。
特定の実施形態では、組み込まれる配列は導入遺伝子を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、操作されたヌクレアーゼポリペプチドを含む核酸誘導型ヌクレアーゼを利用する。本明細書で使用するとき、用語「操作されたヌクレアーゼポリペプチド」は、本明細書では操作された配列などとも称され、非天然のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼポリペプチドを指すことができ、ここでポリペプチドは、そのままで、または追加のプロセシングを伴い、適合性ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡと組み合わせてのいずれかで核酸誘導型ヌクレアーゼとして機能する。非天然のアミノ酸配列は、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、またはそれらの組み合わせにおける、例えば配列中の１つ以上のアミノ酸の置換、及び／または１つ以上のアミノ酸の付加による配列中の非天然アミノ酸により、天然配列とは異なるアミノ酸配列であってもよい。
本明細書で使用するとき、「操作された核酸誘導型ヌクレアーゼ」は、本明細書でＣａｓ１２ａ様ヌクレアーゼとも称され、非天然のヌクレアーゼである。ヌクレアーゼは、操作されたヌクレアーゼポリペプチドを含むことが挙げられるがこれに限定されない理由により、非天然であり得る。
特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、ヌクレアーゼポリペプチド、例えば、例えばアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方において追加のアミノ酸が付加されている、配列番号１４３～１７７及び２２９によって表される任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、場合によっては少なくとも９０％、場合によっては少なくとも９５％、場合によっては少なくとも９９％、または更には１００％の配列同一性を有するアミノ配列を含むヌクレアーゼポリペプチドを含み得る。こうした付加としては、任意の好適な付加が挙げられ得る。例示的な付加としては、１つ以上の核局在配列（ＮＬＳ）、１つ以上の精製タグ、１つ以上の切断配列、１つ以上のマーカー、１つ以上のＦＬＡＧもしくは３ＸＦＬＡＧ配列、またはこれらの組み合わせが挙げられ、各付加は、必要に応じて、コアアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端で生じ得る。「アミノ末端で」という用語は、本明細書で使用するとき、アミノ末端の前に付加され、アミノ末端に直接的または間接的に連結されたアミノ酸付加を含む。「アミノ末端で」という用語は、本明細書で使用するとき、アミノ末端の後に付加され、アミノ末端に直接的または間接的に連結されたアミノ酸付加を含む。追加のアミノ酸の１つ以上は、ヌクレアーゼポリペプチドの調製及び／またはプロセシング中に切断され得る。
「ヌクレアーゼポリペプチド」などの用語は、本明細書で使用するとき、ポリペプチドが、そのままで、または追加のプロセシングを伴い、適合性ｇＮＡ、例えば適合性ｇＲＮＡと組み合わせてのいずれかで核酸誘導型ヌクレアーゼとして機能するようにアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すことができる。用語「天然のヌクレアーゼポリペプチド」は、本明細書では天然のヌクレアーゼポリペプチド配列などとも称され、本明細書で使用するとき、自然界で見出されるヌクレアーゼポリペプチド、例えば原核生物中で見出される核酸誘導型ヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書で使用するとき、用語「元のヌクレアーゼポリヌクレオチド」などは、操作されたヌクレアーゼポリペプチドが由来するヌクレアーゼポリペプチドを指すことができる。場合によっては、元のヌクレアーゼポリペプチドは、天然のヌクレアーゼポリペプチドであり得る。
本明細書で使用するとき、用語「操作されたヌクレアーゼポリペプチド」は、本明細書では操作された配列などとも称され、非天然のヌクレアーゼポリペプチドを指すことができる。ヌクレアーゼポリペプチドは、既知の天然のヌクレアーゼポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する、または１つ以上の追加のアミノ酸配列が、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方において付加される、元のヌクレアーゼポリペプチド（天然のヌクレアーゼポリペプチドであり得る）を含むヌクレアーゼポリペプチドを有するなどの任意の理由により非天然であり得る。
元のヌクレアーゼポリペプチドに付加され得る追加のアミノ酸配列は、任意の好適なアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、追加のアミノ酸配列としては、核局在配列配列（ＮＬＳ）の１つ以上、精製タグの１つ以上、切断配列の１つ以上、ＦＬＡＧもしくは３ＸＦＬＡＧの１つ以上、及び／またはマーカー１つ以上が挙げられる。複数のタイプのアミノ酸配列、例えば複数のＮＬＳが使用される場合、各アミノ酸配列は他のものと同じであっても異なっていてもよく、それぞれを元のヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加することができる。特定の実施形態では、追加のアミノ酸配列の順序及び／またはタイプは、特定の順序及び／またはタイプであり得る。順序は、Ｎ末端からＣ末端に読む。
ＮＬＳ
特定の実施形態では、追加のアミノ酸配列は、元のヌクレアーゼポリペプチドに付加され得る、１つ以上の核局在配列（ＮＬＳ）、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＮＬＳを含むことができる。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、元のヌクレアーゼポリペプチドのアミノ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上のＮＬＳ、元のヌクレアーゼポリペプチドのカルボキシ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上のＮＬＳ、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端に１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端に１つ以上のＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、アミノ末端に１～３個、場合によっては１～２個、例えば１個のＮＬＳを含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、カルボキシ末端に３～５個、場合によっては３～４個、例えば３個のＮＬＳを含む。複数のＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが複数のコピー中に存在し、及び／または２つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、それぞれが他とは独立して選択され得る。特定の実施形態では、４つのＮＬＳが元のヌクレアーゼポリペプチドに付加される。これらの実施形態のあるものでは、１つのＮＬＳがＮ末端にあり、３つがＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書で提供される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳを含み、特定の実施形態では、ｍｙｃ関連ＮＬＳは、元のヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端にある。特定の実施形態では、本明細書で提供される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのヌクレオプラスミンＮＬＳを含み、特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳはＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書で提供される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つ、または少なくとも２つのＳＶ４０ＮＬＳ配列を含み、特定の実施形態では、ＳＶ４０ＮＬＳはＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書で提供される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、Ｎ末端に１つのＮＬＳ及びＣ末端に３つのＮＬＳを含み、例えば、Ｎ末端に１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ及び２つのＳＶ４０ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、Ｎ末端に配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、及び配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳを含む。一般に、１つ以上のＮＬＳは、元のヌクレアーゼポリペプチドと、そのＮ側、もしくはＣ側、またはその両方で隣接する。例えば、４つのＮＬＳを有する実施形態では、順序は、ＮＬＳ－元のヌクレアーゼポリペプチド－ＮＬＳ－ＮＬＳ－ＮＬＳであり得る。したがって、他のタグの一部または全部が、例えば切断配列における切断によって除去される場合、操作されたヌクレアーゼポリペプチドの残りの部分はＮＬＳを保持する。
ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２６５）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２６６）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２６７）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２６８）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２６９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２７０）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２７１）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２７２）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２７３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２７４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２７５）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２７６）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２７７）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２７８）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１７７または２２９のうち１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％の同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチド、ならびに、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳを含み、特定の実施形態では、ｍｙｃ関連ＮＬＳはＮ末端にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのヌクレオプラスミンＮＬＳを含むことができ、特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳはＣ末端にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、例えば１つ、特定の実施形態では２つのＳＶ４０ＮＬＳ配列を含むことができ、特定の実施形態では、ＳＶ４０ＮＬＳはＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１７７または２２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性の、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に１つのＮＬＳ及びＣ末端に３つのＮＬＳ、例えば、Ｎ末端に上記で説明した１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に上記で説明した１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ及び上記で説明した２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１７７または２２９のいずれか１つと少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性の、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、及び配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一の元のヌクレアーゼポリペプチドと、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳと、を含み、特定の実施形態では、ｍｙｃ関連ＮＬＳはＮ－にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのヌクレオプラスミンＮＬＳを含むことができ、特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳはＣ末端にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、例えば１つ、特定の実施形態では２つのＳＶ４０ＮＬＳ配列を含むことができ、特定の実施形態では、ＳＶ４０ＮＬＳはＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に１つのＮＬＳ、及びＣ末端に３つのＮＬＳ、例えば、Ｎ末端に上記で説明した１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に上記で説明した１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ及び上記で説明した２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、及び配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性の元のヌクレアーゼポリペプチドと、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳと、を含み、特定の実施形態では、ｍｙｃ関連ＮＬＳはＮ末端にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのヌクレオプラスミンＮＬＳを含むことができ、特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳはＣ末端にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、例えば１つ、特定の実施形態では２つのＳＶ４０ＮＬＳ配列を含むことができ、特定の実施形態では、ＳＶ４０ＮＬＳはＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性の、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に１つのＮＬＳ及びＣ末端に３つのＮＬＳ、例えば、Ｎ末端に上記で説明した１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に上記で説明した１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ及び上記で説明した２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびに、Ｃ末端に、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、及び配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一の元のヌクレアーゼポリペプチドと、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳと、を含み、特定の実施形態では、ｍｙｃ関連ＮＬＳはＮ－にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのヌクレオプラスミンＮＬＳを含むことができ、特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳはＣ末端にある。追加的にまたは代替的に、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、例えば１つ、特定の実施形態では２つのＳＶ４０ＮＬＳ配列を含むことができ、特定の実施形態では、ＳＶ４０ＮＬＳはＣ末端にある。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性の、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に１つのＮＬＳ及びＣ末端に３つのＮＬＳ、例えば、Ｎ末端に上記で説明した１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびにＣ末端に上記で説明した１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ及び上記で説明した２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端に、配列ＰＡＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２７９）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのｍｙｃ関連ＮＬＳ、ならびに、Ｃ末端に、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、及び配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。
ｂ）精製タグ
本明細書に記載の１つ以上のＮＬＳ、及び／または他の追加のアミノ酸配列を含むことに加えて、またはその代わりに、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、元のヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にあってもよい１つ以上の精製タグを含むことができる。任意の好適な精製タグ（複数可）を使用することができる。例示的な精製タグとしては、Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓタグ（配列番号３３２）またはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）などの、そのＮ末端にｇｌｙを含むことができるポリ－ｈｉｓタグが挙げられる。更なる例示的な精製タグとしては、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ－ｍｙｃ、Ｔ７、及びＧｌｕ－Ｇｌｕ；マルトース結合タンパク質（ｍｂｐ）；Ｎ末端グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）が挙げられる。特定の実施形態では、場合によっては、上記の１つ以上のＮＬＳに加えて、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、例えばＮ末端にＧｌｙ－６ｘｈｉｓタグを含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、例えばＮ末端にＧｌｙ－８ｘｈｉｓタグを含む。一般に、Ｇｌｙ－ポリｈｉｓタグが使用される場合、それは付加された最もＮ末端の配列である。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、ポリ－ｈｉｓタグ、またはＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグもしくはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグなどのｇｌｙ－ポリｈｉｓタグを、例えばＮ末端に含むことができる。これらのＧｌｙ－６ｘＨｉｓまたはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグは、以下を含むいくつかの理由で適用される：１）６ｘＨｉｓまたは８ｘＨｉｓタグは、タンパク質精製において、精製のためのクロマトグラフィーカラムへの結合を実現するために使用することができる、及び２）Ｎ末端グリシンが、更に、高度なタンパク質操作を可能にする部位特異的な化学修飾を実現する。更に、Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓまたはＧｌｙ－８ｘＨｉｓは、必要に応じて、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼによる消化によって簡単に除去できるように設計されている。Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓ ６ｘＨｉｓまたはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグは、Ｎ末端に配置することができる。Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓタグについては、その開示が本明細書に組み込まれるＭａｒｔｏｓ－Ｍａｌｄｏｎａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１８）１７；９（１）：３３０７でより詳細に説明されている。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１７７または２２９のいずれか１つのアミノ酸配列と、または配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一の元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端にＧｌｙ－ポリ－Ｈｉｓタグ、例えばＧｌｙ－６ｘ Ｈｉｓタグ（配列番号３３２）またはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）と、を含む。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグ（配列番号３３２）である。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）である。加えて、または代わりに、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、ＦＬＡＧ（配列番号：２８１）または３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）を含むことができる。特定の実施形態では、タグはアミノ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。ｇｌｙ－ポリｈｉｓタグも存在する場合、３ＸＦＬＡＧはｇｌｙ－ポリｈｉｓタグの内部にあり得る。特定の実施形態では、タグは、カルボキシ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一の元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端にＧｌｙ－ポリ－Ｈｉｓタグ、例えばＧｌｙ－６ｘ Ｈｉｓタグ（配列番号３３２）またはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）と、を含む。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグ（配列番号３３２）である。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）である。加えて、または代わりに、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、ＦＬＡＧ（配列番号：２８１）または３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）を含むことができる。特定の実施形態では、タグはアミノ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。ｇｌｙ－ポリｈｉｓタグも存在する場合、３ＸＦＬＡＧ はｇｌｙ－ポリｈｉｓタグの内部にあり得る。特定の実施形態では、タグは、カルボキシ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一の元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端にＧｌｙ－ポリ－Ｈｉｓタグ、例えばＧｌｙ－６ｘ Ｈｉｓタグ（配列番号３３２）またはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）と、を含む。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグ（配列番号３３２）である。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）である。加えて、または代わりに、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、ＦＬＡＧ（配列番号：２８１）または３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）を含むことができる。特定の実施形態では、タグはアミノ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。ｇｌｙ－ポリｈｉｓタグも存在する場合、３ＸＦＬＡＧはｇｌｙ－ポリｈｉｓタグの内部にあり得る。特定の実施形態では、タグは、カルボキシ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一の元のヌクレアーゼポリペプチドと、Ｎ末端にＧｌｙ－ポリ－Ｈｉｓタグ、例えばＧｌｙ－６ｘ Ｈｉｓタグ（配列番号３３２）またはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）と、を含む。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグ（配列番号３３２）である。特定の実施形態では、タグはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグ（配列番号３３３）である。
ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧ
加えて、または代わりに、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、ＦＬＡＧ（配列番号：２８１）または３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）を含むことができる。特定の実施形態では、タグはアミノ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。ｇｌｙ－ポリｈｉｓタグも存在する場合、３ＸＦＬＡＧはｇｌｙ－ポリｈｉｓタグの内部にあり得る。特定の実施形態では、タグは、カルボキシ末端の３ＸＦＬＡＧ（配列番号：２８０）である。
切断配列
本明細書に記載される１つ以上のＮＬＳ、精製タグ、及び／またはその他の追加のアミノ酸配列を含むことに加えて、またはその代わりに、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端にあってもよい１つ以上の切断配列を含むことができる。任意の好適な切断配列を使用することができ、複数の切断配列が使用される場合、それらは同一であっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、切断配列は、本明細書で「ＴＥＶ配列」（配列番号３３１）と称される、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ切断配列を含む。ＴＥＶ配列は、アミノ末端にあってもよい。一般に、切断配列、例えばＴＥＶ配列は、切断配列での切断が、他の追加のアミノ酸配列、特に元のヌクレアーゼポリペプチドに付加された任意のＮＬＳを無傷のまま残すように配置される。
組み合わせ
元のヌクレアーゼポリペプチドに付加された２つ以上の追加のアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチドが本明細書に開示される。上記に開示されたこうした操作されたヌクレアーゼポリヌクレオチドに加えて、追加の操作されたヌクレアーゼポリヌクレオチドには、以下が含まれ得る：
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドまたはその活性部分は、
（ｉ）精製タグ；
（ｉｉ）切断部位；
（ｉｉｉ）ＮＬＳ；
（ｉｖ）元のヌクレアーゼポリペプチド；及び
（ｖ）３つのＮＬＳ
を含む成分を含む。
特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、Ｃ末端に（ｖｉ）３ＸＦＬＡＧを更に含む。特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｎ－末端にｖ（３ｘ）ＦＬＡＧを更に含む。特定の実施形態では、Ｎ末端の３ＸＦＬＡＧは、精製タグと切断部位との間にある。特定の実施形態では、成分は順番に、すなわち、ヌクレアーゼポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端の順番にある。特定の実施形態では、精製タグは、Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓまたはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグなどのＧｌｙ－ポリｈｉｓタグを含む。特定の実施形態では、精製タグはＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグを含む。特定の実施形態では、切断部位はＴＥＶを含む。特定の実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳは、ｍｙｃ関連ＮＬＳ、例えばアミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２６５）もしくはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２６６）もしくはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つのアミノ酸配列と、または配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２４のペプチドモチーフを含まない。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、または２２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４９、１５１、１７５、または１７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４、１５３、または２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、３つのＮ末端ＮＬＳが、Ｃ末端に、１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、例えば配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヌクレオプラスミンＮＬＳと、２つのＳＶ４０ＮＬＳ、例えば配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２５７のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２６０のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２６１のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリヌクレオチドは、３ＸＦＬＡＧ（配列番号２８０）を更に含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２５８のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼポリペプチドまたはその活性部分は、
（ｉ）精製タグ；
（ｉｉ）切断部位；
（ｉｉｉ）ＮＬＳ；
（ｉｖ）元のヌクレアーゼポリペプチド；
（ｖ）３つのＮＬＳ
を含む。
特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、Ｃ末端に（ｖｉ）３ＸＦＬＡＧを更に含む。特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｎ－末端に（ｖｉ）（３ｘ）ＦＬＡＧを更に含む。特定の実施形態では、Ｎ末端の３ＸＦＬＡＧは、精製タグと切断部位との間にある。特定の実施形態では、成分は順番に、すなわち、ヌクレアーゼポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端の順番にある。特定の実施形態では、精製タグは、Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓまたはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグなどのＧｌｙ－ポリｈｉｓタグを含む。特定の実施形態では、精製タグはＧｌｙ－８ｘＨｉｓタグを含む。特定の実施形態では、切断部位はＴＥＶを含む。特定の実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳは、ｍｙｃ関連ＮＬＳ、例えばアミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２６５）もしくはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２６６）もしくはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つのアミノ酸配列と、または配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２４のペプチドモチーフを含まない。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、または２２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４９、１５１、１７５、または１７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４、１５３、または２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、元のヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、３つのＮ末端ＮＬＳが、Ｃ末端に、１つのヌクレオプラスミンＮＬＳ、例えば配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２６４）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヌクレオプラスミンＮＬＳと、２つのＳＶ４０ＮＬＳ、例えば配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６３）またはこれと少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む２つのＳＶ４０ＮＬＳと、を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２５９のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼポリペプチドは、配列番号２６２のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一性の、例えば少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８５％、及び特定の実施形態では少なくとも９５％同一性、または更には１００％同一性のアミノ酸配列を含む。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされ得る。１またはそれ以上のポリヌクレオチドは天然のものであり得る。特定の実施形態では、１またはそれ以上のポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドを含む。操作されたポリヌクレオチドは、非天然のポリヌクレオチド、例えば、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、コードされたアミノ酸配列が、天然ヌクレアーゼポリペプチド中の１つ以上の置換、ヌクレアーゼポリペプチドのＣ及び／またはＮ末端への１つ以上のアミノ酸配列の付加のいずれか、またはその両方によって天然配列から変更されている、ポリヌクレオチドである。操作されたポリヌクレオチドは、追加的または代替的に、コドン最適化によって産生され得、例えば、一方の種に天然のポリヌクレオチドが、もう一方の種における転写及び／または翻訳に最適化され、ポリヌクレオチド中の少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のコドンが、２つの間で異なる。本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチドは、原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化することができる。本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチドは、単細胞性真核生物、例えばＳ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅなどの酵母菌に対してコドン最適化することができる。本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼなどの核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチドは、多細胞性真核生物、例えばヒトに対してコドン最適化することができる。
本明細書で提供される核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書で開示される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは天然である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされたヌクレアーゼポリペプチドが操作されたヌクレアーゼポリペプチドを含むか、ポリヌクレオチドがコドン最適化されたかのいずれか、またはその両方のために、操作されている。
特定の実施形態では、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上、または配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードする、１つ以上のポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、コードされたポリペプチドは、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含まない。したがって、特定の実施形態では、配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の１つ以上、または配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のいずれか１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含まないコードされたポリペプチドは、ラジカルアミノ酸置換であり、及び／または２０を超えるスニース指数値を有する、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上、または、配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上、または、配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、配列番号１４４に対応するアミノ酸配列、または、配列番号１４４に対応するアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、配列番号１５３に対応するアミノ酸配列、または、配列番号１５３に対応するアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、配列番号２２９に対応するアミノ酸配列、または、配列番号２２９に対応するアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。後者の実施形態のうち特定のものでは、配列番号２５７～２６２に対応するアミノ酸配列、または、配列番号２５７～２６２に対応するアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。上記の実施形態のうち特定のものでは、ポリヌクレオチドは操作されたポリヌクレオチドである。
特定の実施形態では、配列番号１～１４２及び２２５～２２８のいずれか１つに対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチド、または配列番号１～１４２及び２２５～２２８のいずれか１つに対応する配列を含むポリヌクレオチド配列のうち１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列が本明細書で提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはヒトのコドン最適化のうちの１つに対してコドン最適化することができる。上記の実施形態のうち特定のものでは、ポリヌクレオチドは操作されたポリヌクレオチドである。後者の実施形態のうち特定のものでは、ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはヒトに対してコドン最適化されている。
特定の実施形態では、配列番号１、５、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、及び２２５のうちいずれか１つに対応する配列、または配列番号１、５、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、及び２２５のうちいずれか１つに対応するポリヌクレオチド配列のうち１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドが本明細書で提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはヒトのコドン最適化のうちの１つに対してコドン最適化することができる。特定の実施形態では、配列番号２３０～２５６、及び３３０のいずれか１つに対応するポリヌクレオチド、または配列番号２３０～２５６、及び３３０のいずれか１つに対応するポリヌクレオチド配列のうち１つ以上に少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列が提供される。上記の実施形態のうち特定のものでは、ポリヌクレオチドは操作されたポリヌクレオチドである。後者の実施形態のうち特定のものでは、ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはヒトに対してコドン最適化されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、任意のｇＲＮＡであり得る。その他の実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、配列番号１７８～１８８のいずれか１つに対して少なくとも５０％の核酸同一性の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、配列番号１７８～１８８のいずれか１つと約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、または１００％の核酸同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、配列番号１７８～１８８のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超核酸同一性の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチド（ｇＲＮＡ）は、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む断片にスプリットすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、配列番号１８８に対して少なくとも５０％核酸同一性の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、配列番号１８８と約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、または１００％核酸同一性の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、配列番号１８８と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超核酸同一性の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１～１４２または２２５によって表される任意の核酸と少なくとも５０％の核酸同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１～１４２または２２５のいずれか１つと約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％超、または１００％ポリヌクレオチド同一性の核酸配列を含む。
場合によっては、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸配列からコードされる。こうした核酸は、所望の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。好適な宿主細胞としては、非限定的な例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ、及びＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓなどの原核細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、植物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、両生類細胞、魚細胞、またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞が挙げられ得る。
核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結することができる。こうした核酸配列は、線状または環状であり得る。核酸配列は、複製起点、選択マーカーまたは選択可能マーカー、ターミネータ、標的化可能なヌクレアーゼシステムのその他の成分、例えばガイド核酸、または本明細書に開示される編集もしくはレコーダーカセットなどの追加の要素を含む、より大きな線状または環状の核酸配列上に包含され得る。いくつかの態様では、核酸配列は、少なくとも１つのグリシン、少なくとも１つの６Ｘヒスチジンタグ、及び／または少なくとも１つの３Ｘ核局在化シグナルタグを含み得る。下記でより詳細に説明するように、より大きな核酸配列は組換え発現ベクターであり得る。
一般に、ガイドポリヌクレオチドは、適合性の核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することができ、また、標的配列とハイブリダイズすることよってヌクレアーゼを標的配列に向かわせることができる。ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成することができる対象の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドと適合性のある核酸誘導型ヌクレアーゼと称され得る。更に、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することが可能なガイドポリヌクレオチドは、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性のあるガイドポリヌクレオチドまたはガイド核酸と称され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（ｇＲＮＡ）は、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む断片にスプリットすることができる。ｇＲＮＡの例としては、表１に示すｇＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2023543351000001
ガイドポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むことができる。ガイドポリヌクレオチドがＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイドポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるプラスミド、線状コンストラクト、または編集カセットなどのポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によってコードされ得る。
ガイドポリヌクレオチドはガイド配列を含むことができる。ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列への複合核酸誘導型ヌクレアーゼの配列特異的結合を誘導するために、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有するポリヌクレオチド配列である。ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれ以上、または約５０％超、６０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９７．５超％、９９％超、もしくはそれ以上である。配列を整列させるための任意の好適なアルゴリズムを使用して、最適な整列を決定することができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、もしくはそれ以上、または約５超、１０超、１１超、１２超、１３超、１４超、１５超、１６超、１７超、１８超、１９超、２０超、２１超、２２超、２３超、２４超、２５超、２６超、２７超、２８超、２９超、３０超、３５超、４０超、４５超、５０超、７５超、もしくはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。その他の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド長未満であり得る。好ましくは、ガイド配列は１０～３０ヌクレオチド長である。ガイド配列は、１５～２０ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１５ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１６ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１７ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１８ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、１９ヌクレオチド長であり得る。ガイド配列は、２０ヌクレオチド長であり得る。
ガイドポリヌクレオチドは足場配列を含むことができる。一般に、「足場配列」は、標的化可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するのに十分な配列を有する任意の配列を含むことができ、標的化可能なヌクレアーゼ複合体としては、核酸誘導型ヌクレアーゼが挙げられるが、これに限定されず、ガイドポリヌクレオチドとしては、足場配列及びガイド配列が挙げられ得る。標的化可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進する足場配列内の十分な配列は、二次構造の形成に関与する１つまたは２つの配列領域などの足場配列内の２つの配列領域の長さに沿ってある程度の相補性を含み得る。場合によっては、１つまたは２つの配列領域は、同じポリヌクレオチド上に含まれるか、または同じポリヌクレオチド上でコードされる。場合によっては、１つまたは２つの配列領域は、別のポリヌクレオチド上に含まれるか、または別のポリヌクレオチド上でコードされる。最適な整列は、任意の好適な整列アルゴリズムによって決定することができ、１つまたは２つの配列領域のいずれかの内の自己相補性などの二次構造を更に説明することができる。いくつかの実施形態では、２つのうちの短い方の長さに沿った１つまたは２つの配列領域間の相補性の程度は、最適に整列された場合、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはこれ以上、または約２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９７．５％超、９９％超、もしくはこれ以上である。いくつかの実施形態では、２つの配列領域のうち少なくとも１つは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチド長、または約５超、６超、７超、８超、９超、１０超、１１超、１２超、１３超、１４超、１５超、１６超、１７超、１８超、１９超、２０超、２５超、３０超、４０超、５０超、もしくはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
主題のガイドポリヌクレオチドの足場配列は、二次構造を含み得る。二次構造はシュードノット領域を含むことができる。場合によっては、核酸誘導型ヌクレアーゼに対するガイドポリヌクレオチドの結合動態は、足場配列内の二次構造によって部分的に決定される。場合によっては、核酸誘導型ヌクレアーゼに対するガイドポリヌクレオチドの結合動態は、足場配列を含む核酸配列によって部分的に決定される。いくつかの態様では、本発明は、保存された足場配列を含み得るガイドポリヌクレオチドに結合するヌクレアーゼを提供する。例えば、本開示で使用するための核酸誘導型ヌクレアーゼは、保存されたシュードノット領域に結合することができる。したがって、足場配列は二次構造を含むことができる。二次構造はシュードノット領域を含むことができる。場合によっては、核酸誘導型ヌクレアーゼに対するガイドポリヌクレオチドの結合動態は、足場配列内の二次構造によって部分的に決定される。場合によっては、核酸誘導型ヌクレアーゼに対するガイドポリヌクレオチドの結合動態は、足場配列を含む核酸配列によって部分的に決定される。
特定の方法では、適合性のガイド核酸の適合性の足場配列は、天然の核酸誘導型ヌクレアーゼ遺伝子座に隣接する配列をスキャンすることによって見出すことができる。例えば、天然の核酸誘導型ヌクレアーゼは、対応する適合性のガイド核酸または足場配列に近接してゲノム上にコード化することができる。例えば、実施例３を参照されたい。
ＡＲＴ１～ＡＲＴ３５のそれぞれについて保存されたＤＮＡ配列を以下の表３に提供する。これらの配列は、それぞれのヌクレアーゼのｇＲＮＡの保存された配列をコードし、ＲＮＡ配列はこれらの配列から作成できる（表３の保存されたＲＮＡ配列）。更に、ＲＮＡ配列の一部またはすべてを更なるプロセシングに供して、いずれかの末端から１つ以上のヌクレオチドを除去することもできる。各特定のＡＲＴヌクレアーゼで、スペーサーの長さは特定の数のＮＴであり、足場配列の長さは特定の数のＮＴである。したがって、特定のヌクレアーゼのｇＲＮＡ（プロセシング前）の特定の実施形態では、これらの長さは表３に示される通りであり、特定のＡＲＴヌクレアーゼに対するｇＲＮＡ（最終ｇＲＮＡを生成するための潜在的な追加プロセシング前）の全長は、２つの合計である。本明細書における様々な実施形態の議論において、ＡＲＴヌクレアーゼ及び保存配列（またはその一部、以下を参照）を含むｇＲＮＡは、本明細書に開示される特定のＡＲＴヌクレアーゼ、及びそれに対応する特定のｇＲＮＡ、またはその一部を指すことが理解される。
したがって、更に、各ＡＲＴヌクレアーゼでは、保存されたＲＮＡ配列は、ＲＮＡ配列の一部、例えば、保存されたＲＮＡの短縮バージョンであるＲＮＡ配列、例えば、５’及び／または３’末端のいずれかまたは両方で１つ以上のヌクレオチドによって短縮された配列など、を含み得る。理論に束縛されるものではないが、これらの部分は、少なくとも場合によっては、例えば、編集後の最終ｇＲＮＡを表すＲＮＡ配列、及び／または特定のＡＲＴヌクレアーゼ共に使用するための大変のまたは全てのｇＲＮＡに存在する高度に保存された配列に対応し得るものと考えられる。後者の場合、これらは、例えば、最終ｇＲＮＡで重要な二次構造を産生するために必要なＲＮＡ配列である場合がある。特定のＡＲＴヌクレアーゼのｇＲＮＡは、保存された部分、または高度に保存された部分、例えば、ｇＲＮＡの二次構造、例えばシュードノットのヌクレオチド配列を含む高度に保存された部分を含むことができる。
このため、特定の実施形態では、保存されたｇＲＮＡ、すなわち特定のＡＲＴヌクレアーゼの保存された足場部分などの保存された部分、またはその一部を含むｇＲＮＡが、このＡＲＴヌクレアーゼと共に使用される。特定の実施形態では、保存されたｇＲＮＡは、配列番号２９１～３２５の配列のうちいずれか１つ、またはその一部を含む。その部分とは、５’側、３’側のいずれか、またはその両方で１つ以上のヌクレオチドが除去されている、保存されたＲＮＡ配列内の連続した配列である（本文脈では、「除去された」とは、単に、それが産生された方法に関係なく、保存されたＲＮＡのその部分に存在しないことを意味する）。この部分は、任意の好適な部分であってもよく、特定の実施形態では、この部分は、ｇＲＮＡの５’末端から除去された０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドを含み、特定の実施形態では、この部分は、ｇＲＮＡの３’末端から除去された０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドを含む（少なくとも１つのヌクレオチドが除去されている限り）。特定の実施形態では、高度に保存された部分、例えば、ｇＲＮＡの二次構造、例えば、シュードノットを含む二次構造のヌクレオチド配列を含む高度に保存された部分が用いられる。
特定の実施形態では、特定のＡＲＴヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを含むスプリットｇＲＮＡなどのスプリットｇＲＮＡである。特定の実施形態では、特定のＡＲＴヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを含む単一ｇＲＮＡなどの単一ｇＲＮＡである。好適なｇＮＡ、例えばｇＲＮＡは、任意の好適な方法、例えば天然設定内で、宿主細胞内で、合成（修飾ヌクレオチドを有するｇＲＮＡ）、または任意の他の好適な方法によって産生され得る。こうした方法は当技術分野で周知されている。特定の実施形態では、特定のＡＲＴヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡは、合成によって産生される。特定の実施形態では、特定のＡＲＴヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡは、合成によって産生され、化学修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドを含む合成ｇＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号でより詳細に説明されている。特定の実施形態では、特定の核酸誘導型ヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡは、上記の配列番号２９１～３２５のうち１つに由来する保存されたｇＲＮＡまたはその部分などの保存されたｇＲＮＡまたはその部分を含む。特定の実施形態では、保存されたｇＲＮＡは、高度に保存された部分、例えば、シュードノットなどの二次構造を形成する部分を含む。本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドであり得ることが理解される。例えば、記載されている配列番号２９１～３２５は、文脈に応じて、天然のリボヌクレオチドを含む配列、または１つ以上の化学修飾されたリボヌクレオチドを含む配列のいずれかであると解釈されるべきである。
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Figure 2023543351000003
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ガイドポリヌクレオチド、または「ｇＲＮＡ」は、配列番号１７８～１８８によって表される配列のうちいずれか１つ、または他の好適なｇＲＮＡによって表すことができる。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチド（ｇＲＮＡ）は、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む断片にスプリットすることができる。いくつかの実施形態では、配列番号１７８～２２３のうちいずれか１つによって表される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有することによって表されるｇＲＮＡは、合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含むことができる。
本明細書で使用するとき、「ガイド核酸」または「ガイドポリヌクレオチド」は、１つ以上のポリヌクレオチドを指すことができ、１）標的配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び２）本明細書に記載される核酸誘導型ヌクレアーゼと相互作用または複合体形成できる足場配列を含むことができる。ガイド核酸は、１つ以上の核酸として提供することができる。特定の実施形態では、ガイド配列及び足場配列は、単一のポリヌクレオチドとして提供される。その他の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１つのアンプリコン標的化断片を含み得る。
ガイド核酸は、２つの要素が標的配列を切断できる機能的な標的化可能なヌクレアーゼ複合体を形成できる場合、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性があり得る。特定の方法では、適合性のガイド核酸の適合性の足場配列は、天然の核酸誘導型ヌクレアーゼ遺伝子座に隣接する配列をスキャンすることによって見出すことができる。例えば、天然の核酸誘導型ヌクレアーゼは、対応する適合性のガイド核酸または足場配列に近接してゲノム上にコード化することができる。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの内因性宿主内に見出されないガイド核酸と適合することができる。こうした直交ガイド核酸は、経験的試験によって決定することができる。直交ガイド核酸は、異なる細菌種に由来するか、合成されているか、さもなければ非天然となるように操作されている場合がある。
共通する核酸誘導型ヌクレアーゼと適合する直交ガイド核酸は、１つ以上の共通の特徴を含むことができる。共通の特徴には、シュードノット領域外の配列が含まれる場合がある。共通の特徴には、シュードノット領域が含まれる場合がある。共通の特徴には、一次配列または二次構造が含まれ得る。
ガイド核酸は、ガイド配列が標的配列に対して相補的であるようにガイド配列を変更し、それによってガイド配列と標的配列との間のハイブリダイゼーションを可能とすることにより、所望の標的配列を標的化するように操作することができる。操作されたガイド配列を有するガイド核酸は、操作されたガイド核酸と称することができる。操作されたガイド核酸は、多くの場合非天然であり、自然界で発見されない。
操作されたガイド核酸は、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ＳＴＡＲ）システムを使用して形成することができる。ＳＴＡＲは、Ｃａｓ１２ａタンパク質と組み合わせられると、特定のゲノム遺伝子座を標的化する少なくとも１つのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。ＳＴＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）の自然な特性を利用しており、ＣＲＩＳＰＲシステムはウイルス及びプラスミドＤＮＡの侵入に対する免疫システムのように機能する。侵入したウイルスからの短ＤＮＡ配列（スペーサー）は、細菌ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれ、以前の感染の「記憶」として機能する。再感染により、相補的な成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がトリガーされ、一致するウイルス配列が検出される。ｃｒＲＮＡとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が共にＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼを誘導して、「外来」ＤＮＡ配列の二本鎖切断を切断させる。原核生物のＣＲＩＳＰＲの「免疫システム」は、単純、容易、かつ迅速に実装可能なＲＮＡ誘導型哺乳動物ゲノム編集ツールとして機能するように操作されている。ＳＴＡＲ（合成ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む）は、Ｃａｓ１２ａタンパク質と組み合わせられると、特定のゲノム遺伝子座を標的化するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成できる。ＲＮＡ（ＳＴＡＲ）システムを用いて形成された操作されたガイド核酸は、スプリットｇＲＮＡをもたらし得る。本明細書に開示される使用のためのスプリットｇＲＮＡの例は、配列番号１８８によって表される配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、本明細書に開示される少なくとも１つのヌクレアーゼを含み得る。いくつかの態様では、ＲＮＰ複合体は、配列番号１４３～１７７または２２９に対して約７５％、約８５％、約９５％、約９９％、または同一性のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのヌクレアーゼを含むことができる。いくつかの例では、本明細書に開示されるヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体は、少なくとも１つのＳＴＡＲ ｇＲＮＡを更に含むことができる。いくつかのその他の例では、本明細書に開示されるヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体は、少なくとも１つの非ＳＴＡＲ ｇＲＮＡを更に含むことができる。いくつかのその他の例では、本明細書に開示されるヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを更に含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＲＮＰ複合体に含まれるポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長を上回る場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＰ複合体に含まれるポリヌクレオチドは、約５０、約１５０、約５００、約１０００ヌクレオチド、または１０００ヌクレオチド長を上回る場合がある。いくつかの実施形態では、全体的な編集効率に影響を与えるために、複数のヌクレアーゼをＲＮＰ複合体に付加することができる。その他の実施形態では、１回のトランスフェクションで２つ以上の部位の多重編集を可能にして効率を向上させるために、２つ以上のｇＲＮＡをＲＮＰ複合体に付加することができる。その他の実施形態では、特定の所望される修復結果に基づいて１つ以上の部位での多重編集を可能にするために、２つ以上のＤＮＡテンプレートをＲＮＰに付加することができる。
ヌクレアーゼシステム
本明細書に開示される他の実施形態は、標的化可能なヌクレアーゼシステムである。特定の実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼシステムは、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合性のガイド核酸（本明細書では互換的に「ガイドポリヌクレオチド」及び「ｇＲＮＡ」とも称される）を含むことができる。標的化可能なヌクレアーゼシステムは、核酸誘導型ヌクレアーゼまたは核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。標的化可能なヌクレアーゼシステムは、ガイド核酸またはガイド核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
一般に、本明細書に開示される標的化可能なヌクレアーゼシステムは、標的配列の部位で標的化可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進する要素を特徴とすることができ、ここで標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸を含む。
ガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼと共に、ガイド核酸のガイド配列によって決定されるように、標的ポリヌクレオチド内の標的配列に結合することができる標的化可能なヌクレアーゼ複合体を形成する。
一般に、二本鎖切断を生成するには、ほとんどの場合、標的化可能なヌクレアーゼ複合体がガイド核酸によって決定されるように標的配列に結合し、ヌクレアーゼは、標的配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識する必要がある。
標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つの配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び適合性のガイド核酸を含んでもよい。標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１４３～１５１のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び適合性のガイド核酸を含んでもよい。標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１４３～１７７のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び配列番号１７８～１８８によって表される適合性のガイド核酸を含んでもよい。標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１～１４２のいずれか１つによって表されるヌクレアーゼをコードする核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び適合性ｇＲＮＡまたは配列番号１７８～１８８のいずれか１つによって表されるｇＲＮＡを含んでもよい。特定の実施形態では、ガイド核酸は、選択された核酸誘導型ヌクレアーゼと適合する足場配列を含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ガイド配列は、任意の所望の標的配列に相補的であるように操作され得る。選択されたガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作され得る。
標的化可能なヌクレアーゼ複合体の標的配列は、原核細胞もしくは真核細胞に対して、またはインビトロで内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。本明細書では、標的配列はＰＡＭ、すなわち標的化可能なヌクレアーゼ複合体によって認識される短配列と関連しているはずと考えられる。ＰＡＭの正確な配列と長さの要件は、使用される核酸誘導型ヌクレアーゼによって異なるが、ＰＡＭは標的配列に隣接する２～５塩基対の配列であり得る。ＰＡＭ配列の例は、以下の実施例の項に記載されており、当業者であれは、所与の核酸誘導型ヌクレアーゼと共に使用するための更なるＰＡＭ配列を同定することができる。更に、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの操作により、ＰＡＭ特異性のプログラミングが可能になり、標的部位認識の忠実度が向上し、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム操作プラットフォームの転用性が向上し得る。核酸誘導型ヌクレアーゼは、例えば、その開示全体が本明細書に組み込まれるＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ．２３；５２３（７５６１）：４８１－５に記載されるように、そのＰＡＭ特異性を変更するように操作されてもよい。
ＰＡＭ部位は、標的配列に近接するヌクレオチド配列である。ほとんどの場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、適切なＰＡＭが存在する場合にのみ標的配列を切断できる。ＰＡＭは、核酸誘導型ヌクレアーゼ特異的であり、２つの異なる核酸誘導型ヌクレアーゼ間で異なり得る。ＰＡＭは、標的配列の５’または３’であり得る。ＰＡＭは、標的配列の上流または下流にあり得る。ＰＡＭは、ヌクレオチド長が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であり得る。多くの場合、ＰＡＭのヌクレオチド長は２～６である。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、ＰＡＭは別個のオリゴヌクレオチド上に提供され得る。こうした場合、標的配列と同じポリヌクレオチド上に隣接するＰＡＭが存在しないため、オリゴヌクレオチド上にＰＡＭを提供することにより、さもなければ切断できない標的配列の切断が可能になる。
標的化可能なヌクレアーゼシステムの成分をコードするポリヌクレオチド配列は、１つ以上のベクターを含むことができる。一般に、本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、それが連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことができる。ベクターとしては、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖である核酸分子；１つ以上の自由端を含む、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；及び当技術分野で既知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは標準の分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡ断片が挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプは、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がベクター内に存在し、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージングされている、ウイルスベクターである。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結される、発現に用いられる宿主細胞を基準に選択され得る１つ以上の調節要素を含むことを意味し得る。
いくつかの実施形態では、調節要素は、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ以上の成分の発現を駆動するために、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ以上の要素に作動可能に連結することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節要素を含むことができる。核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞または真核細胞などの標的細胞における発現のためにコドン最適化され得る。真核細胞は、酵母、菌類、藻類、植物、動物、またはヒトの細胞であり得る。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物などの生物に由来するものであり得る。
一般に、コドン最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つ以上のコドンを、その宿主細胞遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を修飾するプロセスを指すことができる。様々な種が、特定のアミノ酸のコドンに対して特定のバイアスを示す。本明細書で企図されるように、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用頻度表は、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐで入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」などで容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法で適合させることが可能である。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい．特定の実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上、もしくは配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列、または配列番号１４３～１７７及び２２９のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の１つ以上、もしくは配列番号１４４、１５３、及び２２９のいずれか（場合によっては配列番号１４４、場合によっては配列番号１５３、場合によっては配列番号２２９）のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のアミノ酸配列をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが提供され、ここで、ポリヌクレオチドはコドン最適化され、例えばＥ．ｃｏｌｉにコドン最適化され、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにコドン最適化され、またはヒトにコドン最適化される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。
特定の実施形態では、配列番号２～４、６～１０、１２～１４、１６～１８、２０～２２、２４～２６、２８～３０、３２～３４、３６～３８、４０～４２、４４～４６、４８～５０、５２～５４、５６～５８、６０～６２、６４～６６、６８～７０、７２～７４、７６～７８、８０～８２、８４～８６、８８～９０、９２～９４、９６～９８、１００～１０２、１０４～１０６、１０８～１１０、１１２～１１４、１１６～１１８、１２０～１２２、１２４～１２６、１２８～１３０、１３２～１３４、１３６～１３８、１４０～１４２、２２６～２２８、及び３３０のいずれかに対応する１つ以上のコドン最適化ポリヌクレオチド、または、配列番号２～４、６～１０、１２～１４、１６～１８、２０～２２、２４～２６、２８～３０、３２～３４、３６～３８、４０～４２、４４～４６、４８～５０、５２～５４、５６～５８、６０～６２、６４～６６、６８～７０、７２～７４、７６～７８、８０～８２、８４～８６、８８～９０、９２～９４、９６～９８、１００～１０２、１０４～１０６、１０８～１１０、１１２～１１４、１１６～１１８、１２０～１２２、１２４～１２６、１２８～１３０、１３２～１３４、１３６～１３８、１４０～１４２、２２６～２２８、及び３３０のいずれか１つに対応するポリヌクレオチド配列のうち１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。特定の実施形態では、配列番号２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、２２６、及び３３０のいずれか１つに対応する１つ以上のＥ．ｃｏｌｉコドン最適化ポリヌクレオチド、または、配列番号２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、２２６、及び３３０のいずれか１つに対応するポリヌクレオチド配列のうち１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。特定の実施形態では、配列番号３、７、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、及び２２７のうちいずれかに対応する１つ以上のＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅコドン最適化ポリヌクレオチド、または、配列番号３、７、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、及び２２７のうちいずれか１つに対応するポリヌクレオチド配列のうち１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。特定の実施形態では、配列番号４、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、及び２２８のうちいずれかに対応する１つ以上のヒトコドン最適化ポリヌクレオチド、または、配列番号４、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、及び２２８のうちいずれか１つに対応するポリヌクレオチド配列のうち１つ以上と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％同一のポリヌクレオチド配列が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、配列は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする。追加のアミノ酸配列のタイプ、組み合わせ、ＮまたはＣ末端、及び／または順序は、本明細書に開示されているもののいずれかであり得る。
核酸誘導型ヌクレアーゼ及び１つ以上のガイド核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして送達され得る。核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸の両方をＲＮＡ（未修飾または塩基もしくは骨格修飾を含む）分子として送達することを用いて、核酸誘導型ヌクレアーゼが細胞内に留まる時間を短縮することができる。これにより、標的細胞におけるオフターゲット切断活性のレベルが低下することができる。ｍＲＮＡとして核酸誘導型ヌクレアーゼを送達することは、タンパク質への翻訳に時間がかかるため、核酸誘導型ヌクレアーゼｍＲＮＡの送達の数時間後にガイド核酸を送達して、核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質との相互作用に利用可能なガイド核酸のレベルを最大化することが有利であり得る。他の場合では、核酸誘導型ヌクレアーゼｍＲＮＡ及びガイド核酸は同時に送達される。他の例では、ガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼｍＲＮＡから、例えば０．５、１、２、３、４時間またはそれ以上の後に、連続的に送達される。
ＲＮＡ形態の、またはＤＮＡ発現カセット上にコードされたガイド核酸は、ベクターまたは染色体上にコードされた核酸誘導型ヌクレアーゼを含むことができる宿主細胞に導入することができる。ガイド核酸は、カセット内で連続的または非連続的であり得る１つ以上のポリヌクレオチドとしてカセット内に提供され得る。特定の実施形態では、ガイド核酸は、単一の連続ポリヌクレオチドとしてカセット内に提供される。
様々な送達システムを使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）及びガイド核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主細胞内に導入することができる。これらの実施形態によれば、有用なシステムとしては、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、微粒子銃システム、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、ビリオン、人工ビリオン、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ナノワイヤー（Ｓｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２）、エキソソームが挙げられるが、これらに限定されない。分子トロイの木馬リポソーム（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１０；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７）を使用して、操作されたヌクレアーゼ及びガイドヌクレアーゼを血液脳関門全体に送達することができる。
いくつかの実施形態では、編集テンプレートも提供される。編集テンプレートは、本明細書に記載のベクターの構成要素であってもよく、別個のベクターに含まれてもよく、またはオリゴヌクレオチド、線状ポリヌクレオチド、もしくは合成ポリヌクレオチドなどの別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。場合によっては、編集テンプレートはガイド核酸と同じポリヌクレオチド上にある。いくつかの実施形態では、編集テンプレートは、本明細書に開示される複合体の一部として、核酸誘導型ヌクレアーゼによってニッキングまたは切断される標的配列内またはその近くなど、相同組換えにおけるテンプレートとして機能するように設計される。編集テンプレートポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、もしくはそれ以上、または約１０超、１５超、２０超、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、５００超、１０００超、もしくはそれ以上のヌクレオチド長など、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態では、編集テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含み得るポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列された場合、編集テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、もしくはそれ以上、または約１超、５超、１０超、１５超、２０超、２５超、３０超、３５超、４０超、もしくはそれ以上のヌクレオチド）と重複する場合がある。いくつかの実施形態では、編集テンプレート配列及び標的配列を含み得るポリヌクレオチドが最適に整列される場合、テンプレートポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド以内である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターもしくは線状ポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチド、その１つ以上の転写産物、及び／またはそれらから転写された１つ以上のタンパク質を宿主細胞に送達するための方法が提供される。いくつかの態様では、本発明は、こうした方法によって産生された細胞を更に提供し、生物は、こうした細胞を含み得るか、またはこうした細胞から産生され得る。いくつかの実施形態では、ガイド核酸と組み合わせた（及び場合により複合体を形成した）操作されたヌクレアーゼが細胞に送達される。
従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、または標的組織などの細胞に核酸を導入することができる。こうした方法は、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの成分をコードする核酸を、培養物または宿主生物中の細胞に投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写産物）、ネイキッド核酸、及びリポソームなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系としては、細胞に送達された後にエピソームまたは組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが挙げられる。当技術分野で既知の任意の遺伝子治療法が、本明細書で有用であると考えられる。核酸の非ウイルス系送達法が本明細書で企図される。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順のために、標的核酸を細胞に形質導入するために用いられ得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクター、線状ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸－タンパク質複合体、またはそれらの任意の組み合わせで、一過性または非一過性にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞はインビトロ、培養液中、またはエクスビボでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞は、対象内で天然に生じる際にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクター、線状ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸－タンパク質複合体、またはそれらの任意の組み合わせでトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のトランスフェクション由来配列を含むことができる新しい細胞株を確立する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの成分で一過性にトランスフェクトされ（１つ以上のベクターの一過性トランスフェクション、またはＲＮＡでのトランスフェクションなどによって）、操作されたヌクレアーゼ複合体の活性を介して修飾された細胞を用いて、修飾を含むが任意の他の外因性配列を欠いた細胞を含み得る新しい細胞株を確立する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して、非ヒトトランスジェニック細胞、生物、動物、または植物を産生する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、またはウサギなどの哺乳動物である。トランスジェニック細胞、生物、植物、及び動物を産生する方法は、当技術分野で知られており、一般に、本明細書に記載されるような細胞形質転換またはトランスフェクションの方法から開始する。
特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼ複合体、「標的配列」は、相補性を有するようにガイド配列が設計された配列を指すことができ、ここで標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、操作されたヌクレアーゼ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができる。標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し得る。標的配列は、インビトロまたは無細胞環境中に配置することができる。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ複合体の形成は、標的配列にハイブリダイズされ、本明細書に開示されるような１つ以上の新規な操作されたヌクレアーゼと複合体形成されたガイド核酸を含むことができ、標的配列内またはその付近（例えばそれから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上以内の塩基対）に１つまたは両方の鎖の切断をもたらす。切断は、標的配列内、標的配列の５′、標的配列の上流、標的配列の３′、または標的配列の下流で起こり得る。
いくつかの実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ以上の成分の発現を駆動する１つ以上のベクターが、宿主細胞にまたはインビトロに導入されるか、１つ以上の標的部位で標的化可能なヌクレアーゼ複合体が形成される。例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸はそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節要素に作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節要素から発現される２つ以上の要素を、第１のベクターに含まれない標的化可能なヌクレアーゼシステムの任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターと共に、単一のベクターに組み合わせてもよい。単一のベクター中で組み合わせられた標的化可能なヌクレアーゼシステム要素は、１つの要素が第２の要素に対して５’（の「上流」）または３’（の「下流」）に位置するなど、任意の好適な配向に配置され得る。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列の同じ鎖または反対側の鎖に位置し、同じ方向または反対方向に配向され得る。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターが、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び１つ以上のガイド核酸をコードする転写産物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び１つ以上のガイド核酸は、同じプロモーターに作動可能に連結され、そこから発現される。その他の実施形態では、１つ以上のガイド核酸、または１つ以上のガイド核酸をコードするポリヌクレオチドは、核酸誘導型ヌクレアーゼまたは核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列をすでに含み得る細胞またはインビトロ環境に導入される。
いくつかの実施形態では、複数の異なるガイド配列が使用される場合、細胞内またはインビトロで単一の発現コンストラクトを使用して、ヌクレアーゼ活性を複数の異なる対応する標的配列に標的化することができる。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、もしくはそれ以上、または約１超、２超、３超、４超、５超、６超、７超、８超、９超、１０超、１５超、２０超、もしくはそれ以上のガイド配列を含むことができる。その他の実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上、または約１超、２超、３超、４超、５超、６超、７超、８超、９超、１０超、もしくはそれ以上のこうしたガイド配列含有ベクターを提供することができ、任意選択的にインビボまたはインビトロで細胞に送達することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、各ガイド核酸が異なるガイド配列を有し、それによって異なる標的配列を標的化するように、複数のガイド核酸を含むことができる。これらの実施形態によれば、複数のガイド核酸を、複数の標的が同時に標的化される多重化に使用することができる。更に、またはあるいは、複数のガイド核酸を細胞集団に導入し、集団中の各細胞が異なるまたはランダムなガイド核酸を受け取り、それによって細胞集団全体で複数の異なる標的配列を標的とするようにする。このような場合、その後変更された細胞の集合は、ライブラリーと呼ばれることがある。
その他の実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、それぞれが１つ以上の異なる対応するガイド核酸を有する複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、それにより異なる核酸誘導型ヌクレアーゼによる異なる標的配列の標的化を可能にすることができる。いくつかのこうした場合において、各核酸誘導型ヌクレアーゼは、別個の複数のガイド核酸に対応して、２つ以上の重複しない、部分的に重複する、または完全に重複する多重化イベントを可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断活性またはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置で、一方または両方の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の塩基対内の一方または両方の鎖の切断を指示する。
特定の実施形態では、本発明は、インビトロで、またはインビボ、エクスビボ、もしくはインビトロであり得る原核細胞もしくは真核細胞内で、標的配列を修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、原核細胞などの細胞もしくは細胞集団、またはヒトもしくは非ヒト動物もしくは植物（微細藻類または他の生物を含む）由来の細胞もしくは細胞集団を抽出することと、細胞（複数可）を修飾することと、を含む。培養は、インビトロまたはエクスビボでの任意の段階で行うことができる。細胞（複数可）は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）などの宿主に再導入することさえできる。再導入された細胞の場合、これらは幹細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、方法は、標的化可能なヌクレアーゼ複合体を標的配列に結合させて標的配列の切断を生じさせ、それによって標的配列を修飾することを含み、ここで、標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、ガイド核酸のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの態様では、本発明は、インビトロで、または原核細胞もしくは真核細胞内で、標的ポリヌクレオチドの発現を修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、結合が標的ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことができるように、標的化可能なヌクレアーゼ複合体を標的ポリヌクレオチドを有する標的配列に結合させることを含み、ここで、標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼを含みガイド核酸のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする。
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法及び組成物で開示された要素のいずれか１つ以上を含むキットを提供する。要素は、個別にまたは組み合わせで提供することができ、バイアル、ボトル、またはチューブなどの任意の好適な容器で提供することができる。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語の説明書を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される要素の１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器で提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液または保存緩衝液を提供し得る。試薬は、アッセイで使用可能な形態、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、任意の緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７～約１０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、キットは、ガイド配列と調節要素とを作動可能に連結するように、ベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは編集テンプレートを含む。
いくつかの実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、多様な細胞型における標的配列の修飾（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を含む多種多様な有用性を有する。こうした本発明の標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、例えば、生化学的経路最適化、ゲノム規模の研究、ゲノム操作、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断において幅広い用途を有する。例示的な標的化可能なヌクレアーゼ複合体は、ガイド核酸と複合体を形成した本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、ここでガイド核酸のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズすることができる。ガイド核酸は、足場配列に連結されたガイド配列を含むことができる。足場配列は、共に二次構造を形成するような程度の相補性を有する、１つ以上の配列領域を含むことができる。
編集テンプレートポリヌクレオチドは、組み込まれる配列（例えば、変異遺伝子）を含むことができる。組込みのための配列は、細胞にとって内因性または外因性の配列であり得る。組み込まれる配列の例としては、タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。したがって、組み込みのための配列は、好適な制御配列（複数可）に作動可能に連結され得る。あるいは、組み込まれる配列は、調節機能を提供してもよい。組み込まれる配列は、内因性野生型配列の突然変異またはバリアントであり得る。あるいは、組み込まれる配列は、内因性変異配列の野生型バージョンであってもよい。更に、またはあるいは、組み込まれる配列決定は、内因性突然変異またはバリアント配列のバリアントまたは突然変異形態であってもよい。
特定の実施形態では、上流または下流の配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または約２５００ｂｐを含み得る。いくつかの実施形態では、例示的な上流または下流配列は、約１５ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約５０ｂｐ～約７５０ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、または約７００ｂｐ～約１０００ｂｐを有する。
いくつかの実施形態では、編集テンプレートポリヌクレオチドは、マーカーを更に含むことができる。特定の実施形態では、いくつかのマーカーは、標的化組み込みのスクリーニングを容易にすることができる。好適なマーカーの例には、制限部位、蛍光タンパク質、または選択マーカーが含まれ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、組換え技術を使用して構築することができる。
編集テンプレートポリヌクレオチドを組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを修飾するための例示的な方法の一実施形態では、操作されたヌクレアーゼ複合体によって二本鎖切断がゲノム配列に導入され、切断は編集テンプレートを使用した相同組換えによって修復することができ、その結果、テンプレートは標的ポリヌクレオチドに組み込まれる。二本鎖切断の存在は、編集テンプレートの組み込みの効率を高めることができる。
細胞におけるポリヌクレオチドの発現を修飾するための方法が本明細書に開示される。いくつかの方法は、標的ポリヌクレオチドに結合する標的化可能なヌクレアーゼ複合体を使用することによって、標的ポリヌクレオチドの発現を増加または減少させることを含む。
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイにおいてリアルタイムで行うことができる。一態様では、増幅された産物は、ＤＮＡインターカレーター及びＤＮＡ溝結合剤を含むがこれらに限定されない蛍光ＤＮＡ結合剤を用いて直接可視化することができる。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれたインターカレーターの量は、増幅されたＤＮＡ産物の量に比例し得るため、当該技術分野の従来型の光学系を使用してインターカレートされた色素の蛍光を定量することにより、増幅された産物の量を簡単に決定できる。この用途に適したＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ素プロピジウム、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、及び当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に使用して、増幅産物の検出及び定量化を容易にすることができる。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的な検出に依存する。これは、蛍光性の標的特異的プローブ（例えばＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）を利用して、特異性及び感度を向上させている。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は、当技術分野で十分に確立されている。
いくつかの実施形態では、シグナル伝達生化学的経路に関連する配列の発現における薬剤誘導性変化も、対応する遺伝子産物を調べることによって決定することができる。タンパク質レベルの決定は、ａ）生物学的試料に含まれるタンパク質を、シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させることと、（ｂ）こうして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定することと、を伴い得る。この実施形態の一態様では、シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、結合反応中に形成される薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイによって定量化することができる。上に示したように、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残る標識の量によって直接測定することができる。別の方法では、シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質を、特定の薬剤の結合部位に関して標識類似体と競合する能力について試験する。この競合アッセイでは、捕捉された標識の量は、試験試料中に存在するシグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
いくつかの実施形態では、上記で概説した一般原理に基づくタンパク質分析のための多くの技術が当技術分野で既知であり、かつ本明細書で企図されている。これには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、インサイツイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、主題の方法を実施する際に、異なる身体組織、異なる細胞型、及び／または異なる細胞内構造におけるシグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましい場合がある。これらの研究は、特定の組織、細胞型、または細胞内構造で選択的に発現されるタンパク質マーカーに結合できる、組織特異的、細胞特異的、または細胞内構造特異的抗体を使用して実行できる。
その他の実施形態では、シグナル伝達生化学的経路に関連する遺伝子の変化した発現は、対照細胞と比較した遺伝子産物の活性の変化を調べることによって決定することもできる。シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質の活性における薬剤誘発性変化のアッセイは、調査中の生物学的活性及び／またはシグナル伝達経路に依存する。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の基質（複数可）をリン酸化するその能力の変化は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって決定することができる。代表的なアッセイには、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体を用いたイムノブロッティング及び免疫沈降が含まれるが、これらに限定されない。更に、キナーゼ活性は、ハイスループット化学発光アッセイによって検出できる。
シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質が、細胞内ｐＨ条件の変動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である特定の実施形態では、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／または細胞内イオン濃度の変動を監視することができる。多くの市販のキット及びハイスループット装置が、イオンチャネルのモジュレーターの迅速かつ堅牢なスクリーニングに適している。代表的な機器としては、ＦＬＩＰＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの機器は、マイクロプレートの１０００を超える試料ウェルの反応を同時に検出し、１秒または更には１ミリ秒以内にリアルタイムで測定及び機能データを提供することができる。
本明細書に開示される方法のいずれかを実施する際に、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光トランスフェクション、独自の薬剤により増強した核酸取り込み、ならびにリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介した送達が挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野で既知の１つ以上の方法を介して、好適なベクターを細胞、組織、生物、または胚に導入することができる。いくつかの方法では、ベクターはマイクロインジェクションによって胚に導入される。ベクター（複数可）は、胚の核または細胞質にマイクロインジェクションされ得る。いくつかの方法では、ヌクレオフェクションによってベクター（複数可）を細胞に導入することができる。
標的化可能なヌクレアーゼ複合体の標的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核、原核細胞のゲノム、または宿主細胞の染色体外ベクターに存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、例えば、遺伝子を標的化してノックアウトする、遺伝子を増幅する、及び／またはＤＮＡ反復不安定性及び医学的障害に関連する特定の突然変異を修復するための、本明細書に開示される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの使用に関する。このヌクレアーゼシステムを使用して、これらのゲノム不安定性の欠陥を抑えて修正することができる。その他の実施形態では、本明細書に開示される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムは、ラフォラ病に関連する遺伝子の欠陥を修正するために使用することができる。ラフォラ病は、思春期にてんかん性発作として始まり得る進行性ミオクローヌスてんかんを特徴とする常染色体劣性疾患である。この状態は、発作、筋肉のけいれん、歩行困難、認知症、及び最終的に死をもたらす。
本発明の更に別の態様では、操作された／新規の核酸誘導型ヌクレアーゼシステムを使用して、いくつかの遺伝子突然変異から生じる遺伝的眼疾患を矯正することができる。
本発明のいくつかの他の実施形態は、広範囲の遺伝病に関連する欠陥の修正に関するものであり、これらは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのウェブサイトのＧｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの主題サブセクションで更に記載されている。脳の特定の遺伝性障害としては、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、エカルディ症候群、アルパーズ病、グリア芽腫、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病、及びその他のトリプレットリピート障害、リー病、レッシュ・ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリア性ミオパシー、ならびにＮＩＮＤＳコルポセファリー、または遺伝的に関係のある原因が一因となるその他の脳障害が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、遺伝的に関係のある障害は、新生物形成であり得る。状態が新生物形成であるいくつかの実施形態では、標的遺伝子は、上に挙げた１つ以上の遺伝子を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で企図される健康状態は、加齢性黄斑変性症または統合失調症関連障害であり得る。その他の実施形態では、状態は、トリヌクレオチドリピート障害または脆弱Ｘ症候群であり得る。その他の実施形態では、状態は、セクレターゼ関連障害であり得る。いくつかの実施形態では、状態は、プリオン関連障害であり得る。いくつかの実施形態では、状態は、ＡＬＳであり得る。いくつかの実施形態では、状態は、処方薬または違法薬物に関連する薬物依存症であり得る。これらの実施形態によれば、依存症に関連するタンパク質としては、例えばＡＢＡＴが挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は、自閉症であり得る。いくつかの実施形態では、健康状態は、炎症関連状態、例えば、炎症性サイトカインの過剰発現であり得る。他の炎症状態関連タンパク質としては、Ｃｃｒ２遺伝子によってコードされる単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によってコードされるＣＣケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によってコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、もしくはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によってコードされるＦｃεＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質、またはこれらの状態に遺伝的に関連する他のタンパク質のうちの１つ以上が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、状態はパーキンソン病であり得る。これらの実施形態によれば、パーキンソン病に関連するタンパク質としては、α－シヌクレイン、ＤＪ－１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン－１、及びＮＵＲＲ１が挙げられ得るが、これらに限定されない。
心疾患の一因となる心血管関連タンパク質としては、ＩＬ１ｂ（インターロイキン１－ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー８）、もしくはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）またはこれらの状態に対するその他の既知の寄与因子が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、状態はアルツハイマー病であり得る。これらの実施形態によれば、アルツハイマー病に関連するタンパク質としては、ＶＬＤＬＲ遺伝子によってコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によってコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、もしくは例えば、ＵＢＡ３遺伝子によってコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）、または他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は自閉症スペクトラム障害であり得る。これらの実施形態によれば、自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質としては、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によってコードされるベンゾジアザピン受容体（末梢）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子によってコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）（ＭＦＲ２とも称される）、ＦＸＲ１遺伝子によってコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、もしくはＦＸＲ２遺伝子によってコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は黄斑変性症であり得る。これらの実施形態によれば、黄斑変性症に関連するタンパク質としては、ＡＴＰ結合カセット、ＡＢＣＲ遺伝子によってコードされるサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、もしくはＣＣＬ２遺伝子によってコードされるケモカイン（ＣＣモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、状態は統合失調症であり得る。これらの実施形態によれば、統合失調症に関連するタンパク質としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣＩ、ＧＳＫ３Ｂ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、状態は腫瘍抑制であり得る。これらの実施形態によれば、腫瘍抑制に関連するタンパク質としては、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調及びＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ－ｅｒｂ－ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ－ｅｒｂ－ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ－ｅｒｂ－ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、もしくはノッチ４、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は、セクレターゼ障害であり得る。これらの実施形態によれば、セクレターゼ障害に関連するタンパク質としては、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（前部咽頭欠損１ホモログＢ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、もしくはＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ切断酵素１）、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は、筋萎縮性側索硬化症であり得る。これらの実施形態によれば、筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫に融合される）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）ならびにこれらの任意の組み合わせ、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は、プリオン疾患障害であり得る。これらの実施形態によれば、プリオン疾患障害に関連するタンパク質としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫に融合される）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）ならびにこれらの任意の組み合わせ、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。プリオン障害における神経変性状態に関連するタンパク質の例としては、Ａ２Ｍ（アルファ－２－マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗性転写因子）、ＡＣＰＰ（酸ホスファターゼ前立腺）、ＡＣＴＡ２（アクチンアルファ２平滑筋大動脈）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、もしくはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ－１Ｄアドレノ受容体に対するアルファ－１Ｄアドレナリン性受容体）、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は免疫不全障害であり得る。これらの実施形態によれば、免疫不全障害に関連するタンパク質としては、Ａ２Ｍ［アルファ－２－マクログロブリン］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ－アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］、ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］、もしくはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、状態は免疫不全障害であり得る。これらの実施形態によれば、トリヌクレオチドリピート障害を含み得る免疫不全障害に関連するタンパク質としては、トリヌクレオチドリピート障害は、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチンチン）、もしくはＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、状態は、神経伝達障害であり得る。これらの実施形態によれば、神経伝達障害に関連するタンパク質としては、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性、アルファ－２Ａ－、受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性、アルファ－２Ｃ－、受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、もしくはＨＴＲ２ｃ（５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得る。その他の実施形態では、神経発達に関連する配列としては、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジペートアミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ－アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４－アミノ酪酸アミノトランス－ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］、もしくはＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１３］、またはその他の遺伝的に関連する寄与因子が挙げられ得るが、これらに限定されない。
更に他の実施形態では、遺伝的健康状態としては、エカルディ－グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン・ハーンドン・ダドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ－マンノシドーシス（ＩＩ型及びＩＩＩ型）；アルストレーム症候群；アンジェルマン症候群；血管拡張性失調症；ニューロンセロイドリポフスチン症；ベータ－サラセミア；両側性視神経委縮症及び（乳児性）３視神経委縮症Ｉ型；網膜芽細胞腫（両側性）；カンバン病；脳眼顔骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ランゲ症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン疾患；ドラベ症候群；早発型家族性アルツハイマー病；４フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；Ｆｒｙｎｓ症候群；フコース蓄積症；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球増多症；ハッチソン－ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ；乳児性遊離シアル酸蓄積４疾患；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性；ジャーベル＝ランゲ・ニールセン症候群；接合部型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（乳児性）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群及びＮＡＲＰ；レッシュ・ナイハン症候群、ＬＩＳＴ関連滑脳症；ロー症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送異常症；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型；ペルオキシソーム生合成異常症；ツェルベガー症候群スペクトラム；脳内鉄蓄積を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン・ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン＝マクダーミド症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（乳児性）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバート症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス＝レムリ＝オピッツ症候群；脊髄性筋委縮症；乳児発生型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性骨異形成症１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ＝ヒルショルン症候群；リソソーム性酸性リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症が挙げられ得るが、これらに限定されない。
その他の実施形態では、本明細書に開示される編集システムによって対象とされる動物の遺伝性障害には、股関節形成不全、膀胱状態、てんかん、心臓障害、変性性脊髄症、短頭症候群、グリコーゲン分枝酵素欠損症（ＧＢＥＤ）、遺伝性疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。ウマ局所皮膚無力症（ＨＥＲＤＡ）、高カリウム血症性周期性麻痺症（ＨＹＰＰ）、悪性高熱症（ＭＨ）、多糖類蓄積性ミオパシー１型（ＰＳＳＭ１）、接合部性表皮水疱症、小脳非栄養症、ラベンダー子馬症候群、致命的な家族性不眠症、またはその他の動物－関連する遺伝性疾患。
本発明のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ及び／またはｇＲＮＡ配列は、例えば塩基性に対しては塩基性、酸性に対しては酸性、極性に対しては極性などの、アミノ酸の場合に起こり得る、相同性置換を有する配列を含むことができる（例えば、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）はどちらも、既存のアミノ酸残基またはヌクレオチドを代替の残基またはヌクレオチドと交換することを意味するために本明細書で使用される）。例えば、あるクラスの残基から他のクラスの残基への、あるいは、オルニチン（本明細書では、以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書では、以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（本明細書では、以下、Ｏと称する）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴う、非相同性置換もまた企図される。
本明細書に開示される特定の実施形態では、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトは、ＴＴＴＮ以外の、またはＴＴＴＮに加えて、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識することができる。その他の実施形態では、本明細書に開示される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクトは、標的化効率を改善するために更に変異されてもよく、または特定の標的化された特徴のためにライブラリーから選択されてもよい。
本明細書に開示されるその他の実施形態は、更なる分析及び改善されたゲノム編集特徴を選択するのに役立つ、本明細書に開示されるコンストラクトを含むベクターに関する。
本明細書に開示されるその他の実施形態は、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼコンストラクト及び／または新規のｇＲＮＡ、または本明細書に開示される既知のｇＲＮＡを包装及び輸送するためのキットを含み、更に少なくとも１つの容器を含む。特定の実施形態では、キットに必要ないくつかの試薬を、便利さ、輸送の容易さ、及び効率のために含めることができる。
特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチド中の標的配列またはその近傍に鎖切断を生成する方法であって、標的配列を、本明細書に開示される操作された標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体、例えばＲＮＰなどの標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体と接触させることであって、複合体の適合性のガイド核酸が、標的配列を標的化する、接触させることと、標的化可能なガイド核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体に、鎖切断を生成させることと、を含む、方法が、本明細書で提供される。標的ポリヌクレオチドは、細胞ゲノム中の標的ポリヌクレオチドなどの任意の好適な標的ポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、セーフハーバー部位であり得る。方法は、標的配列に挿入される編集テンプレートを提供することを更に含み得る。編集テンプレートは、切断に挿入することが望まれる任意の好適な配列を含むことができ、特定の実施形態では、編集テンプレートは導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、本方法によって生成された細胞、または本方法によって生成された生物が、本明細書で提供される。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上のベクターもしくは線状ポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチド、その１つ以上の転写産物、及び／またはそれらから転写された１つ以上のタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、こうした方法によって産生された細胞、及びこうした細胞を含むか、またはこうした細胞から産生される生物を更に提供する。いくつかの実施形態では、ガイド核酸と組み合わせた（及び場合により複合体を形成した）操作されたヌクレアーゼが細胞に送達される。
特定の実施形態は、編集テンプレートを組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを修飾するための例示的な方法を提供し、操作されたヌクレアーゼ複合体によって二本鎖切断がゲノム配列に導入され、切断は編集テンプレートを使用した相同組換えによって修復することができ、その結果、テンプレートは標的ポリヌクレオチドに組み込まれる。二本鎖切断の存在は、編集テンプレートの組み込みの効率を高めることができる。
本開示の更なる目的、利点、及び新規な特徴は、本開示を考慮に入れて以下の実施例を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。
配列表を含む付録Ａが本明細書に添付され、本出願の一部を構成する
以下の実施例は、限定的であることを意図しない。
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例に開示された技術は、本開示の実行において良好に機能するように本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その好適な実行の様式を構成すると考えられ得ることを、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示される特定の実施形態でなされ得るが、それでも同様なまたは類似する結果を得ることができることを理解するべきである。
１つの例示的な方法では、選択基準は、Ｃａｓ１２ａに対して６０％未満のＡＡ配列類似性、陽性対照ヌクレアーゼに対して６０％未満のＡＡ配列類似性、及び８０％を超えるクエリカバー率を有する配列を同定するように設定された。いくつかのスクリーニングラウンドの後、３５個のヌクレアーゼが同定され、本明細書では更なる研究のためにＡＲＴ１－３５と呼ばれた。調査の概要を表２に示す。
Figure 2023543351000005
Figure 2023543351000006
いくつかの方法では、コドン最適化は、実施例８に記載されているように、ほとんどの場合、ヌクレオチド配列の類似性を低下させ得るが、タンパク質のアミノ酸配列は変更しない。ヌクレアーゼの天然の状況以外での活性を改善するため、配列に更なる操作を適用した。３５個のＡＲＴヌクレアーゼの天然配列を、グリシン、６ｘヒスチジン、及び３ｘ核局在化シグナルタグを含むように操作した。
これらのＧｌｙ－６ｘＨｉｓタグは、以下を含むいくつかの理由で適用される：１）６ｘＨｉｓタグは、タンパク質精製において、精製のためのクロマトグラフィーカラムへの結合を実現するために使用することができる、及び２）Ｎ末端グリシンが、更に、高度なタンパク質操作を可能にする部位特異的な化学修飾を実現する。更に、Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓは、必要に応じて、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼによる消化によって簡単に除去できるように設計された。これらのコンストラクトでは、Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓタグがＮ末端に配置された。Ｇｌｙ－６ｘＨｉｓタグについては、その開示が本明細書に組み込まれるＭａｒｔｏｓ－Ｍａｌｄｏｎａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１８）１７；９（１）：３３０７でより詳細に説明されている。
ＮＬＳ（核局在化シグナル）断片を、核への輸送を改善するために追加した。これらの実施例で用いられるＮＬＳ断片を、その開示全体が本明細書に組み込まれるＰｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５３（６３０４）；Ｍｅｎｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１５） ５：１４４１０；及びＥｎＧｅｎ（登録商標）Ｓｐｙ Ｃａｓ９ ＮＬＳ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）で既に記載されているように、Ｃａｓ９コンストラクトへと成功裏に付加した。
別の例示的な方法では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集システムは、特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼの少なくとも２つの成分を必要とすることが理解される。ガイドＲＮＡは、目的の標的ＤＮＡ領域を認識し、編集のためにＣａｓヌクレアーゼをこの領域に誘導する、特異的ＲＮＡ配列である。ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡに相補的な１７～２９またはそれより長いヌクレオチド配列であるガイド配列、及び編集を容易にするためにＣａｓヌクレアーゼの結合足場として機能する足場配列の２つの部分で構成され得る。ある方法では、ヌクレアーゼＡＲＴ１～３５のｇＲＮＡの保存配列は、ＡＲＴ１～ＡＲＴ３５のそれぞれの開始コドンの５０００ｂｐ上流及び終止コドンの１０００ｂｐ下流を検索することによって発見され、推定ｇＲＮＡコードセグメントの保存配列を決定するには標準的な方法が使用された。ＡＲＴ１～ＡＲＴ３５のそれぞれについて保存されたＤＮＡ配列を、本願の表３に提供する。これらの配列は、それぞれのヌクレアーゼのｇＲＮＡの保存された部分をコードし、ＲＮＡ配列はこれらの配列から作成できる（表３の保存されたＲＮＡ配列）。更に、当該技術分野で既知であり、かつ本明細書の他の箇所で説明されるように、ＲＮＡ配列の一部またはすべてを更なるプロセシングに供して、いずれかの末端から１つ以上のヌクレオチドを除去することもできる。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼの切断効率をインビボで試験した。ＡＲＴヌクレアーゼの切断効率を、インビボのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で試験した。これらの方法では、アッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるインビボ枯渇アッセイに基づく。最初に、ＡＲＴヌクレアーゼを発現するプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のグリセロールストックを－８０℃の冷凍庫から取り出し、２０μＬの細胞を、１５ｍＬチューブ内の、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２つの４ｍＬ ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地）培地に入れた。細胞を３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。次に、４ｍＬの終夜培養液を、２つの１Ｌフラスコ内の３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２００ｍＬのＬＢ培地に入れた。細胞を、ＯＤ６００が０．５～０．６に達するまで３０℃及び２００ｒｐｍで培養した。フラスコを、４２℃及び２００ｒｐｍの振盪水浴インキュベーターに１５分間入れた。次に、フラスコを手でゆっくりと振盪しながら氷に入れ、氷中に１５分間保持した。その後、細胞をフラスコから５０ｍＬのチューブ（２００ｍＬの細胞に対して４つのチューブ）に移し、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去した。次に、５０ｍＬの氷冷１０％グリセロールを、２００ｍＬの培養液に加え、細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞を、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去し、２ｍＬの氷冷１０％グリセロールを加えた。細胞をピペットで穏やかに再懸濁し、５０μＬのコンピテント細胞に分割した。次いで、混合物を、７２個の冷却した０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に分注した。
２４個のｇＲＮＡ及び１つの非標的化対照ｇＲＮＡを含むプラスミドを、ヌクレアーゼ不含有水中で２５ｎｇ／ｕｌに希釈した。ｇＲＮＡ＿ＥＣ１～ｇＲＮＡ＿ＥＣ２３は、標的化された１８個の標的遺伝子座であり、これらはｇａｌＫ、ｌｐｄ、ａｃｃＡ、ｃｙｎＴ、ｃｙｎＳ、ａｄｈＥ、ｏｐｐＡ、ｆａｂＩ、ｌｄｈＡ、ｐｎｔＡ、ｐｔａ、ａｃｃＤ、ｐｈｅＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ａｒｏＥ、ａｒｏＢ、及びａｒｏＫ遺伝子である。２μＬ（５０ｎｇ）の冷却したプラスミドをエレクトロポレーションキュベットに入れ、１８００Ｖでエレクトロポレーションを行った。次に、９５０μＬのＬＢ培地をキュベットに加えて混合し、細胞を、９６ディープウェルプレート（Ｌｉｇｈｔ ｌａｂｓ）に取り出した。細胞を含む９６ディープウェルプレートを３０℃及び２００ｒｐｍで２時間置いた。
２時間の培養後に回収した細胞を、１０＾０、１０＾１、１０＾２に希釈した。次に、１０μＬの細胞を９０μＬのｄｄＨ２Ｏに入れ、ピペットで混合した。希釈後、各希釈液から８μＬの細胞を採取し、ＬＢ寒天プレート３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンにピペットで移し、カバーを付けずに数分間乾燥させた。次に、カバーをプレートに戻し、プレートを３０℃で一晩培養に戻した。翌日、コロニー数を数えることによって結果を確認した。
ＡＲＴ１、ＡＲＴ２、ＡＲＴ５、ＡＲＴ６、ＡＲＴ８、ＡＲＴ９、ＡＲＴ１０、ＡＲＴ１１、及びＡＲＴ１１＿Ｌ６７９Ｆ（本明細書ではＡＲＴ１１＊またはＡＲＴ１１変異体とも呼ばれる）を用いた枯渇アッセイの結果を、図１～９に示し、データは、パーセント切断効率＝１－（オンターゲットｇＲＮＡを含むプレートのコロニー数／非ターゲットｇＲＮＡを含むプレート上のコロニー数）＊１００％を表す。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼの編集効率を、インビボのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で試験した。これらの方法では、アッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるインビボ編集アッセイに基づいた。最初に、ＡＲＴヌクレアーゼを発現したプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のグリセロールストックを、－８０℃の冷凍庫から取り出し、２０μＬのストック細胞を取り出して、１つの１５ｍＬチューブ内の、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む４ｍＬのＬＢ培地に入れた。細胞を３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。次に、１ｍＬの終夜培養液を、５００ｍＬフラスコ内の３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び０．２％のアラビノースを含む５０ｍＬのＬＢ培地に入れた。細胞を、ＯＤ６００が０．５～０．６に達するまで３０℃及び２００ｒｐｍで培養した。続いて、フラスコを、４２℃及び２００ｒｐｍの振盪水浴インキュベーターに１５分間入れた。次に、フラスコを手でゆっくりと振盪しながら氷に入れ、氷中に１５分間保持した。その後、細胞をフラスコから５０ｍＬのチューブに移し、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去した。次に、２５ｍＬの氷冷１０％グリセロールを、５０ｍＬの培養液に加え、細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞を、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去し、０．５ｍＬの氷冷１０％グリセロールを加えた。細胞をピペットで穏やかに再懸濁し、続いて５０μＬのコンピテント細胞に分割した。次いで、混合物を、９個の冷却した０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに分割した。
３個のｇＲＮＡを含むプラスミドを、ヌクレアーゼ不含有水で２５ｎｇ／ｕｌに希釈した。ｇＲＮＡ＿ＥＣ１からｇＲＮＡ＿ＥＣ３は、ｇａｌＫ遺伝子を標的化した。２μＬ（５０ｎｇ）の冷却ｇＲＮＡプラスミド及び２μＬ（５０ｎｇ）のｓｓＤＮＡ（ＤＮＡ修復テンプレートとして使用）をエレクトロポレーションキュベットに入れ、エレクトロポレーションを１８００Ｖで実施した。次に、９５０μＬのＬＢ培地をキュベットに加えて混合した後、細胞をキュベットから取り出し、１．５ｍＬのチューブに入れた。細胞を含むチューブを３０℃及び２００ｒｐｍで２時間置いた。
回収後、５μＬの細胞を３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、及び１％のガラクトースを含むマッコンキー寒天プレート上にピペットで播種し、滅菌プレーティングビーズを使用して細胞を広げた。プレーティングビーズを取り出した後、カバーをプレートに戻し、プレートを３０℃で一晩培養に戻した。翌日、以下の式を用いて編集効率を計算した。
Figure 2023543351000007
ＡＲＴ２を用いた代表的な編集アッセイの結果を図１０に示し、ＡＲＴ１１に関しては図１１に示す。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼの切断効率をインビボの真核細胞中で試験することができる。これらの方法では、アッセイはインビボのＤＮＡ切断アッセイに基づく。ヒトＴリンパ球細胞の不死化系統であるＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、定期的にスプリットしてからトランスフェクションのために採取する。２つの標的遺伝子座であるＤＮＭＴ１及びＴＲＡＣ４３を、標的としてゲノムＪｕｒｋａｔ ＤＮＡ中で選択する。ヌクレアーゼＡＲＴ２及び対照ヌクレアーゼは、保存緩衝液（例えば、ＮａＣｌ３００ｍＭ、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ＥＤＴＡ０．１ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、及びグリセロール１０％）中で、２０ｍｇ／ｍＬに希釈する。同様に、ｇＲＮＡはヌクレアーゼ不含有水中で１００μＭに希釈する。ＲＮＡ－タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、１μＬのヌクレアーゼ溶液と１．５μＬのｇＲＮＡ溶液とを混合することによって調製する。複合体は、室温で１０分間のインキュベーション中に９６ウェルＶ底プレート中で形成される。
ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００中で細胞を計数し、その生存度を推定した。採取した細胞を、トランスフェクション緩衝液（ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ９６－ｗｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ，ＬｏｎｚａからのＳＦ）で、１００×１０５細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。２０μＬのその溶液を、形成されたＲＮＰを含むウェルに加え、ピペッティングによって混合し、９６－ｗｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ ｐｌａｔｅ（Ｌｏｎｚａ）に移した。細胞をエレクトロポレーションする。場合によっては、ヌクレオポレーションの前に、２成分型ｇＲＮＡ（スプリットｇＲＮＡ；ＳＴＡＲ）を１：１の体積で混合し、３７℃で３０分間アニーリングしてｇＲＮＡ溶液を形成する。ＳＴＡＲ ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが分離されたスプリットｇＲＮＡであることに注目されたい。ＡＲＴ２ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ（単一またはＳＴＡＲのいずれか）は、好適なヌクレオポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した直後に同時送達され、最適化されたヌクレオポレーター（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｏｒ）プログラム（Ｌｏｎｚａ）を介して送達される。
エレクトロポレーションに続いて、１０％のＦＢＳを含む８０μＬの新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地を、エレクトロポレーションの直後にＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートに追加する。溶液を混合し、５０μＬを、１５０μＬの新鮮な培地を含む９６ウェル平底培養プレートに移した。細胞を、７２時間培養してからＤＮＡ抽出のために採取する。１０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を採取し、緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄する。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを２０μＬの予熱したＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で処理する。プレートをサーモサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）に入れ、温度処理（例えば、６５℃で１５分、６８℃で１５分、９５℃で１０分、４℃に冷却）を適用する。遠心分離によって細胞片を採取し、ゲノムＤＮＡを含む上清を採取する。標的部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ反応で増幅し、ＤＮＡを配列決定のために準備する。試料同定用のＩｌｌｕｍｉｎａ適合アダプター配列及びインデックス配列は、２ラウンド目のＰＣＲ中に標的部位のＰＣＲ産物に追加される。２ラウンド目のＰＣＲ産物をプールし、２ｘ１５０ペアエンド配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定機器に投入する。編集頻度を、Ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２分析パッケージを使用して決定した。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼＲＮＰを遺伝子編集のために哺乳動物細胞に導入した。
１．１ 細胞及び培養
Ｊｕｒｋａｔ、クローンＥ６－１、急性Ｔ細胞性白血病細胞を購入し（ＡＴＣＣ）、製造者の指示に従って１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。全ての細胞培養物を、３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｃｅｌｌ ＶＩＯＳ １６０ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で増殖及び維持した。
１．２ 遺伝子編集のための哺乳動物細胞へのＡＲＴ１１ ＲＮＰの導入
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を、単一のｇＲＮＡとＡＲＴ１１ヌクレアーゼとの複合体形成によって生成した。単一のｇＲＮＡを合成し（ＩＤＴ）、組換えＡＲＴ１１を産生して精製した（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）。組換えＡＲＴ１１ヌクレアーゼを、使用前に２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール緩衝液中で、－８０℃で保存した。単一のｇＲＮＡを、ＩＤＴＥ ｐＨ７．５緩衝液（ＩＤＴ）中で再懸濁して、１００Ｍのストックを産生し、使用前に－８０℃で保存した。μＡＲＴ１１ヌクレアーゼとｇＲＮＡとを室温で１０分間混合してＲＮＰを形成した。複合体を形成した後、ＲＮＰを好適なヌクレオポレーション緩衝液（例えば、ＳＦ ｂｕｆｆｅｒ、Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、最適化されたヌクレオポレータープログラム（例えば、ＣＡ－１３７、Ｌｏｎｚａ）を介して哺乳動物細胞に送達した。
１．３ アンプリコンの配列決定のためのＤＮＡの採取
細胞を、４８時間培養してからＤＮＡ抽出のために採取した。細胞を遠心分離（２００×ｇで５分間）によって採取してペレット化し、緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。上清を慎重に取り除いた後、細胞ペレットを２０μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で処理した。試料をサーマルサイクラーに入れ、温度処理を適用した（例えば、６５℃で１５分、６８℃で１５分、９５℃で１０分、及び４℃に冷却）。標的部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ反応で増幅し、ＤＮＡを配列決定のために準備した。試料同定用のＩｌｌｕｍｉｎａ適合アダプター配列及びインデックス配列は、２ラウンド目のＰＣＲ中に標的部位のＰＣＲ産物に追加される。２ラウンド目のＰＣＲ産物をプールし、２ｘ１５０ペアエンド配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定機器に投入する。編集頻度を、Ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２分析パッケージを使用して決定した。結果を図１４に示す。
別の例示的な方法では、本明細書に開示される非天然の核酸配列のコドン最適化は、Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。この方法では、広範囲の用途のためにヌクレアーゼを発現させるために、「生物」の欄から生物（細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ１２）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または多細胞真核生物（例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト））など）を選択した。次に、ＤＮＡ塩基またはアミノ酸配列を、Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌの空白欄にロードした。次に、配列を最適化した。生成されたＤＮＡ配列は、細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ１２）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または多細胞真核生物（例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト））に対してコドン最適化される。
本明細書に開示される非天然の核酸配列の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌中の発現に対してコドン最適化されたＡＲＴ２配列（例えば配列番号６）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母中の発現に対してコドン最適化された配列（例えば配列番号７）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）などの多細胞真核生物中の発現に対してコドン最適化された配列（例えば配列番号８）が挙げられる。こうした非天然の核酸配列は、当業者に既知の方法を使用して、増幅、クローン化、構築、合成、合成オリゴヌクレオチドもしくはｄＮＴＰからの生成、または別の方法で得た。コドン最適化ヌクレアーゼは、細胞株のプラスミドからの発現によって細胞株を編集するために使用されているか、タンパク質産生細胞株中で高レベルで発現され、その後ＲＮＰによる編集のために精製されている。
別の例示的な方法では、２つ以上のＡＲＴヌクレアーゼＲＮＰを遺伝子編集のために哺乳動物細胞に導入する。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、単一のｇＲＮＡまたはＳＴＡＲ ｇＲＮＡと各ＡＲＴヌクレアーゼとの複合体形成によって産生され、複数のＡＲＴヌクレアーゼＲＮＰの混合物がトランスフェクションに使用される。実施例６と同様に、単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡが合成され、組換えＡＲＴが産生及び精製される。続いて、組換えＡＲＴヌクレアーゼを、使用前に２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール緩衝液中で、－８０℃で保存する。単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡを、ＩＤＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ７．５緩衝液中に再懸濁して、１００μＭのストックを産生し、使用前に－８０℃で保存する。ヌクレオポレーションの直前に、組換えＡＲＴを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．５からなる作業緩衝液に希釈し、ｇＲＮＡをＩＤＴＥ ｐＨ７．５緩衝液で最終作業濃度に希釈する（ＳＴＡＲの場合は最初にアニーリングする。セクション１．４を参照されたい）。ＡＲＴヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを希釈した後、両方を１：１の容量で（ｇＲＮＡとヌクレアーゼとの比率が２：１）３７℃で１０分間混合して、ＲＮＰを形成する。複合体を形成した後、ＲＮＰを好適なヌクレオポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、最適化されたヌクレオポレータープログラム（Ｌｏｎｚａ）を介して送達した。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼを複数のｇＲＮＡと組み合わせて多重多標的ＲＮＰを構築し、遺伝子編集のために哺乳動物細胞に導入する。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、単一のＡＲＴヌクレアーゼまたは複数のＡＲＴヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の異なる部位を標的化する複数の単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡのいずれかを複合体形成することによって産生される。実施例６と同様に、単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡが合成され、組換えＡＲＴが産生及び精製される。組換えＡＲＴヌクレアーゼを、使用前に２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール緩衝液中で、－８０℃で保存する。単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡを、ＩＤＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ７．５緩衝液中に再懸濁して、１００μＭのストックを産生し、使用前に－８０℃で保存する。ヌクレオポレーションの直前に、組換えＡＲＴを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．５からなる作業緩衝液に希釈し、ｇＲＮＡをＩＤＴＥ ｐＨ７．５緩衝液で最終作業濃度に希釈する（ＳＴＡＲの場合は最初にアニーリングする。セクション１．４を参照されたい）。ＡＲＴヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを希釈した後、両方を１：１の容量で（ｇＲＮＡとヌクレアーゼとの比率が２：１）３７℃で１０分間混合して、ＲＮＰを形成する。複合体を形成した後、ＲＮＰを好適なヌクレオポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、最適化されたヌクレオポレータープログラム（Ｌｏｎｚａ）を介して送達した。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼＲＮＰを、標的ゲノムの定方向修復または編集に使用されるポリヌクレオチドＤＮＡ修復テンプレートを用いた遺伝子編集のために哺乳動物細胞に導入する。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡとＡＲＴヌクレアーゼとの複合体形成によって生成され、２０ｂｐ～２０ｋｂｐの範囲のサイズのポリヌクレオチドＤＮＡ修復テンプレートがＲＮＰに追加される。実施例６と同様に、単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡが合成され、組換えＡＲＴが産生及び精製される。組換えＡＲＴヌクレアーゼを、使用前に２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール緩衝液中で、－８０℃で保存する。ポリヌクレオチドＤＮＡテンプレートは、ソースＤＮＡ材料を含むプラスミドストックから合成されるか、商業的に合成された合成ＤＮＡ材料（ＩＤＴ、Ｇｅｎｅｗｉｚ）であるかのいずれかである。ＤＮＡテンプレートは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のいずれかであり、ｇＲＮＡ切断部位の近位の挿入または編集領域に隣接する相同性アームを有する。単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡをＩＤＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ７．５緩衝液に再懸濁して１００μＭのストックを生成し、使用前に－８０℃で保存する。ヌクレオポレーションの直前に、組換えＡＲＴを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．５からなる作業緩衝液に希釈し、ｇＲＮＡをＩＤＴＥ ｐＨ７．５緩衝液で最終作業濃度に希釈する（ＳＴＡＲの場合は最初にアニーリングする。セクション１．４を参照されたい）。ＡＲＴヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを希釈した後、３７℃で１０分間、両方を１：１の容量で（ｇＲＮＡとヌクレアーゼとの比率が２：１）混合し、ＤＮＡテンプレートを最適の濃度で添加して、ＲＮＰを形成する。複合体を形成した後、ＲＮＰを好適なヌクレオポレーション緩衝液（例えば、Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、最適化されたヌクレオポレータープログラム（例えば、Ｌｏｎｚａ）を介して送達した。
別の例示的な方法では、ＡＲＴヌクレアーゼＲＮＰを、多重での標的ゲノムの定方向修または編集に使用されるポリヌクレオチドＤＮＡ修復テンプレートの混合物を用いた遺伝子編集のために哺乳動物細胞に導入する。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡとＡＲＴヌクレアーゼとの複合体形成によって生成され、２０ｂｐ～２０ｋｂｐの範囲のサイズのポリヌクレオチドＤＮＡ修復テンプレートの混合物がＲＮＰに追加される。実施例６と同様に、単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡが合成され、組換えＡＲＴが産生及び精製される。組換えＡＲＴヌクレアーゼを、使用前に２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール緩衝液中で、－８０℃で保存する。ポリヌクレオチドＤＮＡテンプレートは、ソースＤＮＡ材料を含むプラスミドストックから合成されるか、商業的に合成された合成ＤＮＡ材料（ＩＤＴ、Ｇｅｎｅｗｉｚ）であるかのいずれかである。ＤＮＡテンプレートは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のいずれかであり、ｇＲＮＡ切断部位の近位の挿入または編集領域に隣接する相同性アームを有する。単一またはＳＴＡＲ ｇＲＮＡをＩＤＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ ７．５緩衝液に再懸濁して１００μＭのストックを生成し、使用前に－８０℃で保存する。ヌクレオポレーションの直前に、組換えＡＲＴを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．５からなる作業緩衝液に希釈し、ｇＲＮＡをＩＤＴＥ ｐＨ７．５緩衝液で最終作業濃度に希釈する（ＳＴＡＲの場合は最初にアニーリングする。セクション１．４を参照されたい）。ＡＲＴヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを希釈した後、３７℃で１０分間、両方を１：１の容量で（ｇＲＮＡとヌクレアーゼとの比率が２：１）混合し、ＤＮＡテンプレートを最適の濃度で添加して、ＲＮＰを形成する。複合体を形成した後、ＲＮＰを好適なヌクレオポレーション緩衝液（例えば、Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、最適化されたヌクレオポレータープログラム（例えば、Ｌｏｎｚａ）を介して送達した。
この実施例では、本明細書に開示される代表的なヌクレアーゼのＰＡＭ配列を評価した。
－８０℃の冷凍庫からの、ＡＲＴヌクレアーゼを発現するプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のグリセロールストック、１００μＬの細胞ストックを用いて、１５ｍＬチューブ内の、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む４ｍＬのＬＢ培地に播種した。細胞を、３０℃及び２００ｒｐｍの振盪インキュベーターで終夜（１２～１６時間）培養した。終夜増殖させた後、１ｍＬの終夜細胞培養物を、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２５ｍＬのＬＢ培地を含む２５０ｍＬのフラスコに加えた。細胞を、３０℃及び２００ｒｐｍの振盪インキュベーターで、ＯＤ６００が０．５～０．６に達するまで培養した。細胞をフラスコから５０ｍＬのチューブに移し、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去した。次に、２５ｍＬの氷冷１０％グリセロールを添加し、細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞を、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去し、２ｍＬの氷冷１０％グリセロールを加えた。細胞をピペットで穏やかに再懸濁し、５０μＬのコンピテント細胞のアリコートに分割した。
５０μＬの準備されたコンピテント細胞を氷の上の０．１ｃｍ間隙のエレクトロポレーションキュベットに移すことによって、エレクトロポレーションの準備をする。２００ｎｇのＰＡＭプラスミドライブラリ（様々なＰＡＭ配列を有するオンターゲット部位を担持する）をエレクトロポレーションキュベットに加え、１８００Ｖでエレクトロポレートする。９５０μＬのＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ（ＳＯＢ）培地を加え、穏やかに混合し、全量を１．５ｍＬチューブに移す。３０℃及び２００ｒｐｍで２時間インキュベートする。各チューブから、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４ｍＬのＬＢ培地を含む別の１５ｍＬのプラスチックチューブに細胞を移し、終夜インキュベートする。各培養物に対して、１ｍＬの終夜細胞培養物を、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２５ｍＬのＬＢ培地を含む２５０ｍＬのフラスコに添加し、３０℃及び２００ｒｐｍの振盪インキュベーターで、ＯＤ６００が０．５～０．６に達するまでインキュベートした。フラスコを、４２℃及び２００ｒｐｍの振盪水浴インキュベーターに１５分間入れた。次に、フラスコを手でゆっくりと振盪しながら氷に入れ、氷中に１５分間保持した。細胞をフラスコから５０ｍＬのチューブに移し、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去した。次に、２５ｍＬの氷冷１０％グリセロールを添加し、細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞を、８０００ｒｐｍ及び４℃で５分間遠心分離して上清を除去し、２ｍＬの氷冷１０％グリセロールを加えた。細胞をピペットで穏やかに再懸濁し、５０μＬのコンピテント細胞のアリコートに分割した。
５０μＬの準備されたコンピテント細胞を氷の上の０．１ｃｍ間隙のエレクトロポレーションキュベットに移すことによって、エレクトロポレーションの新たなラウンドの準備をする。非標的化対照またはオンターゲッティングｇＲＮＡプラスミドのうち１つを１００μｇ加え、１８００Ｖでエレクトロポレートする。９５０μＬのＳＯＰ培地を加え、穏やかに混合し、全量を１．５ｍＬチューブに移す。３０℃及び２００ｒｐｍで２時間インキュベートする。５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレートに回収した細胞のアリコートを播種し、３０℃で終夜インキュベートする。細胞を採取し、プラスミドを精製する。プラスミドを、プライマーｍｉｎｉｓｅｑ＿ｇａｌＫＯＦＦ＿Ｔ２２５－Ｆ２（ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧｃｇｔａｃｃｃｔｇｇｔｔｇｇｃａｇｃｇａａｔａｃ）（配列番号３２６）、及びｍｉｎｉｓｅｑ＿ｇａｌＫＯＦＦ＿Ｔ２２５－Ｒ２（ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧａｃｇｃａｃｇｃｇｔｔｔｔｇｃｃａｃｇａｔｃ）（配列番号３２７）を用いたＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡとして使用する。試料同定用のＩｌｌｕｍｉｎａ適合アダプター配列及びインデックス配列は、２ラウンド目のＰＣＲ中にＰＣＲ産物に追加される。２ラウンド目のＰＣＲ産物をプールし、２ｘ１５０ペアエンド配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定機器に投入する。
ＶＳＥＡＲＣＨツールを使用して、ＮＧＳデータを、参照ＰＡＭライブラリテンプレートと整列させた。整列の閾値は０．９であった。ｐａｎｄａｓプログラムを用いて、整列されたデータをフィルタリングした。データの閾値は１００％であった。各ＰＡＭの正規化された読み取り値を、以下の式を使用して計算したが、ここで、ＰＡＭのヒットは、ｐａｎｄａｓを実行した後のＰＡＭヒットの合計であり、合計ヒットは ＶＳＥＡＲＣＨを実行する前の合計ヒットである。
Figure 2023543351000008
濃縮度を以下の式を使用して計算したが、ここで、正規化された読み取り値ｙは、非標的化対照実験での各ＰＡＭの正規化された読み取り値を意味し、正規化された読み取り値ｘは、オンターゲッティングｇＲＮＡ実験での各ＰＡＭの正規化された読み取り値を意味する。
Figure 2023543351000009
ＡＲＴ１１のＰＡＭ部位の上位ヒット数の結果を、図１１に示す。ＡＲＴ１１＿Ｌ６７９ＦのＰＡＭ部位の上位ヒットの結果を、図１３に示す。
この実施例は、突然変異ヌクレアーゼＡＲＴ１１＿Ｌ６７９Ｆを開発するための部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）について記載する。
Figure 2023543351000010
ＮＥＢ ＳＤＭキットを使用した指数関数的増幅（ＰＣＲ）
Figure 2023543351000011
ｂ．１２０ｖで３０分間、１％アガロースゲル中で５μｌのＰＣＲ産物を実行する。
キナーゼ、リガーゼ、及びＤｐｎＩ（ＫＬＤ）処置
以下の試薬を組み合わせる：
Figure 2023543351000012
上下にピペッティングすることで十分に混合し、室温で３０分間インキュベートする。
形質転換
１．ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のチューブを氷上で解凍する。
２．工程ＩＩからのＫＬＤミックスを５μｌ、解凍した細胞のチューブに加える。チューブを、４～５回慎重に軽く叩いて混合する。ボルテックスしてはならない。
３．混合物を氷上に３０分間置く。
４．４２℃で３０秒間の熱ショックを与える。
５．氷上に５分間置く。
６．９５０μｌの室温ＳＯＣをピペットで混合物に移す。
７．振盪（２００ｒｐｍ）させながら、３０℃で２時間インキュベートする。
８．チューブを軽く叩いて反転させることで細胞を完全に混合し、続いて１０及び１００μｌを選択プレート上に広げ、３０℃で終夜インキュベートする。
９．サンガー配列決定用にいくつかのコロニーを選択して、修正されたプラスミドを見つける。
付録Ａは、参照によりその全体があらゆる目的に関して本明細書に組み込まれる。
本開示の上記の記述は、例示及び説明を目的として提示された。上記は、本開示を本明細書に開示された形態または複数の形態に限定することを意図するものではない。本開示の説明は、１つ以上の実施形態ならびに特定の変形及び修正の説明を含んでいるが、例えば、本開示を理解した後は当業者の技術及び知識の範囲内となり得るようなその他の変形及び修正も本開示の範囲に含まれる。特許請求されるものに対して代替的な、互換的な、及び／または同等の構造、機能、範囲、または工程が本明細書で開示されているか否かに関わらず、また特許性のある主題の公開を意図することなく、代替的な、互換的な、及び／または同等の構造、機能、範囲、または工程を含む、許容される範囲の代替的な実施形態を含む権利を得ることが意図されている。
本発明の好適な実施形態を本明細書で図示及び記載したが、こうした実施形態が単に例として提供されていることは、当業者には明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなしに多数の変形、変更、及び置換を想定するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替手段が、本発明の実施に採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの等価物をそれにより網羅することが意図されている。
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配列番号２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３１： 未知要素の説明： Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ群細菌配列
配列番号３２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号４９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号５８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号６９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７１： 未知要素の説明： Ｓｏｄａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｕｓ配列
配列番号７２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号７８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号８９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９１： 未知要素の説明： Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌配列
配列番号９２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号９８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１００： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１０９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１１８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１２０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１２１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１２２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１２４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
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配列番号１２６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
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配列番号１２９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１３０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
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配列番号１３４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１３６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１３７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１３８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１４０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１４１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１４２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号１５０： 未知要素の説明： Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ群細菌配列
配列番号１６０： 未知要素の説明： Ｓｏｄａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｕｓ配列
配列番号１６５： 未知要素の説明： Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌配列
配列番号１７８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１７９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８０： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１８９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９０： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
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配列番号１９６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号１９９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２００： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２０１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２０２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
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配列番号２０４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２０５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２０６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２０７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
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配列番号２０９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１０： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２１９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２２０： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２２１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２２２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２２３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２２４： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２２５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２２６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２２７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２２８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２２９： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２３０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２３９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４７： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４８： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２４９： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５１： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５２： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５３： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５４： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５５： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５６： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号２５７： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２５８： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２５９： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２６０： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２６１： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２６２： 人工配列の説明： 合成ポリペプチド
配列番号２６４： 未知要素の説明： Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ＮＬＳ配列
配列番号２６５： 未知要素の説明： Ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ配列
配列番号２６６： 未知要素の説明： Ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ配列
配列番号２６８： 未知要素の説明： インポーチンα配列由来のＩＢＢドメイン
配列番号２６９： 未知要素の説明： Ｍｙｏｍａ Ｔタンパク質配列
配列番号２７０： 未知要素の説明： Ｍｙｏｍａ Ｔタンパク質配列
配列番号２７９： 未知要素の説明： 核局在化配列
配列番号２８０： 人工配列の説明： 合成ペプチド
配列番号２８１： 人工配列の説明： 合成ペプチド
配列番号２８２： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８３： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８４： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８５： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８６： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８７： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８８： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２８９： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２９０： 未知要素の説明： ＡＲＴヌクレアーゼモチーフ配列
配列番号２９１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号２９９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３００： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３０９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１０： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１６： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１７： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１８： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３１９： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２０： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２１： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２２： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２３： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２４： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２５： 人工配列の説明： 合成オリゴヌクレオチド
配列番号３２６： 人工配列の説明： 合成プライマー
配列番号３２７： 人工配列の説明： 合成プライマー
配列番号３２８： 人工配列の説明： 合成プライマー
配列番号３２９： 人工配列の説明： 合成プライマー
配列番号３３０： 人工配列の説明： 合成ポリヌクレオチド
配列番号３３２： 人工配列の説明： 合成ペプチド
配列番号３３３： 人工配列の説明： 合成ペプチド
配列番号３３４： 人工配列の説明： 合成６ｘＨｉｓタグ
配列番号３３５： 人工配列の説明： 合成８ｘＨｉｓタグ

Claims (46)

  1. 操作された核酸誘導型ヌクレアーゼを含む組成物であって、（ｉ）配列番号１４３～１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１４３～１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、組成物。
  2. 配列番号１４４、１５３、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１４４、１５３、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 配列番号１４４と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１４４と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 配列番号１５３と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号１５３と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 配列番号２２９と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたヌクレアーゼポリペプチド、または、配列番号２２９と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記配列同一性が少なくとも８０％である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記配列同一性が少なくとも９５％である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記配列同一性が１００％である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記操作されたヌクレアーゼポリペプチドが、ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含有しない、または、前記操作されたヌクレアーゼポリペプチドをコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドが前記ペプチドモチーフＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ（配列番号２２４）を含有しない、請求項１に記載の組成物。
  10. 配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４３～１５１、１６１～１６３、１６５、１６６、１６９、１７１～１７５、１７７、及び２２９のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４９、１５１、１７５、及び１７７のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 標的化可能なガイド核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む組成物であって、請求項１～１１のいずれか１項に記載の操作されたガイド核酸ヌクレアーゼを含み、
    （ｉｉ）適合性のガイド核酸
    を更に含む、組成物。
  13. 前記ガイド核酸がｇＲＮＡであり、前記複合体がＲＮＰである、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記ガイド核酸が、スプリットガイド核酸である、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 前記ｇＲＮＡが操作されたｇＲＮＡである、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. 前記操作されたｇＲＮＡが、保存されたｇＲＮＡを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記保存されたｇＲＮＡが、配列番号２９１～３２５のうちのいずれか１つ、またはその部分を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記保存されたｇＲＮＡが、配列番号２９１～３２５のうちのいずれか１つの部分を含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記部分が、前記ＲＮＡの二次構造のヌクレオチド配列を含む高度に保存された部分である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記二次構造がシュードノットを含む、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記ｇＲＮＡが合成ｇＲＮＡである、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記ｇＲＮＡが１つ以上の化学修飾を含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 標的ポリヌクレオチド中の標的配列またはその近傍に鎖切断を生成する方法であって、前記標的配列を、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の標的化可能な核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体と接触させ、前記複合体の前記適合性のガイド核酸が、前記標的配列を標的化することと、前記標的化可能なガイド核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体に、前記鎖切断を生成させることと、を含む方法。
  24. 前記標的ポリヌクレオチドが細胞ゲノム中にある、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記標的配列に挿入されるべき編集テンプレートを提供することを更に含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記編集テンプレートが導入遺伝子を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記標的ポリヌクレオチドがセーフハーバー部位である、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
  28. 請求項２３に記載の方法によって生成された細胞。
  29. 請求項２３に記載の方法によって生成された生物。
  30. 配列番号１～１４２及び２２５～２２８のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む操作された１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、組成物。
  31. 配列番号１、５、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、及び２２５のうちいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、またはその両方で、１つ以上の追加のアミノ酸配列をコードする、請求項３０または３１に記載の組成物。
  33. 前記追加のアミノ酸配列が、
    （ｉ）１つ以上のＮＬＳ、
    （ｉｉ）１つ以上の精製タグ、
    （ｉｉｉ）１つ以上の切断配列、及び
    （ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧ
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記追加のアミノ酸配列が、
    （ｉ）１つ以上のＮＬＳ、
    （ｉｉ）１つ以上の精製タグ、
    （ｉｉｉ）１つ以上の切断配列、及び
    （ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧ
    のうちの少なくとも２つを含む、請求項３２に記載の組成物。
  35. 前記追加のアミノ酸配列が、
    （ｉ）１つ以上のＮＬＳ、
    （ｉｉ）１つ以上の精製タグ、
    （ｉｉｉ）１つ以上の切断配列、及び
    （ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧ
    のうちの少なくとも３つを含む、請求項３２に記載の組成物。
  36. 前記追加のアミノ酸配列が、
    （ｉ）１つ以上のＮＬＳ、
    （ｉｉ）１つ以上の精製タグ、
    （ｉｉｉ）１つ以上の切断配列、及び
    （ｉｖ）ＦＬＡＧまたは３ＸＦＬＡＧ
    を含む、請求項３２に記載の組成物。
  37. 前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドがコドン最適化されている、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化されている、請求項３７に記載の組成物。
  39. 配列番号２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、２２６、及び３３０のうちいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の組成物。
  40. 前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドが、Ｓ． ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅに対してコドン最適化されている、請求項３７に記載の組成物。
  41. 配列番号３、７、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、及び２２７のうちいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記１またはそれ以上のポリヌクレオチドが、ヒトに対してコドン最適化されている、請求項３７に記載の組成物。
  43. 配列番号３、７、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、及び２２７のうちいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列に対応する配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記配列同一性が少なくとも８０％である、請求項３０～４３のいずれか１項に記載の組成物。
  45. 前記配列同一性が少なくとも９５％である、請求項３０～４３のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記配列同一性が１００％である、請求項３０～４３のいずれか１項に記載の組成物。
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