JP2023536885A - 脳腱黄色腫症の処置のためのｃｙｐ２７ａ１を発現する遺伝子治療ベクター - Google Patents

Abstract

本開示は、脳腱黄色腫症の処置における使用のための遺伝子治療ベクターに関する。さらに具体的には、本発明は、ＣＴＸの処置のためのステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む核酸構築物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、脳腱黄色腫症の処置における使用のための遺伝子治療ベクターに関する。さらに具体的には、本発明は、ＣＴＸの処置のためのステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む核酸構築物に関する。

脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）は、１：５０．０００～１：１００．０００の有病率でＣＹＰ２７Ａ遺伝子中の変異によって生じる常染色体劣性疾患である（Ｌｏｒｉｎｃｚら、Ａｒｄｔ Ｎｅｕｒｏｌ．６２（２００５）１４５９～１４６３；Ａｐｐａｄｕｒａｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１１６（２０１５）２６８～３０４）。原因遺伝子ＣＹＰ２７Ａ１は、肝臓におけるコレステロールからの胆汁酸の合成に必須の酵素である、チトクロムＰ４５０のメンバーのステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする。この生合成経路の遮断は胆汁酸の不足（特にケノデオキシコール酸、ＣＤＣＡ）及び肝臓外の組織、例えば眼、腱及び中枢神経系（ＣＮＳ）での中間代謝物の蓄積をもたらす（Ｂｊｅｉｒｋｈｅｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．２４（２０１３）２８３～２８７）。脂質（コレステロール及びコレスタノール）及び反応性細胞の沈着物である黄色腫がしばしば観察される（Ｖｏｉｃｕｌｅｓｃｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．８２（１９８７）８９～９９、Ｐｉｌｏ Ｄｅ Ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５５（２００８）８３９～８４２）。臨床所見として、胆汁うっ滞、下痢、若年性白内障、関節及び腱の肉眼的黄色腫、骨粗鬆症並びに進行性の神経学的症状（痙縮、運動失調、神経障害、てんかん、認知及び精神の変化）が挙げられる。コレスタノールの神経毒性は十分確立されているが（ｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）、他の代謝物の関与は、疑われているにすぎない（Ｍｉｇｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．３９（２０１６）７５～８３）。ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を用いた処置は、内在性の成熟化学種の欠損を補償し、胆汁酸のデノボ合成を阻害し、血清コレスタノールレベルを低減する一方で、７－アルファ－ヒドロキシ－４－コレステン－３－オン（７ａＣ４）などの他の代謝物は、文献において示されたとおり正常化されない（Ｂｅｒｇｉｎｅｒら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１２３（２００９）１４３～１４７；Ｓｏｆｆｅｒら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．９０（１９９５）２１３～２０）。したがって、疾患の原因に対処する新規処置を開発する必要性は残ったままである。

遺伝子治療（ＧＴ）は、治療目的での生物の細胞への遺伝物質の移入である。ＧＴベクターのトロピズムのおかげで、肝臓酵素の遺伝的欠損によって生じる疾患は、ＧＴについての、特にＣＴＸの場合のように肝機能が深刻に冒されてはいない場合に良い候補である。現在、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＴのための代表的存在である（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖｅ．Ｇｅｎｅｔ．（２０２０）Ｆｅｂ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１９－０２０５－４）。動物及び臨床研究は、それらが数年間導入遺伝子発現を維持できることを実証した（Ｐｅｙｖａｎｄｉら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２５（２０１９）７３８～７４６）。一遺伝子性疾患の遺伝子治療のための発現カセットの設計では、通常最良の選択は、補われる遺伝子の内在性プロモーターである。

Ｃｙｐｌ７ａｌ欠損マウスモデルを使用する、トランスジェニックマウス中の遍在性のニワトリβ－アクチンプロモーターの調節下でのＣＹＰ２７Ａ１の過剰発現は、リポタンパク質代謝に大きな変化は生じなかったが（Ｍｅｉｒ Ｋ．ら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３４０３６～３４０４１）、本発明者らは、肝臓特異的プロモーターの調節下でのＣＹＰ２７Ａ１の発現が、比較的低い用量で疾患の代謝変化を修正できることを発見した。わずかな百分率の肝細胞だけ形質導入しても、完全な修正が生じる。

本発明者らは、内在性プロモーターの調節下でのＣＹＰ２７Ａ１の発現とは対照的に、肝臓特異的プロモーターの調節下で同じ導入遺伝子をコードするベクターが、比較的低い用量で疾患の代謝変化を修正できることを示した。わずかな百分率の肝細胞だけ形質導入しても、完全な修正が生じる。このことは、高レベルのＣＹＰ２７Ａ１を発現する肝細胞のサブセットがＣＴＸマウスにおいて蓄積した毒性代謝物についてのシンクとして作用することを示している。内在性プロモーターの調節下でのＣＹＰ２７Ａ１の発現は、高用量でわずかな影響だけを有し、治療有効性を達成するために非常に高い用量のベクターを必要とする。肝臓特異的プロモーターの調節下でＣＹＰ２７Ａ１をコードするベクターは、胆汁酸代謝を回復させ、血漿中の大部分の胆汁酸の濃度を正常化した。対照的に、標準的処置（経口ケノデオキシコール酸、ＣＤＣＡ）は、コレスタノールを低減する一方で、血漿中の胆汁酸組成を正常化せず、超生理学的レベルのＣＤＣＡ及びその誘導体を生じた。

したがって、本開示の第１の態様は、ヒトステロール２７－ヒドロキシラーゼ又はそのバリアントをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む核酸構築物に関し、好ましくは前記肝臓特異的プロモーターは、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター及び／又はマウスアルブミンエンハンサー、より好ましくはヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター並びに配列番号６若しくは配列番号６に少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列のマウスアルブミンエンハンサーを含む。

具体的な実施形態では、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、さらにより好ましくは配列番号７及び８の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列をさらに含む。好ましい実施形態では、前記核酸構築物は、配列番号９の核酸配列又は配列番号９に少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。

別の態様では本発明は、前記核酸構築物を含む発現ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。

本発明は、ウイルス粒子、好ましくは前記核酸構築物又は発現ベクターを含む、より好ましくは：ＡＡＶ３ ３Ａ型、ＡＡＶ３ ３Ｂ型、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８血清型からなる群から選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子にも関する。

別の態様では本発明は、前記核酸構築物若しくは発現ベクターを含む宿主細胞、又は上に記載されるウイルス粒子を用いて形質導入された宿主細胞に関する。

本発明は、前記核酸構築物、ベクター、ウイルス粒子又は宿主細胞、及び薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物にも関する。

別の態様では本発明は、それを必要とする対象における薬物としてのその使用のための、好ましくはそれを必要とする対象における脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）の予防及び／又は処置のための前記核酸構築物、ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物に関する。
最後に本発明は：
ａ）前記核酸構築物又は発現ベクターを含む宿主細胞を培養培地において培養するステップ、並びに
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内部からウイルス粒子を採取するステップ
ｃ）任意選択で前記ウイルス粒子を精製及び製剤化するステップ
を含む、上に記載されるウイルス粒子を産生する方法に関する。

ベクターゲノムの模式図である。両方の場合について、導入遺伝子はヒトＣＹＰ２７Ａ１ ｃＤＮＡである。ＥＡＡＴは、マウスアルブミンエンハンサー及びヒトアルファｌアンチトリプシンプロモーターからなるハイブリッドプロモーターである。Ｃ２７Ｐは、ヒトＣＹＰ２７Ａ１遺伝子由来の２Ｋｂ ５’ＵＴＲ断片である。ＩＴＲ、ＡＡＶ２由来の末端逆位配列；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル。ゲノムはＡＡＶ８カプシドにパッケージングされている。 ｉｎ ｖｉｖｏでのプロモーターの評価を示す図である。表示のプロモーター（左図）の調節下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドは、ハイドロダイナミック注射（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってＣ５７ＢＬ／６マウスに投与された。４８時間後、マウスは、ルシフェラーゼ基質ルシフェリンの腹腔内注射を受け、光放出（ｌｉｇｈｔ ｍｉｓｓｉｏｎ）はｉｎ ｖｉｖｏルシフェラーゼ画像化システムを使用して定量された。グラフに示された値は、肝臓領域から放出された光子／秒に対応する。^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１を用いて処置されたＣｙｐ２７ａ ｋ．ｏ．マウスの代謝補正を示す図である。６週齢Ｃｙｐ２７ａ１ ｋ．ｏ．マウスは、１．５×１０^１２又は１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇのベクターを用いて静脈注射によって処置された。２週間後、血液は、血漿中のコレスタノール（Ａ）及び７－アルファ－ヒドロキシ－４－コレステン－３－オン（７ａＣ４）（Ｂ）の決定のために回収された。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）は、各代謝物の正常値のための基準として含まれる。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１を用いて処置されたＣｙｐ２７ａ ｋ．ｏ．マウスの不十分な代謝補正を示す図である。６週齢Ｃｙｐ２７ａ）ｋ．ｏ．マウスは、５×１０^１２又は１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇのベクターを用いて静脈注射によって処置された。２週間後、血液は、血漿中のコレスタノール（Ａ）及び７－アルファ－ヒドロキシ－４－コレステン－３－オン（７ａＣ４）（Ｂ）の決定のために回収された。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）は、各代謝物の正常値のための基準として含まれる。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ。 ＡＡＶベクターを用いて処置されたマウスの肝臓におけるＣＹＰ２７Ａ１の発現を示す図である。６週齢Ｃｙｐ２７ａ１ ｋ．ｏ．マウスは、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１（ＥＡＡＴ）又はＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１（Ｃ２７Ｐ）ベクターを用いて静脈注射によって表示の用量（ｖｇ／ｋｇ）で処置された。２週間後、マウスは屠殺され、肝臓は免疫組織化学によるＣＹＰ２７Ａ１含有量の分析のために回収された。対照は、代表的な未処置Ｃｙｐ２７ａ１ ｋ．ｏ．マウスである。陽性細胞は、より濃い染色によって区別することができる。 ＥＡＡＴプロモーターが、一部の株化細胞（ｃｅｌｌ ｌｉｍｅ）及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＹＰ２７Ａ１ ５’ＵＴＲよりも強い活性を示すことを示す図である。Ａ． ＣＭＶプロモーター、ハイブリッド肝臓特異的プロモーターＥＡＡＴ（αｌアンチトリプシンプロモーターに連結されたアルブミンエンハンサー）及びヒトＣＹＰ２７Ａ１遺伝子（Ｃ２７Ｐ）由来の５’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドの模式図。プロモーターを有さないプラスミドｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃは、陰性対照として使用された。Ｂ． プラスミドは、ヒト（ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ）並びにマウス（Ｈｅｐａｌ－６及びＡＭＬ１２）起源由来の表示の肝臓由来の株化細胞にトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの４８時間後に得られた細胞抽出物において測定された。結果は、活性の百分率として表され、ＣＭＶプロモーターを基準とした。Ｃ． プラスミドは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）にハイドロダイナミック注射によって注射され、光放出は４８時間後にＢＬＩによって定量された。^＊ｐ＜０．０５、クラスカル－ウォリス。 ＥＡＡＴプロモーターが、一部の株化細胞（ｃｅｌｌ ｌｉｍｅ）及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＹＰ２７Ａ１ ５’ＵＴＲよりも強い活性を示すことを示す図である。Ａ． ＣＭＶプロモーター、ハイブリッド肝臓特異的プロモーターＥＡＡＴ（αｌアンチトリプシンプロモーターに連結されたアルブミンエンハンサー）及びヒトＣＹＰ２７Ａ１遺伝子（Ｃ２７Ｐ）由来の５’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドの模式図。プロモーターを有さないプラスミドｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃは、陰性対照として使用された。Ｂ． プラスミドは、ヒト（ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ）並びにマウス（Ｈｅｐａｌ－６及びＡＭＬ１２）起源由来の表示の肝臓由来の株化細胞にトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの４８時間後に得られた細胞抽出物において測定された。結果は、活性の百分率として表され、ＣＭＶプロモーターを基準とした。Ｃ． プラスミドは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）にハイドロダイナミック注射によって注射され、光放出は４８時間後にＢＬＩによって定量された。^＊ｐ＜０．０５、クラスカル－ウォリス。 ＥＡＡＴプロモーターが、一部の株化細胞（ｃｅｌｌ ｌｉｍｅ）及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＹＰ２７Ａ１ ５’ＵＴＲよりも強い活性を示すことを示す図である。Ａ． ＣＭＶプロモーター、ハイブリッド肝臓特異的プロモーターＥＡＡＴ（αｌアンチトリプシンプロモーターに連結されたアルブミンエンハンサー）及びヒトＣＹＰ２７Ａ１遺伝子（Ｃ２７Ｐ）由来の５’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドの模式図。プロモーターを有さないプラスミドｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃは、陰性対照として使用された。Ｂ． プラスミドは、ヒト（ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ）並びにマウス（Ｈｅｐａｌ－６及びＡＭＬ１２）起源由来の表示の肝臓由来の株化細胞にトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの４８時間後に得られた細胞抽出物において測定された。結果は、活性の百分率として表され、ＣＭＶプロモーターを基準とした。Ｃ． プラスミドは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）にハイドロダイナミック注射によって注射され、光放出は４８時間後にＢＬＩによって定量された。^＊ｐ＜０．０５、クラスカル－ウォリス。 ＡＡＶベクターからのＣＹＰ２７Ａ１の発現を示す図である。Ａ． ベクターゲノムの模式図である。ＩＴＲ、末端逆位配列；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル。Ｂ． ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（それぞれＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐと略される）は、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与され、２週間後にマウスはｑＲＴ－ＰＣＲによるヒト及びマウスＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡの定量のために屠殺された。ＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。両性間で差異が観察されなかったことからデータは、プールされたオス及びメスマウスを含む。Ｃ． 肝臓試料の一部は、ウエスタンブロットによってＣＹＰ２７Ａ１タンパク質を検出するために使用された。画像は、すべての試料の定量と共に代表的なブロットを示す（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。この技術を使用して抗体がマウス及びヒトタンパク質の両方を検出することができることに注目されたい。Ｄ． ＣＹＰ２７Ａ１の検出（代表的な画像）、及び陽性肝細胞の定量のための免疫組織化学。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶベクターからのＣＹＰ２７Ａ１の発現を示す図である。Ａ． ベクターゲノムの模式図である。ＩＴＲ、末端逆位配列；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル。Ｂ． ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（それぞれＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐと略される）は、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与され、２週間後にマウスはｑＲＴ－ＰＣＲによるヒト及びマウスＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡの定量のために屠殺された。ＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。両性間で差異が観察されなかったことからデータは、プールされたオス及びメスマウスを含む。Ｃ． 肝臓試料の一部は、ウエスタンブロットによってＣＹＰ２７Ａ１タンパク質を検出するために使用された。画像は、すべての試料の定量と共に代表的なブロットを示す（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。この技術を使用して抗体がマウス及びヒトタンパク質の両方を検出することができることに注目されたい。Ｄ． ＣＹＰ２７Ａ１の検出（代表的な画像）、及び陽性肝細胞の定量のための免疫組織化学。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶベクターからのＣＹＰ２７Ａ１の発現を示す図である。Ａ． ベクターゲノムの模式図である。ＩＴＲ、末端逆位配列；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル。Ｂ． ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（それぞれＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐと略される）は、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与され、２週間後にマウスはｑＲＴ－ＰＣＲによるヒト及びマウスＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡの定量のために屠殺された。ＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。両性間で差異が観察されなかったことからデータは、プールされたオス及びメスマウスを含む。Ｃ． 肝臓試料の一部は、ウエスタンブロットによってＣＹＰ２７Ａ１タンパク質を検出するために使用された。画像は、すべての試料の定量と共に代表的なブロットを示す（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。この技術を使用して抗体がマウス及びヒトタンパク質の両方を検出することができることに注目されたい。Ｄ． ＣＹＰ２７Ａ１の検出（代表的な画像）、及び陽性肝細胞の定量のための免疫組織化学。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶベクターからのＣＹＰ２７Ａ１の発現を示す図である。Ａ． ベクターゲノムの模式図である。ＩＴＲ、末端逆位配列；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル。Ｂ． ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（それぞれＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐと略される）は、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与され、２週間後にマウスはｑＲＴ－ＰＣＲによるヒト及びマウスＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡの定量のために屠殺された。ＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。両性間で差異が観察されなかったことからデータは、プールされたオス及びメスマウスを含む。Ｃ． 肝臓試料の一部は、ウエスタンブロットによってＣＹＰ２７Ａ１タンパク質を検出するために使用された。画像は、すべての試料の定量と共に代表的なブロットを示す（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１０；処置ＣＴＸ ｎ＝５）。この技術を使用して抗体がマウス及びヒトタンパク質の両方を検出することができることに注目されたい。Ｄ． ＣＹＰ２７Ａ１の検出（代表的な画像）、及び陽性肝細胞の定量のための免疫組織化学。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＣＤＣＡが、ＣＴＸマウスにおいてコレスタノール及び７ａＣ４を低減することを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１又はＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．１、０．５又は１％で混合された。血液は、ベクター投与の２週間後、又はＣＤＣＡ食餌の開始後１か月で回収された。コレスタノール及び７αＣ４の濃度は、マウス血漿で決定された。未処置ＣＴＸ マウス及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた（ＷＴ ｎ＝１０；ＣＴＸ ｎ＝１５；処置ＣＴＸ ｎ＝５ 各性別）。^＊ｐ＜０．０５；”ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＣＤＣＡが、ＣＴＸマウスにおいてコレスタノール及び７ａＣ４を低減することを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１又はＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．１、０．５又は１％で混合された。血液は、ベクター投与の２週間後、又はＣＤＣＡ食餌の開始後１か月で回収された。コレスタノール及び７αＣ４の濃度は、マウス血漿で決定された。未処置ＣＴＸ マウス及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた（ＷＴ ｎ＝１０；ＣＴＸ ｎ＝１５；処置ＣＴＸ ｎ＝５ 各性別）。^＊ｐ＜０．０５；”ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１が、十分に許容され、単回投与後に持続性治療効果を達成することを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（ＥＡＡＴ）は７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量（×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ）で静脈内投与された。Ａ． 各群（ｎ＝４）から一部のマウスがベクター投与の１５日後に屠殺され、残り（ｎ＝７）は５か月間維持された。ＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって肝臓試料において測定された。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた。血液試料は、コレスタノール及び７ａＣ４（Ｂ）及びトランスアミナーゼＡＬＴ（Ｃ）の測定のために表示の時期に得られた。未処置ＣＴＸマウス及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、メス及びオスマウスを釣り合わせた群に対応する。Ｄ． 処置の開始の５か月後のマウスの肝臓組織学（ヘマトキシリン及びエオシン染色）の代表的な画像。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１が、十分に許容され、単回投与後に持続性治療効果を達成することを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（ＥＡＡＴ）は７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量（×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ）で静脈内投与された。Ａ． 各群（ｎ＝４）から一部のマウスがベクター投与の１５日後に屠殺され、残り（ｎ＝７）は５か月間維持された。ＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって肝臓試料において測定された。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた。血液試料は、コレスタノール及び７ａＣ４（Ｂ）及びトランスアミナーゼＡＬＴ（Ｃ）の測定のために表示の時期に得られた。未処置ＣＴＸマウス及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、メス及びオスマウスを釣り合わせた群に対応する。Ｄ． 処置の開始の５か月後のマウスの肝臓組織学（ヘマトキシリン及びエオシン染色）の代表的な画像。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１が、十分に許容され、単回投与後に持続性治療効果を達成することを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（ＥＡＡＴ）は７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量（×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ）で静脈内投与された。Ａ． 各群（ｎ＝４）から一部のマウスがベクター投与の１５日後に屠殺され、残り（ｎ＝７）は５か月間維持された。ＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって肝臓試料において測定された。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた。血液試料は、コレスタノール及び７ａＣ４（Ｂ）及びトランスアミナーゼＡＬＴ（Ｃ）の測定のために表示の時期に得られた。未処置ＣＴＸマウス及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、メス及びオスマウスを釣り合わせた群に対応する。Ｄ． 処置の開始の５か月後のマウスの肝臓組織学（ヘマトキシリン及びエオシン染色）の代表的な画像。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１が、十分に許容され、単回投与後に持続性治療効果を達成することを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター（ＥＡＡＴ）は７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量（×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ）で静脈内投与された。Ａ． 各群（ｎ＝４）から一部のマウスがベクター投与の１５日後に屠殺され、残り（ｎ＝７）は５か月間維持された。ＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって肝臓試料において測定された。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、容易な視覚化のために係数１．０００をかけられた。血液試料は、コレスタノール及び７ａＣ４（Ｂ）及びトランスアミナーゼＡＬＴ（Ｃ）の測定のために表示の時期に得られた。未処置ＣＴＸマウス及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。データは、メス及びオスマウスを釣り合わせた群に対応する。Ｄ． 処置の開始の５か月後のマウスの肝臓組織学（ヘマトキシリン及びエオシン染色）の代表的な画像。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１はＣＴＸマウスにおいてＣｙｐ７ａ１及びＣｙｐ３ａ１ １の発現を正常化するが、ＣＤＣＡはしないことを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１又はＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．１又は０．５％で混合された。未処置ＣＴＸ及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。動物は、ベクター投与の２週間後に、又はＣＤＣＡ食餌の開始の１か月後に屠殺され、肝臓試料は内在性Ｃｙｐ２７ａ１（Ａ）、Ｃｙｐ７ａ１（Ｂ）及びＣｙｐ３ａ１１（Ｃ）発現の定量のために得られた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、より容易な８３９視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１５；ＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐ ｎ＝５；ＣＤＣＡ ｎ＝８）。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１はＣＴＸマウスにおいてＣｙｐ７ａ１及びＣｙｐ３ａ１ １の発現を正常化するが、ＣＤＣＡはしないことを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１又はＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．１又は０．５％で混合された。未処置ＣＴＸ及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。動物は、ベクター投与の２週間後に、又はＣＤＣＡ食餌の開始の１か月後に屠殺され、肝臓試料は内在性Ｃｙｐ２７ａ１（Ａ）、Ｃｙｐ７ａ１（Ｂ）及びＣｙｐ３ａ１１（Ｃ）発現の定量のために得られた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、より容易な８３９視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１５；ＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐ ｎ＝５；ＣＤＣＡ ｎ＝８）。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１はＣＴＸマウスにおいてＣｙｐ７ａ１及びＣｙｐ３ａ１ １の発現を正常化するが、ＣＤＣＡはしないことを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１又はＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．１又は０．５％で混合された。未処置ＣＴＸ及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。動物は、ベクター投与の２週間後に、又はＣＤＣＡ食餌の開始の１か月後に屠殺され、肝臓試料は内在性Ｃｙｐ２７ａ１（Ａ）、Ｃｙｐ７ａ１（Ｂ）及びＣｙｐ３ａ１１（Ｃ）発現の定量のために得られた。データは、ハウスキーピング遺伝子３６ｂ４を基準として使用する相対的ｍＲＮＡ含有量として表され、より容易な８３９視覚化のために係数１．０００をかけられた（ＷＴ及びＣＴＸ対照 ｎ＝１５；ＥＡＡＴ及びＣ２７Ｐ ｎ＝５；ＣＤＣＡ ｎ＝８）。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１が、ＣＴＸマウスにおいて肝腫大を元に戻すことを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．１又は０．５％で混合された。未処置ＣＴＸ及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。マウスは、３か月間維持され、次いで、体重の百分率として表される相対的肝臓重量の決定のために屠殺された。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１対未処置ＣＴＸマウス。ダンポストテストを含むクラスカル－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１は、ＣＴＸマウスの血中の胆汁酸組成を正常化するが、ＣＤＣＡはしないことを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量（×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ）で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．５％で混合された。未処置ＣＴＸ及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。血液は、処置の開始の５か月後に回収され、主な遊離胆汁酸及びタウロコンジュゲート（ｔａｕｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、血漿中で分析された。ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸；ａＭＣＡ、α－ムリコール酸；ｂＭＣＡ、β－ムリコール酸；ＬＣＡ、リトコール酸；ＵＤＣＡ、ウルソデオキシコール酸；ＨＤＣＡ、ヒオデオキシコール酸；ＴＤＣＡ、タウロデオキシコール酸；ＴＭＣＡ、タウロムリコール酸；ＴＬＣＡ、タウロリトコール酸；ＴＵＤＣＡ、タウロウルソデオキシコール酸；ＴＨＤＣＡ、タウロヒオデオキシコール酸；ＣＡ、コール酸；ＤＣＡ、デオキシコール酸；ＴＣＡ、タウロコール酸；ＴＤＣＡ、タウロデオキシコール酸。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。ダンポストテストを含むクラスカ－ウォリス。 ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１は、ＣＴＸマウスの血中の胆汁酸組成を正常化するが、ＣＤＣＡはしないことを示す図である。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、７週齢ＣＴＸマウスに表示の用量（×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ）で静脈内投与された。ＣＤＣＡは、マウス固形飼料に０．５％で混合された。未処置ＣＴＸ及びＷＴ同腹仔は、基準として含まれた。血液は、処置の開始の５か月後に回収され、主な遊離胆汁酸及びタウロコンジュゲート（ｔａｕｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、血漿中で分析された。ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸；ａＭＣＡ、α－ムリコール酸；ｂＭＣＡ、β－ムリコール酸；ＬＣＡ、リトコール酸；ＵＤＣＡ、ウルソデオキシコール酸；ＨＤＣＡ、ヒオデオキシコール酸；ＴＤＣＡ、タウロデオキシコール酸；ＴＭＣＡ、タウロムリコール酸；ＴＬＣＡ、タウロリトコール酸；ＴＵＤＣＡ、タウロウルソデオキシコール酸；ＴＨＤＣＡ、タウロヒオデオキシコール酸；ＣＡ、コール酸；ＤＣＡ、デオキシコール酸；ＴＣＡ、タウロコール酸；ＴＤＣＡ、タウロデオキシコール酸。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。ダンポストテストを含むクラスカ－ウォリス。

［詳細な説明］
本開示は、ステロール２６－ヒドロキシラーゼとも称されるヒトステロール２７－ヒドロキシラーゼ、そのミトコンドリア前駆体（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００７７５．１、２０２０年４月２５日アクセス）（配列番号１）又はそれらのバリアントをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関する。

チトクロムＰ４５０タンパク質は、薬の代謝並びにコレステロール、ステロイド及び他の脂質の合成に関与する多くの反応を触媒するモノオキシゲナーゼである。このミトコンドリアタンパク質は、胆汁合成経路の一部としてコレステロール中間体を酸化する。

ＣＹＰ２７Ａ１タンパク質は、チトクロムＰ４５０ファミリー２７サブファミリーＡメンバー１、ステロール２７（ＣＹＰ２７Ａ１）遺伝子（遺伝子ＩＤ：１５９３、２０２０年６月４日アクセス）によってコードされ、ＣＴＸ、ＣＰ２７又はＣＹＰ２７ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）とも称される。

本明細書において使用される場合、用語「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする外来性ＤＮＡ又はｃＤＮＡを指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチド又はタンパク質である場合がある。遺伝子産物についてのコード領域に加えて、導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インスレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）及び／又は他の機能性エレメントなどの発現を促進する又は増強するための１つ又は複数のエレメントを含む、又はそれと関連する場合がある。本開示の実施形態は、任意の周知の好適なプロモーター、エンハンサー（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インスレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）及び／又は他の機能性エレメントを利用できる。好適なエレメント及び配列は、当業者に十分周知である。

用語「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」は、モノマーヌクレオチドからなる又はそれを含む任意の分子を指して互換的に使用することができる。核酸は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである場合がある。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾された又は人工のものである場合がある。ヌクレオチド配列として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。これらの各配列は、分子の骨格への変更によって天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡから区別される。同様にホスホロチオエートヌクレオチドも使用することができる。他のデオキシヌクレオチド類似体として、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホロアミデート並びにオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート及びそれらの２’－０－アリル類似体及び、本開示のヌクレオチドにおいて使用することができる２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。

本開示による導入遺伝子は、ステロール２７－ヒドロキシラーゼ、特に天然の哺乳動物の、好ましくはヒトのステロール２７－ヒドロキシラーゼ（配列番号１）又はこれらの機能的バリアントをコードする任意の核酸配列であってもよい。

好ましくは、本明細書において使用される場合、用語「バリアント」又は「機能的バリアント」は、天然配列に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ポリペプチドの機能、本明細書においてステロール２７－ヒドロキシラーゼの酵素機能を保持しているポリペプチドを指す。

本明細書において使用される場合、用語「配列同一性」又は「同一性」は、２個のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のアライメントから位置でのマッチ（同一のアミノ酸残基）の数（％）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながら重複及び同一性を最大化するようにアラインされた場合の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は２個の配列の長さに応じて、多数の数学的な全体的又は局所的アライメントアルゴリズムを使用して決定することができる。同様の長さの配列は、全長にわたって配列を最適にアラインする全体的なアライメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン及びブンシュアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０）を使用して好ましくはアラインされる一方で、実質的に異なる長さの配列は、局所アライメントアルゴリズム（例えば、スミス及びウオーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１）又はアルトシュルアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、２００５）を使用して好ましくはアラインされる。核酸又はアミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウエブサイトで利用可能な公開されている利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の技術の範囲内である種々の方法において達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定できる。本明細書においてこの目的のために、％核酸又はアミノ酸配列同一性値は、ニードルマン－ブンシュアルゴリズムを使用して２個の配列の最適な全体的なアライメントを作成する、ペアワイズ配列アライメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して作成された値を指し、ここですべての検索パラメーターは初期設定値に設定される、すなわち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープン＝１０及びエンドギャップ伸長＝０．５。

より好ましくは、用語「バリアント」又は「機能的バリアント」は、３０、２５、２０、１５、１０又は５個未満の置換、挿入及び／又は欠失によって天然配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、バリアントは、１つ又は複数の保存的置換によって、好ましくは１５、１０又は５個未満の保存的置換によって天然配列とは異なる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）並びに小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びスレオニン）のグループ内である。バリアントのステロール２７－ヒドロキシラーゼ活性は、当業者に周知の任意の方法によって、例えば前記ステロール２７－ヒドロキシラーゼバリアントの酵素活性を測定することによって評価することができる。

特定の実施形態では、本開示は、ヒトステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物に関し、前記導入遺伝子は、ステロール２７－ヒドロキシラーゼの哺乳動物コード配列、好ましくは、ステロール２７－ヒドロキシラーゼのヒトコード配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００７８４．４、２０２０年４月２５日アクセス）、好ましくは配列番号２又は配列番号２に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％配列同一性を有する核酸配列である。

多数の異なる哺乳動物のステロール２７－ヒドロキシラーゼのコード配列は、周知であり、これだけに限らないが、ヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ウサギ又はラットが挙げられ、配列データベースに容易に見出すことができる。代替的にコード配列は、ポリペプチド配列に基づいて当業者によって容易に決定することができる。

別の具体的な実施形態では、前記導入遺伝子は、ステロール２７－ヒドロキシラーゼ又はそのバリアントをコードする最適化された配列であってもよい。

用語「コドン最適化」は、ヒトでの偏りを表す（すなわち、ヒト遺伝子において一般的だが他の哺乳動物遺伝子又は非哺乳動物遺伝子では一般的でない）コドンが、ヒトでの偏りを表さない同義コドン（同じアミノ酸をコードするコドン）に変更されていることを意味する。したがって、コドンにおけるその変更は、コードされるタンパク質においていかなるアミノ酸変化も生じない。

核酸構築物
用語「核酸構築物」は、本明細書において使用される場合、組換えＤＮＡ技術の使用から生じた人工核酸分子を指す。核酸構築物は、核酸配列のセグメントを含有するように改変され、他では天然には存在しない様式で組み合わされ、並置された１本又は２本鎖のいずれかの核酸分子である。通常核酸構築物は「ベクター」、すなわち外来性で作られたＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される核酸分子である。

前記核酸構築物は、前記コード配列の発現のために必要な１つ又は複数の調節配列を含む。一般に核酸構築物は、コード配列並びに、選択された遺伝子産物の発現のために必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）及び続く（３’非コード配列）制御配列を含む。したがって核酸構築物は、プロモーター配列、コード配列並びに、ポリアデニル化部位及び／又は転写終結因子を通常含有する３’非翻訳領域を典型的には含む。核酸構築物は、追加的な制御エレメント、例えば、エンハンサー配列、ベクター内のＤＮＡ断片の挿入を促進するポリリンカー配列及び／又はスプライシングシグナル配列なども含むことができる。

本開示により、前記核酸構築物は、ステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された肝臓特異的制御エレメント、好ましくは強い肝臓特異的制御エレメントを含む。

具体的な実施形態では、前記制御エレメントは、宿主細胞への導入で導入遺伝子発現を開始するプロモーターを含む。本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」は、それに作動可能に連結された核酸の転写を方向付ける制御エレメントを指す。プロモーターは、作動可能に連結された核酸の転写の速度及び効率の両方を制御できる。プロモーターは、核酸のプロモーター依存性転写を増強する（「エンハンサー」）又は抑制する（「リプレッサー」）他の制御エレメントにも作動可能に連結されてもよい。これらの制御エレメントとして、非限定的に、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化因子タンパク質結合部位、並びに例えば、アテニュエータ、エンハンサー及びサイレンサーを含むプロモーターからの転写の量を直接的に又は間接的に制御するように作用する当業者に周知のヌクレオチドの任意の他の配列が挙げられる。プロモーターは、同じ鎖でＤＮＡ配列の上流のそれが作動可能に連結された遺伝子又はコード配列の転写開始部位の近くに位置する（センス鎖の５’領域に向けて）。プロモーターは、約１００～３０００塩基対長であってもよい。プロモーター中の位置は、特定の遺伝子の転写開始部位との比較で指定される（つまり、上流の位置は－１から逆に数える負の数であり、例えば－１００は１００塩基対上流の位置である）。

本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的な関連があるポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関連があるように置かれた場合に「作動可能に連結され」ている。例えば、プロモーター又は転写制御配列は、コード配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されるＤＮＡ配列が必ずしもそうではないが典型的には近接であり；近接で読み枠中にある２個のタンパク質コード領域をつなぐ必要がある場合を意味する。

本開示の文脈では「肝臓特異的プロモーター」は、身体の任意の他の組織においてよりも肝臓においてさらに活性であるプロモーターである。典型的には、肝臓特異的プロモーターの活性は、他の組織においてよりも肝臓において相当大きくなる。例えば、かかるプロモーターは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍さらに活性であることがある（例えば、所与の組織において発現を駆動するその能力を、他の細胞又は組織において発現を駆動するその能力と比較して決定される）。したがって、肝臓特異的プロモーターは、それに連結された遺伝子の肝臓における活発な発現を可能にし、他の細胞又は組織でのその発現を妨げる。

本開示の文脈では「強いプロモーター」は、前記導入遺伝子の内在性プロモーターよりも高活性であるプロモーターである。本開示により、強いプロモーターの活性は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍高活性であることがある（例えば、所与の組織において導入遺伝子の発現を駆動するその能力を、同じ組織において内在性制御エレメントの下流に挿入された同じ導入遺伝子の発現を駆動する能力と比較して決定される）。本開示により、前記内在性プロモーターはＣＹＰ２７Ａ１制御エレメント、特に配列番号３のものである。

プロモーター活性を検査するために、プロモーターは、スクリーニング可能なマーカーに作動可能に連結され、宿主細胞に導入されてもよい。スクリーニング可能なマーカーの発現レベルは評価されてもよく、プロモーター活性は、スクリーニング可能なマーカーの発現のレベルに基づいて決定されてもよい。プロモーターの生物学的活性は、宿主細胞におけるスクリーニング可能なマーカー発現のレベルに基づいて視覚的に又は定量的のいずれかで決定されてもよい。

具体的な実施形態では、前記肝臓特異的プロモーターは：α１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター（ＡＡＴ又はＡ１ＡＴ）、胆汁塩誘導性プロモーター、アルブミン、ヘモペキシン、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｙｒｅｔｉｎ）、ホスホグリセレートキナーゼからなる群において選択される強い肝臓特異的プロモーターであってよく、好ましくは、配列番号４のヒトα１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター又は配列番号４に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の同一性を有する配列であってもよい。

本開示による肝臓特異的プロモーターは、肝臓において導入遺伝子の肝臓特異的発現を増強することができる肝臓特異的エンハンサーエレメントをさらに含むことがある。

かかる肝臓特異的エンハンサーとして、１つ又は複数の血清アルブミンエンハンサー、プロトロンビンエンハンサー、α－Ｉミクログロブリンエンハンサー及びイントロンアルドラーゼエンハンサー、好ましくは配列番号５のマウス血清アルブミンエンハンサー又は配列番号５に７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の同一性を有する配列が挙げられる。

より好ましい実施形態では、前記肝臓特異的プロモーターは、ヒトα１－アンチトリプシン遺伝子プロモーター配列（ＡＡＴ又はＰａ１ＡＴ）をマウスアルブミン遺伝子エンハンサーエレメント（Ｅａｌｂ）、好ましくは配列番号６若しくは配列番号６に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の同一性を有する配列との組合せで含むキメラプロモーター配列ＥａｌｂＰａ１ＡＴ（ＥＡＡＴ）などの強い肝臓特異的プロモーターである。

これらの各核酸構築物実施形態は、ポリアデニル化シグナル配列も；他の任意選択のヌクレオチドエレメントと併せて又は伴わずに含むことができる。本明細書において使用される場合、用語「ポリアデニル化シグナル」又は「ポリ（Ａ）シグナル」は、前駆体ｍＲＮＡ分子に転写され、遺伝子転写の終結を導く遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の特定の認識配列を指す。ポリ（Ａ）シグナルは、新たに形成された前駆体ｍＲＮＡのその３’末端でのヌクレオチド鎖切断、及び、アデニン塩基だけからなるＲＮＡストレッチのこの３’末端への付加（ポリアデニル化プロセス；ポリ（Ａ）テール）のためのシグナルとして作用する。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳及び安定のために重要である。本開示の文脈では、ポリアデニル化シグナルは、哺乳動物細胞における哺乳動物遺伝子及び／又はウイルス遺伝子のポリアデニル化を方向付けることができる認識配列である。

典型的にはポリ（Ａ）シグナルは、ａ）プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）の３’末端切断及びポリアデニル化の両方のために必要である、並びに下流転写終結を推進することが示されている、共通配列ＡＡＵＡＡＡ、並びにｂ）ポリ（Ａ）シグナルとしてのＡＡＵＡＡＡの利用の効率を調節するＡＡＵＡＡＡの上流及び下流の追加的エレメントからなる。哺乳動物遺伝子においてこれらのモチーフには相当な変動性がある。

一実施形態では、本開示の核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、哺乳動物遺伝子又はウイルス遺伝子のポリアデニル化シグナル配列である。好適なポリアデニル化シグナルとして、とりわけＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ＥＩｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化（ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、コンピューターで設計されたポリアデニル化シグナル（合成）などが挙げられる。

具体的な実施形態では、核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０後期ポリＡ遺伝子に基づく合成ポリ（Ａ）シグナル配列である。

発現ベクター
本開示の核酸構築物は、発現ベクターに含まれてもよい。本明細書において使用される場合、用語「発現ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、遺伝物質を移入するため、特に宿主細胞に核酸を送達するためのビヒクルとして使用される核酸分子を指す。発現ベクターは、そのような配列に適合性の宿主細胞又は宿主生物における遺伝子（導入遺伝子）の発現に影響を与えることができる核酸分子も指す。発現ベクターは、典型的には、少なくとも好適な転写制御配列及び任意選択で３’－転写終結シグナルを含む。正確な誘導性シグナル（内在性若しくはキメラ転写因子）に応答することができる又はある特定の細胞、器官若しくは組織に特異的な発現エンハンサーエレメントなどの、発現に影響を与えることに必要又は役立つ追加的因子も存在する場合がある。ベクターとして、これだけに限らないが、プラスミド、ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、コスミド、転位因子、ウイルス及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。好ましくは、本開示のベクターは、遺伝子又は細胞療法における使用のために好適なベクターであり、特に肝細胞を標的にするために好適である。

一部の実施形態では、発現ベクターはウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ又はＳＮＶ、レンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）若しくはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）由来）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス性（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタインバーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター由来のベクターである。

当技術分野において周知のとおり、ＡＡＶベクターについてＡＡＶ ＩＴＲ、又はレンチウイルスベクターについてＬＴＲなどの、使用について検討される具体的なウイルスベクターに応じて好適な配列が、機能性ウイルスベクターを得るために本開示のベクターに導入されるべきである。具体的な実施形態では、前記ベクターはＡＡＶベクターである。

ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のための有望なベクターとして相当な関心を生じてきた。ウイルスの特性の中で好ましいのは、いかなるヒト疾患との関連のその欠如、分裂及び非分裂細胞の両方並びに感染され得るさまざまな組織由来の広範な株化細胞に感染するその能力である。ＡＡＶゲノムは、４６８１塩基を含有する直鎖状、１本鎖ＤＮＡ分子からなる（Ｂｅｒｎｓ及びＢｏｈｅｎｚｋｙ，１９８７，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）３２：２４３～３０７）。ゲノムは、ＤＮＡ複製の起点として及びウイルスのためのパッケージングシグナルとしてシスで機能する末端逆位配列（ＩＴＲ）をその末端に含む。ＩＴＲは、長さおよそ１４５ｂｐである。ゲノムの内部の非反復部分は、それぞれＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子として周知である２個の大きな翻訳領域を含む。これらの遺伝子は、ビリオンの複製及びパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４個のウイルスタンパク質、それらの見かけの分子量により名付けられたＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子から合成される。ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、少なくとも３個のタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な記載について、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．１９９２ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７～１２９を参照されたい。

したがって一実施形態では、本開示の導入遺伝子を含む核酸構築物又は発現ベクターは、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列をさらに含む。

本明細書において使用される場合、用語「末端逆位配列（ＩＴＲ）」は、ウイルスの５’末端（５’ＩＴＲ）に位置するヌクレオチド配列及び３’末端（３’ＩＴＲ）に位置するヌクレオチド配列であって、パリンドローム配列を含有し、Ｔ形ヘアピン構造を形成するように折り重なることができ、ＤＮＡ複製の開始の際にプライマーとして機能するヌクレオチド配列を指す。それらは、宿主ゲノムへのウイルスゲノム組込みのため；宿主ゲノムからのレスキューのため；及び成熟ビリオンへのウイルス核酸のカプシド形成のためにも必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノム複製及びウイルス粒子へのそのパッケージングのためにシスで必要とされる。

本開示のウイルスベクターにおける使用のためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する場合があるか、又は挿入、欠失若しくは置換によって変更される場合がある。ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）の血清型は、任意の周知のヒト又は非ヒトＡＡＶ血清型から選択されてもよい。具体的な実施形態では、核酸構築物又はウイルス発現ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ並びに現在周知の又は後に発見される任意の他のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲを使用することによって実行される場合がある。

一実施形態では核酸構築物は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であるように設計されてもよい。「自己相補性ＡＡＶ」は、ＤＮＡ合成を必要としない分子内２本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計されたＡＡＶベクターを指す（Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、２００１、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８（１６）：１２４８～１２５４）。感染で、第２鎖の細胞媒介合成を待つよりむしろ、ｓｃＡＡＶの２個の相補性半分は、即時の複製及び転写に備えている１個の２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するように会合する。例えば、ＡＡＶは、標的細胞への送達後に共に動き、目的の導入遺伝子ユニットをコードする２本鎖ＤＮＡをもたらす導入遺伝子ユニット及びその相補体をそれぞれコードする、２個の繋がれた１本鎖ＤＮＡを含むゲノムを有するように操作されてもよい。自己相補性ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号及び第７，４５６，６８３号に記載されている。

一実施形態では核酸構築物は、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶ、好ましくは配列番号７及び８の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲをさらに含む。

具体的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号９又は配列番号９に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか又はそれからなる。

一実施形態では、本開示による核酸構築物又はＡＡＶベクターゲノムは、組換えバキュロウイルスゲノムに含まれる。本明細書において使用される場合、用語「組換えバキュロウイルスゲノム」は、バキュロウイルス感染及び複製に許容的な宿主細胞、典型的には昆虫細胞での組換えバキュロウイルスゲノムの自律的複製のためのバキュロウイルスの遺伝エレメントを含む核酸を指す。用語「組換えバキュロウイルスゲノム」は、バキュロウイルスに異種性である核酸を含むゲノムを明確に含む。同様に、用語「組換えバキュロウイルスゲノム」は、ゲノムが感染サイクルの完了のために必要ではないウイルス配列を欠いている場合があることから、完全なバキュロウイルスゲノムを必ずしも指さない。特に、組換えバキュロウイルスゲノムは、ｒＡＡＶ産生のために有用な異種性ＡＡＶ遺伝子、及び／又は遺伝子治療における使用のためにｒＡＡＶ中にカプシド形成されるステロール２７－ヒドロキシラーゼｃＤＮＡなどの導入遺伝子を含む場合がある。本開示における使用のためのバキュロウイルスの遺伝エレメントは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス（オートグラファカリフォルニカマルチヌクレオカプシド核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ））から好ましくは得られる。

具体的な実施形態では、前記第１の及び第２のバキュロウイルスゲノム中のバキュロウイルスカテプシン及びキチナーゼをコードする遺伝子は、破壊又は欠失される。特に、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスの遺伝子ｖ－ｃａｔｈ（Ａｃ１２７）及びｃｈｉＡ（Ａｃ１２６）は、対応するカテプシン又はキチナーゼが発現されないか又は不活性形態として発現される（すなわち、酵素的なカテプシン又はキチナーゼ活性を有さない）ように破壊又は欠失されてもよい。具体的な実施形態では、前記組換えバキュロウイルスゲノムは、少なくともｐ２４遺伝子（Ａｃ１２９）、好ましくは３個のバキュロウイルス遺伝子ｐ１０（Ａｃ１３７）、ｐ２４及びｐ２６（Ａｃ１３６）がさらに破壊又は欠失される。具体的な実施形態では、前記組換えバキュロウイルスゲノムは、機能性ｐ７４バキュロウイルス遺伝子（Ａｃ１３８）を含む（すなわち、前記遺伝子は欠失又は破壊されていない）。

一方、本開示の核酸構築物又は発現ベクターは、合成５’ＩＴＲ及び／又は３’ＩＴＲを使用することによって；及び異なる血清型のウイルスに由来する５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを使用することによっても実行される場合がある。ウイルスベクター複製のために必要なすべての他のウイルス遺伝子は、下に記載されるとおりウイルス産生細胞（パッケージング細胞）内にトランスで提供されてもよい。したがって、ウイルスベクターへのそれらの含有は任意選択である。

一実施形態では、本開示の核酸構築物又はウイルスベクターは、ウイルスの５’ＩＴＲ、ψパッケージングシグナル及び３’ＩＴＲを含む。「ψパッケージングシグナル」は、ウイルスゲノムのシス作用性ヌクレオチド配列であり、一部のウイルス（例えば、アデノウイルス、レンチウイルスなど）において、複製の際のウイルスカプシドへのウイルスゲノムのパッケージングのプロセスのために不可欠である。

組換えＡＡＶウイルス粒子の構築は、当技術分野において一般に周知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号、国際公開第９３／０３７６９号、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８～３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３～５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７～１２９；及びＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３～８０１に記載されている。

ウイルス粒子
本開示の核酸構築物又は発現ベクターは、「ウイルス粒子」、「ウイルスベクター粒子」とも称される、を生成するようにウイルスカプシド中にパッケージングされてもよい。具体的な実施形態では、本開示の核酸構築物又は発現ベクターは、「アデノ随伴ウイルス粒子」又は「ＡＡＶ粒子」を生成するようにＡＡＶ由来カプシドにパッケージングされる。本開示は、本開示の核酸構築物又は発現ベクターを含む、好ましくはアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含むウイルス粒子に関する。

用語ＡＡＶベクター粒子は、遺伝的に操作された任意の組換えＡＡＶベクター粒子又は変異体ＡＡＶベクター粒子を包含する。組換えＡＡＶ粒子は、同じ又は異なる血清型のＡＡＶに対応する天然又は変異体Ｃａｐタンパク質によって形成されたウイルス粒子中の特定のＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ（複数可）を含む、核酸構築物又はウイルス発現ベクターをカプシド形成することによって調製されてもよい。

アデノ随伴ウイルスのウイルスカプシドのタンパク質として、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が挙げられる。種々のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質配列間の差異は、細胞進入のためのさまざまな細胞表面受容体の使用を生じる。代替的細胞内プロセシング経路との組合せで、これは、各ＡＡＶ血清型について別個の組織トロピズムを生じさせる。

いくつかの技術は、天然に存在するＡＡＶウイルス粒子の構造及び機能的特性を改変及び改善するために開発された（Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，２００８；１０：７１７～７３３；Ｐａｕｌｋら、Ｍｏｌ ｔｈｅｒ．２０１８；２６（１）：２８９～３０３；Ｗａｎｇ Ｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５；２３（１２）：１８７７～８７；Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６；２４（６）：１０４２～１０４９；Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１２（６）：１０５６～６８）。

したがって、本開示によるＡＡＶウイルス粒子では、所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲ（複数可）を含む核酸構築物又はウイルス発現ベクターは、例えば：ａ）同じ又は異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質［例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡｎｃ８０カプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質］から構成されるウイルス粒子；ｂ）さまざまなＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質又は変異体の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子［例えば、ＡＡＶ１及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ］；ｃ）異なるＡＡＶ血清型間のドメイン交換によって切断されたカプシドタンパク質又はバリアントから構成されるキメラウイルス粒子［例えば、ＡＡＶ３ドメインを含むＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ］にパッケージングされてもよい。

当業者は、本開示による使用のためのＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、合成ＡＡＶバリアント、例えばＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４（Ｐａｕｌｋら、Ｍｏｌ ｔｈｅｒ．２０１８．２６（１）：２８９～３０３）、ＬＫ０３（Ｗａｎｇ Ｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５．２３（１２）：１８７７～８７）、ＡＡＶ３－ＳＴ（Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６．２４（６）：１０４２～１０４９）、Ａｎｃ８０（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１２（６）：１０５６～６８）並びに現在周知の又は後に発見される任意の他のＡＡＶ血清型を含む任意のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含む場合があることを理解する。

具体的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、肝細胞への送達のためにさらに好適であるＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９からなる群から選択される血清型由来のカプシドタンパク質を含む（Ｎａｔｈｗａｎｉら、Ｂｌｏｏｄ ２００７；１０９：１４１４～１４２１；Ｋｉｔａｊｉｍａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００６；１８６：６５～７３）。

具体的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、Ａｎｃ８０由来のカプシドタンパク質、肝臓、筋肉及び網膜を標的にする非常に強力な遺伝子治療ベクターとして挙動するウイルスＡＡＶ血清型１、２、８及び９の予測される祖先を含む（Ｚｉｎｎ Ｅら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１２（６）：１０５６～６８）。さらに具体的な実施形態では、ウイルス粒子は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ ＶＰ３カプシドタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＫＴ２３５８０４）を含む。

したがってさらなる態様では、本開示は、本開示の核酸構築物又は発現ベクターを含み、好ましくは：ＡＡＶ３ ３Ａ型、ＡＡＶ３ ３Ｂ型、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８血清型からなる群から選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子に関する。

具体的な実施形態では、ウイルス粒子は組換えバキュロウイルスに含まれたＡＡＶベクターゲノムを含む。それにより、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐを含む第２の組換えバキュロウイルスゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子を産生するために使用される。具体的な実施形態では、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、別個のバキュロウイルス後期プロモーターから、好ましくは逆方向で発現される。先の実施形態と組み合わされてもよい具体的な実施形態では、第２のバキュロウイルスゲノムは、ｒｅｐタンパク質、例えば、ＡＡＶ２由来のｒｅｐタンパク質をバキュロウイルス多面体（Ｐ_Ｐｈ）プロモーターの転写調節下でコードする異種性核酸を含む。他の実施形態では、第２のバキュロウイルスゲノムは、ｐ１０バキュロウイルスプロモーターの転写調節下でｃａｐタンパク質をコードする異種性核酸を含む。昆虫細胞における適した発現のための、並びに／或いはＶＰ及びビリオンの収量を増加させるため、又はビリオンのトロピズムを変更する若しくは抗原性を低減するための野生型ＡＡＶ配列の他の改変も当技術分野において周知である。ＡＡＶ血清型のｒｅｐ ＯＲＦ（翻訳領域）及び異なる血清型ＡＡＶのｃａｐ ＯＲＦをコードするヘルパーバキュロウイルス構築物を使用することによって、所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲに隣接されるベクターを、異なる血清型の構造カプシドタンパク質からアセンブルされるビリオンにパッケージングすることは実行可能である。これは、モザイク、キメラ又は標的化ベクターをパッケージングするためのこの同じ手順によっても可能である。

ウイルス－グリカン相互作用は、宿主細胞侵襲の重要な決定因子である。具体的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質を含み、ここで置換は、新規グリカン結合部位をＡＡＶカプシドタンパク質に導入する。さらに具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３～４７５及びアミノ酸４９９～５０２又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０若しくは、Ａｎｃ８０及びＡｎｃ８０Ｌ６５も含む任意の他のＡＡＶ血清型における対応するアミノ酸位置にある。

導入された新規グリカン結合部位は、ヘキソース結合部位［例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）若しくはフコース（ｆｕｃ）結合部位］；シアル酸（Ｓｉａ）結合部位［例えば、Ｓｉａ残基、例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＳＡｃ）若しくはＮ－グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＳＧｃ）である］；又は二糖結合部位である場合があり、ここで二糖は、例えばＳｉａ（アルファ２、３）Ｇａｌ又はＳｉａ（アルファ２、６）Ｇａｌの形態にある、ガラクトースに連結されたシアル酸である。ＡＡＶ血清型由来の新規結合部位を別の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質に導入するための詳細な指針は、国際特許公開第２０１４１４４２２９号及びＳｈｅｎら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３；２８８（４０）：２８８１４～２８８２３）に示されている。具体的な実施形態では、ＡＡＶ９由来のＧａｌ結合部位は、ＡＡＶ２ ＶＰ３骨格に導入され、細胞進入のためのＨＳ及びＧａｌ受容体の両方を使用できる二重グリカン結合ＡＡＶ株を生じる。好ましくは、前記二重グリカン結合ＡＡＶ株はＡＡＶ２Ｇ９である。Ｓｈｅｎらは、ＡＡＶ９ ＶＰ３カプシドタンパク質サブユニットのＧａｌ認識部位に直接関与し、すぐ隣接しているアミノ酸残基を、ＡＡＶ２ ＶＰ３サブユニットコード領域の対応する残基（ＡＡＶ２ ＶＰ３番号付けＱ４６４Ｖ、Ａ４６７Ｐ、Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ４７４Ｇ、Ｙ５００Ｆ及びＳ５０１Ａ）に置換することによってＡＡＶ２Ｇ９を生成した。

別の実施形態では、本開示による使用のためのウイルス粒子は、Ａｄ５ウイルス粒子などのアデノウイルス粒子であってもよく、適切なベクターゲノムの文脈ではＣＹＰ２７Ａ１発現カセットに組み込まれる。ＡＡＶウイルス粒子の場合では、Ａｄウイルス粒子のカプシドタンパク質は、それらのトロピズム及び細胞標的化特性を改変するように操作されてもよく、代替的アデノウイルス血清型も使用されてもよい。

ウイルス粒子を産生するためのプロセス
上に開示される発現ウイルスベクターを保有するウイルス粒子の産生は、発現ベクター及び産生されるベクターのウイルス粒子の実際の実施形態のために選択された構造特性を考慮して選択される、従来の方法及びプロトコールによって実施されてもよい。

簡潔にはウイルス粒子は、ヘルパーベクター若しくはウイルス又は他のＤＮＡ構築物（複数可）の存在下でパッケージングされる核酸構築物又は発現ベクターをトランスフェクトされる宿主細胞において、より具体的には特定のウイルス産生細胞（パッケージング細胞）において産生されてもよい。

本明細書において使用される場合、用語「パッケージング細胞」は、本開示の核酸構築物又は発現ベクターをトランスフェクトでき、ウイルスベクターの完全な複製及びパッケージングのために必要であるすべての欠けている機能をトランスで提供する細胞又は株化細胞を指す。典型的にはパッケージング細胞は、１つ又は複数の前記欠けているウイルス機能を構成的又は誘導性の様式で発現する。前記パッケージング細胞は、接着又は懸濁細胞である場合がある。

これらのパッケージング細胞は、ＡＡＶ産生のためのヘルパー機能を安定に発現する産生株化細胞又はヘルパー機能の一部若しくは全体を一過的に発現する株化細胞のいずれかであってもよい。

例えば、前記パッケージング細胞は、真核細胞、例えば、サル、ヒト、イヌ及びげっ歯類細胞を含む哺乳動物細胞であってもよい。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６ 細胞（国際公開第０１／３８３６２号）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）及び胎性アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－ １６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）又はＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。げっ歯類細胞の例は、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞又はＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。

哺乳動物の供給源に代わるものとして、ウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ又はキジなどのトリの供給源由来であってもよい。トリ株化細胞の例として、トリ胚性幹細胞（国際公開第０１／８５９３８号及び国際公開第０３／０７６６０１号）、不死化アヒル網膜細胞（国際公開第２００５／０４２７２８号）並びに、ニワトリ細胞（国際公開第２００６／１０８８４６号）又はＥＢ６６株化細胞などのアヒル細胞（国際公開第２００８／１２９０５８号及び国際公開第２００８／１４２１２４号）を含むトリ胚性幹細胞由来細胞が挙げられる。

別の実施形態では、細胞は、バキュロウイルス感染及び複製パッケージング細胞に許容的な任意の細胞であってもよい。具体的な実施形態では、前記細胞は、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）又はハイファイブ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）などの昆虫細胞である。

したがって、具体的な実施形態では、パッケージング細胞は：
本開示によるステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物若しくは発現ベクター（例えば、本開示によるＡＡＶ発現ベクター）、
ＩＴＲ配列を保有しない、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／若しくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物、例えばプラスミド；並びに／又は
ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物、例えば、プラスミド若しくはウイルス
を含む。

典型的には、ウイルス粒子を産生するプロセスは、
ａ）上に記載の核酸構築物又は発現ベクターを含むパッケージング細胞を培養培地において培養するステップ、並びに
ｂ）細胞培養上清及び／又は細胞内部からウイルス粒子を採取するステップ
を含む。

従来の方法はＡＡＶウイルス粒子を作製するために使用されてもよく、これは、本開示の導入遺伝子を保有する核酸構築物又は発現ベクター（例えば、プラスミド）；ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を保有しない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；並びにＡＡＶ複製のために必要なアデノウイルス機能を提供する第３の核酸構築物（例えば、プラスミド）を用いた株化細胞の一過的な細胞同時トランスフェクションからなる。ＡＡＶ複製のために必要なウイルス遺伝子は、本明細書においてウイルスヘルパー遺伝子と称される。典型的には、ＡＡＶ複製のために必要な前記遺伝子は、アデノウイルスヘルパー遺伝子、例えばＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４又はＶＡ ＲＮＡである。好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子は、Ａｄ５又はＡｄ２血清型のものである。

本開示によるＡＡＶ粒子の大規模産生は、例えば、組換えバキュロウイルスの組合せを用いた昆虫細胞の感染によっても実行されてもよい（Ｕｒａｂｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００２；１３：１９３５～１９４３）。ＳＦ９細胞は、それぞれＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶｃａｐを発現する２個又は３個のバキュロウイルスベクター及びパッケージングされるＡＡＶベクターを用いて同時感染される。組換えバキュロウイルスベクターは、ウイルス複製及び／又はパッケージングのために必要なウイルスヘルパー遺伝子機能をもたらす。Ｓｍｉｔｈら、２００９年（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１７巻、１１号、１８８８～１８９６ページ）は、昆虫細胞でのＡＡＶ粒子の大規模産生のための二重バキュロウイルス発現系をさらに記載している。

好適な培養培地は、当業者に周知なはずである。かかる培地を構成する成分は、培養される細胞の種類に応じて変化する場合がある。栄養素組成に加えて、モル浸透圧濃度及びｐＨは、培養培地の重要なパラメーターとして考慮される。細胞増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、有機及び無機塩、炭水化物の供給源、脂質、微量元素（ＣｕＳ０４、ＦｅＳ０４、Ｆｅ（Ｎ０３）３、ＺｎＳ０４など）を含む当業者によって十分周知の多数の成分を含み、各成分はｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の培養（すなわち、細胞の生存及び増殖）を支持する量で存在する。成分は、さまざまな補助物質、例えば緩衝物質（重炭酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓなど）、酸化安定化剤、機械的ストレスに対する安定化剤、プロテアーゼ阻害剤、動物増殖因子、植物加水分解物、抗凝集剤、消泡剤も含んでもよい。細胞増殖培地の特徴及び組成は、具体的な細胞の必要量に応じて変動する。商業的に入手できる細胞増殖培地の例は：ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地）ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅｓ）ＤＭＥＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、リーボビッツＬ－１５、マッコイ培地１９９、ハム（ハム培地）Ｆ１０及び派生物、Ｈａｍ Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などである。

ウイルス粒子産生に続いて、ウイルス粒子は、種々の従来の精製方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ＣｓＣ１グラジエントなどを使用して宿主細胞から精製されてもよい。例えば、アニオン交換カラム、親和性カラム及び／又はカチオン交換カラムでの精製など、複数のカラム３６精製ステップが使用される場合がある。さらに、感染が補助機能を発現するために使用される場合、残存ヘルパーウイルスは、周知の方法を使用して不活性化されてもよい。

本開示によるステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする導入遺伝子を含む得られたウイルス粒子は、下に記載される技術を使用する遺伝子治療のために使用されてもよい。

本開示による使用のためのウイルスベクターの構築及び産生のためのさらなる指針は、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７３７巻、Ｍｅｒｔｅｎ ａｎｄ Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ（編）；２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍ．Ｇｉａｃｃａ．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ Ｒ．及びＷｅｇｅｒ Ｓ．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９７；Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（Ｅｄ．）．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；１４３～１７０ページ；Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｍｏｕｌｌｌｉｅｒ（編）．２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈ．ら、Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００８；１０：７１７～７３３；Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍ．Ｃｈｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｓｃｈ（編）；第３版、２０１４ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）に見出すことができる。

宿主細胞
別の態様では本開示は、本開示の核酸構築物又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。さらに具体的には、本開示による宿主細胞は、ヘルパーベクター若しくはウイルス又は他のＤＮＡ構築物の存在下で、本開示による核酸構築物又は発現ベクターをトランスフェクトされた、パッケージング細胞とも称される特定のウイルス産生細胞であり、ウイルス粒子の完全な複製及びパッケージングのために必要であるすべての欠けている機能をトランスで提供する。前記パッケージング細胞は、接着又は懸濁細胞であってもよい。

例えば、前記パッケージング細胞は、サル、ヒト、イヌ及びげっ歯類細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（国際公開第０１／３８３６２号）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）及び胎性アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－ １６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）又はＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。げっ歯類細胞の例は、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞又はＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。

哺乳動物の供給源に代わるものとして、ウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ又はキジなどのトリの供給源由来であってもよい。トリ株化細胞の例として、トリ胚性幹細胞（国際公開第０１／８５９３８号及び国際公開第０３／０７６６０１号）、不死化アヒル網膜細胞（国際公開第２００５／０４２７２８号）並びに、ニワトリ細胞（国際公開第２００６／１０８８４６号）又はＥＢ６６株化細胞などのアヒル細胞（国際公開第２００８／１２９０５８号及び国際公開第２００８／１４２１２４号）を含むトリ胚性幹細胞由来細胞が挙げられる。

別の実施形態では、細胞は、バキュロウイルス感染及び複製パッケージング細胞に許容的な任意の細胞であってもよい。具体的な実施形態では、前記細胞は、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）又はハイファイブ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）などの昆虫細胞である。

したがって、具体的な実施形態では、宿主細胞は：
本開示によるステロール２７－ヒドロキシラーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物若しくは発現ベクター（例えば、本開示によるＡＡＶ発現ベクター）、
ＩＴＲ配列を保有しない、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／若しくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物、例えばプラスミド；並びに／又は
ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物、例えば、プラスミド若しくはウイルス
を含む。

別の態様では、本開示は、本開示のウイルス粒子を用いて形質導入された宿主細胞に関し、用語「宿主細胞」は、本明細書において使用される場合、目的のウイルスによる感染症に感染しやすく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養に適している任意の株化細胞を指す。

本開示の宿主細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療目的のために使用されてもよい。かかる実施形態では、細胞は、本開示のウイルス粒子を用いて形質導入され、次に患者又は対象に移植される。移植される細胞は、自己、同種又は異種由来であってもよい。臨床使用のために、細胞単離は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ＧＭＰ）条件下で一般に実行される。移植前に細胞の品質及び微生物又は他の混入物の非存在は、典型的には調べられ、照射及び／又は免疫抑制処置などの肝臓のプレコンディショニングは実行されてもよい。さらに宿主細胞は、細胞増殖及び／又は分化を刺激するために肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの増殖因子と共に移植されてもよい。

具体的な実施形態では、宿主細胞は、肝臓へのｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療のために使用される。好ましくは、前記細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、これらとして、これだけに限らないが、ヒト、類人猿；チンパンジー；サル及びオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌ及びネコを含む飼い慣らされた動物、並びにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びヤギなどの家畜、又は非限定的に、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が挙げられる。当業者は、移植される患者又は対象に応じてより適切な細胞を選択する。

前記宿主細胞は、幹細胞又は人工多能性幹細胞などの自己再生及び多能性特性を有する細胞であってもよい。幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞又は筋細胞の少なくとも１つに分化することができ、任意の種類の組織から単離することができる。一般にＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯又は末梢血から単離される。これらを得るための方法は、当業者に十分周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣとしても周知である）は、成体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の一種である。Ｙａｍａｎａｋａらは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子をマウス及びヒト線維芽細胞に移入し、細胞に遺伝子を発現させることによってｉＰＳ細胞を誘導した（国際公開第２００７／０６９６６６号）。続いてＴｈｏｍｓｏｎらは、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの代わりにＮａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を使用してヒトｉＰＳ細胞を産生した（国際公開第２００８／１１８８２０号）。

前記宿主細胞は、肝細胞でもあってもよい。細胞単離及び続くヒト又はマウスレシピエントへの移植を含む肝細胞移植手順は、例えば、Ｆｉｌｉｐｐｉ及びＤｈａｗａｎ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２０１４、１３１５ ５０～５５；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９６、１１１：１６５４～１６６０；Ｉｒａｎｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１、３：３，３０２～３０９及びＶｏｇｅｌら、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１４、３７：１６５～１７６に記載されている。肝細胞へのウイルス粒子のｅｘ ｖｉｖｏ形質導入のための方法は、例えば、Ｍｅｒｌｅら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００６、４１：８，９７４～９８２に記載されている。

医薬組成物
本開示の別の態様は、本開示の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子又は宿主細胞を、１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体との組合せで含む医薬組成物に関する。

本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容できる」は、動物及び／又はヒトにおける使用のために、規制機関によって又は欧州薬局方などの認められている薬局方によって承認されていることを意味する。用語「賦形剤」は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、担体又はビヒクルを指す。

任意の好適な薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤は、医薬組成物の調製において使用されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｐｒｉｌ １９９７を参照されたい）。医薬組成物は、典型的には滅菌で、製造及び保存の条件下で安定である。医薬組成物は、溶液（例えば、生理食塩水、ブドウ糖溶液若しくは緩衝液又は他の薬学的に許容できる滅菌液）、マイクロエマルジョン、リポソーム或いは高い産物濃度に適応するために好適な他の秩序構造（例えば、微小粒子又はナノ粒子）として製剤化されてもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）並びにこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合は必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持されてもよい。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを含むことは好ましい。

注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアレート塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。本開示の産物は、放出制御製剤中で、例えば、徐放性ポリマー又は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む急速な放出から産物を保護する他の担体を含む組成物中で投与されてもよい。生分解性及び生体適合性ポリマー、エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧ）などは、例えば使用されてもよい。好ましくは、前記医薬組成物は、溶液として、より好ましくは任意選択で緩衝生理食塩水として製剤化される。補助的な活性化合物も、本開示の医薬組成物に組み込まれてもよい。追加的治療剤の同時投与についての指針は、例えば、カナダ薬剤師会（ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のｔｈｅ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（ＣＰＳ）に見出すことができる。

一実施形態では医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内投与のために好適な組成物を含む非経口医薬組成物である。これらの医薬組成物は、例示のみであり、他の非経口及び非経口でない投与経路のために好適な医薬組成物を制限しない。本明細書に記載される医薬組成物は、単一の単位投薬量に又は多投薬量形態に包装されてもよい。

治療用使用
さらなる態様では、本開示は、それを必要とする対象における薬物としての使用のための本開示の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物に関する。

本明細書において使用される場合、用語「対象」又は「患者」は、哺乳動物を指す。開示された処置の方法から利益を得ることができる哺乳動物種として、これだけに限らないが、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル及びオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌ及びネコを含む飼い慣らされた動物、並びにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びヤギなどの家畜、又は非限定的に、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が挙げられる。

追加的態様では、本開示は、それを必要とする対象における脳腱黄色腫症の処置における使用のための本開示の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物に関する。

脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）は、新生児期の胆汁うっ滞、小児期発症の白内障、青年期から若年成人発症の腱黄色腫及び成人発症神経機能障害を伴う脳黄色腫によって特徴付けられる胆汁酸合成の異常である。ＣＴＸは、ステロール２７－ヒドロキシラーゼ遺伝子中の変異によって生じる。ステロール２７－ヒドロキシラーゼは、胆汁酸合成（ＢＡＳ）経路のステロール中間体の側鎖の酸化における最初のステップを触媒する。欠損した酵素機能は、胆汁酸合成を破壊し、コレステロール及びコレスタノール沈着をもたらし、変性プロセスを生じる。

本明細書において使用される場合、用語「処置」、「処置する」又は「処置すること」は、疾患の治療、予防、発症予防及び遅延などの患者の健康状態を回復させることを目的とする任意の作用を指す。ある特定の実施形態では、かかる用語は、疾患の又は疾患に伴う症状の回復又は根絶を指す。本開示により、ＣＴＸに伴う症状の例は、新生児期の胆汁うっ滞又は乳児期からの慢性下痢、白内障、胆汁うっ滞及び肝機能障害、アキレス腱及び他の腱（肘、手、膝蓋、首）の黄色腫、乳児期からの知的障害、認知症、精神医学的障害、錐体及び／又は小脳症状、発作並びに神経障害を含む成人発症進行性神経性機能障害である。他の実施形態では、この用語は、かかる疾患を有する対象への１つ又は複数の治療剤の投与がもたらす、疾患の伝播又は悪化の最小化を指す。

関連する態様では本開示は、肝疾患の処置における使用のための、好ましくはＣＴＸの処置における使用のための薬物の調製における、本開示の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物の使用に関係する。

さらなる態様では、本開示は、対象に治療有効量の本開示の核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における肝疾患、好ましくはＣＴＸを処置する及び／又は予防する方法に関する。

本開示の文脈では、「有効量」は治療有効量を意味する。

本明細書において使用される場合「治療有効量」は、胆汁塩合成の回復又は修復、血液及び他の器官での胆汁酸前駆体及び副産物の正常化、コレステロール及びコレスタノール沈着の低減並びに神経症状の回復又は安定化などの望ましい治療結果を達成するために必要な投薬量及び期間での有効量を指す。本開示の産物又はそれを含む医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重並びに個体において所望の反応をもたらす産物又は医薬組成物の能力などの要因に応じて変動する場合がある。投薬レジメンは、最適な治療反応をもたらすように調整されてもよい。治療有効量は、典型的には治療に有益な効果が、産物又は医薬組成物のいかなる毒性又は有害な効果も上回るものでもある。

本開示の産物を用いた処置は、ＣＴＸの１つ又は複数の症状の重症度を軽減、回復又は低減できる。例えば処置は、胆汁塩合成を増加及び／又は修復させる；さまざまな器官においてコレステロール及びコレスタノール沈着の量を減少させることができ、結果として疾患の重症度を軽減、回復又は低減できる。

本開示の産物は、典型的には医薬組成物又は薬物に、任意選択で医薬用担体、希釈剤及び／又はアジュバントとの組合せで含まれる。かかる組成物又は薬用の産物は、所望の治療効果をもたらすために十分な有効量で本開示の産物を、及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む。

一実施形態では、治療用使用のための核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物は、対象又は患者に非経口経路、特に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内経路によって投与される。

一実施形態では、治療用使用のための核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物は、組織内経路（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｒｏｕｔｅ）によって、すなわち組織の間隙に又は間隙内への注射によって投与される。組織標的は、特異的、例えば肝組織である場合がある、又はいくつかの組織の組合せ、例えば筋肉及び肝組織である場合がある。例示的な組織標的は、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着、腎臓、肺、血管内皮、上皮及び／又は造血細胞を含んでもよい。好ましい実施形態ではそれは、肝臓内注射、すなわち肝組織の間質腔への注射によって投与される。

対象又は患者に投与される本開示の産物の量は、個体の年齢、性別及び体重；疾患の性質及び段階、疾患の攻撃性；投与の経路；並びに／又は対象若しくは患者に処方されている併用薬を含む、個々の対象又は患者の具体的な状況に応じて変動する場合がある。投薬レジメンは、最適な治療反応をもたらすように調整されてもよい。

任意の具体的な対象のために、特定の投薬レジメンは、個体の必要性及び組成物を投与する又は組成物の投与を監督する者の専門的判断により時間をかけて調整されてもよい。本明細書に記載される投薬量範囲は、例示のみであり、医師によって選択されてもよい投薬範囲を限定しない。

一実施形態では、本開示によるＡＡＶウイルス粒子は、ＣＴＸ疾患の処置のために対象又は患者に、１×１０^８～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ（ｖｇ：ウイルスゲノム；ｋｇ：対象又は患者の体重）の範囲内に含まれる量又は用量で投与されてもよい。さらに具体的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は１×１０^１１～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲内に含まれる量で投与される。さらに具体的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、少なくとも１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、好ましくは５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、より好ましくは１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ及びより好ましくは５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの投薬量で投与される。

キット
別の態様では本開示は、上に記載される核酸構築物、発現ベクター、宿主細胞、ウイルス粒子又は医薬組成物を１つ又は複数の容器に含むキットにさらに関する。キットは、キット内に含有される核酸構築物、発現ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞又は医薬組成物を患者にどのように投与するかを記載する説明書又は包装材料を含んでもよい。キットの容器は、任意の好適な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などの、任意の好適なサイズ、形状又は構造であってもよい。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の産物を好適な液体又は溶液の形態で含有する１つ又は複数のアンプル又はシリンジを含んでもよい。

続く実施例は、例示として提供され、それらは本開示の限定を意図しない。さらに本開示は、本明細書に記載される特定の及び好ましい実施形態のすべての可能な組合せを包含する。

材料及び方法
細胞培養
ＨｕＨ－７（ＪＣＲＢ０４０３）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）、Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６４）、２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）、Ｈｅｐａ １－６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８３０）、ＡＭＬ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２５４）株化細胞を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１％の非必須アミノ酸（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）において維持した。ＡＭＬ１２株化細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２５４）を、１０％のＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌインスリン、０．００５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレニウム（ギブコ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において維持した。すべての細胞を３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気中で維持した。

ルシフェラーゼレポータープラスミド
ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、プロモーターを含まない、バックグラウンドルシフェラーゼ発現を決定するために使用される構築物である。ｐＣＭＶ－Ｌｕｃ及びｐＥａｌｂＰａ１ＡＴ－Ｌｕｃプラスミドは、以前記載された（Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｇら、（２００３）．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７，３７５～３８５）。ＥａｌｂＰａ１ＡＴ－Ｌｕｃプロモーター（本明細書以下でＥＡＡＴと称する）は、肝臓特異的で、ヒトα１－アンチトリプシンプロモーターに連結されたマウスアルブミンエンハンサーからなるハイブリッド制御配列である。ｐＣ２７Ｐ－Ｌｕｃプラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成され、ｐＧＬ３－ＢａｓｉｃのＭｌｕＩ－ＮｈｅＩ部位に導入されたヒトＣＹＰ２７Ａ１翻訳開始点の上流２０２４ｂｐを含む制御配列を含有する（Ａｒａｙａ Ｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７２：５２９～５３４；Ｃｈｅｎ Ｗら、Ｇｅｎｅ．２００３；３１３：７１～８２）。

トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
すべての株化細胞を２４ウエルプレートに１ウエルあたり細胞１０^５個の密度で播種し、２４時間後、それらを１ウエルあたり１μｇのプラスミドＤＮＡ及び２μｇのリポフェクタミンを使用して、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクトした。５時間後、培地を新たにし、細胞をパッシブリシス緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の添加前に４８時間維持した。ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルミナトＫＢ ９５０７ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において測定した。データをブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した各試料中のタンパク質含有量（μｇ）によって正規化した。ＣＭＶプロモーターを基準として使用してプロモーター活性をルシフェラーゼ活性の百分率として表した。

ＡＡＶベクター
ＡＡＶ－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１は、それぞれＥＡＡＴ又はＣＹＰ２７Ａ１プロモーターの調節下にＣＹＰ２７Ａ１ ｃＤＮＡを含有するＡＡＶ８ベクターである。ＡＡＶ－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ゲノム（ｐＡＡＶ－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１プラスミド）の構築ために、ＣＹＰ２７Ａ１コード配列（ＮＣＢＩ ＩＤ．ＣＣＤＳ２４２３．１）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって合成した。このＤＮＡ断片をＡＡＶ２由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接して、ＥＡＡＴプロモーター及びポリアデニル化部位を含有するプラスミドにＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位を使用して導入した。ｐＡＡＶ－ＥＡＡＴ－Ｌｕｃプラスミドは、ＥＡＡＴプロモーターの調節下にホタルルシフェラーゼを含有する。ｐＡＡＶ－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１プラスミドの構築のために、ＣＹＰ２７Ａ１プロモーターをＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ部位を使用してｐＣ２７Ｐ－Ｌｕｃプラスミドから切り出し、ｐＡＡＶ－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１の同じ部位に導入し、これによりＥＡＡＴプロモーターを置き換えた。ウイルス粒子（ＶＰ）産生のために、プラスミドをｐＤＰ８－ａｐｅヘルパープラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆａｃｔｏｒｙ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に２９３－Ｔ細胞に、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を使用してトランスフェクトした。３日後、培養培地及び細胞を遠心分離によって分離した。ＶＰを溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）の添加及び３サイクルの凍結融解（－８０℃）によって細胞沈殿から抽出した。培養培地中のＶＰをポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ８０００、最終濃度８％ｖ／ｖ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して４８～７２時間、４℃で沈殿させ、さらに１３７８×ｇ、１５分間遠心分離した。沈殿を溶解緩衝液中に再懸濁し、－８０℃に保った。培養培地及び細胞可溶化物から得たＶＰを３５０，０００ｇ、２．５時間中、１５～５７％のイオジキサノールグラジエント中での超遠心分離によって精製した。最終的に、精製したウイルスをアミコン限外濾過フィルター－ウルトラセル１００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して濃縮した。ＡＡＶベクターの定量を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実施した。この目的のためにＶＰを、ＤＮＡｓｅを用いて処置し、次にウイルスゲノムを高純度ウイルス核酸キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して抽出した。プライマーを表１に列挙する。

動物及び管理
Ｃｙｐ２７ａ１エクソン８のトランケーションを有するマウス株をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た（Ｂ６．１２９－Ｃｙｐ２７ａ１^{ｔｍ１Ｅｌｔ}／Ｊ、Ｒｅｆ．００９１０６）（Ｒｏｓｅｎ Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：１４８０５～１４８１２）。この変異についてホモ接合性のマウス（以下、Ｃｙｐ２７ａ１^－／－又はＣＴＸマウスと称する）をヘテロ接合性の個体の交雑によってＣ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドに維持した。リポジトリによって示されるとおり子孫を離乳後に遺伝子型判定した。
動物をケージあたり６匹までで（オス又はメス）集団飼育し、飼料及び水を自由摂取で与え、１２時間明暗サイクルで維持した。研究開始での平均年齢は７週齢であった。ＡＡＶベクターを最終体積１５０μｌ生理食塩溶液で後眼窩注射によって静脈内投与した。ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｆ： Ｃ９３７７－２５Ｇ）を標準固形飼料に０．１、０．５及び１ｇ ＣＤＣＡ／固形飼料１００ｇ（それぞれ０．１、０．５及び１．０％のＣＤＣＡ食餌）で補充した。心臓穿刺を麻酔下のマウスに実施した終了時点／終結手順を除いて、血液は顎下静脈穿刺によって１．３ｍｌ ＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して回収した。動物を安楽死させたら、肝臓試料を組織学的及び遺伝子発現分析のために回収した。

すべての手順は、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｒｏｙａｌ Ｄｅｃｒｅｅ ５３／２０１３に従って実施し、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａの倫理委員会によって承認された。

ハイドロダイナミック注射及び生物発光画像化
ｉｎ ｖｉｖｏ肝臓トランスフェクションのために、１．８ｍｌ生理食塩水中に希釈した２０μｇのレポータープラスミドを、外側尾静脈を通じてボーラスとして注射した（Ｋｒａｍｅｒ ＭＧら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；７：３７５～３８５）。ルシフェラーゼ活性を生物発光画像化（ＢＬＩ）によって４８時間後に決定した。この目的のために、マウスをケタミン／キシラジン混合物（８０：１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の注射を用いて短時間麻酔した。基質Ｄ－ルシフェリン（ＲＥＧＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を腹腔内投与した（ＰＢＳ中３０μｇ／μｌ溶液、１００μｌ）。光放出をフォトンイメージャー（ＰｈｏｔｏｎＩｍａｇｅｒ）（商標）オプティマ装置（ＢｉｏＳｐａｃｅ Ｌａｂ、Ｎｅｓｌｅｓ－ｌａ－Ｖａｌｌｅｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して５、２０及び３０分後に検出した。データをＭ３ビジョンソフトウェア（ＢｉｏＳｐａｃｅ Ｌａｂ）を使用して分析し、各動物について得られた最大値を示した。

血漿の生化学分析
血液を１０．０００ｇ、５分間、室温で遠心分離した。－８０℃、不透明チューブ中での保存前に血漿を酸化から保護するためにＮ_２雰囲気中、２０μＭブチルヒドロキシトルエン（Ｓｉｇｍａ）を用いて処置した。ステロール抽出を、以前記載のとおりＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってコレスタノール及び７αＣ４濃度の定量のために１００μｌの血漿を使用して実施した（Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｃｈｉａｎｇ ＪＹＬ．Ｇｅｎｅ．２００３；３１３：７１～８２）。血清中の胆汁酸（ＢＡ）プロファイリングを、６４２０三連四重ＬＣ／ＭＳデバイス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）（Ｍｏｎｔｅ ＭＪら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００２；３６：５３４～５４２）でのＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｙｅ Ｌら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００７；８６０：１０～１７）によってＢＡ測定について以前記載された方法を適合させたものを使用して（Ｎｙｔｏｆｔｅ ＮＳら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２０１１；４８：２１９～２２５）、アセトニトリル沈殿／抽出後に実行した（Ｌｅｎｉｃｅｋ Ｍら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１６；１０３３～１０３４：３１７～３２０）。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）をＣｏｂａｓ Ｃ３１１自動化化学分析機（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して４０μｌ血漿サンプル中で定量した。

定量的ＰＣＲ
ＲＮＡをマクスウエル（Ｍａｘｗｅｌｌ）（登録商標）１６ ＬＥＶシンプリイＲＮＡ細胞キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の推奨に従って使用して凍結肝臓試料から抽出した。ＤＮａｓｅＩを用いて処置した２μｇのＲＮＡを、Ｍ－ＭＬＶレトロトランスクリプターゼ（インビトロジェン（商標））及びランダムプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡを増幅し、相対的遺伝子発現をｉＱＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンスーパーミックス試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＣＦＸ９６ ＴｏｕｃｈＴＭリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定した。表１は、導入遺伝子（ＣＹＰ２７Ａ１）並びにマウス遺伝子Ｃｙｐ７ａ１、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ２７ａ１（エクソン１／２）、Ｃｙｐ２７ａ１（エクソン８／９）及び３６ｂ４（ハウスキーピング遺伝子として使用）に対して特異的なプライマーの配列を含む。

基準遺伝子として３６ｂ４ ｍＲＮＡレベルを使用するΔＣｔ値を各プライマー対の増幅効率を用いて補正し、グラフ表示を容易にするために１．０００をかけた。

ウエスタンブロット
総タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％のグリセリン（Ｇｌｉｃｅｒｏｌ）、２００ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ（インビトロジェン（商標））、０，５ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４及びコンプリートＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ））を使用して肝臓試料から単離した。２０μｇの総タンパク質抽出物を１分間煮沸し、１０％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ニトロセルロース膜への転写を電流３４０ｍＡ、３時間、４℃で実施した。次に、膜を１時間、室温、ブロッキング溶液（ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中５％のウシ血清アルブミン）中でインキュベーションし、ＴＢＳ中の１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．５％のアジ化ナトリウムに希釈した一次抗体との４℃、一晩のインキュベーションが続いた。一次抗体は抗ＣＹＰ２７ａ１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、カタログ番号ＥＰＲ７５２９、カタログ番号ａｂ１２６７８５、１：１．０００）１）及び抗ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、１：５．０００）である。ＴＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を用いた洗浄後、膜を１時間、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、カタログ番号ＮＡ９３４Ｖ、１：１０．０００）とインキュベートした。画像は、ケミドックシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて取得し、イメージラボ（Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ）（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を定量のために使用した。

免疫組織化学
肝細胞でのＣＹＰ２７Ａ１の検出のために、４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンに包埋した肝臓試料から厚さ３μｍの切片を切断し、キシレンを用いて脱パラフィン化し、エタノールの濃度を減少させて水和させ、内在性ペルオキシダーゼを遮断するために３％の過酸化水素を用いてインキュベートした。抗原回復を、それぞれＣＹＰ２７Ａ１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、カタログ番号ａｂ１２６７８５、１：２５０）及びβ－カテニン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、カタログ番号８４８０、１：２５０）に対する抗体を用いたインキュベーションの前に、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６又は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液中で２０分間加熱することによって実施した。ＨＲＰコンジュゲートされたエンビジョン二次抗体（Ｋ４００３、ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に続いてＤＡＢ試薬（Ｋ３４６８、ＤＡＫＯ）を検出手順のために添加した。組織切片をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて対比染色し、脱水した。陰性対照を一次抗体を省いて含めた。タンパク質を過剰発現する肝細胞の定量をマウス１匹あたり視野５個（３１１×３１１μｍ）でイメージＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して実施した。

統計解析
グラフパッドプリズムソフトウェアを分析のために使用した。正規分布に従うデータセット（ダゴスティーノ及びピアソン正規性検定）をシダックの多重比較検査を用いる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して比較した。他では、群はダンポストテストを含むクラスカルウォリスを使用して比較した。

結果
実施例１
ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター中の発現カセットは、マウスアルブミンエンハンサー及びヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターに基づくハイブリッドプロモーター（以下、ＥＡＡＴと称する）の調節下でヒトＣＹＰ２７Ａ１ ｃＤＮＡを含有する（図１）。この強い肝臓特異的制御配列は、Ｋｒａｍｅｒら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（２００３）３７５～３８５によって記載された。

ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクター中の発現カセットは、ヒトＣＹＰ２７Ａ１遺伝子の２ｋｂ ５’ＵＴＲ領域の調節下でヒトＣＹＰ２７Ａ１ ｃＤＮＡを含有し、この遺伝子の主な制御エレメントは同定されている（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｅ ３１３（２００３）７１～８２，Ａｒａｙａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７２（２００４）７１～８２）。本配列は、以下Ｃ２７Ｐと称する（図１）。

ｉｎ ｖｉｖｏでのプロモーターの評価
両プロモーターの相対的強度を評価するために、本発明者らは、ルシフェラーゼコード配列がこれらの配列によって調節されるレポータープラスミドを得た（図２）。プラスミドをＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓にハイドロダイナミック注射によってトランスフェクトし、４８時間後にルシフェラーゼ活性を生物発光画像化によって肝臓において評価した。この目的のために、２５μｇの各プラスミドを２．５ｍｌの生理食塩溶液に溶解し、尾静脈に５秒間かけて注射した。生物発光分析（ＢＬＩ）のためにマウスを２％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）の吸入によって麻酔した。基質Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ、体積１００μｌ中）を腹腔内注射し、５、１５及び３０分間後に光放出を定量した（光子／秒）。ピーク値を表示のために使用した。結果は、この動物モデルにおいて、ＥＡＡＴプロモーターがＣ２７Ｐプロモーターよりも１００倍高い活性を達成したことを示している。

Ｃｙｐ２７ａ ｋ．ｏ．マウスの代謝補正
次に、本発明者らは、Ｃｙｐ２７ａ１遺伝子のトランケーションを保有するＣ５７ＢＬ／６マウス（以下、Ｃｙｐ２７ａ１ ｋ．ｏ．と称する）においてＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターの治療的評価に進んだ。これは、今日までに利用可能である唯一のＣＴＸ動物モデルである（Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９９８）１４８０５～１４８１２）。ベクターを６週齢Ｃｙｐ２７ａ１ ｋ．ｏ．マウスに静脈内投与によって、以下の用量で投与した：ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１について１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ及び１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ並びにＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１について５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ及び１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ。

血液をＨＰＬＣ／質量分析による血漿中のコレスタノール及び７ａＣ４の決定のために１５日後に回収した。結果は、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１が、検査した最も低い用量でさえも両代謝物を正常化できることを実証している（図３）一方で、ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１は、検査した最も高い用量でわずかな影響を有する（図４）。注目すべきことに、処置したいずれの動物においても、肝臓トランスアミナーゼの上昇及び毒性の任意の他の徴候のいずれも検出されなかった。

ＡＡＶベクターを用いて処置したマウスの肝臓におけるＣＹＰ２７Ａ１の発現
マウスを肝臓におけるヒトＣＹＰ２７Ａ１の発現を分析するために血液回収後に屠殺した。組織試料をホルムアルデヒド／エタノール中で固定し、パラフィンに包埋した。組織薄片におけるＣＹＰ２７Ａ１の検出をヒト及びマウスタンパク質を認識する抗体を使用して免疫組織化学によって実行した。染色を、茶色の沈殿物を生じさせる抗体結合西洋ワサビペルオキシダーゼと基質ＤＡＢとの反応によって得た。画像を光学顕微鏡と接続したデジタルカメラを用いて捕捉した。予測されたとおり、低用量のＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１（１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスは、抗ＣＹＰ２７Ａ１抗体で強く標識された少ない割合の肝細胞を示した（図５）。

形質導入された肝細胞は、静脈周囲領域に局在し、胆汁酸が生理学的に合成される肝臓のゾーンと一致する。検査した最も高い用量（１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）では、大部分の肝細胞がヒトＣＹＰ２７Ａ Ｉの強い産生を示す。際立って対照的に、１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－Ｃ２７－ＣＹＰ２７Ａ１を用いて処置したマウスは、かすかな標識を示し、治療用タンパク質の低い産生を示している。

要約すると、これらの結果は、ほんのわずかの肝細胞における高レベルのＣＹＰ２７Ａ１産生が、ＣＴＸなどの遺伝性代謝疾患において生成される過剰な中間代謝物を除去するためのシンクとして作用できることを示している。これは、強いプロモーターを備えたＧＴベクターの比較的低い用量で達成でき、臨床診療での本アプローチの実行可能性を増加させる。

実施例２
肝臓特異的プロモーターを備えたＡＡＶベクターは、ＣＴＸマウスにおいてＣＹＰ２７Ａ１の効率的な発現を達成する。

本治療アプローチは、肝臓におけるＣＹＰ２７Ａ１の発現に基づく。発現カセットの設計のために、本発明者らは、２つの異なる制御配列の性能を比較した、図６Ａに示す：（ｉ）十分に確立されたハイブリッド肝臓特異的プロモーター（ＥＡＡＴ）（Ｋｒａｍｅｒ ＭＧら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；７：３７５～３８５）、及び（ｉｉ）翻訳開始部位の上流２０２４ｂｐを含む内在性ＣＹＰ２７Ａ１制御配列（Ａｒａｙａ Ｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７２：５２９～５３４；Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｃｈｉａｎｇ ＪＹＬ． Ｇｅｎｅ．２００３；３１３：７１～８２）（以下、Ｃ２７Ｐと称する）。目的は、Ｃ２７Ｐプロモーターが導入遺伝子発現の制御のために好適であるかどうか決定することであった。両配列をルシフェラーゼレポータープラスミドに最初に組み込み、ヒト由来（ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ）並びにマウス由来（Ｈｅｐａ１－６及びＡＭＬ－１２）のさまざまな肝臓由来株化細胞にトランスフェクトした。基準として本発明者らは、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）を含有するレポータープラスミドを使用した。プロモーターを有さないプラスミドｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃを、バックグラウンドルシフェラーゼ活性を決定するために使用した。本発明者らは、株化細胞応じて異なる結果を得た。ＥＡＡＴプロモーターがＨｅｐＧ２及びＨｕＨ－７細胞においてＣ２７Ｐよりもさらに強力であった一方で、ＡＭＬ－１２では差異は観察されず、両プロモーターは、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｅｐａ１－６細胞において比較的低い活性を示した（図６Ｂ）。さらなる関連情報を得るために、本発明者らは、ハイドロダイナミック注射によって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてプラスミドのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを実施した。注射４８時間後のＢＬＩによる光放出の定量は、内在性アルブミン及びＣｙｐ２７ａ１転写物の存在量に基づいて予測されるとおり、ＥＡＡＴプロモーターの強い転写活性及びＣ２７Ｐ配列の比較的低い強さを明らかにした（図６Ｃ）。

ＡＡＶベクターゲノムの文脈においては、両プロモーターをＣＹＰ２７Ａ１コード配列の転写を調節するために使用し、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１及びＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターを生じさせた（図７Ａ）。７週齢ＣＴＸマウスを、５×１０^１１～５×１０^１３ｖｇ／Ｋｇの範囲の用量でベクターの静脈内注射を用いて処置した。動物を２週間後に屠殺し、導入遺伝子発現（ＣＹＰ２７Ａ１）を肝臓抽出物におけるｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。

生理学的発現についての基準として、内在性マウスＣｙｐ２７ａ１ ｍＲＮＡをエクソン８を標的にするプライマーを使用して定量した（表１）。予測されたとおり、これらのプライマーを使用した場合は、全長マウスＣｙｐ２７ａ１ ｍＲＮＡはＷＴマウスにおいてだけ検出された（図７Ｂ）。ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターを用いて処置したマウスは、用量が５×１０^１２ｖｇ／Ｋｇに達した場合だけバックグラウンドを上回るＣＹＰ２７Ａ１ ｍＲＮＡレベルを示した。検査した最も高い用量（５×１０^１３ｖｇ／Ｋｇ）でさえ、ｍＲＮＡ含有量は、ＷＴマウスにおいて検出される生理学的レベルを下回った。ｑＲＴ－ＰＣＲを使用するマウス及びヒトｍＲＮＡの直接比較は容易ではなかったが、これらのデータは、このゲノムの文脈ではＣ２７Ｐ制御配列が内在性ＣＹＰ２７Ａ１プロモーターより弱いことを示している。対照的にＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターを用いた処置は、検査した最も低い用量（５×１０^１１ｖｇ／Ｋｇ、マウス１匹あたり１×１０^１０ｖｇに相当）でさえＣＹＰ２７Ａ１のロバストな発現を得た。肝臓試料の一部をタンパク質抽出のために処理し、ウエスタンブロットを、ＣＹＰ２７Ａ１含有量を決定するために実施した。注目すべきことに、本発明者らは、マウス及びオルソログを検出することができるが、ＣＴＸマウスによって発現される切断型タンパク質を検出できない抗体を使用した。結果は、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターを用いて処置したマウスにおける強い発現を一部確認した。しかし、ＷＴレベルを上回るＣＹＰ２７Ａ１の全体的な増加は、ベクターの用量が１．５×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ以上であった場合だけ観察された（図７Ｃ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ結果と一致して、検査した最も高い用量でＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターだけが検出可能なＣＹＰ２７Ａ１タンパク質に達した。これらのベクター用量に対応した形質導入された肝細胞の百分率を決定するために、肝臓試料を免疫組織化学のために処理した。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１を用いた処置したマウスでは、ＣＹＰ２７Ａ１を過剰発現する肝細胞が、容易に、小葉中心性領域で優先的に検出できた（図７Ｄ）。本発明者らは、ＣＹＰ２７Ａ１の全体的な増加は、肝細胞の２０％未満が導入遺伝子を過剰発現する場合（１．５×１０^１２ｖｇ／Ｋｇベクター用量）に得られたことを観察した。しかし、抗体の感度の限界が低レベルで発現する肝細胞の検出を妨げ、ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターを用いて処置したマウスにおいて陽性肝細胞の、誤解を招くような低い百分率を生じた。本発明者らは、同じ抗体を使用してＷＴマウスにおいてマウスＣＹＰ２７Ａ１タンパク質の一貫した検出を得られなかった（未提示）。肝細胞形質導入の予測される過小評価を明らかにするために、ＥＡＡＴプロモーターの調節下でレポーター遺伝子ＧＦＰを発現するＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＧＦＰベクターの静脈内注射を用いて新たなセットのマウスを処置した。ＧＦＰ免疫組織化学検出の高い特異性及び感度は、用量１．５×１０^１２ｖｇ／Ｋｇベクターがおよそ１０％のマウス肝細胞を形質導入する一方で、１．５×１０^１３ｖｇ／Ｋｇの用量は８０％近くに達することの確認を可能にした。

ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、ＣＴＸマウスにおいてコレスタノール及び７αｃ４レベルを正常化する。

ＣＹＰ２７Ａ１－発現ベクターの生物学的効果を評価するために、血液を単回静脈内投与の２週間後にＣＴＸマウスから回収した。血漿中のコレスタノール及び７αＣ４の分析は、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１がメス及びオスマウスにおいて１．５×１０^１２ｖｇ／Ｋｇ以上の用量で代謝物レベルを正常化することができたことを示した（図８）。このベクターの最も低い用量（５×１０^１１ｖｇ／Ｋｇ）は、不完全な低減だけを達成し、これは７αＣ４の場合にさらに明らかであった。同じ傾向が、導入遺伝子の比較的低い発現を有する系統においてＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターを最も高い用量（５×１０^１３ｖｇ／Ｋｇ）で使用した場合に観察された。遺伝子治療の効果を標準処置と比較した。この目的のために、ＣＤＣＡをさまざまな百分率（固形飼料重量の０．１、０．５又は１％）で高めた食餌をＣＴＸマウスに与え、１か月間追跡した。本発明者らは、血漿中のコレスタノール及び７αＣ４の用量依存的低減を観察した（図８）。コレスタノールレベルの減少は特に強く、０．５％のＣＤＣＡ以上でＷＴマウスを下回る値に達する。実際に、この用量がマウスにおける（オス及びメスの両方において）７αＣ４の完全な正常化を達成するために必要であったことから、ＣＴＸモデルにおける治療用量が０．５％であったことを本発明者らは見出した。１％のＣＤＣＡへの用量の増加は、体重減少を生じ、さらに評価しなかった。

導入遺伝子発現の安定性及び治療効果を決定するために、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１を１．５×１０^１２又は１．５×１０^１３ｖｇ／Ｋｇで用いて処置した追加の群のＣＴＸマウスを処置２週間及び５か月後に屠殺した。肝臓及び血液試料の分析は、持続的な導入遺伝子発現及び代謝物の補正を確認した（それぞれ図９Ａ及び９Ｂ）。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは血清トランスアミナーゼの上昇を伴わず（図９Ｃ）、肝臓における病理組織学的異常は非存在（図９Ｄ）でＣＴＸマウスにおいて十分許容された。未処置ＣＴＸマウスは、ＷＴ同腹仔と比較して高いＡＬＴレベルを示したが、この穏やかな上昇は下に考察するとおり肝腫大の存在に関連する可能性があった。

ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、ＣＴＸマウスにおいて胆汁酸代謝を修復させる。

ＣＴＸの生化学マーカーへの遺伝子治療及びＣＤＣＡ処置の生物学的効果を確認した後に、本発明者らは、胆汁酸代謝に関与する重要な酵素の発現への影響を研究した。この目的のためにｍＲＮＡをベクター投与の２週間後、又はＣＤＣＡ処置の開始１か月後に回収した肝臓試料から抽出した。最初に本発明者らは、内在性Ｃｙｐ２７ａ１遺伝子の転写調節への処置の影響を研究した。ＣＴＸマウスが９個のエクソンのうちのエクソン８の遺伝子でのトランケーションを示すことから（Ｒｏｓｅｎ Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：１４８０５～１４８１２）、本発明者らは、野生型又は切断型転写物を検出するためにエクソン１／２を標的にするプライマーを使用した。図７Ｂに示す結果とは対照的に（プライマーがエクソン８／９に設計されている）、Ｃｙｐ２７ａ１ ｍＲＮＡは、ＣＴＸマウスにおいて検出できた。転写物は、おそらくナンセンス変異依存分解機構のためにＷＴ同腹仔においてよりも豊富でなかった。本発明者らは、ＣＰ２７Ａ１の補充が内在性遺伝子の転写に影響を有さなかった一方で、ＣＤＣＡ処置は穏やかな阻害を生じたことを観察した（図１０Ａ）。Ｃｙｐ７ａ１発現の定量は、それらのＷＴ同腹仔と比較してＣＴＸマウスにおけるこの律速酵素の上方制御を確認した（図１０Ｂ）。ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、図８に示す７αＣ４の低減と一致して、検査した最も低い用量（５×１０^１１ｖｇ／Ｋｇ）でさえＣｙｐ７ａ１の効率的な正常化を実証した。対照的に、高用量のＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、まったく効率的でなかった。０．５％のＣＤＣＡを用いた処置は、生理学的レベルを下回るＣｙｐ７ａ１発現の劇的な低減を生じた。次いで本発明者らは、肝臓での生体異物への応答における重要な酵素をコードするＣｙｐ３ａ１１遺伝子の発現を分析した（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｙら、Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０１５；４０：７８７～７９６）。以前記載されたとおり（Ｈｏｎｄａ Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３４５７９～３４５８５）、ＣＴＸマウスは、ＰＸＲ経路の活性化のおかげでこの遺伝子の過剰発現を示した（図１０Ｃ）。興味深いことに、０．５％のＣＤＣＡは、Ｃｙｐ３ａ１１発現のわずかな低減を達成しただけであった一方で、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１は、すべての用量でｍＲＮＡ含有量を完全に正常化した。これらの効果は、ＧＦＰを発現する同等のベクターが未処置ＣＴＸマウスと比較して変化を示さなかった（データ未記載）ことから、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１からのＣＹＰ２７Ａ１の効率的な発現に完全に依存した。加えて、ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、顕著な効果を示さなかった。

異物反応経路の活性化は、ＣＴＸマウスにおいて肝腫大を生じる（Ｒｅｐａ ＪＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：３９６８５～３９６９２）。この変化は、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターによって元に戻されたが、０．５％でのＣＤＣＡによっては不十分なだけであった（図１１）。

ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターは、血中で胆汁酸組成を正常化する。

遺伝子治療が、ＣＴＸマウスにおいて持続的な代謝補正を達成することができるかどうかを決定するために、胆汁酸プロファイルをＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１を用いて５か月、１．５又は１５×１０^１２ｖｇ／Ｋｇで処置した動物の血液において分析した。ＣＤＣＡの最適な用量（０．５％の固形飼料重量）を同じ期間維持し、比較のために使用した。本発明者らは、ＣＤＣＡを含む、両用量でのベクターを用いて処置したマウスにおいて一次及び二次胆汁酸の増加を観察した（図１２）。多くの場合、レベルは、ＷＴ同腹仔において見出されたものと同等であった。コール酸（ＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）及びそれらのタウロコンジュゲートの濃度だけは、１．５×１０^１２ｖｇ／ＫｇでＷＴマウスと比較して中等度の増加を示した。この傾向は、高用量群においてさらに明白であり、タウロムリコール酸（ＴＭＣＡ）及びタウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）などの他の化学種を含んだ。際立って対照的に、ＣＤＣＡを用いた処置は、この胆汁酸及びその誘導体の劇的な増加（正常レベルを１０００倍超える）を生じた一方で、ＣＡ及び誘導化学種は修復されなかった。

考察
ＡＡＶベクターの開発の進行は、遺伝子治療を肝臓に関する一遺伝子性疾患のための現実的な選択肢にしている。しかし、本アプローチの臨床的な実現可能性は、注意深い前臨床的評価をまだ必要とする。発現カセットのサイズ（これらのベクターの容量４．７Ｋｂに適合すべきである）とは別に、最も重要なパラメーターの１つは、関連する治療効果を得るために必要な形質導入された肝細胞の百分率である。低い百分率の肝細胞形質導入が必要とされことは、安全用量のベクターを使用する成功の可能性を増加させる。典型的な例は、機能性の治療用タンパク質が肝臓から発現され、血流中に分泌される、血友病などの疾患である（Ｐｅｙｖａｎｄｉ Ｆ，Ｇａｒａｇｉｏｌａ Ｉ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２０１９；２５：７３８～７４６）。銅蓄積障害ウィルソン病などの他の例では、タンパク質は細胞内で作用するが、形質導入された肝細胞は過剰な銅を除去するシンクとして作用できる（Ｍｕｒｉｌｌｏ Ｏら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１６；６４；Ｍｕｒｉｌｌｏ Ｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１９；７０：１０８～１２６）。本結果は、形質導入された肝細胞が十分多い量のＣＹＰ２７Ａ１チトクロムを発現する限り、ＣＴＸが後者に分類されてもよいことを示す。この前臨床結果は、完全な生化学的修復は、ＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターによって２０％未満の肝細胞の形質導入で得られることを示している。この結論は、ＣＹＰ２７Ａ１免疫組織化学（低いレベルで発現している肝細胞は検出できない）のみではなく、高度に特異的で高感度のＧＦＰ免疫検出も可能にするＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＧＦＰベクターとの間接的な比較にも基づいている。本発明者らは、未形質導入肝細胞において生成された過剰な高度に透過性の７αＣ４代謝物が、ＣＹＰ２７Ａ１を過剰発現する他の細胞に透過し、代謝される場合があると仮定した。さらに、最も低い用量のＡＡＶ８－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターがＷＴマウスと同様のＣＹＰ２７Ａ１タンパク質の全体的な肝臓含有量を達成したが、コレスタノールレベルでは不十分な低減だけを得たことから、この「シンク効果」は限界を有すると考えられる。このことは、形質導入された肝細胞の最小の閾値が、少なくともマウスモデルでは１０％に近い可能性があることを示している。対照的に、Ｃ２７Ｐ制御配列によって付与される転写活性化がこのゲノムの文脈ではＣＹＰ２７Ａ１プロモーターよりも低かったことから、ＡＡＶ８－Ｃ２７Ｐ－ＣＹＰ２７Ａ１ベクターの効果は、検査した最も高い用量でさえわずかであった。ＡＡＶクローニング能力によって課されるサイズの制約を考慮して、本配列の強度の増加は、ハイブリッドＥＡＡＴプロモーターと同様にエンハンサーの追加を必要とする（Ｋｒａｍｅｒ ＭＧら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；７：３７５～３８５）。ＣＹＰ２７Ａ１の過剰発現は、ＣＴＸマウスにおいて十分許容され、導入遺伝子発現の生理学的制御がこの疾患において絶対に必要な条件ではないことを示唆している。このことは、臨床的な実現可能性の観点では別の有利な状況である。ＣＤＣＡの生涯の経口投与に基づく標準治療がコレスタノールレベルを効率的に調節し、慢性下痢及び黄色腫の進行などの多数の臨床症状を回復させることから、ＣＴＸのための代替療法に対する必要性は低いように考えられる（Ｖｅｒｒｉｐｓ Ａら、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０；４１：９４３～９４９）。しかし、この研究において本発明者らは、遺伝子治療の作用機序が異なることの証拠を提供する。治療用量でのＣＤＣＡは、ＣＴＸ患者において観察されたような血中のこの胆汁酸の著しい蓄積を生じた（Ｂａｔｔａ ＡＫ，Ｔｉｎｔ ＧＳ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．１９９４；４３：１０１８～１０２２；Ｓａｌｅｎ Ｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９７４；５３：６１２～６２１）。本発明者らは、Ｃｙｐ７ａ１発現が治療用量で実質的に抑制されたことを見出した。この劇的な影響にもかかわらず、異物反応経路はＣＴＸマウスにおいて活性化されたままであり、他の潜在的に毒性の代謝物の生成が阻害されなかったことを示唆している。この現象は、ＰＸＲ経路がＣＴＸ患者では誘導されないことから、マウスモデルを使用してだけ検出される可能性がある（Ｈｏｎｄａ Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３４５７９～３４５８５）。これらの代謝物が、ＣＤＣＡ処置にもかかわらず多数の患者において観察された進行性の神経機能の低下の原因であることがあるかどうかを決定するために、さらなる調査が必要である（Ｍｉｇｎａｒｒｉ Ａら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２０１６；３９：７５～８３；Ｐｉｌｏ－ｄｅ－ｌａ－Ｆｕｅｎｔｅ Ｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１；１８：１２０３～１２１１；Ｍｉｇｎａｒｒｉ Ａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１７；２６４：８６２～８７４）。血漿交換療法を用いた事例となる経験は、完全な解毒がＣＤＣＡ処置だけでは達成されないとの仮説を支持する（Ｍｉｍｕｒａ Ｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１９９３；１１４：２２７～２３０）。この前臨床結果によって、用量漸増は、それが十分に許容されないことから選択肢にならないであろう。明らかな神経症状を有するマウスモデルの開発は、遺伝子治療が疾患のこの重要な態様に対処することができるかどうかを評価するために必要である。マウスとヒトの胆汁酸代謝の間にいくらかの差異は存在するが、本発明者らは、Ｃｙｐ２７ａ１^－／－マウスが生化学レベルでさまざまな処置を評価するための有益な手段であることを見出した。例えば、０．５％のＣＤＣＡは、いくつかの臨床的観察と一致して、コレスタノールを低減させる上で非常に効率的だが、７αＣ４を完全には正常化しなかった（Ｍｉｇｎａｒｒｉ Ａら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２０１６；３９：７５～８３）。対照的に遺伝子治療は、両代謝物の並行した低減を達成した。要約すると、本発明者らは、ＡＡＶベクターを使用するＣＹＰ２７Ａ１の補充が、単回のベクター投与後に完全で安定した代謝補正の可能性を提供する、ＣＴＸの処置のための安全で実現可能な代替手段であり得る証拠を示す。

本発明の実施における使用のための配列
本発明の実施における使用のための配列は下に記載される：
ステロール２６－ヒドロキシラーゼアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００７７５．１、２０２０年４月２５日アクセス）（配列番号１）
MAALGCARLRWALRGAGRGLCPHGARAKAAIPAALPSDKATGAPGAGPGVRRRQRSLEEIPRLGQLRFFFQLFVQGYALQLHQLQVLYKAKYGPMWMSYLGPQMHVNLASAPLLEQVMRQEGKYPVRNDMELWKEHRDQHDLTYGPFTTEGHHWYQLRQALNQRLLKPAEAALYTDAFNEVIDDFMTRLDQLRAESASGNQVSDMAQLFYYFALEAICYILFEKRIGCLQRSIPEDTVTFVRSIGLMFQNSLYATFLPKWTRPVLPFWKRYLDGWNAIFSFGKKLIDEKLEDMEAQLQAAGPDGIQVSGYLHFLLASGQLSPREAMGSLPELLMAGVDTTSNTLTWALYHLSKDPEIQEALHEEVVGVVPAGQVPQHKDFAHMPLLKAVLKETLRLYPVVPTNSRIIEKEIEVDGFLFPKNTQFVFCHYVVSRDPTAFSEPESFQPHRWLRNSQPATPRIQHPFGSVPFGYGVRACLGRRIAELEMQLLLARLIQKYKVVLAPETGELKSVARIVLVPNKKVGLQFLQRQC
ＣＹＰ２７Ａ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）
ATGGCTGCGCTGGGCTGCGCGAGGCTGAGGTGGGCGCTGCGAGGGGCCGGCCGTGGCCTCTGCCCCCACGGGGCCAGAGCCAAGGCCGCGATCCCTGCCGCCCTCCCCTCGGACAAGGCCACCGGAGCTCCCGGAGCCGGGCCTGGTGTCCGGCGGCGGCAACGGAGCTTAGAGGAGATTCCACGTCTAGGACAGCTGCGCTTCTTCTTTCAGCTGTTCGTTCAAGGCTATGCCCTGCAACTGCACCAGTTACAGGTGCTTTACAAGGCCAAGTACGGTCCAATGTGGATGTCCTACTTAGGGCCTCAGATGCACGTGAACCTGGCCAGTGCCCCGCTCTTGGAGCAAGTGATGCGGCAAGAGGGCAAGTACCCAGTACGGAACGACATGGAGCTATGGAAGGAGCACCGGGACCAGCACGACCTGACCTATGGGCCGTTCACCACGGAAGGACACCACTGGTACCAGCTGCGCCAGGCTCTGAACCAGCGGTTGCTGAAGCCAGCGGAAGCAGCGCTCTATACGGATGCTTTCAATGAGGTGATTGATGACTTTATGACTCGACTGGACCAGCTGCGGGCAGAGAGTGCTTCGGGGAACCAGGTGTCGGACATGGCTCAACTCTTCTACTACTTTGCCTTGGAAGCTATTTGCTACATCCTGTTCGAGAAACGCATTGGCTGCCTGCAGCGATCCATCCCCGAGGACACCGTGACCTTCGTCAGATCCATCGGGTTAATGTTCCAGAACTCACTCTATGCCACCTTCCTCCCCAAGTGGACTCGCCCCGTGCTGCCTTTCTGGAAGCGATACCTGGATGGTTGGAATGCCATCTTTTCCTTTGGGAAGAAGCTGATTGATGAGAAGCTCGAAGATATGGAGGCCCAACTGCAGGCAGCAGGGCCAGATGGCATCCAGGTGTCTGGCTACCTGCACTTCTTACTGGCCAGTGGACAGCTCAGTCCTCGGGAGGCCATGGGCAGCCTGCCTGAGCTGCTCATGGCTGGAGTGGACACGACATCCAACACGCTGACATGGGCCCTGTACCACCTCTCAAAGGACCCTGAGATCCAGGAGGCCTTGCACGAGGAAGTGGTGGGTGTGGTGCCAGCCGGGCAAGTGCCCCAGCACAAGGACTTTGCCCACATGCCGTTGCTCAAAGCTGTGCTTAAGGAGACTCTGCGTCTCTACCCTGTGGTCCCCACAAACTCCCGGATCATAGAAAAGGAAATTGAAGTTGATGGCTTCCTCTTCCCCAAGAACACCCAGTTTGTGTTCTGCCACTATGTGGTGTCCCGGGACCCCACTGCCTTCTCTGAGCCTGAAAGCTTCCAGCCCCACCGCTGGCTGAGAAACAGCCAGCCTGCTACCCCCAGGATCCAGCACCCATTTGGCTCTGTGCCCTTTGGCTATGGGGTCCGGGCCTGCCTGGGCCGCAGGATTGCAGAGCTGGAGATGCAGCTACTCCTCGCAAGGCTGATCCAGAAGTACAAGGTGGTCCTGGCCCCGGAGACGGGGGAGTTGAAGAGTGTGGCCCGCATTGTCCTGGTTCCCAATAAGAAAGTGGGCCTGCA
GTTCCTGCAGAGACAGTGCTGA
ＣＹＰ２７Ａ１制御エレメント（Ｃ２７Ｐ）（配列番号３）
TTAACTTTTGTGTCAAGGCATTTTTGAACAAGCAAGGGCTATCCCTAAAGTCATGAGGCAGTATTGTCCTGGTGTACCATTGGGTAATAGTAGTTTCAGGATTAGTCTACTTGAAAGGAAATAAGTTCTGAGAGTCGAAGTGCAAAGGAATACAAAAGAAAGCATTCTTATGATCTAACACTGTGAACTAATTGGTGTTTTCTGGTATTTGGTTAAGTATAGTATAAGGATTTGGCACTATAGGATGTAAGAGAATTATGACCTCGTTAATGGCTCCTAAGTCTTGAACTAGATCATATATATATATATATATATATAATTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTTGTCCAGGTTGGAGTGCATGGCACAATCTCAGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGTCTCCCCAAGTAGCTGGGATCACGTGTGCCACCACGTTTTTAAAGCATGGCCTCCTGTCCTTCCTGTCCAAAAACCAAATGAAAAATATGGTCTAGGTTGGGTGCTGTGGCTCACACCTGTAATTCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTAGGTAGATCATCTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCAAAACCCTATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCACCTCTAATTCCAGCTACTCTGGAGGCTGAGACCGGAGAATTGCTTGAACCGGGAGGCGGAGGTTGCAGCGAGCCAGGATTGCACCACTGCACTCCAGCCTGGACGACAGGGTGAGACTCTGGGGAGTGGGGAGGAGAGAATTAACAAACTATATGACACAAAGGAACAAAAATACACAAGACAGGATAAGAGAGAGGAAGGATACAGGGAGAGCTAACATACATATAGCAGTTTGAAGTCCCGGGAAAGGAGAAAAAAATGGGGAGGAGCAATATTTGAACAGATAATATCTGAGAAACTCCCCAGACTGATCAAAGACATCCAGTCACAGAGTCAAGAAACTAGGAGTCCTAGAATAAATAAGTAGAAAGCCACACCTAGCAACTCAGCTGTCAGCCTAATTGAACTTAATATGCCCTTTCTTCTCTGGCTGCCTGTAAATCACCAATTTTTCAAATGCTGTTAGAACCAGCTGTACCATCCTGCTGGGTCCTTCATTCCTGGCTTGAATGTGATCTTTGACCCTGTATTTATTTTATACTTGCGTGAGTTATGTTTTTAAACTTTTTGACAACTATACTTTGAATATACATGAAACATAGGATTCATAAGACAATACTTTTTTTTTCTTCTTGCTGTACGTTTTCCGTACTATGTTACTCTTTCCATTTTATTAAAAATAATTCTGGCCATCATCTACGAAATCTGGTCTCAACCTGCAGTTTGAAATATCCTGCCTTGGCAGACGCGGCAGGGAGGTGCGTGGAGGGAGAATTGAATTAAAAAAAAAAACAACAAAACACGAATATTTAGATTTCTTTGTTCAGCGGCCCCCCTCCAGGGATCAGATGACTGGCCCCCCTCGCTCCGAACTGACTCCGGGATCAATCCGGAAGGCCATTGGGAGAAGCCGAGGGCAGCTTAGCCACGGCCGGTTCCCGTTCCCTCCAGGACGCGAGGGTCGCCTTGGGTGGGGAACCGCGACCGGGCGAGGACCTATCCCGGTGTGGGGCTTCCCGATTTCGAAAGAATCTCGCTGCACCCCCGCCCAGAGTTCAGACCAAGCGAAAAGTTATTTGAGAGGCCTCGGGGGCGCGGGGTGAGGAGTCGTGGCGGAGGCCTTGGTCGGGGCGCCGTGGATATCCCCGAGTCACCGCGTCCCTCTCCTGCAGCTCCCGCGTCGCTGGGAGGAGCGAGGGAGCGAGCGGGAAGGGGTCTAGCTGGCCTTTGCTCGGCCCTCCCCAGCGCCCGGCTTTGAACCCGCCCTGCACTGCTGTCTGGGCGGGTCCGGGGACTCAGCACTCGACCCAAAGGTGCAGGCGCGCGAGCACAACCCGCTAGCGAATTC
ヒトアルファ－１アンチトリプシン遺伝子プロモーター（配列番号４）
CGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAA
マウス血清アルブミンエンハンサー（配列番号５）
GTTCCTAGATTACACTACACATTCTGCAAGCATAGCACAGAGCAATGTTCTACTTTAATTACTTTCATTTTCTTGTATCCTCACAGCCTAGAAAATAACCTGCGTTACAGCATCCACTCAGTATCCCTTGAGCATGAGGTGACACTACTTAACATAGGGACGAGATGGTACTTTGTGTCTCCTGCTCTGTCAGCAGGGCACAGTACTTGCTGATACCAGGGAATGTTTGTTCTTAAATACCATCATTCCGGACGTGTTTGCCTTGGCCAGTTTTCCATGTACATGCAGAAAGAAGTTTGGACTGATCAATACAGTCCTCTGCCTTTAAAGCAATAGGAAAAGGCCAACTTGTCTACGTTTAGTATGTGGCTGTAGATCTGTACC
キメラプロモーター配列ＥＡＴＴ（配列番号６）
GTTCCTAGATTACACTACACATTCTGCAAGCATAGCACAGAGCAATGTTCTACTTTAATTACTTTCATTTTCTTGTATCCTCACAGCCTAGAAAATAACCTGCGTTACAGCATCCACTCAGTATCCCTTGAGCATGAGGTGACACTACTTAACATAGGGACGAGATGGTACTTTGTGTCTCCTGCTCTGTCAGCAGGGCACAGTACTTGCTGATACCAGGGAATGTTTGTTCTTAAATACCATCATTCCGGACGTGTTTGCCTTGGCCAGTTTTCCATGTACATGCAGAAAGAAGTTTGGACTGATCAATACAGTCCTCTGCCTTTAAAGCAATAGGAAAAGGCCAACTTGTCTACGTTTAGTATGTGGCTGTAGATCTGTACCCGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAA
５’－ＩＴＲ（配列番号７）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGC
３’－ＩＴＲ（配列番号８）
GCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG
核酸構築物：ＩＴＲ－ＥＡＡＴ－ＣＹＰ２７Ａ１－ポリＡ－ＩＴＲ（配列番号９）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGTTCCTAGATTACACTACACATTCTGCAAGCATAGCACAGAGCAATGTTCTACTTTAATTACTTTCATTTTCTTGTATCCTCACAGCCTAGAAAATAACCTGCGTTACAGCATCCACTCAGTATCCCTTGAGCATGAGGTGACACTACTTAACATAGGGACGAGATGGTACTTTGTGTCTCCTGCTCTGTCAGCAGGGCACAGTACTTGCTGATACCAGGGAATGTTTGTTCTTAAATACCATCATTCCGGACGTGTTTGCCTTGGCCAGTTTTCCATGTACATGCAGAAAGAAGTTTGGACTGATCAATACAGTCCTCTGCCTTTAAAGCAATAGGAAAAGGCCAACTTGTCTACGTTTAGTATGTGGCTGTAGATCTGTACCCGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAAGCGGCCGCTAGCGAATTCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGCTGCGCTGGGCTGCGCGAGGCTGAGGTGGGCGCTGCGAGGGGCCGGCCGTGGCCTCTGCCCCCACGGGGCCAGAGCCAAGGCCGCGATCCCTGCCGCCCTCCCCTCGGACAAGGCCACCGGAGCTCCCGGAGCCGGGCCTGGTGTCCGGCGGCGGCAACGGAGCTTAGAGGAGATTCCACGTCTAGGACAGCTGCGCTTCTTCTTTCAGCTGTTCGTTCAAGGCTATGCCCTGCAACTGCACCAGTTACAGGTGCTTTACAAGGCCAAGTACGGTCCAATGTGGATGTCCTACTTAGGGCCTCAGATGCACGTGAACCTGGCCAGTGCCCCGCTCTTGGAGCAAGTGATGCGGCAAGAGGGCAAGTACCCAGTACGGAACGACATGGAGCTATGGAAGGAGCACCGGGACCAGCACGACCTGACCTATGGGCCGTTCACCACGGAAGGACACCACTGGTACCAGCTGCGCCAGGCTCTGAACCAGCGGTTGCTGAAGCCAGCGGAAGCAGCGCTCTATACGGATGCTTTCAATGAGGTGATTGATGACTTTATGACTCGACTGGACCAGCTGCGGGCAGAGAGTGCTTCGGGGAACCAGGTGTCGGACATGGCTCAACTCTTCTACTACTTTGCCTTGGAAGCTATTTGCTACATCCTGTTCGAGAAACGCATTGGCTGCCTGCAGCGATCCATCCCCGAGGACACCGTGACCTTCGTCAGATCCATCGGGTTAATGTTCCAGAACTCACTCTATGCCACCTTCCTCCCCAAGTGGACTCGCCCCGTGCTGCCTTTCTGGAAGCGATACCTGGATGGTTGGAATGCCATCTTTTCCTTTGGGAAGAAGCTGATTGATGAGAAGCTCGAAGATATGGAGGCCCAACTGCAGGCAGCAGGGCCAGATGGCATCCAGGTGTCTGGCTACCTGCACTTCTTACTGGCCAGTGGACAGCTCAGTCCTCGGGAGGCCATGGGCAGCCTGCCTGAGCTGCTCATGGCTGGAGTGGACACGACATCCAACACGCTGACATGGGCCCTGTACCACCTCTCAAAGGACCCTGAGATCCAGGAGGCCTTGCACGAGGAAGTGGTGGGTGTGGTGCCAGCCGGGCAAGTGCCCCAGCACAAGGACTTTGCCCACATGCCGTTGCTCAAAGCTGTGCTTAAGGAGACTCTGCGTCTCTACCCTGTGGTCCCCACAAACTCCCGGATCATAGAAAAGGAAATTGAAGTTGATGGCTTCCTCTTCCCCAAGAACACCCAGTTTGTGTTCTGCCACTATGTGGTGTCCCGGGACCCCACTGCCTTCTCTGAGCCTGAAAGCTTCCAGCCCCACCGCTGGCTGAGAAACAGCCAGCCTGCTACCCCCAGGATCCAGCACCCATTTGGCTCTGTGCCCTTTGGCTATGGGGTCCGGGCCTGCCTGGGCCGCAGGATTGCAGAGCTGGAGATGCAGCTACTCCTCGCAAGGCTGATCCAGAAGTACAAGGTGGTCCTGGCCCCGGAGACGGGGGAGTTGAAGAGTGTGGCCCGCATTGTCCTGGTTCCCAATAAGAAAGTGGGCCTGCAGTTCCTGCAGAGACAGTGCTGAGCGGCCAacaatgcgatccgaTGGCCGCGACTCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGCCCGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG

Claims (16)

1. ヒトステロール２７－ヒドロキシラーゼ又はその機能的バリアントをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む核酸構築物。
2. 前記肝臓特異的プロモーターがヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 前記肝臓特異的プロモーターがマウスアルブミンエンハンサーを含む、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
4. 前記肝臓特異的プロモーターが前記マウスアルブミンエンハンサー及び前記ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターを含む、請求項３に記載の核酸構築物。
5. 前記肝臓特異的プロモーターが配列番号６の核酸配列又は配列番号６に少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項４に記載の核酸構築物。
6. ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列、さらにより好ましくは配列番号７及び８の５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
7. 配列番号９の核酸配列又は配列番号９に少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
9. ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。
10. 請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項８若しくは９に記載の発現ベクターを含むウイルス粒子。
11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項８若しくは９に記載の発現ベクターを含み、好ましくはＡＡＶ３ ３Ａ型、ＡＡＶ３ ３Ｂ型、ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、ＬＫ０３、ＡＡＶ３－ＳＴ、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８血清型からなる群から選択されるカプシドタンパク質などのアデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子。
12. 請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項８若しくは９に記載の発現ベクターを含むか、或いは請求項１０又は１１に記載のウイルス粒子を用いて形質導入されている宿主細胞。
13. 請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項８若しくは９に記載のベクター、請求項１０若しくは１１に記載のウイルス粒子又は請求項１２に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
14. それを必要とする対象における薬物としての使用のための請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項８若しくは９に記載のベクター、請求項１０若しくは１１に記載のウイルス粒子、請求項１２に記載の宿主細胞又は請求項１３に記載の医薬組成物。
15. それを必要とする対象における脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）の予防及び／又は処置における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項８若しくは９に記載のベクター、請求項１０若しくは１１に記載のウイルス粒子、請求項１２に記載の宿主細胞又は請求項１３に記載の医薬組成物。
16. ａ）請求項１２に記載の核酸構築物又は発現ベクターを含む宿主細胞を培養培地において培養するステップ、並びに
    ｂ）前記細胞培養上清及び／又は前記細胞内部から前記ウイルス粒子を採取するステップ
    ｃ）任意選択で前記ウイルス粒子を精製及び製剤化するステップ
    を含む、請求項１０又は１１に記載のウイルス粒子を産生する方法。
    
    

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