CN116322726A - 用于将转基因模块化和简化插入α疱疹病毒的平台载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种载体系统，其可用作平台载体并适于生产α疱疹病毒亚科的转基因病毒。这种转基因病毒可以用作疫苗或溶瘤病毒或基因治疗。本发明的平台载体是一种载体系统，其允许对病毒进行简化的搜索、生成和生产。本发明还涉及平台载体作为用于生成和产生转基因病毒的载体系统的用途、使用本发明的载体系统生产转基因病毒的方法和通过这种方法获得的病毒。
Description
技术领域
本发明涉及一种载体系统，其可用作平台载体并适于生产α疱疹病毒(Alphaherpsvirinae)亚科的转基因病毒。这种转基因病毒可以用作疫苗或溶瘤病毒或基因治疗。本发明的平台载体是一种载体系统，其允许对病毒进行简化的搜索、生成和生产。本发明还涉及平台载体作为用于生成和产生转基因病毒的载体系统的用途、使用本发明的载体系统生产转基因病毒的方法和通过这种方法获得的病毒。
背景技术
α疱疹病毒是疱疹病毒(Herpersviridae)科中的一个病毒亚科，其主要特点是繁殖速度比其他亚科快，神经元持久性强，哺乳动物宿主范围广。α疱疹病毒含有高度相关的动物和人类病毒病毒学。该亚科目前有42种。此外，单纯疱疹病毒1(HSV-1)和单纯疱疹病毒2(HSV-2)以及密切相关的人类α-疱疹病毒3(HHV-3)也属于这个亚科。
单纯疱疹病毒的许多变种已被考虑用于癌症的病毒治疗，即用作溶瘤疱疹病毒。这种疱疹病毒会感染并杀死癌症细胞。当受感染的细胞被裂解破坏时，它们会释放出新的感染性病毒颗粒或变体，以帮助破坏剩余的肿瘤(S.Varghese和S.D.Rabkin，Cancer GeneTherapy(2002)9,967-978)。疱疹病毒载体在基因治疗(V.Hukkanen，The Open VirologyJournal(2010)494-95)和作为疫苗载体(P.Marconi等人，Human Vaccines(2008)4(2)，91-105)中的应用也是已知的。
细菌人工染色体(BAC)是基于功能生育质粒的DNA构建体，用于细菌(通常是大肠杆菌)的转化和克隆。BAC可用于克隆大的基因组序列，从而使细菌人工染色体的插入大小通常为150至350kbp。US 2012/000742A1和M.Tanaka等人，J.Virol(2003)77(2)，1382-1391描述了将单纯疱疹病毒1型(HSV-1)基因组克隆为细菌人工染色体。
现有技术的相应BAC不是用于搜索和产生新的和改进的转基因病毒的合适工具，所述病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中产生。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种工具，特别是一种载体，其允许一种简化的方法来搜索新的合适的、特别是改进的α疱疹病毒亚科转基因病毒，特别是可以用作疫苗或溶瘤病毒或基因治疗的此类病毒。
本发明的另一个目的是提供新的α疱疹病毒亚科转基因病毒以及开发和生产它们的工具，其中转基因病毒具有改进的功能性。
本发明的问题通过提供根据权利要求1的载体系统来解决。
因此，本发明涉及一种包含细菌人工染色体(BAC)构建体的载体系统，所述载体系统包含病毒部分和非病毒部分，其中所述病毒部分衍生自α疱疹病毒亚科的病毒，其中，所述非病毒部分包含具有细菌质粒序列的DNA，其中，病毒部分包含至少两个重组位点。
病毒部分的至少两个重组位点适合或用于功能化，特别是用于通过插入转基因表达盒进行功能化。
在优选实施方案中，病毒部分包括两个重组位点。在优选实施方案中，病毒部分正好具有两个重组位点，用于插入包含一个或多个基因(转基因)的转基因表达盒，即开放阅读框，以及允许选择和控制其表达的相应元件。
根据本发明的至少两个重组位点有利地允许至少两个转基因表达盒的模块化和简化插入。引入不只一个和至少两个转基因表达盒的可能性允许搜索、产生、测试和生产具有新的和可组合功能的新的和更合适的转基因病毒。两个转基因表达盒可以以模块化的方式组合，以简化的方法产生新的转基因病毒。本发明允许例如将转基因表达盒插入病毒部分的第一重组位点，并测试该转基因表达盒的至少一种产物与可插入病毒部分第二重组位点的转基因表达盒不同其他产物的相互作用。有利地，可以结合两种不同转基因表达盒的功能和效果来改进病毒。因此，根据本发明的载体系统可以有利地用作平台载体，用于生成和产生新的α疱疹病毒亚科转基因病毒，优选转基因单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)。根据本发明的载体系统允许插入至少两个转基因表达盒，抗癌肽(ACP)或蛋白、促凋亡蛋白、细胞外基质降解蛋白、肿瘤抗原呈递蛋白和病原体抗原。由于这些转基因表达盒中的两种或多种的组合，可以获得新的和功能改进的转基因病毒。
本领域技术人员已知合适的重组位点，如FRT及其变体，如mFRT(突变的FRT，如T.Schlake和J.Bode；Biochemistry.1994；33(43):12746-12751中所述)，或如rox和loxP。在优选实施方案中，至少两个重组位点是用于与位点特异性重组酶进行重组的位点。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点是与Flp重组酶、Dre重组酶或Cre重组酶进行重组的位点。
在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点是不同的重组位点，例如第一重组位点是FRT重组位点，第二重组位点是mFRT重组位点。这具有的优点是，可以将转基因或转基因盒特定地插入任一重组位点。
在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点是FRT或mFRT或rox或loxP位点。在优选实施方案中，至少两个重组位点之一是FRT或mFRT或rox或loxP位点。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点之一是FRT位点。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点之一是mFRT位点。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点之一是FRT位点，另一个是mFRT位点。在优选实施方案中，至少两个重组位点之一也可以是loxP位点或rox位点。
在优选的实施方案中，病毒部分源自α疱疹病毒。在一个优选的实施方案中，病毒部分源自单纯疱疹病毒属或水痘疱疹病毒属的病毒。在优选实施方案中，病毒部分源自单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)或人α疱疹病毒3(HHV3)。
在一个优选的实施方案中，病毒部分不源自马立克病毒属(Mardivirus)的病毒。
在优选实施方案中，病毒部分源自单纯疱疹病毒。在优选实施方案中，病毒部分源自单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)。在优选实施方案中，病毒部分源自单纯疱疹病毒1(HSV-1)。在优选实施方案中，病毒部分源自单纯疱疹病毒2(HSV-2)。在替代实施方案中，病毒部分源自人类α疱疹病毒3(HHV3)。
在优选实施方案中，病毒部分编码α疱疹病毒。在优选实施方案中，病毒部分编码来自单纯疱疹病毒属或来自水痘疱疹病毒属的病毒。在优选实施方案中，病毒部分编码单纯疱疹病毒。在优选实施方案中，病毒部分编码单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)或人α疱疹病毒3(HHV3)。
在一个优选的实施方案中，病毒部分不编码来自马立克病毒属的病毒。
在优选实施方案中，病毒部分编码单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)。在优选实施方案中，病毒部分编码单纯疱疹病毒1(HSV-1)。在优选实施方案中，病毒部分编码单纯疱疹病毒2(HSV-2)。在优选实施方案中，病毒部分编码人α疱疹病毒3(HHV3)。
一方面，α疱疹病毒是相关病原体，其需要改进的疫苗。另一方面，α疱疹病毒肽是众所周知的和完全测序的，因此适合用作溶瘤病毒、疫苗载体或基因治疗的工具。
根据本发明，载体系统包括非病毒部分和病毒部分。病毒部分是指与疱疹病毒亚科病毒起源有关的DNA序列。根据本发明，病毒部分包括至少两个重组位点。这些重组位点不必来自病毒。这些至少两个重组位点插入病毒部分，因此位于病毒部分。如上所述，这些至少两个重组位点优选不是病毒来源的，而是重组位点，如FRT、mFRT、loxP或rox。
非病毒部分指的是其他DNA序列，特别是细菌序列。非病毒部分也可以包含真核序列。非病毒部分还可以包括病毒序列，不包括α疱疹病毒亚科病毒的编码序列。因此，非病毒部分还可以特别包括噬菌体序列，例如用于细菌质粒中的噬菌体序列。
在优选的实施方案中，非病毒部分仅包含真核和/或细菌序列或仅包含与噬菌体序列组合的真核和/或细菌序列。
根据本发明，非病毒部分包含具有细菌质粒序列的DNA。这些序列优选可以是BAC盒，即构建本发明载体系统的BAC核心的序列，例如质粒pBeloBAC11的序列。非病毒部分可包含其他DNA序列。非病毒部分的其他DNA序列可以直接连接到构建载体系统BAC核心的序列上，或者可以例如通过病毒部分的DNA序列与构建载体系统的BAC核心序列分离。在优选实施方案中，非病毒部分的其他DNA序列直接连接到构建载体系统BAC核心的序列上。在更优选的实施方案中，非病毒部分通过两个重组位点，更优选通过两个同种重组位点，最优选通过两种loxP重组位点与病毒部分分离。这两个重组位点，例如非病毒部分的loxP重组位点不同于用于搜索和产生功能化载体和病毒的病毒部分的两个重组位点。
根据本发明，载体系统具有病毒部分和非病毒部分，其中病毒部分包括至少两个重组位点。这至少两个重组位点可用于引入转基因表达盒。转基因表达盒可以是任何种类的来源，并且插入到病毒部分的重组位点中，却是与载体系统的病毒和非病毒部分不同的实体。
本发明涉及具有或不具有引入病毒部分重组位点的转基因表达盒的载体系统。
在优选实施方案中，转基因表达盒的DNA序列在插入病毒部分的至少两个重组位点之后通过病毒部分的DNA序列与非病毒部分分离，特别是与构建载体系统BAC核心的序列分离。
在优选实施方案中，在插入病毒部分的至少两个重组位点之后，通过病毒部分的DNA序列将至少两个转基因表达盒的DNA序列彼此分离。
在优选实施方案中，将具有非病毒部分的细菌质粒序列的DNA插入第一病毒基因和第二病毒基因的序列之间。
在优选实施方案中，将非病毒部分插入第一病毒基因和第二病毒基因的序列之间。
在优选实施方案中，病毒部分的第一重组位点插入两个病毒基因的序列之间。在优选实施方案中，病毒部分的第一重组位点插入两个病毒基因的序列之间，病毒部分的第二重组位点插入到另外两个病毒基因的序列之间。
在优选实施方案中，将非病毒部分插入第一病毒基因和第二病毒基因的序列之间，病毒部分的第一重组位点插入第三病毒基因和第四病毒基因的序列之间，病毒部分的第二重组位点插入第五病毒基因和第六病毒基因的序列之间。
在优选实施方案中，将具有非病毒部分细菌质粒序列的DNA插入第一病毒基因和第二病毒基因的序列之间，病毒部分的第一重组位点插入第三病毒基因和第四病毒基因的序列之间，病毒部分的第二重组位点插入第五病毒基因和第六病毒基因的序列之间。
在本发明的上下文中，“第一病毒基因和第二病毒基因”优选地指两个相邻的基因，“第三病毒基因和第四病毒基因”优选是指两个相邻基因，“第五病毒基因和第六病毒基因”是指两个相邻基因，其中第一、第二、第三、第四、第五和第六基因优选是各自不同的基因。
在优选实施方案中，病毒部分包含至少50％，更优选至少65％，最优选至少80％的α疱疹病毒亚科病毒，优选单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)或人α疱疹病毒3(HHV3)的编码序列。
在优选的实施方案中，病毒部分包含至少50％，更优选至少65％，最优选至少80％的α疱疹病毒亚科病毒，优选单纯疱疹病毒，最优选单纯疱疹1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)或人α疱疹病毒3(HHV3)的编码序列。
在优选的实施方案中，病毒部分包含至少50％，更优选至少65％，最优选至少80％的α疱疹病毒亚科病毒，优选单纯疱疹病毒，最优选单纯疱疹1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)的编码序列。
在优选实施方案中，病毒部分包含56个编码序列UL1至UL56中的至少25个编码序列，更优选30个编码序列，更进一步优选40个编码序列。
在优选实施方案中，病毒部分包含12个编码序列US1至US12中的至少5个编码序列，更优选6个编码序列，更进一步优选9个编码序列。
在优选实施方案中，病毒部分包含基因产物UL1至UL56的56个编码序列中的至少25个编码序列，更优选30个编码序列，更进一步优选40个编码序列；以及基因产物US1至US12的12个编码序列中的至少5个编码序列(更优选6个编码序列)，更优选9个编码序列。在优选实施方案中，病毒部分包括病毒基因组的反向重复序列的至少一些编码基因，例如末端重复序列和/或内部重复序列。
本领域技术人员知道可用于载体系统的病毒部分的α疱疹病毒亚科，特别是单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒2(HSV-2)或人类α疱疹病毒3(HHV3)的合适和必要的开放阅读框(ORF)。
在优选实施方案中，病毒部分包括基因产物UL1至UL56的56个编码序列和基因产物US1至US12的12个编码序列中的所有编码序列。
本领域技术人员已知编码序列UL1至UL56和US1至US12以及单纯疱疹病毒的基因产物及其在其他α疱疹病毒亚科中的相应同系物，并描述于例如D.J.McGeoch等人,Journalof General Virology(1988).69(7):1531–1574,in D.J.McGeoch等人,Journal ofMolecular Biology,(1985)181(1):1–13,in T Lenac
SM Bailer等人,Journal ofVirology(2013),87(12):6943-54,inBG Klupp等人,Journal ofVirology(2004)；78(1):424-440和A.Dolan等人,Journal of Virology(1998),72(3):2010-2021。
在优选实施方案中，将非病毒部分插入两个尾到尾定向的基因或开放阅读框的序列之间。在本发明的上下文中，“两个尾到尾定向的基因或开放阅读框”优选地指两个相邻的两个尾到尾定向的基因或者开放阅读框。
在优选实施方案中，将非病毒部分插入UL3基因和UL4基因的序列之间。
两个尾到尾定向的基因如UL3和UL4的基因间区特别适合，因为基因的尾到尾定向产生了一个基因间区，在该区域中，在两个尾到尾的定向聚腺苷酸化信号之间插入一个外来基因(如非病毒部分)不会破坏任何病毒基因或转录单位。
进一步相应地，合适的插入位点在UL7基因和UL8基因的序列之间、UL10基因和UL11基因的序列之间、UL15基因和UL18基因的序列之间、UL21基因和UL22基因的序列之间、UL26基因和UL27基因的序列之间、UL35基因和UL36基因的序列之间、UL40基因和UL41基因的序列之间、UL45基因和UL46基因的序列之间、UL55基因和UL56基因的序列之间以及US9基因和US10基因的序列之间。
在一个优选的实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点中的至少一个插入到两个尾对尾定向的基因的序列之间。在一个优选的实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点都插入两个尾对尾定向的基因的序列之间。在一个优选的实施方案中，所有病毒部分的至少两个重组位点全部插入两个尾对尾定向的基因的序列之间。
在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点之一插入UL10基因和UL11基因的序列之间。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点之一插入UL55基因和UL56基因的序列之间。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点中的一个插入UL10基因和UL11基因的序列之间。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点之一插入UL10基因和UL11基因的序列之间，病毒部分的至少两个重组位点中的另一个插入UL55基因和UL56基因的序列之间。上述两个尾对尾定向的基因的另一个基因间区，即UL7基因和UL8基因的序列之间、UL3基因和UL4基因的序列之间、UL15基因和UL18基因的序列之间、UL21基因和UL22基因的序列之间、UL26基因和UL27基因的序列之间、UL35基因和UL36基因的序列之间、UL40基因和UL41基因的序列之间、UL45基因和UL46基因的序列之间、以及US9基因和US10基因的序列之间也是优选的。
在优选实施方案中，病毒部分的至少两个重组位点以一定距离插入，更优选大距离插入。在优选的实施方案中，在病毒部分的两个重组位点之间定位相距至少5个基因，更优选至少20个基因，更进一步优选至少30个基因，进一步优选至少40个基因。优选地，病毒部分的至少两个重组位点之间的这些基因是UL基因。
在一个优选的实施方案中，病毒部分的两个重组位点位于至少4kb(千碱基)，更优选至少6kb，更进一步优选至少8kb，最优选至少10kb，更进一步优选至少25kb，更进一步优选至少50kb，更进一步优选至少75kb的距离内。
在优选实施方案中，非病毒部分位于距病毒部分的至少两个重组位点的距离处。在优选实施方案中，在非病毒部分和病毒部分的两个重组位点之间定位相距至少1个基因，更优选至少2个基因。
在一个优选的实施方案中，非病毒部分之间的距离与病毒部分的两个重组位点相距至少4kb(千碱基)，更优选至少6kb，更进一步优选至少8kb，最优选至少10kb。
优选选择该距离，使得两个重组位点和非病毒部分位于基因产物UL1至UL56和US1至US12的编码序列之外。
至少两个重组位点之间的距离，更优选大的距离可以具有这样的优点，即可以避免在插入多于一个转基因表达盒之后的空间阻碍。
在一个优选的实施方案中，非病毒部分和病毒部分的至少两个重组位点插入两个尾对尾定向的基因的序列之间，更优选将非病毒部分和病毒部分的至少两个重组位点插入不同的基因间区，所述基因间区选自UL15基因和UL18基因的序列之间、UL21基因和UL22基因的序列之间、UL26基因和UL27基因的序列之间、UL35基因和UL36基因的序列之间、UL40基因和UL41基因的序列之间、UL45基因和UL46基因的序列之间、UL55和UL56基因的序列之间、以及US9基因和US10基因的序列之间。
在优选实施方案中，病毒部分的至少一个基因被突变。在优选实施方案中，至少一个UL基因被突变。在优选实施方案中，病毒部分的至少两个基因被突变。在优选实施方案中，至少两个UL基因被突变。在优选实施方案中，至少一个突变基因是毒力基因。在优选实施方案中，至少两个毒力基因被突变。在优选实施方案中，两个毒力基因被突变。在优选实施方案中，UL37被突变。在优选实施方案中，UL39被突变。在优选实施方案中，至少UL37和UL39被突变。在优选实施方案中，UL37和UL39被突变。在优选实施方案中，突变是点突变或缺失。在优选实施方案中，UL37基因中存在点突变，UL39基因中存在缺失。
UL37和/或UL39等毒力基因的突变具有可以避免病毒的神经毒性和优化病毒安全性的优点。
在优选的实施方案中，优选病毒部分的至少一个基因突变的病毒是在表达相应病毒基因(例如UL39)的反式互补细胞系中产生的。在优选实施方案中，病毒在可调节启动子的控制下在表达UL39基因的反式互补细胞系中产生。
在优选实施方案中，非病毒部分包括质粒pBeloBAC11的序列。
在优选实施方案中，非病毒部分包括额外的聚腺苷酸化信号。
在优选实施例中，非病毒部分包括选择盒。
在优选实施方案中，非病毒部分可以在哺乳动物细胞中通过重组转染后去除。
在一个优选的实施方案中，非病毒部分，更优选具有细菌质粒序列的DNA，由重组位点，优选不同于插入病毒部分的两个重组位点的重组位点构成框架。这具有的优点是，当在哺乳动物细胞中产生转基因病毒时，可以去除具有细菌质粒序列的DNA，例如质粒pBeloBAC11的序列。
在一个优选的实施方案中，非病毒部分，更优选具有细菌质粒序列的DNA，包括Cre重组盒，并由loxP位点作为侧翼。当在哺乳动物细胞中产生转基因病毒时，两个loxP位点之间的非病毒部分被去除。
在优选的实施方案中，非病毒部分包括质粒pBeloBAC11的序列和侧翼为loxP位点的Cre重组盒。
因此，根据优选实施方案，非病毒部分在一端包括第一重组位点，例如loxP，在另一端包括与第一重组位点相同种类的第二重组位点。这些重组位点不同于用于搜索、生成和产生功能化载体和病毒的病毒部分的两个重组位点。在非病毒部分的两个重组位点之间是具有细菌质粒序列的DNA，并且优选其他序列如Cre重组盒和/或选择标记盒。在另一优选实施方案中，在非病毒部分的两个重组位点之外存在额外的聚腺苷酸化信号。
因此，在优选实施方案中，载体系统包括病毒部分中的两个不同的重组位点和非病毒部分末端的两个另外的重组位点，其中非病毒部分的两个重组位点是相同种类的，但不同于病毒部分的这两个重组位点。
本发明还涉及根据本发明的载体系统用于生成和/或产生转基因病毒的用途。在优选实施方案中，转基因病毒包括两个转基因表达盒。
根据本发明，转基因表达盒包含一个或多个基因(转基因)，即开放阅读框，以及允许选择和控制其表达的序列。在优选实施方案中，转基因表达盒包含至少一种转基因。在优选实施方案中，两个转基因表达盒各自包含至少一个转基因。在优选的实施方案中，两个转基因表达盒分别由一个转基因组成。在优选实施方案中，两个转基因表达盒中的一个由一个转基因组成。在优选实施方案中，两个转基因表达盒中的一个包含至少两个转基因。
本发明还涉及用于生成和/或产生转基因病毒的根据本发明的载体系统。在优选实施方案中，转基因病毒包括两个转基因表达盒。
本发明还涉及一种生产转基因病毒的方法，包括以下步骤：
a)将转基因表达盒引入根据本发明的载体系统的病毒部分的至少两个重组位点之一，以获得编码转基因病毒的载体；
b)将步骤a)中获得的载体转染哺乳动物细胞；
c)培养转染的哺乳动物细胞；
d)分离哺乳动物细胞中产生的病毒。
在步骤a)中的优选实施方案中，将第一转基因表达盒引入至少两个重组位点中的第一个，将第二转基因表达和引入所述载体系统病毒部分至少两个重组位点中的第二个。
本领域技术人员知道用于引入转基因和转基因表达盒的方法，特别是在提供两个重组位点的情况下，特别是当提供两个不同的重组位点时。在优选实施方案中，步骤a)在原核系统中进行。或者，可以使用真核系统，优选哺乳动物细胞系。
优选地，步骤b)至d)的哺乳动物细胞是哺乳动物细胞系。优选地，所述细胞系是Vero细胞系。
根据步骤b)至d)的转基因病毒的生产可以在非互补细胞系中进行，如果没有缺失病毒的必需基因，或者可以在反式互补细胞系进行，特别是如果转基因病毒用作疫苗。
在优选的实施方案中，通过重组在哺乳动物细胞中转染后去除具有细菌质粒序列的DNA。
在优选实施方案中，转基因表达盒内的转基因编码蛋白质或肽或RNA。在优选实施方案中，至少一种转基因编码蛋白质或肽。在优选实施方案中，转基因或转基因表达盒内的至少一种转基因编码具有医学功能的蛋白质或肽。在优选实施方案中，转基因或转基因表达盒内的至少一个转基因编码选自以下的蛋白质或肽：靶向控制蛋白、免疫调节剂(如免疫检查点抑制剂或细胞因子)、抗癌肽(ACP)或蛋白、促凋亡蛋白、细胞外基质降解蛋白、用于肿瘤抗原呈递的蛋白质和病原体抗原。
在优选实施方案中，第一转基因表达盒和第二转基因表达盒各自编码至少一种蛋白质或至少一种肽或RNA，优选自以下至少一种蛋白质或至少一种肽：靶向控制蛋白、免疫调节剂(如免疫检查点抑制剂或细胞因子)、抗癌肽(ACP)或蛋白、促凋亡蛋白、细胞外基质降解蛋白、用于肿瘤抗原呈递的蛋白质和病原体抗原。
转基因表达盒的转基因可以受组成型启动子或可调节启动子的控制。启动子可以是单纯疱疹病毒衍生的启动子、可诱导(正调节)启动子或负调节启动子。负调节可有利地用于溶瘤病毒的产生和细胞损伤蛋白的表达。
第一转基因表达盒中的第一转基因可以受与第二转基因表达盒内的第二转基因不同的启动子的控制。应当或被引入载体系统的至少两个重组位点之一的转基因可以是编码单个蛋白质、肽或RNA的单个开放阅读框。应被引入或被引入载体系统的病毒部分的至少两个重组位点之一的转基因盒也可以包括一个以上的开放阅读框。所以，可以用至少两个重组位点产生两种以上不同的蛋白质或肽。
如果将转基因表达盒引入病毒部分的至少两个重组位点中的一个，并且转基因表达盒包含多于一个转基因，即多于一个开放阅读框，则转基因表达盒的不同转基因可以受相同启动子的调节下或在不同启动子的调控。
在优选实施方案中，根据本发明的方法用于生产用于基因治疗的疫苗或溶瘤病毒或病毒载体。
本发明还涉及在根据本发明的方法中获得的病毒。
在根据本发明的用途中可获得的或获得的转基因病毒优选是α疱疹病毒亚科的病毒。
在优选的实施方案中，病毒用作疫苗或溶瘤病毒或基因治疗。
在优选的实施方案中，病毒是用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的溶瘤病毒，优选具有两个转基因表达盒，即靶向表达表皮生长因子受体(EGFR)的肿瘤细胞的靶向控制蛋白和针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的免疫检查点抑制剂。
本发明还涉及包含本发明病毒的疫苗或溶瘤病毒或病毒载体。
从属权利要求中概述了进一步的优选实施方案。
应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。应当注意，在根据本发明的载体系统的上下文中描述的实施方案和特征也可以与在本发明的方法和病毒的上下文中所描述的实施方案和特征组合，反之亦然，除非另有明确说明。
附图说明
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用全部并入本文。本发明的优选实施方案也在以下非限制性实例和附图中描述。
图1示意性地示出了根据本发明的载体系统和由该载体系统产生的病毒；
图2示出了两个重组位点稳定插入HSV-1基因组的验证；
图3示意性地示出了根据本发明的另一个载体系统；
图4示出了两个转基因表达盒在重组位点的稳定插入的验证，也称为功能化；
图5示出了功能化病毒platformNA-ICI-T的详细分析。
具体实施方式
实施例
在实施例中，通过插入靶向控制蛋白和免疫检查点抑制剂以获得用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的溶瘤病毒，更具体地为靶向表达表皮生长因子受体(EGFR)的肿瘤细胞的靶向控制蛋白和针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂对应于衍生自抗PD-1抗体的单链可变片段(scFv)。靶向控制蛋白由抗EGFR的单链抗体组成，其N末端与HSV-1糖蛋白H融合。结果是，产生了用于联合病毒免疫治疗的功能化转基因病毒。主要优点是简化、模块化和稳定地插入两个不同的转基因表达盒，以使载体功能化，从而允许不同的转基因组合。
实施例1
图1显示了在插入重组位点(平台载体)之前(基础载体)和之后根据本发明的载体系统的示意图。HSV-1的基因组由UL(长独特)区、US(短独特)区和反转重复TR(末端重复、末端长重复(TRL)和末端短重复(TRS))区和IR(内部重复、反转长重复(IRL)和反转短重复(IRS))区组成。此外，HSV-1基因组包含两种类型的DNA复制的三个起源：位于基因组长独特(UL)区中心的一个oriL拷贝和位于基因组短独特(US)区两侧重复序列的两个oriS拷贝。非病毒部分，这里显示为BAC，包括pBeloBAC11的序列，该序列编码Cre重组酶和Zeocin选择盒，两侧是loxP重组位点，并插入UL3和UL4之间，以及附加的聚腺苷酸化信号。生成平台载体的两个重组位点FRT和mFRT分别插入UL10和UL11或UL55和UL56之间。Z.Ruzsics提供了具有重组位点的核心质粒系统。
图1中使用了以下符号：
图2示出了两个重组位点稳定插入HSV-1基因组的验证。A：从结合UL10和UL11或UL55和UL56的寡核苷酸(如箭头所示)开始插入重组位点(平台载体)之前(基础载体)和之后的片段大小示意图。两个寡核苷酸之间的数目对应于碱基对的数目。B：使用A中所示的寡核苷酸和基础或平台载体作为模板的聚合酶链反应(PCR)片段。片段在琼脂糖凝胶(2％，三乙酸EDTA缓冲液)中分离，并在紫外光下通过Midori Green Advance进行可视化。C：通过用各自的BAC DNA转染Vero细胞并进一步培养，重组基础和平台病毒。通过三次感染Vero细胞(MOI为0.1)、在感染后不同时间采集细胞培养上清液(hpi)并使用菌斑试验对Vero细胞进行滴定来确定基础病毒和平台病毒的生长特性。
实施例2
图3示出了根据本发明的载体系统在基于图1的示意图的两个转基因功能化之后的示意图。两个毒力基因UL37和UL39分别含有点突变和部分缺失，以获得一种缺乏神经毒性的减毒转基因病毒(称为platformNA)。功能化载体platformNA-ICI-T通过Flp介导的两个转基因在重组位点FRT和mFRT的插入而产生。一个描述为ICI的转基因表达盒编码针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的免疫检查点抑制剂，更具体地，编码源自针对PD-1的抗体的单链可变片段(scFv)。描述为T的另一个转基因表达盒编码针对在肿瘤细胞上表达的表皮生长因子受体(EGFR)的靶向控制蛋白，更具体地，靶向控制蛋白由针对EGFR的scFv(由R.Kontermann提供)组成，其N端与HSV-1糖蛋白H融合。
图3中使用了以下符号：
图4示出了两个转基因表达盒在重组位点的稳定插入的验证，也称为功能化。A：从结合在UL10和UL11或UL55和UL56或UL55/UL56中的寡核苷酸(如箭头所示)开始插入转基因表达盒(platformNA-ICI-T)之前(platformNA载体)和之后的片段大小的示意图，以及包含靶向控制蛋白的转基因表达盒。两个寡核苷酸之间的数量对应于通过在B和D中分离的聚合酶链反应(PCR)产生的碱基对中的片段/产物的长度。在琼脂糖凝胶(1％，2％，三乙酸-EDTA缓冲液)中分离片段，并在紫外光下通过Midori GreenAdvance进行可视化。C：分离的BACDNA用限制性酶NotI消化，片段在琼脂糖凝胶(0.6％，三硼酸EDTA缓冲液)中分离，并在紫外光下用溴化乙锭可视化。关于platformNA载体和功能化载体platformNA-ICI-T之间的限制模式的预期差异用箭头突出显示。D：如B中所述的PCR片段，但使用platformNA病毒(第4代)和platformNA-ICI-T病毒(第8代)作为模板。通过用各自的BAC DNA转染Vero细胞重组了两种病毒并进一步培养。
图5示出了功能化病毒platformNA-ICI-T的详细分析，包括生长特性和表达以及插入转基因所编码蛋白的功能分析。A：通过三次感染Vero细胞(MOI为0.1)、在感染后不同时间采集细胞培养上清液(hpi)以及使用菌斑试验滴定Vero细胞，测定platformNA病毒与重组platformNA-ICI-T病毒(如图4D所示)的生长特性。B：通过单独或在Cetuximab(抗EGFR抗体)存在下感染(MOI为5)J1.1cl2细胞和表达EGFR的J1.1cl1细胞(适用于所用scFv)来研究靶向EGFR表达细胞的功能分析。收集感染后16小时的细胞裂解物，并通过SDS-PAGE进行分析。J1.1cl2，由G.Campadelli Fiume提供，不能被HSV-1感染。C：分析了抗PD-1的scFv在Vero细胞以及非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549和HCC827中的表达。感染后16小时(MOI为0.5)收获细胞裂解物，并通过SDS-PAGE和Western Blot分析以检测Myc标记的scFv。D：为了测试针对PD-1的病毒编码scFv作为免疫检查点抑制剂的功能性，应用了市售的PD-1:PD-L1抑制剂筛选试验。因此，Vero细胞被感染(MOI为0.5)，感染后16小时收获细胞裂解物，并在PD-1:PD-L1抑制剂筛选试验中进行测试。抗PD-1抗体派姆单抗(Pembrolizumab)用作抑制对照。
Claims (16)
1.一种包含细菌人工染色体(BAC)构建体的载体系统，其包含病毒部分和非病毒部分，其中所述病毒部分源自α疱疹病毒亚科的病毒，其中所述非病毒部分包含具有细菌质粒序列的DNA，所述病毒部分包括至少两个重组位点，其中具有细菌质粒序列的DNA插入到第一病毒基因和第二病毒基因序列之间，所述第一重组位点插入到第三病毒基因和第四病毒基因的序列之间，所述第二重组位点插入到第五病毒基因和第六病毒基因的序列之间。
2.根据权利要求1所述的载体系统，其中所述病毒部分源自单纯疱疹病毒属或水痘疱疹病毒属的病毒。
3.根据权利要求1所述的载体系统，其中所述病毒部分源自单纯疱疹病毒。
4.根据前述权利要求所述的载体系统，其中，所述至少两个重组位点中的至少一个插入到两个尾对尾定向的基因的序列之间，和/或其中，具有细菌质粒序列的DNA，优选非病毒部分插入到两条尾对尾定向的基因的序列之间。
5.根据前述权利要求所述的载体系统，其中所述至少两个重组位点插入到两个尾对尾定向的基因的序列之间，并且其中所述具有细菌质粒序列的DNA，优选所述非病毒部分插入到两个尾到尾定向的基因的序列之间。
6.根据前述权利要求所述的载体系统，其中所述具有细菌质粒序列的DNA插入到UL3基因和UL4基因的序列之间，和/或其中所述至少两个重组位点之一插入到UL10基因和UL11基因的序列之间，其中优选第二重组位点插入到UL55基因和UL56基因的序列之间。
7.根据前述权利要求所述的载体系统，其中所述非病毒部分包含质粒pBeloBAC11的DNA序列。
8.根据前述权利要求所述的载体系统，其中所述具有细菌质粒序列的DNA可以在哺乳动物细胞中通过重组转染后去除。
9.根据前述权利要求所述的载体系统用于生成和/或产生转基因病毒的用途。
10.一种生产转基因病毒的方法，包括以下步骤：
a)将转基因表达盒引入根据权利要求1至8所述的载体系统的至少两个重组位点之一，以获得编码转基因病毒的载体；
b)将步骤a)中获得的载体转染哺乳动物细胞；
c)培养转染的哺乳动物细胞；
d)分离哺乳动物细胞中产生的病毒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤a)中，将第一转基因表达盒引入到根据权利要求1至8所述的载体系统的所述至少两个重组位点中的第一个，并且将第二转基因表达盒引入到所述至少二个重组位点的第二个。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中步骤a)在原核系统中进行。
13.根据权利要求10至12所述的方法，其中所述转基因盒编码至少一种蛋白质或至少一种肽或RNA，优选自以下蛋白质或肽：靶向控制蛋白、如细胞因子的免疫调节剂、抗癌肽(ACP)或蛋白、促凋亡蛋白、细胞外基质降解蛋白、用于肿瘤抗原呈递的蛋白、病原体抗原及其组合。
14.根据权利要求10至13所述的方法，用于生产用于基因治疗的疫苗或溶瘤病毒或病毒载体。
15.根据权利要求10至14的方法获得的病毒。
16.根据权利要求15的病毒，其用作疫苗或溶瘤病毒或基因治疗。
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