JP2023536993A

JP2023536993A - モジュール式の簡便なアルファヘルペス亜科（Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）への導入遺伝子挿入のためのプラットフォームベクター

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Publication number: JP2023536993A
Application number: JP2023507899A
Authority: JP
Inventors: バイラー，スザンヌ; ファンク，クリスティーナ
Original assignee: フラウンホファーゲセルシャフトツールフェールデルンクダーアンゲヴァンテンフォルシュンクエー．ファオ．
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2023-08-30
Also published as: CA3188188A1; AU2021322148A1; US20230313226A1; IL300395A; EP4192963A1; WO2022029286A1; EP3950948A1; CN116322726A

Abstract

本発明は、プラットフォームベクターとして使用することができる、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）の遺伝子導入ウイルスの生産に適したベクター系に関するものである。このような遺伝子導入ウイルスは、ワクチンとして、または腫瘍溶解性ウイルスとして、または遺伝子治療において使用することができる。本発明のプラットフォームベクターは、機能を改変して向上させた、ウイルスの探索ならびに生成および生産を簡略化することができるベクター系である。また、本発明は、遺伝子導入ウイルスの生成および生産のためのベクター系としてプラットフォームベクターを使用すること、本発明のベクター系を用いて遺伝子導入ウイルスを生産する方法、ならびにこのような方法で得られたウイルスにも関する。【選択図】図１

Description

説明
本発明は、プラットフォームベクターとして使用することができる、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）の遺伝子導入ウイルスの生産に適したベクター系に関するものである。このような遺伝子導入ウイルスは、ワクチンとして、または腫瘍溶解性ウイルスとして、または遺伝子治療において使用することができる。本発明のプラットフォームベクターは、機能を改変して向上させた、ウイルスの探索ならびに生成および生産を簡略化することができるベクター系である。また、本発明は、遺伝子導入ウイルスの生成および生産のためのベクター系としてプラットフォームベクターを使用すること、本発明のベクター系を用いて遺伝子導入ウイルスを生産する方法、ならびにこのような方法で得られたウイルスにも関する。

アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）は、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）のウイルス亜科であって、主として、他の亜科よりも複製が速いこと、ニューロンにおける持続性、ならびに哺乳類における広範な宿主範囲によって区別される。アルファヘルペスウイルス亜科は、動物ウイルス学およびヒトウイルス学的に非常に重要なウイルスを包含する。現在、この亜科には42種が存在する。また、単純ヘルペスウイルス1（herpes simplex virus 1）（HSV-1）および単純ヘルペスウイルス2（herpes simplex virus 2）（HSV-2）ならびに近縁のヒトアルファヘルペスウイルス3（human alphaherpesvirus 3）（HHV-3）がこの亜科に属する。

単純ヘルペスウイルスの多くのバリアントが、がんのウイルス治療のために、すなわち腫瘍溶解性ヘルペスウイルスとして使用するために検討されてきた。このようなヘルペスウイルスは、がん細胞に感染して死滅させる。感染細胞は、溶解によって破壊されると、新たな感染性ウイルス粒子もしくはバリアントを放出し、残存する腫瘍の破壊を助ける（S. Varghese and S.D. Rabkin, Cancer Gene Therapy (2002) 9, 967-978）。ヘルペスウイルスベクターの遺伝子治療における使用（V. Hukkanen, The Open Virology Journal (2010) 4, 94-95）、およびワクチンベクターとしての使用（P. Marconi et al., Human Vaccines (2008) 4(2), 91-105）も知られている。

バクテリア人工染色体（BAC）は、機能的な自己増殖性プラスミドを基にしたDNA構築物であり、細菌（通常は大腸菌（E. coli））の形質転換およびクローニングに使用される。BACを用いて大きなゲノム配列をクローニングすることが可能であり、バクテリア人工染色体は、通常150～350kbpの挿入サイズを有することができる。US 2012/0003742 A1およびM. Tanaka et al, J. Virol (2003) 77(2), 1382-1391は、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）ゲノムをバクテリア人工染色体としてクローニングすることを記載している。

当技術分野の現状に即したBACは、のちに細胞内、たとえば哺乳動物細胞内で生産されるべき新規の改良された遺伝子導入ウイルスの探索および生成に適したツールではない。

したがって、本発明の目的は、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）の、新規で好適な、特に改良された遺伝子導入ウイルスを、探索し、検討用にこうしたウイルスを生成し、および／またはこうしたウイルスを生産するための、簡略化された方法を可能にするツール、特にベクター、を提供することであって、上記のウイルスは特に、ワクチンとして、もしくは腫瘍溶解性ウイルスとして使用可能であり、または遺伝子治療に使用できるものである。

本発明はさらに、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）の新たな遺伝子導入ウイルスを提供すること、ならびにそうしたウイルスを開発し、生産するツールを提供することを目的とするが、この遺伝子導入ウイルスは改善された機能性を有するものである。

本発明の根底にある課題は、請求項1に記載のベクター系の提供により解決される。

したがって、本発明は、ウイルス部分および非ウイルス部分を含有するバクテリア人工染色体（BAC）構築物を含むベクター系であって、そのウイルス部分がアルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルスに由来し、非ウイルス部分が細菌プラスミドの配列を有するDNAを含有し、ウイルス部分が少なくとも2つの組換え部位を含む、前記ベクター系に関する。

ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、機能付与（functionalization）、特に導入遺伝子発現カセットの挿入による機能付与のために好適であり、あるいはそのために使用される。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、2つの組換え部位を含む。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、導入遺伝子発現カセットを挿入するための、まさに2つの組換え部位を有するが、この導入遺伝子発現カセットは、1つもしくは複数の遺伝子（導入遺伝子）、すなわちオープンリーディングフレーム、および選択を可能にし、その発現を調節するためのそれぞれのエレメントを含むものである。

本発明の少なくとも2つの組換え部位は、好都合なことに、少なくとも2つの導入遺伝子発現カセットの、モジュール式で簡便な挿入を可能にする。導入遺伝子発現カセットを1つだけでなく少なくとも2つ導入することができるので、新規で組み合わせ可能な機能を有する、新規でより好適な遺伝子導入ウイルスを、探索、生成、検証、および生産することが可能となる。2つの導入遺伝子発現カセットをモジュール式に組み合わせて、簡便な方法で新規の遺伝子導入ウイルスを生成することができる。本発明によって、たとえば、ウイルス部分の第1の組換え部位に導入遺伝子発現カセットを挿入し、この導入遺伝子発現カセットの少なくとも1つの産物と、ウイルス部分の第2の組換え部位に挿入することができる導入遺伝子発現カセットのさらに別の産物との相互作用を、検証することが可能となる。ウイルスを改良するために、2つの異なる導入遺伝子発現カセットの機能および効果を有利に組み合わせることができる。したがって、本発明のベクター系は、アルファヘルペス亜科の新規遺伝子導入ウイルス、好ましくは遺伝子導入単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）または単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）の生成および生産のためのプラットフォームベクターとして、有利に使用することができる。本発明のベクター系は、少なくとも2つの導入遺伝子発現カセットの挿入を可能にするが、たとえば、この発現カセットは、医学的機能を有する1もしくは複数のタンパク質またはペプチドをそれぞれコードする導入遺伝子発現カセットから選択されるものであり、このタンパク質またはペプチドは、たとえば、標的制御タンパク質、免疫チェックポイント阻害薬もしくはサイトカインなどの免疫調節薬、抗がんペプチド（ACP）もしくはタンパク質、アポトーシス促進タンパク質、細胞外マトリックス分解タンパク質、腫瘍抗原提示用タンパク質、および病原体抗原からなる一群から選択される。こうした導入遺伝子発現カセットを2つ以上組み合わせることにより、新規の機能的に改良された遺伝子導入ウイルスを得ることができる。

当業者は、FRTのような適当な組換え部位、およびmFRT（たとえばT. Schlake and J. Bode; Biochemistry. 1994;33(43):12746-12751に記載の変異FRT）のような、またはroxおよびloxPのような、そのバリアントを承知している。好ましい実施形態において、少なくとも2つの組換え部位は、部位特異的リコンビナーゼによる組換えのための部位である。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、Flpリコンビナーゼ、DreリコンビナーゼまたはCreリコンビナーゼによる組換えのための部位である。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、異なる組換え部位であって、たとえば、第1の組換え部位はFRT組換え部位であり、第2の組換え部位はmFRT組換え部位である。このことは、組換え部位のいずれかに導入遺伝子または導入遺伝子カセットを特異的に挿入することができるという利点を有する。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、FRT、mFRT、rox、またはloxP部位である。好ましい実施形態において、少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、FRT、mFRT、rox、またはloxP部位である。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、FRT部位である。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、mFRT部位である。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つはFRT部位であり、もう1つはmFRT部位である。好ましい実施形態において、少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、loxP部位またはrox部位とすることもできる。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）に由来する。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ウイルス（Simplexvirus）属またはバリセロウイルス（Varicellovirus）属のウイルスに由来する。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス1（herpes simplex virus 1）（HSV-1）もしくは単純ヘルペスウイルス2（herpes simplex virus 2）（HSV-2）、またはヒトアルファヘルペスウイルス3（human alphaherpesvirus 3）（HHV3）に由来する。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、マルディウイルス（Mardivirus）属のウイルスに由来しない。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）に由来する。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス1（herpes simplex virus 1）（HSV-1）または単純ヘルペスウイルス2（herpes simplex virus 2）（HSV-2）に由来する。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）に由来する。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）に由来する。別の実施形態において、ウイルス部分は、ヒトアルファヘルペスウイルス3（human alphaherpesvirus 3）（HHV3）に由来する。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルスをコードする。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ウイルス（Simplexvirus）属またはバリセロウイルス（Varicellovirus）属のウイルスをコードする。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）をコードする。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス1（herpes simplex virus 1）（HSV-1）または単純ヘルペスウイルス2（herpes simplex virus 2）（HSV-2）またはヒトアルファヘルペスウイルス3（human alphaherpesvirus 3）（HHV3）をコードする。

好ましい実施形態では、ウイルス部分は、マルディウイルス（Mardivirus）属のウイルスをコードしない。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス1（herpes simplex virus 1）（HSV-1）または単純ヘルペスウイルス2（herpes simplex virus 2）（HSV-2）をコードする。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）をコードする。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）をコードする。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、ヒトアルファヘルペスウイルス3（human alphaherpesvirus 3）（HHV3）をコードする。

アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）は、一方では、現実に問題となる病原体であり、それに対する改良されたワクチンが必要とされている。アルファヘルペスウイルス亜科は、他方で、よく知られた、完全に配列決定されたウイルスであり、したがって、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチンベクターとして使用するため、または遺伝子治療に使用するための好適なツールである。

本発明によれば、ベクター系は、非ウイルス部分およびウイルス部分を含む。そのウイルス部分とは、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルスを起源とするDNA配列を指す。本発明のウイルス部分は、少なくとも2つの組換え部位を含む。この組換え部位は、ウイルス起源である必要はない。こうした少なくとも2つの組換え部位はウイルス部分に挿入されており、したがってウイルス部分の中に存在する。上記のように、こうした少なくとも2つの組換え部位は、ウイルス起源ではないことが好ましく、FRT、mFRT、loxPまたはroxなどの組換え部位である。

非ウイルス部分は、他のDNA配列、特に細菌性の配列を指す。非ウイルス部分はまた、真核生物の配列を含んでいてもよい。非ウイルス部分は、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルスのコード配列を除いたウイルス配列を含むこともありうる。したがって、非ウイルス部分はまた、特にバクテリオファージの配列、たとえば、細菌プラスミドに使用されるバクテリオファージ配列も含みうる。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、真核生物および／または細菌の配列のみを含むか、または真核生物および／または細菌の配列のみをバクテリオファージ配列と組み合わせて含む。

本発明の非ウイルス部分は、細菌プラスミドの配列を有するDNAを含む。こうした配列は、好ましくは、BACカセットとすることができるが、それはすなわち、本発明のベクター系のBACコアを構築する配列であり、たとえばプラスミドpBeloBAC11などのプラスミドの配列である。非ウイルス部分は、さらに他のDNA配列を含むことができる。非ウイルス部分のさらに他のDNA配列は、ベクター系のBACコアを構築する配列に直接結合されていてもよいが、たとえばウイルス部分のDNA配列によって、ベクター系のBACコアを構築する配列から隔てられていてもよい。好ましい実施形態において、非ウイルス部分のさらに他のDNA配列は、ベクター系のBACコアを構築する配列に直接結合している。より好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、2つの組換え部位、より好ましくは同種の2つの組換え部位、もっとも好ましくは2つのloxP組換え部位によって、ウイルス部分から隔てられている。非ウイルス部分のこうした2つの組換え部位、たとえばloxP組換え部位は、機能付与された（functionalized）ベクターおよびウイルスの探索ならびに生成および生産に使用される、ウイルス部分の2つの組換え部位とは別個のものである。

本発明のベクター系は、ウイルス部分および非ウイルス部分を有し、このウイルス部分は、少なくとも2つの組換え部位を含む。こうした少なくとも2つの組換え部位を使用して、導入遺伝子発現カセットを導入することができる。導入遺伝子発現カセットは、いかなる種類の起源を有するものであってもよく、ウイルス部分の組換え部位に挿入されるが、ベクター系のウイルス部分および非ウイルス部分とは別個の独立した存在である。

本発明は、ウイルス部分の組換え部位に導入された導入遺伝子発現カセットの有無にかかわらず、そのベクター系に関する。

好ましい実施形態において、導入遺伝子発現カセットのDNA配列は、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位に挿入された後、ウイルス部分のDNA配列によって、非ウイルス部分から隔てられているが、特にベクター系のBACコアを構築する配列から隔てられている。

好ましい実施形態において、少なくとも2つの導入遺伝子発現カセットのDNA配列は、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位に挿入された後、ウイルス部分のDNA配列によって相互に分離されている。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分の細菌プラスミドの配列を有するDNAは、第1のウイルス遺伝子の配列と第2のウイルス遺伝子の配列の間に挿入される。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、第1のウイルス遺伝子の配列と第2のウイルス遺伝子の配列との間に挿入される。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の第1の組換え部位は、2つのウイルス遺伝子の配列の間に挿入される。好ましい実施形態において、ウイルス部分の第1の組換え部位は、2つのウイルス遺伝子の配列の間に挿入され、ウイルス部分の第2の組換え部位は、さらに2つのウイルス遺伝子の配列の間に挿入される。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、第1のウイルス遺伝子と第2のウイルス遺伝子の配列間に挿入され、ウイルス部分の第1の組換え部位は、第3のウイルス遺伝子と第4のウイルス遺伝子の配列間に挿入され、ウイルス部分の第2の組換え部位は、第5のウイルス遺伝子と第6のウイルス遺伝子の配列間に挿入される。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分の細菌プラスミドの配列を有するDNAは、第1のウイルス遺伝子の配列と第2のウイルス遺伝子の配列の間に挿入され、ウイルス部分の第1の組換え部位は、第3のウイルス遺伝子の配列と第4のウイルス遺伝子の配列の間に挿入され、ウイルス部分の第2の組換え部位は、第5のウイルス遺伝子の配列と第6のウイルス遺伝子の配列の間に挿入される。

本発明の文脈において、「第1のウイルス遺伝子および第2のウイルス遺伝子」は、好ましくは2つの隣接する遺伝子を意味し、「第3のウイルス遺伝子および第4のウイルス遺伝子」は、好ましくは2つの隣接する遺伝子を意味し、「第5のウイルス遺伝子および第6のウイルス遺伝子」は、好ましくは2つの隣接する遺伝子を意味するものであって、この第1、第2、第3、第4、第5および第6の遺伝子は、それぞれ異なる遺伝子であることが好ましい。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルス、好ましくは単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）または単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）またはヒトアルファヘルペスウイルス3（HHV3）のコード配列の、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも65%、もっとも好ましくは少なくとも80%を含む。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルス、好ましくは単純ヘルペスウイルス、もっとも好ましくは単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）または単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）のコード配列の、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも65%、もっとも好ましくは少なくとも80%を含む。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、56個のコード配列UL1～UL56のうち、少なくとも25個のコード配列、より好ましくは30個のコード配列、さらに好ましくは40個のコード配列を含む。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、12個のコード配列US1～US12のうち、少なくとも5個のコード配列、より好ましくは6個のコード配列、さらに好ましくは9個のコード配列を含む。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、遺伝子産物UL1～UL56の56個のコード配列のうち、少なくとも25個のコード配列、より好ましくは30個のコード配列、さらに好ましくは40個のコード配列、および遺伝子産物US1～US12の12個のコード配列のうち、少なくとも5個のコード配列、より好ましくは6個のコード配列、さらに好ましくは9個のコード配列を含む。好ましい実施形態において、ウイルス部分は、ウイルスゲノムの逆方向反復、たとえば、末端反復および／または内部反復のコード遺伝子の少なくとも一部を含む。

ベクター系のウイルス部分に使用することができる、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）、特に単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）、単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）またはヒトアルファヘルペスウイルス3（HHV3）の、好適で必須のオープンリーディングフレーム（ORF）は、当業者に知られている。

好ましい実施形態において、ウイルス部分は、遺伝子産物UL1～UL56の56個のコード配列のうちすべてのコード配列、および遺伝子産物US1～US12の12個のコード配列のうちすべてのコード配列を含む。

単純ヘルペスウイルスのコード配列UL1～UL56およびUS1～US12、および遺伝子産物、ならびに他のアルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）におけるそのそれぞれのホモログは、当業者に知られており、たとえば、D.J. McGeoch, et al., Journal of General Virology (1988). 69 (7): 1531-1574；D.J. McGeoch, et al., Journal of Molecular Biology, (1985) 181(1): 1-13；T Lenac Rovis, SM Bailer, et al., Journal of Virology (2013), 87 (12): 6943-54；BG Klupp et al., Journal of Virology (2004);78(1):424-440；およびA. Dolan et al., Journal of Virology (1998), 72(3): 2010-2021に記載されている。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、2つのtail-to-tail方向の遺伝子またはオープンリーディングフレームの配列の間に挿入される。本発明の文脈において、「2つのtail-to-tail方向の遺伝子またはオープンリーディングフレーム」とは、好ましくは、2つの隣接するtail-to-tail方向の遺伝子またはオープンリーディングフレームを意味する。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、UL3遺伝子配列とUL4遺伝子配列の間に挿入される。

UL3およびUL4のような2つのtail-to-tail方向の遺伝子の遺伝子間領域が特に適しているのは、遺伝子のtail-to-tailの方向性によって、2つのtail-to-tail方向のポリアデニル化シグナルの間に非ウイルス部分のような外来遺伝子を挿入してもウイルス遺伝子または転写単位が破壊されることのない遺伝子間領域が生じるためである。

したがって、さらに他の好適な挿入部位は、UL7遺伝子配列とUL8遺伝子配列との間、UL10遺伝子配列とUL11遺伝子配列との間、UL15遺伝子配列とUL18遺伝子配列との間、UL21遺伝子配列とUL22遺伝子配列との間、UL26遺伝子配列とUL27遺伝子配列との間、UL35遺伝子配列とUL36遺伝子配列との間、UL40遺伝子配列とUL41遺伝子配列との間、UL45遺伝子配列とUL46遺伝子配列との間、UL55遺伝子配列とUL56遺伝子配列との間、およびUS9遺伝子配列とUS10遺伝子配列との間である。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの少なくとも1つは、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列の間に挿入される。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位の両方が、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列の間に挿入される。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のすべてが、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列の間に挿入される。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、UL10遺伝子配列とUL11遺伝子配列との間に挿入される。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、UL55遺伝子配列とUL56遺伝子配列との間に挿入される。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つは、UL10遺伝子配列とUL11遺伝子配列との間に挿入され、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちのもう1つは、UL55遺伝子配列とUL56遺伝子配列との間に挿入される。上記の2つのtail-to-tail方向の遺伝子の、他の遺伝子間領域、すなわち、UL7遺伝子配列とUL8遺伝子配列との間、UL3遺伝子配列とUL4遺伝子配列との間、UL15遺伝子配列とUL18遺伝子配列との間、UL21遺伝子配列とUL22遺伝子配列との間、。UL26遺伝子配列とUL27遺伝子配列との間、UL35遺伝子配列とUL36遺伝子配列との間、UL40遺伝子配列とUL41遺伝子配列との間、UL45遺伝子配列とUL46遺伝子配列との間、ならびにUS9遺伝子配列とUS10遺伝子配列との間の遺伝子間領域もまた好ましい。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、距離をおいて挿入され、より好ましくは大きく距離をおいて挿入される。好ましい実施形態において、ウイルス部分の2つの組換え部位の間に、少なくとも5個の遺伝子、より好ましくは少なくとも20個の遺伝子、さらに好ましくは少なくとも30個の遺伝子、さらにより好ましくは少なくとも40個の遺伝子がある。好ましくは、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位の間のこうした遺伝子は、UL遺伝子である。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の2つの組換え部位は、少なくとも4kb（キロベース）、より好ましくは少なくとも6kb、さらに好ましくは少なくとも8kb、もっとも好ましくは少なくとも10kb、さらにより好ましくは少なくとも25kb、さらにより好ましくは少なくとも50kb、さらにより好ましくは少なくとも75kb離れて位置する。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、ウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位に対して距離を置いて配置される。好ましい実施形態において、非ウイルス部分と、ウイルス部分の2つの組換え部位との間には、少なくとも1つの遺伝子、より好ましくは少なくとも2つの遺伝子がある。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、ウイルス部分の2つの組換え部位から少なくとも4kb（キロベース）、より好ましくは少なくとも6kb、さらに好ましくは少なくとも8kb、もっとも好ましくは少なくとも10kbの距離を置いて配置される。

この距離は、好ましくは、2つの組換え部位および非ウイルス部分が、遺伝子産物UL1～UL56およびUS1～US12をコードする配列の外側に位置するように選択される。

少なくとも2つの組換え部位の間が離れていること、より好ましくは大きく離れていることは、2つ以上の導入遺伝子発現カセットを挿入した後の立体障害を回避できるという利点を有する可能性がある。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分、およびウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列間に挿入されているが、より好ましくは、非ウイルス部分、およびウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位は、UL3遺伝子配列とUL4遺伝子配列との間、UL7遺伝子配列とUL8遺伝子配列との間、UL10遺伝子配列とUL11遺伝子配列との間、UL15遺伝子配列とUL18遺伝子配列との間、UL21遺伝子配列とUL22遺伝子配列との間、UL26遺伝子配列とUL27遺伝子配列との間、UL35遺伝子配列とUL36遺伝子配列との間、UL40遺伝子配列とUL41遺伝子配列との間、UL45遺伝子配列とUL46遺伝子配列との間、UL55遺伝子配列とUL56遺伝子配列との間、ならびにUS9遺伝子配列とUS10遺伝子との間、からなる一群から選択される異なる遺伝子間領域に挿入される。

好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも1つの遺伝子が変異している。好ましい実施形態において、少なくとも1つのUL遺伝子が変異している。好ましい実施形態において、ウイルス部分の少なくとも2つの遺伝子が変異している。好ましい実施形態において、少なくとも2つのUL遺伝子が変異している。好ましい実施形態において、少なくとも1つの変異した遺伝子は、ビルレンス（virulence）遺伝子である。好ましい実施形態において、少なくとも2つのビルレンス遺伝子が変異している。好ましい実施形態において、2つのビルレンス遺伝子が変異している。好ましい実施形態において、UL37が変異している。好ましい実施形態において、UL39が変異している。好ましい実施形態において、少なくともUL37およびUL39が変異している。好ましい実施形態において、UL37およびUL39が変異している。好ましい実施形態において、変異は点変異または欠失である。好ましい実施形態において、UL37遺伝子に点変異があり、UL39遺伝子に欠失がある。

UL37および／またはUL39などのビルレンス遺伝子における変異は、ウイルスの神経毒性を回避して、ウイルスの安全性を最適化することができるという利点を有する。

好ましい実施形態において、好ましくはウイルス部分の少なくとも1つの遺伝子が変異しているウイルスは、それぞれのウイルス遺伝子、たとえばUL39、を発現するtranscomplementing（他所の遺伝子で補完する）細胞株で生産される。好ましい実施において、ウイルスは、調節可能なプロモーターの制御下でUL39遺伝子を発現するtranscomplementing（他所の遺伝子で補完する）細胞株で生産される。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、プラスミドpBeloBAC11の配列を含む。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、追加のポリアデニル化シグナルを含む。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、選択カセットを含む。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの後、組換えによって除去することができる。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分、より好ましくは、細菌プラスミドの配列を有するDNAは、組換え部位、好ましくはウイルス部分に挿入された2つの組換え部位とは異なる組換え部位にはめ込まれる。このことは、遺伝子導入ウイルスが哺乳動物細胞内で産生される際に、細菌プラスミドの配列、たとえばプラスミドpBeloBAC11の配列を有するDNAを除去することができるという利点を有する。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分、より好ましくは、細菌プラスミドの配列を有するDNAは、Cre組換えカセットを含み、loxP部位に隣接している。このことは、遺伝子導入ウイルスが哺乳動物細胞内で産生される際に、2つのloxP部位の間にある非ウイルス部分が除去され、1つのloxP組換え部位のみが残るという利点を有する。

好ましい実施形態において、非ウイルス部分は、プラスミドpBeloBAC11の配列、およびloxP部位で挟まれたCre組換えカセットを含む。

したがって、好ましい実施形態によれば、非ウイルス部分は、一方の末端に第1の組換え部位、たとえばloxPを有し、他方の末端には第1の組換え部位と同じ種類の第2の組換え部位を含有する。これらの組換え部位は、機能付与されたベクターおよびウイルスを探索し、生成および生産するために使用される、ウイルス部分の2つの組換え部位とは別個のものである。非ウイルス部分の2つの組換え部位の間には、細菌プラスミドの配列、および、好ましくは、Cre組換えカセットおよび／または選択マーカーカセットのような追加の配列を有するDNAが存在する。さらに好ましい実施形態において、非ウイルス部分の2つの組換え部位の外側に、追加のポリアデニル化シグナルが存在する。

したがって、好ましい実施形態において、ベクター系は、ウイルス部分の2つの異なる組換え部位、および非ウイルス部分の末端にあるさらに2つの組換え部位を含んでおり、この非ウイルス部分の2つの組換え部位は、同じ種類であるがウイルス部分の2つの組換え部位とは異なる。

本発明は、遺伝子導入ウイルスの生成および／または生産のための、本発明のベクター系の使用にも言及する。好ましい実施形態において、遺伝子導入ウイルスは、2つの導入遺伝子発現カセットを含む。

本発明によれば、導入遺伝子発現カセットは、1つもしくは複数の遺伝子（導入遺伝子）、すなわちオープンリーディングフレーム、および選択を可能にし、その発現を調節するための配列を含む。好ましい実施形態において、導入遺伝子発現カセットは、少なくとも1つの導入遺伝子を含んでいる。好ましい実施形態において、2つの導入遺伝子発現カセットは、それぞれ少なくとも1つの導入遺伝子を含む。好ましい実施形態において、2つの導入遺伝子発現カセットは、それぞれ1つの導入遺伝子からなる。好ましい実施形態において、2つの導入遺伝子発現カセットのうち1つは、1つの導入遺伝子からなる。好ましい実施形態において、2つの導入遺伝子発現カセットのうち1つは、少なくとも2つの導入遺伝子を含む。

本発明はまた、遺伝子導入ウイルスの生成および／または生産に使用するための、本発明のベクター系にも言及する。好ましい実施形態において、遺伝子導入ウイルスは、2つの導入遺伝子発現カセットを含んでいる。

本発明はまた、以下のステップを含む、遺伝子導入ウイルスを生産するための方法にも言及する：
a) 導入遺伝子発現カセットを、本発明のベクター系のウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つに導入して、遺伝子導入ウイルスをコードするベクターを得るステップ；
b) ステップa)で得られたベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトするステップ；
c) トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養するステップ；
d) 哺乳動物細胞で産生されたウイルスを単離するステップ。

好ましい実施形態では、ステップa）において、第1の導入遺伝子発現カセットが、ベクター系のウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの第1の部位に導入され、第2の導入遺伝子発現カセットが、少なくとも2つの組換え部位のうちの第2の部位に導入される。

当業者は、特に2つの組換え部位が提供される場合、しかも、特に2つの異なる組換え部位が提供される場合に、導入遺伝子および導入遺伝子発現カセットを導入するために適した方法を承知している。好ましい実施形態において、ステップa）は、原核生物の系で行われる。あるいはまた、真核生物の系、好ましくは哺乳動物細胞株を使用することができる。

好ましくは、ステップb）～d）の哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞株である。好ましくは、その細胞株は、Vero細胞株である。

ステップb)～d)による遺伝子導入ウイルスの生産は、そのウイルスに必須の遺伝子が欠失していない場合には補完性のない細胞株で行うことができるが、特に遺伝子導入ウイルスがワクチンとして使用されることになっている場合には、transcomplementing（他所の遺伝子で補完する）細胞株で行うことができる。

好ましい実施形態において、細菌プラスミドの配列を有するDNAは、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの後、組換えによって除去される。

好ましい実施形態において、導入遺伝子発現カセット内の導入遺伝子は、タンパク質もしくはペプチドまたはRNAをコードする。好ましい実施形態において、導入遺伝子の少なくとも1つは、タンパク質もしくはペプチドをコードする。好ましい実施形態において、導入遺伝子、すなわち導入遺伝子発現カセット内の導入遺伝子の少なくとも1つは、医学的な作用を有するタンパク質もしくはペプチドをコードする。好ましい実施形態において、導入遺伝子、すなわち導入遺伝子発現カセット内の導入遺伝子の少なくとも1つは、標的制御タンパク質、免疫チェックポイント阻害薬もしくはサイトカインなどの免疫調節薬、抗がんペプチド（ACP）もしくはタンパク質、アポトーシス促進タンパク質、細胞外マトリックス分解タンパク質、腫瘍抗原提示のためのタンパク質、および病原性抗原からなる一群から選択されるタンパク質もしくはペプチドをコードする。

好ましい実施形態において、第1の導入遺伝子発現カセットおよび第2の導入遺伝子発現カセットはそれぞれ、少なくとも1つのタンパク質もしくは少なくとも1つのペプチドまたはRNAをコードするが、好ましくは、標的制御タンパク質、免疫チェックポイント阻害薬もしくはサイトカインなどの免疫調節薬、抗がんペプチド（ACP）もしくはタンパク質、アポトーシス促進タンパク質、細胞外マトリックス分解タンパク質、腫瘍抗原提示のためのタンパク質、病原性抗原、およびそれらの組み合わせからなる一群から選択される、少なくとも1つのタンパク質もしくは少なくとも1つのペプチドをコードする。

導入遺伝子発現カセットの導入遺伝子は、構成的プロモーターまたは調節可能なプロモーターの制御下に置くことができる。プロモーターは、単純ヘルペスウイルス由来のプロモーター、誘導性（正の調節が可能な）プロモーター、または負の調節が可能なプロモーターとすることができる。負の調節は、腫瘍溶解性ウイルスの生産および細胞傷害性タンパク質の発現のために有利に使用することができる。

第1の導入遺伝子発現カセット内の第1の導入遺伝子は、第2の導入遺伝子発現カセット内の第2の導入遺伝子とは異なるプロモーターの制御下に置くことができる。ベクター系の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つに導入されるべき、または導入される、導入遺伝子は、単一のタンパク質、ペプチドまたはRNAをコードする単一のオープンリーディングフレームとすることができる。ベクター系のウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つに導入されるべき、または導入される、導入遺伝子カセットは、2つ以上のオープンリーディングフレームを含むこともありうる。したがって、少なくとも2つの組換え部位を用いて、3つ以上の異なるタンパク質もしくはペプチドを生産することが可能である。

導入遺伝子発現カセットがウイルス部分の少なくとも2つの組換え部位の1つに導入され、その導入遺伝子発現カセットが複数の導入遺伝子、すなわち複数のオープンリーディングフレームを含んでいる場合、この導入遺伝子発現カセットの異なる導入遺伝子は、同一のプロモーターの制御下にあることも、異なるプロモーターの制御下にあることもありうる。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、ワクチンもしくは腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療用ウイルスベクターを生産するために使用される。

本発明はまた、本発明の方法で得られたウイルスにも言及する。

本発明の使用で得られる、または得られた遺伝子導入ウイルスは、好ましくは、アルファヘルペス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルスである。

好ましい実施形態において、ウイルスは、ワクチンとして、もしくは腫瘍溶解性ウイルスとして使用するためのものであり、あるいは遺伝子治療に使用するためのものである。

好ましい実施形態において、ウイルスは、非小細胞肺がん（NSCLC）を治療するための腫瘍溶解性ウイルスであって、これは好ましくは、2つの導入遺伝子発現カセット、すなわち、上皮増殖因子受容体（EGFR）発現腫瘍細胞に対して標的化するための標的制御タンパク質、およびプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）に対する免疫チェックポイント阻害薬を有する。

本発明はまた、本発明のウイルスを含む、ワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスまたはウイルスベクターに関する。

さらに好ましい実施形態は、従属クレームで概説される。

注目すべきは、本発明の態様の1つに関連して説明される実施形態および特徴が、本発明の他の態様にも適用されることである。本発明のベクター系に関連して説明される実施形態および特徴は、明示的に別段の記載がない限り、本発明の方法およびウイルスに関連して説明される実施形態および特徴と組み合わせることも可能であり、逆もまた然りであることに留意すべきである。

本件出願において引用されたすべての特許文献および非特許文献は、その全体が参照により本願に組み入れられる。本発明の好ましい実施形態はまた、以下の非限定的な実施例および図面においても説明される。

図1は、本発明のベクター系、およびそのベクター系から生産されるウイルスを模式的に示す。図2は、HSV-1ゲノムへの2つの組換え部位の安定した挿入を検証する図である。図3は、本発明のもう一つのベクター系を模式的に示す。図4は、機能付与とも称される、組換え部位への2つの導入遺伝子発現カセットの安定した挿入を検証する図である。図5は、機能付与されたウイルスプラットフォーム（platform）NA-ICI-Tの詳細な分析を示す。

（実施例）
実施例において、本発明のベクター系の利点は、非小細胞肺がん（NSCLC）治療用の腫瘍溶解性ウイルスを得るために、標的制御タンパク質および免疫チェックポイント阻害薬を挿入することによって示されるが、より具体的には、上皮増殖因子受容体（EGFR）発現腫瘍細胞に対して標的化するための標的制御タンパク質、およびプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）に対する免疫チェックポイント阻害薬の挿入によって示される。免疫チェックポイント阻害薬は、抗PD-1抗体由来の単鎖可変領域フラグメント（scFv）に相当する。標的制御タンパク質は、HSV-1糖タンパク質HとN末端で融合された、EGFRに対するscFvからなる。その結果、複合ウイルス免疫療法用の機能的な遺伝子導入ウイルスが作製された。主な利点は、2つの異なる導入遺伝子発現カセットの、簡便でモジュール化された安定した挿入であり、それがベクターを機能化（functionalize）し、さまざまな導入遺伝子の組み合わせが可能となることである。

（実施例１）
図1は、本発明のベクター系の、組換え部位の挿入前（基本ベクター）および挿入後（プラットフォームベクター）を模式的に示したものである。領域UL（unique long）、US（unique short）、ならびに逆方向反復（inverted repeat）TR（末端反復（terminal repeat）、Terminal repeat long（TRL）およびTerminal repeat short（TRS））およびIR（内部反復（internal repeat）、Inverted repeat long（IRL）およびInverted repeat short（IRS））で構成されるHSV-1のゲノムを示す。さらに、HSV-1ゲノムは、ゲノムのunique long（UL）領域の中心に位置する1コピーのoriL、およびゲノムのunique short（US）領域に隣接する反復配列に位置する2コピーのoriSという、2種類の3つのDNA複製開始点を含有する。pBeloBAC11の配列、Creリコンビナーゼをコードする配列、およびZeocin選択カセットを含む、ここではBACとして示される非ウイルス部分は、loxP組換え部位に隣接し、追加のポリアデニル化シグナルとともにUL3とUL4の間に挿入される。プラットフォームベクターを生成するための2つの組換え部位であるFRTおよびmFRTは、それぞれUL10とUL11の間、またはUL55とUL56の間に挿入される。組換え部位を有する、組換え部位のためのコアプラスミド系は、Z. Ruzsicsのご厚意により提供された。

図1において次の記号が使用される：

図2は、HSV-1ゲノムへの2つの組換え部位の安定した挿入を検証した図である。A：UL10およびUL11、またはUL55およびUL56の中にある、結合するオリゴヌクレオチド（矢印で示す）からの、組換え部位を挿入する前（基本ベクター）および後（プラットフォームベクター）の断片サイズを模式的に描いた図である。2つのオリゴヌクレオチド間の数字は、塩基対の数に対応する。B：Aで示したオリゴヌクレオチド、および基本ベクターまたはプラットフォームベクターをテンプレートとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の断片。断片はアガロースゲル（2 %、トリス酢酸EDTAバッファー）で分離し、紫外線下でMidori Green Advanceにより可視化した。C：基本ウイルスおよびプラットフォームウイルスは、それぞれのBAC DNAを用いてVero細胞にトランスフェクトし、さらに培養することで再構成された。基本ウイルスおよびプラットフォームウイルスの増殖特性は、3連でVero細胞に感染させ（MOI 0.1）、感染後さまざまな時間（hpi）で細胞培養上清を回収し、プラークアッセイを用いてVero細胞上で定量することにより判定した。

（実施例２）
図3は、図1の概略図に基づいて2つの導入遺伝子により機能付与された後の、本発明のベクター系の概略図を示す。2つのビルレンス遺伝子UL37およびUL39は、それぞれ点変異および部分欠失を含み、神経毒性を欠いた弱毒化遺伝子導入ウイルス（platformNAと称する）が得られる。機能付与されたベクターplatformNA-ICI-Tは、組換え部位であるFRTおよびmFRTに2つの導入遺伝子をFlpを介して挿入することで生成される。ICIとして示される一方の導入遺伝子発現カセットは、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）に対する免疫チェックポイント阻害薬、より具体的にはPD-1に対する抗体由来の単鎖可変領域フラグメント（scFv）をコードする。Tとして表されるもう一方の導入遺伝子発現カセットは、腫瘍細胞上に発現される上皮増殖因子受容体（EGFR）に対する標的制御タンパク質をコードするが、より具体的には、標的制御タンパク質は、HSV-1糖タンパク質HにN末端で融合された、EGFRに対するscFv（R. Kontermannのご厚意により提供された）からなる。

図3において次の記号が使用される：

図4は、機能付与とも称される、2つの導入遺伝子発現カセットの組換え部位への安定した挿入の検証を示す。A：UL10およびUL11、またはUL55およびUL56またはUL55/UL56の中にある、結合するオリゴヌクレオチド（矢印で示す）から始まる導入遺伝子発現カセット、および標的制御タンパク質を含む導入遺伝子発現カセットを挿入する前（platform_NA ベクター）および後（platform_NA-ICI-T）の断片サイズを模式的に描いた図である。2つのオリゴヌクレオチド間の数字は、BおよびDで分離された、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生成した断片／産物の塩基対の長さに対応する。B：Aに示したオリゴヌクレオチド、およびplatform_NAまたはplatform_NA-ICI-Tベクターをテンプレートとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の断片を示す。断片はアガロースゲル（1.2 %、トリス酢酸EDTAバッファー）で分離し、紫外線下でMidori Green Advanceにより可視化した。C：分離したBAC DNAを制限酵素NotIで消化し、断片をアガロースゲル（0.6 %、トリスホウ酸EDTAバッファー）で分離して、紫外線下でエチジウムブロマイドにより可視化した。platform_NAベクターと機能付与されたベクターplatform_NA-ICI-Tとの間の制限パターンに関して予想される相違を矢印で強調して示している。D：Bに記載したPCR断片であるが、platform_NAウイルス（継代4）およびplatform_NA-ICI-Tウイルス（継代8）をテンプレートとして用いて、2つの組換え部位を用いた導入遺伝子発現カセット挿入の安定性を示す。両者のウイルスは、それぞれのBAC DNAを用いてVero細胞にトランスフェクトし、さらに培養することで再構成された。

図5は、増殖特性および発現を含めた、機能付与されたウイルスplatform_NA-ICI-Tの詳細な解析、ならびに挿入された導入遺伝子によってコードされるタンパク質の機能解析を示す。A：図4Dに記載のように再構成されたplatform_NA-ICI-Tウイルスと比較したplatform_NAウイルスの増殖特性は、3連でVero細胞に感染させ（MOI 0.1）、感染後さまざまな時間（hpi）で細胞培養上清を回収し、プラークアッセイを用いてVero細胞上で定量することにより判定した。B：EGFR発現細胞に対する標的化の機能解析は、（使用したscFvに適した）EGFRを発現するJ1.1cl2細胞およびJ1.1cl2細胞を、単独またはセツキシマブ（抗EGFR抗体）の存在下で感染（MOI 5）させることによって調べた。感染から16時間後に細胞溶解物を回収し、SDS-PAGEで分析した後、感染の指標としてHSV-1糖タンパク質B（gB）を検出するためにウェスタンブロットで分析した。G.Campadelli-Fiumeのご厚意により提供されたJ1.1cl2は、HSV-1に感染することができない。C：PD-1に対するscFvの発現を、Vero細胞ならびに非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株A549およびHCC827において分析した。感染（MOI 0.5）から16時間後に細胞溶解物を回収し、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットで分析し、Myc標識scFvを検出した。D：免疫チェックポイント阻害薬としての、ウイルスにコードされたPD-1に対するscFvの機能性を調べるために、市販のPD-1：PD-L1阻害薬スクリーニングアッセイを用いた。そこで、Vero細胞を感染させ（MOI 0.5）、感染後16時間で細胞溶解物を回収し、PD-1:PD-L1阻害薬スクリーニングアッセイで検証した。阻害対照として、抗PD-1抗体であるペムブロリズマブを使用した。

Claims

ウイルス部分および非ウイルス部分を含有するバクテリア人工染色体（BAC）構築物を含むベクター系であって、そのウイルス部分はアルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）のウイルスに由来し、非ウイルス部分は細菌プラスミドの配列を有するDNAを含んでおり、ウイルス部分は少なくとも2つの組換え部位を含むが、細菌プラスミドの配列を有するDNAが、第1のウイルス遺伝子と第2のウイルス遺伝子の配列間に挿入され、第1の組換え部位が、第3のウイルス遺伝子と第4のウイルス遺伝子の配列間に挿入され、第2の組換え部位が、第5のウイルス遺伝子と第6のウイルス遺伝子の配列間に挿入されることを特徴とする、前記ベクター系。
ウイルス部分が、単純ウイルス（Simplexvirus）属またはバリセロウイルス（Varicellovirus）属のウイルスに由来する、請求項1に記載のベクター系。
ウイルス部分が、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）に由来する、請求項1に記載のベクター系。
少なくとも2つの組換え部位のうちの少なくとも1つが、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列間に挿入される、および／または、細菌プラスミドの配列を有するDNA、好ましくは非ウイルス部分が、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列間に挿入される、請求項1～3のいずれか1つに記載のベクター系。
少なくとも2つの組換え部位が、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列間に挿入され、細菌プラスミドの配列を有するDNA、好ましくは非ウイルス部分が、2つのtail-to-tail方向の遺伝子の配列間に挿入される、請求項1～4のいずれか1つに記載のベクター系。
細菌プラスミドの配列を有するDNAが、UL3遺伝子とUL4遺伝子の配列間に挿入される、および／または、少なくとも2つの組換え部位の1つが、UL10遺伝子とUL11遺伝子の配列間に挿入され、好ましくは第2の組換え部位が、UL55遺伝子とUL56遺伝子の配列間に挿入される、請求項1～5のいずれか1つに記載のベクター系。
非ウイルス部分が、プラスミドpBeloBAC11のDNA配列を含む、請求項1～6のいずれか1つに記載のベクター系。
細菌プラスミドの配列を有するDNAを、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの後、組換えによって除去することができる、請求項1～7のいずれか1つに記載のベクター系。
遺伝子導入ウイルスを生成および／または生産するための、請求項1～8のいずれか1つに記載のベクター系の使用。
遺伝子導入ウイルスを生産するための方法であって：
a) 導入遺伝子発現カセットを、請求項1～8のいずれか1つに記載のベクター系の少なくとも2つの組換え部位のうちの1つに導入して、遺伝子導入ウイルスをコードするベクターを得るステップ；
b) ステップa)で得られたベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトするステップ；
c) トランスフェクトされた哺乳動物細胞を培養するステップ；
d) 哺乳動物細胞で生産されたウイルスを単離するステップ
を含む、前記方法。
ステップa）において、第1の導入遺伝子発現カセットが、請求項1～8のいずれか1つに記載のベクター系の、少なくとも2つの組換え部位のうちの第1の部位に導入され、第2の導入遺伝子発現カセットが、少なくとも2つの組換え部位のうちの第2の部位に導入される、請求項10に記載の方法。
ステップa）が、原核生物の系で行われる、請求項10または11に記載の方法。
導入遺伝子発現カセットが、少なくとも1つのタンパク質もしくは少なくとも1つのペプチドまたはRNAをコードするが、好ましくは、標的制御タンパク質、サイトカインなどの免疫調節薬、抗がんペプチド（ACP）もしくはタンパク質、アポトーシス促進タンパク質、細胞外マトリックス分解タンパク質、腫瘍抗原提示のためのタンパク質、病原性抗原、およびそれらの組み合わせからなる一群から選択される、タンパク質もしくはペプチドをコードする、請求項10～12のいずれか1つに記載の方法。
ワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療用ウイルスベクターを生産するための、請求項10～13のいずれか1つに記載の方法。
請求項10～14のいずれか1つに記載の方法で得られるウイルス。
ワクチンとして、もしくは腫瘍溶解性ウイルスとして使用するための、または遺伝子治療に使用するための、請求項15に記載のウイルス。