JP2023543101A - リフトバレー熱ウイルスの弱毒化変異体、それを含む組成物、およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）ＲＮＡのＬ、Ｍ、およびＳセグメントによってコードされるアミノ酸配列における突然変異体を有するＲＶＦＶの弱毒化変異体、上記変異体を有する医薬組成物または動物用の組成物、リフトバレー熱の予防において使用するための弱毒化ＲＶＦＶ変異体、および弱毒化ＲＶＦＶ変異体を含むリフトバレー熱に対するワクチンに関する。Ｌタンパク質において突然変異体Ｇｌｙ９２４ＳｅｒおよびＡｌａｌ３０３Ｔｈｒ、およびＮＳｓタンパク質においてＰｒｏ８２Ｌｅｕ置換を有する弱毒化ＲＶＦＶ変異体もまた含まれる。【選択図】なし

Description

本発明は、弱毒化されたリフトバレー熱（ＲＶＦ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）により生じる疾患に対する生ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ファビピラビルを用いた変異誘発処置によって得られるＲＶＦＶの弱毒化変異体に関する。

リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）は、フレボウイルス属のフェニュイウイルス科に属する蚊媒介ブニヤウイルスである。ＲＶＦＶは、反芻動物にリフトバレー熱（ＲＶＦ）を生じさせ、動物間で突発的に流行した後、主に蚊に刺されることによってヒトに伝染する。

リフトバレー熱は、現在、アフリカ大陸、アラビア半島南部、およびインド洋諸島で見られる。加えて、ＲＶＦは、特に、気候変動およびグローバル化に関連して、他の地理的領域に拡大する可能性がある。現在、市場において、リフトバレー熱に対する治療法もワクチンも存在しない。

ＲＶＦＶはＲＮＡウイルスである。ＲＶＦＶビリオンの構造は、ウイルスＲＮＡに連結したウイルス核タンパク質（Ｎ）およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）で構成される内部ヌクレオカプシドを保護する正二十面体格子に配置される２つの膜糖タンパク質（ＧｎおよびＧｃ）を有する脂質膜からなる。

ＲＶＦＶ遺伝子は、負極性（ＬおよびＭ）または両極性（Ｓ）を有する、異なる大きさ（大型（ｌａｒｇｅ：Ｌ）、中型（ｍｅｄｉｕｍ：Ｍ）、小型（ｓｍａｌｌ：Ｓ））の単鎖ＲＮＡの３つのセグメントから作られる。Ｌセグメントは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする。Ｍセグメントは、７８ｋＤａおよび１３－１４ｋＤａの２つの非構造タンパク質（ＮＳｍ）、ならびにＧｎおよびＧｃ膜糖タンパク質をコードする。Ｓセグメントは、２７ｋＤａ非構造タンパク質（ＮＳｓ）をコードし、Ｎタンパク質と同様に、ウイルスの主要な病原性因子であると考えられている。

生弱毒化ワクチンは、単回投与の後、動物とヒトの両方に、長期持続型で防御力の高い免疫を誘発する。これらは、生命体または生存可能な形態に感染を生じさせるが、感染、繁殖、または全体として毒性の能力が大きく低減された（弱毒化された）微生物を含むことから、生ワクチンと呼ばれる。これにより、生弱毒化ワクチンは、影響を受けた国における成果の高い予防接種プログラムの整備、または疾患の伝来または拡大のリスクがより高い国における予防管理措置を講じるための優れた基礎となる。

変異誘発処置は、ウイルス弱毒化方法として頻繁に用いられてきた。その一例は、５－フルオロウラシルを用いた変異誘発処置によって得られる、ＭＰ－１２生弱毒化ＦＶＲワクチン（Ｉｋｅｇａｍｉら、２０１５）である。現在、ＭＰ－１２ワクチンは、ヒト用ワクチンの候補として、第ＩＩ相臨床試験段階にある。

リバビリン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－１－Ｈ－１、２、４－トリアゾール－３－カルボキシアミド）、ファビピラビル（６－フルオロ－３－ヒドロキシ－２－ピラジンカルボキサミド）、およびＢＣＸ４４３０［（２Ｓ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｒ）－２－（４－アミノ－５Ｈ－ピロロ［３、２－ｄ］ピリミジン－７－イル）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリシン３、４－ジオール］（ガリデシビル）など、ＲＶＦＶに対する抗ウイルス活性を有するヌクレオチド類似体が記載されている。ファビピラビルは、ピリミジン類似体として作用し、様々なＲＮＡウイルスに対し強力な抗ウイルス活性を有するピラジン誘導体（６－フルオロ－３－ヒドロキシ－２－ピラジンカルボキサミド）である。

ファビピラビルは、Ｃ型肺炎ウイルス、手足口病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、およびＲＶＦＶを含むいくつかのＲＮＡウイルスに対する変異原活性を有する。先行技術には、ＲＶＦＶに対するファビピラビルの作用機序は、ウイルス遺伝子における突然変異の蓄積が生存可能な子孫ウイルスの減少につながることに起因すると記載されている（Ｂｏｒｒｅｇｏら、２０１９）。

生弱毒化ＲＶＦワクチンの開発は、積極的に研究されている分野であり、動物および／またはヒト用の、安全かつ効果的なＲＶＦ制御戦略を立てるのに役立つことができる、新たな生弱毒化ＲＶＦワクチンを開発する必要がある。

本発明の目的では、アミノ酸は完全な名称で記述されるか、または、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）の特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の一覧表示に関するＳＴ．２５標準でも用いられる、ＩＵＰＡＣ命名法の３文字の記号を用いて表される。したがって、例えば、アミノ酸アラニンは、記号「Ａｌａ」で表され、アミノ酸アスパラギン酸は、「Ａｓｐ」で表される。

本発明の目的では、ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子の対応するヌクレオチド配列によって記載される。当該技術分野では、チミンヌクレオチドをウラシルヌクレオチドで置き換えることによって行われる、対応するＤＮＡ配列からＲＮＡ配列を判定する方法が知られている。

本発明の目的では、「感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）」は、媒介物（例えば、ウイルス）と感染標的（例えば、細胞）との比をいう。例として、ウイルス粒子が接種された細胞群に言及する場合、感染多重度すなわちＭＯＩは、存在するウイルス粒子の数と標的細胞の数との比である。

本発明の目的では、用語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着測定法を指し、この測定法は、基質上で酵素作用によって生じる色の変化またはいくつかの他の変化によって基質から検出可能な生成物を生成することができる酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）に結合した抗体により、固定された抗原が検出される免疫測定技法である。この技法では、抗原を認識した後、酵素に結合した二次抗体によって認識される一次抗体が存在する場合がある。抗原は、分光測色法によって測定される色の変化によって、試料中で間接的に検出することができる。

本発明の目的では、免疫学の観点で、「抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」は、感染媒介物、例えば、ウイルスへの曝露に対する動物の反応を試験するために、感染媒介物に動物を故意に曝露させることをいう。抗原投与に用いられる量は、「抗原投与量」と呼ばれる。

本発明の目的では、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）末端の迅速な増幅を行う技法をいう。ＲＡＣＥは、分子生物学において、ＲＮＡ分子の全長配列を得るために用いられる技法であり、ＲＡＣＥでは、関心対象のＲＮＡ配列のｃＤＮＡ複製が逆転写によって産生され、続いてｃＤＮＡ複製のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅が行われる。

本発明の目的では、「ＡＮＯＶＡ」または「分散分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）」は、統計試料内の平均値間の差を分析するのに用いられる一組の統計モデルである。ＡＮＯＶＡは、特定の変数に観察される分散が、異なる変動源に起因するコンポーネントに分けられる、全分散の法則に基づく。ＡＮＯＶＡは、２つ以上の母平均が同じであるかどうかを判定するための統計検定を提供する。

本発明は、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）の弱毒化変異体を提供し、
当該変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされたＲｄＲｐタンパク質では、
９２４位のアミノ酸はセリン（Ｌ［Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ］）であり、
１３０３位のアミノ酸はトレオニン（Ｌ［Ａｌａ１３０３Ｔｈｒ］）であり、
ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４７の配列、またはＲＶＦウイルスの野生型株ＺＨ５４８の配列番号５４の配列は、上記タンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列であり、
上記変異体のＲＮＡのＳセグメントによってコードされたＮＳタンパク質では、
８２位のアミノ酸はロイシン（ＮＳｓ［Ｐｒｏ８２Ｌｅｕ］）であり、
ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４９の配列、またはＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５６の配列は、上記タンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列である。

さらに、本発明のＲＶＦＶの変異体の一実施形態において、
当該変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされたＲｄＲｐタンパク質では、
１００位のアミノ酸はトレオニン（Ｌ［Ｍｅｔ１００Ｔｈｒ］）であり、
３７５位のアミノ酸はチロシン（Ｌ［Ｈｉｓ３７５Ｔｙｒ］）であり、
１０５０位のアミノ酸はバリン（Ｌ［Ｉｌｅ１０５０Ｖａｌ］）であり、
１６２９位のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｌ［Ｌｅｕ１６２９Ｐｈｅ］）であり、
２０７１位のアミノ酸はリシン（Ｌ［Ｇｌｕ２０７１Ｌｙｓ］）であり、
ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４７の配列、またはＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５４の配列は、上記タンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列であり、
上記変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされたアミノ酸配列では、
２６位のアミノ酸はリシン（Ｍ［Ａｒｇ２６Ｌｙｓ］）であり、
１０８位のアミノ酸はチロシン（Ｍ［Ｈｉｓ１０８Ｔｙｒ］）であり、
１１８位のアミノ酸はリシン（Ｍ［Ｇｌｕ１１８Ｌｙｓ］）であり、
２１０位のアミノ酸はリシン（Ｍ［Ａｒｇ２１０Ｌｙｓ］）であり、
３３３位のアミノ酸はアスパラギン（Ｍ［Ａｓｐ３３３Ａｓｎ］）であり、
４２７位のアミノ酸はトレオニン（Ｍ［Ａｌａ４２７Ｔｈｒ］）であり、
４３２位のアミノ酸はバリン（Ｍ［Ａｌａ４３２Ｖａｌ］）であり、
４８７位のアミノ酸はグリシン（Ｍ［Ｇｌｕ４８７Ｇｌｙ］）であり、
５４０位のアミノ酸はチロシン（Ｍ［Ｈｉｓ５４０Ｔｙｒ］）であり、
５８２位のアミノ酸はトレオニン（Ｍ［Ａｌａ５８２Ｔｈｒ］）であり、
５８７位のアミノ酸はイソロイシン（Ｍ［Ｖａｌ５８７Ｉｌｅ］）であり、
９５０位のアミノ酸はバリン（Ｍ［Ａｌａ９５０Ｖａｌ］）であり、
１０９０位のアミノ酸はイソロイシン（Ｍ［Ｖａｌ１０９０Ｉｌｅ］）であり、
１１１６位のアミノ酸はバリン（Ｍ［Ａｌａ１１１６Ｖａｌ］）であり、
１１８２位のアミノ酸はリシン（Ｍ［Ａｒｇ１１８２Ｌｙｓ］）であり、
ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４８の配列、またはＲＶＦウイルスの野生株ＺＨ５４８の配列番号５５の配列は、上記変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされたアミノ酸配列のアミノ酸ナンバリングのための参照配列であり、
上記変異体のＲＮＡのＳセグメントによってコードされたＮＳタンパク質では、
５２位のアミノ酸はイソロイシン（ＮＳｓ［Ｖａｌ５２Ｉｌｅ］）であり、
ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４９の配列、またはＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５６の配列は、上記タンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列である。

弱毒化変異体リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）の一実施形態において、
当該変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされたアミノ酸配列では、
１００位のアミノ酸はトレオニンであり、
３７５位のアミノ酸はチロシンであり、
９２４位のアミノ酸はセリンであり、
１０５０位のアミノ酸はバリンであり、
１３０３位のアミノ酸はトレオニンであり、
１６２９位のアミノ酸はフェニルアラニンであり、
２０７１位のアミノ酸はリシンであり、
上記変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされたアミノ酸配列では、
２６位のアミノ酸はリシンであり、
１０８位のアミノ酸はチロシンであり、
１１８位のアミノ酸はリシンであり、
２１０位のアミノ酸はリシンであり、
３３３位のアミノ酸はアスパラギンであり、
４２７位のアミノ酸はトレオニンであり、
４３２位のアミノ酸はバリンであり、
４８７位のアミノ酸はグリシンであり、
５４０位のアミノ酸はチロシンであり、
５８２位のアミノ酸はトレオニンであり、
５８７位のアミノ酸はイソロイシンであり、
９５０位のアミノ酸はバリンであり、
１０９０位のアミノ酸はイソロイシンであり、
１１１６位のアミノ酸はバリンであり、
１１８２位のアミノ酸はリシンであり、
上記変異体のＲＮＡのＳセグメントによってコードされたアミノ酸配列では、
５２位のアミノ酸はイソロイシンであり、
８２位のアミノ酸はロイシンであり、
上記アミノ酸は、ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列のアミノ酸置換に対応する。

本発明のＲＶＦＶ変異体の一実施形態では、上記変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされたアミノ酸配列は配列番号４であり、上記変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされたアミノ酸配列は配列番号５であり、ＮＳｓタンパク質は配列番号６の配列からなり、Ｎタンパク質は配列番号７の配列からなる。

本開示において、ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４のＲＮＡのＬセグメントによってコードされたアミノ酸配列は配列番号４７であり、ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４のＲＮＡのＭセグメントによってコードされたアミノ酸配列は配列番号４８であり、ＲＶＦウイルスの野生型５６／７４株のＮＳタンパク質は、配列番号４９の配列からなり、ＲＶＦウイルスの野生型株５６／７４のＮタンパク質は、配列番号５０の配列からなる。

本開示において、ＲＶＦウイルスの野生株ＺＨ５４８のＲＮＡのＬセグメントによってコードされたアミノ酸配列は配列番号５４であり、ＲＶＦウイルスのＺＨ５４８野生株のＲＮＡのＭセグメントによってコードされたアミノ酸配列は配列番号５５であり、ＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株のＮＳｓタンパク質は、配列番号５６の配列からなり、ＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株のＮタンパク質は、配列番号５７の配列からなる。

上記変異体をコードするＲＮＡを含む、本発明のＲＶＦＶ変異体の一実施形態において、上記ＲＮＡのＬセグメントは配列番号１の配列からなり、上記ＲＮＡのＭセグメントは配列番号２の配列からなり、上記ＲＮＡのＳセグメントは配列番号３の配列からなる。

本開示において、ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４は、上記野生株をコードするＲＮＡを含み、上記ＲＮＡのＬセグメントは配列番号４４の配列からなり、上記ＲＮＡのＭセグメントは配列番号４５の配列からなり、上記ＲＮＡのＳセグメントは配列番号４６の配列からなる。

本開示において、ＲＶＦウイルスの野生型株ＺＨ５４８は、上記野生型株をコードするＲＮＡを含み、上記ＲＮＡのＬセグメントは配列番号５１の配列からなり、上記ＲＮＡのＭセグメントは配列番号５２の配列からなり、上記ＲＮＡのＳセグメントは配列番号５３の配列からなる。

本発明は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容される、または動物用の賦形剤と共に、本発明のＲＶＦＶ変異体を含む医薬組成物または動物用組成物を提供する。

本発明は、さらに、薬剤として使用するための本発明のＲＶＦＶ変異体を提供する。

一実施形態において、本発明は、薬剤の製造ための本発明のＲＶＦＶ変異体の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、本発明のＲＶＦＶの弱毒化変異体の有効量の動物への投与を含む、リフトバレー熱の予防のための治療方法を提供する。好ましくは、上記動物はヒトまたは反芻動物である。

本発明の目的のために、「有効量」は、有資格観察者によって認識され、動物の状態における客観的に確認可能な改善を提供し、上記動物が上記量のＲＶＦＶ変異体を含む医薬組成物を用いて治療される、本発明のＲＶＦＶ変異体の量を指す。

加えて、本発明は、リフトバレー熱の予防において使用するための本発明のＲＶＦＶ変異体を提供する。

一実施形態において、本発明は、リフトバレー熱の予防のための薬剤の製造のための本発明のＲＶＦＶ変異体の使用を提供する。好ましくは、上記薬剤はワクチンである。

一実施形態において、本発明のＲＶＦＶ変異体は動物用である。

本発明の使用のためのＲＶＦＶの変異体の好ましい実施形態において、上記動物は反芻動物である。好ましくは、上記反芻動物は、牛、ヒツジ、ヤギ、ラクダおよび水牛から選択される。

本発明のＲＶＦＶ変異体は、反芻家畜および野生の反芻動物用である。野生の反芻動物において使用するにあたって、本発明のＲＶＦＶ変異体は、指定保護区、動物園等の野生動物におけるＲＶＦの予防に役立つ。実際に、アフリカ水牛は、ウイルスの媒介体である可能性があると疑われる。

したがって、本発明の使用のためのＲＶＦＶの変異体の一実施形態において、そのような反芻動物は反芻家畜または野生の反芻動物である。

好ましい実施形態において、上記反芻家畜は、牛、ヒツジ、ヤギおよびラクダから選択される。

別の好ましい実施形態において、上記野生の反芻動物は水牛である。

別の好ましい実施形態において、本発明のＲＶＦＶ変異体はヒト用である。

本発明は、さらに、本発明のＲＶＦＶ変異体を含むリフトバレー熱ワクチンを提供する。

好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、少なくとも１つの薬学的に許容される、または動物用の賦形剤を含む。

本発明の目的のために、これらに限定されないが、バッファー、共溶媒、界面活性剤、油、保水剤、皮膚軟化剤、防腐剤、安定化剤、酸化防止剤、染料、空気および／または湿気プロテクター、ならび結合剤などの不活性成分は、薬学的に許容される、または動物用の賦形剤である。バッファーの一例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

一実施形態において、上記医薬組成物または動物用組成物はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。

本発明の医薬組成物、動物用組成物、またはワクチンは、薬学的または獣医学的な慣例における従来技術にしたがって、薬学的に許容される、または動物用の賦形剤と同様に、任意の他の種類の薬学的に許容される、または動物用の担体または希釈剤を用いて製剤化することができる。

本発明の医薬組成物、動物用組成物、またはワクチンは、単回または複数回用量において投与することができる。

本発明の医薬組成物、動物用組成物、またはワクチンは、任意の投与経路によって投与されることができ、上記組成物は選ばれた投与経路に適した剤型において製剤化される。投与経路の例は、これらに限定されないが、皮下投与、静脈内投与、および筋肉内投与を含む。

本明細書は、さらに、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３から選択される配列のうちのいずれかに少なくとも８０％同一である核酸を含むＲＶＦウイルスＲＮＡの遺伝子領域の増幅のためのプライマーを提供する。

好ましい開示において、上記配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％から選択される。

より好ましい開示において、本発明の上記プライマーは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３から選択される配列からなる核酸からなる。

本発明のそのようなプライマーの一開示において、上記ＲＮＡは、本発明のＲＶＦＶ変異体、またはＲＶＦＶの野生株５６／７４由来である。

哺乳動物細胞および昆虫細胞における成長速度。ベロ（Ａ）細胞およびＣ６／３６蚊細胞（Ｂ）は、０．０１または０．００５の感染多重度（ＭＯＩ）で、８つのパス後（白丸）およびそのようなパスの前に（黒丸）、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（四角）、親ＲＶＦウイルス５６／７４のそれぞれに感染させた。ｈｐｉは感染後の時間を表し、ｄｐｉは感染後の日数を表す。吸着の１時間後、接種材料は取り除かれ、細胞は洗浄され、新たな培地が加えられた。上清は、感染後（ｐｉ）の異なる時点で収集され、半個体培地を用いる標準プレート測定によってベロ細胞単層において測定された。単層は、感染後４日目に、固定され、染色された。測定は少なくとも２回行われた。アスタリスクによって表される平均値と標準偏差との合計は、ｐ＜０．０５（複数回のｔ－検定）である。示されるデータは、代表的実験に対応する。図１Ｃ。８つのパスの後（中央）、上記パスの前（左）の、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（右）を伴う、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４を有するベロ細胞単層における示されるウイルスのプレートの表現型。感染は半個体培地において行われた。単層を、感染後４日目に、固定し、染色した。 哺乳動物細胞および昆虫細胞における成長速度。ベロ（Ａ）細胞およびＣ６／３６蚊細胞（Ｂ）は、０．０１または０．００５の感染多重度（ＭＯＩ）で、８つのパス後（白丸）およびそのようなパスの前に（黒丸）、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（四角）、親ＲＶＦウイルス５６／７４のそれぞれに感染させた。ｈｐｉは感染後の時間を表し、ｄｐｉは感染後の日数を表す。吸着の１時間後、接種材料は取り除かれ、細胞は洗浄され、新たな培地が加えられた。上清は、感染後（ｐｉ）の異なる時点で収集され、半個体培地を用いる標準プレート測定によってベロ細胞単層において測定された。単層は、感染後４日目に、固定され、染色された。測定は少なくとも２回行われた。アスタリスクによって表される平均値と標準偏差との合計は、ｐ＜０．０５（複数回のｔ－検定）である。示されるデータは、代表的実験に対応する。図１Ｃ。８つのパスの後（中央）、上記パスの前（左）の、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（右）を伴う、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４を有するベロ細胞単層における示されるウイルスのプレートの表現型。感染は半個体培地において行われた。単層を、感染後４日目に、固定し、染色した。 哺乳動物細胞および昆虫細胞における成長速度。ベロ（Ａ）細胞およびＣ６／３６蚊細胞（Ｂ）は、０．０１または０．００５の感染多重度（ＭＯＩ）で、８つのパス後（白丸）およびそのようなパスの前に（黒丸）、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（四角）、親ＲＶＦウイルス５６／７４のそれぞれに感染させた。ｈｐｉは感染後の時間を表し、ｄｐｉは感染後の日数を表す。吸着の１時間後、接種材料は取り除かれ、細胞は洗浄され、新たな培地が加えられた。上清は、感染後（ｐｉ）の異なる時点で収集され、半個体培地を用いる標準プレート測定によってベロ細胞単層において測定された。単層は、感染後４日目に、固定され、染色された。測定は少なくとも２回行われた。アスタリスクによって表される平均値と標準偏差との合計は、ｐ＜０．０５（複数回のｔ－検定）である。示されるデータは、代表的実験に対応する。図１Ｃ。８つのパスの後（中央）、上記パスの前（左）の、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（右）を伴う、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４を有するベロ細胞単層における示されるウイルスのプレートの表現型。感染は半個体培地において行われた。単層を、感染後４日目に、固定し、染色した。 Ａ１２９マウス（ＩＦＮＡＲ－／－）におけるＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの生体内感染力分析。５から６ヶ月齢の雄マウスは、８つのパスの後（５６／７４ ｐ８）およびそのようなパスの前（５６／７４）に、示される量のＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス、親ＲＶＦウイルス５６／７４を接種された。動物は、１４日間、毎日モニタリングされた。異なる量が抗原投与されたマウスにおける生存率（Ａ）および体重変化（Ｂ）。Ｃ．間接的ＥＬＩＳＡ測定による核タンパク質特異的抗体の検出１、対照試料、２、試料５６／７４ １０^２、３、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^２、４、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^３、５、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^４。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 Ａ１２９マウス（ＩＦＮＡＲ－／－）におけるＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの生体内感染力分析。５から６ヶ月齢の雄マウスは、８つのパスの後（５６／７４ ｐ８）およびそのようなパスの前（５６／７４）に、示される量のＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス、親ＲＶＦウイルス５６／７４を接種された。動物は、１４日間、毎日モニタリングされた。異なる量が抗原投与されたマウスにおける生存率（Ａ）および体重変化（Ｂ）。Ｃ．間接的ＥＬＩＳＡ測定による核タンパク質特異的抗体の検出１、対照試料、２、試料５６／７４ １０^２、３、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^２、４、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^３、５、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^４。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 Ａ１２９マウス（ＩＦＮＡＲ－／－）におけるＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの生体内感染力分析。５から６ヶ月齢の雄マウスは、８つのパスの後（５６／７４ ｐ８）およびそのようなパスの前（５６／７４）に、示される量のＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス、親ＲＶＦウイルス５６／７４を接種された。動物は、１４日間、毎日モニタリングされた。異なる量が抗原投与されたマウスにおける生存率（Ａ）および体重変化（Ｂ）。Ｃ．間接的ＥＬＩＳＡ測定による核タンパク質特異的抗体の検出１、対照試料、２、試料５６／７４ １０^２、３、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^２、４、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^３、５、試料ＦＭＨ－Ｐ８ １０^４。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを接種したＡ１２９マウス（ＩＦＮＡＲ－／－）の生存率と、ＭＰ－１２ＲＶＦウイルス（Ｉｋｅｇａｍｉら、２０１５）を接種したＡ１２９マウスの生存率との比較。ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを用量１０^３ｐｆｕ（三角）および１０^４ｐｆｕ（四角）で、ＭＰ－１２ＲＶＦウイルス（用量１０^４ｐｆｕ、丸）をマウスに接種した。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 ＲＶＦウイルス５６／７４を用いた致死的な抗原投与に対するＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ウイルスの免疫原性および効能の分析。１０^４ｐｆｕ ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを、野生の１１ヶ月齢の１２９Ｓｖ／Ｅｖマウス（ｎ＝９）に腹腔内接種した。対照のマウス群に接種した（ｎ＝４）。Ａ．マイクロ中和試験。血清試料は、２４日目に採取され（前抗原投与試料）、抗体の中和に関して測定された。血清は、１／１０から１／１２８０のベースにおける希釈において分析された。力価は、ウェルの５０％における細胞変性効果（ＣＰＥ）の減少をもたらす血清の最終的な希釈として表される。検定される第１の希釈、１／１０（切断）、１／５として任意に表される「ｎｅｇ」試料（分析される第１の希釈における全ウェルにおけるＣＰＥ）。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照マウス接種が行われた試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料。Ｂ．ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶ（四角）を用いた抗原投与における１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスおよび対照マウス接種（丸）の生存。Ｃ．ワクチン接種をしたマウスにおける接触後の罹患率。Ｄ、ＳおよびＨは、各マウスの臨床状態（Ｄは死亡、Ｓは病気、Ｈは健康）を表す。下パネルＣ、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを用いた抗原投与におけるマウス、上パネルＣ、対照マウス接種。Ｄ．ＥＬＩＳＡによる抗核タンパク質抗体の検出。「ｎｅｇ」試料（前免疫血清群）を除く、個々の動物に対応する各記号。力価は、０．２５０（平均として０．０７の示度を与える対照「ｎｅｇ」試料、空白ウェルは０．０４を意味する）よりも大きな光学濃度（ＯＤ）を提供する血清の最終的な希釈のｌｏｇ１０として表される。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照群試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料、４、抗原投与後のＦＭＨ－Ｐ８試料。血清を、１／５０から１／１０９３５０のベース３における希釈において分析した。分析される第１の希釈、１／５０（力価１．７（カットオフ値）、試料「ｎｅｇ」１／２５（ｌｏｇ１．４））。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 ＲＶＦウイルス５６／７４を用いた致死的な抗原投与に対するＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ウイルスの免疫原性および効能の分析。１０^４ｐｆｕ ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを、野生の１１ヶ月齢の１２９Ｓｖ／Ｅｖマウス（ｎ＝９）に腹腔内接種した。対照のマウス群に接種した（ｎ＝４）。Ａ．マイクロ中和試験。血清試料は、２４日目に採取され（前抗原投与試料）、抗体の中和に関して測定された。血清は、１／１０から１／１２８０のベースにおける希釈において分析された。力価は、ウェルの５０％における細胞変性効果（ＣＰＥ）の減少をもたらす血清の最終的な希釈として表される。検定される第１の希釈、１／１０（切断）、１／５として任意に表される「ｎｅｇ」試料（分析される第１の希釈における全ウェルにおけるＣＰＥ）。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照マウス接種が行われた試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料。Ｂ．ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶ（四角）を用いた抗原投与における１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスおよび対照マウス接種（丸）の生存。Ｃ．ワクチン接種をしたマウスにおける接触後の罹患率。Ｄ、ＳおよびＨは、各マウスの臨床状態（Ｄは死亡、Ｓは病気、Ｈは健康）を表す。下パネルＣ、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを用いた抗原投与におけるマウス、上パネルＣ、対照マウス接種。Ｄ．ＥＬＩＳＡによる抗核タンパク質抗体の検出。「ｎｅｇ」試料（前免疫血清群）を除く、個々の動物に対応する各記号。力価は、０．２５０（平均として０．０７の示度を与える対照「ｎｅｇ」試料、空白ウェルは０．０４を意味する）よりも大きな光学濃度（ＯＤ）を提供する血清の最終的な希釈のｌｏｇ１０として表される。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照群試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料、４、抗原投与後のＦＭＨ－Ｐ８試料。血清を、１／５０から１／１０９３５０のベース３における希釈において分析した。分析される第１の希釈、１／５０（力価１．７（カットオフ値）、試料「ｎｅｇ」１／２５（ｌｏｇ１．４））。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 ＲＶＦウイルス５６／７４を用いた致死的な抗原投与に対するＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ウイルスの免疫原性および効能の分析。１０^４ｐｆｕ ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを、野生の１１ヶ月齢の１２９Ｓｖ／Ｅｖマウス（ｎ＝９）に腹腔内接種した。対照のマウス群に接種した（ｎ＝４）。Ａ．マイクロ中和試験。血清試料は、２４日目に採取され（前抗原投与試料）、抗体の中和に関して測定された。血清は、１／１０から１／１２８０のベースにおける希釈において分析された。力価は、ウェルの５０％における細胞変性効果（ＣＰＥ）の減少をもたらす血清の最終的な希釈として表される。検定される第１の希釈、１／１０（切断）、１／５として任意に表される「ｎｅｇ」試料（分析される第１の希釈における全ウェルにおけるＣＰＥ）。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照マウス接種が行われた試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料。Ｂ．ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶ（四角）を用いた抗原投与における１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスおよび対照マウス接種（丸）の生存。Ｃ．ワクチン接種をしたマウスにおける接触後の罹患率。Ｄ、ＳおよびＨは、各マウスの臨床状態（Ｄは死亡、Ｓは病気、Ｈは健康）を表す。下パネルＣ、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを用いた抗原投与におけるマウス、上パネルＣ、対照マウス接種。Ｄ．ＥＬＩＳＡによる抗核タンパク質抗体の検出。「ｎｅｇ」試料（前免疫血清群）を除く、個々の動物に対応する各記号。力価は、０．２５０（平均として０．０７の示度を与える対照「ｎｅｇ」試料、空白ウェルは０．０４を意味する）よりも大きな光学濃度（ＯＤ）を提供する血清の最終的な希釈のｌｏｇ１０として表される。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照群試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料、４、抗原投与後のＦＭＨ－Ｐ８試料。血清を、１／５０から１／１０９３５０のベース３における希釈において分析した。分析される第１の希釈、１／５０（力価１．７（カットオフ値）、試料「ｎｅｇ」１／２５（ｌｏｇ１．４））。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 ＲＶＦウイルス５６／７４を用いた致死的な抗原投与に対するＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ウイルスの免疫原性および効能の分析。１０^４ｐｆｕ ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを、野生の１１ヶ月齢の１２９Ｓｖ／Ｅｖマウス（ｎ＝９）に腹腔内接種した。対照のマウス群に接種した（ｎ＝４）。Ａ．マイクロ中和試験。血清試料は、２４日目に採取され（前抗原投与試料）、抗体の中和に関して測定された。血清は、１／１０から１／１２８０のベースにおける希釈において分析された。力価は、ウェルの５０％における細胞変性効果（ＣＰＥ）の減少をもたらす血清の最終的な希釈として表される。検定される第１の希釈、１／１０（切断）、１／５として任意に表される「ｎｅｇ」試料（分析される第１の希釈における全ウェルにおけるＣＰＥ）。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照マウス接種が行われた試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料。Ｂ．ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶ（四角）を用いた抗原投与における１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスおよび対照マウス接種（丸）の生存。Ｃ．ワクチン接種をしたマウスにおける接触後の罹患率。Ｄ、ＳおよびＨは、各マウスの臨床状態（Ｄは死亡、Ｓは病気、Ｈは健康）を表す。下パネルＣ、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶを用いた抗原投与におけるマウス、上パネルＣ、対照マウス接種。Ｄ．ＥＬＩＳＡによる抗核タンパク質抗体の検出。「ｎｅｇ」試料（前免疫血清群）を除く、個々の動物に対応する各記号。力価は、０．２５０（平均として０．０７の示度を与える対照「ｎｅｇ」試料、空白ウェルは０．０４を意味する）よりも大きな光学濃度（ＯＤ）を提供する血清の最終的な希釈のｌｏｇ１０として表される。１、「ｎｅｇ」試料、２、対照群試料、３、ＦＭＨ－Ｐ８試料、４、抗原投与後のＦＭＨ－Ｐ８試料。血清を、１／５０から１／１０９３５０のベース３における希釈において分析した。分析される第１の希釈、１／５０（力価１．７（カットオフ値）、試料「ｎｅｇ」１／２５（ｌｏｇ１．４））。ｄｐｉは、感染後の日数を表す。 ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスおよび親ウイルス５６／７４を接種したヒツジにおける臨床徴候。直腸温度（Ａ）、肝酵素（Ｂ）および抗体産生の中和（Ｃ）を、１０^７ｐｆｕの、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（四角、ｎ＝２）および親ＲＶＦウイルス５６／７４（丸、ｎ＝３）を接種したヒツジにおいて比較する。 ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスおよび親ウイルス５６／７４を接種したヒツジにおける臨床徴候。直腸温度（Ａ）、肝酵素（Ｂ）および抗体産生の中和（Ｃ）を、１０^７ｐｆｕの、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（四角、ｎ＝２）および親ＲＶＦウイルス５６／７４（丸、ｎ＝３）を接種したヒツジにおいて比較する。 ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスおよび親ウイルス５６／７４を接種したヒツジにおける臨床徴候。直腸温度（Ａ）、肝酵素（Ｂ）および抗体産生の中和（Ｃ）を、１０^７ｐｆｕの、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルス（四角、ｎ＝２）および親ＲＶＦウイルス５６／７４（丸、ｎ＝３）を接種したヒツジにおいて比較する。

材料および方法
細胞、ウイルスおよび感染
ベロ細胞（ＡＴＣＣ番号カタログＣＣＬ－８１）を、３７℃で、５％の二酸化炭素の多湿大気下において、５％から１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＬ－グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において育成した。ヒトスジシマカＣ６／３６（ＡＴＣＣ番号カタログＣＲＬ１６６０）を、２８℃で、５％の二酸化炭素の多湿大気下において、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびビタミンＭＥＭ溶液（シグマ）を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）において育成した。

ＶＲＶＲ５６／７４ウイルス（親ウイルス）（Ｂｏｒｒｅｇｏら、２０１９）（Ｂｕｓｑｕｅｔら、２０１０）の野生株５６／７４単離株に実験的に感染したヒツジに由来する出発親ウイルス。上記ウイルスを、感染したヒツジの血漿から再単離し、Ｃ６／３６蚊細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６６０）において培養した。プレート形成単位（ｐｆｕ）を定量するための測定は、１％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、シグマ）を含む半固体培地において行われた。ｐｆｕ単位は、単位体積ごとに、プレートを形成することができるウイルス粒子の数を記載するために、ウイルス学において用いられる。検出可能、または標的細胞に感染し損ねたウイルス粒子は、プラークを形成せず、上記ウイルス粒子に含まれない。

ＲＮＡ抽出、ＲＴ－ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定
ＲＮＡを、製造者の指示にしたがって、スピードツール（Ｓｐｅｅｄ ｔｏｏｌｓ）ＲＮＡウイルス抽出キット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ株式会社、マドリード、スペイン）を用いて、感染細胞の上清から抽出した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、製造者が指示するように、ウイルス遺伝子のＬセグメント（表１Ａ）、Ｍセグメント（表１Ｂ）、およびＳセグメント（表１Ｃ）を増幅するように設計されたプライマーを用いて、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ）ＩＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｈｕｓｉｏｎ高正確性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて行われた。表１Ｄは、ＲＡＣＥ技術による遺伝子末端の増幅のために用いられるプライマーを示す。オーバーラップＰＣＲアンプリコンを、精製し、自動サンガー配列決定を行った。結果の分析のために、Ｌａｓｅｒ Ｇｅｎｅソフトウェアを使用した。

マウスを用いた実験
５～６ヶ月齢のトランスジェニック１２９Ｓｖ／Ｅｖ ＩＦＮＡＲ^－／－マウス、または１１ヶ月齢の野生型１２９Ｓｖ／Ｅｖマウス（Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）の群において、対応する実施例において示されるように、異なる用量のウイルスを腹腔内接種した。ウイルス接種の後、動物を、体重、ならびに、表皮上の徴候、猫背の姿勢、活動の減少、および結膜炎を含む臨床徴候の発現に関して、毎日モニタリングした。示された時間に、顎静脈を介して、動物の採血を行った。血清を、５６℃の熱で３０分間不活性化し、使用するまで－２０℃で保持した。すべてのマウスを、食料と水が随意に提供されるＢＳＬ－３格納エリアに入れた。すべての実験手順を、動物実験に関するＥＵ司令２０１０／６３／ＥＵのガイドライン、ならびにＩＮＩＡの動物実験に関するバイオセーフティおよび倫理委員会によって承認されたプロトコル（ＥＡＥＣ 許可コード ２０１２／０１４およびＣＢＳ ２０１２／０１７）にしたがって管理した。

ヒツジを用いた実験
２頭の雌ヒツジに、１０^７ｐｆｕの用量のＦＭＨ－Ｐ８を接種し、ウイルス５６／７４を接種した３頭の追加の雌ヒツジ（対照群）と比較した。各群の１頭のヒツジを、感染後４日目に、感染によって生じる肝損傷の程度を分析するために屠殺した。抗原投与後、直腸温度を毎日計測し、血液および血清の試料を少なくとも８日間連続で毎日採取した。得られた上記血液および血清の試料を、肝トランスアミナーゼのレベルの定量を実施するために使用し、同様に、抗体を中和するためのインビトロ試験において使用した。

抗体測定
中和試験は、ＯＩＥ（ＯＩＥ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ｍａｎｕａｌ ２０１２、第２．１．１４章）によって規定される試験に続いて、９６－ウェル培養プレート上で行われた。手短に述べると、血清は、２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において、最初の１／１０希釈から、ベース２において希釈され、１００のＴＣＩＤ_５０（５０％感染組織培養用量）を含む感染性ウイルスの同量と混合され、３７℃で３０分インキュベートされた。
その後、ベロ細胞の懸濁液を加え、上記プレートを４日間インキュベートした。
単層を、細胞変性効果の発現のために照査し、固定し、染色した。
各試料を、４つのウェルにおいて試験した。
力価は、上記ウェルの５０％において細胞変性効果の低下をもたらす血清の最終的な希釈として表される。

核タンパク質（Ｎタンパク質）に対する抗体の検出のために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートに、大腸菌において産生され、精製され、重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で希釈された１００ｎｇ／ウェルの遺伝子組み換えＮタンパク質を吸着した。５％の脱脂牛乳－ＰＢＳ－０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いたブロッキングの後、血清を、１／５０で開始されるベース３における連続希釈における二つ組において分析した。結合抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、マウス－ＨＲＰ抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＢｉｏＲａｄ）にコンジュゲートしたヤギ抗体を用いて検出し、結合コンジュゲートを、３、３’、５、５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０分間検出し、続いて、停止液（３Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を検出した。４５０ｎｍ（ＯＤ_４５０）で光学濃度を測定した。

統計分析
データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムバージョン６ソフトウェアを用いて行われた。

ＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスの採取
親ウイルス単離体ＲＶＦＶ５６／７４は、４０μｍファビピラビルの存在下で、ベロ細胞における連続した継代を受けた。培養上清のウイルス滴定は、子ウイルスの産生が次第に減少したことを示し、工程５、６、および７において検出できなかった。しかし、工程８および９において、感染力は通常のウイルス力価にまで回復し、これは、ＦＭＨ－Ｐ８（「Ｆａｖｉｐｉｒａｖｉｒ－Ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ Ｈｙｐｅｒａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｐａｓｓａｇｅ ８」から）と呼称されるファビピラビルに対する抵抗性ウイルスの生成を示した。ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスの上記ウイルス産生は、異なる濃度のファビピラビルの存在下で分析され、濃度８０μＭのファビピラビルでのウイルス産生における５０％の減少を得た。これらの結果は、ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスが、親ウイルスと比較して、ファビピラビルに対してより抵抗性が高いことを示した。

ＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスにおける遺伝子的な変化
オーバーラップＲＴ－ＰＣＲ反応は、実施例１において得られた本発明の弱毒化ＲＶＦウイルス、ＦＭＨ－Ｐ８の感染上清から抽出されたＲＮＡから行われた。アンプリコンは、これらの反応において産生され、ウイルス遺伝子の３つのセグメントのすべてをカバーした。自動配列決定（サンガー配列決定）によってこれらのアンプリコンの配列決定を進めた。推定されるアミノ酸配列をアラインメントさせ、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４の配列と比較した。本発明のＦＭＨ－Ｐ８の弱毒化ＲＶＦウイルス、および親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４の配列の説明は、表２において示される。

本発明のＦＭＨ－Ｐ８の弱毒化ＲＶＦウイルスの配列と親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４の配列とを比較すると、２４のアミノ酸変化を生じる、合計で４７のヌクレオチド変化が見られた。より具体的には、ウイルスポリメラーゼをコードするＬセグメント、ファビピラビルの標的において、７つのアミノ酸変化を伴う、１７のヌクレオチド変化が確認された。３つの上記遺伝子セグメントにおいて見られたすべての変化の分布は、表３において示される。

Ｓセグメントにおいて見られたヌクレオチド変化は、ＮＳｓタンパク質、Ｖａｌ５２ＩｌｅとＰｒｏ８２Ｌｅｕの両方における、たった２つのアミノ酸置換しかもたらさなかった。Ｐｒｏ８２は、上記ＮＳｓタンパク質の核局在化およびインターフェロン－β（ＩＦＮ－β）の活性化に関連する第２のＰｒｏ－Ｘ－Ｘ－Ｐｒｏモチーフに属する。Ｎ核タンパク質は、２つの（サイレント）ヌクレオチド置換のみを伴って、親ウイルスのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示した唯一のＦＭＨ－Ｐ８ウイルスタンパク質であった。

ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスのＭセグメントに対応する配列において、ＮＳｍタンパク質において３つ（Ａｒｇ２６Ｌｙｓ、Ｈｉｓ１０８Ｔｙｒ、Ｇｌｕ１１８Ｌｙｓ）、Ｇｎタンパク質において８つ（Ａｒｇ２１０Ｌｙｓ－ｍｉｘ－、Ａｓｐ３３３Ａｓｎ、Ａｌａ４２７Ｔｈｒ、Ａｌａ４３２Ｖａｌ、Ｇｌｕ４８７Ｇｌｙ、Ｈｉｓ５４０Ｌｙｓ、Ａｌａ５８２Ｔｈｒ、Ｖａｌ５８７Ｉｌｅ）、ならびにＧｃタンパク質において４つ（Ａｌａ９５０Ｖａｌ、Ｖａｌ１０９０Ｉｌｅ、Ａｌａ１１１６ＶａｌおよびＡｒｇ１１８２Ｌｙｓ）、合計で１５のアミノ酸置換が同定された。Ｇｃにおける上記Ａｒｇ１１８２Ｇｌｙ変化は、ＭＰ－１２ウイルス（Ｉｋｅｇａｍｉら、２０１５）の弱毒化マーカとして同定された。

７つのアミノ酸置換が、ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスＬタンパク質において同定され、配列全体を通して分布していた。２つの変化は上記Ｌタンパク質のＮ末端領域（Ｍｅｔ１００ＴｈｒおよびＨｉｓ３７５Ｔｙｒ）に位置し、２つ（Ｌｅｕ１６２９ＰｈｅおよびＧｌｕ２０７１Ｌｙｓ）がＣ末端領域、残り３つの置換（Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１０５０ＶａｌおよびＡｌａ１３０３Ｔｈｒ）が上記タンパク質の中心領域に位置する。９２４位および１０５０位は、ＲｄＲｐコア内に位置し、ここで保存された触媒モチーフＡからＨまでが存在している。

ウイルスＲＮＡポリメラーゼはファビピラビルの標的として知られているため、ＲｄＲｐの触媒核内に位置するＦＭＨ－Ｐ８ウイルスの変異残基の保存レベルを評価した。ＲＶＦＶの６０の異なる株に対応するＬ－タンパク質配列が比較され、フレボウイルス属に属するいくつかのウイルス種もまた含まれている（表４）。残基Ｇｌｙ９２４およびＡｌａ１３０３は、アラインメントにおいて含まれるすべてのウイルスにおいて、極めて保存されていることが分かった。１０５０）は、保存性、主にイソロイシン（親ウイルス５６／７４など）またはバリン（弱毒化ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶなど）のみを示したが、一方で、他の置換位置は、ＲＶＦＶ株の間で保存されたが、フレボウイルス属の他のウイルスにおいて変化した。

ベロ細胞およびＣ６／３６細胞におけるＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスの感染力
ＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスの動態および全収率が分析された。比較のために、ファビピラビルの非存在下で、８つのパス（ｐａｓｓ）に渡って伝播する前後に、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４もまた検定した。蚊はＲＶＦＶの自然伝染サイクルにおいて重要な役割を果たすため、感染をヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６０）由来のＣ６／３６細胞株においても行った。

ベロ細胞上で行われた感染は、３つのウイルスのすべてに関して類似の増殖曲線を示した（図１Ａ）。感染後、いくつかの独立した実験において、異なる時点で採取された上清の滴定は、上記３つのウイルスの間のわずかな違いのみを示した。８つのパスの後の親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４の増殖パターンは、そのようなパスの前の親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４との違いを示さなかった。上記の違いは統計学的に重要においてなかったものの（多重ｔ－検定）、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶは、感染から３から４日後に、より高いウイルス産生収率で、わずかに早く増殖した。

Ｃ６／３６蚊細胞におけるウイルス増殖および最終的な収率の両方は、明らかにＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの影響を受けた（図１Ｂ）。感染したＣ６／３６蚊細胞は、細胞培養において、ベロ細胞におけるよりも、より長く生存可能のままであり、分析は最大９日まで延長された。昆虫細胞において、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの増殖は大幅に遅れ、感染から２から４日後のウイルス力価は１０^４ｐｆｕ／ｍｌであり、対照ウイルスによって産生された力価よりも少なくとも３対数単位低かった。分析された（感染から７から９日後の）最終的な時点での全ウイルス収率は、１０^７ｐｆｕ／ｍＬ力価に達したが、上記親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４が達した力価（＞１０^８ｐｆｕ／ｍＬ）よりも低かった。８つのパスの後、そのようなパスの前の親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４に関して、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４について著しい変化は見られなかった。

ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの存在化におけるベロ細胞プレートの表現型は、親ウイルスから実質的に異なっており、８つのパスの前後の、ＲＶＦＶ５６／７４親ウイルスによって産出されたプレートよりも小さなプレートを産出した（図１Ｃ）。

ＩＦＮＡＲ免疫不全マウス^－／－におけるＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦＶ感染力
生体内におけるＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの弱毒化を確認するために、Ａ１２９マウス株（ＩＦＮＡＲ^－／－）を用いて感染実験を行った。Ａ１２９マウスは急性ウイルス感染に対応することができず、ＲＶＦＶ感染に対して感受性が高く、非常に敏感なＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶ弱毒化の評価を示す。

異なる量のウイルスを、５～６匹のマウス群に腹腔内接種し、疾患および生存の徴候の発現を確認するために、２週間毎日モニタリングした（図２Ａ）。８つのパスの後、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４は、１０^２ｐｆｕでの接種の４日後に、１００％の死亡率をもたらした一方で、そのようなパスの前に、同じ用量の親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４を接種したマウスは４０％（２／５）の生存率を示した。これらのデータは、８つのパスの後の、親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４の毒性の増加を示唆するが、結果は統計上有意においてなかった。より多くの用量の親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４は、感染後の最初の４日間において接種された動物の死亡を引き起こし、死亡率は、１０^３ｐｆｕで接種した動物において１００％、１０^４ｐｆｕで接種した動物において９０％であり、１０日目に生存している個体はいなかった。

これに対して、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを接種した動物は、高い抗原投与用量（１０^４ｐｆｕ）であっても、７０％を超える生存率を示し、実験の終了時には著しい生存数を示し、その生存率は、１０^３ｐｆｕを受けた動物において５／６（８３％）、１０^４ｐｆｕで接種した動物において４／５（８０％）であった。これらの動物のいずれにおいても、感染から３～５日後におけるわずかな体重減少を除いて、疾病の徴候は見られなかった（図２Ｂ）。

１４日目（実験の終了時）に採取された血清試料は、生存個体におけるＮ－核タンパク質（抗－Ｎ）抗体の存在に関して、ＥＬＩＳＡによって分析され、ウイルス複製を示した（図２Ｃ）。最も低いウイルス量、１０^２ｐｆｕを受けた群内のいくつかの動物において、抗－Ｎ抗体は、検出不可能であり、ウイルス複製のレベルが低いまたはゼロであることを示していると思われる（ＲＶＦＶ５６／７４を接種したマウスにおいて２／２、ＦＭＨ－Ｐ８ウイルスを接種したマウスにおいて１／４）。１０^３および１０^４ｐｆｕのＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを接種した動物のすべて、ならびに１０^２ｐｆｕのＦＭＨ－Ｐ８ウイルスを接種した群のうちの３つは、特異抗－Ｎ抗体を発現させた。抗－Ｎ抗体の力価は、受けた量に関係なく、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを接種した群内における有意の違いを示さなかった（通常一元ＡＮＯＶＡ）。

体内感染力測定は、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスおよびＭＰ－１２生弱毒化ワクチン（Ｉｋｅｇａｍｉら、２０１５）を接種したＡ１２９マウスにおいて行われた。ＩＦＮＡＲ－／－マウスに、同じ量（１０^４ｃｆｕ）で投与されたＭＰ－１２ワクチンによって、株の上記マウスの１００％が、５日以内に死亡した。これらの結果は、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスのワクチンとしての高い潜在能力を証明する。

免疫担当マウスにおけるＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスの免疫原性および効能
ＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスは、免疫担当マウスにおいて測定された。このために、野生１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスに、１０^４ｐｆｕのＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを腹腔内接種し、４週間後に、致死量（１０^４ｐｆｕ）の親ＲＶＦウイルス５６／７４を用いて抗原投与を行った。ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの接種後、マウスは、疾病の徴候、有意な重量変化さえも示さなかった。接種後２４日目に採取された血清試料（親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４を用いた致死的な抗原投与以前の試料）において、９匹中７匹のマウスが強い中和抗体応答を示した（図４Ａ）。Ｎ－核タンパク質抗体は、中和測定において陰性であったが、抗－Ｎ抗体力価がわずかに低いだけであった２つの試料を含めて、これらすべての試料において間接的ＥＬＩＳＡによって検出された。これは、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスが、接種したマウスのすべてにおいて、少なくとも免疫応答を引き出すのに十分な程度に複製したことを示す。マウスが毒性株ＲＶＦＶ５６／７４を用いた致死的な抗原投与を受けた場合、中和抗体力価が検出されなかったマウスを含む上記マウスの１００％が、明らかな臨床病態もなく、実験の終了時まで生存した（図４Ｂ、図４Ｃ）。これに対して、対照群におけるすべてのマウスは、４日目に病気にかかったか、死亡した（図４Ｂ、図４Ｃ）。

親ウイルスＲＶＦＶ５６／７４を用いた致死的な抗原投与後に、抗－Ｎ抗体力価が増加し、これはマウスにおける弱毒化ウイルスＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦＶのブースター効果を示している。まとめると、これらの結果は、その高度に弱毒化された表現型に関わらず、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスは、中和抗体が検出されない場合でも、防御免疫応答の誘発を可能にするレベルで、免疫担当１２９ｖ／Ｅｖマウスにおいて複製することができることを示す。

ヒツジにおけるＦＭＨ－Ｐ８弱毒化ＲＶＦウイルスの免疫原性
弱毒化ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを、天然の宿主におけるその弱毒化および免疫原性を評価するために、雌ヒツジに接種した。動物は１０^７ｐｆｕの高量の弱毒化ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスを受け、臨床徴候を毎日モニタリングし、試料採取を毎日行った。弱毒化ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスの接種後の数日間、すべての動物において熱は記録されず、肝酵素滴定は、感染後２日目から熱が急上昇した親ウイルス５６／７４を接種した対照ヒツジとは異なって、ＦＭＨ－Ｐ８を接種したヒツジにおいて変異を示さなかった。臨床徴候がない状態においてでも、セロコンバージョンが観察され、これは接種後８日目に中和抗体の著しい力価に達した。ＲＶＦＶを用いて得られた中和抗体力価は、親ウイルス５６／７４を用いて得られた中和抗体力価よりも低かったが、上記中和抗体力価は重要であり、ヒツジに対する保護を提供するのに有意かつ十分であると結論付けられた。さらに、本実施例の結果は、弱毒化ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスによって提供される安全性を示し、ＦＭＨ－Ｐ８ ＲＶＦウイルスのワクチン実用性を支持する（図５Ａ～図５Ｃ）。

ＲＶＦウイルスの変異体を接種し、致死量のＲＶＦウイルスのＺＨ５４８株を用いた抗原投与を行った後のマウスにおける測定
野生マウス１２９にＲＶＦウイルスの変異体を接種し、その後、ＲＶＦウイルスの致死量の野生株ＺＨ５４８（毒性株）用いた抗原投与を行った。

４つのマウス群に、ＲＶＦウイルスのＺＨ５４８株またはＺＨ５４８株の異なる変異体のどちらかを、以下に示されるように接種した。
群Ｃ１のマウスに、ＲＶＦウイルスの株ＺＨ５４８、野生毒性対照を接種した。
群Ｇ１のマウスに、ＲＶＦウイルスのＺＨ５４８＿ΔＮＳｓ：ｇｆｐ変異体、削除されたＮＳｓタンパク質をコードするＲＮＡの領域を有する弱毒化対照を接種した。
群Ａ２のマウスに、ＲＶＦウイルスの変異体ＺＨ５４８８＿Ｌ［Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ］＿Ｌ［Ａｌａ１３０３Ｔｈｒ］＿ＮＳｓ［Ｐｒｏ８２Ｌｅｕ］、ウイルスＲＮＡのＬセグメントのＲｄＲｐ遺伝子によってコードされたタンパク質においてＧｌｙ９２４Ｓｅｒ置換およびＡｌａ１３０３Ｔｈｒ置換、およびウイルスＲＮＡのＳセグメントのＮＳｓ遺伝子によってコードされたタンパク質においてＰｒｏ８２Ｌｅｕ置換を有する変異体を接種した。
群Ｂ３のマウスに、変異体ＺＨ５４８＿Ｌ ［Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ］＿Ｌ［Ａｌａ１３０３Ｔｈｒ］、ウイルスＲＮＡのＬセグメントのＲｄＲｐ遺伝子によってコードされたタンパク質においてＧｌｙ９２４Ｓｅｒ置換およびＡｌａ１３０３Ｔｈｒ置換を有する変異体を接種した。

本実施例の結果は、ＲＶＦウイルスのＺＨ５４８株における３つのアミノ酸置換、ウイルスＲＮＡのＳセグメントのＮＳｓ遺伝子によってコードされたタンパク質におけるＰｒｏ８２Ｌｅｕ置換と、ウイルスＲＮＡのＬセグメントのＲｄＲｐタンパク質におけるＧｌｙ９２４Ｓｅｒ置換とＡｌａ１３０３Ｔｈｒ置換の非常に明確な弱毒化効果を示す。

株ＺＨ５４８の配列は、ＧｅｎＢａｎｋを介して、アクセスコードＤＱ３７５４０３（セグメントＬ）、ＤＱ３８０２０６（セグメントＭ）およびＤＱ３８０１５１（セグメントＳ）で入手可能である。株ＺＨ５４８の配列の説明は表６において示される。

ＲＶＦウイルスの変異体を接種し、致死量のＲＶＦウイルスのＺＨ５４８株を用いた抗原投与を行った後のヒツジにおける測定

２頭のヒツジの群に、致死量のＲＶＦウイルス株ＺＨ５４８を接種した。

４頭のヒツジの群に、ＲＶＦウイルスの変異体ＺＨ５４８＿Ｌ［Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ］＿Ｌ［Ａｌａ１３０３Ｔｈｒ］＿ＮＳｓ［Ｐｒｏ８２Ｌｅｕ］（ウイルスＲＮＡセグメントＬのＲｄＲｐ遺伝子によってコードされたタンパク質においてＧｌｙ９２４ＳｅｒおよびＡｌａ１３０３Ｔｈｒ置換を有し、ウイルスＲＮＡセグメントＳのＮＳｓ遺伝子によってコードされたタンパク質においてＰｒｏ８２Ｌｅｕ置換を有する変異体）を接種した。この群における２頭のヒツジを、３週間後に、ＲＶＦウイルスのＺＨ５４８株を用いて抗原投与した。上記群における他の２頭のヒツジを、病変の有無を致死量のＲＶＦウイルスのＺＨ５４８株が与えられた対照ヒツジと比較するために、短期間で屠殺した。

ＲＶＦウイルス株ＺＨ５４８＿Ｌ［Ｇ９２４Ｓ／Ａ１３０３Ｔ］＿ＮＳｓ［Ｐ８２Ｌ］を接種した雌ヒツジは、中和抗体を産生し、対照ウイルスを接種した雌ヒツジとは異なり、病変を示さなかった。対照ヒツジとは異なり、免疫化されたヒツジの血液中に感染ウイルスを検出することもまたできなかった。

本実施例の結果は、３つの置換、Ｌ［Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ］、Ｌ［Ａｌａ１３０３Ｔｈｒ］およびＮＳｓ［Ｐ８２Ｌ］によってもたらされる弱毒化を示す。さらに、本実施例の結果は、上記変異株が、野生株ＺＨ５４８を用いた抗原投与からヒツジを守ることができる免疫応答を誘発する能力を有することを確証する。

配列表フリーテキストは表７において再現される。

文献
Ｂｏｒｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｌｅｔｈａｌ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｆｔ Ｖａｌｌｅｙ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆａｖｉｐｉｒａｖｉｒ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，６３（８），ＰＩＩ： ｅ００６６９－１９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＡＡＣ．００６６９－１９
Ｂｕｓｑｕｅｔｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂｒｅｅｄ ｓｈｅｅｐ ｗｉｔｈ Ｒｉｆｔ Ｖａｌｌｅｙ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｏｒｎｅ Ｚｏｏｎｏｔｉｃ Ｄｉｓ，１０（７），６８９－６９６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｖｂｚ．２００９．０２０５
Ｉｋｅｇａｍｉ ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｒｉｆｔ Ｖａｌｌｅｙ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ ＭＰ－１２ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｓ Ｆｕｌｌｙ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｂｙ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉａｌ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓ，Ｍ，ａｎｄ Ｌ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８９（１４），７２６２‐７２７６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＶＩ．００１３５－１５

Claims (13)

1. リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）の弱毒化変異体であって、前記弱毒化変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされるＲｄＲｐタンパク質において、
   ９２４位のアミノ酸がセリン（Ｌ［Ｇｌｙ９２４Ｓｅｒ］）であり、
   １３０３位のアミノ酸がトレオニン（Ｌ［Ａｌａ１３０３Ｔｈｒ］）であり、
   前記ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４７の配列、または前記ＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５４の配列が、前記ＲｄＲｐタンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列であり、
   前記弱毒化変異体のＲＮＡのＳセグメントによってコードされるＮＳｓタンパク質において、
   ８２位のアミノ酸がロイシン（ＮＳｓ［Ｐｒｏ８２Ｌｅｕ］）であり、
   前記ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４９の配列、または前記ＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５６の配列が、前記ＲｄＲｐタンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列である、弱毒化変異体。
2. さらに、前記弱毒化変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされるＲｄＲｐタンパク質において、
   １００位のアミノ酸がトレオニン（Ｌ［Ｍｅｔ１００Ｔｈｒ］）であり、
   ３７５位のアミノ酸がチロシン（Ｌ［Ｈｉｓ３７５Ｔｙｒ］）であり、
   １０５０位のアミノ酸がバリン（Ｌ［Ｉｌｅ１０５０Ｖａｌ］）であり、
   １６２９位のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｌ［Ｌｅｕ１６２９Ｐｈｅ］）であり、
   ２０７１位のアミノ酸がリジン（Ｌ［Ｇｌｕ２０７１Ｌｙｓ］）であり、
   前記ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４７の配列、または前記ＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５４の配列が、前記ＲｄＲｐタンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列であり、
   前記弱毒化変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされるアミノ酸配列において、
   ２６位のアミノ酸がリジン（Ｍ［Ａｒｇ２６Ｌｙｓ］）であり、
   １０８位のアミノ酸がチロシン（Ｍ［Ｈｉｓ１０８Ｔｙｒ］）であり、
   １１８位のアミノ酸がリジン（Ｍ［Ｇｌｕ１１８Ｌｙｓ］）であり、
   ２１０位のアミノ酸がリジン（Ｍ［Ａｒｇ２１０Ｌｙｓ］）であり、
   ３３３位のアミノ酸がアスパラギン（Ｍ［Ａｓｐ３３３Ａｓｎ］）であり、
   ４２７位のアミノ酸がトレオニン（Ｍ［Ａｌａ４２７Ｔｈｒ］）であり、
   ４３２位のアミノ酸がバリン（Ｍ［Ａｌａ４３２Ｖａｌ］）であり、
   ４８７位のアミノ酸がグリシン（Ｍ［Ｇｌｕ４８７Ｇｌｙ］）であり、
   ５４０位のアミノ酸がチロシン（Ｍ［Ｈｉｓ５４０Ｔｙｒ］）であり、
   ５８２位のアミノ酸がトレオニン（Ｍ［Ａｌａ５８２Ｔｈｒ］）であり、
   ５８７位のアミノ酸がイソロイシン（Ｍ［Ｖａｌ５８７Ｉｌｅ］）であり、
   ９５０位のアミノ酸がバリン（Ｍ［Ａｌａ９５０Ｖａｌ］）であり、
   １０９０位のアミノ酸がイソロイシン（Ｍ［Ｖａｌ１０９０Ｉｌｅ］）であり、
   １１１６位のアミノ酸がバリン（Ｍ［Ａｌａ１１１６Ｖａｌ］）であり、
   １１８２位のアミノ酸がリジン（Ｍ［Ａｒｇ１１８２Ｌｙｓ］）であり、
   前記ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４８の配列、または前記ＲＶＦウイルスの野生株ＺＨ５４８の配列番号５５の配列が、前記弱毒化変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされる前記アミノ酸配列のアミノ酸ナンバリングのための参照配列であり、
   前記弱毒化変異体のＲＮＡのＳセグメントによってコードされるＮＳｓタンパク質において、
   ５２位のアミノ酸がイソロイシン（ＮＳｓ［Ｖａｌ５２Ｉｌｅ］）であり、
   前記ＲＶＦウイルスの野生株５６／７４の配列番号４９の配列、または前記ＲＶＦウイルスの野生型ＺＨ５４８株の配列番号５６の配列が、前記ＲｄＲｐタンパク質のアミノ酸のナンバリングのための参照配列である、請求項１に記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
3. 前記弱毒化変異体のＲＮＡのＬセグメントによってコードされるアミノ酸配列は配列番号４であり、前記弱毒化変異体のＲＮＡのＭセグメントによってコードされるアミノ酸配列は配列番号５であり、前記ＮＳｓタンパク質が配列番号６の配列からなり、前記Ｎタンパク質が配列番号７の配列からなる、請求項１または２に記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
4. 前記ＲＶＦＶの弱毒化変異体は、前記弱毒化変異体のＲＮＡコーディングを含み、
   前記ＲＮＡのＬセグメントが配列番号１の配列からなり、
   前記ＲＮＡのＭセグメントが配列番号２の配列からなり、
   前記ＲＮＡのＳセグメントが配列番号３の配列からなる、請求項１から３のうちのいずれかに記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
5. 請求項１から４のうちのいずれかに記載の前記ＲＶＦＶの弱毒化変異体を、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または動物用の賦形剤と共に含む、医薬組成物または動物用組成物。
6. 薬剤として使用するための、請求項１から４のうちのいずれかに記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
7. リフトバレー熱の予防において使用するための、請求項１から４のうちのいずれかに記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
8. 動物において使用するための請求項７に記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
9. 前記動物が反芻動物である、請求項８に記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
10. 前記反芻動物が、牛、羊、ヤギ、ラクダおよび水牛から選択される、請求項９に記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
11. ヒトにおいて使用するための請求項８に記載のＲＶＦＶの弱毒化変異体。
12. 請求項１から４のうちのいずれかの前記ＲＶＦＶの弱毒化変異体を含むリフトバレー熱ワクチン。
13. 少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または動物用の賦形剤をさらに含む、請求項１２に記載のリフトバレー熱ワクチン。