JP2023538736A - Ｂ群レンサ球菌多糖－タンパク質コンジュゲート、コンジュゲートを生成するための方法、コンジュゲートを含む免疫原性組成物、およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一般にＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）と称されるストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来の莢膜多糖（ＣＰ）と、担体タンパク質とを含む免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートに関し、ここで、ＣＰは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択され、ＣＰは、約６０％超のシアル酸レベルを有する。本発明は、コンジュゲートおよびコンジュゲートを含む免疫原性組成物を作製する方法にも関する。本発明はさらに、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発するための、および／または本明細書において開示されている組成物を使用して、対象における侵襲性ＧＢＳ疾患を低減させるもしくは予防するための方法に関する。得られた抗体は、受動免疫療法を介してＧＢＳ感染を治療するまたは予防するために使用することができる。
Description
本発明は、一般にＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）と称されるストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来の莢膜多糖（ＣＰ）と、担体タンパク質とを含む免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートに関し、ＣＰは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択され、ＣＰは、約６０％超のシアル酸レベルを有する。本発明は、コンジュゲートおよびコンジュゲートを含む免疫原性組成物を作製する方法にも関する。本発明は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つのＧＢＳ血清型ならびに場合により１つまたは複数の追加のＧＢＳ血清型由来のＣＰを含む、免疫原性組成物にも関する。本発明はさらに、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発するための、および／または本明細書において開示されている組成物を使用して、対象における侵襲性ＧＢＳ疾患を低減させるもしくは予防するための方法に関する。得られた抗体は、受動免疫療法を介してＧＢＳ感染を治療するもしくは予防するために、または子の保護のため母体における抗体移入を介して母親を免疫化するために使用することができる。
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）としても公知の、グラム陽性多糖被包性生物である。これらは、ヒト胃腸および生殖管の一般的な片利共生生物であり、乳児および老齢者における重篤な疾患の原因でもある（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、３１（付録４）：Ｄ３～Ｄ６（２０１３））。乳児におけるＧＢＳ感染の主要リスク因子は、母体における定着である（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１１０（１）：３１～３６（１９８７））。４人に１人もの女性がＧＢＳを直腸膣で保菌し、これは、出産の前または最中に、羊水または新生児に感染して、敗血症、肺炎および髄膜炎を引き起こす可能性がある（Ｂａｋｅｒ ２０１３；Ｈｅａｔｈ，Ｐ．Ｔ．ら、ＢＭＪ Ｃｌｉｎ．Ｅｖｉｄ．（Ｏｎｌｉｎｅ）、ｐｉｉ：０３２３（２０１４））。ＧＢＳ髄膜炎を克服した乳児の少なくとも２５パーセントが神経学的機能障害を患い、１９％が、認知遅延、脳性まひ、失明および難聴を経験すると推定される（Ｌｉｂｓｔｅｒ，Ｒ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１３０（１）：ｅ８－１５２０１２（２０１２））。ＧＢＳは、流産、早産および死産とも関係がある（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、８（５－６）：２２０～２２７（２０００）；Ｒａｎｄｉｓ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２１０（２）：２６５～２７３（２０１４）：Ｋｅｓｓｏｕｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｍａｔｅｒｎ．Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ．、２５（１０）：１９８３～１９８６（２０１２））。極低出生体重児は、感染リスクがはるかに高く、最大３％が感染しており、直ちに抗生物質による治療を行っても、最大３０％の死亡率である（Ｈｅａｔｈ ２０１４）。
１９９０年代後半、米国におけるＧＢＳスクリーニングおよび分娩時抗生物質予防的投与（ＩＡＰ）の導入は、生後１週間以内に発生する新生児疾患（早期発症疾患［ＥＯＤ］）の率を低減したが、その後に現れる生後３カ月以内の後期発症疾患（ＬＯＤ）の率に、測定可能な影響を及ぼさなかった。米国でのＥＯＤおよびＬＯＤ症例の率は、現在、出生１，０００人当たりそれぞれ０．２５および０．２７である（疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ；ＣＤＣ）、Ａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｒｅ（ＡＢＣ）Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ（２０１３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｂｃｓ／ｒｅｐｏｒｔｓ－ｆｉｎｄｉｎｇｓ／ｓｕｒｖｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｂｓ１３．ｐｄｆにおいて利用可能）。菌血症および髄膜炎を包含する侵襲性肺炎球菌疾患の予防のための肺炎球菌コンジュゲートワクチンの導入に続いて、ならびにＧＢＳ疾患の予防のためのＩＡＰにもかかわらず、ＧＢＳは、米国にて、乳児（２カ月未満）における新生児敗血症（ＥＯＤ）および髄膜炎の単一の最も一般的な原因となった（Ｖｅｒａｎｉ，Ｊ．Ｒ．ら、ＭＭＷＲ、５９（ＲＲ１０）：１～３２（２０１０）；Ｔｈｉｇｐｅｎ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３６４（２１）：２０１６～２０２５（２０１１））。米国とは異なり、侵襲性ＧＢＳ疾患およびＩＡＰのための予防ガイドラインの導入は、オランダにおいても英国においてもＥＯＤの発病率を低減させなかった（Ｂｅｋｋｅｒ，Ｖ．ら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１４（１１）：１０８３～１０８９（２０１４）；Ｌａｍａｇｎｉ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５７（５）：６８２～６８８（２０１３））。この効果の欠如は、普遍的スクリーニングの欠如および最高リスク群の母親（例えば、発熱、長期にわたって破裂した膜）へのＩＡＰを制限することによるものであり得る。ＥＯＤの率は、ＩＡＰを使用しない国において有意に高く、出生１，０００人当たり０．７５の平均発病率（９５％ＣＩ０．５８～０．８９）が報告された（Ｅｄｍｏｎｄ，Ｋ．Ｍら、Ｌａｎｃｅｔ、３７９（９８１５）：５４７～５５６（２０１２））。
ＧＢＳ疾患のリスクがあるもう１つの集団は、高齢者である。リスク因子は、真性糖尿病、がん、心不全、神経学的および泌尿器科学的状態等の慢性的な医学的問題を包含する。ＣＤＣ ＡＢＣサーベイランスデータによれば、２０１３年における侵襲性ＧＢＳの米国での年間発生率は、６５歳以上の成人において、０．２８／１，０００人または１２，４００症例／年であった。この率は、高齢者における侵襲性肺炎球菌疾患の発病率（対６５歳超について０．３０／１，０００）に近似している。これらの率は、米国および欧州の両方において増大し続けると予測されている（ＣＤＣ ２０１３；Ｌａｍａｇｎｉ ２０１３）。
乳児および高齢者の間でのＧＢＳ疾患を予防するための１つのアプローチは、莢膜多糖ベースのワクチンの使用である。母体のＧＢＳ予防ワクチンの実施は、ＩＡＰが使用されるか否かにかかわらず、米国において乳児の間でのＧＢＳ疾患を予防する可能性を有する。多糖は、それら自体が免疫原性であり得るが、多糖のタンパク質担体とのコンジュゲーションが、特に乳児および高齢者における免疫原性を改善するために使用されてきた。多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンは、タンパク質担体と関係がある、概して細菌の外皮由来の、多糖を使用して作製される。多糖およびタンパク質担体の化学結合は、それらの表面上のワクチン内に含有される多糖を表示する細菌に対して免疫応答を誘発し、故に、疾患を予防する。したがって、病原性細菌由来の多糖を使用するワクチン接種は、宿主免疫を上昇させるための潜在的な戦略である。
細菌を覆う多糖の構造は、単一種の細菌内であっても大幅に異なっている。例えば、ＧＢＳには、細菌多糖莢膜における変動により、１０種の異なる血清型（すなわち、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ）がある。したがって、多糖ベースのワクチンは、異なる循環株を確実に幅広く網羅できるような多糖の一団からなることが望ましい。
担体タンパク質は、標的病原体由来の、その病原体に対する特異的免疫応答を上昇させる関連タンパク質抗原であってもよいし、アジュバントまたは全身的免疫応答刺激剤としてさらに役立つ、概して免疫原性のタンパク質であってもよい。
ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶの個々の一価多糖－タンパク質コンジュゲートは、非妊娠成人における第１および第２相臨床試験にて評価されてきた（Ｂｒｉｇｔｓｅｎ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１８５（９）：１２７７～１２８４（２００２）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８８（１）：６６～７３（２００３）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８９（６）：１１０３～１１１２（２００４）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（１）：５５～６３（２００７））。二価ＩＩ－ＴＴおよびＩＩＩ－ＴＴグリココンジュゲートワクチン、ならびにＩａ－ＣＲＭ１９７、Ｉｂ－ＣＲＭ１９７およびＩＩＩ－ＣＲＭ１９７グリココンジュゲートを含む三価ワクチンも研究されてきた（Ｂａｋｅｒ ＪＩＤ ２００３；Ｃｌｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１１９３９２０、ＮＣＴ０１４１２８０１およびＮＣＴ０１４４６２８９）。しかしながら、ＧＢＳワクチンは未だ承認されていない。
その上、三価ワクチンは、南アフリカにおいて新生児疾患を引き起こす侵襲性株の９０％超をカバーする（Ｍａｄｚｉｖｈａｎｄｉｌａ，Ｍ．ら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、６（３）：ｅ１７８６１（２０１１））が、これらの同じ血清型は、チゲサイクリン評価およびサーベイランス試験（Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｅｓｔｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．ｃｏｍ／）から２００４～２０１３年の間に収集された９０１の試料のグローバルコレクションからの最近の新生児分離株のサーベイランスに基づき、それぞれ北米および欧州における侵襲性分離株の６２％および６６％のみを表す。
Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．試料から取得された株の分析は、収集された株の９５％が５つの文書化された主要な血清型（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ）のうちの１つに属し、さらなる３％が血清型ＩＶであったことを示した。一連の刊行物は、過去１０年間でアメリカおよび欧州における血清型ＩＶの出現も確認した（Ｄｉｅｄｒｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４８（９）：３１００～３１０４（２０１０）；Ｔｅａｔｅｒｏ（２０１４）；Ｍｅｅｈａｎ，Ｍ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３３（７）：１１５５～１１６２（２０１４）；Ｆｌｏｒｉｎｄｏ，Ｃ．ら、Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｓｕｒ ｌｅｓ Ｍａｌａｄｉｅｓ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｓ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１９（２３）（２０１４）；Ｐａｌｍｉｅｒｏ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４８（１２）：４３９７～４４０３（２０１０））。乳児へのＧＢＳの伝染のリスク因子である、成人における直腸／膣保菌を調査する研究は、分離株の９７％がこれらの６つの血清型のうちの１つに属し、血清型ＩＶは約４％の頻度を表すことを見出した。研究は、健康な米国成人において、ベータ溶血レンサ球菌（ＧＢＳを包含する）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の保菌をモニターするように設計された（Ｍａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ら、ＩＣＡＡＣ、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉ－３０６（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ｓｅｐ．５～９、２０１４）を参照）。
同様に、Ｔ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．試料の分析は、６５歳以上の老齢者由来の米国の血液分離株の９８％が、同じ６つの優勢な血清群に属することを示した。高齢者分離株と他の集団との間の最も顕著な差異は、血清群分布である。高齢者患者由来の分離株について、血清型Ｖ株は、最大の群を構成する（３４％対新生児について１８％または成人保菌者株について１８％）。
ＧＢＳ疫学の研究は、血清型有病率の地理的分散があることを見出しており、非ＧＢＳ６血清型の有病率が、地形、患者の年齢、およびサーベイランスが定着または侵襲性疾患のいずれに基づくかを包含する若干数の因子によって決まることを示す。
例えば、血清型ＶＩおよびＶＩＩＩ分離株は、日本における健康な妊婦の優勢な外来種であることが示された（Ｌａｃｈｅｎａｕｅｒ，Ｃ．Ｓ．ら、ＪＩＤ １７９（４）：１０３０～１０３３（１９９９）。非ＧＢＳ６血清型定着の率は、西洋諸国よりもアジアにおいて有意に高い。７３人の妊婦についての日本の研究において、血清型ＶＩおよびＶＩＩＩ保菌の率はそれぞれ３５．６％および２４．７％であった。対照的に、これらの血清型は米国の妊婦間で稀にしか観察されない［１、２］。しかしながら、これらの血清型は乳児において対応して高い疾患率を引き起こさない。新生児疾患を引き起こす分離株が２０１１～２０１５年の間に収集された日本におけるＧＢＳ疫学の大規模研究（ｎ＝１３２）において、非ＧＢＳ６血清型の有病率はごくわずかであった（ＥＯＤのみにおいてＶＩについて１．１％；後期発症疾患のみについて血清型ＩＸの１．１％）［３］。これらの結果は、早期新生児侵襲性分離株研究（ｎ＝６０）と合致しており、同様の血清型有病率：ＩＩＩ（４８．３％）、Ｉａ（３０．０％）およびＩｂ（１０．０％）が見られた［４］。非ＧＢＳ６新生児疾患の低率についてのこの傾向は中国と同様であると思われるが、現在までに公開された研究は、より少数の分離株を伴うものであった（＜５０）［５～７］。
有意に、非ＧＢＳ６血清型によって引き起こされる侵襲性疾患の率は、高齢者患者においてはるかに高い。２０１０～２０１３年の間に取得された分離株に基づく日本の大規模研究（ｎ＝４４３）において、侵襲性血清型ＶＩの有病率は９．５％であった［８］。同様の傾向が台湾においても観察され、高い侵襲性血清型ＶＩ疾患率が高齢者において見られるが乳児においては見られない［９］。
これらのサーベイランス研究に基づき、血清型ＶＩは、第２世代ワクチン、とりわけ高齢者層を狙いとしたものへの包含を促す新たに出現した脅威であるように見える。血清型ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸによって引き起こされる侵襲性疾患の発病率は現在は稀であるが、ＧＢＳ６ワクチンの導入後に血清型置きかえが発生するならば、より重要となり得る。
したがって、世界中の幅広い集団間で、新たに出現した血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸによって引き起こされるものを包含するＧＢＳ疾患を予防するまたは治療するための手段として受動免疫を付与するための、多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンまたはモノクローナル抗体が必要である。
ある実施形態において、本発明は、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）莢膜多糖と担体タンパク質とを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、莢膜多糖が、約６０％超、約９５％超、または約１００％のシアル酸レベルを有する、免疫原性組成物を含む。別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖が、血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５ｍＭのシアル酸を有する、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖が、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、または約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、コンジュゲートの分子量が、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、または約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間である、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、莢膜多糖が、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満でＯ－アセチル化されている、記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５または約０．４ｍＭのＯ－アセテートを有する、記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）およびレンサ球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）から選択される、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖を単離する方法であって、有機試薬を、莢膜多糖生産菌を含む細胞ブロスと反応させるステップを含む方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、細菌を溶菌しないおよび／または細菌を熱で死滅させる、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、遠心分離して細胞ペーストを提供するステップをさらに含む、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
また別の実施形態において、本発明は、血液透析濾過である濾過するステップを包含していてもよい、濾過するステップをさらに含む、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖生産菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を含む、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、反応のｐＨが、約５．５から約９．５である、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、反応が、約２０℃から約８５℃の温度で起こる、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
また別の実施形態において、本発明は、反応時間が、約１０時間から約９０時間である、記述されている通りの莢膜多糖を単離する方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、莢膜多糖が、本明細書において記述されている通りの方法に従って単離される、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を作製する方法を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの方法によって調製された莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩおよび担体タンパク質由来の莢膜多糖、ならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型を含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩと担体タンパク質とを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む。別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含み、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含み、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む。さらなる実施形態において、本発明は、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含み、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含み、莢膜多糖が、約６０％超、約９５％超、または約１００％のシアル酸レベルを有する、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩＩと担体タンパク質とを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む。別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩＩを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含み、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩＩ莢膜多糖由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含み、莢膜多糖が、約６０％超、約９５％超、または約１００％のシアル酸レベルを有する、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩＩＩと担体タンパク質とを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む。別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩＩＩを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含み、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含み、莢膜多糖が、約６０％超、約９５％超、または約１００％のシアル酸レベルを有する、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＩＸと担体タンパク質とを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含む。別の実施形態において、本発明は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＩＸを含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を含み、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＩＸ莢膜多糖由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含み、莢膜多糖が、約６０％超、約９５％超、または約１００％のシアル酸レベルを有する、免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩおよびＶＩＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩおよびＶＩＩＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩＩおよびＶＩＩＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＩａおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＩｂおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＩＩおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＩＩＩおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＩＶおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートが、ＧＢＳ血清型ＶおよびＶＩ由来の莢膜多糖と担体タンパク質とを含む、免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、担体、またはそれらの混合物をさらに含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩からなる群から選択される緩衝剤をさらに含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－２０およびポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される界面活性剤をさらに含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される賦形剤をさらに含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、レンサ球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）、アルミニウムベースのアジュバントまたはＱＳ－２１から選択されるアジュバントをさらに含み、アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシルホスフェートおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌの用量を含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、場合により少なくとも１つの賦形剤の存在下で凍結乾燥され、少なくとも１つの賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の少なくとも１つの賦形剤を含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、マンニトールまたはグリシンから選択される追加の賦形剤をさらに含み、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の追加の賦形剤を含む、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水で再溶解される、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性であり、女性が、場合により妊娠後半期、少なくとも妊娠２０週、または妊娠２７週から３６週である、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
別の実施形態において、本発明は、対象が、５０歳以上、６５歳以上、または８５歳以上の成人である、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
ある実施形態において、本発明は、対象が、免疫不全である、かつ／または、対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患もしくは肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を含む。
また別の実施形態において、本発明は、Ｂ群レンサ球菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、有効量の本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量の本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量の本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含み、対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性であり、場合により女性が、妊娠後半期、少なくとも妊娠２０週、または妊娠２７週から３６週である方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量の本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含み、対象が、５０歳以上、６５歳以上、もしくは８５歳以上の成人であり、かつ／または、対象が、免疫不全であり、場合により対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患もしくは肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する方法を含む。
ある実施形態において、本発明は、対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量の本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含み、Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｖまたは血清型ＶＩまたは血清型ＶＩＩまたは血清型ＶＩＩＩまたは血清型ＩＸに対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性コンジュゲートにおいて、莢膜多糖と結合する抗体を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの抗体を含む組成物、または、抗体を生成する方法であって、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を、対象に投与するステップを含む方法を含む。
ある実施形態において、本発明は、対象に受動免疫を付与する方法であって、本明細書において記述されている通りの免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップとを含む方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、（ａ）ＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させて、活性化多糖をもたらすステップと、（ｂ）活性化多糖を担体タンパク質と反応させて、多糖－タンパク質コンジュゲートをもたらすステップとを含み、ステップ（ｂ）が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中で行われてもよい方法を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、多糖を、０．０１から１０．０モル当量の酸化剤と反応させ、酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウムを包含していてもよい過ヨウ素酸塩である方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、ステップ（ａ）の酸化反応が、１時間から５０時間の間であり、酸化反応の温度が、約２℃から約２５℃の間に維持されていてもよく、酸化反応が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびビス－トリスからなる群から選択される緩衝剤中で行われてもよく、さらに、緩衝剤が、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度を有していてもよい方法を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、酸化反応が、約４．０から約８．０の間のｐＨで行われ、酸化剤が、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）であってもよく、Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）が、共酸化剤であってもよく、かつ／またはステップ（ａ）が、クエンチング剤の添加により酸化反応物をさらにクエンチするステップをさらに含む方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、多糖の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間であり、活性化多糖の酸化度が５から２５の間であってもよい方法を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットからなる群から選択される糖の存在下で、活性化多糖を凍結乾燥するステップをさらに含む方法を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、ステップ（ｂ）が、活性化多糖を担体タンパク質と配合するステップと、配合された活性化多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップとを含み、ステップ（ｂ）における活性化多糖の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間であってもよく、かつ／または、活性化多糖対担体タンパク質の初期比（重量／重量）が５：１から０．１：１の間であってもよい方法を含む。
またさらなる実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、還元剤が、ブレンステッドもしくはルイス酸、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）の存在下、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜鉛からなる群から選択され、かつ／または、還元剤の分量が約０．１から約１０．０モル当量の間である方法を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、ステップ（２）の還元反応の持続時間が１時間から６０時間の間であり、かつ／または、還元反応の温度が１０℃から４０℃の間に維持される方法を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、水素化ホウ素の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップ（ステップ（ｃ））をさらに含み、水素化ホウ素の分量が約０．１から約１０．０モル当量の間であってもよく、水素化ホウ素が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素テトラブチルアンモニウム、水素化ホウ素カルシウムおよび水素化ホウ素マグネシウムからなる群から選択され、キャップするステップの持続時間が０．１時間から１０時間の間であってもよく、かつ／または、キャップするステップの温度が約１５℃から約４５℃の間に維持される方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、多糖－タンパク質コンジュゲートが、多糖の総量と比較して約４０％未満の遊離多糖を含む方法を含む。
また別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、コンジュゲート中における多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）が約０．５から約３．０の間であり、かつ／または、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度が２から１５の間である方法を含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、（ｂ）クエンチング剤の添加によりステップ（ａ）の酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップとを含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）はＤＭＳＯ中で行われる方法を含む。
ある実施形態において、本発明は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、（ｂ）クエンチング剤の添加によりステップ（ａ）の酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップと、（ｆ）多糖－タンパク質コンジュゲートを精製するステップとを含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）はＤＭＳＯ中で行われる方法を含む。
本発明は、記述されている特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変更し得る。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、限定を意図していないことも理解されたい。
本明細書において記述されているものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記述する。本明細書において言及されているすべての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書において使用される用語は、当業者に認識されており、公知である意味を有するが、利便性および完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を、以下でおよび明細書全体を通して説明する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の参照物を包含する。故に、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つまたは複数の方法、および／または本明細書において記述されているステップ、および／または本開示等を読めば当業者に明らかとなると予想されるものを包含する。
「約」または「およそ」という用語は、値の統計的に意味のある範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の、一桁以内、典型的には２０％以内、またさらに典型的には１０％以内、さらに一層典型的には５％以内であってよい。「約」または「およそ」という用語によって網羅される許容偏差は、研究中の特定の系によって決まり、当業者には容易に分かり得る。本出願内で範囲が記載されている場合にはいつでも、該範囲内のすべての整数も、本発明の実施形態として企図されている。
本開示において、「含む」、「含まれる」、「含むこと」、「含有する」、「含有すること」等の用語は、米国特許法におけるものに帰属する意味を有し得、例えば、「包含する」、「包含される」、「包含すること」等を意味し得ることに留意されたい。そのような用語は、任意の他の要素を除外することなく、特定の原料または原料のセットの包含を指す。「から本質的になること」および「から本質的になる」等の用語は、米国特許法におけるものに帰属する意味を有し、例えば、本発明の新規または基本的な特徴から逸脱しない追加の原料またはステップの包含を可能にする、すなわち、本発明の新規または基本的な特徴から逸脱する追加の列挙されていない原料またはステップを除外し、本明細書において引用されているまたは参照により本明細書に組み込まれる当技術分野における文書、とりわけ、この文書の目標が、特許性のある、例えば、新規の、自明でない、発明的な、従来技術を上回る、例えば、本明細書において引用されているもしくは参照により本明細書に組み込まれる文書を上回る、実施形態を定義することである場合等、先行技術の原料またはステップを除外する。また、「からなる」および「からなること」という用語は、米国特許法におけるものに属する意味を有する、すなわち、これらの用語はクローズエンドである。したがって、これらの用語は、特定の原料または原料のセットの包含および他すべての原料の除外を指す。
「抗原」という用語は、概して、同族抗体が選択的に結合できる少なくとも１つのエピトープを含有する生体分子、通常はタンパク質、ペプチド、多糖、脂質もしくはコンジュゲート、または、一部の場合において、動物に注射もしくは吸収される組成物を包含する、動物において抗体もしくはＴ細胞応答または両方の生成を刺激することができる免疫原性物質を指す。免疫応答は、全分子に対して、または分子の１つもしくは複数の種々の部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して産生され得る。該用語は、個々の分子または抗原分子の均一もしくは不均一集団を指すために使用され得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または特異的な体液性および／もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」という用語は、すべての関連抗原エピトープを包含する。所与の抗原のエピトープは、当業者に周知であるいくつものエピトープマッピング技術を使用して同定することができる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪを参照）。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上の多数のペプチド、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを同時に合成し、ペプチドが支持体に付着しているままで、ペプチドを抗体と反応させることによって、決定することができる。そのような技術は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８～４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（７）：７０９～７１５（１９８６）において記述されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、立体構造エピトープは、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴によって等、アミノ酸の空間的立体構造を決定することによって同定され得る（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照）。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を導出する能力を維持する限り、欠失、付加および置換等の天然配列への修飾を包含するタンパク質（概して保存的な性質であるが、非保存的であってよい）を指すためにも使用され得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を介して、もしくは特定の合成手順を介して、もしくは遺伝子工学的アプローチを介してのように意図的であってよく、または抗原を生成する宿主の突然変異を介して等、偶発的であってもよい。さらに、抗原は、微生物、例えば細菌から誘導、取得または単離されてもよいし、全生物であってもよい。同様に、核酸免疫化用途において等、抗原を発現しているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、定義に包含される。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成的に誘導された抗原も包含される（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（１１）：２７７７～２７８１（１９９３）；Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７（８）：３２４２～３２４９（１９９６）；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７５（４）：４０２～４０８（１９９７））。
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、交換可能に使用され、動物において免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性組成物を含む医薬組成物を指す。
莢膜多糖
本明細書において使用される場合、「糖」という用語は、単一砂糖部分または単糖単位、ならびに、共有結合して二糖、オリゴ糖および多糖を形成する２つ以上の単一砂糖部分または単糖単位の組合せを指す。「糖」という用語は、「炭水化物」という用語と交換可能に使用され得る。多糖は、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい。
本明細書において使用される場合、「糖」という用語は、単一砂糖部分または単糖単位、ならびに、共有結合して二糖、オリゴ糖および多糖を形成する２つ以上の単一砂糖部分または単糖単位の組合せを指す。「糖」という用語は、「炭水化物」という用語と交換可能に使用され得る。多糖は、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい。
「単糖」は、本明細書において使用される場合、オリゴ糖中における単一砂糖残基を指す。「二糖」という用語は、本明細書において使用される場合、グリコシド結合によって一緒に結合した２つの単糖単位または部分から構成される多糖を指す。
一実施形態において、多糖は、オリゴ糖（ＯＳ）である。「オリゴ糖」は、本明細書において使用される場合、２つ以上の単糖単位または部分を含有する化合物を指す。オリゴ糖の文脈内では、個々のモノマー単位または部分は、ヒドロキシル基を介して別の単糖単位または部分と結合しているまたはすることができる単糖である。オリゴ糖は、保護された単一残基砂糖からの化学合成によってまたは生物学的に生成された多糖の化学分解によってのいずれかで調製することができる。代替として、オリゴ糖は、インビトロ酵素法によって調製され得る。
好ましい実施形態において、多糖は、多糖（ＰＳ）であり、これは、少なくとも５つの単糖単位または部分の直鎖状または分枝鎖状ポリマーを指す。明瞭にするために、より多数の繰り返し単位（ここで、ｎは、約５超、例えば約１０超等である）を、本明細書において多糖と称する。
一実施形態において、多糖は、細胞表面多糖である。細胞表面多糖は、ペプチドグリカン層、細胞壁および莢膜を包含する最も外側の細菌細胞膜または細菌細胞表面上に位置する少なくとも一部を有する多糖を指す。典型的には、細胞表面多糖は、インビボで免疫応答を誘発することに関連する。細胞表面多糖は、「細胞壁多糖」または「莢膜多糖」であってよい。細胞壁多糖は、典型的には、細菌表面上に不連続層を形成する。
一実施形態において、多糖は、莢膜多糖である。莢膜多糖は、グリコシド結合によって接合した１つまたは複数の単糖の繰り返し単位を包含するグリコポリマーである。莢膜多糖は、典型的には、細菌細胞の周囲に莢膜様層を形成する。「莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」または「莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」は、レンサ球菌のほとんどの分離株の細胞壁の外部にある多糖莢膜を指す。例えば、すべてのＧＢＳ莢膜多糖は、細菌の菌力に必要とされる末端α２－３－結合シアル酸を持つ分枝鎖状繰り返し構造を有する。莢膜関連シアル酸（ＨＰＬＣアッセイによって定量化される）は、インビトロで培養したＴ．Ｅ．Ｓ．Ｔ．由来の侵襲性新生児分離株の９４％超において検出された。
本発明者らは、ＧＢＳ莢膜多糖のシアル酸レベルが、免疫応答を生成するために重要な特徴であることを発見した。先行開示は、血清型Ｖについてのシアル酸レベルに関して矛盾する情報、脱シアル化血清型Ｖが好ましい（国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３５５１９号）、および血清型Ｖについて５０％超のシアル酸含有量が使用され得る（国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０５３６１２号）という所見のみを提供していた。しかしながら、これらの参考文献のうちのいずれも、ＧＢＳ多糖の少なくとも大部分についてのシアル酸レベルの、免疫原性に対する重要性について記述していない。本発明者らは、驚くべきことに、ＧＢＳ莢膜多糖が、天然シアル酸レベルを有する多糖に相当する免疫応答（すなわち、１００％または約９５％超）を提供するために、コンジュゲーションの前に約６０％以上のシアル酸を必要とすることを見出した。血清型Ｖについて開示されている先の範囲内である５８％のシアル酸レベルであっても、免疫原性に悪影響を及ぼした。
したがって、本発明の一実施形態において、莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、それらの自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、および最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてもよい。
１００％のシアル酸レベルは、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸に対応することに留意すべきである。したがって、莢膜多糖は、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
一部の莢膜多糖（ＣＰ）血清型の末端シアル残基は、部分的にＯ－アセチル化されている（ＯＡｃ）（Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、１０１（３０）：１１１２３～８（２００４））。血清型Ｉｂ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸは、部分的にＯ－アセチル化されている（最大約４０％）のに対し、血清型Ｉａ、ＩＩおよびＶＩＩは、Ｏ－アセチル化をほとんどまたは全く有さない（約５％未満）（Ｌｅｗｉｓ ２００４）。本発明の一実施形態において、莢膜多糖は、それらの自然なＯ－アセチル化レベル（約０％から約４０％）を含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、Ｏ－脱アセチル化されていてよい（約５％未満）。多糖またはオリゴ糖のＯ－アセチル化の程度は、当技術分野において公知である任意の方法によって、例えば、プロトンＮＭＲによって決定することができる（Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ，Ｘ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９６：８３～９６（１９９６）；Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、３０：１２３３～１２４７（２００２）；国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３３１４８号および同第ＷＯ００／５６３５７号）。別の一般に使用される方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ，Ｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０：２４９～２６１（１９４９）によって記述されている。
また、１００％のＯ－アセテートは、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのＯ－アセテートに対応する。したがって、部分的にＯ－アセチル化されている多糖は、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３５または約０．４ｍＭのＯ－アセテートを含む。Ｏ－脱アセチル化されている多糖は、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．０５ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む。
侵襲性疾患を引き起こすことができるレンサ球菌微生物は、概して、細菌を被包し、宿主の自然免疫系によるクリアランスに対するその抵抗を強化するＣＰを生成することもできる。ＣＰは、細菌を食作用および細胞内死滅に対して抵抗性にする保護莢膜内に細菌細胞を覆い隠すことに役立つ。莢膜を欠いている細菌は、食作用の影響をより受けやすい。莢膜多糖は、高頻度で、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を包含する多くの細菌病原体にとって重要な菌力因子である。
莢膜多糖を使用して、特定の種の細菌の血清型を決めることができる。莢膜多糖の特異的構造または独自のエピトープ特徴への型判定は、通常は、産生された特異抗血清またはモノクローナル抗体との反応によって遂行される。１０のＧＢＳ血清型：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩ～ＩＸがある（Ｆｅｒｒｉｅｒｉ，Ｐ．ら、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］、１９（４）（２０１３）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｎｃ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｅｉｄ／ａｒｔｉｃｌｅ／１９／４／１２－１５７２＿ａｒｔｉｃｌｅにおいて利用可能）。
本発明の一実施形態において、多糖は、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）から単離される。多糖は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の任意の被包性株、例えば、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４、ＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７、ＰＦＥＧＢＳＴ０２６７、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１、ＰＦＥＧＢＳＴ０７０８、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）、ＰＦＥＧＢＳＴ０５６３、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６、ＰＦＥＧＢＳＴ０９６１、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１、ＰＦＥＧＢＳＴ０８３７、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４、ＣＺ－ＰＷ－１１９、７２７１、ＣＺ－ＰＷ－０４５、ＪＭ９１３００１３、ＪＭ９１３０６７２、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２およびＩＴ－ＰＷ－６４等から単離され得る。
本明細書において記述されている多糖は、例えば、本明細書において記述されている方法を包含する、当技術分野において公知の方法によって単離され得る。本明細書において使用される場合、「単離された」は、特定の起源から取得され、分離されることを指す。「単離された」という用語はさらに、そのそれぞれの自然発生形態、状況および／または環境にないことを指す。例えば、「レンサ球菌から単離された」は、レンサ球菌細胞から取得され、分離された物質を指す。単離された多糖は、自然発生のものではない。「単離された」という用語は、材料がその元の環境から取り出されていることを意味する（例えば、それが自然発生のものであれば自然環境、またはそれが組換え実体であればその宿主生物から、もしくは１つの環境から異なる環境へ運ばれる）。例えば、「単離された」莢膜多糖、タンパク質またはペプチドは、タンパク質が由来する細胞もしくは組織起源からの細胞材料もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または、化学的に合成される場合、もしくは化学反応の一部として混合物中に存在する場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。本発明において、タンパク質または多糖は、免疫原性組成物の製造において有用な形態で提供されるように、細菌細胞からまたは細胞残屑から単離され得る。「単離された」または「単離すること」という用語は、当技術分野において公知である単離された多糖を精製するための方法および／または本明細書において記述されている方法を包含する、精製することまたは精製を包含し得る。「細胞材料を実質的に含まない」という言葉は、ポリペプチド／タンパク質が、それを単離または組換えにより生成した細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチド／タンパク質の調製物を包含する。故に、細胞材料を実質的に含まない莢膜多糖、タンパク質またはペプチドは、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％または１％（乾重量で）未満の汚染タンパク質もしくは多糖または他の細胞材料を有する、莢膜多糖、タンパク質またはペプチドの調製物を包含する。ポリペプチド／タンパク質が組換えにより生成される場合、これは、好ましくは培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％または５％未満を表す。ポリペプチド／タンパク質または多糖が化学合成によって生成される場合、これは、好ましくは化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まない、すなわち、これは、タンパク質または多糖の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、ポリペプチド／タンパク質または多糖のそのような調製物は、目的のポリペプチド／タンパク質または多糖断片以外に、約３０％、２０％、１０％、５％（乾重量で）未満の化学的前駆体または化合物を有する。
本発明の一実施形態において、多糖は、細菌から単離される。本発明の別の実施形態において、多糖は、組換えにより生成される。さらなる実施形態において、多糖は、合成であるか、または従来の方法に従って化学的に合成される。本発明のまた別の実施形態において、多糖は、多糖を生成するための生合成経路をクローン化および発現した後の代理宿主における発現によって調製される。一実施形態において、多糖は、免疫原性である。例えば、本発明者らは、本明細書において記述されている各多糖が、免疫応答を誘発するまたは導出することができることを発見した。「免疫原性」という用語は、哺乳動物において、体液性および／または細胞媒介性免疫応答を開始する、トリガーする、引き起こす、強化する、改善する、および／または増強させる能力を指す。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、マウス等である。
莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用のための検討事項である。高分子量の莢膜多糖は、抗原表面上に存在する、より高い原子価のエピトープにより、ある特定の抗体免疫応答を誘発することができる。高分子量の莢膜多糖の単離および精製は、本発明のコンジュゲート、組成物および方法において使用するために企図されている。
しかしながら、一実施形態において、多糖は、担体タンパク質とのコンジュゲーション前に、天然莢膜多糖の分子量より低い分子量（ＭＷ）範囲にサイズ決定されていてよい。精製された莢膜多糖のサイズは、有利な濾過特性および／または収率を持つコンジュゲートを産生するために低減される。
１つのそのような実施形態において、精製された莢膜多糖のサイズは、高圧均質化によって低減される。高圧均質化は、十分に小さい寸法を持つ流路を介してプロセス流をポンプでくみ上げることにより、高せん断速度を実現する。せん断速度は、大きな印加均質化圧力を使用することによって増大され、曝露時間は、ホモジナイザーを介して送給流を再循環させることによって増大させることができる。
一実施形態において、本明細書において記述されている多糖は、オプソニン活性を誘発することができる。別の実施形態において、本明細書において記述されている多糖は、オプソニンおよび食作用活性（例えば、オプソニン食作用活性）を誘発することができる。
オプソニン活性またはオプソニン化は、オプソニン（例えば、抗体または補体因子）が抗原（例えば、本明細書において記述されている単離された多糖）と結合するプロセスを指し、これは、食細胞または食作用細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞および多形核白血球（ＰＭＮＬ））との抗原の結合を容易にする。一部の細菌、例えば、莢膜の存在により典型的には貪食されていない被包性細菌等は、オプソニン抗体でコーティングされると、食細胞によって認識されやすくなる。一実施形態において、多糖は、オプソニンである免疫応答、例えば抗体等を誘発する。一実施形態において、オプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくはレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に対する、より好ましくはＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の少なくとも１つの株に対するものである。
また別の実施形態において、本明細書において記述されている多糖は、殺菌免疫応答を誘発することができる。一実施形態において、殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくはレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に対する、より好ましくはＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の少なくとも１つの株に対するものである。
オプソニン化、食作用および／または殺菌活性を測定するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、細菌負荷の低減をインビボで計測することによるもの（例えば、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種を接種した哺乳動物における菌血症レベルを測定することによるもの）および／または細菌細胞死滅をインビトロで計測することによるもの（例えば、インビトロオプソニン食作用アッセイ）である。一実施形態において、多糖は、適切な対照と比較して、例えば、熱で死滅させたグラム陽性球菌に対して育てられた抗血清と比較して等、オプソニン、食作用および／または殺菌活性を誘発することができる。
血清型Ｉａ
一実施形態は、血清型Ｉａ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｉａの構造は、次のように描写することができる：
一実施形態は、血清型Ｉａ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｉａの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型Ｉａ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間である。別の好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
特定の実施形態において、多糖の構造的特色、例えばシアル酸等を保存しながら、天然ＧＢＳ莢膜多糖血清型Ｉａのサイズを低減させるために、高圧均質化プロセスが使用される。
本発明の一実施形態において、血清型Ｉａ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型Ｉａ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型Ｉａ莢膜多糖は、約５％未満でＯ－アセチル化されている。本発明の血清型Ｉａ莢膜多糖の一部の例示的な株は、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４およびＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）を包含する。
血清型Ｉｂ
一実施形態は、血清型Ｉｂ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｉｂの構造は、次のように描写することができる：
一実施形態は、血清型Ｉｂ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｉｂの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型Ｉｂ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型Ｉｂ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型Ｉｂ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型Ｉｂ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型Ｉｂ莢膜多糖の一部の例示的な株は、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７およびＰＦＥＧＢＳＴ０２６７を包含する。
血清型ＩＩ
一実施形態は、血清型ＩＩ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＩの構造は、次のように描写することができる：
一実施形態は、血清型ＩＩ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＩの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型ＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＩ莢膜多糖は、約５％未満でＯ－アセチル化されている。本発明の血清型ＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１およびＰＦＥＧＢＳＴ０７０８を包含する。
血清型ＩＩＩ
一実施形態は、血清型ＩＩＩ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＩＩの構造は、次のように描写することができる：
一実施形態は、血清型ＩＩＩ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＩＩの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型ＩＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間である。別の好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
特定の実施形態において、多糖の構造的特色、例えばシアル酸等を保存しながら、天然ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＩＩＩのサイズを低減させるために、高圧均質化プロセスが使用される。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＩＩ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＩＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）およびＰＦＥＧＢＳＴ０５６３を包含する。
血清型ＩＶ
一実施形態は、血清型ＩＶ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＶの構造は、次のように描写することができる：
一実施形態は、血清型ＩＶ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型ＩＶの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型ＩＶ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＶ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＶ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＶ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＩＶ莢膜多糖の一部の例示的な株は、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６およびＰＦＥＧＢＳＴ０９６１を包含する。
血清型Ｖ
一実施形態は、血清型Ｖ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｖの構造は、次のように描写することができる：
一実施形態は、血清型Ｖ ＧＢＳ莢膜多糖を包含する。血清型Ｖの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型Ｖ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。１つの好ましい実施形態において、コンジュゲーション前の莢膜多糖の分子量は、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型Ｖ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型Ｖ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型Ｖ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型Ｖ莢膜多糖の一部の例示的な株は、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１およびＰＦＥＧＢＳＴ０８３７を包含する。
血清型ＶＩ
ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖は、ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６１９４）：１２７２～１２８０（１９９３）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩの構造は、次のように描写することができる：
ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖は、ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６１９４）：１２７２～１２８０（１９９３）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩの構造は、次のように描写することができる：
コンジュゲーション前の血清型ＶＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＶＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＶＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＶＩ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＶＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４およびＣＺ－ＰＷ－１１９を包含する。
血清型ＶＩＩ
ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７７（１）：１～９（１９９５）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩＩの繰り返し単位は、次の通りである：
ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７７（１）：１～９（１９９５）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩＩの繰り返し単位は、次の通りである：
コンジュゲーション前の血清型ＶＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＶＩＩ莢膜多糖は、約５％未満でＯ－アセチル化されている。本発明の血清型ＶＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、７２７１およびＣＺ－ＰＷ－０４５を包含する。
血清型ＶＩＩＩ
ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１（１５）：８７８６～８７９０（１９９６）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩＩＩの繰り返し単位は、次の通りである：
ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、Ｋｏｇａｎ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１（１５）：８７８６～８７９０（１９９６）によって記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。血清型ＶＩＩＩの繰り返し単位は、次の通りである：
コンジュゲーション前の血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＪＭ９１３００１３およびＪＭ９１３０６７２を包含する。
血清型ＩＸ
ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖は、Ｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８９（３４）：２３４３７～２３４８（２０１４）およびその他によって以前に記述されてきた。しかしながら、ＧＢＳ血清型ＩＸ多糖の骨格におけるＧｌｃｐＮＡｃの配置はアルファ（α）であり、これは、この結合がβ配置であるように提案した、以前に公開された構造詳細とは異なる。血清型ＩＸの構造は、より正確に次のように描写することができる：
ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖は、Ｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８９（３４）：２３４３７～２３４８（２０１４）およびその他によって以前に記述されてきた。しかしながら、ＧＢＳ血清型ＩＸ多糖の骨格におけるＧｌｃｐＮＡｃの配置はアルファ（α）であり、これは、この結合がβ配置であるように提案した、以前に公開された構造詳細とは異なる。血清型ＩＸの構造は、より正確に次のように描写することができる：
ＧＢＳ血清型ＩＸに対応するこの構造は、次のように表すこともできる：
コンジュゲーション前の血清型ＩＸ莢膜多糖の分子量は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等である。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
本発明の一実施形態において、血清型ＩＸ莢膜多糖は、約１００％または約９５％超等、その自然なシアル酸レベルを含む。別の実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、最大約４０％（約６０％超のシアル化レベル）、例えば最大約３５％（約６５％超のシアル化レベル）、最大約３０％（約７０％超のシアル化レベル）、最大約２５％（約７５％超のシアル化レベル）、最大約２０％（約８０％超のシアル化レベル）、最大約１５％（約８５％超のシアル化レベル）、最大約１０％（約９０％超のシアル化レベル）、または最大約５％（約９５％超のシアル化レベル）等、脱シアル化されていてよい。
別の実施形態において、血清型ＩＸ莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり約１．０ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有する。さらなる実施形態において、莢膜多糖は、コンジュゲーション前に、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸、例えば、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸、または多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸等を有し得る。
血清型ＩＸ莢膜多糖は、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている。本発明の一実施形態において、多糖は、Ｏ－脱アセチル化されている（すなわち、約５％未満でＯ－アセチル化されている）。本発明の血清型ＩＸ莢膜多糖の一部の例示的な株は、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２およびＩＴ－ＰＷ－６４を包含する。
多糖－タンパク質コンジュゲート
本明細書において使用される場合、「コンジュゲート」は、通常は所望範囲の分子量の莢膜多糖および担体タンパク質を含み、莢膜多糖は、担体タンパク質とコンジュゲートしている。コンジュゲートは、若干量の遊離莢膜多糖を含有してもしなくてもよい。本明細書において使用される場合、「遊離莢膜多糖」は、コンジュゲートしている莢膜多糖－担体タンパク質と非共有結合的に会合している（すなわち、それと非共有結合している、それに吸着しているまたはその中にもしくはそれにより捕捉されている）莢膜多糖を指す。「遊離莢膜多糖」「遊離多糖」および「遊離糖」という用語は、交換可能に使用されてよく、同じ意味を伝えるように意図されている。担体分子の性質にかかわらず、担体分子は、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで、莢膜多糖とコンジュゲートすることができる。本明細書において使用される場合、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートしている」および「コンジュゲートすること」は、細菌莢膜多糖が担体分子と共有結合するプロセスを指す。コンジュゲーションは、細菌莢膜多糖の免疫原性を強化する。コンジュゲーションは、後述する方法に従って、または当技術分野において公知のプロセスによって、実行することができる。
本明細書において使用される場合、「コンジュゲート」は、通常は所望範囲の分子量の莢膜多糖および担体タンパク質を含み、莢膜多糖は、担体タンパク質とコンジュゲートしている。コンジュゲートは、若干量の遊離莢膜多糖を含有してもしなくてもよい。本明細書において使用される場合、「遊離莢膜多糖」は、コンジュゲートしている莢膜多糖－担体タンパク質と非共有結合的に会合している（すなわち、それと非共有結合している、それに吸着しているまたはその中にもしくはそれにより捕捉されている）莢膜多糖を指す。「遊離莢膜多糖」「遊離多糖」および「遊離糖」という用語は、交換可能に使用されてよく、同じ意味を伝えるように意図されている。担体分子の性質にかかわらず、担体分子は、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで、莢膜多糖とコンジュゲートすることができる。本明細書において使用される場合、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートしている」および「コンジュゲートすること」は、細菌莢膜多糖が担体分子と共有結合するプロセスを指す。コンジュゲーションは、細菌莢膜多糖の免疫原性を強化する。コンジュゲーションは、後述する方法に従って、または当技術分野において公知のプロセスによって、実行することができる。
「コンジュゲート免疫原性組成物」は、本明細書において使用される場合、免疫原性材料が、担体タンパク質と共有結合して多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する抗原性多糖を包含する、免疫原性組成物を指す。一実施形態において、本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートは、多価免疫原性組成物として製剤化され得る。
本明細書において使用される場合、多糖のまたは担体タンパク質－多糖コンジュゲートの「分子量」という用語は、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出された分子量を指す。
本明細書において使用される場合、「多糖－タンパク質コンジュゲート」は、１つまたは複数の共有結合を介してタンパク質担体分子とコンジュゲートしている多糖分子を指す。多糖を、標的宿主において免疫原性であることが公知の別の種由来のタンパク質とコンジュゲートすることが望ましい場合がある。したがって、一実施形態において、担体分子は、担体タンパク質である。本明細書において定義されている通り、そのような外来タンパク質を、「担体タンパク質」と称する。担体タンパク質は、多糖の抗原性および免疫原性を強化するために役立つ。本明細書において使用される場合、「担体効果」という用語は、弱免疫原性または非免疫原性分子の抗原性および免疫原性が、担体としてのより免疫原性の高い分子（例えば、異種タンパク質）と結合されることによって強化されるプロセスを指す。この場合、組み合わせた多糖－タンパク質コンジュゲート中の多糖は、単独で提示された場合よりも免疫原性が高くなる。担体タンパク質は、抗体応答を生成するのを助けるＴ細胞を刺激するために、Ｔ細胞エピトープを含有する。
「担体タンパク質」または「タンパク質担体」は、本明細書において使用される場合、免疫応答が所望される抗原（莢膜多糖等）とコンジュゲートされ得る任意のタンパク質分子を指す。多糖等の抗原の担体タンパク質とのコンジュゲーションは、抗原を免疫原性にすることができる。担体タンパク質は、好ましくは、非毒性および非反応源性であり、十分な量および純度で取得可能なタンパク質である。担体タンパク質の例は、毒素、トキソイド、または破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種およびレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の毒素の任意の突然変異体交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）である。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適していなくてはならない。ある実施形態において、担体タンパク質は、レンサ球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）である。本発明の別の実施形態において、ＣＲＭ１９７は担体タンパク質として使用される。
交差反応材料またはＣＲＭは、本発明の一部の実施形態にとりわけ有用である。遺伝子改変されたタンパク質を生成することができ、これは、ある特定の細菌毒素と抗原的に同様であるが、非毒性である。これらは、「交差反応材料」またはＣＲＭと呼ばれる。ＣＲＭ１９７（Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）は、天然ジフテリア毒素由来の単一アミノ酸変化を有し、それと免疫学的に区別できないことから、注目に値する。Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．、９（９）：８９１～９０６（１９７２）；米国特許第５，６１４，３８２号を参照されたく、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸および酵母抽出物ベースの培地中で成長させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離されたジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーを介して精製される。ＣＲＭ１９７タンパク質を生成するジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）の培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ５３２８１が割り当てられた。他のジフテリアトキソイドも、担体タンパク質として使用するために好適である。ＣＲＭ３２０１は、百日咳毒素の遺伝子操作された変異体である。Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０（４８５２）：６５６～６５９（１９８８）を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
レンサ球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）は、感染部位への多形核細胞動員を司る補体成分５（Ｃ５ａ）のアルファ断片をタンパク質分解的に不活性化する、ベータ溶血レンサ球菌属のメンバーによってコードされる細胞壁固定病原性タンパク質である（２００５．ＰＮＡＳ．１０２（５１）：１８３９１．）。これは、保護抗体の標的であり、ＳＣＰに向けられたＩｇＧ抗体は、オプソニン食作用を媒介することができる。加えて、ＳＣＰは、コンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ多糖ハプテンに対する免疫応答を強化する担体タンパク質として役立つことができる。
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７、ＳＣＰおよび百日咳トキソイドに加えて、担体タンパク質のさらなる例は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号において記述されている通り）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性トキソイド（ＬＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）耐熱性トキソイド（ＳＴ）、肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来の肺炎球菌溶血素（野生型または毒性を低減した突然変異体）、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のＣ５ａペプチダーゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ａｕｒｅｕｓ）由来の溶血素、分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）タンパク質、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、ならびに呼吸器合胞体ウイルスＦおよびＧタンパク質、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素または組換えにより生成された非毒性突然変異体緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａを包含するその誘導体を包含する。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜タンパク質複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質等、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）エンテロトキシン（毒素Ａ）および細胞毒素（毒素Ｂ）を使用することもできる。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）等を、担体タンパク質として使用することもできる。好ましい実施形態において、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドである。より好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。本発明の別の実施形態において、担体タンパク質は、破傷風トキソイドである。
多価コンジュゲート免疫原性組成物の合成のために、多糖－タンパク質コンジュゲートは、２つの異なる種の細菌から精製された多糖の混合物を、担体タンパク質とコンジュゲートすることによって生成され得る。代替として、多価コンジュゲート免疫原性組成物は、同じ細菌の２つ以上の異なる血清型の細菌から精製された多糖を組み合わせ、それらを混合物として担体タンパク質とコンジュゲートすることによって生成され得る。代替として、単一種類の多糖を担体タンパク質と、異なる多糖を使用する別個の反応において反応させることによって生成された多糖－タンパク質コンジュゲートを、混合してよい。故に、多価免疫原性組成物は、結合した多糖の均一または不均一集団を担持している担体タンパク質を包含し得る。
莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーション後、多糖－タンパク質コンジュゲートは、様々な技術によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関しては富化される）。これらの技術は、例えば、濃縮／血液透析濾過作業、沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィーおよび深層濾過を包含する。
上述した通り、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ莢膜多糖を含むコンジュゲートに関する。本発明の一実施形態は、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖を含むコンジュゲート、および、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖、または担体タンパク質とコンジュゲートしているＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖を含む少なくとも１つの追加のコンジュゲートを提供する。本発明の一態様において、多糖は、約５ｋＤａから１，０００ｋＤａの間の分子量を有し、コンジュゲートは、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間の分子量を有し、コンジュゲートは、全多糖と比べて約４０％未満の遊離多糖を含む。一実施形態において、コンジュゲートは、全多糖と比べて、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離多糖を含む。
一実施形態において、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよび／またはＩＸ多糖は、コンジュゲーションの前、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約５０ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２５０ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３５０ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、の間、約２５０ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４５０ｋＤａの間、約２５０ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから７５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６５０ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５５０ｋＤａの間、または約３００ｋＤａから約５００ｋＤａの間等の分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態として企図されている。
一実施形態において、コンジュゲートは、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、例えば、約３００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約４，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約３，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約２，０００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約４，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約３，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約２，０００ｋＤａの間、約５００ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約１，５００ｋＤａから約５，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約２，０００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、約２，５００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約９，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約８，０００ｋＤａの間、約３，０００ｋＤａから約７，０００ｋＤａの間、または約３，０００ｋＤａから約６，０００ｋＤａの間等の分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖コンジュゲートは、上記範囲のうちのいずれかの分子量を有する。
一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９７または０．９８ｍＭのシアル酸を有する。好ましい実施形態において、コンジュゲートは、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９または０．９５ｍＭのシアル酸を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちの少なくともいずれかのシアル酸含有量を有する。
ある実施形態において、本発明のコンジュゲートは、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．０５ｍＭ未満のＯ－アセテートを含む。別の実施形態において、コンジュゲートは、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３５または約０．４ｍＭのＯ－アセテートを含む。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｉｂ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
ある実施形態において、ＧＢＳ血清型ＩＸ莢膜多糖コンジュゲートは、上記値のうちのいずれかのＯ－アセテート含有量を有する。
さらなる実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離ＧＢＳ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して、約５％未満の未反応の遊離糖を含む。
また別の実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）は、約０．５から約３．０の間である。一態様において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．５から約２．０の間、約０．５から約１．５の間、約０．５から約１．０の間、約１．０から約１．５の間、または約１．０から約２．０の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．８から約１．０の間である。
別の実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から１５の間、２から１３の間、２から１０の間、２から８の間、２から６の間、２から５の間、２から４の間、３から１５の間、３から１３の間、３から１０の間、３から８の間、３から６の間、３から５の間、３から４の間、５から１５の間、５から１０の間、８から１５の間、８から１２の間、１０から１５の間、または１０から１２の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から５の間である。
コンジュゲーション
コンジュゲーションは、直接的であってよく、ここでは、多糖からの原子がタンパク質表面からの原子と共有結合している。代替として、コンジュゲーションは、リンカー分子を介するものであってよく、これが多糖およびタンパク質の両方と反応し、２つを接続して、炭水化物をタンパク質に繋ぐ。
コンジュゲーションは、直接的であってよく、ここでは、多糖からの原子がタンパク質表面からの原子と共有結合している。代替として、コンジュゲーションは、リンカー分子を介するものであってよく、これが多糖およびタンパク質の両方と反応し、２つを接続して、炭水化物をタンパク質に繋ぐ。
担体および多糖等の１つまたは複数の抗原がコンジュゲートしている（すなわち、共有結合的に会合している）場合、コンジュゲーションは、当業者において公知である任意の化学的方法、プロセスまたは遺伝学的技術によるものであってよい。例えば、担体ポリペプチド、および、炭水化物、オリゴ糖、脂質、リポオリゴ糖、多糖、オリゴ糖－タンパク質コンジュゲート、多糖－タンパク質コンジュゲート、ペプチド－タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖－ペプチドコンジュゲート、多糖－ペプチドコンジュゲート、タンパク質－タンパク質コンジュゲート、リポオリゴ糖－タンパク質コンジュゲート、多糖－タンパク質コンジュゲート、またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される１つまたは複数の抗原は、（１）タンパク質官能基を介する直接的カップリング（例えば、チオール－チオール結合、アミン－カルボキシル結合、アミン－アルデヒド結合；酵素直接的カップリング）、（２）アミンのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス－アルデヒドを使用する）、（３）チオールのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス－マレイミドを使用する）、（４）光活性化試薬を介するホモ二官能性カップリング、（５）アミンのチオールとのヘテロ二官能性カップリング（例えば、マレイミドを使用する）、（６）光活性化試薬を介するヘテロ二官能性カップリング（例えば、β－カルボニルジアゾ（ｃａｒｂｏｎｙｉｄｉａｚｏ）ファミリー）、（７）臭化シアン活性化またはカルボキシメチル化を介してアミン－反応性基を多糖またはオリゴ糖に導入すること、（８）マレイミド－ヒドラジド等のヘテロ二官能性化合物を介してチオール－反応性基を多糖またはオリゴ糖に導入すること、（９）疎水性基をタンパク質に導入することを介するタンパク質－脂質コンジュゲーションおよび（１０）反応性基を脂質に組み込むことを介するタンパク質－脂質コンジュゲーションを包含するがこれらに限定されない技術によって、コンジュゲートしていてよい。また、ビオチン－アビジン相互作用等のヘテロ二官能性「非共有結合的カップリング」技術も企図されている。オリゴ糖および多糖の、免疫原性担体タンパク質とのコンジュゲーションを達成するための、当技術分野において周知である他の方法も、本発明の一部の実施形態の範囲内である。
ある実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、多糖を１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化させて、シアン酸エステルを形成することによって取得される。活性化多糖は、担体タンパク質上のアミノ基と、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用する）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡまたはＳＢＡＰを使用する）との反応後に取得されるチオエーテル結合を介して担体とカップリングされ得るチオール化多糖を得るために、シスタミンまたはシステアミンであってよい。
一態様において、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学によって作製されていてもよい）は、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングされており、アミノ誘導体化糖は、タンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を使用して、担体タンパク質とコンジュゲートしている。そのようなコンジュゲートは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５７６０号、同第ＷＯ９５／０８３４８号および同第ＷＯ９６／２９０９４号において記述されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣおよびＴＳＴＵを使用する。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号において記述されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基の、１，１カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）または１，１カルボニルジ１，２，４トリアゾール（ＣＤＴ）との反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：２５７２～２５７４（１９７９）；Ｈｅａｒｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、２１８：５０９～５１８（１９８１）を参照）、続いて、カルバメート結合を形成するためのタンパク質との反応によって形成され得るカルボニルリンカーを伴ってよい。これは、アノマー末端の第一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩ／ＣＤＴカルバメート中間体を形成するための第一級ヒドロキシル基のＣＤＩ／ＣＤＴとの反応、およびＣＤＩ／ＣＤＴカルバメート中間体をタンパク質上のアミノ基とカップリングすることを伴ってよい。
好ましい実施形態において、本発明のＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、還元的アミノ化を使用して調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ：（１）個々の六糖単位において隣接ジオールからアルデヒド官能基を産生するための多糖の酸化、ならびに（２）コンジュゲートを形成するための活性化多糖および担体タンパク質の還元を伴う。
ある実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖は、
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと
を含むプロセスによって活性化（酸化）される。
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと
を含むプロセスによって活性化（酸化）される。
本発明のある態様において、単離された莢膜多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬから約５．０ｍｇ／ｍＬの間、約１．０ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬの間、または約２．０ｍｇ／ｍＬ等である。
特定の実施形態において、酸化剤は、過ヨウ素酸塩である。過ヨウ素酸塩は、隣接ヒドロキシル基を酸化してカルボニルまたはアルデヒド基を形成し、Ｃ－Ｃ結合の開裂を引き起こす。「過ヨウ素酸塩」という用語は、過ヨウ素酸塩および過ヨウ素酸の両方を包含する。この用語は、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４
－）およびオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６
５－）の両方も包含する。「過ヨウ素酸塩」という用語は、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムを包含する過ヨウ素酸塩の種々の塩も包含する。好ましい実施形態において、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである。好ましい実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖の酸化に使用される過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸塩である。好ましい実施形態において、血清型莢膜多糖の酸化に使用される過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
別の実施形態において、多糖を、０．０１から１０．０、０．０５から５．０、０．１から１．０、０．５から１．０、０．７から０．８、０．０５から０．５、または０．１から０．３モル当量の酸化剤と反応させる。特定の実施形態において、多糖を、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．６５、約０．７、約０．７５、約０．８、約０．８５、約０．９、または約０．９５モル当量の酸化剤と反応させる。さらなる実施形態において、多糖を、約０．１モル当量の酸化剤と反応させる。さらなる実施形態において、多糖を、約０．１５モル当量の酸化剤と反応させる。追加の実施形態において、多糖を、約０．２５モル当量の酸化剤と反応させる。また別の実施形態において、多糖を、約０．５モル当量の酸化剤と反応させる。代替的な実施形態において、多糖を、約０．６モル当量の酸化剤と反応させる。さらなる実施形態において、多糖を、約０．７モル当量の酸化剤と反応させる。
本発明の一態様において、酸化反応の持続時間は、約１時間から約５０時間の間、約１０時間から約３０時間の間、約１５時間から約２０時間の間、約１５時間から約１７時間の間、または約１６時間である。
本発明の別の態様において、酸化反応の温度は、約２℃から約２５℃の間、約２℃から約８℃の間、または約２０℃から約２５℃の間に維持される。１つの好ましい実施形態において、反応の温度は、約２３℃に維持される。別の好ましい実施形態において、反応の温度は、約５℃に維持される。
さらなる態様において、酸化反応は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびビス－トリスからなる群から選択される緩衝剤中で行われる。好ましい実施形態において、緩衝剤は、リン酸カリウムである。
追加の態様において、緩衝剤は、約１ｍＭから約５００ｍＭの間、約１ｍＭから約３００ｍＭの間、または約５０ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度を有する。好ましい実施形態において、緩衝剤は、約１００ｍＭの濃度を有する。
一態様において、酸化反応は、約４．０から約８．０の間、約５．０から約７．０の間、または約５．５から約６．５の間のｐＨで行われる。好ましい実施形態において、ｐＨは、約６．０である。
一実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５．０ｍｇ／ｍＬの単離された莢膜多糖を、約０．０５から約０．３モル当量の過ヨウ素酸塩と、約２０℃から２５℃の間の温度で反応させることによって取得される。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約０．５ｍｇ／Ｌから約５．０ｍｇ／ｍＬの単離された莢膜多糖を、約０．０５から約０．３モル当量の過ヨウ素酸塩と、約２℃から約８℃の間の温度で反応させることによって取得される。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、当業者に公知の方法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析または限外濾過／血液透析濾過等に従って精製される。例えば、活性化莢膜多糖は、濃縮および限外濾過デバイスを使用する血液透析濾過によって精製される。
一実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖の酸化度は、５から２５の間、例えば、５から１５の間、５から１０の間、１０から２５の間、１０から２０の間、１０から１５の間等である。好ましい実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖の酸化度は、１０から２０の間、１１から１９の間、１２から１８の間、１３から１７の間、または１４から１６の間である。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、例えば、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約７００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約１００ｋＤａから約３００ｋＤａの間、約２００ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約３００ｋＤａから約７００ｋＤａの間等の分子量を有する。好ましい実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、約７５ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する。
ある実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、場合により糖の存在下で、凍結乾燥される。好ましい実施形態において、糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態において、糖は、スクロースである。次いで、凍結乾燥された活性化莢膜多糖を、担体タンパク質を含む溶液と配合することができる。
別の実施形態において、活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、担体タンパク質と配合され、場合により糖の存在下で、凍結乾燥される。一態様において、糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態において、糖は、スクロースである。次いで、共凍結乾燥した多糖および担体タンパク質を、溶液に再懸濁し、還元剤と反応させることができる。
活性化ＧＢＳ莢膜多糖は、
（ａ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｂ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含むプロセスによって、担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。
（ａ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｂ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含むプロセスによって、担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。
極性非プロトン性溶媒中における還元的アミノ化による活性化ＧＢＳ莢膜多糖のタンパク質担体とのコンジュゲーションは、例えば、未反応の（遊離）多糖のレベルが有意に上昇する水溶液中における還元的アミノ化と比較して、低レベルの遊離多糖を維持するために好適である。好ましい実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、極性非プロトン性溶媒中で行われる。
一実施形態において、ステップ（ａ）は、凍結乾燥したＧＢＳ莢膜多糖を、担体タンパク質および極性非プロトン性溶媒を含む溶液に溶解することを含む。別の実施形態において、ステップ（ａ）は、共凍結乾燥したＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、極性非プロトン性溶媒に溶解することを含む。
一実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯである。
ステップ（ａ）および（ｂ）が水溶液中で行われる場合、ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくは、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ビス－トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される、約６．０から約８．５の間、約７．０から約８．０の間、または約７．０から約７．５の間のｐＨの水性媒体中の緩衝剤中で行われる。好ましい実施形態において、緩衝剤は、ＰＢＳである。好ましい実施形態において、ｐＨは、約７．３である。
一実施形態において、ステップ（ｂ）における活性化ＧＢＳ莢膜多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間、約０．５ｍｇ／ｍＬから約５．０ｍｇ／ｍＬの間、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約２．０ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）における活性化血清型ＧＢＳ莢膜多糖の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．７ｍｇ／ｍＬ、約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．９ｍｇ／ｍＬ、約２．０ｍｇ／ｍＬ、約２．１ｍｇ／ｍＬ、約２．２ｍｇ／ｍＬ、約２．３ｍｇ／ｍＬ、約２．４ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約２．６ｍｇ／ｍＬ、約２．７ｍｇ／ｍＬ、約２．８ｍｇ／ｍＬ、約２．９ｍｇ／ｍＬ、または約３．０ｍｇ／ｍＬである。
別の実施形態において、活性化血清型ＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の初期比（重量／重量）は、５：１から０．１：１、２：１から０．１：１、２：１から１：１、１．５：１から１：１、０．１：１から１：１、０．３：１から１：１、０．６：１から１：１の間である。好ましい実施形態において、活性化血清型ＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の初期比は、約０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１である。
ある実施形態において、還元剤は、ブレンステッドもしくはルイス酸、アミンボラン、例えば、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）等の存在下、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは亜鉛である。好ましい実施形態において、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
別の実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される還元剤の分量は、約０．１から約１０．０モル当量の間、約０．５から約５．０モル当量の間、または約１．０から約２．０モル当量の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される還元剤の分量は、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０モル当量である。
さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の持続時間は、１時間から６０時間の間、１０時間から５０時間の間、４０時間から５０時間の間、または４２時間から４６時間の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）の持続時間は、約４４時間である。
さらなる実施形態において、ステップ（ｂ）における反応の温度は、１０℃から４０℃の間、１５℃から３０℃の間、または２０℃から２６℃の間に維持される。好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）における反応の温度は、約２３℃に維持される。
追加の実施形態において、担体タンパク質と共有結合しているＧＢＳ莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートの調製のためのプロセスは、水素化ホウ素の添加により、未反応のアルデヒドをキャップする（クエンチする）ステップ（ステップ（ｃ））をさらに含む。
一実施形態において、キャッピング試薬は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素テトラブチルアンモニウム、水素化ホウ素カルシウムおよび水素化ホウ素マグネシウムからなる群から選択される水素化ホウ素である。好ましい実施形態において、キャッピング試薬は、水素化ホウ素ナトリウムである。
また別の実施形態において、ステップ（ｃ）において使用される水素化ホウ素の分量は、約０．１から約１０．０モル当量の間、約０．５から約５．０モル当量の間、または約１．０から３．０モル当量の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）において使用される水素化ホウ素の分量は、約２．０モル当量である。
一実施形態において、ステップ（ｃ）において使用される水素化ホウ素は、約２．０モル当量の濃度のＮａＢＨ４である。
一実施形態において、ステップ（ｃ）の持続時間は、０．１時間から１０時間の間、０．５時間から５時間の間、２から４時間の間である。好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）の持続時間は、約３時間である。
別の実施形態において、ステップ（ｃ）における反応の温度は、約１５℃から約４５℃の間、約１５℃から約３０℃の間、または約２０℃から約２６℃の間に維持される。好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）における反応の温度は、約２３℃に維持される。
ＧＢＳ莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーションおよびキャッピング後、多糖－タンパク質コンジュゲートは、当業者に公知である様々な技術によって精製され得る（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関しては富化される）。これらの技術は、透析、濃縮／血液透析濾過作業、タンジェント流濾過、沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）および深層濾過を包含する。
さらなる実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の遊離ＧＢＳ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖の総量と比較して約５％未満の未反応の遊離糖を含む。
別の実施形態において、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲートは、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、例えば、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間または約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間等の分子量を有する。
また別の実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）は、約０．５から約３．０の間である。一態様において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．５から約２．０の間、約０．５から約１．５の間、約０．５から約１．０の間、約１．０から約１．５の間、または約１．０から約２．０の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲート中におけるＧＢＳ莢膜多糖対担体タンパク質の比は、約０．８から約１．０の間である。
別の実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から１５の間、２から１３の間、２から１０の間、２から８の間、２から６の間、２から５の間、２から４の間、３から１５の間、３から１３の間、３から１０の間、３から８の間、３から６の間、３から５の間、３から４の間、５から１５の間、５から１０の間、８から１５の間、８から１２の間、１０から１５の間、または１０から１２の間である。好ましい実施形態において、コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２から５の間である。
本発明の一態様において、ＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、上述した還元的アミノ化方法によって取得される。例えば、一態様において、本開示は、
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、
（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、場合により
（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により未反応のアルデヒドをキャップするステップと
を含む方法によって生成されるまたは取得可能な、担体タンパク質とコンジュゲートしている多糖を含むＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、
（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、場合により
（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により未反応のアルデヒドをキャップするステップと
を含む方法によって生成されるまたは取得可能な、担体タンパク質とコンジュゲートしている多糖を含むＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。
好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）および（ｄ）は、ＤＭＳＯ中で行われる。
本発明の別の態様において、本発明のＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、活性化／酸化ステップにおいて２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を共酸化剤として用いたことを除き、上述した通りの還元的アミノ化を使用して調製される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９７０９９号を参照されたい。そのような実施形態において、ＧＢＳ莢膜多糖由来のグリココンジュゲートは、実施例７および国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９７０９９号において記述されているように、共酸化剤としてＮＣＳを使用して糖の第一級アルコールをアルデヒドに酸化させる（以後、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化」）ためにＴＥＭＰＯフリーラジカルを使用して調製される。したがって、一態様において、ＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲートは、ａ）ＧＢＳ莢膜多糖を、溶媒中でＴＥＭＰＯおよびＮＣＳと反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップ（以後、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化」）とを含む方法によって取得可能である。一実施形態において、溶媒は、水性溶媒またはＤＭＳＯであってもよい。
一態様において、ＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートは、前記方法によって取得される。例えば、一態様において、本開示は、ａ）糖を、溶媒中で２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法によって生成されるまたは取得可能な、担体タンパク質とコンジュゲートしている多糖を含むＧＢＳ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを提供する。一実施形態において、溶媒は、水性溶媒またはＤＭＳＯであってもよい。
免疫原性組成物
個々のコンジュゲートを精製した後、これらを組み合わせて、例えばワクチンにおいて使用され得る本発明の免疫原性組成物を製剤化することができる。本発明の免疫原性組成物の製剤化は、当技術分野において認められている方法を使用して遂行することができる。
個々のコンジュゲートを精製した後、これらを組み合わせて、例えばワクチンにおいて使用され得る本発明の免疫原性組成物を製剤化することができる。本発明の免疫原性組成物の製剤化は、当技術分野において認められている方法を使用して遂行することができる。
免疫原性組成物に対する「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する分子（例えば、タンパク質または多糖等の抗原）に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の対象における発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体媒介性免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物中に存在する抗原に対する親和性を持つ抗体の産生を伴い、一方、「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔ－リンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子と会合している抗原エピトープの提示によって導出される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球細胞（ＣＴＬ）を活性化させる。ＣＴＬは、ＭＨＣまたはＣＤ１によってコードされ、細胞の表面上に発現されるタンパク質と会合して提示されているペプチドまたは脂質抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染している細胞の溶菌を、誘発し促進するのを助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激し、それらの表面上の古典的なまたは非古典的なＭＨＣ分子と会合しているペプチド抗原を表示している細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に集中するのを助けるように作用する。「細胞媒介性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを包含する他の白血球によって生成された他のそのような分子の生成も指す。細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、若干数のアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイによって、感作された対象における抗原に対して特異的なＴ－リンパ球についてアッセイすることによって、または抗原による再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン生成の測定によって等、決定され得る。そのようなアッセイは、当技術分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１（８）：４１８９～４１９９（１９９３）；Ｄｏｅ，Ｂ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１０）：２３６９～２３７６（１９９４）を参照されたい。
「免疫原性」という用語は、体液性もしくは細胞媒介性のいずれかまたは両方の免疫応答を導出する抗原またはワクチンの能力を指す。
「免疫原性量」または「免疫学的有効量」または「用量」は、それらのそれぞれが本明細書において交換可能に使用され、概して、当業者に公知の標準的なアッセイによって測定される通りの、細胞性（Ｔ細胞）もしくは体液性（Ｂ細胞または抗体）応答のいずれかまたは両方の免疫応答を導出するのに十分な、抗原または免疫原性組成物の量を指す。
「免疫干渉」または「有意な免疫干渉」は、本明細書において使用される場合、一価ワクチンで投与される場合の同じ抗原に対する免疫応答と比較した、多価または多成分ワクチンにおける個々の抗原に対する免疫応答の統計的に有意な減少を指す。
「保護的」免疫応答は、対象を感染から保護するために役立つ、体液性または細胞媒介性いずれかの免疫応答を導出する免疫原性組成物の能力を指す。提供される保護は絶対的である必要はない、すなわち、対象の対照集団、例えば、ワクチンも免疫原性組成物も投与されていない感染動物と比較して統計的に有意な改善があるならば、感染を完全に予防するまたは根絶する必要はない。保護は、感染の症状の発症の重症度または速さを緩和することに限定され得る。免疫応答が「保護的免疫応答」を示すものであるか否かを決定するためのいくつかのアッセイが、当技術分野において公知である。例えば、抗体レベルの増大は、さらに後述する全細胞ＥＬＩＳＡアッセイ等の結合アッセイによって測定され得る。他のアッセイは、後述する通りのオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）で試験することができる、細菌死滅の容易化等の機能的抗体応答を測定することを包含する。特定の状況において、「保護的免疫応答」は、対象の少なくとも５０％において、特定の抗原に対して特異的な、抗体レベルの２倍の増大または抗体レベルの４倍の増大の誘発を包含し得る。別の状況において、「保護的免疫応答」は、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の細菌カウントにおける減少を包含し得る。
組成物中における特定のコンジュゲートの量は、概して、そのコンジュゲートについて、コンジュゲートしているおよびコンジュゲートしていない全多糖に基づいて算出される。例えば、２０％の遊離多糖を持つＧＢＳ莢膜多糖コンジュゲートは、１００ｍｃｇ／ｍｌのＧＢＳ莢膜多糖用量中に、約８０ｍｃｇ／ｍｌのコンジュゲートしているＧＢＳ莢膜多糖および約２０ｍｃｇ／ｍｌのコンジュゲートしていないＧＢＳ莢膜多糖を有すると予想される。コンジュゲートへのタンパク質担体の寄与は、通常、コンジュゲートの用量を算出する際には考慮されない。コンジュゲートの量は、レンサ球菌の血清型に応じて変動し得る。概して、各用量は、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｃｇ／ｍｌ、特に約１ｍｃｇ／ｍｌから約７０ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌの各多糖を含むことになる。免疫原性組成物中における異なる多糖成分の「免疫原性量」は、相違していてよく、それぞれが、約０．０１ｍｃｇ／ｍｌ、約０．１ｍｃｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｃｇ／ｍｌ、約０．５ｍｃｇ／ｍｌ、約１ｍｃｇ／ｍｌ、約２ｍｃｇ／ｍｌ、約３ｍｃｇ／ｍｌ、約４ｍｃｇ／ｍｌ、約５ｍｃｇ／ｍｌ、約６ｍｃｇ／ｍｌ、約７ｍｃｇ／ｍｌ、約８ｍｃｇ／ｍｌ、約９ｍｃｇ／ｍｌ、約１０ｍｃｇ／ｍｌ、約１５ｍｃｇ／ｍｌ、約２０ｍｃｇ／ｍｌ、約２５ｍｃｇ／ｍｌ、約３０ｍｃｇ／ｍｌ、約４０ｍｃｇ／ｍｌ、約５０ｍｃｇ／ｍｌ、約６０ｍｃｇ／ｍｌ、約７０ｍｃｇ／ｍｌ、約８０ｍｃｇ／ｍｌ、約９０ｍｃｇ／ｍｌ、または約１００ｍｃｇ／ｍｌの任意の特定の多糖抗原を含み得る。多価免疫原性組成物の用量または免疫原性量は、別段の指示がない限り、各多糖の用量を示すと予想される。例えば、１０ｍｃｇ／ｍｌ用量の六価免疫原性組成物は、１０ｍｃｇ／ｍｌの６つのそれぞれの多糖を含有すると予想される。
免疫原としての抗原の有効性は、イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、機能的抗体アッセイ、例えば、インビトロオプソニンアッセイ等、および当技術分野において公知である多くの他のアッセイを使用して、血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することにより、Ｂ細胞活性のレベルを測定することによって測定することができる。Ｔ細胞免疫原としての抗原の有効性の別の測定は、増殖アッセイによって、細胞溶菌アッセイ、例えば、その特異的標的細胞を溶菌するＴ細胞の能力を測定するためのクロム放出アッセイ等によってのいずれかで測定することができる。さらに、本発明において、「免疫原性量」は、抗原の投与後に誘発された抗原特異的抗体の血清中レベルを測定することによって、または、そのようにして誘発された抗体の、本明細書において記述されている通りの特定の白血球のオプソニン食作用能力を強化する能力を測定することによって、定義されてもよい。免疫応答の保護のレベルは、免疫化された宿主に、注射された抗原を接種することによって測定され得る。例えば、免疫応答が所望される抗原が細菌である場合、「免疫原性量」の抗原によって誘発される保護のレベルは、動物への細菌細胞の接種後の生存パーセントまたは死亡パーセントを検出することによって測定することができる。一実施形態において、保護の量は、細菌感染に関連する少なくとも１つの症状、例えば、感染に関連する発熱を測定することによって測定され得る。多抗原もしくは多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中における抗原のそれぞれの量は、他の成分のそれぞれに関して変動することになり、当業者に公知の方法によって決定することができる。そのような方法は、例えば、免疫原性および／またはインビボ効力を測定するための手順を包含すると予想される。
「免疫原性組成物」という用語は、抗原、例えば微生物、またはその成分を含有し、対象において免疫応答を導出するために使用することができる任意の医薬組成物に関する。本発明の免疫原性組成物は、全身経皮または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与することを利用して、ＧＢＳ感染の影響を受けやすいヒトを治療するために使用することができる。これらの投与は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮内（ｉ．ｄ．）もしくは皮下経路を介する注射、パッチもしくは他の経皮送達デバイスによる適用、または経口／消化、呼吸もしくは尿生殖路への粘膜投与を介するものを含有し得る。一実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンの製造において、または動物を受動的に保護するもしくは治療するために使用され得るポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の導出において使用され得る。
一態様において、本発明は、本明細書において記述されている通りの、有効量の少なくとも１つの多糖、オリゴ糖、多糖－タンパク質コンジュゲート、またはそれらの生物学的同等物を包含する免疫原性組成物に関する。例えば、一実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを包含し、莢膜多糖は、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択され、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。別の例において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを包含し、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＶＩならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＶＩならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも２つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。また別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＶＩならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも３つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＶＩならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも４つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ由来の莢膜多糖を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩ由来の莢膜多糖を含む。また別の実施形態において、免疫原性組成物は、多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型ＶＩならびに血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも５つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、６つの多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩ由来の莢膜多糖を含む。
ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の１から１０までの異なる血清型を含む。したがって、ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、一価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。別の実施形態において、免疫原性組成物は、２、３、４、５または６価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。また別の実施形態において、免疫原性組成物は、７価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、８価のＧＢＳコンジュゲート組成物である。
したがって、本発明は、少なくとも５つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、少なくとも６つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、少なくとも７つのＧＢＳ莢膜多糖血清型、少なくとも８つのＧＢＳ莢膜多糖血清型または少なくとも９つのＧＢＳ莢膜多糖血清型等、少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む、一価および／または多価免疫原性組成物に関する。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩを含む。
多糖－タンパク質コンジュゲートは、同じまたは異なるタンパク質担体を含み得る。一実施形態において、コンジュゲートは、同じタンパク質担体を含み、糖は、タンパク質担体の同じ分子（それとコンジュゲートしている２つ以上の異なる多糖を有する担体分子）とコンジュゲートしている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号を参照されたい。別の実施形態において、１つまたは複数の多糖は、タンパク質担体の異なる分子（それとコンジュゲートしている１種類の多糖のみを有するタンパク質担体の各分子）とそれぞれ独立してコンジュゲートしている。そのような実施形態において、莢膜糖は、担体タンパク質と独立してコンジュゲートしていると言われている。
特定の免疫原性組成物に最適な量の成分は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって解明することができる。初回ワクチン接種の後、対象は、１回または数回のブースター免疫化を、適度に間隔をおいて受けることができる。
本発明の免疫原性組成物は、複数の莢膜多糖タンパク質コンジュゲートに加えて、１つまたは複数の保存剤をさらに含んでよい。ＦＤＡは、複数回用量（多回用量）バイアル中の生物学的製品が、わずかな例外を除いて、保存剤を含有することを求めている。本発明は、そのような多回用量バイアルの使用を企図している。保存剤を含有するワクチン製品は、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２－フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））およびフェノール（肺炎、腸チフス（非経口））を含有するワクチンを包含する。注射薬において使用することが承認された保存剤は、例えば、クロロブタノール、ｍクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノールおよび硝酸フェニル水銀を包含する。
別の態様において、本発明は、本明細書において記述されている任意の多糖のうちの少なくとも１つ、および薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、希釈剤もしくは担体、またはそれらの混合物を包含する組成物に関する。
免疫原性組成物は、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩から選択されるがこれらに限定されない１つまたは複数の生理学的に許容できる緩衝剤を含む。好ましい実施形態において、緩衝剤は、ヒスチジンである。
一実施形態において、免疫原性組成物は、緩衝剤を、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約５ｍＭから約４０ｍＭ、約５ｍＭから約３０ｍＭ、約５ｍＭから約２０ｍＭ、約５ｍＭから約１０ｍＭ、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約４０ｍＭ、約１０ｍＭから約３５ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約２５ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、約１０ｍＭから約１５ｍＭ、約１５ｍＭから約５０ｍＭ、約１５ｍＭから約４０ｍＭ、約１５ｍＭから約３５ｍＭ、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、約１５ｍＭから約２５ｍＭ、または約１５ｍＭから約２０ｍＭまでの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、緩衝剤を、約１０ｍＭから約２５ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度で含む。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、ヒスチジンを、約２０ｍＭの濃度で含む。
ある特定の実施形態において、製剤は、約５．０から約７．１、例えば、約５．３から約７．１、約５．５から約７．０、約６．０から約７．０、約６．０から約６．５、約６．３から約７．０、または約６．５から約７．０等のｐＨ範囲内に緩衝されている。別の実施形態において、製剤は、約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０のｐＨに緩衝されている。好ましい実施形態において、製剤は、約６．０から約７．０までのｐＨ範囲、最も好ましくは約６．５に緩衝されている。
免疫原性組成物は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０（ツイーン８０）、ポリソルベート－６０（ツイーン６０）、ポリソルベート－４０（ツイーン４０）、ポリソルベート－２０（ツイーン２０）を包含するがこれらに限定されない１つまたは複数の非イオン性界面活性剤、および、ＢＲＩＪ（登録商標）５８、ＢＲＩＪ（登録商標）３５を包含するがこれらに限定されないポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびにその他、例えば、トリトンＸ－１００、トリトンＸ－１１４、ＮＰ４０、スパン８５およびプルロニック（登録商標）シリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック（登録商標）１２１）等を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、ポリソルベート－８０またはポリソルベート－４０、好ましくはポリソルベート－８０（ＰＳ８０）を含む。
一実施形態において、免疫原性組成物は、界面活性剤を、約０．００１％から約２％（ｖ／ｗ）、約０．００１％から約１％、約０．００１％から約０．５％、約０．００１％から約０．１％、約０．００１％から約０．０５％、約０．００１％から約０．０１％、約０．００１％から０．００５％、約０．００５％から約２％、約０．００５％から約１％、約０．００５％から約０．５％、約０．００５％から約０．１％、約０．００５％から約０．０５％、約０．００５％から約０．０１％、約０．０１％から約２％、約０．０１％から約１％、約０．０１％から約０．５％、約０．０１％から約０．１％、約０．０１％から約０．０５％、約０．０１％から約０．０４％、約０．０１％から約０．０３％、約０．０１５％から約２％、約０．０１５％から約１％、約０．０１５％から約０．５％、約０．０１５％から約０．１％、約０．０１５％から約０．０５％、約０．０１５％から約０．０４％、約０．０１５％から約０．０３％、約０．０２％から約２％、約０．０２％から約１％、約０．０２％から約０．５％、約０．０２％から約０．１％、約０．０２％から約０．０５％、約０．０２％から約０．０４％、約０．０２％から約０．０３％、約０．０５％から約２％、約０．０５％から約１％、約０．０５％から約０．５％、約０．０５％から約０．１％、約０．１％から約２％、約０．１％から約１％、約０．１％から約０．５％または約０．１％から０．２５％までの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、界面活性剤を、約０．０１％から０．０３％、最も好ましくは約０．０２％の濃度で含む。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、約０．００１％から約２％まで（最大約０．２５％が好ましい）の濃度のポリソルベート－８０（ＰＳ８０）または約０．００１％から１％まで（最大約０．５％が好ましい）の濃度のポリソルベート－４０を含む。
ある実施形態において、免疫原性組成物は、ＰＳ８０を、約０．０２％の濃度で含む。
薬学的に許容できる担体は、本発明の炭水化物をタンパク質に結合する際に使用され、その炭水化物に対する免疫応答を修飾する「担体タンパク質」と混同されるべきではない。本明細書において記述されているタンパク質担体との混同を回避するために、薬学的に許容できる希釈剤という用語を、薬学的に許容できる担体よりも好ましいとするが、これらの用語は、時折、交換可能に使用され得る。「薬学的に許容できる担体」という用語は、連邦規制機関、州政府もしくは他の規制機関によって承認されている、または、米国薬局方もしくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する動物において使用するための他の一般に認められている薬局方に収載された担体を意味する。「担体」という用語は、医薬組成物がともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。好適な薬学的に許容できる希釈剤は、ありとあらゆる従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を包含する。そのような薬学的に許容できる希釈剤は、滅菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを包含する油等であってよい。水、注射用水（ＷＦＩ）、滅菌等張生理食塩水、リン酸緩衝溶液、アジュバント懸濁液、水性デキストロースおよびグリセロール溶液、ならびにそれらの組合せを、特に注射用溶液用の液体担体として用いることができる。薬学的に許容できる希釈剤は、体内における貯蔵寿命または有効性を強化する、少量の補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤等をさらに含んでよい。薬学的に許容できる希釈剤の調製および使用は、当技術分野において周知である。好適な医薬担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著において記述されている。一実施形態において、希釈剤は、水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水である。特定の実施形態において、希釈剤は、本明細書において記述されている任意のアジュバントの懸濁液である。好ましい実施形態において、希釈剤は、リン酸アルミニウム懸濁液等のアルミニウムベースのアジュバント懸濁液である。
好適な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を包含する。好ましい実施形態において、賦形剤は、ＮａＣｌである。
一実施形態において、免疫原性組成物は、賦形剤を、約１０ｍＭから約５００ｍＭ、約１０ｍＭから約４５０ｍＭ、約１０ｍＭから約４００ｍＭ、約１０ｍＭから約３５０ｍＭ、約１０ｍＭから約３００ｍＭ、約１０ｍＭから約２５０ｍＭ、約１０ｍＭから約２００ｍＭ、約１０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約３０ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、２０ｍＭから約５００ｍＭ、約２０ｍＭから約４５０ｍＭ、約２０ｍＭから約４００ｍＭ、約２０ｍＭから約３５０ｍＭ、約２０ｍＭから約３００ｍＭ、約２０ｍＭから約２５０ｍＭ、約２０ｍＭから約２００ｍＭ、約２０ｍＭから約１５０ｍＭ、約２０ｍＭから約１００ｍＭ、約２０ｍＭから約５０ｍＭ、約２０ｍＭから約３０ｍＭ、５０ｍＭから約５００ｍＭ、約５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約５０ｍＭから約４００ｍＭ、約５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約５０ｍＭから約３００ｍＭ、約５０ｍＭから約２５０ｍＭ、約５０ｍＭから約２００ｍＭ、約５０ｍＭから約１５０ｍＭ、約５０ｍＭから約１００ｍＭ、約１００ｍＭから約５００ｍＭ、約１００ｍＭから約４５０ｍＭ、約１００ｍＭから約４００ｍＭ、約１００ｍＭから約３５０ｍＭ、約１００ｍＭから約３００ｍＭ、約１００ｍＭから約２５０ｍＭ、約１００ｍＭから約２００ｍＭ、約１００ｍＭから約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約５００ｍＭ、約１５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約４００ｍＭ、約１５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約３００ｍＭ、約１５０ｍＭから約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約２００ｍＭ、約２００ｍＭから約５００ｍＭ、約２００ｍＭから約４５０ｍＭ、約２００ｍＭから約４００ｍＭ、約２００ｍＭから約３５０ｍＭ、約２００ｍＭから約３００ｍＭ、約２００ｍＭから約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭから約５００ｍＭ、約２５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約２５０ｍＭから約４００ｍＭ、約２５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約２５０ｍＭから約３００ｍＭ、約３００ｍＭから約５００ｍＭ、約３００ｍＭから約４５０ｍＭ、約３００ｍＭから約４００ｍＭ、約３００ｍＭから約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭから約５００ｍＭ、約３５０ｍＭから約４５０ｍＭ、約３５０ｍＭから約４００ｍＭ、約４００ｍＭから約５００ｍＭ、約４００ｍＭから約４５０ｍＭまたは約４５０ｍＭから約５００ｍＭまでの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、賦形剤を、約１０ｍＭから約２５０ｍＭまで、最も好ましくは約１５０ｍＭの濃度で含む。
別の実施形態において、賦形剤は、約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
組成物は、所望ならば、少量の湿潤、増量、乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、凍結乾燥粉末またはケーキ等の形態をとることができる。製剤は、投与モードに適合すべきである。任意の従来の媒体または作用物質が有効成分と不適合である場合を除いて、本発明の免疫原性組成物におけるそれらの使用が企図されている。
ある実施形態において、免疫原性組成物は、場合により少なくとも１つの賦形剤の存在下で、凍結乾燥される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、スクロース、マンニトールおよびグリシンからなる群から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、スクロースである。別の実施形態において、凍結乾燥した組成物は、追加の賦形剤を含む。１つのそのような実施形態において、追加の賦形剤は、マンニトールまたはグリシンである。
別の実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、約１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０．０％等の少なくとも１つの糖を含む。好ましい実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約５．５％（ｗ／ｖ）超、例えば、約７．０％（ｗ／ｖ）超等の少なくとも１つの賦形剤を含む。さらなる実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、約１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０．０％等の追加の賦形剤を含む。好ましい実施形態において、凍結乾燥した組成物は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の少なくとも１つの賦形剤および約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の追加の賦形剤を含む。
また別の実施形態において、凍結乾燥した組成物は、水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水で再溶解される。好ましい実施形態において、希釈剤は、リン酸アルミニウム懸濁液等のアルミニウムベースのアジュバント懸濁液である。
一実施形態において、組成物は、本明細書において記述されている単離された多糖および担体分子を包含する。好適な担体分子は、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴またはリポソーム等）および不活性ウイルス粒子を包含し得る。粒子状担体の例は、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもの、ならびに、ポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）に由来する微粒子を包含する。
本発明の免疫原性組成物は、免疫系を混乱させるまたは改変する作用物質である、１つまたは複数の追加の「免疫調節剤」をさらに含むことができ、そのため、体液性および／または細胞媒介性免疫の上方調節または下方調節のいずれかが観察される。１つの特定の実施形態において、免疫系の体液性および／または細胞媒介性アームの上方調節が好ましい。ある特定の免疫調節剤の例は、例えば、中でも、米国特許第５，２５４，３３９号において記述されている、アジュバントもしくはサイトカイン、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を包含する。「アジュバント」という用語は、本明細書においてさらに記述されている通り、抗原に対する免疫応答を強化する化合物または混合物を指す。
本発明の組成物において使用することができるアジュバントの非限定的な例は、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウムゲル等；油中水型エマルション、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント等；ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）；ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）；ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａまたは他のサポニン画分；モノホスホリル脂質Ａ；およびアブリジン脂質－アミンアジュバントを包含する。本発明のワクチンにおいてアジュバントとして有用な水中油型エマルションの非限定的な例は、ＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）等のマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．５％スパン８５（種々の量のＭＴＰ－ＰＥを含有していてもよい）を含有する）、およびＳＡＦ（サブミクロンエマルションに微小流動化したか、より大きい粒径のエマルションを産生するためにボルテックスしたかいずれかの、１０％スクアレン、０．４％ポリソルベート８０、５％プルロニック（登録商標）ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有する）；修飾されたＳＥＡＭ６２（５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性物質（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０界面活性物質（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロールおよび０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する）；ならびに修飾されたＳＥＡＭ １／２（５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性物質、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０界面活性物質、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａおよび５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含有する）を包含する。
免疫応答を強化するために使用される好適なアジュバントは、限定されないが、米国特許第４，９１２，０９４号において記述されている、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）をさらに包含する。アジュバントとして使用するために、Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号において記述されている、合成脂質Ａ類似体もしくはアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくは類似体も好適である。１つのそのようなＡＧＰは、２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル（ｔｅｔｒａ－ｄｅｃａｎｏｙｏｘｙ－ｔｅｔｒａｄｅ－ｃａｎｏｙｌ）］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル－アミノ］－ｂ－Ｄ－グルコピラノシドであり、これは、５２９としても公知である（以前はＲＣ５２９として公知であった）。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）としてまたは安定なエマルション（ＳＥ）として製剤化される。
また他のアジュバントは、シクロデキストリン誘導体（米国特許第６，１６５，９９５号）；ポリアニオン性ポリマー（米国特許第６，６１０，３１０号）；ムラミルペプチド、例えば、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）およびＮ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）等；Ａｍｐｈｉｇｅｎ；アブリジン；Ｌ１２１／スクアレン；Ｄ－ラクチド－ポリラクチド／グリコシド；プルロニック（登録商標）ポリオール；死滅ボルデテラ属；サポニン、例えば、米国特許第５，０５７，５４０号において記述されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ．）等；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；細菌リポ多糖；合成ポリヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号）等；欧州特許第１，２９６，７１３号および同第１，３２６，６３４号において記述されているＩＣ－３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）；百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（例えば、米国特許第７，２８５，２８１号、同第７，３３２，１７４号、同第７，３６１，３５５号および同第７，３８４，６４０号）；または、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特にＬＴ－Ｋ６３、ＬＴ－Ｒ７２（例えば、米国特許第６，１４９，９１９号、同第７，１１５，７３０号および同第７，２９１，５８８号）を包含する。
ワクチンに包含され得る他の「免疫調節剤」は、例えば、インターロイキン１－α、１－β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその突然変異体型）；インターフェロン－α、βおよびγ；顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００を参照）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；または腫瘍壊死因子αおよびβのうちの１つまたは複数を包含する。本明細書において記述されている免疫原性組成物で有用なまた他のアジュバントは、限定されないが、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βおよびＲＡＮＴＥＳを包含するケモカイン；接着分子、例えば、セレクチン、例えば、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチンおよびＥ－セレクチン等；ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１およびＭａｄＣＡＭ－１；インテグリンファミリーのメンバー、例えば、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１およびｐ１５０．９５等；免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭｓ、例えば、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２およびＩＣＡＭ－３、ＣＤ２ならびにＬＦＡ－３等；共刺激分子、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ等；血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ－１および血管内皮成長因子を包含する成長因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を包含する受容体分子；ならびにカスパーゼ（ＩＣＥ）を包含する。
免疫調節剤および／もしくはアジュバントを使用するか否かの決断、またはいずれの免疫調節剤および／もしくはアジュバントを使用するかの選択は、ワクチンまたは免疫原性組成物が投与される対象、注射経路、および与えられる予定の注射の数によって決まると予想されることを理解されたい。例えば、対象が病原体に自然に曝露されてきた場合、ワクチン抗原が記憶応答を有効に誘発することができるため、アジュバントは必要とされない場合がある。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントを包含することになる。一実施形態において、免疫原性組成物は、レンサ球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、アルミニウムベースのアジュバントを含む。１つのそのような実施形態において、アルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムヒドロキシルホスフェートである。特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。本発明の別の実施形態において、免疫原性組成物は、ＱＳ－２１をアジュバントとして含む。
一実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントを、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．７ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．３ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．８５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．６５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．７ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．６５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから約０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、および０．７５ｍｇ／ｍｌから約０．８５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントを、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌまで、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。
別の実施形態において、アジュバントは、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のアルミニウムベースのものである。１つのそのような実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムヒドロキシルホスフェートである。
一実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書において記述されている通りの多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている。
１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されており、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
一実施形態において、免疫原性組成物は、ＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されており、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含み、ここで、莢膜多糖は、約６０％超のシアル酸レベルを有する。
１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも１つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７のｐＨに緩衝されている。
１つのそのような実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、組成物は、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されており、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌずつの少なくとも２つのＧＢＳ多糖－タンパク質コンジュゲート、約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含み、コンジュゲートは、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む。
免疫原性組成物の評価
種々のインビトロ試験を使用して、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を評定する。例えば、インビトロオプソニンアッセイは、レンサ球菌細胞、問題の抗原に対する特異的抗体を含有する熱不活性化血清、および外因性補体源の混合物を一緒にインキュベートすることによって行われる。オプソニン食作用は、新たに単離された多形核細胞（ＰＭＮ）またはＨＬ６０等の分化したエフェクター細胞および抗体／補体／レンサ球菌細胞混合物のインキュベーション中に進行する。抗体および補体でコーティングされた細菌細胞は、オプソニン食作用時に死滅する。オプソニン食作用から回収される生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物を平板培養することによって決定される。力価は、アッセイ対照との比較によって決定された際に、５０％細菌死滅を与える最高希釈の逆数として報告される。
種々のインビトロ試験を使用して、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を評定する。例えば、インビトロオプソニンアッセイは、レンサ球菌細胞、問題の抗原に対する特異的抗体を含有する熱不活性化血清、および外因性補体源の混合物を一緒にインキュベートすることによって行われる。オプソニン食作用は、新たに単離された多形核細胞（ＰＭＮ）またはＨＬ６０等の分化したエフェクター細胞および抗体／補体／レンサ球菌細胞混合物のインキュベーション中に進行する。抗体および補体でコーティングされた細菌細胞は、オプソニン食作用時に死滅する。オプソニン食作用から回収される生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物を平板培養することによって決定される。力価は、アッセイ対照との比較によって決定された際に、５０％細菌死滅を与える最高希釈の逆数として報告される。
全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗原のインビトロ免疫原性および表面露出を評定してもよく、目的の細菌株（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））を、９６ウェルプレート等のプレート上にコーティングし、免疫化された動物由来の試験血清を、細菌細胞と反応させる。試験抗原に特異的な抗体が抗原の表面露出エピトープと反応性であれば、当業者に公知の標準的な方法によって検出することができる。代替として、フローサイトメトリーを使用して、莢膜多糖抗原の表面露出およびモノクローナル抗体を包含する抗体の特異性を測定してもよい。
次いで、所望のインビトロ活性を実証している抗原を、インビボ動物接種モデルにおいて試験してもよい。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、当業者に公知である免疫化の方法および経路（例えば、鼻腔内、非経口、経口、経直腸、膣内、経皮、腹腔内、静脈内、皮下等）により、動物（例えば、マウス）の免疫化において使用される。ＧＢＳ免疫原性組成物による動物の免疫化の後、動物に、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株を接種し、レンサ球菌感染に対する抵抗についてアッセイする。
一実施形態において、病原体フリーのマウスを免疫化し、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を接種する。例えば、マウスを、免疫原性組成物中の１または複数回用量の所望の抗原で免疫化する。その後、マウスにＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を接種し、接種後、経時的に生存をモニターする。
使用方法
「免疫不全である」は、本明細書において使用される場合、免疫系の細胞性および／または体液性アームに関して欠損を患っている対象を指す。したがって、免疫プロセスにおけるわずかな機能障害から完全な免疫抑制まで変動する、免疫機能における欠損の程度が企図されている。
「免疫不全である」は、本明細書において使用される場合、免疫系の細胞性および／または体液性アームに関して欠損を患っている対象を指す。したがって、免疫プロセスにおけるわずかな機能障害から完全な免疫抑制まで変動する、免疫機能における欠損の程度が企図されている。
「対象」という用語は、哺乳動物、鳥、魚、爬虫類、または任意の他の動物を指す。「対象」という用語は、ヒトも包含する。「対象」という用語は、家庭用ペットも包含する。家庭用ペットの非限定的な例は、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメおよびカエルを包含する。「対象」という用語は、家畜動物も包含する。家畜動物の非限定的な例は、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウおよびシチメンチョウを包含する。
本明細書において使用される場合、「治療」（その変化形、例えば、「治療する」または「治療される」を包含する）は、下記のうちのいずれか１つまたは複数を指す：（ｉ）伝統的なワクチンのような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の重症度低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的なまたは完全な排除。それ故、治療は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）達成され得る。本発明において、予防的または治療的治療を使用することができる。本発明の特定の実施形態によれば、微生物感染（例えば、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）等の細菌）に対して宿主動物を、予防的にかつ／または治療的に免疫化することを包含し、治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は、予防的および／または治療的免疫を対象に付与するために有用である。本発明の方法は、生物医学研究用途のために対象において実施することもできる。
別の態様において、本発明は、対象に、有効量の本明細書において記述されている免疫原性組成物を投与することにより、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法に関する。一実施形態において、本発明は、対象に、有効量の本明細書において記述されている免疫原性組成物を投与することにより、対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法に関する。ある態様において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物に関する。ある態様において、本発明は、対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物に関する。特定の実施形態において、対象は、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である。１つのそのような実施形態において、妊娠中の女性は、少なくとも妊娠２０週または少なくとも２７週等、妊娠第三期または後半期である。好ましい実施形態において、妊娠中の女性は、妊娠２７週から３６週である。別の実施形態において、対象は、５０歳以上、６５歳以上、および８５歳以上の成人等の老齢者である。さらなる実施形態において、対象は、免疫不全である。一態様において、対象は、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有し得る。好ましい実施形態において、Ｂ群レンサ球菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である。
免疫原性組成物の免疫原性または有効量は、対象を漸増量の免疫原性組成物で免疫化し、免疫応答を分析して最適投薬量を決定する、用量応答研究を行うことにより、決定することができる。研究の出発点は、動物モデルにおける免疫化データから推測することができる。投薬量は、個体の具体的な条件に応じて変動し得る。量は、当業者に公知の手段により、日常的検査で決定することができる。
適切な用量数の、免疫学的有効量の免疫原性組成物を対象に投与して、免疫応答を導出する。投薬量は、年齢および体重等、個体の具体的な条件に応じて変動し得る。この量は、当業者に公知の手段により、日常的検査で決定することができる。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物が投与された患者は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）保菌率の低減を示す。免疫原性組成物の投与後の、そのような保菌の低減または非保菌者として過ごした時間間隔の延長は、医療ニーズの視点から有意である。例えば、保菌者におけるＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）保菌全体の低減は、本発明の免疫原性組成物の１回用量後に評定され得る。例えば、免疫原性組成物の投与１日前に、１８～５０歳の成人の群を、鼻、喉、腋窩、直腸、会陰および膣スワブによって保菌についてスクリーニングし、続いて、培養して、保菌状態を決定することができる。次に、その群に本発明の免疫原性組成物を投与し、ある群には対照を受けさせることができる。免疫原性組成物の投与後、鼻、喉、腋窩、直腸、会陰および膣スワブを１２週間にわたって毎週および最大６カ月間毎月実行し、プラシーボと比較する。１つのプライマリーエンドポイントは、免疫原性組成物の投与後の患者における保菌率を、免疫化後３カ月の間隔でプラシーボと比較することである。
抗体
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等と特異的結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、文脈上別段の指示がない限り、該用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、操作された抗体（例えば、エフェクター機能、安定性および他の生物学的活性を改変するために、キメラ、ヒト化および／または誘導体化されたもの）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ＳｃＦｖ）ならびにサメおよびラクダ抗体を包含するドメイン抗体）、および抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体）および本明細書において記述されている通りの抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置を網羅することも意図されている。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ等（またはそれらのサブクラス）の抗体を包含し、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられてよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等と特異的結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、文脈上別段の指示がない限り、該用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、操作された抗体（例えば、エフェクター機能、安定性および他の生物学的活性を改変するために、キメラ、ヒト化および／または誘導体化されたもの）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ＳｃＦｖ）ならびにサメおよびラクダ抗体を包含するドメイン抗体）、および抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体）および本明細書において記述されている通りの抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置を網羅することも意図されている。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ等（またはそれらのサブクラス）の抗体を包含し、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられてよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部分のみを含み、該部分は、好ましくは、無傷の抗体中に存在する場合、その部分に通例関連する機能のうちの少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべてを保持している。
抗体の「機能的活性」または「機能的抗体」は、本明細書において使用される場合、最低でも抗原と特異的に結合することができる抗体を指す。追加の機能は当技術分野において公知であり、オプソニン化、ＡＤＣＣまたは補体媒介性細胞毒性を介するもの等、病原体のクリアランスまたは死滅を達成する免疫系の追加の成分を包含し得る。抗原結合後、その後のあらゆる抗体機能は、抗体のＦｃ領域を介して媒介され得る。抗体オプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）は、エフェクター細胞（白血球）による細菌のインビトロＩｇ補体補助死滅を測定するように設計されたインビトロアッセイであり、故に、生物学的プロセスを模倣している。抗体結合は、それが結合している抗原の生物学的機能を直接的に阻害する場合もある。一部の実施形態において、「機能的抗体」は、動物効力モデルにおける細菌の死滅または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン食作用死滅アッセイによって測定した場合に機能的である抗体を指す。
一態様において、本発明は、本明細書において記述されている多糖と特異的に結合する単離された抗体またはその断片に関する。「単離された」抗体は、本明細書において使用される場合、その自然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体を指す。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用に干渉し、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を包含し得る材料である。例示的な実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって決定された際に、９５重量％の抗体、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ－末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を取得するのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均質まで、精製されることになる。単離された抗体は、抗体の自然環境のうちの少なくとも１つの成分が存在しないと予想されることから、組換え細胞内にインサイチュで抗体を包含する。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
特定の多糖また特定の多糖上のエピトープ「と特異的に結合している」または「に特異的な」抗体は、いかなる他の多糖または多糖エピトープとも特異的に結合することなく、特定の多糖または特定の多糖上のエピトープと結合しているものである。
「標識」という語は、本明細書において使用される場合、「標識」抗体を産生するように抗体と直接的にまたは間接的にコンジュゲートしている、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であってもよいし（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学的改変を触媒していてもよい。
本発明は、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原と特異的にかつ選択的に結合している抗体および抗体組成物をさらに提供する。一部の実施形態において、抗体は、本発明の免疫原性組成物の対象への投与時に産生される。一部の実施形態において、本発明は、本発明の免疫原性組成物の抗原のうちの１つまたは複数に向けられた精製または単離された抗体を提供する。一部の実施形態において、本発明の抗体は、いずれかの動物効力モデルにおいて細菌を死滅させることによってまたはオプソニン食作用死滅アッセイを介して測定した場合、機能的である。一部の実施形態において、本発明の抗体は、対象に受動免疫を付与する。本発明はさらに、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、ならびに、当業者に周知の技術を使用して本発明の抗体または抗体組成物を生成する細胞または細胞株（ハイブリドーマ細胞または抗体の組換え生成のための他の操作された細胞株等）およびトランスジェニック動物を提供する。
本発明の抗体または抗体組成物は、対象においてＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）に関連するレンサ球菌感染、疾患または状態を治療するまたは予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を産生するステップと、前記抗体または抗体組成物を使用して、対象に受動免疫を付与するステップとを含む方法において使用され得る。本発明の抗体は、診断方法、例えば、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原の存在を検出することまたはそのレベルを定量化することにも有用となり得る。
本発明の多糖等の繰り返し構造に対する抗体応答は、いくつかの独自の特色を呈し得る。例えば、繰り返し単位の規則性は、非常に様々な分子量の抗原分子が、多糖に対して特異的な抗体と結合できることを意味し得る。より長い多糖の第二の繰り返し構造は、Ｔ細胞非依存性抗体応答を誘発することができる。したがって、Ｔ細胞ヘルパーエピトープを有するタンパク質担体とコンジュゲートしている多糖を使用する場合、Ｔ細胞非依存性およびＴ細胞依存性抗体応答の両方を刺激することができる。したがって、免疫応答は、多糖サイズの適切な選択によって、担体タンパク質が使用されるか否かにかかわらず、修飾することができる。
ポリクローナル抗体
ある特定の実施形態において、抗多糖抗体は、ポリクローナル抗体である。本明細書において定義されている通りのポリクローナル抗体は、血清の調製物に由来し、かつ異なるＢ細胞クローンを起源とする異なる特異性を有する抗体の混合物を指す。ポリクローナル抗体の調製および特徴付けは、当技術分野において公知である。
ある特定の実施形態において、抗多糖抗体は、ポリクローナル抗体である。本明細書において定義されている通りのポリクローナル抗体は、血清の調製物に由来し、かつ異なるＢ細胞クローンを起源とする異なる特異性を有する抗体の混合物を指す。ポリクローナル抗体の調製および特徴付けは、当技術分野において公知である。
ポリクローナル抗体は、免疫原または本明細書において記述されている免疫原性組成物の１または複数回の注射、ならびに、所望ならば、アジュバント、緩衝剤および／または希釈剤を投与することによって、対象において、例えば哺乳動物において育てられる。ある範囲の動物種が、特異的抗血清の生成に有用となり得る。典型的には、抗糖ポリクローナル抗血清の生成に使用される動物は、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。典型的には、免疫原または免疫原性組成物は、アジュバントを加えてまたは加えずに、複数回の注射によって哺乳動物に注射される。免疫原性材料は、多糖、オリゴ糖、多糖、本明細書において記述されている多糖－タンパク質コンジュゲート、または免疫原のより大きい集合体を包含し得る。典型的には、初回免疫化後初めの２～６週間、免疫化された動物から血液を収集し、凝固させ、血清を採取する。血清は、免疫化された動物由来の抗糖ポリクローナル抗体を含有し、多くの場合、抗血清と称される。
モノクローナル抗体
抗糖モノクローナル抗体は、公知のハイブリドーマ技術の使用を介して調製され得る。典型的には、モノクローナル抗体を調製することは、多糖、オリゴ糖、多糖または本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートを含む選択された免疫原で、好適な標的動物宿主を最初に免疫化することを伴う。所望ならば、アジュバント、緩衝剤および／または希釈剤が包含されてもよい。免疫化は、多糖またはそのコンジュゲートと特異的に結合している抗体を生成するまたは発現するようにＢリンパ球を導くために十分な様式で行われる。代替として、リンパ球はインビトロで免疫化される。
抗糖モノクローナル抗体は、公知のハイブリドーマ技術の使用を介して調製され得る。典型的には、モノクローナル抗体を調製することは、多糖、オリゴ糖、多糖または本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートを含む選択された免疫原で、好適な標的動物宿主を最初に免疫化することを伴う。所望ならば、アジュバント、緩衝剤および／または希釈剤が包含されてもよい。免疫化は、多糖またはそのコンジュゲートと特異的に結合している抗体を生成するまたは発現するようにＢリンパ球を導くために十分な様式で行われる。代替として、リンパ球はインビトロで免疫化される。
次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。リンパ球の起源は、モノクローナル抗体がヒトまたは動物起源のいずれであるかを決定する。概して、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）は、ヒト起源の抗体および細胞が所望される場合に使用され、脾臓細胞またはリンパ節細胞は、非ヒト哺乳動物起源が所望される場合に使用される。
不死化細胞株は、典型的には、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地中で培養される。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を包含することになり、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
不死化細胞株は、起源、融合および成長特徴の種等の実施上の配慮点で選択される。例えば、好適な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞によって抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性であるものである。不死化細胞株の例は、ネズミ骨髄腫株を包含する。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の生成について記述されている。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって培養培地中に分泌される。次いで、培養培地を、多糖を認識し結合するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって生成される特定のモノクローナル抗体の抗多糖結合特異性は、当業者に周知である多数の手順のうちの１つによって決定される。例えば、抗体結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴（例えば、ビアコア）によって決定され得る。モノクローナル抗体によって認識された正確なエピトープは、エピトープマッピングによって決定される。そのような技術およびアッセイは、当技術分野において周知である。
所望の特異性を持つハイブリドーマ細胞生成抗体が同定された後、クローンを限界希釈によってサブクローン化し、標準的な方法を使用して培養する。この目的に好適な培養培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ－１６４０培地を包含する。代替として、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水のようにインビボで成長する。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィー等によって、培養培地または腹水液から単離し、精製する。
代替として、所望の特異性を有する、所望の種の起源由来の抗体は、ファージディスプレイライブラリーの使用を介して取得することができる。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを産生しスクリーニングする際に使用するのに特に適している方法および試薬の例は、当技術分野において見ることができる。
抗体の使用
一態様において、本発明は、ＧＢＳ抗体および／または抗体断片を生成するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物の使用に関する。本明細書において記述されている多糖－タンパク質コンジュゲートおよび／またはそれから産生された抗体は、ＥＬＩＳＡおよびマイクロアレイ関連技術を包含する当業者に公知の様々な免疫診断技術において使用され得る。加えて、これらの試薬は、例えば、免疫原性多糖コンジュゲートに対する血清抗体レベルを含む抗体応答を評価するために使用され得る。本発明のアッセイ方法論は、蛍光、化学発光、放射性、酵素標識もしくは染料分子等の標識、ならびに／または生物学的試料中の抗原もしくは抗体および固体支持体と結合している対応する抗体もしくは抗原の間の複合体の直接的または間接的検出のための二次免疫学的試薬の使用を伴い得る。
一態様において、本発明は、ＧＢＳ抗体および／または抗体断片を生成するための、本明細書において記述されている免疫原性組成物の使用に関する。本明細書において記述されている多糖－タンパク質コンジュゲートおよび／またはそれから産生された抗体は、ＥＬＩＳＡおよびマイクロアレイ関連技術を包含する当業者に公知の様々な免疫診断技術において使用され得る。加えて、これらの試薬は、例えば、免疫原性多糖コンジュゲートに対する血清抗体レベルを含む抗体応答を評価するために使用され得る。本発明のアッセイ方法論は、蛍光、化学発光、放射性、酵素標識もしくは染料分子等の標識、ならびに／または生物学的試料中の抗原もしくは抗体および固体支持体と結合している対応する抗体もしくは抗原の間の複合体の直接的または間接的検出のための二次免疫学的試薬の使用を伴い得る。
生成された抗体または抗体断片は、受動免疫療法において、またはレンサ球菌感染に対する予防のためにも有用であり得る。
多糖を生成する方法
また別の態様において、本発明は、本明細書において記述されている多糖を生成するための方法に関する。方法は、ＧＢＳを培養するステップと、細菌によって生成された多糖を収集するステップとを包含する。一実施形態において、ＧＢＳは、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を包含する。細菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の任意の株であってもよい。好ましい実施形態において、細菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の被包性株である。本発明において使用するためのＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株は、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４、ＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７、ＰＦＥＧＢＳＴ０２６７、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１、ＰＦＥＧＢＳＴ０７０８、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）、ＰＦＥＧＢＳＴ０５６３、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６、ＰＦＥＧＢＳＴ０９６１、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１、ＰＦＥＧＢＳＴ０８３７、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４、ＣＺ－ＰＷ－１１９、７２７１、ＣＺ－ＰＷ－０４５、ＪＭ９１３００１３、ＪＭ９１３０６７２、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２、およびＩＴ－ＰＷ－６４を包含する。
また別の態様において、本発明は、本明細書において記述されている多糖を生成するための方法に関する。方法は、ＧＢＳを培養するステップと、細菌によって生成された多糖を収集するステップとを包含する。一実施形態において、ＧＢＳは、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を包含する。細菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の任意の株であってもよい。好ましい実施形態において、細菌は、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の被包性株である。本発明において使用するためのＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株は、０９０、Ａ９０９（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１３８）、５１５（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７７）、Ｂ５２３、ＣＪＢ５２４、ＭＢ４０５２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７４）、Ｈ３６Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号１２４０１）、Ｓ４０、Ｓ４２、ＭＢ４０５３（ＡＴＣＣ受託番号３１５７５）、Ｍ７０９、１３３、７３５７、ＰＦＥＧＢＳＴ０２６７、ＭＢ４０５５（ＡＴＣＣ受託番号３１５７６）、１８ＲＳ２１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７５）、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｖ８（ＡＴＣＣ受託番号１２９７３）、ＤＫ２１、ＤＫ２３、ＵＡＢ、５４０１、ＰＦＥＧＢＳＴ０７０８、ＭＢ４０８２（ＡＴＣＣ受託番号３１５７７）、Ｍ１３２、１１０、Ｍ７８１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２２）、Ｄ１３６Ｃ（３）（ＡＴＣＣ受託番号１２４０３）、Ｍ７８２、Ｓ２３、１２０、ＭＢ４３１６（Ｍ－７３２；ＡＴＣＣ受託番号３１４７５）、Ｍ１３２、Ｋ７９、ＣＯＨ１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－１１７６）、ＰＦＥＧＢＳＴ０５６３、３１３９（ＡＴＣＣ受託番号４９４４６）、ＣＺ－ＮＩ－０１６、ＰＦＥＧＢＳＴ０９６１、１１６９－ＮＴ１、ＣＪＢ１１１（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－２３）、ＣＪＢ１１２、２６０３Ｖ／Ｒ（ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ－６１１）、ＮＣＴＣ１０／８１、ＣＪ１１、ＰＦＥＧＢＳＴ０８３７、１１８７５４、１１４８５２、１１４８６２、１１４８６６、１１８７７５、Ｂ４５８９、Ｂ４６４５、ＳＳ１２１４、ＣＺ－ＰＷ－１１９、７２７１、ＣＺ－ＰＷ－０４５、ＪＭ９１３００１３、ＪＭ９１３０６７２、ＩＴ－ＮＩ－０１６、ＩＴ－ＰＷ－６２、およびＩＴ－ＰＷ－６４を包含する。
本明細書において記述されている多糖は、ＧＢＳを適切な培地中で培養することによって生成され得る。適切な培地は、コロンビアブロスを包含し得る。培地は、デキストロース、ヘミンおよび／またはグルコースを包含し得る。ある実施形態において、培地は、コロンビアブロスおよびデキストロースを包含する。Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）がコロンビアブロスおよびデキストロースを使用して培養される場合、好ましくは、培養のための温度は、２０から４０℃、好ましくは３７℃である。好ましい実施形態において、細菌は、好気条件下で培養される。別の好ましい実施形態において、細菌は、１２から６０時間にわたって培養される。
多糖は、培養物から標的物質を収集するための当業者において公知の方法、例えば、加熱、酵素処理、遠心分離、沈殿、活性炭による処理、および／または濾過等を使用することにより、取得された培養物から収集され得る（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、同第２００６／０２２８３８１号、同第２００７／０１８４０７１号、同第２００７／０１８４０７２号、同第２００７／０２３１３４０号および同第２００８／０１０２４９８号；国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１１８７５２号を参照）。一実施形態において、細菌および多糖を含有する培養物を遠心分離し、酵素、例えば、リゾチーム、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ムタノリシン、およびそれらの混合物等で処理する。例えば、一実施形態において、取得された上清に適切な有機溶媒を添加して、タンパク質を沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって除去する。次いで、上清に適切な有機溶媒をさらに添加することによって多糖を沈殿させてよく、遠心分離によって多糖を収集してよい。より具体的には、本明細書において記述されている多糖は、エタノールを、約２５体積％の最終濃度で、細菌が除去された上清に添加し、タンパク質を含有する沈殿を遠心分離によって除去し、それにエタノールを約７５体積％の最終濃度までさらに添加し、次いで、遠心分離によって沈殿物を収集することによって取得され得る。得られた沈殿物を、窒素で乾燥させてよい。得られた沈殿物を、トリスおよび０．０５％アジ化Ｎａに再懸濁してよい。
本発明のさらなる態様は、Ｎ－およびＯ－アセチル基を保存しながら、ほぼ無傷の高分子量ＣＰの単離のために誘導体化ヒドロキシルアミン化合物等の有機試薬を使用する新規方法を提供する。この方法は、細胞を溶菌しないため、遠心分離によって単離されたＣＰは、細胞内成分による汚染が最小限であり、より高い全収率につながり得る。その上、これらの試薬は、その複数のホスホジエステル結合により、Ｂ群抗原不純物を非常に小さい断片に開裂し、これは、血液透析濾過によって簡単に除去することができる。
一実施形態において、ＣＰは、ヒドロキシルアミンを、莢膜多糖生産菌を含む細胞ペーストと反応させることによって単離される。ある実施形態において、方法は、遠心分離するステップをさらに含む。別の実施形態において、方法は、濾過するステップをさらに含む。
本発明のある態様において、ヒドロキシルアミンは、実施例２の表２に収載されたものであってもよい。好ましい実施形態において、ヒドロキシルアミンは、ジベンジルヒドロキシルアミン、ジエチルヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミン、エチレンジアミン、トリエチレンテトラミン、１，１，４，７，１０，１０ヘキサメチルトリエチレンテトラミンおよび２，６，１０，トリメチル２，６，１０トリアザウンデカンからなる群から選択される。
本発明の一態様において、ヒドロキシルアミンの濃度は、約５ｍＭから約２００ｍＭ、例えば、約５ｍＭから約１５０ｍＭ、約５ｍＭから約１００ｍＭ、約５ｍＭから約７５ｍＭ、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約５ｍＭから約２５ｍＭ、約５ｍＭから約１０ｍＭ、１０ｍＭから約２００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭから約１５０ｍＭ、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約７５ｍＭ、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約２５ｍＭ、約２５ｍＭから約２００ｍＭ、約２５ｍＭから約１５０ｍＭ、約２５ｍＭから約１００ｍＭ、約２５ｍＭから約７５ｍＭ、約２５ｍＭから約５０ｍＭ、約５０ｍＭから約２００ｍＭ、約５０ｍＭから約１５０ｍＭ、５０ｍＭから約１００ｍＭおよび約５０ｍＭから約７５ｍＭ等である。
別の態様において、反応のｐＨは、約５．５から約９．５、例えば、約５．５から約９．０、約５．５から約８．５、約５．５から約８．０、約５．５から約７．５、約５．５から約７．０、約５．５から約６．５、約６．０から約９．５、約６．０から約９．０、約６．０から約８．５、約６．０から約８．０、約６．０から約７．５、約６．０から約７．０、約６．５から約９．５、約６．５から約８．５、約６．５から約８．０、約６．５から約７．５、約７．０から約９．５、約７．０から約９．０、７．０から約８．５および約７．０から約８．０等に維持される。
本発明のさらなる態様において、反応は、約２０℃から約８５℃、例えば、約２０℃から約８０℃、約２０℃から約７５℃、約２０℃から約７０℃、約２０℃から約６５℃、約２０℃から約６０℃、約２０℃から約５５℃、約２０℃から約５０℃、約２５℃から約８５℃、約２５℃から約８０℃、約２５℃から約７５℃、約２５℃から約７０℃、約２５℃から約６５℃、約２５℃から約６０℃、約２５℃から約５５℃、約２５℃から約５０℃、約３０℃から約８５℃、約３０℃から約８０℃、約３０℃から約７５℃、約３０℃から約７０℃、約３０℃から約６５℃、約３０℃から約６０℃、約３０℃から約５５℃、約３０℃から約５０℃、約３５℃から約８５℃、約３５℃から約８０℃、約３５℃から約７５℃、約３５℃から約７０℃、約３５℃から約６５℃、約３５℃から約６０℃、約３５℃から約５５℃、約４０℃から約８５℃、約４０℃から約８０℃、約４０℃から約７５℃、約４０℃から約７０℃、約４０℃から約６５℃、約４０℃から約６０℃、約４５℃から約８５℃、約４５℃から約８０℃、約４５℃から約７５℃、約４５℃から約７０℃、約４５℃から約６５℃、約５０℃から約８５℃、約５０℃から約８０℃、約５０℃から約７５℃、約５０℃から約７０℃、約５５℃から約８５℃、約５５℃から約８０℃、約５５℃から約７５℃、約６０℃から約８５℃および約６５℃から約８５℃等の温度で起こる。
また別の態様において、反応時間は、約１０時間から約９０時間、例えば、約１０時間から約８５時間、約１０時間から約８０時間、約１０時間から約７５時間、約１０時間から約７０時間、約１０時間から約６０時間、約１０時間から約５０時間、約１０時間から約４０時間、約１０時間から約３０時間、約１０時間から約２５時間、約１０時間から約２０時間、約１０時間から約１５時間、約１５時間から約９０時間、約１５時間から約８５時間、約１５時間から約８０時間、約１５時間から約７５時間、約１５時間から約７０時間、約１５時間から約６０時間、約１５時間から約５０時間、約１５時間から約４０時間、約１５時間から約３０時間、１５時間から約２０時間、例えば、約２０時間から約９０時間、約２０時間から約８５時間、約２０時間から約８０時間、約２０時間から約７５時間、約２０時間から約７０時間、約２０時間から約６０時間、約２０時間から約５０時間、約２０時間から約４０時間、約２０時間から約３０時間および約２０時間から約２５時間等である。
代替として、本発明の別の実施形態において、多糖は、化学的に合成される。多糖は、従来の方法に従って、化学的に合成され得る。
本発明のまた別の実施形態において、多糖は、多糖を生成するための生合成経路をクローン化し発現した後、代理宿主における発現によって調製される。例えば、宿主細胞は、本明細書において記述されている多糖と構造的類似性を有する多糖を生成するように修飾されてよく、宿主細胞において生成された多糖の繰り返し単位は、本明細書において記述されている多糖の繰り返し単位と部分的に同一である。多糖は、本明細書において記述されている多糖と構造的に同様であり、例えば、多糖の繰り返し単位が不明の分枝を有するならば、本明細書において記述されている多糖の繰り返し単位と比較した場合に、サイズが不均一であり、かつ／または分枝配置が不均一である。好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。
下記の例は、本発明の一部の実施形態を実証するものである。しかしながら、これらの例は、例証のみのためのものであり、本発明の条件および範囲について完全に決定的であることを主張するものではないことを理解されたい。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が与えられている場合、概してあまり好都合ではないが、指定された範囲の上下両方の条件も使用できることを理解すべきである。本明細書において言及されるすべての部およびパーセントは、重量ベースであり、すべての温度は、別段の定めがない限り、摂氏度で表現される。
さらに、下記の例は、別途詳細に記述されている場合を除き、当業者に周知かつ日常的である標準的な技術を使用して行った。上記で注記した通り、下記の例は、例証を目的として提示されるものであり、本発明の範囲をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
（実施例１）
Ｏ－脱アセチル化されている多糖を用いる多糖－タンパク質コンジュゲートの調製
それぞれの血清型についてのＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株を、限定培地中、ｐＨ制御した深部培養において発酵させた。使用した手順および培地は、実験を介して最適化したものであり、ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８（４）：４５８～４６２（１９９３）において以前に記述された基本技術の拡張であった。莢膜多糖を、ＮａＯＨ処理によって細胞から除去した。浄化後、一連のＵＦ／ＤＦ、沈殿および炭素濾過ステップにより、精製された多糖を生じさせた。例えば、米国特許第８，６５２，４８０号を参照されたい。還元的アミノ化化学を使用して、活性化多糖をＣＲＭ１９７とコンジュゲートさせた。例えば、米国特許第５，３６０，８９７号を参照されたい。
Ｏ－脱アセチル化されている多糖を用いる多糖－タンパク質コンジュゲートの調製
それぞれの血清型についてのＳ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）株を、限定培地中、ｐＨ制御した深部培養において発酵させた。使用した手順および培地は、実験を介して最適化したものであり、ｖｏｎ Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８（４）：４５８～４６２（１９９３）において以前に記述された基本技術の拡張であった。莢膜多糖を、ＮａＯＨ処理によって細胞から除去した。浄化後、一連のＵＦ／ＤＦ、沈殿および炭素濾過ステップにより、精製された多糖を生じさせた。例えば、米国特許第８，６５２，４８０号を参照されたい。還元的アミノ化化学を使用して、活性化多糖をＣＲＭ１９７とコンジュゲートさせた。例えば、米国特許第５，３６０，８９７号を参照されたい。
（実施例２）
還元的アミノ化によるＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲーション
多糖を活性化する
多糖酸化は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６．０±０．５）中、計算量の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）の順次添加によって行い、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要ならば、反応ｐＨを、およそｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を２３℃に調整した。酸化は、およそ０．２５モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加によって開始した。酸化反応は、およそ１６時間の間、５±３℃で実行した。
還元的アミノ化によるＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲーション
多糖を活性化する
多糖酸化は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６．０±０．５）中、計算量の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）の順次添加によって行い、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要ならば、反応ｐＨを、およそｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を２３℃に調整した。酸化は、およそ０．２５モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加によって開始した。酸化反応は、およそ１６時間の間、５±３℃で実行した。
活性化多糖の濃縮および血液透析濾過は、５Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過カセットを使用して行った。血液透析濾過は、２０倍ダイアボリュームのＷＦＩに対して実行した。次いで、精製された活性化多糖を、５±３℃で貯蔵した。精製された活性化糖を、とりわけ、（ｉ）比色アッセイによる糖濃度、（ｉｉ）比色アッセイによるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、および（ｉｖ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量によって、特徴付ける。
活性化多糖の酸化度（ＤＯ＝砂糖繰り返し単位のモル数／アルデヒドのモル数）は、次のように決定された：
砂糖繰り返し単位のモル数は、種々の比色法によって、例えば、アンスロン法を使用することによって決定される。アンスロン法により、多糖は、硫酸および熱の作用によって最初に単糖に解体される。アンスロン試薬は、ヘキソースと反応して、黄緑色の複合体を形成し、その吸光度を６２５ｎｍにおいて分光光度的に読み取る。アッセイの範囲内で、吸光度は、存在するヘキソースの量に正比例している。
アルデヒドのモル数も、ＭＢＴＨ比色法を使用して同時に決定される。ＭＢＴＨアッセイは、アルデヒド基（所与の試料由来）を３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨアッセイ試薬）と反応させることによる、アジン化合物の形成を伴う。過剰な３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾンが酸化して、反応性カチオンを形成する。反応性カチオンおよびアジンが反応して、青色発色団を形成する。次いで、形成された発色団を、６５０ｎｍにて分光的に読み取る。
活性化多糖をスクロース賦形剤と配合し、凍結乾燥する
活性化多糖をスクロースと、活性化多糖１グラム当たり２５グラムのスクロースの比まで配合した。次いで、配合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥した活性化多糖を含有するボトルを、－２０±５℃で貯蔵した。計算量のＣＲＭ１９７タンパク質をシェル冷凍し、別個に凍結乾燥した。凍結乾燥したＣＲＭ１９７を、－２０±５℃で貯蔵した。
活性化多糖をスクロースと、活性化多糖１グラム当たり２５グラムのスクロースの比まで配合した。次いで、配合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥した活性化多糖を含有するボトルを、－２０±５℃で貯蔵した。計算量のＣＲＭ１９７タンパク質をシェル冷凍し、別個に凍結乾燥した。凍結乾燥したＣＲＭ１９７を、－２０±５℃で貯蔵した。
凍結乾燥した活性化多糖および担体タンパク質を再溶解する
凍結乾燥した活性化多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再溶解した。多糖が完全溶解したら、等量の無水ＤＭＳＯを、凍結乾燥したＣＲＭ１９７に、再溶解のために添加した。
凍結乾燥した活性化多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再溶解した。多糖が完全溶解したら、等量の無水ＤＭＳＯを、凍結乾燥したＣＲＭ１９７に、再溶解のために添加した。
コンジュゲートし、キャップする
再溶解された活性化多糖を、再溶解されたＣＲＭ１９７と反応容器中で合わせ、続いて、徹底的に混合して、透明溶液を取得した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとのコンジュゲーションを開始した。反応溶液中における最終多糖濃度は、およそ１ｇ／Ｌであった。コンジュゲーションは、１．０～１．５ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加し、２３±２℃で２０～４８時間にわたってインキュベートすることによって開始した。コンジュゲーション反応は、２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して、未反応のアルデヒドをキャップすることにより、終了させた。このキャッピング反応を、２３±２℃で３±１時間にわたって続けた。
再溶解された活性化多糖を、再溶解されたＣＲＭ１９７と反応容器中で合わせ、続いて、徹底的に混合して、透明溶液を取得した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとのコンジュゲーションを開始した。反応溶液中における最終多糖濃度は、およそ１ｇ／Ｌであった。コンジュゲーションは、１．０～１．５ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加し、２３±２℃で２０～４８時間にわたってインキュベートすることによって開始した。コンジュゲーション反応は、２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して、未反応のアルデヒドをキャップすることにより、終了させた。このキャッピング反応を、２３±２℃で３±１時間にわたって続けた。
コンジュゲートを精製する
コンジュゲート溶液を、１００～３００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過による精製のために、調製物中、冷やした５ｍＭコハク酸塩－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）で１：１０に希釈した。
コンジュゲート溶液を、１００～３００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過による精製のために、調製物中、冷やした５ｍＭコハク酸塩－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）で１：１０に希釈した。
希釈したコンジュゲート溶液を、５μｍのフィルターに通過させ、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）を媒体として使用して、血液透析濾過を実行した。血液透析濾過が完了した後、コンジュゲート濃縮液を、０．２２μｍのフィルターを介して移した。コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水（ｐＨ６）でさらに希釈して、およそ０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖濃度とした。代替として、コンジュゲートを、１００～３００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過により、２０ｍＭヒスチジン－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．５）を使用して精製した。最終０．２２μｍ濾過ステップを完了させて、免疫原性コンジュゲートを取得した。
（実施例３）
ＣＤＡＰ（１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）によるＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲーション
ＧＢＳ多糖をＷＦＩに対して透析して、緩衝塩を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥した多糖（１００ｍｇ）をＷＦＩ（４～５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＣＤＡＰ（１００ｍｇ；アセトニトリル：水、９：１中１００ｍｇ／ｍＬ）で約３０秒間にわたって活性化した。活性化後、０．２Ｍのトリエチルアミン（４ｍＬ）を添加し、約２．５分間にわたって撹拌し、続いて、破傷風トキソイド（ＴＴ）（１５０ｍｇ、生理食塩水中３ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応物のｐＨを８．８に調整し、室温で２４時間にわたって撹拌した。コンジュゲーション反応物を２Ｍのグリシンでクエンチし、コンジュゲートを５μｍのフィルターに通過させ、１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過により、生理食塩水を使用して精製した。最終０．２２μｍ濾過ステップを完了させて、免疫原性コンジュゲートを取得した。
ＣＤＡＰ（１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）によるＧＢＳ莢膜多糖のコンジュゲーション
ＧＢＳ多糖をＷＦＩに対して透析して、緩衝塩を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥した多糖（１００ｍｇ）をＷＦＩ（４～５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＣＤＡＰ（１００ｍｇ；アセトニトリル：水、９：１中１００ｍｇ／ｍＬ）で約３０秒間にわたって活性化した。活性化後、０．２Ｍのトリエチルアミン（４ｍＬ）を添加し、約２．５分間にわたって撹拌し、続いて、破傷風トキソイド（ＴＴ）（１５０ｍｇ、生理食塩水中３ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応物のｐＨを８．８に調整し、室温で２４時間にわたって撹拌した。コンジュゲーション反応物を２Ｍのグリシンでクエンチし、コンジュゲートを５μｍのフィルターに通過させ、１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用するタンジェント流濾過により、生理食塩水を使用して精製した。最終０．２２μｍ濾過ステップを完了させて、免疫原性コンジュゲートを取得した。
（実施例４）
ＧＢＳ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに対する様々なコンジュゲーション条件の効果
ＧＢＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸコンジュゲートは、試薬のための溶媒（水性媒体対ＤＭＳＯ）、初期多糖中における様々なレベルのシアル酸、および酸化度／糖エピトープ修飾を包含する、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学（ＰＯ／ＲＡＣ）条件を故意に変動させることによって産生され得る。概して、ＤＭＳＯを溶媒として使用して生成されたコンジュゲートは、水性媒体を使用して生成されたコンジュゲートよりも、低レベルの未反応の（遊離）多糖、より高いコンジュゲート分子量およびより高い糖／タンパク質比を有することが分かる。
ＧＢＳ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに対する様々なコンジュゲーション条件の効果
ＧＢＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸコンジュゲートは、試薬のための溶媒（水性媒体対ＤＭＳＯ）、初期多糖中における様々なレベルのシアル酸、および酸化度／糖エピトープ修飾を包含する、過ヨウ素酸酸化／還元的アミノ化化学（ＰＯ／ＲＡＣ）条件を故意に変動させることによって産生され得る。概して、ＤＭＳＯを溶媒として使用して生成されたコンジュゲートは、水性媒体を使用して生成されたコンジュゲートよりも、低レベルの未反応の（遊離）多糖、より高いコンジュゲート分子量およびより高い糖／タンパク質比を有することが分かる。
低レベルの未反応の（遊離）多糖を持つコンジュゲートを生成するコンジュゲーションプロセスは、有利であり、好ましい。高レベルの未反応の（遊離）多糖は、多糖－タンパク質コンジュゲートによって産生されたＴ細胞依存性応答を希釈する可能性を有する過度のＴ細胞非依存性免疫応答を引き起こし得、それにより、コンジュゲートによって産生される免疫原性応答を低下させることが周知である。
ＧＢＳ多糖を、当技術分野において公知の方法によって化学的に脱シアルし（Ｃｈａｆｆｉｎ，Ｄ．Ｏら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８７（１３）：４６１５～４６２６（２００５）を参照）、コンジュゲート変異体を産生して、免疫原性に対する脱シアル化％の影響を決定し得る。概して、約４０％超の脱シアル化（すなわち、シアル酸レベル約６０％未満）は、免疫原性に対して悪影響を及ぼす。
同様に、ほとんどの場合において、約５未満の酸化度、または約２０％超の糖エピトープ修飾は、免疫原性に対して悪影響を及ぼす。酸化は莢膜多糖上のシアル酸を介して発生するため、約２０％超の糖エピトープ修飾がシアル酸含有量を低減させ、これが免疫原性の低減をもたらすことが分かる。
逆に、様々な糖／タンパク質比または多糖分子量を有するコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性応答を生成し、これらの属性に関して比較的広範囲の受容基準を示すことが分かっている。
追加のコンジュゲート変異体は、代替的な化学経路を使用しても産生され得る。１つの代替的な化学は、多糖をカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）と反応させることによりコンジュゲートを産生すること、およびＤＭＳＯ中でコンジュゲーション反応を行うことを包含する。別の代替的な化学において、コンジュゲートは、（過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに）ＴＥＭＰＯ［（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－イル）オキシル］試薬を使用する多糖の酸化、続いて、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化化学（ＴＥＭＰＯ／ＲＡＣ）を使用するコンジュゲーションにより、上記の実施例において詳述した通りに産生され得る。これらの代替的な化学によって産生されたコンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であり、ＰＯ／ＲＡＣ以外の代替的な化学経路の適合性を示すことが分かっている。しかしながら、一部のコンジュゲーション化学は、他のものよりも、一部の血清型を用いて、より良好に実行され得る。
ＯＰＡは、Ｂｕｕｒｍａｎ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、Ｊｕｎ ５；２２０（１）：１０５～１１５（２０１９）のように実行した。
（実施例５）
一価コンジュゲートワクチンはウサギにおいて機能的および結合抗体応答を生成した
ウサギ（１群当たり４～５匹）に、コンジュゲート用量当たり２０ｍｃｇのＱＳ２１を加えて製剤化された異なる担体タンパク質（ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＳＣＰ）とコンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸの一価コンジュゲートの多糖の重量に基づき、２０ｍｃｇで０、３および６週目にワクチン接種した。血清を、ＣＰＳコーティングされたミクロスフェアを用いる直接結合ルミネックスイムノアッセイ（ｄＬＩＡ）により、ベースライン時および１０週目に抗ＣＰＳ ＩｇＧ力価について評定した。
一価コンジュゲートワクチンはウサギにおいて機能的および結合抗体応答を生成した
ウサギ（１群当たり４～５匹）に、コンジュゲート用量当たり２０ｍｃｇのＱＳ２１を加えて製剤化された異なる担体タンパク質（ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＳＣＰ）とコンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸの一価コンジュゲートの多糖の重量に基づき、２０ｍｃｇで０、３および６週目にワクチン接種した。血清を、ＣＰＳコーティングされたミクロスフェアを用いる直接結合ルミネックスイムノアッセイ（ｄＬＩＡ）により、ベースライン時および１０週目に抗ＣＰＳ ＩｇＧ力価について評定した。
図１は、ＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートが投与された２匹のウサギ由来の連続希釈した血清の平均結合活性プロファイルを示す。図１に示すＧＢＳ ＣＰＳ ＶＩについての内挿されたＥＣ５０血清希釈力価は、シグモイド用量応答曲線当てはめ（勾配変化のある法面）（グラフパッドプリズム）を使用して決定した。表１は、ＣＲＭ１９７、ＳＣＰおよびＴＴとコンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩについて産生された抗体力価を示す。ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩによる免疫化は、血清型ＶＩに特異的である測定可能な抗体力価を産生し、直接結合ルミネックスイムノアッセイによって評定すると、血清型ＶＩが誘発した血清について、他の血清型とのごくわずかな結合が見られた。
図２Ａ～２Ｃおよび表２に示す通り、ＴＴとコンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸのコンジュゲートは、免疫化後の同族多糖に対して強固なＩｇＧ抗体力価を同様に誘発した。
図３Ａおよび３Ｂは、ＧＢＳ ＣＰＳ ＶＩＩ－ＴＴコンジュゲートおよびＧＢＳ ＣＰＳ ＩＸ－ＴＴコンジュゲートをそれぞれ投与された２匹のウサギ由来の連続希釈した血清の平均結合活性プロファイルを示す。ＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶおよびＩＸ抗原に対するＧＢＳ ＣＰＳ ＶＩＩ－ＴＴコンジュゲート誘発抗体についてならびにＧＢＳ ＣＰＳ ＶＩおよびＶＩＩ抗原に対するＧＢＳ ＣＰＳ ＩＸ－ＴＴコンジュゲート誘発抗体について、交差反応性が見られた。図３Ａ（ＧＢＳ ＣＰＳ Ｖ、ＶＩＩおよびＩＸ）および３Ｂ（ＧＢＳ ＣＰＳ ＶＩ、ＶＩＩおよびＩＸ）に示されている内挿されたＥＣ５０血清希釈力価は、シグモイド用量応答曲線当てはめ（勾配変化のある法面）（グラフパッドプリズム）を使用して決定した。
担体タンパク質としてのＣＲＭ１９７またはＣ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）とのＧＢＳ ＣＰＳ血清型ＶＩコンジュゲートをオプソニン食作用取り込み（ＯＰＡ）により死滅し得る機能性殺菌抗体の誘発についてさらに評定した。ウサギを、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしているＧＢＳ ＣＰＳ ＶＩにより、０、３および６週目に、またはＳＣＰとコンジュゲートしているＣＰＳ ＶＩにより、０、３、６、１３週目に、免疫化した。それぞれ１３および１６週目に採取したＧＢＳ ＶＩ－ＣＲＭ１９７またはＧＢＳ ＶＩ－ＳＣＰにより免疫化されたウサギ由来の血清を、ＨＬ－６０食作用細胞によるＯＰＡ力価について評定した（表３）。
ＧＢＳ ＶＩ－ＣＲＭ１９７またはＶＩ：ＳＣＰにより免疫化されたウサギ由来の血清は、血清型ＶＩ莢膜を発現している標的株を用いるＯＰＡによる死滅活性を実証した。ＯＰＡ分析前の可溶性ＳＣＰタンパク質によるＧＢＳ ＶＩ－ＳＣＰ誘発血清の前吸着は、観察された力価をわずかに低減させ、これは特異性を実証する。ＧＢＳ ＶＩ－ＣＲＭ１９７誘発血清によるごくわずかな交差反応性死滅が、異種血清型ＩＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸを発現している標的株について見られた。比較すると、血清型ＧＢＳ ＶＩ－ＳＣＰ免疫化されたウサギ由来の血清は、異種血清型ＩＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸを発現している株に対して測定可能な力価を実証した。可溶性ＳＣＰによるＳＣＰ特異的抗体の吸着は、観察される力価を有効に低下させ、多様な莢膜型の文脈において分離株全体にわたる機能的活性を達成する抗ＳＣＰ抗体の能力を裏付けた。
これらの結果は、抗ＣＰＳ抗体による機能的活性が主として同種血清型に限られること、および抗ＳＣＰ担体抗体が、異なるＣＰＳ型を発現している多様な分離株間で中等度であるが幅広いレベルのＣＰＳ非依存性交差機能的活性を付与できることを示す。
（実施例６）
多価コンジュゲートワクチンはウサギにおいて結合抗体応答を生成した
単一のウサギに、０、３、６および９週目に、各抗原２０ｍｃｇ用量を使用する血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩのＣＲＭ１９７コンジュゲートをワクチン接種し、２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバントを投与した。実施例５において記述されているルミネックスアッセイを使用して、血清におけるＩｇＧ力価を１１週目に評定した。血清の３倍連続希釈を１：１５から出発して試験した。
多価コンジュゲートワクチンはウサギにおいて結合抗体応答を生成した
単一のウサギに、０、３、６および９週目に、各抗原２０ｍｃｇ用量を使用する血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩのＣＲＭ１９７コンジュゲートをワクチン接種し、２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバントを投与した。実施例５において記述されているルミネックスアッセイを使用して、血清におけるＩｇＧ力価を１１週目に評定した。血清の３倍連続希釈を１：１５から出発して試験した。
図４は、投与された７つの血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ－ＣＲＭ１９７コンジュゲート（開いた記号）ならびに製剤由来の存在しない３つの血清型（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ）（閉じた記号）についての血清応答を示す。結果は、新たに出現した血清型ＶＩを包含する七価ＧＢＳグリココンジュゲートワクチンが、７つすべての莢膜多糖成分に対して抗原特異的ＩｇＧ抗体を誘発し得ることを実証する。血清型ＶＩＩおよびＩＸ多糖に対する応答は、血清型Ｖ抗原に対する抗体の交差反応性に起因し得るのもであり、繰り返し単位の分枝鎖状シアル化側鎖内の共通エピトープを共有する（Ｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、（２０１４）ＪＢＣ ２８９：３４ ２３４３７～２３４４８）。
本発明の態様
下記の条項は、本発明の追加の実施形態を記述するものである。
下記の条項は、本発明の追加の実施形態を記述するものである。
Ｃ１． Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）莢膜多糖と担体タンパク質とを含む免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートであって、前記莢膜多糖が、約６０％超のシアル酸レベルを有する、免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲート。
Ｃ２． 莢膜多糖が、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される、Ｃ１の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ３． 莢膜多糖が血清型ＶＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ４． 莢膜多糖が血清型ＶＩＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ５． 莢膜多糖が血清型ＶＩＩＩである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ６． 莢膜多糖が血清型ＩＸである、Ｃ２の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ７． 莢膜多糖が、約９５％超のシアル酸レベルを有する、Ｃ１～Ｃ６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ８． 莢膜多糖が、約１００％のシアル酸レベルを有する、Ｃ１～Ｃ７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ９． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ８のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１０． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ９のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１１． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１０のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１２． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．７５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１１のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１３． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１２のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１４． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．８５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１３のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１５． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１４のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１６． 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．９５ｍＭのシアル酸を有する、Ｃ１～Ｃ１５のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１７． 莢膜多糖が、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ１６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１８． 莢膜多糖が、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ１７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ１９． 莢膜多糖が、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ１８のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２０． 莢膜多糖が、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ１９のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２１． 莢膜多糖が、約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する、Ｃ１～Ｃ２０のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２２． コンジュゲートの分子量が、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間である、Ｃ１～２１のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２３． コンジュゲートの分子量が、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間である、Ｃ１～Ｃ２２のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２４． コンジュゲートの分子量が、約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間である、Ｃ１～Ｃ２３のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２５． 多糖が、それぞれ独立して担体タンパク質とコンジュゲートしている、Ｃ１～Ｃ２４のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２６． 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドである、Ｃ１～Ｃ２５のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２７． 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、Ｃ１～Ｃ２６のいずれか一項の免疫原性コンジュゲート。
Ｃ２８． 莢膜多糖を単離する方法であって、有機試薬を、莢膜多糖生産菌を含む細胞ブロスと反応させるステップを含む方法。
Ｃ２９． 細菌を溶菌しない、Ｃ２８の方法。
Ｃ３０． 細菌を熱で死滅させる、Ｃ２８またはＣ２９の方法。
Ｃ３１． 遠心分離して細胞ペーストを提供するステップをさらに含む、Ｃ２８～Ｃ３０のいずれか一項の方法。
Ｃ３２． 濾過するステップをさらに含む、Ｃ２８～Ｃ３１のいずれか一項の方法。
Ｃ３３． 前記濾過するステップが、血液透析濾過である、Ｃ３２の方法。
Ｃ３４． 細菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ２８の方法。
Ｃ３５． Ｃ１～Ｃ２７のいずれか一項の免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
Ｃ３６． 多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、担体タンパク質とコンジュゲートしているＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩ由来の莢膜多糖を含む、免疫原性組成物。
Ｃ３７． １つまたは複数の多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、Ｂ群レンサ球菌（ＧＢＳ）血清型ＶＩならびにＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型由来の莢膜多糖を含む、免疫原性組成物。
Ｃ３８． 少なくとも１つの追加の血清型が、Ｉａである、Ｃ３７の免疫原性組成物。
Ｃ３９． ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８の免疫原性組成物。
Ｃ４０． ＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８またはＣ３９の免疫原性組成物。
Ｃ４１． ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８～Ｃ４０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ４２． ＧＢＳ血清型ＩＶ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８～Ｃ４１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ４３． ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８～Ｃ４２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ４４． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８～Ｃ４３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ４５． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８～Ｃ４４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ４６． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３８～Ｃ４５のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ４７． ＧＢＳ血清型ＶＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３６の免疫原性組成物。
Ｃ４８． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ３６またはＣ４７の免疫原性組成物。
Ｃ４９． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ４６～Ｃ４８のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ５０． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＶＩＩである、Ｃ３７の免疫原性組成物。
Ｃ５１． ＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ５０の免疫原性組成物。
Ｃ５２． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ５０またはＣ５１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ５３． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＶＩＩＩである、Ｃ３８の免疫原性組成物。
Ｃ５４． ＧＢＳ血清型ＩＸ由来の莢膜多糖を含むコンジュゲートをさらに含む、Ｃ５３の免疫原性組成物。
Ｃ５５． 少なくとも１つの追加の血清型が、ＩＸである、Ｃ５４の免疫原性組成物。
Ｃ５６． Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸからなる群から選択される少なくとも４つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
Ｃ５７． 少なくとも２つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ５８． 少なくとも３つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ５９． 少なくとも４つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ６０． 少なくとも５つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ６１． 少なくとも６つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ６２． 少なくとも７つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ６３． 少なくとも８つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ６４． 少なくとも９つのＧＢＳ莢膜多糖血清型を含む、Ｃ５６の免疫原性組成物。
Ｃ６５． 薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、担体、またはそれらの混合物をさらに含む、Ｃ３５～Ｃ６４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ６６． 緩衝剤をさらに含む、Ｃ３５～Ｃ６５のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ６７． 緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩からなる群から選択される、Ｃ６６の免疫原性組成物。
Ｃ６８． 緩衝剤が、ヒスチジンである、Ｃ６７の免疫原性組成物。
Ｃ６９． 界面活性剤をさらに含む、Ｃ３５～Ｃ６８のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７０． 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－２０およびポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される、Ｃ６９の免疫原性組成物。
Ｃ７１． 界面活性剤が、ポリソルベート－８０である、Ｃ７０の免疫原性組成物。
Ｃ７２． 賦形剤をさらに含む、Ｃ３５～Ｃ７１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７３． 賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される、Ｃ７２の免疫原性組成物。
Ｃ７４． 賦形剤が、塩化ナトリウムである、Ｃ７３の免疫原性組成物。
Ｃ７５． アジュバントをさらに含む、Ｃ３５～Ｃ７４のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ７６． アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントまたはＱＳ－２１である、Ｃ７５の免疫原性組成物。
Ｃ７７． アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシルホスフェートおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、Ｃ７６の免疫原性組成物。
Ｃ７８． アジュバントが、リン酸アルミニウムである、Ｃ７７の免疫原性組成物。
Ｃ７９． アジュバントが、アルミニウムヒドロキシルホスフェートである、Ｃ７８の免疫原性組成物。
Ｃ８０． 緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、および場合によりアジュバントを含み、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている、Ｃ３５～Ｃ７９のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８１． ヒスチジン、ポリソルベート－８０、塩化ナトリウム、および場合によりリン酸アルミニウムを含み、約６．０から約７．０のｐＨに緩衝されている、Ｃ３５～Ｃ８０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８２． 約１０ｍＭから約２５ｍＭのヒスチジン、約０．０１％から約０．０３％（ｖ／ｗ）のポリソルベート－８０、約１０ｍＭから約２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および場合により約０．２５ｍｇ／ｍｌから約０．７５ｍｇ／ｍｌのアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含む、Ｃ３５～Ｃ８１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８３． 約５ｍｃｇ／ｍｌから約５０ｍｃｇ／ｍｌの用量を含む、Ｃ３５～Ｃ８２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８４． 場合により少なくとも１つの賦形剤の存在下で、凍結乾燥される、Ｃ３５～Ｃ８３のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８５． 少なくとも１つの賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールからなる群から選択される、Ｃ８４の免疫原性組成物。
Ｃ８６． 少なくとも１つの賦形剤が、スクロースである、Ｃ８５の免疫原性組成物。
Ｃ８７． 約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の少なくとも１つの賦形剤を含む、Ｃ８４～Ｃ８６のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８８． 追加の賦形剤を含む、Ｃ８４～Ｃ８７のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ８９． 追加の賦形剤が、マンニトールまたはグリシンである、Ｃ８８の免疫原性組成物。
Ｃ９０． 約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の追加の賦形剤を含む、Ｃ８８またはＣ８９の免疫原性組成物。
Ｃ９１． 水、注射用水（ＷＦＩ）、アジュバント懸濁液または生理食塩水で再溶解される、Ｃ８４～Ｃ９０のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９２． 医薬として使用するための、Ｃ４４～Ｃ９１のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９３． 対象においてＧＢＳに対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、Ｃ３５～Ｃ９２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ９４． 対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である、Ｃ９３の免疫原性組成物。
Ｃ９５． 女性が、妊娠後半期である、Ｃ９４の免疫原性組成物。
Ｃ９６． 妊娠中の女性が、少なくとも妊娠２０週である、Ｃ９５の免疫原性組成物。
Ｃ９７． 妊娠中の女性が、妊娠２７週から３６週である、Ｃ９６の免疫原性組成物。
Ｃ９８． 対象が、５０歳以上の成人である、Ｃ９７の免疫原性組成物。
Ｃ９９． 対象が、６５歳以上の成人である、Ｃ９８の免疫原性組成物。
Ｃ１００． 対象が、８５歳以上の成人である、Ｃ９９の免疫原性組成物。
Ｃ１０１． 対象が、免疫不全である、Ｃ９０～Ｃ１００のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１０２． 対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、Ｃ１０１の免疫原性組成物。
Ｃ１０３． Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、Ｃ９３～Ｃ１０２のいずれか一項の免疫原性組成物。
Ｃ１０４． Ｂ群レンサ球菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、有効量のＣ３５～Ｃ１０３のいずれか一項の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
Ｃ１０５． 対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量のＣ３５～Ｃ１０４のいずれか一項の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
Ｃ１０６． 対象が、妊娠を計画している女性または妊娠中の女性である、Ｃ１０４またはＣ１０５の方法。
Ｃ１０７． 女性が、妊娠後半期である、Ｃ１０６の方法。
Ｃ１０８． 妊娠中の女性が、少なくとも妊娠２０週である、Ｃ１０６またはＣ１０７の方法。
Ｃ１０９． 妊娠中の女性が、妊娠２７週から３６週である、Ｃ１０６～Ｃ１０８のいずれか一項の方法。
Ｃ１１０． 対象が、５０歳以上の成人である、Ｃ１０４またはＣ１０５の方法。
Ｃ１１１． 対象が、６５歳以上の成人である、Ｃ１１０の方法。
Ｃ１１２． 対象が、８５歳以上の成人である、Ｃ１１０またはＣ１１１の方法。
Ｃ１１３． 対象が、免疫不全である、Ｃ１０４～Ｃ１１２のいずれか一項の方法。
Ｃ１１４． 対象が、肥満、糖尿病、ＨＩＶ感染、がん、心血管疾患または肝疾患からなる群から選択される医学的状態を有する、Ｃ１１３の方法。
Ｃ１１５． Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、先行する段落のいずれか一項の方法。
Ｃ１１６． Ｃ１～Ｃ２７のいずれか一項の免疫原性コンジュゲートにおいて、莢膜多糖と結合する抗体。
Ｃ１１７． Ｃ１１６の抗体を含む組成物。
Ｃ１１８． 対象に受動免疫を付与する方法であって、
（ａ）いずれかの先行する段落の免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、
（ｂ）抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップと
を含む方法。
（ａ）いずれかの先行する段落の免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、
（ｂ）抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップと
を含む方法。
Ｃ１１９． Ｃ１～Ｃ２７のいずれか一項の免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）ＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させて、活性化多糖をもたらすステップと、
（ｂ）活性化多糖を担体タンパク質と反応させて、多糖－タンパク質コンジュゲートをもたらすステップと
を含む方法。
（ａ）ＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させて、活性化多糖をもたらすステップと、
（ｂ）活性化多糖を担体タンパク質と反応させて、多糖－タンパク質コンジュゲートをもたらすステップと
を含む方法。
Ｃ１２０． ステップ（ｂ）が、極性非プロトン性溶媒中で行われる、Ｃ１１９の方法。
Ｃ１２１． 溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される、Ｃ１２０の方法。
Ｃ１２２． 溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、Ｃ１２１の方法。
Ｃ１２３． 多糖を、０．０１から１０．０モル当量の酸化剤と反応させる、Ｃ１１９～Ｃ１２２のいずれか一項の方法。
Ｃ１２４． 酸化剤が、過ヨウ素酸塩である、Ｃ１１９～Ｃ１２３のいずれか一項の方法。
Ｃ１２５． 過ヨウ素酸塩が、過ヨウ素酸ナトリウムである、Ｃ１２４の方法。
Ｃ１２６． ステップ（ａ）の酸化反応が、１時間から５０時間の間である、Ｃ１１９～Ｃ１２５のいずれか一項の方法。
Ｃ１２７． 酸化反応の温度が、約２℃から約２５℃の間に維持される、Ｃ１１９～Ｃ１２６のいずれか一項の方法。
Ｃ１２８． 酸化反応が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびビス－トリスからなる群から選択される緩衝剤中で行われる、Ｃ１１９～Ｃ１２７のいずれか一項の方法。
Ｃ１２９． 緩衝剤が、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度を有する、Ｃ１２８の方法。
Ｃ１３０． 酸化反応が、約４．０から約８．０の間のｐＨで行われる、Ｃ１１９～Ｃ１２９のいずれか一項の方法。
Ｃ１３１． 酸化剤が、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）である、Ｃ１１９の方法。
Ｃ１３２． Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）が、共酸化剤である、Ｃ１３１の方法。
Ｃ１３３． ステップ（ａ）が、クエンチング剤の添加により酸化反応物をクエンチするステップをさらに含む、Ｃ１１９～Ｃ１３２のいずれか一項の方法。
Ｃ１３４． 多糖の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間である、Ｃ１１９～Ｃ１３３のいずれか一項の方法。
Ｃ１３５． 活性化多糖の酸化度が、５から２５の間である、Ｃ１１９～Ｃ１３４のいずれか一項の方法。
Ｃ１３６． 活性化多糖を凍結乾燥するステップをさらに含む、Ｃ１１９～Ｃ１３５のいずれか一項の方法。
Ｃ１３７． 活性化多糖が、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットからなる群から選択される糖の存在下で凍結乾燥される、Ｃ１３６の方法。
Ｃ１３８． ステップ（ｂ）が、
（１）活性化多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（２）配合された活性化多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含む、Ｃ１１９～Ｃ１３７のいずれか一項の方法。
（１）活性化多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（２）配合された活性化多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと
を含む、Ｃ１１９～Ｃ１３７のいずれか一項の方法。
Ｃ１３９． ステップ（２）における活性化多糖の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０．０ｍｇ／ｍＬの間である、Ｃ１３８の方法。
Ｃ１４０． 活性化多糖対担体タンパク質の初期比（重量／重量）が、５：１から０．１：１の間である、Ｃ１３７またはＣ１３８の方法。
Ｃ１４１． 還元剤が、ブレンステッドもしくはルイス酸、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）の存在下、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは亜鉛からなる群から選択される、Ｃ１３８～Ｃ１３９のいずれか一項の方法。
Ｃ１４２． 還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである、Ｃ１４１の方法。
Ｃ１４３． 還元剤の分量が、約０．１から約１０．０モル当量の間である、Ｃ１３８～Ｃ１４２のいずれか一項の方法。
Ｃ１４４． ステップ（２）の還元反応の持続時間が、１時間から６０時間の間である、Ｃ１３８～Ｃ１４３のいずれか一項の方法。
Ｃ１４５． 還元反応の温度が、１０℃から４０℃の間に維持される、Ｃ１３８～Ｃ１４４のいずれか一項の方法。
Ｃ１４６． 水素化ホウ素の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップ（ステップ（ｃ））をさらに含む、Ｃ１１９～Ｃ１４５のいずれか一項の方法。
Ｃ１４７． 水素化ホウ素の分量が、約０．１から約１０．０モル当量の間である、Ｃ１４６の方法。
Ｃ１４８． 水素化ホウ素が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化ホウ素テトラブチルアンモニウム、水素化ホウ素カルシウムおよび水素化ホウ素マグネシウムからなる群から選択される、Ｃ１４６の方法。
Ｃ１４９． 水素化ホウ素が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である、Ｃ１４６の方法。
Ｃ１５０． キャップするステップの持続時間が、０．１時間から１０時間の間である、Ｃ１４６の方法。
Ｃ１５１． キャップするステップの温度が、約１５℃から約４５℃の間に維持される、Ｃ１４６～Ｃ１４９のいずれか一項の方法。
Ｃ１５２． 多糖－タンパク質コンジュゲートを精製するステップをさらに含む、Ｃ１１９～Ｃ１５１のいずれか一項の方法。
Ｃ１５３． 多糖－タンパク質コンジュゲートが、多糖の総量と比較して約４０％未満の遊離多糖を含む、Ｃ１１９～Ｃ１５２のいずれか一項の方法。
Ｃ１５４． コンジュゲート中における多糖対担体タンパク質の比（重量／重量）が、約０．５から約３．０の間である、Ｃ１１９～Ｃ１５３のいずれか一項の方法。
Ｃ１５５． コンジュゲートのコンジュゲーションの程度が、２から１５の間である、Ｃ１１９～Ｃ１５４のいずれか一項の方法。
Ｃ１５６． 多糖－タンパク質コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加によりステップ（ａ）の酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、
（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、
（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップと
を含み、
ここで、ステップ（ｃ）および（ｄ）はＤＭＳＯ中で行われる方法。
（ａ）単離されたＧＢＳ莢膜多糖を酸化剤と反応させるステップと、
（ｂ）クエンチング剤の添加によりステップ（ａ）の酸化反応物をクエンチして、活性化ＧＢＳ莢膜多糖をもたらすステップと、
（ｃ）活性化ＧＢＳ莢膜多糖を担体タンパク質と配合するステップと、
（ｄ）配合された活性化ＧＢＳ莢膜多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、ＧＢＳ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップと、
（ｅ）水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の添加により、未反応のアルデヒドをキャップするステップと
を含み、
ここで、ステップ（ｃ）および（ｄ）はＤＭＳＯ中で行われる方法。
参考文献
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a nationwide surveillance study in Japan, 2011-2015.）」Infection,
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invasive infections: a population-based study in Japan.）」Japanese Journal of Infectious Diseases, 2014. 67(5): p. 356-60.
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Claims (36)
- 血清型ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択されるＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）莢膜多糖と、担体タンパク質とを含む、多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物。
- ＧＢＳ莢膜多糖が、血清型ＶＩを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- ＧＢＳ莢膜多糖が、血清型ＶＩＩを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- ＧＢＳ莢膜多糖が、血清型ＶＩＩＩを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- ＧＢＳ莢膜多糖が、血清型ＩＸを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- 血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶから選択される少なくとも１つの追加の血清型をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 多糖－タンパク質コンジュゲートが、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩと、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型とを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- 多糖－タンパク質コンジュゲートが、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩＩと、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型とを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- 多糖－タンパク質コンジュゲートが、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＶＩＩＩと、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＩＸから選択される少なくとも１つの追加の血清型とを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- 多糖－タンパク質コンジュゲートが、ＧＢＳ莢膜多糖血清型ＩＸと、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩから選択される少なくとも１つの追加の血清型とを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、約６０％超、約９５％超、または約１００％のシアル酸レベルを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、多糖１ｍＭ当たり少なくとも約０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９または０．９５ｍＭのシアル酸を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約７５０ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約４００ｋＤａの間、約２５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、または約１００ｋＤａから約４００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- コンジュゲートの分子量が、約３００ｋＤａから約２０，０００ｋＤａの間、約１，０００ｋＤａから約１５，０００ｋＤａの間、または約１，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの間である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、約０％から約４０％の間でＯ－アセチル化されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満でＯ－アセチル化されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３５または約０．４ｍＭのＯ－アセテートを有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 莢膜多糖が、糖繰り返し単位１ｍＭ当たり約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、または０．０５ｍＭ未満のＯ－アセテートを有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）およびレンサ球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）から選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 薬学的に許容できる賦形剤、緩衝剤、安定剤、アジュバント、抗凍結剤、塩、二価カチオン、非イオン性界面活性物質、フリーラジカル酸化の阻害剤、担体、またはそれらの混合物をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、トリス（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩から選択される、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
- 緩衝剤が、ヒスチジンである、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
- 界面活性剤をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－２０およびポリオキシエチレンアルキルエーテルから選択される、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
- 賦形剤をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 賦形剤が、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール、パラチニット、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、グリシン、アルギニン、リシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールから選択される、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 医薬として使用するための、請求項１から２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 対象においてＢ群レンサ球菌に対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、請求項１から２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、請求項２９に記載の免疫原性組成物。
- Ｂ群レンサ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、有効量の請求項１から２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- 対象においてＢ群レンサ球菌に関連する疾患または状態を予防する、治療するまたは低減させる方法であって、対象に、有効量の請求項１から２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- Ｂ群レンサ球菌が、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）である、請求項３１または３２に記載の方法。
- 抗体を生成する方法であって、請求項１から２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を、対象に投与するステップを含む方法。
- 請求項３４に記載の方法によって生成された抗体。
- 対象に受動免疫を付与する方法であって、
請求項１から２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を使用して、抗体調製物を産生するステップと、
抗体調製物を対象に投与して、受動免疫を付与するステップと
を含む方法。
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