JP2023539727A - 転移バイオマーカー - Google Patents
転移バイオマーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023539727A JP2023539727A JP2023511615A JP2023511615A JP2023539727A JP 2023539727 A JP2023539727 A JP 2023539727A JP 2023511615 A JP2023511615 A JP 2023511615A JP 2023511615 A JP2023511615 A JP 2023511615A JP 2023539727 A JP2023539727 A JP 2023539727A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- membrane
- actin
- subject
- level
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title claims description 7
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims abstract description 225
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims abstract description 214
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 83
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 57
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 256
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 166
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 85
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 85
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 54
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 39
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 35
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 33
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 13
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 12
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 7
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 138
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 42
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 32
- 108010054050 Plectin Proteins 0.000 description 26
- 102000056300 Plectins Human genes 0.000 description 26
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 24
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 102100030374 Actin, cytoplasmic 2 Human genes 0.000 description 13
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 11
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 11
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 9
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 6
- 206010050017 Lung cancer metastatic Diseases 0.000 description 6
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 4
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 4
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 3
- 208000006402 Ductal Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 230000004712 cancer cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100033587 DNA topoisomerase 2-alpha Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000237369 Helix pomatia Species 0.000 description 2
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000773237 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 206010026673 Malignant Pleural Effusion Diseases 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 2
- KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-threonine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010046308 Type II DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQORYDLIGBDITI-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxypyrene-1,2,3-trisulfonic acid Chemical compound C1=C2C(O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=C(S(O)(=O)=O)C(S(O)(=O)=O)=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 UQORYDLIGBDITI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026656 Actin, alpha skeletal muscle Human genes 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000000571 Fibrocystic breast disease Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058611 Helix lectin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000834207 Homo sapiens Actin, alpha skeletal muscle Proteins 0.000 description 1
- 101000929319 Homo sapiens Actin, aortic smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- 101000678433 Homo sapiens Actin, gamma-enteric smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- 101001126471 Homo sapiens Plectin Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 244000267823 Hydrangea macrophylla Species 0.000 description 1
- 235000014486 Hydrangea macrophylla Nutrition 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010025282 Lymphoedema Diseases 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 206010025538 Malignant ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 238000011226 adjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 208000011803 breast fibrocystic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 108091007231 endothelial receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000044418 human PLEC Human genes 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 208000002502 lymphedema Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを検出することを含む方法に関する。本発明はまた、がん、特に転移性がんを診断、予後診断、モニタリングおよび/または病期分類するための方法およびマーカーにも関する。
Description
本発明は、バイオマーカーおよびその使用に関する。特に、本発明は、がん転移の可能性の予測、またはがん転移の診断および/もしくはモニタリングにおけるその使用に関する。
導入
癌腫としても知られる上皮細胞がんは、全てのがん症例の80~90パーセントを占める。1つのそのような癌腫、乳がんは、世界で2番目に最もよく見られるがんタイプであり、全てのがんの10%以上を占める。乳がんは女性に最もよく見られるがんであり、年間200万人を超える女性が乳がんと診断され、年間50万人以上の患者が該疾患で死亡している。
癌腫としても知られる上皮細胞がんは、全てのがん症例の80~90パーセントを占める。1つのそのような癌腫、乳がんは、世界で2番目に最もよく見られるがんタイプであり、全てのがんの10%以上を占める。乳がんは女性に最もよく見られるがんであり、年間200万人を超える女性が乳がんと診断され、年間50万人以上の患者が該疾患で死亡している。
原発腫瘍の転移性播種はがん関連死の主な原因であり、固形腫瘍がん死亡の最大90%を占める。さらに、腫瘍が転移していると診断された患者は5年生存率が22%しかない。転移は、原発腫瘍から広がった細胞の集団化から始まる遊走性上皮間葉転換(EMT)表現型をがん細胞が獲得すると生じる。そのような細胞の浸潤性表現型は、転移の初期段階でのそのような細胞の血管内皮層(endothelial vascular layer)への浸潤と相関する基本的特性である。
がんのステージの評価は何らかの予後診断を行い、適切な治療レジメンを決定するのに極めて重要である。現在の予後はリンパ節状態の評価に基づく場合が多く、リンパ浮腫などの重度の副作用をもたらす可能性があるリンパ節生検などの浸潤的手技を必要とする。
したがって、当技術分野にはがんを診断、予後診断、モニタリングおよび/または病期分類するための新たな改善された方法およびマーカーを開発する必要性がある。本発明はこれらの必要性を満たし、他の関連する利点をさらに提供するものである。
発明の概要
第1の態様では、本発明は、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定される、方法を提供する。検出されたアクチンは、アルファ、ベータ、および/またはガンマアクチンのうちの1つまたは複数であってもよい。一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第1の態様では、本発明は、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定される、方法を提供する。検出されたアクチンは、アルファ、ベータ、および/またはガンマアクチンのうちの1つまたは複数であってもよい。一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第2の態様では、対象を転移性がんと診断する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、対象は転移性がんを有すると決定される方法が提供される。一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第1または第2の態様のいずれかにおいて、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのいずれのレベルの検出も方法の実施を可能にすることができる。
第3の態様では、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含む方法が提供される。
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第4の態様では、対象を転移性がんと診断する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、対象を転移性がんと診断すること
を含む方法が提供される。
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、対象を転移性がんと診断すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第5の態様では、がんと診断された対象を予後診断する方法であって、
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、患者は予後不良であると決定すること
を含む方法が提供される。
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、患者は予後不良であると決定すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
予後不良とは、転移を発症する可能性の増加および/または対象の生存の可能性の低下を指し得る。
第6の態様では、転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性がある、がんと診断された患者を同定する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、患者は転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性があると決定すること
を含む方法が提供される。
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、患者は転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性があると決定すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
当業者は、転移性がんの適切な既知の治療を同定することができ、転移性疾患がどれほど広範で進行している可能性があるか、およびがんの分子プロファイルに応じて転移性がんの既知の治療が異なることを理解するであろう。例えば、適切な治療は補助化学療法であってもよく、特定の治療および/またはレジメンは対象の特定の腫瘍の特徴に依存する。
一例として、転移性がんの既知の治療は、ハーセプチン(商標)または別のHer2遮断モノクローナル抗体治療などの、転移性乳がんの治療における使用で知られている治療であってもよい。
任意の態様では、膜結合アクチンは上皮がん細胞などの細胞の膜で検出または測定され得る。膜結合アクチンは、細胞外小胞(EV)の膜で検出または測定され得る。膜結合アクチンは、細胞の膜および細胞外小胞の膜のいずれにおいても検出され得る。
任意の態様では、EVには限定されるものではないが、エキソソーム、エキソマー(exomer)、微小胞、およびアポトーシス小体が含まれ得る。
任意の態様において対象から得られた、または標準として使用される試料は、血液試料、唾液試料、尿試料などの生体液試料であってもよく、または試料は、乳房組織生検試料などの組織生検試料であってもよい。
任意の態様では、膜結合アクチンは、対象から得られた固形乳房組織生検からの乳がん上皮細胞の形質膜から検出または測定され得る。
任意の態様では、膜結合アクチンは、対象から得られた血液試料から単離された細胞外小胞の膜から検出または測定され得る。
第3から第6の態様のいずれかにおいて、標準試料は陽性標準試料であってもよい。
第3から第6の態様のいずれかにおいて、標準試料は陰性標準試料であってもよい。
任意の態様では、膜結合アクチンはベータアクチンであってもよい。任意の態様では、膜結合アクチンはアルファアクチンであってもよい。任意の態様では、膜結合アクチンはガンマアクチンであってもよい。任意の態様では、膜結合アクチンは、アルファアクチン、ベータアクチンおよびガンマアクチンのうちの1つもしくは複数、または全てであってもよい。
標準試料が陽性標準試料である場合、本発明の第3から第6の態様のいずれかのうちの工程cにおける決定は、その試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルと同等かまたはより高い場合になされる。
標準試料が陰性標準試料である場合、本発明の第3から第6の態様のいずれかのうちの工程cにおける決定は、その試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルより高い場合になされる。差異の大きさは、対象から得られた試料と標準試料の間の関係、および各試料の特徴に依存し得る。例えば、対象から得られた試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルより少なくとも約5%多い、少なくとも約10%多い、少なくとも約20%多い、少なくとも約50%多い、少なくとも約100%多い、少なくとも約200%多い、少なくとも約300%多い、少なくとも約400%多い、少なくとも約500%多い、少なくとも約1000%多い、少なくとも約2000%多い、少なくとも約5000%多い、約少なくとも10,000%多い、少なくとも20,000%以上、少なくとも50,000%多い、少なくとも100,000%多い、少なくとも500,000%多い、少なくとも1,000,000%多い場合に、決定はなされ得る。あるいはまたはさらに、対象から得られた試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルより少なくとも約1倍以上、少なくとも約2倍以上、少なくとも約3倍以上、少なくとも約4倍以上、少なくとも約5倍以上、少なくとも約10倍以上、少なくとも約20倍以上、少なくとも約50倍以上、少なくとも約100倍以上、少なくとも約250倍以上、少なくとも約500倍以上、少なくとも約1000倍以上、少なくとも約5000倍以上、少なくとも約10,000倍以上、少なくとも約20,000倍以上、少なくとも約50,000倍以上、少なくとも約100,000倍以上、少なくとも約500,000倍以上高い場合に、決定はなされ得る。
任意の態様の一実施形態では、対象から得られた試料は、上皮細胞、および/またはEV、および/または循環腫瘍細胞を含み得る。循環腫瘍細胞は上皮細胞であってもよい。
試料が上皮細胞を含む場合、膜結合アクチンの検出はこれらの細胞で実施することができ、これらの細胞は必要に応じて残りの試料から最初に単離、同定、または分離され得る。
試料がEVを含む場合、膜結合アクチンの検出または測定はこれらのEVで実施することができ、これらのEVは必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
試料が循環腫瘍細胞を含む場合、膜結合アクチンの検出または測定はこれらの細胞で実施することができ、これらの細胞は必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
細胞および/またはEVが残りの試料から単離、同定、または分離される場合、1つまたは複数の適切なバイオマーカーが使用され得る。
例えば、上皮細胞を試料から単離、同定、または分離するために、上皮抗EpCAM抗体が、当業者が適切と思う任意の方法、例えばFACSで使用されてもよい。
試料からEVを単離または分離するために、抗体CD9、抗CD63および/または抗CD81抗体のうちの1つまたは複数が、当業者が適切と思う任意の方法、例えばFACSで使用されてもよい。同様に、残りの試料から上皮細胞に由来するEVを単離、同定、または分離するために、抗EpCAM抗体が1つまたは複数のEV特異的バイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。
循環腫瘍細胞を試料から単離、同定、または分離するために、抗EpCAM抗体またはEpCAMに結合するDNAもしくはRNAが使用されてもよい。これは、上皮細胞が通常は循環中に見出されず、その存在が循環腫瘍細胞を示すことになるためである。循環腫瘍細胞を試料から単離、同定、または分離するために、ER、PR、EGFR、HER2、TOP2Aのうちの1つまたは複数を検出する手段が使用されてもよい(Nadal et al. Breast Cancer Research 2012, 14:R71)。該手段は、ER、PR、EGFR、HER2またはTOP2Aに特異的に結合する抗体、DNAまたはRNA分子であってもよい。
別の態様では、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定することを含む、転移性がんの治療に対する対象の反応をモニタリングする方法であって、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルより低い場合に、対象は転移性がんの治療に反応していると決定される方法が提供される。あるいは、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルと同等以上である場合に、対象は転移性がんの治療に反応していないと決定され得る。以前の対応する試料は、対象に治療が施される前にまたは同時に得られてもよい。好ましくは、以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルは、治療の施行後に得られた1つまたは複数の試料中のレベルと比較され、これらの試料は、治療の施行後に1つまたは複数の時点で得られてもよい。治療経過中および/または治療後に膜結合アクチンのレベルをモニタリングすることによって、治療に対する対象の反応が決定され得る。熟練した医師は、治療中に試料で観察された膜結合アクチンのレベルを使用して、必要に応じて治療を調整できることが理解されよう。
別の態様では、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定することを含む、転移性がんと診断された対象における疾患進行をモニタリングする方法であって、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルより低い場合に、転移性がんは進行していないと決定される方法が提供される。あるいは、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルと同等以上である場合に、転移性がんは進行していると決定され得る。
別の態様では、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定することを含む、転移性がんの治療が成功した対象における転移性がんの再発をモニタリングする方法であって、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料で測定された膜結合アクチンのレベルより低い場合に、転移性がんは再発していないと決定される方法が提供される。あるいは、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料で測定された膜結合アクチンのレベルと同等以上である場合に、転移性がんは再発していると決定され得る。対応する試料は、治療成功の決定の時点で、または治療成功の決定の1週間、2週間もしくは4週間以内に採取されていてもよい。
本明細書における「対応する試料」への言及は、同じ対象から採取された同じタイプ、例えば同じ組織タイプの試料を指し得る。試料は、より早期の時点で好ましくは採取される。
本発明の任意の態様の方法は、インビボ(in vivo)、エクスビボ(ex vivo)またはインビトロ(in vitro)で行うことができる。好ましくは、方法はインビトロ方法である。
さらなる態様では、(a)がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、もしくは転移を発症している可能性があるかどうかを決定する、(b)がんと診断された対象を予後診断する、(c)対象を転移性がんと診断する、(d)転移性がんの治療に対する対象の反応をモニタリングする、または(e)転移性がんと診断された対象における疾患進行をモニタリングするためのキットであって、
膜結合アクチンを検出する手段を含み、
i.目的の細胞タイプを同定する手段、および/または
ii.EVを単離する試薬
のうちの1つまたは複数をさらに含んでもよいキットが提供される。
膜結合アクチンを検出する手段を含み、
i.目的の細胞タイプを同定する手段、および/または
ii.EVを単離する試薬
のうちの1つまたは複数をさらに含んでもよいキットが提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
膜結合アクチンを検出する手段は、抗体などのアクチン結合ポリペプチドであってもよい。例えば、膜結合アクチンを検出する手段は、抗ベータアクチン抗体などの抗アクチン抗体であってもよい。膜結合アクチンを検出する手段は、アクチンに結合することができるアプタマーなどのDNAまたはRNA分子であってもよい。
目的の細胞タイプは、上皮細胞または循環腫瘍細胞であってもよい。循環腫瘍細胞は、上皮腫瘍細胞であってもよい。
目的の細胞タイプを同定する手段は、抗体などのEpCAM結合ポリペプチドであってもよい。目的の細胞タイプを同定する手段は、EpCAMに結合することができるアプタマーなどのRNAまたはDNA分子であってもよい。
一実施形態では、キットは、試料からEVを単離する試薬をさらに含んでもよい。当業者は、試料からEVを単離するのに当技術分野で利用可能な任意の試薬セットを選択することができるであろう。選択される的確な試薬は試料の性質に依存し得、例えば、血液試料と特に適合する特定の試薬が選択され得る。
一実施形態では、キットは説明書のセットをさらに含んでもよい。
ある特定の非限定的な実施形態では、膜結合アクチンを検出する手段および/または目的の細胞タイプを同定する手段は、カラムマトリックス、アレイ、またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に結合されて提供されてもよい。あるいは、支持体はキットの別個の要素として提供することができる。
本明細書で使用される場合、用語「アクチン結合ポリペプチド」および「EpCAM結合ポリペプチド」とは、アクチンまたはEpCAMにそれぞれ結合する任意のポリペプチドを指し得る。そのようなポリペプチドは、T細胞受容体、または限定されるものではないがFv、Fab、Fab’およびF(ab’)2断片、ならびにラクダ科動物単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を含む、抗体もしくはその抗原結合断片であってもよい。ベータアクチンなどのアクチンに特異的な、および/またはEpCAMに特異的な、ポリクローナルでもモノクローナルでも抗体または抗原結合断片は、一般的に当業者には分かるように従来の免疫手法を使用して調製することができる。
目的の細胞タイプを同定する手段は、アプタマーなどのEpCAMに結合することができるDNAまたはRNA分子も含み得る。
本明細書で言及される抗体、ポリペプチド、またはDNAもしくはRNA分子は、所与の抗体、ポリペプチドまたはDNAもしくはRNA分子と結合されるかまたはこれらに連結される検出可能な標識を含んでもよい。そのような検出可能な標識には、例えば、化学発光分子もしくは蛍光分子(例えば、ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Cy3、Cy5またはROX)、放射標識(例えば、3H、35S、32P、14C、131I)、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ)、またはペプチド/アミノ酸配列(例えば、His-Tag、FLAG、Myc)が含まれる。
任意の態様または実施形態では、がんは、乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは膵臓がんなどの上皮細胞がんであってもよく、またはこれらに由来してもよい。
転移性がんは、転移性乳がん、転移性結腸直腸がん、転移性肺がんまたは転移性膵臓がんであってもよい。
HPAまたはリンゴマイマイ(Helix pomatia)凝集素は、末端N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を有するグリカンを検出するのに使用され得るリンゴマイマイに由来するレクチンである。本明細書で使用される場合、「HPA陽性(positive)」および「HPA陽性(positivity)」とは、有意なレベルのGalNAcをその表面に示し、それ故に高レベルのHPAによって認識され、高レベルのHPAに結合する細胞またはEVを指す。HPA陰性細胞またはEVは、その表面にGalNAcを示さないかまたは低レベルのGalNAcを示し、それ故にHPAによって認識されず、HPAに結合しないかまたは低レベルのHPAにのみ結合する細胞として定義される。
試料中に細胞および/またはEVを含む試料は、試料中の細胞および/またはEVの約50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、98%超、99%超がHPA陽性であるならば、HPA陽性として同定され得る。
試料中に細胞および/またはEVを含む試料は、試料中の細胞および/またはEVの約50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、98%超、99%超がHPA陰性であるならば、HPA陰性として同定され得る。
任意の態様では、本発明は、細胞および/またはEVのHPA陽性のレベルを検出または測定することをさらに含んでもよい。
任意の態様では、本発明は、アクチンの検出もしくは測定に加えて、またはアクチンの検出もしくは測定に代わるものとして、HPA陽性のレベルを検出または測定することをさらにまたはあるいは含んでもよい。HPA陽性はEVで決定されてもよい。例えば、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法では、方法は:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルを、標準試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルと比較すること、ならびに
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルが、標準試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含んでもよい。そのような方法では、EVは必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルを、標準試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルと比較すること、ならびに
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルが、標準試料中の膜結合アクチンおよび/またはHPA陽性のレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含んでもよい。そのような方法では、EVは必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
本発明は、上皮がん細胞および/またはそれに由来する細胞外小胞の表面の膜結合アクチンの存在および/またはレベルと、これらのがん細胞の転移能の間の正の相関の発見に一部基づく。
したがって、細胞表面、または細胞外小胞の膜におけるアクチンの存在、またはアクチンのレベルの増加の決定は、臨床医ががん細胞の転移能を正確に同定すること、ならびにがんの病期を分類および/または予後を診断することを可能にし得る。これにより、より後期の乳がん患者、または転移を発症する可能性があるかもしくは既に発症している可能性がある者の同定が可能になるため、該患者はより早い、より適切な治療を受けることができる。方法はまた、治療に対する患者の反応をモニタリングおよび/または疾患進行をモニタリングするのにも使用され得る。
さらに、本発明は、不必要なリンパ節生検を患者が回避できるようにする可能性がある。例えば、本発明は、原発腫瘍または原発腫瘍周囲から得られた組織、例えば、乳がんの診断を下すのに使用される初回生検からの乳房組織、または治療中、乳房組織の除去後の乳房組織に由来する細胞で行うことができる。さらにまたはあるいは、細胞外小胞の膜にあるアクチンのレベルを検出または決定する場合、本発明は、生検を必要とすることなく容易に利用できる生体液で行うことができる。本発明は、がんの転移能、病期分類の決定、特定の治療を速く、低侵襲もしくは非侵襲的に、および/または外科的介入の前に行う必要がある患者の診断、予後診断および/または同定を可能にし得る。
当業者は、膜結合アクチンのレベルを検出または測定するのに当技術分野のいくつかの方法または手法が使用され得ることを理解するであろう。適切な手法には、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ELISA、ラテラルフローアッセイ、膜の生化学的または機械的分離/単離後のウェスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、および質量分析が含まれる。任意の態様では、アクチンの検出は、例えば、アクチンを検出する一次検出試薬、および一次検出試薬を特異的に検出する二次検出試薬を使用した、直接的または間接的検出であってもよい。二次検出試薬は標識されてもよい。本発明はそれ故に、高度に特殊な装置または訓練を必要とすることなく、世界中の多くの病院または検査室で広く採用され得る。
一実施形態ではアクチンのレベルは、アクチンと検出剤との複合体を形成し、次いでアクチン/検出剤複合体を検出することによって検出されてもよい。
当業者は、試料からEVを単離するのに当技術分野のいくつかの方法または手法が使用され得ることを理解するであろう(Konoshenko et al., 2018, BioMed. Res. Intl.で概説されている)。
本明細書で言及されるアクチンは、宿主種に内因性であるタンパク質である。ヒトでは、例えば、アクチンは、ACTB遺伝子によってコードされるタンパク質であるベータアクチンを指し得る。アクチンは、ACTA1またはACTA2遺伝子によってコードされるタンパク質であるアルファアクチンを指し得る。アクチンは、ACTG1またはACTG2遺伝子によってコードされるタンパク質であるガンマアクチンを指し得る。
「膜結合アクチン」とは、本明細書で使用される場合、細胞の表面、好ましくは細胞の形質膜中/上に存在するかもしくは検出可能な、または細胞外小胞の表面に存在するかもしくは検出可能な、ベータアクチンなどのアクチンを指す。アクチンは、グリコシル化目印などの翻訳後修飾を有してもよい。アクチンは、細胞および/またはEVを化学的または機械的に破壊する必要なしに検出可能であり得る。アクチンは、機械的および/または化学的に破壊された細胞および/またはEVの膜画分で検出可能であり得、前記画分は細胞またはEVの形質膜の膜のみを含む。検出または測定されるアクチンは、内在性膜タンパク質または内在性膜タンパク質と相互作用し得る表在性膜タンパク質であってもよい。
「転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性がある」とは、本明細書で使用される場合、本発明の態様および/または実施形態に記載された必要な特徴を持たない対象と比較した、転移を発症するかまたは既に発症している可能性の増加を指す。
本明細書で使用される場合、用語「より高い(higher)」とは、標準試料中の膜結合アクチンのレベルより少なくとも約5%以上、少なくとも約10%以上、少なくとも約20%以上、少なくとも約50%以上、少なくとも約100%以上、少なくとも約200%以上、少なくとも約300%以上、少なくとも約400%以上、少なくとも約500%以上、少なくとも約1000%以上、少なくとも約2000%以上、少なくとも約5000%以上、少なくとも約10000%以上、少なくとも約20000%以上、少なくとも約50000%以上、少なくとも約100000%以上、少なくとも約500000%以上、少なくとも約1000000%以上高い数を指し得る。あるいは、用語「より高い」とは、標準試料中の膜結合アクチンのレベルより少なくとも約1倍以上、少なくとも約2倍以上、少なくとも約3倍以上、少なくとも約4倍以上、少なくとも約5倍以上、少なくとも約10倍以上、少なくとも約20倍以上、少なくとも約50倍以上、少なくとも約100倍以上、少なくとも約250倍以上、少なくとも約500倍以上、少なくとも約1000倍以上、少なくとも約5000倍以上、少なくとも約10000倍以上、少なくとも約20,000倍以上、少なくとも約50,000倍以上、少なくとも約100000倍以上、少なくとも約500000倍以上高い数を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「アクチン結合ポリペプチド」および「EpCAM結合ポリペプチド」とは、アクチンまたはEpCAMにそれぞれ結合する任意のポリペプチドを指し得る。そのようなポリペプチドは、T細胞受容体、または限定されるものではないがFv、Fab、Fab’およびF(ab’)2断片を含む、抗体もしくはその抗原結合断片であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「対象から得られた試料」とは、組織、組織試料、生検、細胞試料、腫瘍試料、糞便試料、および生体液、例えば血漿、血清、血液、尿、リンパ液、腹水、唾液の試料を含む、対象、例えばヒト対象から得られた生体物質の試料を指す。一実施形態では、試料は例えば、対象由来の乳房組織の生検からの組織試料である。一実施形態では、試料は対象から得られた血液試料である。
用語「患者」または「対象」とは、本明細書で互換的に使用される場合、任意の哺乳動物、例えばヒトを指す。非ヒト哺乳動物の非限定的な例には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、家禽、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が含まれる。
本開示では、「生検」と記載される試料は、関連する医学技術の当業者に周知の方法を使用して、従来の方法によって得ることができる。生検試料を得る方法には、大きな塊への腫瘍の分割、またはマイクロダイセクション、または当技術分野で公知の他の細胞分離方法が含まれる。腫瘍細胞は、小ゲージ針を用いた吸引による細胞診によってさらに得ることができる。試料の保存および取り扱いを簡単にするために、試料は、ホルマリンで固定され、パラフィンに浸されてもよく、または最初に凍結され、次いで、迅速凍結を可能にする極低温媒体への浸漬によるOCT化合物などの組織凍結媒体に浸されてもよい。試料を保存および/または処理する他の方法は当業者に公知である。
試料は、目的の細胞タイプを単離する、またはEVを単離するために操作されてもよい。例えば、組織試料または生検中の目的の細胞タイプに対するマーカーが、そのような細胞を単離または分離するのに使用され得る。一例は、ベータアクチンなどの膜結合アクチンが検出されるかまたはレベルが決定される前に、生検で採取された組織から上皮細胞を同定および/または分離するためのEpCAM結合ポリペプチドの使用である。別の例は、試料中の他のEVおよび/または生体物質から、上皮細胞に由来するEVを同定および/または分離するためのEpCAM結合ポリペプチドの使用である。
標準試料とは、同等の試料、例えば対象もしくは他の対象から得られた試料と同じ組織および/もしくは細胞タイプか、または対象から得られた試料タイプに非常によく似た細胞株からの同等の試料を指し得る。
「陰性標準試料」とは、非がん性であるか、またはがん性である/不死化されているが転移を発症していないかもしくは発症しないことが分かっている標準試料を指し得る。例えば、陰性標準試料は、対象の腫瘍を取り囲む領域由来の対応する試料、例えば生検試料、または1つもしくは複数の健康な対象由来の対応する組織であってもよい。陰性標準試料はまた、性質が非転移性であることが分かっており、対象について得られた試料と同じまたは類似した性質である細胞株、例えば、対象から得られた乳房組織試料の陰性標準試料として浸潤性が低いことが分かっている乳房上皮細胞株、例えばBT474細胞[Lasfargues et al., 1978, J. Nat. Cancer Institute, 61(4): 967-978]、または良性線維嚢胞性乳房組織から単離されたHMT3522ヒト乳房上皮細胞[Briand et al, 1987, In Vitro Cell and Dev. Biol., 23 (3): 181-188]であってもよい。
膜結合アクチンの存在またはレベルがEVで検出または測定される場合、陰性標準試料とは、がんを有さない1つもしくは複数の対象、もしくはがんを有する/有した、および転移を発症していないかもしくは発症しなかった1つもしくは複数の対象から、または上記のような浸潤性が低いことが分かっている比較細胞株から単離されたEVを指し得る。
故に、そのような陰性標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルは、陰性対照としての役割を果たす。
「陽性標準試料」とは、浸潤性であることが分かっているがん性の、および/または転移を発症しているかもしくは発症する可能性があることが分かっている標準試料を指し得る。例えば、陽性標準試料は、転移を発症していることが分かっている1つまたは複数の対象由来の対応する試料、例えば生検試料であってもよい。陽性標準試料はまた、性質が浸潤性および/または転移性であることが分かっており、対象について得られた試料と同じまたは類似した性質である細胞株、例えば、対象から得られた乳房組織試料の陽性標準試料として浸潤性が高いことが分かっている乳房上皮細胞株、例えばMCF7細胞[Soule et al., 1973, J. Nat. Cancer Institute, 51(5): 1409-14-16]であってもよい。
膜結合アクチンの存在またはレベルがEVで検出または測定される場合、陽性標準試料とは、がんを有する/有した、および転移を発症した1つまたは複数の対象から、または上記のような浸潤性が高いことが分かっている比較細胞株から単離されたEVを指し得る。
故に、そのような陽性標準試料で検出可能なまたは測定された膜結合アクチンのレベルは、陽性対照としての役割を果たす。
がんと診断された対象由来であり、上記の標準試料の膜結合ベータアクチンのレベルより高いレベルが測定された試料は、転移を発症するかもしくは発症している可能性がより高い、または転移性がんと診断される可能性がより高いとして同定され得る。患者にとって適切な治療レジメンが、次いで特定および提供され得る。
当業者は、転移が確認されているかもしくは記録された転移がない対象から、または性質が転移性であるかもしくは非転移性であることが分かっている細胞株から、所与の試料タイプ中の膜結合アクチンのレベルが記録されているデータベースを調べることができ得る。当業者は、必要に応じてそのような転移性または非転移性細胞株を容易に同定することができる。
当業者は、本発明の任意の1つの実施形態および/または態様の好ましい特徴が、本発明の全ての他の実施形態および/または態様に適用され得ることを理解するであろう。
材料および方法
内皮細胞からのタンパク質抽出および定量化
HUVEC細胞をコンフルエンスまでT175フラスコで増殖させ、次いで完全増殖培地で加湿雰囲気中、37℃、2時間、10ug/ml TNFαで処理した。細胞を氷冷PBSで洗浄した。細胞を短時間遠心分離してペレット化し、上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤カクテル10ul/mlを添加した1×RIPA緩衝液にペレットを再懸濁し、4℃で30分間エンドオーバーエンドミキサーに入れた。この時間後、チューブを13,000RPMで4℃、20分間遠心分離した。上清を新しい1.5mlチューブに移し、ペレットを捨てた。抽出したタンパク質をBCAアッセイを使用して定量化した。
HUVEC細胞をコンフルエンスまでT175フラスコで増殖させ、次いで完全増殖培地で加湿雰囲気中、37℃、2時間、10ug/ml TNFαで処理した。細胞を氷冷PBSで洗浄した。細胞を短時間遠心分離してペレット化し、上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤カクテル10ul/mlを添加した1×RIPA緩衝液にペレットを再懸濁し、4℃で30分間エンドオーバーエンドミキサーに入れた。この時間後、チューブを13,000RPMで4℃、20分間遠心分離した。上清を新しい1.5mlチューブに移し、ペレットを捨てた。抽出したタンパク質をBCAアッセイを使用して定量化した。
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット
タンパク質試料10ugを、Laemmli試料緩衝液3ulおよび1M DTT 1ulを用いたSDS-PAGEに使用した。これを混合し、100℃に10分間加熱し、次いで氷上に置いた。試料をPrecision Plus Protein Dual Colour Standardと共に、1×TGS緩衝液中ミニPROTEAN TGXステインフリープレキャストゲル(12%)に流した。ゲルを100ボルトで2時間実行した。Trans-Blot Turbo Midi PVDF転写パックを使用してタンパク質を転写した。ゲルを膜の上に置き、層の間に挟み、次いでTransblot Turbo機に高MW設定で入れた。膜を振盪台で5分間、TBST(0.05% Tween)で3回洗浄した。膜を次いで振盪台RTで2時間、5% BSA/TBSTとインキュベートして遮断した。遮断した膜は、5% BSA/TBST中1ug/ml GalNAc-BSA-ビオチン10ml、または5% BSA/TBST中1ug/ml BSA-ビオチン10mlで一晩、4℃でインキュベートした。膜を5% BSA/TBSTで5分間、3回洗浄した後、膜を5% BSA-TBST中5ug/mlストレプトアビジン-HRP 10mlで1時間、室温でインキュベートした。膜を5% BSA-TBSTで5分間、2回、次いで1回、15分間洗浄した。HRP基質を1:1比で調製し(Clarity+Clarity Max Western ECL Substrate、BioRad、170-5060)、混合した。これを膜に添加し、Chemidoc(登録商標)トランスイルミネーターで画像化した。
タンパク質試料10ugを、Laemmli試料緩衝液3ulおよび1M DTT 1ulを用いたSDS-PAGEに使用した。これを混合し、100℃に10分間加熱し、次いで氷上に置いた。試料をPrecision Plus Protein Dual Colour Standardと共に、1×TGS緩衝液中ミニPROTEAN TGXステインフリープレキャストゲル(12%)に流した。ゲルを100ボルトで2時間実行した。Trans-Blot Turbo Midi PVDF転写パックを使用してタンパク質を転写した。ゲルを膜の上に置き、層の間に挟み、次いでTransblot Turbo機に高MW設定で入れた。膜を振盪台で5分間、TBST(0.05% Tween)で3回洗浄した。膜を次いで振盪台RTで2時間、5% BSA/TBSTとインキュベートして遮断した。遮断した膜は、5% BSA/TBST中1ug/ml GalNAc-BSA-ビオチン10ml、または5% BSA/TBST中1ug/ml BSA-ビオチン10mlで一晩、4℃でインキュベートした。膜を5% BSA/TBSTで5分間、3回洗浄した後、膜を5% BSA-TBST中5ug/mlストレプトアビジン-HRP 10mlで1時間、室温でインキュベートした。膜を5% BSA-TBSTで5分間、2回、次いで1回、15分間洗浄した。HRP基質を1:1比で調製し(Clarity+Clarity Max Western ECL Substrate、BioRad、170-5060)、混合した。これを膜に添加し、Chemidoc(登録商標)トランスイルミネーターで画像化した。
2D PAGE
プロテアーゼ阻害剤を添加した1×RIPA緩衝液中1ug/ulの濃度で活性化した全HUVECタンパク質を、2D PAGEで使用するためにGE Healthcare製の2D Clean-upキットを用いて、製造者の説明書(80-6484-51)に従って精製した。試料を、BioRad製のReadyPrep 2-Dスターターキットを用いて製造者の説明書(163-2105)に従って2D PAGE用に調製した。これにより、試料を11cm IPGストリップに吸収させ、次いでその後Ettan IPGphor 3で等電点電気泳動によって16時間分離できるようになった。IPGストリップを洗浄し、再水和し、次いでCriterion(商標)XT Bis-Trisプレキャストゲルに入れ、12%ゲルをタンクに充填し、標準物質を添加し、ゲルをアガロースで封入した。アガロースは、タンクに充填する前に1×MOPS緩衝液で固定した。NuPage Antioxidant(Thermo、NP0005)250ulをゲルごとに添加した。ゲルを200ボルトで70分間実行した。ブロッティングするゲルをそのカセットから除去し、dH2Oで2回洗浄した。残りの手順を室温で実施した。ゲルをInvitrogen(商標)Novex(商標)SimplyBlue(商標)SafeStain(Thermo、LC6065)に入れ、振盪台に1時間置いた。次いで、ゲルを振盪台で一晩、dH2Oで脱染した。ゲルをiBlot(商標)2 Dry Blotting Systemを使用してブロッティングした。膜をdH2Oで簡単に洗浄し、次いでロッキングプラットフォームで5% Marvel/TBSTを用いて1時間遮断した。膜をロッキングプラットフォームで5% BSA/TBST中1ug/ml GalNAc-BSA-ビオチンと2時間インキュベートし、次いでロッキングプラットフォームで3回、それぞれ10分間、TBSTで洗浄した。膜をロッキングプラットフォームで1時間、5% BSA/TBST中5ug/mlストレプトアビジン-ペルオキシダーゼとインキュベートし、次いでロッキングプラットフォームで3回、それぞれ10分間、TBSTで洗浄した。ECL HRP基質を調製し、膜に添加し、次いでChemidoc(登録商標)トランスイルミネーターを使用して画像化した。
プロテアーゼ阻害剤を添加した1×RIPA緩衝液中1ug/ulの濃度で活性化した全HUVECタンパク質を、2D PAGEで使用するためにGE Healthcare製の2D Clean-upキットを用いて、製造者の説明書(80-6484-51)に従って精製した。試料を、BioRad製のReadyPrep 2-Dスターターキットを用いて製造者の説明書(163-2105)に従って2D PAGE用に調製した。これにより、試料を11cm IPGストリップに吸収させ、次いでその後Ettan IPGphor 3で等電点電気泳動によって16時間分離できるようになった。IPGストリップを洗浄し、再水和し、次いでCriterion(商標)XT Bis-Trisプレキャストゲルに入れ、12%ゲルをタンクに充填し、標準物質を添加し、ゲルをアガロースで封入した。アガロースは、タンクに充填する前に1×MOPS緩衝液で固定した。NuPage Antioxidant(Thermo、NP0005)250ulをゲルごとに添加した。ゲルを200ボルトで70分間実行した。ブロッティングするゲルをそのカセットから除去し、dH2Oで2回洗浄した。残りの手順を室温で実施した。ゲルをInvitrogen(商標)Novex(商標)SimplyBlue(商標)SafeStain(Thermo、LC6065)に入れ、振盪台に1時間置いた。次いで、ゲルを振盪台で一晩、dH2Oで脱染した。ゲルをiBlot(商標)2 Dry Blotting Systemを使用してブロッティングした。膜をdH2Oで簡単に洗浄し、次いでロッキングプラットフォームで5% Marvel/TBSTを用いて1時間遮断した。膜をロッキングプラットフォームで5% BSA/TBST中1ug/ml GalNAc-BSA-ビオチンと2時間インキュベートし、次いでロッキングプラットフォームで3回、それぞれ10分間、TBSTで洗浄した。膜をロッキングプラットフォームで1時間、5% BSA/TBST中5ug/mlストレプトアビジン-ペルオキシダーゼとインキュベートし、次いでロッキングプラットフォームで3回、それぞれ10分間、TBSTで洗浄した。ECL HRP基質を調製し、膜に添加し、次いでChemidoc(登録商標)トランスイルミネーターを使用して画像化した。
質量分析用のゲルの調製
1Dゲルをクマシーブルーで染色し、2Dゲルを銀染色で染色し、次いで参照としてブロットを使用して、目的のバンドおよびドットを1Dおよび2D ゲルから切除した。ゲルを次いでPorton Biopharma Ltd.での質量分析に送った。
1Dゲルをクマシーブルーで染色し、2Dゲルを銀染色で染色し、次いで参照としてブロットを使用して、目的のバンドおよびドットを1Dおよび2D ゲルから切除した。ゲルを次いでPorton Biopharma Ltd.での質量分析に送った。
がん細胞からのEV抽出
がん細胞を70%コンフルエンシーまでT175フラスコで増殖させ、25ml/フラスコのEV除去培地(FBSを前もって120,000gで16時間回転させて存在するEVを除去した、10% FBS含有DMEM培地)を供給し、48時間馴化させた。培地を除去し、300×gで5分間、次いで16,000×gで20分間、4℃で回転させた。培地をフラスコから「ノーマル」50mlチューブ(Greiner Bio-One、227285)に除去し、300×gで5分間回転させた。微小胞については、上清を高速(トップが緑色またはオレンジ色の)50mlチューブ(Alpha Laboratories、CT1120)に移し、ペレットを捨て、16000gで20分間遠心分離する。上清をノーマル50mlチューブに移す-これがEV部分である。ペレットは微小胞を含有する。微小胞をプールし、PBS 20mlに再懸濁する。これを次いで再び16000gで20分間回転させる。上清をチューブから注ぎ出し、約300ulを残す容量のPBSにペレットを再懸濁する。PBS中0.1% BSA(Sigma、A7906-100G)溶液(40ml PBS中10% BSA 40μl)を使用して0.22ミクロン(Fisher、fdr-050-071n)フィルターを遮断し、このフィルターにより培地を濾過する。培地をVivaspin 20 100kDa濃縮装置(Fisher、10774797に添加する。培地を3000g(スイングバケット-25分)または5000g(固定角ローター-20分工程)で回転させて濃縮する。
がん細胞を70%コンフルエンシーまでT175フラスコで増殖させ、25ml/フラスコのEV除去培地(FBSを前もって120,000gで16時間回転させて存在するEVを除去した、10% FBS含有DMEM培地)を供給し、48時間馴化させた。培地を除去し、300×gで5分間、次いで16,000×gで20分間、4℃で回転させた。培地をフラスコから「ノーマル」50mlチューブ(Greiner Bio-One、227285)に除去し、300×gで5分間回転させた。微小胞については、上清を高速(トップが緑色またはオレンジ色の)50mlチューブ(Alpha Laboratories、CT1120)に移し、ペレットを捨て、16000gで20分間遠心分離する。上清をノーマル50mlチューブに移す-これがEV部分である。ペレットは微小胞を含有する。微小胞をプールし、PBS 20mlに再懸濁する。これを次いで再び16000gで20分間回転させる。上清をチューブから注ぎ出し、約300ulを残す容量のPBSにペレットを再懸濁する。PBS中0.1% BSA(Sigma、A7906-100G)溶液(40ml PBS中10% BSA 40μl)を使用して0.22ミクロン(Fisher、fdr-050-071n)フィルターを遮断し、このフィルターにより培地を濾過する。培地をVivaspin 20 100kDa濃縮装置(Fisher、10774797に添加する。培地を3000g(スイングバケット-25分)または5000g(固定角ローター-20分工程)で回転させて濃縮する。
エキソソームについては、0.1% BSAで遮断した0.22umフィルターにより上清を濾過した。Vivaspin 20、100kDa濃縮装置を使用して上清を500ulに濃縮した。SECカラム(BioRad、7321010)を、セファロース14mlおよびPBS 10mlを添加して調製し、これを2時間沈殿させ、次いでカラム支持体を添加し、PBSを通過させた。カラムを次いでPBS 10mlで3回洗浄した。試料500ulをカラム支持体に添加し、吸着させ、次いでPBS 10mlを添加した。フロースルー2.5mlを回収し、捨て、次いでフロースルー2mlを回収した(EVを含有)。Particlematrix(商標)粒子分析器を使用してEVを定量化した。EVは、次いで短期使用のために冷蔵庫で保管してもよい。
EVありまたはなしの内皮静的接着アッセイ
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml 8-ヒドロキシピレントリスルホン酸(HTPS)で37℃、5% CO2で2時間処理した。この時間後、HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞をEV 500ulまたはPBS 500ulのどちらかで処理し、RTで10分間混合した。HUVEC細胞をEV 500ulまたはPBS 500ulのどちらかで37℃、5% CO2で30分間処理した。EVまたはPBSを細胞から除去し、20,000細胞/mlのMCF7細胞をウェルごとに添加し、10分間をインキュベートし、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウント(商標)を使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml 8-ヒドロキシピレントリスルホン酸(HTPS)で37℃、5% CO2で2時間処理した。この時間後、HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞をEV 500ulまたはPBS 500ulのどちらかで処理し、RTで10分間混合した。HUVEC細胞をEV 500ulまたはPBS 500ulのどちらかで37℃、5% CO2で30分間処理した。EVまたはPBSを細胞から除去し、20,000細胞/mlのMCF7細胞をウェルごとに添加し、10分間をインキュベートし、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウント(商標)を使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml HTPSで37℃、5% CO2で2時間処理した。HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞を、PBS中0.1ug/ml組換えプレクチン(2b Scientific SKU RPC754Hu01(ヒトプレクチンUniprot ID Q15149の残基Asp 175~Pro 400、アクチン結合ドメインに対応)、またはPBSのどちらかで10分間、RTで処理した。組換えプレクチンまたはPBSを細胞から除去し、20,000細胞/mlのMCF7細胞をウェルごとに添加し、10分間インキュベートし、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
プレクチンサイレンシングおよびEVレスキューありまたはなしの内皮静的接着アッセイ
MCF7およびHUVEC細胞を70%コンフルエンシーまで24ウェル細胞培養プレートで増殖させ、細胞をDharmafect(商標)トランスフェクション試薬および5uMのプレクチンsiRNAまたはスクランブル陰性対照で24時間処理した。一部のHUVECおよびMCF7細胞は無処理であった。HUVEC細胞を完全培地中10ug/ml TNFaで37℃、5% CO2で2時間処理して活性化した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml HTPSで37℃、5% CO2で2時間処理した。HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞を、上に概説した抽出方法を使用して単離したEV 500ul、またはPBS 500ulのどちらかで10分間、RTで処理した。EVまたはPBSを除去し、MCF7細胞1mlをHUVEC細胞に添加し、37℃、5% CO2で10分間インキュベートした後、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
MCF7およびHUVEC細胞を70%コンフルエンシーまで24ウェル細胞培養プレートで増殖させ、細胞をDharmafect(商標)トランスフェクション試薬および5uMのプレクチンsiRNAまたはスクランブル陰性対照で24時間処理した。一部のHUVECおよびMCF7細胞は無処理であった。HUVEC細胞を完全培地中10ug/ml TNFaで37℃、5% CO2で2時間処理して活性化した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml HTPSで37℃、5% CO2で2時間処理した。HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞を、上に概説した抽出方法を使用して単離したEV 500ul、またはPBS 500ulのどちらかで10分間、RTで処理した。EVまたはPBSを除去し、MCF7細胞1mlをHUVEC細胞に添加し、37℃、5% CO2で10分間インキュベートした後、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
ドットブロットアッセイ
形質膜タンパク質抽出キット(Abcam、ab56400)、エキソソーム/MVを結合プロトコールでのように使用して膜単離を行った。細口ピペットチップを使用して、2μlの試料または緩衝液をニトロセルロース膜にスポットした。溶液をゆっくり適用して、溶液が浸透する面積を最小化する(通常は3~4mm)。膜を約30分間乾燥させる。各膜を6ウェルプレートの内側に入れる。膜をTBS-T中5% marvel、またはHPAについては0.1% Tween 20を用いてdH2Oで希釈したCarbo-freeブロッキング溶液(2BScientific、SP-5040-125)に浸漬して遮断する(1時間、RT)。Carbo-Block-T中10ug/mlビオチン化HPA、または全ての抗体については1:1,000と、TBS-T中5% marvelで37℃、2時間または4℃、一晩インキュベートする。膜をTBS-Tで3回洗浄する(3×5分)。ビオチン化抗Ms(Vector Labs、BA-2000-1.5)またはビオチン化抗Rb(Vector Labs、BA-1000-1.5)と5% marvel TBSTで37℃、1時間インキュベートする。膜をTBS-Tで3回洗浄する(3×5分)。5% marvel TBS-T、またはHPAについてはCarbo-Block-Tで1ug/mlストレプトアビジン-ペルオキシダーゼとインキュベートする。TBSで3回洗浄する(3×10分)。ECL基質AおよびB(BioRad Clarityキット)を混合する。各膜をECL試薬と1分間インキュベートし、過剰な溶液を表面から除去し、ケミ高感度ブロット(chemi-high sensitivity blot)として画像化する。
形質膜タンパク質抽出キット(Abcam、ab56400)、エキソソーム/MVを結合プロトコールでのように使用して膜単離を行った。細口ピペットチップを使用して、2μlの試料または緩衝液をニトロセルロース膜にスポットした。溶液をゆっくり適用して、溶液が浸透する面積を最小化する(通常は3~4mm)。膜を約30分間乾燥させる。各膜を6ウェルプレートの内側に入れる。膜をTBS-T中5% marvel、またはHPAについては0.1% Tween 20を用いてdH2Oで希釈したCarbo-freeブロッキング溶液(2BScientific、SP-5040-125)に浸漬して遮断する(1時間、RT)。Carbo-Block-T中10ug/mlビオチン化HPA、または全ての抗体については1:1,000と、TBS-T中5% marvelで37℃、2時間または4℃、一晩インキュベートする。膜をTBS-Tで3回洗浄する(3×5分)。ビオチン化抗Ms(Vector Labs、BA-2000-1.5)またはビオチン化抗Rb(Vector Labs、BA-1000-1.5)と5% marvel TBSTで37℃、1時間インキュベートする。膜をTBS-Tで3回洗浄する(3×5分)。5% marvel TBS-T、またはHPAについてはCarbo-Block-Tで1ug/mlストレプトアビジン-ペルオキシダーゼとインキュベートする。TBSで3回洗浄する(3×10分)。ECL基質AおよびB(BioRad Clarityキット)を混合する。各膜をECL試薬と1分間インキュベートし、過剰な溶液を表面から除去し、ケミ高感度ブロット(chemi-high sensitivity blot)として画像化する。
MCF7およびBT474乳がん細胞のウェスタンブロット後のHPAプロービング
MCF7およびBT474細胞株は、以前に記載したようにT75フラスコで70%コンフルエンスまで増殖させ、それらのタンパク質を抽出し、定量化し、SDS-PAGEにかけ、次いでブロッティングした。ビオチン化HPAまたは抗GAPDH抗体を使用して膜をプローブした。
MCF7およびBT474細胞株は、以前に記載したようにT75フラスコで70%コンフルエンスまで増殖させ、それらのタンパク質を抽出し、定量化し、SDS-PAGEにかけ、次いでブロッティングした。ビオチン化HPAまたは抗GAPDH抗体を使用して膜をプローブした。
Nanoview
NanoviewerによるR100および分析のための標準的なプロトコールに従って、EVをMCF7およびBT474乳がん細胞からSEC(以前に記載)を使用して抽出し、蛍光コンジュゲート抗体(CD81およびCD9)およびHPAレクチンで標識した。
NanoviewerによるR100および分析のための標準的なプロトコールに従って、EVをMCF7およびBT474乳がん細胞からSEC(以前に記載)を使用して抽出し、蛍光コンジュゲート抗体(CD81およびCD9)およびHPAレクチンで標識した。
カバースリップ上での活性化内皮細胞の調製
滅菌13mm Dガラスカバースリップを24ウェルプレートのウェルに置き、100,000HUVEC細胞を播種した。細胞が単層になるまで細胞を37℃、5% CO2雰囲気でインキュベートした。HUVEC細胞を完全培地中10ug/ml TNFαで37℃、5% CO2で2時間処理して活性化した。
滅菌13mm Dガラスカバースリップを24ウェルプレートのウェルに置き、100,000HUVEC細胞を播種した。細胞が単層になるまで細胞を37℃、5% CO2雰囲気でインキュベートした。HUVEC細胞を完全培地中10ug/ml TNFαで37℃、5% CO2で2時間処理して活性化した。
アクチン抗体阻害ありまたはなしの内皮接着アッセイ
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml HTPSで37℃、5% CO2で2時間処理した。この時間後、HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞を1:1,000アクチンIgG(Abcam ab8227)、1:1,000 GAPDH IgGまたはPBSのどちらかで30分間、RTで処理した。抗体またはPBSを細胞から除去し、20,000細胞/mlのMCF7細胞をウェルごとに添加し、10分間インキュベートし、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。MCF7乳がん細胞をT75フラスコで70%コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中10mg/ml HTPSで37℃、5% CO2で2時間処理した。この時間後、HTPSを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をPBS 10mlで5回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。20,000細胞/mlを調製した。MCF7細胞を1:1,000アクチンIgG(Abcam ab8227)、1:1,000 GAPDH IgGまたはPBSのどちらかで30分間、RTで処理した。抗体またはPBSを細胞から除去し、20,000細胞/mlのMCF7細胞をウェルごとに添加し、10分間インキュベートし、細胞を除去し、加温したPBSでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで4% PFAで10分間、RTで固定した。固定液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
フローサイトメトリー
生細胞試験のために、培養細胞を70%コンフルエンス前後で収集し、アキュターゼを使用してフラスコの底から剥離した。細胞を遠心分離(1400rpm、5分間)によって回収した。分析のために、0.5×106/mlの濃度を有する細胞を使用した。細胞をPBSで洗浄し、3% BSA/TBS中、暗所、RTで10分間、HPA抗体とインキュベートして(7.5μg/ml)、細胞の表面のHPA GalNAcエピトープまたは1/50アクチン(クローンSP124)を検出した。細胞をヨウ化プロピジウム(10ug/ml)で処理して生集団をゲートした。375nm、405nm、488nmおよび638nmレーザーを備え、CytExpertソフトウェアを使用して操作する13カラー、4レーザーCytoFLEX S N-V-B-Rフローサイトメーターを使用して、647コンジュゲートの波長をAPC-Aチャネルで定量的に記録した。
生細胞試験のために、培養細胞を70%コンフルエンス前後で収集し、アキュターゼを使用してフラスコの底から剥離した。細胞を遠心分離(1400rpm、5分間)によって回収した。分析のために、0.5×106/mlの濃度を有する細胞を使用した。細胞をPBSで洗浄し、3% BSA/TBS中、暗所、RTで10分間、HPA抗体とインキュベートして(7.5μg/ml)、細胞の表面のHPA GalNAcエピトープまたは1/50アクチン(クローンSP124)を検出した。細胞をヨウ化プロピジウム(10ug/ml)で処理して生集団をゲートした。375nm、405nm、488nmおよび638nmレーザーを備え、CytExpertソフトウェアを使用して操作する13カラー、4レーザーCytoFLEX S N-V-B-Rフローサイトメーターを使用して、647コンジュゲートの波長をAPC-Aチャネルで定量的に記録した。
各試料を三重に分析し、分析した細胞の表面のGalNAcエピトープレベルの決定は、APC検出器からの蛍光シグナルの平均値に基づいた。ゲーティング:1)FSC-H vs FSC-A - ダブレット除去、凝集している細胞は2倍の面積および高さを有することになる。2)Pi生存ゲート - 死細胞から生細胞を識別。死細胞は透過性になり、それ故にPIは核に結合し、それ故により多くの蛍光を有することになる(本発明者は、違いを示すために本発明者の非染色Pi対照も結合させた)3)異なる条件間でピークのシフトを決定するための目的の抗体/レクチンチャネル。
固定細胞については、細胞を収集し、冷PBSに再懸濁した。細胞を抗アクチンAbと4℃で1時間インキュベートした(Proteintechカタログ:60008-1-Ig)。細胞を次いで洗浄し、フローサイトメトリー前にPBSに再懸濁した。
NanoFCM
NanoFCMは、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/jev2.12044およびhttps://doi.org/10.1002/jev2.12079で独立してレビューされている、エキソソーム分析に重点を置く40nm~1ミクロンフローサイトメーターである。これらの結果は全て、ノッティンガム、UKに拠点を置く企業によって行われた。エキソソームは以前に説明したように抽出した。機器は以下の設定でセットした:SN-N30E、V1.11ソフトウェア、試料圧力-1Kpa、レーザー-10/50mW 488@ 20/100mW 640、SS減衰-10%および最小幅-0.3ms。シリカナノ粒子を用いて検量し、EV濃度を定量化した。PBS、抗体対照およびEV非染色および染色最適化を行った。アクチン抗体については、約2e8~2e10粒子を、抗体/染色と1/50~1/500で30分間、室温でインキュベートし、PBSで1/5~1/50に希釈した。HPAについては、約2e8 粒子を抗体/染色と1/500で30分間、室温でインキュベートし、次いでPBSで1/20~1/50に希釈した。高いバックグラウンドの場合、110k×gで1時間超遠心分離し、50μlに再懸濁した。上清を除去し、試料を50ul PBSに再懸濁した。約40~199nmの間でゲートした事象を1分間記録し、そのサイズでゲートした全エキソソームの割合としての陽性シグナルを有するエキソソームの数として記録した。
NanoFCMは、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/jev2.12044およびhttps://doi.org/10.1002/jev2.12079で独立してレビューされている、エキソソーム分析に重点を置く40nm~1ミクロンフローサイトメーターである。これらの結果は全て、ノッティンガム、UKに拠点を置く企業によって行われた。エキソソームは以前に説明したように抽出した。機器は以下の設定でセットした:SN-N30E、V1.11ソフトウェア、試料圧力-1Kpa、レーザー-10/50mW 488@ 20/100mW 640、SS減衰-10%および最小幅-0.3ms。シリカナノ粒子を用いて検量し、EV濃度を定量化した。PBS、抗体対照およびEV非染色および染色最適化を行った。アクチン抗体については、約2e8~2e10粒子を、抗体/染色と1/50~1/500で30分間、室温でインキュベートし、PBSで1/5~1/50に希釈した。HPAについては、約2e8 粒子を抗体/染色と1/500で30分間、室温でインキュベートし、次いでPBSで1/20~1/50に希釈した。高いバックグラウンドの場合、110k×gで1時間超遠心分離し、50μlに再懸濁した。上清を除去し、試料を50ul PBSに再懸濁した。約40~199nmの間でゲートした事象を1分間記録し、そのサイズでゲートした全エキソソームの割合としての陽性シグナルを有するエキソソームの数として記録した。
実施例1-転移能のバイオマーカーとしての膜結合アクチンの同定
エスカルゴ由来のレクチンであるリンゴマイマイ凝集素(HPA)の、乳がん(BC)および他の上皮がんへの結合は、転移能および患者の予後不良と関連している[Brooks S., 2000, Histology and Histopathology, 15(1): 143-158]。HPAが何に特異的に結合するかは不明であるが、HPAは末端α-GalNAc(HPAが最も高い親和性を有する単糖)を有する一連の糖タンパク質に結合することが示されている。これらの糖タンパク質の1つががん関連Tn抗原(Ser/Thr-GalNAc)である。がん関連Tn抗原は、O結合型グリコシル化で作られる初期構造であり、通常は常にさらに精密に作られるが、がんで頻発している(Brooks S.A. & Leathem A.J.C., 1995, British J. Cancer, 71: 1033-1038)。
エスカルゴ由来のレクチンであるリンゴマイマイ凝集素(HPA)の、乳がん(BC)および他の上皮がんへの結合は、転移能および患者の予後不良と関連している[Brooks S., 2000, Histology and Histopathology, 15(1): 143-158]。HPAが何に特異的に結合するかは不明であるが、HPAは末端α-GalNAc(HPAが最も高い親和性を有する単糖)を有する一連の糖タンパク質に結合することが示されている。これらの糖タンパク質の1つががん関連Tn抗原(Ser/Thr-GalNAc)である。がん関連Tn抗原は、O結合型グリコシル化で作られる初期構造であり、通常は常にさらに精密に作られるが、がんで頻発している(Brooks S.A. & Leathem A.J.C., 1995, British J. Cancer, 71: 1033-1038)。
高HPA陽性BC細胞は、静的接着アッセイにおいて弱HPA陽性またはHPA陰性BC細胞より有意に多く内皮細胞に接着する。このアッセイは、狭い毛細血管における転移性がん細胞停止を模倣している。がん細胞が転移に成功するには、がん細胞は血管に結合し、血管外遊出しなければならない。細胞をHPAまたはBSA-GalNAcとインキュベートすると細胞結合を阻害することから、結合はこのグリコシル化目印を通じて媒介されることが示されている。
HPA陽性細胞接着を媒介する内皮細胞上の受容体の同定
BC細胞のHPA結合グリカンを認識している内皮細胞上の推定受容体を同定するために、TNFα(内皮受容体を上方制御することが知られている炎症性サイトカイン)を使用して活性化してある内皮細胞から全タンパク質を抽出した。タンパク質をSDS-PAGEにかけ、次いでブロッティングした。GalNAc-BSA-ビオチン(GalNAcは、HPAが名目上最大の特異性を有する糖である)をプローブとして使用して、目的の内皮タンパク質を同定した。陰性対照としてBSA-ビオチンも使用して膜をプローブした。図1に例示するように、膜をGalNAc-BSA-ビオチンでプローブするといくつかのバンドが観察されたが、膜をBSA-ビオチンでプローブした場合、バンドは観察されなかった。
BC細胞のHPA結合グリカンを認識している内皮細胞上の推定受容体を同定するために、TNFα(内皮受容体を上方制御することが知られている炎症性サイトカイン)を使用して活性化してある内皮細胞から全タンパク質を抽出した。タンパク質をSDS-PAGEにかけ、次いでブロッティングした。GalNAc-BSA-ビオチン(GalNAcは、HPAが名目上最大の特異性を有する糖である)をプローブとして使用して、目的の内皮タンパク質を同定した。陰性対照としてBSA-ビオチンも使用して膜をプローブした。図1に例示するように、膜をGalNAc-BSA-ビオチンでプローブするといくつかのバンドが観察されたが、膜をBSA-ビオチンでプローブした場合、バンドは観察されなかった。
GalNAc-BSA-ビオチンをプローブとして使用して、いくつかのバンドが一貫して同定された。これらから、5つのゲル断片を選択し、質量分析用に切除した(図2)。分離はサイズ上に過ぎないことから、1Dゲルからのブロットで観察されたバンドは多数のタンパク質に相当し得る。バンドをよりうまく解明するために、2D-PAGEを使用してタンパク質をサイズおよびpHの両方について分離した。2Dゲルをブロッティングし、GalNAc-BSA-ビオチンでプローブした。13個のスポットを目的のスポットとして同定し、2D PAGEゲルから切除した(図3)。
質量分析データは、1Dおよび2D-PAGEの両方からのゲル断片中のいくつかのタンパク質を明らかにし、これらの一部は両方で重複していた。同定されたそれらのタンパク質の一つが、通常は細胞内スカフォールドタンパク質であるプレクチンであった。しかし、Shin et al (2013)は、プレクチンがエキソソーム分泌により細胞の膜に局在化できることを示した。これを調べるために、EVをBC細胞から単離し、静的接着アッセイの前にBC細胞か内皮細胞のどちらか、または両方とインキュベートした。BC細胞および内皮細胞の両方をEVとインキュベートすると、無処理、BC細胞のみまたは内皮細胞のみの処理と比べて、内皮細胞へのBC細胞の結合を有意に増加させることが見出された(図4)。この知見は、内皮細胞へのBC細胞接着を助ける上でEVが積極的な役割を果たし得ることを示唆するものである。
これをさらに調べるために、siRNAを使用してプレクチンをBC細胞か内皮細胞のどちらか、または両方でノックダウンした。無処理およびスクランブルsiRNA処理細胞(グラフでは陰性と呼ばれる)陰性対照細胞と比べて、全ての場合において内皮細胞へのBC細胞の結合は有意に低下し、それ故に、プレクチンはBC細胞が内皮細胞に結合するのに必要であることを示唆している(図5)。
内皮細胞上の受容体が、BC細胞におけるグリコシル化目印に特異的であり、細胞結合を媒介することの確認
内皮細胞上の受容体が、BC細胞におけるグリコシル化目印に特異的であることを確認するために、組換えプレクチン断片[プレクチンのアクチン結合ドメインを含有、該ドメインは全てのアクチンアイソフォームに結合することができる(Fontao et al., 2001, J. Cell. Sci., 114: 2065-2076)]を使用して、内皮細胞の添加前に10分間インキュベートしてBC細胞を遮断した。内皮細胞への細胞接着は、無処理対照細胞と比べて有意に低下した(図6)。BC細胞を組換えプレクチンとインキュベートした場合に観察される結合の低下は、HPA陽性グリコシル化目印へのプレクチン結合の結果であり、それによってBC細胞に「キャップし」、内皮細胞への結合を防ぐという仮説を立てた。
内皮細胞上の受容体が、BC細胞におけるグリコシル化目印に特異的であることを確認するために、組換えプレクチン断片[プレクチンのアクチン結合ドメインを含有、該ドメインは全てのアクチンアイソフォームに結合することができる(Fontao et al., 2001, J. Cell. Sci., 114: 2065-2076)]を使用して、内皮細胞の添加前に10分間インキュベートしてBC細胞を遮断した。内皮細胞への細胞接着は、無処理対照細胞と比べて有意に低下した(図6)。BC細胞を組換えプレクチンとインキュベートした場合に観察される結合の低下は、HPA陽性グリコシル化目印へのプレクチン結合の結果であり、それによってBC細胞に「キャップし」、内皮細胞への結合を防ぐという仮説を立てた。
BC細胞由来のEVが内皮細胞への接着をどのように増加させるかの調査
BC細胞におけるプレクチンのノックダウンの知見は、BC細胞由来のEVは内皮細胞へのBC細胞の接着を増加させ得るという観察と合わせて、EVはプレクチンをBC細胞から内皮細胞の表面に運び、次いでBC細胞が結合する有効な「上陸プラットフォーム(landing platform)」を増加させ得るという仮説をもたらした。この仮説のテストに取りかかるために、「レスキュー」実験を行った。BC細胞においてプレクチンをノックダウンすると、内皮細胞へのBC細胞の結合は低下した(図7)。興味深いことに、内皮細胞を対照BC細胞由来のEVで処理すると、この結合の低下は部分的にレスキューされた。これは、正常な細胞(プレクチンを有する)由来のEVが、結合の発生を可能にする「上陸プラットフォーム」を提供しているという仮説と一致する。
BC細胞におけるプレクチンのノックダウンの知見は、BC細胞由来のEVは内皮細胞へのBC細胞の接着を増加させ得るという観察と合わせて、EVはプレクチンをBC細胞から内皮細胞の表面に運び、次いでBC細胞が結合する有効な「上陸プラットフォーム(landing platform)」を増加させ得るという仮説をもたらした。この仮説のテストに取りかかるために、「レスキュー」実験を行った。BC細胞においてプレクチンをノックダウンすると、内皮細胞へのBC細胞の結合は低下した(図7)。興味深いことに、内皮細胞を対照BC細胞由来のEVで処理すると、この結合の低下は部分的にレスキューされた。これは、正常な細胞(プレクチンを有する)由来のEVが、結合の発生を可能にする「上陸プラットフォーム」を提供しているという仮説と一致する。
モデル系では、高HPA陽性(MCF7)および弱HPA陽性(BT474)であることが以前に報告されている2つのBC細胞株を使用して、上記の仮説を検証した。2つの細胞株からタンパク質を抽出し、SDS-PAGEにかけ、次いでブロッティングし、HPAでプローブした。HPA陽性BC細胞株(MCF7)は、75kDaに1つのバンドしか持たない弱HPA陽性BC細胞株(BT474)より広範なHPA陽性糖タンパク質を有し、それによってこのモデル系の使用を確認した(図8)。
NanoViewを使用すると、HPA結合陽性細胞はHPA結合陽性EVを産生し、同様にHPA結合陰性細胞はHPA結合陰性EVを産生することが示された。これを行うために、2つの一般的に使用されるEVマーカーおよびHPAに特異的な蛍光コンジュゲート抗体で2つのEV集団を標識して、2つのBC細胞株(一方はHPA結合陰性、他方はHPA結合陽性)からEVを単離し、EVが「HPA結合陽性」を有する量を定量化することができた。HPA結合陰性BC細胞由来のEV(BT474左、図9)はHPA結合陰性であることが見出されたが、HPA結合陽性BC細胞由来のEV(MCF7右、図9)はHPA結合陽性であった。特に、HPAは小胞においてCD9と優勢的に共局在化された - CD81陽性小胞の13%、およびCD63陽性小胞の9%と比べて、CD9陽性小胞の最大45%がHPA陽性である。APC発光スペクトルとの重複のため、蛍光コンジュゲート抗体CD63はこの実験に含めなかった。
内皮細胞上の受容体への結合を媒介するBC細胞での糖タンパク質の同定
細胞骨格プレクチンは、ベータアクチンを含む、そのアクチン結合ドメイン(ABD)と相互作用するいくつかの結合パートナーを有する。グリコシル化ベータアクチンが細胞表面プレクチンの潜在的結合パートナーであるかどうかを調べるために遮断実験を行い、抗ベータアクチンIgG(Abcam ab8227)を使用して、内皮細胞とのインキュベーションの前にベータアクチンを30分間マスキングした)。未処理対照細胞と比べて、ベータアクチンを遮断すると細胞接着は有意に低下し、それ故に、ベータアクチンがプレクチンの結合パートナーであること、およびこの相互作用が内皮細胞へのBC細胞の結合に寄与することを示唆している(図10)。
細胞骨格プレクチンは、ベータアクチンを含む、そのアクチン結合ドメイン(ABD)と相互作用するいくつかの結合パートナーを有する。グリコシル化ベータアクチンが細胞表面プレクチンの潜在的結合パートナーであるかどうかを調べるために遮断実験を行い、抗ベータアクチンIgG(Abcam ab8227)を使用して、内皮細胞とのインキュベーションの前にベータアクチンを30分間マスキングした)。未処理対照細胞と比べて、ベータアクチンを遮断すると細胞接着は有意に低下し、それ故に、ベータアクチンがプレクチンの結合パートナーであること、およびこの相互作用が内皮細胞へのBC細胞の結合に寄与することを示唆している(図10)。
異なる細胞株における表面アクチンのレベル
既知の浸潤性およびHPA結合プロファイルが分かっている一連の細胞を使用して、異なる細胞タイプにおける表面アクチンのレベルをフローサイトメトリーによって決定した。これらは、正常/HPA陰性から、非転移性/弱HPA陽性~高転移性/高HPA陽性にわたった(図11)。HME細胞は正常な乳房細胞であり、HPA陰性である;BT474は、転移の証拠がない原発性浸潤性腺管がんに由来し[Lasfargues et al. 1978, J. Nat. Institute, 61(4): 967-978]、HPAで弱く標識される;ZR751は、浸潤性原発性乳管がんからの悪性腹水-すなわち既に転移していた細胞に由来し(Engel et al. 1978, Canc. Res., 38, 3352-3364)、HPAで中程度に標識される;T47Dは、浸潤性原発性乳管がんからの悪性胸水-すなわち既に転移していた細胞に由来し[Keydar et al 1979, Eur J Cancer, 15 (5):65 9-70]、HPAで高度に標識される;MCF7は、浸潤性原発性乳管がんからの悪性胸水-すなわち既に転移していた細胞に由来し[Soule et al. 1973, J. Nat. Cancer Institute, 5 1(5): 1409-14-16]、HPAで高度に標識される。アクチン標識は、表面アクチンの増加がより浸潤性/転移性細胞で測定される点でHPA標識と類似した傾向に沿っているようである。
既知の浸潤性およびHPA結合プロファイルが分かっている一連の細胞を使用して、異なる細胞タイプにおける表面アクチンのレベルをフローサイトメトリーによって決定した。これらは、正常/HPA陰性から、非転移性/弱HPA陽性~高転移性/高HPA陽性にわたった(図11)。HME細胞は正常な乳房細胞であり、HPA陰性である;BT474は、転移の証拠がない原発性浸潤性腺管がんに由来し[Lasfargues et al. 1978, J. Nat. Institute, 61(4): 967-978]、HPAで弱く標識される;ZR751は、浸潤性原発性乳管がんからの悪性腹水-すなわち既に転移していた細胞に由来し(Engel et al. 1978, Canc. Res., 38, 3352-3364)、HPAで中程度に標識される;T47Dは、浸潤性原発性乳管がんからの悪性胸水-すなわち既に転移していた細胞に由来し[Keydar et al 1979, Eur J Cancer, 15 (5):65 9-70]、HPAで高度に標識される;MCF7は、浸潤性原発性乳管がんからの悪性胸水-すなわち既に転移していた細胞に由来し[Soule et al. 1973, J. Nat. Cancer Institute, 5 1(5): 1409-14-16]、HPAで高度に標識される。アクチン標識は、表面アクチンの増加がより浸潤性/転移性細胞で測定される点でHPA標識と類似した傾向に沿っているようである。
図12は、アクチンのレベルが非転移性乳がん細胞(BT474)より転移性乳がん細胞(MCF7)の表面で高いことをフローサイトメトリーを使用してさらに示している。このデータは、ベータおよびガンマアクチンの両方を検出できる抗体を使用して作成された。図13は、乳がんMCF7、結腸直腸がんHT-29、および肺がんA539を含む転移性がんも、その表面でHPAのレベル上昇を示すことをさらに示している。これらの結果は、アクチンおよびHPAいずれの表面レベルも転移性がん細胞で増加することをさらに示しており、故にそれらの診断能を示すものである。
図14はさらに、転移性がん細胞におけるアクチンの表面レベルの増加を支持する。このデータは非転移性および転移性乳がんを比較し、ベータアクチンまたはガンマアクチンのどちらかに対する抗体を使用しており、どちらも転移性がん細胞におけるアクチンレベルの増加を示している。
異なる細胞株から得られた微小胞における表面アクチンのレベル
図15~17は、転移性および非転移性乳がん、肺がんおよび膵臓がん細胞から得られた微小胞の表面のアクチンレベルを比較する。結果は、転移性細胞から得られた微小胞におけるアクチンのレベル上昇を明白に示している。
図15~17は、転移性および非転移性乳がん、肺がんおよび膵臓がん細胞から得られた微小胞の表面のアクチンレベルを比較する。結果は、転移性細胞から得られた微小胞におけるアクチンのレベル上昇を明白に示している。
異なる細胞株から得られたエキソソームにおける表面アクチンのレベル
図18~20は、転移性および非転移性乳がんおよび結腸直腸がん細胞から得られたエキソソームの表面のアクチンレベルを比較する。結果は、非転移性細胞と比べて転移性細胞から得られたエキソソームにおけるアクチンのレベル上昇を明白に示している。図21は、転移性がん、具体的には結腸直腸HT-29がん細胞から得られたエキソソームも、その表面でHPAのレベル上昇を示すことをさらに示している。図22は、転移性乳がんおよび結腸直腸がん細胞がそれらの表面でガンマアクチンのレベル上昇を示すことを示している。
図18~20は、転移性および非転移性乳がんおよび結腸直腸がん細胞から得られたエキソソームの表面のアクチンレベルを比較する。結果は、非転移性細胞と比べて転移性細胞から得られたエキソソームにおけるアクチンのレベル上昇を明白に示している。図21は、転移性がん、具体的には結腸直腸HT-29がん細胞から得られたエキソソームも、その表面でHPAのレベル上昇を示すことをさらに示している。図22は、転移性乳がんおよび結腸直腸がん細胞がそれらの表面でガンマアクチンのレベル上昇を示すことを示している。
考察
結論として、本明細書に提示されたデータは、上皮がん細胞、および/またはそれに由来する細胞外小胞の表面(膜結合)のアクチンが、がん細胞の転移能の診断マーカーまたは予後マーカーとして機能し得ることを示している。アクチンレベルは、特定のがん治療に対する反応のモニタリング、疾患進行のモニタリング、および/または疾患再発のモニタリングに使用することもでき、HPAレベルも、単独でまたはアクチンレベルとの併用のどちらかでバイオマーカーとして使用され得る。
結論として、本明細書に提示されたデータは、上皮がん細胞、および/またはそれに由来する細胞外小胞の表面(膜結合)のアクチンが、がん細胞の転移能の診断マーカーまたは予後マーカーとして機能し得ることを示している。アクチンレベルは、特定のがん治療に対する反応のモニタリング、疾患進行のモニタリング、および/または疾患再発のモニタリングに使用することもでき、HPAレベルも、単独でまたはアクチンレベルとの併用のどちらかでバイオマーカーとして使用され得る。
Claims (23)
- がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを検出することを含み、
膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、その対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定される、方法。 - 対象を転移性がんと診断する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、その対象はがん転移を有すると決定される方法。
- がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含む方法。 - 対象を転移性がんと診断する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、対象を転移性がんと診断すること
を含む方法。 - がんと診断された対象を予後診断する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、患者は予後不良であると決定すること
を含む方法。 - 予後不良が、転移を発症する可能性の増加および/または生存の可能性の低下と関係している、請求項5に記載の方法。
- 転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性がある、がんと診断された患者を同定する方法であって:
a.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
b.試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
c.対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、患者は転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性があると決定すること
を含む方法。 - 対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルより少なくとも約50%、75%、100%、150%、200%、300%、500%、1000%、5000%、または10000%多い場合に、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルは標準試料中の膜結合アクチンのレベルより高いと決定される、請求項3~7のいずれかに記載の方法。
- 標準試料が、がんと診断されていない健康な患者からの同等の試料であるか、または転移性であることが分かっている同等の試料である、請求項3~8のいずれかに記載の方法。
- 方法が、エクスビボ方法またはインビトロ方法である、請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 試料が、組織生検ならびに/または血液試料および/もしくは唾液試料である、請求項1~10のいずれかに記載の方法。
- 組織生検が乳房組織生検である、請求項11に記載の方法。
- 膜結合アクチンのレベルの検出または測定が、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、および/またはELISAによって行われる、請求項1~12のいずれかに記載の方法。
- a.対象が転移を発症する可能性があるかもしくは発症している可能性があると決定される、または
b.対象が転移性がんと診断される、または
c.対象が予後不良診断を受ける、または
d.対象が転移性がんの治療から恩恵を受ける可能性があると決定される
ならば、転移性がんの治療法が対象に施される、請求項1~13のいずれかに記載の方法。 - (a)がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、もしくは転移を発症している可能性があるかどうかを決定する、または(b)がんと診断された対象を予後診断する、または(c)対象を転移性がんと診断するためのキットであって、
膜結合アクチンを検出する手段を含み、
i.目的の細胞タイプを同定する手段、および/または
ii.細胞外小胞を単離する試薬
のうちの1つまたは複数をさらに含んでもよいキット。 - 膜結合アクチンを検出する手段がアクチン結合ポリペプチドである、請求項15に記載のキット。
- 目的の細胞タイプが上皮細胞であり、上皮細胞を同定する手段がEpCAM結合ポリペプチドである、請求項15または16に記載のキット。
- 膜結合アクチンが細胞の膜、および/または細胞外小胞の膜で検出される、請求項1~14のいずれかに記載の方法または請求項15~17のいずれかに記載のキット。
- 細胞が上皮細胞または循環腫瘍細胞である、請求項18に記載の方法またはキット。
- 上皮細胞が乳房組織由来である、請求項19に記載の方法またはキット。
- がんが上皮細胞がんである、請求項1~14もしくは17~20のいずれかに記載の方法、または請求項15~20のいずれかに記載のキット。
- 上皮細胞がんが乳がんである、請求項21に記載の方法またはキット。
- アクチンがベータアクチンである、請求項1~14もしくは17~22のいずれかに記載の方法、または請求項15~22のいずれかに記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB2012760.1 | 2020-08-14 | ||
GBGB2012760.1A GB202012760D0 (en) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | Metastatic biomarker |
PCT/GB2021/052110 WO2022034343A1 (en) | 2020-08-14 | 2021-08-13 | Metastatic biomarker |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023539727A true JP2023539727A (ja) | 2023-09-19 |
Family
ID=72615481
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023511615A Pending JP2023539727A (ja) | 2020-08-14 | 2021-08-13 | 転移バイオマーカー |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230305007A1 (ja) |
EP (1) | EP4196791A1 (ja) |
JP (1) | JP2023539727A (ja) |
CN (1) | CN116457662A (ja) |
CA (1) | CA3189186A1 (ja) |
GB (1) | GB202012760D0 (ja) |
WO (1) | WO2022034343A1 (ja) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2013229762A1 (en) * | 2012-03-09 | 2014-09-25 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh | Biomarker compositions and methods |
EP2998406A1 (en) * | 2013-05-14 | 2016-03-23 | Medicinal Bioconvergence Research Center | Method for monitoring metastasis of cancer cells using cells cultured in three-dimensional collagen environment |
CN106526185B (zh) * | 2016-10-28 | 2018-03-30 | 拜尔康(天津)医药科技有限公司 | 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及检测方法 |
-
2020
- 2020-08-14 GB GBGB2012760.1A patent/GB202012760D0/en not_active Ceased
-
2021
- 2021-08-13 WO PCT/GB2021/052110 patent/WO2022034343A1/en active Application Filing
- 2021-08-13 EP EP21762077.2A patent/EP4196791A1/en active Pending
- 2021-08-13 CN CN202180070407.XA patent/CN116457662A/zh active Pending
- 2021-08-13 US US18/020,752 patent/US20230305007A1/en active Pending
- 2021-08-13 CA CA3189186A patent/CA3189186A1/en active Pending
- 2021-08-13 JP JP2023511615A patent/JP2023539727A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022034343A1 (en) | 2022-02-17 |
EP4196791A1 (en) | 2023-06-21 |
CN116457662A (zh) | 2023-07-18 |
CA3189186A1 (en) | 2022-02-17 |
GB202012760D0 (en) | 2020-09-30 |
US20230305007A1 (en) | 2023-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5221381B2 (ja) | 卵巣癌を判定するためのhe4及び他の生化学マーカーの使用 | |
JP5175864B2 (ja) | 疾患の検出及び特徴付けのために自己抗体を検出する方法 | |
Yang et al. | Immuno-proteomic discovery of tumor tissue autoantigens identifies olfactomedin 4, CD11b, and integrin alpha-2 as markers of colorectal cancer with liver metastases | |
KR101976219B1 (ko) | 유방암의 바이오마커 | |
Shi et al. | Down-regulation of poly (rC)-binding protein 1 correlates with the malignant transformation of hydatidiform moles | |
US8216789B2 (en) | Diagnostic panel of cancer antibodies and methods for use | |
EP2318841B1 (en) | Anln protein as an endocrine treatment predictive factor | |
US9625461B2 (en) | Method of detecting cancer using delta-catenin | |
KR101680360B1 (ko) | Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물 | |
EP2288721B1 (en) | Treatment prediction involving hmgcr protein | |
Torres-Cabala et al. | Differential expression of S100C in thyroid lesions | |
JP2023539727A (ja) | 転移バイオマーカー | |
WO2021132544A1 (ja) | 癌の予後バイオマーカー | |
JP2022153482A (ja) | 癌のバイオマーカーとしてのpd-ecgf | |
KR101687775B1 (ko) | 자궁내막증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단키트 | |
CN110763845B (zh) | 一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断结肠癌的产品中的用途和试剂盒 | |
CN112534264A (zh) | 微卫星不稳定性的抗原标志物 | |
JP2019158613A (ja) | laeverinを用いたPSTT(胎盤部トロホブラスト腫瘍)の検出 | |
JP7556791B2 (ja) | マイクロサテライト不安定性の抗原バイオマーカー | |
KR20200025706A (ko) | Fgf 21을 포함하는 갑상선 암 진단 또는 갑상선 암 예후 예측용 바이오마커 조성물 | |
WO2009138130A1 (en) | Breast cancer prognostics | |
JP2022072531A (ja) | 女性ホルモン依存性がんの悪性度及び予後の判定のためのバイオマーカー | |
Tacke et al. | Y-box protein-1/p18 fragment identifies malignancies in patients with chronic liver | |
Ahmed et al. | CD24 shows early upregulation and nuclear |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20240502 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240611 |