JP2023542980A - Ｆｏｘｐ３促進モルホリノ - Google Patents
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Abstract
患者においてＴｒｅｇのＦＯＸＰ３Ｓ発現を増加させるための組成物並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの方法が、本明細書において開示される。これらの組成物及び方法は、がんの処置を含む、多様な目的のために有用である。【選択図】図９－１
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が本明細書に明確に組み込まれる、２０２０年９月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／０８３，４５２号の優先権を主張する。
電子出願された情報の参照による組込み
その全体が参照により組み込まれるのは、添付して同時に提出され、以下：２０２１年９月７日に作成された、「３４３９６９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた３キロバイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイルとして特定される、コンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストである。
連邦政府による支援の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された、ＡＩ０８５０４６及びＣＡ２０３７３７に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、その開示が本明細書に明確に組み込まれる、２０２０年９月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／０８３，４５２号の優先権を主張する。
電子出願された情報の参照による組込み
その全体が参照により組み込まれるのは、添付して同時に提出され、以下：２０２１年９月７日に作成された、「３４３９６９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた３キロバイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイルとして特定される、コンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストである。
連邦政府による支援の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された、ＡＩ０８５０４６及びＣＡ２０３７３７に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
乳がんは、米国において女性で診断される２番目に多いがんである。現在、一生のうちにどこかで乳がんを発症する米国の女性の平均リスクは、約１３％（８人中１人の女性）であり、したがって、２０２０年には約２７６，４８０人の浸潤性乳がんの新しい症例が診断されるであろう。研究は、乳がんの発生率が、人種及び性別にわたって軍人で顕著により高く、出産歴（初産の年齢及び避妊薬の使用）及び有害化学物質への暴露における、軍人の女性と一般集団との間の違いによる可能性が高いことを示した。処置の進歩、スクリーニングによる早期検出、及び意識の向上により、乳がん死亡率は数十年にわたり減少しているが、米国において毎年４０，０００人を超える患者が疾患により死亡している。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系ホメオスタシスの維持に中心的な役割を果たし、免疫介在性炎症、例えば、自己免疫疾患、喘息、及びアレルギーを負に制御する。しかしながら、Ｔｒｅｇは、慢性感染症及び腫瘍に対する有効な免疫も抑制する。８６６６人の乳がん患者を含む１５の公表された研究の系統的レビュー及びメタ分析は、乳がんにおける腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の増加は、全体的な生存の低下、腫瘍悪性、及び転移を含む、臨床転帰不良と相関することを実証した。これに対し、転移性乳がんを有する患者における、実験的がんワクチンと併用する抗ＣＤ２５抗体（ダクリズマブ）によるＴｒｅｇの枯渇は、Ｔｒｅｇの明らかな及び持続的な減少、並びにＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞のロバストなプライミング及びブーストをもたらす。その結果、この患者の少数のセットにおいて、全体的な生存が改善した。マウス乳がんモデルでは、Ｔｒｅｇの枯渇又は下方制御は、抗腫瘍免疫及び腫瘍退縮の増強をもたらした。
ＦＯＸＰ３は、Ｔｒｅｇの発生及び機能のマスター制御因子である。ヒト及びマウスの両方におけるＦＯＸＰ３機能消失変異は、Ｔｒｅｇの欠損による致死性の免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、及びＸ連鎖症候群（ＩＰＥＸ）を生じる。ヒトＦＯＸＰ３遺伝子は、ｍＲＮＡ選択的スプライシングにより２つの主要なアイソフォーム－長い全長アイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｌ）及びエクソン２領域を欠損するより短いアイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｓ）をコードし、マウスＦｏｘｐ３遺伝子は、Ｆｏｘｐ３Ｌアイソフォームのみをコードする。ＦＯＸＰ３エクソン２領域（２番目のタンパク質コードエクソン；配列番号１２）は、Ｔｈ１７分化の制御に重要であることが示されているが、２つのＦＯＸＰ３アイソフォームは両方とも、強制的な過剰発現下の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ分化及び機能の指示に有効であった。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３Ｌ及びＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの異所性の過剰発現は、超生理学的な発現レベルを生じ得、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの機能を表さないようであることが知られていることが多い。したがって、Ｔｒｅｇの機能性及び生物学の決定において、これら２つの主要なアイソフォームがいかに異なるかの謎は残っている。
本明細書に開示される、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３Ｌ及びＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの相対発現は、がん進行に対する抵抗及びがん免疫療法の有効性に影響することが発見された。
ヒトＦＯＸＰ３遺伝子は、ｍＲＮＡ選択的スプライシングにより２つの主要なアイソフォーム－長い全長アイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｌ）及びエクソン２領域を欠損する短いアイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｓ）をコードする。しかしながら、マウスＦｏｘｐ３遺伝子は、Ｆｏｘｐ３Ｌアイソフォームのみをコードする。したがって、ＦＯＸＰ３ＬはＴｒｅｇ分化及び機能を指示することができるが、ＦＯＸＰ３Ｓの役割は分かりにくいままである。出願人は、ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｓのみを発現する遺伝的に改変したマウスモデルが、乳がんの進行に耐性を付与されたことを発見した。さらに、出願人は、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇが不安定であり、ヘルパー様Ｔ細胞に分化転換することができ、したがって、抗腫瘍免疫の増強を提供することを見出した。さらに、乳がん組織にＦＯＸＰ３Ｓが高発現する患者は、ＦＯＸＰ３Ｓが低発現の患者よりも良い全生存率を示した。
したがって、本開示の一実施形態により、方法は、ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３Ｓ発現を促進することにより抗腫瘍免疫を増強する、及びより具体的には、乳がんに対する抗腫瘍免疫を増強するために提供される。一実施形態では、方法は、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＯ）を投与して、プレｍＲＮＡスプライシング中にエクソン２領域の包括をブロックし、ＦＯＸＰ３発現をＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトするステップを含む。出願人は、この新規のＭＯが、前臨床マウス乳がんモデル並びに患者由来のｅｘ ｖｉｖｏ乳がんモデル及び結腸直腸がんモデルにおける腫瘍増殖を効果的に抑制することを確かめた。
一実施形態により、本発明は、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を改変することにより、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導することを対象とする。より詳細には、一実施形態では、ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度が増加され、場合により、ＦＯＸＰ３Ｓは改変されたＴｒｅｇに存在する優勢なＦＯＸＰ３アイソフォームになる。一実施形態では、ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３Ｓの発現を増強するための方法、より詳細には、Ｔｒｅｇを誘導してＦＯＸＰ３Ｌ優勢発現からＦＯＸＰ３Ｓ優勢発現にスイッチするための方法が提供される。一実施形態では、方法は、ＦＯＸＰ３Ｓ発現と比較してＦＯＸＰ３Ｌの発現を減少させるステップ、及び場合によりＦＯＸＰ３Ｓの発現を増強するステップを含む。
一実施形態により、ＦＯＸＰ３Ｌの発現は、ＦＯＸＰ３Ｌの発現を阻害又は防止する干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトするステップにより減少される。一実施形態では、トランスフェクションステップは、単離されたＴｒｅｇ又は腫瘍浸潤リンパ球において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。一実施形態では、干渉オリゴマーはＦＯＸＰ３エクソン２を標的化し、Ｔｒｅｇはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでトランスフェクトされる。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、エクソン２（ＦＯＸＰ３Ｌにのみ存在する）を標的化する干渉オリゴヌクレオチド及びＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする核酸の両方によってトランスフェクトされ、したがって、同時にＦＯＸＰ３Ｌの産生を減少させ、ＦＯＸＰ３Ｓ産生を増加させる。一実施形態では、干渉オリゴマーは、以下のＦＯＸＰ３領域ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）を標的化する核酸塩基の配列、若しくはＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）と少なくとも８０％、８５％、９５％又は９９％の配列同一性を有する核酸塩基の配列、その相補鎖、又は配列番号１の１０、１５、１８、２０、２３若しくは２５ｂｐ又はそれより大きい連続する配列断片又はその相補鎖を含む。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧ（配列番号１０）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む干渉ＲＮＡであり、場合により、干渉オリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノである。
一実施形態により、Ｔｒｅｇのヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導する方法は、がんを処置するために使用され得る。現在の乳がんの処置オプションは、乳がんのサブタイプ及びステージ応じた内分泌療法、化学療法、放射線療法及び外科手術からなる。免疫療法の近年の進歩は、多くのタイプのがんに新しい処置アルゴリズムをもたらし、乳がんを処置するために免疫療法を使用することに強い関心が生じている。通常、Ｔｒｅｇは乳がん組織に多く浸潤し、したがって、抗腫瘍免疫を抑制する。しかしながら、出願人は、ＦＯＸＰ３Ｌと比較して、細胞内濃度が増強されたＦＯＸＰ３Ｓを発現するように改変されたＴｒｅｇは、ヘルパー様Ｔ細胞に分化転換され、抗腫瘍免疫応答を促進することを発見した。
この発見に基づき、ＦＯＸＰ３標的化オリゴマー（例えば、ＦＯＸ３のエクソン２を標的化するｉＲＮＡ又はモルホリノオリゴ（ＭＯ））は、細胞のＦＯＸＰ３Ｌの産生をＦＯＸＰ３Ｓ発現へとシフトするために使用することができ、抗腫瘍活性を提供するそのようなアプローチの有効性は、前臨床マウスモデル及び患者由来のがんオルガノイドモデルにおいて検証されている。したがって、これらのＦＯＸＰ３Ｓ促進ＭＯ、又は細胞内ＦＯＸＰ３Ｓ／ＦＯＸＰ３Ｌ比を変更する他のメカニズムは、乳がん処置、及び他の固形腫瘍の処置の新規の免疫療法として寄与するであろう。
一実施形態により、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＯＸＰ３エクソン２スキッピングを誘導するためにヒトモルホリノ配列又は他の干渉核酸が使用され、したがって干渉部分によって標的化された細胞においてヒトＦＯＸＰ３ＬアイソフォームをＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトする。一実施形態では、ＦＯＸＰ３エクソン２スキッピングを誘導するモルホリノは、ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）の配列、若しくはＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）と少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸塩基の配列、又は配列番号１の少なくとも１０、１５、１８、２０、２３若しくは２５ｂｐ又はそれより大きい連続する核酸塩基を含む配列番号１の断片を含む。一実施形態では、ＦＯＸＰ３エクソン２スキッピングを誘導する干渉部分は、
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号３）；
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）；
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）；
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）；
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）；及び
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、配列番号１～８の群から選択される、１つ又は複数のｉＲＮＡ又はモルホリノを含む組成物を使用して、ＦＯＸ３Ｌのエクソン２をスキップし、標的細胞においてＦＯＸＰ３Ｌの細胞内産生をＦＯＸＰ３Ｓ発現へとシフトする。
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号３）；
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）；
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）；
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）；
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）；及び
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）
からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、配列番号１～８の群から選択される、１つ又は複数のｉＲＮＡ又はモルホリノを含む組成物を使用して、ＦＯＸ３Ｌのエクソン２をスキップし、標的細胞においてＦＯＸＰ３Ｌの細胞内産生をＦＯＸＰ３Ｓ発現へとシフトする。
一実施形態により、ヒトモルホリノ配列又は他の干渉核酸が使用され、ＦＯＸＰ３Ｌの翻訳をブロックするか、又はエクソン２領域を含有するＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡの分解を誘導し、したがって、干渉部分によって標的化された細胞においてＦＯＸＰ３Ｓ／ＦＯＸＰ３Ｌ比を変更する。一実施形態では、モルホリノ又は他の干渉核酸は、配列番号１２の少なくとも１０ｂｐ若しくはそれより大きい連続する核酸塩基であるＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧ（配列番号１２）の断片、又はその相補鎖を含み、配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する。
定義
本発明の記載及び請求において、以下の用語は、以下に記載した定義に従って使用されるであろう。
本発明の記載及び請求において、以下の用語は、以下に記載した定義に従って使用されるであろう。
用語「約」は、本明細書で使用される場合、記載した値又は値の範囲より１０％まで大きい若しくは小さいことを意味するが、任意の値又は値の範囲をこの広義にのみ限定することを意図しない。用語「約」によって先行される各値又は値の範囲は、記載した絶対値又は値の範囲の実施形態を包含することも意図する。
本明細書で使用される場合、用語「精製した」及び同様の用語は、本来の又は天然の環境での分子又は化合物と通常関連する夾雑物を実質的に含まない形態の分子又は化合物の単離に関する。本明細書で使用される場合、用語「精製した」は、完全な純度を必要とせず、むしろ相対的な定義と意図される。
用語「単離した」は、そのオリジナルの環境（例えば、自然発生である場合、自然環境）から、参照物質が除去されることを必要とする。例えば、生きた動物に存在する自然発生のポリヌクレオチドは単離されないが、自然システムにおいて一部又は全ての共存する物質から分離された、同じヌクレオチドは単離される。
組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）は、核酸配列及びタンパク質をナノスケールで細胞のサイトゾルへと送達することができる、エレクトロポレーションベースの技術である。より詳細には、ＴＮＴは、並置した組織細胞膜に穏やかにナノポレートし、電気泳動により積荷（例えば核酸又はタンパク質）を細胞に運ぶ、配置したナノチャンネルを通る高強度及び収束電界を使用する。
本明細書で使用される場合、「調節エレメント」又は「制御配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行する、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域を含む、機能遺伝子の非翻訳領域である。そのようなエレメントは、それらの強度及び特異性が多様であり得る。「真核生物の制御配列」は、真核細胞の宿主細胞タンパク質と相互作用して、哺乳動物細胞を含む真核細胞における転写及び翻訳を実行する、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域を含む、機能遺伝子の非翻訳領域である。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位に関して、比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列（１つ又は複数）である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本相互作用に必要なコアエレメントを含有し、上流エレメント及び応答エレメントを含有し得る。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」は、転写開始部位からの距離と無関係に機能するＤＮＡの配列であり、転写単位の５‘又は３’のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内及びコード配列自体内であり得る。それらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、それらはｃｉｓに機能する。エンハンサーは、プロモーターの近くで機能して転写を増加させる。プロモーターのように、エンハンサーも、転写の制御を媒介する応答エレメントを含有することが多い。エンハンサーは、発現の制御を決定することが多い。
用語「同一性」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の配列間の類似性に関する。同一性は、同一の残基の数を残基の総数によって割り、結果に１００を掛けてパーセンテージを得ることによって測定される。したがって、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％同一性を有するが、互いを比較してアミノ酸又はヌクレオチド欠失、付加、若しくは置換を有する２つの配列は同一性の程度が低い。当業者は、いくつかのコンピュータープログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３～４１０）などのアルゴリズムを用いるものが、配列同一性を決定するために利用可能であることを認識するであろう。
用語「ストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．５２～９．５５で議論された特異的ハイブリダイゼーション手順による、第２の標的核酸（即ち、目的の特定の核酸配列）への第１の核酸のハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ ９．４７～９．５２及び９．５６～９．５８においても参照。一実施形態では、ストリンジェントな条件は、約５０℃～約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ～約０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む溶液を使用して第１及び第２の核酸のハイブリダイゼーションを実施した後、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液による洗浄（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）を含む。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、任意の標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば水中油型又は油中水型エマルジョン、及び様々なタイプの湿潤剤を含む。用語は、米国連邦政府の規制当局によって認可されたか、又はヒトを含む、動物での使用のための米国薬局方に列挙される任意の薬剤も包含する。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、特定の障害若しくは状態と関連する症状の軽減、及び／又は前記症状を防止若しくは除去することを含む。
本明細書で使用される場合、薬物の「有効」量又は「治療有効量」は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な薬物を指す。「有効」である量は、対象によってか、又は対象内でも経時的に、個体の年齢及び健康状態、投与の様式等に応じて変わるであろう。したがって、正確な「有効量」を特定することはいつも可能なわけではない。しかしながら、任意の個々のケースにおける適切な「有効」量は、通常の実験を使用して、当業者に決定され得る。
本明細書で使用される場合、薬物の「有効」量又は「治療有効量」は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な薬物を指す。「有効」である量は、対象によってか、又は対象内でも経時的に、個体の年齢及び健康状態、投与の様式等に応じて変わるであろう。したがって、正確な「有効量」を特定することはいつも可能なわけではない。しかしながら、任意の個々のケースにおける適切な「有効」量は、通常の実験を使用して、当業者に決定され得る。
本明細書で使用される場合、さらなる指定のない用語「患者」は、任意の温血の飼育脊椎動物（例えば、限定はされないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ及び他のペットを含む）及びヒトを包含することを意図する。
用語「担体」は、化合物又は組成物と組み合わされる場合、その意図される使用又は目的のための化合物又は組成物の調製、保存、投与、送達、有効性、選択性、又は任意の他の特徴を補助又は促進する化合物、組成物、物質、又は構造物を意味する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最少にする、及び対象における任意の有害副作用を最少にするために選択され得る。
用語「阻害する」は、活性、応答、状態、疾患、又は任意の他の生物学的パラメーターの減少を規定する。これは、限定はされないが、活性、応答、状態、又は疾患の完全な除去を含み得る。これは、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾患の１０％低減も含み得る。したがって、低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又は任意の量の間の低減であり得る。
用語「ベクター」又は「構築物」は、ベクター配列が連結された別の核酸を細胞へと輸送することができる核酸配列を指す。用語「発現ベクター」は、細胞による発現のために好適な形態（例えば、転写調節エレメントに連結される）の遺伝子構築物を含有する任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド又はファージ染色体）を含む。「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが、ベクターの一般に使用される形態であるため、交換可能に使用される。さらに、本発明は、等価な機能を果たす他のベクターを含むことを意図する。
用語「作動可能に連結された」は、別の核酸配列との核酸の機能的な関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部位、並びに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結し得る核酸配列の例である。例えば、転写調節エレメントへのＤＮＡの作動可能な連結は、そのようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識、結合、及び転写するＲＮＡポリメラーゼによって、プロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的及び機能的関係を指す。
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション」又は「トランスフェクト」は、核酸配列、又はその模倣アナログが、真核細胞によって、細胞膜を通過して細胞質へと内部移行されるプロセスを規定する。トランスフェクションは、受動的な手段（例えば受容体媒介取り込み、細胞孔通過）及び物理的（例えば、エレクトロポレーション）、化学的（例えば、カチオン性脂質又はリン酸カルシウム）、又は分子改変（細胞送達又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増強する改変）メカニズムを含む外部アシスト手段を含み得る。
本明細書で使用される場合、「干渉オリゴマー」は、転写後遺伝子制御、例えばサイレンシング及びスプライシングに参加する任意の核酸オリゴヌクレオチド又はそのアナログである。干渉オリゴマーの例としては、限定はされないが、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖で構成されるホスホロジアミデートモルホリノ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ホスホロジアミデートモルホリノ」は、ＤＮＡ／ＲＮＡのホスホジエステル骨格が、ホスホロジアミデート連結によって接続されたモルホリノ環の骨格と置換される、ＤＮＡ／ＲＮＡアナログを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＦＯＸＰ３Ｓ促進モルホリノ」は、細胞への導入時に、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を増加させるであろうホスホロジアミデートモルホリノを指す。一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｓ促進ホスホロジアミデートモルホリノは、ＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡからのＦＯＸＰ３エクソン２の除外を標的化及び誘導し、したがって、ＦＯＸＰ３Ｓ発現を促進するオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、用語「分化転換」は、中間の多能性状態又は前駆細胞型を経由すること無く、ある成熟体細胞が、別の成熟体細胞へと形質転換される人工的なプロセスを規定する。
実施形態
ヒトＦＯＸＰ３遺伝子は、ｍＲＮＡ選択的スプライシングにより２つの主要なアイソフォーム－長い完全長アイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｌ）及びエクソン２領域を欠損するより短いアイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｓ）をコードする。しかしながら、マウスＦｏｘｐ３遺伝子は、Ｆｏｘｐ３Ｌアイソフォームのみをコードする。したがって、ＦＯＸＰ３Ｌは、Ｔｒｅｇ発生及び機能を促進するが、ＦＯＸＰ３Ｓの役割は依然として分かりにくい。出願人は、ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｓのみを発現する遺伝子改変マウスモデルが、乳がん及び大腸がんの進行に耐性を付与されたことを発見した。さらに、出願人は、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇが不安定であり、ヘルパー様Ｔ細胞に分化転換することができ、したがって抗腫瘍免疫の増強を提供することを見出した。さらに、腫瘍組織により高いＦＯＸＰ３Ｓ転写物を有する乳がん患者は、より良好な全生存率を示した。
実施形態
ヒトＦＯＸＰ３遺伝子は、ｍＲＮＡ選択的スプライシングにより２つの主要なアイソフォーム－長い完全長アイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｌ）及びエクソン２領域を欠損するより短いアイソフォーム（ＦＯＸＰ３Ｓ）をコードする。しかしながら、マウスＦｏｘｐ３遺伝子は、Ｆｏｘｐ３Ｌアイソフォームのみをコードする。したがって、ＦＯＸＰ３Ｌは、Ｔｒｅｇ発生及び機能を促進するが、ＦＯＸＰ３Ｓの役割は依然として分かりにくい。出願人は、ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｓのみを発現する遺伝子改変マウスモデルが、乳がん及び大腸がんの進行に耐性を付与されたことを発見した。さらに、出願人は、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇが不安定であり、ヘルパー様Ｔ細胞に分化転換することができ、したがって抗腫瘍免疫の増強を提供することを見出した。さらに、腫瘍組織により高いＦＯＸＰ３Ｓ転写物を有する乳がん患者は、より良好な全生存率を示した。
したがって、本開示の一実施形態により、方法は、ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３Ｓ発現を促進することにより抗腫瘍免疫を増強し、より具体的には、乳がんに対する抗腫瘍免疫を増強するために提供される。一実施形態では、方法は、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＭＯ）を投与して、プレｍＲＮＡスプライシング中にエクソン２領域の包括をブロックし、ＦＯＸＰ３発現をＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトするステップを含む。
一実施形態により、本開示は、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を改変することにより、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導することを対象にする。より詳細には、本明細書に開示されるように、方法は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導してＦＯＸＰ３Ｌ産生からＦＯＸＰ３Ｓ産生へとシフトするために提供される。一実施形態では、方法は、ＦＯＸＰ３Ｓ発現と比較してＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームの発現を減少させるステップを含む。一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームの発現は、前記ＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３の発現をＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトするのに有効な量で、ＦＯＸＰ３Ｓ促進干渉オリゴマーによって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトすることによって減少される。
Ｔｒｅｇを誘導してＦＯＸＰ３の発現をＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトする方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。一実施形態では、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又は腫瘍浸潤リンパ球は、患者から回収され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導され（ＦＯＸＰ３Ｌ産生と比較して細胞のＦＯＸＰ３Ｓ産生を増加させることにより）、次いで患者に戻された。一実施形態では、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は患者から回収され、干渉オリゴマーが細胞によって取り込まれ、ＦＯＸＰ３発現を阻害及び／又はサイレンシングする条件下で、ＦＯＸＰ３を標的化する１つ又は複数の干渉オリゴマーと接触される。モルホリノ又はｉＲＮＡによるＦＯＸＰ３Ｌアイソフォーム発現のサイレンシング又は阻害は、腫瘍反応性Ｔｒｅｇがヘルパー様Ｔ細胞になるのを誘導するであろう。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導したヘルパーＴ細胞は、単独で又は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた腫瘍浸潤リンパ球との共投与を含む、他の標準的な抗がん療法と併せてのいずれかで患者に再導入され得る。
一実施形態では、Ｔｒｅｇは、免疫療法効果の増強の必要がある患者において、ＦＯＸＰ３のエクソン２を標的化する核酸配列、又は核酸配列アナログによりｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされる。干渉オリゴマーは、Ｔｒｅｇがエクソン２標的化干渉オリゴマーを取り込み、場合により、干渉オリゴマーと接触したＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３ＬからＦＯＸＰ３Ｓ発現へと発現をシフトすることにより、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を増加させる条件下で、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇと接触して置かれ得る。一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｓのエクソン２を標的化するために好適なオリゴマーは、配列ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号２）又はＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣＣＡＵＡＣ（配列番号９）又は配列番号２若しくは配列番号９と少なくとも９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する配列に特異的に結合する配列を含む。一実施形態では、ＦＯＸＰ３のエクソン２を標的化するのに好適な干渉オリゴマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号２）又はＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣＣＡＵＡＣ（配列番号９）に結合する配列を含む。一実施形態により、ＦＯＸＰ３のエクソン２を除外するのに好適な干渉オリゴマーは、
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号３）、
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）、
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）、
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）、
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）、及び
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）
の群から選択される配列に結合する配列を含む。
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号３）、
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）、
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）、
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）、
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）、及び
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）
の群から選択される配列に結合する配列を含む。
一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｌの発現と比較して、ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｓの発現を増強するための方法、より詳細には、Ｔｒｅｇを誘導してＦＯＸＰ３Ｌの発現からＦＯＸＰ３Ｓの優勢発現へとスイッチするための方法が提供される。一実施形態では、方法は、ＦＯＸＰ３Ｓ発現と比較してＦＯＸＰ３Ｌの発現を減少させ、場合により、ＦＯＸＰ３Ｓの発現を増強するステップを含む。一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｓ発現と比較してＦＯＸＰ３Ｌの発現を減少させるステップは、ＦＯＸＰ３Ｌの発現に特異的に干渉する干渉オリゴマーをＴｒｅｇの細胞質へと導入することによって、場合により、エクソン２の配列を標的化することによって実施される。一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｓの発現は、場合によりＦＯＸＰ３Ｌ発現と干渉することと併せて、場合によりＴｒｅｇへとＦＯＸＰ３Ｓをコードする核酸配列を導入することにより、増強される。
一実施形態により、ＦＯＸＰ３エクソン２を標的化し、
ｉ）核酸塩基ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸塩基の配列若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉｉ）配列番号１の連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ又はそれ以上の断片配列若しくはその相補鎖、又は
ｉｖ）ｉ）、ｉｉ）又はｉｉｉ）の任意の組合せ
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより、ＦＯＸＰ３Ｌの発現は減少され、ＦＯＸＰ３Ｓの発現は増加される。一実施形態では、干渉オリゴマーは、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、例えば干渉ＲＮＡを含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、天然ＤＮＡのホスホジエステル骨格が非イオン性模倣物によって置き換えられた、改変ＤＮＡである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又はその相補鎖を含む干渉ＲＮＡであり、場合により、干渉オリゴマーは、ＲＮＡ又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーとして形成された核酸塩基ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧを含む。
ｉ）核酸塩基ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸塩基の配列若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉｉ）配列番号１の連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ又はそれ以上の断片配列若しくはその相補鎖、又は
ｉｖ）ｉ）、ｉｉ）又はｉｉｉ）の任意の組合せ
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより、ＦＯＸＰ３Ｌの発現は減少され、ＦＯＸＰ３Ｓの発現は増加される。一実施形態では、干渉オリゴマーは、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、例えば干渉ＲＮＡを含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、天然ＤＮＡのホスホジエステル骨格が非イオン性模倣物によって置き換えられた、改変ＤＮＡである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又はその相補鎖を含む干渉ＲＮＡであり、場合により、干渉オリゴマーは、ＲＮＡ又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーとして形成された核酸塩基ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧを含む。
一実施形態により、ＦＯＸＰ３Ｌの発現は、ＦＯＸＰ３エクソン２を標的化し、
ｉ）核酸塩基
ＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧ（配列番号１２）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ若しくはそれ以上の配列番号１２の断片配列又はその相補鎖
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることによって、減少される。一実施形態では、干渉オリゴマーは、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、例えば干渉ＲＮＡを含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノである。
ｉ）核酸塩基
ＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧ（配列番号１２）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ若しくはそれ以上の配列番号１２の断片配列又はその相補鎖
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることによって、減少される。一実施形態では、干渉オリゴマーは、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、例えば干渉ＲＮＡを含む、オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、干渉オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノである。
一実施形態により、Ｔｒｅｇは、がんを処置する治療用アプローチとして、ヘルパー様Ｔ細胞へと分化転換を誘導される。現在の乳がんの処置オプションは、乳がんのサブタイプ及びステージに応じて、内分泌療法、化学療法、放射線療法及び外科手術からなる。免疫療法の近年の進歩は、多くのタイプのがんに新しい処置アルゴリズムをもたらし、乳がんを処置するために免疫療法を使用することに強い関心が生じている。通常、Ｔｒｅｇは乳がん組織に多く浸潤し、したがって、抗腫瘍免疫を抑制する。しかしながら、出願人は、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇが、ヘルパー様Ｔ細胞に分化転換され、したがって抗腫瘍免疫応答を促進することを発見した。
この発見に基づき、ＦＯＸＰ３標的化オリゴマー（例えば、ｉＲＮＡ又はモルホリノオリゴ（ＭＯ））は、細胞のＦＯＸＰ３Ｌの産生をＦＯＸＰ３Ｓ発現へとシフトするために使用することができ、抗腫瘍活性を提供するそのようなアプローチの有効性は、前臨床マウスモデル及び患者由来のがんのオルガノイドモデルにおいて立証されている。したがって、これらのＦＯＸＰ３Ｓ促進ＭＯ、又は細胞内ＦＯＸＰ３Ｓ／ＦＯＸＰ３Ｌ比を変更する他のメカニズムは、乳がん処置、及び他の固形腫瘍の処置のための新規免疫療法として機能するであろう。
一実施形態では、患者においてがんを処置する方法は、ＦＯＸＰ３Ｌを発現する制御性Ｔ細胞と比較して、ＦＯＸＰ３Ｓを発現する制御性Ｔ細胞の相対濃度を増加させるステップを含む。一実施形態により、固形腫瘍を有する患者を処置する方法であって、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇの数は、前記患者において増加され、場合により、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇの数の増加は、腫瘍の部位に局在する、方法が提供される。一実施形態では、ＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇの数は、前記患者へのＦＯＸＰ３Ｓを発現するＴｒｅｇの導入により増加される。一実施形態では、Ｔ細胞が患者から回収され、Ｔ細胞が患者へと再導入される前に、Ｔ細胞は処理され、制御性Ｔ細胞を誘導してＦＯＸＰ３ＬアイソフォームからＦＯＸＰ３Ｓ発現へとシフトさせる。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞は、患者へと静脈内に注入されるか、又は固形腫瘍を持つ組織へと注入される。
一実施形態では、乳がんを含む、固形腫瘍を処置する方法は、前記ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｓ発現を増加させるのに有効な量で干渉オリゴマーによって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトすることによって、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が腫瘍反応性ヘルパー様Ｔ細胞へと分化するのを誘導するステップを含む。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３Ｌ発現と干渉する１つ又は複数の干渉オリゴマー及び／又はＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする核酸配列によってトランスフェクトされる。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３のエクソン２を標的化する干渉オリゴマーによってトランスフェクトされる。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、例えば組織ナノトランスフェクションを含む、標準的な技術を使用してｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされる。一実施形態では、干渉オリゴマーは、Ｔｒｅｇのサイトゾルへと導入され、オリゴマーはＦＯＸＰ３Ｓ促進モルホリノである。
一実施形態では、Ｔｒｅｇのヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導することによりがんを処置する方法は、他の公知の免疫学的又は他のがん処置療法と併せて実施される。一実施形態では、本明細書に開示のがんを処置する方法は、前記患者に、免疫チェックポイント遮断抗体を投与するステップをさらに含む。
さらなる実施形態
実施形態１により、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を変更する方法であって、前記ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３アイソフォーム、ＦＯＸＰ３Ｌ及びＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を改変するステップを含み、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの量がＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームと比較して増加される、方法が提供される。
さらなる実施形態
実施形態１により、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を変更する方法であって、前記ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３アイソフォーム、ＦＯＸＰ３Ｌ及びＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を改変するステップを含み、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの量がＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームと比較して増加される、方法が提供される。
実施形態２により、ＦＯＸＰ３Ｌを標的化する干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより、場合によりＦＯＸＰ３のエクソン２を除くことにより、ＦＯＸＰ３Ｓと比較してＦＯＸＰ３Ｌの発現が阻害される、実施形態１の方法が提供される。
実施形態３により、ＦＯＸＰ３Ｓの発現が、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする核酸によってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより、ＦＯＸＰ３Ｌと比較して増強される、実施形態１又は２の方法が提供される。
実施形態４により、単離したＴｒｅｇのヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導するのに十分な量の前記干渉オリゴマーによって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトする、実施形態１～３のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態５により、ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームの相対発現が、
ｉ）配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸塩基配列、又は
ｉｉ）配列番号１の少なくとも連続する１０核酸塩基断片；又は
ｉｉｉ）ｉ）若しくはｉｉ）の相補鎖
を含むＦＯＸＰ３Ｌ標的化干渉オリゴマーによって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトすることにより減少される、実施形態１～４のいずれか１つの方法が提供される。
ｉ）配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸塩基配列、又は
ｉｉ）配列番号１の少なくとも連続する１０核酸塩基断片；又は
ｉｉｉ）ｉ）若しくはｉｉ）の相補鎖
を含むＦＯＸＰ３Ｌ標的化干渉オリゴマーによって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトすることにより減少される、実施形態１～４のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態６により、前記干渉オリゴマーが、ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）の核酸塩基配列、又はその相補鎖を含む、実施形態１～５のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態６．５により、ＦＯＸＰ３Ｌの発現が、ＦＯＸＰ３エクソン２を標的化し、
ｉ）核酸塩基
ＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧ（配列番号１２）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ若しくはそれ以上の配列番号１２の断片配列又はその相補鎖
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることによって減少され、場合により、干渉オリゴマーが、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、例えば干渉ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドであり、場合により、干渉オリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノである、実施形態１～６のいずれか１つの方法が提供される。
ｉ）核酸塩基
ＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧ（配列番号１２）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ若しくはそれ以上の配列番号１２の断片配列又はその相補鎖
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることによって減少され、場合により、干渉オリゴマーが、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、例えば干渉ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドであり、場合により、干渉オリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノである、実施形態１～６のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態７により、ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームの相対発現が、ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号２）又はＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣＣＡＵＡＣ（配列番号９）を含む配列に特異的に結合するＦＯＸＰ３Ｌ標的化干渉オリゴマーによって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトすることによって減少される、実施形態１～６．５のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態８により、干渉オリゴマーが
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号２）、
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）、
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）、
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）、
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）及び
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）、又はそのＲＮＡカウンターパート
からなる群から選択される配列に特異的に結合する、実施形態１～７のいずれか１つの方法
が提供される。
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号２）、
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）、
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）、
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）、
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）及び
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）、又はそのＲＮＡカウンターパート
からなる群から選択される配列に特異的に結合する、実施形態１～７のいずれか１つの方法
が提供される。
実施形態９により、干渉オリゴマーが、ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧ（配列番号１０）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む干渉ＲＮＡである、実施形態１～８のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１０により、前記干渉オリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノである、実施形態１～９のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１１により、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする遺伝子によって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトするステップをさらに含む、実施形態１～１０のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１１により、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする遺伝子によって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトするステップをさらに含む、実施形態１～１０のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１２により、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を増加させるステップを含む、患者においてがんを処置する方法が提供される。
実施形態１３により、ＦＯＸＰ３Ｓの相対濃度の増加が、前記単離したＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３を標的化する干渉オリゴマーによってｉｎ ｖｉｔｒｏで単離したＴｒｅｇをトランスフェクトすること；及び前記トランスフェクトしたＴｒｅｇを前記患者に再導入することによって達成される、がんを処置する方法が提供される。
実施形態１４により、前記ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を増加させるのに有効な量で、干渉オリゴマーによってｉｎ ｖｉｖｏで制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がトランスフェクトされる、がんを処置する方法が提供される。
実施形態１５により、干渉オリゴマーが、ＦＯＸＰ３Ｓ促進モルホリノである、実施形態１２又は１４の方法が提供される。
実施形態１６により、干渉オリゴマーが
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ及び
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ
からなる群から選択される核酸塩基の配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１６により、干渉オリゴマーが
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ及び
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ
からなる群から選択される核酸塩基の配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１７により、前記干渉オリゴマーがホスホロジアミデートモルホリノであり、場合により、干渉オリゴマーがｉＲＮＡである、実施形態１２～１６のいずれか１つの方法が提供される。
実施形態１８により、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする遺伝子によって前記Ｔｒｅｇをトランスフェクトするステップをさらに含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法が提供される。
実施例１
本明細書に開示されるように、本出願人により、ＦＯＸＰ３のエクソン２に欠失変異を持つとして４人の患者が同定された（図１Ａ）。これらの変異は、エクソン２を含有するｍＲＮＡにフレームシフトをもたらし、したがって、ＦＯＸＰ３Ｌのアミノ酸配列を変更及びトランケートした。しかしながら、選択的にスプライスされたＦＯＸＰ３Ｓアイソフォーム－変異エクソン２を除く－は、インタクトであると予測される。２つの抗ＦＯＸＰ３抗体－ｐａｎ－ＦＯＸＰ３抗体（クローン２５９Ｄ）及びエクソン２特異的抗体（クローン１５０Ｄ）による、患者＃３からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の染色は、患者の９．３％のＣＤ４＋Ｔ細胞がｐａｎ－ＦＯＸＰ３に陽性に染色されるが、エクソン２特異的抗体には陰性であることが示され、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの発現が示された（図１Ｂ）。健常対照では、ＦＯＸＰ３Ｓ及びＦＯＸＰ３Ｌは、所与のＴｒｅｇ細胞において選択的スプライシングにより共発現され、したがって、両抗体に陽性に染色された（図１Ｂ）。近年の研究と一致して、本発明者らのデータは、ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームが無く、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォーム単独では、自己寛容の維持に不十分であり、自己免疫をもたらすことを実証した。
本明細書に開示されるように、本出願人により、ＦＯＸＰ３のエクソン２に欠失変異を持つとして４人の患者が同定された（図１Ａ）。これらの変異は、エクソン２を含有するｍＲＮＡにフレームシフトをもたらし、したがって、ＦＯＸＰ３Ｌのアミノ酸配列を変更及びトランケートした。しかしながら、選択的にスプライスされたＦＯＸＰ３Ｓアイソフォーム－変異エクソン２を除く－は、インタクトであると予測される。２つの抗ＦＯＸＰ３抗体－ｐａｎ－ＦＯＸＰ３抗体（クローン２５９Ｄ）及びエクソン２特異的抗体（クローン１５０Ｄ）による、患者＃３からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の染色は、患者の９．３％のＣＤ４＋Ｔ細胞がｐａｎ－ＦＯＸＰ３に陽性に染色されるが、エクソン２特異的抗体には陰性であることが示され、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの発現が示された（図１Ｂ）。健常対照では、ＦＯＸＰ３Ｓ及びＦＯＸＰ３Ｌは、所与のＴｒｅｇ細胞において選択的スプライシングにより共発現され、したがって、両抗体に陽性に染色された（図１Ｂ）。近年の研究と一致して、本発明者らのデータは、ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームが無く、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォーム単独では、自己寛容の維持に不十分であり、自己免疫をもたらすことを実証した。
２つのＦＯＸＰ３アイソフォームの機能差を研究するため、本発明者らは、エクソン２を欠損するＦｏｘｐ３の短いアイソフォームをコードする、マウスＦｏｘｐ３遺伝子（Ｆｏｘｐ３Ｓ）のエクソン２を欠失させたが、イントロン調節エレメントはインタクトなままにした。Ｆｏｘｐ３Ｓマウスは、胸腺細胞及び胸腺のＴｒｅｇ発生に影響せず、生存可能であり、形態学的に正常であった。Ｆｏｘｐ３Ｌアイソフォームのみを発現するＷＴマウスと比較して、Ｆｏｘｐ３Ｓマウスは、約４０日齢（図２Ｂ）で抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧを発生した（図２Ａ）。２ヶ月齢のＦｏｘｐ３Ｓマウスからの血清は、マウス３Ｔ３細胞の核を強く染色し（図２Ｃ）、抗核自己抗体（ＡＮＡ）の存在を示している。これらのマウスは、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームのみを発現する患者の表現型（図１Ａ）に似た湿疹及び腎障害も発症した（データは示さない）。
Ｆｏｘｐ３Ｓマウスは、自己寛容を維持できないため、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３Ｓアイソフォームのみを発現するＴｒｅｇが、エフェクターヘルパーＴを抑制する能力を欠損しているか疑った。驚いたことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイでは、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇ及びＦｏｘｐ３Ｌ Ｔｒｅｇは、十分に等しくレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制した（データは示さない）。本発明者らは、自己免疫疾患の兆候を示さない、ヘテロ接合のＦｏｘｐ３エクソン２欠失（Ｆｏｘｐ３Ｓ／Ｌ）雌マウスのＴｒｅｇを調べた。無作為Ｘ染色体不活性化により、これらのマウスは、Ｆｏｘｐ３Ｓアイソフォーム又はＦｏｘｐ３Ｌアイソフォームのいずれかを発現するが、両方ではないＴｒｅｇの２つの集団を有する。Ｆｏｘｐ３Ｓ／Ｌ雌マウスの胸腺における約５０％のＴｒｅｇがＦｏｘｐ３Ｓアイソフォームを発現したが、その頻度は、約２０％まで大きく低減した（図３Ａ）。末梢におけるそのようなＦＯＸＰ３Ｓ Ｔｒｅｇ頻度の低減は、ＷＴ ＦＯＸＰ３対立遺伝子及びエクソン２領域内の欠失変異（ｃ．３０５ｄｅｌＴ）によりＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームのみをコードする他のＦＯＸＰ３対立遺伝子を持つ女性においても観察された（公開されたデータ）。このヘテロ接合の雌は、５０％というよりむしろ、１７％のＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームのみを発現する循環Ｔｒｅｇを有した。
末梢において頻度が大いに低減したことから（図３Ａ）、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇが不安定であるという仮説を立てた。この仮説を試験するため、本発明者らは、ＴＧ：Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ－Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－ＹＦＰマウスをＦｏｘｐ３Ｌ（ＷＴ）又はＦｏｘｐ３Ｓマウスと交雑させ、系統追跡マウス株を作製した（図３Ｂ）。本発明者らは、著しく多くのＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇが、Ｆｏｘｐ３Ｌ Ｔｒｅｇ（図３Ｃ）よりも、Ｆｏｘｐ３発現（ＹＦＰ＋Ｆｏｘｐ３Ｄｉｍ及びＹＦＰ＋Ｆｏｘ３－）を下方制御し、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇの不安定性を示している。
胸腺由来Ｔｒｅｇが自己反応性ＴＣＲを発現するという事実は、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇが、Ｆｏｘｐ３発現の欠損時に自己反応性エフェクターになり、自己免疫をもたらす可能性を示唆している。この仮説を試験するため、本発明者らは、図４Ａに示すように、精製したＦｏｘｐ３Ｓ及び／又はＦｏｘｐ３Ｌ Ｔｒｅｇを、Ｔｃｒｂ欠損レシピエントマウスに移植した。細胞移植の３ヶ月後、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇを受けたレシピエントマウスは、抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ自己抗体（図４Ｂ）及び抗核自己抗体（図４Ｃ）を発生した。Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇを受けたレシピエントマウスは、Ｆｏｘｐ３Ｌ Ｔｒｅｇ又は混合Ｔｒｅｇを受けたものよりも濾胞性ヘルパーＴ細胞及びＧＣ Ｂ細胞を著しく増加した。レシピエントＴｃｒｂ欠損マウスは、αβＴ細胞を持たないため、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇを受けたマウスに見られるＴｆｈ細胞は、養子移植したＴｒｅｇ由来であり、自己反応性Ｔｆｈ細胞へと分化転換するＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇの能力を示している。
Ｆｏｘｐ３Ｓ ＴｒｅｇがヘルパーＴ細胞に分化し、自己反応性免疫応答を媒介し得るという本発明者らのデータ（図４Ａ～４Ｃ）は、Ｆｏｘｐ３Ｓマウスが腫瘍進行に耐性を付与し得るという仮説をもたらした。０．５×１０６個のＥＯ７７１乳がん細胞（マウストリプルネガティブ乳がん細胞株）は、ＷＴ及びＦｏｘｐ３Ｓ雌マウスの第４乳房脂肪パッドへと同所性注射された。全てのＷＴマウスが、がん細胞注射の１７日後に顕著な腫瘍増殖（平均＝２００ｍｍ３）を示した一方で、Ｆｏｘｐ３Ｓマウスは、初めは、およそ２０～３０ｍｍ３の小さい塊を発生し、次いで退行又は消失した（図５Ａ）。このデータは、Ｆｏｘｐ３Ｓアイソフォームが、ＥＯ７７１腫瘍増殖に対して抗腫瘍免疫を促進することを強く示唆している。同様に、本発明者らは、ルイス肺癌（ＬＬＣ）（図５Ｂ）、Ｂ１６メラノーマ（図５Ｃ）及びＭＣ３８大腸腺癌（図５Ｄ）の腫瘍増殖を比較し、これら全ての腫瘍増殖がＷＴマウスにおいてよりもＦｏｘｐ３Ｓマウスにおいて著しく遅いことを見出した。
本発明者らは、単一細胞ＲＮＡシークエンシングを実施し、ＷＴ及びＦｏｘｐ３ＳマウスにおいてＥＯ７７１腫瘍に浸潤する免疫細胞の表現型を決定した。本発明者らは、腫瘍に浸潤する多くのＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇが、ヘルパーＴ２様表現型を示したが、多くのＦｏｘｐ３Ｌ ＴｒｅｇがＴｒｅｇ表現型のままであったことを見出した（図６Ａ）。また、ＷＴマウスにおけるものよりもＦｏｘｐ３Ｓマウスにおいて、腫瘍に浸潤するエフェクターＣＤ８細胞傷害性細胞が著しく多かった（図６Ａ）。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）プロファイリング解析は、ＷＴマウス由来よりもＦｏｘｐ３Ｓマウス由来のＥＯ７７１ ＴＮＢＣ腫瘍においてＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方のより大きなクローン増殖を実証した（図６Ｂ）。Ｆｏｘｐ３Ｓマウスにおいて見られる抗腫瘍免疫の増強は、Ｆｏｘｐ３Ｓマウスにおいて、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗体媒介性枯渇がＥＯ７７１ ＴＮＢＣ増殖を回復するため、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞に補助を提供するＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇの能力によるようである（図６Ｃ及び６Ｄ）。
本発明者らは、次に、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの乳がん組織のトランスクリプトームデータセットを解析し、ヒト乳がんにおけるＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの臨床的関連性を評価した。トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）症例では、乳がん組織におけるＦＯＸＰ３Ｓ発現は、より良好な全生存率と相関した（図７Ａ）。このデータセットを使用して、本発明者らは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ－汎用コンピューター法により、ＴＮＢＣ組織に浸潤する免疫細胞の組成を推定した。本発明者らの単一細胞ＲＮＡシークエンシング結果（図６Ａ）と一致して、ＦＯＸＰ３Ｓの高発現は、腫瘍組織に浸潤するＣＤ８及び細胞傷害性リンパ球の増加と正に相関した（図７Ｂ）。
実施例２
トリプルネガティブ乳がん処置において、Ｆｏｘｐ３アイソフォームをシフトするモルホリノの有効性をマウスモデルで試験した。１×１０６個のＥＯ７７１ ＴＮＢＣ細胞は、野生型マウスの両側の第４乳房脂肪パッドへと同所性注射された。１２、１４、１６及び１８日目に、３０ｎｍｏｌ／マウスのＦｏｘｐ３アイソフォームをシフトするモルホリノ（Ｅ２ ＭＯ）又は対照ＭＯを左側の腫瘍に腫瘍内注射し、右側の腫瘍は内部対照として残した（図８Ａ）。Ｅ２ ＭＯの腫瘍内注射は、左側の処置した腫瘍の増殖を著しく抑制しただけでなく（図８Ｂ）、右側の未処置の腫瘍の増殖も遅延させた（図８Ｃ）。Ｅ２ ＭＯ処置は、Ｆｏｘｐ３Ｌ ＴｒｅｇをＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇに変換した。対照ＭＯを受けた腫瘍ではＦｏｃｐ３Ｓ Ｔｒｅｇは見られなかったが（データは示さない）、Ｅ２ ＭＯを注射した腫瘍では、約３０％のＴｒｅｇがＦｏｘｐ３Ｓアイソフォームを発現した（図８Ｄ）。さらに、同じマウスの右側の未処置の腫瘍では、約６％のＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇが腫瘍内に見られた（図８Ｄ）。腫瘍浸潤リンパ球の免疫表現型検査は、Ｅ２ ＭＯ注射した腫瘍において著しく高い割合のＣＤ４（図８Ｅ）及びＣＤ８（図８Ｆ）Ｔ細胞がＩＦＮ－γを発現したことを明らかにした。
トリプルネガティブ乳がん処置において、Ｆｏｘｐ３アイソフォームをシフトするモルホリノの有効性をマウスモデルで試験した。１×１０６個のＥＯ７７１ ＴＮＢＣ細胞は、野生型マウスの両側の第４乳房脂肪パッドへと同所性注射された。１２、１４、１６及び１８日目に、３０ｎｍｏｌ／マウスのＦｏｘｐ３アイソフォームをシフトするモルホリノ（Ｅ２ ＭＯ）又は対照ＭＯを左側の腫瘍に腫瘍内注射し、右側の腫瘍は内部対照として残した（図８Ａ）。Ｅ２ ＭＯの腫瘍内注射は、左側の処置した腫瘍の増殖を著しく抑制しただけでなく（図８Ｂ）、右側の未処置の腫瘍の増殖も遅延させた（図８Ｃ）。Ｅ２ ＭＯ処置は、Ｆｏｘｐ３Ｌ ＴｒｅｇをＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇに変換した。対照ＭＯを受けた腫瘍ではＦｏｃｐ３Ｓ Ｔｒｅｇは見られなかったが（データは示さない）、Ｅ２ ＭＯを注射した腫瘍では、約３０％のＴｒｅｇがＦｏｘｐ３Ｓアイソフォームを発現した（図８Ｄ）。さらに、同じマウスの右側の未処置の腫瘍では、約６％のＦｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇが腫瘍内に見られた（図８Ｄ）。腫瘍浸潤リンパ球の免疫表現型検査は、Ｅ２ ＭＯ注射した腫瘍において著しく高い割合のＣＤ４（図８Ｅ）及びＣＤ８（図８Ｆ）Ｔ細胞がＩＦＮ－γを発現したことを明らかにした。
Ｅ２ ＭＯの腫瘍内注射からの結果（図８）は、Ｆｏｘｐ３発現のＦｏｘｐ３Ｓアイソフォームへのシフトは、抗腫瘍免疫を促進するのに１００％に達する必要はないことを示唆している。これを確かめるため、本発明者らは、ＥＯ７７１ ＴＮＢＣ細胞を、末梢において２０～３０％のＴｒｅｇがＦｏｘｐ３Ｓアイソフォームを発現するＦｏｘｐ３Ｓ／Ｌヘテロ接合マウスに接種した（図３Ａ）。実際、Ｆｏｘｐ３Ｓ／Ｌマウスの腫瘍は、ＷＴマウスにおけるよりも著しく遅く増殖した（図９Ａ）。さらに、腫瘍を担持するＦｏｘｐ３Ｓ／Ｌマウスへの抗ＰＤ－１抗体の投与（１２日目と２４日目との間に１０ｍｇ／ｋｇで４回投与）は、腫瘍増殖を完全に停止させた一方、腫瘍を担持するＷＴマウスの、抗ＰＤ－１抗体による処置は、腫瘍増殖に効果がなかった（図９Ａ）。
Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇの抗腫瘍免疫をブーストする能力をさらに試験するため、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇ及びＦｏｘｐ３Ｌ Ｔｒｅｇをドナーマウスから単離し、接種の１２日後に、ＥＯ７７１ ＴＮＢＣへと２×１０６個のＴｒｅｇを腫瘍内注射した（図９Ｂ）。結果は、Ｆｏｘｐ３Ｓ Ｔｒｅｇ単独が、抗腫瘍免疫の増強及び腫瘍増殖を著しく遅延させるのに十分であることを実証した（図９Ｂ）。このデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３Ｓ発現を増加させ、マウスに細胞を戻し、再導入して抗腫瘍免疫をブーストすることが可能であることを示唆している。本発明者らは、次いで、腫瘍担持ＷＴマウスの流入領域リンパ節からの全Ｔ細胞を単離し、７日間、アイソフォームをシフトするＥ２ ＭＯ又は対照ＭＯ（１μＭ）の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。２×１０６個の増殖させたＴ細胞を、１０日間、ＷＴマウスで増殖した腫瘍に注射した。Ｅ２ ＭＯによって増殖したＴ細胞は、腫瘍増殖を著しく低減させ、ＰＤ－１処置との組合せは、有効性をさらに増強した（図９Ｃ）。
実施例３
末梢血単核細胞を、健常ドナーから得て、３週間、１μＭのアイソフォームをシフトするモルホリノ（Ｅ２ ＭＯ）とｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。フローサイトメトリー解析は、ほとんどのＴｒｅｇがＦＯＸＰ３Ｓアイソフォーム（ｐａｎ－ＦＯＸＰ３抗体染色に陽性であるが、ＦＯＸＰ３エクソン２特異的抗体染色には陰性である）のみを発現する一方で、ＭＯ処置しないＴｒｅｇはＦＯＸＰ３Ｌを発現したことを示した（ＦＯＸＰ３エクソン２特異的抗体染色に陽性）（図１０Ａ）。ＭＯ処置したＴｒｅｇは、阻害分子を下方制御するが、ヘルパーＴ細胞に通常発現する共刺激分子を上方制御した（データは示さない）。さらに、ＭＯ処置したＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインＩＦＮ－γを高発現した（図１０Ｂ）。したがって、本発明者らは、ヒトＦＯＸＰ３発現をＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトするのに非常に有効であり、そのようなアイソフォームのシフトが、共刺激分子及びエフェクターサイトカインを上方制御するヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）をもたらすモルホリノを同定した。
末梢血単核細胞を、健常ドナーから得て、３週間、１μＭのアイソフォームをシフトするモルホリノ（Ｅ２ ＭＯ）とｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。フローサイトメトリー解析は、ほとんどのＴｒｅｇがＦＯＸＰ３Ｓアイソフォーム（ｐａｎ－ＦＯＸＰ３抗体染色に陽性であるが、ＦＯＸＰ３エクソン２特異的抗体染色には陰性である）のみを発現する一方で、ＭＯ処置しないＴｒｅｇはＦＯＸＰ３Ｌを発現したことを示した（ＦＯＸＰ３エクソン２特異的抗体染色に陽性）（図１０Ａ）。ＭＯ処置したＴｒｅｇは、阻害分子を下方制御するが、ヘルパーＴ細胞に通常発現する共刺激分子を上方制御した（データは示さない）。さらに、ＭＯ処置したＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインＩＦＮ－γを高発現した（図１０Ｂ）。したがって、本発明者らは、ヒトＦＯＸＰ３発現をＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームへとシフトするのに非常に有効であり、そのようなアイソフォームのシフトが、共刺激分子及びエフェクターサイトカインを上方制御するヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）をもたらすモルホリノを同定した。
本発明者らは、次に、Ｅ２ ＭＯの存在下で増殖した腫瘍浸潤リンパ球が、自己腫瘍細胞の死滅を増強したかどうか試験した。乳がん及び大腸がん患者からの腫瘍摘出を得た。腫瘍オルガノイドは、切除からの腫瘍細胞から生成され、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、Ｅ２ ＭＯの存在下又は非存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。７日間の増殖後、ＴＩＬを自家腫瘍オルガノイドと共培養し、オルガノイドのサイズを測定した。乳がん患者（図１１Ａ～１１Ｄ）及び大腸がん患者（図１１Ｅ～１１Ｈ）からの、４つのＥ２ ＭＯ増殖したＴＩＬのうちの３つが、それらの相当するオルガノイドの著しい死滅の増強を示した。
Claims (28)
- 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を変更する方法であって、該ＴｒｅｇにおいてＦＯＸＰ３アイソフォーム、ＦＯＸＰ３Ｌ及びＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を改変するステップを含み、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームの量がＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームと比較して増加される、上記方法。
- ＦＯＸＰ３Ｌを標的化する干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより、場合によりＦＯＸＰ３のエクソン２を標的化することにより、ＦＯＸＰ３Ｓと比較してＦＯＸＰ３Ｌの発現が阻害される、請求項１に記載の方法。
- ＦＯＸＰ３Ｓの発現が、ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする核酸によってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより、ＦＯＸＰ３Ｌと比較して増強される、請求項２に記載の方法。
- 単離したＴｒｅｇのヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導するのに十分な量の干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトする、請求項３に記載の方法。
- ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームの相対発現が、
ｉ）配列番号１若しくは配列番号１２と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸塩基配列、又は
ｉｉ）配列番号１若しくは配列番号１２の少なくとも連続する１０核酸塩基断片；又は
ｉｉｉ）ｉ）若しくはｉｉ）の相補鎖
を含むＦＯＸＰ３Ｌ標的化干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることにより減少される、請求項４に記載の方法。 - 標的化干渉オリゴマーが、ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）の核酸塩基配列、又はその相補鎖を含む、請求項５に記載の方法。
- ＦＯＸＰ３Ｌアイソフォームの相対発現が、ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号２）又はＣＣＡＵＵＣＡＣＣＧＵＣＣＡＵＡＣ（配列番号９）を含む配列に特異的に結合するＦＯＸＰ３Ｌ標的化干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることによって減少される、請求項４に記載の方法。
- 干渉オリゴマーが、
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号２）、
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ（配列番号４）、
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号５）、
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号６）、
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ（配列番号７）
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号８）及び
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号１）又はそのＲＮＡカウンターパート
からなる群から選択される配列に特異的に結合する、請求項７に記載の方法。 - 干渉オリゴマーが、ＧＵＡＵＧＧＡＣＧＧＵＧＡＡＵＧＧ（配列番号１０）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む干渉ＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
- 干渉オリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノである、請求項８に記載の方法。
- ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする遺伝子によってＴｒｅｇをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
- 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を増加させるステップを含む、患者においてがんを処置する方法。
- ＦＯＸＰ３Ｓの相対濃度の増加が、
単離したＴｒｅｇにおいて、ＦＯＸＰ３を標的化する干渉オリゴマーによって該単離したＴｒｅｇをｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトすること；及び
トランスフェクトしたＴｒｅｇを前記患者に再導入すること
によって達成される、請求項１２に記載の方法。 - Ｔｒｅｇにおいて、ＦＯＸＰ３Ｌと比較してＦＯＸＰ３Ｓの細胞内濃度を増加させるのに有効な量で、干渉オリゴマーによってｉｎ ｖｉｖｏで制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がトランスフェクトされる、請求項１２に記載の方法。
- 干渉オリゴマーが、ＦＯＸＰ３Ｓ促進モルホリノである、請求項１４に記載の方法。
- ＦＯＸＰ３Ｌの発現が、ＦＯＸＰ３エクソン２を標的化し、
ｉ）核酸塩基
ＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧ（配列番号１２）若しくはその完全な相補鎖、又は
ｉｉ）連続する１０、１５、１７、２０若しくは２５ｂｐ若しくはそれ以上の配列番号１２の断片配列又はその相補鎖
に結合する配列を含む、干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトすることによって減少される、請求項１２に記載の方法。 - 干渉オリゴマーが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
- 干渉オリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノである、請求項１６に記載の方法。
- 干渉オリゴマーが、
ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ
ＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣ
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧ
ＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧ
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣ
ＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴ及び
ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧ
からなる群から選択される核酸塩基の配列を含む、請求項１２に記載の方法。 - 干渉オリゴマーがホスホロジアミデートモルホリノである、請求項１９に記載の方法。
- 干渉オリゴマーがｉＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
- ＦＯＸＰ３Ｓアイソフォームをコードする遺伝子によってＴｒｅｇをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 原発性又は転移性ＴＮＢＣモデルにおいて、ＦＯＸＰ３Ｓ促進モルホリノと組み合わせて免役チェックポイント遮断ＰＤ－１抗体を患者に投与するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の腫瘍反応性ヘルパー様Ｔ細胞への分化転換を誘導する方法であって、Ｔｒｅｇにおいて、ＦＯＸＰ３Ｓ発現を増強するのに有効な量のＦＯＸＰ３Ｓ促進干渉オリゴマーによってＴｒｅｇをトランスフェクトするステップを含む、方法。
- 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が、ＦＯＸＰ３Ｌのエクソン２に結合する干渉オリゴヌクレオチドによってｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされ、トランスフェクションが組織ナノトランスフェクションによる、請求項２４に記載の方法。
- 患者におけるがんの免疫治療処置を増強する方法であって、該患者においてＦＯＸＰ３Ｓアイソタイプを発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数を増加させるステップを含む、方法。
- 増加した数のＦＯＸＰ３Ｓアイソタイプを発現するＴｒｅｇが、ＦＯＸＰ３Ｌの細胞内レベルよりも多いＦＯＸＰ３Ｓの細胞内レベルを発現する、請求項２６に記載の方法。
- 処置されるがんが、固形腫瘍であり、場合により、がんが乳がんである、請求項２６又は２７に記載の方法。
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