JP2023542241A - 糖尿病を処置するための修飾型インスリンおよびグルコキナーゼ核酸 - Google Patents

糖尿病を処置するための修飾型インスリンおよびグルコキナーゼ核酸 Download PDF

Info

Publication number
JP2023542241A
JP2023542241A JP2023524498A JP2023524498A JP2023542241A JP 2023542241 A JP2023542241 A JP 2023542241A JP 2023524498 A JP2023524498 A JP 2023524498A JP 2023524498 A JP2023524498 A JP 2023524498A JP 2023542241 A JP2023542241 A JP 2023542241A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
polynucleotide
nucleic acid
sequence
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023524498A
Other languages
English (en)
Inventor
ナチ グプタ，
ウェイラン シェン，
マルティネス， ミケル ガルシア
センサーノ， ヴェロニカ ヒメネス
トゥーベルト， マリア ファティマ ボッシュ
Original Assignee
クリヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド
ウニヴェルシタット・アウトノマ・デ・バルセロナ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by クリヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド, ウニヴェルシタット・アウトノマ・デ・バルセロナ filed Critical クリヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド
Publication of JP2023542241A publication Critical patent/JP2023542241A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01002—Glucokinase (2.7.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、インスリンおよびグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列、それを含む発現カセットおよび送達ベクター、ならびに糖尿病を処置するためのそれらの送達方法に関する。特定の態様は、ヒトインスリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象とし、このポリヌクレオチドは、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、必要に応じて、シグナルペプチドは野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸位置に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み、必要に応じて、ポリヌクレオチドは切断部位をさらに含む。

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０２０年７月３日に出願された米国仮出願第６３／０４７，９６５号、２０２０年７月２０日に出願された米国仮出願第６３／０５４，１６２号、２０２０年８月１８日に出願された米国仮出願第６３／０６７，２６４号、２０２１年１月２６日に出願された米国仮出願第６３／１４１，９１８号、および２０２１年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／１８８，７８８号の優先権の利益を主張するものであり、これらの米国仮出願の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
本願と共に提出された、ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子提出された配列表（４５２５＿０１６ＰＣ０５＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５、サイズ：２４０，３６０バイト、および作成日：２０２１年６月３０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
真性糖尿病の２つの主な形態は、１型（Ｔ１ＤＭ）および２型（Ｔ２ＤＭ）である（Diabetes care, 1997, 20-1183-1197）。
Ｔ１ＤＭは、膵臓β細胞の特異的な破壊に起因するインスリン産生の重篤な欠如によって特徴付けられる。Ｔ１ＤＭにおけるβ細胞の喪失は、膵島炎と呼ばれる慢性炎症がβ細胞の破壊を引き起こす自己免疫媒介プロセスの結果である（Eizirik D. L. et al, 2001, Diabetologia, 44:2115-2133およびMathis D et al, 2001, Nature, 414: 792-798）。Ｔ１ＤＭは、小児の内分泌状態および代謝状態で最も一般的なものの１つであり、発生率は、幼児の間で特に急速に上昇している。Ｔ１ＤＭは、自己免疫媒介性のβ細胞の破壊がほぼ完了し、患者が生存のためにインスリン補充療法を必要とするようになったときに診断される。成人におけるＴ１ＤＭは、Ｔ２ＤＭと同様に現れることがあり、代謝制御がゆっくりと悪化し、その後にインスリン依存状態へと進行する。この形態は、成人潜在性自己免疫性真性糖尿病（ＬＡＤＡ）と呼ばれている（Diabetes Atlas 4th edition, 2009, International Diabetes Federation）。
Ｔ２ＤＭは、真性糖尿病の最も一般的な形態であり、遺伝的危険因子、環境的危険因子、および行動的危険因子の間の相互作用に起因するとされている。Ｔ２ＤＭは、インスリン非感受性、インスリン産生量低下、および最終的な膵臓ベータ細胞不全によって特徴付けられる（Olokoba, A. et al, 2012, Oman Med. J. 27(4):269-273）。
生涯にわたるインスリン処置が、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの両方のために選ばれる療法であることが多い。生涯にわたる外因性インスリンでの処置は糖尿病の管理において概ね成功しているが、厳格な血糖制御を維持することは困難であるため、糖尿病性合併症が依然として起こり得る。長期に及ぶ高血糖の状態は、網膜症、ニューロパチー、腎症、脳血管発作、または心筋梗塞として現れることが最も一般的である、重篤な微小血管性または大血管性の合併症につながり得る。これらの深刻な合併症は、血糖制御の向上によって防止することができる。なお、特に易変性の形態である不安定型糖尿病は、生涯にわたって外因性インスリンを用いても管理がきわめて困難であり得る。
さらに、多くの発展途上国では、セルフケアツールおよびインスリンへのアクセスが限られていることがあり、これは、糖尿病の小児における重大なハンディキャップおよび早期死亡につながり得る（Diabetes Atlas 4th edition, 2009, International Diabetes Federation, Beran D. et al 2006, Lancet, 368: 1689-1695、およびGale E. A., et al, 2006, Lancet, 368: 1626-1628）。糖尿病を有する小児において最も一般的な死因は、世界的に見ると、インスリンにアクセスできないことである。したがって、１回限りの遺伝子療法アプローチが利用できれば、インスリンへのアクセスが限られる状況において絶大な効果が得られる可能性がある（Greenwood H. L. et al, 2006, PLoS Med 3.e381）。
高血糖の低下および正常血糖の維持は、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭに対するあらゆる治療アプローチの目標である。ほとんどの糖尿病患者に対する現在の療法は、短時間作用性および長時間作用性の両方のインスリン調製物の定期的な皮下注射に基づいている。
Diabetes care, 1997, 20-1183-1197 Eizirik D. L. et al, 2001, Diabetologia, 44:2115-2133 Mathis D et al, 2001, Nature, 414: 792-798 Diabetes Atlas 4th edition, 2009, International Diabetes Federation Olokoba, A. et al, 2012, Oman Med. J. 27(4):269-273 Beran D. et al 2006, Lancet, 368: 1689-1695 Gale E. A., et al, 2006, Lancet, 368: 1626-1628 Greenwood H. L. et al, 2006, PLoS Med 3.e381
開示の分野
本開示は、糖尿病の処置において使用するためのインスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸を含む遺伝子療法組成物を含む、医学分野に関連する。
簡潔な概要
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）をコードするポリヌクレオチドを対象とし、このポリヌクレオチドは、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、必要に応じて、シグナルペプチドは野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸位置に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み、必要に応じて、ポリヌクレオチドは切断部位をさらに含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列である。一部の態様では、切断部位は、フーリン切断部位である。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象とし、この核酸は、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）配列番号４３～５７、１１０～１１６、１５０～１５１、１５４～１５５、および１５７～１５９のいずれかの核酸７３～３３０、配列番号１１７～１２２、１５２、および１５６のいずれかの核酸８８～３４５、または配列番号１５３の核酸７９～３３６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列とを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）、および（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０を含む。一部の態様では、コードされるヒトインスリンタンパク質は、切断部位（例えば、フーリン切断部位）をさらに含む。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象とし、この核酸は、配列番号４３～５７、１１０～１２２、または１５０～１５９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＩｎｓタンパク質をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３～５７、１１０～１２２、または１５０～１５９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＯＲＦヌクレオチド配列を少なくとも２つ含み、２つのＯＲＦヌクレオチド配列は、同じであっても異なっていてもよい。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列をさらに含む。一部の態様では、少なくとも２つのＯＲＦヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ配列によって分離されている。
一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、シグナル配列およびプロインスリンポリペプチドを含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、プレプロインスリンである。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、配列番号１～１６、８４～８８、１２３～１４１、または１６０～１６１のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象とし、この核酸は、（ｉ）シグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾（または、野生型プレプロインスリンにおける対応するアミノ酸に対して、アミノ酸Ｈ３４、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、Ｌ８６、もしくはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾）を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む。
一部の態様では、シグナルペプチドは、野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない（例えば、野生型プレプロインスリン配列が、ＩＬ－６シグナル配列またはフィブロネクチンシグナル配列に置き換えられている）。一部の態様では、プロインスリンポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、ポリヌクレオチドは、切断部位（例えば、フーリン切断部位）をさらに含む。
一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）は、（ｉ）Ｈ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、もしくはＨ３４Ｖ（または、プロインスリンＢ鎖のＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはバリン（Ｖ））、および／または（ｉｉ）野生型プレプロインスリン配列に対して、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、および／もしくはＬ８６（あるいは、プロインスリンＢ鎖のＢ２８位および／もしくはＢ２９位またはプロインスリンＣ鎖のＣ１位および／もしくはＣ３２位）における１つもしくは複数のアミノ酸修飾から選択されるアミノ酸修飾を含む。一部の態様では、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、および／またはＬ８６における１つまたは複数のアミノ酸修飾は、Ｐ５２Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、Ｌ８６Ｒ、またはそれらの任意の組合せを含む（または、プロインスリンＢ鎖もしくはＣ鎖における１つもしくは複数の修飾は、プロインスリンＢ鎖のＢ２８位におけるプロリン（Ｐ）からアスパラギン酸（Ｄ）、プロインスリンＢ鎖のＢ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、プロインスリンＣ鎖のＣ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、プロインスリンＣ鎖のＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）、もしくはそれらの任意の組合せを含む）。
本開示のある特定の態様は、ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象とし、この核酸は、配列番号６１～８０もしくは１６２のいずれかの核酸１～１３９８、または配列番号６１～８０および１６２のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む。一部の態様では、コードされるヒトＧｃｋタンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、Ｇｃｋタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列は、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、核酸は、配列番号４２、配列番号４２の５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、核酸は、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、配列番号２０～３９および８９～９６、ならびに１６３～１６４のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、核酸は、プロモーター（例えば、真核生物プロモーター）に作動可能に連結している。本開示のある特定の態様は、本開示のポリヌクレオチドと、核酸配列に作動可能に連結した異種発現制御配列とを含む、発現カセットを対象とする。一部の態様では、核酸は、ポリアデニル化（ポリＡ）エレメントに作動可能に連結している。
本開示のある特定の態様は、本開示のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクター（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソーム）を対象とする。一部の態様では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。本開示のある特定の態様は、ＡＡＶカプシドと、本開示のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を対象とする。一部の態様では、ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶｒｈ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２からなる群から選択される。本開示のある特定の態様は、本開示のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）を対象とする。
本開示のある特定の態様は、対象においてヒトＩｎｓタンパク質および／またはヒトＧｃｋタンパク質を産生させる方法であって、本開示のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を対象に投与し、それにより、対象においてヒトＩｎｓタンパク質および／またはヒトＧｃｋを産生させることを含む方法を対象とする。本開示のある特定の態様は、糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善（ameliorate）させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、本開示のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子の治療有効量を対象に送達し、それにより、対象の糖尿病を処置することを含む方法を対象とする。一部の態様では、糖尿病は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である。
一部の態様では、本明細書で開示される方法は、ヒトインスリンをコードする第１のポリヌクレオチドおよびヒトＧｃｋをコードする第２のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチド、ヒトインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む第１の発現カセットおよびヒトＧｃｋをコードするポリヌクレオチドを含む第２の発現カセットを含む複数の発現カセット、ヒトインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む第１のベクターおよびヒトＧｃｋをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む第２のベクターを含む複数のベクター、またはヒトインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む第１のｒＡＡＶ粒子およびヒトＧｃｋをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む第２のｒＡＡＶ粒子を含む複数のｒＡＡＶ粒子を対象に投与することを含む。一部の態様では、複数のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子は、共に（simultaneously）または順次投与される。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子の送達および／または投与は筋肉内である。一部の態様では、本開示の方法は、（ｉ）対象における血中糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルの低下および／もしくは調節、（ｉｉ）対象における循環ケトンの低減、（ｉｉｉ）対象におけるトリグリセリドの低減、または（ｉｖ）それらの任意の組合せをもたらす。
図１Ａは、ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）の未修飾型核酸配列（配列番号１、配列番号１２７、および配列番号１６０）および修飾型ｈＩｎｓ核酸配列（配列番号２～１６、８４～８８、１２３～１２６、および１２８～１４１）を含む核酸配列構築物のリストを示す。配列は、３’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および５’ＵＴＲ核酸配列を含む。ある特定の配列には、ＩＲＥＳ配列も含まれる。右側の縦列には、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトされた例示的なｐＡＡＶ－Ｉｎｓプラスミドが示されている。 図１Ａは、ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）の未修飾型核酸配列（配列番号１、配列番号１２７、および配列番号１６０）および修飾型ｈＩｎｓ核酸配列（配列番号２～１６、８４～８８、１２３～１２６、および１２８～１４１）を含む核酸配列構築物のリストを示す。配列は、３’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および５’ＵＴＲ核酸配列を含む。ある特定の配列には、ＩＲＥＳ配列も含まれる。右側の縦列には、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトされた例示的なｐＡＡＶ－Ｉｎｓプラスミドが示されている。 図１Ａは、ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）の未修飾型核酸配列（配列番号１、配列番号１２７、および配列番号１６０）および修飾型ｈＩｎｓ核酸配列（配列番号２～１６、８４～８８、１２３～１２６、および１２８～１４１）を含む核酸配列構築物のリストを示す。配列は、３’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および５’ＵＴＲ核酸配列を含む。ある特定の配列には、ＩＲＥＳ配列も含まれる。右側の縦列には、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトされた例示的なｐＡＡＶ－Ｉｎｓプラスミドが示されている。
図１Ｂおよび１Ｃは、０．５μｇ／ウェル（図１Ｂ）または０．１μｇ／ウェル（図１Ｃ）のいずれかのｐＡＡＶ－インスリンプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からのインスリン分泌を示すグラフである。各プラスミドのインスリン発現レベルを対照プラスミド（ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ＿２）と比較した。 図１Ｂおよび１Ｃは、０．５μｇ／ウェル（図１Ｂ）または０．１μｇ／ウェル（図１Ｃ）のいずれかのｐＡＡＶ－インスリンプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からのインスリン分泌を示すグラフである。各プラスミドのインスリン発現レベルを対照プラスミド（ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ＿２）と比較した。
図２Ａは、ヒトグルコキナーゼ（ｈＧｃＫ）の野生型核酸配列（配列番号１９および配列番号１６３）および修飾型ｈＧｃＫ核酸配列（配列番号２０～３９および８９～９６）を含む核酸配列構築物のリストを示す。配列は、３’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および５’ＵＴＲ核酸配列を含む。右側の縦列には、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトされた例示的なｐＡＡＶ－Ｇｃｋプラスミドが示されている。 図２Ａは、ヒトグルコキナーゼ（ｈＧｃＫ）の野生型核酸配列（配列番号１９および配列番号１６３）および修飾型ｈＧｃＫ核酸配列（配列番号２０～３９および８９～９６）を含む核酸配列構築物のリストを示す。配列は、３’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および５’ＵＴＲ核酸配列を含む。右側の縦列には、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトされた例示的なｐＡＡＶ－Ｇｃｋプラスミドが示されている。
図２Ｂは、２．５μｇ／ウェルのｐＡＡＶ－ＧｃｋプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞におけるグルコキナーゼ発現を示すグラフである。各プラスミドのＧｃＫ発現レベルを対照プラスミド（ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃＫＷＴ＿２）と比較した。
図３Ａ～３Ｃは、３つの独立した研究において、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））で、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ－９（配列番号１１０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）に感染させた２ｖ６．１１細胞の細胞抽出物における、細胞内ＡＡＶ１－ｈＩｎｓｕｌｉｎベクターゲノム（ｖｇ）の量を示すグラフである。図３Ａはアッセイ１であり、図３Ｂはアッセイ２であり、図３Ｃはアッセイ３である。
図４Ａ～４Ｃは、３つの独立した研究において、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））で、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１１０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）に感染させた２ｖ６．１１細胞における、ヒトインスリンｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。図４Ａはアッセイ１であり、図４Ｂはアッセイ２であり、図４Ｃはアッセイ３である。
図５Ａ～５Ｃは、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））でのベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１１０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）による、２ｖ６．１１細胞の３つの独立した感染研究後に測定した、分泌されたヒトインスリン（ｍＵ／Ｌ）のレベルを示すグラフである。図５Ａはアッセイ１であり、図５Ｂはアッセイ２であり、図５Ｃはアッセイ３である。
図６Ａ～６Ｃは、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））でのベクターＡ ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１１０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）による、２ｖ６．１１細胞の３つの独立した感染研究後に測定した、分泌されたヒトインスリンの機能性を示すグラフである。活性は、組換えヒトインスリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を標準対照として使用して、ｎｇ／ｍｌとして表されている。図６Ａはアッセイ１であり、図６Ｂはアッセイ２であり、図６Ｃはアッセイ３である。
図７Ａ～７Ｃは、３つの独立したアッセイにおいて、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））で、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（野生型）（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）に感染させた２ｖ６．１１細胞の細胞抽出物における、細胞内ＡＡＶ１－ヒトグルコキナーゼ（ｈＧｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）ベクターゲノム（ｖｇ）の量を示すグラフである。図７Ａはアッセイ１であり、図７Ｂはアッセイ２であり、図７Ｃはアッセイ３である。
図８Ａ～８Ｃは、３つの独立したアッセイにおいて、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））で、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（野生型）（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）に感染させた２ｖ６．１１細胞における、ヒトグルコキナーゼｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。図８Ａはアッセイ１であり、図８Ｂはアッセイ２であり、図８Ｃはアッセイ３である。
図９Ａ～９Ｃは、３つの独立したアッセイにおける、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））でのベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（野生型）（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）による、２ｖ６．１１細胞の３つの独立した感染研究後に測定した、細胞内グルコキナーゼレベル（ｎｇ／ｍｇ）を示すグラフである。図９Ａはアッセイ１であり、図９Ｂはアッセイ２であり、図９Ｃはアッセイ３である。
図１０Ａ～１０Ｃは、３つの独立したアッセイにおける、３つの異なるＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））でのベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（野生型）（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）による、２ｖ６．１１細胞の３つの独立した感染研究後の細胞抽出物において測定された、グルコキナーゼ酵素活性（ｍＵ／ｍｇ）を示すグラフである。図１０Ａはアッセイ１であり、図１０Ｂはアッセイ２であり、図１０Ｃはアッセイ３である。
図１１Ａ～１１Ｃは、給餌条件下または絶食条件下で、ヒトインスリン遺伝子（配列番号１）を含有するＡＡＶ１およびラットグルコキナーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ１を注射した個々のＣ５７Ｂｌｋ６マウスについての、注射の３週間後（図１１Ａ）、４週間後（図１１Ｂ）、および５週間後（図１１Ｃ）のグルコースレベルを示すグラフである。図１１Ｂの第４週時点は、絶食条件下で収集した。 図１１Ａ～１１Ｃは、給餌条件下または絶食条件下で、ヒトインスリン遺伝子（配列番号１）を含有するＡＡＶ１およびラットグルコキナーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ１を注射した個々のＣ５７Ｂｌｋ６マウスについての、注射の３週間後（図１１Ａ）、４週間後（図１１Ｂ）、および５週間後（図１１Ｃ）のグルコースレベルを示すグラフである。図１１Ｂの第４週時点は、絶食条件下で収集した。 図１１Ａ～１１Ｃは、給餌条件下または絶食条件下で、ヒトインスリン遺伝子（配列番号１）を含有するＡＡＶ１およびラットグルコキナーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ１を注射した個々のＣ５７Ｂｌｋ６マウスについての、注射の３週間後（図１１Ａ）、４週間後（図１１Ｂ）、および５週間後（図１１Ｃ）のグルコースレベルを示すグラフである。図１１Ｂの第４週時点は、絶食条件下で収集した。
図１２は、給餌条件下または絶食条件下で、ヒトインスリン遺伝子（配列番号１）を含有するＡＡＶ１およびラットグルコキナーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ１を注射したＣ５７Ｂｌｋ６マウスにおける、注射後５週間にわたって試験した平均グルコースレベルを示すグラフである。これらの時点は、絶食条件下で収集した第４週時点以外は給餌条件下で収集した。
図１３Ａ～１３Ｂは、修飾型インスリン核酸配列を含むＡＡＶプラスミド（ｐＡＡＶ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞についての細胞内インスリン含有量およびインスリン分泌レベルを示すグラフである。
図１４Ａ～１４Ｄは、修飾型インスリン核酸配列を含むｐＡＡＶをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるインスリンの発現レベルを示すグラフである。 図１４Ａ～１４Ｄは、修飾型インスリン核酸配列を含むｐＡＡＶをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるインスリンの発現レベルを示すグラフである。
図１５は、修飾型インスリン核酸配列を含むｐＡＡＶをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞についてのインスリン分泌レベルを示すグラフである。
図１６Ａ～１６Ｆは、修飾型インスリン核酸配列を含むＡＡＶベクターで処置したＣＤ１マウスの経口グルコース耐性試験後の血中グルコースレベルを示すグラフである。 図１６Ａ～１６Ｆは、修飾型インスリン核酸配列を含むＡＡＶベクターで処置したＣＤ１マウスの経口グルコース耐性試験後の血中グルコースレベルを示すグラフである。 図１６Ａ～１６Ｆは、修飾型インスリン核酸配列を含むＡＡＶベクターで処置したＣＤ１マウスの経口グルコース耐性試験後の血中グルコースレベルを示すグラフである。
図１７は、修飾型インスリン核酸配列を含むＡＡＶベクターで処置した健康なマウスの絶食時グルコースレベルを示すグラフである。測定値は、ＡＡＶ投与の３週間後に取得した。
図１８Ａ～１８Ｃは、ヒトＴＬＲ９を過剰発現するように修飾した後に、ＡＡＶ－ｒａｔＧｃｋまたはＡＡＶ－ｈＩｎｓＢ１０＿２（図１８Ａ）；ＡＡＶ１－ｈＧｃｋＷＴ、ＡＡＶ１－ｈＧｃｋ８、またはＡＡＶ１－ｈＧｃｋ１２（図１８Ｂ）；およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ、ＡＡＶ１－ｈＩｎｓ５、またはＡＡＶ１－ｈＩｎｓ７（図１８Ｃ）を形質導入したＨＥＫ細胞におけるＴＬＲ９刺激を示すグラフである。
図１９は、１型糖尿病のＳＴＺ誘導マウスモデルにおける経時的な平均血中グルコースレベルを示すグラフである。黒塗りの丸は非ＳＴＺ＋ＰＢＳビヒクル対照を表し、白抜きの丸はＳＴＺ＋ＰＢＳ対照を表し、白抜きの三角形はＡＡＶ１＿９２６＋ＡＡＶ１＿９２７（高用量）を表し、破線付きの黒塗りの三角形はＢ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）を表し、黒塗りのひし形はＩｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）を表し、実線付きの黒塗りの三角形はＢ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（中用量）を表し、白抜きのひし形はＢ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）を表す。
図２０Ａおよび２０Ｂは、ＡＡＶ１＿９２６＋ＡＡＶ１＿９２７（高用量）、Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ２（低用量）、Ｂ１０Ｈ－ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｂ１０Ｈ－ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、またはＰＢＳ対照の筋肉内（ｉ．ｍ．）投与から４週間後の絶食対照またはＳＴＺ処置マウスにおける循環ヒトインスリンのレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。循環インスリンレベルは、絶命した動物または健康不良／低血糖のために安楽死させた動物においては判定しなかった。図２０Ｂの破線は、絶食条件下の非糖尿病性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける循環インスリンレベルを表す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ＡＡＶ１＿９２６＋ＡＡＶ１＿９２７（高用量）、Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ２（低用量）、Ｂ１０Ｈ－ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｂ１０Ｈ－ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、またはＰＢＳ対照の筋肉内（ｉ．ｍ．）投与から４週間後の絶食対照またはＳＴＺ処置マウスにおける循環ヒトインスリンのレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。循環インスリンレベルは、絶命した動物または健康不良／低血糖のために安楽死させた動物においては判定しなかった。図２０Ｂの破線は、絶食条件下の非糖尿病性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける循環インスリンレベルを表す。
図２１は、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ－ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、またはビヒクル対照の投与から８週間後に行われた、対照またはＳＴＺ処置マウスにおける経口グルコース耐性試験の結果を示すグラフである。
図２２は、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、またはビヒクル対照の投与から８週間後に行われた、対照またはＳＴＺ処置マウスにおけるグルコース負荷の０～１２０分後に計算された血中グルコースレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。
図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ－Ｇｃｋ（中用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）もしくはビヒクル対照（図２３Ａ）、またはＢ１０Ｈ－ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、もしくはビヒクル対照（図２３Ｂ）の投与から８週間後の対照およびＳＴＺ処置マウスにおけるＨｂＡ１ｃレベルを示すグラフである。ＨｂＡ１Ｃレベルは、絶命した動物または健康不良／低血糖のために安楽死させた動物においては判定しなかった。 図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ－Ｇｃｋ（中用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）もしくはビヒクル対照（図２３Ａ）、またはＢ１０Ｈ－ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、もしくはビヒクル対照（図２３Ｂ）の投与から８週間後の対照およびＳＴＺ処置マウスにおけるＨｂＡ１ｃレベルを示すグラフである。ＨｂＡ１Ｃレベルは、絶命した動物または健康不良／低血糖のために安楽死させた動物においては判定しなかった。
図２４Ａ～２４Ｂは、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（中用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、またはビヒクル対照の投与後の対照またはＳＴＺ処置マウスにおける血清トリグリセリド（図２４Ａ）またはケトン（図２４Ｂ）のレベルを示すグラフである。 図２４Ａ～２４Ｂは、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｂ１０Ｈ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｄ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（中用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）、Ｉｎｓ－Ｂ１０Ｈ＋ＩＬ６ ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）、またはビヒクル対照の投与後の対照またはＳＴＺ処置マウスにおける血清トリグリセリド（図２４Ａ）またはケトン（図２４Ｂ）のレベルを示すグラフである。
図２５は、ＡＡＶ１ｍＴＷｈＩｎｓ＋ＡＡＶ１ｒＧｃｋ（ＫＴ１＋ＡＡＶ９２６；高用量）、ＡＡＶ１ｍＷＴＩＮＳ＋ＡＡＶ１ｒＧｃｋ（ＩＮＳ－１７＋ＡＡＶ９２６；低用量）、またはＡＡＶ１ｍＷＴｈＩＮＳ＋ＡＡＶ１ｒＧｃｋ（ＩＮＳ－１７＋ＡＡＶ９２６；高用量）の投与後のＳＴＺ処置マウスの肝臓におけるｈＩＮＳ発現を示すグラフである。
開示の詳細な説明
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、本願が定義を含めて優先する。文脈上別段の解釈を必要としない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本開示の全体を通して、実体に付く「ａ」または「ａｎ」という用語は、その実体の１つまたは複数を指す。例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義に使用され得る。
さらに、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書において使用される場合、特定された２つの特徴または構成要素の各々の具体的開示と解釈されるものとし、他のものを含むか含まないかを問わない。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、次の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
「約」という用語は、本明細書では、およそ、ほぼ、おおよそ、またはその領域内を意味するように使用される。「約」という用語は、数値範囲と併せて使用される場合、記載された数値の上下に境界を広げることにより、その範囲を修飾する。概して、「約」という用語は、本明細書では、別段の記載がない限り、規定の値の上下に、１０パーセントの差異だけ上または下に（より高くまたはより低く）数値を修飾するように使用される。
ある数または一連の数に先行する「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接する数、および文脈から明らかである論理的に含まれ得るすべての後続の数または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子のうちの少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドに、示された特性があることを意味する。少なくともが一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、その一連の数または範囲内の数の各々を修飾し得ると理解される。また、「少なくとも」は、整数に限定されない（例えば、「少なくとも５％」には、有効桁数を考慮せずに、５．０％、５．１％、５．１８％が含まれる）。
ヌクレオチド配列は、本明細書では、具体的に別段の記載がない限り、一本鎖のみにより、５’から３’の方向で、左から右に提示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される方式で、または（アミノ酸の場合）一文字コードもしくは三文字コードのいずれかにより、いずれも３７ ＣＦＲ §１．８２２および確立された使用法に従って表される。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、ホスホジエステル結合によって接続されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは、本明細書では、５’から３’の方向で提示される。本開示のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子でもリボ核酸（ＲＮＡ）分子でもよい。ヌクレオチド塩基は、本明細書では、一文字コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、およびウラシル（Ｕ）によって示される。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、別段の記載がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「コード配列」または「をコードする配列」という用語は、本明細書では、例えばインスリンまたはグルコキナーゼなどの特定のタンパク質を「コードする」ＤＮＡまたはＲＮＡ領域（転写される領域）を意味するように使用される。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下におかれると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡ）、翻訳されて（ＲＮＡ）、ポリペプチドになる。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物由来のゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終了配列は、コード配列に対して３’側に位置し得る。
遺伝子には、いくつかの作動可能に連結した断片、例えばプロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コード配列、および３’非翻訳配列、例えば、ポリアデニル化部位またはシグナル配列を含むものが含まれ得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡへと転写され、かつ／または活性タンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、本明細書で使用される場合、翻訳される能力を有するリーディングフレームの一部である。ＯＲＦは、開始コドンで始まって停止コドンで終わるコドンの連続するストレッチである。一部の態様では、ＯＲＦ配列は、開始コドン配列および／または停止コドン配列ありまたはなしで示されるか、または参照され得る。
Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス、またはＫｏｚａｋ配列は、真核生物ｍＲＮＡにおいて生じ、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ［ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドン（ＡＵＧ）にもう１つの「Ｇ」が続いている］を有する配列として公知である。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列と少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含む。
「配列同一性」という用語は、本明細書では、２つもしくはそれよりも多くのアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つもしくはそれよりも多くの核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の、配列の比較により決定される関係を意味するように使用される。ある特定の態様では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の完全長またはそれらの一部に基づいて計算される。それらの一部は、両方の配列番号の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはいずれかの他の規定のパーセンテージを意味し得る。「同一性」という用語は、場合によっては、アミノ酸または核酸の配列間の配列関連性の度合いを意味することもあり、これは、かかる配列のストリング間のマッチによって決定される。
ある特定の態様では、同一性を決定する方法は、試験される配列間で最大のマッチが得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。
核酸またはその断片に言及している場合、「実質的相同性」または「実質的類似性」は、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と最適にアラインされたとき、配列の少なくとも約９５～９９％にヌクレオチド配列同一性があることを意味する。
本明細書で使用される場合、かつ別段の記載がない場合、第１の核酸配列を第２の核酸配列との関連で説明するために使用されるときの「相補的」という用語は、当業者には理解されるように、第１の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある特定の条件下で、第２の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェント条件であり得、ストリンジェント条件は、次のものを含み得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃、または７０℃、１２～１６時間、その後に洗浄（例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと）。生物の内部で起こり得る生理学的に妥当な条件のような、他の条件を使用してもよい。当業者は、ハイブリダイズされるヌクレオチドの最終的用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
「プロモーター」という用語は、本明細書では、１つまたは複数の遺伝子（またはコード配列）の転写を制御するように機能し、転写の方向を基準として遺伝子の転写開始部位の上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびに、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、およびプロモーターからの転写量を調節するように直接的または間接的に作用することが当業者に公知であるヌクレオチドのいずれかの他の配列を含むがこれらに限定されない、いずれかの他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に識別される、核酸配列または断片を意味するように使用される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理条件および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理条件または発生条件に応じて調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの分化細胞／組織において優先的に活性がある。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、いずれの向きでも、コード配列から、かつ転写領域の下流の位置から、数キロベースペア（ｋｂ）までの距離にわたって機能し得る（例えば、コード配列と関連付けられ得る）。
「動作可能に連結した」、「動作可能に挿入された」、「動作可能に位置付けられた」、「制御下」、または「転写制御下」という用語は、プロモーターが、核酸との関連において、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するのに正しい位置および向きにあることを意味する。「作動可能に連結した」という用語は、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が調節配列に結合すると遺伝子発現が可能になるような様式で、ＤＮＡ配列および調節配列が接続していることを意味する。「作動可能に挿入された」という用語は、細胞に導入された目的のＤＮＡが、導入されたＤＮＡの転写および翻訳を指示する（すなわち、例えば目的のＤＮＡによってコードされるポリペプチドの産生を容易にする）ＤＮＡ配列に隣接して位置付けられることを意味する。
「導入遺伝子」という用語は、本明細書では、細胞に導入される遺伝子または核酸分子を意味するように使用される。導入遺伝子の一例は、治療用ポリペプチドをコードする核酸（例えば、インスリンをコードする遺伝子および／またはグルコキナーゼをコードする遺伝子）である。一部の実施形態では、遺伝子は、細胞内に存在し得るが、場合によっては、通常は細胞内で発現されないか、または細胞内で不十分なレベルで発現される。この文脈において、「不十分」とは、前記遺伝子、例えば、インスリンおよび／またはグルコキナーゼが、細胞内で正常に発現されるが、本明細書で開示される状態および／または疾患（例えば、糖尿病）が依然として発生し得ることを意味する。ある特定の態様では、導入遺伝子は、遺伝子の、例えば、インスリンおよび／またはグルコキナーゼの、発現増加または過剰発現を可能にする。導入遺伝子は、細胞固有の配列を含むか、細胞内で天然に発生しない配列を含むか、または両方の組合せを含むことができる。ある特定の態様では、導入遺伝子は、インスリン、グルコキナーゼ、インスリンとグルコキナーゼとの両方、および／またはさらなるタンパク質をコードする修飾型配列を含むことができ、これは、インスリン、グルコキナーゼ、またはインスリンとグルコキナーゼとの両方をコードする配列の細胞内での発現のために適切な調節配列に作動可能に連結していてもよい。一部の態様では、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれない。
「修飾型遺伝子」、「修飾型核酸」などの用語は、本明細書では同義に使用され、遺伝子の天然配列または核酸配列に対する１つまたは複数の修飾または変化の導入を意味する。そのような修飾は、コードされるタンパク質配列に対する突然変異をもたらす場合もあれば、もたらさない場合もある。一部の実施形態では、修飾型核酸は、野生型または突然変異型のタンパク質配列またはその断片をコードする。
「から導出される」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の分子もしくは生物、または特定の分子もしくは生物からの情報（例えば、アミノ酸または核酸配列）から単離される、またはそれらを使用して作製される、成分を指す。例えば、第２の核酸配列（例えば、野生型ヒトインスリン遺伝子）から導出される核酸配列（例えば、修飾型ヒトインスリン遺伝子）は、第２の核酸配列のヌクレオチド配列と同一のまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部を含み得る。一部の態様では、突然変異体、アナログ、または誘導体が、野生型配列から導出され得る。
ポリヌクレオチドの場合、導出される種は、例えば、天然に発生する突然変異誘発、人工的な定方向突然変異誘発、または人工的なランダム突然変異誘発によって取得することができる。ポリヌクレオチドを導出するために使用される突然変異誘発は、意図的に方向付けられたもの、もしくは意図的にランダムなもの、または各々の混合でもよい。
本明細書で使用される場合、「送達ベクター」または「ベクター」という用語には、適当な制御エレメントと関連付けられると複製が可能であり、かつ細胞間で遺伝子または核酸配列を伝達することができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどのような、あらゆる遺伝エレメントが含まれる。したがって、この用語には、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターが含まれる。一部の態様では、有用なベクターは、転写すべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置付けられているベクターであると想定される。一部の態様では、送達ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、脂質、およびリソソームからなる群から選択される。
一部の態様では、生物学的ベクターは、ウイルス、特に弱毒化ウイルスおよび／または複製欠損ウイルスを含む。一部の実施形態では、化学的ベクターは、脂質複合体およびネイキッドＤＮＡ構築物を含む。
本明細書で使用される場合、「ネイキッドＤＮＡ」または「ネイキッド核酸」などの用語は、ウイルス粒子にも、細菌細胞にも、標的細胞の細胞質へ核酸を送達することを容易にする他の封入手段にも含有されていない核酸分子を指す。ネイキッド核酸は、標的細胞の部位へ核酸を送達することを容易にするため（例えば、核酸が消化管を通って標的細胞内に移動することを容易にするため、核酸を胃酸から保護するため、かつ／または腸粘液を透過するのに役立つため）、かつ／または標的上皮細胞の表面へ核酸を送達することを容易にするための手段と関連付けられ得る。
「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」または「ウイルスベクター」は、目的の分子、例えば、タンパク質、ペプチド、およびポリヌクレオチド、または複数のそれらをコードするかまたは含む、１つまたは複数のポリヌクレオチド領域を含む配列を指す。ウイルスベクターは、遺伝物質を細胞内に送達するために使用される。ウイルスベクターは、特定用途のために修飾することができる。一部の態様では、送達ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターを含む。
「アデノ随伴ウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、アデノ随伴ベクターの成分を含むまたはそれから導出され、かつ、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に感染するのに好適である、あらゆるベクターを指す。ＡＡＶベクターという用語は、通常、ペイロードを含むＡＡＶ型ウイルス粒子またはビリオンを意味する。ＡＡＶベクターは、血清型の組合せを含む様々な血清型から導出されることもあれば（すなわち、「偽型」ＡＡＶ）、様々なゲノムから導出されることもある（例えば、一本鎖または自己相補性）。さらに、ＡＡＶベクターは、複製欠損型および／またはターゲティング型でもよい。本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、ＡＡＶ １型、ＡＡＶ ２型、ＡＡＶ ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ ４型、ＡＡＶ ５型、ＡＡＶ ６型、ＡＡＶ ７型、ＡＡＶ ８型、ＡＡＶ ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ １１型、ＡＡＶ １２型、ＡＡＶ １３型、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏら（J. Virol. 78:6381 (2004)）およびＭｏｒｉｓら（Virol. 33:375 (2004)）によって開示されているＡＡＶ血清型およびクレード、ならびにいずれかの他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照のこと。一部の態様では、「ＡＡＶベクター」は、公知のＡＡＶベクターの誘導体を含む。一部の態様では、「ＡＡＶベクター」は、修飾型または人工のＡＡＶベクターを含む。「ＡＡＶゲノム」および「ＡＡＶベクター」という用語は同義に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのペイロード領域（例えば、インスリンおよび／またはＧｃｋをコードするポリヌクレオチド）と、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域とを有するＡＡＶベクターを含むＡＡＶウイルスである。一部の態様では、「本開示のＡＡＶベクター」または「本明細書で開示されるＡＡＶベクター」という用語は、例えば、ＡＡＶ粒子に封入された、インスリン、ＧｃＫ、またはそれらの組合せをコードする、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたは核酸を含むＡＡＶベクターを指す。
ウイルスによる細胞の「形質導入」は、ウイルス粒子から細胞への核酸の伝達があることを意味する。一部の態様では、形質導入は、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする１つの核酸または複数の核酸をウイルスベクターによってレシピエント宿主細胞へ送達することを指す。例えば、本開示のｒＡＡＶベクターによる標的細胞の形質導入は、そのベクターに含有されたｒＡＡＶゲノム（例えば、本開示のポリヌクレオチドを含むもの）が形質導入細胞内に伝達されることにつながる。
細胞の「トランスフェクション」は、細胞を遺伝子修飾する目的で細胞に遺伝物質が導入されることを意味する。トランスフェクションは、当技術分野において公知である種々の手段、例えば、形質導入または電気穿孔によって達成され得る。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞内に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドまたはウイルスを意味する。
「宿主細胞」または「標的細胞」という用語は、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでポリヌクレオチドの送達が行われる細胞を意味するように使用される。ＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入することができる。
「組換え」は、天然に一般に見出されるものから区別できることを意味する。
ベクターまたはウイルスカプシドに関する「血清型」は、カプシドタンパク質配列およびカプシド構造に基づいて区別できる免疫学的プロファイルによって定義される。
「ＡＡＶ Ｃａｐ」は、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、ならびにそれらのアナログを意味する。
「ＡＡＶ Ｒｅｐ」は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびそのアナログを意味する。
他のエレメントによってフランキングされる配列に関する「フランキングされる」は、その配列に対して上流および／または下流、すなわち、５’側および／または３’側に、１つまたは複数のフランキングエレメントが存在することを示す。「フランキングされる」という用語は、複数の配列が必ず連続していることを示すよう意図するものではない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸とフランキングエレメントとの間に介在する配列があってもよい。２つの他のエレメント（例えば、ＩＴＲ）によって「フランキングされる」配列（例えば、導入遺伝子）は、一方のエレメントが配列の５’側に位置し、他方が配列の３’側に位置することを示すが、間に介在する配列があってもよい。
本明細書で使用される場合、例えば本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む遺伝子療法組成物の、「有効量」、「治療有効量」、および「十分な量」という用語は、ヒトを含む対象に投与したとき、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量を指し、したがって、「有効量」またはその同義語は、それが適用されている文脈に依存する。
所与の治療剤または組成物の量は、所与の薬剤、医薬品製剤、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置される対象または宿主の個性（例えば、年齢、性別、および／または体重）などといった様々な因子に応じて変動するような量に対応する。
本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、疾患または状態を処置するために、核酸配列（例えば、本明細書で定義される治療用分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む核酸）を個体の細胞および／または組織に挿入することである。遺伝子療法には、本質的に阻害性である導入遺伝子、すなわち、望まれないまたは異常な（例えば、病原性）遺伝子またはタンパク質などの内因性遺伝子またはタンパク質の発現、活性または機能を阻害する、減少させる、または低減する導入遺伝子の挿入も含まれる。そのような導入遺伝子は外因性であり得る。外因性の分子または配列は、処置すべき細胞、組織および／または個体において通常は発生しない分子または配列であると理解される。後天性疾患と先天性疾患との両方が遺伝子療法に適している場合がある。
一部の態様では、本開示は、野生型もしくは突然変異型のインスリンおよび／もしくは野生型グルコキナーゼまたはそれらの機能的断片をコードする修飾型核酸を提供する。本開示は、野生型もしくは突然変異型のインスリンおよび／もしくは野生型グルコキナーゼまたはそれらの機能的断片をコードする修飾型核酸を配列の一部として含む核酸構築物も提供する。例えば、本開示には、調節エレメントのような他のエレメントと併せて修飾型核酸配列を含む発現カセット、プラスミド、および／または他のベクターが含まれる。一部の態様では、本開示は、野生型もしくは突然変異型のインスリンおよび／もしくは野生型グルコキナーゼまたはそれらの機能的断片をコードする修飾型核酸配列を含む、ウイルスカプシドなどのパッケージングされた遺伝子送達ビヒクルを提供する。本開示には、細胞における発現を促進するために必要なエレメントと併せて修飾型核酸配列を細胞内に送達することにより、野生型もしくは突然変異型のインスリンおよび／もしくは野生型グルコキナーゼまたはそれらの機能的断片を発現させる方法も含まれる。本開示は、野生型もしくは突然変異型のインスリンおよび／もしくは野生型グルコキナーゼまたはそれらの機能的断片をコードする修飾型核酸配列が、例えば１つもしくは複数のベクターの成分として対象に投与される、かつ／または１つもしくは複数のウイルス遺伝子送達ビヒクルの成分としてパッケージングされる、遺伝子療法の方法も提供する。処置は、例えば、糖尿病の症状を処置または低減することを必要とする対象における糖尿病の症状を処置または低減するために行われ得る。本開示のこれらの態様の各々について、本明細書でさらに詳細に検討する。
修飾型核酸
一部の態様では、本開示は、インスリン、グルコキナーゼ、またはそれらの組合せをコードする修飾型（例えば、コドン最適化された、かつ／またはＣｐＧ含有量が低減した）核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の態様では、修飾型核酸は、ヒトインスリン（例えば、プレプロインスリンもしくはプロインスリン、それらの突然変異体、アナログ、またはバリアント）をコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、ヒトグルコキナーゼ（例えば、Ｇｃｋ、その突然変異体、アナログ、またはバリアント）をコードする。一部の態様では、コード配列に対する修飾は、インスリンおよび／またはグルコキナーゼの野生型または突然変異型のアミノ酸配列を保存する。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、シグナル配列およびプロインスリンポリペプチドを含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の態様では、修飾型核酸配列は、ヒトプレプロインスリン（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）をコードする。一部の態様では、修飾型核酸配列は、ヒトＧｃｋ（例えば、配列番号８２）をコードする。
一部の態様では、修飾型核酸は、コドン最適化されている。一部の態様では、コドン最適化は、インスリンまたはグルコキナーゼをコードする核酸のオープンリーディングフレーム内のコドンを修飾することを含む。一部の態様では、修飾型核酸は、対応する野生型配列および／または未修飾型配列に対して低減したＣｐＧ含有量を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、対応する野生型配列および／または未修飾型配列に対して低減した自然免疫原性を有する。一部の態様では、修飾型核酸は、対応する野生型配列および／または未修飾型配列に対して増加した発現を有する。一部の態様では、修飾型核酸は、対応する野生型配列および／または未修飾型配列に対して減少した発現を有する。一部の態様では、修飾型配列は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法の後に手作業の配列検査を行うことによって開発される。本開示の核酸は、分子生物学技術を使用して産生することができる、例えば、インスリンまたはグルコキナーゼをコードする修飾型ｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって取得することができる。
一部の態様では、核酸配列は、ＣｐＧ含有量を低減するために、例えば、ＴＬＲ９二量体化および関連する経路を介した炎症応答を最小化するために修飾される。一部の態様では、ある特定のＣｐＧモチーフは、それらの炎症性効果を阻害または中和する。一部の実施形態では、これらのモチーフのうちの１つまたは複数は保存されていてもよい。一部の態様では、そのようなＣｐＧモチーフは、ＴＬＲ９二量体化の下流効果の阻害のために核酸配列に導入され得る。
一部の態様では、コドン修飾は、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードするポリヌクレオチドの免疫原性を、対応する野生型ポリヌクレオチドおよび／または未修飾型ポリヌクレオチドに対して低減し得る。一部の態様では、コドン修飾は、インスリンまたはグルコキナーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を、対応する野生型および／または未修飾型ポリヌクレオチドに対して向上させる。一部の態様では、コドン修飾は、グルコキナーゼをコードするポリヌクレオチドの免疫原性を、対応する野生型Ｇｃｋポリヌクレオチドおよび／または未修飾型Ｇｃｋポリヌクレオチドに対して低減し得る。
本開示の修飾型核酸は、細胞全体に、細胞溶解物に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。修飾型核酸は単離されていてもよい。核酸が「単離される」または「実質的に純粋にされる」のは、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処置、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技術（例えば、F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと）を含む標準的技術によって精製されるときである。一部の態様では、本開示の修飾型核酸は、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含有してもしなくてもよい。一部の態様では、核酸は、ｃＤＮＡ分子であり得る。
修飾型インスリン核酸
一部の態様では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたは核酸配列は、野生型（配列番号１４７）および／もしくは未修飾型ヒトインスリン（Ｉｎｓ）またはヒトＩｎｓ突然変異体もしくはアナログ（例えば、配列番号１１０または配列番号１１１）に対して修飾されている。一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、例えば、配列番号１または配列番号１２７に対応する、５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および／または３’ＵＴＲを含む配列に対して修飾されている。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型ヒトインスリン（配列番号４１）、そのバリアントもしくは突然変異体（例えば、配列番号１４４または配列番号１４５）、またはそれらの機能的断片をコードする。
インスリンは、ジスルフィド結合によってひとつに連結された、Ａ鎖およびＢ鎖の２つのポリペプチド鎖を含む。これはまず、プレプロインスリンと呼ばれる単一のポリペプチドとして合成される。「プレプロインスリン」は、インスリン遺伝子の一次翻訳産物である。それは１１０アミノ酸長のペプチドである。プレプロインスリンはプロインスリン分子を含み、そのＮ末端にシグナルペプチドが結合している。プレプロインスリンのシグナルペプチドを含むＮ末端の一部が切断され、残りのアミノ酸が「プロインスリン」として残る。得られた切断後の配列のアミノ酸１～３０が「Ｂ鎖」であり、ここで「Ｂ１０」はプレプロインスリンの３４位に対応する。したがって、例えば、「Ｂ１０」プロインスリン突然変異は、プレプロインスリンにおけるＨ３４突然変異に対応する。ある特定の態様では、本明細書で参照される場合、「Ｂ１０Ｈ」は、Ｂ１０位の野生型ヒスチジンアミノ酸を指す（野生型プレプロインスリン配列におけるＨ３４としても参照される）。プレプロインスリンおよびプロインスリンは、Ａ鎖とＢ鎖との間のＣ－ペプチドも含む。成熟インスリンタンパク質では、Ｃ－ペプチドがタンパク分解的に切断され、Ａ鎖およびＢ鎖がジスルフィド結合によって連結される。
一部の態様では、本明細書で開示される修飾型コード配列は、野生型プレプロインスリン（配列番号４１）における対応する位置に対して、Ｈ３４位、Ｐ５２位、Ｋ５３位、Ｒ５５位、および／またはＬ８６位における１つまたは複数の突然変異を含むプレプロインスリン突然変異体をコードする。一部の態様では、修飾型コード配列は、配列番号４１における対応する位置に対して、突然変異Ｈ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、Ｈ３４Ｖ、Ｐ５２Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、および／またはＬ８６Ｒのうちの１つまたは複数を含むプレプロインスリン突然変異体をコードする。一部の態様では、修飾型コード配列は、配列番号４１における対応する位置に対して、突然変異Ｈ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、Ｈ３４Ｖ、Ｐ５２Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、および／またはＬ８６Ｒを含むプレプロインスリン突然変異体をコードする。一部の態様では、修飾型コード配列は、配列番号４１における対応する位置に対して、突然変異Ｐ５２Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、および／またはＬ８６Ｒを含むプレプロインスリン突然変異体をコードする。一部の態様では、修飾型コード配列は、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％類似するアミノ酸配列をコードする。一部の態様では、修飾型コード配列は、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％類似するアミノ酸配列をコードし、ここで、アミノ酸配列は、配列番号４１における対応する位置に対して、突然変異Ｈ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、Ｈ３４Ｖ、Ｐ５２Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、および／またはＬ８６Ｒのうちの１つまたは複数を含む。一部の態様では、修飾型コード配列は、配列番号４１における対応する位置に対してＨ３４突然変異を含まないアミノ酸配列をコードする。
一部の態様では、修飾型核酸配列は、切断部位、例えば、フーリンエンドプロテアーゼ切断部位を含む。
一部の態様では、修飾型核酸配列は、シグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）をコードする核酸を含む。一部の態様では、プレプロインスリンは、野生型インスリンシグナル配列（例えば、ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡ（配列番号１６５）または配列番号４１のアミノ酸１～２４）を含む。一部の態様では、野生型プレプロインスリンのシグナル配列は、非インスリン分泌ペプチド、例えば、ＩＬ－６シグナル配列（例えば、ＭＮＳＦＳＴＳＡＦＧＰＶＡＦＳＬＧＬＬＬＶＬＰＡＡＦＰＡＰ（配列番号１６６））またはフィブロネクチンシグナル配列（例えば、ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＬＡＶＱＣＬＧＴＡＶＰＳＴＧＡ（配列番号１６７））に置き換えられている。
一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するＨ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、またはＨ３４Ｖから選択されるアミノ酸修飾（または、プロインスリンＢ鎖のＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはバリン（Ｖ））を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｄ（または、プロインスリンＢ鎖のＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ））を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するＨ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、またはＨ３４Ｖから選択されるアミノ酸修飾（または、プロインスリンＢ鎖のＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはバリン（Ｖ））を含むヒトインスリンをコードし、ヒトインスリンは、必要に応じて、切断部位、例えば、フーリン切断部位、およびシグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードし、ヒトインスリンは、必要に応じて、切断部位、例えば、フーリン切断部位、およびシグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードし、ヒトインスリンは、必要に応じて、切断部位、例えば、フーリン切断部位、およびシグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｉ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からイソロイシン（Ｉ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｉ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からイソロイシン（Ｉ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードし、ヒトインスリンは、必要に応じて、切断部位、例えば、フーリン切断部位、およびシグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からバリン（Ｖ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｈ３４Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からバリン（Ｖ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードし、ヒトインスリンは、必要に応じて、切断部位、例えば、フーリン切断部位、およびシグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応するアミノ酸修飾Ｐ４９Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（または、プロインスリンのＢ２８位におけるプロリン（Ｐ）からアスパラギン酸（Ｄ）、Ｂ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、Ｃ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、およびＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に対応する修飾）を含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、修飾型核酸は、アミノ酸修飾Ｐ４９Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、およびＬ８６Ｒ（野生型プレプロインスリンアミノ酸位置に対応する）を含むヒトインスリンをコードし、ヒトインスリンは、必要に応じて、切断部位、例えば、フーリン切断部位、およびシグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）を含む。
一部の態様では、修飾型核酸は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）をコードし、核酸は、（ｉ）シグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾（または、野生型プレプロインスリンにおける対応するアミノ酸に対して、アミノ酸Ｈ３４、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、Ｌ８６、もしくはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾）を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、野生型プレプロインスリンシグナル配列ではなく、例えば、野生型プレプロインスリン配列が、ＩＬ－６シグナル配列またはフィブロネクチンシグナル配列に置き換えられている。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、切断部位（例えば、フーリン切断部位）をさらに含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）は、（ｉ）Ｈ３４Ｄ、Ｈ３４Ｉ、もしくはＨ３４Ｖ（または、プロインスリンＢ鎖のＢ１０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）もしくはバリン（Ｖ））、および／または（ｉｉ）野生型プレプロインスリン配列に対して、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、および／もしくはＬ８６（あるいは、プロインスリンＢ鎖のＢ２８位および／もしくはＢ２９位またはプロインスリンＣ鎖のＣ１位および／もしくはＣ３２位）における１つもしくは複数のアミノ酸修飾から選択されるアミノ酸修飾を含む。一部の態様では、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、および／またはＬ８６における１つまたは複数のアミノ酸修飾は、Ｐ５２Ｄ、Ｋ５３Ｒ、Ｒ５５Ｋ、Ｌ８６Ｒ、またはそれらの任意の組合せを含む（または、プロインスリンＢ鎖もしくはＣ鎖における１つもしくは複数の修飾は、プロインスリンＢ鎖のＢ２８位におけるプロリン（Ｐ）からアスパラギン酸（Ｄ）、プロインスリンＢ鎖のＢ２９位におけるリシン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）、プロインスリンＣ鎖のＣ１位におけるアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）、プロインスリンＣ鎖のＣ３２位におけるロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）、もしくはそれらの任意の組合せを含む）。
一部の態様では、修飾型核酸は、バリアントもしくは突然変異型ヒトインスリンタンパク質またはそれらの機能的断片をコードする。一部の態様では、ヒトインスリンタンパク質は、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ヒトインスリンタンパク質は、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ヒトインスリンタンパク質は、野生型ヒトインスリンに対して、挿入、欠失、置換、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、ヒトインスリンタンパク質は、少なくとも１つの置換を含む。一部の態様では、少なくとも１つの置換は、保存的置換である。一部の態様では、少なくとも１つの置換は、非保存的置換である。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４３～５７、１１０～１１６、１５０～１５１、１５４～１５５、および１５７～１５９のいずれかの核酸７３～３３０、配列番号１１７～１２２、１５２、および１５６のいずれかの核酸８８～３４５、または配列番号１５３の核酸７９～３３６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を有する核酸配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。一部の態様では、ＯＲＦは、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、修飾型核酸配列は、ヒトインスリンタンパク質（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１２２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９の配列を有する核酸を含むオーブンリーディングフレームを含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１２２の配列を有する核酸を含むオープンリーディングフレームを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１、表１３、および／または図１Ａに存在するかまたは参照されるＯＲＦ配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、およびそれらの任意の組合せと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される２つまたはそれよりも多くのＯＲＦを含む。一部の態様では、２つまたはそれよりも多くのＯＲＦのうちの１つは、配列番号１２２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の態様では、２つまたはそれよりも多くのＯＲＦは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の態様では、２つまたはそれよりも多くのＯＲＦのうちの１つは、配列番号１２２の核酸配列を有する。
一部の態様では、２つまたはそれよりも多くのＯＲＦは、作動可能に連結している。一部の態様では、ＯＲＦは、ＩＲＥＳによって作動可能に連結している。一部の態様では、ＩＲＥＳは、配列番号１４２または配列番号１４３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の態様では、ＩＲＥＳは、配列番号１４２または配列番号１４３の核酸配列を含む。
一部の態様では、ＩＲＥＳによって連結される２つまたはそれよりも多くのＯＲＦは、配列番号１１０および配列番号５３、配列番号４７および配列番号５４、配列番号４９および配列番号５６、配列番号１１１および配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５、配列番号１１３および配列番号１１６、配列番号１２０および配列番号１１４、配列番号１２１および配列番号１１５、または配列番号１２２および配列番号１１６を含む配列と少なくとも少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の態様では、ＩＲＥＳを通して連結される２つまたはそれよりも多くのＯＲＦは、配列番号１１０および配列番号５３、配列番号４７および配列番号５４、配列番号４９および配列番号５６、配列番号１１１および配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５、配列番号１１３および配列番号１１６、配列番号１２０および配列番号１１４、配列番号１２１および配列番号１１５、または配列番号１２２および配列番号１１６を含む核酸配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、修飾型５’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、または配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ＫｏｚａｋコンセンサスまたはＫｏｚａｋ配列）をさらに含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ核酸配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、修飾型３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される３’ＵＴＲ核酸配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ヒトインスリンタンパク質（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１３８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列の核酸５～９５７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１３８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６の核酸５～９５７を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａにおいて提示される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含む修飾型核酸を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドを含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドをコードしない。一部の態様では、野生型プレプロインスリンは、非インスリン分泌シグナルによって置き換えられている。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、インターロイキン６（ＩＬ－６）分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする。
修飾型グルコキナーゼ核酸
一部の態様では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたは核酸配列は、例えば、５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および／または３’ＵＴＲ、核酸配列、例えば、配列番号１９に対応するものを含む、野生型および／または未修飾型ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）に対して修飾されている。一部の態様では、修飾型核酸は、野生型ヒトグルコキナーゼ（配列番号８２）またはその機能的断片をコードする。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むＯＲＦを含み、核酸配列は、ヒトグルコキナーゼタンパク質（配列番号８２）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２の配列を有する核酸を含むオーブンリーディングフレームを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照されるＯＲＦ配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、修飾型５’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ＫｏｚａｋコンセンサスまたはＫｏｚａｋ配列）をさらに含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、修飾型３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性の核酸配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される３’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ヒトグルコキナーゼタンパク質（例えば、配列番号８２）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９から選択される配列の核酸５～２０２５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の核酸５～２０２５を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される修飾型核酸である。
発現構築物
一部の態様では、本開示は、核酸配列、例えば、本明細書で開示される、インスリン、グルコキナーゼ、それらの組合せ、またはそれらの機能的断片をコードする修飾型核酸配列と、核酸配列に作動可能に連結した異種制御配列とを含む、発現カセットも提供する。一部の態様では、異種制御配列はプロモーターである。
目的のＤＮＡに作動可能に連結した真核生物プロモーターを有する核酸構築物を本開示において使用することができる。本開示に従って使用することのできるＤＮＡ配列（または対応するＲＮＡ配列）を含有する構築物は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含有するいずれの真核生物発現構築物でもよい。例えば、プラスミドまたはウイルス構築物（例えば、ＡＡＶベクター）を切断して、ライゲーション可能な末端を有する線状ＤＮＡをもたらすことができる。これらの末端を、相補的な同様のライゲーション可能な末端を有する外因性ＤＮＡと結合させると、インタクトなレプリコンおよび所望の表現型特性を有する生物学的に機能的な組換えＤＮＡ分子がもたらされる。一部の態様では、構築物は、真核生物および原核生物の両方の宿主において複製可能である。
一部の態様では、本開示において使用される外因性ＤＮＡは、好適な細胞から取得され、構築物は、当技術分野において公知の技術を使用して調製される。同様に、遺伝子改変された宿主細胞における外因性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の発現を達成するための技術は、当技術分野において公知である（例えば、Kormal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2150-2154 (1987)、Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと；これらの各々は、目的のＤＮＡの真核生物における発現のための方法および組成物に関して、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の態様では、ＤＮＡ構築物は、分泌細胞内での目的のＤＮＡ（例えば、インスリン、グルコキナーゼ、それらの組合せ、またはそれらの断片をコードする修飾型核酸）の発現を容易にするためにプロモーターを含有する。一部の態様では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、またはアデノウイルス由来のプロモーターのような、強力な真核生物プロモーターである。例示的なプロモーターは、ヒトＣＭＶの前初期遺伝子由来のプロモーター（Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)）およびＲＳＶの長末端反復（ＬＴＲ）由来のプロモーター（Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781 (1982)）を含むが、これらに限定されない。あるいは、使用されるプロモーターは、組織特異的プロモーターでもよい。
本開示の構築物は、構築物を含有および／または発現する細胞の選択を助けるためのマーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（アンピシリン抵抗性遺伝子など）またはβ－ガラクトシダーゼ）、細菌細胞における構築物の安定な複製のための複製起点（好ましくは、高コピー数の複製起点）、核局在化シグナル、または、ＤＮＡ構築物、それによってコードされるタンパク質、もしくはその両方の産生を容易にする他のエレメントのような、他の成分を含むこともできる。
真核生物での発現の場合、構築物は、目的のＤＮＡ（例えば、インスリン、グルコキナーゼ、それらの組合せ、またはそれらの断片をコードする修飾型核酸）に作動可能に連結した真核生物プロモーターを最低でも含有することができ、目的のＤＮＡは、今度は、ポリアデニル化配列に作動可能に連結している。ポリアデニル化シグナル配列は、当技術分野において公知の種々のポリアデニル化シグナル配列のいずれから選択されてもよい。一部の態様では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列である。構築物には、目的のＤＮＡがｃＤＮＡである（例えば、天然に発生する配列のイントロンを含有しない）場合は特に、目的のＤＮＡの発現レベルを上昇させ得る、１つまたは複数のイントロンが含まれていてもよい。当技術分野において公知の種々のイントロンのいずれを使用してもよい（例えば、目的のＤＮＡの５’側の位置で構築物に挿入されるヒトβ－グロビンイントロン）。
目的のＤＮＡ（例えば、インスリン、グルコキナーゼ、それらの組合せ、またはそれらの断片をコードする修飾型核酸）は、治療用分子（例えば、タンパク質）が融合タンパク質（例えば、β－ガラクトシダーゼまたはその一部をＮ末端に有し、治療用タンパク質をＣ末端部分に有する融合タンパク質）として発現されるように、構築物に挿入されてもよい。融合タンパク質の産生は、タンパク質を発現する形質転換細胞の識別（例えば、融合タンパク質に結合する抗体を使用した酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による）を容易にすることができる。
目的のＤＮＡ（例えば、インスリン、グルコキナーゼ、それらの組合せ、またはそれらの断片をコードする修飾型核酸）の送達のためのベクターは、ウイルス性もしくは非ウイルス性のいずれでもよく、またはウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）もしくはカチオン性脂質もしくはリポソームなどのアジュバントと混和したネイキッドＤＮＡから構成されていてもよい。「アジュバント」とは、それ自体は所望の効果をもたらさないが、活性化合物の作用を向上させるまたは別様に向上させるように作用する物質である。使用される正確なベクターおよびベクター製剤は、遺伝子移入の標的となる細胞および／または臓器などのいくつかの因子に依存する。
好適なプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ウイルス長末端反復プロモーター（ＬＴＲ）、例えばマウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ラウス肉腫ウイルス、またはＨＴＬＶ－１由来のもの、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。一部の態様では、プロモーターは、細胞特異的プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターである。一部の態様では、プロモーターは、イントロン配列と共に使用される。一部の態様では、プロモーターは、組織特異的である。一部の態様では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。一部の態様では、ＣＭＶプロモーターは、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターである。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＯＲＦを含む修飾型核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、修飾型核酸配列は、ヒトインスリンタンパク質（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、発現カセットは、配列番号１２２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＯＲＦを含む修飾型核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９の配列を有する核酸を含むオーブンリーディングフレームを含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１２２の配列を有する核酸を含むオーブンリーディングフレームを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１、表１３および／または図１Ａに存在するかまたは参照されるＯＲＦ配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドを含むヒトインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドをコードしない。一部の態様では、野生型プレプロインスリンは、非インスリン分泌シグナルによって置き換えられている。一部の態様では、発現カセットは、インターロイキン６（ＩＬ－６）分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、発現カセットは、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、または配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される３’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７ 配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含み、修飾型核酸配列は、ヒトインスリンタンパク質（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、発現カセットは、配列番号１３８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列の核酸５～９５７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７ 配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１の配列を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号１３８の配列を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列の核酸５～９５７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含む修飾型核酸を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＯＲＦを含む修飾型核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２の配列を有する修飾型核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照されるＯＲＦ配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される３’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含み、核酸配列は、ヒトグルコキナーゼタンパク質（例えば、配列番号８２）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、発現カセットは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９から選択される配列の核酸５～２０２５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４の配列を有する修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の核酸５～２０２５を含む修飾型核酸を含む。一部の態様では、発現カセットは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含む修飾型核酸を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＯＲＦを含む第１の修飾型核酸、および配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＯＲＦを含む第２の修飾型核酸配列を含む。
一部の態様では、発現カセットは、修飾型核酸に作動可能に連結したプロモーターを含み、第１および第２の修飾型核酸の各々が、第１および第２のプロモーターにそれぞれ連結している。一部の態様では、第１のＯＲＦを含む第１の修飾型核酸配列は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８，および配列番号１５９から選択され、第２のＯＲＦを含む第２の修飾型核酸配列は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０，および配列番号１６２からなる群から選択される。
一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドを含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドをコードしない。一部の態様では、野生型プレプロインスリンは、非インスリン分泌シグナルによって置き換えられている。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、インターロイキン６（ＩＬ－６）分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする。
一部の態様では、第１および第２の修飾型核酸配列は、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。
一部の態様では、第１および第２の修飾型核酸配列は、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。
一部の態様では、発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第１の修飾型核酸、および配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第２の修飾型核酸配列を含み、第１および第２の修飾核酸の各々はそれぞれ、第１および第２のプロモーターに連結されている。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列の核酸５～９５７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、第２の修飾型核酸は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９から選択される配列の核酸５～２０２５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１からなる群から選択され、および第２の核酸配列は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４からなる群から選択される。一部の態様では、第１の修飾型核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６の核酸５～９５７を含み、第２の修飾型核酸は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の核酸５～２０２５を含む。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含み、第２の修飾型核酸配列は、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含む。
本開示のある特定の態様は、発現構築物、例えば、ベクターを対象とする。一部の態様では、発現構築物は、発現カセットを含む。一部の態様では、発現構築物は、細胞内で安定化してエピソーム状態を保つことができるゲノムをさらに含む。本開示との関連において、一部の態様では、細胞または宿主細胞は、構築物を作製するために使用される細胞、または構築物が投与される細胞を包含し得る。一部の態様では、構築物は、細胞のゲノムに、例えば相同組換えまたは別法により、組み込むことが可能である。一部の態様では、発現構築物は、本明細書で開示されるようなインスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列が、本明細書で提示されるようなプロモーターに作動可能に連結したものであり、ここで、プロモーターは、細胞におけるヌクレオチド配列（すなわち、コード配列）の発現を指示することが可能である。一部の態様では、本明細書で使用される場合の発現カセットは、インスリンをコードするヌクレオチド配列および／またはグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなり、各事例において、ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結しており、プロモーターは、前記ヌクレオチド配列の発現を指示することが可能である。一部の態様では、ウイルス発現構築物が、遺伝子療法において使用されることが意図される発現構築物である。これは、本明細書で開示されるウイルスゲノムの一部を含むように設計することができる。
一部の態様では、発現構築物は、ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ）、ポリＡ配列（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ｂＧＨポリアデニル化シグナル）、およびエンハンサー配列（例えば、ＳＶ４０エンハンサー配列）のうちの１つまたは複数をさらに含む。
一部の態様では、本明細書で開示される発現構築物は、組換え技術を使用して調製され、組換え技術では、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列を、好適な細胞、例えば、培養細胞または多細胞生物の細胞において、例えばAusubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)およびSambrook and Russell（２００１年、上掲）に記載されているように発現させる；これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488（部位指向性突然変異誘発について記載している）およびRoberts et al. (1987) Nature 328:731-734またはWells, J. A., et al. (1985) Gene 34: 315（カセット突然変異誘発について記載している）も参照のこと。
送達ベクター
本開示は、本明細書に記載される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、または発現カセットのいずれかを含むベクターも提供する。一部の態様では、送達ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソームである。一部の態様では、送達ベクターは、ウイルスベクターである。一部の態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現ベクターである。
一部の態様では、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸またはヌクレオチド配列は、発現構築物または発現ベクターにおいて使用される。「発現ベクター」という語句は、概して、ヌクレオチド配列と適合する宿主における遺伝子の発現をもたらすことが可能なヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、少なくとも好適なプロモーター配列を含み、必要に応じて、転写終了シグナルを含み得る。発現をもたらす際に必要または有用であるさらなる因子を、本明細書で開示されるように使用してもよい。インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸もしくはＤＮＡまたはコドン最適化ヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物に導入して発現させることが可能な発現ベクターに組み込まれ得る。一部の態様では、発現ベクターは、細菌、例えば大腸菌などの原核生物宿主における複製に好適であるか、または培養された哺乳動物、植物、昆虫（例えば、Ｓｆ９）、酵母、真菌、もしくは他の真核細胞系に導入することができる。一部の態様では、発現構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現に好適である。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＯＲＦを含む修飾型核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含み、修飾型核酸配列は、ヒトインスリンタンパク質（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１２２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＯＲＦを含む修飾型核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。一部の態様では、修飾型核酸は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９の配列を有するＯＲＦを含む。一部の態様では、修飾型核酸は、配列番号１２２の配列を有するＯＲＦを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１、表１３および／または図１Ａに存在するかまたは参照されるＯＲＦ配列を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドを含むヒトインスリンをコードする修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドをコードしない修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。一部の態様では、野生型プレプロインスリンは、非インスリン分泌シグナルによって置き換えられている。一部の態様では、送達ベクターは、インターロイキン６（ＩＬ－６）分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性３’ＵＴＲを有する核酸配列をさらに含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される３’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む発現カセットを含み、修飾型核酸配列は、ヒトインスリンタンパク質（例えば、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１３８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列の核酸５～９５７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１の配列を有する修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１３８の配列を有する修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６の核酸５～９５７を含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＯＲＦ配列を含む修飾型核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２の配列を有する修飾型核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照されるＯＲＦ配列を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される３’ＵＴＲ配列を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む発現カセットを含み、核酸配列は、ヒトグルコキナーゼタンパク質（例えば、配列番号８２）またはその機能的断片をコードする。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９から選択される配列の核酸５～２０２５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４の配列を有する修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の核酸５～２０２５を含む修飾型核酸を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ配列、ＯＲＦおよび３’ＵＴＲを含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、または配列番号１５９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＯＲＦを含む第１の修飾型核酸、および配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＯＲＦを含む第２の修飾型核酸配列を含む発現カセットを含む。一部の態様では、送達ベクターは、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１６２の配列を有する修飾型核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含み、第１および第２の修飾型核酸の各々はそれぞれ、第１および第２のプロモーターに連結されている。一部の態様では、第１のＯＲＦを含む第１の修飾型核酸配列は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、および配列番号１５９からなる群から選択され、第２のＯＲＦを含む第２の修飾型核酸配列は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、および配列番号８０からなる群から選択される。
一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドを含むヒトインスリンをコードする。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、野生型プレプロインスリン分泌シグナルペプチドをコードしない。一部の態様では、野生型プレプロインスリンは、非インスリン分泌シグナルによって置き換えられている。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、インターロイキン６（ＩＬ－６）分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含むヒトプレプロインスリンをコードする。
一部の態様では、第１および第２の修飾型核酸配列は、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列番号４２、配列番号４２の核酸５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８の配列を有する核酸を含む。
一部の態様では、第１および第２の修飾型核酸配列は、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される制限部位を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９の配列を有する核酸を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも（ｌｅａｓｔ）９９％、または１００％の配列同一性を有する第１の修飾型核酸および配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する第２の修飾型核酸配列を含む発現カセットを含み、第１および第２の修飾型核酸の各々はそれぞれ、第１および第２のプロモーターに連結されている。一部の態様では、第１の修飾型核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列の核酸５～９５７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、第２の修飾型核酸配列は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９から選択される配列の核酸５～２０２５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１６０、または配列番号１６１からなる群から選択され、第２の核酸配列は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１６３、または配列番号１６４からなる群から選択される。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６の核酸５～９５７を含み、第２の修飾型核酸配列は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の核酸５～２０２５を含む。一部の態様では、第１の修飾型核酸配列は、表１および／または図１Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含み、第２の修飾型核酸配列は、表２および／または図２Ａに存在するかまたは参照される５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、および３’ＵＴＲを含む。
一部の態様では、送達ベクターは、制御配列もしくは調節配列、選択可能マーカー、任意の融合パートナー、および／またはさらなるエレメントと作動可能に連結した、タンパク質（例えば、インスリンおよび／またはＧｃｋ）をコードする配列を含み得る。ある特定の態様では、修飾型核酸は、別の核酸配列との機能的関係におかれる。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、およびタンパク質の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。そのような調節配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載されている。一部の態様では、発現ベクターは、タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結した転写調節核酸および翻訳調節核酸を含み、典型的には、タンパク質を発現させるために使用される宿主細胞に適切である。概して、転写調節配列および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含み得る。また、当技術分野において公知であるように、発現ベクターは、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子またはマーカーを含有することができる。選択遺伝子は、当技術分野において公知であり、使用される宿主細胞によって異なる。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与する。一部の態様では、選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞においてメトトレキサート選択／増幅と共に使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
一部の態様では、送達ベクターは、ウイルス発現構築物を含むウイルスベクターまたは遺伝子療法ベクターである。ある特定の態様では、ウイルスベクターまたは遺伝子療法ベクターは、遺伝子療法に好適なベクターである。
一部の態様では、遺伝子療法ベクターは、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。これらのベクターは、滑膜細胞および肝臓細胞を含め、多数の分裂細胞型および非分裂細胞型に感染する。細胞に進入した後のアデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターのエピソーム性により、これらのベクターは、上記のように、治療用途に好適になる（Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604、Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43）。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の非常に安定した長期発現（イヌでは最長９年（Niemeyer et al, Blood. 2009 Jan. 22; 113(4):797-806）、ヒトでは最長２年（Nathwani et al, N Engl J Med. 2011 Dec. 22; 365(25):2357-65、Simonelli et al, Mol Ther. 2010 March; 18(3):643-50. Epub 2009 Dec. 1.)）をもたらし得る。一部の態様では、アデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００年、上掲）によって概説されているように、宿主応答を低減するように修飾される。ＡＡＶベクターを使用する遺伝子療法の方法は、Wang et al., 2005, J Gene Med. March 9 (Epub ahead of print)、Mandel et al., 2004, Curr Opin Mol Ther. 6(5):482-90、およびMartin et al., 2004, Eye 18(11):1049-55、Nathwani et al, N Engl J Med. 2011 Dec. 22; 365(25):2357-65、Apparailly et al, Hum Gene Ther. 2005 April; 16(4):426-34に記載されている。
一部の態様では、遺伝子療法ベクターは、レトロウイルスベクターを含む。一部の態様では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベースの発現構築物である。レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に感染し、それらのゲノムに安定に組み込まれる能力を有する（Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6）。レンチウイルスベースの発現構築物の構築および使用のための方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、同第６，２０７，４５５号、同第６，２１８，１８１号、同第６，２７７，６３３号、および同第６，３２３，０３１号、ならびにFederico (1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53)およびVigna et al. (2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16)に記載されている。
一部の態様では、遺伝子療法ベクターは、ヘルペスウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、またはワクシニアウイルスベクターである。
一部の態様では、遺伝子療法ベクターは、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型ヌクレオチド配列を含み、前記修飾型ヌクレオチド配列の各々は、適切な調節配列に作動可能に連結している。そのような調節配列は、少なくともプロモーター配列を含み得る。インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列を遺伝子療法ベクターから発現させるのに好適なプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ウイルス長末端反復プロモーター（ＬＴＲ）、例えばマウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ラウス肉腫ウイルス、またはＨＴＬＶ－１由来のもの、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターを含み得る。
一部の態様では、遺伝子療法ベクターは、さらなるポリペプチドをコードする、さらなるヌクレオチド配列を含む。さらなるポリペプチドは、発現構築物を含有する細胞の識別、選択、および／またはスクリーニングを可能にする（選択可能）マーカーポリペプチドであり得る。一部の態様では、この目的のために好適なマーカータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質ＧＦＰ、ならびに選択可能マーカー遺伝子のＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地での選択のため）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢでの選択のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８での選択のため）、およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートでの選択のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を取得するための供給源およびそれらの使用方法は、Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに提示されている。
非ウイルスベクター
一部の態様では、本開示の修飾型核酸、ポリヌクレオチド、または発現構築物は、非ウイルスベクターを使用して投与することができる。「非ウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＤＮＡを含有する化学製剤（例えば、ＤＮＡおよびカチオン性化合物（例えば、硫酸デキストラン）の製剤）、およびウイルス粒子などのアジュバントと混合されたネイキッドＤＮＡ（すなわち、目的のＤＮＡはウイルス粒子内に含有されていないが、形質転換製剤はネイキッドＤＮＡおよびウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の両方から構成されている（例えば、Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6:247-52 (1992)を参照のこと）を含むことを意味する。したがって、「非ウイルスベクター」には、ＤＮＡにウイルス粒子を加えて構成されたベクターであって、ウイルス粒子が目的のＤＮＡをウイルスゲノム内に含有しないベクターが含まれ得る。
一部の態様では、本開示の修飾型核酸、ポリヌクレオチド、または発現構築物は、ポリ－Ｌ－リシンもしくはＤＥＡＣ－デキストランなどのポリカチオン性物質、ターゲティングリガンド、および／またはＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ヒストン）と複合体化することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡとリポソームの複合製剤は、遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合して細胞内への核酸の送達を容易にする脂質の混合物を含む。本開示に従って使用することのできるリポソームとしては、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＣＵＤＭＥＤＡ（Ｎ－（５－コレストラム－３－β－オール３－ウレタニル）－Ｎ’，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン）が挙げられる。
一部の態様では、本開示の修飾型核酸、ポリヌクレオチド、または発現構築物は、宿主細胞の生物学的特性を改変する目的で、宿主細胞への送達を容易にする担体分子（例えば、抗体または受容体リガンド）にカップリングされたＤＮＡまたはＲＮＡの化学製剤として投与することもできる。「化学製剤」という用語は、タンパク質もしくは脂質、またはそれらの誘導体などの担体分子に核酸化合物をカップリングすることを可能にする、核酸の修飾を指す。例示的なタンパク質担体分子としては、標的細胞に特異的な抗体、すなわち、送達の標的となる細胞に関連する受容体と相互作用することができる分子が挙げられる。
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）
一部の態様では、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、または発現構築物は、パッケージングされたウイルスベクターの成分として投与することができる。概して、パッケージングされたウイルスベクターは、カプシド内にパッケージングされたウイルスベクターを含む。
一部の態様では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の態様では、本明細書で使用される場合のＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）を含み得る。本明細書で使用される場合の「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で開示されるＡＡＶ血清型から導出されたカプシドタンパク質のタンパク質外殻にカプシド封入されたＡＡＶゲノムの一部を含む組換えベクターを指す。ＡＡＶゲノムの一部は、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などのアデノ随伴ウイルス血清型から導出された逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有し得る。一部の態様では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から導出される。
典型的に、ベクターゲノムは、ベクターゲノムをｒＡＡＶカプシドに効率的にパッケージングするために、フランキングする５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列の使用を必要とする。一部の態様では、ｒＡＡＶベクター内に存在するｒＡＡＶゲノムは、少なくとも、ＡＡＶ血清型のうちの１つ（例えば、本明細書で以前に開示した血清型ＡＡＶ２）の逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一のヌクレオチド配列、ならびに好適な調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下でインスリンおよび／もしくはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列を含み、ここで、調節エレメントおよび修飾型核酸配列は、２つのＩＴＲ間に挿入されている。
いくつかのＡＡＶ血清型の完全なゲノムおよび対応するＩＴＲは、シーケンシングされている（Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No. 2, p 1309-1319）。これらは、クローニングすることもでき、または、当技術分野において公知のように、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）などにより供給されるオリゴヌクレオチド合成機を使用して、もしくは標準的な分子生物学技術によって、化学合成によって作製することもできる。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローニングしてもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターから切除してもよい。標準的な分子生物学技術を使用して、１つもしくは複数の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列にいずれかの末端でＩＴＲヌクレオチド配列をライゲーションしてもよく、または、ＩＴＲ間の野生型ＡＡＶ配列を所望のヌクレオチド配列に置き換えてもよい。
パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド成分は、パルボウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶ Ｃａｐおよび／またはキメラカプシドであり得る。好適なパルボウイルスのウイルスカプシド成分の例は、自律性パルボウイルスまたはディペンドウイルスなどのパルボウイルス科由来のカプシド成分である。例えば、ウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシドでもよく（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８ ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２カプシド；当業者であれば、同じまたは同様の機能を果たす、未だ識別されていない他のバリアントが存在する可能性が高いことが分かるであろう）、または、２つもしくはそれよりも多くのＡＡＶカプシドに由来する成分を含んでもよい。ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な補体は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦが完全な補体よりも少ないＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含むこともでき、または、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な補体を提供することもできる。
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のうちの１つまたは複数は、２つまたはそれよりも多くのウイルス、好ましくは２つまたはそれよりも多くのＡＡＶに由来するアミノ酸配列ＡＡＶ Ｃａｐを含む、キメラタンパク質であり得る。例えば、キメラウイルスカプシドは、ＡＡＶ１ Ｃａｐタンパク質またはサブユニットと、少なくとも１つのＡＡＶ２ Ｃａｐまたはサブユニットとを含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などの、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれも含まない。このｒＡＡＶゲノムは、当技術分野において公知である、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ｇｆｐ）、または化学的に、酵素的に、もしくは別様に検出可能および／もしくは選択可能な産物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）のような、マーカーまたはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。
一部の態様では、前記ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター配列をさらに含む。一部の態様では、プロモーター配列は、筋細胞および／または筋組織における発現を付与するプロモーターである。そのようなプロモーターの例としては、本明細書で開示されるようなＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターが挙げられる。
一部の態様では、好適な３’非翻訳配列が、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列に作動可能に連結していてもよい。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列と天然に関連付けられるものでもよく、または、例えばウシ成長ホルモン３’非翻訳領域（例えば、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列）などの様々な遺伝子から導出されてもよい。
一部の態様では、さらなるヌクレオチド配列、例えば、シグナル配列、核局在化シグナル、発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列が、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列に作動可能に連結していてもよい。
別段の記載がある場合を除き、当業者に公知の方法を使用して、組換えパルボウイルスおよびＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、ならびに一過性および安定に処理されたパッケージング細胞を構築することができる。そのような技術は、当業者には公知である。例えば、SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、AUSUBEL el al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley Sons, Inc., New York)を参照のこと。
レンチウイルス発現構築物
レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子のｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構造的機能をもつ他の遺伝子を含有する、複雑なレトロウイルスである。高い複雑性により、レンチウイルスが潜伏感染の過程でそのライフサイクルをモジュレートすることが可能になる。
典型的なレンチウイルスは、ＡＩＤＳの病原因子であるヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）である。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＨＩＶは、リンパ球およびマクロファージのような、まれにしか分裂しない最終分化細胞に感染し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＨＩＶは、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）の初代培養物、およびアフィジコリンまたはγ照射による処置によって細胞周期が停止されたＨｅＬａ－Ｃｄ４またはＴリンパ系細胞に感染し得る。
細胞の感染は、標的細胞の核孔を通したＨＩＶ組込み前複合体の能動的核内移行に依存する。これは、複合体内の複数の部分的に重複する分子決定基と、標的細胞の核内移行機構との相互作用によって起こる。識別されている決定基には、ｇａｇマトリックス（ＭＡ）タンパク質中の機能的核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核親和性ビリオン関連タンパク質、ｖｐｒ、およびｇａｇ ＭＡタンパク質中のＣ末端ホスホチロシン残基が含まれる。
レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスに見られる３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを有し、これらは、２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列によってフランキングされている。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他のシス作用性配列のすべてを含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘ（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶにおいて）を含むさらなる遺伝子を有する。
５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）と、粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なカプシド封入に必要な配列（Ｐｓｉ部位）とが隣接している。カプシド封入（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠如している場合、シス欠損がゲノムＲＮＡのカプシド封入を妨げる。しかしながら、得られる突然変異体は依然として、すべてのビリオンタンパク質の合成を指示することが可能である。
一部の態様では、組換えレンチウイルスは、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを搭載した２つまたはそれよりも多くのベクターを、好適な宿主細胞にトランスフェクトすることにより、非分裂細胞に感染することが可能である。一部の例では、機能的なｔａｔ遺伝子を欠いているベクターが望ましい。したがって、例えば、パッケージング細胞を産生するために、第１のベクターが、ウイルスｇａｇおよびウイルスｐｏｌをコードする核酸を提供することができ、別のベクターが、ウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することができる。異種遺伝子を提供する、移送ベクターと識別されるベクターを、このパッケージング細胞に導入することで、目的の外来遺伝子を搭載した感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が得られる。
目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子についても、当技術分野において公知である。したがって、選択されたベクターに関連遺伝子がクローニングされ、次いで目的の標的細胞を形質転換するために使用される。
ベクターおよび外来遺伝子の上記構成によれば、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含め、いずれのウイルスから導出されてもよい。ｅｎｖは、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする両栄養性エンベロープタンパク質であることが好ましい。
特定の細胞型の受容体へのターゲティングのための抗体または特定のリガンドとエンベロープタンパク質を連結させることにより、組換えウイルスをターゲティングすることが望ましい場合がある。目的の（調節領域を含む）配列を、例えば、特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と併せてウイルスベクターに挿入することにより、ベクターが標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば糖脂質またはタンパク質を挿入することによって標的特異的にすることができる。ターゲティングは、多くの場合、一本鎖抗体などの抗体または組換え抗体型分子の抗原結合性部分を使用してレトロウイルスベクターをターゲティングすることによって達成される。当業者は、特定の標的へのレトロウイルスベクターの送達を実現するための具体的方法を認識しているか、または過度の実験を行わずにそれを容易に確認することができる。
レトロウイルス由来ｅｎｖ遺伝子の例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これらに限定されない。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質（ＶＳＶ Ｇ）、肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスのものなど、他のｅｎｖ遺伝子を使用することもできる。
ウイルスｅｎｖ核酸配列を提供するベクターは、調節配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサーと作動可能に関連している。調節配列は、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーターエンハンサーエレメント、ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー、またはワクシニアＰ７．５プロモーターを含め、いずれの真核生物プロモーターまたはエンハンサーでもよい。場合によっては、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーターエンハンサーエレメントなどのプロモーターエンハンサーエレメントが、ＬＴＲ配列の中に、またはそれに隣接して位置している。
一部の態様では、前記レンチウイルスベクターに存在するレンチウイルスゲノムは、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター配列をさらに含む。一部の態様では、プロモーター配列は、筋細胞および／または筋組織における発現を付与するプロモーターである。そのようなプロモーターの例としては、本明細書で開示されるようなＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターが挙げられる。
一部の態様では、好適な３’非翻訳配列が、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列に作動可能に連結していてもよい。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列と天然に関連付けられるものでもよく、または、例えばウシ成長ホルモン３’非翻訳領域（例えば、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列）などの様々な遺伝子から導出されてもよい。
一部の態様では、さらなるヌクレオチド配列、例えば、シグナル配列、核局在化シグナル、発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列が、インスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列に作動可能に連結していてもよい。
別段の記載がある場合を除き、当業者に公知の方法を使用して、レンチウイルス構築物、ベクター、ならびに一過性および安定に処理されたパッケージング細胞を構築することができる。そのような技術は、当業者には公知である。例えば、SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、AUSUBEL el al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley Sons, Inc., New York)を参照のこと。
宿主細胞
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される修飾型核酸配列、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または発現構築物を含む宿主細胞も提供する。一部の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
特定の宿主に導入するために調製される構築物は、宿主によって認識される複製系、所望のポリペプチドをコードする意図されるＤＮＡセグメント、ならびにポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳の開始および終了の調節配列を含み得る。「作動可能に連結した」という用語については本明細書で既に定義してある。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に作動可能に連結しているのは、それが配列の転写を刺激する場合である。シグナル配列のＤＮＡが、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結しているのは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合である。概して、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列の場合には、連続しており、かつリーディングフレーム内にある。しかしながら、エンハンサーは、それが転写を制御するコード配列と連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーにおけるライゲーションによって、あるいは遺伝子合成によって達成される。
適切なプロモーター配列の選択は、概して、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞に依存する。好適なプロモーター配列の例としては、当技術分野において周知の原核生物プロモーターおよび真核生物プロモーターが挙げられる（例えば、Sambrook and Russell、２００１年、上掲を参照のこと）。転写調節配列は、典型的には、宿主によって認識される異種のエンハンサーまたはプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｌａｃ、およびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ならびに解糖酵素プロモーターなどのプロモーターが公知であり、利用可能である（例えば、Sambrook and Russell、２００１年、上掲を参照のこと）。発現ベクターは複製系を含み、ポリペプチドをコードするセグメントの挿入部位と合わせた転写調節配列および翻訳調節配列を用いることができる。ほとんどの場合、複製系は、ベクターを作製するために使用される細胞（大腸菌としての細菌細胞）においてのみ機能的である。ほとんどのプラスミドおよびベクターは、ベクターに感染した細胞では複製しない。細胞系および発現ベクターの実現可能な組合せの例は、Sambrook and Russell（２００１年、上掲）およびMetzger et al. (1988) Nature 334: 31-36に記載されている。例えば、好適な発現ベクターは、酵母、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、例えば、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、および細菌細胞、例えば、大腸菌において発現することができる。したがって、細胞は原核生物または真核生物の宿主細胞であり得る。細胞は、液体または固形培地で培養するのに好適な細胞であり得る。
外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。技術は、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処置、ポリエチレンイミン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルスまたはファージ感染、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核内へのＤＮＡの直接微量注射を含むが、これらに限定されない。哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは一過性または安定のいずれでもよい。
宿主細胞は、酵母、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、例えば、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、および細菌細胞、例えば、大腸菌であり得る。したがって、細胞は原核生物または真核生物の宿主細胞であり得る。細胞は、液体または固形培地で培養するのに好適な細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、トランスジェニック植物または動物などの多細胞生物の一部である細胞である。一部の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
一部の態様では、複製およびパッケージングのために本明細書で開示される修飾型核酸を含むウイルスベクターを細胞宿主に導入する方法を用いることができ、この方法は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、微量注射、カチオン性またはアニオン性のリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームを含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターを使用したトランスフェクションによってウイルスベクター機能が提供される実施形態では、ウイルス感染をもたらすための標準的方法が使用され得る。
一部の態様では、パッケージング機能は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングのための遺伝子を含み得る。したがって、例えば、パッケージング機能は、必要に応じて、ウイルス遺伝子発現、ウイルスベクター複製、組み込まれた状態からのウイルスベクターの回復、ウイルス遺伝子発現、およびウイルス粒子へのウイルスベクターのパッケージングに必要な機能を含み得る。パッケージング機能は、プラスミドまたはアンプリコンなどの遺伝子構築物を使用して、パッケージング細胞に一緒に供給されても別個に供給されてもよい。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在してもよく、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。例としては、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
一部の態様では、ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために必要とされる、パッケージング細胞の活動性感染を確立するのに必要なヘルパーウイルスエレメントを含み得る。例としては、ウイルスベクターのパッケージングをもたらすのに十分な、アデノウイルス、バキュロウイルスおよび／またはヘルペスウイルスから導出される機能が挙げられる。例えば、アデノウイルスヘルパー機能は、典型的には、アデノウイルス成分Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含む。パッケージング機能は、必要なウイルスにパッケージング細胞を感染させることにより供給され得る。パッケージング機能は、プラスミドまたはアンプリコンなどの遺伝子構築物を使用して、パッケージング細胞に一緒に供給されても別個に供給されてもよい。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在してもよく、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。
任意の好適なヘルパーウイルス機能が用いられ得る。例えば、パッケージング細胞が昆虫細胞である場合、バキュロウイルスがヘルパーウイルスとして機能することができる。ヘルペスウイルスをＡＡＶパッケージング方法におけるヘルパーウイルスとして使用することもできる。
ヘルパー機能を有するヌクレオチド配列を複製およびパッケージングのために細胞宿主に導入する方法のいずれを用いてもよく、この方法は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、微量注射、カチオン性またはアニオン性のリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームを含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターを使用したトランスフェクションまたはヘルパーウイルスを使用した感染によってヘルパー機能が提供される実施形態では、ウイルス感染をもたらすための標準的方法が使用され得る。
当技術分野において公知の好適な許容細胞またはパッケージング細胞のいずれも、パッケージングされたウイルスベクターの産生に用いることができる。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本発明の実施におけるパッケージング細胞の産生に有用な細胞の例としては、例えば、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、２９３細胞、Ｂ－５０またはいずれかの他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞系などのヒト細胞系または霊長類細胞が挙げられる。
一部の態様では、パッケージング細胞として使用される細胞系は、昆虫細胞系である。ＡＡＶの複製を可能にし、培養下で維持することができる昆虫細胞はいずれも、本発明に従って使用することができる。例としては、Ｓｆ９もしくはＳｆ２１細胞系などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．細胞系、または蚊細胞系、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞系が挙げられる。好ましい細胞系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞系である。次の参考文献は、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、かかる細胞に核酸を導入する方法、およびかかる細胞を培養下で維持する方法に関する教示について本明細書に組み込まれる：Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995)、O'Reilly et al, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)、Samulski et al., J. Vir. 63:3822-8 (1989)、Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)、Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992)、Kimbauer et al., Vir. 219:37-44 (1996)、Zhao et al., Vir. 272:382-93 (2000)、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、米国特許第６，２０４，０５９号。
産生中、パッケージング細胞は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングをもたらすのに十分なヘルパー機能およびパッケージング機能と併せて１つまたは複数のウイルスベクター機能を含み得る。これらの様々な機能は、プラスミドまたはアンプリコンなどの遺伝子構築物を使用して、パッケージング細胞に一緒に供給されても別個に供給されてもよく、また、細胞系内で染色体外に存在してもよく、細胞の染色体に組み込まれてもよい。
細胞は、既に組み込まれている機能のうちのいずれか１つまたは複数を供給されてもよく、例えば、１つもしくは複数のベクター機能が染色体外に組み込まれた、もしくは細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞系か、１つもしくは複数のパッケージング機能が染色体外に組み込まれた、もしくは細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞系か、またはヘルパー機能が染色体外に組み込まれた、もしくは細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞系でもよい。
医薬組成物
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される修飾型核酸配列、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または発現構築物を含む医薬組成物も提供する。一部の態様では、本明細書で開示されるようなインスリンおよび／またはグルコキナーゼをコードする修飾型核酸配列を含む発現構築物または送達ベクター（例えば、ＡＡＶカプシドにパッケージングされたウイルスベクター）を含む組成物が提供される。一部の態様では、組成物は、遺伝子療法組成物である。一部の態様では、組成物は医薬組成物であり、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤および／または賦形剤を含む。
そのような薬学的に許容される担体、充填剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤および／または賦形剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, Md.: Lippincott Williams & Wilkins, 2000に見出すことができる。
一部の態様では、組成物は、医薬として使用するためのものである。一部の態様では、医薬は、糖尿病の症状を防止する、低減する、もしくは改善する、遅延させる、治癒する、逆転させる、および／または処置するために使用される。一部の態様では、糖尿病は、糖尿病１型、糖尿病２型、または一遺伝子性糖尿病であり得る。一部の態様では、処置される対象は、哺乳動物、例えば、ネコ、げっ歯類（マウス、ラット、アレチネズミ、モルモット、マウスまたはラット）、イヌ、またはヒトである。
一部の態様では、修飾型核酸、発現構築物、送達ベクターおよび／または組成物は、前記修飾型核酸、発現構築物、送達ベクターおよび／または組成物が抗糖尿病効果を呈することができる場合、糖尿病の症状を防止する、低減する、もしくは改善する、遅延させる、逆転させる、治癒する、および／または処置するために使用される。抗糖尿病効果は、血液中のグルコース処理が増加した場合および／またはグルコース耐性が向上（improve）した場合に到達され得る。これは、当業者に公知の技術を使用して評価することができる。この文脈において、「増加」（それぞれ「向上」）は、少なくとも、当業者に公知のアッセイを使用して、または実験パートで行われるアッセイを使用して検出可能な増加（それぞれ検出可能な向上）を意味する。
抗糖尿病効果は、典型的な症状（すなわち、膵島炎、ベータ細胞喪失）の進行が緩徐化したと医師が評価したときにも観察され得る。糖尿病に関連する典型的な症状の減少は、症状発達の進行の緩徐化または症状の完全な消失を意味し得る。症状、そしてまた症状の減少は、種々の方法を使用して評価することができ、この方法は大方の場合、臨床検査および定型的な実験室試験を含む、糖尿病の診断に使用されるものと同じ方法である。そのような方法は、肉眼的方法および微視的方法の両方、ならびに分子的方法、生化学的方法、免疫組織化学的方法などを含む。
本明細書で定義される医薬（修飾型核酸、発現構築物、送達ベクター、組成物など）は、好ましくは、本明細書で開示される修飾型核酸、ウイルス発現構築物、ウイルスベクター、または組成物を使用した処置の少なくとも１週間後、１ヶ月後、６ヶ月後、１年後、またはそれよりも後に、患者の、または前記糖尿病患者の細胞、組織もしくは臓器の、１つの症状または１つの特徴が減少していれば、またはもはや検出できなければ、前記症状または特徴を軽減することができる。
糖尿病の症状を防止する、低減する、もしくは改善する、遅延させる、逆転させる、治癒する、および／または処置するために使用される、本明細書で開示される修飾型核酸、発現構築物、送達ベクター、または組成物は、糖尿病に罹患した個体または糖尿病を発症するリスクがある個体のｉｎ ｖｉｖｏの細胞、組織および／または臓器に投与するのに好適である場合があり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与することができる。前記組合せおよび／または組成物は、糖尿病に罹患した個体または糖尿病を発症するリスクがある個体のｉｎ ｖｉｖｏの細胞、組織および／または臓器に直接的または間接的に投与することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで直接的または間接的に投与してもよい。一部の態様では、投与様式は筋肉内である。
一部の態様では、本明細書で開示される修飾型核酸、発現構築物、送達ベクター、または組成物は、当技術分野において公知の好適な手段を使用して直接的または間接的に投与することができる。一部の態様では、本明細書で開示される修飾型核酸、発現構築物、送達ベクター、または組成物は、個体、前記個体の細胞、組織または臓器にそのまま送達することができる。疾患または状態に応じて、前記個体の細胞、組織または臓器は、本明細書で以前に定義したとおりであり得る。一部の態様では、本明細書で開示される修飾型核酸、発現構築物、送達ベクター、または組成物は、送達方法と適合する溶液中に溶解している。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内、関節腔内および／または心室内投与の場合、溶液は、生理食塩水であり得る。一部の態様では、投与は筋肉内投与である。一部の態様では、筋肉内投与は、マルチニードルを使用して行われる。一部の態様では、本明細書に記載される修飾型核酸、発現構築物、ベクター、または組成物の治療有効用量は、単一かつ独特の用量で投与されるため、定期的な反復投与が回避される。一部の態様では、単一用量は、筋組織に投与される。一部の態様では、単一用量は、骨格筋組織に投与される。一部の態様では、単一用量は、１つまたは複数の筋肉（例えば、複数の筋肉群）に対する複数回の注射（例えば、２回、３回、４回、または５回）を含む。
一部の態様では、化合物が本発明の組成物中に存在し得る。前記化合物は、修飾型核酸またはそれを含む組成物の送達に役立ち得る。一部の態様では、この化合物は、複合体、ナノ粒子、ミセル、細胞膜を介して小胞もしくはリポソームに複合もしくは捕捉された本明細書で定義される各構成成分を送達するリポソーム、またはそれらの組合せを形成することが可能な化合物である。これらの化合物の多くは当技術分野において公知である。一部の態様では、さらなる化合物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む同様のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ－１８）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＯＴＡＰ、またはそれらの組合せである。
使用の方法
本開示は、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、送達ベクター、または発現構築物のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、糖尿病の症状を防止する、低減する、もしくは改善する、遅延させる、逆転させる、治癒する、および／または処置するための方法も提供する。一部の態様では、糖尿病は、Ｔ１ＤＭであり得る。一部の態様では、糖尿病は、Ｔ２ＤＭであり得る。一部の態様では、この方法は、遺伝子療法である。ある特定の態様では、本開示の方法は、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、送達ベクター、または発現構築物のいずれかの、それを必要とする細胞、組織、または対象への投与（例えば、筋肉内投与）を含む。ある特定の態様では、この方法は、（ｉ）ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）をコードする修飾型（または野生型もしくは未修飾型）核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、送達ベクター、もしくは発現構築物、および／または（ｉｉ）ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）タンパク質をコードする核酸を含む修飾型（または野生型もしくは未修飾型）核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、送達ベクター、もしくは発現構築物の投与を含む。一部の態様では、ｈＩｎｓ核酸配列は、本明細書で開示される修飾型ｈＩｎｓ配列であり、ｈＧｃｋ核酸配列は、本明細書で開示される修飾型ｈＧｃｋ配列である。一部の態様では、ｈＩｎｓ核酸配列は、本明細書で開示される野生型または未修飾型ｈＩｎｓ配列であり、ｈＧｃｋ配列は、本明細書で開示される修飾型ｈＧｃｋ配列である。ある特定の態様では、（ｉ）および（ｉｉ）の投与は、共にまたは順次にのものである。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む使用の方法を対象とし、このポリヌクレオチドは、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、必要に応じて、シグナルペプチドは野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸位置に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み、必要に応じて、ポリヌクレオチドは切断部位をさらに含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列である。一部の態様では、切断部位は、フーリン切断部位である。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを投与することを含む使用の方法を対象とし、この核酸は、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）配列番号４３～５７、１１０～１１６、１５０～１５１、１５４～１５５、および１５７～１５９のいずれかの核酸７３～３３０、配列番号１１７～１２２、１５２、および１５６のいずれかの核酸８８～３４５、または配列番号１５３の核酸７９～３３６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列とを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）、および（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０を含む。一部の態様では、コードされるヒトインスリンタンパク質は、切断部位（例えば、フーリン切断部位）をさらに含む。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを投与することを含む使用の方法を対象とし、この核酸は、配列番号４３～５７、１１０～１２２、または１５０～１５９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＩｎｓタンパク質をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４３～５７、１１０～１２２、または１５０～１５９のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＯＲＦヌクレオチド配列を少なくとも２つ含み、２つのＯＲＦヌクレオチド配列は、同じであっても異なっていてもよい。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列をさらに含む。一部の態様では、少なくとも２つのＯＲＦヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ配列によって分離されている。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、シグナル配列およびプロインスリンポリペプチドを含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、プレプロインスリンである。一部の態様では、コードされるヒトＩｎｓタンパク質は、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、配列番号１～１６、８４～８８、１２３～１４１、または１６０～１６１のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
本開示のある特定の態様は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質（例えば、プレプロインスリンまたはそのバリアント）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを投与することを含む使用の方法を対象とし、この核酸は、（ｉ）シグナルペプチド（例えば、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾（または、野生型プレプロインスリンにおける対応するアミノ酸に対して、アミノ酸Ｈ３４、Ｐ５２、Ｋ５３、Ｒ５５、Ｌ８６、もしくはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾）を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない（例えば、野生型プレプロインスリン配列が、ＩＬ－６シグナル配列またはフィブロネクチンシグナル配列に置き換えられている）。一部の態様では、プロインスリンポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、切断部位（例えば、フーリン切断部位）をさらに含む。
本開示のある特定の態様は、ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを投与することを含む使用の方法を対象とし、この核酸は、配列番号６１～８０もしくは１６２のいずれかの核酸１～１３９８、または配列番号６１～８０および１６２のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む。一部の態様では、コードされるヒトＧｃｋタンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、Ｇｃｋタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列は、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、核酸は、配列番号４２、配列番号４２の５～３２９、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、核酸は、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、配列番号２０～３９および８９～９６、ならびに１６３～１６４のいずれかと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、核酸は、プロモーター（例えば、真核生物プロモーター）に作動可能に連結している。本開示のある特定の態様は、本開示のポリヌクレオチドと、核酸配列に作動可能に連結した異種発現制御配列とを含む、発現カセットを対象とする。一部の態様では、核酸は、ポリアデニル化（ポリＡ）エレメントに作動可能に連結している。
本開示のある特定の態様は、本開示のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクター（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソーム）を投与することを含む使用の方法を対象とする。一部の態様では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。本開示のある特定の態様は、ＡＡＶカプシドと、本開示のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を投与する方法を対象とする。一部の態様では、ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶｒｈ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２からなる群から選択される。
本明細書で開示される遺伝子療法の方法に関するある特定の利点には、糖尿病対象の生涯にわたって治療用遺伝子の発現をもたらす、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、送達ベクター、または発現構築物の投与の可能性が含まれる。ＷＯ２０１２／００７４５８は、糖尿病の処置として、１つはインスリン遺伝子を発現し、１つはグルコキナーゼ遺伝子を発現する、２つのウイルスベクターの生成を開示している。さらに、ＷＯ２０１６／１１０５１８は、インスリン遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子を含む単一ベクター遺伝子構築物を開示している。ある特定の態様では、本開示は、インスリンおよび／もしくはグルコキナーゼの発現が増加し、有害な免疫反応が減少し、かつ／またはより低用量のウイルスベクターの投与を可能にする、糖尿病の処置または防止のための改善された核酸配列、発現構築物、および／または送達ベクターを提供する。
一部の態様では、本開示の方法は、個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器における糖尿病の１つもしくは複数の症状を軽減もしくは低減するか、または前記個体の細胞、組織もしくは臓器の１つもしくは複数の特徴もしくは症状を軽減もしくは低減し、この方法は、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または発現構築物のうちの１つまたは複数を前記個体に投与することを含む。
糖尿病を有する成人に対する処置の推奨は、概して、著しい低血糖を伴わずにＨｂＡ１ｃ＜７．０％を標的とする。一部の態様では、ＨｂＡ１ｃの「正常範囲」は、＜７．０％、例えば、＜６．５％、＜６．０％、＜５．７％、例えば、約５．０％から約６．５％の間である。ほとんどの市販製品は、ＨｂＡ１ｃを０．５％から１．５０％の間に低下させる。一部の態様では、本開示の方法は、処置された糖尿病対象におけるＨｂＡ１ｃレベルを、非糖尿病性対象におけるＨｂＡ１ｃレベルまで、例えば８週間以内に正常化する。一部の態様では、本開示の方法は、対象における血中糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルの低下および／または調節を可能にする。一部の態様では、処置後の対象におけるＨｂＡ１ｃレベルは、例えば、処置後８週間以内に、＜７．０％（例えば、＜６．５％、＜６．０％、＜５．７％、例えば、５．０％から６．５％の間）である。
インスリンは、肝臓、脂肪、および腸における脂質代謝調節において中心的役割を果たす（Verges B. Insulin sensitivity and lipids. Diabetes Metab. 2001 Apr;27(2 Pt 2):223-7. PMID: 11452214.）。制御されていない１型糖尿病では、患者はグルコースを利用することができず、代替的な燃料源が必要になる。脂肪組織では、インスリンにより、通常は脂肪細胞におけるトリグリセリドの貯蓄を促進し、循環中の脂肪組織からの遊離脂肪酸の放出を低減するホルモン感受性リパーゼが阻害される。循環インスリンレベルが低いと、リポタンパク質の異化作用が著しく低減する（Taskinen MR. Lipoprotein lipase in diabetes. Diabetes Metab Rev. 3:551-570. 1987 doi: 10.1002/dmr.5610030208. 1987）。脂肪分解が起こり、その結果、循環しているトリグリセリドリッチなリポタンパク質（カイロミクロン、ＶＬＤＬ）のレベルが上昇して、高トリグリセリド血症につながる。一部の態様では、本開示の方法は、対象（例えば、糖尿病を患う対象）、前記対象の細胞、組織または臓器におけるトリグリセリドリッチなリポタンパク質（例えば、カイロミクロンまたはＶＬＤＬ）のレベルを低下させ、この方法は、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または発現構築物のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む。
肝臓では、ケトン体（β－ヒドロキシ酪酸（β－ＨＢ）およびアセト酢酸（ＡｃＡｃ））が脂肪酸のβ－酸化によって産生される。絶食中または食事性炭水化物制限中、ケトンは、グルコース制限条件における代替的なエネルギー源として機能し、脳のエネルギー必要量のうち最大８０％を提供することができる。短期的には有用であるが、循環ケトンが慢性的に高いと、脳、腎臓、肝臓、および微小血管において望ましくない効果が生じることがあり（Kanikarla-Marie P, Jain SK. Hyperketonemia and ketosis increase the risk of complications in type 1 diabetes. Free Radic Biol Med. 95:268-277, 2016. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2016.03.020）、致命的となり得るケトアシドーシスが生じることがある。一部の態様では、本開示の方法は、対象（例えば、糖尿病を患う対象）、前記対象の細胞、組織または臓器におけるケトンのレベルを低下させ、この方法は、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、または発現構築物のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む。
一部の態様では、本開示の方法は、（ｉ）対象における血中糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルの低下および／もしくは調節、（ｉｉ）対象における循環ケトンの低減、（ｉｉｉ）対象におけるトリグリセリドの低減、または（ｉｖ）それらの任意の組合せをもたらす。
一部の態様では、方法または使用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば細胞培養物を使用して行われる。一部の態様では、方法または使用は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の態様では、本明細書で開示される修飾型核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、送達ベクター、または発現構築物は、個体の糖尿病を処置するために使用されることが公知であるさらなる化合物と組み合わされる。一部の態様では、方法は、例えば通常の注射を介して組換えインスリンを投与することをさらに含む。
一部の態様では、本明細書で開示される方法は繰り返されない。一部の態様では、本明細書で開示される方法は、毎年、または２年毎、３年毎、４年毎、５年毎、６年毎、７年毎、８年毎、９年毎、もしくは１０年毎に繰り返される。
一部の態様では、この方法は、本明細書に記載される修飾型核酸、発現構築物、ベクター、または組成物の治療有効用量を投与することを含み、投与は単回であり、例えば、定期的な反復投与が回避される。一部の態様では、単一用量は、筋組織に投与される。一部の態様では、単一用量は、骨格筋組織に投与される。一部の態様では、単一用量は、１つまたは複数の筋肉（例えば、複数の筋肉群）に対する複数回の注射（例えば、２回、３回、４回、または５回）を含む。
概要および要約のセクションではなく、詳細な説明のセクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されるよう意図されていることを理解されたい。概要および要約のセクションは、発明者が想定する本発明の例示的な実施形態のうちの１つまたは複数を記載するが、すべてを記載するとは限らず、したがって、いかなる様式においても本発明および添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明の広さおよび範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれかによって限定されてはならず、以下の請求項およびそれらの均等物に従って定義されるべきである。
本発明について記載してきたが、これを以下の実施例においてさらに詳細に説明する。実施例は、例示のみを目的として本明細書に含まれており、本発明を限定することを意図するものではない。
（実施例１）
修飾型インスリン核酸
配列番号１～１６、８４～８８、１２３～１４１、および１６０～１６１に対応する、以下の修飾型ヒトインスリン核酸配列（表１に示す）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した。５’ＵＴＲ配列（配列番号４２、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８）は太字であり、ＯＲＦ配列には下線を引いてあり（配列番号４３～５７、１１０～１２２）、３’ＵＴＲ配列はイタリック体である（配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、または配列番号１４９）。配列番号４２の配列を有する５’ＵＴＲをさらに修飾して、１～４位のＣＴＡＧを除去した。したがって、ある特定の構築物において、５’ＵＴＲは配列番号４２の核酸５～３２９を含んでいた。いくつかの構築物では、ＩＲＥＳ配列を２つのインスリンＯＲＦ配列間に付加し、ＩＲＥＳ配列は太字およびイタリック体で示してある（配列番号１４３）。
Figure 2023542241000001
Figure 2023542241000002
Figure 2023542241000003
Figure 2023542241000004
Figure 2023542241000005
Figure 2023542241000006
Figure 2023542241000007
Figure 2023542241000008
Figure 2023542241000009
Figure 2023542241000010
Figure 2023542241000011
Figure 2023542241000012
Figure 2023542241000013
Figure 2023542241000014
Figure 2023542241000015
Figure 2023542241000016
Figure 2023542241000017
Figure 2023542241000018
Figure 2023542241000019
Figure 2023542241000020
Figure 2023542241000021
Figure 2023542241000022
Figure 2023542241000023
Figure 2023542241000024
Figure 2023542241000025
Figure 2023542241000026
一部の態様では、核酸は、野生型および／または未修飾型ヒトインスリン核酸配列（例えば、配列番号１）に対してコドン最適化され、かつＣｐＧが低減した配列を含む。修飾型核酸を化学合成し、ＣＭＶプロモーターを含む発現カセット中で調製し、発現プラスミドにクローニングした。修飾型配列をＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。
ｐＡＡＶ－インスリンプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からのインスリンの分泌を試験した。ｐＡＡＶ－インスリンプラスミドのＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ＿２（配列番号１６０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－未修飾型ｈＩｎｓ（配列番号１）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２２（配列番号１２３）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ６（配列番号６）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ８（配列番号８）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２３（配列番号１２４）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２４（配列番号１２５）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２５（配列番号１２６）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ＿２（配列番号１２７）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２７（配列番号１２８）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２８（配列番号１２９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ２９（配列番号１３０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３０（配列番号１３１）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３１（配列番号１３２）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３２（配列番号１３３）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３３（配列番号１３４）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３４（配列番号１３５）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３５（配列番号１３６）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３６（配列番号１３７）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３７（配列番号１３８）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３８（配列番号１３９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＩｎｓ３９（配列番号１４０）、またはＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型Ｉｎｓ４０（配列番号１４１）を、２４ウェルプレート中、０．５μｇ（図１Ｂ）または０．１μｇ（図１Ｃ）でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞外インスリンレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。ｐＡＡＶ－インスリンプラスミドは、トランスフェクション後にインスリン発現を呈する。
（実施例２）
修飾型Ｇｃｋ核酸
配列番号２０～３９、８９～９６、および１６３～１６４に対応する、以下の修飾型ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）核酸配列（表２に示す）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した。５’ＵＴＲ配列（配列番号４２または配列番号８３）は太字であり、ＯＲＦ配列には下線を引いてあり（配列番号６１～８０および１６２）、３’ＵＴＲはイタリック体である（配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、または配列番号１０９）。配列番号４２の配列を有する５’ＵＴＲをさらに修飾して、１～４位のＣＴＡＧを除去した。したがって、ある特定の構築物において、５’ＵＴＲは配列番号４２の核酸５～３２９を含んでいた。
Figure 2023542241000027
Figure 2023542241000028
Figure 2023542241000029
Figure 2023542241000030
Figure 2023542241000031
Figure 2023542241000032
Figure 2023542241000033
Figure 2023542241000034
Figure 2023542241000035
Figure 2023542241000036
Figure 2023542241000037
Figure 2023542241000038
Figure 2023542241000039
Figure 2023542241000040
Figure 2023542241000041
Figure 2023542241000042
Figure 2023542241000043
Figure 2023542241000044
Figure 2023542241000045
Figure 2023542241000046
Figure 2023542241000047
Figure 2023542241000048
Figure 2023542241000049
Figure 2023542241000050
Figure 2023542241000051
Figure 2023542241000052
Figure 2023542241000053
Figure 2023542241000054
Figure 2023542241000055
Figure 2023542241000056
Figure 2023542241000057
Figure 2023542241000058
Figure 2023542241000059
Figure 2023542241000060
Figure 2023542241000061
一部の態様では、核酸は、野生型および／または未修飾型ヒトＧｃｋ核酸配列（例えば、配列番号１９）に対してコドン最適化され、かつＣｐＧが低減した配列を含む。修飾型核酸を化学合成し、ＣＭＶプロモーターを含む発現カセット中で調製し、発現プラスミドにクローニングした。修飾型配列をＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。
ｐＡＡＶ－ＧｃｋプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞におけるＧｃＫ発現を試験した。ｐＡＡＶ－ＧｃＫプラスミドのＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ＿２（配列番号１６３）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ９（配列番号６８）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１０（配列番号６９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１１（配列番号７０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１２（配列番号７１）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１３（配列番号７２）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１４（配列番号７３）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１５（配列番号７４）、およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－修飾型ｈＧｃｋ１６（配列番号７５）を、６ウェルプレート中、１ウェル当たり２．５μｇでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞ペレットを収集し、細胞内インスリンレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。ｐＡＡＶ－ＧｃＫプラスミドは、トランスフェクション後にＧｃＫ発現を呈した。
（実施例３）
ヒトインスリンベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ比較解析
インスリンバリアント（配列番号１、配列番号８７および配列番号８８）を担持するＡＡＶ１－ＣＭＶ－ヒトインスリンベクターの感染力および効力（インスリンｍＲＮＡ発現、細胞培地へのインスリン分泌、および分泌されたインスリンの生物活性）について研究した。２ｖ６．１１細胞を、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＷＴ（配列番号１１０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）ベクターに、異なるＭＯＩで感染させた。感染力アッセイでは、ベクターゲノムの細胞内含有量を数量化した。効力アッセイでは、ヒトインスリンｍＲＮＡ発現と、細胞培地に分泌されたインスリンとを測定した。分泌されたインスリンは機能性についても評価した。
方法
３．１ ２ｖ６．１１細胞のＡＡＶ１－ＣＭＶ－ヒトインスリンベクターによる感染
感染の前日、２ｖ６．１１細胞を２４ウェルプレートに２Ｅ＋０５細胞／ウェルの密度で播種した。抗生物質（ペニシリン＝１０，０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン＝１０，０００μｇ／ｍｌ）および１μｇ／ｍｌのポナステロンＡを補った増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）において、３７℃および８．５％ＣＯ２で細胞を増殖させた。
感染前、明視野顕微鏡で適正な細胞コンフルエンス（７０～８０％）のために細胞を評価した。細胞計数を評価するために、４ウェルの細胞をトリプシン処理し、Ｓｃｅｐｔｅｒ ２．０ Ｈａｎｄｈｅｌｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて数量化した。細胞を、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ヒトインスリンベクターのＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（野生型）（配列番号１１０）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）（表３）に、ＭＯＩ＝１０００、２０００および４０００ｖｇ／細胞で感染させた。細胞は、感染力試験と効力試験との両方で、四連で感染させた。非感染２ｖ６．１１細胞（ＮＩ）を陰性対照として使用した。感染は、異なる細胞継代数の細胞を使用し、異なる日に３回繰り返した。
Figure 2023542241000062
３．２ 感染力試験
感染の２４時間後、細胞を明視野顕微鏡下で生存率について観察した。次に、細胞培地を吸引し、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて２００μｌの１×ＰＢＳ中に収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞内ベクターゲノムを抽出し、ＩＴＲ２配列をターゲティングするオリゴセットを用いるＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって増幅した。標準ＤＮＡの段階希釈を用いて生成された標準曲線からの内挿により、ベクターゲノムを数量化した。
３．３ 効力試験のための試料収集
感染の４８時間後、かつ細胞生存率を評価した後に、細胞培地を吸引し、３７℃まで温めた４００μｌのＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡと交換し、プレートをインキュベータに戻した。５時間のインキュベーション後、タンパク質の読み取り値のために、３５０μｌの細胞培地を１．５ｍｌのマイクロチューブに収集し、６００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、３００μｌの上清を新しいチューブに移した。ｍＲＮＡ発現のために、残りの培地をウェルから吸引し、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳで穏やかに洗浄し、３５０μｌのＲＬＴ＋β－メルカプトエタノール（１０μｌ／ｍｌ）（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）に収集した。試料は処理するまで－８０℃で保管した。
３．４ ヒトインスリンｍＲＮＡ発現
感染したＡＡＶベクターゲノムの適切な分解を確実にするために、オンカラムＤＮＡｓｅ Ｉ消化を標準的な１５分間から３０分間に延長したことを除いては、製造元により提供されたプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＲＮＡを抽出した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、各ＲＮＡ試料１μｇを逆転写した。Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）および２μｌの試料（１／１０に希釈）を使用し、ｑＰＣＲを三連で行った。発現を数量化するために、ＳＶ４０ポリＡシグナル（すべてのヒトインスリンプラスミドに共通する配列）をターゲティングするプライマー・プローブミックスを使用した（フォワードプライマー：ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ Ａ；リバースプライマー：ＣＡＧ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＡ ＧＡＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＴ Ｔ；プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＡＧＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴ／ＺＥＮ／ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＴＴ ＣＴＡ ＧＴＴ ＧＴＧ ＧＴＴ ＴＧＴ Ｃ／３ＩＡＢｋＦＱ／）。ハウスキーピング遺伝子ｈＲｐｌｐ０用のプライマー・プローブミックスを正規化のために使用した（フォワードプライマー：ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴ；リバースプライマー：ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＣＴＧ ＡＡ；プローブ：／５ＨＥＸ／ＡＡ ＣＴＣ ＴＧＣ Ａ／ＺＥＮ／ＴＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＧＧ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ）。
３．５ 分泌されたヒトインスリンの定量解析
Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）を使用し、ｍｉｌｌｉＱ水で１／１０に希釈した培地試料において分泌されたインスリンを二連で測定した。
３．６ 分泌されたヒトインスリンの機能解析
感染細胞により産生され細胞培地中に分泌されたインスリンの生物活性をｉＬｉｔｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｖａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。簡潔に述べると、４０μｌの標準物質または感染細胞の細胞培地と、予め解凍して９％ＦＢＳ（熱失活したもの）および抗生物質（ペニシリン＝１０，０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン＝１０，０００μｇ／ｍｌ）を補ったＲＰＭＩに再懸濁した４０μｌのｉＬｉｔｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓとを、９６ウェル白色プレートに加えた。３７℃および５％ＣＯ２で５時間のインキュベーション後、プレートを室温に平衡化し、８０μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ試薬をウェルに加えた。細胞を１０分間溶解させ、発光をプレートリーダーで測定した。組換えヒトインスリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を標準曲線のために使用した。
３．７ 統計的解析
Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定を使用し、各ＭＯＩを３つの研究について独立して解析した。
結果
２ｖ６．１１細胞を、ヒトインスリンバリアントのＩｎｓ５およびＩｎｓ７ならびにＷＴヒトインスリンを担持するＡＡＶ１－ヒトインスリンベクターに感染させて、ベクターの感染力および効力を３つの独立した研究で評価した。
３．８ 感染力アッセイ
２ｖ６．１１細胞においてＡＡＶ１－ヒトインスリンベクターのＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）を用いて行った３つの独立した感染研究は、細胞内ベクターゲノム含有量（ｖｇ／ｎｇ ＤＮＡ）によって示されるように、試験した３つのＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））において細胞に感染する異なるベクターの能力における有意差を示さなかった（図３Ａ～３Ｃおよび表４）。
Figure 2023542241000063
Figure 2023542241000064
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応する感染力データは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。
３．９ 効力アッセイ
３．９．１ ヒトインスリンｍＲＮＡ発現
ヒトインスリン発現レベルの数量化により、行った３つの研究において、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１）とＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）との間には有意差がないことが明らかになった（図４Ａ～４Ｃおよび表５）。その一方、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）の感染により媒介されたｍＲＮＡ発現レベルは、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１１０）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）により媒介されたものより有意に低かった（図４Ａ～４Ｃおよび表５）。
Figure 2023542241000065
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応するヒトインスリンｍＲＮＡ発現データは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
３．９．２ 分泌されたヒトインスリンの定量解析
異なるＡＡＶ１－ヒトインスリンベクターに感染した２ｖ６．１１細胞によって細胞培地に分泌されたインスリンを、Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）を使用して数量化したとき、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１１０）とＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）との間に有意差は観察されなかった（図５Ａ～５Ｃおよび表６）。ｍＲＮＡ発現の読み取り値について観察されるように（図４Ａ～４Ｃおよび表５）、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）により媒介されたインスリン分泌のレベルは、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）のベクターによりもたらされたものより有意に低かった（図５Ａ～５Ｃおよび表６）。１Ｋからのデータは最低基準未満であり数量化できなかったため、２Ｋおよび４Ｋでの感染からのデータを用いて統計的解析を行った。
Figure 2023542241000066
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応する分泌されたヒトインスリンのデータは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
３．９．３ 分泌されたヒトインスリンの機能解析
感染細胞により産生され細胞培地中に分泌されたインスリンの活性をｉＬｉｔｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｄｙ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｖａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。ｍＲＮＡ発現およびヒトインスリンタンパク質の読み取り値について取得された結果によれば（図４Ａ～４Ｃおよび５Ａ～５Ｃならびに表５および６）、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓ＿Ｂ１０Ｄ（配列番号１）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ５（配列番号８７）について観察されたインスリン活性は有意に異ならなかったが、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｉｎｓ７（配列番号８８）は、やはり著しく低いインスリン活性を示した（図６Ａ～６Ｃおよび表７）。
Figure 2023542241000067
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応するヒトインスリン活性のデータは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
（実施例４）
ヒトグルコキナーゼベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ比較解析
野生型（配列番号１９）ならびにＧｃｋ８（配列番号９３）およびＧｃｋ１２（配列番号９５）のヒトグルコキナーゼバリアントを担持するＡＡＶ１－ＣＭＶ－ヒトグルコキナーゼベクターの感染力および効力（ｍＲＮＡ発現、タンパク質含有量および生物活性）について研究した。この目的のために、２ｖ６．１１細胞を、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）に、異なるＭＯＩで感染させた。感染力アッセイでは、ベクターゲノムの細胞内含有量を数量化した。効力アッセイでは、ヒトグルコキナーゼｍＲＮＡ発現、グルコキナーゼ細胞内含有量およびグルコキナーゼ活性を測定した。
方法
４．１ ２ｖ６．１１細胞のＡＡＶ１－ＣＭＶ－ヒトグルコキナーゼベクターによる感染
感染の前日、２ｖ６．１１細胞を２４ウェルプレートに２Ｅ＋０５細胞／ウェルの密度で播種した。抗生物質（ペニシリン＝１０，０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン＝１０，０００μｇ／ｍｌ）および１μｇ／ｍｌのポナステロンＡを補った増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）において、３７℃および８．５％ＣＯ２で細胞を増殖させた。
感染前、明視野顕微鏡で適正な細胞コンフルエンス（７０～８０％）のために細胞を評価した。細胞計数を評価するために、４ウェルの細胞をトリプシン処理し、Ｓｃｅｐｔｅｒ ２．０ Ｈａｎｄｈｅｌｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて数量化した。細胞を、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ヒトグルコキナーゼベクターのＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（表８）に、ＭＯＩ＝１０００、２０００および４０００ｖｇ／細胞で感染させた。細胞は、各特異的解析：感染力、ヒトグルコキナーゼｍＲＮＡ発現、細胞内ヒトグルコキナーゼおよびグルコキナーゼ活性について、四連で感染させた。非感染２ｖ６．１１細胞（ＮＩ）を陰性対照として使用した。感染は、異なる細胞継代数の細胞を使用し、異なる日に３回繰り返した。
Figure 2023542241000068
４．２ 感染力アッセイ
感染の２４時間後、細胞を明視野顕微鏡下で生存率について観察した。次に、細胞培地を吸引し、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて２００μｌの１×ＰＢＳ中に収集した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞内ベクターゲノムを抽出し、ＩＴＲ２配列をターゲティングするオリゴセットを用いるＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって増幅した。標準ＤＮＡの段階希釈を用いて生成された標準曲線からの内挿により、ベクターゲノムを数量化した。
４．３ ヒトグルコキナーゼｍＲＮＡ発現
感染の４８時間後、かつ細胞生存率を評価した後に、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳで穏やかに洗浄し、３５０μｌのＲＬＴ＋β－メルカプトエタノール（１０μｌ／ｍｌ）（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）に収集した。感染したＡＡＶベクターゲノムの適切な分解を確実にするために、オンカラムＤＮＡｓｅ Ｉ消化を標準的な１５分間から３０分間に延長したことを除いては、製造元により提供されたプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＲＮＡを抽出した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、各ＲＮＡ試料１μｇを逆転写した。Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）および２μｌの試料（１／１０に希釈）を使用し、ｑＰＣＲを三連で行った。発現を数量化するために、ＳＶ４０ポリＡシグナル（すべてのヒトグルコキナーゼバリアントに共通する配列）をターゲティングするプライマー・プローブミックスを使用した（フォワードプライマー：ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ Ａ；リバースプライマー：ＣＡＧ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＡ ＧＡＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＴ Ｔ；プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＡＧＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴ／ＺＥＮ／ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＴＴ ＣＴＡ ＧＴＴ ＧＴＧ ＧＴＴ ＴＧＴ Ｃ／３ＩＡＢｋＦＱ／）。ハウスキーピング遺伝子ｈＲｐｌｐ０用のプライマー・プローブミックスを正規化のために使用した（フォワードプライマー：ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴ；リバースプライマー：ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＣＴＧ ＡＡ；プローブ：／５ＨＥＸ／ＡＡ ＣＴＣ ＴＧＣ Ａ／ＺＥＮ／ＴＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＧＧ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ）。
４．４ 細胞内グルコキナーゼ含有量の定量解析
感染の４８時間後、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳ／ウェルで穏やかに洗浄した。次いで、細胞を２００μｌの氷冷１×ＰＢＳでスクラップし、マイクロチューブに収集した。細胞抽出物を取得するために、細胞の凍結（液体窒素）および解凍（３７℃水浴）を３回行い、５０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を取っておいて－８０℃で保管した。Ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用し、ヒトグルコキナーゼを二連（標準物質および試料）で測定した。ＥＬＩＳＡ ｋｉｔにより提供された１× ｄｉｌｕｅｎｔ Ｎを使用して試料を１／２０に希釈した。ｍｉｌｌｉＱ水中の試料の１／１０希釈物を使用し、ＢＣＡ法によって細胞抽出物において二連で数量化した総タンパク質含有量により、グルコキナーゼ含有量を正規化した。
４．５ グルコキナーゼ活性アッセイ
感染の４８時間後、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳ／ウェルで穏やかに洗浄した。次いで、２５０μｌのトリプシンをウェルに穏やかに加え、かき混ぜ、余剰のトリプシン（tryspin）を吸引により除去した。室温で２分間のインキュベーション後、細胞を上下にピペッッティングすることにより７５０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに収集し、１．５ｍｌのマイクロチューブに移した。細胞を６００×ｇで１０分間、４℃でペレット化し、上清を吸引し、細胞ペレットを処理するまで－８０℃で保管した。
グルコキナーゼ活性をＧｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡｓｓａｙＧｅｎｉｅ）によって測定した。２．５ｍＭ ＤＴＴを含有するＧｃｋアッセイ緩衝剤２５０μｌ中で細胞ペレットを超音波処理したことを除いては、製造元により提供されたプロトコールに従った。試料の１０倍希釈物１０μｌをアッセイに使用した。
４．６ 統計的解析
Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定を使用し、各ＭＯＩを３つの研究について独立して解析した。
結果
２ｖ６．１１細胞を、ヒトグルコキナーゼバリアントのＧｃｋ８およびＧｃｋ１２ならびにＷＴ ｈＧｃｋを担持するＡＡＶ１－ヒトグルコキナーゼベクターに感染させて、ベクターの感染力および効力を３つの独立した研究で評価した。
４．７ 感染力アッセイ
３つのＡＡＶ１－ヒトグルコキナーゼベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）は、３つの異なるアッセイにおける細胞内ベクターゲノム含有量（ｖｇ／ｎｇ ＤＮＡ）によって示されるように、試験した３つのＭＯＩ（１０００ｖｇ／細胞（１Ｋ）、２０００ｖｇ／細胞（２Ｋ）および４０００ｖｇ／細胞（４Ｋ））において２ｖ６．１１細胞に感染する能力における一貫した有意差を示さなかった（図７Ａ～７Ｃおよび表９）。
Figure 2023542241000069
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応する感染力データは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
４．８ 効力アッセイ
４．８．１ ヒトグルコキナーゼｍＲＮＡ発現
ヒトグルコキナーゼ発現レベルの数量化により、ｈＧｃｋＷＴおよびグルコキナーゼバリアントＧｃｋ８をそれぞれ担持するベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（配列番号１９）とＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）との間には、一貫した有意差がないことが明らかになった（図８Ａ～８Ｃおよび表１０）。グルコキナーゼバリアントＧｃｋ１２を含有するＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）は、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（配列番号１９）および特にＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）と比較すると、複数のアッセイ間およびＭＯＩ間で一貫してはいないものの、より低いｍＲＮＡ発現を媒介する傾向を示した（図８Ａ～８Ｃおよび表１０）。
Figure 2023542241000070
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応するヒトグルコキナーゼｍＲＮＡ発現データは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
４．８．２ 細胞内グルコキナーゼ含有量の定量解析
異なるＡＡＶ１－ヒトグルコキナーゼベクターに感染した２ｖ６．１１細胞の細胞内グルコキナーゼ含有量を、Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を使用して数量化したとき、複数のＭＯＩおよびアッセイを通して一貫した有意差はベクター間で観察されなかった（図９Ａ～９Ｃおよび表１１）。
Figure 2023542241000071
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応する細胞内グルコキナーゼ含有量のデータは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
４．８．３ グルコキナーゼ活性アッセイ
感染細胞の細胞抽出物中のグルコキナーゼ活性をＧｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡｓｓａｙＧｅｎｉｅ）によって測定した。ｍＲＮＡ発現およびタンパク質の読み取り値について観察された結果と一致して（図８Ａ～８Ｃおよび９Ａ～９Ｃならびに表１０および１１）、ベクターＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＧｃｋＷＴ（配列番号１９）、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ８（配列番号９３）およびＡＡＶ１－ＣＭＶ－Ｇｃｋ１２（配列番号９５）について観察されたグルコキナーゼ活性は、複数のＭＯＩおよびアッセイを通して、ベクター間で有意に異ならなかった（図１０Ａ～１０Ｃおよび表１２）。
Figure 2023542241000072
各ＭＯＩおよび各アッセイに対応するグルコキナーゼ活性のデータは、Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定によって解析した。太字およびイタリック体は統計的有意性を示す。
（実施例５）
骨格筋におけるインスリンおよびグルコキナーゼの発現を介する１型糖尿病性マウスの逆転
血液からグルコースを除去するＡＡＶベクターインスリンおよびグルコキナーゼ構築物の単回投与の有効性を評価するため、Ｃ５７Ｂｌｋ６マウスの両後肢の骨格筋（四頭筋、腓腹筋、および頭蓋脛骨）に、ヒトインスリン遺伝子（配列番号１）を含有するＡＡＶ１と、ラットグルコキナーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ１とを注射した。
まずマウスを４０ｍｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により５日連続で処置して膵臓内のベータ細胞を枯渇させ、それにより、天然マウスインスリンの産生を消失させ、血中グルコースレベルが約６００ｍｇ／ｄＬに達するようにした。次いで、動物の両後肢における３つの識別された筋肉に、ＡＡＶ１－インスリン（配列番号１）とＡＡＶ１－ラットグルコキナーゼとの等量混合物を与えた。別個の群において、同じ総用量のＡＡＶ１－インスリン（配列番号１）およびＡＡＶ１－ラットグルコキナーゼを、動物の２つの後肢筋肉（四頭筋および腓腹筋）に、より低い総体積で投与した。これらの動物を、ＳＴＺ－ビヒクル処置動物および非糖尿病性ビヒクル処置動物（ｎ＝１０～１１／群）と比較した。ＡＡＶ１－インスリン（配列番号１）およびＡＡＶ１－ラットグルコキナーゼを受けたＳＴＺ処置糖尿病性マウスは、以前の研究で観察されたように、給餌条件および絶食条件において、正常血糖およびＨｂＡ１Ｃレベルを回復し、維持した。
２つの筋肉に対する遺伝子療法の投与は、３つの筋肉に投与したときと等しく効果的であった。ＡＡＶ１－インスリン（配列番号１）およびＡＡＶ１－ラットグルコキナーゼを受けたストレプトゾトシン処置糖尿病性マウスは、給餌条件（図１１Ａ～１１Ｃおよび図１２）および絶食条件（第４週のデータが示されている）において、正常血糖を回復し、注射５週間後まで維持した。さらに、より高濃度のベクターで２つの大きな筋肉群（四頭筋および腓腹筋）のみを処置したマウスは、３つの筋肉群を処置したマウスと比べて同等またはより良好に機能するように見受けられた（図１１Ａ～１１Ｃおよび図１２）。これらの結果は、筋肉の解剖学的構造および血流が、アロメトリックな翻訳における検討事項であり得ることを示している。治療効果は早くも投薬後１週間に観察され、未処置対照動物の範囲内で２週間までに高血糖の著しい低減が観察された。ＡＡＶが媒介する基礎インスリン産生およびグルコキナーゼ活性の連合作用は、骨格筋において、糖尿病性動物におけるグルコースの適切な調節を可能にする「グルコースセンサ」を生成し、処置を受けた動物における糖尿病の完全な逆転の動因となる可能性がある。
（実施例６）
さらなるプロインスリンバリアントの開発
配列番号１５０～１５９に対応する、プレプロインスリンバリアントをコードするさらなる修飾型核酸ヒトインスリンＯＲＦ配列１０個を設計した（表１３に示す）。これらのＯＲＦは、Ｂ鎖および／もしくはＣ鎖におけるアミノ酸突然変異、シグナル配列における置換、フーリンエンドプロテアーゼ切断部位の付加、またはそれらの組合せを含むプレプロインスリンバリアントをコードする。
Figure 2023542241000073
Figure 2023542241000074
（実施例７）
プレプロインスリンバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ｉｎ ｖｉｔｒｏで配列番号１５０～１５９によって媒介されるインスリンの産生および分泌のレベルを評価するため、各インスリンバリアントをまず、ＡＡＶプラスミド（ｐＡＡＶ）においてｍｉｎｉＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした（ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－ＩｎｓＸ、ここでＸは特定のＯＲＦ、すなわち、配列番号１５０～１５９を示す）。プラスミドの名称および対応するＯＲＦ配列を表１４に列記する。
Figure 2023542241000075
ＡＡＶ２のＩＴＲ間で、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターの制御下のヒトプレプロインスリンバリアントをクローニングすることにより、ＡＡＶ発現カセットを取得した（ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－ＩｎｓＸ、ここでＸは特定のインスリンバリアントを示す）。
ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターの制御下のプレプロインスリンバリアントおよびＲＳＶプロモーターの制御下のヒトグルコキナーゼをコードする血清型１の一本鎖ＡＡＶベクター（ＡＡＶ１－ＩｎｓＸ、ここでＸは特定のプロインスリンバリアントを示す）を、標準的方法（Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36）に従ったＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって産生した。１０個のローラーボトル（８５０ｃｍ２、平底；Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳ）において、細胞をＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ中で８０％コンフルエンスまで培養し、リン酸カルシウム法により、ＡＡＶ２ ＩＴＲによってフランキングされた発現カセットを搭載したプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子および血清型１のＡＡＶのｃａｐ遺伝子を搭載したヘルパープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパー機能を搭載したプラスミドをコトランスフェクトした。非コードプラスミドを使用してヌルベクター（ｐＡＡＶ－ヌル）を産生した。ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび２つの連続した塩化セシウム（ＣｓＣｌ）グラジエントに基づく最適化された方法により、ＡＡＶを精製した。この第２世代のＣｓＣｌに基づくプロトコールは、空のＡＡＶカプシドならびにＤＮＡおよびタンパク質の不純物を劇的に低減した（Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36）。精製されたＡＡＶベクターをＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で保管した。線状化プラスミドＤＮＡを標準曲線として使用したＡＡＶ２参照標準物質について説明されているプロトコール（Lock M, et al., Hum. Gene Ther. 2010; 21:1273-1285）に従う定量ＰＣＲにより、ウイルスゲノムの力価を決定した。ベクターは、当技術分野において周知の分子生物学技術に従って構築した。
まず、ＨＥＫ２９３細胞に等モル量のｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ１～８プラスミドをトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートで培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を製造元の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用して、１ウェル当たり０．８μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞、および導入遺伝子を含まないＡＡＶプラスミド（ｐＡＡＶ－ヌル）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を対照とした。ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ３プラスミドは、最も高い細胞内インスリン含有量および培養培地へのインスリンの分泌の両方を媒介した（図１３Ａ～１３Ｂ）。これらの結果は、残りのバリアントと比較して、ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ３プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるインスリン発現レベルが向上したことに起因するものではなかった（図１４Ａ～１４Ｄ）。
次に、ＨＥＫ２９３細胞に、ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ３、ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ９、またはｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ１０をトランスフェクトした。ｐＡＡＶ－ヌルプラスミドをトランスフェクトしたＨＫ２９３細胞を対照として使用した。以前の観察と同様に、ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ３をトランスフェクトした細胞は、ｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ９またはｐＡＡＶ－ｍｉｎｉＣＭＶ－Ｉｎｓ９を形質導入したものより優れた性能を示した（図１５）。
（実施例８）
プレプロインスリンバリアントの生物活性のｉｎ ｖｉｖｏ評価
生物活性を評価するために、プレプロインスリンバリアントをコードするＡＡＶ１ベクターのＡＡＶ１－Ｉｎｓ１、ＡＡＶ１－Ｉｎｓ３、ＡＡＶ１－Ｉｎｓ４、ＡＡＶ１－Ｉｎｓ５またはＡＡＶ１－Ｉｎｓ６（表１３参照）を生成し、グルコース処理をｉｎ ｖｉｖｏで向上させるそれらの有効性を健康なマウスにおいて評価した。この目的のために、ＣＤ１マウスを３×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ－ＩｎｓまたはＡＡＶ１－ヌルベクターで処置した。マウスはケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。後肢を剃毛し、各後肢の四頭筋、腓腹筋、および頭蓋脛骨に分配された６つの注射部位に１８０μｌの総体積を分割した筋肉内注射によってベクターを投与した。
ＡＡＶ投与の３週間後、グルコース耐性試験を行った。グルコース耐性試験を行うためには、覚醒状態のマウスを一晩（１６時間）絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射を投与した。示されている時点で尾静脈血液試料中の血糖を測定した。
ＷＴプレプロインスリン、プレプロインスリンバリアント１または４をコードするＡＡＶ１ベクターで処置した対照マウスのコホート間で、腹腔内グルコース耐性試験後の血中グルコースレベルに差異は観察されなかった（図１６Ａ～１６Ｃおよび図１７）。その一方、ＡＡＶ１－Ｉｎｓ３ベクターを受けたマウスは、健康なマウスと比較して向上したグルコース耐性を示した（図１６Ｄおよび図１７）。ＡＡＶ１－Ｉｎｓ６による処置は、グルコース処理を部分的に向上させた（図１６Ｅおよび図１７）。６×１０１１ｖｇのＡＡＶ－Ｉｎｓ６ベクターで処置したマウス、および３×１０１１ｖｇのＡＡＶ１－Ｉｎｓ３ベクターで処置した対照マウスに関する結果を、図１６Ｆおよび図１７に示す。
（実施例９）
ＴＬＲ９のＡＡＶ－ＩｎｓまたはＡＡＶ－Ｇｃｋによる刺激のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ＡＡＶ１－ｒａｔＧｃｋまたはＡＡＶ１－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ＿２を形質導入したＨＥＫ－Ｄｕａｌ（商標）ｈＴＬＲ９細胞において、ＴＬＲ９刺激における差異が検出された（図１８Ａ）。ＴＬＲ９刺激は、修飾型ＡＡＶ１－ＧＣＫ構築物で（１）ＣＭＶプロモーターと修飾型ｈＧｃｋ８コード配列とを含むもの（ＡＡＶ１－ｈＧｃｋ８）および（２）ＣＭＶプロモーターと修飾型ｈＧｃｋ１２コード配列とを含むもの（ＡＡＶ１－ｈＧｃｋ１２）を形質導入した細胞では、ＣＭＶプロモーターおよびｈＧｃｋＷＴコード配列を含む野生型ＡＡＶ１－ＧＣＫ対照構築物（ＡＡＶ１－ｈＧｃｋＷＴ）と比較して低減した（図１８Ｂ）。ＴＬＲ９刺激は、対照ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｄ、ならびに修飾型ＡＡＶ１－Ｉｎｓ構築物で（１）ＣＭＶプロモーターと修飾型ｈＩｎｓ５コード配列とを含むもの（ＡＡＶ１－ｈＩｎｓ５）および（２）ＣＭＶプロモーターと修飾型ｈＩｎｓ７コード配列とを含むもの（ＡＡＶ１－ｈＩｎｓ７）を形質導入した細胞の間では同様であった（図１８Ｃ）。ＴＬＲ９刺激の傾きを表１５に示す。結果は、修飾型ＧｃＫコード配列を含む構築物によるＴＬＲ９の刺激の低減を示し、修飾型構築物による免疫活性化の低減を示唆している。
Figure 2023542241000076
Figure 2023542241000077
（実施例１０）
糖尿病性マウスにおけるＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターのｉｎ ｖｉｖｏ評価
ラットグルコキナーゼおよびヒトインスリンを発現するＡＡＶ１ベクター構築物の有効性を、６回の筋肉内注射の投与後の糖尿病性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのストレプトゾトシン誘導モデルにおいて評価した。２コホートのマウス（投薬開始時８～９週齢）を取得した。１つのコホートには、５回の一日腹腔内（ｉ．ｐ．）用量のストレプトゾトシン（５０ｍｇ／ｋｇ；ＳＴＺ）を投与して糖尿病を誘導した。第２のコホートには、５回の一日腹腔内用量のクエン酸Ｎａ緩衝剤を投与して、非糖尿病性対照とした。
誘導後、動物に食餌を不断で与え、また、逆浸透処理し、１～６ｐｐｍの塩素を維持するように塩素処理した地方自治体の水道水を、自動給水システムを介して不断で与えた。動物は、ベースライン体重、非絶食時血中グルコース、および循環マウスインスリンレベルを決定する前の４日間にわたり、動物施設に馴化させた。次いで、これらのパラメーターのいずれに関しても群内または群間の有意差がないように、動物をブロック分けし、処置群に割り付けた。
処置の前に動物を酸素中のイソフルランで麻酔し、３０マイクロリットル（μＬ）用量を各後肢の四頭筋、腓腹筋、および前脛骨筋にインスリンシリンジで直接注射することによって投与した。構築物ＡＡＶ１－９２６＋ＡＡＶ１－９２７（ラットＧｃＫおよびヒトインスリンそれぞれ１：１の混合物で、これはＢｏｓｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍａｓら、２００６年）が発表した研究および米国特許第９，３０９，５３４号において既報であり、これにより参照により本明細書に組み込まれる）を、比較のための対照として投与した。ベクターは、高用量、中用量（中）、または低用量のいずれかで投与した。高用量は低用量より３倍高く、中用量より１．５倍高かった。投薬はすべての実験で一貫していた。各注射（マウス１匹当たり合計６回）では、注射１回当たりベクター懸濁液（３０μＬ）全量を、選択された一組の筋肉（前脛骨筋、四頭筋、および腓腹筋）に両側で注入した。処置群を表１６にまとめる。
Figure 2023542241000078
体重および非絶食時血中グルコースは毎週決定した。一貫性を保つために、すべての測定を１日のうち同じ時間（午後１～３時）に行った。絶食時血中グルコースを４週目に決定し、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を８週目に行った。研究の終了時、血液試料をすべての動物から収集して、血中グルコース、マウスおよびヒトの循環インスリン、ＨｂＡ１ｃ、ならびに他の代謝パラメーターを測定した。筋肉、肝臓、および膵臓の組織試料を収集し、秤量し、ｍＲＮＡ、タンパク質レベルおよびタンパク質活性の評価のために保存した。ＳＴＺまたはクエン酸Ｎａ緩衝剤のいずれかで処置したすべてのマウスのベースライン値を表１７に示す。
Figure 2023542241000079
試験品は、３３日目までに血中グルコースを非糖尿病性対照のレベルに有意に低下させるのに効果的であった（図１９）。正常血糖が達成されたら、この効果は研究過程全体を通して維持された。処置は、未処置の１型糖尿病にしばしば関連付けられる体重減少を防いだように見受けられ、いくつかの代謝パラメーターを正常血糖に関連付けられるレベルまで回復させた。動態およびグルコース低下効果の最適なプロファイルは、天然インスリンシグナルペプチドを含有するＢ１０Ｈ構築物（高用量）およびＩＬ－６シグナルペプチドを含有するＢ１０Ｈ構築物（低用量）で示された。
これらのデータは、ＡＡＶ１ベクターを使用すると骨格筋内でインスリンおよびグルコキナーゼを発現させることができることをさらに示した。１型糖尿病のマウスモデルにおけるこれらのベクターでの処置は、給餌条件および絶食条件において正常血糖を急速に回復させ、８週間にわたって維持した。
１０．１ ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの投与後の糖尿病性マウスにおける循環インスリンレベル
ＳＴＺの投与は、検出可能な循環マウスインスリンをすべて消失させた。天然配列またはＩＬ－６シグナル配列を有するｈＩｎｓＢ１０ＤまたはｈＩｎｓＢ１０Ｈのいずれかのコード配列を含むＡＡＶ１ベクター構築物の有効性を評価するために、ＡＡＶ１ベクター構築物の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射の４週間後、６時間の絶食後のＳＴＺマウスにおいて循環ヒトインスリンを測定した。試料はすべて、正当性が認められているプレートベースのＥＬＩＳＡ法によって解析した。
文献で報告されているＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける絶食時循環インスリンレベルは、典型的に０．７５～１．０ｎｇ／ｍＬの範囲である。第４週までに、ＡＡＶ１－９２６＋ＡＡＶ１－９２７（高用量）およびｈＩＮＳＢ１０Ｄ（配列番号１１０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（中用量）を注射したマウスは、持続的な低血糖のために安楽死させた。打ち切りのエンドポイントにおいて、これらの群の平均循環ヒトインスリンレベルは、それぞれ１０．１ｎｇ／ｍＬおよび４．５ｎｇ／ｍＬであった。４週目において、ｈＩｎｓＢ１０Ｄ（配列番号１１０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（低用量）およびｈＩｎｓＢ１０Ｈ＋ＩＬ６（配列番号１２０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（高用量）を注射したマウスの循環ヒトインスリンは、それぞれ５．２７±０．３４および３．３９±０．２５ｎｇ／ｍｌのレベルに達していた（図２０Ａ）。最終的には、これら２群も低血糖のために安楽死させた。
図１９に示すように、ｈＩｎｓＢ１０Ｈ（配列番号１１１のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（高用量）およびｈＩｎｓＢ１０Ｈ＋ＩＬ６（配列番号１２０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（低用量）を投与した動物はいずれも、血中グルコースを低減し、研究期間にわたって非糖尿病性対照マウスのレベルまたはその付近に維持した。これらのマウスの循環ヒトインスリン値は、それぞれ１．３３±０．１４および０．６±０．１ｎｇ／ｍＬであった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。これらのデータは、循環インスリンレベルが正常な絶食時（すなわち、基礎）レベルの範囲内にあるとき、ＳＴＺ処置マウスの骨格筋にｈＩＮＳおよびｈＧＣＫを共投与すると、血中グルコースを効果的に制御できることを示す。
１０．２ ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの投与後の糖尿病性マウスにおける経口グルコース耐性
第５４日における最後の給餌時グルコース測定の後、かつ１２時間の暗期に入る前に、動物を清潔なケージに入れた。食餌は取り除いたが、水へのアクセスは工程全体を通して提供した。４～６時間絶食させた後、動物を秤量し、グルコース２ｇ／ｋｇの用量で強制経口投与によりグルコース溶液（１０ｍＬ／ｋｇでグルコース０．２ｍｇ／ｍＬ）を投与した。次いで、尾切断により尾から得た血液２滴目（５～１０μＬ）を用い、ハンドヘルド型血糖測定器を使用して血中グルコースを決定した。測定は、グルコース投薬に対する次の時点で行った：Ｔ＝０（グルコース投薬直前）、１５分、３０分、６０分、９０分、および１２０分。最後の血中グルコース測定の後、食餌をケージに戻した。
非糖尿病性対照マウスの絶食時血中グルコース（Ｔ＝０）は、ＳＴＺ処置動物のものよりも有意に低かった（図２１）。ＡＡＶ１ベクター構築物による処置は、ＳＴＺ対照マウスおよび非糖尿病性対照のレベルと比較して、絶食時グルコースを有意に低減した。グルコース（２ｇ／ｋｇ）の強制経口投与後、非ＳＴＺ対照の血中グルコースは１８９±１７ｍｇ／ｄＬ増加し、１５分でピークに達し、９０分で対照に近いレベルに戻った。その一方、ＳＴＺ処置マウスは２６４±３７ｍｇ／ｄＬ増加し、ピークは３０分近くで生じ、１２０分時点でも対照レベルに戻っていない。このデータは、ＳＴＺ処置マウスが食後変動域後に正常にグルコース処理を調節できなかったことを示した。非糖尿病性対照と同様に、ベクター構築物ｈＩｎｓＢ１０Ｈ（配列番号１１１のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（高用量）およびｈＩｎｓＢ１０Ｈ＋ＩＬ６（配列番号１２０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）（低用量）の筋肉内注射は、負荷１５分後にそれぞれ１５４±１６および２１８±２２ｍｇ／ｄＬのピークグルコース変動域をもたらした。両方の処置が、血中グルコースを６０分以内にＴ＝０レベルに戻した。ＡＵＣを利用したＡＮＣＯＶＡ解析からの結果は、これらの解釈を裏付けた（図２２）。全体として、これらのデータは、これらの構築物の筋肉内注射が絶食時グルコースレベルを制御し得るだけでなく、糖尿病患者で典型的に観察される大きな食後グルコース変動域を平滑化することもできることを示唆している。
１型糖尿病に関する目標は、体重を変化させずに血糖制御を正常化すると共に、糖尿病ケトアシドーシスおよび医学的帰結の低血糖を防止することである。１型糖尿病患者は循環インスリンをほとんどまたは全く有しないため、生き続けるためにインスリンを毎日摂取しなければならない。さらに、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性糖尿病によりもたらされる高血糖は、末梢組織を漸進的にインスリン抵抗性にすることが報告されている（Ordonez P, Moreno M, Alonso A, Fernandez R, Diaz F and Gonzalez C. Insulin sensitivity in streptozotocin-induced diabetic rats treated with different doses of 17beta-oestradiol or progesterone. Exp Physiol 92:241-9, 2007. doi: 10.1113/expphysiol.2006.035006. Epub 2006 Oct 26.）。ここで示されている結果は、末梢組織のインスリン感受性を向上させることに加えて筋肉にインスリンの代替的な供給を与えることができれば、血糖制御を回復させる複数の手段がもたらされることを裏付けている。
１０．３ ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの投与後の糖尿病性マウスにおけるＨｂＡ１ｃレベル
注射の８週間後の最後の非絶食時血液収集中に血液試料を取得した。ハンドヘルド型ＨｂＡ１ｃ測定器を使用して、尾切断からの血液２滴目（５～１０μＬ）から血中糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を決定した。この方法は、絶対的基準としてのＮａｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＧＳＰ）により認定された方法に対する比較試験によって正当性が認められている。ＨｂＡ１ｃは、絶命した動物または健康不良／低血糖のために安楽死させた動物（ＡＡＶ１－Ｉｎｓ＋ＡＡＶ１ ＧＣＫ高用量）においては判定しなかった。
非糖尿病性マウスにおけるＨｂＡ１ｃの正常範囲は４％～５．６％であり、糖尿病はＨｂＡ１ｃ＞６．５％と定義される。この研究からのデータは図２３に示す。非ＳＴＺ対照マウスのＨｂＡ１ｃ値は４．３±０．０５％であった。ＳＴＺの投与は、非糖尿病性対照と比較してＨｂＡ１ｃの有意な増加（９．４８±０．６４％；ｐ＜０．００１）をもたらした。ベクター構築物ｈＩｎｓＢ１０Ｈ＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（配列番号１１１のコード配列を含む）（ＡＡＶ９２６）高用量（４．８９±０．１５）およびｈＩｎｓＢ１０Ｈ＋ＩＬ６（配列番号１２０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）低用量（５．０３±０．２７％）での処置は、血中グルコースおよびＨｂＡ１ｃを非糖尿病性対照のレベルまで有意に低下させた。
ＨｂＡ１ｃは、一定期間にわたる平均血糖を反映する総合的なシグナルである。マウスの場合、赤血球のｔ１／２は約１４日である。臨床的に、この試験は、血糖制御を評価するための主要なツールであり、糖尿病および共存症に関する強い予測値を有する。糖尿病療法の目標はＨｂＡ１ｃを正常範囲（＜６．５％）に維持することであり、ほとんどの市販製品は、ＨＢＡ１Ｃを０．５～１．２５％に低下させる。ここでは、マウスにおけるＳＴＺによる１型糖尿病の化学的誘導は、ＨｂＡ１ｃを４．３％から９．４８％に増加させた。ｈＩＮＳおよびｒＧＣＫを含有するＡＡＶ１ベクターの筋肉内注射は、８週間以内にＨｂＡ１ｃを非糖尿病性対照のものまで事実上正常化した。さらに、これらのベクターは、ＳＴＺ対照と比較して、ＨｂＡ１ｃの＞４％の低減をもたらした。すべての群でＨｂＡ１ｃが低下したが、ｈＩｎｓＢ１０Ｈ（配列番号１１１のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（高用量）およびｈＩｎｓ－Ｂ１０Ｈ－ＩＬ６（配列番号１２０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－Ｇｃｋ（低用量）のみが８週目の採血まで生存した。これは、ＨｂＡ１ｃレベルが８週間の平均であることを意味する。
ＨｂＡ１ｃは、毎週の血中グルコースの時間的測定と併せて、一定期間にわたる食事後グルコース曝露の改善と、血糖変動の程度の低減との両方の定量的測度を提供し、このことは、両因子がこの処置で正常化され得ることを示唆している。これらの結果は、１型糖尿病患者の筋肉内に共投与されたｈＩｎｓおよびＧｃＫ ＡＡＶ構築物が、この慢性かつ消耗性の疾患を単一用量で逆転させるものとなる可能性を裏付ける。
１０．４ ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの投与後の糖尿病性マウスにおける血清トリグリセリドおよびケトン体レベル
ＳＴＺ誘発性糖尿病のマウスモデルは、血中トリグリセリドおよびケトンの両方のレベルが非糖尿病性対照と比較して上昇しており、主に脂質に基づくエネルギー源に移行している。ベクター構築物ｈＩｎｓＢ１０Ｈ（配列番号１１１のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）高用量およびｈＩｎｓＢ１０Ｈ＋ＩＬ６（配列番号１２０のコード配列を含む）＋ＡＡＶ１－ＧＣＫ（ＡＡＶ９２６）低用量の筋肉内注射は、循環トリグリセリド（図２４Ａ）およびケトン（図２４Ｂ）のレベルを非糖尿病性対照のレベルまたはそれ未満に低下させた。このデータは、複数の代謝エンドポイントが、ＡＡＶ－ｈＩｎｓＢ１０Ｈ（天然配列またはＩＬ－６シグナル配列を含む）およびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの投与後に正常化したことを示した。
１０．５ ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの投与後の糖尿病性マウスにおける肝臓ｈＩＮＳ ｍＲＮＡレベル
ｑＰＣＲ解析を使用して、ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋ構築物の投与後のＳＴＺ誘発性糖尿病性マウスにおけるｍＲＮＡ発現を評価した。肝臓におけるｈＩＮＳ ｍＲＮＡレベルを評価して、ＡＡＶ－１ベクターが筋肉を回避し、循環に入り、肝臓に形質導入し、その後検出可能なレベルで転写されたかどうかを決定した。非糖尿病性対照またはＳＴＺ対照マウスにはベクターを注射しなかったため、これらの群の試料は測定しなかった。予期せず死亡した動物または苦痛を示した動物については解析しなかった。結果を表１８および図２５に示す。
Figure 2023542241000080
このアッセイの結果は５サイクルを超えるΔＣｔを示しており、これは、試験した３つの構築物（ＡＡＶ１－ｍＷＴＩｎｓ＋ＡＡＶ１－ｒＧｃｋ（ＡＡＶ９２６）高用量；ＡＡＶ１－ｍＷＴＩｎｓ（Ｉｎｓ１７）＋ＡＡＶ１－ｒＧｃｋ（ＡＡＶ９２６）低用量；およびＡＡＶ１－ｍＷＴＩｎｓ（Ｉｎｓ１７）＋ＡＡＶ１－ｒＧｃｋ（ＡＡＶ９２６）高用量）を投与したマウスの肝臓におけるｈＩＮＳ ｍＲＮＡの存在量がきわめて低いかまたは全くなく、したがって筋肉内注射したＡＡＶは大部分が標的筋肉に残ることを示唆している。これらの結果は、ＡＡＶ１－Ｉｎｓ構築物を筋肉内送達したことにより、ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの形質導入ならびに筋肉内のタンパク質発現に起因して、血中グルコース、ＨｂＡ１ｃ、ケトン、およびトリグリセリドの正常化が観察されたことを示している。
このアッセイの結果は５サイクルを超えるΔＣｔを示しており、これは、試験した３つの構築物（ＡＡＶ１－ｍＷＴＩｎｓ＋ＡＡＶ１－ｒＧｃｋ（ＡＡＶ９２６）高用量；ＡＡＶ１－ｍＷＴＩｎｓ（Ｉｎｓ１７）＋ＡＡＶ１－ｒＧｃｋ（ＡＡＶ９２６）低用量；およびＡＡＶ１－ｍＷＴＩｎｓ（Ｉｎｓ１７）＋ＡＡＶ１－ｒＧｃｋ（ＡＡＶ９２６）高用量）を投与したマウスの肝臓におけるｈＩＮＳ ｍＲＮＡの存在量がきわめて低いかまたは全くなく、したがって筋肉内注射したＡＡＶは大部分が標的筋肉に残ることを示唆している。これらの結果は、ＡＡＶ１－Ｉｎｓ構築物を筋肉内送達したことにより、ＡＡＶ－ＩｎｓおよびＡＡＶ－Ｇｃｋベクターの形質導入ならびに筋肉内のタンパク質発現に起因して、血中グルコース、ＨｂＡ１ｃ、ケトン、およびトリグリセリドの正常化が観察されたことを示している。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、必要に応じて、前記シグナルペプチドは野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸位置に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み、必要に応じて、前記ポリヌクレオチドはフーリン切断部位をさらに含む、ポリヌクレオチド。
（項目２）
ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、前記核酸が、（ａ）配列番号４３～５７、１１０～１１６、１５０～１５１、１５４～１５５もしくは１５７～１５９のいずれかの核酸７３～３３０、配列番号１１７～１２２、１５２もしくは１５６のいずれかの核酸８８～３４５、または配列番号１５３の核酸７９～３３６、あるいは（ｂ）配列番号４３～５７、配列番号１１０～１２２、もしくは配列番号１５０～１５９のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、あるいは１００％同一のヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、ポリヌクレオチド。
（項目３）
前記コードされるヒトＩｎｓタンパク質が、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、項目２に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）
前記ヒトＩｎｓタンパク質が、シグナルペプチドを含む、項目２または３に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）
前記シグナルペプチドが、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列である、項目１または４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目６）
前記シグナルペプチドが、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０を含む、項目５に記載のポリヌクレオチド。
（項目７）
前記ヒトＩｎｓタンパク質が、切断部位をさらに含む、項目１から６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目８）
前記核酸が、配列番号４２の核酸５～３２９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、項目１から７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９）
前記核酸が、配列番号４２、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、項目１から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目１０）
前記核酸が、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、または配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む、項目１から９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目１１）
前記３’ＵＴＲが、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩからなる群から選択される制限部位をさらに含む、項目１から１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目１２）
ヒトＩｎｓタンパク質をコードする少なくとも２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３）
前記少なくとも２つのＯＲＦが、ＩＲＥＳ配列によって作動可能に連結している、項目１２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４）
前記ＩＲＥＳ配列が、配列番号１４２または配列番号１４３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む、項目１３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５）
前記核酸が、
（ａ）配列番号１～１６のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
を含む、項目１から１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目１６）
前記核酸が、
（ａ）配列番号８４～８８のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７）
前記核酸が、
（ａ）配列番号１２４～１２６、１３０～１３２、および１３９～１４１のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
を含む、項目１２から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目１８）
前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結している、項目１から１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目１９）
項目１から１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、前記核酸の配列に作動可能に連結した異種発現制御配列とを含む、発現カセット。
（項目２０）
前記異種発現制御配列が、プロモーターである、項目１９に記載の発現カセット。
（項目２１）
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、項目２０に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
（項目２２）
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、項目２１に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
（項目２３）
前記核酸が、ポリアデニル化（ポリＡ）エレメントに作動可能に連結している、先行項目のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
（項目２４）
先行項目のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクター。
（項目２５）
前記ベクターが、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソームである、項目２４に記載のベクター。
（項目２６）
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、項目２４に記載のベクター。
（項目２７）
ＡＡＶカプシドと、項目１から２３のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子。
（項目２８）
前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶｒｈ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２からなる群から選択される、項目２６または２７に記載のベクターまたはｒＡＡＶ粒子。
（項目２９）
前記シグナルペプチドが、ＩＬ－６シグナルペプチドまたはフィブロネクチンシグナルペプチドである、先行項目のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子。
（項目３０）
先行項目のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞。
（項目３１）
哺乳動物細胞である、項目３０に記載の宿主細胞。
（項目３２）
細胞においてヒトＩｎｓタンパク質を産生させる方法であって、項目１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子と前記細胞を接触させ、かつ／または項目１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子で前記細胞を形質転換させ、それにより、前記細胞において前記ヒトＩｎｓタンパク質を産生させることを含む方法。
（項目３３）
対象においてヒトＩｎｓタンパク質を産生させる方法であって、項目１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に投与し、それにより、前記対象において前記ヒトＩｎｓタンパク質を産生させることを含む方法。
（項目３４）
糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、前記対象の治療有効量の項目１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に送達し、それにより、前記対象の糖尿病を処置することを含む方法。
（項目３５）
前記糖尿病が、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、前記核酸が、
（ａ）ヌクレオチド配列であって、（ａ）配列番号６１～８０もしくは１６２のいずれかの核酸１～１３９８、または（ｂ）配列番号６１～８０および１６２、もしくはそれらの任意の組合せのいずれかから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
を含むＯＲＦを含む、ポリヌクレオチド。
（項目３７）
前記コードされるヒトＧｃｋタンパク質が、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、項目３６に記載のポリヌクレオチド。
（項目３８）
前記核酸が、配列番号４２の核酸５～３２９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、項目３６または項目３７に記載のポリヌクレオチド。
（項目３９）
前記核酸が、配列番号４２、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、項目３６から３８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目４０）
前記核酸が、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む、項目３６から３９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目４１）
前記３’ＵＴＲが、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩからなる群から選択される制限部位をさらに含む、項目３６から４０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目４２）
前記核酸が、
（ａ）配列番号２０～３９のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む、項目３６から４０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目４３）
前記核酸が、
（ａ）配列番号８９～９６および１６３～１６４のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
を含む、項目３６から４０のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
（項目４４）
前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結している、項目３６から４３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目４５）
項目３６から４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、前記核酸の配列に作動可能に連結した異種発現制御配列とを含む、発現カセット。
（項目４６）
前記異種発現制御配列が、プロモーターである、項目４５に記載の発現カセット。
（項目４７）
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、項目４６に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
（項目４８）
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、項目４６に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
（項目４９）
前記核酸が、ポリアデニル化（ポリＡ）エレメントに作動可能に連結している、項目３６から４８のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
（項目５０）
項目３６から４９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクター。
（項目５１）
ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソームである、項目５０に記載のベクター。
（項目５２）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、項目５１に記載のベクター。
（項目５３）
ＡＡＶカプシドと、項目３６から４９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子。
（項目５４）
前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶｒｈ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２からなる群から選択される、項目５２または５３に記載のベクターまたはｒＡＡＶ粒子。
（項目５５）
項目３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞。
（項目５６）
哺乳動物細胞である、項目５５に記載の宿主細胞。
（項目５７）
細胞においてヒトＧｃｋタンパク質を産生させる方法であって、項目３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子と前記細胞を接触させ、かつ／または項目３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子で前記細胞を形質転換させ、それにより、前記細胞において前記ヒトＧｃｋタンパク質を産生させることを含む方法。
（項目５８）
対象においてヒトＧｃｋタンパク質を産生させる方法であって、項目３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に投与し、それにより、前記対象において前記ヒトＧｃｋタンパク質を産生させることを含む方法。
（項目５９）
糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、前記対象の治療有効量の項目３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に送達し、それにより、前記対象の糖尿病を処置することを含む方法。
（項目６０）
前記糖尿病が、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、（ｉ）項目１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および（ｉｉ）項目３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子の治療有効量を前記対象に送達し、それにより、前記対象の糖尿病を処置することを含む方法。
（項目６２）
ヒトＩｎｓタンパク質およびヒトＧｃｋタンパク質を産生させることを必要とする対象においてヒトＩｎｓタンパク質およびヒトＧｃｋタンパク質を産生させ、かつ／または糖尿病に関連する症状を処置するもしくは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するもしくは改善させる方法であって、（ｉ）項目１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および（ｉｉ）項目３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む、複数のポリヌクレオチド、複数の発現カセット、複数のベクター、または複数のｒＡＡＶ粒子を前記対象に投与し、それにより、前記対象においてヒトＩｎｓタンパク質およびヒトＧｃｋタンパク質を産生させ、かつ／または糖尿病を処置することを含む方法。
（項目６３）
前記糖尿病が、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である、項目６１または６２に記載の方法。
（項目６４）
（ｉ）項目１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および（ｉｉ）項目３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子が、共にまたは順次投与される、項目６１から６３のいずれかに記載の方法。
（項目６５）
前記送達および／または投与は筋肉内である、項目３２から３５、５７から６０、および６１から６４のいずれかに記載の方法。
（項目６６）
（ｉ）前記対象において血中糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルが低下し、かつ／もしくは調節される、（ｉｉ）前記対象において循環ケトンが低減する、（ｉｉｉ）前記対象においてトリグリセリドが低減する、または（ｉｖ）それらの任意の組合せである、項目３２から３５、５７から６０、および６１から６５のいずれかに記載の方法。

Claims (66)

  1. ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、必要に応じて、前記シグナルペプチドは野生型プレプロインスリンシグナル配列ではない、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）野生型プロインスリンにおける対応するアミノ酸位置に対して、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸Ｂ１０、Ｂ２８、および／もしくはＢ２９、ヒトインスリンＣ鎖のＣ１および／もしくはＣ３２、またはそれらの任意の組合せから選択される位置におけるアミノ酸修飾を含む、プロインスリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含み、必要に応じて、前記ポリヌクレオチドはフーリン切断部位をさらに含む、ポリヌクレオチド。
  2. ヒトインスリン（Ｉｎｓ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、前記核酸が、（ａ）配列番号４３～５７、１１０～１１６、１５０～１５１、１５４～１５５もしくは１５７～１５９のいずれかの核酸７３～３３０、配列番号１１７～１２２、１５２もしくは１５６のいずれかの核酸８８～３４５、または配列番号１５３の核酸７９～３３６、あるいは（ｂ）配列番号４３～５７、配列番号１１０～１２２、もしくは配列番号１５０～１５９のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、あるいは１００％同一のヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、ポリヌクレオチド。
  3. 前記コードされるヒトＩｎｓタンパク質が、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０、配列番号４１、配列番号１４４、または配列番号１４５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ヒトＩｎｓタンパク質が、シグナルペプチドを含む、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記シグナルペプチドが、野生型プレプロインスリンシグナル配列、ＩＬ－６シグナル配列、またはフィブロネクチンシグナル配列である、請求項１または４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記シグナルペプチドが、配列番号４１のアミノ酸２５～１１０、配列番号１４４のアミノ酸２５～１１０、または配列番号１４５のアミノ酸２５～１１０を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ヒトＩｎｓタンパク質が、切断部位をさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記核酸が、配列番号４２の核酸５～３２９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記核酸が、配列番号４２、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記核酸が、配列番号６０、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、または配列番号１０１、または配列番号１４９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記３’ＵＴＲが、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩからなる群から選択される制限部位をさらに含む、請求項１から１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  12. ヒトＩｎｓタンパク質をコードする少なくとも２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記少なくとも２つのＯＲＦが、ＩＲＥＳ配列によって作動可能に連結している、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記ＩＲＥＳ配列が、配列番号１４２または配列番号１４３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記核酸が、
    （ａ）配列番号１～１６のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
    を含む、請求項１から１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記核酸が、
    （ａ）配列番号８４～８８のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
    を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記核酸が、
    （ａ）配列番号１２４～１２６、１３０～１３２、および１３９～１４１のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
    を含む、請求項１２から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項１から１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、前記核酸の配列に作動可能に連結した異種発現制御配列とを含む、発現カセット。
  20. 前記異種発現制御配列が、プロモーターである、請求項１９に記載の発現カセット。
  21. 前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項２０に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
  22. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項２１に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
  23. 前記核酸が、ポリアデニル化（ポリＡ）エレメントに作動可能に連結している、先行請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
  24. 先行請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクター。
  25. 前記ベクターが、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソームである、請求項２４に記載のベクター。
  26. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
  27. ＡＡＶカプシドと、請求項１から２３のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子。
  28. 前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶｒｈ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２からなる群から選択される、請求項２６または２７に記載のベクターまたはｒＡＡＶ粒子。
  29. 前記シグナルペプチドが、ＩＬ－６シグナルペプチドまたはフィブロネクチンシグナルペプチドである、先行請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子。
  30. 先行請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞。
  31. 哺乳動物細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
  32. 細胞においてヒトＩｎｓタンパク質を産生させる方法であって、請求項１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子と前記細胞を接触させ、かつ／または請求項１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子で前記細胞を形質転換させ、それにより、前記細胞において前記ヒトＩｎｓタンパク質を産生させることを含む方法。
  33. 対象においてヒトＩｎｓタンパク質を産生させる方法であって、請求項１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に投与し、それにより、前記対象において前記ヒトＩｎｓタンパク質を産生させることを含む方法。
  34. 糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、前記対象の治療有効量の請求項１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に送達し、それにより、前記対象の糖尿病を処置することを含む方法。
  35. 前記糖尿病が、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である、請求項３４に記載の方法。
  36. ヒトグルコキナーゼ（Ｇｃｋ）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、前記核酸が、
    （ａ）ヌクレオチド配列であって、（ａ）配列番号６１～８０もしくは１６２のいずれかの核酸１～１３９８、または（ｂ）配列番号６１～８０および１６２、もしくはそれらの任意の組合せのいずれかから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
    を含むＯＲＦを含む、ポリヌクレオチド。
  37. 前記コードされるヒトＧｃｋタンパク質が、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記核酸が、配列番号４２の核酸５～３２９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、請求項３６または請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記核酸が、配列番号４２、配列番号８３、配列番号１４６、または配列番号１４８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲをさらに含む、請求項３６から３８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記核酸が、配列番号６０、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、または配列番号１４９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲをさらに含む、請求項３６から３９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記３’ＵＴＲが、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＶｓｐＩ、ＮｓｉＩ、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ、ＳｓｐＩ、およびＰａｃＩからなる群から選択される制限部位をさらに含む、請求項３６から４０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記核酸が、
    （ａ）配列番号２０～３９のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
    を含む、請求項３６から４０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記核酸が、
    （ａ）配列番号８９～９６および１６３～１６４のいずれかまたはそれらの任意の組合せから選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列
    を含む、請求項３６から４０のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  44. 前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項３６から４３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  45. 請求項３６から４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、前記核酸の配列に作動可能に連結した異種発現制御配列とを含む、発現カセット。
  46. 前記異種発現制御配列が、プロモーターである、請求項４５に記載の発現カセット。
  47. 前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項４６に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
  48. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項４６に記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
  49. 前記核酸が、ポリアデニル化（ポリＡ）エレメントに作動可能に連結している、請求項３６から４８のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセット。
  50. 請求項３６から４９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクター。
  51. ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、脂質、またはリソソームである、請求項５０に記載のベクター。
  52. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項５１に記載のベクター。
  53. ＡＡＶカプシドと、請求項３６から４９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子。
  54. 前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶｒｈ９、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２からなる群から選択される、請求項５２または５３に記載のベクターまたはｒＡＡＶ粒子。
  55. 請求項３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞。
  56. 哺乳動物細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
  57. 細胞においてヒトＧｃｋタンパク質を産生させる方法であって、請求項３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子と前記細胞を接触させ、かつ／または請求項３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子で前記細胞を形質転換させ、それにより、前記細胞において前記ヒトＧｃｋタンパク質を産生させることを含む方法。
  58. 対象においてヒトＧｃｋタンパク質を産生させる方法であって、請求項３６から５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に投与し、それにより、前記対象において前記ヒトＧｃｋタンパク質を産生させることを含む方法。
  59. 糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、前記対象の治療有効量の請求項３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を前記対象に送達し、それにより、前記対象の糖尿病を処置することを含む方法。
  60. 前記糖尿病が、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である、請求項５９に記載の方法。
  61. 糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するまたは改善させる方法であって、（ｉ）請求項１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および（ｉｉ）請求項３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子の治療有効量を前記対象に送達し、それにより、前記対象の糖尿病を処置することを含む方法。
  62. ヒトＩｎｓタンパク質およびヒトＧｃｋタンパク質を産生させることを必要とする対象においてヒトＩｎｓタンパク質およびヒトＧｃｋタンパク質を産生させ、かつ／または糖尿病に関連する症状を処置するもしくは改善させることを必要とする対象における糖尿病に関連する症状を処置するもしくは改善させる方法であって、（ｉ）請求項１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および（ｉｉ）請求項３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む、複数のポリヌクレオチド、複数の発現カセット、複数のベクター、または複数のｒＡＡＶ粒子を前記対象に投与し、それにより、前記対象においてヒトＩｎｓタンパク質およびヒトＧｃｋタンパク質を産生させ、かつ／または糖尿病を処置することを含む方法。
  63. 前記糖尿病が、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. （ｉ）請求項１から２９のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および（ｉｉ）請求項３６から５４のいずれかのいずれかに記載のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子が、共にまたは順次投与される、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
  65. 前記送達および／または投与は筋肉内である、請求項３２から３５、５７から６０、および６１から６４のいずれかに記載の方法。
  66. （ｉ）前記対象において血中糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルが低下し、かつ／もしくは調節される、（ｉｉ）前記対象において循環ケトンが低減する、（ｉｉｉ）前記対象においてトリグリセリドが低減する、または（ｉｖ）それらの任意の組合せである、請求項３２から３５、５７から６０、および６１から６５のいずれかに記載の方法。
JP2023524498A 2020-07-03 2021-07-02 糖尿病を処置するための修飾型インスリンおよびグルコキナーゼ核酸 Pending JP2023542241A (ja)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063047965P 2020-07-03 2020-07-03
US63/047,965 2020-07-03
US202063054162P 2020-07-20 2020-07-20
US63/054,162 2020-07-20
US202063067264P 2020-08-18 2020-08-18
US63/067,264 2020-08-18
US202163141918P 2021-01-26 2021-01-26
US63/141,918 2021-01-26
US202163188778P 2021-05-14 2021-05-14
US63/188,778 2021-05-14
PCT/US2021/040366 WO2022006551A2 (en) 2020-07-03 2021-07-02 Modified insulin and glucokinase nucleic acids for treating diabetes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023542241A true JP2023542241A (ja) 2023-10-05

Family

ID=79317842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023524498A Pending JP2023542241A (ja) 2020-07-03 2021-07-02 糖尿病を処置するための修飾型インスリンおよびグルコキナーゼ核酸

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4176060A2 (ja)
JP (1) JP2023542241A (ja)
KR (1) KR20230087436A (ja)
CN (1) CN116234904A (ja)
AU (1) AU2021300450A1 (ja)
CA (1) CA3174156A1 (ja)
IL (1) IL299545A (ja)
MX (1) MX2023000099A (ja)
WO (1) WO2022006551A2 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023212683A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Kriya Therapeutics, Inc. Insulin and glucokinase gene therapy compositions and its use for treating diabetes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602004015980D1 (de) * 2003-06-17 2008-10-02 Sembiosys Genetics Inc Verfahren zur insulinproduktion in pflanzen
WO2016110518A1 (en) * 2015-01-07 2016-07-14 Universitat Autònoma De Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes

Also Published As

Publication number Publication date
EP4176060A2 (en) 2023-05-10
CN116234904A (zh) 2023-06-06
AU2021300450A1 (en) 2023-03-02
KR20230087436A (ko) 2023-06-16
MX2023000099A (es) 2023-04-20
WO2022006551A2 (en) 2022-01-06
CA3174156A1 (en) 2022-01-06
WO2022006551A3 (en) 2022-02-03
IL299545A (en) 2023-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6894062B2 (ja) ジストロフィー病態の効率的な全身処置
JP2024015194A (ja) アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
JP6348064B2 (ja) 効率の高いトランスジーン送達のためのウイルスベクター
JP2020528734A (ja) バリアントカプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
EP3242945B1 (en) Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
EP1287125A2 (en) Dna sequences encoding dystrophin minigenes and methods of use thereof
CN110914419A (zh) 糖原贮积病iii的治疗
US20210403947A1 (en) Miniaturized dystrophins and uses thereof
US20240091383A1 (en) Synergistic effect of smn1 and mir-23a in treating spinal muscular atrophy
JP2023542241A (ja) 糖尿病を処置するための修飾型インスリンおよびグルコキナーゼ核酸
CN116685329A (zh) 核酸构建体及其用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的用途
US20230407331A1 (en) Miniaturized dystrophins having spectrin fusion domains and uses thereof
WO2016037931A1 (en) Nucleic acid constructs and expression vectors for gene therapy of acute porphyrias and other diseases
ZA200305184B (en) Sequences upstream of the CARP gene, vectors containing them and uses thereof.
WO2023212683A1 (en) Insulin and glucokinase gene therapy compositions and its use for treating diabetes
EP4089171A1 (en) Recombinant tert-encoding viral genomes and vectors
WO2022221462A1 (en) Vector constructs for delivery of nucleic acids encoding therapeutic vlcad or mcad and methods of using the same
JP2007504219A (ja) 関節リウマチのインビボ遺伝子治療のためのａａｖベクター
CA3206590A1 (en) Gene therapy for monogenic diabetes
WO2023135316A1 (en) Gene therapy composition and treatment for dystrophin-related cardiomyopathy
EA046419B1 (ru) Миниатюризированные дистрофины и их применения

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230303