JP2023542033A

JP2023542033A - 脂肪肝疾患を治療する方法

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Publication number: JP2023542033A
Application number: JP2023518138A
Authority: JP
Inventors: リンデン，ダニエル; リー，リチャード; ブイ，フィン－ホア; ロメオ，ステファノ
Original assignee: AstraZeneca AB; Ionis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: AstraZeneca AB; Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2021-09-21
Publication date: 2023-10-04
Also published as: TW202227102A; US20220090072A1; AU2021347431A1; KR20230074214A; MX2023003281A; WO2022063782A1; US20240158791A1; US11840689B2; IL301377A; EP4217487A1; CN116194583A; CA3194735A1

Abstract

本開示は、対象において脂肪肝疾患を治療若しくは予防し、且つ／又はコレステロール及びＬＤＬコレステロールレベルを低下させる方法を提供する。本開示は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させる方法を更に提供する。

Description

本開示は、対象において脂肪肝疾患を治療若しくは予防し、且つ／又はコレステロール及びＬＤＬコレステロールレベルを低下させる方法を提供する。本開示は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎａｎｄＳｅｃ７ＤｏｍａｉｎＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ３）（ＰＳＤ３）タンパク質の発現を低下させる方法を提供する。ＰＳＤ３の発現を低下させるのに適した化合物も本明細書で提供される。

脂肪肝疾患（ＦＬＤ）は、過剰なアルコール摂取の有無に関わらず、５％を超える肝臓脂質含有量として定義される。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、あらゆる年齢層で発生するが、特に肥満及び２型糖尿病等の高リスク因子のために心疾患のリスクが高い４０歳代及び５０歳代の人々に発症する。脂肪肝疾患は、腹部脂肪の増加、ホルモンインスリンの使用能力の低下、高血圧及び高血中トリグリセリド濃度を含む異常の一群であるメタボリックシンドロームにも密接に関連している。ＮＡＦＬＤは、世界中で一層一般的になっており、米国では慢性肝疾患の最も一般的な形態であり、推定８千～１億人が罹患している（非特許文献１）。世界的には、ＮＡＦＬＤは、世界人口の約２５％に影響を及ぼしている。ＮＡＦＬＤには、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる。ＮＡＦＬがＮＡＳＨに進行する患者は、全体的及び肝臓特異的死亡率が増加しており、肝硬変、肝不全及び肝細胞癌（ＨＣＣ）のリスクが増加している。ＮＡＳＨは、急速に慢性肝疾患の主因となりつつあり、米国では肝移植の主因としてＣ型肝炎を追い越す見込みである。ＮＡＦＬを有する人々における脂肪肝は、肝細胞内の脂肪滴の実質的な蓄積を特徴とする。ＮＡＳＨへの進行は、肝生検の組織学的検査において、肝線維症の有無に関わらず、肝炎症及び肝細胞傷害によって特徴付けられる。進行性線維症は、対応のある生検研究のメタ分析によると、肝臓関連の臨床転帰の悪化をもたらし、ＮＡＳＨ患者の３５％～４１％に発症する。

現在の治療選択肢には、体重減少及びアルコール性脂肪肝疾患の場合にはアルコール摂取の減少又は中止が含まれる。現在、非アルコール性脂肪性肝疾患又はアルコール性脂肪性肝疾患を治療するための医薬品は、承認されていない。機構的に、炎症、肝細胞傷害及び線維症を含む肝損傷は、非アルコール性脂肪性肝疾患及びアルコール性脂肪性肝疾患において同様の経路を伴う。したがって、非アルコール性脂肪性肝疾患のために開発された医薬品は、アルコール性脂肪性肝疾患でも作用する可能性が高い。更に、肝臓に含まれる異所性脂質蓄積は、２型糖尿病につながる肝臓インスリン抵抗性につながるインスリンシグナル伝達を損なう経路を引き起こす。したがって、肝臓脂質レベルを低下させる療法は、２型糖尿病の根本原因の１つを逆転させる（非特許文献２）。

開発中の現在の脂肪肝疾患医薬品は、患者のコレステロールレベルを増加させるという更なる課題に直面する可能性があり、これは、心疾患、肥満及び２型糖尿病のリスクが既に高い患者の健康に対する負担を増加させる。

ＭａｙｏＣｌｉｎｉｃ，ＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃＦａｔｔｙＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２６（１）：１２－２２（２０１６）

本開示は、脂肪肝疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む方法に関する。

いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（肝硬変及び非肝硬変ＮＡＳＨ）、脂質異常症、混合型脂質異常症、高コレステロール血症、糖尿病、肝線維症、肝細胞癌（ＨＣＣ）、アルコール性脂肪肝疾患（ＡＦＬＤ）又はアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）（肝硬変及び非肝硬変ＡＳＨ）である。特定の実施形態において、高コレステロール血症は、家族性高コレステロール血症である。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患は、糖尿病である。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患は、２型糖尿病である。

いくつかの実施形態において、対象は、心血管疾患を有する。特定の実施形態において、疾患は、脂質異常症である。特定の実施形態において、疾患は、混合型脂質異常症である。特定の実施形態において、疾患は、高コレステロール血症である。特定の実施形態において、疾患は、家族性高コレステロール血症である。

いくつかの実施形態では、化合物の投与を、それを必要とする対象において行う方法は、対象の細胞内肝脂肪含有量、肝臓重量、肝臓トリグリセリド含有量、血漿循環アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、肝臓コラーゲン１ａ１及び脂質含有量の１つ以上を減少させる。

いくつかの実施形態では、方法は、対象の肝損傷、脂肪症、肝線維症、肝臓の炎症、肝臓の瘢痕化又は肝硬変、肝不全を軽減する。

特定の実施形態は、細胞におけるＰＳＤ３の発現又は活性を阻害する方法であって、細胞を、ＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物と接触させ、それにより細胞におけるＰＳＤ３の発現又は活性を阻害することを含む方法に関する。特定の実施形態において、細胞は、肝細胞である。特定の実施形態では、細胞は、対象中にある。特定の実施形態では、対象は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（肝硬変及び非肝硬変）、脂質異常症、混合型脂質異常症、高コレステロール血症、糖尿病、肝線維症、肝細胞癌（ＨＣＣ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）若しくはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）（肝硬変及び非肝硬変ＡＳＨ）又は２型糖尿病を有するか又はそれらのリスクがある。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の活性化を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、対象におけるＰＳＤ３発現を低下させることを含み、より低いＰＳＤ３発現は、ＡＲＦ６の低下した活性化をもたらす。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象の肝細胞における細胞内脂肪含有量を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象のコレステロールを低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＬＤＬコレステロールは、対象において低下される。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＳＤ３減少療法に適している、脂肪肝疾患を有する対象の亜集団を同定する方法を提供し、方法は、（ｉ）対象が脂肪性肝疾患を有するかどうかを診断すること、（ｉｉ）対象がＰＳＤ３の１８６Ｔ対立遺伝子変異体又はＰＳＤ３の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有するかどうかを判定することを含み、対象がＰＳＤ３の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する場合、適切な治療は、ＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含み、対象がＰＳＤ３の１８６Ｔ対立遺伝子変異体を有する場合、治療は、適切ではないＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含まない。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、１８６Ｌ対立遺伝子変異体の遺伝子型決定又は１８６Ｌ対立遺伝子変異体との強い連鎖不平衡にある遺伝子変異体の遺伝子型決定からの推論によって決定され得る。

いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪肝疾患を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、（ｉ）対象がＰＳＤ３の１８６Ｔ対立遺伝子変異体又はＰＳＤ３の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有するかどうかを判定することと、（ｉｉ）対象がＰＳＤ３の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する場合にのみ、ＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することとを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、１８６Ｌ対立遺伝子変異体の遺伝子型決定又は１８６Ｌ対立遺伝子変異体との強い連鎖不平衡にある遺伝子変異体の遺伝子型決定からの推論によって決定され得る。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＳＤ３の１８６Ｔ対立遺伝子変異体を有さない。先の実施形態のいずれかにおいて、対象は、ヒトである。

いくつかの実施形態では、化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ又はｓｓＲＮＡｉから選択される。いくつかの実施形態では、化合物は、配列番号２～１８のいずれか１つの等しい長さの部分に相補的なポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、一本鎖である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと対になって二重鎖を形成する。特定の実施形態では、化合物は、ｓｉＲＮＡ化合物である。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、８～５０個の連結されたヌクレオシドからなり、且つＰＳＤ３をコードする核酸の等しい長さの部分に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、長さが１２～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～１８の全て又はいずれか１つの等しい長さの部分に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結、少なくとも１つの修飾糖部分及び少なくとも１つの修飾された核酸塩基から選択される少なくとも１つの修飾を含む。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドのヌクレオシドの少なくとも１つは、修飾糖部分を含む。特定の実施形態では、修飾糖は、二環式糖又は２’－Ｏ－メトキシエチルである。特定の実施形態において、修飾糖は、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’架橋又は４’－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－２’架橋を含み、ここで、ｎは、１又は２である。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのヌクレオシドの少なくとも１つは、修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間連結は、修飾されたヌクレオシド間連結である。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント、
連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を有し、ギャップセグメントは、５’ウイングセグメント及び３’ウイングセグメントに直接隣接して且つそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。

いくつかの実施形態において、化合物は、コンジュゲート基を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端に結合している。一定の実施形態では、コンジュゲート基は、１～５個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、化合物は、対象の肝細胞に送達される。

特定の実施形態では、化合物は、非経口投与される。いくつかの実施形態において、非経口投与は、皮下投与又は静脈内投与である。いくつかの実施形態において、方法は、化合物及び少なくとも１つの更なる治療を同時投与することを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、８～５０個の連結されたヌクレオシドからなり、且つ配列番号２～１８の等しい長さの部分に少なくとも９０％配列相補的な核酸塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む化合物を提供する。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１０～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１２～２０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１６個の連結されたヌクレオシドからなる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのヌクレオシドの少なくとも１つは、修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖は、二環式糖又は２’－Ｏ－メトキシエチルである。特定の実施形態において、修飾糖は、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’架橋又は４’－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－２’架橋を含み、ここで、ｎは、１又は２である。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのヌクレオシドの少なくとも１つは、修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのヌクレオシド間連結の少なくとも１つは、修飾されたヌクレオシド間連結である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

特定の実施形態では、化合物は、１～５個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端に結合している。

いくつかの実施形態において、本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１の配列である。

実施例１に記載されているように、ヨーロッパ系の子孫の個体におけるトリグリセリドに影響を及ぼす３２個の遺伝子座の表を示す（Ｔｅｓｌｏｖｉｃｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４６６，７０７－７１３，２０１０）。略語：ＴＧ、トリグリセリド；ＴＣ、総コレステロール；ＬＤＬ、低密度リポタンパク質；ＨＤＬ、高密度リポタンパク質。実施例１に記載されるように、ＤａｌｌａｓＨｅａｒｔＳｔｕｄｙにおける肝臓トリグリセリド含有量に関連するミスセンス変異体の表を示す。循環トリグリセリドレベルに関する以前のゲノムワイド研究によって同定された３２の遺伝子座のうち、５％を超えるヨーロッパ系のＭＡＦを有する合計３つのミスセンス変異体は、ＤＨＳコホートの肝臓トリグリセリド含有量と名目上関連していた。これらの変異体のうち、１つは、肝脂肪含有量の減少に関連し（ｒｓ７１５１９９３４、ベータ＝－０．０２）、２つは、肝脂肪含有量の増加に関連していた（ｒｓ１２６０３２６、ベータ＝０．０３及びｒｓ５８５４２９２６、ベータ＝０．１２）。関連性を、年齢、性別及び祖先の上位４つの主成分について調整した線形回帰分析によって試験した。略語：Ｃｈｒ、染色体；ｒｓＩＤ、参照一塩基多型同定；Ｎ０、主要対立遺伝子についてホモ接合性の個体の数；Ｎ１、ヘテロ接合性の個体数；Ｎ２、マイナー対立遺伝子についてホモ接合性の個体数；ＭＡＦ、マイナー対立遺伝子頻度。＾ＭＡＦは、ＤＨＳコホート全体におけるマイナー対立遺伝子頻度を指す。ＤＨＳでは、ｒｓ７１５１９９３４は、ｒｓ７１５１９９３４と完全な連鎖不平衡（Ｄ’＝１、ｒ２＝１）にあるｒｓ７００３０６０として見出された。＾＾ＭＡＦＥＵＲは、ｄｂＳＮＰでは入手できないため、ＵＫＢｉｏｂａｎｋ５０，０００エクソームシーケンシングデータから英国系白人参加者の頻度を推定したｒｓ７１５１９９３４を除いて、単一ヌクレオチド多型のデータベース（ｄｂＳＮＰ、ＣｕｒｒｅｎｔＢｕｉｌｄ１５４、２０２０年４月２１日リリース）に報告されている１０００ゲノムデータを指す。＊ＧＣＫＲの遺伝子型決定は、２人の個体では決定されなかった。肝臓生検コホート（ＬＢＣ）及び独立複製ＥＵコホート（「中央ヨーロッパコホート」）の連続的及びカテゴリ的形質を示す。連続形質は、平均及び標準偏差（正規分布形質）又は中央値及び四分位範囲（非正規分布形質）として示されている。カテゴリ的形質は、数及び割合として示されている。＊ｎ＝１，８０５について入手可能なデータ。年齢、性別、ＢＭＩ、採用センター及びＰＮＰＬＡ３変異対立遺伝子の数によって調整された付加的遺伝モデル下でのバイナリーロジスティック回帰分析を使用することにより、脂肪肝、線維症、炎症及び風船様変性のより低い有病率によって測定される、肝生検コホート（ＬＢＣ、Ｎ組織学的データ＝１，９５１）における肝疾患のより低い有病率と関連するＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４マイナー対立遺伝子の表を示す。脂肪症、線維症、炎症又は風船様変性の存在を相対的な程度＞０と定義した。＊ｎ＝１，８０５について入手可能なデータ。［図５Ａ－Ｃ］ＰＳＤ３マイナー対立遺伝子が、肝臓生検コホート（ＬＢＣ）における組織学的肝損傷の重症度の増強から保護し、その遺伝子発現がＦＬＤを有する肝臓においてより高いことを示す。図５Ａは、肝生検コホート（ＬＢＣ）におけるＰＳＤ３遺伝子型によって層別化された組織学的肝損傷を示す。バーは、特定の疾患の程度を示し、白色から黒色への色の濃淡は、疾患重症度の増加を示す。組織学的損傷をＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）及び肝線維症段階の異なる成分に従って評価した。ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４１８６Ｔマイナー対立遺伝子のキャリアは、重症度の低い肝疾患を有し、脂肪症、炎症、風船様変性及び線維症の程度がより低かった。関連性を、年齢、性別、ＢＭＩ、採用センター及びＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍ変異対立遺伝子の数について調整した順序回帰分析によって試験した。図５Ｂは、健康な肝臓及びＦＬＤ肝臓によって層別化された総ＰＳＤ３ｍＲＮＡ発現を示す。肝臓ＰＳＤ３発現レベルは、健常対照と比較してＦＬＤ対象においてより高かった。Ｐ値は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。図５Ｃは、健康な肝臓及びＦＬＤ肝臓によって層別化された総ＮＡＴ２ｍＲＮＡ発現を示す。ＦＬＤの存在に基づくＮＡＴ２発現レベルに差はなかった。Ｐ値は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。略語：Ｃｔｒ、健康な対照肝臓（ｎ＝１０）；ＦＬＤ、脂肪肝疾患を有する肝臓（ｎ＝６７）；ＰＳＤ３、プレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３；ＮＡＴ２、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ２。ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４マイナー対立遺伝子が、独立複製ＥＵコホートにおける肝疾患のより低い有病率及びより低い重症度と関連することを示す（Ｎ組織学的データ＝６７４）。関連性を、年齢、性別、ＢＭＩ、採用センター及びＰＮＰＬＡ３変異対立遺伝子の数によって調整された付加的遺伝モデル下でバイナリーロジスティック（疾患の存在）又は順序回帰（疾患の重篤度）分析によって試験した。順序回帰のオッズ比（ＯＲ）を係数推定値及びその信頼区間（ＣＩ）の指数関数として計算した。脂肪症、線維症、炎症又は風船様変性の存在を相対的な程度＞０と定義されている。ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４によって層別化された、肝臓生検コホート（ＬＢＣ）及び独立複製ＥＵコホート（「中央ヨーロッパコホート」）からの複製コホートの連続的及びカテゴリ的形質を示す。連続形質は、平均及び標準偏差（正規分布形質）又は中央値及び四分位範囲（非正規分布形質）として示されている。カテゴリ的形質は、数及び割合として示されている。連続形質については、年齢、性別及び採用センター（ＢＭＩ）について調整されていないか（年齢）又は調整されている付加的遺伝モデル下で線形回帰又は年齢、性別、ＢＭＩ及び採用センターによってＰ値を計算した。モデルに入る前に、非正規分布形質を対数変換した。カテゴリ的形質については、カイ二乗検定（性別）又は年齢、性別、ＢＭＩ及び採用センター（糖尿病）について調整した二項ロジスティック回帰によってＰ値を計算した。［図８Ａ－Ｂ］肝生検コホート（ＬＢＣ）及び独立複製ＥＵコホートにおけるＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４と肝臓組織学的形質との間の関連のメタ分析を要約する表を示す。２つの研究の逆分散メタ分析を、Ｒバージョン３．６．１の固定効果モデル及びランダム効果モデルを有するパッケージ「メタ」を使用して行った。図８Ａは、脂肪症重症度、線維症重症度、炎症重症度及び風船様変性重症度についての結果を示す。図８Ｂは、脂肪症の存在、線維症の存在、炎症の存在及び風船様変性の存在についての結果を示す。［図９Ａ－Ｃ］ＰＳＤ３ｍＲＮＡアイソフォーム００１が、実施例１に記載されるように、ヒト肝臓組織において最も高い発現を有することを示す。図９Ａは、ヒト肝臓組織における異なるＰＳＤ３ｍＲＮＡアイソフォームの発現レベルを示す。肝臓生検コホート（ＬＢＣ）のミラノのサブグループからの７７人の個体のサブセットの肝臓生検からのトランスクリプトーム。アイソフォーム００１（ＥｎｓｅｍｂｌによってＥＮＳＴ０００００３２７０４０として又はＮＣＢＩによってＮＰ＿０５６１２５［アイソフォーム－ａ］として識別、１０４７ａａ）が最も高いレベルで発現し、次いでアイソフォーム００８（ＥｎｓｅｍｂｌによってＥＮＳＴ０００００５２１８４１として識別され、非符号化）が発現した。図９Ｂは、ｒｓ７１５１９９３４遺伝子型によって層別化された全ＰＳＤ３ｍＲＮＡ発現を示す。遺伝子型によって層別化した場合、ＰＳＤ３ｍＲＮＡ発現レベルに差は見られなかった。Ｐ値は、未調整の線形回帰によって計算した。値は、モデルに入る前に対数変換した。図９Ｃは、ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４遺伝子型間で総ＮＡＴ２ｍＲＮＡ発現レベルが異ならなかったことを示す。Ｐ値は、未調整の線形回帰によって計算した。値は、モデルに入る前に対数変換した。略語：ＦＰＫＭ、マッピングされた１００万リード当たりのエクソンモデル１キロベース当たりのフラグメント；１８６Ｌ：Ｌ対立遺伝子についてのホモ接合体（ｎ＝４２）；Ｌ１８６Ｔ：ヘテロ接合体（ｎ＝２９）；１８６Ｔ：Ｔ対立遺伝子についてのホモ接合体（ｎ＝６）。［図１０Ａ－Ｄ］ＭｃＡ－ＲＨ７７７７細胞においてｓｉＲＮＡを使用することによるインビトロでのＰＳＤ３の下方制御が、スクランブル（Ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞と比較して、実施例２に記載されるように、ベータ酸化（図１０Ｄ）における差異を伴うことなく、より低い細胞内中性脂肪含有量（図１０Ａ）をもたらしたことを示す。細胞内中性脂肪含有量をＯＲＯ染色によって可視化し（上のパネル）、Ｂｉｏｐｉｘによって定量した。デノボトリグリセリド合成を、ＴＬＣによって分離された放射性標識された新たに合成されたトリグリセリドとして測定し、５μＣｉ／ｍｌ ^３Ｈ－グリセロール＋５０μＭオレイン酸とのインキュベーションの１５、３０、６０分後にシンチレーション計数によって定量し；Ａｐｏ－ｂ分泌をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びその定量によって可視化した。細胞を０．０５ｍＣｉ／ｍＬ ^３５ＳＭｅｔ／Ｃｙｓ＋５０μＭＯＡで２時間パルスした。過剰のＬ－メチオニン及びＬ－システインを含むＣｈａｓｅ培地を５、１５、３０又は６０分間インキュベートした。Ａｐｏ－ｂを培地から免疫沈降させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分離後にホスホイメージャによって可視化した。β酸化は、沈殿した放射性標識パルミテートとして測定した。細胞を８．５μＣｉ／ｍＬ３Ｈ－パルミテート＋５５μｍｏｌ／Ｌパルミチン酸と２時間インキュベートし、その後、パルミテートをＢＳＡ及び過塩素酸で沈殿させ、シンチレーション計数によって定量した。データは、報告された独立した実験の平均±ＳＤとして示されている。各図パネルについて、ＰＳＤ３下方制御効率の平均は、２^{－ΔΔＣｔ}法によって分析したリアルタイム定量ＰＣＲによって評価されるように約８０％であった。Ｐ値は、ＳｃｒｓｉＲＮＡ対ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡを比較するマン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。略語：ＡＵ：任意単位；ＲＵ：相対単位；ｄｐｍ：毎分の分解。ラットＭｃＡ－ＲＨ７７７７肝細胞におけるｓｉＲＮＡを使用することによるＰＳＤ３の下方制御が、脂質生成に関与する遺伝子の発現低下をもたらしたことを示す。データを６回の独立した実験の平均及びＳＤとして示す。Ｐ値は、ＳｃｒｓｉＲＮＡ対ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡを比較するマン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。［図１２Ａ－Ｂ］ヒト不死化Ｈｕｈ７肝細胞におけるｓｉＲＮＡの使用によるＰＳＤ３の下方制御の効果を示す。図１２Ａは、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較した細胞内中性脂肪含有量に対する効果を示す。細胞内脂肪含有量をＯＲＯ染色によって可視化し（上のパネル）、ＯＲＯの面積をＢｉｏｐｉｘによって定量した。ＰＳＤ３ｍＲＮＡ下方制御の効率は、２－ΔΔＣｔ法によって分析したリアルタイム定量ＰＣＲによって評価したところ、約６５％であった。細胞を三連で播種し、播種の２４時間後、それらをスクランブル又はＰＳＤ３－ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＦＢＳ＋２５μＭのＯＡを含まない通常の培地で４８時間増殖させた。図１２Ｂは、５μＣｉ／ｍｌの３Ｈ－グリセロール＋５０μＭオレイン酸とのインキュベーションの１５、３０、６０分後にＴＬＣによって分離され、シンチレーションカウンティングによって定量化された新たに合成されたトリグリセリドによって測定されたデノボトリグリセリド合成に対する効果を示す。データを、報告された独立した実験の平均及びＳＤとして示す。Ｐ値は、ＳｃｒｓｉＲＮＡ対ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡを比較するマン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。［図１３Ａ－Ｇ］実施例３に記載されるように、脂肪症、炎症及びＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）の重症度に対する、ＮＡＳＨ誘導食を合計５０週間与えたＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける肝臓ＰＳＤ３の下方制御の効果を示す。最後の１６週間にわたり、マウス群に生理食塩水、対照ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）又はＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）を週１回の皮下注射によって投与した。ＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯは、肝臓ＰＳＤ３ｍＲＮＡ発現レベルを減少させ（図１３Ａ）、肝臓重量の減少（図１３Ｂ）、総肝臓トリグリセリド含有量（図１３Ｃ）、血漿ＡＬＴレベル（図１３Ｄ）、肝臓コラーゲン１ａ１タンパク質レベル（図１３Ｅ）及び肝臓脂肪滴数（図１３Ｆ）と関連していた。ＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ処置は、脂肪症及び炎症の重症度及びＮＡＦＬＤ活性スコアも低下させたが、肝線維症スコアに有意な変化はなかった（図１３Ｇ）。データを平均及びＳＤとして示す。Ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定、続いて多重比較のためのＤｕｎｎの補正によって計算した。各群の平均を対照群（ＣｔｒＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ）の平均と比較して多重比較を行った。肝疾患の重症度スコアを順序回帰分析で分析した。［図１４Ａ－Ｈ］実施例３に記載されるように、ＮＡＳＨ誘導食を合計５０週間与えたＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける肝臓ＰＳＤ３の下方制御の効果を示す。最後の１６週間にわたり、マウス群に生理食塩水、対照ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）又はＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）を週１回の皮下注射によって投与した。ＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯは、体重増加に有意に影響しなかった（図１４Ａ）が、肝臓コレステロール（図１４Ｂ）及びコレステリルエステルレベル（図１４Ｃ）並びに血漿ＡＳＴ（図１４Ｄ）、コレステロール（図１４Ｅ）及びＬＤＬコレステロールレベル（図１４Ｆ）を低下させた。血漿トリグリセリド（図１４Ｇ）又はＨＤＬコレステロールレベル（図１４Ｈ）に有意な効果はなかった。データを平均±ＳＤとして示す。Ｐ値は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定、続いてＤｕｎｎの多重比較検定によって計算した。多重比較を、各群を対照群（ＣｔｒＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ）と比較することによって行った。実施例３に記載されるように、ＮＡＳＨ誘導食を合計５０週間与えたＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける肝臓ＰＳＤ３の下方制御の効果を示す。最後の１６週間にわたり、マウス群に生理食塩水、対照ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）又はＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）を週１回の皮下注射によって投与した。肝ｍＲＮＡをデジタル遺伝子発現プロファイリングによって定量し、１００万当たりの転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ：ＴＰＭ）として表す。ＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃＡＳＯ処置は、肝臓Ａｃｃ１、Ｆａｓｎ及びＳｃｄ１ｍＲＮＡ発現を有意に減少させた。データを平均及びＳＤとして示す。Ｐ値を、一元配置ＡＮＯＶＡＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定によって計算した。ＰＳＤ３マイナー対立遺伝子が、遺伝的リスク因子の調整後の肝臓生検コホート（ＬＢＣ）における肝疾患のより低い有病率と関連することを示す。関連性を、年齢、性別、ＢＭＩ、採用センター、ＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍ変異対立遺伝子の数（ｎ＝１，９５０）について調整し、更に他の主要な遺伝的リスク因子（ＴＭ６ＳＦ２ｒｓ５８５４２９２６［Ｅ１６７Ｋ］（ｎ＝１，９４３）、ＭＢＯＡＴ７ｒｓ６４１７３８（ｎ＝１，９３８）及びＧＣＫＲｒｓ１２６０３２６［Ｌ４４６Ｐ］（ｎ＝１，８６３）及び糖尿病の存在）について調整した順序回帰分析によって試験した。＊ｎ＝１，８０５について入手可能なデータ。ＰＳＤ３Ｌ１８６Ｔ遺伝子型によって層別化された、実施例１に記載のＤａｌｌａｓＨｅａｒｔＳｔｕｄｙの参加者の表を示す。Ｐ値は、必要に応じて年齢、性別及びＢＭＩについて調整し、自己報告民族性について調整又は層別化した線形回帰によって計算した。全体及び４つのＢＭＳ層内のＵＫＢｉｏｂａｎｋからの英国系白人参加者におけるプロトン密度脂肪分率（ＰＤＦＦ）とＰＳＤ３ｒｓ７００３０６０との関連を示す。年齢、性別、ＢＭＩ、祖先及び配列型の最初の１０個の主成分を調整した線形回帰を用いて分析を行った。［図１９Ａ－Ｃ］１８６Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性であるドナー由来の初代ヒト肝細胞と、１８６Ｌ対立遺伝子についてホモ接合性であるドナー由来の初代ヒト肝細胞とを２Ｄで比較したときのＰＳＤ３タンパク質及び細胞内脂質レベルに対する影響を示す。図１９Ａは、オイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色によって可視化され、Ｂｉｏｐｉｘによって定量化された細胞内中性脂肪含有量を示す。データは、報告された独立した実験の平均及び標準偏差として示されている。Ｐ値は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。図１９Ｂは、２％ＦＢＳ、１０μＭのＯＡ又は２５μＭのＯＡを補充した無血清通常培地中で４８時間培養した細胞の画像を示す。全細胞溶解物を用いて免疫ブロット法を行い、カスタム抗体を用いてＰＳＤ３（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿０５６１２５、１０４７ａａ）を検出した。棒グラフは、ＰＳＤ３／カルネキシンとして計算された相対ＰＳＤ３を示す。図１９Ｃは、示差的に発現された脂質代謝に関与する重要な遺伝子がＲＮＡ－Ｓｅｑを用いて得られたことを示す。データを発現のＬｏｇ２倍数変化及びｐ値の－ｌｏｇ１０として示す。略語：ＲＵ：相対単位、ＣＮＸ：カルネキシン。［図２０Ａ－Ｃ］ＰＳＤ３下方制御が、より低いレベルの活性化されたＡＲＦ６（ＡＲＦ－ＧＴＰ）をもたらしたことを示す。図２０Ａは、沈殿後、キットによって提供される抗ＡＲＦ６抗体を使用する免疫ブロット法によって活性ＡＲＦ６－ＧＴＰが検出されたことを示す。図２０Ｂは、ノックダウン効率が、２^{－ΔΔＣｔ}法によって分析されるリアルタイム定量ＰＣＲによって評価されるように、ＰＳＤ３について約６０％の減少及びＡＲＦ６について約７５％の減少を示したことを示す。図２０Ｃは、ＧＴＰ－ＡＲＦ６／カルネキシンとして計算された相対的なＡＲＦ６－ＧＴＰ（活性）を示す。データは、報告された独立した実験の平均±ＳＤとして示されている。Ｐ値は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。略語：ＲＵ：相対単位、ＣＮＸ：カルネキシン。［図２１Ａ－Ｄ］ＰＳＤ３の下方制御が、２Ｄで培養した場合、いずれかの対立遺伝子を有する肝細胞における細胞内中性脂質含有量を減少させることを示す。Ｐ値は、ＳＣＲｓｉＲＮＡ対ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡを比較するマン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって計算した。略語：ＲＵ：相対単位、ＣＮＸ：カルネキシン。

定義
「２’－デオキシフラノシル糖部分」又は「２’－デオキシフラノシル糖」は、２’－位置に２つの水素を有するフラノシル糖部分を意味する。２’－デオキシフラノシル糖部分は、非修飾又は修飾であり得、且つ２’－位置以外の位置で置換されていても又は置換されていなくてもよい。オリゴヌクレオチドに関連して、β－Ｄ－２’－デオキシリボシル糖部分は、非置換非修飾２’－デオキシフラノシルであり、天然に存在するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中に見出される。

「２’－デオキシヌクレオシド」は、天然に存在するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中に見出される、２’－Ｈ（Ｈ）フラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。特定の実施形態において、２’－デオキシヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含み得るか、又はＲＮＡ核酸塩基（ウラシル）を含み得る。

「２’－Ｏ－メトキシエチル」（２’－ＭＯＥでもある）は、リボシル環の２’－ＯＨ基の代わりに２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２－ＯＣＨ_３）を指す。２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。

「２’－ＭＯＥヌクレオシド」（２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドとも称される）は、２’－ＭＯＥ修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「２’－置換ヌクレオシド」又は「２－修飾ヌクレオシド」は、２’－置換糖部分又は２’－修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用される、糖部分に関する「２’－置換」又は「２－修飾」は、Ｈ又はＯＨ以外の少なくとも１つの２’－置換基を含む糖部分を意味する。

「５－メチルシトシン」は、５位に付着しているメチル基を有するシトシンを意味する。５－メチルシトシンは修飾核酸塩基である。

本出願全体にわたり、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられている方法／装置についての誤差の固有の変動又は試験対象間で存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、用語「約」は、状況に応じておよそ又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％未満の変動性を包含することを意味する。

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すと明示されない限り又はその代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」は、標的核酸又はその領域若しくはセグメントに相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸又はその領域若しくはセグメントに特異的にハイブリダイズ可能であり、そのハイブリダイゼーションは、標的核酸のＲＮａｓｅＨ媒介性切断をもたらす。

「二環式糖」又は「二環式糖部分」は、２つの環を含む修飾糖部分（第２の環が、第１の環中の原子の２つを連結する架橋を介して形成されており、それにより二環構造を形成している）を意味する。特定の実施形態において、二環式糖部分の第１の環は、フラノシル部分である。「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「コンジュゲート基」は、ポリヌクレオチドに直接結合している原子の群を意味する。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、コンジュゲート部分と、コンジュゲート部分をポリヌクレオチドに結合するコンジュゲートリンカーとを含む。

「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」又は「ｃＥｔ修飾糖部分」は、二環式糖の第２の環がβ－Ｄリボシル糖部分の４’－炭素と２’－炭素とを接続する架橋を介して形成され、架橋が式４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’を有する二環式β－Ｄリボシル糖部分を意味する。「ｃＥｔヌクレオシド」は、ｃＥｔ糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

オリゴヌクレオチドに関連して、「連続する」は、互いに直接隣接するヌクレオシド、核酸塩基、糖部分又はヌクレオシド間連結を指す。例えば、「連続核酸塩基」は、配列中で互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。

「ギャップマー」は、１つ以上のヌクレオシドを有する外部領域の間に位置するＲＮａｓｅＨ切断を支持する複数のヌクレオシドを有する内部領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味し、内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含む１つ以上のヌクレオシドと化学的に異なる。内部領域は、「ギャップ」と称することができ、外部領域は、「ウイング」と称することができる。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。

「ヌクレオシド間連結」は、ポリヌクレオチド中の隣接するヌクレオシド間の共有結合である。本明細書で使用される場合、「修飾されたヌクレオシド間連結」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結以外の任意のヌクレオシド間連結を意味する。「ホスホロチオエートヌクレオシド間連結」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置き換えられた修飾ヌクレオシド間連結である。

「連鎖不平衡」は、所与の集団における異なる遺伝子座での対立遺伝子の非ランダムな会合を意味すると理解される。正の連鎖不平衡の対立遺伝子は、それらがランダムに会合した場合に予想されるよりもはるかに高い頻度で一緒に現れるが、負の連鎖不平衡の対立遺伝子は、それらがランダムに会合した場合に予想されるよりもはるかに低い頻度で一緒に現れる。

「結合ヌクレオシド」は、ヌクレオシド間連結によって一緒に結合された隣接ヌクレオシドを意味する。

「ミスマッチ」又は「非相補的」は、第１及び第２のポリヌクレオチドがアラインメントされたときに、第２のポリヌクレオチド又は標的核酸の対応する核酸塩基に相補的でない第１のポリヌクレオチドの核酸塩基を意味する。例えば、限定されるものではないが、ユニバーサル核酸塩基、イノシン及びヒポキサンチンが挙げられる核酸塩基は、少なくとも１つの核酸塩基とハイブリダイズすることができるが、ハイブリダイズした核酸塩基に対して依然としてミスマッチであるか又は非相補的である。別の例として、第１及び第２のポリヌクレオチドがアラインメントされたときに第２のポリヌクレオチド又は標的核酸の対応する核酸塩基にハイブリダイズすることができない第１のポリヌクレオチドの核酸塩基は、ミスマッチ又は非相補的核酸塩基である。

「オーバーハングヌクレオシド」とは、アンチセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチドとセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって形成される二重鎖の一方又は両方の末端の不対ヌクレオチドを指す。

核酸塩基は、天然に存在し得るか又は合成であり得る。核酸塩基及び糖塩基は、それぞれ独立して、修飾又は非修飾であり得る。「修飾ヌクレオシド」は、修飾核酸塩基及び／又は修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドとしては、核酸塩基を欠く脱塩基ヌクレオシドが挙げられる。

「ホスホロチオエート結合」は、非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置き換えられた修飾ホスフェート結合を意味する。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、修飾ヌクレオシド間連結である。

「部分」は、核酸の規定数の連続（すなわち結合）核酸塩基を意味する。特定の実施形態において、部分は、標的核酸の規定数の連続核酸塩基である。特定の実施形態において、部分は、規定数のオリゴマー化合物の連続核酸塩基である。

「ポリヌクレオチド」は、結合ヌクレオシドのポリマーを意味し、各結合ヌクレオシドは、互いに独立して、修飾又は非修飾であり得る。別途指示しない限り、ポリヌクレオチドは、８～８０個の結合ヌクレオシドからなる。「修飾ポリヌクレオチド」は、少なくとも１つの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間連結が修飾されているポリヌクレオチドを意味する。「非修飾ポリヌクレオチド」は、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間修飾を含まないポリヌクレオチドを意味する。

「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、それにはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子が含まれる。いくつかの実施形態では、「遺伝子」は、コード配列の前（すなわち５’）及び後（すなわち３’）の調節配列として作用することができる非コード核酸断片も指す。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子等の核酸分子は、目的の配列、例えばＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。核酸分子は、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに、温度及びイオン強度溶液の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態がその別の核酸分子にアニールし得る場合、「ハイブリダイズ可能である」又は「ハイブリダイズされる」。特定の機構に限定するものではないが、ハイブリダイゼーションの最も一般的な機構は、相補的な核酸塩基間のワトソン・クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を含む。一部の実施形態において、相補的核酸分子として、以下に限定されないが、アンチセンス化合物及び核酸標的が挙げられる。一部の実施形態において、相補的核酸分子として、以下に限定されないが、ポリヌクレオチド及び標的核酸が挙げられる。

「特異的にハイブリダイズ可能」とは、ポリヌクレオチドと標的核酸との間に、所望の効果を誘導するのに十分な程度の相補性を有するが、非標的核酸に対する効果が最小限であるか又は全くないポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、特異的ハイブリダイゼーションは、生理学的条件下で起こる。

用語「相補的な」は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基及び／又はポリヌクレオチドの関係を説明するのに用いられ、例えば、そのようなポリヌクレオチド又はその１つ以上の領域のヌクレオチド配列は、別のポリヌクレオチド又はその１つ以上の領域のヌクレオチド配列に、２つのヌクレオチド配列が逆方向にアラインメントされた場合にマッチする。本明細書に記載される核酸塩基マッチ又は相補的核酸塩基として、以下の対が挙げられる：アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）及び５－メチルシトシン（^ｍＣ）とグアニン（Ｇ）。相補的ポリヌクレオチド及び／又は核酸は、各ヌクレオシドに核酸塩基相補性を有する必要はなく、１つ以上の核酸塩基ミスマッチを含み得る。したがって、本開示は、本明細書で開示又は使用される配列に相補的な単離ポリヌクレオチド及びその実質的に類似する核酸配列も含む。２つのポリヌクレオチドが、マッチする核酸塩基を有する程度は、「相補性パーセント」又は「相補的パーセント」に換算して表すことができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される別のポリヌクレオチド又は標的核酸との７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％若しくは少なくとも９９％又は１００％の相補性を有する。２つのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び標的核酸が「完全に相補的」又は「１００％相補的」である実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、いかなる核酸塩基ミスマッチも伴わずに各ヌクレオシドにおいて核酸塩基マッチを有する。別段示されない限り、相補性パーセントは、より長い配列に相補的であるより短い配列の核酸塩基の百分率である。

ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロ又はインビボで細胞内において転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列の鎖の１つである。「調節配列」は、コード配列の上流（すなわち５’）、内部又は下流（すなわち３’）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼす非コードポリヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を挙げることができる。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、細菌及び古細菌ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡポリヌクレオチド及び合成ＤＮＡポリヌクレオチドを含むことができるが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、典型的にはコード配列の３’に位置する。

「ＰＳＤ３」は、遺伝子、プレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３の任意の核酸又はタンパク質を意味する。「ＰＳＤ３核酸」は、ＰＳＤ３をコードする任意の核酸を意味する。例えば、特定の実施形態において、ＰＳＤ３核酸には、ＰＳＤ３をコードするＤＮＡ配列、ＰＳＤ３をコードするＤＮＡ（イントロン及びエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）から転写されたＲＮＡ配列及びＰＳＤ３をコードするｍＲＮＡ配列が含まれる。「ＰＳＤ３ｍＲＮＡ」とは、ＰＳＤ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。標的は、大文字又は小文字のいずれかで称され得る。

本明細書において使用される用語「配列類似性」又は「％類似性」は、核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性又は対応性の程度を指す。ポリヌクレオチドに関連して、「配列類似性」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が１つ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない核酸配列を指す。また、「配列類似性」は、結果として生じる転写産物の機能的特性に実質的に影響しないポリヌクレオチドの修飾、例えば、１つ以上のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入を指し得る。したがって、本開示は、特定の例示的な配列よりも多くのものを包含することが理解される。ヌクレオチド塩基の置換を形成する方法は、コードされるポリペプチドの生物活性の保持を判定する方法と同様に、既知である。

配列類似性は、当技術分野で公知の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸを含む）及びＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（例えば、Ｍ－Ｃｏｆｆｅｅ、Ｒ－Ｃｏｆｆｅｅ及びＥｘｐｒｅｓｓｏ等の変形例を含む）を用いた配列アラインメントによって決定することができる。いくつかの実施形態において、２つ又はそれを超えるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の特定の部分のみが、配列同一性を決定するためにアラインメントされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定のドメインのみをアラインメントして配列類似性が判定される。比較ウィンドウは、配列をアラインメントして比較することができる少なくとも１０～１０００個超の残基、少なくとも２０～約１０００個の残基又は少なくとも５０～５００個の残基のセグメントであり得る。配列同一性の判定のためのアラインメント方法は周知であり、公的に利用可能なデータベース、例えばＢＬＡＳＴを使用して実行することができる。例えば、一部の実施形態において、２つのヌクレオチド配列の「同一性パーセント」は、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９０：５８７３－５８７７（１９９３）の通り修正されたＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアルゴリズムを用いて求められる。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラム、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴ＋又はＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、プログラム、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３により実行されて、本開示のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載の通り利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。

方法
いくつかの実施形態において、本開示は、脂肪肝疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与し、それにより、対象において脂肪肝疾患を治療又は予防することを含む。

肝細胞癌関連抗原であるＰＳＤ３は、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）を活性化するグアニン交換因子である。例えば、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６９，１１０２－１１０９（２００２）、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１２，３６２－３７５（２０１１）及びＦｒａｎｃｏｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ１８，１４８０－１４９１（１９９９）を参照されたい。ＰＳＤ３は、１８の注釈付きアイソフォームを有するタンパク質であり（Ｅｎｓｅｍｂｌリリース７５）、最も一般的なのはアイソフォーム－ａ（ＮＰ＿０５６１２５、１０４７ａａ）及びアイソフォーム－ｂ（ＮＰ＿９９６７９２、５１３ａａ）である。肝臓では、アイソフォーム－ａがアイソフォーム－ｂよりも高レベルで発現されることが発見された。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される「ＰＳＤ３」は、ＰＳＤ３のアイソフォーム－ａである。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される「ＰＳＤ３」は、ＰＳＤ３のアイソフォーム－ｂである。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される「ＰＳＤ３」は、特定のアイソフォームに限定されず、ＰＳＤ３の任意のアイソフォームを指し得る。

本明細書に開示される研究は、ゲノムワイド関連研究を使用して、肝疾患の全範囲に対する保護を潜在的に与えるアミノ酸位置１８６でのロイシンからトレオニンへの置換を有するＰＳＤ３変異体（本明細書では「ＰＳＤ３Ｌ１８６Ｔ」、「Ｌ１８６Ｔ」又は「１８６Ｔ対立遺伝子変異体」と略記する）を同定した。具体的には、このＰＳＤ３変異体は、脂肪症、炎症、風船様変性及び線維症のより低い有病率に関連していた。肝疾患を有し、ＰＳＤ３Ｌ１８６Ｔ変異体を有する対象について、肝疾患重症度は全範囲にわたってより低かった。ＰＳＤ３Ｌ１８６Ｔ変異体のキャリアは、より低い血漿総コレステロール及びＬＤＬコレステロールを有していた。

驚くべきことに、Ｌ１８６Ｔ置換は、そのグアニン交換因子活性に関してＰＳＤ３の機能喪失及びそのＡＲＦ６－ＧＤＰ不活性形態からＡＲＦ６－ＧＴＰ活性形態へのＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の触媒作用をもたらすことが発見された。具体的には、野生型ＰＳＤ３（１８６Ｌ）は、ＡＲＦ６を活性化したが、変異ＰＳＤ３Ｌ１８６Ｔは、活性化されたＡＲＦ６を減少させた。

肝疾患を有する対象におけるＰＳＤ３の下方制御は、機能喪失変異体ＰＳＤ３と同じ保護をもたらすと考えられた。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、対象の細胞におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）発現を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、脂肪肝疾患を有するか又は有するリスクがある。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象のコレステロールを低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＬＤＬコレステロールは、対象において低下する。いくつかの実施形態において、対象は、脂肪肝疾患を有するか又は有するリスクがある。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の活性化を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させることを含み、方法は、対象におけるＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含み、より低いＰＳＤ３発現は、ＡＲＦ６の低下した活性化をもたらす。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象の肝細胞における細胞内脂肪含有量を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、脂肪肝疾患を有するか又は有するリスクがある。

特定の実施形態では、化合物は、標的核酸に相補的な領域を含むポリヌクレオチドを含むか又はそれからなり、標的核酸は、ＰＳＤ３ＲＮＡである。上記の各実施形態において、化合物はＰＳＤ３ＲＮＡを標的とし得る。特定の実施形態では、ＰＳＤ３ＲＮＡは、配列番号２０（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号：ＮＭ＿０１５３１０．３）に示される配列を有する。特定の実施形態では、細胞を、配列番号２０に相補的なポリヌクレオチドを含む化合物と接触させると、ＰＳＤ３ＲＮＡの量が減少し、特定の実施形態では、ＰＳＤ３タンパク質の量が減少する。特定の実施形態では、化合物は修飾オリゴヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、細胞は、それを必要とする対象内にある。特定の実施形態では、配列番号２０に相補的なポリヌクレオチドを含む化合物を対象に投与すると、対象の肝損傷、脂肪症、肝線維症、肝臓の炎症、肝瘢痕又は肝硬変、肝不全が減少する。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、化合物は修飾オリゴヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、化合物は、修飾オリゴヌクレオチド及びコンジュゲート基からなる。特定の実施形態では、化合物はＲＮＡｉ化合物である。

化合物
いくつかの実施形態では、化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｓＲＮＡｉから選択される。特定の実施形態では、化合物はリボザイムである。

いくつかの実施形態において、化合物は一本鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一本鎖ポリヌクレオチドは、相補的ポリヌクレオチドに結合して二本鎖二重鎖を形成することができる。いくつかの実施形態において、一本鎖ポリヌクレオチドは自己相補的配列を含む。「自己相補的」は、ポリヌクレオチドがそれ自体に少なくとも部分的にハイブリダイズすることができることを意味する。いくつかの実施形態において、一本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、一本鎖ポリヌクレオチドは、ｓｓＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。

いくつかの実施形態では、化合物は二本鎖である。そのような二本鎖化合物は、標的核酸に相補的な領域を有する第１のポリヌクレオチド（及びアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド）並びに第１のポリヌクレオチドに相補的な領域を有する第２のポリヌクレオチド（センスＲＮＡｉポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖化合物はＤＮＡポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、化合物はＲＮＡポリヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、ポリヌクレオチド中のチミン核酸塩基は、ウラシル核酸塩基によって置き換えられる。二本鎖化合物のポリヌクレオチドは、非相補的なオーバーハングヌクレオシドを含み得る。特定の実施形態では、化合物は、糖の２’位がハロゲン（フッ素基等；２’－Ｆ）を含有するか、又はアルコキシ基（例えばメトキシ基等；２’－ＯＭｅ）を含有する１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、化合物は、少なくとも１つの２’－Ｆ糖修飾及び少なくとも１つの２’－ＯＭｅ糖修飾を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの２’－Ｆ糖修飾及び少なくとも１つの２’－ＯＭｅ糖修飾は、化合物の鎖に沿って少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個の連続核酸塩基について、交互のパターンで配置されている。特定の実施形態では、化合物は、天然に存在するホスホジエステル結合以外の隣接するヌクレオシド間に１つ以上の結合を含む。そのような結合の例としては、ホスホルアミド結合、ホスホロチオエート結合及びホスホロジチオエート結合が挙げられる。化合物は、米国特許第６，６７３，６６１号明細書に教示されているような化学的に修飾された核酸分子でもあり得る。別の実施形態において、化合物は、例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレットにより開示されているような１つ又は２つのキャップされた鎖を含む。二本鎖化合物の例はｓｉＲＮＡである。

特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物は、干渉ＲＮＡ化合物（ＲＮＡｉ）であり、二本鎖ＲＮＡ化合物（小分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとも称される）及び一本鎖ＲＮＡｉ化合物（又はｓｓＲＮＡ）が挙げられる。そのような化合物は、少なくとも部分的にＲＩＳＣ経路を介して機能し、標的核酸を分解及び／又は捕捉する（したがってマイクロＲＮＡ／マイクロＲＮＡ模倣化合物が含まれる）。本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子を説明するために使用される他の用語、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ポリヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾ポリヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）等と同等であることを意味する。また、本明細書で用いられる用語「ＲＮＡｉ」は、配列特異的ＲＮＡ干渉、例えば転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害又はエピジェネティクスを説明するのに用いられる他の用語に等しいことを意味する。

特定のアンチセンス活性において、標的核酸への本明細書に記載される化合物のハイブリダイゼーションは、標的核酸を開裂させるタンパク質のリクルートメントをもたらす。例えば、本明細書に記載される特定の化合物は、標的核酸のＲＮアーゼＨ媒介開裂をもたらす。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂させる細胞エンドヌクレアーゼである。そのようなＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖におけるＤＮＡは、非修飾ＤＮＡである必要はない。特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物は、ＲＮアーゼＨ活性を誘発するのに十分に「ＤＮＡ様」である。更に、特定の実施形態において、ギャップマーのギャップ内に、１つ以上の非ＤＮＡ様ヌクレオシドが許容される。

特定のアンチセンス活性において、本明細書に記載される化合物又は化合物の一部が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中にロードされて、最終的に標的核酸の開裂をもたらす。例えば、本明細書に記載される特定の化合物は、アルゴノートによる標的核酸の開裂をもたらす。ＲＩＳＣにロードされる化合物は、ＲＮＡｉ化合物である。ＲＮＡｉ化合物は、二本鎖（ｓｉＲＮＡ）又は一本鎖（ｓｓＲＮＡ）であり得る。

ＲＮＡｉ化合物
ＲＮＡｉ化合物は、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド及び場合によりセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ化合物は、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド又はセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド（存在する場合）に結合し得る末端基及び／又はコンジュゲート基も含み得る。

アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド及びセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドを含むＲＮＡｉ化合物は、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドがアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスハイブリダイズ領域を含むため、二重鎖を形成し得る。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド及びセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドの各核酸塩基は、互いに相補的である。特定の実施形態では、２つのＲＮＡｉポリヌクレオチドは、互いに対して少なくとも１つのミスマッチを有する。

特定の実施形態では、アンチセンスハイブリダイズ領域は、センスＲＮＡｉポリヌクレオチド及びアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドの全長を構成する。特定の実施形態において、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド及びセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドの一方又は両方は、ハイブリダイズしない付加的なヌクレオシド（オーバーハングヌクレオシド）を一方又は両方の末端に含む。特定の実施形態では、オーバーハングヌクレオシドはＤＮＡである。特定の実施形態では、オーバーハングヌクレオシドは、互いに（２つ以上が存在する場合）及びホスホロチオエート結合を有する第１の非オーバーハングヌクレオシドに結合している。

ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示は、８～５０個の連結されたヌクレオシドからなり、且つＰＳＤ３をコードする核酸の等しい長さの部分に対して少なくとも９０％の配列相補性を有するポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１０～３０個の連結されたヌクレオシドからなり、且つＰＳＤ３をコードする核酸の等しい長さの部分の少なくとも９０％の配列相補性を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１２～２０個の連結されたヌクレオシドからなり、且つＰＳＤ３をコードする核酸の等しい長さの部分に対して少なくとも９０％の配列相補性を有する。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、８～８０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、８～５０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１０～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１２～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１２～２２個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１４～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１５～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１６～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１７～３０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１２～２０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１５～２０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１６～２０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の連結されたヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個又は約２０個の連結されたヌクレオシドからなる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＳＤ３をコードする核酸（配列番号２～１８）の等しい長さの部分と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は約１００％相補的な核酸塩基配列を有する。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＳＤ３をコードする核酸の等しい長さの部分とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＤ３をコードする核酸は、配列番号２～１８を含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＳＤ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写開始部位、翻訳開始部位、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、コード配列、プレｍＲＮＡ配列及び／又はイントロン／エクソン接合部の等しい長さの部分に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は約１００％相補的な核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＳＤ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写開始部位、翻訳開始部位、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、コード配列、プレｍＲＮＡ配列及び／又はイントロン／エクソン接合部の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％相補的な核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＳＤ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写開始部位、翻訳開始部位、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、コード配列、プレｍＲＮＡ配列及び／又はイントロン／エクソン接合部の等しい長さの部分又は全てとハイブリダイズすることができる核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２～１８のいずれか１つの等しい長さの部分に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は約１００％相補的な核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２～１８のいずれか１つの等しい長さの部分に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％相補的な核酸塩基配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２～１８のいずれか１つの等しい長さの部分とハイブリダイズすることができる核酸塩基配列を有する。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結を含む。ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結は、３’－５’ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾された、すなわち天然に存在しないヌクレオシド間連結を有する本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、細胞取込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増加等の望ましい特性のために、天然に存在するヌクレオシド間連結を有するポリヌクレオチドよりも選択されることが多い。

いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドのヌクレオシドは、任意のヌクレオシド間連結を用いて共に結合され得る。ヌクレオシド間連結基の２つの主な分類は、リン原子の有無によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結として、限定されるものではないが、ホスホジエステル結合（「Ｐ＝Ｏ」）を含有するホスフェート（非修飾結合又は天然に存在する結合とも称される）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミダート、及びホスホロチオエート（「Ｐ＝Ｓ」）、及びホスホロジチオエート（「ＨＳ－Ｐ＝Ｓ」）が挙げられる。代表的な非リン含有ヌクレオシド間連結基として、限定されるものではないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－ＳｉＨ_２－Ｏ－）；及びＮ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－）が挙げられる。天然に存在するホスフェート結合と比較して、修飾ヌクレオシド間連結は、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変更するのに、典型的には増大させるのに用いることができる。いくつかの実施形態において、キラル原子を有するヌクレオシド間連結は、ラセミ混合物又は別個のエナンチオマーとして調製される。リン含有及び非リン含有ヌクレオシド間連結を調製する方法は、当業者に知られている。

代表的なキラルヌクレオシド間連結として、限定されるものではないが、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートが挙げられる。キラル中心を有するヌクレオシド間連結を含む本明細書に開示される修飾ポリヌクレオチドは、立体的に無作為なヌクレオシド間連結を含むポリヌクレオチドの集団又はホスホロチオエート結合、特に立体化学的配置を含むポリヌクレオチドの集団として調製することができる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの集団は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含み、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は全てステレオランダムである。そのようなポリヌクレオチドは、各ホスホロチオエート結合の立体化学的配置にランダムな選択をもたらす合成方法を使用して生成することができる。それにも関わらず各個々のｏポリヌクレオチド分子の個々のホスホロチオエートは、定義された立体配置を有する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの集団は、特定の独立して選択される立体化学的配置の１つ以上の特定のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含むポリヌクレオチドについて濃縮される。特定の実施形態において、特定のホスホロチオエート結合の特定の立体配置は、集団中の分子の少なくとも６５％に存在する。特定の実施形態において、特定のホスホロチオエート結合の特定の立体配置は、集団中の分子の少なくとも７０％に存在する。特定の実施形態において、特定のホスホロチオエート結合の特定の立体配置は、集団中の分子の少なくとも８０％に存在する。特定の実施形態において、特定のホスホロチオエート結合の特定の立体配置は、集団中の分子の少なくとも９０％に存在する。特定の実施形態において、特定のホスホロチオエート結合の特定の立体配置は、集団中の分子の少なくとも９９％に存在する。ポリヌクレオチドのこのようなキラル濃縮された集団は、当技術分野において公知の合成方法、例えば、Ｏｋａｅｔａｌ．，ＪＡＣＳ１２５，８３０７（２００３）、Ｗａｎｅｔａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．４２，１３４５６（２０１４）及び国際公開第２０１７／０１５５５５号パンフレットに記載の方法を使用して生成することができる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの集団は、（Ｓｐ）配置の少なくとも１つの示されたホスホロチオエートを有するポリヌクレオチドについて濃縮される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの集団は、（Ｒｐ）配置の少なくとも１つのホスホロチオエートを有するポリヌクレオチドについて濃縮される。特定の実施形態において、（Ｒｐ）及び／又は（Ｓｐ）ホスホロチオエートを含むポリヌクレオチドは、それぞれ以下の式の１つ以上を含み、式中、「Ｂ」は、核酸塩基を示す。

別途指示しない限り、本明細書に記載されるＲＮＡｉポリヌクレオチドのキラルヌクレオシド間連結は、ステレオランダムであり得るか又は特定の立体化学的配置であり得る。リン含有及び非リン含有ヌクレオシド間連結を調製する方法は、当業者に知られている。

中性ヌクレオシド間連結としては、限定されるものではないが、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ（３’－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－５’）、アミド－３（３’－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－５’）、アミド－４（３’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｈ）－Ｃ（＝Ｏ）－５’）、ホルムアセタール（３’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－５’）、メトキシプロピル及びチオホルムアセタール（３’－Ｓ－ＣＨ_２－Ｏ－５’）が挙げられる。更なる中性ヌクレオシド間連結には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホン酸エステル及びアミドを含む非イオン性結合が含まれる（例えば、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉａｎｄＰ．Ｄ．Ｃｏｏｋ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ３ａｎｄ４，４０－６５を参照されたい）。更なる中性ヌクレオシド間連結としては、混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成成分部分を含む非イオン結合が挙げられる。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド及び／又はセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド）は、以下に示されるように、１つ以上の反転ヌクレオシドを含み、

式中、各Ｂｘは独立して任意の核酸塩基を表す。

特定の実施形態において、反転ヌクレオシドは末端にあり（すなわちオリゴヌクレオチドの一端の最後のヌクレオシド）、そのため、上に示される１つのヌクレオシド間連結のみが存在するであろう。特定のこのような実施形態において、付加的な特徴（例えば、コンジュゲート基）が反転ヌクレオシドに結合され得る。そのような末端反転ヌクレオシドは、ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端に結合することができる。

特定の実施形態では、そのような基は核酸塩基を欠き、本明細書では逆糖部分と呼ばれる。特定の実施形態において、逆性糖部分は末端にあり（すなわちポリヌクレオチドの一端の最後のヌクレオシドに結合している）、したがって、上記のヌクレオシド間連結は、１つのみ存在するであろう。特定のこのような実施形態において、付加的な特徴（例えば、コンジュゲート基）が逆方向糖部分に結合され得る。そのような末端逆位糖部分は、ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端に結合することができる。

特定の実施形態において、核酸は、標準的な３’－５’連結ではなく、２’－５’連結され得る。そのような連結を以下に示す。

式中、各Ｂｘは任意の核酸塩基を表す。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はその領域に沿って配置された修飾ヌクレオシド間連結を、規定されたパターン又は修飾ヌクレオシド間連結モチーフ内に含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド間連結は、ギャップモチーフ内に配置される。そのような実施形態において、２つのウイング領域のそれぞれにおけるヌクレオシド間連結は、ギャップ領域内のヌクレオシド間連結と異なる。いくつかの実施形態において、ウイング内のヌクレオシド間連結はホスホジエステル結合であり、ギャップ内のヌクレオシド間連結はホスホロチオエート結合である。ヌクレオシドモチーフは独立して選択されるため、ギャップヌクレオシド間連結モチーフを有するそのようなポリヌクレオチドは、ギャップヌクレオシドモチーフを有していても又は有していなくてもよく、ギャップヌクレオシドモチーフを有する場合、ウイング長及びギャップ長は、同一であっても又はなくてもよい。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、交互にヌクレオシド間連結モチーフを有する領域を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、均一に修飾されたヌクレオシド間連結の領域を含む。そのような実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって一様に結合された領域を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートにより一様に結合されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオシド間連結はホスホロチオエートである。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも６個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも８個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも６個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１個のブロックを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも８個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１個のブロックを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１個のブロックを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１２個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間連結の少なくとも１個のブロックを含む。いくつかのそのような実施形態では、少なくとも１個のそのようなブロックがポリヌクレオチドの３’末端に位置する。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１個のそのようなブロックは、ポリヌクレオチドの３’末端の３つのヌクレオシド内に位置する。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上のメチルホスホネート結合を含む。いくつかの実施形態において、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するポリヌクレオチドは、１つ又は２つのメチルホスホネート結合を除き、全てホスホロチオエート結合を含む結合モチーフを含む。いくつかの実施形態において、１つのメチルホスホネート結合は、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するポリヌクレオチドの中央のギャップ内に存在する。

いくつかの実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結及びホスホジエステルヌクレオシド間連結の数は、ヌクレアーゼ耐性を維持するように配置することが望ましい。いくつかの実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数及び位置並びにホスホジエステルヌクレオシド間連結の数及び位置は、ヌクレアーゼ耐性を維持するように配置することが望ましい。いくつかの実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減らすことができるか、又はホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増やすことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ耐性を依然として維持したまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減らし、且つホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増やすことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ耐性を保持したまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結の数を減らすことが望ましい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を維持しながら、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の数を増加させることが望ましい。

いくつかの実施形態では、標的核酸、例えばＰＳＤ３タンパク質をコードする配列を標的とするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドの少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾糖は、二環式糖、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｆ又は２’－Ｏ－メチルである。

いくつかの実施形態において、糖部分は、非二環式修飾糖部分である。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、二環式糖部分又は三環式糖部分である。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、糖代替物である。そのような糖代替物は、他の種類の修飾糖部分の置換に対応する１つ以上の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、１つ以上の非環式置換基（限定されるものではないが、２’、３’、４’及び／又は５’位の置換基が挙げられる）を有するフラノシル環を含む非二環式修飾糖部分である。いくつかの実施形態において、非二環式修飾糖部分の１つ以上の非環式置換基は、分枝鎖である。

修飾糖部分、例えば、非二環式修飾糖部分を含むヌクレオシドは、ヌクレオシドの糖部分における置換の位置に従って称される。例えば、２’－置換又は２－修飾糖部分を含むヌクレオシドは、２’－置換ヌクレオシド又は２－修飾ヌクレオシドと称される。非二環式修飾糖部分に適した２’－置換基の例として、以下に限定されないが：２’－Ｆ，２’－ＯＣＨ_３（「ＯＭｅ」又は「Ｏ－メチル」）及び２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３（「ＭＯＥ」）が挙げられる。いくつかの実施形態において、２’－置換基は、ハロ、アリル、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ_３、Ｏ－Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、Ｏ－Ｃ_１～Ｃ_１０置換アルコキシ、Ｏ－Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｏ－Ｃ_１～Ｃ_１０置換アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ（Ｒ_ｍ）－アルキル、Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ（Ｒ_ｍ）－アルケニル、Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ（Ｒ_ｍ）－アルキニル、Ｏ－アルキレニル－Ｏ－アルキル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリール、Ｏ－アラルキル、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）又はＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）（式中、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基又は置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルである）、－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２（「ＤＭＡＯＥ」）、２’－ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_２）_２（「ＤＭＡＥＯＥ」）並びにＣｏｏｋらの米国特許第６，５３１，５８４号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，８５９，２２１号明細書；及びＣｏｏｋらの米国特許第６，００５，０８７号明細書に記載の２’－置換基から選択される。これらの２’－置換基のいくつかの実施形態は、以下から独立して選択される１つ以上の置換基で更に置換され得る：ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ_２）、チオール、チオアルコキシ、チオアルキル、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニル。いくつかの実施形態において、２’－置換ヌクレオシド又は２’－非二環式修飾ヌクレオシドは、以下から選択される直鎖状の２’－置換基を含む糖部分を含む：Ｆ、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_３）_２及びＮ－置換アセトアミド（ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ））（式中、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基又は置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルである）。

いくつかの実施形態において、２’－置換ヌクレオシド又は２’－非二環式修飾ヌクレオシドは、以下から選択される直鎖状の２’－置換基を含む糖部分を含む：Ｆ、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２、Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_３）_２及びＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３（「ＮＭＡ」）。いくつかの実施形態において、２’－置換ヌクレオシド又は２’－非二環式修飾ヌクレオシドは、以下から選択される直鎖状の２’－置換基を含む糖部分を含む：Ｆ、ＯＣＨ_３及びＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３。

特定の実施形態では、非二環式修飾糖部分は、４’位に置換基を含む。適切な４’－置換基の例としては、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アルキル及びＭａｎｏｈａｒａｎらの国際公開第２０１５／１０６１２８号パンフレットに記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、非二環式修飾糖部分は、３’位に置換基を含む。修飾糖部分の３’位に適した置換基の例としては、アルコキシ（例えば、メトキシ）、アルキル（例えば、メチル、エチル）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、非二環式修飾糖部分は、５’位に置換基を含む。修飾糖部分の５’位に適した置換基の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：アルキル（例えば、メチル（Ｒ又はＳ）、ビニル及び５’－アルコキシ（例えば、メトキシ）。いくつかの実施形態において、非二環式修飾糖は、２つ以上の非架橋糖置換基、例えば、２’－Ｆ－５’－メチル糖部分並びにＭｉｇａｗａらの国際公開第２００８／１０１１５７号パンフレット及びＲａｊｅｅｖらの米国特許出願公開第２０１３／０２０３８３６号明細書に記載される修飾糖部分及び修飾ヌクレオシドを含む。

天然に存在する核酸では、糖は互いに３’～５’に結合している。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、代替位置、例えば２’又は逆位５’から３’に連結された１つ以上のヌクレオシド又は糖部分を含む。例えば、連結が２’位にある場合、２’－置換基は、代わりに、３’位にあり得る。

特定の修飾糖部分は、第２の環を形成して二環式糖部分をもたらす架橋糖置換基を含む。そのような二環式糖部分を含むヌクレオシドは、二環式ヌクレオシド（ＢＮＡ）、ロックドヌクレオシド又は配座的に制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）と呼ばれている。特定のこのような化合物は、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；及び国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットに記載されている。いくつかのそのような実施形態において、二環式糖部分は、４’フラノース環原子と２’フラノース環原子間の架橋を含む。特定のそのような実施形態において、フラノース環は、リボース環である。そのような４’～２’架橋糖置換基の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：４’－ＣＨ_２－２’、４’－（ＣＨ_２）_２－２’、４’－（ＣＨ_２）_３－２’、４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’（「ＬＮＡ」）、４’－ＣＨ_２－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（「ＥＮＡ」）、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’（Ｓ立体配置である場合、「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」と称される）、４’－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－２’、４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－２’、４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’（「拘束ＭＯＥ」又は「ｃＭＯＥ」）及びそれらの類似体（例えば、Ｓｅｔｈらの米国特許第７，３９９，８４５号明細書、Ｂｈａｔらの米国特許第７，５６９，６８６号明細書、Ｓｗａｙｚｅらの米国特許第７，７４１，４５７号明細書及びＳｗａｙｚｅらの米国特許第８，０２２，１９３号明細書を参照されたい）、４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－Ｏ－２’及びそれらの類似体（例えば、Ｓｅｔｈらの米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照されたい）、４’－ＣＨ_２－Ｎ（ＯＣＨ_３）－２’及びそれらの類似体（例えば、Ｐｒａｋａｓｈらの米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照されたい）、４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－２’（例えば、Ａｌｌｅｒｓｏｎらの米国特許第７，６９６，３４５号明細書及びＡｌｌｅｒｓｏｎらの米国特許第８，１２４，７４５号明細書を参照されたい）、４’－ＣＨ_２ ^－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_３）－２’（例えば、Ｚｈｏｕ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照されたい）、４’－ＣＨ_２－Ｃ（＝ＣＨ_２）－２’及びそれらの類似体（例えば、Ｓｅｔｈらの米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照されたい）、４’－Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’、４’－Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’、４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’及び４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、各Ｒ、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、独立して、Ｈ、保護基又はＣ_１～Ｃ_１２アルキルである）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、そのような４’～２’架橋は、独立して、以下から独立して選択される１～４個の連結基を含む：－［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ－、－［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ－Ｏ－、－Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｃ（Ｒ_ｂ）－、－Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（＝ＮＲ_ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒ_ａ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_ｘ－及び－Ｎ（Ｒ_ａ）－（式中、ｘは、０、１又は２であり、ｎは、１、２、３又は４であり、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５～Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５～Ｃ_２０アリール、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_５～Ｃ_７脂環式ラジカル、置換Ｃ_５～Ｃ_７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）－Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２－Ｊ_１）又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）－Ｊ_１）であり；並びにＪ_１及びＪ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５～Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５～Ｃ_２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）－Ｈ）、置換アシル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、Ｃ_１～Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_１２アミノアルキル又は保護基である）。

更なる二環式糖部分が、当技術分野において公知であり、例えば、以下を参照されたい：Ｆｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９－４４４３、Ａｌｂａｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１－７７４０、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５－４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７－３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３－５６３８；Ｋｕｍａｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９－２２２２；Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５－１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００１７，１２９，８３６２－８３７９；Ｅｌａｙａｄｉｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＩｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８－５６１；Ｂｒａａｓｃｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１－７；Ｏｒｕｍ１０ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９－２４３；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第７，０５３，２０７号明細書；Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第６，２６８，４９０号明細書；Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第６，７７０，７４８号明細書；Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第ＲＥ４４，７７９号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第６，７９４，４９９号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第６，６７０，４６１号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第７，０３４，１３３号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第８，０８０，６４４号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第８，０３４，９０９号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第８，１５３，３６５号明細書；Ｗｅｎｇｅｌらの米国特許第７，５７２，５８２号明細書；及びＲａｍａｓａｍｙらの米国特許第６，５２５，１９１号明細書；Ｔｏｒｓｔｅｎらの国際公開第２００４／１０６３５６号パンフレット；Ｗｅｎｇｅｌらの国際公開第９１９９９／０１４２２６号パンフレット；Ｓｅｔｈらの国際公開第２００７／１３４１８１号パンフレット；Ｓｅｔｈらの米国特許第７，５４７，６８４号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第７，６６６，８５４号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，０８８，７４６号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第７，７５０，１３１号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，０３０，４６７号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，２６８，９８０号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，５４６，５５６号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，５３０，６４０号明細書；Ｍｉｇａｗａらの米国特許第９，０１２，４２１号明細書；Ｓｅｔｈらの米国特許第８，５０１，８０５号明細書；及び米国特許出願公開であるＡｌｌｅｒｓｏｎらの米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書及びＭｉｇａｗａらの米国特許出願公開第２０１５／０１９１７２７号明細書。

いくつかの実施形態において、二環式糖部分及びそのような二環式糖部分を組み込んだヌクレオシドは更に、異性体立体配置によって定義される。例えば、ＬＮＡヌクレオシド（本明細書に記載される）は、α－Ｌ立体配置又はβ－Ｄ立体配置であり得る。

α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）又はα－Ｌ－ＬＮＡ二環式ヌクレオシドは、アンチセンス活性を示すポリヌクレオチドに組み込まれている（Ｆｒｉｅｄｅｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５－６３７２）。ｓｉＲＮＡへのロック核酸の付加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．，（２００５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔａｌ．，（２００７）ＭａｌＣａｎｅＴｈｅｒ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本明細書において、二環式ヌクレオシドの一般的な説明には、両方の異性体立体配置が含まれる。本明細書の例示的な実施形態において、特定の二環式ヌクレオシド（例えば、ＬＮＡ又はｃＥｔ）の配置が特定される場合、それらの配置は、別途明記しない限りβ－Ｄ立体配置である。

いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、１つ以上の非架橋糖置換基及び１つ以上の架橋糖置換基（例えば、５’－置換及び４’－２’架橋糖）を含む。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、糖代替物である。いくつかのそのような実施形態において、糖部分の酸素原子は、例えば、硫黄原子、炭素原子又は窒素原子で置換されている。いくつかのそのような実施形態において、そのような修飾糖部分は、本明細書に記載されるような架橋及び／又は非架橋置換基も含む。例えば、特定の糖代替物は、４’硫黄原子並びに２’位（例えば、Ｂｈａｔらの米国特許第７，８７５，７３３号明細書及びＢｈａｔらの米国特許第７，９３９，６７７号明細書を参照されたい）及び／又は５’位における置換を含む。

いくつかの実施形態において、糖代替物は、５原子以外の環を含む。例えば、いくつかの実施形態において、糖代替物は、６員テトラヒドロピラン（「ＴＨＰ」）を含む。そのようなテトラヒドロピランは、更に修飾又は置換され得る。そのような修飾テトラヒドロピランを含むヌクレオシドとしては、限定されないが、ヘキシトール核酸（「ＨＮＡ」）、アニトール核酸（「ＡＮＡ」）、マンニトール核酸（「ＭＮＡ」）（例えば、Ｌｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，１０，８４１－８５４を参照されたい）、フルオロＨＮＡ：

（「Ｆ－ＨＮＡ」、例えばＳｗａｙｚｅらの米国特許第８，０８８，９０４号明細書；Ｓｗａｙｚｅらの米国特許第８，４４０，８０３号明細書；Ｓｗａｙｚｅらの米国特許；及びＳｗａｙｚｅらの米国特許第９，００５，９０６号明細書を参照されたい。Ｆ－ＨＮＡは、Ｆ－ＴＨＰ又は３’－フルオロテトラヒドロピランとも称され得る）及び次式を有する追加の修飾ＴＨＰを含むヌクレオシド：

（式中、独立して、前記修飾ＴＨＰヌクレオシドのそれぞれについて：Ｂｘは、核酸塩基部分であり、Ｔ_３及びＴ_４は、それぞれ独立して、修飾ＴＨＰヌクレオシドをポリヌクレオチドの残部に結合させるヌクレオシド間連結基であるか、又はＴ_３及びＴ_４の一方は、修飾ＴＨＰヌクレオシドをポリヌクレオチドの残部に結合させるヌクレオシド間連結基であり、且つＴ_３及びＴ_４の他方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合コンジュゲート基又は５’若しくは３’末端基であり；ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル又は置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニルであり；並びにＲ_１及びＲ_２のそれぞれは、独立して、以下：水素、ハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、ＮＪ_３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２及びＣＮから選択され、式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ_１であり、Ｊ_１、Ｊ_２及びＪ_３は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルである）が挙げられる。

いくつかの実施形態において、修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７は、それぞれＨである。いくつかの実施形態において、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７の少なくとも１つはＨ以外である。いくつかの実施形態において、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７の少なくとも１つはメチルである。いくつかの実施形態において、修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、Ｒ_１及びＲ_２の一方はＦである。いくつかの実施形態において、Ｒ_１はＦであり、且つＲ_２はＨである、いくつかの実施形態において、Ｒ_１はメトキシであり、且つＲ_２はＨである。いくつかのの実施形態において、Ｒ_１はメトキシエトキシであり、且つＲ_２はＨである。

いくつかの実施形態において、糖代替物は、６つ以上の原子及び２つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えば、モルホリノ糖部分を含むヌクレオシド及びポリヌクレオチドにおけるそれらの使用が報告されている（例えば、Ｂｒａａｓｃｈｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３－４５１０及びＳｕｍｍｅｒｔｏｎらの米国特許第５，６９８，６８５号明細書；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎらの米国特許第５，１６６，３１５号明細書；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎらの米国特許第５，１８５，４４４号明細書；及びＳｕｍｍｅｒｔｏｎらの米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照されたい）。本明細書において使用される用語「モルホリノ」は、以下の構造を有する糖代替物を意味する。

いくつかの実施形態において、モルホリノは、例えば、種々の置換基を上記のモルホリノ構造に付加するか、又は上記のモルホリノ構造から変更することによって修飾され得る。そのような糖代替物は、本明細書において、「修飾モルホリノ」と称される。

いくつかの実施形態において、糖代替物は、非環式部分を含む。そのような非環式糖代用物を含むヌクレオシド及びポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチドの例には、それに限らないが、以下が含まれる：ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、非環式ブチル核酸（例えば、Ｋｕｍａｒｅｔａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，１１，５８５３－５８６５を参照されたい）並びにＭａｎｏｈａｒａｎらの国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレットに記載されているヌクレオシド及びポリヌクレオチド。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、それに限らないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、米国特許第５，７１４，３３１号明細書及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書が含まれる。本明細書に適した追加のＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。

特定の実施形態では、糖代用物は、ＵＮＡ（ロックされていない核酸）ヌクレオシドの「ロックされていない」糖構造である。ＵＮＡは、ロックされていない非環式核酸であり、糖の結合のいずれかが除去され、ロックされていない糖代用物を形成する。ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国公開公報には、参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３１４，２２７号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；米国特許出願公開第２０１３／００１１９２２号明細書；及び米国特許出願公開第２０１１／０３１３０２０号明細書が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、糖代用物は、以下に示すＧＮＡ（グリコール核酸）ヌクレオシドに見られるグリセロールであり、

式中、Ｂｘは任意の核酸塩基を表す。

修飾ヌクレオシドに使用することができる多くの他の二環式糖及び三環式糖並びに糖代替物環系は、当技術分野において公知である。

修飾核酸塩基
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上のイノシンヌクレオシド（すなわちヒポキサンチン核酸塩基を含むヌクレオシド）を含む。核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、天然に存在する核酸塩基又は合成非修飾核酸塩基と構造的に識別可能であるが、天然に存在する核酸塩基又は合成非修飾核酸塩基と機能的に交換可能である。天然核酸塩基及び修飾核酸塩基は両方とも、水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性又は他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、修飾、すなわち修飾ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、未修飾核酸塩基を含む１つ以上のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む１つ以上のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオシドと称される、核酸塩基を含まない１つ以上のヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、アルキル又はアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン並びにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリンから選択される。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、２－アミノプロピルアデニン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－Ｎ－メチルグアニン、６－Ｎ－メチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－プロピニル（Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－リボシルウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、８－アザ並びに他の８－置換プリン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－Ｎ－イソブチリルグアニン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、広域塩基、サイズ拡張塩基及びフッ素化塩基から選択される。更なる修飾核酸塩基として、三環式ピリミジン、例えば、１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン、１，３－ジアザフェノチアジン－２－オン及び９－（２－アミノエトキシ）－１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン（Ｇ－クランプ）が挙げられる。また、修飾核酸塩基としては、プリン塩基又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されているもの、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドンを挙げることもできる。更なる核酸塩基としては、Ｍｅｒｉｇａｎらの米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８－８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３，２７３－２８８に開示されているもの；及びＣｈａｐｔｅｒｓ６ａｎｄ１５，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＤｒｕｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｒｏｏｋｅＳ．Ｔ．，Ｅｄ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，２００８，１６３－１６６ａｎｄ４４２－４４３に開示されているものが挙げられる。

上記の修飾核酸塩基の特定のもの及び他の修飾核酸塩基の調製を記載する刊行物としては、限定されるものではないが、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号明細書、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２００３／０１７５９０６号明細書；Ｄｉｎｈらの米国特許第４，８４５，２０５号明細書；Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌらの米国特許第５，１３０，３０２号明細書；Ｒｏｇｅｒｓらの米国特許第５，１３４，０６６号明細書；Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒらの米国特許第５，１７５，２７３号明細書；Ｕｒｄｅａらの米国特許第５，３６７，０６６号明細書；Ｂｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号明細書；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらの米国特許第５，４３４，２５７号明細書；Ｇｍｅｉｎｅｒらの米国特許第５，４５７，１８７号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，４５９，２５５号明細書；Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許第５，４８４，９０８号明細書；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらの米国特許第５，５０２，１７７号明細書；Ｈａｗｋｉｎｓらの米国特許第５，５２５，７１１号明細書；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓらの米国特許第５，５５２，５４０号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，５８７，４６９号明細書；Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許第５，５９４，１２１号明細書；Ｓｗｉｔｚｅｒらの米国特許第５，５９６，０９１号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，６１４，６１７号明細書；Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許第５，６４５，９８５号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，６８１，９４１号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，８１１，５３４号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，７５０，６９２号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，９４８，９０３号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，５８７，４７０号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，４５７，１９１号明細書；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらの米国特許第５，７６３，５８８号明細書；Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許第５，８３０，６５３号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第５，８０８，０２７号明細書；Ｃｏｏｋらの米国特許第６，１６６，１９９号明細書；及びＭａｔｔｅｕｃｃｉらの米国特許第６，００５，０９６号明細書が挙げられる。

いくつかの実施形態では、標的核酸、例えばＰＳＤ３タンパク質をコードする配列を標的とするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの修飾核酸塩基は５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの各シトシンは、５－メチルシトシンである。

糖モチーフ
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、定義されたパターン又は糖モチーフでポリヌクレオチド又はその領域に沿って配置された１つ以上のタイプの修飾糖及び／又は修飾されていない糖部分を含む。いくつかの実施形態では、そのような糖モチーフは、本明細書で論じられる糖修飾のいずれかを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、２つの外部領域、すなわち「ウイング」と、中央又は内部領域、すなわち「ギャップ」とを含むギャップマーモチーフを有する領域を含むか又はそれからなる。ギャップマーモチーフの３つの領域（５’－ウイング、ギャップ及び３’－ウイング）は、ウイングのそれぞれのヌクレオシドの糖部分の少なくとも一部が、ギャップのヌクレオシドの糖部分の少なくとも一部と異なるヌクレオシドの連続配列を形成する。具体的には、ギャップに最も近い各ウイングのヌクレオシド（５’－ウイングの最も３’側のヌクレオシド及び３’－ウイングの最も５’側のヌクレオシド）の少なくとも糖部分は、隣接するギャップヌクレオシドの糖部分と異なるため、ウイングとギャップとの間の境界（すなわちウイング／ギャップ接合部）を定義する。いくつかの実施形態において、ギャップ内の糖部分は、互いに同一である。いくつかの実施形態において、ギャップは、１つ以上のヌクレオシドを含むが、そのヌクレオシドは、ギャップの１つ以上の他のヌクレオシドの糖部分と異なる糖部分を有する。いくつかの実施形態において、２つのウイングの糖モチーフは、互いに同一である（対称ギャップマー）。いくつかの実施形態において、５’－ウイングの糖モチーフは、３’－ウイングの糖モチーフと異なる（非対称ギャップマー）。

いくつかの実施形態において、ギャップマーのウイングは、１～５個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ギャップマーのウイングは、２～５個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ギャップマーのウイングは、３～５個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ギャップマーのヌクレオシドは、全て修飾ヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、ギャップマーのギャップは、７～１２個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ギャップマーのギャップは、７～１０個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ギャップマーのギャップは、８～１０個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ギャップマーのギャップは、１０個のヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、ギャップマーのギャップの各ヌクレオシドは、非修飾２’－デオキシヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、ギャップマーはデオキシギャップマーである。そのような実施形態において、各ウイング／ギャップ接合部のギャップ側のヌクレオシドは、非修飾２’－デオキシヌクレオシドであり、及び各ウイング／ギャップ接合部のウイング側のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。いくつかのそのような実施形態において、ギャップの各ヌクレオシドは、非修飾２’－デオキシヌクレオシドである。いくつかのそのような実施形態において、各ウイングの各ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。

いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、完全に修飾糖モチーフを有し、修飾ポリヌクレオチドの各ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、完全に修飾糖モチーフを有する領域を含むか又はそれからなり、その領域の各ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、完全に修飾糖モチーフを有する領域を含むか又はそれからなり、完全に修飾された領域内の各ヌクレオシドは、本明細書では一様に修飾糖モチーフと称される、同一の修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態において、完全に修飾されたポリヌクレオチドは、一様に修飾されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、均一に修飾されたポリヌクレオチドの各ヌクレオシドは、同じ２’－修飾を含む。

ヌクレオシドモチーフ
核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、天然に存在する核酸塩基又は合成非修飾核酸塩基と構造的に識別可能であるが、天然に存在する核酸塩基又は合成非修飾核酸塩基と機能的に交換可能である。天然核酸塩基及び修飾核酸塩基は両方とも、水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基修飾は、例えば、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、例えば本開示のポリヌクレオチドにヌクレアーゼ安定性、結合親和性又は何らかの他の有益な生物学的特性を付与することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、定義されたパターン又はモチーフでポリヌクレオチド又はその領域に沿って配置された修飾及び／又は非修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、各核酸塩基は、修飾されている。いくつかの実施形態において、核酸塩基はいずれも修飾されていない。いくつかの実施形態において、各プリン又は各ピリミジンが修飾されている。いくつかの実施形態において、各アデニンが修飾されている。いくつかの実施形態において、各グアニンが修飾されている。いくつかの実施形態では、各チミンが修飾されている。いくつかの実施形態において、各ウラシルが修飾されている。いくつかの実施形態において、各シトシンが修飾されている。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドのシトシン核酸塩基の一部又は全てが５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、修飾核酸塩基のブロックを含む。いくつかのそのような実施形態において、ブロックは、ポリヌクレオチドの３’末端に存在する。いくつかの実施形態において、ブロックは、ポリヌクレオチドの３’末端の３ヌクレオシド以内に存在する。いくつかのそのような実施形態において、ブロックは、ポリヌクレオチドの５’末端に存在する。いくつかの実施形態において、ブロックは、ポリヌクレオチドの５’末端の３ヌクレオシド以内に存在する。

いくつかの実施形態において、ギャップマーモチーフを有するポリヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基を含む１個のヌクレオシドは、ギャップマーモチーフを有するポリヌクレオチドの中央のギャップ内に存在する。いくつかのそのような実施形態において、前記ヌクレオシドの糖部分は、２’－デオキシリボシル部分である。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、２－チオピリミジン及び５－プロピンピリミジンから選択される。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、定義されたパターン又はモチーフでポリヌクレオチド又はその領域に沿って配置された修飾及び／又は非修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、それぞれのヌクレオシド間連結基は、本質的にリン酸ヌクレオシド間連結（Ｐ＝Ｏ）である。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結基は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結基は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結及びホスフェートヌクレオシド間連結から独立して選択される。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドの糖モチーフはギャップマーであり、ギャップ内のヌクレオシド間連結は全て修飾されている。いくつかのそのような実施形態において、ウイング内のヌクレオシド間連結の一部又は全てが、非修飾ホスフェート結合である。いくつかの実施形態において、末端のヌクレオシド間連結が修飾されている。

修飾ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、上記修飾（例えば、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間連結）の１つ以上が、修飾ポリヌクレオチドに組み込まれる。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、その修飾、モチーフ及び全長によって特性決定される。いくつかの実施形態において、そのようなパラメータは、それぞれ互いに独立している。したがって、別途指示しない限り、ギャップマー糖モチーフを有するポリヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、修飾又は非修飾であり得、糖修飾のギャップマー修飾パターンに従っても又は従わなくてもよい。例えば、糖ギャップマーのウイング領域内のヌクレオシド間連結は、互いに同じであるか又は異なり得、糖モチーフのギャップ領域のヌクレオシド間連結と同じであるか又は異なり得る。同様に、そのようなギャップマーポリヌクレオチドは、糖修飾のギャップマーパターンから独立した１つ以上の修飾核酸塩基を含み得る。更に、特定の場合、ポリヌクレオチドは、全長又は範囲及び２つ以上の領域（例えば、特定の糖修飾を有するヌクレオシドの領域）の長さ又は長さ範囲によって記載される。そのような実施形態において、特定の範囲外となる全長のポリヌクレオチドをもたらす数を、各範囲に選択することが可能であり得る。そのような実施形態において、両方の要素が満たされる必要がある。例えば、いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドが１５～２０個の結合ヌクレオシドからなり、３つの領域Ａ、Ｂ及びＣからなる糖モチーフを有し、領域Ａは、特定の糖モチーフを有する２～６個の結合ヌクレオシドからなり、領域Ｂは、特定の糖モチーフを有する６～１０個の結合ヌクレオシドからなり、及び領域Ｃは、特定の糖モチーフを有する２～６個の結合ヌクレオシドからなる。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物は、ポリヌクレオチド（修飾又は非修飾）並びに場合により１つ以上のコンジュゲート基及び／又は末端基を含むか又はそれらからなる。コンジュゲート基は、１つ以上のコンジュゲート部分及びコンジュゲート部分をポリヌクレオチドに結合するコンジュゲートリンカーからなる。コンジュゲート基は、ポリヌクレオチドのいずれか若しくは両方の末端及び／又は任意の内部位置に結合され得る。いくつかの実施形態において、コンジュゲート基は、修飾ポリヌクレオチドのヌクレオシドの２’位に結合している。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端に結合しているコンジュゲート基は、末端基である。特定のそのような実施形態において、コンジュゲート基又は末端基は、ポリヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に結合している。特定のこのような実施形態では、コンジュゲート基（又は末端基）は、ポリヌクレオチドの３’末端に結合している。いくつかの実施形態において、コンジュゲート基は、ポリヌクレオチドの３’末端付近に結合している。いくつかの実施形態において、コンジュゲート基（又は末端基）は、ポリヌクレオチドの５’末端に結合している。いくつかの実施形態において、コンジュゲート基は、ポリヌクレオチドの５’末端付近に結合している。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのコンジュゲート／末端基は、キャッピング基、リン酸部分、保護基及び修飾又は非修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、コンジュゲート／末端基には、インターカレーター、レポーター、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、ビタミン、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、ホレート、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、フルオロフォア及び色素が含まれる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのコンジュゲート／末端基は、標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、ポリヌクレオチドの５’末端にある。いくつかの実施形態において、標的化部分は、ポリヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ポリヌクレオチドを特定の細胞内位置及び／又は特定の細胞若しくは組織型に標的化する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、受容体に対するリガンドを含む。いくつかの実施形態では、受容体は細胞及び／又は組織の種類に特異的である。いくつかの実施形態では、受容体による標的化部分（例えば、リガンド）の認識は、標的化部分にコンジュゲートされたポリヌクレオチドのエンドサイトーシスを媒介する。

いくつかの実施形態では、標的化部分は、肝臓細胞（本明細書では肝細胞とも呼ばれる）を標的とする。いくつかの実施形態において、肝細胞はヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、肝細胞は、その細胞表面にアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）を発現する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＡＳＧＰｒのリガンドである。いくつかの実施形態では、標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、１～５個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、１、２、３、４又は５個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、３アンテナ配置の３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む（３アンテナＧａｌＮＡｃ）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの５’に３アンテナＧａｌＮＡｃを含む。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’末端に安定化リン酸基を含む。特定のこのような実施形態では、化合物は、ｓｓＲＮＡｉ化合物であるか、又は化合物は、ｓｉＲＮＡであり、安定化リン酸基を含むポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖である。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’－Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’－ＰＳ_２）、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）又は５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルであり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネートである場合、５’ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわちトランス－ビニルホスフェート）、５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわちシス－ビニルホスフェート）又はそれらの混合物のいずれかであり得る。そのようなリン酸基は、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド又はアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドのいずれかに結合することができるが、特定のＲＮＡｉ化合物の活性を改善することが示されているように、典型的にはアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドに結合する。例えば、Ｐｒａｋａｓｈｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，４３（６）：２９９３－３０１１，２０１５；Ｅｌｋａｙａｍ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，４５（６）：３５２８－３５３６，２０１７；Ｐａｒｍａｒ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１７（１１）９８５－９８９；２０１６；Ｈａｒａｓｔｚｉ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，４５（１３）：７５８１－７５９２，２０１７を参照されたい。特定の実施形態において、リン酸塩安定化基は、５’－シクロプロピルホスホネートである。例えば、国際公開第２０１８／０２７１０６号パンフレットを参照されたい。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全長にわたって標的核酸に相補的である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、標的核酸に対して９９％、９５％、９０％、８５％又は８０％相補的である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全長にわたって標的核酸に少なくとも８０％相補的であり、標的核酸に１００％又は完全に相補的な領域を含む。特定の実施形態において、完全な相補性の領域は、６～２０個、１０～１８個又は１８～２０個の核酸塩基長である。

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、標的核酸に相補的な標的化領域を含む。特定の実施形態において、標的化領域は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２５個又は少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含むか又はそれらからなる。特定の実施形態において、標的化領域は、ポリヌクレオチドのヌクレオシドの７０％、８０％、８５％、９０％、９５％を構成する。特定の実施形態において、標的化領域は、ポリヌクレオチドのヌクレオシドの全てを構成する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの標的化領域は、標的核酸に対して少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％又は８０％相補的である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの標的化領域は標的核酸に１００％相補的である。

特定の実施形態において、ＲＮＡｉ化合物は、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスハイブリダイズ領域を含む。特定の実施形態において、アンチセンスハイブリダイズ領域は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２５個又は少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含むか又はそれらからなる。特定の実施形態では、アンチセンスハイブリダイズ領域は、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドのヌクレオシドの７０％、８０％、８５％、９０％、９５％を構成する。特定の実施形態において、アンチセンスハイブリダイズ領域は、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドのヌクレオシドの全てを構成する。特定の実施形態では、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドのアンチセンスハイブリダイズ領域は、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドに少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％又は８０％相補的である。特定の実施形態では、センスＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンスハイブリダイズ領域は、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドに１００％相補的である。

センスＲＮＡｉポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域は、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖領域を形成する。特定の実施形態において、そのような二重鎖領域は、７個のハイブリダイズしたヌクレオシド対からなる（各対の一方はアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド上にあり、各対の他方はセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド上にある）。特定の実施形態において、二重鎖領域は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２５個又は少なくとも２５個のハイブリダイズした対を含む。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドの各ヌクレオシドは、二重鎖領域で対になる（すなわち、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオシドを有さない）。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドは、３’末端及び／又は５’末端に不対ヌクレオシド（オーバーハングヌクレオシド）を含む。特定の実施形態では、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドの各ヌクレオシドは、二重鎖領域で対になる（すなわち、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオシドを有さない）。特定の実施形態では、センスＲＮＡｉポリヌクレオチドは、３’末端及び／又は５’末端に不対ヌクレオシド（オーバーハングヌクレオシド）を含む。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチド及びセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドによって形成される二重鎖は、一方又は両方の末端にオーバーハングを含まない。オーバーハングのないそのような端部は、平滑と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドがオーバーハングヌクレオシドを有する特定の実施形態では、それらのオーバーハングヌクレオシドの１つ以上が標的核酸に相補的である。アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドがオーバーハングヌクレオシドを有する特定の実施形態では、それらのオーバーハングヌクレオシドの１つ以上が標的核酸に相補的ではない。

追加の化合物
いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療若しくは予防を、それを必要とする対象において行うための又はＰＳＤ３発現の低下のための本開示の化合物は、ｓｉＲＮＡを含む。「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）」、「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）」、「サイレンシングＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、それぞれが約１５～約３０個の連結したヌクレオシドを含む、互いにハイブリダイズした相補的ＲＮＡポリヌクレオチドを含む化合物のクラスである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内においてインビボで作用し、ＲＩＳＣ又はＡｇｏ２を介して少なくとも部分的に作用して、転写後にｍＲＮＡを分解することによって相補的ヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨害し、それによって翻訳を妨げる。例えば、Ｄａｎａｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＢｉｏｍｅｄＳｃｉ１３（２），４８－５７（２０１７）、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄｅｔａｌ．，ＡｎｎＲｅｖＣｈｅｍＢｉｏｍｏｌＥｎｇ２，７７－９６（２０１１）、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ１５，３３１－３４１，（２００５）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＳＤ３タンパク質をコードする核酸とハイブリダイズすることができ、ＰＳＤ３タンパク質の発現を阻害することができる、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＰＳＤ３タンパク質をコードする核酸配列の等しい長さの部分に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＰＳＤ３タンパク質をコードする配列の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号２～１８のいずれか１つの等しい長さの部分に少なくとも少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療若しくは予防を、それを必要とする対象において行うための又はＰＳＤ３発現の低下のための本開示の化合物は、ｍｉＲＮＡを含む。「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節においてインビボで機能する約１５～約３０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡとの相補的配列との塩基対形成を介して機能する。ｍｉＲＮＡの塩基対合の結果として、ｍＲＮＡは、以下のプロセスの１つ以上によって「サイレンシング」される：（１）ｍＲＮＡ鎖の２つの断片への切断；（２）ポリ（Ａ）尾部の短縮によるｍＲＮＡの不安定化；及び（３）ｍＲＮＡの低い翻訳効率。ｍｉＲＮＡは、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡに類似するが、ただし、ｍｉＲＮＡは、一般に、それ自体で折り返されてヘアピン構造を形成するＲＮＡの領域に由来し、一方、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡのより長い領域に由来する。例えば、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ１５，３３１－３４１，（２００５）、ｖａｎＲｏｏｉｊｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１１７，２３６９－２３７６（２００７）及びＭａｃＦａｒｌａｎｅｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＧｅｎｏｍｉｃｓ１１（７），５３７－５６１（２０１０）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＳＤ３タンパク質をコードする核酸とハイブリダイズすることができ、ＰＳＤ３タンパク質の発現を阻害することができる、ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＰＳＤ３タンパク質をコードする核酸配列の等しい長さの部分に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＰＳＤ３タンパク質をコードする配列の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号２～１８のいずれか１つの等しい長さの部分に少なくとも少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。

細胞及び対象
いくつかの実施形態において、本開示の化合物は、対象に投与される。いくつかの実施形態において、本開示の化合物は、細胞及び／又は組織に投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、インビトロで、例えば細胞又は組織培養プレート中で細胞及び／又は組織に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は肝臓細胞、すなわち肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞又は非実質細胞である。

いくつかの実施形態において、化合物は、インビボにおいて、例えば対象において、細胞及び／又は組織に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は動物対象である。いくつかの実施形態では、動物は、動物モデル、例えば疾患モデルである。例えば、対象は、ヒト、ラット、イヌ、マウス、サル、ネコ又はウサギであり得る。

疾患及び状態
いくつかの実施形態では、対象は、脂肪肝疾患のリスクがあるか又は脂肪肝疾患を有する。ＮＡＦＬＤは、著しいアルコール摂取、脂肪合成薬物療法（ｓｔｅａｔｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）又は遺伝性疾患がない状態で、肝臓に５重量％超の脂肪が蓄積されるものとして定義されている（Ｋｏｔｒｏｎｅｎｅｔａｌ，ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００８，２８：２７－３８）。ＮＡＦＬＤは、脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び肝硬変に至る多様な肝疾患を包含する。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、炎症及び肝障害の徴候があるＮＡＦＬＤである。ＮＡＳＨは、大滴性脂肪症、肝細胞の風船様変性及び小葉の炎症性浸潤によって組織学的に定義されている（Ｓａｎｙａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２０１１．４１：６７０－４）。ＮＡＳＨは、一般的な集団の２～３％に影響を及ぼすものと推定されている。肥満症又は糖尿病等の他の症状がある場合、推定罹患率はそれぞれ７％及び６２％に増大する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏｅｔａｌ，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１１．４６（１）：６３－６９）。

脂肪肝疾患は、細胞内脂肪含有量、肝臓重量、肝臓トリグリセリド含有量、血漿循環アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、肝臓コラーゲン１ａ１及び脂質含有量の１つ以上の増加を含み得る。脂肪肝疾患の治療は、臨床開発中の脂肪肝疾患薬、例えば抗ＮＡＳＨ薬により更に複雑化され、心血管疾患の既知の危険因子であるコレステロール、特にＬＤＬコレステロールの増加を引き起こす可能性がある。

いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪肝疾患の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、方法は、対象におけるＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチド、例えば、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療又は予防を必要とする本開示の対象は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（肝硬変及び非肝硬変ＮＡＳＨ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び／又は肝線維症の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療又は予防を必要とする本開示の対象は、アルコール性脂肪肝疾患（ＡＦＬＤ）又はアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）（肝硬変及び非肝硬変ＡＳＨ）を有する。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療又は予防を必要とする本開示の対象は、対象における肝損傷、脂肪症、肝線維症、肝臓の炎症、肝臓の瘢痕化又は肝硬変、肝不全を有する。

いくつかの実施形態において、方法は、対象における細胞内脂肪含有量、肝臓重量、肝臓トリグリセリド含有量、血漿循環アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、肝臓コラーゲン１ａ１及び脂質含有量の１つ以上を減少させる。いくつかの実施形態では、対象のコレステロール及び／又はＬＤＬの量は、化合物の投与後に減少する。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療又は予防を必要とする本開示の対象は、脂質異常症等の心血管疾患を有する。特定の実施形態において、疾患は、混合型脂質異常症である。特定の実施形態において、疾患は、高コレステロール血症である。特定の実施形態において、疾患は、家族性高コレステロール血症である。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象の肝細胞における細胞内脂肪含有量を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドである。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象のコレステロールを低下させる方法を提供し、方法は、対象において、ＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドである。

いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ＰＳＤ３と脂肪肝疾患との間の相関は、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）のＰＳＤ３活性化に関連し得る。ＰＳＤ３は、ＡＲＦ６－ＧＤＰのＡＲＦ－ＧＴＰへの変換を触媒することによってＡＲＦ６と相互作用し、これを活性化すると考えられている。ＡＲＦ６は、細胞内小胞輸送に関与し、脂肪滴形成に関与するＡＲＦ１と相同性を共有し、したがって、ＡＲＦ６は、脂肪滴輸送及び形成に影響を及ぼすことによって肝脂肪含有量に寄与している可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の活性化を低下させる方法を提供し、方法は、対象におけるＰＳＤ３発現を低下させることを含み、対象におけるＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含み、より低いＰＳＤ３発現は、ＡＲＦ６の低下した活性化をもたらす。

亜集団の同定及び治療
いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患の治療を受ける本開示の対象は、ＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｔ対立遺伝子変異体を有さない。本明細書に記載されるように、ＰＳＤ３は、脂肪肝疾患の発生率の低下並びにコレステロール及びＬＤＬコレステロールのレベルの低下をもたらした特定の個体におけるＰＳＤ３Ｌ１８６Ｔ変異体の新規な同定により、脂肪肝疾患の治療又は予防のための潜在的な標的として発見された。本明細書に記載の結果は、この遺伝的変異体が、ＰＳＤ３タンパク質のグアニン交換活性を低下させる機能喪失変異であることを実証している。本明細書に記載される結果は、１８６Ｌ対立遺伝子の存在が肝疾患を引き起こすことも実証する。したがって、本明細書に記載されるデータは、ＰＳＤ３下方制御がＮＡＦＬＤに対する保護を付与し得ることを示唆する。

ＰＳＤ３対立遺伝子変異体（すなわち１８６Ｔ及び１８６Ｌ）は、ＰＳＤ３減少療法に適している、脂肪肝疾患を有する対象の亜集団を区別するための有用な方法を提供し得る。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＳＤ３減少療法に適している、脂肪肝疾患を有する対象の亜集団を同定する方法を提供し、方法は、（ａ）対象が脂肪肝疾患を有するかどうかを診断することと、（ｂ）対象がＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｔ対立遺伝子変異体又はＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有するかどうかを判定することとを含み、対象がＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する場合、適切な治療は、ＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含み、対象がＰＳＤ３の１８６Ｔ対立遺伝子変異体を有する場合、治療は、適切ではないＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含まない。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、１８６Ｌ対立遺伝子変異体の遺伝子型決定又は１８６Ｌ対立遺伝子変異体との強い連鎖不平衡にある遺伝子変異体の遺伝子型決定からの推論によって決定され得る。

いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪肝疾患を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、（ａ）対象がＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｔ対立遺伝子変異体又はＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有するかどうかを判定することと、（ｂ）対象がＰＳＤ３の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する場合にのみ、ＰＳＤ３の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することとを含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）は、１８６Ｌ対立遺伝子変異体の遺伝子型決定又は１８６Ｌ対立遺伝子変異体との強い連鎖不平衡にある遺伝子変異体の遺伝子型決定からの推論によって決定され得る。

予防
いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪肝疾患の予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、対象におけるプレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。本明細書で使用される「予防すること」又は「予防する」という用語は、脂肪肝疾患を発症するリスクがより高い対象の可能性を統計的に改善することである。したがって、ＰＳＤ３発現を低下させるのに有効な化合物の投与を、脂肪肝疾患の発症前に対象に提供することができる。いくつかの実施形態では、脂肪肝疾患を発症するリスクがより高い対象は、ＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を対象に投与することを含む、ＰＳＤ３の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する対象における脂肪肝疾患を予防することに関する。

本明細書に引用される全ての参考文献、例えば特許、特許出願、論文、教科書等及びこれらに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

非限定的な開示及び参照による組込み
本明細書に記載される特定の化合物、組成物及び方法を、特定の実施形態に従って特性と共に説明してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載される化合物を説明する役割を果たすものに過ぎず、これを限定することを意図するものではない。本出願に記載される参考文献、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号等の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願に付随する配列表は、必要に応じて、「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」のいずれかとして各配列を特定するが、実際には、これらの配列は、化学修飾のあらゆる組合せにより修飾され得る。当業者であれば、修飾オリゴヌクレオチドを記述する「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」のような指定が、場合によっては、恣意的であることを容易に認識するであろう。例えば、２’－ＯＨ糖部分及びチミン塩基を含むヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ（ＤＮＡの１つの２’－Ｈの代わりに２’－ＯＨ）又は修飾塩基を有するＲＮＡ（ＲＮＡのウラシルの代わりにチミン（メチル化ウラシル））として記述され得る。したがって、限定されるものではないが、配列表に含まれるものが挙げられる、本明細書で提供される核酸配列は、天然の又は修飾されたＲＮＡ及び／又はＤＮＡのあらゆる組合せを含有する、限定されるものではないが、修飾核酸塩基を有するような核酸が挙げられる核酸を包含することが意図される。更なる例としては、限定されるものではないが、核酸塩基配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するポリヌクレオチドは、修飾されているか非修飾であるかに関わらず、そのような核酸塩基配列を有するあらゆる化合物を包含し、限定されるものではないが、ＲＮＡ塩基を含むそのような化合物、例えば、配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、いくつかのＤＮＡ塩基及びいくつかのＲＮＡ塩基、例えば「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」を有するもの並びに他の修飾核酸塩基、例えば「ＡＴ^ｍＣＧＡＵＣＧ」（^ｍＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す）を有する化合物が挙げられる。

本明細書に記載される特定の化合物（例えば、修飾オリゴヌクレオチド）は、１つ以上の不斉中心を有し、これにより絶対立体化学の点から（Ｒ）若しくは（Ｓ）、例えば糖アノマー等ではα若しくはβとして又はアミノ酸等では（Ｄ）若しくは（Ｌ）等として定義され得るエナンチオマー、ジアステレオマー及び他の立体異性配置が生じる。特定の立体異性配置を有するものとして描写又は記載される、本明細書で提供される化合物は、指示された化合物のみを含む。立体化学が定義されずに描写又は記載される、本明細書で提供される化合物は、特に明記されない限り、そのステレオランダムな形態及び光学的に純粋な形態を含む、そのような考えられる異性体の全てを含む。同様に、本明細書における化合物の互変異性型も別段示されない限り含まれる。別段示されない限り、本明細書に記載される化合物は、対応する塩形態を含むことが意図される。

本明細書に記載される化合物は、１つ以上の原子が、示される元素の非放射性同位体又は放射性同位体で置換されているバリエーションを含む。例えば、水素原子を含む本明細書における化合物は、^１Ｈ水素原子の各々に対して、考えられる全ての重水素置換を包含する。本明細書における化合物によって包含される同位体置換として、限定されないが、^１Ｈの代わりに^２Ｈ又は^３Ｈ、^１２Ｃの代わりに^１３Ｃ又は^１４Ｃ、^１４Ｎの代わりに^１５Ｎ、^１６Ｏの代わりに^１７Ｏ又は^１８Ｏ及び^３２Ｓの代わりに^３３Ｓ、^３４Ｓ、^３５Ｓ又は^３６Ｓが挙げられる。特定の実施形態において、非放射性同位体置換は、治療又は研究ツールとしての使用に有益なオリゴマー化合物に対して、新たな特性を付与し得る。特定の実施形態において、放射性同位体置換は、化合物を、研究又は診断目的、例えばイメージングに適したものとし得る。

実施例１－ＰＳＤ３配列変異及びＦＬＤとの会合
発見段階では、ゲノム全体で有意なレベルで主にトリグリセリド（ｎ＝２４）又は二次形質（ｎ＝８）として以前に関連していた３２の遺伝子タグ付け一塩基多型（ＳＮＰ）を選択した（Ｔｅｓｌｏｖｉｃｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４６６，７０７－７１３，２０１０）（図１）。次に、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＥｘｏｍｅＢｅａｄチップ（入手可能な場合にはタグ付けＳＮＰを含む）上にある選択された遺伝子座の５０ｋｂ以内の全てのミスセンス変異体及びナンセンス変異体を、ＤａｌｌａｓＨｅａｒｔＳｔｕｄｙ（ＤＨＳ）において肝脂肪含有量との関連性について試験した（図２）。タグ付けＳＮＰが遺伝子間である場合、タグ付けＳＮＰに隣接する両方の遺伝子上の変異体を分析した。

試験コホート
ＤａｌｌａｓＨｅａｒｔＳｔｕｄｙ（ＤＨＳ）－ＤａｌｌａｓＨｅａｒｔＳｔｕｄｙ（ＤＨＳ）は、ダラス郡の住民の多民族集団ベースのサンプルである。研究デザイン及び採用手順は、Ｖｉｃｔｏｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔａｌ．に以前に記載されている。ＤａｌｌａｓＨｅａｒｔＳｔｕｄｙ：心血管の健康状態における民族差の集学的研究のための集団ベースの確率サンプル（ＡｍＪＣａｒｄｉｏｌ９３，１４７３－１４８０（２００４））。手短に言えば、元のコホートを２０００～２００２年の間に登録し、全ての参加者及びその配偶者又は重要な他者を２００７～２００９年の反復評価（ＤＨＳ－２）のために招待した。登録時に、全ての参加者が詳細な調査を完了し、血圧の測定、人体測定、血液及び尿サンプル採取並びにイメージング検査を含む臨床検査を受けた。民族性は自己報告された。Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４０，１３８７－１３９５（２００４）及びＳｚｃｚｅｐａｎｉａｋ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２７６，Ｅ９７７－９８９（１９９９）に以前記載されたように、ｎ＝２７３６名の参加者においてプロトン磁気共鳴分光法（１Ｈ－ＭＲＳ）を用いて肝トリグリセリド含有量を測定した。本研究では、全ての分析は横断的データに基づいた。大量飲酒の有病率が低い（＞３０ｇ／日）ことを考慮すると、アルコール摂取に基づいて対象を除外しなかった。この研究は、ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒによって承認され、全ての個人が書面によるインフォームドコンセントを提供した。

肝生検コホート（ＬＢＣ）－肝生検コホート（ＬＢＣ）は、ＮＡＳＨ又は重度の肥満の疑いで肝生検を受け、３つの欧州センターに連続して登録されている欧州家系の個体の横断的研究である。この研究は、Ｄｏｎｇｉｏｖａｎｎｉ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ６１，５０６－５１４（２０１５）及びＭａｎｃｉｎａ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０１６）に以前に記載されている。本研究では、ＰＳＤ３遺伝子型及び肝臓組織学の両方について利用可能な完全なデータを有する個体のみを含めた。これらには、４番目の独立したフィンランドセンターからの合計３２３人の個体が含まれている。本研究では、４つの異なる欧州センターからの１９５１人の個体が含まれている：１，０２２名（５２％）がミラノ（ｔｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅｓｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓｅｒｖｉｃｅａｎｄｆｒｏｍｔｈｅＦｏｎｄａｚｉｏｎｅＩＲＣＣＳＣａ’ＧｒａｎｄａＯｓｐｅｄａｌｅＰｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏＭｉｌａｎｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）（Ｖａｌｅｎｔｉ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，ＪＨｅｐａｔｏｌ５５，１４０９－１４１４（２０１１）を参照されたい）からであり、３７４名（１９％）がイタリアのパレルモのＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ＆ＬｉｖｅｒＵｎｉｔｏｆｔｈｅＰａｌｅｒｍｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ（Ｐｅｔｔａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ９，ｅ８７５２３（２０１４）を参照されたい）からであり、４１０名（２１％）がフィンランドのクオピオにあるＮｏｒｔｈｅｒｎＳａｖｏＨｏｓｐｉｔａｌＤｉｓｔｒｉｃｔ（Ｓｉｍｏｎｅｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５８，９７６－９８２（２０１３）を参照されたい）からであり、１４５名（７％）がフィンランドのヘルシンキとウシマーの病院地区（Ｓｉｍｏｎｅｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＪＨｅｐａｔｏｌ６４，１１６７－１１７５（２０１６）を参照されたい）からであった。アルコール摂取の増加（男性、＞３０ｇ／日；女性、＞２０ｇ／日）、ウイルス性及び自己免疫性の肝炎又は肝疾患の他の原因を有する個体を除外した。ＮＡＳＨの診断は、小葉壊死－炎症及び風船様変性又は線維症を伴う脂肪症の存在に基づいた。疾患活動性を、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）に従って評価した。Ｋｌｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔａｌ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４１，１３１３－１３２１（２００５）に記載のＮＡＦＬＤ臨床調査ネットワークの推奨に従って、線維症を分類した。肝臓生検のスコアリングは、患者の状態及び遺伝子型を知らない独立した病理学者が行った。この試験は、ＦｏｎｄａｚｉｏｎｅＩＲＣＣＳＣａ’Ｇｒａｎｄａ（ミラノ）、ＰａｌｅｒｍｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ（パレルモ）及びＮｏｒｔｈｅｒｎＳａｖｏＨｏｓｐｉｔａｌＤｉｓｔｒｉｃｔｉｎＫｕｏｐｉｏ（フィンランド）並びにＨｏｓｐｉｔａｌＤｉｓｔｒｉｃｔｏｆＨｅｌｓｉｎｋｉａｎｄＵｕｓｉｍａａ（フィンランド）の倫理委員会によって承認された。

ＵＫＢｉｏｂａｎｋコホート－ＵＫＢｉｏｂａｎｋは、２００６～２０１４年に英国全体で２２の採用センターを訪問した５００，０００人を超える成人（採用時年齢４０～６９歳）を含む大規模コホート研究である。本研究で使用した表現型データ及び遺伝子型データの両方は、申請番号３７１４２でＵＫＢｉｏｂａｎｋから得た。分析は、ヨーロッパ系のＵＫＢｉｏｂａｎｋ参加者のサブセットに限定された（最初の２つの遺伝的主成分に基づいて外れ値を除去した後、「英国人」、「アイルランド人」又は「白人」として自己報告によって定義される）。（１）過度の血縁者（１０人を超える推定上の第三級血縁者）；（２）自己報告された性別と遺伝的に推測された性別との間の不一致；又は（３）推定上の性染色体異数性及び（４）Ｃａｎｅｌａ－Ｘａｎｄｒｉｅｔａｌ（Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ５０，１５９３－１５９９（２０１８））及びＣｒａｗｆｏｒｄｅｔａｌ（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５６，１３１－１３８（２０１９））のヘテロ接合性及びミスシングリネスに基づいて、ＵＫＢｉｏｂａｎｋによって外れ値として同定された者を有する個体を除外した。２つの非常に類似したＵＫＢｉＬＥＶＥ又はＵＫＢｉｏｂａｎｋＡｘｉｏｍアレイ（＞９５％の重複）を使用して、ＵＫＢｉｏｂａｎｋ参加者の遺伝子型を特定した。次いで、１０００ＧｅｎｏｍｅｓＰｈａｓｅ３、ＵＫ１０Ｋハプロタイプ及びＨａｐｌｏｔｙｐｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＨＲＣ）の参照パネル（Ｃ．Ｂｙｃｒｏｆｔｅｔａｌ．，ＴｈｅＵＫＢｉｏｂａｎｋｒｅｓｏｕｒｃｅｗｉｔｈｄｅｅｐｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｄａｔａ．Ｎａｔｕｒｅ５６２，２０３－２０９（２０１８）を参照されたい）に基づいて、遺伝子型データを帰属した。ｒｓ７１５１９９３４ジヌクレオチド変化の遺伝子型データは、ＵＫＢｉｏｂａｎｋでは入手できなかった；ｒｓ７００３０６０（ｒｓ７１５１９９３４の最初のヌクレオチド変化を同定する）は、直接遺伝子型決定された変異体の中にあり、代わりに使用された。肝臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）由来のプロトン密度脂肪分率（ＰＤＦＦ）データ（データフィールド２２４３６）を使用し、６分間のデュアルエコーＤｉｘｏｎＶｉｂｅプロトコルを使用してＳｉｅｍｅｎｓＭＡＧＮＥＴＯＭＡｅｒａ１．５－ＴＭＲＩスキャナで参加者をスキャンし、単一のマルチエコースライスを更に取得して肝臓ＰＤＦＦを分析した。ＵＫＢｉｏｂａｎｋ研究は、ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＥｔｈｉｃｓＳｅｒｖｉｃｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅＮｏｒｔｈＷｅｓｔＭｕｌｔｉ－ＣｅｎｔｒｅＨａｙｄｏｃｋ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ１６／ＮＷ／０２７４）から倫理的承認を受けた。

独立した複製ＥＵコホート－経皮的又は外科的肝生検を受けた、オーストリア（ｎ＝８３）、ドイツ（ｎ＝５５９）及びスイス（ｎ＝３２）の三次照会センターからのＢＭＩ≧３０Ｋｇ／ｍ^２の合計６７４人の成人コーカサス人ＮＡＦＬＤ個体（平均年齢４５±１２歳）が含まれた（Ｖ．Ｒ．Ｔｈａｎｇａｐａｎｄｉｅｔａｌ．，Ｇｕｔ，（２０２０）を参照されたい）。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）によって定義した。線維症の存在をクライナー分類（Ｄ．Ｅ．Ｋｌｅｉｎｅｒｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４１，１３１３－１３２１（２００５））に従って組織学的に評価した。全ての患者において、慢性肝疾患の感染性（例えば、ウイルス性肝炎、ＨＩＶ）、免疫学的、薬物誘発性脂肪肝（例えば、アミオダロン、メトトレキサート、ステロイド、バルプロ酸等）又は遺伝的原因（遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病）は、許容される手段によって除外された。自己報告によって評価されるように、平均アルコール摂取量が３０ｇ／日（男性）又は２０ｇ／日（女性）を超える対象は含まなかった。肝臓生検を、２人の経験豊富な組織病理学者が盲検様式で読み取った。全ての患者は、肝生検及び遺伝子検査のために書面によるインフォームドコンセントを提出した。

統計分析－ＤＨＳについて、年齢、性別及び祖先の４つの主要主成分について調整した線形回帰分析を使用して、肝脂肪含有量と標的変異体との間の関連のＰ値を計算した。全ての分析において、付加的遺伝モデルを使用した。ＬＢＣ及び独立複製ＥＵコホートについては、ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４変異体と肝疾患との間の関連性を、年齢、性別、肥満度指数（ＢＭＩ）、採用センター及びＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍ変異対立遺伝子の数について調整したバイナリーロジスティック（肝疾患の有病率）又は順序回帰（肝臓組織学的特徴）分析による付加的遺伝モデル下で評価した。ＵＫＢｉｏｂａｎｋの場合、肝臓ＰＤＦＦを最初にランクベースの逆正規変換し、次いで、年齢、性別、ＢＭＩ、最初の１０のゲノム主成分及び付加的遺伝モデルのもとでのアレイタイプについて調整された線形回帰を使用して、ＰＳＤ３ｒｓ７００３０６０との関連を調べた。記述統計学のために、データは、必要に応じて平均及び標準偏差又は中央値及び四分位範囲として示される。カテゴリ的形質は、数及び割合として示されている。連続形質については、年齢、性別及びＢＭＩについて調整されていないか又は調整された付加的遺伝モデル下で線形回帰によってＰ値を計算した。モデルに入る前に、非正規分布形質を対数変換した。カテゴリ的形質については、カイ二乗検定又は年齢、性別及びＢＭＩについて調整した二項ロジスティック回帰によってＰ値を計算した。ヒト組織における発現レベルの差を、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定（健康な個体とＦＬＤを有する個体との比較のため）又は線形回帰分析（遺伝子型間の比較のため）によって評価した。組織学的コホートのメタ分析のために、２つの研究（肝生検コホート及び中央ヨーロッパ複製コホート）の逆分散メタ分析を、Ｒバージョン３．６．１の固定効果モデル及びランダム効果モデルを有するパッケージ「メタ」を使用して行った。インビボ及びインビトロ研究については、データを平均及び標準偏差として示す。Ｐ値は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定（インビトロ）又は多重比較のためのダンの補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定（インビボ）によって計算した。

遺伝子型決定及び検証
遺伝子型決定－ＤＨＳからの全ての参加者は、Ｊ．Ｋｏｚｌｉｔｉｎａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ４６，３５２－３５６（２０１４）及びＳ．Ｒｏｍｅｏｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ４０，１４６１－１４６５（２００８）に記載されているように、ＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｆｉｎｉｕｍＨｕｍａｎＥｘｏｍｅＢｅａｄＣｈｉｐを使用して変異体について以前に遺伝子型決定された。ＬＢＣ及び独立複製ＥＵコホートからの参加者を、ＴａｑＭａｎ５’ヌクレアーゼアッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって遺伝子型決定した。ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４に対する対立遺伝子識別プローブは市販されていなかった。この変異体のカスタムアッセイを以下のように設計した。
コンテキスト配列：

フォワードプライマー：ＣＧＴＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡ（配列番号２２）
リバースプライマー：ＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴ（配列番号２３）
レポーター１（ＶＩＣ）配列：

レポーター２（ＦＡＭ）配列：

ヒト肝臓生検における遺伝子発現分析－ヒト肝臓生検について、ＦＬＤ対非ＦＬＤにおける異なるＰＳＤ３アイソフォーム並びにＰＳＤ３及びＮＡＴ２のｍＲＮＡ発現を、ＬＢＣのＭｉｌａｎサブセットからの７７名の参加者において測定した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ４０００プラットフォーム（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ，ＨｏｎｇＫｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を用いてＲＮＡ配列決定を行い、ＲＮＡリードをヒトゲノムに対してマッピングし、ＲＳＥＭソフトウェアを用いて遺伝子リード数（Ｅｎｓｅｍｂｌヒト転写物参照アセンブリ、バージョン７５）を決定した。遺伝子発現を定量するために、遺伝子カウント当たりのＲＳＥＭデータを、ＤＥＳｅｑ２パッケージを使用して正規化した。各患者からインフォームドコンセントを得、試験プロトコルをＦｏｎｄａｚｉｏｎｅＩＲＣＣＳＣａ’Ｇｒａｎｄａ，Ｍｉｌａｎの倫理委員会によって承認し、１９７５年ヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに準拠させた。

不死化細胞における遺伝子発現分析－ＲＮＡをＲＮｅａｓｙＰｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の説明書に従って使用して逆転写した。遺伝子発現を、ＴａｑＭａｎプローブ及びマスターミックス（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者のプロトコルに従って使用するリアルタイムｑＰＣＲによって評価した。全ての反応を３連で行った。２^{－ΔΔＣｔ}法を用いてデータを分析した。

マウスにおける遺伝子発現－肝臓ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製し、定量的ＰＣＲ分析に供した。リアルタイム蛍光ＲＴ－ＰＣＲ検出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用するＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲＴ－ＰＣＲシステムを使用して、ＲＮＡ発現を定量した。プライマープローブセットＭｍ０１３５１０９９＿ｍ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてＰＳＤ３ｍＲＮＡを定量した。ＲＮＡ転写物レベルを、Ｑｕａｎｔ－ｉＴＲｉｂｏＧｒｅｅｎＲＮＡ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して総ＲＮＡレベルに対して正規化した。脂質生成遺伝子発現のために、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマウス肝臓から全ＲＮＡを単離した。各サンプルについて１００ｎｇの総ＲＮＡを使用して、ＱｕａｎｔｓｅｑＫｉｔ３’ｍＲＮＡキット（Ｌｅｘｏｇｅｎ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して３’末端ＲＮＡｓｅｑライブラリーを作製した。これらのライブラリーをプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ５００配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で、サンプル当たり５０ｂｐのリード長及び３～５００万リードの深さまで配列決定した。擬似マッピングに基づく定量化モード及び自動化されたリブタイプ検出（Ｐａｔｒｏ，Ｒ．，Ｄｕｇｇａｌ，Ｇ．，Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｉｒｉｚａｒｒｙ，Ｒ．Ａ．，＆Ｋｉｎｇｓｆｏｒｄ，Ｃ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ１４，４１７－４１９（２０１７））を使用して、Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．７．１）を使用して、リードを遺伝子モデルにマッピングした。Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．７．１）は、転写物発現の迅速でバイアスを認識した定量化を提供し、遺伝子関連リードをサンプル当たりの全マッピングされたリードで正規化することにより、１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）として遺伝子存在量が報告された。

細胞培養－基礎条件では、ラット肝細胞癌ＭｃＡｒｄｌｅ（ＭｃＡ）－ＲＨ７７７７細胞（ヒトＮＰ＿０５６１２５．３とラットＸＰ＿０１７４５５９０８．１とのアラインメントによるヒトＰＳＤ３の１８６Ｔに対応する１８０Ｔのホモ接合体）をＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中で培養し、ヒト肝細胞Ｈｕｈ７（ＰＳＤ３Ｌ１８６Ｌ）を日本のＪＣＲＢ細胞バンクから購入し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（低グルコース）中で培養した。実験条件では、播種後２４時間で、細胞をスクランブル又はＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ（それぞれＭｃＡ－ＲＨ７７７７及びＨｕｈ７細胞のラット又はヒト遺伝子に対して）でトランスフェクトし、ＦＢＳを含まない通常培地＋異なる補助培地で増殖させた。３つのヒトｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号４３９２４２０）の混合物を使用した。ヒトＰＳＤ３ｓｉＲＮＡを以下の表１に更に記載する。

ラットｓｉＲＮＡの場合、３ｓｉＲＮＡの混合物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号４３９０７７１）を使用した。ラットＰＳＤ３ｓｉＲＮＡを以下の表２に更に記載する。

細胞内脂肪含有量の定量化－細胞内中性脂肪含有量をオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色によって可視化した。画像は、ＡｘｉｏＫＳ４００ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．８ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して１００倍の倍率で取得した。ＯＲＯ染色領域は、例えば、Ｐ．Ｐｉｎｇｉｔｏｒｅｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２５，５２１２－５２２２（２０１６）に以前に記載されたように、ＢｉｏＰｉｘによって定量化した。染色前に、ＭｃＡ－ＲＨ７７７７及びＨｕｈ７細胞をスクランブル又はＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ（それぞれラット又はヒトＲＮＡに対して）でトランスフェクトし、５０μＭ（ＭｃＡ－ＲＨ７７７７）及び２５μＭ（Ｈｕｈ７）オレイン酸（ＯＡ）を補充したＦＢＳ非含有通常培地中で４８時間増殖させた。

デノボトリグリセリド合成－ＭｃＡ－ＲＨ７７７７及びＨｕｈ７細胞を６ウェルプレートに三重に播種した。播種の２４時間後、細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で４８時間、ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ又はスクランブル（Ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、ＦＢＳなし＋５μＣｉ／ｍｌ ^３Ｈ－グリセロール（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）＋５０μＭオレイン酸（及びＨｕｈ７について２５μＭオレイン酸）を含むＤＭＥＭと共に１５、３０又は６０分間インキュベートした。細胞溶解物を回収し、脂質をクロロホルム：メタノール（２：１）で、フォルチ抽出手順によって抽出した。有機相を乾燥させ、メタノール中で再可溶化し、スズ層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離した。トリグリセリドに対応するスポットをヨウ素蒸気で可視化し、シンチレーション流体を含むバイアルに添加した。放射活性を、シンチレーションカウンターにより、崩壊／分（ＤＰＭ）として測定した。

アポリポタンパク質ｂ分泌－ＭｃＡ－ＲＨ７７７７細胞をＴ－２５フラスコ中で成長させ、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ又はＳｃｒｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をメチオニン及びシステインを含まないＤＭＥＭと共に２時間インキュベートし、続いて０．０５ｍＣｉ／ｍＬ ^３５ＳＭｅｔ／Ｃｙｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）＋５０μＭＯＡで更に２時間処理した。次いで、細胞を、過剰の冷Ｌ－メチオニン及びＬ－システイン（最終濃度１０ｍＭ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭから構成される追跡培地と共に５、１５、３０又は６０分間インキュベートし、その後、培地及び溶解物を回収した。次いで、Ａｐｏ－ｂを、Ａｐｏ－ｂ抗体により被覆されるアガロースビーズ（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して免疫沈降させた。サンプルを、ベータメルカプトエタノールを含有する６０μｌＳＤＳＰＡＧＥサンプル緩衝液中で５分間沸騰させることによってビーズから溶出し、続いて３～８％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。次いで、ゲルを乾燥させ、一晩ＢＡＳ－ＭＳフィルム上に曝露し、ホスホイメージャ（ＦｕｊｉｆｉｌｍＦＬＡ－３０００、東京、日本）で可視化した。

β酸化－ＭｃＡ－ＲＨ７７７７細胞を６ウェルプレートにおいて３連で増殖させ、ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ又はＳｃｒｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中の８．５μＣｉ ^３Ｈ－パルミチン酸＋５５μｍｏｌ／Ｌパルミチン酸と共に２時間インキュベートした。次いで、培地５００μｌを回収し、標識パルミテートを、５０μｌの２０％ＢＳＡ及び２７μｌの７０％過塩素酸を添加することによって沈殿させた。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収し、２０％ＢＳＡの第２の一定分量を添加した。これを合計３回繰り返した。次いで、最終上清を、シンチレーション液を含むバイアルに添加した。放射活性を、シンチレーションカウンターにより、崩壊／分（ＤＰＭ）として測定した。

結果－年齢、性別及び祖先の上位４つの主要成分について調整した付加的遺伝モデル下で線形回帰分析を使用することにより、３つの遺伝子の合計３つのミスセンス変異体がヨーロッパ系（マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）＞５％、１０００ゲノムプロジェクトより、ｄｂＳＮＰＣｕｒｒｅｎｔＢｕｉｌｄ１５４、２０２０年４月２１日公開）で同定され、ＤＨＳの肝脂肪含有量と名目上関連していた（Ｐ＜０．０５０）（図２）。これらの変異体の中で、ＴＭ６ＳＦ２（ｒｓ５８５４２９２６；Ｐ＝５．７×１０^－８）及びＧＣＫＲ（ｒｓ１２６０３２６；Ｐ＝０．００７）は、脂肪肝疾患に関連し、ＤＨＳの肝脂肪含有量の増加に関連する循環トリグリセリドに関連する２つの周知の遺伝的変異体である（例えば、Ｅ．Ｋ．Ｓｐｅｌｉｏｔｅｓｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．７，ｅ１００１３２４（２０１１）を参照されたい）。ＰＳＤ３遺伝子の変異体であるｒｓ７１５１９９３４もより低い肝脂肪含有量に関連することが見出された（Ｐ＝０．０４９）。臨床的、人体測定的、リポタンパク質及び肝脂肪含有量の差も、ヨーロッパ系アメリカ人においてＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４遺伝子型について循環総コレステロールレベルの減少が観察された民族群（図１７）によって層別化した。

変異体ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４をＬＢＣ（利用可能な肝生検でＦＬＤのリスクが高いｎ＝１，９５１のヨーロッパ系を含む）で調べて、ＦＬＤに対する保護との関連性を同定した（図３）。ＬＢＣでは、ＰＳＤ３ｒｓ７１５１９９３４マイナー対立遺伝子（１８６Ｔ）は、年齢、性別、ＢＭＩ、採用センター及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９について調整した付加的遺伝モデル下でバイナリーロジスティック回帰分析を使用することにより、脂肪肝（Ｐ＝５．９×１０^－６）、線維症（Ｐ＝０．００６）、炎症（Ｐ＝９．９×１０^－７）及び風船様変性（Ｐ＝０．００２）（図４）のより低い有病率と関連していた。

更に、１８６Ｔマイナー対立遺伝子のキャリアを、付加的遺伝モデルのもとでの順序回帰分析を使用することにより、より重篤な脂肪肝（Ｐ＝３．３×１０^－７）、炎症（Ｐ＝１．６×１０^－７）、風船様変性（Ｐ＝０．００１）及び線維症（Ｐ＝０．００１）（図５Ａ）から保護し、年齢、性別、ＢＭＩ、採用センター及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９について調整した。これらの結果は、ＦＬＤに影響を及ぼす他の遺伝的変数（ＴＭ６ＳＦ２ｒｓ５８５４２９２６［Ｅ１６７Ｋ］、ＭＢＯＡＴ７ｒｓ６４１７３８及びＧＣＫＲｒｓ１２６０３２６［Ｌ４４６Ｐ］）及び環境的変数（糖尿病及びコレステロール治療の存在）について更に調整した場合、実質的に同一であった（図１６）。更に、ＰＳＤ３１８６Ｔマイナー対立遺伝子のキャリアは、より低い総循環及び低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルを有していた（それぞれＰ＝１．４×１０^－６及びＰ＝０．００１）（図７）。ＦＬＤに対する保護をもたらすＨＳＤ１７Ｂ１３の遺伝的変異体は、ＰＮＰＬＡ３変異体と相互作用することが示され、ＰＮＰＬＡ３有害対立遺伝子のキャリアは、ＨＳＤ１７Ｂ１３保護変異体の保有からより多くの利益を得る（例えば、Ｈ．Ｇｅｌｌｅｒｔ－Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（２０２０）を参照されたい）。したがって、ＬＢＣにおけるＰＳＤ３変異体とＰＮＰＬＡ３変異体との間の相互作用を試験したが、肝疾患におけるこれらの２つの遺伝的変異体の間で相互作用は同定されなかった。

磁気共鳴画像法由来のプロトン密度脂肪分率（ＰＤＦＦ）による肝脂肪含有量の測定を用いたＵＫＢｉｏｂａｎｋの英国系白人参加者（ｎ＝１０，９７０）におけるＰＳＤ３変異体の効果を、肝脂肪含有量とのＰＳＤ３変異体の関連を理解するために行った。ｒｓ７１５１９９３４ジヌクレオチド置換に関する遺伝データは入手できなかったため、ｒｓ７００３０６０を分析した（ヨーロッパ系においてｒｓ７１５１９９３４と完全な連鎖不平衡（Ｄ’＝１、ｒ^２＝１）にある）。ＵＫＢｉｏｂａｎｋでは、ＰＳＤ３マイナー対立遺伝子と肝脂肪含有量の低下との間に関連性は見られなかった。しかしながら、ＦＬＤに影響を及ぼす遺伝的変異は、それらの効果を増幅する過剰な体重との強い遺伝子－環境相互作用を有するため（例えば、Ｓ．Ｓｔｅｎｄｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＧｅｎｅｔ４９，８４２－８４７（２０１７）を参照されたい）、年齢、性別、ＢＭＩ、最初の１０のゲノム主成分に対して調整された線形回帰分析にＢＭＩ×ｒｓ７００３０６０相互作用項を含めることにより、（ＰＤＦＦによって測定された）肝脂肪含有量に対するＰＳＤ３ｒｓ７００３０６０とＢＭＩとの間の相互作用をＵＫＢｉｏｂａｎｋで分析した。この変異体はＢＭＩと相互作用し（Ｐ＝０．０４６）、より高いＢＭＩが、脂肪肝に対するｒｓ７００３０６０変異体の保護効果を明らかにすることが見出された。ＢＭＩによって測定された過体重／肥満の重症度について層別化した後のＰＳＤ３ｒｓ７００３０６０遺伝子型間の肝脂肪含有量の差は、ＰＳＤ３マイナー対立遺伝子の重度肥満（ＢＭＩ＞３５）キャリアがより低い肝脂肪含有量（β＝－０．１７５、Ｐ＝０．０２）を有することを示した（図１８）。

ＬＢＣにおけるＰＳＤ３遺伝子型とＢＭＩとの間の相互作用を、独立複製ＥＵコホートにおいて個体におけるＰＳＤ３変異体と肝疾患に対する保護との間の関連性を試験することによって更に検証した。ＰＳＤ３マイナー対立遺伝子は、脂肪肝（Ｐ＝０．０２４）、線維症（Ｐ＝０．０４９）及び風船様変性（Ｐ＝０．０４７）のより低い有病率と関連し、より重症でない線維症及び風船様変性（それぞれＰ＝０．０４０及びＰ＝０．０４８と関連することが分かった（図６）。ＰＳＤ３遺伝子型によって層別化されたこのコホートでは、臨床的又は代謝的形質の差は検出されなかった（図７）。肝生検が利用可能な２つのコホート、すなわちＬＢＣ及び独立複製ＥＵコホートのメタ分析を行った。固定効果モデル及びランダム効果モデルの両方において、遺伝的関連は、関連がランダム効果モデルを使用することによって減弱された炎症の存在及び重症度を除いて、試験した全ての形質についてより強かった（図８Ａ～図８Ｂ）。

ヒト肝臓及びＦＬＤにおけるＰＳＤ３発現－ＰＳＤ３タンパク質は、１８のアノテーションされたアイソフォームを有する（Ｅｎｓｅｍｂｌリリース７５）。ＬＢＣからの個体のサブセット（ｎ＝７７）からの肝臓生検のトランスクリプトームを検討することにより、アイソフォーム－ａ（ＮＣＢＩではＮＰ＿０５６１２５、Ｅｎｓｅｍｂｌでは００１ＥＮＳＴ０００００３２７０４０と注釈付けされている）が肝臓で最も高い発現レベルを有することが決定された（図９Ａ）。総肝臓ＰＳＤ３ｍＲＮＡレベルは、ＦＬＤを有する肝臓では有さない肝臓よりも高かったが（図５Ｂ）、ＮＡＴ２ｍＲＮＡレベルの差は観察されず（図５Ｃ）、これは、ＮＡＴ２ではなくＰＳＤ３がＦＬＤに関与していることを示唆している。ＰＳＤ３遺伝子型に基づいて個体を層別化した場合、ＰＳＤ３又はＮＡＴ２のいずれかのｍＲＮＡ発現レベルに差は同定されなかった（図９Ｂ及び図９Ｃ）。

１８６Ｌ及び１８６Ｔアミノ酸のホモ接合性の変化を有するドナー由来の初代ヒト肝細胞を比較して、ｒｓ７１５１９９３４マイナー対立遺伝子と肝脂肪含有量の低下との間の関連の根底にある機序を解明した。遺伝的関連と一致して、２Ｄで培養した１８６Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性のヒト初代肝細胞は、ホモ接合性１８６Ｌ肝細胞と比較して、オイルレッドＯ染色によって測定した中性脂肪含有量が低かった（ｐ＝０．００７）（図１９Ａ）。２つの異なる遺伝子型におけるＰＳＤ３レベルを調べるために、本発明者らは、ヒトＰＳＤ３に特異的な抗体を作製した（ウサギにおける免疫後に組換えＰＳＤ３に対するポリクローナル抗体を作製し、リード抗体を、ウエスタンブロット分析においてシグナルを省いたヒトヘパトーマＨｅｐａＲＧ細胞におけるＰＳＤ３のｓｉＲＮＡサイレンシングによって検証した）。細胞を異なる量のオレイン酸（ＯＡ）（０、１０及び２５μＭ）と共にインキュベートし、初代肝細胞における２つの遺伝子型間のタンパク質レベルを調べた。全体として、ＰＳＤ３の量は、オレイン酸の量の増加と共に増加した（図１９Ｂ）。しかしながら、各オレイン酸濃度について、ＰＳＤ３タンパク質発現は、１８６Ｔ対立遺伝子についてホモ接合体の細胞においてより低かった。ＲＮＡ－Ｓｅｑによる脂質ホメオスタシスに関与する示差的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）は、トリグリセリド合成及び分泌並びにコレステロール生合成に関与する遺伝子の堅固な減少を示したが、ミトコンドリア生合成に関与するＰＧＣ－１αの発現は増加した（図１９Ｃ）。

実施例２－ＦＬＤに対するＳｉＲＮＡ供与体保護を介したＰＳＤ３下方制御
実験１の結果－ラット肝細胞におけるＰＳＤ３下方制御
ＰＳＤ３の下方制御が細胞内脂肪含有量の減少をもたらすであろうという仮説を、ヒトＰＳＤ３における１８６Ｔに対応する１８０Ｔについて、ラット（ラット肝癌ＭｃＡｒｄｌｅ細胞［ＭｃＡ－ＲＨ７７７７］）不死化肝細胞ホモ接合体におけるｓｉＲＮＡを使用することによって試験した。これらの細胞では、ＰＳＤ３下方制御は、ＯＲＯ染色によって測定した場合、細胞内脂質含有量の減少をもたらした（図１０Ａ）。更に、ＭｃＡ－ＲＨ７７７７細胞におけるＰＳＤ３下方制御は、デノボトリグリセリド合成として測定される場合（図１０Ｂ）及びトリグリセリド合成に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現として測定される場合（図１１）、より低いトリグリセリド産生をもたらした。更に、アポリポタンパク質－ｂ分泌として測定された超低密度リポタンパク質分泌（図１０Ｃ）もスクランブル対照ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して低かった。ベータ酸化として測定された細胞内脂質利用に差は検出されなかった（図１０Ｄ）。細胞内脂質蓄積（図１２Ａ）及びトリグリセリド合成を複製して、ＰＳＤ３下方制御（図１２Ｂ）後にＰＳＤ３Ｌ１８６Ｌ対立遺伝子変異体を保有するヒト肝癌細胞、Ｈｕｈ７細胞において放射性標識トレーサーを使用することによってデータを確認し、実質的に同一の結果を得た。したがって、内因的に発現されたＰＳＤ３トレオニン及びＰＳＤ３ロイシンの両方の下方制御は、細胞内脂質レベルの低下をもたらした。

ＰＳＤ３の下方制御がＡＲＦ６活性化の変化をもたらすかどうかを試験するために、ＰＳＤ３をＨｕｈ７細胞において下方制御し、活性化されたＡＲＦ６のレベルを、ＧＧＡ３タンパク質結合ドメイン（ＰＢＤ）プルダウンアッセイを使用して測定した。ヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞に、陰性対照ＳＣＲｓｉＲＮＡ（ＡＭ４６１１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ（上記のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのｓ２３６５３、ｓ２３６５４及びｓ２３６５５の混合物）又はＡＲＦ６ｓｉＲＮＡ（ｓ１５６５、ｓ１５６６及びｓ１５６７の混合物、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一過性にトランスフェクトした。ヒトＡＲＦ６ｓｉＲＮＡを以下の表３に更に記載する。

トランスフェクションの４８時間後、細胞溶解物を、内因性活性ＡＲＦ６（ＡＲＦ６－ＧＴＰ）を選択的に単離し、プルダウンするＧＧＡ３ＰＢＤアガロースビーズと共にインキュベートした。沈殿後、キットによって提供される抗ＡＲＦ６抗体を使用する免疫ブロット法によって活性ＡＲＦ６－ＧＴＰが検出された（図２０Ａ）。ＡＲＦ６ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞を陽性対照として使用した。ノックダウン効率が、２^{－ΔΔＣｔ}法によって分析されるリアルタイム定量ＰＣＲによって評価されるように、ＰＳＤ３について約６０％の減少及びＡＲＦ６について約７５％の減少を示した（図２０Ｂ）。棒グラフは、ＧＴＰ－ＡＲＦ６／カルネキシン（図２０Ｃ）として計算された相対的なＡＲＦ６－ＧＴＰ（活性）を示す。

実験２の結果－ヒト初代肝細胞におけるＰＳＤ３下方制御
この仮説を、ＦＬＤを有する個体から得られた肝臓におけるヒト初代肝細胞に対するｓｉＲＮＡ（上と同じ）を使用することによっても試験した。ヒト初代肝細胞を、１８６Ｌ又は１８６Ｔ対立遺伝子のいずれかについてホモ接合性であるドナーから採取し、２Ｄ及び３Ｄで培養した。２Ｄ培養のために、コラーゲンコーティングしたプレートに細胞を付着させた後、細胞を、１０μＭオレイン酸を補充した通常の増殖培地と共にインキュベートし、陰性対照スクランブル（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡ又はＰＳＤ３ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした。

細胞内中性脂肪含有量をオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色によって可視化し、１８６Ｌ対立遺伝子を有する初代ヒト肝細胞（図２１Ａ）及び１８６Ｔ対立遺伝子を有する初代ヒト肝細胞（図２１Ｂ）においてＢｉｏｐｉｘによって定量した。ＰＳＤ３下方制御効率の平均は、両方のドナータイプについて２^{－ΔΔＣｔ}法及びウェスタンブロッティングによって分析したリアルタイム定量ＰＣＲによって評価した場合、約８０％であった。初代ヒト肝細胞の３Ｄ培養のために、スフェロイドを、合計１００μＬの培地中のトランスフェクションミックスと共に、２０００細胞／ウェルを９６ウェル丸底フラスコに播種することによって作製した。１８６Ｔ対立遺伝子スフェロイドの生成のために、５ｎＭのＦＭＫ－Ｚ－ＶＡＤを加えてスフェロイド形成を支援した。２４時間後、更なる増殖培地を添加して、２００μＬ／ウェルの総体積を達成した。全培地の５０％に新鮮培地を４８時間毎に補充した。形成の７日後、スフェロイドを回収し、８μＭ切片をＯＲＯ染色に供して、細胞内中性脂肪含有量を可視化した。核をＤＡＰＩで染色し、ＯＲＯ染色を、１８６Ｌ対立遺伝子を有する初代ヒト肝細胞スフェロイド（図２１Ｃ）及び１８６Ｔ対立遺伝子を有する初代ヒト肝細胞スフェロイド（図２１Ｄ）の核の数に対して正規化したＩｍａｇｅＪによって定量した。遺伝子ノックダウン効率の平均は、両方のドナータイプについて２－ΔΔＣｔ法によって分析されるリアルタイム定量ＰＣＲによって評価した場合、約５０～６０％であった。細胞生存率の尺度としての細胞ＡＴＰレベルは、陰性対照スクランブル群とＰＳＤ３ｓｉＲＮＡ群との間で安定したままであった。

実施例３－ＡＳＯを介したＰＳＤ３下方制御によるＦＬＤに対する保護
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）合成－１～３位及び１４～１６位に２’，４’－拘束された２’－Ｏ－エチル（ｃＥｔ）及びＡＳＯの５’末端に結合した３アンテナガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含有するキメラ１６量体ホスホロチオエートＡＳＯは、ｏｓｔｅｒｇａａｒｄｅｔａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２６，１４５１－１４５５（２０１５））によって以前に記載されたように、ＩｏｎｉｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で合成された。一方は、マウスＰＳＤ３、ＰＳＤ３ＡＳＯを標的とする塩基対配列（５’－ＧＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＣＴＣ－３’；配列番号１）を、及び他方は、既知のマウス遺伝子を標的としない対照ＡＳＯ（５’－ＧＧＣＣＡＡＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡ－３’’；配列番号１９）の２つのＡＳＯをこの研究で使用した。

動物及びＡＳＯ処置－マウス研究のための全ての手順及びプロトコルは、施設内動物管理使用委員会によって承認された。全てのマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、１２時間／１２時間の明／暗サイクルでケージに収容し、試験期間中自由に摂食させた。６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ヒトＮＰ＿０５６１２５．３及びマウスＸＰ＿０１７１６８１９２．１のアラインメントによるヒトＰＳＤ３の１８６Ｔに対応する１４７Ｔのホモ接合体）に、ＮＡＳＨ誘導食（Ｄ１６０１０１０１、研究食）を３４週間与えた。次いで、マウスから採血し、体重及び血漿ＡＬＴレベルに基づいて試験群に無作為化した（ｎ＝９～１０／群）。マウスをＮＡＳＨ食で維持し、生理食塩水、対照ＧａｌＮＡｃＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）又はＰＳＤ３ＧａｌＮＡｃＡＳＯ（５ｍｇ／ｋｇ／週）のいずれかで毎週の皮下注射によって１６週間処置した。ＡＳＯ処置期間中、体重を毎週モニタリングした。最終ＡＳＯ用量の７２時間後、マウスを麻酔し、心臓穿刺によって血液を採取し、組織を採取し、組織学的分析のために液体窒素中で急速凍結するか又はホルマリン中で固定した。血液を３，０００×ｇで遠心分離し、血漿を回収した。血漿及び急速凍結組織を－８０℃で保存した。

血漿及び肝臓の生化学－血漿トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、総血漿コレステロール、血漿トリグリセリド、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）を、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床分析装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して定量した。肝臓トリグリセリド、遊離コレステロール及びコレステリルエステルを、Ｔ．Ｐ．Ｃａｒｒ，Ｃ．Ｊ．Ａｎｄｒｅｓｅｎ，Ｌ．Ｌ．Ｒｕｄｅｌ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ｆｒｅｅｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ａｎｄｔｏｔａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｉｎｔｉｓｓｕｅｌｉｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，３９－４２（１９９３）に記載されているように定量した。

組織病理学及び画像分析－ホルマリン固定、脱水及びパラフィン包埋の後、標準的な手順に従って、４μｍ切片をヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）並びにピクロサイラスレッド（ＰＳＲ）で染色した。連続切片を、自動化されたＶｅｎｔａｎａＵｌｔｒａシステム（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＲｏｃｈｅＧｒｏｕｐ，ＵＳＡ）においてコラーゲン１ａ１について免疫組織化学的に染色した（Ｃｏｌ１ａ１，ＬＳ－Ｃ３４３９２１，ＢｉｏＳｉｔｅ，ＵＳＡ）。画像分析は、ＶｉｓｉｏｐｈａｒｍＩｎｔｅｇｒａｔｏｒＳｙｓｔｅｍソフトウェア（バージョン２０１８．０９、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してデジタル画像で行った。ＨＥ染色スライド上の非染色領域（脂質）を定量化し、総断面積に関連させた。Ｋｌｅｉｎｅｒｅｔａｌ（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４１，１３１３－１３２１（２００５）によって報告された方法に従って、ＨＥ及びＰＲＳ染色肝臓切片において脂肪肝、炎症、ＦＬＤ活性スコア及び線維症段階を評価した。全ての組織学的評価は、ボード認定獣医病理学者が盲検様式で行った。

マウスにおける遺伝子発現－肝臓ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製し、定量的ＰＣＲ分析に供した。リアルタイム蛍光ＲＴ－ＰＣＲ検出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用するＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲＴ－ＰＣＲシステムを使用して、ＲＮＡ発現を定量した。プライマープローブセットＭｍ０１３５１０９９＿ｍ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてＰＳＤ３ｍＲＮＡを定量した。ＲＮＡ転写物レベルを、Ｑｕａｎｔ－ｉＴＲｉｂｏＧｒｅｅｎＲＮＡ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して総ＲＮＡレベルに対して正規化した。

脂質生成遺伝子発現のために、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマウス肝臓から全ＲＮＡを単離した。各サンプルについて１００ｎｇの総ＲＮＡを使用して、ＱｕａｎｔｓｅｑＫｉｔ３’ｍＲＮＡキット（Ｌｅｘｏｇｅｎ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して３’末端ＲＮＡｓｅｑライブラリーを作製した。これらのライブラリーをプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ５００配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で、サンプル当たり５０ｂｐのリード長及び３～５００万リードの深さまで配列決定した。擬似マッピングに基づく定量化モード及び自動化されたリブタイプ検出を使用して、Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．７．１）を使用して、リードを遺伝子モデルにマッピングした。Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．７．１）は、転写物発現の迅速でバイアスを認識した定量化を提供し、遺伝子関連リードをサンプル当たりの全マッピングされたリードで正規化することにより、１００万当たりの転写物（ＴＰＭ）として遺伝子存在量が報告された。

結果－肝臓ＰＳＤ３は、３アンテナＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を投与することによってマウスにおいて下方制御された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）誘発食を合計５０週間与え、最後の１６週間にわたり、マウスの群をＰＳＤ３ＡＳＯ、対照ＡＳＯ又は生理食塩水で処置した。ＰＳＤ３ＡＳＯ処理は、肝臓ＰＳＤ３ｍＲＮＡ発現レベルを著しく低下させ（－９８％）（図１３Ａ）、肝臓重量、総肝臓トリグリセリド含有量及び血漿ＡＬＴレベルを低下させた（図１３Ｂ～図１３Ｄ）。ＰＳＤ３ＡＳＯ処理はマウスの体重に影響を及ぼさなかった（図１４Ａ）。更に、ＰＳＤ３ＡＳＯ処理は、総肝臓遊離コレステロール、肝臓コレステリルエステル、血漿アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、総コレステロール及び総ＬＤＬ－Ｃレベルを低下させたが、血漿トリグリセリド又は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）レベルを変化させなかった（図１４Ｂ～図１４Ｈ）。組織学的に、ＰＳＤ３ＡＳＯ処理は、肝臓コラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）タンパク質及び肝臓脂肪滴レベルを低下させた（図１３Ｅ～図１３Ｆ）。

肝疾患の重症度を順序回帰分析によって評価し、ＰＳＤ３ＡＳＯ処理が脂肪症及び炎症の重症度及びＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）を減少させたが、肝線維症スコアは有意に変化しなかった（図１３Ｇ）ことを見出した。トリグリセリド合成に関与する遺伝子の発現レベルを評価し、ＭｃＡ－ＲＨ７７７７肝細胞におけるインビトロ実験と一致することが見出され（図１１）、ＮＡＳＨ誘導食を与えたマウスにおけるＰＳＤ３下方制御は、デノボ脂質生成に関与する遺伝子の発現を減少させた（図１５）。

Claims

脂肪肝疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、プレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効な化合物を前記対象に投与することを含み、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、方法。
細胞におけるＰＳＤ３の発現又は活性を阻害する方法であって、前記細胞を、ＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物と接触させ、それにより前記細胞におけるＰＳＤ３の発現又は活性を阻害することを含む方法。
対象におけるＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の活性化を低下させる方法であって、前記対象におけるＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含み、より低いＰＳＤ３発現は、ＡＲＦ６の低下した活性化をもたらす、方法。
対象の肝細胞の細胞内脂肪含有量を低下させる方法であって、前記対象におけるＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む方法。
対象のコレステロールを低下させる方法であって、前記対象におけるＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む方法。
ＰＳＤ３減少療法が適切な治療である、脂肪肝疾患を有する対象の亜集団を同定する方法であって、
ａ．対象が脂肪肝疾患を有するかどうかを診断すること、
ｂ．前記対象がＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｔ対立遺伝子変異体又はＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有するかどうかを判定すること
を含み、
前記対象がＰＳＤ３タンパク質の前記１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する場合、前記対象は、ＰＳＤ３減少療法が適切な治療である、脂肪肝疾患を有する対象の前記亜集団に含まれ、
前記対象がＰＳＤ３タンパク質の前記１８６Ｔ対立遺伝子変異体を有する場合、前記対象は、ＰＳＤ３減少療法が適切な治療である、肝疾患を有する対象の前記亜集団に含まれない、方法。
脂肪肝疾患を有する対象を治療する方法であって、
ａ．前記対象がＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｔ対立遺伝子変異体又はＰＳＤ３タンパク質の１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有するかどうかを判定することと、
ｂ．前記対象がＰＳＤ３タンパク質の前記１８６Ｌ対立遺伝子変異体を有する場合にのみ、ＰＳＤ３発現を低下させるのに有効なポリヌクレオチドを含む化合物を投与することと
を含む方法。
前記化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｓＲＮＡｉから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記化合物は、１７～３０個の連結されたヌクレオシドからなるアンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドを含み、前記アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドの核酸塩基配列は、ＰＳＤ３ＲＮＡの等しい部分に相補的な少なくとも１５個の連続する核酸塩基を含む標的化領域を含み、前記アンチセンスＲＮＡｉポリヌクレオチドは、配列番号２～１８のいずれかの等しい部分に少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％相補的である、請求項８に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドは、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント、
連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を有し、前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメント及び前記３’ウイングセグメントに直接隣接して且つそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
脂肪肝疾患を治療するための医薬品の製造又は調製のための、プレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患の治療のための、プレクストリン及びＳｅｃ７ドメイン含有３（ＰＳＤ３）の発現を低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患を治療するための医薬品を製造又は調製するための、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の活性化を低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患の治療のための、ＡＤＰ－リボシル化因子６（ＡＲＦ６）の活性化を低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患を治療するための医薬品の製造又は調製のための、対象の肝細胞の細胞内脂肪含有量を低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患の治療のための、対象の肝細胞の細胞内脂肪含有量を低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患を治療するための医薬品の製造又は調製のための、対象のコレステロールを低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。
脂肪肝疾患の治療のための、対象のコレステロールを低下させるのに有効な化合物の使用であって、前記化合物は、ポリヌクレオチドを含む、使用。