JP2023537524A - 腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体及びそのナノ粒子、調製方法、使用 - Google Patents

腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体及びそのナノ粒子、調製方法、使用 Download PDF

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Abstract

本発明に係る腫瘍能動標的治療用の複合体は腫瘍能動標的化機能を有する親水性アフィボディと疎水性抗腫瘍細胞毒素とが小分子連結基を介して結合されてなり、アフィボディは複数種の腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体に対して特異的結合活性と高親和性を有し、細胞毒素は効果的な抗腫瘍薬である。そのナノ粒子、調製方法及びその使用をさらに開示する。本発明に係るアフィボディ－細胞毒素複合体は水中で自己集合されてアフィボディをシェル、細胞毒素をコアとするナノ粒子を形成することができ、アフィボディが腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体を特異的に認識して結合し得るので、該ナノ粒子は腫瘍部位に効果的に濃縮され、連結基を介して生分解され、細胞毒素を放出して、有効治療濃度になり、これによって、腫瘍成長を阻害するとともに、正常器官や組織に対する毒性及び副作用を低減させ、腫瘍を能動でかつ標的に治療するための新しい手段を提供する。【選択図】図１６

Description

本発明はバイオ・ナノ医薬の技術分野に関し、特に腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体及びそのナノ粒子の調製方法と使用に関する。
悪性腫瘍（がん）は人間の生存と社会の発展を深刻に危うくする重大な疾患であり、すでに全世界で解決すべき難題及び重大な挑戦となっている。現在、化学療法は癌治療の主要な手段であり、小分子細胞毒素は構造が明確で、透過性が高く、細胞毒性が強いなどの優位性を持っているが、その分子量が比較的に小さく、標的特異性が欠損しているため、投与後に生体に素早く代謝され、しかも生体の深刻な毒性や副作用を引き起こすことが多く、臨床応用は制限されている。
抗体－薬物複合体（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）技術はモノクローナル抗体の標的選択性と小分子細胞毒素の高効率を結合し、腫瘍の「精密医療」のための新しい方法を提供した。新しい腫瘍治療薬として、ＡＤＣの研究開発は広く注目されているだけでなく、すでに臨床に応用されている製品もある。しかし、現在のＡＤＣ薬物はまだ以下のような多くの欠陥が存在している。（１）抗体分子量が大きすぎ（１．５×１０５Ｄａ）、薬物の腫瘍内部の浸透率が非常に低くなる。（２）抗体表面と小分子細胞毒素の結合部位の数が不確定であるため、ロット間の担持率が一致せず、均一な製品を得ることが困難である。（３）エンドサイトーシス率及び抗体媒介生物効果を更に高めるための高品質の標的及び好適な抗体がない。このため、以上の欠陥をどのように克服し、薬物送達比が高く、細胞毒素を均一に担持したＡＤＣ薬物を開発するかは急務となっている。これに基づいて、他の親和性がより強く、腫瘍組織又は細胞に対する選択性がより高く、しかも細胞毒素と均一に結合できる標的ベクターを使用して、新規な能動標的抗腫瘍薬を開発する試みは必要であるだけでなく、科学的意義と臨床応用価値も大きい。
本発明は従来技術における上記欠陥を解決することができる腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体を提供することである。
本発明の技術的解決手段は以下のとおりである。
腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体であって、主に細胞毒素と能動標的化機能を有するアフィボディを含み、前記細胞毒素と前記アフィボディが小分子連結基を介して共有結合されてなる。
（ここで、Ａはアフィボディであり、Ｌは有機小分子連結基であり、
は細胞毒素である。）
好ましくは、前記アフィボディは、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）を標的とするアフィボディ ＺＨＥＲ２：３４２、ＺＥＧＦＲ：１９０７、ヒトインスリン様成長因子－１受容体を標的とするアフィボディ ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１及びヒト血小板由来成長因子受容体βを標的とするアフィボディＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１から選ばれる少なくとも１種であり、これらのアミノ酸配列は順次式（ＩＩ～Ｖ）に示される。
Figure 2023537524000004
好ましくは、前記細胞毒素はエポチロンＢ及びその誘導体、メイタンシン及びその誘導体、ドラスタチン（ＭＭＡＥ）及びその誘導体から選ばれる少なくとも１種である。
好ましくは、前記小分子連結基はマレイミド末端を有する連結基であり、しかも、小分子連結基はマレイミドを介してアフィボディのメルカプトに連結される。
好ましくは、前記小分子連結基は以下の式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）から選ばれる少なくとも１種である。
Figure 2023537524000005
（ここで、Ｒ１は、－アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－アルキル－ＳＯ２ＮＨ－又はＣ１～８アルコキシから選ばれ、Ｒ２はカルボキシル又はアシルクロリドから選ばれ、ｎ、ｍはそれぞれ独立に２～１０から選ばれ、
前記アルキルはＣ１～８アルキルから選ばれ、前記アルキル、アルコキシは無置換又は、ハロゲン、シアノ、アセチル、ヒドロキシ、メチロール、ヒドロキシエチル、カルボキシル、Ｃ１～８アルキル、Ｃ１～８アルコキシ、ハロゲン化Ｃ１～８アルキル、Ｃ３～８シクロアルキル、Ｃ３～８シクロアルコキシ、ハロゲン化Ｃ１～８アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－１０アルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＣ１－１０アルキル、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－１０アルキル、－ＣＯＮＲａ０Ｒｂ０からなる群から選ばれる１、２、３個の置換基で置換され、Ｒａ０、Ｒｂ０はそれぞれ独立に水素又はＣ１～８アルキルである。）
腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子は、上記のいずれか１項に記載の複合体を水媒体にて自己集合してなる。
好ましくは、前記ナノ粒子のシェルは能動標的化機能を有するアフィボディで構成され、前記ナノ粒子のコアは前記小分子連結基及び細胞毒素で構成され、前記ナノ粒子の粒径が２００ｎｍ未満である。
腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子の調製方法であって、
ヒドロキシ及び／又はアミノ及び／又はメルカプトを含む疎水性細胞毒素と小分子連結基を結合して、エステル化、クリックなどの化学反応を行い、能動標的アフィボディとさらに結合反応し、能動標的化機能を有するアフィボディ－細胞毒素複合体を得るステップ（１）と、
所定量のステップ（１）の前記アフィボディ－細胞毒素複合体を所定の体積の有機溶媒に溶解し、室温でゆっくりと撹拌している超純水に滴下し、有機溶媒を除去し、能動標的化機能を有する複合体ナノ粒子水溶液を得るステップ（２）と、を含む。
好ましくは、ステップ（２）における有機溶媒はジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ'－ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールから選ばれる少なくとも１種である。
上記のいずれか１項に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体、前記ナノ粒子又は前記の調製方法によって製造されたナノ粒子の、腫瘍能動標的治療薬の調製における使用。
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は以下の通りである。
本発明の腫瘍能動標的治療用の複合体は、腫瘍能動標的化機能を有する親水性アフィボディと疎水性抗腫瘍細胞毒素とが連結基を介して結合されたものであり、その中でも、アフィボディは５８個のアミノ酸残基及び３個のα－螺旋構造を有し、複数種の腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体に対して特異的結合活性及び高親和性を有する一本鎖ポリペプチド分子である。
本発明の能動標的化機能を有するアフィボディ－細胞毒素複合体は水にて自己集合してナノ粒子を形成することができ、外層が能動標的化機能を有するアフィボディであり、腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体に高特異性で結合し、薬物の腫瘍部位への濃縮を増強し、薬物が効率的に腫瘍細胞に入るようにし、正常細胞及び組織に対する毒性及び副作用を低減させる。複合体ナノ粒子が腫瘍細胞に入ると、有機小分子連結基中のチオアセタール結合又はアミド結合が分解し、細胞毒素が放出されて、腫瘍細胞を殺滅し、これによって、正常細胞に対する毒性及び副作用を低減させ、癌を標的に治療する目的を達成させる。
もちろん、本発明の１つを実施するいずれかの製品は前記の全ての利点を有するものであるとは限らない。
実施例１における能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ ＢのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例１における能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の透過電子顕微鏡写真である。 実施例１における能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の動的光散乱データ図である。 実施例２において得た中間体Ｂ－１の高解像率質量スペクトルである。 実施例２における能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例３において能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例４において能動標的化機能を有する複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例５において能動標的化機能を有する複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例６において能動標的化機能を有する複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例７において能動標的化機能を有する複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例８において能動標的化機能を有する複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例９において能動標的化機能を有する複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳスペクトルである。 実施例１０において能動標的化機能を有する複合体ナノ粒子の腫瘍細胞成長への阻害作用の概略図である。 実施例１１において能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子のＳＤラット体内の薬物動態学の概略図である。 実施例１２において能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子を蛍光修飾したもののＳＫＯＶ－３担癌ハダカネズミの長時間体内循環の場合の画像の概略図である。 実施例１３において能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子で治療した担癌マウスの腫瘍体積変化の曲線図である。 実施例１３において能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子で治療した担癌マウスの体重変化の曲線図である。 実施例１３において能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子で治療した担癌マウスの治療効果図である。
本発明は、主に細胞毒素と能動標的化機能を有するアフィボディとを含み、前記細胞毒素と前記アフィボディが小分子連結基を介して共有結合してなる腫瘍能動標的機治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体を提供する。
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）は新規なアフィボディリガンドであり、その分子媒介性受容体結合領域の面積は８ｎｍ２に達しており、抗原－抗体反応結合領域の面積と類似しており、相対分子質量が小さく、構造安定性が高く、「人工抗体」と呼ばれており、これらの独特な性質により生物学や免疫学などの分野で応用の将来性が期待されている。
アフィボディは５８個のアミノ酸残基からなり、相対分子質量が約６．５×１０３Ｄａであり、３個のα－螺旋構造を含む一本鎖ポリペプチド分子である。アフィボディは抗体と機能が類似しているだけでなく、抗体にはない次のような優位性を持っている。（１）相対分子質量が小さく、抗体分子の２５分の１しかなく、安定性が非常に高く、調製が容易である。（２）高い選択性と親和性を有し、その親和性は最高で２２ｐｍｏｌ／Ｌである。（３）アミノ酸配列中にシステインを含まず、アフィボディ分子を調製する際にシステインを指向的に導入し、メルカプトと他の活性基との反応により有効負荷に結合させてもよい。（４）迅速に作用部位に局在化でき、かつ良好な組織透過能を持ち、一部の抗体分子では到達できない標的部位に到達することができる。
現在、アフィボディの応用分野は日増しに拡大しているが、アフィボディ－薬物複合体に関する研究報告はまだ少ない。アフィボディの独特な優位性は、それが高親和性標的分子として抗腫瘍薬物に連結し、腫瘍の能動標的治療を実現できることを可能にする。
従来技術では、細胞結合剤を介して細胞毒素と結合する例があり、細胞結合剤上の２－ヒドロキシエチルアミン基を含むアミノ酸は複数あり、化学反応の活性が制限されているため、各細胞結合剤で酸化されたアルデヒド基は全て細胞毒性剤と反応して結合するわけではなく、そのため、細胞結合剤分子ごとに担持される細胞毒性剤分子の数は不確定であり、この欠陥は必然的に最終産物のロット間の差をもたらすことができ、現在抗体薬物複合体（ＡＤＣ）薬物において緊急に改善する必要があることでもある。
本発明は、アフィボディを標的ベクターとして、アフィボディ－細胞毒素複合体を調製する。まず、アフィボディ分子自体がシステインを含んでいないことから、アフィボディアミノ酸配列にシステイン分子を指向的に導入し、また細胞毒素をマレイミド化修飾し、その後、システインとマレイミドとのクリック反応により両者を結合させて、アフィボディ－細胞毒素複合体を得る。このような複合体では、１つのアフィボディ分子が１つの細胞毒素分子に結合するだけで、ＡＤＣ薬物の担持率が不安定でロット間の差が大きいという欠点を回避することができる。また、複合体は両親媒性分子構造により水中で自己集合してナノ粒子を形成することができる。 この戦略は、細胞毒素に優れた能動標的化機能を与えるだけでなく、複合体ナノ薬物が有する受動標的化による腫瘍部位での濃縮の特徴（ＥＰＲ効果）を付与し。効率的な標的性は担持された細胞毒素の生体に対する毒性及び副作用を効果的に低減させ、一方、ナノ化の特徴は複合体の生体内生物半減期を効果的に向上させるため、良好な臨床応用の将来性と巨大な市場価値がある。アフィボディは腫瘍細胞の表面で過剰発現する受容体を特異的に認識して結合することができるため、それで調製されたナノ粒子は腫瘍部位で有効に濃縮でき、そして連結基の生分解により、細胞毒素を放出し、有効な治療濃度にし、腫瘍の成長を阻害すると同時に、正常器官と組織に対する毒性及び副作用を低減させ、腫瘍の能動標的の正確な治療に新しい方案を提供する。
ここで、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）を標的とするアフィボディＺＨＥＲ２：３４２、ＺＥＧＦＲ：１９０７、ヒトインスリン様成長因子－１受容体を標的とするアフィボディＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１及びヒト血小板由来成長因子受容体βを標的とするアフィボディＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１は全て大腸菌の生物発酵と発現誘導を組み合わせた方法により調製される。例えばアフィボディＺＨＥＲ２：３４２アミノ酸配列から対応するＤＮＡ塩基配列を調製し、プラスミドに連結する。その後、組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換し、特定のプラスミド抵抗性スクリーニングによって、目的のアフィボディＺＨＥＲ２：３４２遺伝子を保有する大腸菌菌株を得る。その後、適量のこの菌株を２Ｌ培養瓶に入れて拡大培養し、一定濃度まで成長させると、誘導剤を加え、１２ｈ誘導発現した後、菌体を収集する。高圧ホモジナイザーを用いて菌体細胞を破砕し、遠心分離により上清を採取し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにより分離精製してアフィボディＺＨＥＲ２：３４２溶離液を得、得られたアフィボディタンパク質溶離液を透析脱塩し（透析袋の分画分子量３．５ｋＤａ）、遠心濃縮後凍結乾燥し、綿状アフィボディＺＨＥＲ２：３４２タンパク質を得て、密封して保存する。
本明細書において、「ある数値から別の数値」で表される範囲は、本明細書においてその範囲内のすべての数値を１つずつ列挙することを避ける概略的な表示方法である。したがって、ある特定の数値範囲の記載は、当該数値範囲内の任意の数値及び当該数値範囲内の任意の数値により制限されたより小さい数値範囲を包含し、説明書に当該任意の数値及び当該より小さい数値範囲を明示的に記載すると同程度である。
以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の特許範囲を限定するものではない。実用においては当業者が本発明に基づいて行った改良及び調整はなお発明の特許範囲に属する。
Figure 2023537524000006
１．１ 中間体Ａ－１の合成
３，３’－プロパン－２，２－ジイルビス（スルファネジイル）ジプロピオン酸（ＴＫ、２５２．０５ｍｇ）、１－エチル－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボニルジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ、２８７．５５ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１２．２ｍｇ）及び無水トリエチルアミン（ＴＥＡ、０．２８ｍＬ）を反応瓶に加え、無水ジクロロメタン２５ｍＬを加え、室温で１時間撹拌して反応させた後、エポチロンＢ（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ、５０７．２７ｍｇ）を加え、次に、さらに室温で２４時間撹拌して反応させた。反応終了後、脱イオン水２０ｍＬを加えて抽出し、有機相を収集し、体積比（２０：１）のジクロロメタンとメタノールとの混合溶液を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより分離し、白色粉末状の中間体Ａ－１（３４５．９２ｍｇ、収率４６．６％）を得た。中間体Ａ－１の１Ｈ ＮＭＲスペクトル中の各プロトンピークの帰属は以下のとおりである：δ(ppm from TMS),1H NMR (CDCl3,400 MHz) δ7.04 (1H, s), 6.82 (1H, bs), 5.34 (1H, dd), 5.26 (1H, dd),4.21 (1H, m), 4.19 (1H, bs), 3.56 (1H, dq), 2.93 (4H, m), 2.84 (1H, dd), 2.75 (3H, s), 2.69 (4H, m), 2.51 (1H, dd), 2.35 (1H, dd), 2.16 (1H, ddd), 2.12 (3H,d), 1.95 (1H, ddd), 1.74 (2H, m), 1.63 (6H, s), 1.35 (2H, m), 1.32 (3H, m), 1.30 (3H, s), 1.27 (3H, s), 1.16 (3H, d), 1.13 (3H, s), 0.97 (3H, d). HRMS (Esi-TOF, m/z) m/z [M+H]+ calcd: C36H55NO9S3: 742.3039,found: 742.3122.
１．２ 中間体Ａ－２の合成
中間体Ａ－１（７４．１３ｍｇ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（３８．１２ｍｇ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ,Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ、５７．０４ｍｇ）及びＮ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、４２ μＬ）を反応瓶に加え、無水ジクロロメタン２０ｍＬを加え、室温で６時間撹拌して反応させた。反応終了後、脱イオン水２０ｍＬを加えて抽出し、有機相を収集し、体積比（２０：１）のジクロロメタンとメタノールの混合溶液を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより分離し、白色粉末状の中間体Ａ－２（７４．０７ｍｇ、収率８５．７％）を得た。
本実施例で調製された中間体Ａ－２の１Ｈ ＮＭＲスペクトル中の各プロトンピークの帰属は以下のとおりである：δ (ppm from TMS), 1H NMR (CDCl3,400 MHz) 7.01 (1H, s), 6.74 (1H, s), 6.64 (1H, bs), 5.49 (1H, dd ), 5.33(1H, dd ), 4.28 (1H, bs), 4.12 (1H, m), 3.75 (1H, m), 3.71 (2H, t), 3.50 (2H, t), 3.20 (1H, dq), 2.90 (4H, m), 2.84 (1H, dd), 2.72 (3H, s), 2.67 (2H, t), 2.58 (1H, dd), 2.49 (1H, dd), 2.44 (2H, t), 2.18 (1H, d), 2.12 (3H, d), 1.97 (1H, d), 1.68 (2H, m), 1.60 (6H, s). 1.47 (2H, m), 1.44 (3H, m), 1.38 (3H, s), 1.29 (3H, s), 1.16 (3H, d), 1.09 (3H, s), 0.94 (3H, d).
１．３ 複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂの合成
アフィボディＺＨＥＲ２：３４２（１０ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体Ａ－２（１．２２ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥させて白色棉状の複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂを得た。
図１に示す本実施例で調製された複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ ＢのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ－ＭＳ質量スペクトルデータのように、生成物分子量の単一ピークが７９４１．４７に現れ、理論分子量の７９４２．２１とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。図２に示す、本実施例で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂ抗腫瘍ナノ粒子に基づく透過電子顕微鏡写真のように、ナノ粒子の平均粒径サイズは１００ｎｍ程度であり、図３に示す動的光散乱データのように、ナノ粒子の平均粒径サイズは１００ｎｍ程度であり、透過電子顕微鏡写真データとほぼ一致する。
本実施例のＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂ抗腫瘍ナノ粒子は良好な均一性を有し、ナノ粒子を調製するときのロッド間のばらつきを効果的に低下させ、その品質安定性を向上させ、また、良好な均一性により薬物ナノ粒子が生体内で循環するときに、薬物動態学挙動及び体内代謝経路が一致し、これは臨床評価に有利である。
Figure 2023537524000007
２．１ 中間体Ｂ－１の合成
Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）メイタンシン（ＤＭ１、７３７．２ｍｇ）、エチルビスマレイミド（１．１ ｇ）、を反応瓶に加え、メタノール５０ｍＬを加え、室温で１２時間撹拌して反応させた。反応終了後、回転蒸発して濃縮させ、体積比（２０：１）のジクロロメタンとメタノールの混合溶液を溶離剤として、カラムクロマトグラフィーにより分離し、淡黄色粉末状の中間体Ｂ－１（８８３．４ｍｇ、収率９２．３％）を得た。
図４に示す本実施例で調製した中間体Ｂ－１のマススペクトルのように、HRMS (Esi-TOF, m/z)m/z [M+H]+ calcd:C45H56ClN5O14S: 958.3233,found: 958.3330である。
２．２ 複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＤＭ１の合成
アフィボディＺＨＥＲ２：３４２（１０ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体Ｂ－１（１．３５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＤＭ１を得た。
図５に示す本実施例で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが８０３０．０９に現れ、理論分子量８０３８．２５とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＤＭ１をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＤＭ１抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000008
３．１ 複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥの合成
アフィボディＺＨＥＲ２：３４２ （１０ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．８５ｍｇ、南京康満林生物医薬科技有限公司より購入）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥを得た。
図６に示す本実施例で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが８３７０．５３に現れ、理論分子量８３９３．６３とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥ抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000009
４．１ 複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＤＭ１の合成
アフィボディＺＥＧＦＲ：１９０７（１２．３ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体Ｂ－１（１．３５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＤＭ１を得た。
図７に示す本実施例で調製した複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが１０３８２．５３に現れ、理論分子量１０４４５．３２とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＤＭ１をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＤＭ１抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000010
５．１ 複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＭＭＡＥの合成
アフィボディＺＥＧＦＲ：１９０７（１２．３ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．８５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＭＭＡＥを得た。
図８に示す本実施例で調製した複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが１０７３６．４６に現れ、理論分子量１０８０３．５３とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＭＭＡＥをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＥＧＦＲ：１９０７－ＭＭＡＥ抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000011
６．１ 複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＤＭ１の合成
アフィボディＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１（１２．８ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体Ｂ－１（１．３５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＤＭ１を得た。
図９に示す本実施例で調製した複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが１００８３．０２に現れ、理論分子量１００４０．２５とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＤＭ１をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＤＭ１抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000012
７．１ 複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＭＭＡＥの合成
アフィボディＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１（１２．８ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．８５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＭＭＡＥを得た。
図１０に示す本実施例で調製した複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが１０２７１．０８に現れ、理論分子量１０３９８．５６とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＭＭＡＥをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１－ＭＭＡＥ抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000013
８．１ 複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＤＭ１の合成
アフィボディＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１（１３．４ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体Ｂ－１（１．３５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＤＭ１を得た。
図１１に示す本実施例で調製した複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＤＭ１のＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが１０４７４．６１に現れ、理論分子量１０４５６．７２とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＤＭ１をジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＤＭ１抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
Figure 2023537524000014
９．１ 複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＭＭＡＥの合成
アフィボディＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１（１３．４ｍｇ）をＰＢＳ溶液５ｍＬに溶解し、次に、中間体ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．８５ｍｇ）をジメチルスルホキシド１５０μＬに溶解し、前述アフィボディ溶液にゆっくりと１滴ずつ滴加し、室温で撹拌しながら１２時間反応させた。反応液を水に入れて透析して精製し、透析終了後、凍結乾燥して白色棉状の複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＭＭＡＥを得た。
図１２に示す本実施例で調製した複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＭＭＡＥのＭａｌｄｉ－Ｔｏｆ質量スペクトルのように、生成物分子量の単一ピークが１０７３７．２４に現れ、理論分子量１０８１５．０３とほぼ一致する。
上記で調製した複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＭＭＡＥをジメチルスルホキシドに溶解したものを室温で水に滴下し、ジメチルスルホキシドを除去し、複合体のナノ粒子水溶液を得た。本実施例で調製した複合体ＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１－ＭＭＡＥ抗腫瘍ナノ粒子に基づく平均サイズは１００ｎｍ程度である。
実施例１０
本実施例は、腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子の癌細胞に対する作用の実験を提供した。
実施例１～９で調製したアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子をそれぞれ細胞培養液で濃度０．１、０．５、１、２．５、５、１０、２０、４０、５０ｎｍｏｌ／Ｌの溶液にし、その後、それぞれＳＫＯＶ－３細胞（卵巣癌細胞系）、Ａ４３１細胞（上皮癌細胞系）、Ａ５４９細胞（肺癌細胞系）及びＵ８７細胞（脳膠腫細胞系）を４８時間培養した後、ＭＴＴ方法によって細胞活性をテトスし、その結果を図１３のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに示す。
アフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子の濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌになると、癌細胞増殖が明らかに阻害され、アフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子は癌細胞に対する阻害作用が濃度に比例する。このことから、実施例１～９で調製されたアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子は悪性腫瘍の治療において応用価値が期待できることが示された。
実施例１１
本実施例は腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子のＳＤラット体内の薬物動態学実験を提供した。
Ｃｙ５．５（メロシアニン染料５．５）を体内の蛍光プローブ分子として、Ｃｙ５．５を実施例１で得た、能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の表面に共有修飾し、ナノ粒子の体内薬物動態学特性を評価した。
ＳＤラット（～２００ｇ）２匹を実験群として、Ｃｙ５．５共有修飾ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子２００μＬをそれぞれ尾静脈注射し、所定の時点（１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、及び１２ｈ）に、ラットの眼窩から約０．５ｍＬの血液をヘパリンナトリウム入り試験管に採取した後、４℃の冷蔵庫に保存した。全てのデータ点について採取した後、全ての血液サンプルを３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上層血清のサンプルを得た。各時点に血清２００μＬを採取し、蛍光スペクトルによりそのＣｙ５．５含有量を分析し、換算して対応するＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂの含有量を得た。
その結果、図１４に示すように、図から、ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の血液半減期は約６ｈであることが推定され、その値は一般的な小分子抗腫瘍薬の血液半減期（例えば、現在臨床の化学療法の第一線抗癌薬であるパクリタキセルのラット体内の血液半減期は１．１ｈしかない）よりも大幅に大きかった。ラットにＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子を尾静脈注射してから１２ｈ後にも、その血液中のＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子は５．６μｇ／ｍＬの高濃度を維持しており、このことから、ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子は血液循環系に効果的に保留され、長い血液滞留時間はより多くのＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の腫瘍部位への濃縮にも有利であり、これによって、高い抗腫瘍効果が得られた。
実施例１２
本実施例は腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の担癌ハダカネズミ体内の長時間循環の場合の画像の概略図を提供する。
Ｃｙ５．５（メロシアニン染料５．５）を体内の蛍光プローブ分子として、Ｃｙ５．５を実施例１で得た能動標的化機能を有する複合体ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子の表面に共有修飾し、ナノ粒子の体内循環時間及び標的効果を評価した。濃度４．０×１０６個／ｍＬの対数成長期のＳＫＯＶ－３細胞の細胞懸濁液を調製し、ハダカネズミの右前腋窩皮下に１匹ずつ２００μＬ摂取し、腫瘍体積が約５００ｍｍ３になると、それぞれ２匹のマウスをランダムに選択して、対照群及び実験群とした。実験群では、Ｃｙ５．５共有修飾ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子２００μＬ、対照群では、Ｃｙ５．５溶液（実験群溶液と対照群溶液中のＣｙ５．５含有量は同じ）２００μＬを注射した。４ｈ、１２ｈ注射後、ＺＫＫＳ－Ｍｕｌａｕｒｏｒａ画像形成システムにより撮影し、マウス全身の蛍光強度を分析した。
その結果、図１５に示すように、小分子Ｃｙ５．５は、４時間注射後、マウスの体内では明らかな存在が認められず、１２ｈ後にはほぼ完全に代謝されており、一方、ＺＨＥＲ２：３４２－Ｅｐｏ Ｂナノ粒子は、４時間注射後、腫瘍部位に明らかに濃縮され、また他の臓器では明らかな存在が認められず、マウスの体内で１２ｈ循環した後にも、腫瘍部位では明らかな蛍光信号が観察された。その結果から、このアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子は優れた腫瘍標的性を有するとともに、体内で長時間循環が可能であり、腫瘍治療において応用価値が期待できる。
実施例１３
本実施例は腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子の、担癌ハダカネズミに対する腫瘍治療効果図を提供した。
濃度４．０×１０６個／ｍＬの対数成長期のＳＫＯＶ－３細胞の細胞懸濁液を調製し、ハダカネズミの右前腋窩皮下に１匹ずつ２００μＬ接種し、腫瘍体積が約１００ｍｍ３になると、５匹ずつランダムに４群に分け、それぞれＰＢＳ対照群、ＭＭＡＥ ０．６ｍｇ／ｋｇ群、ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子（ＭＭＡＥ含有量０．４ｍｇ／ｋｇ）群、ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子（ＭＭＡＥ含有量０．６ｍｇ／ｋｇ）群とし、これらのうち、ＰＢＳ群では２００ μｌ ＰＢＳ、ＭＭＡＥ ０．６ｍｇ／ｋｇ群ではＭＭＡＥ ０．６ｍｇ／ｋｇ、ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥ含有量０．４ｍｇ／ｋｇ）群ではＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥ（含ＭＭＡＥ ０．４ｍｇ／ｋｇ）、ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥ含有量０．６ｍｇ／ｋｇ）群ではＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥ（含ＭＭＡＥ ０．６ｍｇ／ｋｇ）を３日ごとに１回注射した。投与後に担癌ハダカネズミの生存を観察し、マウスの体重及び腫瘍のサイズを測定して、写真を撮って保存した。
実験の結果、図１６、１７、１８に示すように、ＰＢＳ対照群ではマウスの腫瘍が迅速に増大し、ＭＭＡＥ ０．６ｍｇ／ｋｇ群では、マウスへ投与した後、体重が急に低下し、３回投与後、全部が死亡し、この結果から、ＭＭＡＥ有効成分には強烈な毒性及び副作用があり、また、担癌マウスは、ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子（ＭＭＡＥ含有量０．４ｍｇ／ｋｇ）で治療したところ、腫瘍体積が明らかに減少し、投与量が０．６ｍｇ／ｋｇに増加すると、担癌マウスの腫瘍体積が明らかに減少し、最後にほぼ消えており、しかも、生存状態が良好である。
この結果から明らかに、アフィボディ－細胞毒素複合体ＺＨＥＲ２：３４２－ＭＭＡＥナノ粒子では、その標的性によって、優れた生体内抗腫瘍効果が得られるとともに、ＭＭＡＥの毒性及び副作用が明らかに低減した。優れた抗腫瘍効果及び良好な生物学的安全性から、アフィボディ－細胞毒素複合体は市場での将来性が期待できる抗体－薬物結合による新規剤形であることが証明された。
以上の開示は本発明の好適な実施例に過ぎない。好適な実施例では全て詳細が説明されておらず、また、本発明は前記具体的な実施形態に限定されるものではない。明らかなに、本明細書の内容に基づいて多くの修正や変化が可能である。本明細書では、これらの実施例を選択して具体的に説明するのは、本発明の原理及び実際の適用をより良好に説明し、当業者であれば本発明を良好に利用できるようにするためである。本発明は特許請求の範囲及びその範囲全体や等価物により制限される。
本発明及び上記の実施例に基づいて、本発明に挙げられる又は例示された各原料又はその等同物、各加工方法又はその等同物のいずれも本発明を実現することができ、また、各原料及び加工方法のパラメータの上限値と下限値、区間の値が全て本発明を実現することができることを当業者が容易に予測できるので、ここでは実施例を一々例示していない。

Claims (10)

  1. 腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体であって、主に細胞毒素と能動標的化機能を有するアフィボディとを含み、前記細胞毒素と前記アフィボディが小分子連結基を介して共有結合されてなることを特徴とする複合体。
    （ここで、Ａはアフィボディであり、Ｌは有機小分子連結基であり、
    は細胞毒素である。）
  2. 前記アフィボディはヒト上皮成長因子受容体を標的とするアフィボディ ＺＨＥＲ２：３４２又はＺＥＧＦＲ：１９０７、ヒトインスリン様成長因子受容体を標的とするアフィボディＺＩＧＦ１Ｒ：４５５１又はヒト血小板由来成長因子受容体βを標的とするアフィボディＺＰＤＧＦＲβ：０７５９１から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体。
  3. 前記細胞毒素はエポチロンＢ及びその誘導体、メイタンシン及びその誘導体、ドラスタチン及びその誘導体から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体。
  4. 前記小分子連結基は以下の式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体。
    Figure 2023537524000017
    （ここで、Ｒ１は－アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－アルキル－ＳＯ２ＮＨ－又はＣ１～８アルコキシから選ばれ、Ｒ２はカルボキシル又はアシルクロリドから選ばれ、ｎ、ｍはそれぞれ独立に２～１０から選ばれ、
    前記アルキルはＣ１～８アルキルから選ばれ、前記アルキル、アルコキシは無置換又は、ハロゲン、シアノ、アセチル、ヒドロキシ、メチロール、ヒドロキシエチル、カルボキシル、Ｃ１～８アルキル、Ｃ１～８アルコキシ、ハロゲン化Ｃ１～８アルキル、Ｃ３～８シクロアルキル、Ｃ３～８シクロアルコキシ、ハロゲン化Ｃ１～８アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－１０アルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＣ１－１０アルキル、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－１０アルキル、－ＣＯＮＲａ０Ｒｂ０からなる群から選ばれる１、２、３個の置換基で置換され、Ｒａ０、Ｒｂ０はそれぞれ独立に水素又はＣ１～８アルキルである。）
  5. 以下の構造のうちの１種であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体。
    Figure 2023537524000018
    Figure 2023537524000019
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の前記複合体を水媒体にて自己集合してなることを特徴とする腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子。
  7. 前記ナノ粒子のシェルは能動標的化機能を有するアフィボディで構成され、前記ナノ粒子のコアは前記小分子連結基及び細胞毒素で構成され、前記ナノ粒子の粒径が２００ｎｍ未満であることを特徴とする請求項６に記載のナノ粒子。
  8. ヒドロキシ及び／又はアミノ及び／又はメルカプトを含む疎水性細胞毒素と小分子連結基を結合して、能動標的アフィボディとさらに結合反応し、能動標的化機能を有するアフィボディ－細胞毒素複合体を得るステップ（１）と、
    所定量のステップ（１）の前記アフィボディ－細胞毒素複合体を所定の体積の有機溶媒に溶解し、室温でゆっくりと撹拌している超純水に滴下し、有機溶媒を除去し、能動標的化機能を有する複合体ナノ粒子水溶液を得るステップ（２）と、を含むことを特徴とする腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体ナノ粒子の調製方法。
  9. ステップ（２）における有機溶媒はジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ'－ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項８に記載の調製方法。
  10. 請求項１～５のいずれか１項に記載の腫瘍能動標的治療用のアフィボディ－細胞毒素複合体、又は請求項６又は７に記載のナノ粒子又は請求項８又は９に記載の調製方法によって製造された前記ナノ粒子の、腫瘍能動標的治療薬の調製における使用。
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