JP2023539727A - 転移バイオマーカー - Google Patents

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Abstract

本発明は、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを検出することを含む方法に関する。本発明はまた、がん、特に転移性がんを診断、予後診断、モニタリングおよび／または病期分類するための方法およびマーカーにも関する。

Description

本発明は、バイオマーカーおよびその使用に関する。特に、本発明は、がん転移の可能性の予測、またはがん転移の診断および／もしくはモニタリングにおけるその使用に関する。
導入
癌腫としても知られる上皮細胞がんは、全てのがん症例の８０～９０パーセントを占める。１つのそのような癌腫、乳がんは、世界で２番目に最もよく見られるがんタイプであり、全てのがんの１０％以上を占める。乳がんは女性に最もよく見られるがんであり、年間２００万人を超える女性が乳がんと診断され、年間５０万人以上の患者が該疾患で死亡している。
原発腫瘍の転移性播種はがん関連死の主な原因であり、固形腫瘍がん死亡の最大９０％を占める。さらに、腫瘍が転移していると診断された患者は５年生存率が２２％しかない。転移は、原発腫瘍から広がった細胞の集団化から始まる遊走性上皮間葉転換（ＥＭＴ）表現型をがん細胞が獲得すると生じる。そのような細胞の浸潤性表現型は、転移の初期段階でのそのような細胞の血管内皮層（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｌａｙｅｒ）への浸潤と相関する基本的特性である。
がんのステージの評価は何らかの予後診断を行い、適切な治療レジメンを決定するのに極めて重要である。現在の予後はリンパ節状態の評価に基づく場合が多く、リンパ浮腫などの重度の副作用をもたらす可能性があるリンパ節生検などの浸潤的手技を必要とする。
したがって、当技術分野にはがんを診断、予後診断、モニタリングおよび／または病期分類するための新たな改善された方法およびマーカーを開発する必要性がある。本発明はこれらの必要性を満たし、他の関連する利点をさらに提供するものである。
発明の概要
第１の態様では、本発明は、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定される、方法を提供する。検出されたアクチンは、アルファ、ベータ、および／またはガンマアクチンのうちの１つまたは複数であってもよい。一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第２の態様では、対象を転移性がんと診断する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、対象は転移性がんを有すると決定される方法が提供される。一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第１または第２の態様のいずれかにおいて、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのいずれのレベルの検出も方法の実施を可能にすることができる。
第３の態様では、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって：
ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
ｂ．対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第４の態様では、対象を転移性がんと診断する方法であって：
ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
ｂ．対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、対象を転移性がんと診断すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
第５の態様では、がんと診断された対象を予後診断する方法であって、
ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
ｂ．試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、患者は予後不良であると決定すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
予後不良とは、転移を発症する可能性の増加および／または対象の生存の可能性の低下を指し得る。
第６の態様では、転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性がある、がんと診断された患者を同定する方法であって：
ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
ｂ．試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、患者は転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性があると決定すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
当業者は、転移性がんの適切な既知の治療を同定することができ、転移性疾患がどれほど広範で進行している可能性があるか、およびがんの分子プロファイルに応じて転移性がんの既知の治療が異なることを理解するであろう。例えば、適切な治療は補助化学療法であってもよく、特定の治療および／またはレジメンは対象の特定の腫瘍の特徴に依存する。
一例として、転移性がんの既知の治療は、ハーセプチン（商標）または別のＨｅｒ２遮断モノクローナル抗体治療などの、転移性乳がんの治療における使用で知られている治療であってもよい。
任意の態様では、膜結合アクチンは上皮がん細胞などの細胞の膜で検出または測定され得る。膜結合アクチンは、細胞外小胞（ＥＶ）の膜で検出または測定され得る。膜結合アクチンは、細胞の膜および細胞外小胞の膜のいずれにおいても検出され得る。
任意の態様では、ＥＶには限定されるものではないが、エキソソーム、エキソマー（ｅｘｏｍｅｒ）、微小胞、およびアポトーシス小体が含まれ得る。
任意の態様において対象から得られた、または標準として使用される試料は、血液試料、唾液試料、尿試料などの生体液試料であってもよく、または試料は、乳房組織生検試料などの組織生検試料であってもよい。
任意の態様では、膜結合アクチンは、対象から得られた固形乳房組織生検からの乳がん上皮細胞の形質膜から検出または測定され得る。
任意の態様では、膜結合アクチンは、対象から得られた血液試料から単離された細胞外小胞の膜から検出または測定され得る。
第３から第６の態様のいずれかにおいて、標準試料は陽性標準試料であってもよい。
第３から第６の態様のいずれかにおいて、標準試料は陰性標準試料であってもよい。
任意の態様では、膜結合アクチンはベータアクチンであってもよい。任意の態様では、膜結合アクチンはアルファアクチンであってもよい。任意の態様では、膜結合アクチンはガンマアクチンであってもよい。任意の態様では、膜結合アクチンは、アルファアクチン、ベータアクチンおよびガンマアクチンのうちの１つもしくは複数、または全てであってもよい。
標準試料が陽性標準試料である場合、本発明の第３から第６の態様のいずれかのうちの工程ｃにおける決定は、その試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルと同等かまたはより高い場合になされる。
標準試料が陰性標準試料である場合、本発明の第３から第６の態様のいずれかのうちの工程ｃにおける決定は、その試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルより高い場合になされる。差異の大きさは、対象から得られた試料と標準試料の間の関係、および各試料の特徴に依存し得る。例えば、対象から得られた試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルより少なくとも約５％多い、少なくとも約１０％多い、少なくとも約２０％多い、少なくとも約５０％多い、少なくとも約１００％多い、少なくとも約２００％多い、少なくとも約３００％多い、少なくとも約４００％多い、少なくとも約５００％多い、少なくとも約１０００％多い、少なくとも約２０００％多い、少なくとも約５０００％多い、約少なくとも１０，０００％多い、少なくとも２０，０００％以上、少なくとも５０，０００％多い、少なくとも１００，０００％多い、少なくとも５００，０００％多い、少なくとも１，０００，０００％多い場合に、決定はなされ得る。あるいはまたはさらに、対象から得られた試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルが、標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルより少なくとも約１倍以上、少なくとも約２倍以上、少なくとも約３倍以上、少なくとも約４倍以上、少なくとも約５倍以上、少なくとも約１０倍以上、少なくとも約２０倍以上、少なくとも約５０倍以上、少なくとも約１００倍以上、少なくとも約２５０倍以上、少なくとも約５００倍以上、少なくとも約１０００倍以上、少なくとも約５０００倍以上、少なくとも約１０，０００倍以上、少なくとも約２０，０００倍以上、少なくとも約５０，０００倍以上、少なくとも約１００，０００倍以上、少なくとも約５００，０００倍以上高い場合に、決定はなされ得る。
任意の態様の一実施形態では、対象から得られた試料は、上皮細胞、および／またはＥＶ、および／または循環腫瘍細胞を含み得る。循環腫瘍細胞は上皮細胞であってもよい。
試料が上皮細胞を含む場合、膜結合アクチンの検出はこれらの細胞で実施することができ、これらの細胞は必要に応じて残りの試料から最初に単離、同定、または分離され得る。
試料がＥＶを含む場合、膜結合アクチンの検出または測定はこれらのＥＶで実施することができ、これらのＥＶは必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
試料が循環腫瘍細胞を含む場合、膜結合アクチンの検出または測定はこれらの細胞で実施することができ、これらの細胞は必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
細胞および／またはＥＶが残りの試料から単離、同定、または分離される場合、１つまたは複数の適切なバイオマーカーが使用され得る。
例えば、上皮細胞を試料から単離、同定、または分離するために、上皮抗ＥｐＣＡＭ抗体が、当業者が適切と思う任意の方法、例えばＦＡＣＳで使用されてもよい。
試料からＥＶを単離または分離するために、抗体ＣＤ９、抗ＣＤ６３および／または抗ＣＤ８１抗体のうちの１つまたは複数が、当業者が適切と思う任意の方法、例えばＦＡＣＳで使用されてもよい。同様に、残りの試料から上皮細胞に由来するＥＶを単離、同定、または分離するために、抗ＥｐＣＡＭ抗体が１つまたは複数のＥＶ特異的バイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。
循環腫瘍細胞を試料から単離、同定、または分離するために、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはＥｐＣＡＭに結合するＤＮＡもしくはＲＮＡが使用されてもよい。これは、上皮細胞が通常は循環中に見出されず、その存在が循環腫瘍細胞を示すことになるためである。循環腫瘍細胞を試料から単離、同定、または分離するために、ＥＲ、ＰＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａのうちの１つまたは複数を検出する手段が使用されてもよい（Nadal et al. Breast Cancer Research 2012, 14:R71）。該手段は、ＥＲ、ＰＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＴＯＰ２Ａに特異的に結合する抗体、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。
別の態様では、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定することを含む、転移性がんの治療に対する対象の反応をモニタリングする方法であって、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルより低い場合に、対象は転移性がんの治療に反応していると決定される方法が提供される。あるいは、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルと同等以上である場合に、対象は転移性がんの治療に反応していないと決定され得る。以前の対応する試料は、対象に治療が施される前にまたは同時に得られてもよい。好ましくは、以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルは、治療の施行後に得られた１つまたは複数の試料中のレベルと比較され、これらの試料は、治療の施行後に１つまたは複数の時点で得られてもよい。治療経過中および／または治療後に膜結合アクチンのレベルをモニタリングすることによって、治療に対する対象の反応が決定され得る。熟練した医師は、治療中に試料で観察された膜結合アクチンのレベルを使用して、必要に応じて治療を調整できることが理解されよう。
別の態様では、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定することを含む、転移性がんと診断された対象における疾患進行をモニタリングする方法であって、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルより低い場合に、転移性がんは進行していないと決定される方法が提供される。あるいは、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料中の膜結合アクチンのレベルと同等以上である場合に、転移性がんは進行していると決定され得る。
別の態様では、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定することを含む、転移性がんの治療が成功した対象における転移性がんの再発をモニタリングする方法であって、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料で測定された膜結合アクチンのレベルより低い場合に、転移性がんは再発していないと決定される方法が提供される。あるいは、試料中の測定された膜結合アクチンのレベルが、対象から得られた以前の対応する試料で測定された膜結合アクチンのレベルと同等以上である場合に、転移性がんは再発していると決定され得る。対応する試料は、治療成功の決定の時点で、または治療成功の決定の１週間、２週間もしくは４週間以内に採取されていてもよい。
本明細書における「対応する試料」への言及は、同じ対象から採取された同じタイプ、例えば同じ組織タイプの試料を指し得る。試料は、より早期の時点で好ましくは採取される。
本発明の任意の態様の方法は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行うことができる。好ましくは、方法はインビトロ方法である。
さらなる態様では、（ａ）がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、もしくは転移を発症している可能性があるかどうかを決定する、（ｂ）がんと診断された対象を予後診断する、（ｃ）対象を転移性がんと診断する、（ｄ）転移性がんの治療に対する対象の反応をモニタリングする、または（ｅ）転移性がんと診断された対象における疾患進行をモニタリングするためのキットであって、
膜結合アクチンを検出する手段を含み、
ｉ．目的の細胞タイプを同定する手段、および／または
ｉｉ．ＥＶを単離する試薬
のうちの１つまたは複数をさらに含んでもよいキットが提供される。
一実施形態では、膜結合アクチンはベータアクチンである。
膜結合アクチンを検出する手段は、抗体などのアクチン結合ポリペプチドであってもよい。例えば、膜結合アクチンを検出する手段は、抗ベータアクチン抗体などの抗アクチン抗体であってもよい。膜結合アクチンを検出する手段は、アクチンに結合することができるアプタマーなどのＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。
目的の細胞タイプは、上皮細胞または循環腫瘍細胞であってもよい。循環腫瘍細胞は、上皮腫瘍細胞であってもよい。
目的の細胞タイプを同定する手段は、抗体などのＥｐＣＡＭ結合ポリペプチドであってもよい。目的の細胞タイプを同定する手段は、ＥｐＣＡＭに結合することができるアプタマーなどのＲＮＡまたはＤＮＡ分子であってもよい。
一実施形態では、キットは、試料からＥＶを単離する試薬をさらに含んでもよい。当業者は、試料からＥＶを単離するのに当技術分野で利用可能な任意の試薬セットを選択することができるであろう。選択される的確な試薬は試料の性質に依存し得、例えば、血液試料と特に適合する特定の試薬が選択され得る。
一実施形態では、キットは説明書のセットをさらに含んでもよい。
ある特定の非限定的な実施形態では、膜結合アクチンを検出する手段および／または目的の細胞タイプを同定する手段は、カラムマトリックス、アレイ、またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に結合されて提供されてもよい。あるいは、支持体はキットの別個の要素として提供することができる。
本明細書で使用される場合、用語「アクチン結合ポリペプチド」および「ＥｐＣＡＭ結合ポリペプチド」とは、アクチンまたはＥｐＣＡＭにそれぞれ結合する任意のポリペプチドを指し得る。そのようなポリペプチドは、Ｔ細胞受容体、または限定されるものではないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびにラクダ科動物単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を含む、抗体もしくはその抗原結合断片であってもよい。ベータアクチンなどのアクチンに特異的な、および／またはＥｐＣＡＭに特異的な、ポリクローナルでもモノクローナルでも抗体または抗原結合断片は、一般的に当業者には分かるように従来の免疫手法を使用して調製することができる。
目的の細胞タイプを同定する手段は、アプタマーなどのＥｐＣＡＭに結合することができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子も含み得る。
本明細書で言及される抗体、ポリペプチド、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子は、所与の抗体、ポリペプチドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子と結合されるかまたはこれらに連結される検出可能な標識を含んでもよい。そのような検出可能な標識には、例えば、化学発光分子もしくは蛍光分子（例えば、ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５またはＲＯＸ）、放射標識（例えば、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、またはペプチド／アミノ酸配列（例えば、Ｈｉｓ－Ｔａｇ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ）が含まれる。
任意の態様または実施形態では、がんは、乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは膵臓がんなどの上皮細胞がんであってもよく、またはこれらに由来してもよい。
転移性がんは、転移性乳がん、転移性結腸直腸がん、転移性肺がんまたは転移性膵臓がんであってもよい。
ＨＰＡまたはリンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素は、末端Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有するグリカンを検出するのに使用され得るリンゴマイマイに由来するレクチンである。本明細書で使用される場合、「ＨＰＡ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」および「ＨＰＡ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）」とは、有意なレベルのＧａｌＮＡｃをその表面に示し、それ故に高レベルのＨＰＡによって認識され、高レベルのＨＰＡに結合する細胞またはＥＶを指す。ＨＰＡ陰性細胞またはＥＶは、その表面にＧａｌＮＡｃを示さないかまたは低レベルのＧａｌＮＡｃを示し、それ故にＨＰＡによって認識されず、ＨＰＡに結合しないかまたは低レベルのＨＰＡにのみ結合する細胞として定義される。
試料中に細胞および／またはＥＶを含む試料は、試料中の細胞および／またはＥＶの約５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超がＨＰＡ陽性であるならば、ＨＰＡ陽性として同定され得る。
試料中に細胞および／またはＥＶを含む試料は、試料中の細胞および／またはＥＶの約５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超がＨＰＡ陰性であるならば、ＨＰＡ陰性として同定され得る。
任意の態様では、本発明は、細胞および／またはＥＶのＨＰＡ陽性のレベルを検出または測定することをさらに含んでもよい。
任意の態様では、本発明は、アクチンの検出もしくは測定に加えて、またはアクチンの検出もしくは測定に代わるものとして、ＨＰＡ陽性のレベルを検出または測定することをさらにまたはあるいは含んでもよい。ＨＰＡ陽性はＥＶで決定されてもよい。例えば、がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法では、方法は：
ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンおよび／またはＨＰＡ陽性のレベルを測定すること、
ｂ．対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンおよび／またはＨＰＡ陽性のレベルを、標準試料中の膜結合アクチンおよび／またはＨＰＡ陽性のレベルと比較すること、ならびに
ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンおよび／またはＨＰＡ陽性のレベルが、標準試料中の膜結合アクチンおよび／またはＨＰＡ陽性のレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
を含んでもよい。そのような方法では、ＥＶは必要に応じて残りの試料から単離、同定、または分離され得る。
図１は、１Ｄウェスタンブロットを使用して、ＧａｌＮＡｃが内皮細胞の複数のタンパク質に結合することを示す。Ａ．全内皮細胞タンパク質が抽出され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけられ、次いでウェスタンブロットが行われた。左側の膜はＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチンでプローブされ、いくつかのバンドを示した。陰性対照として右側の膜がＢＳＡ－ビオチンで標識され、バンドは観察されなかった。 図２は、質量分析による分析用に切除されたバンドを示す。どこでゲル断片が質量分析用に切除され、５つの断片が分析されたかを示す１Ｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびブロット。 図３は、２Ｄ ＰＡＧＥを使用して、ＧａｌＮＡｃが内皮細胞の複数のタンパク質に結合することを示す。ゲル断片が質量分析用に切除された箇所を示す２Ｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびブロット（合計１３断片）。 図４は、ＥＶが細胞接着を増加させ得ることを示す。ＥＶは静的接着アッセイの前に乳がん細胞から単離され、乳がん細胞か内皮細胞のどちらか、または両方とインキュベートされた。内皮細胞への乳がん細胞接着は、ＥＶの存在下で有意に増加される。乳がん細胞も内皮細胞も、ＥＶを用いて前処理される場合に最大の増加が見られる。３回の反復からのデータ、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）であり、行われた統計検定はＴｕｋｅｙ検定による一元配置ＡＮＯＶＡである。星印は、未処理対照と比べた有意性を示す。 図５は、プレクチンのノックダウンが、内皮細胞への乳がん細胞の接着を低減することを示す。ＭＣＦ７および／またはＨＵＶＥＣ細胞は、プレクチンを標的にする陰性スクランブルｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡで処理された。細胞接着は、プレクチンがどちらか一方の細胞株または両方の細胞株でノックダウンされる場合に有意に減少される。３回の反復からのデータ、エラーバーは平均値の標準誤差であり、行われた統計検定はＴｕｋｅｙ検定による一元配置ＡＮＯＶＡである。星印は、未処理対照と比べた統計的有意性を示す。 図６は、組換えプレクチンを用いた乳がん細胞の処理が、内皮細胞への細胞接着を低減することを示す。ＭＣＦ７細胞は未処理であるか、または静的接着アッセイを行う前に０．１ｕｇ／ｍｌ組換えプレクチンで処理された。組換えプレクチンによるＭＣＦ７細胞の処理は、内皮細胞への細胞接着を有意に減少させる。３回の反復からのデータ、エラーバーは平均値の標準誤差であり、行われた統計検定はＴｕｋｅｙ検定による一元配置ＡＮＯＶＡである。 図７は、プレクチンがノックダウンされたがん細胞では、「野生型」がん細胞由来のＥＶにより細胞接着が部分的に回復され得ることを示す。プレクチンは、ＭＣＦ７細胞でｓｉＲＮＡを使用してノックダウンされ（２番目の列）、内皮細胞への接着の低下を示す。野生型ＭＣＦ７細胞由来のＥＶで処理されたプレクチンノックダウンＭＣＦ７細胞は、内皮細胞への接着の部分的回復を示す。３回の反復からのデータ、エラーバーは平均値の標準誤差であり、行われた統計検定はＴｕｋｅｙ検定による一元配置ＡＮＯＶＡである。 図８は、ＭＣＦ７細胞が、ＢＴ４７４細胞より多くのＨＰＡ結合タンパク質を有することを示す。プローブとしてのビオチン化ＨＰＡおよびローディング対照として使用される抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用してウェスタンブロットする前に、２種類の乳がん細胞株からの溶解物がＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけられた。ＭＣＦ７溶解物は、７２ｋＤａの１つのＨＰＡ結合バンドしかなかったＢＴ４７４細胞からの溶解物より多くのＨＰＡ結合バンドを含有した。 図９は、細胞のＨＰＡ結合能とそれらの細胞によって産生されたＥＶのＨＰＡ結合能の間の正の相関を示す。ＭＣＦ７およびＢＴ４７４細胞ならびにこれらの細胞によって産生されたＥＶのＮａｎｏｖｉｅｗ分析。ＨＰＡ陰性ＢＣ細胞株（ＢＴ４７４、左）およびＨＰＡ陽性ＢＣ細胞株（ＭＣＦ７、右）ＥＶは、蛍光コンジュゲート抗体で標識された（第１のカラム＝ＣＤ８１、第２のカラム＝ＣＤ９、第３のカラム＝ＨＰＡ）。ＢＴ４７４ ＥＶはＨＰＡ陰性であることが見出されたが、ＭＣＦ７ ＥＶはＨＰＡ陽性であった。ＭｉｇＧは非特異的結合のレベルを示す陰性対照を指す。 図１０は、細胞表面ベータアクチンの遮断が、内皮細胞への乳がん細胞接着を低減したことを示す。ＭＣＦ７細胞は未処理か、またはベータアクチンもしくはＧＡＰＤＨに対する抗体で処理された。ＧＡＰＤＨは対照として使用される。無処理ＭＣＦ７ ＢＣ細胞と比べて、抗ベータアクチン抗体とインキュベートされた細胞は内皮細胞への接着が有意に少ない。３回の反復からのデータ、エラーバーはＳＥＭである。 図１１は、細胞表面ベータアクチンレベルがＨＰＡ結合能／転移能と相関することを示す。表面アクチンを検出するのにフローサイトメトリーが使用された。（Ａ）：高転移性およびＨＰＡ陽性ＭＣＦ７ ＢＣ細胞の表面のベータアクチンの発現は、非転移性および弱ＨＰＡ陽性ＢＴ４７４細胞、ならびに中程度浸潤性および中程度ＨＰＡ陽性ＺＲ７５１ ＢＣ細胞での発現より多いことを示す。高転移性およびＨＰＡ陽性ＭＣＦ７ ＢＣ細胞の表面のベータアクチンの発現は、浸潤性および高度ＨＰＡ陽性Ｔ４７Ｄ ＢＣ細胞に匹敵する。（Ｂ）ＭＣＦ７およびＢＴ４７４細胞における表面ベータアクチンの発現が、ＨＰＡ陰性、正常な乳房細胞ＨＭＥよりはるかにより高いことを示す。 図１２は、転移性乳がん細胞（ＭＣＦ７）が、その表面に非転移性乳がん細胞（ＢＴ４７４）より多くのアクチンを有することを示す。データはフローサイトメトリーによって回収された。Ｐａはパンアクチンを標的にするアクチン抗体を指す。ＩｇＧは非特異的結合のレベルを示す陰性対照を指す。抗体なし（ｎｏ ａｎｔｉ）は、バックグラウンド自己蛍光発光を示すために添加されている抗体がないことを指す。 同上 図１３は、転移性がん細胞が、その表面に非転移性がん細胞より多くのＨＰＡを有することを示す。データは、乳がん（ＭＣＦ７は転移性であり、ＢＴ－４７４は非転移性である）、結腸直腸がん（ＳＷ４８０は転移性であり、ＨＴ－２９は非転移性である）および肺がん（Ａ５３９は転移性であり、ＮＣＩ－Ｈ３２２は非転移性である）の転移性および非転移性細胞タイプのペアに関してフローサイトメトリーによって回収された。 同上 図１４は、転移性細胞形質膜が、非転移性細胞より多くのアクチンを有することを示す。データは細胞株のプローブされた膜抽出物からドットブロットによって得られた。ＡＣＴＢはアクチンベータを認識する抗体であり、ＡＣＴＧはアクチンガンマを認識する抗体である。結果は、バックグラウンドに対して調整され、全膜からのシグナルに対して正規化されたシグナルの強度として表されている。 図１５は、肺転移性がん微小胞が、非転移性細胞由来のものより多くのアクチンを有することを示す。データはドットブロットによって得られた。データは、転移性肺がん（Ａ５４９）または非転移性肺がん（ＮＣＩ－Ｈ３２２）のどちらか由来の微小胞への様々な異なる抗体の結合レベルを示す。がんタイプごとにバー１、５および６は、それぞれ対照（ＩｇＧ）、Ｇｍ１３０および抗体なしであり、バー２、３、および４はベータアクチン抗体の３つの異なるクローンを表す。示された結果は、転移性肺がん細胞から得られた微小胞により多くの膜結合アクチンがあることを明白に示している。結果は、バックグラウンドに対して調整され、一次抗体なしに対して正規化されたシグナルの強度として表されている。 図１６は、膵臓転移性がん微小胞が、非転移性細胞より多くのアクチンを有することを示す。データはドットブロットによって得られた。図１６Ａ－データは、転移性膵臓がん（ＭＩＡＰａＣａ２）または非転移性膵臓がん（ＢＸＰＣ－３）のどちらか由来の微小胞への様々な異なる抗体の結合レベルを示す。がんタイプごとにバー１、５および６は、それぞれ対照－ＩｇＧ、Ｇｍ１３０および抗体なしであり、バー２、３、および４は３つの異なるベータアクチン抗体を表す。示された結果は、転移性膵臓がん細胞から得られた微小胞により多くの膜結合アクチンがあることを明白に示している。図１６Ｂ－データは、転移性膵臓がん（ＭＩＡＰａＣａ２）または非転移性膵臓がん（ＢＸＰＣ－３）のどちらか由来の微小胞への様々な異なる抗体の結合レベルを示す。がんタイプごとにバー１、３および４は、それぞれ対照－ＩｇＧ、Ｇｍ１３０および抗体なしであり、バー２はガンマアクチン抗体である。示された結果は、転移性膵臓がん細胞から得られた微小胞により多くの膜結合ガンマアクチンがあることを明白に示している。結果は、バックグラウンドに対して調整され、一次抗体なしに対して正規化されたシグナルの強度として表されている。 同上 図１７は、転移性乳がん微小胞が、非転移性細胞より多くのアクチンを有することを示す。データはドットブロットによって得られた。図１７Ａ－データは、転移性乳がん（ＭＣＦ７）または非転移性乳がん（ＢＴ４７４）のどちらか由来の微小胞への様々な異なる抗体の結合レベルを示す。がんタイプごとに、バー１、５および６は、それぞれ対照－ＩｇＧ、Ｇｍ１３０および抗体なしであり、バー２、３、および４は３つの異なるベータアクチン抗体を表す。示された結果は、転移性肺がん細胞（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）から得られた微小胞により多くの膜結合アクチンがあることを明白に示している。図１７Ｂ－データは、転移性乳がんまたは非転移性乳がんのどちらか由来の微小胞への様々な異なる抗体の結合レベルを示す。がんタイプごとに、バー１、３および４は、それぞれ対照－ＩｇＧ、Ｇｍ１３０および抗体なしであり、バー２はガンマアクチン抗体である。示された結果は、より多くの膜結合があることを明白に示している。結果は、バックグラウンドに対して調整され、一次抗体なしに対して正規化されたシグナルの強度として表されている。 同上 図１８は、転移性乳がん細胞に由来するエキソソームが、非転移性乳がん細胞に由来するエキソソームより多くのアクチンを有することを示す。データはドットブロットによって得られた。結果は、ＩｇＧ対照に対して正規化されたシグナルの強度として表されている。 図１９は、非転移性乳がん細胞に由来するエキソソームよりはるかに大きな割合の転移性乳がん細胞に由来するエキソソームが、アクチン陽性であることを示す。データはＮａｎｏＦＣＭによって得られた。これは、集団の割合の直接比較（ｄｉｒｅｃｔ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を可能にする単一粒子検出法であり、全シグナルのドットブロット平均を支持するものである。試料はパンアクチン抗体を用いてプローブされた。 図２０は、非転移性結腸直腸がん細胞に由来するエキソソームより大きな割合の転移性結腸直腸がん細胞に由来するエキソソームが、アクチン陽性であることを示す。データはＮａｎｏＦＣＭによって得られた。これは、集団の割合の直接比較を可能にする単一粒子検出法であり、全シグナルのドットブロット平均を支持するものである。試料はパンアクチン抗体を用いてプローブされた。陽性ＥＶの転移性割合は、非転移性割合と比べた倍率変化として表されている。 図２１は、非転移性結腸直腸がん細胞に由来するエキソソームより大きな割合の転移性結腸直腸がん細胞に由来するエキソソームが、ＨＰＡ陽性であることを示す。データは、Ｎａｎｏｖｉｅｗのものとは独立した単一粒子分析法としてのＮａｎｏＦＣＭによって得られ、異なる組織タイプにおける図９の知見を支持するものである。 図２２は、同等の非転移性がん細胞に由来するエキソソームより大きな割合の（Ａ）転移性乳がん細胞（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ）に由来するエキソソーム、および（Ｂ）転移性結腸直腸がん細胞に由来するエキソソームが、ガンマアクチン陽性であることを示す。データはＮａｎｏＦＣＭによって得られた。
本発明は、上皮がん細胞および／またはそれに由来する細胞外小胞の表面の膜結合アクチンの存在および／またはレベルと、これらのがん細胞の転移能の間の正の相関の発見に一部基づく。
したがって、細胞表面、または細胞外小胞の膜におけるアクチンの存在、またはアクチンのレベルの増加の決定は、臨床医ががん細胞の転移能を正確に同定すること、ならびにがんの病期を分類および／または予後を診断することを可能にし得る。これにより、より後期の乳がん患者、または転移を発症する可能性があるかもしくは既に発症している可能性がある者の同定が可能になるため、該患者はより早い、より適切な治療を受けることができる。方法はまた、治療に対する患者の反応をモニタリングおよび／または疾患進行をモニタリングするのにも使用され得る。
さらに、本発明は、不必要なリンパ節生検を患者が回避できるようにする可能性がある。例えば、本発明は、原発腫瘍または原発腫瘍周囲から得られた組織、例えば、乳がんの診断を下すのに使用される初回生検からの乳房組織、または治療中、乳房組織の除去後の乳房組織に由来する細胞で行うことができる。さらにまたはあるいは、細胞外小胞の膜にあるアクチンのレベルを検出または決定する場合、本発明は、生検を必要とすることなく容易に利用できる生体液で行うことができる。本発明は、がんの転移能、病期分類の決定、特定の治療を速く、低侵襲もしくは非侵襲的に、および／または外科的介入の前に行う必要がある患者の診断、予後診断および／または同定を可能にし得る。
当業者は、膜結合アクチンのレベルを検出または測定するのに当技術分野のいくつかの方法または手法が使用され得ることを理解するであろう。適切な手法には、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフローアッセイ、膜の生化学的または機械的分離／単離後のウェスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、および質量分析が含まれる。任意の態様では、アクチンの検出は、例えば、アクチンを検出する一次検出試薬、および一次検出試薬を特異的に検出する二次検出試薬を使用した、直接的または間接的検出であってもよい。二次検出試薬は標識されてもよい。本発明はそれ故に、高度に特殊な装置または訓練を必要とすることなく、世界中の多くの病院または検査室で広く採用され得る。
一実施形態ではアクチンのレベルは、アクチンと検出剤との複合体を形成し、次いでアクチン／検出剤複合体を検出することによって検出されてもよい。
当業者は、試料からＥＶを単離するのに当技術分野のいくつかの方法または手法が使用され得ることを理解するであろう（Konoshenko et al., 2018, BioMed. Res. Intl.で概説されている）。
本明細書で言及されるアクチンは、宿主種に内因性であるタンパク質である。ヒトでは、例えば、アクチンは、ＡＣＴＢ遺伝子によってコードされるタンパク質であるベータアクチンを指し得る。アクチンは、ＡＣＴＡ１またはＡＣＴＡ２遺伝子によってコードされるタンパク質であるアルファアクチンを指し得る。アクチンは、ＡＣＴＧ１またはＡＣＴＧ２遺伝子によってコードされるタンパク質であるガンマアクチンを指し得る。
「膜結合アクチン」とは、本明細書で使用される場合、細胞の表面、好ましくは細胞の形質膜中／上に存在するかもしくは検出可能な、または細胞外小胞の表面に存在するかもしくは検出可能な、ベータアクチンなどのアクチンを指す。アクチンは、グリコシル化目印などの翻訳後修飾を有してもよい。アクチンは、細胞および／またはＥＶを化学的または機械的に破壊する必要なしに検出可能であり得る。アクチンは、機械的および／または化学的に破壊された細胞および／またはＥＶの膜画分で検出可能であり得、前記画分は細胞またはＥＶの形質膜の膜のみを含む。検出または測定されるアクチンは、内在性膜タンパク質または内在性膜タンパク質と相互作用し得る表在性膜タンパク質であってもよい。
「転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性がある」とは、本明細書で使用される場合、本発明の態様および／または実施形態に記載された必要な特徴を持たない対象と比較した、転移を発症するかまたは既に発症している可能性の増加を指す。
本明細書で使用される場合、用語「より高い（ｈｉｇｈｅｒ）」とは、標準試料中の膜結合アクチンのレベルより少なくとも約５％以上、少なくとも約１０％以上、少なくとも約２０％以上、少なくとも約５０％以上、少なくとも約１００％以上、少なくとも約２００％以上、少なくとも約３００％以上、少なくとも約４００％以上、少なくとも約５００％以上、少なくとも約１０００％以上、少なくとも約２０００％以上、少なくとも約５０００％以上、少なくとも約１００００％以上、少なくとも約２００００％以上、少なくとも約５００００％以上、少なくとも約１０００００％以上、少なくとも約５０００００％以上、少なくとも約１００００００％以上高い数を指し得る。あるいは、用語「より高い」とは、標準試料中の膜結合アクチンのレベルより少なくとも約１倍以上、少なくとも約２倍以上、少なくとも約３倍以上、少なくとも約４倍以上、少なくとも約５倍以上、少なくとも約１０倍以上、少なくとも約２０倍以上、少なくとも約５０倍以上、少なくとも約１００倍以上、少なくとも約２５０倍以上、少なくとも約５００倍以上、少なくとも約１０００倍以上、少なくとも約５０００倍以上、少なくとも約１００００倍以上、少なくとも約２０，０００倍以上、少なくとも約５０，０００倍以上、少なくとも約１０００００倍以上、少なくとも約５０００００倍以上高い数を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「アクチン結合ポリペプチド」および「ＥｐＣＡＭ結合ポリペプチド」とは、アクチンまたはＥｐＣＡＭにそれぞれ結合する任意のポリペプチドを指し得る。そのようなポリペプチドは、Ｔ細胞受容体、または限定されるものではないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を含む、抗体もしくはその抗原結合断片であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「対象から得られた試料」とは、組織、組織試料、生検、細胞試料、腫瘍試料、糞便試料、および生体液、例えば血漿、血清、血液、尿、リンパ液、腹水、唾液の試料を含む、対象、例えばヒト対象から得られた生体物質の試料を指す。一実施形態では、試料は例えば、対象由来の乳房組織の生検からの組織試料である。一実施形態では、試料は対象から得られた血液試料である。
用語「患者」または「対象」とは、本明細書で互換的に使用される場合、任意の哺乳動物、例えばヒトを指す。非ヒト哺乳動物の非限定的な例には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、家禽、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が含まれる。
本開示では、「生検」と記載される試料は、関連する医学技術の当業者に周知の方法を使用して、従来の方法によって得ることができる。生検試料を得る方法には、大きな塊への腫瘍の分割、またはマイクロダイセクション、または当技術分野で公知の他の細胞分離方法が含まれる。腫瘍細胞は、小ゲージ針を用いた吸引による細胞診によってさらに得ることができる。試料の保存および取り扱いを簡単にするために、試料は、ホルマリンで固定され、パラフィンに浸されてもよく、または最初に凍結され、次いで、迅速凍結を可能にする極低温媒体への浸漬によるＯＣＴ化合物などの組織凍結媒体に浸されてもよい。試料を保存および／または処理する他の方法は当業者に公知である。
試料は、目的の細胞タイプを単離する、またはＥＶを単離するために操作されてもよい。例えば、組織試料または生検中の目的の細胞タイプに対するマーカーが、そのような細胞を単離または分離するのに使用され得る。一例は、ベータアクチンなどの膜結合アクチンが検出されるかまたはレベルが決定される前に、生検で採取された組織から上皮細胞を同定および／または分離するためのＥｐＣＡＭ結合ポリペプチドの使用である。別の例は、試料中の他のＥＶおよび／または生体物質から、上皮細胞に由来するＥＶを同定および／または分離するためのＥｐＣＡＭ結合ポリペプチドの使用である。
標準試料とは、同等の試料、例えば対象もしくは他の対象から得られた試料と同じ組織および／もしくは細胞タイプか、または対象から得られた試料タイプに非常によく似た細胞株からの同等の試料を指し得る。
「陰性標準試料」とは、非がん性であるか、またはがん性である／不死化されているが転移を発症していないかもしくは発症しないことが分かっている標準試料を指し得る。例えば、陰性標準試料は、対象の腫瘍を取り囲む領域由来の対応する試料、例えば生検試料、または１つもしくは複数の健康な対象由来の対応する組織であってもよい。陰性標準試料はまた、性質が非転移性であることが分かっており、対象について得られた試料と同じまたは類似した性質である細胞株、例えば、対象から得られた乳房組織試料の陰性標準試料として浸潤性が低いことが分かっている乳房上皮細胞株、例えばＢＴ４７４細胞［Lasfargues et al., 1978, J. Nat. Cancer Institute, 61(4): 967-978］、または良性線維嚢胞性乳房組織から単離されたＨＭＴ３５２２ヒト乳房上皮細胞［Briand et al, 1987, In Vitro Cell and Dev. Biol., 23 (3): 181-188］であってもよい。
膜結合アクチンの存在またはレベルがＥＶで検出または測定される場合、陰性標準試料とは、がんを有さない１つもしくは複数の対象、もしくはがんを有する／有した、および転移を発症していないかもしくは発症しなかった１つもしくは複数の対象から、または上記のような浸潤性が低いことが分かっている比較細胞株から単離されたＥＶを指し得る。
故に、そのような陰性標準試料で検出または測定された膜結合アクチンのレベルは、陰性対照としての役割を果たす。
「陽性標準試料」とは、浸潤性であることが分かっているがん性の、および／または転移を発症しているかもしくは発症する可能性があることが分かっている標準試料を指し得る。例えば、陽性標準試料は、転移を発症していることが分かっている１つまたは複数の対象由来の対応する試料、例えば生検試料であってもよい。陽性標準試料はまた、性質が浸潤性および／または転移性であることが分かっており、対象について得られた試料と同じまたは類似した性質である細胞株、例えば、対象から得られた乳房組織試料の陽性標準試料として浸潤性が高いことが分かっている乳房上皮細胞株、例えばＭＣＦ７細胞［Soule et al., 1973, J. Nat. Cancer Institute, 51(5): 1409-14-16］であってもよい。
膜結合アクチンの存在またはレベルがＥＶで検出または測定される場合、陽性標準試料とは、がんを有する／有した、および転移を発症した１つまたは複数の対象から、または上記のような浸潤性が高いことが分かっている比較細胞株から単離されたＥＶを指し得る。
故に、そのような陽性標準試料で検出可能なまたは測定された膜結合アクチンのレベルは、陽性対照としての役割を果たす。
がんと診断された対象由来であり、上記の標準試料の膜結合ベータアクチンのレベルより高いレベルが測定された試料は、転移を発症するかもしくは発症している可能性がより高い、または転移性がんと診断される可能性がより高いとして同定され得る。患者にとって適切な治療レジメンが、次いで特定および提供され得る。
当業者は、転移が確認されているかもしくは記録された転移がない対象から、または性質が転移性であるかもしくは非転移性であることが分かっている細胞株から、所与の試料タイプ中の膜結合アクチンのレベルが記録されているデータベースを調べることができ得る。当業者は、必要に応じてそのような転移性または非転移性細胞株を容易に同定することができる。
当業者は、本発明の任意の１つの実施形態および／または態様の好ましい特徴が、本発明の全ての他の実施形態および／または態様に適用され得ることを理解するであろう。
材料および方法
Figure 2023539727000002
Figure 2023539727000003
内皮細胞からのタンパク質抽出および定量化
ＨＵＶＥＣ細胞をコンフルエンスまでＴ１７５フラスコで増殖させ、次いで完全増殖培地で加湿雰囲気中、３７℃、２時間、１０ｕｇ／ｍｌ ＴＮＦαで処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を短時間遠心分離してペレット化し、上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｕｌ／ｍｌを添加した１×ＲＩＰＡ緩衝液にペレットを再懸濁し、４℃で３０分間エンドオーバーエンドミキサーに入れた。この時間後、チューブを１３，０００ＲＰＭで４℃、２０分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍｌチューブに移し、ペレットを捨てた。抽出したタンパク質をＢＣＡアッセイを使用して定量化した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
タンパク質試料１０ｕｇを、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液３ｕｌおよび１Ｍ ＤＴＴ １ｕｌを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥに使用した。これを混合し、１００℃に１０分間加熱し、次いで氷上に置いた。試料をＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｕｒ Ｓｔａｎｄａｒｄと共に、１×ＴＧＳ緩衝液中ミニＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸステインフリープレキャストゲル（１２％）に流した。ゲルを１００ボルトで２時間実行した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｄｉ ＰＶＤＦ転写パックを使用してタンパク質を転写した。ゲルを膜の上に置き、層の間に挟み、次いでＴｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ機に高ＭＷ設定で入れた。膜を振盪台で５分間、ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。膜を次いで振盪台ＲＴで２時間、５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴとインキュベートして遮断した。遮断した膜は、５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１ｕｇ／ｍｌ ＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチン１０ｍｌ、または５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ－ビオチン１０ｍｌで一晩、４℃でインキュベートした。膜を５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴで５分間、３回洗浄した後、膜を５％ ＢＳＡ－ＴＢＳＴ中５ｕｇ／ｍｌストレプトアビジン－ＨＲＰ １０ｍｌで１時間、室温でインキュベートした。膜を５％ ＢＳＡ－ＴＢＳＴで５分間、２回、次いで１回、１５分間洗浄した。ＨＲＰ基質を１：１比で調製し（Ｃｌａｒｉｔｙ＋Ｃｌａｒｉｔｙ Ｍａｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＲａｄ、１７０－５０６０）、混合した。これを膜に添加し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（登録商標）トランスイルミネーターで画像化した。
２Ｄ ＰＡＧＥ
プロテアーゼ阻害剤を添加した１×ＲＩＰＡ緩衝液中１ｕｇ／ｕｌの濃度で活性化した全ＨＵＶＥＣタンパク質を、２Ｄ ＰＡＧＥで使用するためにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の２Ｄ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキットを用いて、製造者の説明書（８０－６４８４－５１）に従って精製した。試料を、ＢｉｏＲａｄ製のＲｅａｄｙＰｒｅｐ ２－Ｄスターターキットを用いて製造者の説明書（１６３－２１０５）に従って２Ｄ ＰＡＧＥ用に調製した。これにより、試料を１１ｃｍ ＩＰＧストリップに吸収させ、次いでその後Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ ３で等電点電気泳動によって１６時間分離できるようになった。ＩＰＧストリップを洗浄し、再水和し、次いでＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＸＴ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプレキャストゲルに入れ、１２％ゲルをタンクに充填し、標準物質を添加し、ゲルをアガロースで封入した。アガロースは、タンクに充填する前に１×ＭＯＰＳ緩衝液で固定した。ＮｕＰａｇｅ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＮＰ０００５）２５０ｕｌをゲルごとに添加した。ゲルを２００ボルトで７０分間実行した。ブロッティングするゲルをそのカセットから除去し、ｄＨ２Ｏで２回洗浄した。残りの手順を室温で実施した。ゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＬＣ６０６５）に入れ、振盪台に１時間置いた。次いで、ゲルを振盪台で一晩、ｄＨ２Ｏで脱染した。ゲルをｉＢｌｏｔ（商標）２ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用してブロッティングした。膜をｄＨ２Ｏで簡単に洗浄し、次いでロッキングプラットフォームで５％ Ｍａｒｖｅｌ／ＴＢＳＴを用いて１時間遮断した。膜をロッキングプラットフォームで５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１ｕｇ／ｍｌ ＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチンと２時間インキュベートし、次いでロッキングプラットフォームで３回、それぞれ１０分間、ＴＢＳＴで洗浄した。膜をロッキングプラットフォームで１時間、５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中５ｕｇ／ｍｌストレプトアビジン－ペルオキシダーゼとインキュベートし、次いでロッキングプラットフォームで３回、それぞれ１０分間、ＴＢＳＴで洗浄した。ＥＣＬ ＨＲＰ基質を調製し、膜に添加し、次いでＣｈｅｍｉｄｏｃ（登録商標）トランスイルミネーターを使用して画像化した。
質量分析用のゲルの調製
１Ｄゲルをクマシーブルーで染色し、２Ｄゲルを銀染色で染色し、次いで参照としてブロットを使用して、目的のバンドおよびドットを１Ｄおよび２Ｄ ゲルから切除した。ゲルを次いでＰｏｒｔｏｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｌｔｄ．での質量分析に送った。
がん細胞からのＥＶ抽出
がん細胞を７０％コンフルエンシーまでＴ１７５フラスコで増殖させ、２５ｍｌ／フラスコのＥＶ除去培地（ＦＢＳを前もって１２０，０００ｇで１６時間回転させて存在するＥＶを除去した、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）を供給し、４８時間馴化させた。培地を除去し、３００×ｇで５分間、次いで１６，０００×ｇで２０分間、４℃で回転させた。培地をフラスコから「ノーマル」５０ｍｌチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、２２７２８５）に除去し、３００×ｇで５分間回転させた。微小胞については、上清を高速（トップが緑色またはオレンジ色の）５０ｍｌチューブ（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＴ１１２０）に移し、ペレットを捨て、１６０００ｇで２０分間遠心分離する。上清をノーマル５０ｍｌチューブに移す－これがＥＶ部分である。ペレットは微小胞を含有する。微小胞をプールし、ＰＢＳ ２０ｍｌに再懸濁する。これを次いで再び１６０００ｇで２０分間回転させる。上清をチューブから注ぎ出し、約３００ｕｌを残す容量のＰＢＳにペレットを再懸濁する。ＰＢＳ中０．１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７９０６－１００Ｇ）溶液（４０ｍｌ ＰＢＳ中１０％ ＢＳＡ ４０μｌ）を使用して０．２２ミクロン（Ｆｉｓｈｅｒ、ｆｄｒ－０５０－０７１ｎ）フィルターを遮断し、このフィルターにより培地を濾過する。培地をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０ １００ｋＤａ濃縮装置（Ｆｉｓｈｅｒ、１０７７４７９７に添加する。培地を３０００ｇ（スイングバケット－２５分）または５０００ｇ（固定角ローター－２０分工程）で回転させて濃縮する。
エキソソームについては、０．１％ ＢＳＡで遮断した０．２２ｕｍフィルターにより上清を濾過した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０、１００ｋＤａ濃縮装置を使用して上清を５００ｕｌに濃縮した。ＳＥＣカラム（ＢｉｏＲａｄ、７３２１０１０）を、セファロース１４ｍｌおよびＰＢＳ １０ｍｌを添加して調製し、これを２時間沈殿させ、次いでカラム支持体を添加し、ＰＢＳを通過させた。カラムを次いでＰＢＳ １０ｍｌで３回洗浄した。試料５００ｕｌをカラム支持体に添加し、吸着させ、次いでＰＢＳ １０ｍｌを添加した。フロースルー２．５ｍｌを回収し、捨て、次いでフロースルー２ｍｌを回収した（ＥＶを含有）。Ｐａｒｔｉｃｌｅｍａｔｒｉｘ（商標）粒子分析器を使用してＥＶを定量化した。ＥＶは、次いで短期使用のために冷蔵庫で保管してもよい。
ＥＶありまたはなしの内皮静的接着アッセイ
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。ＭＣＦ７乳がん細胞をＴ７５フラスコで７０％コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中１０ｍｇ／ｍｌ ８－ヒドロキシピレントリスルホン酸（ＨＴＰＳ）で３７℃、５％ ＣＯ２で２時間処理した。この時間後、ＨＴＰＳを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をＰＢＳ １０ｍｌで５回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。２０，０００細胞／ｍｌを調製した。ＭＣＦ７細胞をＥＶ ５００ｕｌまたはＰＢＳ ５００ｕｌのどちらかで処理し、ＲＴで１０分間混合した。ＨＵＶＥＣ細胞をＥＶ ５００ｕｌまたはＰＢＳ ５００ｕｌのどちらかで３７℃、５％ ＣＯ２で３０分間処理した。ＥＶまたはＰＢＳを細胞から除去し、２０，０００細胞／ｍｌのＭＣＦ７細胞をウェルごとに添加し、１０分間をインキュベートし、細胞を除去し、加温したＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで４％ ＰＦＡで１０分間、ＲＴで固定した。固定液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いでフルオロマウント（商標）を使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。ＭＣＦ７乳がん細胞をＴ７５フラスコで７０％コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中１０ｍｇ／ｍｌ ＨＴＰＳで３７℃、５％ ＣＯ２で２時間処理した。ＨＴＰＳを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をＰＢＳ １０ｍｌで５回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。２０，０００細胞／ｍｌを調製した。ＭＣＦ７細胞を、ＰＢＳ中０．１ｕｇ／ｍｌ組換えプレクチン（２ｂ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＫＵ ＲＰＣ７５４Ｈｕ０１（ヒトプレクチンＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ１５１４９の残基Ａｓｐ １７５～Ｐｒｏ ４００、アクチン結合ドメインに対応）、またはＰＢＳのどちらかで１０分間、ＲＴで処理した。組換えプレクチンまたはＰＢＳを細胞から除去し、２０，０００細胞／ｍｌのＭＣＦ７細胞をウェルごとに添加し、１０分間インキュベートし、細胞を除去し、加温したＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで４％ ＰＦＡで１０分間、ＲＴで固定した。固定液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
プレクチンサイレンシングおよびＥＶレスキューありまたはなしの内皮静的接着アッセイ
ＭＣＦ７およびＨＵＶＥＣ細胞を７０％コンフルエンシーまで２４ウェル細胞培養プレートで増殖させ、細胞をＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬および５ｕＭのプレクチンｓｉＲＮＡまたはスクランブル陰性対照で２４時間処理した。一部のＨＵＶＥＣおよびＭＣＦ７細胞は無処理であった。ＨＵＶＥＣ細胞を完全培地中１０ｕｇ／ｍｌ ＴＮＦａで３７℃、５％ ＣＯ２で２時間処理して活性化した。ＭＣＦ７乳がん細胞をＴ７５フラスコで７０％コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中１０ｍｇ／ｍｌ ＨＴＰＳで３７℃、５％ ＣＯ２で２時間処理した。ＨＴＰＳを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をＰＢＳ １０ｍｌで５回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。２０，０００細胞／ｍｌを調製した。ＭＣＦ７細胞を、上に概説した抽出方法を使用して単離したＥＶ ５００ｕｌ、またはＰＢＳ ５００ｕｌのどちらかで１０分間、ＲＴで処理した。ＥＶまたはＰＢＳを除去し、ＭＣＦ７細胞１ｍｌをＨＵＶＥＣ細胞に添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で１０分間インキュベートした後、細胞を除去し、加温したＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで４％ ＰＦＡで１０分間、ＲＴで固定した。固定液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
ドットブロットアッセイ
形質膜タンパク質抽出キット（Ａｂｃａｍ、ａｂ５６４００）、エキソソーム／ＭＶを結合プロトコールでのように使用して膜単離を行った。細口ピペットチップを使用して、２μｌの試料または緩衝液をニトロセルロース膜にスポットした。溶液をゆっくり適用して、溶液が浸透する面積を最小化する（通常は３～４ｍｍ）。膜を約３０分間乾燥させる。各膜を６ウェルプレートの内側に入れる。膜をＴＢＳ－Ｔ中５％ ｍａｒｖｅｌ、またはＨＰＡについては０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を用いてｄＨ２Ｏで希釈したＣａｒｂｏ－ｆｒｅｅブロッキング溶液（２ＢＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＰ－５０４０－１２５）に浸漬して遮断する（１時間、ＲＴ）。Ｃａｒｂｏ－Ｂｌｏｃｋ－Ｔ中１０ｕｇ／ｍｌビオチン化ＨＰＡ、または全ての抗体については１：１，０００と、ＴＢＳ－Ｔ中５％ ｍａｒｖｅｌで３７℃、２時間または４℃、一晩インキュベートする。膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄する（３×５分）。ビオチン化抗Ｍｓ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＢＡ－２０００－１．５）またはビオチン化抗Ｒｂ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、ＢＡ－１０００－１．５）と５％ ｍａｒｖｅｌ ＴＢＳＴで３７℃、１時間インキュベートする。膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄する（３×５分）。５％ ｍａｒｖｅｌ ＴＢＳ－Ｔ、またはＨＰＡについてはＣａｒｂｏ－Ｂｌｏｃｋ－Ｔで１ｕｇ／ｍｌストレプトアビジン－ペルオキシダーゼとインキュベートする。ＴＢＳで３回洗浄する（３×１０分）。ＥＣＬ基質ＡおよびＢ（ＢｉｏＲａｄ Ｃｌａｒｉｔｙキット）を混合する。各膜をＥＣＬ試薬と１分間インキュベートし、過剰な溶液を表面から除去し、ケミ高感度ブロット（ｃｈｅｍｉ－ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｌｏｔ）として画像化する。
ＭＣＦ７およびＢＴ４７４乳がん細胞のウェスタンブロット後のＨＰＡプロービング
ＭＣＦ７およびＢＴ４７４細胞株は、以前に記載したようにＴ７５フラスコで７０％コンフルエンスまで増殖させ、それらのタンパク質を抽出し、定量化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、次いでブロッティングした。ビオチン化ＨＰＡまたは抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用して膜をプローブした。
Ｎａｎｏｖｉｅｗ
ＮａｎｏｖｉｅｗｅｒによるＲ１００および分析のための標準的なプロトコールに従って、ＥＶをＭＣＦ７およびＢＴ４７４乳がん細胞からＳＥＣ（以前に記載）を使用して抽出し、蛍光コンジュゲート抗体（ＣＤ８１およびＣＤ９）およびＨＰＡレクチンで標識した。
カバースリップ上での活性化内皮細胞の調製
滅菌１３ｍｍ Ｄガラスカバースリップを２４ウェルプレートのウェルに置き、１００，０００ＨＵＶＥＣ細胞を播種した。細胞が単層になるまで細胞を３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。ＨＵＶＥＣ細胞を完全培地中１０ｕｇ／ｍｌ ＴＮＦαで３７℃、５％ ＣＯ２で２時間処理して活性化した。
アクチン抗体阻害ありまたはなしの内皮接着アッセイ
活性化内皮細胞を含むカバースリップを上記のように調製した。ＭＣＦ７乳がん細胞をＴ７５フラスコで７０％コンフルエンシーまで増殖させ、完全培地中１０ｍｇ／ｍｌ ＨＴＰＳで３７℃、５％ ＣＯ２で２時間処理した。この時間後、ＨＴＰＳを除去し、洗浄液が透明に流れるまで細胞をＰＢＳ １０ｍｌで５回洗浄した。細胞を擦り取り、カウントした。２０，０００細胞／ｍｌを調製した。ＭＣＦ７細胞を１：１，０００アクチンＩｇＧ（Ａｂｃａｍ ａｂ８２２７）、１：１，０００ ＧＡＰＤＨ ＩｇＧまたはＰＢＳのどちらかで３０分間、ＲＴで処理した。抗体またはＰＢＳを細胞から除去し、２０，０００細胞／ｍｌのＭＣＦ７細胞をウェルごとに添加し、１０分間インキュベートし、細胞を除去し、加温したＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄して全ての結合していない細胞を除去した。ウェルを次いで４％ ＰＦＡで１０分間、ＲＴで固定した。固定液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いでフルオロマウントを使用してカバースリップを乗せた。カバースリップごとの全接着細胞をカウントした。
フローサイトメトリー
生細胞試験のために、培養細胞を７０％コンフルエンス前後で収集し、アキュターゼを使用してフラスコの底から剥離した。細胞を遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）によって回収した。分析のために、０．５×１０６／ｍｌの濃度を有する細胞を使用した。細胞をＰＢＳで洗浄し、３％ ＢＳＡ／ＴＢＳ中、暗所、ＲＴで１０分間、ＨＰＡ抗体とインキュベートして（７．５μｇ／ｍｌ）、細胞の表面のＨＰＡ ＧａｌＮＡｃエピトープまたは１／５０アクチン（クローンＳＰ１２４）を検出した。細胞をヨウ化プロピジウム（１０ｕｇ／ｍｌ）で処理して生集団をゲートした。３７５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍおよび６３８ｎｍレーザーを備え、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェアを使用して操作する１３カラー、４レーザーＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ Ｎ－Ｖ－Ｂ－Ｒフローサイトメーターを使用して、６４７コンジュゲートの波長をＡＰＣ－Ａチャネルで定量的に記録した。
各試料を三重に分析し、分析した細胞の表面のＧａｌＮＡｃエピトープレベルの決定は、ＡＰＣ検出器からの蛍光シグナルの平均値に基づいた。ゲーティング：１）ＦＳＣ－Ｈ ｖｓ ＦＳＣ－Ａ － ダブレット除去、凝集している細胞は２倍の面積および高さを有することになる。２）Ｐｉ生存ゲート － 死細胞から生細胞を識別。死細胞は透過性になり、それ故にＰＩは核に結合し、それ故により多くの蛍光を有することになる（本発明者は、違いを示すために本発明者の非染色Ｐｉ対照も結合させた）３）異なる条件間でピークのシフトを決定するための目的の抗体／レクチンチャネル。
固定細胞については、細胞を収集し、冷ＰＢＳに再懸濁した。細胞を抗アクチンＡｂと４℃で１時間インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ：６０００８－１－Ｉｇ）。細胞を次いで洗浄し、フローサイトメトリー前にＰＢＳに再懸濁した。
ＮａｎｏＦＣＭ
ＮａｎｏＦＣＭは、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/jev2.12044およびhttps://doi.org/10.1002/jev2.12079で独立してレビューされている、エキソソーム分析に重点を置く４０ｎｍ～１ミクロンフローサイトメーターである。これらの結果は全て、ノッティンガム、ＵＫに拠点を置く企業によって行われた。エキソソームは以前に説明したように抽出した。機器は以下の設定でセットした：ＳＮ－Ｎ３０Ｅ、Ｖ１．１１ソフトウェア、試料圧力－１Ｋｐａ、レーザー－１０／５０ｍＷ ４８８＠ ２０／１００ｍＷ ６４０、ＳＳ減衰－１０％および最小幅－０．３ｍｓ。シリカナノ粒子を用いて検量し、ＥＶ濃度を定量化した。ＰＢＳ、抗体対照およびＥＶ非染色および染色最適化を行った。アクチン抗体については、約２ｅ８～２ｅ１０粒子を、抗体／染色と１／５０～１／５００で３０分間、室温でインキュベートし、ＰＢＳで１／５～１／５０に希釈した。ＨＰＡについては、約２ｅ８ 粒子を抗体／染色と１／５００で３０分間、室温でインキュベートし、次いでＰＢＳで１／２０～１／５０に希釈した。高いバックグラウンドの場合、１１０ｋ×ｇで１時間超遠心分離し、５０μｌに再懸濁した。上清を除去し、試料を５０ｕｌ ＰＢＳに再懸濁した。約４０～１９９ｎｍの間でゲートした事象を１分間記録し、そのサイズでゲートした全エキソソームの割合としての陽性シグナルを有するエキソソームの数として記録した。
Figure 2023539727000004
実施例１－転移能のバイオマーカーとしての膜結合アクチンの同定
エスカルゴ由来のレクチンであるリンゴマイマイ凝集素（ＨＰＡ）の、乳がん（ＢＣ）および他の上皮がんへの結合は、転移能および患者の予後不良と関連している［Brooks S., 2000, Histology and Histopathology, 15(1): 143-158］。ＨＰＡが何に特異的に結合するかは不明であるが、ＨＰＡは末端α－ＧａｌＮＡｃ（ＨＰＡが最も高い親和性を有する単糖）を有する一連の糖タンパク質に結合することが示されている。これらの糖タンパク質の１つががん関連Ｔｎ抗原（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ－ＧａｌＮＡｃ）である。がん関連Ｔｎ抗原は、Ｏ結合型グリコシル化で作られる初期構造であり、通常は常にさらに精密に作られるが、がんで頻発している（Brooks S.A. & Leathem A.J.C., 1995, British J. Cancer, 71: 1033-1038）。
高ＨＰＡ陽性ＢＣ細胞は、静的接着アッセイにおいて弱ＨＰＡ陽性またはＨＰＡ陰性ＢＣ細胞より有意に多く内皮細胞に接着する。このアッセイは、狭い毛細血管における転移性がん細胞停止を模倣している。がん細胞が転移に成功するには、がん細胞は血管に結合し、血管外遊出しなければならない。細胞をＨＰＡまたはＢＳＡ－ＧａｌＮＡｃとインキュベートすると細胞結合を阻害することから、結合はこのグリコシル化目印を通じて媒介されることが示されている。
ＨＰＡ陽性細胞接着を媒介する内皮細胞上の受容体の同定
ＢＣ細胞のＨＰＡ結合グリカンを認識している内皮細胞上の推定受容体を同定するために、ＴＮＦα（内皮受容体を上方制御することが知られている炎症性サイトカイン）を使用して活性化してある内皮細胞から全タンパク質を抽出した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、次いでブロッティングした。ＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチン（ＧａｌＮＡｃは、ＨＰＡが名目上最大の特異性を有する糖である）をプローブとして使用して、目的の内皮タンパク質を同定した。陰性対照としてＢＳＡ－ビオチンも使用して膜をプローブした。図１に例示するように、膜をＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチンでプローブするといくつかのバンドが観察されたが、膜をＢＳＡ－ビオチンでプローブした場合、バンドは観察されなかった。
ＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチンをプローブとして使用して、いくつかのバンドが一貫して同定された。これらから、５つのゲル断片を選択し、質量分析用に切除した（図２）。分離はサイズ上に過ぎないことから、１Ｄゲルからのブロットで観察されたバンドは多数のタンパク質に相当し得る。バンドをよりうまく解明するために、２Ｄ－ＰＡＧＥを使用してタンパク質をサイズおよびｐＨの両方について分離した。２Ｄゲルをブロッティングし、ＧａｌＮＡｃ－ＢＳＡ－ビオチンでプローブした。１３個のスポットを目的のスポットとして同定し、２Ｄ ＰＡＧＥゲルから切除した（図３）。
質量分析データは、１Ｄおよび２Ｄ－ＰＡＧＥの両方からのゲル断片中のいくつかのタンパク質を明らかにし、これらの一部は両方で重複していた。同定されたそれらのタンパク質の一つが、通常は細胞内スカフォールドタンパク質であるプレクチンであった。しかし、Shin et al (2013)は、プレクチンがエキソソーム分泌により細胞の膜に局在化できることを示した。これを調べるために、ＥＶをＢＣ細胞から単離し、静的接着アッセイの前にＢＣ細胞か内皮細胞のどちらか、または両方とインキュベートした。ＢＣ細胞および内皮細胞の両方をＥＶとインキュベートすると、無処理、ＢＣ細胞のみまたは内皮細胞のみの処理と比べて、内皮細胞へのＢＣ細胞の結合を有意に増加させることが見出された（図４）。この知見は、内皮細胞へのＢＣ細胞接着を助ける上でＥＶが積極的な役割を果たし得ることを示唆するものである。
これをさらに調べるために、ｓｉＲＮＡを使用してプレクチンをＢＣ細胞か内皮細胞のどちらか、または両方でノックダウンした。無処理およびスクランブルｓｉＲＮＡ処理細胞（グラフでは陰性と呼ばれる）陰性対照細胞と比べて、全ての場合において内皮細胞へのＢＣ細胞の結合は有意に低下し、それ故に、プレクチンはＢＣ細胞が内皮細胞に結合するのに必要であることを示唆している（図５）。
内皮細胞上の受容体が、ＢＣ細胞におけるグリコシル化目印に特異的であり、細胞結合を媒介することの確認
内皮細胞上の受容体が、ＢＣ細胞におけるグリコシル化目印に特異的であることを確認するために、組換えプレクチン断片［プレクチンのアクチン結合ドメインを含有、該ドメインは全てのアクチンアイソフォームに結合することができる（Fontao et al., 2001, J. Cell. Sci., 114: 2065-2076）］を使用して、内皮細胞の添加前に１０分間インキュベートしてＢＣ細胞を遮断した。内皮細胞への細胞接着は、無処理対照細胞と比べて有意に低下した（図６）。ＢＣ細胞を組換えプレクチンとインキュベートした場合に観察される結合の低下は、ＨＰＡ陽性グリコシル化目印へのプレクチン結合の結果であり、それによってＢＣ細胞に「キャップし」、内皮細胞への結合を防ぐという仮説を立てた。
ＢＣ細胞由来のＥＶが内皮細胞への接着をどのように増加させるかの調査
ＢＣ細胞におけるプレクチンのノックダウンの知見は、ＢＣ細胞由来のＥＶは内皮細胞へのＢＣ細胞の接着を増加させ得るという観察と合わせて、ＥＶはプレクチンをＢＣ細胞から内皮細胞の表面に運び、次いでＢＣ細胞が結合する有効な「上陸プラットフォーム（ｌａｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）」を増加させ得るという仮説をもたらした。この仮説のテストに取りかかるために、「レスキュー」実験を行った。ＢＣ細胞においてプレクチンをノックダウンすると、内皮細胞へのＢＣ細胞の結合は低下した（図７）。興味深いことに、内皮細胞を対照ＢＣ細胞由来のＥＶで処理すると、この結合の低下は部分的にレスキューされた。これは、正常な細胞（プレクチンを有する）由来のＥＶが、結合の発生を可能にする「上陸プラットフォーム」を提供しているという仮説と一致する。
モデル系では、高ＨＰＡ陽性（ＭＣＦ７）および弱ＨＰＡ陽性（ＢＴ４７４）であることが以前に報告されている２つのＢＣ細胞株を使用して、上記の仮説を検証した。２つの細胞株からタンパク質を抽出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、次いでブロッティングし、ＨＰＡでプローブした。ＨＰＡ陽性ＢＣ細胞株（ＭＣＦ７）は、７５ｋＤａに１つのバンドしか持たない弱ＨＰＡ陽性ＢＣ細胞株（ＢＴ４７４）より広範なＨＰＡ陽性糖タンパク質を有し、それによってこのモデル系の使用を確認した（図８）。
ＮａｎｏＶｉｅｗを使用すると、ＨＰＡ結合陽性細胞はＨＰＡ結合陽性ＥＶを産生し、同様にＨＰＡ結合陰性細胞はＨＰＡ結合陰性ＥＶを産生することが示された。これを行うために、２つの一般的に使用されるＥＶマーカーおよびＨＰＡに特異的な蛍光コンジュゲート抗体で２つのＥＶ集団を標識して、２つのＢＣ細胞株（一方はＨＰＡ結合陰性、他方はＨＰＡ結合陽性）からＥＶを単離し、ＥＶが「ＨＰＡ結合陽性」を有する量を定量化することができた。ＨＰＡ結合陰性ＢＣ細胞由来のＥＶ（ＢＴ４７４左、図９）はＨＰＡ結合陰性であることが見出されたが、ＨＰＡ結合陽性ＢＣ細胞由来のＥＶ（ＭＣＦ７右、図９）はＨＰＡ結合陽性であった。特に、ＨＰＡは小胞においてＣＤ９と優勢的に共局在化された － ＣＤ８１陽性小胞の１３％、およびＣＤ６３陽性小胞の９％と比べて、ＣＤ９陽性小胞の最大４５％がＨＰＡ陽性である。ＡＰＣ発光スペクトルとの重複のため、蛍光コンジュゲート抗体ＣＤ６３はこの実験に含めなかった。
内皮細胞上の受容体への結合を媒介するＢＣ細胞での糖タンパク質の同定
細胞骨格プレクチンは、ベータアクチンを含む、そのアクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）と相互作用するいくつかの結合パートナーを有する。グリコシル化ベータアクチンが細胞表面プレクチンの潜在的結合パートナーであるかどうかを調べるために遮断実験を行い、抗ベータアクチンＩｇＧ（Ａｂｃａｍ ａｂ８２２７）を使用して、内皮細胞とのインキュベーションの前にベータアクチンを３０分間マスキングした）。未処理対照細胞と比べて、ベータアクチンを遮断すると細胞接着は有意に低下し、それ故に、ベータアクチンがプレクチンの結合パートナーであること、およびこの相互作用が内皮細胞へのＢＣ細胞の結合に寄与することを示唆している（図１０）。
異なる細胞株における表面アクチンのレベル
既知の浸潤性およびＨＰＡ結合プロファイルが分かっている一連の細胞を使用して、異なる細胞タイプにおける表面アクチンのレベルをフローサイトメトリーによって決定した。これらは、正常／ＨＰＡ陰性から、非転移性／弱ＨＰＡ陽性～高転移性／高ＨＰＡ陽性にわたった（図１１）。ＨＭＥ細胞は正常な乳房細胞であり、ＨＰＡ陰性である；ＢＴ４７４は、転移の証拠がない原発性浸潤性腺管がんに由来し［Lasfargues et al. 1978, J. Nat. Institute, 61(4): 967-978］、ＨＰＡで弱く標識される；ＺＲ７５１は、浸潤性原発性乳管がんからの悪性腹水－すなわち既に転移していた細胞に由来し（Engel et al. 1978, Canc. Res., 38, 3352-3364）、ＨＰＡで中程度に標識される；Ｔ４７Ｄは、浸潤性原発性乳管がんからの悪性胸水－すなわち既に転移していた細胞に由来し［Keydar et al 1979, Eur J Cancer, 15 (5):65 9-70］、ＨＰＡで高度に標識される；ＭＣＦ７は、浸潤性原発性乳管がんからの悪性胸水－すなわち既に転移していた細胞に由来し［Soule et al. 1973, J. Nat. Cancer Institute, 5 1(5): 1409-14-16］、ＨＰＡで高度に標識される。アクチン標識は、表面アクチンの増加がより浸潤性／転移性細胞で測定される点でＨＰＡ標識と類似した傾向に沿っているようである。
図１２は、アクチンのレベルが非転移性乳がん細胞（ＢＴ４７４）より転移性乳がん細胞（ＭＣＦ７）の表面で高いことをフローサイトメトリーを使用してさらに示している。このデータは、ベータおよびガンマアクチンの両方を検出できる抗体を使用して作成された。図１３は、乳がんＭＣＦ７、結腸直腸がんＨＴ－２９、および肺がんＡ５３９を含む転移性がんも、その表面でＨＰＡのレベル上昇を示すことをさらに示している。これらの結果は、アクチンおよびＨＰＡいずれの表面レベルも転移性がん細胞で増加することをさらに示しており、故にそれらの診断能を示すものである。
図１４はさらに、転移性がん細胞におけるアクチンの表面レベルの増加を支持する。このデータは非転移性および転移性乳がんを比較し、ベータアクチンまたはガンマアクチンのどちらかに対する抗体を使用しており、どちらも転移性がん細胞におけるアクチンレベルの増加を示している。
異なる細胞株から得られた微小胞における表面アクチンのレベル
図１５～１７は、転移性および非転移性乳がん、肺がんおよび膵臓がん細胞から得られた微小胞の表面のアクチンレベルを比較する。結果は、転移性細胞から得られた微小胞におけるアクチンのレベル上昇を明白に示している。
異なる細胞株から得られたエキソソームにおける表面アクチンのレベル
図１８～２０は、転移性および非転移性乳がんおよび結腸直腸がん細胞から得られたエキソソームの表面のアクチンレベルを比較する。結果は、非転移性細胞と比べて転移性細胞から得られたエキソソームにおけるアクチンのレベル上昇を明白に示している。図２１は、転移性がん、具体的には結腸直腸ＨＴ－２９がん細胞から得られたエキソソームも、その表面でＨＰＡのレベル上昇を示すことをさらに示している。図２２は、転移性乳がんおよび結腸直腸がん細胞がそれらの表面でガンマアクチンのレベル上昇を示すことを示している。
考察
結論として、本明細書に提示されたデータは、上皮がん細胞、および／またはそれに由来する細胞外小胞の表面（膜結合）のアクチンが、がん細胞の転移能の診断マーカーまたは予後マーカーとして機能し得ることを示している。アクチンレベルは、特定のがん治療に対する反応のモニタリング、疾患進行のモニタリング、および／または疾患再発のモニタリングに使用することもでき、ＨＰＡレベルも、単独でまたはアクチンレベルとの併用のどちらかでバイオマーカーとして使用され得る。

Claims (23)

  1. がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを検出することを含み、
    膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、その対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定される、方法。
  2. 対象を転移性がんと診断する方法であって、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを検出することを含み、膜結合アクチンが試料中に検出される場合に、その対象はがん転移を有すると決定される方法。
  3. がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、または発症している可能性があるかどうかを決定する方法であって：
    ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
    ｂ．対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
    ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、対象は転移を発症する可能性があるかまたは発症している可能性があると決定すること
    を含む方法。
  4. 対象を転移性がんと診断する方法であって：
    ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
    ｂ．対象から得られた試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、および
    ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、対象を転移性がんと診断すること
    を含む方法。
  5. がんと診断された対象を予後診断する方法であって：
    ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
    ｂ．試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
    ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高い場合に、患者は予後不良であると決定すること
    を含む方法。
  6. 予後不良が、転移を発症する可能性の増加および／または生存の可能性の低下と関係している、請求項５に記載の方法。
  7. 転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性がある、がんと診断された患者を同定する方法であって：
    ａ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルを測定すること、
    ｂ．試料で測定された膜結合アクチンのレベルを標準試料中の膜結合アクチンのレベルと比較すること、
    ｃ．対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルとほぼ同等かまたはより高ければ、患者は転移性がんの既知の治療による治療から恩恵を受ける可能性があると決定すること
    を含む方法。
  8. 対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルが、標準試料中の膜結合アクチンのレベルより少なくとも約５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％、５０００％、または１００００％多い場合に、対象から得られた試料中の膜結合アクチンのレベルは標準試料中の膜結合アクチンのレベルより高いと決定される、請求項３～７のいずれかに記載の方法。
  9. 標準試料が、がんと診断されていない健康な患者からの同等の試料であるか、または転移性であることが分かっている同等の試料である、請求項３～８のいずれかに記載の方法。
  10. 方法が、エクスビボ方法またはインビトロ方法である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 試料が、組織生検ならびに／または血液試料および／もしくは唾液試料である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 組織生検が乳房組織生検である、請求項１１に記載の方法。
  13. 膜結合アクチンのレベルの検出または測定が、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、および／またはＥＬＩＳＡによって行われる、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. ａ．対象が転移を発症する可能性があるかもしくは発症している可能性があると決定される、または
    ｂ．対象が転移性がんと診断される、または
    ｃ．対象が予後不良診断を受ける、または
    ｄ．対象が転移性がんの治療から恩恵を受ける可能性があると決定される
    ならば、転移性がんの治療法が対象に施される、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. （ａ）がんと診断された対象が転移を発症する可能性があるか、もしくは転移を発症している可能性があるかどうかを決定する、または（ｂ）がんと診断された対象を予後診断する、または（ｃ）対象を転移性がんと診断するためのキットであって、
    膜結合アクチンを検出する手段を含み、
    ｉ．目的の細胞タイプを同定する手段、および／または
    ｉｉ．細胞外小胞を単離する試薬
    のうちの１つまたは複数をさらに含んでもよいキット。
  16. 膜結合アクチンを検出する手段がアクチン結合ポリペプチドである、請求項１５に記載のキット。
  17. 目的の細胞タイプが上皮細胞であり、上皮細胞を同定する手段がＥｐＣＡＭ結合ポリペプチドである、請求項１５または１６に記載のキット。
  18. 膜結合アクチンが細胞の膜、および／または細胞外小胞の膜で検出される、請求項１～１４のいずれかに記載の方法または請求項１５～１７のいずれかに記載のキット。
  19. 細胞が上皮細胞または循環腫瘍細胞である、請求項１８に記載の方法またはキット。
  20. 上皮細胞が乳房組織由来である、請求項１９に記載の方法またはキット。
  21. がんが上皮細胞がんである、請求項１～１４もしくは１７～２０のいずれかに記載の方法、または請求項１５～２０のいずれかに記載のキット。
  22. 上皮細胞がんが乳がんである、請求項２１に記載の方法またはキット。
  23. アクチンがベータアクチンである、請求項１～１４もしくは１７～２２のいずれかに記載の方法、または請求項１５～２２のいずれかに記載のキット。
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