JP2023535351A - 関節機能を改善する遺伝子編集 - Google Patents

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Abstract

本開示は、炎症成分によって特徴付けられる関節障害を治療するための組成物及び方法を提供する。一部の態様では、組成物及び方法は、変形性関節炎及び他の関節炎の進行を予防し、哺乳動物関節における変形性関節炎及び他の関節炎を治療するためのものである。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月１６日出願の米国仮特許出願第６３／０５２，８８１号、及び２０２０年７月２３日出願の米国仮特許出願第６３／０５５，８０８号に対する優先権を主張するものであり、それらの内容は、参照によりその全体で全ての目的に対して本明細書に組み込まれる。
滑膜関節機能障害を治療するための組成物及び方法が本明細書に説明される。加えて、変形性関節炎などの疾患の治療における、滑膜細胞並びに／又は滑膜細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、及び滑膜線維芽細胞を遺伝子編集するための方法と、遺伝子編集された滑膜細胞並びに／又は滑膜細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、及び滑膜線維芽細胞の使用が本明細書に開示される。
変形性関節炎、変形性関節疾患、及び他の関節機能障害の治療は複雑であり、症候性緩和又は関節機能回復のための長期的な選択肢はほとんど存在しない。変形性関節炎（ＯＡ）は、疼痛に起因する障害の主な原因である。Ｎｅｏｇｉ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ２０１３；２１：１１４５－５３。全ての哺乳動物種が影響を受けている：使役動物、家畜、及びそれらの所有者は、全て、疾患進行の程度に応じて、ＯＡ関連の不快感、疼痛、及び障害に苦しむ。
ＯＡは、進行性の障害の経過によって特徴付けられる複雑な疾患である。全身性炎症は、ＯＡ及びＯＡ疾患進行と関連付けられている。炎症は、増加した炎症誘発性サイトカインのレベルによって引き起こされる。この疾患を治療するための新しい方法及び組成物が、緊急に必要とされている。本明細書では、ＯＡ並びに他の炎症性関節障害の治療に有用な組成物及び方法が開示される。
本開示は、炎症成分によって特徴付けられる関節障害を治療するための組成物及び方法を提供する。一部の態様では、組成物及び方法は、変形性関節炎及び他の関節炎の進行を予防し、哺乳動物関節における変形性関節炎及び他の関節炎を治療するためのものである。例示的な実施形態によると、関節滑膜細胞及び／又は滑膜細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、又は滑膜線維芽細胞の少なくとも一部分は、炎症性サイトカインの発現を減少させるために遺伝子編集される。一部の態様では、関節滑膜細胞及び／又は滑膜細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、若しくは滑膜線維芽細胞の少なくとも一部分が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、又はＩＬ－１α、ＩＬ－１βの両方の発現を低減するように遺伝子編集される。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、哺乳動物関節を含む細胞の少なくとも一部分において、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子の発現をサイレンシング又は低減させる。一部の態様では、細胞が、滑膜細胞である。一部の態様では、細胞が、滑膜線維芽細胞である。一部の態様では、細胞が、滑膜細胞である。一部の態様では、細胞が、軟骨細胞である。一部の態様では、細胞が、滑膜マクロファージである。
一部の実施形態では、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを含む群から選択される。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、ジンクフィンガー法、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の方法を含む。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法を含む。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ法が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法である。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、ＴＡＬＥ法を含む。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、ジンクフィンガー法を含む。
一部の実施形態では、遺伝子編集が、関節を含む細胞の少なくとも一部分において、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子の発現をサイレンシング又は低減させる。一部の実施形態では、編集された細胞の部分が、滑膜細胞である。一態様では、編集された細胞の部分が、滑膜線維芽細胞である。一部の実施形態では、編集された細胞の部分が、滑膜細胞である。一部の実施形態では、編集された細胞の部分が、軟骨細胞である。一部の実施形態では、編集された細胞の部分が、滑膜マクロファージである。
一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達システムが、遺伝子編集システムを送達するために使用される。一部の実施形態では、ＡＡＶ送達システムが、関節内に注射される。
本開示の一部の態様は、遺伝子編集システム及び薬学的に許容される担体を含む関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。一態様では、遺伝子編集システムが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＩＬ－１８からなる群から選択される１つ以上の遺伝子座を標的とする１つ以上の核酸を含む。
実施形態は、イヌの跛行を治療する方法を提供し、方法が、遺伝子編集組成物を投与することを含み、組成物が、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βの発現を、跛行関節の滑膜細胞、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、又は滑膜線維芽細胞の一部分においてサイレンシング又は低減させる。
一部の実施形態では、上記の方法が、本明細書に記載される方法及び組成物のいずれかに列挙された１つ以上の特徴を更に含む。
本開示の実施形態が、添付図面を参照して更に説明される。示される図面は、必ずしも縮尺どおりではなく、その代わりに、概して、本開示の実施形態の原理を例示することに重点を置く。
０．５μｇのＳｐｙＣａｓ９（ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９タンパク質ｖ２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって切断された、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｉｌ１ａ及びＩｌ１ｂ遺伝子に対して設計された１００ｎｇのマウスＤＮＡ（ｇＢｌｏｃｋｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、並びにＩｌ１ａ遺伝子（＃４３～４６）及びＩｌ１ｂ遺伝子（＃４７～５０）に対して標的化された２００ｎｇのホスホロチオエート修飾されたシングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡのインビトロにおけるアガロースゲル電気泳動分析を例示する。 ０．５μｇのＳａｕＣａｓ９（ＧｅｎｅＳｎｉｐｐｅｒ（商標）Ｃａｓ９、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）によって切断された、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｉｌ１ａ及びＩｌ１ｂ遺伝子に対して設計された１００ｎｇのマウスＤＮＡ（ｇＢｌｏｃｋｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、並びにＩｌ１ａ遺伝子（＃５１～５３）及びＩｌ１ｂ遺伝子（＃５４～５６）に対する２００ｎｇのホスホロチオエート修飾されたガイドｓｇＲＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を例示する。 Ｊ７７４．２（「Ｊ」）及びＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）細胞のガイドＲＮＡの範囲で使用されるＳｐｙＣａｓ９及びＳａｕＣａｓ９の編集効率を表示するグラフを集合的に例示し、図２Ａは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、図２Ｂは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ｂのインビボ切断であり、図２Ｃは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で３×ｓｇＲＮＡ（ＳａｕＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、編集効率は、各プールのＳａｎｇｅｒシーケンシングトレース（ＩＣＥツール、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）の逆畳み込みを使用して決定される。 Ｊ７７４．２（「Ｊ」）及びＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）細胞のガイドＲＮＡの範囲で使用されるＳｐｙＣａｓ９及びＳａｕＣａｓ９の編集効率を表示するグラフを集合的に例示し、図２Ａは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、図２Ｂは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ｂのインビボ切断であり、図２Ｃは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で３×ｓｇＲＮＡ（ＳａｕＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、編集効率は、各プールのＳａｎｇｅｒシーケンシングトレース（ＩＣＥツール、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）の逆畳み込みを使用して決定される。 Ｊ７７４．２（「Ｊ」）及びＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）細胞のガイドＲＮＡの範囲で使用されるＳｐｙＣａｓ９及びＳａｕＣａｓ９の編集効率を表示するグラフを集合的に例示し、図２Ａは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、図２Ｂは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ｂのインビボ切断であり、図２Ｃは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で３×ｓｇＲＮＡ（ＳａｕＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、編集効率は、各プールのＳａｎｇｅｒシーケンシングトレース（ＩＣＥツール、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）の逆畳み込みを使用して決定される。 Ｊ７７４．２（「Ｊ」）及びＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）細胞のガイドＲＮＡの範囲で使用されるＳｐｙＣａｓ９及びＳａｕＣａｓ９の編集効率を表示するグラフを集合的に例示し、図２Ａは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、図２Ｂは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で４×ｓｇＲＮＡ（ＳｐｙＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ｂのインビボ切断であり、図２Ｃは、２つの細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）及びＪ７７４．２（「Ｊ」）にわたる、２つの別個のプール（Ｐｏｏｌ１及び２）で３×ｓｇＲＮＡ（ＳａｕＣａｓ９）を用いて編集されたＩｌ１ａのインビボ切断であり、編集効率は、各プールのＳａｎｇｅｒシーケンシングトレース（ＩＣＥツール、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）の逆畳み込みを使用して決定される。 ＩＶＩＳシステムを使用して測定されたＧＦＰ発現を例示する。フラックス値は、動物の注射された膝関節を中心とする関心対象の領域に基づいていた。データは、群当たり４つの標本の平均（ＳＤ）として提示される。 本開示の実施例５に説明される研究の設計を例示する。 本開示の実施例５に説明される研究で取得された生存転帰測定値を例示する。 本開示の実施例５に説明される研究において、ＰＢＳ、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－６、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－６、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－５、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－５の関節内（ＩＡ）注射で処理されたマウスの体重変化を例示する。 本開示の実施例５に説明される研究において、ＰＢＳ、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－６、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－６、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－５、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－５の関節内（ＩＡ）注射で処理されたマウスにおける（Ａ）経時的なマウス関節のベースラインからの膝キャリパー測定値の変化、及び（Ｂ）ＡＵＣによる足首キャリパー測定値の平均差を集合的に例示する。 本開示の実施例５に説明される研究において、ＰＢＳ、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－６、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－６、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－５、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－５の関節内（ＩＡ）注射で処理されたマウスにおける（Ａ）経時的なマウス関節のベースラインからの膝キャリパー測定値の変化、及び（Ｂ）ＡＵＣによる足首キャリパー測定値の平均差を集合的に例示する。 本開示の実施例５に説明される研究において、ＰＢＳ、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－６、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－６、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－５、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－５の関節内（ＩＡ）注射で処理されたマウスから取得された（Ａ）ｖｏｎ Ｆｒｅｙ測定値の変化、及び（Ｂ）ｖｏｎ Ｆｒｅｙ測定値の平均絶対閾値を集合的に例示する。 本開示の実施例５に説明される研究において、ＰＢＳ、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－６、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－６、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－５、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－５の関節内（ＩＡ）注射で処理されたマウスから取得された（Ａ）ｖｏｎ Ｆｒｅｙ測定値の変化、及び（Ｂ）ｖｏｎ Ｆｒｅｙ測定値の平均絶対閾値を集合的に例示する。 本開示の実施例５に説明される研究において、ＰＢＳ、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－６、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－６、スクランブルベクターを含むＡＡＶ－５、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド１及び２を含むＡＡＶ－５の関節内（ＩＡ）注射で処理されたマウスから取得された滑液におけるＩＬ－１β発現のためのｑＰＣＲアッセイの結果を例示する。 ＰＢＳで前処置された（Ａ、Ｂ）、及びＣＲＩＳＰＲで処理された（Ｃ、Ｄ）ＭＳＵ注射された動物の滑膜組織におけるマウスＩＬ－１βについての免疫組織化学を集合的に例示する。（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）それぞれ、図１０Ａ及び図１０Ｃの各々に対するアイソタイプ対照を示す。 ＰＢＳで前処置された（Ａ、Ｂ）、及びＣＲＩＳＰＲで処理された（Ｃ、Ｄ）ＭＳＵ注射された動物の滑膜組織におけるマウスＩＬ－１βについての免疫組織化学を集合的に例示する。（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）それぞれ、図１０Ａ及び図１０Ｃの各々に対するアイソタイプ対照を示す。 ＰＢＳで前処置された（Ａ、Ｂ）、及びＣＲＩＳＰＲで処理された（Ｃ、Ｄ）ＭＳＵ注射された動物の滑膜組織におけるマウスＩＬ－１βについての免疫組織化学を集合的に例示する。（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）それぞれ、図１０Ａ及び図１０Ｃの各々に対するアイソタイプ対照を示す。 ＰＢＳで前処置された（Ａ、Ｂ）、及びＣＲＩＳＰＲで処理された（Ｃ、Ｄ）ＭＳＵ注射された動物の滑膜組織におけるマウスＩＬ－１βについての免疫組織化学を集合的に例示する。（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）それぞれ、図１０Ａ及び図１０Ｃの各々に対するアイソタイプ対照を示す。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１アルファ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１アルファ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１アルファ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 マウス、ヒト、ウマ、ネコ、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子間のアライメントを集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 イヌＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 イヌＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 イヌＩＬ－１アルファ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 イヌＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 イヌＩＬ－１ベータ遺伝子を編集するために設計された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡ配列を集合的に例示する。 実施例８に説明されるように、ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ａ）、ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｂ）、イヌＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ｃ）、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｄ）を標的とするｃｒＲＮＡ配列の細胞ベース及びインシリコ遺伝子編集分析の結果を集合的に例示する。°アミノ酸（ＡＡ）の翻訳フレーム内のＣＲＩＳＰＲ切断位置。＊Ｄｏｅｎｃｈ，Ｆｕｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）からの最適化されたスコア。このスコアは、ＮＧＧを含む２０ｂｐのガイドに最適化される。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）からの特異性スコア。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高精度スコア（＞０．４）は、ＤＮＡ修復結果が均一であり、ほんの一握りの固有の遺伝子型に濃縮されていることを示唆する。＊＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高い（＞８０％）フレームシフト頻度は、タンパク質コード遺伝子をフレーム外に外す傾向がある。１－ｂｐの挿入及び１～２ｂｐの欠失が、特に一般的な修復結果であるため、典型的なゲノムフレームシフト頻度は、６６％を上回る。＾複合スコア＝（オフターゲットスコア＋精度スコア＊１００＋フレームシフト）／３。†パイプ記号「｜」は、ＣＲＩＳＰＲ切断部位を示す。中括弧「｛｝」は、挿入を示す。ハイフン「－」は、欠失を示す。＄潜在的なオフターゲット部位。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によるスコアリング。オフターゲット部位は、１００のスコアを有する。 実施例８に説明されるように、ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ａ）、ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｂ）、イヌＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ｃ）、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｄ）を標的とするｃｒＲＮＡ配列の細胞ベース及びインシリコ遺伝子編集分析の結果を集合的に例示する。°アミノ酸（ＡＡ）の翻訳フレーム内のＣＲＩＳＰＲ切断位置。＊Ｄｏｅｎｃｈ，Ｆｕｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）からの最適化されたスコア。このスコアは、ＮＧＧを含む２０ｂｐのガイドに最適化される。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）からの特異性スコア。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高精度スコア（＞０．４）は、ＤＮＡ修復結果が均一であり、ほんの一握りの固有の遺伝子型に濃縮されていることを示唆する。＊＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高い（＞８０％）フレームシフト頻度は、タンパク質コード遺伝子をフレーム外に外す傾向がある。１－ｂｐの挿入及び１～２ｂｐの欠失が、特に一般的な修復結果であるため、典型的なゲノムフレームシフト頻度は、６６％を上回る。＾複合スコア＝（オフターゲットスコア＋精度スコア＊１００＋フレームシフト）／３。†パイプ記号「｜」は、ＣＲＩＳＰＲ切断部位を示す。中括弧「｛｝」は、挿入を示す。ハイフン「－」は、欠失を示す。＄潜在的なオフターゲット部位。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によるスコアリング。オフターゲット部位は、１００のスコアを有する。 実施例８に説明されるように、ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ａ）、ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｂ）、イヌＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ｃ）、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｄ）を標的とするｃｒＲＮＡ配列の細胞ベース及びインシリコ遺伝子編集分析の結果を集合的に例示する。°アミノ酸（ＡＡ）の翻訳フレーム内のＣＲＩＳＰＲ切断位置。＊Ｄｏｅｎｃｈ，Ｆｕｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）からの最適化されたスコア。このスコアは、ＮＧＧを含む２０ｂｐのガイドに最適化される。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）からの特異性スコア。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高精度スコア（＞０．４）は、ＤＮＡ修復結果が均一であり、ほんの一握りの固有の遺伝子型に濃縮されていることを示唆する。＊＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高い（＞８０％）フレームシフト頻度は、タンパク質コード遺伝子をフレーム外に外す傾向がある。１－ｂｐの挿入及び１～２ｂｐの欠失が、特に一般的な修復結果であるため、典型的なゲノムフレームシフト頻度は、６６％を上回る。＾複合スコア＝（オフターゲットスコア＋精度スコア＊１００＋フレームシフト）／３。†パイプ記号「｜」は、ＣＲＩＳＰＲ切断部位を示す。中括弧「｛｝」は、挿入を示す。ハイフン「－」は、欠失を示す。＄潜在的なオフターゲット部位。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によるスコアリング。オフターゲット部位は、１００のスコアを有する。 実施例８に説明されるように、ヒトＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ａ）、ヒトＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｂ）、イヌＩＬ－１アルファ遺伝子（図７Ｃ）、及びイヌＩＬ－１ベータ遺伝子（図７Ｄ）を標的とするｃｒＲＮＡ配列の細胞ベース及びインシリコ遺伝子編集分析の結果を集合的に例示する。°アミノ酸（ＡＡ）の翻訳フレーム内のＣＲＩＳＰＲ切断位置。＊Ｄｏｅｎｃｈ，Ｆｕｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）からの最適化されたスコア。このスコアは、ＮＧＧを含む２０ｂｐのガイドに最適化される。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）からの特異性スコア。スコアは、０～１００の範囲である。高ければ高いほど良好である。＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高精度スコア（＞０．４）は、ＤＮＡ修復結果が均一であり、ほんの一握りの固有の遺伝子型に濃縮されていることを示唆する。＊＊＊＊このスコアは、Ｕ２ＯＳにおける実験に基づく。高い（＞８０％）フレームシフト頻度は、タンパク質コード遺伝子をフレーム外に外す傾向がある。１－ｂｐの挿入及び１～２ｂｐの欠失が、特に一般的な修復結果であるため、典型的なゲノムフレームシフト頻度は、６６％を上回る。＾複合スコア＝（オフターゲットスコア＋精度スコア＊１００＋フレームシフト）／３。†パイプ記号「｜」は、ＣＲＩＳＰＲ切断部位を示す。中括弧「｛｝」は、挿入を示す。ハイフン「－」は、欠失を示す。＄潜在的なオフターゲット部位。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によるスコアリング。オフターゲット部位は、１００のスコアを有する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１８Ａ及び図１８Ｃ）並びに２４時間（図１８Ｂ及び図１８Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのイヌＩＬ－１アルファ（図１８Ａ及び図１８Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１８Ａ及び図１８Ｃ）並びに２４時間（図１８Ｂ及び図１８Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのイヌＩＬ－１アルファ（図１８Ａ及び図１８Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１８Ａ及び図１８Ｃ）並びに２４時間（図１８Ｂ及び図１８Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのイヌＩＬ－１アルファ（図１８Ａ及び図１８Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１８Ａ及び図１８Ｃ）並びに２４時間（図１８Ｂ及び図１８Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのイヌＩＬ－１アルファ（図１８Ａ及び図１８Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１９Ａ及び図１９Ｃ）並びに２４時間（図１９Ｂ及び図１９Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのヒトＩＬ－１アルファ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１９Ａ及び図１９Ｃ）並びに２４時間（図１９Ｂ及び図１９Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのヒトＩＬ－１アルファ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１９Ａ及び図１９Ｃ）並びに２４時間（図１９Ｂ及び図１９Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのヒトＩＬ－１アルファ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）放出を集合的に例示する。 実施例９に説明されるように、ＰＢＳ又はＬＰＳへの曝露後６時間（図１９Ａ及び図１９Ｃ）並びに２４時間（図１９Ｂ及び図１９Ｄ）の非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）イヌ軟骨細胞からのヒトＩＬ－１アルファ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）並びにイヌＩＬ－１ベータ（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）放出を集合的に例示する。
上記で識別された図面は、現在開示される実施形態を記載しているが、他の実施形態もまた、議論に記載されるように意図されている。本開示は、限定ではなく、表現として例示的な実施形態を提示する。本開示の実施形態の原理の範囲及び趣旨に収まる数多くの他の修正及び実施形態が、当業者によって考案され得る。
詳細な説明
本明細書に説明されるように、本開示の実施形態は、関節機能を改善し、関節疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。特定の実施形態では、滑膜線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、又は滑膜マクロファージを遺伝子編集して、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、１つ以上のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、又はＮＬＲＰ３インフラマソームの１つ以上の成分の発現を低減させるための組成物及び方法が提供される。実施形態は、変形性関節炎及び他の炎症性関節疾患を治療するために使用される。実施形態は、変形性関節炎に起因するイヌの跛行を治療するために更に有用である。実施形態は、関節疾患に起因するウマの跛行を治療するために更に有用である。実施形態はまた、外傷後関節炎、痛風、偽痛風、及び他の炎症介在性又は免疫介在性関節疾患を治療するために有用である。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を指す。
「インビトロ」という用語は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生存又は死滅した細胞が用いられる細胞ベースのアッセイを包含し、また、無傷の細胞が用いられる細胞非含有アッセイも包含し得る。
「エクスビボ」という用語は、対象の身体から除去された細胞、組織、及び／又は器官を処置すること、又はそれらに対する処置を実施することを伴う事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／又は器官は、外科手術又は治療の方法において対象の身体に戻され得る。
「ＩＬ－１」（本明細書では「ＩＬ１」とも呼ばれる）という用語は、インターロイキン－１として知られる炎症誘発性サイトカインを指し、ＩＬ１－α及びＩＬ－１β、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオ後続品、及びそれらのバリアントを含む、ＩＬ－１の全形態を含む。ＩＬ－１α及びＩＬ－１βは、Ｉ型ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１ＲＩ）と呼ばれる同じ受容体分子に結合する。この受容体の第３のリガンドが存在する。下流シグナル伝達を活性化せず、それゆえに、受容体の結合部位に関してＩＬ－１α及びＩＬ－１βシグナル伝達と競合することによってＩＬ－１α及びＩＬ－１βシグナル伝達の阻害剤として作用する、インターロイキン１受容体拮抗薬（ＩＬ－１Ｒａ）。例えば、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｂｌｏｏｄ１１７：３７２０－３２（２０１１）及びＷｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ３（１０５）：ｃｍ１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．３１０５ｃｍ１を参照されたい。ＩＬ－１は、例えば、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．８：２５３－６５（１９９７）に説明されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＩＬ－１という用語は、ＩＬ－１のヒトの組換え形態を包含する。
Figure 2023535351000002
Figure 2023535351000003
「ＮＬＲＰ３インフラマソーム」という用語は、いくつかの炎症反応の活性化に関与する多タンパク質複合体を指す。ＮＭＲＰ３インフラマソームは、機能性炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１β及びＩＬ－１８の産生を促進する。ＮＬＲＰ３インフラマソームのコア成分は、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、及びカスパーゼ－１であり、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．１６：２７１（２０１７）及びＧｒｏｓｌａｍｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｙ，Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．１１：３５９－３７４（２０１８）によって説明される。
「マトリックスメタロプロテアーゼ」及び「ＭＭＰ」という用語は、例えば、Ｆａｎｊｕｌ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１８０３：３－１９（２０１０）によって特徴付けられるように、ジンクエンドペプチダーゼのマトリックスメタロプロテアーゼファミリーのメンバーのうちのいずれか１つであると定義される。当技術分野では、ファミリーメンバーは、多くの場合、原型的なＭＭＰ、ゼラチナーゼ、マトリリジン、及び／又はフリン活性化可能なＭＭＰと呼ばれる。本明細書で使用される場合、「マトリックスメタロプロテアーゼ」及び「ＭＭＰ」は、限定されるものではないが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４、ＭＭＰ－１５、ＭＭＰ－１６、ＭＭＰ－１７、ＭＭＰ－１８、ＭＭＰ－１９、ＭＭＰ－２０、ＭＭＰ－２１、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２５、ＭＭＰ－２６、ＭＭＰ－２７、及びＭＭＰ－２８を含む、全ＭＭＰファミリーを包含する。
本明細書で使用される場合、「同時投与」、「同時投与する」、「組み合わせて投与される」、「組み合わせて投与する」、「同時」、及び「併用」という用語は、両方の活性医薬成分及び／又はそれらの代謝物が、同時に対象内に存在するように対象に２つ以上の活性医薬成分の投与を包含する（本開示の好ましい実施形態では、例えば、ウイルスベクターと組み合わせて少なくとも１つの抗炎症化合物が機能的に操作されて、本明細書に説明される遺伝子編集核酸を送達する）。同時投与は、別個の組成物の同時投与、別個の組成物の異なる時点における投与、又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物における投与を含む。別個の組成物における同時投与、及び両方の薬剤が存在する組成物における投与が好ましい。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、限定されるものではないが、疾患治療を含む、意図される用途に効果をもたらすのに十分である、本明細書に説明される組成物又は組成物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）、若しくは治療される対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢、若しくは性別）、疾患状態の重症度、又は投与の様式に応じて変化し得る。用語はまた、標的細胞に特定の応答を誘発することになる用量（例えば、血小板付着及び／又は細胞遊走の低減）にも適用される。特定の用量は、選択された特定の組成物、従うべき投与レジメン、組成物が他の組成物又は化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、投与される組織、及び組成物が輸送される物理的送達システムに応じて変化することになる。
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を取得することを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に予防するという観点で予防的であってもよく、並びに／又は疾患に起因する疾患及び／若しくは有害作用に対する部分的若しくは完全な治癒の観点で治療的であってもよい。例えば、本開示の組成物、方法、又はシステムは、所与の状態（例えば、関節炎）に対する傾向を有する対象に、予防的治療として投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物、特にヒト、イヌ、ネコ、又はウマにおける疾患の任意の治療に及び、（ａ）疾患の素因があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において疾患が発生することを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、疾患の発症又は進行を抑止すること、並びに（ｃ）疾患を緩和する、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと、及び／又は１つ以上の疾患症状を緩和することを含む。「治療」はまた、疾患又は状態の非存在下であっても、薬理学的効果を提供するために、薬剤の送達を包含することを意味する。例えば、「治療」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態の非存在下で免疫反応を誘発するか、又は免疫を付与し得る組成物の送達を包含する。本開示の組成物及び方法は、限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの対象を含む、全ての哺乳動物を治療するために適用可能であることが理解される。
核酸又はタンパク質の部分を参照して使用されるときの「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、自然界では互いに同じ関係で見つからない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、新しい機能性核酸、例えば、１つのソースからのプロモーター及び別のソースからのコーディング領域、又は異なるソースからのコーディング領域を作製するために配置された非関連遺伝子からの２つ以上の配列を有して、組換え的に産生される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然界では互いに同じ関係で見つからない２つ以上の部分配列（例えば、融合タンパク質）を含むことを示す。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指す。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライシング又は非スプライシングｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ拮抗薬、並びに阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、例えば、小又は短ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、小又は短干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドはまた、例えば、限定されるものではないが、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ拮抗薬、アプタマー、及び当業者に公知の任意の他の非コーディングＲＮＡを含む、非コーディングＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、天然型、合成型、及び意図的に改変若しくは修飾されたポリヌクレオチド、並びに類似体及び誘導体を含む。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態も指し、核酸配列と同義である。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与され得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、二本及び一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定又は要求がない限り、ポリヌクレオチドを包含する本明細書に説明される任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、又は予測される２つの相補的な一本鎖形態との両方を包含する。ポリヌクレオチドは、単一、二重、又は三重鎖、直線、又は円形であってもよく、任意の長さであってもよい。ポリヌクレオチドを考察する際、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’の方向に配列を提供するという慣例に従って本明細書で説明され得る。
「遺伝子」又は「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳、及び転写／翻訳の調節に関与するコーディング領域（リーダー及びトレーラー）の前後の領域、並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。例えば、遺伝子は、転写及び翻訳された後、特定のタンパク質又はポリペプチドをコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを含む。
ヌクレオチド配列の観点で「相同」という用語は、既知の参照配列と同一であるか、又は実質的に同様であるかのいずれかであるヌクレオチド（核酸）配列を含む。一実施形態では、「相同ヌクレオチド配列」という用語は、既知の参照配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である核酸配列を有する配列を特徴付けるために使用される。
「異種」とは、それが比較される実体の残部から遺伝子型的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって、異なる種に由来するプラスミド又はベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。プロモーターは、その天然コーディング配列から除去され、異種プロモーターに連結された自然には存在しないコーディング配列に作動可能に連結される。「異種」という用語は、本明細書で常にポリヌクレオチドを参照して使用されるものではないが、修飾語「異種」の非存在下でも、ポリヌクレオチドに対する参照は、省略にもかかわらず異種ポリヌクレオチドを含むことが意図される。
２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「パーセント同一性」、及び「配列パーセント同一性」（又はその類義語、例えば、「９９％同一」）という用語は、配列同一性の一部としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、最大の対応に関して比較及び整列されたとき（必要な場合、ギャップを導入する）、同じであるか、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性が、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定され得る。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアライメントを取得するために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野で公知である。パーセント配列同一性を決定するための好適なプログラムとしては、例えば、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートが挙げられる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して行われ得る。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用されるが、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ＤＮＡＳＴＡＲから入手可能なＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、又はＭｅｇＡｌｉｇｎは、配列を整列させるために使用され得る追加の公開ソフトウェアプログラムである。ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸは、アライメントを生成するために使用され得る、Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２３：２９４７－２９４８（２００７）、Ｇｏｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８Ｓｕｐｐｌ：Ｗ６９５－９（２０１０）、及びＭｃＷｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４１（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７－６００（２０１３）。当業者は、特定のアライメントソフトウェアによって、最大アライメントのための適切なパラメータを決定し得る。特定の実施形態では、アライメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、限定されるものではないが、参照抗体のアミノ酸配列内の又はそれに隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失、及び／又は付加によって参照抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含する。バリアントは、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様の帯電又は非帯電アミノ酸の置換を伴い得る。バリアントは、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持する。バリアントという用語はまた、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
「関節疾患」は、例えば、関節の解剖学的及び／又は生理学的変化をトリガーする病気、例えば、代謝及び分子的障害につながり得る、関節の細胞又は組織における測定可能な異常として定義される。限定されるものではないが、関節腔狭小化、軟骨下硬化症、軟骨下嚢胞、及び骨棘形成の放射線検出を含む。
「関節病」は、ヒト対象において、医学的介入を求めるように対象を駆り立てる症状、例えば、対象が報告した疼痛、こわばり、腫脹、又は強直として定義される。非ヒト哺乳動物については、「関節病」は、例えば、跛行、歩行における観察可能な変化、体重負荷、アロディニア、又は探索的挙動として定義される。
本明細書で使用される際、ｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）は、ＲＮＡ、好ましくは合成ＲＮＡであり、標的化配列及び足場から構成される。ゲノム工学実験では、Ｃａｓ９を特定の遺伝子座にガイドするために使用される。ｓｇＲＮＡは、例えば、合成ＲＮＡとして、又は後から標的細胞で発現されるｇＲＮＡをコードする配列を含む核酸として、投与又は製剤化され得る。当業者には明らかであろうように、例えば、ゲノム編集の特異性及び／又は精度を高めるために、ｓｇＲＮＡの配列を設計及び／又は最適化するために、様々なツールが使用され得る。一般に、候補ｓｇＲＮＡは、利用可能なウェブベースのツールのいずれかに基づいて、高い予測オンターゲット効率及び低いオフターゲット効率を有する標的領域内の配列を識別することによって設計され得る。候補ｓｇＲＮＡは、手動検査及び／又は実験スクリーニングによって更に評価され得る。ウェブベースのツールの例としては、限定なしで、ＣＲＩＳＰＲシーク、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、Ｅ－ＣＲＩＳＰ、ＣｈｏｐＣｈｏｐ、ＣａｓＯＴ、ＣＲＩＳＰＲダイレクト、ＣＲＩＳＰＯＲ、ＢＲＥＡＫＩＮＧ－ＣＡＳ、ＣｒｉｓｐＲＧｏｌｄ、及びＣＣＴｏｐが挙げられる。例えば、参照によりその全体が全ての目的に対して本明細書に組み込まれる、Ｓａｆａｒｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照されたい。そのようなツールはまた、例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１４／０９３７０１Ａ１号及びＬｉｕ，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＣＲＩＳＰＲ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ”，Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．，２０２０；１８：３５－４４にも説明されており、それらの各々は、参照によりその全体が全ての目的に対して本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの活性酵素である。「ｎＣａｓ９」は、不活性化された２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つ、すなわち、ＲｕｖＣ又はＨＮＨドメインのいずれかを有するＣａｓ９を指す。ｎＣａｓ９は、標的ＤＮＡの一本鎖のみを切断することができる（「ニッカーゼ」）。「Ｃａｓ９」という用語は、ＲＮＡガイド二本鎖ＤＮＡ結合ヌクレアーゼタンパク質若しくはニッカーゼタンパク質、又はそのバリアントを指す。本明細書では、「Ｃａｓ９」は、天然型及び組換えＣａｓ９ｓの両方を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、異なるＤＮＡ鎖を切断する、２つの機能ドメイン、例えば、ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。本明細書に説明されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨ若しくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、並びに／又はＲｕｖＣ若しくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。Ｃａｓ９は、両方の機能ドメインが活性であるとき、ゲノムＤＮＡ（標的座位）において二本鎖切断を誘発し得る。Ｃａｓ９酵素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる群に属する細菌由来のＣａｓ９タンパク質の１つ以上の触媒ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、２つの触媒ドメインは、異なる細菌種に由来する。
本明細書で使用される場合、「ＰＡＭ」は、プロトスペーサー隣接モチーフを指し、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡを結合するために必要であり、標的配列の直後にある。Ｃａｓ９は、例えば、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）として、又は後から標的細胞で発現されるＣａｓ９タンパク質をコードする配列を含む核酸として、投与又は製剤化され得る。天然型Ｃａｓ９分子は、特定のＰＡＭ配列を認識する（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＰＡＭ認識配列）。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然型Ｃａｓ９分子と同じＰＡＭ特異性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然型Ｃａｓ９分子と関連付けられていないＰＡＭ特異性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性は、それが最も近い配列相同性を有する天然型Ｃａｓ９分子と関連付けられていない。例えば、天然型Ｃａｓ９分子は、ＰＡＭ配列認識が、オフターゲット部位を減少させるか、特異性を改善するか、又はＰＡＭ認識要件を排除するために改変されるように、改変され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、改変され得る（例えば、ＰＡＭ認識配列を長くするために、Ｃａｓ９特異性を高レベルの同一性に改善するために、オフターゲット部位を減少させるために、及び／又は特異性を増加させるために）。一実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０又は１５のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ＰＡＭ認識を切除するように改変され得る。
「発現カセット」は、宿主細胞中の特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的又は合成的に生成された核酸構築物である。発現カセット又はベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、又は核酸断片の一部であってもよい。典型的には、発現カセット又はベクターは、転写され、プロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチドを含む。
「プロモーター」という用語は、本明細書において、核酸の転写を誘導する核酸制御配列のアレイを指すために使用される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなどの、転写の開始部位の近くで必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意選択的に、転写の開始部位から数千塩基対程度に位置し得る、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。発現ベクター中に存在し得る他のエレメントとしては、転写を増強する（例えば、エンハンサー）、及び転写を終了する（例えば、ターミネーター）エレメント、並びに発現ベクターから産生される組換えタンパク質に特定の結合親和性又は抗原性を付与するエレメントが挙げられる。
「作動可能に連結された」という用語は、遺伝的エレメントの並置を指し、エレメントは、それらが予期される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写を開始するのを助ける場合、プロモーターは、コーディング領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコーディング領域との間に介在する残基が存在し得る。
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、又は他の物質は、物質若しくは同様の物質が自然に存在する場所、又は最初に調製された場所に存在する他の成分の少なくとも一部を欠いた物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を使用して、ソース混合物からそれを濃縮することによって調製され得る。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定され得るか、又はソース混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質に関連して測定され得る。本開示の実施形態の濃縮が増加すると、ますます単離される。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、又は他の物質は、一部の実施形態では、精製され、例えば、約８０％～約９０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は少なくとも約９９％以上純粋である。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」は、様々な核酸配列をコードするＡＡＶベクター核酸配列を指し、一部の実施形態では、バリアント又はキメラカプシドポリペプチドを含む（すなわち、ＡＡＶベクターは、バリアント又はキメラカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む）。ＡＡＶベクターはまた、核酸挿入物の一部としてＡＡＶ起源ではない異種核酸配列も含み得る。この異種核酸配列は、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための関心対象の配列を含む。一般に、異種核酸配列は、少なくとも１つの、及び概して２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。特定の実施形態では、Ｃａｓ配列、ガイドＲＮＡ配列、及び任意の他の遺伝的エレメント（例えば、プロモーター配列、ＰＡＭ配列など）は、対象に投与されたとき、同じＡＡＶベクター上、又は２つ以上の異なるＡＡＶベクター上にあってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ配列、ガイドＲＮＡ配列、及び任意の他の遺伝的エレメント（例えば、プロモーター配列、ＰＡＭ配列など）は、対象に投与されたとき、２つ以上の異なるＡＡＶベクター上にあってもよく、ＡＡＶは、同じ血清型であってもよいか、又はＡＡＶは、２つ以上の異なる血清型（例えば、ＡＡＶ５及びＡＡＶ６）であってもよい。
「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドポリペプチド及びカプシド化ポリヌクレオチドＡＡＶ輸送ベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種核酸（すなわち、細胞に送達される導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれ得る。したがって、ＡＡＶビリオン又はＡＡＶ粒子の産生は、ベクターがＡＡＶビリオン又はＡＡＶ粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクターの産生を必然的に含む。
本明細書で使用される場合、「担体」又は「ビヒクル」は、薬剤投与に好適な担体材料を指す。本明細書に有用な担体及びビヒクルは、無毒であり、有害な様式で組成物の他の成分と相互作用しない、当技術分野で公知の任意のそのような材料、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、界面活性剤などを含む。
「薬学的に許容される」という語句は、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしで、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な健全な医学的判断の範囲内にあるそのような化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに不活性成分を含むことが意図される。活性医薬成分に対するそのような薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来的な薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本開示の治療組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分もまた、説明される組成物及び方法に組み込まれ得る。
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、その意図された機能の実施を促進するために化合物と同時投与されることができるビヒクル及び担体を含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体の使用は、当技術分野で周知である。そのようなビヒクル及び担体の例としては、溶液、溶媒、分散媒体、遅延剤、乳剤などが挙げられる。多結合化合物による使用に好適な任意の他の従来的担体もまた、本開示の範囲内に収まる。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」という用語は、概して、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈される。
「約」及び「およそ」という用語は、値の統計的に有意な範囲内を意味する。そのような範囲は、所定の値又は範囲から一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、より好ましくはまだ１０％以内、更により好ましくは５％以内とすることができる。「約」又は「およそ」という用語によって包含される許容可能な変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。更に、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、組成物、量、製剤、パラメータ、形状、並びに他の量及び特性が正確ではなく、かつ正確である必要はないが、近似、及び／又はより大きいか、若しくはより小さくてもよく、所望に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映することを意味する。一般的に、寸法、サイズ、製剤、パラメータ、形状、又は他の量若しくは特性は、明示的にそのように記載されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状、及び寸法の実施形態が、説明される配置を採用し得ることに留意されたい。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は少なくとも約９９．９９９％以上のように、大半、又は大部分を指し得る。
元の形態及び補正された形態で、添付の特許請求の範囲で使用されるとき、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という接続句は、列挙されていない追加の特許請求の範囲のどの要素又はステップが、存在する場合、特許請求の範囲から除外されるかに関して特許請求の範囲を定義する。「含む」という用語は、包括的又は非限定的であることを意図しており、いかなる追加の列挙されていない要素、方法、ステップ、又は材料も除外しない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲に指定されるもの以外の任意の要素、ステップ、又は材料を除外し、後者の事例では、指定された材料と通常関連付けられる不純物を除外する。「から本質的になる」という用語は、特定の要素、ステップ、又は材料、並びに特許請求の範囲の方法及び組成物の基本的及び新規の特徴に実質的に影響しないものに、特許請求の範囲を限定する。本開示を具体化する本明細書に説明される全ての組成物、方法、及びキットは、代替的な実施形態では、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という接続句のいずれかによってより具体的に定義され得る。
本明細書に説明される方法又は組成物のいずれかによって治療される対象は、任意の年齢であり得、成人、幼児、又は子供であり得る。一部の場合、対象は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９歳、又はその範囲内である（例えば、限定なしで、２～２０歳、２０～４０歳、又は４０～９０歳）。対象は、ヒト又は非ヒト対象とすることができる。本開示の組成物及び方法から利益を得ることができる特定のクラスの対象は、４０歳、５０歳、又は６０歳を超える対象を含む。本開示の組成物及び方法から利益を得ることができる別のクラスの対象は、関節炎（例えば、変形性関節炎）を有する対象である。
本明細書に開示される組成物のいずれかは、実験室又は家畜動物などの、非ヒト対象に投与され得る。非ヒト対象の非限定的な例としては、実験室又は研究動物、ペット、野生又は家畜動物、家畜など、例えば、イヌ、ヤギ、モルモット、ハムスター、マウス、ブタ、非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ、サル、オランウータン、キツネザル、ヒヒなど）、ラット、ヒツジ、ウマ、ウシなどが挙げられる。
本開示は、炎症成分による関節障害を治療するために有用な組成物を提供する。一部の態様では、組成物は、変形性関節炎の進行を予防し、哺乳動物関節における変形性関節炎を治療するために有用である。
一部の態様では、医薬組成物が、遺伝子編集システムを含み、遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座の発現を、関節を含む細胞の少なくとも一部分においてサイレンシング又は低減させる。
一態様では、医薬組成物が、遺伝子編集システムを含み、遺伝子編集システムが、ＩＬ－１α及び／又はＩＬ－１βのうちの１つ以上を標的とする。一部の態様では、医薬組成物が、遺伝子編集システムを含み、遺伝子編集システムが、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、又はＮＬＲＰ３インフラマソームの成分のうちの１つ以上を標的とする。
一部の態様では、医薬組成物が、遺伝子編集システムを含み、遺伝子編集が、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む。一部の実施形態では、遺伝子編集システムが、標的遺伝子座の遺伝子発現を低減する。一部の実施形態では、関節組織に関連する少なくとも１つの遺伝子座は、関節を含む細胞の少なくとも一部分においてサイレンシング又は低減される。
一部の態様では、関節を含む細胞が、滑膜細胞である。一部の態様では、細胞が、滑膜マクロファージである。一部の態様では、細胞が、滑膜線維芽細胞である。一部の態様では、滑膜細胞の少なくとも一部分が編集される。一部の態様では、関節を含む細胞が、軟骨細胞である。
一部の態様では、医薬組成物は、１つ以上のサイトカインを標的とする、及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、又はＮＬＲＰ３インフラマソームの成分を含む群から選択される。一部の実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの成分は、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、カスパーゼ－１、及びそれらの組み合わせを含む。
遺伝子編集が、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子の発現を、関節を含む細胞の少なくとも一部分において増強させ、サイトカイン及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１Ｒａ、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＩＭＰ－３、ＴＩＭＰ－４、及びそれらの組み合わせを含む群から選択される、医薬組成物も提供される。
一部の実施形態では、医薬組成物が、遺伝子編集のために提供され、遺伝子編集が、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む。一部の実施形態では、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、ジンクフィンガー法、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の方法を含む。
一態様では、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法を含む。更に他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ法が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法である。一部の態様では、Ｃａｓ９が、機能を増強するために変異される。
変形性関節炎の動物モデル
変形性関節炎の数個の動物モデルが、当技術分野で公知である。例示的な非限定的な動物モデルが要約されるが、様々なモデルが使用され得ることが理解される。多くの異なる種の動物が、ＯＡを模倣するために使用され、例えば、研究は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ブタ、ウマ、及び更に他の動物に対して実施されている。例えば、Ｋｕｙｉｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．１１：１９（２０１６）（以下、「Ｋｕｙｉｎｕ，２０１６」）を参照されたい。
ＯＡを誘導するための様々な方法が、任意の哺乳動物で使用され得ることが理解される。マウスでは、自然発生、化学的誘導、外科的誘導、及び非侵襲的誘導が、一般的に使用される。例えば、Ｋｕｙｉｎｕ，２０１６、Ｂａｐａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．７：３６（２０１８）（以下、「Ｂａｐａｔ，２０１８」）、及びＰｏｕｌｅｔ，Ｃｕｒｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｒｅｐ１８：４０（２０１６）。ウマでは、骨軟骨断片運動モデル、化学的誘導、外傷性誘導、及び過剰使用を通じた誘導が、一般的に使用される。ヒツジでは、外科的誘導が最も一般的であり、モルモットでは、外科的誘導、化学的誘導、及び自然発生（Ｄｕｒｋｉｎ Ｈａｒｔｌｅｙ）方法が多くの場合に使用される。例えば、Ｂａｐａｔ，２０１８。
不安定化された内側半月板（ＤＭＭ）が、多くの場合、外傷後変形性関節炎をモデル化するためにマウスで使用される、例えばＣｕｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２２６：１４３－７３（２０１５）。ＤＭＭモデルは、臨床的な半月板損傷、ヒトＯＡの発症の既知の素因を模倣し、疾患の経過にわたる構造的及び生物学的変化の研究を可能にする。遺伝的背景が定義されたマウス系統が使用され得るため、マウスは、魅力的なモデル生物である。加えて、ノックアウト又は他の遺伝子操作されたマウス系統が、様々なＯＡ治療様式及びレジメンに対する応答における様々な分子経路の重要性を評価するために使用され得る。例えば、ＳＴＲ／ｏｒｔマウスは、炎症性サイトカインＩＬ１βの増加したレベルを含む、ＯＡを特に発症し易い系統を作製する特徴を有する、Ｂａｐａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．７：３６（２０１８）。これらのマウスは、膝、足首、肘、及び顎関節でＯＡを一般的に発症する、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ１６：６０７－６１４（２００８）。マウスの他の有用な変異株は、当業者に既知であり、例えば、Ｃｏｌ９ａ１（－／－）マウスである、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，６０：２６８４－２６９３（２００９）。
ＯＡに対する別の一般的に使用される外科的モデルは、前十字靱帯離断（ＡＣＬＴ）モデルである。Ｌｉｔｔｌｅ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，９（８）：４８５－４９７（２０１３）。対象のＡＣＬは、外科的に切断され、関節不安定化を引き起こす。屈曲した関節を用いた前方引き出し試験が、靱帯の離断が発生したことを確認するために使用される。一部の場合、後十字靭帯、内側側副靭帯、外側側副靭帯、及び／又は半月板のいずれかなどの他の靭帯が、切断されてもよい。ＤＭＭモデルと同様に、様々なマウス系統が、様々な分子経路を調査するために使用され得る。
技術的目的に応じて、様々なサイズの動物が、使用のために選択され得る。げっ歯類は、骨格成熟に必要な時間が短く、結果として、ＯＡを誘発する外科手術又は他の技術に続くＯＡの発症時間がより短いため、有用である。より大きい動物は、治療的介入を評価するために特に有用である。より大きい動物の解剖学的構造は、ヒトと非常に類似しており、例えば、イヌでは、軟骨の厚さが、ヒトの厚さの約半分未満であり、この顕著な類似性は、そのような軟骨変性及び骨軟骨欠損の研究が、大型動物モデルではるかに有用である理由の例である。例えば、ＭｃＣｏｙ，Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，５２：８０３－１８（２０１５）、及びＰｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｙ，７：６２１－３４（２０１０）。
遺伝子編集プロセス
概要：滑膜細胞を遺伝子編集するための組成物
本開示の実施形態は、滑膜細胞（滑膜細胞）を遺伝子編集するための方法を対象とし、変形性関節炎又は他の関節障害を治療するために関節内の滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集する１つ以上のステップを含む。本明細書で使用される場合、「遺伝子編集」、「遺伝子編集」、及び「ゲノム編集」は、細胞のゲノム内でＤＮＡが恒久的に修飾される、例えば、ＤＮＡが細胞のゲノム内で挿入、欠失、修飾、又は置換される、遺伝子修飾のタイプを指す。一部の実施形態では、遺伝子編集は、ＤＮＡ配列の発現をサイレンシング（遺伝子ノックアウトとも呼ばれる）又は阻害／低減（遺伝子ノックダウンとも呼ばれる）させる。他の実施形態では、遺伝子編集は、ＤＮＡ配列の発現を増強させる（例えば、過剰発現を引き起こすことによって）。本開示の実施形態によると、遺伝子編集技術は、炎症誘発性遺伝子の発現を低減させるか、若しくは炎症誘発性遺伝子をサイレンシングする、及び／又は再生遺伝子の発現を増強するために使用される。
インターロイキン
追加の実施形態によると、本開示の遺伝子編集方法は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、及びＴＮＦ－αのうちの１つ以上などの、特定のインターロイキンの発現を増加させるために使用され得る。特定のインターロイキンは、関節組織における炎症反応を増強させ、疾患進行に関連していることが実証されている。
発現構築物
ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓ９編集酵素のうちの一方又は両方をコードする発現構築物は、任意の有効な担体、例えば、成分遺伝子をインビボで細胞に効果的に送達することができる任意の製剤又は組成物で投与され得る。アプローチとしては、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス－１、又は組換え細菌若しくは真核プラスミドを含む、ウイルスベクターにおける電気穿孔及び／又は挿入が挙げられる。ウイルスベクターは、細胞を直接的にトランスフェクトし、プラスミドＤＮＡは、裸で送達されるか、あるいは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクタミン）、若しくは誘導体化された（例えば、抗体コンジュゲートされた）、ポリリシンコンジュゲート、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、又は他のそのような細胞内担体、並びにインビボで実施される遺伝子構築物又はＣａＰＯ４沈殿物の直接注射の助けによって送達され得る。
細胞内への核酸のインビボ導入のための好ましいアプローチは、例えば、ｃＤＮＡなどの核酸を含有するウイルスベクターの使用によるものである。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、標的細胞の大部分が核酸を受容し得るという利点を有する。加えて、ウイルスベクター内に、例えば、ウイルスベクター中に含有されるｃＤＮＡによってコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞において効率的に発現される。
レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボの、特にヒトへの外因性遺伝子の輸送のための組換え遺伝子送達システムとして使用され得る。これらのベクターは、細胞内への遺伝子の効率的な送達を提供する。一部の事例では、輸送された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定的に組み込まれる。他の事例では、特にアデノ随伴ウイルスベクターについて、宿主ＤＮＡへの安定的な組み込みは、稀な事象であり得、結果として、導入遺伝子のエピソーム発現及び導入遺伝子の一過性発現をもたらす。
複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊細胞株（いわゆる「パッケージング細胞」）の開発は、遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性を増加させ、欠損レトロウイルスは、遺伝子療法目的のための遺伝子導入における使用に対して特徴付けられる（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ７６：２７１（１９９０）を参照されたい）。複製欠損レトロウイルスは、標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させるために使用され得るビリオンにパッケージングされ得る。組換えレトロウイルスを産生し、インビトロ又はインビボでそのようなウイルスで細胞を感染させるためのプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０－９．１４、及び他の標準的な実験マニュアルに見出され得る。好適なレトロウイルスの例としては、当業者に公知である、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、及びｐＥＭが挙げられる。異方性及び両指向性レトロウイルス系の両方を調製するための好適なパッケージングウイルス株の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、及びΨＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、上皮細胞、インビトロ、及び／又はインビボを含む、多くの異なる細胞型に様々な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、各々が参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５－１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０－６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４－３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１－６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９－８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７－８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２－１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０－７６４４、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３：６４１－６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２－１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４－４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０５３４５号、及びＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい）。
本方法で有用な別のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、関心対象の遺伝子産物をコード及び発現するように操作され得るが、通常の溶解ウイルスライフサイクルにおける複製するその能力に関して不活性化される。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６（１９８８）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１－４３４（１９９１）、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ６８：１４３－１５５（１９９２）を参照されたい。好適なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である他の種（例えば、マウス、イヌ、ヒトなど）由来のアデノウイルス血清型を含む、アデノウイルスの任意の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５、又はＡｄ７など）に由来し得る。ウイルス粒子は、比較的安定しており、精製及び濃縮に適しており、上記のように、感染性のスペクトルに影響するように修飾され得る。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びその中に含有される外来性ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれないが、エピソームのままであり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）内に組み込まれる、インサイチュにおける挿入変異の結果として起こり得る潜在的な問題を回避する。更に、外来性ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの担持能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（最大８キロ塩基）（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｈａｊ－Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７（１９８６））。
ヘルパー依存性（ＨＤＡｄ）ベクターはまた、左のパッケージングシグナルの下流のゲノムの５プライム末端におけるパッケージングシグナルとともに、ウイルスＤＮＡの各末端におけるＤＮＡ複製の起源を除いて欠失された全てのアデノウイルス配列で産生され得る。ＨＤＡｄベクターは、複製に必要な必要とされる初期及び後期タンパク質を提供する複製可能なヘルパーアデノウイルスの存在下で構築及び増殖される。
核酸の送達に有用な更に別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどの別のウイルスを、効率的な複製及び生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする、天然型欠損ウイルスである。（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９（１９９２）を参照されたい。アデノ随伴ウイルスはまた、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込み、高頻度の安定的組み込みを呈する少数のウイルスのうちの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９－３５６（１９９２）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８（１９８９）、及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３－１９７３（１９８９）を参照されたい。わずか３００塩基対のＡＡＶを含有するベクターは、パッケージングされ得、組み込むことができる。外因性ＤＮＡに対する空間は、約４．５ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）で説明されるものなどのＡＡＶベクターが、ＤＮＡを細胞内に導入するために使用され得る。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８５）、Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２－３９（１９８８）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１－６１９（１９８４）、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１－３７９０（１９９３）を参照されたい。インビボでより高度に安定及び有効であり、容易に産生され、ＦＤＡによって承認され、かつ複数の臨床試験で試験されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージングされ得るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）及び他のより小さいＣａｓ９酵素の識別は、治療用遺伝子編集のための新たな道を開く。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体（例えば、Ｃａｓ９又はｇＲＮＡ）をコードする核酸は、標的細胞の細胞表面抗原に対する抗体でタグ付けされ得る、それらの表面上に正電荷を有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）に閉じ込められる。これらの送達ビヒクルはまた、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体を送達するために使用され得る。
臨床設定では、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸のための遺伝子送達システムは、各々が当技術分野で周知であるいくつかの方法のいずれかによって対象に導入され得る。例えば、遺伝子送達システムの医薬調製物は、例えば、静脈内注射によって、全身的に導入され得、標的細胞中のタンパク質の特異的形質導入は、主に、遺伝子送達ビヒクル、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列に起因する細胞型若しくは組織型発現、又はそれらの組み合わせによって提供される、トランスフェクションの特異性から起こることになる。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸の初期送達がより限定され、対象への導入が非常に局在化される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸は、関節疾患（例えば、変形性関節炎）を呈する関節内への関節内注射によって導入され得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸は、外科手術中又はその後に投与され、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸を含む徐放性ヒドロゲルは、経時的にＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸の定常用量を提供することによって、変形性関節炎を予防、低減、又は排除するために、閉鎖前の外科手術の終了時に投与される。
ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子編集複合体をコードする核酸の医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子送達システム（例えば、ウイルスベクター）から本質的になり得るか、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性基質を含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達システムが、組換え細胞、例えばアデノ随伴ウイルスベクターから無傷で産生され得る場合、医薬調製物は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含み得る。
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β編集複合体は、特異的であり、すなわち、標的部位（ＩＬ－１α又はＩＬ－１β）で優先的にゲノム改変を誘導し、他の部位で改変を誘導しないか、又は他の部位でごく稀に改変を誘導する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＩＬ－１α又はＩＬ－１β編集複合体は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の編集効率を有する。
ＨＲのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用するためのｓｇＲＮＡは、典型的には、標的核酸配列（標的遺伝子座）に相補的であるガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）又はそのバリアント若しくは断片と相互作用する足場配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集複合体によるＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子におけるゲノム改変を誘導するための例示的な標的配列が、表２及び１２に提供されている。本開示の組成物、方法、及びシステムで使用するための例示的なガイドＲＮＡが表３及び１３に提供される。
Figure 2023535351000004
Figure 2023535351000005
Figure 2023535351000006
Figure 2023535351000007
Figure 2023535351000008
Figure 2023535351000009
Figure 2023535351000010
Figure 2023535351000011
Figure 2023535351000012
Figure 2023535351000013
Figure 2023535351000014
Figure 2023535351000015
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）の配列は、編集効率を増加させる、及び／又はオフターゲット効果を低減するように修飾され得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡの配列は、標的配列から、約１塩基、約２塩基、約３塩基、約４塩基、約５塩基、約５塩基、約６塩基、約７塩基、約８塩基、約９塩基、約１０塩基、約１５塩基、又は約１５塩基超変化し得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡの配列は、標的配列から、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、又は約２０％超変化し得る。本明細書で使用される場合、標的配列を形成する変化は、相補性の程度を指し得る。
特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約９５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約９０％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約８５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約６５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約６０％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約５５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約５０％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約４５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約４０％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約３５％同一である。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約３５％同一である。
特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の２塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の３塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の４塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の４塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の６塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の７塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の８塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の９塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１０塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１１塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１２塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１３塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１４塩基置換を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物、方法、又はシステムとともに使用されるガイドＲＮＡは、配列番号２１～３４及び配列番号１６８～２９７のうちのいずれか１つに示される配列の１５塩基置換を有する。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、配列番号７～２０及び配列番号３７～１６７のうちのいずれか１つに示される標的遺伝子の発現をノックダウンするように設計される、及び／又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン８の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、ヒトＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、配列番号７～２０及び配列番号３７～１６７のうちのいずれか１つに示される標的遺伝子の発現をノックダウンするように設計される、及び／又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン８の少なくとも一部分に結合することによって、イヌＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、配列番号７～２０及び配列番号３７～１６７のうちのいずれか１つに示される標的遺伝子の発現をノックダウンするように設計される、及び／又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ウマＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、ウマＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、配列番号７～２０及び配列番号３７～１６７のうちのいずれか１つに示される標的遺伝子の発現をノックダウンするように設計される、及び／又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子のエクソン８の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１α遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン１の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。特定の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の少なくとも一部分に結合することによって、ハツカネズミＩＬ－１β遺伝子をノックダウンするように設計されるか、又はノックダウンすることができる。
一部の事例では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）又はそのバリアント若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを用いて細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞、又は患者内などのインビボ細胞）に導入される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）又はそのバリアント若しくは断片と複合体化されて、細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞、又は患者などのインビボ細胞）への導入のためのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達システムを形成する。他の事例では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）又はそのバリアント若しくは断片をコードするｍＲＮＡを用いて細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞、又は患者内などのインビボ細胞）に導入される。
任意の異種又は外来性核酸（例えば、標的遺伝子座特異的ｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド）が、当業者に公知の任意の方法を使用して細胞に導入され得る。そのような方法としては、限定されるものではないが、電気穿孔、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、マイクロインジェクション、エレクトロインジェクション、電気融合、ナノ粒子衝撃、形質転換、コンジュゲーションなどが挙げられる。
ｓｇＲＮＡの核酸配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、標的ＤＮＡ配列）と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適に整列されたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれらの値以上である。最適なアライメントは、配列を整列するための任意の好適なアルゴリズムの使用を用いて決定され得、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づくアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド以上の長さである。一部の事例では、ガイド配列は、約２０ヌクレオチドの長さである。他の事例では、ガイド配列は、約１５ヌクレオチドの長さである。他の事例では、ガイド配列は、約２５ヌクレオチドの長さである。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分は、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターを用いたトランスフェクションなどによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、標的配列内の優先的切断の評価に続く。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の成分を提供することと、試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間の標的配列における結合又は切断速度を比較することによって、試験管内で評価され得る。
ｓｇＲＮＡの核酸配列は、上記のウェブベースのソフトウェアのうちのいずれかを使用して選択され得る。ＤＮＡ標的化ＲＮＡを選択するための検討事項は、使用されるＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）に対するＰＡＭ配列、及びオフターゲット修飾を最小化するための戦略を含む。ＣＲＩＳＰＲ設計ツールなどのツールは、ｓｇＲＮＡを調製するための、標的修飾効率を評価する、及び／又はオフターゲット部位における切断を評価するための配列を提供し得る。ｓｇＲＮＡの配列を選択するための別の検討事項は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減することを含む。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーを計算することに基づく。好適なアルゴリズムの例としては、ｍＦｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，９（１９８１），１３３－１４８）、ＵＮＡＦｏｌｄパッケージ（Ｍａｒｋｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００８，４５３：３－３１）、及びＶｉｅｎｎａＲＮａ Ｐａｃｋａｇｅを形成するＲＮＡｆｏｌｄが挙げられる。
ｓｇＲＮＡは、約１０～約５００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２１０ヌクレオチド、２２０ヌクレオチド、２３０ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、２６０ヌクレオチド、２７０ヌクレオチド、２８０ヌクレオチド、２９０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３１０ヌクレオチド、３２０ヌクレオチド、３３０ヌクレオチド、３４０ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、３６０ヌクレオチド、３７０ヌクレオチド、３８０ヌクレオチド、３９０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４１０ヌクレオチド、４２０ヌクレオチド、４３０ヌクレオチド、４４０ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４６０ヌクレオチド、４７０ヌクレオチド、４８０ヌクレオチド、４９０ヌクレオチド、又は約５００ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、約２０～約５００ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド １１０ヌクレオチド、１１５ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１３５ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１４５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１５５ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１６５ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１８５ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、１９５ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２０５ヌクレオチド、２１０ヌクレオチド、２１５ヌクレオチド、２２０ヌクレオチド、２２５ヌクレオチド、２３０ヌクレオチド、２３５ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２４５ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、２５５ヌクレオチド、２６０ヌクレオチド、２６５ヌクレオチド、２７０ヌクレオチド、２７５ヌクレオチド、２８０ヌクレオチド、２８５ヌクレオチド、２９０ヌクレオチド、２９５ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３０５ヌクレオチド、３１０ヌクレオチド、３１５ヌクレオチド、３２０ヌクレオチド、３２５ヌクレオチド、３３０ヌクレオチド、３３５ヌクレオチド、３４０ヌクレオチド、３４５ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、３５５ヌクレオチド、３６０ヌクレオチド、３６５ヌクレオチド、３７０ヌクレオチド、３７５ヌクレオチド、３８０ヌクレオチド、３８５ヌクレオチド、３９０ヌクレオチド、３９５ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４０５ヌクレオチド、４１０ヌクレオチド、４１５ヌクレオチド、４２０ヌクレオチド、４２５ヌクレオチド、４３０ヌクレオチド、４３５ヌクレオチド、４４０ヌクレオチド、４４５ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４５５ヌクレオチド、４６０ヌクレオチド、４６５ヌクレオチド、４７０ヌクレオチド、４７５ヌクレオチド、４８０ヌクレオチド、４８５ヌクレオチド、４９０ヌクレオチド、４９５ヌクレオチド、又は５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、約２０～約１００ヌクレオチド、例えば、約２０ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５１ヌクレオチド、５２ヌクレオチド、５３ヌクレオチド、５４ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、５６ヌクレオチド、５７ヌクレオチド、５８ヌクレオチド、５９ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６１ヌクレオチド、６２ヌクレオチド、６３ヌクレオチド、６４ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６６ヌクレオチド、６７ヌクレオチド、６８ヌクレオチド、６９ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７１ヌクレオチド、７２ヌクレオチド、７３ヌクレオチド、７４ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、７６ヌクレオチド、７７ヌクレオチド、７８ヌクレオチド、７９ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８１ヌクレオチド、８２ヌクレオチド、８３ヌクレオチド、８４ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、８６ヌクレオチド、８７ヌクレオチド、８８ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９１ヌクレオチド、９２ヌクレオチド、９３ヌクレオチド、９４ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、９６ヌクレオチド、９７ヌクレオチド、９８ヌクレオチド、９９ヌクレオチド、又は約１００ヌクレオチドである。
足場配列は、約１０～約５００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２１０ヌクレオチド、２２０ヌクレオチド、２３０ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、２６０ヌクレオチド、２７０ヌクレオチド、２８０ヌクレオチド、２９０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３１０ヌクレオチド、３２０ヌクレオチド、３３０ヌクレオチド、３４０ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、３６０ヌクレオチド、３７０ヌクレオチド、３８０ヌクレオチド、３９０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４１０ヌクレオチド、４２０ヌクレオチド、４３０ヌクレオチド、４４０ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４６０ヌクレオチド、４７０ヌクレオチド、４８０ヌクレオチド、４９０ヌクレオチド、又は約５００ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、足場配列は、約２０～約５００ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド １１０ヌクレオチド、１１５ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１３５ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１４５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１５５ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１６５ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１８５ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、１９５ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２０５ヌクレオチド、２１０ヌクレオチド、２１５ヌクレオチド、２２０ヌクレオチド、２２５ヌクレオチド、２３０ヌクレオチド、２３５ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２４５ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、２５５ヌクレオチド、２６０ヌクレオチド、２６５ヌクレオチド、２７０ヌクレオチド、２７５ヌクレオチド、２８０ヌクレオチド、２８５ヌクレオチド、２９０ヌクレオチド、２９５ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３０５ヌクレオチド、３１０ヌクレオチド、３１５ヌクレオチド、３２０ヌクレオチド、３２５ヌクレオチド、３３０ヌクレオチド、３３５ヌクレオチド、３４０ヌクレオチド、３４５ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、３５５ヌクレオチド、３６０ヌクレオチド、３６５ヌクレオチド、３７０ヌクレオチド、３７５ヌクレオチド、３８０ヌクレオチド、３８５ヌクレオチド、３９０ヌクレオチド、３９５ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４０５ヌクレオチド、４１０ヌクレオチド、４１５ヌクレオチド、４２０ヌクレオチド、４２５ヌクレオチド、４３０ヌクレオチド、４３５ヌクレオチド、４４０ヌクレオチド、４４５ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、４５５ヌクレオチド、４６０ヌクレオチド、４６５ヌクレオチド、４７０ヌクレオチド、４７５ヌクレオチド、４８０ヌクレオチド、４８５ヌクレオチド、４９０ヌクレオチド、４９５ヌクレオチド、又は５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、足場配列は、約２０～約１００ヌクレオチド、例えば、約２０ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５１ヌクレオチド、５２ヌクレオチド、５３ヌクレオチド、５４ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、５６ヌクレオチド、５７ヌクレオチド、５８ヌクレオチド、５９ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６１ヌクレオチド、６２ヌクレオチド、６３ヌクレオチド、６４ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６６ヌクレオチド、６７ヌクレオチド、６８ヌクレオチド、６９ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７１ヌクレオチド、７２ヌクレオチド、７３ヌクレオチド、７４ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、７６ヌクレオチド、７７ヌクレオチド、７８ヌクレオチド、７９ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８１ヌクレオチド、８２ヌクレオチド、８３ヌクレオチド、８４ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、８６ヌクレオチド、８７ヌクレオチド、８８ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９１ヌクレオチド、９２ヌクレオチド、９３ヌクレオチド、９４ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、９６ヌクレオチド、９７ヌクレオチド、９８ヌクレオチド、９９ヌクレオチド、又は約１００ヌクレオチドである。
ｓｇＲＮＡのヌクレオチドは、リボース（例えば、糖）基、リン酸基、核酸塩基、又はそれらの任意の組み合わせにおける修飾を含み得る。一部の実施形態では、リボース基における修飾は、リボースの２’位置における修飾を含む。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、２’フルオロ－アラビノ核酸、三環ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホジアミデートモルフォリノ、又はそれらの組み合わせを含む。
修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、糖及び／又は骨格リボヌクレオチド（すなわち、リン酸－糖骨格への修飾を含む）を含み得る。例えば、天然又は自然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むものであり得る。一部の骨格－リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに接続するホスホエステル基は、基、例えば、ホスホチオエート基によって置換され得る。一部の糖－リボヌクレオチドでは、２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ｈａｌｏ、ＳＨ、ＳＲ、Ｈ２、ＨＲ、Ｒ２又はＯＮから選択され、Ｒは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、ｈａｌｏは、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、又はＩである。
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、糖修飾を含有する。糖修飾の非限定的な例としては、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びその異性体（２’－アラシチジン－５’－三リン酸、２’－アラウリジン－５’－三リン酸）、アジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上の２’－フルオロ、２’－アミノ、及び／又は２’－チオ修飾を含有する。一部の事例では、修飾は、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、５－アミノ－アリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジン、及び／又は５－フルオロ－ウリジンである。
哺乳動物ＲＮＡ上に見出される９６を超える天然型ヌクレオシド修飾が存在する。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（１２）：２１８３－２１９６（１９９４）を参照されたい。ヌクレオチド並びにヌクレオチド及びヌクレオシドの調製は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、同第５，２６２，５３０号、及び同第５，７００，６４２号に説明される。本明細書に説明される使用に好適である多数のヌクレオシド及びヌクレオチドが市販されている。ヌクレオシドは、天然型ヌクレオシドの類似体であり得る。一部の事例では、類似体は、ジヒドロウリジン、メチルアデノシン、メチルシチジン、メチルウリジン、メチルシュードウリジン、チオウリジン、デオキシシトジン、及びデオキシウリジンである。
一部の事例では、本明細書に説明されるｓｇＲＮＡは、核酸塩基リボヌクレオチド、すなわち、天然型核酸塩基の代わりに、少なくとも１つの非天然型核酸塩基を含有するリボヌクレオチドを含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドに組み込まれ得る核酸塩基の非限定的な例としては、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｌＡ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６．－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍｉｌ（１－メチルイノシン）、ｍ’ｌｍ（ｌ，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－ｏ－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－ｆｏｎｎｙｌシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍｌＧ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシウイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシウィブトシン）、ＯＨｙＷ＊（ヒドロキシウィブトシン下）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（クエオシン）、ｏＱ（エポキシクエンシン）、ｇａｌＱ（ガルタクトシル－クエオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル－クエオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アルカエオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン）、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレンウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－Ｏ－ジメチルアデノシン）、ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，０－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｍｌＧｍ（ｌ，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２－Ｏ－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、又はａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、それらの７－置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７－置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２－Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８－置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７－置換プリン、７－デアザ－８－置換プリン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
ｓｇＲＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって合成され得る。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、化学的に合成される。修飾されたｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－チオノカルバメート－保護ヌクレオシドホスホラミダイトを使用して合成され得る。方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３３，１１５４０－１１５５６（２０１１）、Ｔｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０，７４６－７５４（２０１２）、及びＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２５，９４０－９５０（２００３）に説明される。修飾されたｓｇＲＮＡは、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。
有用なｓｇＲＮＡの追加の詳細な説明は、例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，３３（９）：９８５－９８９及びＤｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３９：３８４－３８９に見出され得、その開示は、参照によりその全体で全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、本開示に開示されているガイドＲＮＡが、当技術分野で公知の任意のＣａｓタンパク質（例えば、任意の好適な生物又は細菌種からのものと組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。
Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、又はＶＩ型Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のドメインを含み得る。ドメインの非限定的な例としては、ガイド核酸認識及び／又は結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、及び二量体化ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識及び／又は結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用し得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断を予防するように触媒活性を欠き得る。Ｃａｓタンパク質は、他のタンパク質又はポリペプチドに融合されるキメラＣａｓタンパク質であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、例えば、異なるＣａｓタンパク質由来のドメインを含む、様々なＣａｓタンパク質のキメラであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１Ｏ、Ｃａｓ１Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１Ｏ、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕｌ９６６、並びにそれらの相同体又は修飾されたバージョンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の好適な生物由来であり得る。非限定的な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ ｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａが挙げられる。一部の態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。一部の態様では、生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。一部の態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
Ｃａｓタンパク質は、限定されるものではないが、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａを含む様々な細菌種由来であり得る。「由来」という用語は、この事例では、天然型の様々な細菌種に対して有意な部分又は有意な相同性を維持するために、天然型の様々な細菌種から修飾されたものとして定義される。有意な部分は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、少なくとも２０個の連続ヌクレオチド、少なくとも３０個の連続ヌクレオチド、少なくとも４０個の連続ヌクレオチド、少なくとも５０個の連続ヌクレオチド、少なくとも６０個の連続ヌクレオチド、少なくとも７０個の連続ヌクレオチド、少なくとも８０個の連続ヌクレオチド、少なくとも９０個の連続ヌクレオチド、又は少なくとも１００個の連続ヌクレオチドであり得る。有意な相同性は、少なくとも５０％相同、最後の６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、又は少なくとも９５％相同であり得る。派生種は、天然型の種類の活性を保持しながら修飾されてもよい。
遺伝子編集方法
上述のように、本開示の実施形態は、関節障害を治療するために組成物及び方法を提供し、関節細胞の一部分は、関節障害を治療するために遺伝子編集を介して遺伝子修飾される。本開示の実施形態は、１つ以上のタンパク質の発現の促進、及び１つ以上のタンパク質の発現の阻害、並びにそれらの組み合わせの両方のために、ヌクレオチド挿入（ＲＮＡ若しくはＤＮＡ）、又は組換えタンパク質挿入を通した滑膜細胞の集団への遺伝子編集を包含する。本開示の実施形態はまた、遺伝子編集組成物を関節細胞に送達する、特に遺伝子編集組成物を滑膜細胞に送達するための方法を提供する。関節細胞を遺伝子修飾するために使用され得る数個の遺伝子編集技術が存在し、これは、本開示による使用に好適である。
一部の実施形態では、関節細胞を遺伝子修飾する方法は、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定的な組み込みのステップを含む。一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１７３７２－７７、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５，８７１－７５、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９８，７２，８４６３－７１、及び米国特許第６，６２７，４４２号に説明され、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマ－レトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｃｅｐｋｏ ａｎｄ Ｐｅａｒ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，９．９．１－９．９．１６に説明され、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼが、ＤＮＡ発現ベクターとして、又は発現性ＲＮＡ若しくはタンパク質として提供され、それにより、トランスポサーゼの長期発現が、トランスジェニック細胞、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼで起こらないシステムを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１、及びＳＢ１００ｘなどのサケ型Ｔｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ）、並びに増加した酵素活性を伴う操作された酵素を含む、好適なトランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、例えば、Ｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ２０１０，１８，６７４－８３及び米国特許第６，４８９，４５８号に説明されており、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、ウイルスベクター又はシステムは、関節を含む細胞に遺伝子編集システムを導入するために使用される。一部の態様では、細胞が、滑膜線維芽細胞である。一部の態様では、ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである。一部の態様では、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１（Ｙ７０５＋７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、ＡＡＶ３（Ｙ７０５＋７３１Ｆ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５（Ｙ４３６＋６９３＋７１９Ｆ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６（ＶＰ３バリアントＹ７０５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ－７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９（ＶＰ３バリアントＹ７３１Ｆ）、ＡＡＶ１０（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ－ＳｈＨ１０、及びＡＡＶ－ＤＪ／８からなる群から選択される血清型を含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６（Ｙ７０５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ９（Ｙ７３１Ｆ）からなる群から選択される血清型を含む。
一部の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。一態様では、レンチウイルスが、ヒト免疫不全－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全－２（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジャンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）からなる群から選択される。
一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、１つ以上のタンパク質の産生又は阻害（例えば、サイレンシング）のための遺伝子を安定的な組み込みの工程を含む。一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、リポソーム形質導入のステップを含む。カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及び濾過水中のジオレオイルホホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９１，１０，５２０－５２５、及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、並びに米国特許第５，２７９，８３３号、米国特許第５，９０８，６３５号、米国特許第６，０５６，９３８号、米国特許第６，１１０，４９０号、米国特許第６，５３４，４８４号、及び米国特許第７，６８７，０７０号に説明されており、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、関節の滑膜細胞の一部分を遺伝子修飾する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に説明される方法を使用するトランスフェクションのステップを含み、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態によると、遺伝子編集プロセスが、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含み得る。そのようなプログラム可能ヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に切断を導入することによって、精密なゲノム編集を可能にし、すなわち、それらは、ゲノム内の特定のＤＮＡ配列の認識に依存して、ヌクレアーゼドメインをこの場所に標的化し、標的配列における二本鎖切断の生成を媒介する。ＤＮＡの二本鎖切断は、その後、切断部位に内因性修復機構を呼び起こして、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）のいずれかによるゲノム編集を媒介する。したがって、切断の修復は、結果として、標的遺伝子産物を破壊する（例えば、サイレンシング、抑制、又は増強する）挿入／欠失変異の導入をもたらし得る。
部位特異的ゲノム編集を可能にするために開発された主要なクラスのヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）が挙げられる。これらのヌクレアーゼシステムは、それらのＤＮＡ認識の様式に基づいて、大きく２つのカテゴリーに分類され得る。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、タンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特異的ＤＮＡ結合を達成するが、それに対して、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲシステムは、標的ＤＮＡと直接塩基対となる短いＲＮＡガイド分子によって、及びタンパク質－ＤＮＡ相互作用によって、特異的ＤＮＡ配列に標的化される。例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２を参照されたい。
本開示の方法に従って使用されうる遺伝子編集方法の非限定的な例としては、以下により詳細に説明される、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、及びＺＦＮ法が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ法
遺伝子編集システムを含む関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物であって、遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とし、関節の滑膜細胞の少なくとも一部をＣＲＩＳＰＲ法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａとしても公知）によって遺伝子編集する、医薬組成物。特定の実施形態によると、関節滑膜細胞を遺伝子編集するためのＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、関節の滑膜細胞の少なくとも一部分でサイレンシング又は低減させる。
ＣＲＩＳＰＲは、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」の略である。遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法はまた、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ法とも呼ばれる。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込み、かつ本開示に従って使用され得る、３つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型が存在する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９によって例示される）は、最もよく特徴付けされたシステムのうちの１つである。
ＣＲＩＳＰＲ技術は、細菌及び古細菌（単細胞微生物のドメイン）の自然防御機構から転用された。これらの生物は、ＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ、及びＣａｓ９を含む様々なＣａｓタンパク質を使用して、外来性侵入者のＤＮＡ又はＲＮＡを細断及び破壊することによって、ウイルス及び他の異物による攻撃を妨げる。ＣＲＩＳＰＲは、２つの別個の特徴、ヌクレオチド反復及びスペーサーの存在を有する、ＤＮＡの専門領域である。ヌクレオチドの反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ領域全体に分布し、外来性ＤＮＡの短いセグメント（スペーサー）が反復配列中に散在する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に転写され、処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をアニールし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的切断及びサイレンシングを誘導する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識は、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列、及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流の保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を必要とする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、それによって、再標的化されて、ｃｒＲＮＡを再設計することによって、事実上、任意のＤＮＡ配列を切断することができる。天然システム内のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、遺伝子操作で使用するために、およそ１００ヌクレオチドのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に単純化され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するプラスミド、並びに必要なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）成分の同時送達によって、ヒト細胞に直接移植可能である。Ｃａｓタンパク質の異なるバリアントが、標的化制限を低減するために使用され得る（例えば、Ｃｐｆ１などのＣａｓ９のオルソログ）。
ＣＲＳＩＰＲ－Ｃａｓ媒介相同組換え
相同組換え（ＨＲ）のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）又はそのバリアント若しくは断片と、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ゲノムＤＮＡに標的化するガイド配列及びＣａｓヌクレアーゼと相互作用する足場配列を含有するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））と、ドナーテンプレートと、を含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細胞のゲノム中の所望の標的遺伝子座で二本鎖切断を生じさせ、細胞の内因性機構を利用して、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって誘発された切断を修復するために利用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって送達される外因性ＤＮＡの遺伝子座特異的染色体組み込みを容易にし得る。典型的には、組み込まれ得る外因性ＤＮＡ（例えば、導入遺伝子、発現カセットなど）のサイズは、約４．０ｋｂであるＡＡＶベクターのＤＮＡパッケージング能力によって制限される。相同組換えに必要である２つの相同アームを含めると、単一のＡＡＶベクターは、約３．７ｋｂ未満の外因性ＤＮＡのみを送達し得る。本明細書に説明される方法は、２つの異なるＡＡＶベクター間でヌクレオチド配列を分割することによって、４ｋｂ以上である外因性ＤＮＡの送達を可能にする。ドナーテンプレートは、ヌクレオチド配列の２つの部分を組み込み、融合し得る、連続相同組換え事象のために設計される。
本開示の相同組換えは、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、操作されたメガヌクレアーゼなどの、ゲノム編集のための操作されたヌクレアーゼシステムを使用して実施され得る。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースのヌクレアーゼシステムが使用される。有用なヌクレアーゼシステムの詳細な説明は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，Ｊｕｌ：３１（７）：３９７－４０５に見出され得る。
任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本明細書に開示される方法及び組成物に使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々な命名システムを使用して言及され得る。例示的な命名システムは、Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，“Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１５）１３：７２２－７３６、及びＳｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２０１５）６０：１－１３に提供されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、又は任意の他の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス１、クラス２、又は任意の他の好適に分類されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。クラス１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して、調節効果をもたらし得る。クラス１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、Ｉ型（例えば、Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＵ）、ＩＩＩ型（例えば、ＩＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ）、及びＩＶ型（例えば、ＩＶ、ＩＶＡ、ＩＶＢ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの型を含み得る。クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一の大きいＣａｓタンパク質を使用して、調節効果をもたらし得る。クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、ＩＩ型（例えば、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ）及びＶ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの型を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、互いに相補的であり得る、及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の標的化を容易にするために、トランスにおいて機能単位を与え得る。
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に存在する。特定の事例では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。例えば、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどに基づき得る。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及び、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターに基づき得る。有用な発現ベクターは、当業者に既知であり、多くが市販されている。真核宿主細胞に対する例として、以下のベクター、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０が提供される。しかしながら、任意の他のベクターは、宿主細胞と適合性がある場合に使用され得る。例えば、Ｃａｓ９酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する有用な発現ベクターは、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＯｒｉｇｅｎｅから市販されている。
宿主細胞は、感染性ＡＡＶベクターを生成するために、並びに開示されたＡＡＶベクターに基づいてＡＡＶビリオンを生成するために必要である。様々な宿主細胞が当技術分野で公知であり、本開示の方法における使用を見出す。本明細書に説明される、又は当技術分野で公知の任意の宿主細胞が、本明細書に説明される組成物及び方法とともに用いられ得る。
一部の実施形態では、感染性ビリオンの生成に使用するための宿主細胞は、原核（例えば、細菌）細胞を含む任意の生物有機体、並びに昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞を含む真核細胞から選択され得る。様々な細胞、例えば、マウス細胞を含む、例えば、哺乳動物細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）は、使用され得る。特に所望の宿主細胞は、限定なしで、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｈｕｈ－７Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、ＲＡＴ１、Ｓｆ９、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）、ヒト胚性幹細胞、ヒト成人組織幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、リプログラミング幹細胞、オルガノイド幹細胞、骨髄幹細胞、ＨＬＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、及びハムスターを含む哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞などの、細胞を含む、任意の哺乳動物種の中から選択される。使用される細胞の要件は、ＡＡＶベクターによる感染又はトランスフェクションが可能であることである。一部の実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐを有し、細胞内で安定的にトランスフェクトされたキャップを有するものである。
一部の実施形態では、本開示による宿主細胞の調製は、選択されたＤＮＡ配列のアセンブリなどの技術を伴う。このアセンブリは、従来的な技術を利用して達成され得る。そのような技術は、周知であり、上記に引用されたＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．に説明されているｃＤＮＡ及びゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせられたアデノウイルス及びＡＡＶゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、合成方法、並びに所望のヌクレオチド配列を提供するための任意の他の好適な方法を含む。
ＡＡＶベクターに加えて、宿主細胞は、ＡＡＶカプシドポリペプチドの発現を駆動する配列を含有し得る（宿主細胞、並びにＡＡＶベクター内に見出されるＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）の血清型と同じ血清型、又は交差相補血清型のｒｅｐ（複製）配列において。ＡＡＶカプシド及びｒｅｐ（複製）配列は、ＡＡＶソースから独立して取得され得、当業者に公知の任意の方法で、又は本明細書に説明されるように宿主細胞内に導入され得る。加えて、ＡＡＶ８カプシドにおいてＡＡＶベクターをシュードタイピングするとき、例えば、必須のｒｅｐ（複製）タンパク質の各々をコードする配列は、ＡＡＶ８によって供給され得るか、又はｒｅｐ（複製）タンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、及び／又はＡＡＶ９）によって供給され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、好適なプロモーターの制御下でカプシドタンパク質を安定的に含有する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、トランスにおいて宿主細胞に供給される。トランスにおいて宿主細胞に送達されるとき、カプシドタンパク質は、宿主細胞中の選択されたカプシドタンパク質の発現を指示するために必要な配列を含有するプラスミドを介して送達され得る。いくつかの実施形態では、トランスにおいて宿主細胞に送達されるとき、カプシドタンパク質をコードするベクターはまた、ＡＡＶをパッケージングするために必要な他の配列、例えば、ｒｅｐ（複製）配列も担持する。
一部の実施形態では、宿主細胞は、好適なプロモーターの制御下でｒｅｐ（複製）配列を安定的に含有する。別の実施形態では、ｒｅｐ（複製）タンパク質は、トランスにおいて宿主細胞に供給される。トランスにおいて宿主細胞に送達されるとき、ｒｅｐ（複製）タンパク質は、宿主細胞中の選択されたｒｅｐ（複製）タンパク質の発現を誘導するために必要な配列を含有するプラスミドを介して送達され得る。いくつかの実施形態では、トランスにおいて宿主細胞に送達されるとき、カプシドタンパク質をコードするベクター（はまた、ＡＡＶベクターをパッケージングするために必要な他の配列、例えば、ｒｅｐ（複製）配列も担持する。
いくつかの実施形態では、ｒｅｐ（複製）配列及びカプシド配列は、単一の核酸分子上で宿主細胞内にトランスフェクトされ、細胞内で組み込まれていないエピソームとして安定して存在し得る。別の実施形態では、ｒｅｐ（複製）及びカプシド配列は、細胞の染色体内に安定的に統合される。別の実施形態は、宿主細胞中に一時的に発現されるｒｅｐ（複製）配列及びカプシド配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’の方向に、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ（複製）遺伝子配列の開始部位との間に介在される任意選択のスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ（複製）遺伝子配列、及びＡＡＶカプシド遺伝子配列を含む。
ｒｅｐ（複製）及びカプシドを提供する分子は、宿主細胞に一時的に（すなわち、トランスフェクションを通じて）存在し得るが、一部の実施形態では、ｒｅｐ（複製）及びカプシドタンパク質並びにそれらの発現を制御するプロモーターのうちの一方又は両方は、宿主細胞内で、例えば、エピソームとして、又は宿主細胞の染色体への組み込みによって、安定的に発現される。本開示の実施形態を構築するために用いられる方法は、上記の参考文献に説明されるものなどの、従来の遺伝子工学又は組換え工学技術である。
ＡＡＶビリオンを生成する様々な方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に説明されるＡＡＶベクターを含むＡＡＶビリオンを生成するために使用され得る。一般的に、本開示のＡＡＶベクターを、ＡＡＶベクターをＡＡＶビリオンにパッケージングすることができる宿主細胞に挿入又は形質導入することを伴った。例示的な方法は、以下に説明及び参照されるが、当業者に公知の任意の方法は、本開示のＡＡＶビリオンを生成するために用いられ得る。
異種核酸（例えば、ドナーテンプレート）を含み、かつＡＡＶビリオンを生成するために使用されるＡＡＶベクターは、当技術分野で周知である方法を使用して構築され得る。例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７：２０８８、Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１６：１７０３－１７０９、並びに米国特許第７，４３９，０６５号、第６，９５１，７５８号、及び第６，４９１，９０７号を参照されたい。例えば、異種配列は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がそこから切除された状態で、ＡＡＶゲノムに直接挿入され得る。ＩＴＲの十分な部分が複製及びパッケージング機能を可能にするように残っている限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた、欠失され得る。そのような構築物は、当技術分野で周知の技術を使用して設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び同第５，１３９，９４１号、国際特許出願公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）及び同第ＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：５３３－５３９、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３－８０１、Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１：１６５－１６９、及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７－１８７５を参照されたい。
ＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶベクターは、トランスフェクションなどによって、公知の技術を使用して好適な宿主細胞に導入される。いくつかのトランスフェクション技術は、当技術分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ１３：１９７を参照されたい。特に好適なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６－４６７）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ２２：４７９－４８８）、電気穿孔（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：７４２－７５１）、リポソーム媒介遺伝子導入（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６８２－６９０）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３－７４１７）、及び高速マイクロプロジェクタを使用した核酸送達（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０－７３）が挙げられる。
使用される発現システムに応じて、プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用され得る。有用なプロモーターは、ウイルス、又は任意の生物、例えば、原核若しくは真核生物に由来し得る。好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ最初期プロモーター領域、ＣＭＶＩＥなどの）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）、増強されたＵ６プロモーター、及びヒトＨＩプロモーター（ＨＩ）などが挙げられる。
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが本開示で使用され得る。そのようなポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどから商業的に取得され得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、本開示で使用され得る。有用なＣａｓ９ポリペプチドの詳細な説明は、例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，３３（９）：９８５－９８９及びＤｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３９：３８４－３８９に見出され得、その開示は、参照によりその全体で全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、ｓｇＲＮＡと複合体化されて、Ｃａｓリボ核タンパク質（例えば、Ｃａｓ９リボ核タンパク質）を形成する。ＣａｓヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとのモル比は、標的化ＡＡＶベクター及び標的遺伝子座の連続相同組換えを容易にする任意の範囲とすることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドとｓｇＲＮＡとのモル比は、約１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、又は１：１である。他の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドとｓｇＲＮＡとのモル比は、約１：２～約１：３である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドとｓｇＲＮＡとのモル比は、約１：２．５である。
Ｃａｓヌクレアーゼ及びそのバリアント若しくは断片は、Ｃａｓポリペプチド又はそのバリアント若しくは断片、Ｃａｓポリペプチド又はそのバリアント若しくは断片をコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓポリペプチド又はそのバリアント若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、あるいはＣａｓリボ核タンパク質として、細胞（例えば、対象から単離された細胞、又は対象などのインビボ細胞）に導入され得る。当業者は、外因性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はリボ核タンパク質を送達する任意の方法が使用され得ることを認識するであろう。そのような方法の非限定的な例としては、電気穿孔、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、マイクロインジェクション、エレクトロインジェクション、電気融合、ナノ粒子衝撃、形質転換、コンジュゲーションなどが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ法を介して滑膜細胞を恒久的に遺伝子編集することによってサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、及びＴＮＦ－αが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ法を介して滑膜細胞を恒久的に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、及びＴＮＦ－αが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ法によって標的遺伝子配列の発現を改変するための、及び本開示の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，９９３，２３３号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８６５，４０６号、同第８，９９９，６４１号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９３２，８１４号、同第８，８７１，４４５号、同第８，９０６，６１６号、及び同第８，８９５，３０８号に説明されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１を発現するためのプラスミドなどの、ＣＲＩＳＰＲ法を実施するためのリソースは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔなどの企業から市販されている。
一実施形態では、本明細書に説明される関節の滑膜細胞の少なくとも一部分の遺伝子修飾は、米国特許第９，７９０，４９０号に説明されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムを使用して実施され得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に説明される関節の滑膜細胞の少なくとも一部分の遺伝子修飾は、米国特許第９，９０７，８６３号に説明される単一ベクターシステムを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して実施され得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＴＡＬＥ法
遺伝子編集システムを含む関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物であって、遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とし、方法が、ＴＡＬＥ法によって関節滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的化するためのＴＡＬＥ法の使用であって、関節の滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集する。あるいは、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的化する間のＴＡＬＥ法の使用であって、関節の滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集して、関節機能遺伝子に関連する少なくとも１つの遺伝子座の発現を、関節滑膜細胞の少なくとも一部分で増強させる。
ＴＡＬＥは、ＴＡＬＥＮ（「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」）を含む、「転写活性化因子様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」タンパク質の略である。遺伝子編集のためにＴＡＬＥシステムを使用する方法はまた、本明細書ではＴＡＬＥ法とも呼ばれ得る。ＴＡＬＥは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌由来の天然型タンパク質であり、各々が単一の塩基対を認識する一連の３３～３５のアミノ酸反復ドメインから構成されるＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＴＡＬＥ特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥ反復は、連続ＤＮＡ配列を認識するように一緒に連結される。ＤＮＡ結合ドメイン内の特定のＲＶＤは、標的遺伝子座内の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインをアセンブルする構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩＳ型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合されて、標的化可能なＴＡＬＥヌクレアーゼを作製する。部位特異的変異を誘導するために、１４～２０塩基対のスペーサー領域によって分離された２つの個々のＴＡＬＥＮアームは、ＦｏｋＩモノマーを近接して、二量体化し、標的二重鎖切断を産生する。
様々なアセンブリ方法を利用するいくつかの大規模で体系的な研究は、ＴＡＬＥ反復が、事実上、任意のユーザー定義配列を認識するために組み合わせられ得ることを示した。カスタム設計ＴＡＬＥアレイはまた、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を通じて市販されている。本開示における使用に好適なＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ法は、米国特許出願公開第２０１１／０２０１１１８Ａ１号、同第２０１３／０１１７８６９Ａ１号、同第２０１３／０３１５８８４Ａ１号、同第２０１５／０２０３８７１Ａ１号、及び同第２０１６／０１２０９０６Ａ１号に説明され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＴＡＬＥ法を介して滑膜細胞を恒久的に遺伝子編集することによってサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、及びＴＮＦ－αが挙げられる。
ＴＡＬＥ法を介して滑膜細胞を恒久的に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、及びＴＮＦ－αが挙げられる。
ＴＡＬＥ法によって標的遺伝子配列の発現を改変するための、及び本開示の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，５８６，５２６号に説明されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
ジンクフィンガー法
遺伝子編集システムを含む関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物であって、遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とし、方法が、ジンクフィンガー又はジンクフィンガーヌクレアーゼ法によって関節滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的化するためのジンクフィンガー法の使用であって、関節の滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集する。あるいは、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的化する間のジンクフィンガー法の使用であって、関節の滑膜細胞の少なくとも一部分を遺伝子編集して、関節機能遺伝子に関連する少なくとも１つの遺伝子座の発現を、関節滑膜細胞の少なくとも一部分で増強させる。
個々のジンクフィンガーは、保存されたββα構成で約３０個のアミノ酸を含有する。αヘリックスの表面上の数個のアミノ酸は、典型的には、ＤＮＡの主溝の３ｂｐに、様々なレベルの選択性で接触する。ジンクフィンガーは、２つのタンパク質ドメインを有する。第１のドメインは、真核生物の転写因子を含み、かつジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメインである。第２のドメインは、ＦｏｋＩ制限酵素を含み、かつＤＮＡの触媒的切断に関与するヌクレアーゼドメインである。
個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～６個の個々のジンクフィンガー反復を含有し、各々９～１８塩基対を認識し得る。ジンクフィンガードメインが、それらの意図された標的部位に特異的である場合、合計１８塩基対を認識する３フィンガーのＺＦＮの対でも、理論上、哺乳動物ゲノム中の単一の遺伝子座を標的とし得る。新しいジンクフィンガーアレイを生成する１つの方法は、既知の特異性のより小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラーアセンブリプロセスは、３塩基対ＤＮＡ配列を各々認識し得る３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対標的部位を認識し得る３フィンガーアレイを生成することを伴う。あるいは、オリゴマー化プール工学（ＯＰＥＮ）などの選択ベースのアプローチが、隣接フィンガー間のコンテキスト依存性相互作用を考慮する無作為化されたライブラリーから新しいジンクフィンガーアレイを選択するために使用され得る。操作されたジンクフィンガーは、市販されており、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と提携して、ジンクフィンガー構築物用の固有プラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標））を開発している。
ジンクフィンガー法を介して滑膜細胞を恒久的に遺伝子編集することによってサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＮＦ－αが挙げられる。ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、又はＮＬＲＰ３インフラマソームの成分。一部の実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの成分は、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、カスパーゼ－１、及びそれらの組み合わせを含む。
ジンクフィンガー法を介して滑膜細胞を恒久的に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＩＬ－１Ｒａ、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＩＭＰ－３、ＴＩＭＰ－４、及びそれらの組み合わせを含む群が挙げられる。一態様では、本開示は、抗炎症性サイトカインの上方調節のための組成物を提供する。
ジンクフィンガー法によって標的遺伝子配列の発現を改変するための、及び本開示の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第６，４７９，６２６号に説明されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、細胞は、エクスビボで遺伝子編集され得、遺伝子編集は、１つ以上の抗炎症性サイトカイン遺伝子座を標的とする。一部の態様では、細胞が、被滑膜細胞である。一部の態様では、細胞が、間葉系幹細胞である。一部の態様では、細胞が、マクロファージである。一部の態様では、本開示は、遺伝子編集された細胞の集団を含む関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物を提供し、遺伝子編集された細胞は、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とする遺伝子編集システムによって編集される。一態様では、遺伝子編集された細胞の集団が滑膜関節内に注射される。
ジンクフィンガー法によって標的遺伝子配列の発現を改変するための、及び本開示の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の他の例は、Ｂｅａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３ １３８０－１３９０に説明され、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な実施形態
一部の実施形態では、本開示は、関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物を提供し、組成物が、治療有効量の、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子編集システムをコードする１つ以上の核酸を含む。システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）タンパク質と、ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡであって、標的配列が、Ｃａｓ９タンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している、ガイドＲＮＡと、を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン６又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号３０１と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号３０９と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン６又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号４６２と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３９１と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３９３と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３８８と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３８９と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５５２と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５５４と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５７８と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５７９と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号４９８と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号５０６と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６である。
一部の実施形態では、医薬組成物が、本明細書に説明されるように、１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス－１から選択される組換えウイルスを含む。一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶが、血清型５（ＡＡＶ５）のものである。一部の実施形態では、組換えＡＡＶが、血清型６（ＡＡＶ６）のものである。
一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をコードする、１つ以上の核酸のうちの第１の核酸を含む第１のウイルスベクターと、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、１つ以上の核酸のうちの第２の核酸を含む第２のウイルスベクターと、を含む。一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、単一の核酸を含むウイルスベクターを含み、単一の核酸が、Ｃａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする。
一部の実施形態では、組成物が、１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のリポソームを含む。一部の実施形態では、１つ以上の核酸が、裸の状態で存在する。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである。
一部の実施形態では、組成物が、非経口投与のために製剤化される。一部の実施形態では、組成物が、対象の関節内の関節内注射のために製剤化される。
別の態様では、本開示は、関節の疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行うための方法を提供する。方法は、対象の関節に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子編集システムをコードする１つ以上の核酸を含む薬学的有効量の組成物を含む医薬組成物を投与することを含む。システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）タンパク質と、ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡであって、標的配列が、Ｃａｓ９タンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している、ガイドＲＮＡと、を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号３０１と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０１である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号３０９と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３０９である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号４６２と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４６２である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３９１と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９１である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３９３と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３９３である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３８８と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８８である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号３８９と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号３８９である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５５２と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５２である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５５４と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５５４である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５７８と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７８である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、配列番号５７９と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５７９である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン２の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン４の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン５の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン６の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン７の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン６又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン６の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、ＩＬ－１α遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号４９８と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号４９８である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、配列番号５０６と少なくとも７５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、配列番号５０６である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン２の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン４の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン５の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン６の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と５つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と４つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と３つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と２つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列と１つ以下のミスマッチを形成する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列が、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン７の標的配列とのミスマッチを形成しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン３の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン６又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン４の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン５の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン５、エクソン６、又はエクソン６の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、ＩＬ－１β遺伝子のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７の標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列を含む。
概して、本明細書に説明されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、標的配列の逆相補と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換を含み得る。ヌクレオチド置換を作製するためのガイダンスは、例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ（Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４６：５０５－２９（２０１７））に見出され得、その内容は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、Ｊｉａｎｇ及びＤｏｕｄｎａは、ａｐｏ Ｃａｓ９タンパク質（図３）から、侵入した二本鎖ＤＮＡ分子の標的鎖に結合したＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体（図５及び図７）までの範囲のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの多くの異なる確認のために生成された分子構造を、図６のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９結合及び切断の詳細な分子モデルに到達するように考慮する。これらの分子モデルから、当業者は、ｃｒＲＮＡ配列中のどのヌクレオチド位置が、標的配列とのミスマッチに対してより寛容であるかを知るであろう。
例えば、Ｊｉａｎｇは、ｃｒＲＮＡ標的化配列の「シード領域」としても知られるＰＡＭ近位１０～１２ヌクレオチドが、強固なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９結合に対して最も重要であると教示している。具体的には、Ｊｉａｎｇは、シード領域のミスマッチが「標的ＤＮＡの結合及び切断を著しく損ねるか、又は完全に破壊するのに対し、シード領域で近い相同性が、他の場所で多くのミスマッチがあっても、多くの場合、オフターゲット結合事象につながる」、すなわち、ＰＡＭ－遠位８～１０ヌクレオチドにおけるミスマッチを開示している。Ｊｉａｎｇ、５１２。同様に、Ｊｉａｎｇは、ｓｇＲＮＡのシード領域と標的ＤＮＡとの間の”［ｐ］ｅｆｅｃｔ相補性がＣａｓ９媒介ＤＮＡ標的化及び切断に必要であるが、それに対して、非シード領域における不完全な塩基対合が、標的結合特異性に関してはるかに許容されることを教示する。同上、引用は省略。
したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、ＰＡＭ遠位８～１０ヌクレオチド内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つ以上のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ＰＡＭ遠位８～１０ヌクレオチド内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ＰＡＭ遠位８～１０ヌクレオチド内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、２つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ＰＡＭ遠位８～１０ヌクレオチド内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、３つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ＰＡＭ遠位８～１０ヌクレオチド内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、４つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ＰＡＭ遠位８～１０ヌクレオチド内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、５つのヌクレオチド置換を含む。
したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の８の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つ以上のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の８の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の８の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、２つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の８の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、３つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の８の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、４つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の８の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、５つのヌクレオチド置換を含む。
同様に、一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の１０の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つ以上のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の１０の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の１０の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、２つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の１０の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、３つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の１０の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、４つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列の最初の１０の位置内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、５つのヌクレオチド置換を含む。
更に、Ｊｉａｎｇ及びＤｏｕｄｎａは、ｃｒＲＮＡ標的化配列の１４～１７位におけるＰＡＭ遠位ヌクレオチドの塩基対合が、標的配列への結合後の切断活性に重要であると仮定している。
したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８～１０内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つ以上のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８～１０内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８～１０内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、２つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８～１０内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、３つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８～１０内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、４つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８～１０内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、５つのヌクレオチド置換を含む。
同様に、一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つ以上のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、２つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、３つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド位置１～３及び８内の、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、４つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ。
更に他の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、実験を通じて決定されるように、ｃｒＲＮＡの配列全体を通して、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つ以上のヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、実験を通じて決定されるように、ｃｒＲＮＡの配列全体を通して、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、１つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、実験を通じて決定されるように、ｃｒＲＮＡの配列全体を通して、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、２つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、実験を通じて決定されるように、ｃｒＲＮＡの配列全体を通して、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、３つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、実験を通じて決定されるように、ｃｒＲＮＡの配列全体を通して、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、４つのヌクレオチド置換を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物及び／又は方法で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、例えば、実験を通じて決定されるように、ｃｒＲＮＡの配列全体を通して、例えば、配列番号２９８～５９０のいずれかに対する、５つのヌクレオチド置換を含む。
一部の実施形態では、関節の疾患又は状態は、関節炎である。一部の実施形態では、関節炎は、変形性関節炎である。
一部の実施形態では、投与は、対象の関節内への医薬組成物の関節内注射を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、手術中に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、手術後に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、徐放性医薬組成物である。
一部の実施形態では、医薬組成物が、本明細書に説明されるように、１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス－１から選択される組換えウイルスを含む。一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶが、血清型５（ＡＡＶ５）のものである。一部の実施形態では、組換えＡＡＶが、血清型６（ＡＡＶ６）のものである。
一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、Ｃａｓ９タンパク質をコードする、１つ以上の核酸のうちの第１の核酸を含む第１のウイルスベクターと、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、１つ以上の核酸のうちの第２の核酸を含む第２のウイルスベクターと、を含む。一部の実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、単一の核酸を含むウイルスベクターを含み、単一の核酸が、Ｃａｓ９タンパク質及び少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする。
一部の実施形態では、組成物が、１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のリポソームを含む。一部の実施形態では、１つ以上の核酸が、裸の状態で存在する。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである。
変形性関節炎及び他の疾患を治療する方法
本明細書に説明される組成物及び方法は、疾患を治療するための方法で使用され得る。一実施形態では、それらは、炎症性関節障害を治療する際に使用するためのものである。これらはまた、本明細書及び以下の段落に説明される他の障害を治療する際に使用され得る。一態様では、組成物及び方法は、変形性関節炎（ＯＡ）を治療するために使用される。
一部の実施形態では、本開示は、関節の疾患又は状態の治療又は予防のための方法であって、方法が、遺伝子編集システムを導入することを含み、遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とする、方法を提供する。一部の実施形態では、関節疾患は、変形性関節炎である。一態様では、方法は、イヌを変形性関節炎で治療するために使用される。別の態様では、方法は、変形性関節疾患を有する哺乳動物を治療するために使用される。一部の態様では、方法は、関節疾患を患うイヌ又はウマを治療するために使用される。一部の態様では、方法は、変形性関節炎、外傷後関節炎、感染後関節炎、関節リウマチ、痛風、偽痛風、自己免疫媒介性関節炎、炎症性関節炎、炎症介在性及び免疫介在性の関節の疾患を治療するために使用される。
一部の実施形態では、方法は、関節滑膜細胞の一部分を遺伝子編集して、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、及びＴＮＦ－αのうちの１つ以上の発現を低減させるか、又はサイレンシングすることを更に含む。一態様では、方法は、関節滑膜細胞の一部分を遺伝子編集して、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βのうちの１つ以上の発現を低減させるか、又はサイレンシングすることを更に含む。
一態様では、方法は、遺伝子編集を更に含み、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、ジンクフィンガー法、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の方法を含む。
一部の態様では、方法は、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターを使用して遺伝子編集を送達することを更に含む。好ましい実施形態では、方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１（Ｙ７０５＋７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、ＡＡＶ３（Ｙ７０５＋７３１Ｆ）、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５（Ｙ４３６＋６９３＋７１９Ｆ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６（ＶＰ３バリアントＹ７０５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ－７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９（ＶＰ３バリアントＹ７３１Ｆ）、ＡＡＶ１０（Ｙ７３３Ｆ）、及びＡＡＶ－ＳｈＨ１０を使用して遺伝子編集を送達することを更に含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６（Ｙ７０５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ９（Ｙ７３１Ｆ）からなる群から選択される血清型を含む。
医薬組成物及び投与の方法
本明細書に説明される方法は、活性成分としてＣＲＩＳＰＲ遺伝子（例えば、ＩＬ－１α及び／又はＩＬ－１β）編集複合体を含む医薬組成物の使用を含む。
投与の方法／経路に応じて、医薬剤形は、数個のタイプでもたらされる。これらは、多くの種類の液体、固体、及び半固体剤形を含む。一般的な医薬剤形としては、多くの他のものの中でも、丸薬、錠剤、又はカプセル、飲料又はシロップ、並びに植物又は食品などの天然又はハーブ形態が挙げられる。特に、薬物送達の投与の経路（ＲＯＡ）は、問題の物質の剤形に依存する。液体医薬剤形は、投与又は消費を意図する薬物又は医薬品として使用される化合物の用量の液体形態である。
一実施形態では、本開示の組成物は、皮下（例えば、関節内注射）、皮膚（例えば、パッチを介して経皮的に）、及び／又はインプラントを介して対象に送達され得る。例示的な医薬剤形としては、例えば、丸薬、浸透圧送達システム、エリキシル、エマルション、ハイドロゲル、懸濁液、シロップ、カプセル、錠剤、経口溶解錠剤（ＯＤＴ）、ゲルカプセル、薄膜、粘着性局所パッチ、ロリポップ、ロゼンジ、チューインガム、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、気化器、ネブライザー、定量吸入器（ＭＤＩ）、軟膏、経皮パッチ、皮内インプラント、皮下インプラント、及び経皮インプラントが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「皮膚送達」又は「皮膚投与」は、医薬剤形が真皮（すなわち、表皮（皮膚を構成する）と皮下組織との間の皮膚の層）に、又はそれらを通して投与される投与の経路を指し得る。「皮下送達」は、医薬剤形が皮下組織層に対して又はその下である投与の経路を指し得る。
好適な医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ ｅｄ．，２００５、及びｔｈｅ ｂｏｏｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。例えば、非経口、皮内、又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はブドウ糖などの毒性の調整のための薬剤を含み得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの、酸又は塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチックで作製された複数回投与バイアルに封入され得る。
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性である）又は分散液及び滅菌粉末を含み得る。静脈内投与については、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されなければならず、注射容易性が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の混入作用に抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含むことが好ましいことになる。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
滅菌注射可能な溶液は、活性化合物を、上記で列挙された成分のうちの１つ又は組み合わせを用いて、適切な溶媒中に必要な量で組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌されることによって調製され得る。一般に、分散剤は、塩基性分散媒体、及び上記で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する活性化合物を滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、活性成分の粉末に、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分を加えて得られる。
核酸であるか、又は核酸を含む治療用化合物は、ＤＮＡワクチンなどの核酸剤の投与に好適な任意の方法によって投与され得る。これらの方法としては、遺伝子銃、バイオインジェクター、及び皮膚パッチ、並びに米国特許第６，１９４，３８９号に開示される微粒子ＤＮＡワクチン技術、及び米国特許第６，１６８，５８７号に開示される粉末形態ワクチンを有する哺乳動物経皮無針ワクチン接種などの無針方法が挙げられる。加えて、鼻腔内送達が、特に、Ｈａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５－１０（１９９８）に説明されるように可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に説明される）及びマイクロカプセル化もまた、使用され得る。生分解性標的可能微粒子送達システムもまた、使用され得る（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に説明される）。
治療用化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放性製剤などの、身体からの急速な排除に対して治療用化合物を保護することになる担体を用いて調製され得る。コラーゲン、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物（例えば、ポリ［１，３－ビス（カルボキシフェノキシ）プロパン－ｃｏ－セバシン酸］（ＰＣＰＰ－ＳＡ）基質、脂肪酸二量体－セバシン酸（ＦＡＤ－ＳＡ）コポリマー、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオールトリエステル、ポリエチレングリコール被覆リポソーム、及びポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性のポリマーが使用され得る。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製されるか、又は、例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に取得され得る。リポソーム懸濁液（細胞抗原に対するモノクローナル抗体を有する選択された細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に説明されるように、当業者に公知の方法によって調製され得る。半固体、ゲル化、ソフトゲル、又は他の製剤（徐放性を含む）が、例えば、外科手術部位への投与が所望されるときに、使用され得る。そのような製剤を作製する方法は、当技術分野で公知であり、生分解性の生体適合性ポリマーの使用を含み得る。例えば、Ｓａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２００６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ、７９（３－４）：１４１－１５２を参照されたい。
医薬組成物は、容器、キット、パック、又はディスペンサーに、投与の説明書と一緒に含まれ得る。
ここで、本明細書に包含される実施形態を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示のみの目的のために提供され、本明細書に包含される本開示は、決してこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきではないが、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる、いかなる及び全ての変形例をも包含するように解釈されるべきである。
実施例１．変形性関節炎のマウスモデルにおけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子操作によるＩＬ－１発現を低減する。
６０匹のＣ５７Ｂマウスが選択され、各々１５匹のマウスの４群に分布される。ＤＭＭ外科的方法を使用して、マウスの各々にＯＡを誘導する。マウスがＯＡを発症すると、マウスを以下のように処理した：
第１群：ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを標的とするように操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターをＯＡ関節に直接注射、ＩＬ－１タンパク質の発現をサイレンシング又は低減する。
第２群：ＩＬ－１産生に影響しない「ナンセンス」量で操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターをＯＡ関節に直接注射、陰性対照。
第３群：ＩＬ－１Ｒａを標的とするように操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターをＯＡ関節に直接注射、ＩＬ－１Ｒａタンパク質の発現をサイレンシング又は低減する。
第４群：ＯＡ関節の滅菌緩衝生理食塩水への直接注射、注射プロセスに関する対照。
マウスは、処理の前及び後に監視され、それらの移動運動及び探索的活動に対する効果を評価する。機械的感受性及び歩行の変化もまた、監視される。アロディニア及び後肢の握力もまた、監視され得る。
約８週間後、動物を殺傷し、肉眼的組織病理、及びＩＨＣによるＩＬ－１発現についてＯＡ関節組織を評価する。炎症のバイオマーカー、例えば、ＯＡ関節におけるＭＭＰ－３発現もまた、評価される。
ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを標的とし、かつＩＬ－１タンパク質の発現をサイレンシング又は低減するように操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターで処理された第１群マウスは、ＩＨＣによるＩＬ－１の低減されたレベル、組織病理学による組織再生、及び３つの他の群のうちのいずれかよりも低いレベルの炎症バイオマーカーを示すことになる。第３群マウスは、他の３つの群のうちのいずれかよりも比較的高いレベルの炎症バイオマーカーを示すことになる。
実施例２．マウスＩＬ１Ａ及びＩＬ１Ｂに対するガイド切断効率を評価する
インビトロ切断アッセイ
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ホスフォロチオネート修飾されたｓｇＲＮＡ、表３）を、Ｉｌ１ａのエクソン４及びＩｌ１ｂのエクソン４に対して設計した（Ｉｌ１ａ－２０１ＥＮＳＭＵＳＴ００００００２８８８２．１及びＩｌ１ｂ－２０１ＥＮＳＭＵＳＴ００００００２８８８１．１３、Ｉｌ１ａのエクソン４及びＩｌ１ｂのエクソン４上の標的配列に関する表２を参照）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｍ０５３０Ｓ）によってＩｌ１ａ及びＩｌ１ｂのエクソン４を増幅する、Ｉｌ１ａプライマー順配列：ＣＡＴＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡ（配列番号６２０）、Ｉｌ１ａプライマー逆配列：ＧＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＧ（配列番号６２１）、Ｉｌ１ｂプライマー順配列：ＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧ（配列番号６２２）、Ｉｌ１ｂプライマー逆配列：ＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＧ（配列番号６２３）。アンプリコンをＰＣＲ精製した（ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｃａｔ＃２８１０６）。１００ｎｇの精製ＰＣＲ産物、２００ｎｇの修飾ガイドＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．５ｕｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｓｐｙ Ｃａｓ９タンパク質Ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ３６４９８）又は０．５ｕｇのＧｅｎｅ Ｓｎｉｐｐｅｒ ＮＬＳ Ｓａｕ Ｃａｓ９（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｃａｔ＃Ｍ１２８１－５０－１）を使用して、インビトロ切断アッセイを使用して、ガイド切断効率を決定した。Ｃａｓ９の２つのタイプ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９及びＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９を、それらの編集能力について比較した。２％アガロースゲルを、切断アッセイの定性読み取りに使用した。
細胞株を編集する
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ホスフォロチオネート修飾されたｓｇＲＮＡ、表２）を、Ｉｌ１ａのエクソン４及びＩｌ１ｂのエクソン４に対して設計した（Ｉｌ１ａ－２０１ＥＮＳＭＵＳＴ００００００２８８８２．１及びＩｌ１ｂ－２０１ＥＮＳＭＵＳＴ００００００２８８８１．１３）。ガイドＲＮＡ切断効率を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング、及びＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ（例えば、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ，Ｈｓｉａｕ Ｔ，Ｍａｕｒｅｓ Ｔ，Ｗａｉｔｅ Ｋ，Ｙａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏｒｘｉｖ．２０１８参照）、又は編集率を計算するＴＩＤＥ（全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｅａｓｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｃｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｅ，Ｃｈｅｎ Ｔ，Ａｍｅｎｄｏｌａ Ｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌ Ｂ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓ２０１４参照）ウェブツールを使用して、Ｊ７７４．２及びＮＩＨ３Ｔ３細胞のプールで決定した。実験はまた、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９とＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９との効率を比較した。細胞を、５ｕｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｓｐｙ Ｃａｓ９タンパク質Ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ３６４９８）又は１００ｐｍｏｌの修飾ガイドＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を有する５ｕｇのＥｎＧｅｎ Ｓａｕ Ｃａｓ９タンパク質（ＮＥＢ Ｍ０６５４Ｔ）を用いて、電気穿孔した。ＳＦヌクレオフェクタ溶液及びプログラムＣＭ１３９をＪ７７４．２細胞に使用し、ＳＧヌクレオフェクタ溶液及びプログラムＥＮ１５８をＮＩＨ３Ｔ３細胞に使用した。電気穿孔の３日後に細胞ペレットを採取し、各プールからｇＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ，ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ，６９５０６）。Ｉｌ１ａ又はＩｌ１ｂのエクソン４を、ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＮＥＢ、ｃａｔ＃Ｍ０５３０Ｓ）によって適切なプール内で増幅した。Ｉｌ１ａプライマー順配列：ＴＧＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧ（配列番号６２４）、Ｉｌ１ａプライマー逆配列：ＧＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡ（配列番号６２５）、Ｉｌ１ｂプライマー順配列：ＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧ（配列番号６２２）、Ｉｌ１ｂプライマー逆配列：ＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＴＴＧＧＡＴＴ（配列番号６２６）。アンプリコンをＳａｎｇｅｒシーケンシングに供し、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ又はＴＩＤＥウェブツールのいずれかを使用して分析して、各クローンに野生型配列が存在しないこと、及びｃＤＮＡ配列にフレームシフトを結果的にもたらすインデルの存在を決定した。
Figure 2023535351000016
Figure 2023535351000017
各ｃＲＮＡ（例えば、表３参照）を、以下のｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合された上記のｃＲＮＡ配列からなるシングルガイドＲＮＡとして合成した（例えば、配列番号３５及び３６参照）。特定の実施形態では、Ａ＜＞Ｕが、ガイドＲＮＡ活性を増加させるために使用される。
Ｓａｕ Ｃａｓ９：ＧＵＵＡＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵＵ（配列番号３５）
Ｓｐｙ Ｃａｓ９：ＧＵＵＡＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（配列番号３６）
インビトロ切断アッセイ
図１Ａは、０．５ｕｇのＳｐｙ Ｃａｓ９並びに２００ｎｇの修飾ガイドＲＮＡのＩｌ１ａ遺伝子に対する４３～４６及びＩＬ１Ｂに対する４７～５０によって切断された、１００ｎｇのマウスＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を例示する。ＤＮＡは、ガイドＲＮＡを使用して、ｃａｓ９によって特定の部位で切断されて、未切断対照と比較してアガロースゲル上に予測可能なバンドパターンを生じさせる（いかなる特定の理論によって縛られることを望まず、ｓｇ８＊に対するアガロースゲル電気泳動は、失敗した合成を示すように見える）。
図１Ｂは、０．５ｕｇのＳａｕ Ｃａｓ９並びに２００ｎｇの修飾ガイドＲＮＡのＩｌ１ａ遺伝子に対する５１～５３及びＩｌ１Ｂに対する５４～５６によって切断された、１００ｎｇのマウスＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を例示する。ＤＮＡは、ガイドＲＮＡを使用してＣａｓ９によって特定の部位で切断されて、未切断対照と比較してアガロースゲル上に予測可能なバンドパターンを生じさせる。
細胞株を編集する
ゲノムＤＮＡを、編集されたプールから抽出し、Ｉｌ１ａ又はＩｌ１ｂエクソン４を、適切なプールでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングのために送って、次いで、ＴＩＤＥ又はＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥソフトウェアを使用して逆畳み込みした。Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥを使用して、Ｓｐｙ Ｃａｓ９プールを逆畳み込みした。ソフトウェアは、ガイドＲＮＡ配列及びＰＡＭ部位に基づいて、各プール内の編集のパターンを決定し得る。それは、切断された機能性タンパク質につながり得るインフレーム欠失を引き起こした編集と、真のノックアウトにつながることになるフレームシフト変異を引き起こした編集とを区別することができる。Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥソフトウェアがＳａｕＣａｓ９の編集を逆畳み込みすることができないため、ＳａｕＣａｓ９プールをＴＩＤＥで分析した。ＴＩＤＥ分析は、ガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位に基づいて、プール内の編集のパターンを決定することによって、ＩＣＥと同様の方式で機能する。しかしながら、真のノックアウトスコアを与えるのではなく、それは、インフレーム及びフレームシフト編集パターンの間を区別することができない編集効率スコアを与える。したがって、編集効率スコアは、タンパク質をノックアウトするガイドＲＮＡの能力を超えて表現する可能性がある。ＳｐｙＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集に使用される標準タンパク質である。しかしながら、それは、３１５６ｂｐであるＳａｕ Ｃａｓ９と比較して、４１０１ｂｐである。ＡＡＶなどの一部のウイルスをパッケージングするサイズ制限に起因して、それは、Ｓａｕ Ｃａｓ９及びＳｐｙＣａｓ９の編集能力を比較して、より小さいＳａｕ Ｃａｓ９が、このプロジェクト用に設計されているベクターに使用され得るか否かを確認するために決定された。
図２Ａ～図２Ｄは、Ｊ７７４．２（「Ｊ」）及びＮＩＨ３Ｔ３（「Ｎ」）細胞におけるガイドＲＮＡの範囲とともに使用されるＳｐｙ Ｃａｓ９（図２Ａ及び図２Ｂ）並びにＳａｕＣａｓ９（図２Ｃ及び図２Ｄ）の編集効率を表示するグラフを例示する。編集効率は、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ又はＴＩＤＥサンガー逆畳み込みソフトウェアを使用して決定された。図２Ａ：Ｊ７７４．２及びＮＩＨ３Ｔ３のＳｐｙＣａｓ９とともにガイドＲＮＡ４３～４６を使用したＩｌ１ａのノックアウト効率。Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥを使用して、サンガー配列トレースを逆畳み込みし、ノックアウト効率を決定した。図２Ｂ：Ｊ７７４．２及びＮＩＨ３Ｔ３のＳｐｙＣａｓ９とともにガイドＲＮＡ４７～５０を使用したＩｌ１ｂのノックアウト効率であり、いかなる特定の理論に縛られることを望まず、ｓｇＲＮＡ８に関するデータは、失敗した合成を示すように見える。Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥを使用して、サンガー配列トレースを逆畳み込みし、ノックアウト効率を決定した。図２Ｃ：Ｊ７７４．２及びＮＩＨ３Ｔ３におけるｓａＣａｓ９とともにガイドＲＮＡ５１～５３を使用したＩｌ１ａのノックアウト効率。ＴＩＤＥを使用して、サンガー配列トレースを逆畳み込みし、編集効率を決定した。図２Ｄ：Ｊ７７４．２及びＮＩＨ３Ｔ３におけるＳａｕ Ｃａｓ９とともにガイドＲＮＡ５４～５６を使用したＩｌ１ｂのノックアウト効率。ＴＩＤＥを使用して、サンガー配列トレースを逆畳み込みし、編集効率を決定した。
実施例３．マウス尿酸モデルにおけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子操作によるＩＬ－１β発現を低減する。
最適な前処理時間を決定するための経時的実験
パイロット実験を実施して、マウスを尿酸に曝露させる前に、ウイルスを有するマウスの最適な前処理時間を決定する。マウスは、ＧＦＰ標識ＡＡＶ５ベクターを膝関節内に注射される。次いで、ウイルス量がＰＣＲによって定量化され、ウイルス感染の場所が、感染の３、５、及び７日後に組織学によって定量化される。ＩＬ－１ｂを標的とし、かつＩＬ－１ｂの発現をサイレンシング又は低減するように操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターによるマウス尿酸モデルにおけるＩＬ－１ｂの低減をけって得する実験では、マウスへウイルスベクターを注射するための最適なリードタイムとして、関節内のウイルスの強固な発現が得られる処理時間が選択される。
尿酸モデルにおけるｌＬ－１ｂ発現及び治療効果のＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶ（ＡＡＶ－ｓｐＣａｓ９）ノックダウンを確認するための実験
マウスが選択され、以下の３つの群に分けられる：
第１群：ＩＬ－１ｂを標的とし、かつＩＬ－１タンパク質の発現をサイレンシング又は低減するように操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ｓｐＣａｓ９）を注射されたマウス、
第２群：ＩＬ－１産生に影響を与えないことになる量で操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターである、「スクランブル」ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＡＡＶ－ｓｐＣａｓ９）を注射されたマウス、及び
第３群：生理食塩水を注射されたマウス。
次いで、マウスは、最適な前処理時間の後に尿酸に曝露される。尿酸の注射から２４時間以内に、動物を殺傷し、関節組織がサイトカイン発現について分析される（例えば、ＩＨＣによるＩＬ－１発現について評価される）。関節組織はまた、肉眼的組織病理、及び炎症のバイオマーカーの発現についても評価され得る。
ＩＬ－１ｂを標的とし、かつＩＬ－１タンパク質の発現をサイレンシング又は低減するように操作されたＣＲＩＳＰＲ ＡＡＶベクターで処理された第１群マウスは、ＩＨＣによるＩＬ－１の低減されたレベル、及び２つの他の群のうちのいずれかよりも低いレベルの炎症バイオマーカーを示すことになる。
実施例４．マウスにおけるＡＡＶの関節内注射の経時的試験
オスのＣ５７ＢＬ／６マウスの関節にＡＡＶを注射することについて経時的に評価するために、試験を実施した。
物質及び方法
試験物品の識別及び調製－ｅＧＦＰ ＡＡＶＰｒｉｍｅ（商標）精製アデノ随伴ウイルス粒子：ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（商標）、カタログ番号ＡＢ２０１、ロット番号ＧＣ０８２２２Ｋ１９０２、１．１８×１０１３ゲノムコピー／ｍＬ）及びＡＡＶ６（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（商標）、カタログ番号ＡＢ４０１、ロット番号ＧＣ０９２４２Ｋ１９０５、５．４７×１０１２ゲノムコピー／ｍＬ）を我々が供給した。ＡＡＶ－粒子を、ドライアイスで出荷し、受領直後に－８０℃で保存した。投与直前に、ＡＡＶ粒子を、１０μＬ／膝のＩＡ投与のために、リン酸緩衝生理食塩水（カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ：Ｃｏｒｎｉｎｇ、ロット番号１１４１９００５）中で再構築した。試験物品の調製、保管、及び取り扱いに関する追加の詳細は、試験プロトコル（付録Ａ）を参照されたい。
試験システム識別－８～１０週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３０）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から取得した。マウスが計量され、試験０日目の登録時に約２４～２９グラム（平均２６ｇ）であった。動物を、群及び動物番号を記す尾の付け根の別個のマークによって識別した。無作為化後、全てのケージを、プロトコル番号、群番号、及び動物番号を適切な色コードで標識化した（付録Ａ）。
環境及び管理－到着時に、動物を、木製チップのベッド及び吊るされた飼料及び水ボトルを有するポリカーボネートケージに１ケージ当たり３～５匹で収容した。マウスを、フィルタートップを有するシューボックスケージ（静止空気流、約７０インチ２のフロア空間）又は個別に換気されたパイケージ（受動的気流、約７０～７５インチ２のフロア空間）のいずれかに収容した。部屋、ケージ、及び機器の衛生を含む動物ケアは、ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０１１に引用されたガイドラインに適合しており、これは、参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
試験で歩調を追う前に、動物を４日間馴化させた。試験のライブフェーズ中、主治医の獣医師が現場に居たか、又は待機していた。併用薬剤は投与しなかった。
馴化及び試験期間中、動物を、１９℃～２５℃の範囲の温度及び３０％～７０％の相対湿度の実験室環境に収容した。自動タイマーで、１２時間の明るい状態及び１２時間の暗い状態を提供した。動物が、Ｅｎｖｉｇｏ Ｔｅｋｌａｄ８６４０の飼料及び新鮮な水道水を自由に摂取することを可能にした。
実験設計－試験０日目に、マウスを体重によって処理群に無作為化した。無作為化後、動物は、表４に示されるように関節内（ＩＡ）注射によって投与された。動物体重を、セクション８．５．１に説明されるように測定した。マウスを、「死体解剖標本」と題されるセクションで以下に説明されるように、３つの時点（３、５、及び７日目）で死体解剖及び組織採取のために安楽死させた。
Figure 2023535351000018
観察、測定、及び標本
体重測定－マウスを、試験０日目に、また、１、３、５、及び７日目に再び無作為化のために計量した。体重の測定値は、表６に見出され得る。
死体解剖標本－表５に示されるように、試験３、５、及び７日目にマウスを死体解剖した。
Figure 2023535351000019
死体解剖では、マウスを心臓穿刺を介して放血させ、その後、頸椎脱臼させた。左右の膝を全動物から採取した。関節包を無傷に保ちながら、皮膚及び筋肉を関節から除去した。関節を、マウス番号、採取日、及び右又は左脚のみで標識された１５ｍＬの円錐管で別々に急速冷凍した。膝関節を－８０℃で冷凍して発送のために保管した。
動物の処分－動物の死体を、ＢＢＰ ＳＯＰに従って処分した。
検体及び未加工データの保存－標本（右及び左膝関節）、試験データ、及び報告書を、試験中又は試験完了時に送達した。
試験の質及び完全性に対する逸脱の影響に関する声明－試験プロトコルからの逸脱は存在しなかった。
結果／結論
試験０日目に、オスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５のＩＡ注射（５×１０９粒子、１０μＬ）を右膝に、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ６のＩＡ注射（５×１０９粒子、１０μＬ）を左膝に受けた。動物を、試験０、１、３、５、及び７日目に計量した。死体解剖は、試験３日目（動物１～１０）、５日目（動物１１～２０）、及び７日目（動物２１～３０）に実施され、右及び左膝関節を発送のために採取した。動物の計量、投与、及び生体試料採取を含む本研究のライブ部分を成功裏に完了した。全ての動物は、試験終了まで生存した。
参考文献
Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０１１、これは、参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
Figure 2023535351000020
Figure 2023535351000021
プロトコル
試験システム
動物数：３３（３０＋３の余分）
種／株又は育種：Ｃ５７ＢＬ／６
ベンダー：Ｊａｃｋｓｏｎ
到着時の年齢／体重：８～１０週齢（約２０グラム）
性別：オス
試験開始時の年齢／体重範囲：試験開始までに少なくとも９週間
馴化：ＢＢＰ到着後少なくとも３日間馴化させる
収容：３～５匹／ケージ
Figure 2023535351000022
Figure 2023535351000023
試験物品及びビヒクル情報
製剤化されていない試験物品保管条件－ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５（第１群）：－８０Ｃ、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ６（第１群）：－８０℃。
ビヒクル情報－ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５（第１群）：ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ及びＭｇ）、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ６（第１群）：ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ及びＭｇ）。
試験物品製剤の説明及び計算－ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５（第１群）：ＰＢＳを使用して適切な濃度にストックを希釈する、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ６（第１群）：ＰＢＳを使用して適切な濃度にストックを希釈する。
投与製剤及びビヒクルの保管及び安定性－ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５（第１群）：注射直前に希釈する、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ６（第１群）：注射直前に希釈する。
投与後の試験物品の処分－ＧＦＰタグ付きＡＡＶ５（第１群）：製剤を廃棄し、将来の試験のためにストック溶液を保持する、ＧＦＰタグ付きＡＡＶ６（第１群）：製剤を廃棄し、将来の試験のためにストック溶液を保持する。
Figure 2023535351000024
死体解剖情報
殺傷スケジュール：第１群Ａｎ１～１０：３日目
第１群Ａｎ１１～２０：５日目
第１群Ａｎ２１～３０：７日目
安楽死の方法：心臓穿刺による出血で放血させ、その後、頸椎脱臼させる。
時点：時間指定なし
Figure 2023535351000025
 ＊管をマウス番号、採取日、及び左又は右脚のみで標識付けする。試料は、それらがＡＡＶ－２又はＡＡＶ－５注射であるか否かを参照せずに試験されることになる。キーはＰＣＲ完了後のみ提供されることになる。
試料分析
組織標本－ＡＡＶ注射マウス由来の後肢を瞬間凍結し、発送した。到着時に、標本を保管のために－８０℃の冷凍庫に移した。
標的組織におけるＧＦＰ発現－後肢（対）を室温で解凍し、ＩＶＩＳ生物発光撮像システム（Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で撮像した。ＧＦＰ蛍光を、４８８ｎｍにおける励起及び５１０ｎｍにおける放射の測定を使用して定量化した。合計４匹のマウスを各時点で評価した（３日、５日、及び７日）。各時点で残りの６匹の動物からの組織を、リアルタイムＰＣＲを使用してウイルス量のその後の確認のために保持した。
結果－図３に見られるように、注射された膝関節内で高レベルのＧＦＰの発現が注射後３日目に存在した。ウイルス量は、５日目にわずかに減少し、その後、７日目まで再び上昇した。このパイロット試験における限定されたサンプルサイズにより、ＡＡＶ－５及びＡＡＶ－６の挙動の間に有意差はなかった。
考察－本試験からのデータは、マウス膝関節へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の関節内送達のためのＡＡＶ－５又はＡＡＶ－６のいずれかの使用を支持する。両方のウイルス血清型のレベルは、５～７日に上昇し、追跡期間が２週間又は３週間まで延長された場合、更に上昇する可能性が残された。これを確認するために追加の研究が必要となるが、これまでのデータは、ベクターの注射、及び関節内のモノヨードアセテート（ＭＩＡ）結晶による曝露前に少なくとも１週間の間隔が存在するべきであることを示唆するものとなる。
背景及び根拠－モノヨードアセテート（ＭＩＡ）誘発性ＯＡモデルが、２つの理由でこの研究で使用される。第１に、自然（自然発生）ＯＡは、マウスでは極めて稀であるのに対し、ＭＩＡの注射は、結果として、比較的早く発症し、予測可能であり、かつ関節内炎症、疼痛、及び軟骨変性を含む、ヒトＯＡ患者で見られる疾患表現型と良好な臨床相関を提供する、ＯＡの誘発性モデルをもたらす。第２に、内側半月板（ＤＭＭ）の不安定化及び前十字靱帯離断（ＡＣＬＴ）などの外科的モデルとは対照的に、ＭＩＡモデルは、関節包の外科的切開を伴わず、ＯＡを有するヒト患者の関節包にはるかに関連させる。
げっ歯類におけるＭＩＡ結晶の注射は、挙動試験及び客観的遅延評価などの技術によって分析及び定量化され得るＯＡ様病変及び機能障害を再現する。ＭＩＡは、グリセルアルデヒド－３－ホスファターゼの阻害剤であり、結果として生じる細胞解糖の改変は、最終的に、軟骨細胞を含む関節内の細胞の死を引き起こす。軟骨細胞死は、軟骨変性及びプロテオグリカン染色の改変として現れる。ＭＩＡを注射されたマウスは、通常、７２時間以内に疼痛様挙動、及び注射後約４週までに軟骨の喪失を呈する。ＩＬ－１発現の増加は、ラット及びマウスにおける注射から２～３日以内に実証されている。
試験設計－マウスは、ＭＩＡ又は生理食塩水ビヒクル対照のいずれかを片側のみに注射される（動物当たり１つの関節）。各グループ内では、動物の半数は、マウスＩＬ－１ベータ遺伝子を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターで前処理され、残りの半分は、ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スクランブル対照を注射される。両群の動物は、２つの時点のうち１つの時点で試験から外される：滑液中のＩＬ－１のレベルに対する療法の影響の評価を可能にするために４８時間のより早い時点、及び軟骨破壊及び変形性関節炎の組織学的証拠に対する治療の影響の評価を可能にするために４週間のより後の時点。
方法
実験動物－この研究では、合計８０匹のマウスが使用される。実験手順は、局所ＩＡＣＵＣによってレビューされ、承認される。マウスは、マイクロアイソレーターケージに収容され、標準的な実験動物飼料を与えられ、水の自由な利用を可能にされている。
ＭＩＡモデル及びＡｎｔｉ－ＩＬ１療法－マウスは、試験前の７日間で馴化される。試験の初日に、マウスを、酸素中のイソフルランの吸入混合物で麻酔する。外科手術面の麻酔が確認されると、右後肢を切り取り、外科用消毒液を用いて皮膚を擦り洗いする。４０匹のマウス（処理された）は、ＩＬ－１を標的とするＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターの関節内注射を受け、残りの４０匹の動物（対照）は、ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スクランブル対照を関節内注射される。７日後、各群の動物の半数がＭＩＡを同じ関節に注射され、半数が生理食塩水ビヒクルを注射される。これは、４つの試験群の確立につながる：
第１群：処理された－ＭＩＡ（２０匹のマウス）
第２群：対照－ＭＩＡ（２０匹のマウス）
第３群：処理された－ビヒクル（２０匹のマウス）
第４群：対照－ビヒクル（２０匹のマウス）
１群当たり１０匹のマウスを、膝関節のＩＬ－１レベルを記録するために、ＭＩＡ曝露の４８時間後に安楽死させる。残りの動物は、疼痛挙動（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を含む挙動試験）、跛行（四肢使用）、関節腫脹（キャリパー測定）、及び関節病理（病理組織学）に対する療法の効果を評価するために、４週間収容されることになる。
安楽死及び組織採取－マウスは、放血、その後の頸椎脱臼によって殺傷される。関節は、開腹され、ＩＬ－１測定のために洗浄される（４８時間群）か、又は脱石灰組織病理のために１０％のホルマリン中で浸漬固定される（４週間群）。
実施例５．マウスにおけるＭＳＵ結晶誘発性関節炎のＡＡＶ－６及びＡＡＶ－５媒介ＣＲＩＳＰＲ治療の有効性
導入及び目的
これらの研究の目的は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）結晶誘発性のインターロイキン１Ｊ３（ＩＬ－１Ｊ３）の放出によって誘発される炎症を阻害する化合物／タンパク質を識別することである。これは、様々なタイプの抗炎症剤、特に、ＩＬ－１又はＩＬ１Ｒ１を遮断するインターロイキン受容体拮抗薬又は抗体のようなＩＬ－１経路遮断薬の抗炎症活性を識別する、単純なプレスクリーニングである（Ｔｏｒｒｅｓ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ，ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｒｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｏｕｔｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ Ｒｈｅｙｍ Ｄｉｓ．２００９；６８（１０）：１６０２－１６０８、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。痛風は、炎症性関節炎の最も一般的な形態であり、世界中で有病率が増加している（Ｒｏｄｄｙ Ｅ ａｎｄ Ｄｏｈｅｒｔｙ Ｍ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｏｕｔ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０；１２（６）：２２３、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。痛風関節炎は、関節内及び関節周囲の血清尿酸濃度の上昇及び尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）の沈着によって特徴付けられ、腫脹した関節及び重度の疼痛につながる（Ｓａｂｉｎａ ＥＰ，Ｃｈａｎｄｅｌ Ｓ，ａｎｄ Ｒａｓｏｏｌ ＭＫ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｕｒａｔｅ ｃｒｙｓｔａｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ Ａ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ．２００８；１１（４）：４６－５５、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。現在の治療としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド、又はコルヒチンが挙げられる。一部の患者について、これらの治療は、痛風の治療に有効ではないか、又は有害な副作用を有する可能性がある（Ｓａｂｉｎａ，２００８；Ｇｅｔｔｉｎｇ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｔｙｐｅ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｇｏｕｔｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．２００２；４６（１０）：２７６５－２７７５、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＭＳＵ誘発性炎症モデルは、全身性関節炎及びより複雑なＩＬ－１駆動性疾患などの、より複雑な疾患プロセスで活性を有し得る化合物を識別するための、良好で単純なスクリーニングツールを提供する。
マウスにおける尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）結晶誘発性炎症のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介ＣＲＩＳＰＲ療法の有効性を評価するために試験を実施した。試験０日目、オスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、プラセボ対照（希釈剤、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）、ＡＡＶ－６の２つのバリアントの混合物（一方はガイドＲＮＡ１を担持し、他方はガイドＲＮＡ２を担持する、５×１０９ウイルスゲノム［ｖｇ］コピー／ｍＬ）、ＡＡＶ－５の２つのバリアントの混合物（ガイド１＋ガイド２、５×１０９ｖｇ／ｍＬ）、スクランブルＡＡＶ－６対照（非標的化ガイドＲＮＡを担持する、１×１０１０ｖｇ／ｍＬ）、又はスクランブルＡＡＶ－５対照（１×１０１０ｖｇ／ｍＬ）の単一（１×）関節内（ＩＡ）注射を右膝に投与された。試験７日目、マウスは、ＭＳＵ結晶（２５ｍｇ／ｍＬ：１０ｕＬのＰＢＳ中２５０μｇ）を右膝（治療と同じ関節）に注射された。マウスを、試験７日目のＭＳＵ注射の約６時間後に死体解剖のために安楽死させた。有効性評価は、動物の体重、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ検査、及び膝キャリパーの測定値に基づいた。
Figure 2023535351000026
ＡＡＶ－６（ガイド１＋２：５×１０９ｖｇ／ガイド／膝）でＩＡ処理されたマウス（０日目に１回）は、ＡＡＶ－５スクランブルベクターをＩＡ投与されたマウスと比較して、７日目にＭＳＵ注射後６時間で、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験によって測定された関連痛の統計的に有意な低減（ｐ＝０．０２５）を示し、ＡＡＶ－６スクランブルベクター及びＰＢＳ対照群（それぞれ、ｐ＝０．０５１及びｐ＝０．０７５）と比較してほぼ有意である結果を示した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ評価に対する曲線下面積（ＡＵＣ）計算は、群間で統計的に異なっていなかった。動物の体重増加及び膝の腫脹は、群間で統計的に異なっていなかった（表７）。全ての動物は、試験終了まで生存した。
Figure 2023535351000027
 値は、群平均及び標準誤差（ＳＥ）を表す。
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水対照、ＡＡＶ＝アデノ随伴ウイルス、ＡＵＣ＝曲線下面積
＊ｐ＜０．０５ ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）対ＡＡＶ－６ガイド１
†ｐ＜０．０５ ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）対ＰＢＳ
‡ｐ＜０．０５ ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）対ＡＡＶ－５スクランブルベクター
§ｐ＜０．０５ ＡＮＯＶＡ（テューキーの事後検定）対ＡＡＶ－５ガイド１
臨床転帰の概要－経時的に群間で有意差は観察されなかった。ウイルス注射がビヒクル群に見られるものよりも大きい応答を誘発した臨床的証拠はない。ウイルス注射が関節腫脹に対するＭＳＵの効果を改変したという臨床的証拠はない。ＭＳＵ誘発性炎症におけるＩＬ－１の具体的な役割は不明であり、そのため、臨床効果の欠如は、予想外ではない可能性がある。
ｑＰＣＲの概要－ｑＰＣＲデータは、ＡＡＶ－６又はＡＡＶ－５を用いたＣＲＩＳＰＲ編集が、ＩＬ－１ベータｍＲＮＡ発現を正常レベルに復元するのに有効であることを裏付ける。統計的有意性は、試料サイズを考慮すると実証することが困難である。この効果の確認は、滑膜組織のＩＨＣ分析を通して得られ得る。
規制遵守
本試験は、試験施設の標準業務手順書（ＳＯＰ）、世界保健機関の基礎生物医学研究における品質管理ガイドライン、並びにＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ９ ＣＦＲ Ｐａｒｔｓ１－３．Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ３９１２９，Ｊｕｌｙ２２，１９９３を含む全ての州及び連邦規制を遵守して実施された。
施設内の動物のケア及び使用
本試験は、Ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ＆Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）に従って実施された。本試験で使用した動物について、許容可能な代替的な試験システムが識別されなかった。
物質及び方法
試験物品の識別及び調製
ＡＡＶベクターを、凍結アリコート中のウイルス粒子懸濁液（＞５×１０１２ウイルスゲノム［ｖｇ］コピー／ｍＬ）として予め製剤化した。アリコートを－８０℃で保管し、使用直前に希釈剤（滅菌濾過ＰＢＳ［Ｃｏｒｎｉｎｇ、ロット番号０１４２０００７］）中で再構築した。標準的なバイオセーフティレベル２（ＢＳＬ－２）の取り扱いが、注射前にＡＡＶベクターを取り扱う人員によって使用された。ＡＡＶスクランブル対照を滅菌ＰＢＳ中で調製して、ＩＡ注射用の１×１０１２ｖｇ／ｍＬを１０μＬ／膝で含有するワーキングストックを形成して、１×１０１０ｖｇのスクランブル対照を膝関節に送達した。活性ＡＡＶベクターを、２つの活性ＡＡＶ－５又はＡＡＶ－６構築物の各々を滅菌ＰＢＳと均等に混合して、２つのガイドの各々に対して５×１０１１ｖｇ／ｍＬを含有するワーキングストックを形成することによって調製した。活性ＡＡＶ製剤を、１０μＬ／膝でＩＡ注射し、５×１０９ｖｇの２つのガイドの各々を膝関節に送達した。試験物品の調製、保管、及び取り扱いに関する更なる詳細は、試験プロトコル（付録Ｂ）を参照されたい。
ＡＡＶベクターを以下のように識別した：
Figure 2023535351000028
尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）結晶を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（カタログ番号Ｔｌｒｌ－２５－ＭＳＵ、ロット番号ＭＳＵ－４２－０１）から取得した。ＭＳＵ結晶を、プラスチック管内でＰＢＳ（Ｃａ又はＭｇなし：Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２１－０３１－ＣＶ、ロット番号３１７１９００３）中、２５ｍｇ／ｍＬで調製し、約１分間ボルテックスし、約１５～２０分間超音波処理し、その後、ピペット操作及び使用前にボルテックスした。
Figure 2023535351000029
８～１０週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝７０＋４の余分）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から取得した。マウスが計量され、試験－１日目の登録時に約２０～２９グラム（平均２５ｇ）であった。
動物を、動物番号を記す尾の付け根の色コード付きドットによって識別した。登録後、全てのケージを、プロトコル番号、群番号、及び動物番号で標識化した。
環境及び管理
到着時に、動物を、トウモロコシの穂軸のベッド及び吊るされた飼料及び水ボトルを有するポリカーボネートケージに１ケージ当たり３～５匹で収容した。マウスを、個別に換気されたパイケージ（受動的気流、約０．０４５～０．０４８ｍ２のフロア空間）に収容した。部屋、ケージ、及び機器の衛生を含む動物ケアは、ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｇｕｉｄｅ，２０１１）及び適用可能なＢＢＰ ＳＯＰに引用されたガイドラインに適合した。
試験で歩調を追う前に、動物を９日間馴化させた。試験のライブフェーズ中、主治医の獣医師が現場に居たか、又は待機していた。併用薬剤は投与しなかった。
馴化及び試験期間中、動物を、１９℃～２５℃の範囲の温度及び３０％～７０％の相対湿度の実験室環境に収容した。自動タイマーで、１２時間の明るい状態及び１２時間の暗い状態を提供した。動物が、Ｅｎｖｉｇｏ Ｔｅｋｌａｄ８６４０の飼料及び新鮮な水道水を自由に摂取することを可能にした。
試験設計
試験－１日目、動物を体重によって治療群に無作為化し、膝の毛を剃り、ベースラインの膝キャリパー測定を行った。試験０日目、動物に、表８に示されるように治療薬を投与した（右膝へのＩＡ）。試験７日目、動物に、右膝（治療と同じ膝）へのＭＳＵ結晶（合計で１０μＬ、２５０μｇのＭＳＵ）のＩＡ注射を行った。体重測定を、説明されたように行った。関連通を、説明されるように、５つの時点でｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験によって測定した。右膝のキャリパー測定を、説明されるように、５つの時点で行った。動物を、説明されるように、７日目の最終挙動試験後に死体解剖のために安楽死させた。
Figure 2023535351000030
疾患誘発
ＭＳＵ結晶を、滅菌ＰＢＳ中、２５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。結晶を可溶化して、使用前に注射調製物を慎重に混合した。１０ｕＬのＭＳＵ結晶溶液を右膝関節に注射した。
Figure 2023535351000031
体重測定及びライブフェーズサンプリング
マウスを、試験－１日目（注射前）に無作為化のために計量し、体重を試験２及び６日目に再び測定した。動物の体重の測定値は、表９に見出され得る。
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ法
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ分析を、５つの時点、ベースライン（－１日目）、投与後６時間（０日目）、投与後２４時間（１日目）、ＭＳＵ注射前（０時間、７日目）、及びＭＳＵ注射後６時間（７日目）で、右後足に対して実施した。群を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験中に研究者に対して盲検化した。
ｖｏｎ Ｆｒｅｙ法は、足への較正されたフィラメント（Ｂｉｏｓｅｂ、Ｖｉｔｒｏｌｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の適用に対する動物の応答に基づいて、機械的アロディニア（通常は疼痛を誘発しない刺激に起因する疼痛）を評価する。フィラメントは、ミリグラム×１０の力のｌｏｇ１０を表す数によって識別される。動物は、ベースライン評価の前に３回（４５～６０分）、試験ラックに馴化される。試験するとき、ｖｏｎ Ｆｒｅｙの毛を後足の表面上に置き、毛が顕著に曲がるまで滑らかに押し、毛は、６秒間、後足に押し付けられる。応答は、０（応答なし）又は１（応答）のいずれかとして記録される。応答は、後足を毛から離れるように持ち上げる、脚を離して揺らす、毛から離れて歩くなどとして定義される。開始毛は、３．２２であり、動物が応答した場合、試験器が２．８３に下降し、３．２２の毛に応答がない場合、試験器が３．６１に上昇し、試験器は、応答に基づいて毛を試験し続け、必要に応じて上下に動く。毛の増分は、以下のとおりである。１．６５、２．３６、２．４４、２．８３、３．２２、３．６１、３．８４、４．０８、４．１７。各足は、５回試験され、最終フィラメントに到達するまで毛の間で上下に動く。データがスプレッドシートに入力され、応答速度を足の引き出し閾値に変換するために使用される。試験の結果は、式１０（ｘ＋ｙｚ）／１００００を使用して、グラム単位で絶対閾値（５０％応答速度）に変換され、式中、ｘは、最終試験されたフィラメントの対数単位値に等しく、ｙは、小さい試料に対するＤｉｘｏｎの昇降法（Ｄｉｘｏｎ，１９６５）からの応答パターンの表形式値に等しく、ｚは、フィラメント値間の平均間隔に等しい。かかとがより高い信頼性、及び感度応答を示す傾向があるため、試験は、後肢の後部分で行われる。試験器は、過剰反応又は凍結に関して動物を監視し、その場合、動物は、穏やかになるまで単独で放置される。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙデータは、表１０に見出され得る。
キャリパー法
右膝のキャリパー測定を、５つの時点、ベースライン（－１日目）、投与後６時間（０日目）、投与後２４時間（１日目）、ＭＳＵ注射前（０時間、７日目）、及びＭＳＵ注射後６時間（７日目）で、右後足に対して実施した。膝キャリパー測定を、ばね式マイクロメーターキャリパー（Ｍｉｔｕｔｕｙｏ）を使用して行った。膝キャリパー測定値は、表１１に見出され得る。
瀕死又は死んだ動物
動物が死んだ場合、試料は採取されなかった。安楽死させる必要のある動物については、理由にかかわらず、試料を、それらが死体解剖される際に採取した（死体解剖情報セクション参照）。健康評価中の動物は、ＳＣ流体、並びにケージの底部にハイドロゲル及び飼料を与えられ得る。
Figure 2023535351000046
Figure 2023535351000047
Figure 2023535351000048
Figure 2023535351000049
Figure 2023535351000050
Figure 2023535351000051
Figure 2023535351000052
Figure 2023535351000053
Figure 2023535351000054
死体解剖情報
動物を、試験７日目（ＭＳＵ後約６時間）の最終挙動試験後に死体解剖した。死体解剖では、動物を、心臓穿刺により放血させ、組織採取のために頸椎脱臼によって安楽死させた。全血を血清（≧２００μＬ／マウス）用に処理し、これを、試験スポンサーへの発送のために－８０℃で凍結保管した。全ての動物から右（注射された）及び左（正常）の膝を採取した（膝関節を無傷に保ちながら、皮膚、筋肉、及び足を除去した）。関節を、スポンサーへの発送のために１５ｍＬの円錐管内で直線状に急速冷凍した。
Figure 2023535351000055
統計分析
データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに入力し、各群の平均値及び標準誤差（ＳＥ）を決定した。群を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）又は反復測定（ＲＭ）ＡＮＯＶＡを使用して、テューキーの事後検定と比較した。ＡＮＯＶＡを、Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０．２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して実施した。示唆されない限り、ＢＢＰは、未加工（非変換）のデータのみに対して統計分析を実施する。統計検定は、データの正常性及び分散の均質性に関して特定の仮定を行い、検定がこれらの仮定の違反を結果的にもたらした場合、更なる分析が必要とされ得る。全ての検定の有意性を、ｐ＜０．０５０に設定し、ｐ値を小数点第３位まで四捨五入した。
ＡＡＶ調製
注射用ウイルスを調製するための標準業務手順書
各構築物に対して、５×１０＾１１ｖｇ／ｍｌを含有するワーキングストックを作成する（ガイド１、ガイド２）。等価性について、スクランブル対照群は、合計１×１０＾１０コピーのスクランブルベクターを注射されることを必要とすることに留意されたい。希釈剤（ＰＢＳ）は、ビヒクル対照群で使用されることになる。
Figure 2023535351000056
手順
第１群：ＡＡＶ－６スクランブル対照－４００マイクロリットルの滅菌濾過されたＣａ及びＭｇ非含有ＰＢＳを滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に等分する。１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）のストックＡＡ０６－ＣＣＰＣＴＲ０１－ＡＤ０１－２００を加える。これは、結果として、１×１０＾１２ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ－５スクランブル対照を含有する０．５ｍｌの体積のワーキングストックをもたらす。膝関節への１０マイクロリットルのこの溶液の注射は、１×１０＾１０ｖｇのＡＡＶ－６スクランブル対照を送達する。
第２群：活性ＡＡＶ－６ガイド１＋２－８００マイクロリットルの滅菌濾過されたＣａ及びＭｇ非含有ＰＢＳを滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に等分する。１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）の２つの活性ＡＡＶ－６構築物の各々を追加する－これは、１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）のＡＡ０６－ＭＣＰ００１６８２－ＡＤ０１－２－２００－ａ、及び１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）のストックＡＡ０６－ＭＣＰ００１６８２－ＡＤ０１－２－２００－ｂを意味する。これは、結果として、５×１０＾１１ｖｇ／ｍｌの２つのガイドの各々を含有する１ｍｌの体積のワーキングストックをもたらす。膝関節への１０マイクロリットルのこの溶液の注射は、２つのＡＡＶ－６ガイドの各々について５×１０＾９ｖｇを送達する。
第３群：ＰＢＳ－ウイルスストックを希釈するために使用される、滅菌濾過されたＣａ及びＭｇ非含有ＰＢＳは、本試験のビヒクル対照として提供された。これを、膝関節当たり１０マイクロリットルで投与した。
第４群：ＡＡＶ－５スクランブル対照－４００マイクロリットルの滅菌濾過されたＣａ及びＭｇ非含有ＰＢＳを滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に等分する。１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）のストックＡＡ０５－ＣＣＰＣＴＲ０１－ＡＤ０１－２００を加える。これは、結果として、１×１０＾１２ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ－５スクランブル対照を含有する０．５ｍｌの体積のワーキングストックをもたらす。膝関節への１０マイクロリットルのこの溶液の注射は、１×１０＾１０ｖｇのＡＡＶ－５スクランブル対照を送達した。
第５群：活性ＡＡＶ－６ガイド１＋２－８００マイクロリットルの滅菌濾過されたＣａ及びＭｇ非含有ＰＢＳを滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に等分する。１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）の２つの活性ＡＡＶ－６構築物の各々を追加する－これは、１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）のＡＡ０５－ＭＣＰ００１６８２－ＡＤ０１－２－２００－ａ、及び１００マイクロリットル（５×１０＾１１ｖｇに相当）のストックＡＡ０５－ＭＣＰ００１６８２－ＡＤ０１－２－２００－ｂを意味する。これは、結果として、５×１０＾１１ｖｇ／ｍｌの２つのガイドの各々を含有する１ｍｌの体積のワーキングストックをもたらす。膝関節への１０マイクロリットルのこの溶液の注射は、２つのＡＡＶ－６ガイドの各々について５×１０＾９ｖｇを送達した。
ｑＰＣＲ
瞬間凍結された滑膜組織を、塊状（遠位大腿骨及び近位脛骨を含む）に切除し、ＲＬＴ緩衝液中に配置した。Ｃｙｒｏｌｙｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ組織ホモジナイザー（「ＨＡＲＤ」プログラムサイクル）を使用してホモジナイズされた。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ又はＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット、その後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使用して抽出された。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｎｓｔｒｉｎｇを使用して定量化された。ｃＤＮＡが逆転写され、ｑＰＣＲが、ＩＬ－１ベータ、ベータ－アクチン、及びＲＰＬ１３に対するマウス特異的プライマーを使用して実施された。
結果
図６に示されるように、ＰＢＳ対照マウスは、試験の過程で４．３％（１．１ｇ）の平均体重増加を有した。体重増加は、群間で統計的に異なっていなかった（表７、表９）。
図７Ａに示されるように、全群における膝キャリパー測定値は、試験０日目の投与後６時間でピークに達し、投与後２４時間でベースラインに戻り、次いで、試験７日目のＭＳＵ後６時間で再びピークに達した。ベースラインからの膝キャリパーの変化は、経時的に群間で統計的に異なっていなかった（表１１）。図７Ｂに示されるように、－１～７日目の膝キャリパーの変化のＡＵＣは、群間で統計的に異なっていなかった（表７、表１１）。
図８Ａに示されるように、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ絶対閾値は、試験０日目のＩＡ投与後、全ての群でわずかに減少し、次いで、ＭＳＵのＩＡ注射後に急激に減少する前に、試験７日目のベースラインに向かう傾向を示した。ＡＡＶスクランブルベクター対照群とＰＢＳ対照群との間に経時的な統計的差異は存在しなかった。ＡＡＶ－６で処理されたマウス（ガイド１＋２）は、対照群と比較して、７日目のＭＳＵ後６時間増加したｖｏｎ Ｆｒｅｙ絶対閾値を有し、この時点におけるｖｏｎ Ｆｒｅｙ絶対閾値の増加は、ＡＡＶ－６スクランブルベクター及びＰＢＳ対照群と比較して統計的有意性にほぼ達し（それぞれ、ｐ＝０．０５１及びｐ＝０．０７５）、ＡＡＶ－５スクランブルベクター対照群と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０２５）。ＡＡＶ－５で処理されたマウス（ガイド１＋２）は、経時的に対照群と統計的に異ならなかったｖｏｎ Ｆｒｅｙ絶対閾値を有した（表１０）。図８Ｂに示されるように、－１～７日目のｖｏｎ Ｆｒｅｙ絶対閾値のＡＵＣは、群間で統計的に異なっていなかった（表７、表１０）。
図１０に示されるように、滑膜組織中のマウスＩＬ－１βの免疫組織化学データは、ＣＲＩＳＰＲ処理動物における低減されたＩＬ－１β発現を示した。（Ａ）ＰＢＳで前処理されたＭＳＵ注射された動物では、ＩＬ－１βの強固な発現（褐色染色）が存在する。この効果は、ＣＲＩＳＰＲ処理動物（パネルＣ）には見られない。ＣＲＩＳＰＲ処理された動物におけるＩＬ－１β（褐色染色）の非存在は、陰性抗体対照（パネルＢ及びＤ）に類似している。全ての画像は、１０×オリジナル倍率である。
考察及び結論
ＡＡＶ－６（ガイド１＋２：５×１０９ｖｇ／ガイド／膝）でＩＡ処理されたマウス（０日目に１回）は、ＡＡＶ－５スクランブルベクターをＩＡ投与されたマウスと比較して、７日目にＭＳＵ注射後６時間で、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験によって測定された関連痛の統計的に有意な低減（ｐ＝０．０２５）を示し、ＡＡＶ－６スクランブルベクター及びＰＢＳ対照群（それぞれ、ｐ＝０．０５１及びｐ＝０．０７５）と比較してほぼ有意である結果を示した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ評価に対するＡＵＣ計算は、群間で統計的に異なっていなかった。動物の体重増加及び膝の腫脹は、群間で統計的に異なっていなかった。全ての動物は、試験終了まで生存した。
実施例６．ガイドＲＮＡ設計
ヒトＩＬ－１α及びＩＬ－１βを標的とするガイドＲＮＡ（表１４）を、以下の手順に従って設計した：
１．適切なゲノムアセンブリ及び遺伝子モデルを識別する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）、
２．標的化ウィンドウ外にマッピングする主要な機能ドメインを識別する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）、
３．主要なエクソンにわたる全ての可能性のあるガイドＲＮＡのリストを生成する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、ＵＣＳＣ、ＩｎＤｅｌｐｈｉ）、
４．ＭＬ予測されたフレームシフトスコアに基づいてガイドをランク付けし、下位のガイドを排除する、
５．＜５ｂｐのガイドを、イントロン：エクソン境界から、６×Ｔ以上のホモポリヌクレオチド経路とともに除外する、
６．各ガイドのオンターゲット（Ｄｏｅｎｃｈ２０１６）及びオフターゲット（Ｈｓｕ２０１３）の指標を決定する（ツール：ＵＣＳＣ、Ｄｅｓｋｇｅｎ）、
７．下位のオン及びオフターゲットスコアを有するガイドをフィルタ除外して、最終リストを生成する、
８．フレームシフトインデックスに基づいてランク付けする。
ネコ、イヌ、又はウマＩＬ－１α及びＩＬ－１βを標的とするガイドＲＮＡ（表１５）を、以下の手順に従って設計した：
１．適切なゲノムアセンブリ及び遺伝子モデルを識別する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）
２．標的化ウィンドウ外にマッピングする主要な機能ドメインを識別する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）
３．適切なエクソン及び関連する隣接イントロン配列からコーディング配列を取得する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ＡＰＥ）
４．主要なエクソンにわたる全ての可能性のあるガイドＲＮＡのリストを生成する（ツール：Ｅｎｓｅｍｂｌｅ、ＩｎＤｅｌｐｈｉ）
５．ＭＬ予測されたフレームシフトスコアに基づいてガイドをランク付けし、下位のガイドを排除する
６．＜５ｂｐのガイドを、イントロン：エクソン境界から、６×Ｔ以上のホモポリヌクレオチド経路とともに除外する
７．各ガイドに対するオフターゲット指標を決定する（ツール：Ｃａｓ Ｏｆｆ－Ｆｉｎｄｅｒ、Ｅｘｃｅｌ）
８．下位のオフターゲットスコアを有するガイドをフィルタ除外して、最終リストを生成する
９．フレームシフトインデックスに基づいてランク付けする。
考慮される全ての種の遺伝子転写情報が、表１６に含まれる。
Figure 2023535351000057
Figure 2023535351000058
Figure 2023535351000059
Figure 2023535351000060
実施例７．マウスＩＬ－１βの免疫組織化学
免疫組織化学をマウス滑膜組織に対して実施して、以下のプロトコルに従ってＩＬ－１βを検出した：
試薬及び調製物
１．０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を有する１０×ＰＢＳ
２．滅菌ＰＢＳ
３．ＩＨＣ緩衝液
４．一次抗体（ヤギ抗マウスＩＬ－１、ＡＦ－４０１－ＮＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、滅菌ＰＢＳ中で０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に再構築した。
ａ．＋４Ｃにおける短期保管
ｂ．－２０～－７０Ｃにおける長期保管
５．対照抗体（正常なヤギＩｇＧ、ＡＢ－１０８－Ｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を、滅菌ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に再構築する。
ａ．＋４Ｃにおける短期保管
ｂ．－２０～－７０Ｃにおける長期保管
６．二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ、ａｂ６８８５、Ａｂｃａｍ）が再構築産物としてもたらされる
ａ．＋４Ｃにおける短期保管
ｂ．－２０～－７０Ｃにおける長期保管
７．ペルオキシダーゼブロック（ＢＬＯＸＡＬＬ試薬、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
８．２．５％（ｖ／ｖ）に希釈された正常ウマ血清（Ｉｍｐｒｅｓｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
９．ＤＡＢ色素原
方法
抗原の回収を１時間（手動又は自動、ユーザ選好）実施し、次いで、試料を短期保管のためにＰＢＳに移した。ペルオキシダーゼブロックを室温で１０分間実施し、その後、試料をＩＨＣ緩衝液中で５分間洗浄した。試料を、対照ウマ血清を用いて室温で６０分間ブロックし、一次抗体（１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で１：１００又は１：２００に希釈された）に室温で２時間曝露した。試料をＩＨＣ緩衝液中で２回、５分間洗浄した（各洗浄）。次いで、試料を二次抗体（１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で１：５００に希釈された）に１時間曝露し、ＩＨＣ緩衝液中で２回、５分間洗浄した（各洗浄）。検出は、ＤＡＢ色素原を用いて３０秒間実施された。対比染色をＭａｙｅｒのヘマトキシリン（６分）で実施し、試料を等級分けされたアルコールシリーズを通してキシレンに戻した。ＤＰＸ封入剤を適用し、カバースリップを取り付けた。
図１０に示されるように、滑膜組織中のマウスＩＬ－１βの免疫組織化学データは、ＣＲＩＳＰＲ処理動物における低減されたＩＬ－１β発現を示した。（Ａ）ＰＢＳで前処理されたＭＳＵ注射された動物では、ＩＬ－１βの強固な発現（褐色染色）が存在する。この効果は、ＣＲＩＳＰＲ処理動物（パネルＣ）には見られない。ＣＲＩＳＰＲ処理された動物におけるＩＬ－１β（褐色染色）の非存在は、陰性抗体対照（パネルＢ及びＤ）に類似している。全ての画像は、１０×オリジナル倍率である。（Ａ）及び（Ｂ）は、同じ動物の同じ関節から採取された隣接断片であり、（Ａ）は、ＩＬ－１ベータに特異的に標識された組織を示し、（Ｂ）は、陰性（同位体）対照抗体で標識された組織を示す。染色の差異は、この動物においてＰＢＳで前処理されたＭＳＵ注射された動物（例えば、ＰＢＳで前処理され、次いで、ＭＳＵ結晶で曝露された陽性対照動物）における、実証可能なＩＬ－１ベータ発現を反映する。（Ｃ）及び（Ｄ）は、同様に隣接断片であるが、ＭＳＵ注射前にＣＲＩＳＰＲ編集ウイルスで前処理された動物由来のものである。（Ｃ）ＩＬ－１抗体で処理された切片にはＩＬ－１ベータに対する明らかな染色は存在せず、（Ｄ）陰性（同位体）対照抗体で処理された切片に同じ陰性パターンが見られる。いかなる特定の理論に縛られることを望まず、これは、ＣＲＩＳＰＲ処理された動物の滑膜に検出可能なＩＬ－１ベータ発現が存在しないことを確認する。
実施例８．イヌ及びヒトインターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１α）及びインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドの設計及び検証。
可能性のあるｃｒＲＮＡ配列を、ヒト及びイヌのインターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１α）及びインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）遺伝子の様々なエクソンに対して識別した。図１３Ａ～図１３Ｄは、ヒトＩＬ－１α遺伝子のエクソン２～７から識別されたｃｒＲＮＡ配列のランク付けされたリストを示す。図１４Ａ～図１４Ｅは、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン２～７から識別されたｃｒＲＮＡ配列のランク付けされたリストを示す。図１５Ａ～図１５Ｃは、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３～５から識別されたｃｒＲＮＡ配列を示す。図１６Ａ及び図１６Ｂは、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３～５から識別されたｃｒＲＮＡ配列を示す。
次いで、公的にアクセス可能なゲノム（ヒト、ｈｇ３８、イヌ、ＣａｎＦａｍ３．１）、折り畳み遺伝子モデル（併合Ｅｎｓｅｍｂｌ／Ｈａｖａｎａ）、組織特異的エクソン発現（ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）、及び様々なｇＲＮＡモデルを使用して、イヌ及びヒトインターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１α）及びインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）を標的とする、遺伝子当たり２～５個の個別のｃｒＲＮＡ配列を選択した。以下のｇＲＮＡ設計規則を適用した：
１．ｇＲＮＡ標的領域は、コード配列（ＣＤＳ）の最初の５～５０％に限定された。
２．シングルｇＲＮＡを、Ａｚｉｍｕｔｈ２．０モデル（１０．１０３８／ｎｂｔ．３４３７）を使用する最大オンターゲット編集、及びＣｕｔｔｉｎｇ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（ＣＦＤ）（１０．１０３８／ｎｂｔ．３４３７）を使用する最小オフターゲット編集、及びＨｓｕ ｅｔ ａｌ．からの特異性スコア（１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）に従ってランク付けした。
３．ｉｎＤｅｌｐｈｉ（１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１８－０６８６－ｘ）によって予測されるように、高フレームシフト頻度（＞７５％）及び均一なＤＮＡ修復結果（＞０．４８）を有する高ランクのｓｇＲＮＡを、インビトロ合成のために選択した。
この選択基準を使用して、それぞれの標的遺伝子の異なるエクソンを標的とするｃｒＲＮＡガイド配列を、更なる調査のために選択した。具体的に、図１７Ａに示されるように、ヒトＩＬ－１α遺伝子のｓｇ２３５（配列番号３０１）及びｓｇ２３６（配列番号３０９）標的エクソン３及び４を選択した。同様に、図１７Ｂに示されるように、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、４、及び５を標的とする、ｓｇ２３７（配列番号４６２）、ｓｇ２３８（配列番号３９１）、ｓｇ２４８（配列番号３９３）、ｓｇ２４９（配列番号３８８）、及びｓｇ２５０（配列番号３８９）を選択した。図１７Ｃに示されるように、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、４、及び５を標的とするｓｇ２３９（配列番号５５２）、ｓｇ２４０（配列番号５５４）、ｓｇ２５１（配列番号５７８）、及びｓｇ２５２（配列番号５７９）を選択した。同様に、図１７Ｄに示されるように、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３及び４を標的とするｓｇ２４１（配列番号４９８）及びｓｇ２４２（配列番号５０６）を選択した。
次いで、選択されたｃｒＲＮＡガイド配列を足場配列に融合するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、それらの安定性を増加させ、それらの細胞免疫原性を減少させるように設計された足場修飾を用いて合成した（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）。遺伝子型決定のためのプライマーは、標的部位から少なくとも２００ｂｐとなり、＜１．５ｋｂのＰＣＲアンプリコンを生成するように設計され、合成された（Ｍｅｒｃｋ）。
以下の数量を４Ｄ－ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ、カタログＡＡＦ－１００２Ｂ及びＡＡＦ－１００２Ｘ）並びにヌクレオキュベットストリップを使用した単一の電気穿孔ベースのトランスフェクションに使用した。８０ｐｍｏｌの合成されたｓｇＲＮＡを、室温で少なくとも１０分間、４μｇのＣａｓ９ヌクレアーゼで事前複合体化した。３００～４００Ｋの解離細胞を、２０μｌの補充されたＰ３ヌクレオフェクション溶液に再懸濁し、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を添加する前にＰＢＳで洗浄した。次いで、これらの細胞をヌクレオキュベットウェルに移し、パルスコードＥＲ－１００を使用して電気穿孔した。電気穿孔の直後に、ヌクレオキュベットを、細胞が電圧から回復するために、３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに１０分間置いた。その後、８０μｌの成長培地をヌクレオキュベットウェルに追加し、細胞を、予め温められた成長培地を有する６つのウェルディッシュに移した。
電気穿孔の２日後～１１日後の間、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ６９５０６）を使用して５０～２００Ｋ細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。シングルｇＲＮＡ標的（及びオフターゲット）領域を、ＰＣＲによって増幅した。
ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によってサイズ検証し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ２８１０６）を使用して精製し、Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅにおけるＳａｎｇｅｒシーケンシングのために提出した。Ｓａｎｇｅｒトレース（ａｂ１）を、ＩＣＥバージョン１．２（ＵＲＬ ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｙｎｔｈｅｇｏ－ｏｐｅｎ／ｉｃｅにおいてオンラインで見つかる）を使用して逆畳み込みし、ＣＲＩＳＰＲ編集を推測した。加えて、選択されたプローブを使用した遺伝子編集の機械学習予測を、ｉｎＤｅｌｐｈｉを使用して生成した。加えて、予測されたオフターゲット部位を、直接シーケンシングを通じて分析して、ｇＲＮＡがオフターゲット編集を容易にするか否かを検証した。
選択されたガイド配列を使用する遺伝子編集の経験的実験及び機械学習予測の結果が、図１７に示される。
実施例９．－イヌ及びヒトインターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１α）及びインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）放出に対する選択されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドの効果。
実施例８からの最高のノックアウト（ＫＯ）スコア（すなわち、最高のフレームシフト頻度）を有するｇＲＮＡを使用して、二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１βノックアウト（ＫＯ）細胞を生成した。具体的には、ヒト軟骨細胞を編集して、ｃｒＲＮＡ配列ＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＵＧＡＵＣＡＡＵＧＧ（配列番号３０１）を使用して＞９９％のＩＬ－１α ＫＯ、及びｃｒＲＮＡ配列ＧＵＧＣＡＧＵＵＣＡＧＵＧＡＵＣＧＵＡＣ（配列番号３８９）を使用して６７％のＩＬ－１β ＫＯを達成した。イヌ軟骨細胞を編集して、ｃｒＲＮＡ配列ＧＡＣＡＵＣＣＣＡＧＣＵＵＡＣＣＵＵＣＡ（配列番号５５４）を使用して９７％のＩＬ－１α ＫＯ、及びｃｒＲＮＡ配列ＡＣＵＣＵＵＧＵＵＡＣＡＧＡＧＣＵＧＧＵ（配列番号５０６）を使用して９９％のＩＬ－１β ＫＯを達成した。
イヌ軟骨細胞（カタログＣｎ４０２Ｋ－０５）、ヒト軟骨細胞（カタログ４０２－０５ａ）、及びヒト線維芽細胞様滑膜細胞（カタログ４０８－０５ａ）を、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから凍結ストック（５×１０＾５細胞）として購入した。軟骨細胞を、２０％（ｖ／ｖ）の未処理ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１０２７０－１０６）及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０３８）で補充されたＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ２１３３１－０２０）からなる成長培地中で培養した。滑膜細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１１９６０－０４４）、１０％の未処理ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ１０２７０－１０６）、及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３５０５０－０３８）からなる成長培地中で培養した。細胞を、使用前に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．に対して陰性であることを確認し、ＳＴＲプロファイリングに供した。電気穿孔及び継代培養について、細胞を、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ２５２０００５６）を使用して解離させた。トリプシンを９体積の成長培地でクエンチし、細胞を１，０００ｇで遠心分離して上清を除去した。
ＬＰＳによるＩＬ－１の誘導。インターロイキン－１の放出を、細胞のサブコンフルエントな単層（編集された又は野生型非編集）をリポ多糖（ＬＰＳ）に曝露することによって誘発した。簡潔に述べると、非編集（対照）及び二重ＩＬ－１α／ＩＬ－１β ＫＯ（編集された）ヒト又はイヌ軟骨細胞を、２４個のウェルプレート中で約５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。２４～４８時間後、培地を、ＬＰＳ（５０ｕｇ／ｍｌ）又はＰＢＳビヒクルのいずれかを含有する新鮮な無血清培地で置換し、プレートをインキュベーターに戻した。ＩＬ－１の放出の決定のために、プレートを６及び２４時間後に採取した。培地を液体窒素中で瞬間凍結し、それらがアッセイされるまで－２０℃で保管した。
ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータの放出の測定。培養培地中のＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータの濃度を、製造業者の説明書に従って、種特異的市販アッセイで測定した。測定前に、凍結培地を解凍し、次いで、細胞残骸を除去するために遠心分離した（１，５００ｇ、２分間）。培地のアリコートを２回測定し、必要に応じて、組換えヒト又はイヌＩＬ－１アルファ又はベータの標準曲線からＩＬ－１の濃度を決定した。イヌ細胞におけるＩＬ－１アルファの放出の結果が、図１８Ａ（６時間）及び図１８Ｂ（２４時間）に示される。イヌ細胞におけるＩＬ－１ベータの放出の結果が、図１８Ｃ（６時間）及び図１８Ｄ（２４時間）に示される。ヒト細胞におけるＩＬ－１アルファの放出の結果が、図１９Ａ（６時間）及び図１９Ｂ（２４時間）に示される。ヒト細胞におけるＩＬ－１ベータの放出の結果が、図１９Ｃ（６時間）及び図１９Ｄ（２４時間）に示される。
Ｐ３一次細胞ヌクレオフェクション試薬及びヌクレオキュベットストリップ（カタログＶ４ＸＰ－３０３２）を、Ｌｏｎｚａ（Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（カタログＡ３６４９９）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ５５：Ｂ５（カタログＬ６５２９）からのリポ多糖（ＬＰＳ）をＭｅｒｃｋから購入した。ヒトＩＬ－１アルファ（カタログａｂ２１４０２５）及びヒトＩＬ－１ベータ（カタログａｂ１００５６０）、イヌＩＬ－１アルファ（カタログＡ４２７０）、及びイヌＩＬ－１ベータ（カタログａｂ２７３１７０）のためのＥＬＩＳＡキットを、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。
実施例１０．－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集の増加した特異性。
実施例８で報告された遺伝子編集特異性の分析を、強化された特異性ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９を使用して繰り返した。ｅＳｐＣａｓ９は、以下の３つの特異性強化変異、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａを含み、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５１：８４－８８（２０１６）に説明される。ｅＳｐＣａｓ９をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、均質に精製した。構築物は、１６１ｋＤａの分子量を有し、Ｎ末端フラグタグ及びＣ末端ヘキサＨｉｓタグを含有する。ｅＳｐＣａｓ９の配列は：
ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＡＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＡＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＡＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号６８０）。
簡潔に述べると、実施例８で使用され、かつ図１７に示される同じｓｇＲＮＡを、ｅＳｐＣａｓ９と複合体化した。図１７Ａに示されるように、ヒトＩＬ－１α遺伝子のｓｇ２３５（配列番号３０１）及びｓｇ２３６（配列番号３０９）標的エクソン３及び４を使用した。同様に、図１７Ｂに示されるように、ヒトＩＬ－１β遺伝子のエクソン３、４、及び５を標的とする、ｓｇ２３７（配列番号４６２）、ｓｇ２３８（配列番号３９１）、ｓｇ２４８（配列番号３９３）、ｓｇ２４９（配列番号３８８）、及びｓｇ２５０（配列番号３８９）を使用した。図１７Ｃに示されるように、イヌＩＬ－１α遺伝子のエクソン３、４、及び５を標的とするｓｇ２３９（配列番号５５２）、ｓｇ２４０（配列番号５５４）、ｓｇ２５１（配列番号５７８）、及びｓｇ２５２（配列番号５７９）を使用した。同様に、図１７Ｄに示されるように、イヌＩＬ－１β遺伝子のエクソン３及び４を標的とするｓｇ２４１（配列番号４９８）及びｓｇ２４２（配列番号５０６）を使用した。
次いで、選択されたｃｒＲＮＡガイド配列を足場配列に融合するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、それらの安定性を増加させ、それらの細胞免疫原性を減少させるように設計された足場修飾を用いて合成した（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）。遺伝子型決定のためのプライマーは、標的部位から少なくとも２００ｂｐとなり、＜１．５ｋｂのＰＣＲアンプリコンを生成するように設計され、合成された（Ｍｅｒｃｋ）。
以下の数量を４Ｄ－ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ、カタログＡＡＦ－１００２Ｂ及びＡＡＦ－１００２Ｘ）並びにヌクレオキュベットストリップを使用した単一の電気穿孔ベースのトランスフェクションに使用した。８０ｐｍｏｌの合成されたｓｇＲＮＡを、室温で少なくとも１０分間、ｅＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼで事前複合体化した。３００～４００Ｋの解離細胞を、２０μｌの補充されたＰ３ヌクレオフェクション溶液に再懸濁し、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を添加する前にＰＢＳで洗浄した。次いで、これらの細胞をヌクレオキュベットウェルに移し、パルスコードＥＲ－１００を使用して電気穿孔した。電気穿孔の直後に、ヌクレオキュベットを、細胞が電圧から回復するために、３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに１０分間置いた。その後、８０μｌの成長培地をヌクレオキュベットウェルに追加し、細胞を、予め温められた成長培地を有する６つのウェルディッシュに移した。
電気穿孔の２日後～１１日後の間、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ６９５０６）を使用して５０～２００Ｋ細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。シングルｇＲＮＡ標的（及びオフターゲット）領域を、ＰＣＲによって増幅した。
ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によってサイズ検証し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ２８１０６）を使用して精製し、Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅにおけるＳａｎｇｅｒシーケンシングのために提出した。Ｓａｎｇｅｒトレース（ａｂ１）を、ＩＣＥバージョン１．２（ＵＲＬ ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｙｎｔｈｅｇｏ－ｏｐｅｎ／ｉｃｅにおいてオンラインで見つかる）を使用して逆畳み込みし、ＣＲＩＳＰＲ編集を推測した。加えて、選択されたプローブを使用した遺伝子編集の機械学習予測を、ｉｎＤｅｌｐｈｉを使用して生成した。加えて、予測されたオフターゲット部位を、直接シーケンシングを通じて分析して、ｇＲＮＡがオフターゲット編集を容易にするか否かを検証した。
実施例８で報告されたＣａｓ９編集と比較して、ｅＳｐＣａｓ９の使用は、オンターゲット活性を失わずに、オフターゲット編集を低減する。例えば、それぞれ、２、３、及び３のミスマッチを有する３つの遺伝子座のｓｇＲＮＡ＃２４２（標的化イヌＩＬ－１β）によるオフターゲット編集を、表１８に報告される遺伝子座を増幅し、次いで、シーケンシングすることによって評価した。表１８に示されるように、第１のオフターゲット遺伝子座は、実施例８に説明される実験において編集を経験せず、ここでは試験されなかった。第２のオフターゲット遺伝子座は、実施例８に説明された実験においてほぼ完全なオフターゲット編集（９８～９９％）を経験したが、ｅＳｐＣａｓ９が使用されたときに編集を経験しなかった。第３のオフターゲット遺伝子座は、実施例８に説明された実験において一部の編集（０～２５％）を経験したが、ｅＳｐＣａｓ９が使用されたときに同様に編集を経験しなかった。更に、表１７に示されるように、この実施例に説明されるｅＳｐＣａｓ９を使用した編集に対応する「強化されたオンターゲットスコア」は、試験された各ｓｇＲＮＡについて、実施例８に説明される編集に対応する「オンターゲットスコア」と同等かそれ以上の高さであった。
Figure 2023535351000061
Figure 2023535351000062
上記の実施例は、当業者に、本開示の組成物、システム、及び方法の実施形態を作製及び使用するやり方の完全な開示及び説明を与えるために提供され、発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。当業者にとって明らかである本開示の実施形態を実施するための上記の方式の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本明細書に説明されている全ての特許及び刊行物は、本開示が関連する当業者の技能レベルを示すものである。
全ての見出し及びセクションの名称は、明確性及び参照のみを目的として使用され、いかなる方式でも制限とみなされるものではない。例えば、当業者であれば、本明細書に説明される開示の趣旨及び範囲に従って、適宜、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を組み合わせる有用性を認識するであろう。
本明細書に説明される方法は、本明細書に説明される特定の方法論、プロトコル、対象、及びシーケンシング技術に限定されず、したがって、変更され得ることが理解されることになる。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、本明細書に説明される方法及び組成物の範囲を限定することを意図するものではなく、それらは、添付の特許請求の範囲のみによって限定されることになる。本開示のいくつかの実施形態が本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態が単に例として提供されることが、当業者には明らかであろう。今後、本開示から逸脱することなく、当業者が多数の変形、変化、及び置換を行うであろう。本明細書に説明された本開示の実施形態に対する様々な代替例は、本開示の実施に用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲、及びこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの均等物が、それによって包含されることが意図される。
いくつかの態様が、例示のための例示的な用途を参照して説明される。別段の示唆がない限り、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせられ得る。本明細書に説明される特徴の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、及び方法が明記されていることが理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本明細書に説明される特徴が、特定の詳細のうちの１つ以上を伴わずに、又は他の方法を伴って実施され得ることを容易に認識するであろう。本明細書に説明される特徴は、いくつかの作用が、異なる順序で、及び／又は他の作用若しくは事象と同時に起こり得るため、作用又は事象の例示された順序によって限定されない。更に、本明細書に説明される特徴に従って方法論を実装するために、例示される全ての作用又は事象が必要とされるわけではない。
いくつかの実施形態が本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態が単に例として提供されることが、当業者には明らかであろう。本開示が、本明細書に提供される特定の実施例によって限定されることは意図されていない。本開示が上述の明細書を参照して説明されてきたが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、限定された意味で解釈されることを意図していない。今後、本開示から逸脱することなく、当業者が多数の変形、変化、及び置換を行うであろう。
更に、本開示の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載される特定の描写、構成、又は相対的割合に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に説明された本開示の実施形態に対する様々な代替例は、本開示の実施に用いられ得ることが理解されるべきである。したがって、本開示は、任意のそのような代替例、修正例、変形例、又は均等物も包含するべきであることが企図される。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲、及びこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの均等物が、それによって包含されることが意図される。
本明細書の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。本明細書の用語と組み込まれた参考文献の用語との間に矛盾がある場合、本明細書の用語が優先される

Claims (142)

  1. 関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物であって、
    治療有効量の、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子編集システムをコードする１つ以上の核酸を含み、前記システムが、
    （ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡであって、標的配列が、前記Ｃａｓ９タンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している、ガイドＲＮＡと、を含む、医薬組成物。
  2. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  11. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  12. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  13. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  14. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  15. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  16. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  17. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  18. 前記組成物が、前記１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のウイルスベクターを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 前記１つ以上のウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス－１から選択される組換えウイルスを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記１つ以上のウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. 前記組換えＡＡＶが、血清型５（ＡＡＶ５）のものである、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記組換えＡＡＶが、血清型６（ＡＡＶ６）のものである、請求項２０に記載の医薬組成物。
  23. 前記１つ以上のウイルスベクターが、
    前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする、前記１つ以上の核酸のうちの第１の核酸を含む第１のウイルスベクターと、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、前記１つ以上の核酸のうちの第２の核酸を含む第２のウイルスベクターと、を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 前記１つ以上のウイルスベクターが、単一の核酸を含むウイルスベクターを含み、前記単一の核酸が、前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 前記組成物が、前記１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のリポソームを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. 前記１つ以上の核酸が、裸の状態で存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  29. 前記組成物が、非経口投与のために製剤化される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. 前記組成物が、対象の関節内の関節内注射のために製剤化される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 関節の疾患又は状態の治療又は予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記方法が、
    前記対象の関節に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子編集システムをコードする１つ以上の核酸を含む薬学的有効量の組成物を含む医薬組成物を投与することを含み、前記システムが、
    （ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡであって、標的配列が、前記Ｃａｓ９タンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している、ガイドＲＮＡと、を含む、方法。
  32. 前記関節の疾患又は状態が、関節炎である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記関節炎が、変形性関節炎である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記対象が、ヒトである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号２９８～３８７からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  39. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  41. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ヒトＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号３８８～４９６からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  43. 前記対象が、イヌである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１α遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号５２２～５９０からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  48. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  49. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  50. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、イヌＩＬ－１β遺伝子を標的とし、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号４９７～５５１からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  52. 前記投与することが、前記対象の前記関節への前記医薬組成物の関節内注射を含む、請求項３１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記医薬組成物が、外科手術中に投与される、請求項３１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記医薬組成物が、外科手術後に投与される、請求項３１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記医薬組成物が、徐放性医薬組成物である、請求項３１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記医薬組成物が、前記１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のウイルスベクターを含む、請求項３１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記１つ以上のウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス－１から選択される組換えウイルスを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記１つ以上のウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記組換えＡＡＶが、血清型５（ＡＡＶ５）のものである、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記組換えＡＡＶが、血清型６（ＡＡＶ６）のものである、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記１つ以上のウイルスベクターが、
    前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする、前記１つ以上の核酸のうちの第１の核酸を含む第１のウイルスベクターと、
    前記少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、前記１つ以上の核酸のうちの第２の核酸を含む第２のウイルスベクターと、を含む、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記１つ以上のウイルスベクターが、単一の核酸を含むウイルスベクターを含み、前記単一の核酸が、前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記医薬組成物が、前記１つ以上の核酸を集合的に含む１つ以上のリポソームを含む、請求項３１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記１つ以上の核酸が、裸の状態で存在する、請求項３１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項３１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項３１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  67. 遺伝子編集システムを含む関節の疾患又は状態の治療又は予防のための医薬組成物であって、前記遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とする、医薬組成物。
  68. 前記遺伝子編集システムが、ＩＬ－１α及び／又はＩＬ－１βのうちの１つ以上を標的とする、請求項６７に記載の医薬組成物。
  69. 前記遺伝子編集システムが、前記関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座の発現を、前記関節を含む前記細胞の少なくとも一部分においてサイレンシング又は低減させる、請求項６７又は６８に記載の医薬組成物。
  70. 前記関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座が、サイトカイン及び／又は成長因子遺伝子座である、請求項６７に記載の医薬組成物。
  71. 前記サイトカイン及び／又は成長因子遺伝子座が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、カスパーゼ－１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 前記遺伝子編集が、前記関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む、請求項６７に記載の医薬組成物。
  73. 前記遺伝子編集が、関節に関連する前記少なくとも１つの遺伝子座の発現を、前記関節を含む前記細胞の少なくとも一部分においてサイレンシング又は低減させる、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  74. 前記１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、カスパーゼ－１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７３に記載の医薬組成物。
  75. 前記遺伝子編集が、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子の発現を、前記関節を含む前記細胞の少なくとも一部分において増強させ、前記サイトカイン及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１Ｒａ、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＩＭＰ－３、ＴＩＭＰ－４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  76. 前記遺伝子編集が、前記１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  77. 前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、ジンクフィンガー法、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の方法を含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  78. 前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法を含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  79. 前記ＣＲＩＳＰＲ法が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法である、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. 前記遺伝子編集が、ＴＡＬＥ法を含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  81. 前記遺伝子編集が、ジンクフィンガー法を含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  82. 関節の疾患又は状態の治療又は予防のための方法であって、前記方法が、遺伝子編集システムを導入することを含み、前記遺伝子編集システムが、関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座を標的とする、方法。
  83. 前記遺伝子編集システムが、ＩＬ－１α及び／又はＩＬ－１βのうちの１つ以上を標的とする、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記遺伝子編集システムが、前記関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座の発現を、前記関節を含む前記細胞の少なくとも一部分においてサイレンシング又は低減させる、請求項８２又は８３に記載の方法。
  85. 前記関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座が、サイトカイン及び／又は成長因子遺伝子座である、請求項８２に記載の方法。
  86. 前記サイトカイン及び／又は成長因子遺伝子座が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、カスパーゼ－１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記遺伝子編集が、前記関節機能に関連する少なくとも１つの遺伝子座で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記遺伝子編集が、関節に関連する前記少なくとも１つの遺伝子座の発現を、前記関節を含む前記細胞の少なくとも一部分においてサイレンシング又は低減させる、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）、カスパーゼ－１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記遺伝子編集が、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子の発現を、前記関節を含む前記細胞の少なくとも一部分において増強させ、前記１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子が、ＩＬ－１Ｒａ、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＩＭＰ－３、ＴＩＭＰ－４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８２又は８３のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記遺伝子編集が、前記１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子遺伝子で二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能ヌクレアーゼの使用を含む、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、ジンクフィンガー法、及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上の方法を含む、請求項８２～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ法を含む、請求項８２～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記ＣＲＩＳＰＲ法が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法である、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記遺伝子編集が、ＴＡＬＥ法を含む、請求項８２～９１のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記遺伝子編集が、ジンクフィンガー法を含む、請求項８２～９１のいずれか一項に記載の方法。
  97. 関節疾患に起因するイヌの跛行を治療するための方法であって、前記方法が、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とするイヌに投与することを含む、方法。
  98. 前記組成物が、関節内に注射される、請求項９７に記載の方法。
  99. 関節疾患に起因するウマの跛行を治療するための方法であって、前記方法が、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とするウマに投与することを含む、方法。
  100. 前記組成物が、関節内に注射される、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記関節疾患が、炎症性関節疾患である、請求項９７～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 関節炎を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に治療有効量の、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体を投与することを含み、
    前記遺伝子が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号７～配列番号２０からなる群から選択されるＤＮＡ配列と相補的なＲＮＡ配列である、方法。
  103. 前記関節炎が、変形性関節炎である、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体が、Ｃａｓ９タンパク質及びシングルガイドＲＮＡを含む、請求項１０２に記載の方法。
  105. 前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体が、前記シングルガイドＲＮＡとの複合体中にＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体が、Ｃａｓ９タンパク質と、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βのうちの一方又は両方を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸と、を含む、請求項１０２に記載の方法。
  107. 前記Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする配列を含む核酸として投与される、請求項１０２に記載の方法。
  108. 前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする配列を含む前記核酸が、ウイルスで投与される、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記ウイルスが、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びレンチウイルスからなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記ウイルスが、ｎ個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１０９に記載の方法。
  111. ＩＬ－１α及びＩＬ－１βのうちの一方又は両方を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする配列を含む核酸を投与することを含む、請求項１０８に記載の方法。
  112. 前記ガイドＲＮＡをコードする配列を含む前記核酸が、ウイルスで投与される、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記ウイルスが、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びレンチウイルスからなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記ウイルスが、ｎ個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記複合体が、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする配列及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする配列を含む単一の核酸、好ましくはウイルスベクターとして投与され、前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、同じ核酸から発現される、請求項１０２に記載の方法。
  116. 前記複合体が、１つ超の核酸、好ましくは１つ超のウイルスベクターで投与され、第１の核酸が、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする配列を含み、第２の核酸が、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする配列を含み、前記少なくとも１つのガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓ９タンパク質が、別個の核酸から発現される、請求項１０２に記載の方法。
  117. 前記核酸が、組換えレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項１１５又は１１６に記載の方法。
  118. 前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１７に記載の方法。
  119. ＩＬ－１αを標的とするガイドＲＮＡを投与することを含む、請求項１０２に記載の方法。
  120. ＩＬ－１βを標的とするガイドＲＮＡをｇ投与することを含む、請求項１０２に記載の方法。
  121. 前記Ｃａｓ９が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳＴ）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＴＤ）（ＴｄＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳＰ）（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、若しくはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、又はそのバリアントである、請求項１０２に記載の方法。
  122. 前記Ｃａｓ９が、ＳｐＣａｓ９、又はそのバリアントである、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記ＳｐＣａｓ９が、ＳｐｙＣａｓ９、又はそのバリアントである、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体が、関節炎の部位に全身的又は局所的に投与される、請求項１０２に記載の方法。
  125. 前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体が、外科手術、局所軟膏の塗布、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される治療の部位に局所的に投与される、請求項１０２に記載の方法。
  126. 前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体が、生分解性及び／又は生体適合性ポリマーを含む組成物で投与されるように製剤化される、請求項１０２に記載の方法。
  127. 前記生分解性及び／又は生体適合性ポリマーが、コラーゲン、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール被覆リポソーム、及びポリ乳酸からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記対象が、ヒトである、請求項１０２に記載の方法。
  129. 前記対象が、サル、ヒヒ、ウシ、イヌ、ヤギ、ゴリラ、モルモット、ハムスター、キツネザル、マウス、オランウータン、ブタ、ラット、ウマ、及びヒツジからなる群から選択される非ヒト対象である、請求項１０２に記載の方法。
  130. ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体の編集効率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％である、請求項１０２に記載の方法。
  131. 医薬組成物であって、
    治療有効量の、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集複合体を含み、
    前記遺伝子が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、配列番号７～配列番号２０からなる群から選択されるＤＮＡ配列と相補的なＲＮＡ配列である、医薬組成物。
  132. プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する核酸標的配列及び非天然型Ｃａｓ９タンパク質の局所投与を含む、多細胞真核生物の遺伝子修飾を通じて関節疾患を治療するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介方法であって、
    ａ）前記標的配列とハイブリダイズする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体ｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントと、
    ｂ）ＩＩ型Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントと、
    ｃ）標的関節細胞への成分（ａ）及び（ｂ）の送達が可能なウイルスベクターと、を含み、それによって、核酸成分の共発現が、結果として、関節の少なくともいくつかの細胞における低減された炎症をもたらす、ウイルスベクターと、を含む、方法。
  133. 関節疾患を治療する方法であって、
    ａ）ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターであって、前記ｇＲＮＡ分子が、ＩＬ－１α遺伝子又はＩＬ－１βを標的とするドメインを含む、ウイルスベクターと、
    ｂ）Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターと、の局所投与を含み、
    ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む前記ウイルスベクター、及びＣａｓ９分子を含む前記ウイルスベクターが、関節の少なくともいくつかの細胞におけるＩＬ－１α又はＩＬ－１βのレベルが低減されるように細胞への送達が可能である、方法。
  134. ＩＬ－１α又はＩＬ－１β遺伝子の標的部位に結合する配列番号２１～３４からなる群から選択される配列を有するシングルガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼであって、前記ヌクレアーゼが、前記遺伝子を切断及び不活性化する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ。
  135. 対象の関節において内因性ＩＬ－１α又はＩＬ－１βを不活性化する方法であって、前記方法が、請求項１３４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを前記関節に投与するステップを含み、前記ヌクレアーゼが、前記ＩＬ－１α遺伝子又は前記ＩＬ－１β遺伝子を切断及び不活性化する、方法。
  136. ゲノムインターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１ａ）に相補的である標的化ドメインを含む、クラスター化して規則的な配置の回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣａｓガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記標的化ドメインが、野生型配列を破壊するように構成されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇＲＮＡ。
  137. １つ以上のパッケージングされたベクターを含むベクターシステムであって、
    ａ）請求項１３６に記載のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントと、
    ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された第２の調節エレメントと、を含む、ベクターシステム。
  138. 細胞においてＩＬ－１Ａをコードする核酸配列を改変する方法であって、前記細胞を、
    ａ）ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターであって、前記ｇＲＮＡ分子が、ＩＬ－１α遺伝子又はＩＬ－１βを標的とするドメインを含む、ウイルスベクター、及び
    ｂ）Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターと、接触させることを含み、
    ｇＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む前記ウイルスベクター、及びＣａｓ９分子を含む前記ウイルスベクターが、関節の少なくともいくつかの細胞におけるＩＬ－１α又はＩＬ－１βのレベルが低減されるように細胞への送達が可能である、方法。
  139. 対象における変形性関節炎を治療する方法であって、請求項１３７に記載のＩＬ－１α遺伝子又はＩＬ－１βベクターシステムを前記対象に局所的に投与することを含む、方法。
  140. 関節の少なくともいくつかの細胞においてＩＬ－１α遺伝子又はＩＬ－１β発現を低減するための方法であって、請求項１３７に記載のベクターシステムを前記細胞において導入するか、又は発現させることを含む、方法。
  141. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２１～３４及び１６８～２９７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物、方法、又はシステム。
  142. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－５及びＡＡＶ－６からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物、方法、又はシステム。
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