JP2023537524A - 腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体及びそのナノ粒子、調製方法、使用 - Google Patents

腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体及びそのナノ粒子、調製方法、使用 Download PDF

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Abstract

本発明に係る腫瘍能動標的治療用の複合体は腫瘍能動標的化機能を有する親水性アフィボディと疎水性抗腫瘍細胞毒素とが小分子連結基を介して結合されてなり、アフィボディは複数種の腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体に対して特異的結合活性と高親和性を有し、細胞毒素は効果的な抗腫瘍薬である。そのナノ粒子、調製方法及びその使用をさらに開示する。本発明に係るアフィボディ-細胞毒素複合体は水中で自己集合されてアフィボディをシェル、細胞毒素をコアとするナノ粒子を形成することができ、アフィボディが腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体を特異的に認識して結合し得るので、該ナノ粒子は腫瘍部位に効果的に濃縮され、連結基を介して生分解され、細胞毒素を放出して、有効治療濃度になり、これによって、腫瘍成長を阻害するとともに、正常器官や組織に対する毒性及び副作用を低減させ、腫瘍を能動でかつ標的に治療するための新しい手段を提供する。【選択図】図16

Description

本発明はバイオ・ナノ医薬の技術分野に関し、特に腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体及びそのナノ粒子の調製方法と使用に関する。
悪性腫瘍(がん)は人間の生存と社会の発展を深刻に危うくする重大な疾患であり、すでに全世界で解決すべき難題及び重大な挑戦となっている。現在、化学療法は癌治療の主要な手段であり、小分子細胞毒素は構造が明確で、透過性が高く、細胞毒性が強いなどの優位性を持っているが、その分子量が比較的に小さく、標的特異性が欠損しているため、投与後に生体に素早く代謝され、しかも生体の深刻な毒性や副作用を引き起こすことが多く、臨床応用は制限されている。
抗体-薬物複合体(ADC:antibody-drug conjugate)技術はモノクローナル抗体の標的選択性と小分子細胞毒素の高効率を結合し、腫瘍の「精密医療」のための新しい方法を提供した。新しい腫瘍治療薬として、ADCの研究開発は広く注目されているだけでなく、すでに臨床に応用されている製品もある。しかし、現在のADC薬物はまだ以下のような多くの欠陥が存在している。(1)抗体分子量が大きすぎ(1.5×10Da)、薬物の腫瘍内部の浸透率が非常に低くなる。(2)抗体表面と小分子細胞毒素の結合部位の数が不確定であるため、ロット間の担持率が一致せず、均一な製品を得ることが困難である。(3)エンドサイトーシス率及び抗体媒介生物効果を更に高めるための高品質の標的及び好適な抗体がない。このため、以上の欠陥をどのように克服し、薬物送達比が高く、細胞毒素を均一に担持したADC薬物を開発するかは急務となっている。これに基づいて、他の親和性がより強く、腫瘍組織又は細胞に対する選択性がより高く、しかも細胞毒素と均一に結合できる標的ベクターを使用して、新規な能動標的抗腫瘍薬を開発する試みは必要であるだけでなく、科学的意義と臨床応用価値も大きい。
本発明は従来技術における上記欠陥を解決することができる腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体を提供することである。
本発明の技術的解決手段は以下のとおりである。
腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体であって、主に細胞毒素と能動標的化機能を有するアフィボディを含み、前記細胞毒素と前記アフィボディが小分子連結基を介して共有結合されてなる。
(ここで、Aはアフィボディであり、Lは有機小分子連結基であり、
は細胞毒素である。)
好ましくは、前記アフィボディは、ヒト上皮成長因子受容体(HER)を標的とするアフィボディ ZHER2:342、ZEGFR:1907、ヒトインスリン様成長因子-1受容体を標的とするアフィボディ ZIGF1R:4551及びヒト血小板由来成長因子受容体βを標的とするアフィボディZPDGFRβ:07591から選ばれる少なくとも1種であり、これらのアミノ酸配列は順次式(II~V)に示される。
Figure 2023537524000004
好ましくは、前記細胞毒素はエポチロンB及びその誘導体、メイタンシン及びその誘導体、ドラスタチン(MMAE)及びその誘導体から選ばれる少なくとも1種である。
好ましくは、前記小分子連結基はマレイミド末端を有する連結基であり、しかも、小分子連結基はマレイミドを介してアフィボディのメルカプトに連結される。
好ましくは、前記小分子連結基は以下の式(II)、式(III)、式(IV)から選ばれる少なくとも1種である。
Figure 2023537524000005
(ここで、R1は、-アルキル-C(O)NH-、-アルキル-SO2NH-又はC1~8アルコキシから選ばれ、R2はカルボキシル又はアシルクロリドから選ばれ、n、mはそれぞれ独立に2~10から選ばれ、
前記アルキルはC1~8アルキルから選ばれ、前記アルキル、アルコキシは無置換又は、ハロゲン、シアノ、アセチル、ヒドロキシ、メチロール、ヒドロキシエチル、カルボキシル、C1~8アルキル、C1~8アルコキシ、ハロゲン化C1~8アルキル、C3~8シクロアルキル、C3~8シクロアルコキシ、ハロゲン化C1~8アルコキシ、-C(O)C1-10アルキル、-C(O)OC1-10アルキル、-OC(O)C1-10アルキル、-CONRa0Rb0からなる群から選ばれる1、2、3個の置換基で置換され、Ra0、Rb0はそれぞれ独立に水素又はC1~8アルキルである。)
腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子は、上記のいずれか1項に記載の複合体を水媒体にて自己集合してなる。
好ましくは、前記ナノ粒子のシェルは能動標的化機能を有するアフィボディで構成され、前記ナノ粒子のコアは前記小分子連結基及び細胞毒素で構成され、前記ナノ粒子の粒径が200nm未満である。
腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子の調製方法であって、
ヒドロキシ及び/又はアミノ及び/又はメルカプトを含む疎水性細胞毒素と小分子連結基を結合して、エステル化、クリックなどの化学反応を行い、能動標的アフィボディとさらに結合反応し、能動標的化機能を有するアフィボディ-細胞毒素複合体を得るステップ(1)と、
所定量のステップ(1)の前記アフィボディ-細胞毒素複合体を所定の体積の有機溶媒に溶解し、室温でゆっくりと撹拌している超純水に滴下し、有機溶媒を除去し、能動標的化機能を有する複合体ナノ粒子水溶液を得るステップ(2)と、を含む。
好ましくは、ステップ(2)における有機溶媒はジメチルスルホキシド、N,N'-ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールから選ばれる少なくとも1種である。
上記のいずれか1項に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体、前記ナノ粒子又は前記の調製方法によって製造されたナノ粒子の、腫瘍能動標的治療薬の調製における使用。
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は以下の通りである。
本発明の腫瘍能動標的治療用の複合体は、腫瘍能動標的化機能を有する親水性アフィボディと疎水性抗腫瘍細胞毒素とが連結基を介して結合されたものであり、その中でも、アフィボディは58個のアミノ酸残基及び3個のα-螺旋構造を有し、複数種の腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体に対して特異的結合活性及び高親和性を有する一本鎖ポリペプチド分子である。
本発明の能動標的化機能を有するアフィボディ-細胞毒素複合体は水にて自己集合してナノ粒子を形成することができ、外層が能動標的化機能を有するアフィボディであり、腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体に高特異性で結合し、薬物の腫瘍部位への濃縮を増強し、薬物が効率的に腫瘍細胞に入るようにし、正常細胞及び組織に対する毒性及び副作用を低減させる。複合体ナノ粒子が腫瘍細胞に入ると、有機小分子連結基中のチオアセタール結合又はアミド結合が分解し、細胞毒素が放出されて、腫瘍細胞を殺滅し、これによって、正常細胞に対する毒性及び副作用を低減させ、癌を標的に治療する目的を達成させる。
もちろん、本発明の1つを実施するいずれかの製品は前記の全ての利点を有するものであるとは限らない。
実施例1における能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo BのMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例1における能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子の透過電子顕微鏡写真である。 実施例1における能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子の動的光散乱データ図である。 実施例2において得た中間体B-1の高解像率質量スペクトルである。 実施例2における能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-DM1のMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例3において能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-MMAEのMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例4において能動標的化機能を有する複合体ZEGFR:1907-DM1のMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例5において能動標的化機能を有する複合体ZEGFR:1907-MMAEのMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例6において能動標的化機能を有する複合体ZIGF1R:4551-DM1のMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例7において能動標的化機能を有する複合体ZIGF1R:4551-MMAEのMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例8において能動標的化機能を有する複合体ZPDGFRβ:07591-DM1のMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例9において能動標的化機能を有する複合体ZPDGFRβ:07591-MMAEのMaldi-Tof-MSスペクトルである。 実施例10において能動標的化機能を有する複合体ナノ粒子の腫瘍細胞成長への阻害作用の概略図である。 実施例11において能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子のSDラット体内の薬物動態学の概略図である。 実施例12において能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子を蛍光修飾したもののSKOV-3担癌ハダカネズミの長時間体内循環の場合の画像の概略図である。 実施例13において能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-MMAEナノ粒子で治療した担癌マウスの腫瘍体積変化の曲線図である。 実施例13において能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-MMAEナノ粒子で治療した担癌マウスの体重変化の曲線図である。 実施例13において能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-MMAEナノ粒子で治療した担癌マウスの治療効果図である。
本発明は、主に細胞毒素と能動標的化機能を有するアフィボディとを含み、前記細胞毒素と前記アフィボディが小分子連結基を介して共有結合してなる腫瘍能動標的機治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体を提供する。
アフィボディ(Affibody)は新規なアフィボディリガンドであり、その分子媒介性受容体結合領域の面積は8nmに達しており、抗原-抗体反応結合領域の面積と類似しており、相対分子質量が小さく、構造安定性が高く、「人工抗体」と呼ばれており、これらの独特な性質により生物学や免疫学などの分野で応用の将来性が期待されている。
アフィボディは58個のアミノ酸残基からなり、相対分子質量が約6.5×10Daであり、3個のα-螺旋構造を含む一本鎖ポリペプチド分子である。アフィボディは抗体と機能が類似しているだけでなく、抗体にはない次のような優位性を持っている。(1)相対分子質量が小さく、抗体分子の25分の1しかなく、安定性が非常に高く、調製が容易である。(2)高い選択性と親和性を有し、その親和性は最高で22pmol/Lである。(3)アミノ酸配列中にシステインを含まず、アフィボディ分子を調製する際にシステインを指向的に導入し、メルカプトと他の活性基との反応により有効負荷に結合させてもよい。(4)迅速に作用部位に局在化でき、かつ良好な組織透過能を持ち、一部の抗体分子では到達できない標的部位に到達することができる。
現在、アフィボディの応用分野は日増しに拡大しているが、アフィボディ-薬物複合体に関する研究報告はまだ少ない。アフィボディの独特な優位性は、それが高親和性標的分子として抗腫瘍薬物に連結し、腫瘍の能動標的治療を実現できることを可能にする。
従来技術では、細胞結合剤を介して細胞毒素と結合する例があり、細胞結合剤上の2-ヒドロキシエチルアミン基を含むアミノ酸は複数あり、化学反応の活性が制限されているため、各細胞結合剤で酸化されたアルデヒド基は全て細胞毒性剤と反応して結合するわけではなく、そのため、細胞結合剤分子ごとに担持される細胞毒性剤分子の数は不確定であり、この欠陥は必然的に最終産物のロット間の差をもたらすことができ、現在抗体薬物複合体(ADC)薬物において緊急に改善する必要があることでもある。
本発明は、アフィボディを標的ベクターとして、アフィボディ-細胞毒素複合体を調製する。まず、アフィボディ分子自体がシステインを含んでいないことから、アフィボディアミノ酸配列にシステイン分子を指向的に導入し、また細胞毒素をマレイミド化修飾し、その後、システインとマレイミドとのクリック反応により両者を結合させて、アフィボディ-細胞毒素複合体を得る。このような複合体では、1つのアフィボディ分子が1つの細胞毒素分子に結合するだけで、ADC薬物の担持率が不安定でロット間の差が大きいという欠点を回避することができる。また、複合体は両親媒性分子構造により水中で自己集合してナノ粒子を形成することができる。 この戦略は、細胞毒素に優れた能動標的化機能を与えるだけでなく、複合体ナノ薬物が有する受動標的化による腫瘍部位での濃縮の特徴(EPR効果)を付与し。効率的な標的性は担持された細胞毒素の生体に対する毒性及び副作用を効果的に低減させ、一方、ナノ化の特徴は複合体の生体内生物半減期を効果的に向上させるため、良好な臨床応用の将来性と巨大な市場価値がある。アフィボディは腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体を特異的に認識して結合することができるため、それで調製されたナノ粒子は腫瘍部位で有効に濃縮でき、そして連結基の生分解により、細胞毒素を放出し、有効な治療濃度にし、腫瘍の成長を阻害すると同時に、正常器官と組織に対する毒性及び副作用を低減させ、腫瘍の能動標的の正確な治療に新しい方案を提供する。
ここで、ヒト上皮成長因子受容体(HER)を標的とするアフィボディZHER2:342、ZEGFR:1907、ヒトインスリン様成長因子-1受容体を標的とするアフィボディZIGF1R:4551及びヒト血小板由来成長因子受容体βを標的とするアフィボディZPDGFRβ:07591は全て大腸菌の生物発酵と発現誘導を組み合わせた方法により調製される。例えばアフィボディZHER2:342アミノ酸配列から対応するDNA塩基配列を調製し、プラスミドに連結する。その後、組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)菌株に形質転換し、特定のプラスミド抵抗性スクリーニングによって、目的のアフィボディZHER2:342遺伝子を保有する大腸菌菌株を得る。その後、適量のこの菌株を2L培養瓶に入れて拡大培養し、一定濃度まで成長させると、誘導剤を加え、12h誘導発現した後、菌体を収集する。高圧ホモジナイザーを用いて菌体細胞を破砕し、遠心分離により上清を採取し、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーカラムにより分離精製してアフィボディZHER2:342溶離液を得、得られたアフィボディタンパク質溶離液を透析脱塩し(透析袋の分画分子量3.5kDa)、遠心濃縮後凍結乾燥し、綿状アフィボディZHER2:342タンパク質を得て、密封して保存する。
本明細書において、「ある数値から別の数値」で表される範囲は、本明細書においてその範囲内のすべての数値を1つずつ列挙することを避ける概略的な表示方法である。したがって、ある特定の数値範囲の記載は、当該数値範囲内の任意の数値及び当該数値範囲内の任意の数値により制限されたより小さい数値範囲を包含し、説明書に当該任意の数値及び当該より小さい数値範囲を明示的に記載すると同程度である。
以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の特許範囲を限定するものではない。実用においては当業者が本発明に基づいて行った改良及び調整はなお発明の特許範囲に属する。
Figure 2023537524000006
1.1 中間体A-1の合成
3,3’-プロパン-2,2-ジイルビス(スルファネジイル)ジプロピオン酸(TK、252.05mg)、1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボニルジイミド塩酸塩(EDCI、287.55mg)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、12.2mg)及び無水トリエチルアミン(TEA、0.28mL)を反応瓶に加え、無水ジクロロメタン25mLを加え、室温で1時間撹拌して反応させた後、エポチロンB(Epothilone B、507.27mg)を加え、次に、さらに室温で24時間撹拌して反応させた。反応終了後、脱イオン水20mLを加えて抽出し、有機相を収集し、体積比(20:1)のジクロロメタンとメタノールとの混合溶液を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより分離し、白色粉末状の中間体A-1(345.92mg、収率46.6%)を得た。中間体A-1のH NMRスペクトル中の各プロトンピークの帰属は以下のとおりである:δ(ppm from TMS),1H NMR (CDCl3,400 MHz) δ7.04 (1H, s), 6.82 (1H, bs), 5.34 (1H, dd), 5.26 (1H, dd),4.21 (1H, m), 4.19 (1H, bs), 3.56 (1H, dq), 2.93 (4H, m), 2.84 (1H, dd), 2.75 (3H, s), 2.69 (4H, m), 2.51 (1H, dd), 2.35 (1H, dd), 2.16 (1H, ddd), 2.12 (3H,d), 1.95 (1H, ddd), 1.74 (2H, m), 1.63 (6H, s), 1.35 (2H, m), 1.32 (3H, m), 1.30 (3H, s), 1.27 (3H, s), 1.16 (3H, d), 1.13 (3H, s), 0.97 (3H, d). HRMS (Esi-TOF, m/z) m/z [M+H]+ calcd: C36H55NO9S3: 742.3039,found: 742.3122.
1.2 中間体A-2の合成
中間体A-1(74.13mg)、N-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロ酢酸塩(38.12mg)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩(HATU、57.04mg)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、42 μL)を反応瓶に加え、無水ジクロロメタン20mLを加え、室温で6時間撹拌して反応させた。反応終了後、脱イオン水20mLを加えて抽出し、有機相を収集し、体積比(20:1)のジクロロメタンとメタノールの混合溶液を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより分離し、白色粉末状の中間体A-2(74.07mg、収率85.7%)を得た。
本実施例で調製された中間体A-2のH NMRスペクトル中の各プロトンピークの帰属は以下のとおりである:δ (ppm from TMS), 1H NMR (CDCl3,400 MHz) 7.01 (1H, s), 6.74 (1H, s), 6.64 (1H, bs), 5.49 (1H, dd ), 5.33(1H, dd ), 4.28 (1H, bs), 4.12 (1H, m), 3.75 (1H, m), 3.71 (2H, t), 3.50 (2H, t), 3.20 (1H, dq), 2.90 (4H, m), 2.84 (1H, dd), 2.72 (3H, s), 2.67 (2H, t), 2.58 (1H, dd), 2.49 (1H, dd), 2.44 (2H, t), 2.18 (1H, d), 2.12 (3H, d), 1.97 (1H, d), 1.68 (2H, m), 1.60 (6H, s). 1.47 (2H, m), 1.44 (3H, m), 1.38 (3H, s), 1.29 (3H, s), 1.16 (3H, d), 1.09 (3H, s), 0.94 (3H, d).
1.3 複合体ZHER2:342-Epo Bの合成
アフィボディZHER2:342(10mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体A-2(1.22mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥させて白色棉状の複合体ZHER2:342-Epo Bを得た。
図1に示す本実施例で調製された複合体ZHER2:342-Epo BのMaldi-Tof-MS質量スペクトルデータのように、生成物分子量の単一ピークが7941.47に現れ、理論分子量の7942.21とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZHER2:342-Epo Bをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。図2に示す、本実施例で調製した複合体ZHER2:342-Epo B抗腫瘍ナノ粒子に基づく透過電子顕微鏡写真のように、ナノ粒子の平均粒径サイズは100nm程度であり、図3に示す動的光散乱データのように、ナノ粒子の平均粒径サイズは100nm程度であり、透過電子顕微鏡写真データとほぼ一致する。
本実施例のZHER2:342-Epo B抗腫瘍ナノ粒子は良好な均一性を有し、ナノ粒子を調製するときのロッド間のばらつきを効果的に低下させ、その品質安定性を向上させ、また、良好な均一性により薬物ナノ粒子が生体内で循環するときに、薬物動態学挙動及び体内代謝経路が一致し、これは臨床評価に有利である。
Figure 2023537524000007
2.1 中間体B-1の合成
N2’-デアセチル-N2’-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メイタンシン(DM1、737.2mg)、エチルビスマレイミド(1.1 g)、を反応瓶に加え、メタノール50mLを加え、室温で12時間撹拌して反応させた。反応終了後、回転蒸発して濃縮させ、体積比(20:1)のジクロロメタンとメタノールの混合溶液を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより分離し、淡黄色粉末状の中間体B-1(883.4mg、収率92.3%)を得た。
図4に示す本実施例で調製した中間体B-1のマススペクトルのように、HRMS (Esi-TOF, m/z)m/z [M+H]+ calcd:C45H56ClN5O14S: 958.3233,found: 958.3330である。
2.2 複合体ZHER2:342-DM1の合成
アフィボディZHER2:342(10mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体B-1(1.35mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZHER2:342-DM1を得た。
図5に示す本実施例で調製した複合体ZHER2:342-DM1のMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが8030.09に現れ、理論分子量8038.25とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZHER2:342-DM1をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZHER2:342-DM1抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000008
3.1 複合体ZHER2:342-MMAEの合成
アフィボディZHER2:342 (10mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体mc-vc-PAB-MMAE(1.85mg、南京康満林生物医薬科技有限公司より購入)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZHER2:342-MMAEを得た。
図6に示す本実施例で調製した複合体ZHER2:342-MMAEのMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが8370.53に現れ、理論分子量8393.63とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZHER2:342-MMAEをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZHER2:342-MMAE抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000009
4.1 複合体ZEGFR:1907-DM1の合成
アフィボディZEGFR:1907(12.3mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体B-1(1.35mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZEGFR:1907-DM1を得た。
図7に示す本実施例で調製した複合体ZEGFR:1907-DM1のMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが10382.53に現れ、理論分子量10445.32とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZEGFR:1907-DM1をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZEGFR:1907-DM1抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000010
5.1 複合体ZEGFR:1907-MMAEの合成
アフィボディZEGFR:1907(12.3mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体mc-vc-PAB-MMAE(1.85mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZEGFR:1907-MMAEを得た。
図8に示す本実施例で調製した複合体ZEGFR:1907-MMAEのMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが10736.46に現れ、理論分子量10803.53とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZEGFR:1907-MMAEをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZEGFR:1907-MMAE抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000011
6.1 複合体ZIGF1R:4551-DM1の合成
アフィボディZIGF1R:4551(12.8mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体B-1(1.35mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZIGF1R:4551-DM1を得た。
図9に示す本実施例で調製した複合体ZIGF1R:4551-DM1のMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが10083.02に現れ、理論分子量10040.25とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZIGF1R:4551-DM1をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZIGF1R:4551-DM1抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000012
7.1 複合体ZIGF1R:4551-MMAEの合成
アフィボディZIGF1R:4551(12.8mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体mc-vc-PAB-MMAE(1.85mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZIGF1R:4551-MMAEを得た。
図10に示す本実施例で調製した複合体ZIGF1R:4551-MMAEのMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが10271.08に現れ、理論分子量10398.56とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZIGF1R:4551-MMAEをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZIGF1R:4551-MMAE抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000013
8.1 複合体ZPDGFRβ:07591-DM1の合成
アフィボディZPDGFRβ:07591(13.4mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体B-1(1.35mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZPDGFRβ:07591-DM1を得た。
図11に示す本実施例で調製した複合体ZPDGFRβ:07591-DM1のMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが10474.61に現れ、理論分子量10456.72とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZPDGFRβ:07591-DM1をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZPDGFRβ:07591-DM1抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
Figure 2023537524000014
9.1 複合体ZPDGFRβ:07591-MMAEの合成
アフィボディZPDGFRβ:07591(13.4mg)をPBS溶液5mLに溶解し、次に、中間体mc-vc-PAB-MMAE(1.85mg)をジメチルスルホキシド150μLに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと1滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら12時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ZPDGFRβ:07591-MMAEを得た。
図12に示す本実施例で調製した複合体ZPDGFRβ:07591-MMAEのMaldi-Tof質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが10737.24に現れ、理論分子量10815.03とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ZPDGFRβ:07591-MMAEをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ZPDGFRβ:07591-MMAE抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは100nm程度である。
実施例10
本実施例は、腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子の癌細胞に対する作用の実験を提供した。
実施例1~9で調製したアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子をそれぞれ細胞培養液で濃度0.1、0.5、1、2.5、5、10、20、40、50nmol/Lの溶液にし、その後、それぞれSKOV-3細胞(卵巣癌細胞系)、A431細胞(上皮癌細胞系)、A549細胞(肺癌細胞系)及びU87細胞(脳膠腫細胞系)を48時間培養した後、MTT方法によって細胞活性をテトスし、その結果を図13のA、B、C、Dに示す。
アフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子の濃度が10nmol/Lになると、癌細胞増殖が明らかに阻害され、アフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子は癌細胞に対する阻害作用が濃度に比例する。このことから、実施例1~9で調製されたアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子は悪性腫瘍の治療において応用価値が期待できることが示された。
実施例11
本実施例は腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子のSDラット体内の薬物動態学実験を提供した。
Cy5.5(メロシアニン染料5.5)を体内の蛍光プローブ分子として、Cy5.5を実施例1で得た、能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子の表面に共有修飾し、ナノ粒子の体内薬物動態学特性を評価した。
SDラット(~200g)2匹を実験群として、Cy5.5共有修飾ZHER2:342-Epo Bナノ粒子200μLをそれぞれ尾静脈注射し、所定の時点(15min、30min、1h、2h、4h、8h、及び12h)に、ラットの眼窩から約0.5mLの血液をヘパリンナトリウム入り試験管に採取した後、4℃の冷蔵庫に保存した。全てのデータ点について採取した後、全ての血液サンプルを3000rpmで10min遠心分離し、上層血清のサンプルを得た。各時点に血清200μLを採取し、蛍光スペクトルによりそのCy5.5含有量を分析し、換算して対応するZHER2:342-Epo Bの含有量を得た。
その結果、図14に示すように、図から、ZHER2:342-Epo Bナノ粒子の血液半減期は約6hであることが推定され、その値は一般的な小分子抗腫瘍薬の血液半減期(例えば、現在臨床の化学療法の第一線抗癌薬であるパクリタキセルのラット体内の血液半減期は1.1hしかない)よりも大幅に大きかった。ラットにZHER2:342-Epo Bナノ粒子を尾静脈注射してから12h後にも、その血液中のZHER2:342-Epo Bナノ粒子は5.6μg/mLの高濃度を維持しており、このことから、ZHER2:342-Epo Bナノ粒子は血液循環系に効果的に保留され、長い血液滞留時間はより多くのZHER2:342-Epo Bナノ粒子の腫瘍部位への濃縮にも有利であり、これによって、高い抗腫瘍効果が得られた。
実施例12
本実施例は腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子の担癌ハダカネズミ体内の長時間循環の場合の画像の概略図を提供する。
Cy5.5(メロシアニン染料5.5)を体内の蛍光プローブ分子として、Cy5.5を実施例1で得た能動標的化機能を有する複合体ZHER2:342-Epo Bナノ粒子の表面に共有修飾し、ナノ粒子の体内循環時間及び標的効果を評価した。濃度4.0×10個/mLの対数成長期のSKOV-3細胞の細胞懸濁液を調製し、ハダカネズミの右前腋窩皮下に1匹ずつ200μL摂取し、腫瘍体積が約500mmになると、それぞれ2匹のマウスをランダムに選択して、対照群及び実験群とした。実験群では、Cy5.5共有修飾ZHER2:342-Epo Bナノ粒子200μL、対照群では、Cy5.5溶液(実験群溶液と対照群溶液中のCy5.5含有量は同じ)200μLを注射した。4h、12h注射後、ZKKS-Mulaurora画像形成システムにより撮影し、マウス全身の蛍光強度を分析した。
その結果、図15に示すように、小分子Cy5.5は、4時間注射後、マウスの体内では明らかな存在が認められず、12h後にはほぼ完全に代謝されており、一方、ZHER2:342-Epo Bナノ粒子は、4時間注射後、腫瘍部位に明らかに濃縮され、また他の臓器では明らかな存在が認められず、マウスの体内で12h循環した後にも、腫瘍部位では明らかな蛍光信号が観察された。その結果から、このアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子は優れた腫瘍標的性を有するとともに、体内で長時間循環が可能であり、腫瘍治療において応用価値が期待できる。
実施例13
本実施例は腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ZHER2:342-MMAEナノ粒子の、担癌ハダカネズミに対する腫瘍治療効果図を提供した。
濃度4.0×10個/mLの対数成長期のSKOV-3細胞の細胞懸濁液を調製し、ハダカネズミの右前腋窩皮下に1匹ずつ200μL接種し、腫瘍体積が約100mmになると、5匹ずつランダムに4群に分け、それぞれPBS対照群、MMAE 0.6mg/kg群、ZHER2:342-MMAEナノ粒子(MMAE含有量0.4mg/kg)群、ZHER2:342-MMAEナノ粒子(MMAE含有量0.6mg/kg)群とし、これらのうち、PBS群では200 μl PBS、MMAE 0.6mg/kg群ではMMAE 0.6mg/kg、ZHER2:342-MMAE(MMAE含有量0.4mg/kg)群ではZHER2:342-MMAE(含MMAE 0.4mg/kg)、ZHER2:342-MMAE(MMAE含有量0.6mg/kg)群ではZHER2:342-MMAE(含MMAE 0.6mg/kg)を3日ごとに1回注射した。投与後に担癌ハダカネズミの生存を観察し、マウスの体重及び腫瘍のサイズを測定して、写真を撮って保存した。
実験の結果、図16、17、18に示すように、PBS対照群ではマウスの腫瘍が迅速に増大し、MMAE 0.6mg/kg群では、マウスへ投与した後、体重が急に低下し、3回投与後、全部が死亡し、この結果から、MMAE有効成分には強烈な毒性及び副作用があり、また、担癌マウスは、ZHER2:342-MMAEナノ粒子(MMAE含有量0.4mg/kg)で治療したところ、腫瘍体積が明らかに減少し、投与量が0.6mg/kgに増加すると、担癌マウスの腫瘍体積が明らかに減少し、最後にほぼ消えており、しかも、生存状態が良好である。
この結果から明らかに、アフィボディ-細胞毒素複合体ZHER2:342-MMAEナノ粒子では、その標的性によって、優れた生体内抗腫瘍効果が得られるとともに、MMAEの毒性及び副作用が明らかに低減した。優れた抗腫瘍効果及び良好な生物学的安全性から、アフィボディ-細胞毒素複合体は市場での将来性が期待できる抗体-薬物結合による新規剤形であることが証明された。
以上の開示は本発明の好適な実施例に過ぎない。好適な実施例では全て詳細が説明されておらず、また、本発明は前記具体的な実施形態に限定されるものではない。明らかなに、本明細書の内容に基づいて多くの修正や変化が可能である。本明細書では、これらの実施例を選択して具体的に説明するのは、本発明の原理及び実際の適用をより良好に説明し、当業者であれば本発明を良好に利用できるようにするためである。本発明は特許請求の範囲及びその範囲全体や等価物により制限される。
本発明及び上記の実施例に基づいて、本発明に挙げられる又は例示された各原料又はその等同物、各加工方法又はその等同物のいずれも本発明を実現することができ、また、各原料及び加工方法のパラメータの上限値と下限値、区間の値が全て本発明を実現することができることを当業者が容易に予測できるので、ここでは実施例を一々例示していない。

Claims (10)

  1. 腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体であって、主に細胞毒素と能動標的化機能を有するアフィボディとを含み、前記細胞毒素と前記アフィボディが小分子連結基を介して共有結合されてなることを特徴とする複合体。
    (ここで、Aはアフィボディであり、Lは有機小分子連結基であり、
    は細胞毒素である。)
  2. 前記アフィボディはヒト上皮成長因子受容体を標的とするアフィボディ ZHER2:342又はZEGFR:1907、ヒトインスリン様成長因子受容体を標的とするアフィボディZIGF1R:4551又はヒト血小板由来成長因子受容体βを標的とするアフィボディZPDGFRβ:07591から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体。
  3. 前記細胞毒素はエポチロンB及びその誘導体、メイタンシン及びその誘導体、ドラスタチン及びその誘導体から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体。
  4. 前記小分子連結基は以下の式(II)、式(III)、式(IV)から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体。
    Figure 2023537524000017
    (ここで、R1は-アルキル-C(O)NH-、-アルキル-SONH-又はC1~8アルコキシから選ばれ、R2はカルボキシル又はアシルクロリドから選ばれ、n、mはそれぞれ独立に2~10から選ばれ、
    前記アルキルはC1~8アルキルから選ばれ、前記アルキル、アルコキシは無置換又は、ハロゲン、シアノ、アセチル、ヒドロキシ、メチロール、ヒドロキシエチル、カルボキシル、C1~8アルキル、C1~8アルコキシ、ハロゲン化C1~8アルキル、C3~8シクロアルキル、C3~8シクロアルコキシ、ハロゲン化C1~8アルコキシ、-C(O)C1-10アルキル、-C(O)OC1-10アルキル、-OC(O)C1-10アルキル、-CONRa0b0からなる群から選ばれる1、2、3個の置換基で置換され、Ra0、Rb0はそれぞれ独立に水素又はC1~8アルキルである。)
  5. 以下の構造のうちの1種であることを特徴とする請求項1に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体。
    Figure 2023537524000018
    Figure 2023537524000019
  6. 請求項1~5のいずれか1項に記載の前記複合体を水媒体にて自己集合してなることを特徴とする腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子。
  7. 前記ナノ粒子のシェルは能動標的化機能を有するアフィボディで構成され、前記ナノ粒子のコアは前記小分子連結基及び細胞毒素で構成され、前記ナノ粒子の粒径が200nm未満であることを特徴とする請求項6に記載のナノ粒子。
  8. ヒドロキシ及び/又はアミノ及び/又はメルカプトを含む疎水性細胞毒素と小分子連結基を結合して、能動標的アフィボディとさらに結合反応し、能動標的化機能を有するアフィボディ-細胞毒素複合体を得るステップ(1)と、
    所定量のステップ(1)の前記アフィボディ-細胞毒素複合体を所定の体積の有機溶媒に溶解し、室温でゆっくりと撹拌している超純水に滴下し、有機溶媒を除去し、能動標的化機能を有する複合体ナノ粒子水溶液を得るステップ(2)と、を含むことを特徴とする腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体ナノ粒子の調製方法。
  9. ステップ(2)における有機溶媒はジメチルスルホキシド、N,N'-ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールから選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項8に記載の調製方法。
  10. 請求項1~5のいずれか1項に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ-細胞毒素複合体、又は請求項6又は7に記載のナノ粒子又は請求項8又は9に記載の調製方法によって製造された前記ナノ粒子の、腫瘍能動標的治療薬の調製における使用。
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